[go: up one dir, main page]

CN103096875B - 用于递送活性剂的生物可降解脂质 - Google Patents

用于递送活性剂的生物可降解脂质 Download PDF

Info

Publication number
CN103096875B
CN103096875B CN201180037927.7A CN201180037927A CN103096875B CN 103096875 B CN103096875 B CN 103096875B CN 201180037927 A CN201180037927 A CN 201180037927A CN 103096875 B CN103096875 B CN 103096875B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
gene
compound
alkyl
granule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180037927.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103096875A (zh
Inventor
姆夏·马诺哈兰
马丁·迈尔
穆图萨米·贾亚拉曼
松田茂夫
纳拉亚南奈尔·K·贾亚普拉卡什
卡兰托塔特·G·拉杰夫
埃金·埃金科
托马斯·A·贝利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of CN103096875A publication Critical patent/CN103096875A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103096875B publication Critical patent/CN103096875B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/62—Quaternary ammonium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种阳离子脂质，其具有位于所述阳离子脂质的脂质部分(例如，疏水链)的中间或远端部分的一个或多个生物可降解基团。这些阳离子脂质可并入脂质颗粒中用于递送活性剂，例如核酸。本发明还涉及脂质颗粒，其包含中性脂质、能够减少聚集的脂质、本发明的阳离子脂质和(任选地)固醇。所述脂质颗粒可进一步包括治疗剂，如核酸。

Description

用于递送活性剂的生物可降解脂质
优先权要求
本申请要求2010年6月3日提交的美国专利申请No.61/351,146和2011年5月23日提交的美国专利申请No.61/489,197的权益，其各自通过引用整体并入。
技术领域
本发明涉及生物可降解脂质及其用于递送活性剂如核酸的用途。
发明背景
治疗性核酸包括(例如)小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒、免疫刺激性核酸、反义核苷酸、拮抗剂(antagomir)、antimir、微RNA模拟物、supermir、U1适配子和适配体。这些核酸通过多种机制起作用。在siRNA或miRNA的情况下，这些核酸可通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调细胞内特定蛋白的水平。siRNA或miRNA引入细胞质后，这些双链RNA构建体可与称为RISC的蛋白质结合。siRNA或miRNA的有义链离开RISC复合物，在RISC内提供了可识别并结合具有与结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA的模板。结合互补mRNA，RISC复合物裂解所述mRNA并释放裂解的链。RNAi可通过靶向特定破坏编码蛋白质合成的相应mRNA提供对特定蛋白质的下调。
RNAi的治疗应用极其广泛，因为可用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成siRNA和miRNA构建体。到目前为止，siRNA构建体已经在体外和体内模型中显示出特异性下调靶蛋白的能力。另外，siRNA构建体目前正在临床研究中进行评估。
然而，siRNA或miRNA构建体目前面临两个问题，第一，它们在血浆中易受核酸酶消化影响，第二，当作为游离siRNA或miRNA全身施用时，它们进入可结合RISC的细胞内隔室的能力有限。可通过在分子内并入经化学修饰的核苷酸连接子，例如硫代磷酸酯基团，稳定这些双链构建体。然而，这些化学修饰仅对核酸酶消化提供了有限防护并且可降低所述构建体的活性。可通过使用载体系统例如聚合物、阳离子脂质体或通过化学修饰所述构建体，例如通过共价连接胆固醇分子促进siRNA或miRNA的细胞内递送。然而，需要经改进的递送系统以增强siRNA和miRNA分子的效能并减少或消除对化学修饰的需要。
反义寡核苷酸和核酶也可抑制mRNA翻译成为蛋白质。在反义构建体的情况下，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA的序列互补的序列并且可通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与所述mRNA结合。这种结合防止靶mRNA翻译和/或触发mRNA转录物的RNA酶H降解。因此，反义寡核苷酸具有特异性作用的巨大潜力(即，下调特定的疾病相关蛋白)。到目前为止，这些化合物在若干体外和体内模型，包括炎性疾病、癌症和HIV的模型中显示出希望(查阅Agrawal，Trends in Biotech.14：376-387(1996))。反义构建体也可通过与染色体DNA特异性杂交影响细胞活性。目前正在进行若干反义药物的高级人体临床评估。这些药物的靶标包括bcl2和载脂蛋白B基因和mRNA产物。
免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。在脱氧核糖核酸的情况下，已经证实某些序列或基序在哺乳动物体内引起免疫刺激。这些序列或基序包括CpG基序、嘧啶富集序列和回文序列。人们认为，脱氧核糖核酸中的CpG基序被内体受体，toll样受体9(TLR-9)特异性识别，然后触发先天性和获得性免疫刺激途径。还报道了某些免疫刺激性核糖核酸序列。人们认为，这些RNA序列通过与toll样受体6和7(TLR-6和TLR-7)结合触发免疫激活。另外，还报道了双链RNA为免疫刺激性并且认为是通过与TLR-3结合激活。
使用治疗性核酸的一个众所周知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间连接键的稳定性和该连接子对核酸酶的敏感性。血清中核酸外切酶和核酸内切酶的存在引起具有磷酸二酯连接子的核酸迅速消化并且，因此，在血清存在下或在细胞内治疗性核酸可具有很短的半衰期。(Zelphati，O.等，Antisense.Res.Dev.3：323-338(1993)；和Thierry，A.R.等，GeneRegulation：Biology of Antisense RNA and DNA中第147-161页(Erickson，RP和Izant，JG编辑；Raven Press，NY(1992))。由于这些和其它已知的问题，目前正在研发的治疗性核酸并未采用天然核酸中存在的基本磷酸二酯化学结构。
这个问题已经通过降低血清或细胞内降解的化学修饰得到部分克服。已经在核苷酸间磷酸二酯桥(例如，使用硫代磷酸酯、甲基磷酸酯或氨基磷酸酯连接键)，在核苷酸碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)，或在糖(例如，2′-修饰糖)处试验了修饰(Uhlmann E.等，Antisense：Chemical Modifications.Encyclopedia of Cancer，第X卷，第64-81页Academic Press Inc.(1997))。其它人已试图使用2′-5′糖连接键提高稳定性(见，例如，美国专利No.5,532,130。还尝试了其它改变。然而，经证明这些解决方案都不完全令人满意，并且体内游离治疗性核酸仍然仅仅具有有限的功效。
另外，正如上面所提到的，关于siRNA和miRNA，问题仍在于治疗性核酸跨过细胞膜的能力有限(见，Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta 1197：95-1082(1994))和与全身毒性相关的问题，例如补体介导的过敏反应、凝结性质改变和血细胞减少(Galbraith等，Antisense Nucl.Acid Drug Des.4：201-206(1994))。
为视图提高功效，调研人员还采用了基于脂质的载体系统来递送经化学修饰或未修饰的治疗性核酸。在Zelphati，O和Szoka，F.C.，J.Contr.Rel.41：99-119(1996)中，作者提到阴离子(常规)脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、融合脂质体和阳离子脂质/反义聚集物。类似地，已经在阳离子脂质体中系统性施用了siRNA，并且已经报道这些核酸-脂质颗粒在哺乳动物，包括非人灵长类动物中提供了对靶蛋白的更好下调(Zimmermann等，Nature441：111-114(2006))。
尽管有这种进展，但是在本领域中仍需要适合一般治疗使用的改良脂质-治疗性核酸组合物。优选地，这些组合物将以高效率封装核酸，具有高药物∶脂质比，防止封装的核酸从血清中降解和清除，适合全身递送，并且提供了对封装核酸的细胞内递送。另外，这些脂质-核酸颗粒应耐受良好并且提供足够的治疗指数，以致在核酸的有效剂量下患者治疗不会伴有对患者的显著毒性和/或风险。提供了化合物、制备化合物的方法和使用所述化合物将核酸引入细胞的方法，包括治疗疾病的方法。
发明概述
本发明涉及一种阳离子脂质，其具有位于所述阳离子脂质的脂质部分(例如，疏水链)的中间或远端部分的一个或多个生物可降解基团。这些阳离子脂质可并入脂质颗粒中用于递送活性剂，如核酸(例如，siRNA)。生物可降解基团并入阳离子脂质中引起在将活性剂递送至靶标区域后阳离子脂质从体内更快代谢和去除。因此，这些阳离子脂质的毒性大大低于没有生物可降解基团的相似阳离子脂质。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质为下式的化合物：
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，
其中
R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；
关于R1和R2，
(i)R1和R2各自独立地为经任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基或杂环；
(ii)R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的杂环；或
(iii)R1和R2其中之一为经任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基或杂环，而另一个与(a)相邻氮原子和(b)与所述氮原子相邻的(R)a基团一起形成4-10元杂环或杂芳基(例如，6元环)；
每次出现的R独立地为-(CR3R4)-；
每次出现的R3和R4独立地为H、OH、烷基、烷氧基、-NH2、烷基氨基或二烷基氨基(在一个优选的实施方案中，每次出现的R3和R4独立地为H或C1-C4烷基)；
或R3和R4和与之直接连接的碳原子一起形成环烷基，其中每条链中至多3个与碳C*连接的R基团为环烷基(例如，环丙基)；
连接Q的虚线为不存在或者为键；
当连接Q的虚线不存在时，则Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；或
当连接Q的虚线为键时，则(i)b为0并且(ii)Q和与之(C*)相邻的叔碳形成具有5-10个环原子的经取代或未经取代的单环或双环杂环基团(例如，杂环基团中的杂原子选自O和S，优选为O)；
Q1和Q2各自独立地为不存在、-O-、-S-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-或-OC(O)O-；
Q3和Q4各自独立地为H、-(CR3R4)-、芳基或胆固醇部分；
每次出现的A1、A2、A3和A4独立地为-(CR5R5-CR5＝CR5)-；
每次出现的R5独立地为H或烷基；
M1和M2各自独立地为生物可降解基团(例如，-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-OC(O)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-)；
Z为不存在、亚烷基或-O-P(O)(OH)-O-；
与Z连接的每条------为任选的键，以致当Z不存在时，Q3和Q4不直接共价结合在一起；
a为1、2、3、4、5或6；
b为0、1、2或3；
c、d、e、f、i、j、m、n、q和r各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
g和h各自独立地为0、1或2；
k和l各自独立地为0或1，其中k和l中的至少一个为1；并且
o和p各自独立地为0、1或2，
其中
(i)所述化合物不含以下部分：
其中----为任选的键；并且
(ii)Q3和Q4各自独立地与标有星号(*)的叔碳原子被一条8个或更多个原子(例如，12或14个或更多个原子)的链隔开。
在一个实施方案中，(i)R1和R2各自独立地为经任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基或杂环；或(ii)R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的杂环。
在式(I)化合物的一个优选的实施方案中，
(a)当Q1为生物可降解基团(例如，-C(O)O-)时，则c至少为4；
(b)当Q2为生物可降解基团时，则d至少为4；并且
(c)Q3和Q4各自独立地与标有星号(*)的叔碳原子被一条10个或更多个原子(例如，12或14个或更多个原子)的链隔开。
在另一优选的实施方案中，式(I)中与生物可降解基团(例如，-C(O)O-)连接的碳原子α或β可经一个或多个烷基(例如，一个C1-C4烷基(例如-CH3取代基)或两个C1-C4烷基(例如两个-CH3取代基))取代或具有螺环基团(例如，C3-C5环烷基(例如C3环烷基))。例如，与生物可降解基团连接的碳原子α或β可独立地选自
(其中n为4-6)。
在一个实施方案中，所述M1或M2基团和相邻变量形成以下基团：
(其中n为4-6)。
又一实施方案为下式的阳离子脂质
式(IA-1)
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
R1、R2、R、a和b如关于式(I)所定义；
Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；
R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；并且
R9和R10的每一个独立地为具有一个或多个生物可降解基团的C12-C24烷基(例如，C12-C20烷基)、C12-C24烯基(例如，C12-C20烯基)或C12-C24烷氧基(例如，C12-C20烷氧基)；每个生物可降解基团独立地中断所述C12-C24烷基、烯基或烷氧基或在所述C12-C24烷基、烯基或烷氧基的末端被取代，
其中
(i)所述化合物不含以下部分：
其中----为任选的键；并且
(ii)所述R9和R10的末端与标有星号(*)的叔碳原子被一条8个或更多个原子(例如，12或14个或更多个原子)的链隔开。
在另一实施方案中，所述阳离子脂质为下式的化合物：
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，其中
R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；
R1和R2各自独立地为经任选取代的C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C6环烷基、(C3-C6环烷基)C1-C4烷基或单环杂环；或
R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的5或6元杂环(例如，C5或C6杂环)；
每次出现的R独立地为-(CR3R4)-；
每次出现的R3和R4独立地为H、OH、烷基、烷氧基、-NH2、烷基氨基或二烷基氨基(在一个优选的实施方案中，每次出现的R3和R4独立地为H或C1-C4烷基)；
或R3和R4和与之直接连接的碳原子一起形成C3-C6环烷基，其中每条链中至多3个与碳C*连接的R基团为环烷基(例如，环丙基)；
连接Q的虚线为不存在或者为键；
当连接Q的虚线不存在时，则Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；或
当连接Q的虚线为键时，则b为0而Q和与之(C*)相邻的叔碳形成具有5-10个环原子的经取代或未经取代的单环或双环杂环基团(例如，杂环基团中的杂原子选自O和S，优选为O)；
Q3和Q4各自独立地为H、-(CR3R4)-、芳基或胆固醇部分；
每次出现的A1、A2、A3和A4独立地为-(CR5R5-CR5＝CR5)-；
每次出现的R5独立地为H或烷基；
M1和M2各自独立地为-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R5)＝N-、-C(R5)＝N-O-、-O-C(O)O-、-C(O)N(R5)-、-C(O)S-、-C(S)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-
Z为不存在、亚烷基或-O-P(O)(OH)-O-；
与Z连接的每条------为任选的键，以致当Z不存在时，Q3和Q4不直接共价结合在一起；
a为1、2、3、4、5或6；
b为0、1、2或3；
d、e、i、j、m、n、q和r各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
g和h各自独立地为0、1或2；
d+3h的总和至少为4，并且e+3g的总和至少为4；
k和l各自独立地为0或1，其中k和l中的至少一个为1；并且
o和p各自独立地为0、1或2，
其中Q3和Q4各自独立地与标有星号(*)的叔碳原子被一条8个或更多个原子(例如，12或14个或更多个原子)的链隔开。
在一个实施方案中，式(IA-2)中的R’为不存在或氢。在一个实施方案中，式(IA-2)中的R’为不存在或烷基(例如，甲基)。
在一个实施方案中，式(IA-2)中的R1和R2各自独立地为C1-C4烷基(例如，甲基或乙基)。
在一个实施方案中，式(IA-2)中每次出现的R独立地为-CH2-或-CH(CH3)-
在一个实施方案中，式(IA-2)中的Q3和Q4各自独立地为H、芳基或胆固醇部分。
在一个实施方案中，式(IA-2)中每次出现的A1、A2、A3和A4独立地为-(CH2-CH＝CH)-；
在一个实施方案中，式(IA-2)中的M1和M2各自为-C(O)-O-。
在式(IA-2)的化合物的一个实施方案中，Z不存在并且每条------不存在(即，Q3和Q4不直接共价结合在一起)。
在一个实施方案中，式(IA-2)中e+3g+i+m+3o+q的总和为约8至约20。在另一实施方案中，式(IA-2)中e+3g+i+m+3o+q的总和为约12至约20。
在一个实施方案中，式(IA-2)中d+3h+j+n+3p+r的总和为约8至约20。在另一实施方案中，式(IA-2)中d+3h+j+n+3p+r的总和为约12至约20。
在另一实施方案中，所述阳离子脂质为下式的化合物
其中
R1、R2、R、a、b、M1和M2如关于式(I)所定义；
Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；
R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；
R9和R10的每一个独立地为亚烷基或亚烯基；并且
R11和R12的每一个独立地为烷基或烯基，任选被COOR13封端，其中每个R13独立地为烷基(例如，C1-C4烷基如甲基或乙基)；
R9、M1和R11总长度为至少8个碳原子(例如，12或14个碳原子或更长)；并且
R10、M2和R12总长度为至少8个碳原子(例如，12或14个碳原子或更长)。
在式(IB)的化合物的一个优选实施方案中，R9和R10各自独立地为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基，M1和M2为-C(O)O-，并且R11和R12为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基。在一个实施方案中，R9、M1和R11总长度为12-24个碳原子。在另一实施方案中，R9、M1和R11总长度为14-18个碳原子。在一个实施方案中，R10、M2和R12总长度为12-24个碳原子。在另一实施方案中，R10、M2和R12总长度为14-18个碳原子。
R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-基团可为本文所述的任何头基，包括以下表1中所示的头基及其盐。在一个优选的实施方案中，R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-为(CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)＝N-O-。
又一实施方案中，所述阳离子脂质为下式的化合物
其中
R1、R2、R、a和b如关于式(I)所定义；
Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；
R9和R10的每一个独立地为末端经生物可降解基团(例如COOR13)取代的C12-C24烷基或烯基，其中每个R13独立地为烷基(优选为C1-C4烷基如甲基或乙基)。
在式(IC)的化合物的一个优选实施方案中，R9和R10各自独立地为C14-C18亚烷基或C14-C18亚烯基。在另一优选实施方案中，生物可降解基团为-COOR13，其中R13为C1-C4烷基(例如甲基或乙基)。
R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-基团可为本文所述的任何头基，包括以下表1中所示的头基。在一个优选的实施方案中，R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-为(CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)＝N-O-。
又一实施方案为下式的中间产物：
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，
其中
R’为不存在、氢或烷基(例如，C1-C4烷基)；
R1和R2各自独立地为经任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基或杂环；或
R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的杂环；
每次出现的R独立地为-(CR3R4)-；
每次出现的R3和R4独立地为H、OH、烷基、烷氧基、-NH2、烷基氨基或二烷基氨基(在一个优选的实施方案中，每次出现的R3和R4独立地为H或烷基)；
或R3和R4和与之直接连接的碳原子一起形成环烷基，其中每条链中至多3个与碳C*连接的R基团为环烷基(例如，环丙基)；
连接Q的虚线为不存在或者为键；
当连接Q的虚线不存在时，则Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；或
当连接Q的虚线为键时，则b为0而Q和与之(C*)相邻的叔碳形成具有5-10个环原子的经取代或未经取代的单环或双环杂环基团(例如，杂环基团中的杂原子选自O和S，优选为O)；
Q1和Q2各自独立地为不存在、-O-、-S-、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-或-OC(O)O-；
Q3和Q4各自独立地为H、-(CR3R4)-、芳基、-OH或胆固醇部分；
每次出现的A1、A2、A3和A4独立地为-(CR5R5-CR5＝CR5)-；
每次出现的R5独立地为H或烷基；
M1和M2各自独立地为生物可降解基团(例如，-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-OC(O)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-)；
Z为不存在、亚烷基或-O-P(O)(OH)-O-；
与Z连接的每条------为任选的键，以致当Z不存在时，Q3和Q4不直接共价结合在一起；
a为1、2、3、4、5或6；
b为0、1、2或3；
c、d、e、f、i、j、m、n、q和r各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
g和h各自独立地为0、1或2；
k和l各自独立地为0或1；
o和p各自独立地为0、1或2；
其中
(i)所述化合物不含以下部分：
其中----为任选的键；并且
(ii)Q3和Q4各自独立地与标有星号(*)的叔碳原子被一条8个或更多个原子(例如，12或14个或更多个原子)的链隔开。
又一实施方案中，所述阳离子脂质为式IE的化合物：
或其盐(例如，其药学上可接受的盐)，
其中
R1为具有式-L1a-(CR1aR1b)α-[L1b-(CR1aR1b)β]γ-L1c-R1c(其中L1a为键)、-CR1aR1b-、-O-、-CO-、-NR1d-、-S-或其组合的C10-C30基团；
每个R1a和每个R1b独立地为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C3-C8环烷基；-OR1c；-NR1cR1d；芳基；杂芳基；或杂环基；
每个L1b独立地为键、-(CR1aR1b)1-2-、-O-、-CO-、-NR1d-、-S-、或其组合；或可具有式其中如果j、k和l的总和至少为1且不大于8，j、k和l各自独立地为0、1、2或3；并且R1f和R1g各自独立地为R1b，或相邻R1f和R1g一起任选地为键；
或可具有式其中如果j和k的总和至少为1，j和k各自独立地为0、1、2、3或4；并且R1f和R1g各自独立地为R1b，或相邻R1f和R1g一起任选地为键；
或可具有式：其中-Ar-为经0-6个独立R1a基团任选取代的6-14元亚芳基；
或可具有式：其中-Het-为经0-6个独立R1a基团任选取代的3-14元杂亚环基或杂亚芳基；
L1c为-(CR1aR1b)1-2-、-O-、-CO-、-NR1d-、-S-、 或其组合；
R1c为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基、烷氧基或芳基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基、烷氧基或芳基任选取代的C3-C8环烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；或R1c具有式：
R1d为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C3-C8环烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；
α为0-6，均包括在内；
每个β独立地为0-6，均包括在内；
γ为0-6，均包括在内；
R2为具有式-L2a-(CR2aR2b)δ-[L2b-(CR2aR2b)ε]ζ-L2c-R2c(其中L2a为键)、-CR2aR2b-、-O-、-CO-、-NR2d-、-S-或其组合的C10-C30基团；
每个R2a和每个R2b可独立地为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C3-C8环烷基；-OR2c；-NR2cR2d；芳基；杂芳基；或杂环基；
每个L2b可独立地为键、-(CR2aR2b)1-2-、-O-、-CO-、-NR2d-、-S-、或其组合；
或可具有式其中如果j、k和l的总和至少为1且不大于8，j、k和l各自独立地为0、1、2或3；并且R2f和R2g各自独立地为R2b，或相邻R2f和R2g一起任选地为键；
或可具有式其中如果j和k的总和至少为1，j和k各自独立地为0、1、2、3或4；并且R2f和R2g各自独立地为R2b，或相邻R2f和R2g一起任选地为键；
或可具有式：其中-Ar-为经0-6个独立R2a基团任选取代的6-14元亚芳基；
或可具有式：其中-Het-为经0-6个独立R2a基团任选取代的3-14元杂亚环基或杂亚芳基；
L2c为-(CR2aR2b)1-2-、-O-、-CO-、-NR2d-、-S-、 或其组合；
R2c为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基、烷氧基或芳基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基、烷氧基或芳基任选取代的C3-C8环烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；或R2c具有式：
R2d为H；卤素；羟基；氰基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C1-C6烷基；经卤素、羟基或烷氧基任选取代的C3-C8环烷基；芳基；杂芳基；或杂环基；
δ为0-6，均包括在内；
每个ε独立地为0-6，均包括在内；
ζ为0-6，均包括在内；
L1为C(Ra)、-(CR5R6)xC(Ra)-或P(Q2)；
Ra为H、烷基、烷氧基、-OH、-N(Q)Q或-SQ；
L2为-(CR5R6)x-、-C(O)-(CR5R6)x-、-(CR5R6)x-C(O)-、-(CR5R6)x-CR5＝CR5-(CR5R6)y-、-C(O)-(CR5R6)x-CR5＝CR5-(CR5R6)y-、-(CR5R6)x-CR5＝CR5-(CR5R6)y-C(O)-、-O-、-S-、-N(Q)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)-、-N(Q)C(O)-、-C(O)N(Q)-、-N(Q)C(O)O-、-OC(O)N(Q)-、S(O)，-N(Q)S(O)2N(Q)-、-S(O)2-、-N(Q)S(O)2-、-SS-、-O-N＝、＝N-O-、-C(O)-N(Q)-N＝、-N(Q)-N＝、-N(Q)-O-、-C(O)S-、亚芳基、杂亚芳基、环亚烷基或杂亚环基；
每个x可独立地为0-6，均包括在内；
每个y可独立地为0-6，均包括在内；
R3具有式： 或
Y1为烷基、环烷基、芳基、芳烷基或炔基，其中Y1经0-6个独立的Rn任选取代；
Y2为烷基、环烷基、芳基、芳烷基或炔基，其中Y2经0-6个独立的Rn任选取代；
Y3不存在，或如果存在，为烷基、环烷基、芳基、芳烷基或炔基，其中Y3经0-6个独立的Rn任选取代；
Y4不存在，或如果存在，为烷基、环烷基、芳基、芳烷基或炔基，其中Y4经0-6个独立的Rn任选取代；
或Y1、Y2和Y3中任两个和与之连接的N原子一起形成经0-6个独立的Rn任选取代的3-8元杂环；
或Y1、Y2和Y3全部和与之连接的N原子一起形成经0-6个独立的Rn任选取代的5-12元双环杂环；
每个Rn可独立地为H、卤素、氰基、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
L3为键、-N(Q)-、-O-、-S-、-(CR7R8)a-、-C(O)-或这些中任两者的组合；
L4为键、-N(Q)-、-O-、-S-、-(CR7R8)a-、-C(O)-或这些中任两者的组合；
L5为键、-N(Q)-、-O-、-S-、-(CR7R8)a-、-C(O)-或这些中任两者的组合；
每次出现的R7和R8独立地为H、卤素、氰基、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
或相邻碳原子上的两个R7基团可一起在其各自的碳原子之间形成双键；
或相邻碳原子上的两个R7基团和相同相邻碳原子上的两个R8基团可一起在其各自的碳原子之间形成三键；
或，来自L3、L4或L5中任一个的R7或R8取代基可任选与来自L3、L4或L5中任一个的R7或R8取代基一起形成3-8元环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
或Y1、Y2或Y3中的任一个可与来自L3、L4或L5中任一个的R7或R8基团和与之连接的原子一起形成3-8元杂环基；
每个a可独立地为0、1、2或3；
每次出现的R5和R6可独立地为H、卤素、氰基、羟基、氨基、烷基、烷氧基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基；
每个Q独立地为H、烷基、酰基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或杂环基；并且
每个Q2独立地为O、S、N(Q)Q、烷基或烷氧基。
在一些实施方案中，L1可为-C(R5R6)xC(Ra)-；或L1可为-CH2-C(Ra)-。L2可为-C(O)O-、-OC(O)-、-N(Q)C(O)-、-C(O)N(Q)-、-N(Q)C(O)O-、-OC(O)N(Q)-、-SS-、-O-N＝或＝N-O-。L2可为-C(O)O-、-OC(O)-、-SS-或＝N-O-。
在一些实施方案中，-L1a-(CR1aR1b)α-可为-(CH2)8-。-L2a-(CR2aR2b)δ-可为-(CH2)8-。L1b-(CR1aR1b)β可为CH2CH2CH2、CH＝CH-CH2或并且β为1、2或3。L2b-(CR2aR2b)ε可为CH2CH2CH2、CH＝CH-CH2或并且ε为1、2或3。
在式IE的化合物的一个实施方案中，化合物中存在的至少一个L1a、L1b、L1c、L2a、L2b或L2c为生物可降解基团，例如酯-C(O)O-、-OC(O)-、二硫化物(-S-S-)、-C(R5)＝N-、-O-C(O)O-、-C(O)N(R5)、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(O)(CR1aR1b)C(O)O-或-OC(O)(CR1aR1b)C(O)-。在式IE的化合物的另一实施方案中，化合物中存在的至少一个L1a、L1b和L1c为生物可降解基团并且化合物中存在的至少一个L2a、L2b或L2c为生物可降解基团(例如上面提到的生物可降解基团)。在式IE的化合物的又一实施方案中，R1中的α至少为4，R2中的δ至少为4，化合物中存在的至少一个L1a、L1b和L1c为生物可降解基团并且化合物中存在的至少一个L2a、L2b或L2c为生物可降解基团(例如上面提到的生物可降解基团)。在另一实施方案中，R1和/或R2中的碳链饱和。又一实施方案中，R1和/或R2中的碳链含有一个或两个双键。
又一实施方案中，所述阳离子脂质为选自式II-XXIII化合物的化合物：
及其盐(例如，其药学上可接受的盐)，
其中
m、n、o和p各自单独为1-25，条件是：
(i)式(II)、(IV)、(VI)和(VII)中，m和p均为4或更大；
(ii)在式(VIII)、(X)、(XII)、(XIV)、(XVI)、(XVIII)、(XXI)和(XXIII)中，m为4或更大；并且
(iii)在式(VIII)、(IX)、(XII)和(XIII)中，p为8或更大(例如，12或14或更大)。
在另一实施方案中，本发明涉及一种阳离子脂质或其盐，其具有：
(i)中心碳原子，
(ii)含有与所述中心原子直接结合的头基的氮，和
(iii)2个与所述中心碳原子直接结合的疏水尾，每个疏水尾包含与所述中心碳原子连接的C8或更大的脂族基(优选C14或更大的脂族基)，其中所述脂族基的其中一个或两个(a)被生物可降解基团中断，以致在所述生物可降解基团和所述中心碳原子之间有一条至少4个碳原子的链，或(b)包括在所述疏水尾末端的生物可降解基团。例如，所述生物可降解基团选自-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-和-OC(O)O-。
又一实施方案为包括本发明的阳离子脂质的脂质颗粒。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括如本文所述式II-XXIII中任一项的化合物。在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括如本文所述式I的化合物。在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括如本文所述式IA-1、IA-2、IB、IC、ID或IE的化合物。
在一个优选的实施方案中，所述脂质颗粒包括中性脂质、能够减少聚集的脂质、阳离子脂质和任选地，固醇(例如，胆固醇)。适合的中性脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、POPC、DOPE和SM。能够减少聚集的适合脂质包括但不限于PEG脂质，例如PEG-DMA、PEG-DMG或其组合。
所述脂质颗粒可进一步包括活性剂(例如，治疗剂)。活性剂可为核酸，例如质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、拮抗剂(antagomir)、适配体或核酶。
在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括本发明的阳离子脂质、中性脂质和固醇。所述脂质颗粒可进一步包括活性剂，例如核酸。
本发明的又一实施方案为包括本发明的脂质颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。
又一实施方案为在受试者体内递送核酸分子的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含所述核酸分子和阳离子脂质(或其盐)的脂质颗粒，所述阳离子脂质具有
(i)中心碳原子，
(ii)含有与所述中心原子直接结合的头基的氮，和
(iii)2个与所述中心碳原子直接结合的疏水尾，每个疏水尾包含与所述中心碳原子连接的C8或更大的脂族基(优选C14或更大的脂族基)，其中所述脂族基的其中一个或两个(a)被生物可降解基团中断，以致在所述生物可降解基团和所述中心碳原子之间有一条至少4个碳原子的链，或(b)包括在所述疏水尾末端的生物可降解基团。
在一个实施方案中，所述疏水尾在体内发生裂解后，所述阳离子脂质保持完整直到递送所述核酸分子为止。
又一方面为通过为细胞提供本发明的脂质颗粒调节靶基因在所述细胞中的表达的方法。所述活性剂可为选自质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、拮抗剂(antagomir)、适配体和核酶的核酸。
又一方面为通过向受试者提供本发明的药物组合物治疗受试者中特征在于多肽过表达的疾病或病症的方法，其中所述活性剂为选自siRNA、微RNA和反义寡核苷酸的核酸，并且其中所述siRNA、微RNA或反义寡核苷酸包括与编码所述多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。
又一方面为通过向受试者提供本发明的药物组合物治疗受试者中特征在于多肽表达不足的疾病或病症的方法，其中所述活性剂为编码所述多肽或其功能变异体或片段的质粒。
又一方面为通过向受试者提供本发明的药物组合物诱导受试者免疫反应的方法，其中所述活性剂为免疫刺激性寡核苷酸。
又一方面为包括上述组合物或脂质颗粒的转染剂，其中所述组合物或脂质颗粒包括核酸。当与细胞接触时，所述试剂可有效地将核酸递送至所述细胞。又一方面为通过获得或形成上述组合物或脂质颗粒，并且使所述组合物或脂质颗粒与细胞接触将核酸递送至细胞内部的方法。
从说明书和权利要求看，其它特征和方面将显而易见。
附图简述
图1是在如实施例14中所述施用脂质颗粒中的阳离子脂质后，随时间推移小鼠肝脏内阳离子脂质(化合物1-3和参考脂质)的浓度图。
图2示出了实施例14的化合物1和3的预期代谢途径。
图3是在如实施例14中所述施用脂质颗粒中的阳离子脂质后，随时间推移小鼠脾脏内阳离子脂质(化合物1-3和参考脂质)的浓度图。
图4是在如实施例14中所述施用脂质颗粒中的阳离子脂质后，随时间推移小鼠血浆内阳离子脂质(化合物1-3和参考脂质)的浓度图。
发明详述
一方面，本发明涉及包括中性脂质、能够减少聚集的脂质、阳离子脂质和任选地固醇的脂质颗粒。在某些实施方案中，所述脂质颗粒进一步包括活性剂(例如，治疗剂)。以下更详细地描述了这些脂质、脂质颗粒和包含脂质颗粒的组合物的各种示例性实施方案及其递送治疗剂和调节基因和蛋白质表达的用途。
阳离子脂质
在一个实施方案中，所述阳离子脂质为式I-XXIII的化合物。在另一实施方案中，所述阳离子脂质为式II-XXIII的化合物。在一个实施方案中，所述阳离子脂质为式I的化合物。在另一实施方案中，所述阳离子脂质为式IA-1、IA-2、IB、IC或ID的化合物。以下公开内容代表式I化合物的各种实施方案。
在一个实施方案中，M1和M2各自独立地为：
-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-OC(O)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-。
在另一实施方案中，M1和M2各自独立地为：
-OC(O)-、-C(O)-O-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-O-C(O)O-、-C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-。
又一实施方案中，M1和M2各自独立地为：
-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R5)＝N-、-C(R5)＝N-O-、-O-C(O)O-、-C(O)N(R5)-、-C(O)S-、-C(S)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-。
在另一实施方案中，M1和M2各自为-C(O)O-。
在一个实施方案中，R1和R2各自独立地为经任选取代的烷基、环烷基、环烷基烷基或杂环。在一个实施方案中，R1为烷基并且R2为烷基、环烷基或环烷基烷基。在一个实施方案中，R1和R2各自单独为烷基(例如，C1-C4烷基(例如甲基、乙基或异丙基))。在一个实施方案中，R1和R2均为甲基。在另一实施方案中，R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的杂环(例如，N-甲基哌嗪基)。在另一实施方案中，R1和R2其中一个为(例如，R1为前述两种基团之一而R2为氢)。
在一个实施方案中，R’为氢或烷基。在另一实施方案中，R’为氢或甲基。在一个实施方案中，R’不存在。在一个实施方案中，R’为不存在或甲基。
对于其中R’不可或缺的化合物而言，与R’连接的氮原子带正电荷，并且所述化合物也含有带负电的抗衡离子。抗衡离子也可为任何阴离子，例如有机或无机阴离子。阴离子的适当实例包括但不限于甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、α-甘油磷酸盐、卤化物(例如，氯化物)、硫酸盐、硝酸盐、重碳酸盐和碳酸盐。在一个实施方案中，抗衡离子为卤化物(例如，Cl)。
在一个实施方案中每个R独立地为-(CR3R4)-，其中R3和R4各自独立地为H或烷基(例如，C1-C4烷基)。例如，在一个实施方案中每个R独立地为-(CHR4)-，其中每个R4独立地为H或烷基(例如，C1-C4烷基)。在另一实施方案中，每个R独立地为-CH2-、-C(CH3)2-或-CH(iPr)-(其中iPr为异丙基)。在另一实施方案中，每个R为-CH2-。
在另一实施方案中R5在每种情况下为氢或甲基。例如，在每种情况下R5均可为氢。
在一个实施方案中，Q为不存在、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-。在一个实施方案中，Q为-C(O)O-。
在一个实施方案中，Q1和Q2各自独立地为不存在或-O-。例如，在一个实施方案中，Q1和Q2各自不存在。在另一实施方案中，Q1和Q2各自为-O-。
在一个实施方案中，连接Q的虚线不存在，b为0并且R’R1R2N-(R)a-Q-和与之(C*)相邻的叔碳形成下列基团：
其中n为1-4(例如，n为2)。
在一个实施方案中，连接Q的虚线不存在，b为0并且R’R1R2N-(R)a-Q-和与之相邻的叔碳形成下列基团：
其中n为1-4(例如，n为2)，并且R1、R2、R、a和b如关于式(I)所定义。在一个实施方案中，a为3。
在一个实施方案中，连接Q的虚线不存在，b为0并且R’R1R2N-(R)a-Q-和与之相邻的叔碳形成下列基团：
其中n为1-4(例如，n为2)，并且R1、R2、R、a和b如关于式(I)所定义。在一个实施方案中，a为0。例如，所述基团可为：
在一个实施方案中，b为0。在另一实施方案中，a为2、3或4而b为0。例如，在一个实施方案中，a为3而b为0。在另一实施方案中，a为3，b为0，而Q为-C(O)O-。
在一个实施方案中，式(I)的化合物具有下式：
式(IF)，其中R、R’、R1、R2、A1、A2、A3、A4、Q1、Q2、Q3、Q4、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q和r如本文公开的任何实施方案中所定义。
在式(IF)的化合物的另外的实施方案中，以下的一项或多项适用：
(i)Q1和Q2不存在；
(ii)M1和M2均为-C(O)O-；
(iii)g和h均为1；
(iv)g和h均为0；
(v)c和e总计为7；
(vi)d和f总计为7；
(vii)c、e和i总计为7；
(viii)d、f和j总计为7；
(ix)i和j各自为7；
(x)k和l均为1；
(xi)m和n均为0；
(xii)m和q总计为1或m和q总计为2；
(xiii)m和l总计为6；
(xiv)r和n总计为6；
(xv)p和o均为0；
(xvi)n和r总计为2或n和r总计为1；并且
(xvii)Q3为H。
在某些实施方案中，所述阳离子脂质中存在的生物可降解基团选自酯(例如，-C(O)O-或-OC(O)-)、二硫化物(-S-S-)、肟(例如，-C(H)＝N-O-或-O-N＝C(H)-)、-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-O-C(O)O-、-C(O)N(R5)、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、(NR5)C(S)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(S)O-、-OC(S)-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质其中一个或两个疏水尾中的脂族基包括至少一个碳-碳双键。
对于本发明的阳离子脂质(包括式(I)、IA-2、ID、IE和IF的化合物)而言，适合的胆固醇部分具有下式：
另外的实施方案包括具有头基、一个或多个疏水尾和在所述头基和所述一个或多个尾之间的连接子的阳离子脂质。头基可包括胺；例如具有所需pKa的胺。所述pKa可受脂质的结构，尤其是头基的特性影响；例如，官能团的存在、不存在和位置，所述官能团例如阴离子官能团、氢键供体官能团、氢键受体基团、疏水基(例如，脂族基)、亲水基(例如，羟基或甲氧基)或芳基。头基胺可为阳离子胺；伯胺、仲胺或叔胺；头基可包括1个胺基(一元胺)、2个胺基(二元胺)、3个胺基(三元胺)或更大数量的胺基，如同寡聚胺或多胺中一样。头基可包括碱性不如胺强的官能团，例如咪唑、吡啶或胍基。头基可为两性离子型。其它头基也适合。
所述一个或多个疏水尾可包括可相同或不同的两条疏水链。所述尾可为脂肪族，例如，所述尾可由碳和氢组成，饱和或不饱和，但是无芳香环。所述尾可为脂肪酸尾。一些此类基团包括辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、硬脂基、α-亚油烯基、亚麻油基、亚油烯基、γ-亚油醇基、花生酰基和油烯基。其它疏水尾也适合。
连接子可包括(例如)甘油酯连接子、无环甘油酯类似物连接子或环状连接子(包括螺环连接子、双环连接子和多环连接子)。所述连接子可包括功能团，例如醚、酯、磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯、磺酸酯、二硫化物、缩醛、缩酮、亚胺、腙或肟。其它连接子和官能团也适合。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质为外消旋混合物。在另一实施方案中，所述阳离子脂质富集呈一种非对映异构体，例如所述阳离子脂质有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％非对映异构体过量。又一实施方案中，所述阳离子脂质富集呈一种对映异构体，例如所述脂质有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％对映异构体过量。又一实施方案中，所述阳离子脂质为手性纯性，例如为单一光学异构体。又一实施方案中，所述阳离子脂质富集一种光学异构体。
存在双键(例如，碳-碳双键或碳-氮双键)时，双键周围的构型可存在异构现象(即，顺/反或E/Z异构现象)。在化学结构中说明了双键的构型时，应理解也可存在相应的异构体。存在的异构体的量可根据异构体的相对稳定性和异构体之间转化所需的能量而变化。因此，实际上一些双键仅在单一构型中存在，然而其它的(例如，其中相对稳定性相似并且转化能量低)可能作为构型不可分离的平衡混合物存在。
在一些情况下，不饱和双键可用不饱和环取代。不饱和环可为不饱和脂环族，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。在一些情况下，环状基团可为多环基团，例如双环基团或三环基团。双环基团可桥接、稠合，或具有螺环结构。
在一些情况下，双键部分可用环丙基部分取代，例如可用取代。例如，以下所示部分具有两个碳-碳双键，每个双键可独立地用环状部分取代，例如环丙基部分。因此，对于的取代基可包括：
再例如，对于的取代基包括：
再例如，对于的取代基包括：
再例如，对于的取代基包括：
所述阳离子脂质包括一个或多个生物可降解基团。所述生物可降解基团包括在生物环境中，例如在生物体、器官、组织、细胞或细胞器中可进行键断裂反应的一个或多个键。含有生物可降解键的官能团包括(例如)酯、二硫醇和肟。生物降解作用可以是当向受试者施用化合物时可影响化合物从体内清除的因素。可在基于细胞的测定中测量生物降解作用，其中向细胞暴露包括阳离子脂质的制剂，并且在不同时间点取样。可从细胞中提取出脂质成分并分离并且可用LC-MS分析。由LC-MS数据，可测量出生物降解速率(例如，t1/2值)。
例如，所述化合物
在每条脂肪链中包括酯连接键，所述酯连接键可在生物环境中进行水解，例如当暴露于(例如)脂肪酶或酯酶时。当然，所述化合物的结构影响化合物进行生物降解的速率。因此，预计相关化合物如
将展现出不同的生物降解速率。预计化合物在水解位点的结构变化将对所述速率产生更大影响。可影响水解速率并因此影响生物降解速率和从受试者体内清除的速率的一种修饰是使水解反应的离去基团具有伯醇，而非仲醇。
例如，希望不受理论约束，以上所示化合物1和2可如图2所示代谢。
在一个实施方案中，本文所述任何实施方案的阳离子脂质的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝脏、脾脏或血浆中)小于约3h，例如小于约2.5h，小于约2h，小于约1.5h，小于约1h，小于约0.5h或小于约0.25h。
在另一实施方案中，本文所述任何实施方案的含有生物可降解基团的阳离子脂质的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝脏、脾脏或血浆中)比没有生物可降解基团的相同阳离子脂质的体内半衰期小约10％(例如，小约7.5％、小约5％、小约2.5％)。
可方便地将一些阳离子脂质表示为与头基结合的疏水基。举例而言，所述化合物：
可认为是头基和疏水基的组合，如下：
因此，一些适合的头基包括表1所示基团：
表1
一些适合的疏水尾基包括表2所示基团：
表2
另一方面，本发明涉及一种制备式I-XXIII中任一项的化合物的方法。以下方案A-G中说明了适合的示例性合成方法。以下方案中的变量与以上式I-XXIII中相同位置的那些变量相同。
方案A中脂质链长度和连接子长度可改变。另外，可衍生化酯官能团上的R基团和氮原子上的取代基。
如方案B所示，铜介导的偶联获得了含有带末端官能团R的脂质链的二炔烃，可使二炔烃还原生成含有脂质链的二烯烃。可改变所述连接子和脂质链的长度，并且可衍生化所述官能取代基(R、R1、R2)。
其中Rx为烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳基或经取代的芳基，并且表1中定义了头基。
方案C中的头基可为本文公开的任何头基(见，例如表1)。
本发明阳离子脂质的实例包括以下表3-13中所示的阳离子脂质及其盐(包括其药学上可接受的盐)。
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
下列化合物可用作合成根据本发明所述的阳离子脂质的中间产物。
在一个实施方案中，本发明的阳离子脂质选自下列化合物及其盐(包括其药学上可接受的盐)。
阳离子脂质包括具有替代性脂肪酸基团和其它二烷基氨基的阳离子脂质，包括烷基取代基不同的阳离子脂质(例如，N-乙基-N-甲基氨基-、N-丙基-N-乙基氨基等)。对于R1和R2均为长链烷基、烯基、炔基或环烷基烷基的那些实施方案而言，它们可相同或不同。一般而言，具有欠饱和酰基链的脂质(例如，阳离子脂质)更易测量尺寸，尤其是当为了过滤灭菌，测量小于约0.3μm的复合物时。典型的是含有碳链长度在C10-C20范围之内的不饱和脂肪酸的阳离子脂质。其它支架也可用于分离氨基(例如，所述阳离子脂质的氨基)和阳离子脂质的脂肪酸或脂肪烷基部分。本领域的技术人员已知适合的支架。
在某些实施方案中，阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，以致所述脂质在生理pH(例如pH 7.4)或低于其的pH下带正电，而在第二pH下，优选在生理pH或以上时为中性。适合的脂质也称为阳离子脂质。当然应理解，根据pH添加或去除质子是一个平衡过程，并且提到带电或中性脂质指优势种类的特性并不需要全部脂质均以带电或中性形式存在。所述脂质也可具有一个以上的可质子化或可去质子化的基团，或可为两性离子型。
在某些实施方案中，可质子化脂质(即，阳离子脂质)的可质子化基团的pKa在约4至约11的范围之内。通常，脂质的pKa为约4至约7，例如在约5和7之间，例如当并入脂质颗粒中时在约5.5和6.8之间。此类脂质在更低pH配制阶段将为阳离子型，而颗粒在约pH 7.4的生理pH下将大部分(虽然并非完全)表面中性化。pKa在约4和7之间的范围内的好处之一是至少一些与颗粒外表面缔合的核酸在生理pH下将失去其静电相互作用并通过简单透析去除；从而大大降低了颗粒对清除的敏感性。例如，可通过使用荧光探针2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)，使用通过引用整体并入的Cullis等，(1986)Chem Phys Lipids 40，127-144中描述的方法进行脂质颗粒中脂质的pKa测量。
在特定实施方案中，所述脂质为带电脂质。如本文所使用，术语“带电脂质”旨在包括具有一条或两条脂肪酰基或脂肪烷基链和季氨头基的那些脂质。季胺携带永久正电荷。头基可任选地包括可电离基团，例如在生理pH下可质子化的伯胺、仲胺或叔胺。相对于在没有季胺(例如，季胺被叔胺代替)的结构相似的化合物中的基团的pKa，季胺的存在可改变可电离基团的pKa。在一些实施方案中，带电脂质称为“氨基脂质”。见，例如，2009年12月7日提交的临时美国专利申请61/267,419，其通过引用整体并入。
除以上特别描述的阳离子脂质外，在本文所述的脂质颗粒和组合物中也可包括在生理pH附近携带净正电荷的一种或多种另外的阳离子脂质。此类阳离子脂质包括但不限于N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2，3-二油烯基氧基)丙基-N，N-N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)；N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；1，2-二油烯基氧基-3-三甲基氨基氯丙烷盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)、双十八烷基氨基甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)、1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)、N，N-二甲基-2，3-二油烯基氧基)丙胺(“DODMA”)和N-(1，2-双十四烷氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(“DMRIE”)。另外，可使用阳离子脂质的许多商用制剂，例如LIPOFECTIN(包括可从GIBCO/BRL获得的DOTMA和DOPE)和LIPOFECTAMINE(包括可从GIBCO/BRL获得的DOSPA和DOPE)。在特定实施方案中，阳离子脂质为氨基脂质。
中性脂质
本文所述的脂质颗粒和组合物也可包括一种或多种中性脂质。存在时，中性脂质可为在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的许多脂质种类的任何一种。此类脂质包括(例如)二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、神经鞘磷脂、二氢神经鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。通常通过考虑(例如)血流中脂质体的尺寸和脂质体的稳定性指导选择用于本文所述颗粒的中性脂质。优选地，中性脂质组分是具有两个酰基的脂质(即，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。具有多个不同链长和饱和度的酰基链基团的脂质可用或可通过众所周知的技术分离或合成。在一组实施方案中，优选含有碳链长度在C10-C20的范围之内的饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方案中，使用具有碳链长度在C10-C20的范围之内的单或二不饱和脂肪酸的脂质。另外，可使用具有饱和和不饱和脂肪酸链混合物的脂质。优选地，所用中性脂质为DOPE、DSPC、POPC、DPPC或任何相关磷脂酰胆碱。中性脂质也可由神经鞘磷脂、二氢神经鞘磷脂或具有其它头基(例如丝氨酸和肌醇)的磷脂组成。
能够减少聚集的脂质
本文所述的脂质颗粒和组合物也可包括一种或多种能够减少聚集的脂质。形成期间减少颗粒聚集的脂质的实例包括聚乙二醇(PEG)修饰的脂质、单唾液神经节苷酯Gm1和聚酰胺寡聚物(“PAO”)，例如(通过引用整体并入的美国专利No.6,320,017中所述)。具有不带电荷的亲水性空间障碍部分，防止形成期间聚集的其它化合物，如PEG、Gm1或ATTA也可与脂质偶联。例如，在美国专利No.6,320,017中描述了ATTA-脂质，并且例如在美国专利No.5,820,873、5,534,499和5,885,613中描述了PEG-脂质缀合物，其各自通过引用整体并入。通常，为减少聚集所选择的脂质组分的浓度为约1-15％(按脂质的摩尔百分比计)。
可具有多个“锚定”脂质部分以将PEG部分固定在脂囊泡表面的经PEG修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)的具体实例包括经PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸，通过引用并入本文的美国专利No.5,820,873中描述的PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)，经PEG修饰的二烷基胺和经PEG修饰的1，2-二酰氧基丙-3-胺。特别优选经PEG修饰的二酰甘油和二烷基甘油。
在占用较大空间的部分例如PEG或ATTA与脂质锚缀合的实施方案中，脂质锚的选择取决于缀合物将与脂质颗粒缔合的类型。众所周知，mPEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)将保持与脂质体缔合，直至颗粒从循环中清除，可能约几天。其它缀合物，例如PEG-CerC20具有相似保持能力。然而，PEG-CerC14一旦接触血清将迅速交换到制剂外，在一些测定中T1/2小于60min。如美国专利No.5,820,873所说明，至少3种特性影响交换速率：酰基链的长度、酰基链的饱和度和空间障碍头基的尺寸。具有这些特征的适合变化的化合物可能有用。对于一些治疗应用而言，可优选用于经PEG修饰的脂质以从体内核酸-脂质颗粒中迅速失去并且因此经PEG修饰的脂质将具有相对较短的脂质锚。在其它治疗应用中，可优选用于核酸-脂质颗粒以展现出更长的血浆循环半衰期并且因此经PEG修饰的脂质将具有相对较长的脂质锚。
应当指出的是，防聚集化合物不一定需要脂质缀合才能正常作用。溶液中的游离PEG或游离ATTA可足以防止聚集。如果在配制后颗粒稳定，可在向受试者施用之前将PEG或ATTA透析掉。
脂质颗粒
再一方面，本发明涉及包括一种或多种本文所述的阳离子脂质的脂质颗粒。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括式I-XXIII的一种或多种化合物。在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括式II-XXIII的一种或多种化合物。在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括式I的一种或多种化合物。在另一实施方案中，所述脂质颗粒包括式IA-1、IA-2、IB、IC、ID或IE的化合物。
脂质颗粒包括但不限于脂质体。如本文所使用，脂质体为具有包裹含水内部的含脂膜的结构。脂质体可具有一层或多层脂质膜。脂质体可为单层，称为单层脂质体，或为多层，称为多层脂质体。当与核酸复合时，脂质颗粒也可为脂复合物，由夹在DNA层间的阳离子脂质双层组成。
脂质颗粒可进一步包含一种或多种另外的脂质和/或其它组分，例如胆固醇。其它脂质可包括在脂质体组合物中作多种用途，例如防止脂质氧化或使配体附于脂质体表面。许多脂质的任一种均可存在于脂质体中，包括两性、中性、阳离子和阴离子脂质。此类脂质可单独或组合使用。
在脂质颗粒中可存在的另外的组分包括双层稳定组分，例如聚酰胺寡聚物(见例如，美国专利No.6,320,017，其通过引用整体并入)、肽、蛋白质、洗涤剂、脂质衍生物，例如与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺缀合的PEG(见，美国专利No.5,885,613，其通过引用整体并入)。
在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括第二氨基脂质或阳离子脂质、中性脂质、固醇和选择用于减少形成期间脂质颗粒聚集的脂质中的一种或多种，聚集减少可由防止形成期间电荷诱导的聚集的颗粒空间稳定引起。
脂质颗粒可包括两种或更多种阳离子脂质。可选择脂质以赋予不同有利性质。例如，在脂质颗粒中可使用性质不同的阳离子脂质，所述性质例如胺pKa、化学稳定性、循环半衰期、在组织中的半衰期、在组织中的净积累量或毒性。特别的是，可挑选阳离子脂质以致混合脂质颗粒的性质比单独脂质的单一脂质颗粒的性质更合需要。
可通过挑选阳离子脂质的混合物而不选择指定制剂中的单一阳离子脂质以有利方式调节来自阳离子脂质的组织净积累量和长期毒性(如果有)。此类混合物也可提供更好的药物封装和/或释放。当与制剂中的单一实体相比时，阳离子脂质的组合也可影响系统稳定性。
在一个实例中，一系列结构相似的化合物可具有不同pKa值，跨度(例如)小于1个pKa单位，1-2个pKa单位的范围，或大于2个pKa单位的范围。在该系列中，可发现与pKa值在所述范围端部的化合物相比，在所述范围中间的pKa与有利性质增强(效率更高)或不利性质减少(例如，毒性降低)相关。在这种情况下，可选择pKa值在所述范围相对端的两种(或更多种)不同化合物一起用于脂质颗粒中。这样，脂质颗粒的净性质(例如，根据局部pH的电荷)可更接近于包括来自所述范围中间的单一脂质的颗粒。结构不同的阳离子脂质(例如，并非以上提到的结构相似的化合物系列的一部分)也可用于混合脂质颗粒中。
在一些情况下，两种或更多种不同阳离子脂质可具有大不相同的pKa值，例如相差3个或更多个pKa单位。在这种情况下，混合脂质颗粒的净行为将不一定模拟具有中间pKa的单一脂质颗粒的净行为。更确切地说，净行为可为具有两个pKa值不同的不同可质子化(或可去质子化，这视情况而定)位点的颗粒的净行为。在单一脂质的情况下，当pH从低于pKa到高于pKa时，实际上质子化的可质子化位点的分数急剧变化(当pH等于pKa值时，50％的位点质子化)。当可具有大不相同的pKa值(例如，相差3个或更多个pKa单位)的两种或更多种不同阳离子脂质结合成脂质颗粒时，pH变化时所述脂质颗粒可显示出从非质子化到质子化更缓慢的过渡。
在其它实例中，可基于其它因素选择两种或更多种脂质。例如，如果一种脂质本身非常有效但毒性中等，所述脂质可与不太有效但无毒的脂质结合。在一些情况下，甚至在可预测组合仅中等有效且毒性仅略低时，组合也可保持非常有效，但毒性大大降低。
可用实验可测特性的测量值，例如可赋值来自实验结果的数值的特性，指导选择。实验可测特性可包括安全性的量度、功效的量度、与预定生物分子相互作用的量度或pKa。
安全性的量度可包括存活率、LD50或与组织损伤相关的生物标记(例如血清生物标记)的水平(例如，肝脏的肝酶；肌肉的CPK；肾脏的离子平衡)。功效的量度可为表示治疗剂是否起效；特别是表示治疗剂是否产生所需效果和/或程度的任何测量，所需效果例如治疗、预防、缓解或以其它方式改善疾病、病症或其它临床情况。功效的量度可为间接量度；例如，如果想要治疗剂在细胞水平产生特殊作用，对细胞培养物的作用的测量可为功效的量度。与预定生物分子相互作用的量度可包括与特定蛋白质结合的Kd或性状的量度，与其它脂质相互作用的程度或范围，包括细胞形亚结构例如细胞膜、内体膜、核膜等。
可根据作用机制，例如脂质是否与预定生物分子相互作用，在何种条件下相互作用或其程度，选择阳离子脂质。例如，可挑选第一阳离子脂质，部分因为第一阳离子脂质与依赖ApoE的机制相关；可选择第二阳离子脂质，部分因为第二阳离子脂质与依赖ApoE的机制相关。
例如，脂质颗粒也可包括在(例如)WO 2009/086558和2008年10月9日提交的临时美国申请No.61/104,219(各自通过引用整体并入)中描述的阳离子脂质及其酯类似物的混合物。在另一实例中，脂质颗粒可包括脂质(例如，2010年1月29日提交的PCT/US10/22614中描述的脂质A)和脂质(例如，2009年5月5日提交的美国临时申请61/175,770中描述的式V或式VI的脂质)的混合物。
在某些实施方案中，使用对细胞类型或组织有特异性的靶向部分靶向脂质颗粒是可取的。先前已经描述了使用多个靶向部分，例如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和单克隆抗体靶向脂质颗粒(见，例如，美国专利No.4,957,773和4,603,044，其各自通过引用整体并入)。靶向部分可包含完整蛋白或其片段。靶向机制通常需要靶向试剂位于脂质颗粒的表面，这样靶部分可用于和靶标(例如，细胞表面受体)相互作用。本领域中已知多种不同靶向试剂和方法并且可用，包括(例如)在Sapra，P.和Allen，TM，Prog.LipidRes.42(5)：439-62(2003)；和Abra，RM等，J.Liposome Res.12：1-3，(2002)中描述的靶向试剂和方法。
已经提出使用具有亲水性聚合物链(例如聚乙二醇(PEG)链)表面涂层的脂质颗粒(即，脂质体)用于靶向(Allen等，Biochimica et Biophysica Acta 1237：99-108(1995)；DeFrees等，Journal of the American Chemistry Society 118：6101-6104(1996)；Blume等，Biochimica et Biophysica Acta 1149：180-184(1993)；Klibanov等，Journal ofLiposome Research 2：321-334(1992)；美国专利No.5,013556；Zalipsky，BioconjugateChemistry 4：296-299(1993)；Zalipsky，FEBS Letters 353：71-74(1994)；Zalipsky，在Stealth Liposomes中第9章(Lasic和Martin编辑)CRC Press，Boca Raton Fl(1995)。一种方法是，使用于靶向脂质颗粒的配体(例如抗体)与形成脂质颗粒的脂质的极性头基连接。另一种方法是，使靶向配体与形成亲水性聚合物涂层的PEG链的远端连接(Klibanov等，Journal of Liposome Research 2：321-334(1992)；Kirpotin等，FEBS Letters 388：115-118(1996))。
可使用偶联靶试剂的标准方法。例如，可使用可活化用于连接靶试剂的磷脂酰乙醇胺或衍生的亲脂性化合物，例如脂质衍生化博莱霉素(bleomycin)。可使用(例如)并入蛋白质A的脂质体构建抗体靶向脂质体(见，Renneisen等，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：2448-2451(1990))。美国专利No.6,027,726中公开了抗体缀合物的其它实例，其教导通过引用并入本文。靶向部分的实例也可包括对细胞组分有特异性的其它蛋白质，包括与赘生物或肿瘤相关的抗原。用作靶向部分的蛋白质可通过共价键与脂质体连接(见，Heath，Covalent Attachment of Proteins toLiposomes，149 Methods in Enzymology 111-119(Academic Press，Inc.1987))。其它靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白系统。
在一些实施方案中，所述脂质颗粒包括阳离子脂质和促融合脂质的混合物。所述脂质颗粒可进一步包括中性脂质、固醇、经PEG修饰的脂质或这些的组合。例如，所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质(例如，DPPC)和中性脂质，但是不包括固醇或经PEG修饰的脂质。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质和中性脂质，但是不包括固醇或经PEG修饰的脂质。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质和经PEG修饰的脂质，但是不包括固醇或中性脂质。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质、固醇和中性脂质，但是不包括经PEG修饰的脂质。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质、固醇和经PEG修饰的脂质，但是不包括中性脂质。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质、中性脂质和经PEG修饰的脂质，但是不包括固醇。所述脂质颗粒可包括阳离子脂质、促融合脂质、固醇、中性脂质和经PEG修饰的脂质。
在一个示例性实施方案中，所述脂质颗粒包含阳离子脂质、促融合脂质、中性脂质(除阳离子脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和经PEG修饰的脂质(例如，PEG-DMG或PEG-DMA)的混合物。在某些实施方案中，脂质混合物由或基本上由阳离子脂质、促融合脂质、中性脂质、胆固醇和经PEG修饰的脂质组成。在更多优选的实施方案中，所述脂质颗粒包括以上的脂质混合物，摩尔比为约20-70％阳离子脂质∶0.1-50％促融合脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，促融合脂质可以0.1-50％、0.5-50％、1-50％、5％-45％、10％-40％或15％-35％的摩尔比存在。在一些实施方案中，促融合脂质可以0.1-50％、0.5-50％、1-50％、5％-45％、10％-40％或15％-35％的摩尔比存在。在一些实施方案中，促融合脂质可以0.1-50％、10-50％、20-50％或30-50％的摩尔比存在。在一些实施方案中，促融合脂质可以0.1-50％、0.5-45％、1-40％、1％-35％、1％-30％或1％-20％的摩尔比存在。
在更多优选的实施方案中，所述脂质颗粒由或基本上由以上的脂质混合物组成，摩尔比为约20-70％阳离子脂质∶0.1-50％促融合脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％经PEG修饰的脂质。
在特定实施方案中，关于阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)的mol％，脂质摩尔比为约40/10/40/10、35/15/40/10或52/13/30/5；该混合物与摩尔比为0.1-50％、0.1-50％、0.5-50％、1-50％、5％-45％、10％-40％或15％-35％的促融合脂质进一步组合；换言之，当脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA的40/10/40/10混合物与摩尔比为50％的促融合肽组合时，所得的脂质颗粒的总摩尔比(阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA/促融合肽mol％)为20/5/20/5/50。在另一组实施方案中，这些组合物中的中性脂质DSPC用POPC、DPPC、DOPE或SM代替。
本文所述的脂质颗粒可进一步包括一种或多种治疗剂。因此，提供了包括脂质颗粒和活性剂的组合物，其中所述活性剂与脂质颗粒缔合。在特定实施方案中，所述活性剂为治疗剂。在特定实施方案中，所述活性剂封装在脂质颗粒的含水内部。在其它实施方案中，所述活性剂存在于脂质颗粒的一层或多层脂质中。在其它实施方案中，所述活性剂与脂质颗粒的外部或内部脂质表面结合。
如本文所使用，“完全封装”表示颗粒中的核酸在暴露于血清或会使游离核酸显著降解的核酸酶测定后并未显著降解。在完全封装系统中，在通常会使100％的游离核酸降解的处理中优选少于25％的颗粒核酸被降解，更优选少于10％和最优选少于5％的颗粒核酸被降解。可选地，可通过Oligreen测定确定完全封装。Oligreen是用于测定溶液中寡核苷酸和单链DNA量的超敏荧光核酸染料(可从Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA获得)。完全封装还表明，所述颗粒血清稳定，即在体内施用后所述颗粒不会迅速分解为其组成部分。
在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含本发明的阳离子脂质、中性脂质、固醇和经PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括按摩尔计约25％至约75％的阳离子脂质，例如按摩尔计约35至约65％，约45至约65％，约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括按摩尔计约0％至约15％的中性脂质，例如按摩尔计约3至约12％，约5至约10％，约15％、约10％、约7.5％、约7.1％或约0％。在一个实施方案中，所述中性脂质为DPPC。在一个实施方案中，所述中性脂质为DSPC。在一个实施方案中，所述制剂包括按摩尔计约5％至约50％的固醇，例如按摩尔计约15至约45％，约20至约40％，约48％、约40％、约38.5％、约35％、约34.4％、约31.5％或约31％。在一个实施方案中，所述固醇为胆固醇。
在一个实施方案中，所述脂质颗粒包括按摩尔计约0.1％至约20％的经PEG修饰的脂质，例如按摩尔计约0.5至约10％，约0.5至约5％，约10％、约5％、约3.5％、约1.5％、约0.5％或约0.3％。在一个实施方案中，经PEG修饰的脂质为PEG-DMG。在一个实施方案中，经PEG修饰的脂质为PEG-c-DMA。在一个实施方案中，按摩尔计，所述脂质颗粒包括25-75％的阳离子脂质、0.5-15％的中性脂质、5-50％的固醇和0.5-20％的经PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，按摩尔计，所述脂质颗粒包括35-65％的阳离子脂质、3-12％的中性脂质、15-45％的固醇和0.5-10％的经PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，按摩尔计，所述脂质颗粒包括45-65％的阳离子脂质、5-10％的中性脂质、25-40％的固醇和0.5-5％的经PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，经PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在一个实施方案中，经PEG修饰的脂质为PEG-联苯乙烯甘油(PEG-DSG)。
在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比例为至少约0.5∶1、至少约1∶1、至少约2∶1、至少约3∶1、至少约4∶1、至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约11∶1或至少约33∶1。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比例在约1∶1至约35∶1，约3∶1至约15∶1，约4∶1至约15∶1或约5∶1至约13∶1之间。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比例在约0.5∶1至约12∶1之间。
在一个实施方案中，所述脂质颗粒为纳米颗粒。在另外的实施方案中，所述脂质颗粒的平均直径尺寸为约50nm至约300nm，例如约50nm至约250nm，例如约50nm至约200nm。
在一个实施方案中，含有本文所述任一实施方案的阳离子脂质的脂质颗粒的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝脏、脾脏或血浆中)小于约3h，例如小于约2.5h，小于约2h，小于约1.5h，小于约1h，小于约0.5h或小于约0.25h。
在另一实施方案中，含有本文所述任一实施方案的阳离子脂质的脂质颗粒的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝脏、脾脏或血浆中)比没有生物可降解基团的相同阳离子脂质的体内半衰期小约10％(例如，小约7.5％、小约5％、小约2.5％)。
另外的组分
本文所述的脂质颗粒和组合物可进一步包括载脂蛋白。如本文所使用，术语“载脂蛋白”或“脂蛋白”指本领域技术人员已知的载脂蛋白及其变异体和片段并且指载脂蛋白激动剂、以下所述的其类似物或片段。
适合的载脂蛋白包括但不限于ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V和ApoE及其活性多晶型物、同种型、变异体和突变体以及片段或截断形式。在某些实施方案中，所述载脂蛋白是含硫醇的载脂蛋白。“含硫醇的载脂蛋白”指含有至少一个半胱氨酸残基的载脂蛋白、变异体、片段或同种型。最常见的含硫醇的载脂蛋白是含有一个半胱氨酸残基的ApoA-IMilano(ApoA-IM)和ApoA-IParis(ApoA-IP)(Jia等，2002，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：206-13；Bielicki和Oda，2002，Biochemistry 41：2089-96)。ApoA-II、ApoE2和ApoE3也是含硫醇的载脂蛋白。美国专利No.5,672,685；5,525,472；5,473,039；5,182,364；5,177,189；5,168,045；5,116,739中描述了分离的ApoE3和/或其活性片段和多肽类似物，包括其重组生成形式；其公开内容通过引用并入本文。Weisgraber等，″Human E apoproteinheterogeneity：cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence ofthe apo-E isoforms″，J.Biol.Chem.(1981)256：9077-9083；和Rall等，″Structuralbasis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type IIIhyperlipoproteinemic subjects″，Proc.Nat.Acad.Sci.(1982)79：4696-4700中公开了ApoE3。同样见基因库登录号K00396。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可呈其成熟形式，呈其前体原载脂蛋白形式或呈其原载脂蛋白形式存在。也可利用原ApoA-I和成熟ApoA-I(Duverger等，1996，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(12)：1424-29)、ApoA-I Milano(Klon等，2000，Biophys.J.79：(3)1679-87；Franceschini等，1985，J.Biol.Chem.260：1632-35)、ApoA-IParis(Daum等，1999，J.Mol.Med.77：614-22)、ApoA-II(Shelness等，1985，J.Biol.Chem.260(14)：8637-46；Shelness等，1984，J.Biol.Chem.259(15)：9929-35)、ApoA-IV(Duverger等，1991，Euro.J.Biochem.201(2)：373-83)和ApoE(McLean等，1983，J.Biol.Chem.258(14)：8993-9000)的同型二聚体或异源二聚体(可行时)。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的片段、变异体或同种型。术语“片段”指氨基酸序列比天然载脂蛋白的氨基酸序列更短的任何载脂蛋白和保持了天然载脂蛋白的活性(包括脂质结合性)的片段。“变异体”指载脂蛋白的氨基酸序列中的取代或改变，所述取代或改变，例如氨基酸残基的添加或缺失，并未消除天然载脂蛋白的活性，包括脂质结合性。因此，变异体可包含具有与本文提供的天然载脂蛋白大体相同的氨基酸序列的蛋白质或肽，其中一个或多个氨基酸残基经化学上相似的氨基酸保守性取代。保守性取代的实例包括至少一个疏水性残基的取代，例如用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一个。同样，例如，至少一个亲水性残基的取代，例如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间和甘氨酸和丝氨酸之间的取代(见美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166)为保守性取代。术语“同种型”指具有相同、更强或部分功能和相似、相同或部分序列的蛋白质，并且可能是或不是相同基因的产物并且通常具组织特异性(见Weisgraber 1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson和Powers 1991，J.Lipid Res.32(9)：1529-35；Lackner等，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等，1987，Cell 50(6)：831-40；Aviram等，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等，2000，Drug Metab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sacre等，2003，FEBS Lett.540(1-3)：181-7；Weers，等，2003，Biophys.Chem.100(1-3)：481-92；Gong等，2002，J.Biol.Chem.277(33)：29919-26；Ohta等，1984，J.Biol.Chem.259(23)：14888-93和美国专利No.6,372,886)。
在某些实施方案中，本文所述的脂质颗粒和组合物包括载脂蛋白的嵌合构建体。例如，载脂蛋白的嵌合构建体可由具有高脂质结合能力的载脂蛋白结构域和含有缺血再灌注防护性质的载脂蛋白结构域缔合组成。载脂蛋白的嵌合构建体可为在载脂蛋白中包括单独区域的构建体(即，同源构建体)或嵌合构建体可为在不同载脂蛋白之间包括单独区域的构建体(即，异源构建体)。包含嵌合构建体的组合物也可包括为载脂蛋白变异体的片段或设计为具有特定性状(例如，脂质结合、受体结合、酶、酶活化、抗氧化或还原-氧化性质)的片段(见Weisgraber 1990，J.Lipid Res.31(8)：1503-11；Hixson和Powers 1991，J.LipidRes.32(9)：1529-35；Lackner等，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等，1987，Cell50(6)：831-40；Aviram等，1998，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等，2000，DrugMetab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann 1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等，1995，J.Lipid Res.36(1)：80-8；Sorenson等，1999，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.19(9)：2214-25；Palgunachari1996，Arterioscler.Throb.Vasc.Biol.16(2)：328-38：Thurberg等，J.Biol.Chem.271(11)：6062-70；Dyer 1991，J.Biol.Chem.266(23)：150009-15；Hill 1998，J.Biol.Chem.273(47)：30979-84)。
利用的载脂蛋白还包括重组、合成、半合成或纯化的载脂蛋白。获得载脂蛋白或其等效物的方法在本领域中众所周知。例如，可通过(例如)密度梯度离心或免疫亲和色谱法从血浆或自然产物中分离载脂蛋白，或经合成、半合成生成或使用本领域人员已知的重组DNA技术生成(见，例如，Mulugeta等，1998，J.Chromatogr.798(1-2)：83-90；Chung等，1980，J.Lipid Res.21(3)：284-91；Cheung等，1987，J.Lipid Res.28(8)：913-29；Persson等，1998，J.Chromatogr.711：97-109；美国专利No.5,059,528、5,834,596、5,876,968和5,721,114；和PCT公布WO 86/04920和WO 87/02062)。
载脂蛋白进一步包括载脂蛋白激动剂，例如模拟ApoA-I、ApoA-IMilano(ApoA-IM)、ApoA-I Paris(ApoA-IP)、ApoA-II、ApoA-IV和ApoE的活性的肽和肽类似物。例如，所述载脂蛋白可为美国专利No.6,004,925、6,037,323、6,046,166和5,840,688中所述的任何载脂蛋白，其内容通过引用整体并入本文。
可使用本领域中已知用于肽合成的任何技术，包括(例如)美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166中描述的技术，合成或生产载脂蛋白激动肽或肽类似物。例如，可使用最初由Merrifield(1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)描述的固相合成技术制备所述肽。在Bodanszky等，Peptide Synthesis，John Wiley&Sons，第2版(1976)和本领域技术人员易于获得的其它参考文献中找到其它肽合成技术。在Stuart和Young，Solid PhasePeptide.Synthesis，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.，(1984)中可找到对多肽合成技术的总结。也可通过如The Proteins，第II卷，第3版，Neurath等编辑，第105-237页，Academic Press，New York，N.Y.(1976)中所述的解决方法合成肽。以上提及的文档以及McOmie，Protective Groups in Organic Chemistry，Plenum Press，New York，N.Y.(1973)中描述了用于不同肽合成的适当保护基。也可通过从(例如)载脂蛋白A-I的较大部分化学或酶促裂解制备所述肽。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的混合物。在一个实施方案中，所述载脂蛋白可为均匀混合物，即，单一类型的载脂蛋白。在另一实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的不均匀混合物，即，两种或更多种不同载脂蛋白的混合物。载脂蛋白的不均匀混合物的实施方案可包括(例如)来自动物来源的载脂蛋白和来自半合成来源的载脂蛋白的混合物。在某些实施方案中，不均匀混合物可包括(例如)ApoA-I和ApoA-I Milano的混合物。在某些实施方案中，不均匀混合物可包括(例如)ApoA-I Milano和ApoA-I Paris的混合物。用于本文所述方法和组合物的适合混合物对于本领域技术人员而言将显而易见。
如果从自然来源获得载脂蛋白，可从植物或动物来源获得。如果从动物来源获得载脂蛋白，所述载脂蛋白可来自任何物种。在某些实施方案中，可从动物来源获得载脂蛋白。在某些实施方案中，可从人类来源获得载脂蛋白。在优选的实施方案中，载脂蛋白源自与施用载脂蛋白的个体相同的物种。
本文所述的脂质颗粒和组合物可进一步含有脂质混合物的固醇组分。存在时，所述固醇可为在脂质体、脂囊泡或脂质颗粒制备领域中常规使用的固醇的任一种。在一个实施方案中，所述固醇为胆固醇。
本文所述的脂质颗粒和组合物可进一步包括阴离子脂质。适合用于脂质颗粒中的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油和与中性脂质连接的其它阴离子修饰基团。
在另外的实施方案中，在本文所述的脂质颗粒和组合物中还包括两性脂质。“两性脂质”指任何适合物质，其中脂质物质的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向含水相。此类化合物包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。代表性的磷脂包括神经鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。其它缺磷化合物，例如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰甘油和β-酰氧基酸也可使用。另外，此类两性脂质可容易地和其它脂质混合，例如三甘油酯和固醇。
也适于包含在本文所述脂质颗粒和组合物中的是可编程融合脂质或促融合脂质。在指定信号事件发生之前，此类脂质颗粒几乎不倾向于和细胞膜融合并递送其有效载荷。这使得脂质颗粒在注入生物体或疾病部位后，开始与细胞融合之前分布更均匀。所述信号事件可为(例如)pH、温度、离子环境或时间变化。促融合脂质可为(例如)如上所述式(I)的化合物。在一些情况下，所述信号事件可为pH变化，例如细胞外环境和细胞内环境之间，或细胞内环境和内体环境之间的pH差异。
当时间为信号事件时，融合延迟或“掩盖”组分，例如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物，可随时间推移交换到脂质颗粒膜外。到脂质颗粒在体内适当分布时，脂质颗粒已经失去了足够的掩盖剂以便具融合性。关于其它信号事件，可取的是选择与所述疾病部位或靶细胞相关的信号，例如炎症部位的温度升高。
活性(治疗)剂
本文所述的脂质颗粒和组合物可进一步包括一种或多种活性剂(例如，治疗剂)。如本文所使用，活性剂包括能够对细胞、组织、器官或受试者发挥所需作用的任何分子或化合物。例如，此类作用可为生物学、生理学或美容性作用。所述脂质颗粒和组合物可用于递送多种活性剂的任一种。活性剂可为核酸、肽、多肽(例如，抗体)、细胞因子、生长因子、凋亡因子、诱导分化因子、细胞表面受体及其配体、激素和小分子。适合的治疗剂还包括抗炎化合物、抗抑郁剂、兴奋剂、止痛剂、抗生素、避孕药物、退热剂、血管舒张药、抗血管生成剂、细胞血管剂、信号转导抑制剂、心血管药物，例如抗心律失常药、血管收缩药、激素和类固醇。本发明的脂质颗粒也可递送适配体。
在某些实施方案中，所述治疗剂为肿瘤药物，也可称为抗肿瘤药物、抗癌药物、肿瘤药物、抗肿瘤剂等。可使用的肿瘤药物的实例包括但不限于亚德里亚霉素(adriamycin)、左旋溶内瘤素(alkeran)、别嘌呤醇(allopurinol)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、araC、三氧化二砷、硫唑嘌呤、贝沙罗汀(bexarotene)、biCNU、博莱霉素、静脉用白消安(busulfan)、口服白消安、卡培他滨(capecitabine)(希罗达(Xeloda))、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CCNU、塞来昔布(celecoxib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环孢菌素A(cyclosporine A)、阿糖孢苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、柔红霉素(daunorubicin)、环磷酰胺(cytoxan)、柔红霉素、地塞米松(dexamethasone)、右雷佐生(dexrazoxane)、多西他赛(dodetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素、DTIC、表柔比星(epirubicin)、雌二醇氮芥(estramustine)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、依托泊苷和VP-16、依西美坦(exemestane)、FK506、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、5-FU、吉西他滨(gemcitabine)(健择(Gemzar))、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab-ozogamicin)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、羟基脲(hydrea)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、干扰素、伊立替康(irinotecan)(Camptostar，CPT-111)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、克拉屈滨(leustatin)、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、阿里维酸(litretinoin)、甲地孕酮(megastrol)、美法仑(melphalan)、L-PAM、美司那(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氮芥、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸(pamidronate)、培加酶(Pegademase)、喷司他丁(pentostatin)、卟吩姆钠(porfimersodium)、强的松(prednisone)、美罗华(rituxan)、链脲菌素(streptozocin)、STI-571、它莫西芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、VM-26、拓扑替康(topotecan)(和美新(Hycamtin))、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、ATRA、戊柔比星(valrubicin)、长春花碱(velban)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、VP16和长春瑞滨(vinorelbine)。可使用的肿瘤药物的其它实例为玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素(epothilone)、细胞内激酶抑制剂和喜树碱(camptothecin)。
在一个优选的实施方案中，所述活性剂为核酸，例如siRNA。例如，所述活性剂可为用目标产物编码的核酸，包括但不限于RNA、反义寡核苷酸、拮抗剂(antagomir)、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)(例如，为单链且长度为17-25个核苷酸的miRNA)、转运RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、抗原、其片段、蛋白质、肽、疫苗和小分子或其混合物。在一个更优选的实施方案中，所述核酸为寡核苷酸(例如，长度为15-50个核苷酸(或长度为15-30或20-30个核苷酸))。例如，siRNA可具有16-30个核苷酸长的双链体区。在另一实施方案中，所述核酸为免疫刺激性寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、supermir、miRNA模拟物或miRNA抑制剂。supermir指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或二者或其变体的单链、双链或部分双链的寡聚体或聚合体，其核苷酸序列与miRNA大体上相同并且相对于其靶标为反义核苷酸。miRNA模拟物代表可用于模仿一种或多种miRNA的基因沉默能力的一类分子。因此，术语“微RNA模拟物”指能够进入RNAi途径并调节基因表达的合成非编码RNA(即，miRNA并非从内源的miRNA源纯化获得)。
脂质-核酸颗粒中存在的核酸可呈任何形式。例如，所述核酸可为单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交物。双链RNA的非限制性实例包括siRNA。单链核酸包括(例如)反义寡核苷酸、核酶、微RNA和形成三链体的寡核苷酸。本发明的脂质颗粒也可递送与一个或多个配体缀合的核酸。
药物组合物
脂质颗粒，特别是与治疗剂缔合时，可配制为药物组合物，例如所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，例如生理盐水或磷酸盐缓冲液，根据施用途径和标准药学实践选择。
在某些实施方案中，描述了用于递送siRNA分子的组合物。这些组合物在下调蛋白质水平和/或靶蛋白的mRNA水平中有效。这些组合物的活性可受制剂中阳离子脂质的存在和阳离子脂质的摩尔比影响。
在特定实施方案中，根据标准技术制备包含脂质-核酸颗粒的药物组合物并且进一步包含药学上可接受的载体。通常，可采用生理盐水作为药学上可接受的载体。其它适合载体包括(例如)水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于提高稳定性的糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。在包含盐水或其它含有载体的盐的组合物中，优选在脂质颗粒形成之后添加载体。因此，在脂质-核酸组合物形成后，可将组合物稀释于药学上可接受的载体如生理盐水中。
可通过众所周知的常规灭菌技术为所得的药物制剂灭菌。然后可包装水溶液供使用或在无菌条件下过滤并且冻干，施用之前将冻干制剂与无菌水溶液合并。根据大概的生理条件，所述组合物可含有药学上可接受的辅助物，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等(例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等)。另外，脂悬浮液可包括保护脂质在储存时免于自由基和脂质过氧化损伤的脂质保护剂。亲脂性自由基猝灭剂(例如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(例如铁草胺)适合。
药物制剂中脂质颗粒或脂质-核酸颗粒的浓度可有很大变化，即从小于约0.01重量％，通常为或至少为约0.05-5重量％至高达10-30重量％并且将主要根据所选特定施用模式按流体体积、粘性等进行选择。例如，可提高浓度以降低与治疗相关的流体荷载。这在有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者中特别需要。可选地，可稀释由刺激性脂质构成的复合物以降低浓度来减轻施用部位的炎症。在一组实施方案中，核酸将具有附加标记并且将用于诊断(通过指示互补核酸的存在)。在这种情况下，施用复合物的量将取决于所用特定标记、诊断的疾病状态和临床医师的判断，但是通常将在约0.01和约50mg/kg体重之间，优选在每千克体重约0.1和约5mg/kg体重。
如以上所提到的，脂质-治疗剂(例如，核酸)颗粒可包括聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂、PEG-神经酰胺或神经节苷脂GM1修饰的脂质或对防止或限制聚集有效的其它脂质。添加此类组分不仅仅防止复合物聚集。更确切地说，添加此类组分还可提供增加循环半衰期和提高脂质-核酸复合物向靶组织的递送的方式。
脂质-治疗剂组合物也可以试剂盒形式提供。试剂盒通常由分隔用于容纳试剂盒的各种成分的容器组成。试剂盒将装有优选呈脱水或浓缩形式的颗粒或药物组合物及其再水合或稀释和施用的说明书。在某些实施方案中，所述颗粒包含活性剂，而在其它实施方案中，所述颗粒不含活性剂。
生产方法
例如，在国际公布No.WO 2010/054406、WO 2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054384、WO 2010/042877、WO 2010/129709、WO 2009/086558和WO 2008/042973中描述了制备阳离子脂质、含有阳离子脂质的脂质颗粒和含有阳离子脂质和/或脂质颗粒的药物组合物的方法，其各自通过引用整体并入。
例如，在美国公布No.2004/0142025、2006/0051405和2007/0042031中也描述了制备脂质颗粒和含有脂质颗粒的药物组合物的方法，其各自通过引用整体并入。另外，描述了制备脂质颗粒，包括与治疗剂(例如，核酸)缔合的脂质颗粒的方法。在本文所述的方法中，合并脂质混合物和核酸的缓冲水溶液以生成含有封装在脂质颗粒中的核酸的中间混合物。在一个实施方案中，封装核酸以约3wt％至约25wt％，优选5-15wt％的核酸/脂质比存在。所述中间混合物可为任选尺寸以获得脂质封装的核酸颗粒，其中脂质部分为单层囊泡，优选直径为30-150nm，更优选为约40-90nm。然后升高pH以中和脂质-核酸颗粒上至少一部分的表面电荷，从而提供至少部分表面中和的脂质封装的核酸组合物。
例如，在一个实施方案中，制备于有机溶液(例如，乙醇)中的一种或多种脂质(包括本文所述任一实施方案的阳离子脂质)的溶液。类似地，制备于缓冲水溶液(例如，柠檬酸盐缓冲液)中的一种或多种活性(治疗)剂(例如，一种siRNA分子或两种siRNA分子的1∶1摩尔混合物)的溶液。混合两种溶液并稀释以形成siRNA脂质颗粒的胶状悬浮液。在一个实施方案中，siRNA脂质颗粒的平均粒度为约80-90nm。在更多实施方案中，可通过0.45/2μm过滤器过滤分散体，浓缩并通过切向流过滤法渗滤。再一实施方案中，所得产物的浓度可调节为约2mg/mL。再一实施方案中，无菌过滤所述产物，在无菌条件下过滤并包装。如上所述，这些阳离子脂质中的几种是在低于氨基pKa的pH下带电而在高于所述pKa的pH下大体为中性的氨基脂质。这些阳离子脂质称为可滴定阳离子脂质并且可使用两步法用于制剂中。首先，可在较低pH下，在核酸的存在下用可滴定的阳离子脂质和其它囊泡组分形成脂质囊泡。这样，所述囊泡将封装并诱捕所述核酸。其次，可通过将介质的pH提高到高于存在的可滴定阳离子脂质的pKa的水平，即生理pH或更高水平来中和新形成的囊泡的表面电荷。这种方法特别有利的方面包括容易地去除了任何表面吸附的核酸和所生成的核酸递送媒介物具有中性表面。期望具有中性表面的脂质体或脂质颗粒避免从循环中迅速清除并且避免与阳离子脂质体制剂相关的某些毒性。通过引用并入本文的美国专利6,287,591和美国专利6,858,225中提供了关于此类可滴定阳离子脂质在核酸-脂质颗粒制剂中的用途的另外的详情。
进一步指出，以这种方式形成的囊泡提供了囊泡尺寸均匀、核酸含量高的制剂。另外，囊泡的尺寸范围可从约30至约150nm，更优选约30nm至约90nm。
不想要受任何特定理论约束，据信核酸封装的效率非常高是低pH下静电的相互作用的结果。在酸性pH(例如pH 4.0)下囊泡表面带电并且通过静电相互作用结合核酸的一部分。将外部酸性缓冲液换成更为中性的缓冲液(例如，pH 7.5)时，中和了脂质颗粒或脂质体的表面，从而使任何外部核酸被去除。在各种出版物(例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)中提供了有关配制方法的更多详细信息。
鉴于以上情况，描述了制备脂质/核酸制剂的方法。在本文所述的方法中，合并脂质混合物与核酸的缓冲水溶液以生成含有封装于脂质颗粒中的核酸的中间混合物，例如其中封装的核酸以约10wt％至约20wt％的核酸/脂质比存在。所述中间混合物可为任选尺寸以获得脂质封装的核酸颗粒，其中脂质部分为单层囊泡，优选直径为30-150nm，更优选为约40-90nm。然后升高pH以中和脂质-核酸颗粒上至少一部分的表面电荷，从而提供至少部分表面中和的脂质封装的核酸组合物。
在某些实施方案中，脂质混合物包括至少两种脂质组分：第一种脂质组分选自其pKa使得所述脂质在低于所述pKa的pH下为阳离子而在高于所述pKa的pH下为中性的脂质，而第二种脂质组分选自在脂质-核酸颗粒形成期间防止颗粒聚集的脂质。在特定实施方案中，氨基脂质为阳离子脂质。
在制备核酸-脂质颗粒时，脂质混合物通常为有机溶剂中的脂质溶液。然后在与含水缓冲液水合形成脂质体之前，可干燥这种脂质混合物以形成薄膜或冻干形成粉末。可选地，在一个优选的方法中，可使脂质混合物溶解于水溶性醇(例如乙醇)中，并且将这种乙醇溶液添加到含水缓冲液中，导致脂质体自发形成。在多数实施方案中，使用呈市场上可购买到的形式的醇。例如，乙醇可用作无水乙醇(100％)，或用作95％乙醇，其余的为水。在美国专利5,976,567中更详细地描述了这种方法。
在一个示例性实施方案中，脂质混合物为阳离子脂质、中性脂质(除阳离子脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和经PEG修饰的脂质(例如，PEG-DMG或PEG-DMA)于醇溶剂中的混合物。在优选的实施方案中，脂质混合物基本上由于醇(更优选乙醇)中的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和经PEG修饰的脂质组成。在更多优选的实施方案中，第一种溶液由以上的脂质混合物组成，摩尔比为约20-70％阳离子脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％经PEG修饰的脂质。还有更多优选的实施方案中，第一种溶液基本上由选自表1-5中所述脂质的阳离子脂质、DSPC、Chol和PEG-DMG或PEG-DMA的混合物组成，更优选摩尔比为约20-60％阳离子脂质∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-DMG或PEG-DMA。在特定实施方案中，脂质摩尔比为约40/10/40/10(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)。在另一组优选的实施方案中，这些组合物中的中性脂质用POPC、DPPC、DOPE或SM代替。
脂质混合物与可含有核酸的缓冲水溶液合并。缓冲水溶液通常是其中缓冲液的pH小于脂质混合物中可质子化脂质的pKa的溶液。适合缓冲液的实例包括柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐和MES。特别优选的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。优选的缓冲液具有1-1000mM范围的阴离子，这取决于封装核酸的化学结构，并且优化缓冲液浓度可对于达到高载荷水平而言很重要(见，例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225，其各自通过引用整体并入)。可选地，用氯化物、硫酸盐等酸化为pH 5-6的纯净水可用。在这种情况下，当透析颗粒以去除乙醇，提高pH或与药学上可接受的载体(例如生理盐水)混合时，可能适合添加5％葡萄糖或另一种将平衡跨过颗粒膜的渗透势的非离子溶质。缓冲液中核酸的量可改变，但通常为约0.01mg/mL至约200mg/mL，更优选为约0.5mg/mL至约50mg/mL。
合并脂质混合物和治疗性核酸的缓冲水溶液以提供中间混合物。中间混合物通常为具有封装核酸的脂质颗粒的混合物。另外，中间混合物也可含有一部分由于脂质颗粒表面带负电的核酸和带正电的脂质的离子吸引附于脂质颗粒(脂质体或脂质囊泡)表面的核酸(氨基脂质或构成可质子化第一脂质组分的其它脂质在pH低于脂质上可质子化基团的pKa的缓冲液中带正电)。在一组优选的实施方案中，脂质混合物为脂质的醇溶液并且调节每种溶液的体积以致一旦合并，所得醇含量为约20体积％至约45体积％。合并混合物的方法可包括多种工艺的任一种，通常取决于生产制剂的规模。例如，当总体积为约10-20mL或更小时，可将溶液合并于试管中并使用涡旋混合器一起搅拌。大规模工艺可在适合生产规模的玻璃器皿中进行。
任选地，可确定通过合并脂质混合物和治疗剂的缓冲水溶液生成的脂质封装治疗剂(例如，核酸)复合物的尺寸以获得所需尺寸范围和相对狭窄的脂质颗粒尺寸分布。优选地，本文提供的组合物的尺寸将确定为平均直径约70至约200nm，更优选约90至约130nm。有几种技术可用于将脂质体的尺寸确定为所需尺寸。通过引用并入本文的美国专利No.4,737,323中描述了一种尺寸确定方法。通过浴或探针声波处理超声处理脂质体悬浮液引起尺寸逐渐减小为尺寸小于约0.05μm的小单层囊泡(SUV)。均匀化是依赖于将大脂质体片段剪切为较小片段的能量的另一种方法。在典型均匀化过程中，多层囊泡再循环通过标准乳液均化器直至获得所选脂质体尺寸，通常观察到在约0.1至0.5μm之间。在两种方法中，可通过常规的激光束粒度测定监测粒度分布。对于本文的某些方法而言，可使用挤压法以获得均匀的囊泡尺寸。
挤压脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜产生相对明确定义的尺寸分布。通常，悬浮液循环通过膜一次或多次直至达到所需脂质体复合物尺寸分布。可相继挤压脂质体通过孔较小的膜，以实现脂质体尺寸的逐渐减小。在一些情况下，可使用形成的脂质-核酸组合物，而无需任何尺寸测量。
在特定实施方案中，方法进一步包括中和脂质-核酸组合物的脂质部分上的至少一些表面电荷的步骤。通过至少部分中和表面电荷，使未封装的核酸从脂质颗粒表面释放并且可使用常规技术从组合物中去除。优选地，通过交换缓冲溶液使未封装的和表面吸附的核酸从所得组合物中去除。例如，用HEPES缓冲盐水(HBS pH约7.5)代替柠檬酸盐缓冲液(pH约4.0，用于形成所述组合物)引起脂质体表面中和并且核酸从表面释放。然后可使用标准方法，通过色谱法去除释放的核酸，然后转移至pH高于所用脂质的pKa的缓冲液中。
任选地，可通过在含水缓冲液中水合形成脂质囊泡(即，脂质颗粒)并且在添加核酸之前使用上述任何方法测定尺寸。如上所述，含水缓冲液的pH应低于氨基脂质的pKa。然后可将核酸溶液添加到这些尺寸确定的预成型囊泡中。为使得核酸封装至“预成型”囊泡中，所述混合物应含有醇，例如乙醇。在为乙醇的情况下，应以约20％(w/w)至约45％(w/w)的浓度存在。另外，可能必须根据脂质囊泡的组成和核酸的性质，使含水缓冲液-乙醇混合物中预成型囊泡和核酸的混合物升温至约25℃至约50℃。对于本领域的普通技术人员而言显而易见的是，优化封装过程以在脂质囊泡中获得所需水平的核酸将需要控制诸如乙醇浓度和温度的变量。实施例中提供了核酸封装的适合条件的实例。一旦核酸被封装在预成型的囊泡中，就可提高外部pH以至少部分地中和表面电荷。然后可如上所述去除未封装的和表面吸附的核酸。
治疗方法
本文所述的脂质颗粒和组合物可用于多种目的，包括向体外和体内的细胞递送缔合或封装的治疗剂。因此，治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法可包括使所述受试者和与适合治疗剂缔合的脂质颗粒接触。
如本文所述，脂质颗粒对于递送核酸，包括(例如)siRNA分子和质粒特别有用。因此，可通过使细胞和与降低靶基因表达的核酸(例如，siRNA)或可用于增强所需蛋白质的表达的核酸(例如，编码所需蛋白质的质粒)缔合的脂质颗粒接触，将脂质颗粒和组合物用于调节体外和体内靶基因和蛋白质的表达。
脂质颗粒可用于向体外或体内细胞递送治疗剂。在特定实施方案中，所述治疗剂为核酸，使用核酸-脂质颗粒将其递送至细胞。虽然用与核酸-脂质颗粒有关的描述例证了使用脂质颗粒和有关药物组合物的各种方法的以下描述，但是应理解，可易于使这些方法和组合物适合于递送用于治疗将受益于此类治疗的任何疾病或病症的任何治疗剂。
在某些实施方案中，描述了将核酸引入细胞中的方法。用于引入细胞中的优选核酸为siRNA、免疫刺激性寡核苷酸、质粒、反义核苷酸和核酶。可通过在足以发生细胞内递送的时间内使所述颗粒或组合物与细胞接触实现这些方法。
所述组合物可被吸附至几乎所有细胞类型上。一经吸附，核酸-脂质颗粒就可被一部分细胞内吞，与细胞膜交换脂质或与细胞融合。转运或并入复合物的核酸部分可通过这些途径的任一种发生。不想受到限制，据信在通过胞吞作用将颗粒摄入细胞内的情况下，于是所述颗粒与内体膜相互作用，导致内体膜不稳定，可能是因形成非双层相引起，导致封装核酸引入细胞质内。类似地，在所述颗粒与细胞质膜直接融合的情况下，当发生融合时，脂质体膜整合至细胞膜中并且脂质体的内含物与细胞内流体合并。细胞与脂质-核酸组合物之间的接触，当在体外进行时，将在生物相容的介质中发生。组合物的浓度可根据特定应用广泛变化，但是通常在约1μmol和约10mmol之间。在某些实施方案中，通常在生理温度(约37℃)下用脂质-核酸组合物处理细胞约1-24h，优选约2-8h。对于体外应用而言，可向培养基中生长的任何细胞递送核酸，植物或动物来源的细胞、脊椎动物或无脊椎动物细胞和任何组织或类型的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞将为动物细胞，更优选为哺乳动物细胞并且最优选为人类细胞。
在一组实施方案中，向细胞密度为约103至约105个细胞/mL，更优选约2×104个细胞/mL的60-80％融合接种细胞中添加脂质-核酸颗粒。向所述细胞添加的悬浮液的浓度优选为约0.01-20μg/mL，更优选为约1μg/mL。
在另一实施方案中，脂质颗粒可用于将核酸递送至细胞或细胞系(例如，肿瘤细胞系)。此类细胞系的非限制性实例包括：HELA(ATCC目录号：CCL-2)、KB(ATCC目录号：CCL-17)、HEP3B(ATCC目录号：HB-8064)、SKOV-3(ATCC目录号：HTB-77)、HCT-116(ATCC目录号：CCL-247)、HT-29(ATCC目录号：HTB-38)、PC-3(ATCC目录号：CRL-1435)、A549(ATCC目录号：CCL-185)、MDA-MB-231(ATCC目录号：HTB-26)。
典型应用包括使用众所周知的程序提供siRNA的细胞内递送以敲除或使特定细胞靶标沉默。可选地，应用包括递送编码治疗有用的多肽的DNA或mRNA序列。这样，通过供给不足或缺乏的基因产物为遗传性疾病(即，为杜氏肌营养不良(Duchenne′s dystrophy)，见Kunkel等，Brit.Med.Bull.45(3)：630-643(1989)，和为囊肿性纤维化，见Goodfellow，Nature 341：102-103(1989))提供治疗。组合物的其它用途包括在细胞内引入反义寡核苷酸(见，Bennett等，Mol.Pharm.41：1023-1033(1992))。
可选地，使用本领域技术人员已知的方法也可将所述组合物用于向体内细胞递送核酸。关于DNA或mRNA序列的递送，通过引用并入本文的Zhu等，Science 261：209-211(1993)描述了使用DOTMA-DOPE复合物静脉内递送巨细胞病毒(CMV)-氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达质粒。通过引用并入本文的Hyde等，Nature362：250-256(1993)描述了使用脂质体向小鼠的呼吸道上皮细胞和肺泡递送囊性纤维化跨膜转导调节(CFTR)基因。通过引用并入本文的Brigham等，Am.J.Med.Sci.298：278-281(1989)描述了用编码细胞内酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)的功能性原核基因在体内转染小鼠肺部。因此，所述组合物可用于传染病的治疗中。
对于体内施用，优选经肠胃外，即经关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内施用药物组合物。在特定实施方案中，通过快速推注注射经静脉内或腹膜内施用药物组合物。例如，见Stadler等，美国专利No.5,286,634，其通过引用并入本文。在Straubringer等，Methods in Enzymology，Academic Press，New York.101：512-527(1983)；Mannino等，Biotechniques 6：682-690(1988)；Nicolau等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.6：239-271(1989)和Behr，Acc.Chem.Res.26：274-278(1993)中还讨论了细胞内核酸递送。例如，在Rahman等，美国专利No.3,993,754；Sears，美国专利No.4,145,410；Papahadjopoulos等，美国专利No.4,235,871；Schneider，美国专利No.4,224,179；Lenk等，美国专利No.4,522,803；和Fountain等，美国专利No.4,588,578中描述了施用基于脂质的治疗剂的更多其它方法。
在其它方法中，可通过将制剂直接敷用到组织上使药物制剂与靶组织接触。敷用可为局部、“开放式”或“封闭式”手术。“局部”指将药物制剂直接敷用到暴露于环境中的组织上，例如皮肤、口咽、外耳道等。“开放式”手术是包括切开患者的皮肤并且直接肉眼观察敷用药物制剂的下层组织的手术。这通常伴有外科手术，例如接近肺部的胸廓切开术、接近腹部内脏的剖腹术或对靶组织的其它直接手术方法。“封闭式”手术为侵入性手术，其中不可直接看到内部靶组织，但是通过在皮肤的小伤口中插入仪器接近内部靶组织。例如，可通过针灌洗向腹膜施用制剂。同样，在腰椎穿刺过程中可通过输注，接着如脊椎麻醉或甲泛葡胺(metrazamide)脊髓造影通常所实践那样，恰当定位患者向脑膜或脊髓施用药物制剂。可选地，可通过内窥镜装置施用制剂。
也可呈吸入肺部的气雾剂(见，Brigham等，Am.J.Sci.298(4)：278-281(1989))或通过在疾病部位直接注射(Culver，Human Gene Therapy，MaryAnn Liebert，Inc.，Publishers，New York。第70-71页(1994))施用脂质-核酸组合物。
脂质-治疗剂颗粒的剂量将取决于治疗剂与脂质的比例和责任医师基于患者年龄、体重和状况的意见。
在一个实施方案中，描述了调节靶多核苷酸或多肽的表达的方法。这些方法通常包括使细胞接触与能够调节靶多核苷酸或多肽的表达的核酸缔合的脂质颗粒。如本文所使用，术语“调节”指改变靶多核苷酸或多肽的表达。在不同实施方案中，调节可指提高或增强，或可指降低或减少。测量靶多核苷酸或多肽的表达水平的方法在本领域中已知并且可用，并且包括(例如)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化技术的方法。在特定实施方案中，与适当的对照值相比，靶多核苷酸或多肽的表达水平提高或降低至少10％、20％、30％、40％、50％或50％以上。
例如，如果需要提高多肽的表达，核酸可为包括编码所需多肽的多核苷酸的表达载体。另一方面，如果需要降低多核苷酸或多肽的表达，则核酸可为(例如)反义核苷酸、siRNA或微RNA，其包含与编码靶多肽的多核苷酸特异性杂交，从而破坏靶多核苷酸或多肽的表达的多核苷酸序列。可选地，核酸可为表达此类反义寡核苷酸、siRNA或微RNA的质粒。
在特定实施方案中，治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微RNA或反义RNA包含与编码所述多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体，以致所述多核苷酸的表达降低。
在其它实施方案中，核酸为编码所述多肽或其功能变异体或片段的质粒，以致所述多肽或其功能变异体或片段的表达提高。
在有关实施方案中，治疗受试者中特征在于多肽过表达的疾病或病症的方法包括为所述受试者提供药物组合物，其中所述治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微RNA或反义RNA包含与编码所述多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。
在一个实施方案中，药物组合物包含由或基本上由选自表1-5中所述脂质的阳离子脂质、DSPC、Chol和PEG-DMG或PEG-DMA的混合物组成的脂质颗粒，例如摩尔比为约20-60％阳离子脂质∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-DMG或PEG-DMA，其中脂质颗粒与治疗性核酸缔合。在特定实施方案中，脂质摩尔比为约40/10/40/10(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)、35/15/40/10(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)或52/13/30/5(mol％阳离子脂质/DSPC/Chol/PEG-DMG或PEG-DMA)。在另一组实施方案中，这些组合物中的中性脂质用POPC、DPPC、DOPE或SM代替。
在另一有关实施方案中，治疗受试者中特征在于多肽表达不足的疾病或病症的方法包括为所述受试者提供药物组合物，其中所述治疗剂为编码所述多肽或其功能变异体或片段的质粒。
一种诱导受试者免疫反应的方法可包括为所述受试者提供药物组合物，其中所述治疗剂为免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，免疫反应为体液或粘膜免疫反应。
在更多实施方案中，药物组合物与疫苗或抗原组合向受试者提供。因此，疫苗可包括脂质颗粒，所述脂质颗粒包含免疫刺激性寡核苷酸并且还与需要对其产生免疫反应的抗原缔合。在特定实施方案中，抗原为肿瘤抗原或与传染物缔合，例如病毒、细菌或寄生虫。
多种肿瘤抗原、传染物抗原和与其它疾病相关的抗原在本领域中众所周知并且在本文引用的参考文献中描述了这些抗原的实例。适合抗原的实例包括但不限于多肽抗原和DNA抗原。抗原的特定实例为甲型肝炎(Hepatitis A)、乙型肝炎(Hepatitis B)、天花、脊髓灰质炎、炭疽、流感、斑疹伤寒、破伤风、麻疹、轮状病毒、白喉、百日咳、肺结核和风疹抗原。在一个优选的实施方案中，抗原为乙型肝炎重组抗原。在其它方面，抗原为甲型肝炎重组抗原。另一方面，抗原为肿瘤抗原。此类肿瘤相关抗原的实例为MUC-1、EBV抗原和与伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)相关的抗原。又一方面，抗原是与酪氨酸酶有关的蛋白质肿瘤抗原重组抗原。本领域的技术人员将了解适合使用的其它抗原。
适合使用的肿瘤相关抗原包括可表示单一肿瘤类型的突变和非突变分子，在几种类型的肿瘤中共有，和/或与正常细胞相比在肿瘤细胞中特异表达或过表达。除蛋白质和糖蛋白外，还用文件证明了碳水化合物、神经节苷脂、糖脂和粘蛋白的肿瘤特异性表达模式。用于受试癌症疫苗中的示例性肿瘤相关抗原包括致癌基因、肿瘤抑制基因和具有对肿瘤细胞而言独特的突变或重排的其它基因的蛋白质产物、再活化胚胎基因产物、癌胚抗原、组织特异性(但非肿瘤特异性)分化抗原、生长因子受体、细胞表面受体碳水化合物残留物、外源病毒蛋白和许多其它自身蛋白。
肿瘤相关抗原的特定实施方案包括(例如)突变抗原，例如Ras p21原癌基因、肿瘤抑制因子p53和BCR-abl致癌基因的蛋白质产物以及CDK4、MUM1、半胱天冬酶8和β连环蛋白；过表达抗原，例如半乳糖凝集素4、半乳糖凝集素9、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA；癌胚抗原，例如α胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)；自体抗原，例如癌胚抗原(CEA)和黑素细胞分化抗原(例如Mart 1/Melan A、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2)；前列腺相关抗原，例如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2；再活化胚胎基因产物例如MAGE 1、MAGE 3、MAGE 4、GAGE 1、GAGE2、BAGE、RAGE和其它癌-睾丸抗原例如NY-ESO1、SSX2和SCP1；粘蛋白，例如Muc-1和Muc-2；神经节苷脂(例如GM2、GD2和GD3)、中性糖脂和糖蛋白(例如Lewis(y)和globo-H)；和糖蛋白，例如Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。本文还包括的肿瘤相关抗原为全细胞和肿瘤细胞溶解产物及其免疫原部分，以及用于抵抗B细胞淋巴瘤在B淋巴细胞单克隆增殖时表达的免疫球蛋白独特型。
病原体包括但不限于感染哺乳动物而且更特别地感染人类的传染物，例如病毒。传染性病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；和其它隔离病毒如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、鼻病毒、埃可病毒(echovirus))；杯状病毒科(例如，引起胃肠炎的病毒株)；披膜病毒科(例如，马脑脊髓炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，疱疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，疱疹性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒(ebola viruses))；副黏液病毒科(例如，副流行性感冒病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正黏病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒(Hantaan virus)、地瓜病毒、白蛉病毒(phlebovirus)和内罗病毒(Nairovirus))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原因子，丁型肝炎病毒因子(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷型卫星病毒)，非甲型、非乙型肝炎的病毒因子(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即，丙型肝炎))；诺沃克病毒(Norwalk virus)和相关病毒和星形病毒)。
同样，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌在脊椎动物体内作为抗原。此类革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德菌属(Pasteurella)、葡萄球菌属(Staphylococci)和链球菌属(Streptococcus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和沙门氏菌属属(Salmonella)。传染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋菌(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sps)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)、链球菌(Streptococcus)(绿色类)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧种类)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、致病性弯曲菌(pathogenic Campylobacter sp.)、肠球菌(Enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus infuenzae)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp.)、猪丹毒丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋菌(Treponema pallidium)、极细密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次体(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。
另外的病原体实例包括但不限于感染哺乳动物而且更特别地感染人类的传染性真菌。传染性真菌的实例包括但不限于：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白念珠菌(Candidaalbicans)。传染性寄生虫的实例包括疟原虫属(Plasmodium)，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)。其它传染性生物(即，原生生物)包括弓形虫(Toxoplasma gondii)。
在一个实施方案中，所述制剂可用于沉默化或调节靶基因，例如但不限于FVII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGF β基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活蛋白基因、Her2/Neu基因、SORT1基因、XBP1基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因、p53肿瘤抑制基因、p53家族成员DN-p63、pRb肿瘤抑制基因、APC1肿瘤抑制基因、BRCA1肿瘤抑制基因、PTEN肿瘤抑制基因、mLL融合基因、BCR/ABL融合基因、TEL/AML1融合基因、EWS/FLI1融合基因、TLS/FUS1融合基因、PAX3/FKHR融合基因、AML1/ETO融合基因、αv-整联蛋白基因、Flt-1受体基因、微管蛋白基因、人乳头瘤病毒基因、人乳头瘤病毒复制所需基因、人类免疫缺陷病毒基因、人类免疫缺陷病毒复制所需基因、甲型肝炎病毒基因、甲型肝炎病毒复制所需基因、乙型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒复制所需基因、丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒复制所需基因、丁型肝炎病毒基因、丁型肝炎病毒复制所需基因、戊型肝炎病毒基因、戊型肝炎病毒复制所需基因、己型肝炎病毒基因、己型肝炎病毒复制所需基因、庚型肝炎病毒基因、庚型肝炎病毒复制所需基因、辛型肝炎病毒基因、辛型肝炎病毒复制所需基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒复制所需基因、单纯疱疹病毒基因、单纯疱疹病毒复制所需基因、疱疹巨细胞病毒基因、疱疹巨细胞病毒复制所需基因、疱疹埃-巴二氏病毒(pstein Barr Virus)基因、疱疹埃-巴二氏病毒复制所需基因、卡波西肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)相关疱疹病毒基因、卡波西肉瘤相关疱疹病毒复制所需基因、JC病毒基因、JC病毒复制所需人类基因、粘液病毒基因、粘液病毒复制所需基因、鼻病毒基因、鼻病毒复制所需基因、冠状病毒基因、冠状病毒复制所需基因、西尼罗病毒(West Nile Virus)基因、西尼罗病毒复制所需基因、圣路易脑炎(St.LouisEncephalitis)基因、圣路易脑炎病毒复制所需基因、蜱传脑炎病毒基因、蜱传脑炎病毒复制所需基因、澳洲墨莱溪谷脑炎(Murray Valley encephalitis)病毒基因、澳洲墨莱溪谷脑炎病毒复制所需基因、登革热病毒基因、登革热病毒复制所需基因、猴病毒40(SimianVirus 40)基因、猴病毒40复制所需基因、人嗜T细胞淋巴病毒基因、人嗜T细胞淋巴病毒复制所需基因、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney-Murine Leukemia Virus)基因、莫洛尼鼠白血病病毒复制所需基因、脑心肌炎病毒基因、脑心肌炎病毒复制所需基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒复制所需基因、水痘带状疱疹病毒(Vericella zoster virus)基因、水痘带状疱疹病毒复制所需基因、腺病毒基因、腺病毒复制所需基因、黄热病病毒基因、黄热病病毒复制所需基因、脊髓灰质炎病毒基因、脊髓灰质炎病毒复制所需基因、痘病毒基因、痘病毒复制所需基因、疟原虫基因、疟原虫基因复制所需基因、溃疡分支杆菌(Mycobacteriumulcerans)基因、溃疡分支杆菌复制所需基因、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)基因、结核分支杆菌复制所需基因、麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)基因、麻风分支杆菌复制所需基因、金黄色葡萄球菌基因、金黄色葡萄球菌复制所需基因、肺炎链球菌基因、肺炎链球菌复制所需基因、酿脓链球菌基因、酿脓链球菌复制所需基因、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)基因、肺炎衣原体复制所需基因、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)基因、肺炎支原体复制所需基因、整联蛋白基因、选择蛋白基因、补体系统基因、趋化因子基因、趋化因子受体基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、前血小板碱性蛋白基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、离子通道组分的基因、神经递质受体的基因、神经递质配体的基因、淀粉样蛋白家族基因、早老蛋白基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、LOH细胞中存在的等位基因或多形基因的一个等位基因。
在另一实施方案中，本发明涉及一种递送核酸分子的方法，所述方法包括施用包含所述核酸分子和阳离子脂质的核酸脂质颗粒，所述阳离子脂质具有
(i)中心碳原子，
(ii)与所述中心原子直接结合的头基，和
(iii)2个与所述中心碳原子直接结合的疏水尾，每个疏水尾包含与所述中心碳原子连接的C14或更大的脂族基，其中所述脂族基(a)被生物可降解基团中断，以致在所述生物可降解基团和所述中心碳原子之间有一条至少4个碳原子的链，或(b)包括在所述疏水尾末端的生物可降解基团，以致所述疏水尾在体内发生裂解后，所述阳离子脂质保持完整直到递送所述核酸分子为止。
定义
如本文所使用，术语“阳离子脂质”包括具有一条或两条脂肪酸或脂肪族链和在生理pH下可质子化以形成阳离子脂质的氨基头基(包括烷基氨基或二烷基氨基)的阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质称为“氨基脂质”。
施用复合物是疾病或病症的有效治疗方案的受试者或患者优选为人，但是在临床试验或筛选或活性实验的情况下可为任何动物，包括实验动物。因此，本领域技术人员可易于认识到，本发明的方法、化合物和组合物特别适于向任何动物，特别是哺乳动物施用，所述哺乳动物包括但不限于人、家畜(例如猫科或犬科受试者)、农场动物(例如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪受试者)、野生动物(野外或动物园的动物)、研究动物(例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、猪、狗和猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸣鸟)，即供兽医使用。
以上通式中叙述的许多化学基团按特定顺序书写(例如，-OC(O)-)。其目的是，除非另外指出，应按提出的顺序将化学基团并入通式中。例如，除非另外指出，其中M1为-C(O)O-并且k为1的-(R)i-(M1)k-(R)m-形式的通式指-(R)i-C(O)O-(R)m-。应理解，当化学基团按特定顺序书写时，除非另外说明，还涵盖了相反顺序。例如在M1定义为-C(O)NH-的通式-(R)i-(M1)k-(R)m-(即，-(R)i-C(O)-NH-(R)m-)中，除非另外说明，还涵盖了M1为-NHC(O)-的化合物(即，-(R)i-NHC(O)-(R)m-)。
如本文所使用，术语“生物可降解基团”指包括在生物环境中，例如在生物体、器官、组织、细胞或细胞器中可进行键断裂反应的一个或多个键。例如，生物可降解基团可被哺乳动物(例如人)机体(例如，通过水解)代谢。一些含有生物可降解键的基团包括(例如)但不限于酯、二硫醇和肟。生物可降解基团的非限制性实例为-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-O-N＝C(R5)-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-OC(O)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-或-OC(O)(CR3R4)C(O)-。
如本文所使用，“脂肪族”基团是其中碳原子连接成链的非芳香族基团，并且饱和或不饱和。
术语“烷基”和“亚烷基”指直链或支链饱和烃部分。在一个实施方案中，烷基为直链饱和烃。除非另外说明，“烷基”或“亚烷基”基团含有1-24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基和正己基。代表性饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基和异戊基。
术语“烯基”指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃部分。在一个实施方案中，烯基含有1、2或3个双键并且不饱和。除非另外说明，“烯基”含有2-24个碳原子。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基和2，3-二甲基-2-丁烯基。
术语“炔基”指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃部分。除非另外说明，“炔基”含有2-24个碳原子。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。
术语“酰基”指经氢、烷基、部分饱和或完全饱和的环烷基、部分饱和或完全饱和的杂环、芳基或杂芳基取代的羰基。例如，酰基包括诸如以下的基团：(C1-C20)烷酰基(例如，甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基和叔丁基乙酰基)、(C3-C20)环烷基羰基(例如，环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基和环己基羰基)、杂环羰基(例如，吡咯烷基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶基羰基、哌嗪基羰基和四氢呋喃基羰基)、芳酰基(例如，苯甲酰基)和杂芳酰基(例如，苯硫基-2-羰基、苯硫基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、呋喃基-3-羰基、1H-吡咯基-2-羰基、1H-吡咯基-3-羰基和苯并[b]苯硫基-2-羰基)。
术语“芳基”指芳香族单环、双环或三环烃环系。除非另外说明，“芳基”含有6-14个碳原子。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和芘基。
术语“环烷基”和“环亚烷基”指饱和单环或双环烃部分，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。除非另外说明，“环烷基”或“环亚烷基”含有3-10个碳原子。
术语“环烷基烷基”指与烷基结合的环烷基，其中环烷基与分子的其余部分结合。
术语“杂环”(或“杂环基”)指非芳香族5-8元单环或7-12元双环或11-14元三环环系，所述环系饱和或不饱和，并且若为单环则含有1-3个杂原子，若为双环则含有1-6个杂原子，或若为三环则含有1-9个杂原子，所述杂原子独立地选自氮、氧和硫，并且其中氮和硫杂原子可任选氧化，并且氮杂原子可任选季铵化。例如，杂环可为环烷氧基。杂环可通过杂环中的任何杂原子或碳原子与分子的其余部分连接。杂环包括但不限于吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、成内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢苯硫基和四氢噻喃基。
术语“杂芳基”指芳香族5-8元单环、7-12元双环或11-14元三环环系，若为单环则具有1-3个杂原子，若为双环则具有1-6个杂原子或若为三环则具有1-9个杂原子，其中所述杂原子选自O、N或S(例如，碳原子和如果为单环、双环或三环则分别为1-3、1-6或1-9个N、O或S的杂原子)。本文所述的杂芳基基团还含有有共同碳-碳键的稠环。
除非另外指出，术语“经取代”指指定结构中一个或多个氢自由基被规定取代基的自由基置换，取代基包括但不限于：卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、硫醇、烷硫基、氧代、硫代氧基、芳基硫代基、烷基硫代烷基、芳基硫代烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基氨基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环和脂族基。应理解，所述取代基可经进一步取代。示例性取代基包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基和环状氨基化合物。
术语“卤素(halogen)”或“卤素(halo)”指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基胺”和“二烷基胺”分别指-NH(烷基)和-N(烷基)2基团。
术语“烷基磷酸盐”指-O-P(Q′)(Q″)-O-R，其中Q′和Q″各自独立地为O、S、N(R)2、经任选取代的烷基或烷氧基；并且R为经任选取代的烷基、ω-氨基烷基或ω-(取代的)氨基烷基。
术语“烷基硫代磷酸酯”指其中Q′或Q″中的至少一个为S的烷基磷酸酯。
术语“烷基膦酸酯”指其中Q′或Q″中的至少一个为烷基的烷基磷酸酯。
术语“羟基烷基”指-O-烷基。
术语“烷基杂环”指其中至少一个亚甲基经杂环置换的烷基。
术语“ω-氨基烷基”指-烷基-NH2基。并且术语“ω-(取代的)氨基烷基”指其中N上的至少一个H经烷基置换的ω-氨基烷基。
术语“ω-磷烷基”指-烷基-O-P(Q′)(Q″)-O-R，其中Q′和Q″各自独立地为O或S并且R为经任选取代的烷基。
术语“ω-硫代磷烷基”指其中Q′或Q″中的至少一个为S的ω-磷烷基。
本申请中使用了以下缩写：
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱；DPPC：1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸；POPC：1-棕榈酰基-2-油酰-sn-磷脂酰胆碱；DOPE：1，2-油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺；PEG-DMG通常指1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(例如，PEG 2000)；TBDPSCl：叔丁基二苯基氯硅烷；DMAP：二甲基氨基吡啶；NMO：N-甲基吗啉-N-氧化物；LiHDMS：双(三甲基硅烷基)氨基锂；HMPA：六甲基磷酰胺；EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；DIPEA：二异丙基乙胺；DCM：二氯甲烷；TEA：三乙胺；TBAF：四丁基氟化铵。
在一些实施方案中，所述方法可能需要使用保护基。对于本领域的技术人员而言保护基方法众所周知(见，例如，Protective Groups in Organic Synthesis，Green，T.W.等，Wiley-Interscience，New York City，1999)。简言之，保护基为降低或消除官能团的不必要反应性的任何基团。可将保护基添加到官能团上以在某些反应期间掩盖其反应性，然后去除以显露原官能团。在一些实施方案中使用“醇保护基”。“醇保护基”是降低或消除醇官能团的不必要反应性的任何基团。可使用本领域众所周知的技术添加和去除保护基。
可通过本文所述的至少一种技术或已知的有机合成技术制备所述化合物。
实施例
实施例1
化合物2：向化合物1(10.0g，18.8mmol，见国际公布No.WO2010/054406)于CH2Cl2(80mL)中的溶液添加三乙胺(7.86mL，56.4mmol)、DMAP(459mg，3.76mmol)和叔丁基(氯)二苯基硅烷(9.62mL，37.6mmol)。搅拌反应混合物24h。然后用CH2Cl2稀释混合物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤。分离有机层并且在无水Na2SO4上干燥。过滤并浓缩后，用硅胶柱色谱法(于己烷中的0-5％EtOAc)纯化粗产物以获得2(12.4g，16.1mmol，86％，Rf＝0.24，含己烷)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.66-7.68(m，4H)，7.33-7.42(m，6H)，5.30-5.39(m，4H)，3.67-3.72(m，1H)，1.97-2.04(m，8H)，1.07-1.42(m，52H)，1.05(s，9H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H)。
化合物3：向2(12.4g，16.1mmol)于叔丁醇(100mL)、THF(30mL)和H2O(10mL)中的溶液，添加4-甲基吗啉N-氧化物(4.15g，35.4mmol)和四氧化锇(41mg，0.161mg)。搅拌反应混合物16h，然后通过添加亚硫酸氢钠猝灭。通过蒸发去除溶剂后，用Et2O(500mL)和H2O(300mL)萃取残留物。分离有机层并且在无水Na2SO4上干燥。过滤并浓缩后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝1∶1，Rf＝0.49)纯化粗产物以获得3(12.7g，15.1mmol，94％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.66-7.68(m，4H)，7.33-7.43(m，6H)，3.67-3.73(m，1H)，3.57-3.62(m，4H)，1.82(t，J＝5.0Hz，4H)，1.10-1.51(m，60H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H)。
化合物4：向3(12.6g，15.0mmol)于1，4-二噁烷(220mL)、CH2Cl2(70mL)、MeOH(55mL)和H2O(55mL)中的溶液添加NaIO4(7.70g，36.0mmol)。在室温下搅拌反应混合物16h。用Et2O(500mL)和H2O(300mL)萃取混合物。分离有机层并且在无水Na2SO4上干燥。过滤并浓缩后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝9∶1，Rf＝0.30)纯化粗产物以获得4(7.98g，14.5mmol，97％)。C35H54NaO3Si(M+Na)+的分子量计算值为573.3740，真实值为573.3。
化合物7：在-20℃下向5(见，Tetrahedron，63，1140-1145，2006；1.09g，2.18mmol)于THF(20mL)和HMPA(4mL)中的溶液添加LiHMDS(1M THF溶液，4.36mL，4.36mmol)。在相同温度下搅拌所得混合物20min，然后冷却至-78℃。添加4(500mg，0.908mmol)于THF(4mL)中的溶液。搅拌混合物并使其升温至室温过夜。MS分析显示形成二酸(6；C53H85O5Si(M-H)-，计算值为829.6166，观测值为829.5)。向混合物中添加NaHCO3(1.10g，13.1mmol)和硫酸二甲酯(1.24mL，13.1mmol)并在室温下搅拌2h。通过添加饱和NH4Cl水溶液(50mL)猝灭反应，然后用Et2O(2×100mL)萃取。分离有机层并且在无水Na2SO4上干燥。过滤并浓缩后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝9∶1，Rf＝0.35)纯化粗产物以获得7(270mg，0.314mmol，35％)。C55H90NaO5Si(M+Na)+的分子量计算值为881.6455，真实值为881.6484。
化合物8：向7(265mg，0.308mmol)于THF(2.5mL)中的溶液添加n-TBAF(1M THF溶液，0.555mL，0.555mmol)。在45℃下搅拌反应混合物14h。浓缩后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝3∶1，Rf＝0.52)纯化粗产物以获得8(155mg，0.250mmol，81％)。C39H72NaO5(M+Na)+的分子量计算值为643.5277，真实值为643.5273。
化合物9：向化合物8(150mg，0.242mmol)和4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(49mg，0.290mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液，添加二异丙基乙胺(0.126mL，0.726mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(56mg，0.290mmol)和DMAP(6mg，0.0484mmol)。在室温下搅拌反应混合物14h。然后用CH2Cl2(100mL)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)洗涤。在MgSO4上干燥有机层，过滤并浓缩。用硅胶柱色谱法(0-5％于CH2Cl2中的MeOH)纯化粗产物以获得化合物9(121mg，0.165mmol，68％，Rf＝0.25，用5％于CH2Cl2中的MeOH显影)。C45H84NO6(M+H)+的分子量计算值为734.6299，真实值为734.5。
化合物10：于CH3CN和CHCl3中用CH3Cl处理化合物9可获得化合物10。
实施例2
化合物12：在-20℃下向11(见，J.Med.Chem.，38，636-46，1995；1.25g，2.58mmol)于THF(20mL)和HMPA(4mL)中的溶液，添加LiHMDS(1M THF溶液，2.58mL，2.58mmol)。在相同温度下搅拌混合物20min，然后冷却至-78℃。添加4(500mg，0.908mmol)于THF(9mL)和HMPA(0.9mL)中的溶液。搅拌混合物并使其升温至室温过夜。通过添加H2O(40mL)猝灭反应，然后用Et2O(150mL×3)萃取。分离有机层并且在无水Na2SO4上干燥。过滤并浓缩后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝9∶1，Rf＝0.35)纯化粗产物以获得12(136mg，0.169mmol，19％)。C51H82NaO5Si(M+Na)+的分子量计算值为825.5829，真实值为825.5。
使用13代替5，遵循对化合物7所述的类似程序以获得化合物12(135mg，0.168mmol，46％)。
化合物15/化合物16：向12(800mg，0.996mmol)于THF(5mL)中的溶液，添加n-TBAF(1M THF溶液，5mL，5.00mmol)。在45℃下搅拌反应混合物16h。浓缩后，用硅胶柱色谱法纯化混合物以获得15(己烷∶EtOAc＝3∶1，Rf＝0.46，372mg，0.659mmol，66％)和16(CH2Cl2∶MeOH＝95∶5，Rf＝0.36，135mg，0.251mmol，25％)。对于15C35H64NaO5(M+Na)+的分子量计算值为587.4651，真实值为587.4652；对于16C33H61O5(M+H)+的分子量计算值为537.4519，真实值为537.5。
化合物17：向化合物15(164mg，0.290mmol)和4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(58mg，0.348mmol)于CH2Cl2(5mL)中的溶液，添加二异丙基乙胺(0.152mL，0.870mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(67mg，0.348mmol)和DMAP(7mg，0.058mmol)。在室温下搅拌反应混合物14h。用CH2Cl2(100mL)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)洗涤。在MgSO4上干燥有机层，过滤并浓缩。用硅胶柱色谱法(0-5％于CH2Cl2中的MeOH)纯化粗产物以获得化合物17(158mg，0.233mmol，80％，Rf＝0.24，用5％于CH2Cl2中的MeOH显影)。C45H84NO6(M+H)+的分子量计算值为734.6299，真实值为734.5。
化合物18：于CH3CN和CHCl3中用CH3Cl处理化合物17可获得化合物18。
化合物19：向16(130mg，0.242mmol)于THF(2mL)和MeOH(2mL)中的溶液，添加三甲基硅烷化重氮甲烷(2M溶液，于Et2O中，0.158mL，0.315mmol)。搅拌反应混合物14h。蒸发后，用硅胶柱色谱法(己烷∶EtOAc＝3∶1，Rf＝0.50)纯化残留物以获得19(99mg，0.180mmol，74％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.29-5.40(m，4H)，4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.66(s，3H)，3.55-3.59(m，1H)，2.30(dd，J＝14.7，7.2Hz，4H)，1.98-2.07(m，8H)，1.60-1.68(m，4H)，1.23-1.43(m，37H)。
化合物20：向化合物19(95mg，0.168mmol)和4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(42mg，0.252mmol)于CH2Cl2(3mL)中的溶液添加二异丙基乙胺(0.088mL，0.504mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(48mg，0.504mmol)和DMAP(4mg，0.034mmol)。在室温下搅拌反应混合物14h。用CH2Cl2(100mL)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3水溶液(50mL)洗涤。在MgSO4上干燥有机层，过滤并浓缩。用硅胶柱色谱法(0-5％于CH2Cl2中的MeOH)纯化粗产物以获得化合物20(103mg，0.155mmol，92％，Rf＝0.19，用5％于CH2Cl2中的MeOH显影)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ5.29-5.40(m，4H)，4.83-4.89(m，1H)，4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.67(s，3H)，2.28-2.34(m，8H)，2.23(s，6H)，1.98-2.07(m，8H)，1.76-1.83(m，2H)，1.60-1.68(m，4H)，1.23-1.51(m，35H)。
化合物21：于CH3CN和CHCl3中用CH3Cl处理化合物20可获得化合物21。
实施例3：二醛中间产物4的替代合成
可如方案3所示，使用1-溴-9-癸烯合成二醛4。含有头基27的二醛可用于使用例如，维蒂希反应(Wittig reaction)合成末端酯取代的脂质。臭氧分解可获得二醛4和27。
实施例4：化合物8的替代合成
可如方案4所示合成化合物8。
化合物29：在0℃下使用滴液漏斗向NaH(于油中60％，82g，1.7096mol)于500mL无水DMF中的搅拌悬浮液缓慢添加化合物28(250g，1.7096mol)于1.5L DMF中的溶液。搅拌反应混合物30min，然后在氮气气氛下缓慢添加苄基溴(208.86mL，1.7096mol)。然后使反应升温至环境温度并搅拌10h。然后用碎冰(～2kg)猝灭混合物并且用乙酸乙酯(2×1L)萃取。用水(1L)洗涤有机层以去除多余的DMF，在Na2SO4上干燥并在真空中蒸发至干。在60-120硅胶上纯化粗化合物，用0-5％于DCM中的MeOH洗脱以获得呈浅黄色液体的化合物29(220g，54％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.24(m，5H)，4.49(s，2H)，3.63-3.60(m，2H)，3.47-3.43(m，2H)，1.63-1.51(m，4H)，1.39-1.23(m，8H)。
化合物30：将化合物29(133g，0.5635mol)溶于1.5L的DCM中，向该搅拌溶液添加CBr4(280.35g，0.8456mol)并且在惰性气体下使反应混合物冷却至0℃。然后按份数添加PPh3(251.03g，0.9571mol)，温度保持在20℃以下。完全添加后，在室温下搅拌反应混合物3h。反应完成后，通过过滤去除从反应混合物中沉淀的固体(PPh3O)，并且用碎冰(～1.5kg)稀释滤液并用DCM(3×750mL)萃取。分离有机层，在无水Na2SO4上干燥并在真空下蒸馏。使用0-5％于己烷中的乙酸乙酯作为洗脱系统在60-120目硅胶柱上用色谱法分离所得粗化合物以获得呈浅黄色液体的化合物30(150g，89％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.25(m，5H)，4.49(s，2H)，3.47-3.41(m，2H)，3.41-3.37(m，2H)，1.86-1.80(m，4H)，1.62-1.56(m，2H)，1.42-1.29(m，8H)。
化合物31：向新活化的Mg切屑(24.08g，1.003mol)添加200mL无水THF，接着在惰性气体下向混合物中添加少许碘。缓慢添加化合物30(150g，0.5016mol)于1L无水THF中的溶液，控制放热反应。然后加热反应1h至回流，再冷却至室温。然后缓慢添加甲酸甲酯(60.24g，1.0033mol)并且使反应持续2h。完成后，通过缓慢添加10％HCl，接着添加水(1L)猝灭反应并且用乙酸乙酯(3×1L)萃取。将有机层放入5L烧杯，用500mL甲醇稀释并冷却至0℃。向该溶液中，按份数添加过量NaBH4(～5个当量)以确保添加HCl不会使其裂解的甲酸酯水解。搅拌所得溶液1h，然后在真空下去除挥发性物质。将残留物放入水(1L)中并且用10％HCl溶液(pH 4)酸化。然后用乙酸乙酯(3×1L)萃取产物。然后在旋转蒸发器上干燥并浓缩有机相以获得呈固体的所需化合物31(57g，24％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.35-7.32(m，8H)，7.29-7.24(m，2H)，4.49(s，4H)，3.56(m，1H)，3.46-3.43(m，4H)，1.63-1.56(m，4H)，1.44-1.34(m，28H)。13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ＝138.56，128.21，127.49，127.34，72.72，71.76，70.37，37.37，29.64，29.56，29.47，29.33，26.07，25.54。
化合物32：将化合物31(56g，0.1196mol)溶于700mL无水THF中并冷却至0℃。在惰性气体下缓慢添加TBSCl(36.06g，0.2396mol)，接着添加咪唑(32.55g，0.4786mol)。然后在室温下搅拌反应18h。一旦完成，就用冰(～1kg)猝灭反应并且用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液洗涤以去除酸性杂质，在Na2SO4上干燥并减压蒸发以获得粗化合物，用硅胶(60-120目)纯化粗化合物并且用0-10％于己烷中的乙酸乙酯洗脱以获得呈淡黄色油的化合物32(60g，82％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.24(m，10H)，4.49(s，4H)，3.60-3.57(m，1H)，3.46-3.43(m，4H)，1.61-1.54(m，4H)，1.41-1.26(m，28H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
化合物33：将化合物32(60g，0.1030mol)溶于500mL乙酸乙酯中并且用N2排气20min。添加(10wt％)钯在碳(12g)并且在氢气气氛下搅拌反应18h。完成后，通过硅藻土床过滤混合物并且用乙酸乙酯洗涤。在真空下蒸发滤液以获得纯度足以用于下一合成序列中的化合物33(19g，46％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.64-3.58(m，5H)，1.59(br，2H)，1.57-1.51(m，4H)，1.38-1.22(m，28H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
化合物34：将化合物33(8.2g，0.0199mol)溶于100mL无水DCM中并冷却至0℃。在惰性气体下添加TEA(22.14mL，0.1592mol)。搅拌混合物5min后，滴加甲磺酰氯(4.6mL，0.059mol)并且再搅拌反应3h。反应完成后，用冰(～200g)猝灭混合物并且用DCM(3×75mL)萃取。在无水硫酸钠上干燥有机层并蒸发以获得粗化合物，使用0-30％于己烷中的乙酸乙酯作为洗脱系统在60-120目硅胶柱上纯化粗化合物以获得呈浅黄色液体的化合物34(8.2g，73％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝4.22-4.19(m，4H)，3.60-3.58(m，1H)，2.99(s，6H)，1.75-1.69(m，4H)，1.38-1.28(m，28H)，0.86(s，9H)，0.02(s，6H)。
化合物35：在0℃，在氮气气氛下向化合物34(8.2g，0.0146mol)于400mL干醚中的溶液按份数添加MgBr2·Et2O(22.74g，0.08817mol)。完全反应后，加热反应混合物28h至回流。反应完成后，通过过滤去除反应中形成的无机物质。蒸发滤液并且使用0-3％于己烷中的乙酸乙酯作为洗脱系统在60-120目硅胶柱上纯化所得的粗化合物以获得呈无色液体的化合物35(6.6g，85％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.61-3.58(m，1H)，3.41-3.37(t，4H，J＝6.8Hz)，1.87-1.80(m，4H)，1.42-1.25(m，24H)，0.87(s，9H)，0.012(s，6H)。
化合物36：将乙炔基三甲基硅烷(5.3mL，0.0378mol)于60mL无水THF中的溶液冷却至-78℃并且在惰性气体下缓慢添加1.4M于己烷中的n-BuLi(23mL，0.03405mol)。搅拌反应10min，然后添加HMPA(2.3g，0.01324mol)并且在0℃下搅拌所得混合物2h，然后冷却至-78℃。向该混合物中缓慢添加化合物35(5g，0.0094mol)于60mL无水THF中的溶液并在完全添加后，使反应升温至室温并保持18h。通过1HNMR监测反应进度。完成后，使反应混合物冷却至0℃并通过小心添加饱和NH4Cl溶液(50mL)，接着添加水(200mL)猝灭反应混合物。用己烷(3×250mL)萃取含水相。干燥有机层并且在真空下去除溶剂以获得无需进一步纯化而使用的化合物36(5g，94％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.62-3.56(m，1H)，2.21-2.17(m，4H)，1.49-1.47(m，4H)，1.37-1.26(m，24H)，0.87(s，9H)，0.13(s，18H)，0.021(s，6H)。
化合物37：向化合物36(5g，0.0088mol)于50mL甲醇中的搅拌溶液，添加一份K2CO3(6.1g，0.044mol)，并且在环境温度下搅拌所得混合物18h。然后在旋转蒸发器上去除挥发性物质并且用100mL水稀释粗混合物并用己烷(3×100mL)萃取。在Na2SO4上干燥有机层并且在真空下蒸发以获得无需进一步纯化而使用的化合物37(3.5g，97％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.60-3.58(m，1H)，2.19-2.14(m，4H)，1.93-1.92(m，2H)，1.54-1.49(m，4H)，1.37-1.27(m，24H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
化合物39：将化合物37(2.5g，0.00598mol)溶于25mL无水THF中并冷却至-40℃。缓慢添加n-BuLi(1.4M于己烷中，12.9mL，0.01794mol)，间隔10min后，接着缓慢添加HMPA(25mL)。在氮气气氛下将所得混合物保持在-40℃下30min。然后向冷却的反应混合物滴加化合物38(3.5g，1.01196mol)于25mL无水THF中的溶液。使所得混合物升温2h至室温，然后在室温下搅拌18h。然后通过添加饱和NH4Cl溶液(～50mL)猝灭混合物并且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取产物。在旋转蒸发器上去除溶剂并且使用0-3％于二氯甲烷中的乙酸乙酯作为洗脱系统，用(100-200目)硅胶柱纯化所得粗产物以获得呈黄色油的化合物39(0.9g，18％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝4.56-4.55(m，2H)，3.87-3.83(m，2H)，3.74-3.68(m，2H)，3.59-3.57(m，1H)，3.49-3.46(m，2H)，3.39-3.33(m，2H)，2.13-2.10(m，8H)，1.87-1.75(m，2H)，1.74-1.66(m，2H)，1.57-1.42(m，20H)，1.40-1.19(m，40H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
化合物40：向化合物39(504mg，0.598mmol)于10mL干醚中的溶液添加MgBr2·Et2O(926mg，3.59mmol)。搅拌反应混合物14h，然后通过添加饱和NaHCO3水溶液猝灭。用CH2Cl2萃取产物。在Na2SO4上干燥有机层，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物以获得化合物40(307mg，0.455mmol，76％，Rf＝0.36，用己烷∶EtOAc＝2∶1显影)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.59-3.66(m，5H)，2.14(t，J＝6.6Hz，8H)，1.21-1.59(m，52H)，0.88(s，9H)，0.03(s，6H)。
化合物41：向40(180mg，0.267mmol)于无水DMF(5mL)中的搅拌溶液添加重铬酸吡啶盐(603mg，1.60mmol)。搅拌反应混合物48h。用水(20mL)稀释后，用Et2O(3×40mL)萃取混合物。在Na2SO4上干燥有机层，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物以获得化合物41(53mg，0.075mmol，28％，Rf＝0.25，用CH2Cl2∶MeOH∶AcOH＝95∶4.5∶0.5显影)。C43H77O5Si(M-H)-的分子量计算值为701.5540，真实值为701.5。可通过TEMPO氧化合成该化合物。
化合物42：通过对化合物19所述的类似程序获得化合物42(23mg，0.032mmol，21％来自化合物40)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.67(s，6H)，3.59-3.62(m，1H)，2.30(t，J＝7.5Hz，4H)，2.13(t，J＝6.8Hz，8H)，1.27-1.64(m，48H)，0.88(s，9H)，0.03(s，6H)。
使用P-2镍条件还原可产生化合物43并且随后用TBAF去保护可获得化合物8。
实施例5：化合物8的替代合成
可如方案5所示合成化合物8。可将溴化物51转化为其格氏试剂(Grignardreagent)，然后与甲酸乙酯偶联以获得化合物52。随后的酸处理、氧化和还原可产生化合物8。
实施例6：化合物8的替代合成
可如方案6所示合成化合物8。可使化合物58、60或62的溴化物与甲酸乙酯反应以生成末端官能化二烯烃链。然后可使用标准化学反应由二烯烃链化合物制备化合物8。
实施例7
方案7：
8-苄氧基-辛-1-醇(2)的合成：
在0℃下使用滴液漏斗向NaH(60％于油中，82g，1.7096mol)于500mL无水DMF中的搅拌悬浮液缓慢添加化合物1(250g，1.7096mol)于1.5L DMF中的溶液。搅拌反应混合物30min，然后在氮气气氛下缓慢添加苄基溴(208.86mL，1.7096mol)。然后使反应升温至环境温度并搅拌10h。反应完成后，用碎冰(～2kg)猝灭混合物并用乙酸乙酯(2×1L)萃取。用水洗涤有机层以去除多余的DMF，在Na2SO4上干燥并且在真空下蒸发至干。在60-120硅胶上纯化粗产物，用0-5％于DCM中的MeOH洗脱以获得呈浅黄色液体的化合物2(220g，54％)。H1NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.24(m，5H)，4.49(s，2H)，3.63-3.60(m，2H)，3.47-3.43(m，2H)，1.63-1.51(m，4H)，1.39-1.23(m，8H)。
(8-溴-辛氧基甲基)-苯(3)的合成：将化合物2(133g，0.5635mol)溶于1.5L的DCM中，向该搅拌溶液中添加CBr4(280.35g，0.8456mol)并且在惰性气体下将反应混合物冷却至0℃。然后按份数添加PPh3(251.03g，0.9571mol)，温度保持在20℃以下并且在完全添加后，在室温下搅拌反应混合物3h。反应完成后，通过过滤分离从反应混合物中沉淀出的固体(PPh3O)并且用碎冰(～1.5kg)稀释滤液并用DCM(3×750mL)萃取。分离有机层，在无水Na2SO4上干燥并且在真空下蒸馏。使用0-5％于己烷中的乙酸乙酯作为洗脱系统在60-120目硅胶柱上用色谱法分离所得粗化合物以获得呈浅黄色液体的化合物3(150g，89％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.25(m，5H)，4.49(s，2H)，3.47-3.41(m，2H)，3.41-3.37(m，2H)，1.86-1.80(m，4H)，1.62-1.56(m，2H)，1.42-1.29(m，8H)。
1，17-二-苄氧基-十七烷-9-醇(4)的合成：
向新活化的Mg切屑(24.08g，1.003mol)添加200mL无水THF，接着在惰性气体下向混合物中添加少许碘。格氏试剂形成开始后，缓慢添加化合物3(150g，0.5016mol)于1L无水THF中的溶液，控制放热反应。完全添加后，加热反应1h至回流，再冷却至室温。然后缓慢添加甲酸甲酯(60.24g，1.0033mol)并且使反应持续2h。完成后，通过缓慢添加10％HCl，接着添加水(1L)猝灭反应并且用乙酸乙酯(3×1L)萃取。将有机层放入5L烧杯中，用500mL甲醇稀释并冷却至0℃。向该溶液中，按份数添加过量NaBH4(～5个当量)以确保添加HCl不会使其裂解的甲酸酯水解。搅拌所得溶液1h，然后在真空下去除挥发性物质。将残留物放入水(1L)中并且用10％HCl溶液(pH 4)酸化。然后用乙酸乙酯(3×1L)萃取产物。然后在旋转蒸发器上干燥并浓缩有机相以获得呈固体的化合物4(57g，24％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.35-7.32(m，8H)，7.29-7.24(m，2H)，4.49(s，4H)，3.56(m，1H)，3.46-3.43(m，4H)，1.63-1.56(m，4H)，1.44-1.34(m，28H)。C13 NMR(100MHz，CDCl3)：δ＝138.56，128.21，127.49，127.34，72.72，71.76，70.37，37.37，29.64，29.56，29.47，29.33，26.07，25.54。
[9-苄氧基-1-(8-苄氧基-辛基)-壬氧基]-叔丁基-二甲基-硅烷(5)的合成：
将化合物4(56g，0.1196mol)溶于700mL无水THF中并冷却至0℃。在惰性气体下缓慢添加TBS-Cl(36.06g，0.2396mol)，接着添加咪唑(32.55g，0.4786mol)。然后在室温下搅拌反应18h，然后用冰(～1kg)猝灭反应。用乙酸乙酯(3×500mL)萃取产物。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液洗涤以去除酸性杂质，在Na2SO4上干燥并减压蒸发以获得粗化合物，用硅胶(60-120目)纯化粗化合物并且用0-10％于己烷中的乙酸乙酯洗脱以获得呈淡黄色油的化合物5(60g，82％)。H1NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.33-7.24(m，10H)，4.49(s，4H)，3.60-3.57(m，1H)，3.46-3.43(m，4H)，1.61-1.54(m，4H)，1.41-1.26(m，28H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
9-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-十七烷-1，17-二醇(6)的合成：
将化合物5(60g，0.1030mol)溶于500mL乙酸乙酯中并且用N2排气20min。添加(10wt％)钯碳(12g)并且在氢气气氛下搅拌反应18h。完成后，通过硅藻土床过滤混合物并且用乙酸乙酯洗涤。在真空下蒸发滤液。这样获得的化合物6(19g，46％)纯度足以进行下一反应。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.64-3.58(m，5H)，1.59(br，2H)，1.57-1.51(m，4H)，1.38-1.22(m，28H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
9-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-十七烷二酸(7)的合成：
在0℃，在惰性气体下向6(2g，0.0049mol)于无水DMF(40mL)中的搅拌溶液添加重铬酸吡啶盐(2.7g，0.0074mol)。然后使反应混合物升温10-15min至室温并持续24h。然后，用水(100mL)稀释反应。使用DCM(3×40mL)萃取含水相。用盐水(1×25mL)洗涤有机相并在真空下浓缩以获得粗酸，然后使用0-30％于己烷体系中的乙酸乙酯，用(100-200目)硅胶柱纯化所述酸。获得呈浅黄色油的纯净产物(7)(0.7g，33％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝3.61-3.56(m，1H)，2.35-2.32(m，4H)，1.64-1.59(m，4H)，1.40-1.19(m，24H)，0.86(s，9H)，0.017(s，6H)；LC-MS[M+H]-431.00；HPLC(ELSD)纯度-96.94％。
二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十七烷二酯(8)的合成
将二酸7(0.42g，0.97mmol)溶于20mL二氯甲烷中并向其中添加顺-2-壬烯-1-醇(0.35g，2.44mmol)，接着添加Hunig碱(0.68g，4.9mmol)和DMAP(12mg)。向该混合物中添加EDCI(0.47g，2.44mmol)并且在室温下搅拌反应混合物过夜。然后用CH2Cl2(40mL)稀释反应混合物并用饱和NaHCO3(50mL)、水(60mL)和盐水(60mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层并且在真空下去除溶剂。用CombiflashRf纯化系统(40g硅胶，0-10％于CH2Cl2中的MeOH)纯化这样获得的粗产物以获得呈无色油的纯净产物8(0.35g，53％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.64(dt，J＝10.9，7.4Hz，2H)，5.58-5.43(m，2H)，4.61(d，J＝6.8Hz，4H)，3.71-3.48(m，1H)，2.30(t，J＝7.6Hz，4H)，2.20-1.98(m，4H)，1.71-1.53(m，4H)，1.31(ddd，J＝8.3，7.0，3.7Hz，34H)，1.07-0.68(m，14H)，0.02(s，5H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ178.18，139.81，127.78，81.73，81.42，81.10，76.72，64.59，41.52，41.32，38.76，36.09，34.10，33.93，33.80，33.70，33.59，33.55，33.26，31.95，30.34，29.69，29.58，29.39，27.01，22.56，18.48，0.01。
二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-羟基十七烷二酯(9)的合成
将甲硅烷基保护的二酯8(0.3g，0.44mmol)溶于1M TBAF于THF中的溶液(6mL)中并将溶液保存在40℃下2天。用水(60mL)稀释反应混合物并用乙醚(2×50mL)萃取。浓缩合并的有机层并且用柱纯化这样获得的粗产物以分离纯净产物(0.097g，39％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.64(dt，J＝10.9，7.4Hz，2H)，5.52(dt，J＝11.0，6.8Hz，2H)，4.61(d，J＝6.8Hz，4H)，3.57(s，1H)，2.30(t，J＝7.5Hz，4H)，2.09(q，J＝7.1Hz，4H)，1.75-1.53(m，4H)，1.53-1.06(m，36H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ173.98，135.64，123.57，77.54，77.22，76.91，72.14，60.41，37.69，34.54，31.89，29.70，29.60，29.44，29.29，29.07，27.76，25.80，25.15，22.82，14.29。
二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酯的合成
将醇9(0.083g，0.147mmol)溶于20mL二氯甲烷中并向其中添加二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.030g，0.176mmol)，接着添加Hunig碱(0.045g，0.44mmol)和DMAP(2mg)。向该混合物中添加EDCI(0.034g，0.176mmol)并且在室温下搅拌反应混合物过夜，并且TLC(硅胶，10％于CH2Cl2中的MeOH)显示原来的醇完全消失。用CH2Cl2(40mL)稀释反应混合物并且用饱和NaHCO3(50mL)、水(60mL)和盐水(60mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥合并的有机层并且在真空中去除溶剂。用Combiflash Rf纯化系统(40g硅胶，0-10％于CH2Cl2中的MeOH)纯化这样获得的粗产物以分离呈无色油的纯净产物(0.062g，62％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ5.74-5.58(m，2H)，5.51(dtt，J＝9.7，6.8，1.3Hz，2H)，4.95-4.75(m，1H)，4.61(d，J＝6.8Hz，4H)，2.35-2.24(m，8H)，2.22(d，J＝7.9Hz，6H)，2.09(q，J＝6.9Hz，4H)，1.83-1.72(m，2H)，1.60(dd，J＝14.4，7.2Hz，4H)，1.49(d，J＝5.7Hz，4H)，1.41-1.13(m，30H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。13CNMR(101MHz，CDCl3)δ173.72，173.36，135.40，123.35，74.12，60.18，58.95，45.46，34.30，34.11，32.45，31.67，29.38，29.35，29.17，29.07，28.84，27.53，25.28，24.93，23.16，22.59，14.06。C41H75NO6(MH+)的分子量计算值：678.04，真实值：678.5。
实施例8
以下更短的途径可用于合成本发明的化合物1。用镁处理商用9-溴壬-1-烯10以形成相应格氏试剂，所述格氏试剂与甲酸乙酯反应产生相应加成物11，用溴丁酰氯处理以提供溴酯12。用RuO4处理溴酯12提供二酸13。用二甲胺处理溴二酸13提供氨基二酸14。氨基二酸14与醇15偶联提供产率良好的产物。
十九烷-1，18-二烯-10-醇(11)的合成
向经火焰干燥的500mL圆底烧瓶，添加新活化的Mg切屑(9g)并且为烧瓶装备磁性搅拌棒、加料漏斗和回流冷凝器。为该装置排气并用氩气冲洗并通过注射器向烧瓶中添加100mL无水乙醚。将溴化物3(51.3g，250mmol)溶于无水乙醚(100mL)中并加入加料漏斗中。一边用力搅拌一边将约5mL这种乙醚溶液添加到Mg切屑中。注意放热反应(为确认/加速格氏试剂形成，添加5mg碘并观察到立即脱色，从而确认格氏试剂形成)并且乙醚开始回流。滴加剩余溴化物溶液，同时通过于水中冷却烧瓶保持在轻微回流下反应。完成添加后，将反应混合物保持在35℃下1h，然后于冰浴中冷却。将甲酸乙酯(9g，121mmol)溶于无水乙醚(100mL)中并转移至加料漏斗中，并且在搅拌的同时滴加至反应混合物中。观察放热反应并且反应混合物开始回流。反应开始后，如水流般迅速添加剩余的甲酸酯的醚溶液并且在环境温度下搅拌反应混合物另外1h。滴加10mL丙酮，接着滴加冰冷水(60mL)猝灭反应。用含水H2SO4(按体积计10％，300mL)处理反应混合物直至溶液变得均匀并且分层。用乙醚(2×200mL)萃取含水相。干燥(Na2SO4)并浓缩合并的乙醚层以获得粗产物，用柱(硅胶，0-10％于己烷中的乙醚)色谱法纯化粗产物。蒸发产物成分以提供呈白色固体的纯净产物11(30.6g，90％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.26(s，1H)，5.81(ddt，J＝16.9，10.2，6.7Hz，8H)，5.04-4.88(m，16H)，3.57(dd，J＝7.6，3.3Hz，4H)，2.04(q，J＝6.9Hz，16H)，1.59(s，1H)，1.45(d，J＝7.5Hz，8H)，1.43-1.12(m，94H)，0.88(t，J＝6.8Hz，2H)。13C NMR(101MHz，cdcl3)δ139.40，114.33，77.54，77.22，76.90，72.21，37.70，34.00，29.86，29.67，29.29，29.12，25.85。
十九烷-1，18-二烯-10-基4-溴丁酸酯(12)的合成
在0℃，在惰性气体下向醇11(5.6g，20mol)于无水DCM(300mL)中的溶液，缓慢且小心地添加溴丁酰氯(20mmol)。使反应混合物升温至室温，搅拌20h并用TLC(硅胶，10％于己烷中的乙酸乙酯)监测。一旦反应完成，就用水(400mL)稀释混合物并分离出有机层。然后用饱和NaHCO3溶液(1×400mL)洗涤有机相，接着用盐水(1×100mL)洗涤并且在真空下浓缩。然后用硅胶(100-200目)柱纯化粗产物，用2-3％于己烷溶液中的乙酸乙酯洗脱以产生6g(90％)呈无色液体的所需产物12。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.80(ddt，J＝16.9，10.2，6.7Hz，2H)，5.05-4.81(m，5H)，3.46(t，J＝6.5Hz，2H)，2.48(t，J＝7.2Hz，2H)，2.17(p，J＝6.8Hz，2H)，2.11-1.93(m，4H)，1.65-1.44(m，4H)，1.43-1.17(m，19H)。13C NMR(101MHz，cdcl3)δ172.51，139.37，114.35，77.54，77.23，76.91，74.86，34.31，33.99，33.01，32.96，29.65，29.56，29.24，29.09，28.11，25.52。
9-((4-溴丁酰基)氧基)十七烷二元酸(13)的合成
向溴酯12(12.1g，28.2mmol)于二氯甲烷(300mL)和乙腈(300mL)中的溶液，添加RuCl3(1.16g，5mol％)并且使混合物冷却至10℃，并滴加于水(400mL)中的偏高碘酸钠(60g)。在10℃下搅拌20h。用水稀释反应混合物，分层并且在搅拌的同时向有机层添加饱和盐水溶液，接着滴加3％硫化钠溶液以便脱色(深绿色变为浅黄色)。分层，在硫酸钠上干燥有机层并减压蒸发以获得纯净产物。C20H35BrO7的分子量计算值为467.39，真实值为465.4(M-2H)。
9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二元酸(14)的合成
将溴代酸13(2mmol)溶于2M二甲胺于THF(20mL)中的溶液中并向其中添加1g无水K2CO3，并且在50℃下于耐压瓶中加热混合物过夜。TLC显示反应完成。用醋酸酸化反应混合物并用水(100mL)稀释，并且用二氯甲烷(2×60mL)萃取。浓缩干燥合并的有机层并同样用于下一反应中。C23H43NO6的分子量计算值为429.59；真实值为430.6(MH)+。
二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酯的合成
如对8的合成所述将二酸14转化为相应二酯并且分析和光谱数据与产物的一致。
实施例9
在另一种方法中，使用以下合成方法合成本发明的化合物1。
方案9
实施例10：使用阳离子脂质衍生的脂质体进行FVII体内评估
C57BL/6小鼠(Charles River Labs，MA)通过尾静脉注射得到体积为0.01mL/g的盐水或于所需制剂中的siRNA。在施用后的不同时间点，通过吸入异氟烷麻醉动物并通过后眼窝放血将血液收集至血清分离管中。使用生色测定法(Coaset Factor VII，DiaPharmaGroup，OH或Biophen FVII，Aniara Corporation，OH)，根据生产商方法测定样品中因子VII蛋白的血清水平。使用从用盐水处理的动物收集的血清生成标准曲线。在估计肝脏mRNA水平的实验中，在施用后的不同时间点，处死动物并收获肝脏并且速冻于液氮中。将冷冻的肝脏组织研磨成粉。制备组织溶解产物并使用支链DNA测定法(QuantiGene Assay，Panomics，CA)测定因子VII和apoB的肝脏mRNA水平。
实施例11：使用体内啮齿动物因子VII沉默模型测定含有各种阳离子脂质的脂质颗粒制剂的功效
因子VII(FVII)，凝血级联的主要蛋白质，在肝脏(肝细胞)中合成并分泌至血浆中。可通过简单的基于板的比色测定法测定血浆中的FVII水平。正因如此，FVII表示用于测定siRNA介导的肝细胞源蛋白质的下调，以及监测核酸脂质颗粒和siRNA(例如表19中所示siRNA)的血浆浓度和组织分布的简便模型。
表19
小写字母为2′OMe修饰而Nf是经2′F修饰的核碱基，dT为脱氧胸苷，s为硫代磷酸酯。
使用如通过引用整体并入的国际专利公布No.WO 2010/088537中所述的在线混合法，将本文所述的阳离子脂质用于配制含有AD-1661双链体的脂质体。使用以下摩尔比配制脂质颗粒：50％阳离子脂质/10％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)/38.5％胆固醇/1.5％PEG-DMG(1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2，3-二肉豆蔻酰基甘油，PEG平均分子量为2000)。
C57BL/6小鼠(Charles River Labs，MA)通过尾静脉注射得到盐水或配制的siRNA。在施用后的不同时间点，通过后眼窝放血收集血清样品。使用生色测定法(BiophenFVII，Aniara Corporation，OH)测定样品中因子VII蛋白的血清水平。为测定因子VII的肝脏mRNA水平，处死动物并收获肝脏并且速冻于液氮中。由冷冻组织制备组织溶解产物并使用支链DNA测定法(QuantiGene Assay，Panomics，CA)量化因子VII的肝脏mRNA水平。
C57BL/6小鼠静脉(快速推注)注射48h后，对用FVII siRNA处理的动物评估FVII活性。使用商购的用于测定血清或组织中蛋白质水平的试剂盒，遵循生产商的说明在微孔板规模上测量FVII。对未经处理的对照小鼠测定到FVII减少，并且将结果表示为残留FVII％。在每种新型脂质体组合物的筛选中使用两个剂量水平(0.05和0.005mg/kg FVII siRNA)。
实施例12：使用预成型囊泡配制siRNA
使用预成型囊泡法制备含有阳离子脂质的颗粒。使阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质溶解于乙醇中，摩尔比分别为40/10/40/10。将脂质混合物添加到含水缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)中，混合至乙醇和脂质最终浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/mL，并且在挤压前使其在室温下平衡2min。在22℃下使用Lipex挤出机(Northern Lipids，Vancouver，BC)挤压水合脂质通过2台堆叠的孔径为80nm的过滤器(Nuclepore)，直至通过Nicomp分析测定获得70-90nm的囊泡直径。这通常需要1-3次。对于不形成小囊泡的一些阳离子脂质混合物而言，用较低pH的缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 3)使脂质混合物水合以质子化DSPC头基上的磷酸基团有助于形成稳定的70-90nm囊泡。
将FVII siRNA(溶解于50mM柠檬酸盐中，pH 4，含有30％乙醇的水溶液)添加到囊泡中，并预先平衡至35℃，速率为～5mL/min并混合。达到0.06(wt/wt)的最终靶siRNA/脂质比例后，在35℃下再培育混合物30min以使囊泡重组和封装FVII siRNA。然后去除乙醇并且通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl，3mM Na2HPO4，1mMKH2PO4，pH 7.5)置换外部缓冲液。在去除未封装的siRNA后使用尺寸排阻离心柱或离子交换离心柱测定封装siRNA与脂质的最终比例。
实施例13：在体内测定脂质制剂的功效
首先在0.1、0.3、1.0和5.0mg/kg下，对在7-9周龄、15-25g雌性C57Bl/6小鼠估计试验制剂的FVII敲除，每个处理组3只小鼠。所有研究均包括得到磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组)或基准制剂的动物。试验之前立即将制剂稀释于PBS中至适当浓度。为小鼠称重并计算适当的剂量体积(10μl/g体重)。通过尾侧静脉经静脉施用试验和基准制剂以及PBS(对于对照动物而言)。腹膜内注射氯胺酮(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine)24h后将动物麻醉并且通过心脏穿刺收集500-700μl血液至血清分离管(BD Microtainer)中。在15℃下2,000×g离心血液10min，收集血清并且在分析之前保存在-70℃下。在37℃下解冻血清样品30min，稀释于PBS中并等分至96孔测定板中。使用生色测定法(Biophen FVII试剂盒，HyphenBioMed)，根据生产商说明测定因子VII水平并且在装备有405nm波长滤波器的酶标仪中测量吸光度。定量血浆FVII水平并使用由来自对照动物的混合血浆样品生成的标准曲线计算ED50(与对照动物相比，引起血浆FVII水平降低50％的剂量)。在独立研究中，在更低剂量范围下再次试验那些显示出高FVII敲除水平(ED50＜＜0.1mg/kg)的目标制剂，以确认效力并确定ED50水平。
实施例14：测定小鼠体内脂质谱和组织清除率的研究
进行研究以测定根据本发明所述的阳离子脂质在小鼠体内的脂质谱和组织清除率。
将雄性小鼠(C57BL，20-30g)分为4组并且如下表20中所示(静脉)施用本发明的化合物1、2或3或参考脂质。
表20
小鼠未禁食。在给药后0.17、8、24、72、168、336和672h收集血液、肝脏和脾脏样品(每个组每个时间点2份样品)。
图1示出了随时间推移第I-IV组中每个组的小鼠的肝脏脂质浓度。以下表21中呈现了肝脏药代动力学数据。
表21
MRT代表平均滞留时间。NC代表未计算。
图2中示出了化合物1和3的预期代谢途径。测量了肝脏中这些代谢产物的浓度。结果示于下表22。24h后的所有测量(包括在施用后72、168、336和672h进行的测量)均低于量化水平(BLQ)。
表22
图3示出了随时间推移第I-IV组中每个组的小鼠的脾脏脂质浓度。下表23中呈现了脾脏药代动力学数据。
表23
测量了脾脏中化合物1-3代谢产物的浓度并将结果示于下表24中。
表24
图4示出了随时间推移第I-IV组中每个组的小鼠的血浆脂质浓度。下表25中呈现了血浆药代动力学数据。
表25
测量了血浆中化合物1-3代谢产物的浓度并将结果示于下表26中。24h后的所有测量(包括在施用后72、168、336和672h进行的测量)均低于量化水平(BLQ)。
表26
正如从图1、3、4和表22、24和26中可见，当与参考脂质比较时，本发明的化合物1、2和3表现出显著提高的组织清除率和活性。
根据以上详细描述可对实施方案进行这些和其它改变。一般而言，在下列权利要求中，不得将所用术语视为限制说明书和权利要求中公开的特定实施方案的权利，但是应视为包括所有可能的实施方案连同此授权权利要求的等同方案的全部范围。因此，权利要求不受公开内容限制。

Claims (25)

1.一种式IB的化合物
其中
R1和R2各自独立地为经任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基烷基或杂环；或
R1和R2和与之连接的氮原子一起形成经任选取代的杂环；
每次出现的R独立地为-(CR3R4)-；
每次出现的R3和R4独立地为H、OH、烷基、烷氧基、-NH2或烷基氨基；
Q为不存在或-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R5)C(O)-、-S-S-、-OC(O)O-、-O-N＝C(R5)-、-C(R5)＝N-O-、-OC(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-N(R5)C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-或-C(R5)＝N-O-C(O)-；
每次出现的R5独立地为H或烷基；a为1、2、3、4、5或6；
b为0、1、2或3；
R’为不存在、氢或烷基；
M1和M2各自独立地为-C(O)O-或-OC(O)-；
R9和R10每一个独立地为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基；并且
R11和R12每一个独立地为C4-C12亚烷基或C4-C12亚烯基，任选被COOR13封端，其中每个R13独立地为烷基；
条件是：
R9、M1和R11总长度为至少8个碳原子；并且
R10、M2和R12总长度为至少8个碳原子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中每次出现的R3和R4独立地为H或C1-C4烷基或二烷基氨基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R’为C1-C4烷基。
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R9、M1和R11总长度为12-24个碳原子。
5.根据权利要求1-3任一项所述的化合物，其中R10、M2和R12总长度为12-24个碳原子。
6.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述R’R1R2N-(R)a-Q-(R)b-基团为(CH3)2N-(CH2)3-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-NH-C(O)O-、(CH3)2N-(CH2)2-OC(O)-NH-或(CH3)2N-(CH2)3-C(CH3)＝N-O-。
7.选自下式的化合物：
及其盐，
其中
m、n和p各自独立地为1-25，q为1-12，条件是：
在式(II)、(IV)中，m和p均为4或更大。
8.选自下式的化合物：
或其盐。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物呈药学上可接受的盐的形式。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物呈阳离子脂质的形式。
11.一种脂质颗粒，其包含中性脂质、能够减少聚集的脂质和权利要求10所述的阳离子脂质。
12.根据权利要求11所述的脂质颗粒，其中所述中性脂质选自DSPC、DPPC、POPC、DOPE；所述能够减少聚集的脂质为PEG脂质；并且所述脂质颗粒进一步包含固醇。
13.根据权利要求12所述的脂质颗粒，其中所述阳离子脂质以20％和60％的摩尔百分比存在；所述中性脂质以5％至25％的摩尔百分比存在；所述固醇以25％至55％的摩尔百分比存在；并且所述PEG脂质为PEG-DMA、PEG-DMG或其组合，并且以0.5％至15％的摩尔百分比存在。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的脂质颗粒，其进一步包含活性剂。
15.根据权利要求14所述的脂质颗粒，其中所述活性剂为选自质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、antagomir、适配体和核酶的核酸。
16.根据权利要求11-13中任一项所述的脂质颗粒，其中所述脂质颗粒的体内半衰期(t1/2)小于3小时。
17.根据权利要求11-13中任一项所述的脂质颗粒，其中所述脂质颗粒的体内半衰期(t1/2)比含有相同阳离子而不含生物可降解基团的脂质的体内半衰期小10％，其中所述生物可降解基团是-C(O)O-或-OC(O)-。
18.一种药物组合物，其包含权利要求11-17中任一项所述的脂质颗粒和药学上可接受的载体。
19.一种调节靶基因在细胞中的表达的非治疗性方法，所述方法包括为所述细胞提供权利要求11-17中任一项所述的脂质颗粒。
20.权利要求18所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中特征在于多肽过表达的疾病或病症的药物中的用途，其中活性剂为选自siRNA、微RNA和反义寡核苷酸的核酸，并且其中所述siRNA、微RNA或反义寡核苷酸包括与编码所述多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。
21.权利要求18所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中特征在于多肽表达不足的疾病或病症的药物中的用途，其中活性剂为编码所述多肽或其功能变异体或片段的质粒。
22.权利要求18所述的药物组合物在制备用于诱导受试者免疫反应的药物中的用途，其中活性剂为免疫刺激性寡核苷酸。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述免疫刺激性寡核苷酸的靶基因选自因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活蛋白基因、Her2/Neu基因、SORT1基因、XBP1基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、小窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因和p53肿瘤抑制基因。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述靶基因含有一个或多个突变。
25.一种递送核酸分子的非治疗性方法，所述方法包括施用包含所述核酸分子和根据权利要求10所述的阳离子脂质的核酸脂质颗粒。
CN201180037927.7A 2010-06-03 2011-06-03 用于递送活性剂的生物可降解脂质 Active CN103096875B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35114610P 2010-06-03 2010-06-03
US61/351,146 2010-06-03
US201161489197P 2011-05-23 2011-05-23
US61/489,197 2011-05-23
PCT/US2011/039164 WO2011153493A2 (en) 2010-06-03 2011-06-03 Biodegradable lipids for the delivery of active agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103096875A CN103096875A (zh) 2013-05-08
CN103096875B true CN103096875B (zh) 2016-08-17

Family

ID=45067325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180037927.7A Active CN103096875B (zh) 2010-06-03 2011-06-03 用于递送活性剂的生物可降解脂质

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9012498B2 (zh)
EP (3) EP4481047A3 (zh)
JP (3) JP5893611B2 (zh)
KR (2) KR101967411B1 (zh)
CN (1) CN103096875B (zh)
AU (6) AU2011261247B2 (zh)
CA (1) CA2800401C (zh)
DK (1) DK2575764T3 (zh)
ES (1) ES2634087T3 (zh)
IL (3) IL300109A (zh)
MX (1) MX341332B (zh)
NZ (1) NZ605079A (zh)
SG (1) SG186085A1 (zh)
WO (1) WO2011153493A2 (zh)

Families Citing this family (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110045473A1 (en) * 2008-01-02 2011-02-24 De Fougerolles Antonin Liver screening method
LT3338765T (lt) 2009-12-01 2019-06-25 Translate Bio, Inc. Steroidiniai dariniai, skirti mrnr tiekimui, esant genetinėms ligoms
DK2575764T3 (en) * 2010-06-03 2017-08-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc BIODEGRADABLE LIPIDS FOR THE ACTIVATION OF ACTIVE AGENTS
EP2629802B1 (en) * 2010-10-21 2019-12-04 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP4458350A3 (en) 2011-06-08 2025-01-22 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
AU2012347605B2 (en) 2011-12-07 2017-09-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2013116126A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
DE18200782T1 (de) 2012-04-02 2021-10-21 Modernatx, Inc. Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen
US9402816B2 (en) 2012-04-19 2016-08-02 Sima Therapeutics, Inc. Diester and triester based low molecular weight, biodegradeable cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
CN104519915A (zh) 2012-06-08 2015-04-15 夏尔人类遗传性治疗公司 肺部递送mRNA至非肺靶细胞
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
WO2014008334A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Stable non-aggregating nucleic acid lipid particle formulations
CA2928520C (en) 2012-10-23 2023-03-14 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. Aptamers and uses thereof
US10942184B2 (en) 2012-10-23 2021-03-09 Caris Science, Inc. Aptamers and uses thereof
EP4331620A3 (en) 2012-12-07 2024-12-04 Translate Bio, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivery
US9687448B2 (en) 2012-12-07 2017-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid lipid particle formulations
US9939443B2 (en) 2012-12-19 2018-04-10 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Compositions and methods for aptamer screening
SG11201507391VA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Shire Human Genetic Therapies Cftr mrna compositions and related methods and uses
EP2970955B1 (en) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
US9522176B2 (en) 2013-10-22 2016-12-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. MRNA therapy for phenylketonuria
US11224642B2 (en) 2013-10-22 2022-01-18 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
US9365610B2 (en) * 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
CN105873902B (zh) 2013-11-18 2019-03-08 阿克丘勒斯治疗公司 用于rna递送的可电离的阳离子脂质
US20160367638A1 (en) 2013-12-19 2016-12-22 Crystal BYERS LEPTIN mRNA COMPOSITIONS AND FORMULATIONS
JP6571679B2 (ja) 2014-04-25 2019-09-04 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの精製方法
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
CN106573877B (zh) 2014-08-07 2021-04-13 武田药品工业株式会社 阳离子脂质
WO2016027699A1 (ja) * 2014-08-18 2016-02-25 日油株式会社 核酸送達のためのカチオン性脂質
AU2015364508A1 (en) 2014-12-18 2017-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ReversirTM compounds
CA2969664C (en) 2014-12-26 2022-06-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Cationic lipid
CA2975371C (en) * 2015-01-30 2024-02-13 Nof Corporation Cationic lipid for nucleic acid delivery
JP2018526321A (ja) 2015-04-27 2018-09-13 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 適応免疫応答を誘導するためのヌクレオシド修飾ｒｎａ
CN107922364B (zh) 2015-06-29 2021-12-31 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2017019636A1 (en) * 2015-07-24 2017-02-02 Insmed Incorporated Compositions and methods for the treatment of sarcoidosis
SMT202300052T1 (it) 2015-10-28 2023-05-12 Acuitas Therapeutics Inc Nuovi lipidi e for­mulazioni di nanoparticelle lipidiche per il rilascio di acidi nucleici
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2017186711A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 Invivogen Novel complexes of immunostimulatory compounds, and uses thereof
US10501416B2 (en) * 2016-06-24 2019-12-10 Eisai R&D Management Co., Ltd. Cationic lipid
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
US11542490B2 (en) 2016-12-08 2023-01-03 CureVac SE RNAs for wound healing
EP3551230A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 CureVac AG Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
US10526284B2 (en) 2016-12-21 2020-01-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US10383952B2 (en) 2016-12-21 2019-08-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
US11141476B2 (en) 2016-12-23 2021-10-12 Curevac Ag MERS coronavirus vaccine
EP3558355A2 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Henipavirus vaccine
EP3558354A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 CureVac AG Lassa virus vaccine
EP3568155A4 (en) 2017-01-11 2020-09-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA MODIFIED BY NUCLEOSIDE TO INDUCE AN IMMUNE RESPONSE AGAINST ZIKA VIRUS
CA3054062A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
JP7162021B2 (ja) 2017-03-17 2022-10-27 ニューカッスル ユニバーシティ 筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィン断片のアデノ随伴ウイルスベクター送達
KR20190133699A (ko) 2017-03-24 2019-12-03 큐어백 아게 Crispr-연관 단백질을 암호화하는 핵산 및 이의 용도
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
WO2018191719A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid delivery of therapeutic agents to adipose tissue
CA3061612A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
EP3630200A4 (en) 2017-05-31 2021-02-24 Arcturus Therapeutics, Inc. THERAPEUTICS FOR PHENYLKETONURIA
WO2018222890A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
TWI794237B (zh) 2017-05-31 2023-03-01 美商奧特吉尼克斯製藥公司 Iii 型糖原貯積病治療劑
BR112019028280A2 (pt) 2017-07-04 2020-07-14 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico
JP7429536B2 (ja) 2017-08-04 2024-02-08 協和キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
EP3668834B1 (en) 2017-08-17 2024-10-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019038332A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Curevac Ag VACCINE AGAINST BUNYAVIRUS
JP6826014B2 (ja) 2017-09-13 2021-02-03 株式会社東芝 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
EP3697912A1 (en) 2017-10-19 2020-08-26 CureVac AG Novel artificial nucleic acid molecules
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
CN111511924A (zh) 2017-11-08 2020-08-07 库瑞瓦格股份公司 Rna序列调整
MX389626B (es) 2017-11-17 2025-03-20 Cellix Bio Private Ltd Compuestos de pilocarpina con ácido lipoico para el tratamiento de trastornos oculares.
EP3723796A1 (en) 2017-12-13 2020-10-21 CureVac AG Flavivirus vaccine
WO2019131580A1 (ja) 2017-12-27 2019-07-04 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 カチオン性脂質
EP3733211A4 (en) 2017-12-27 2021-11-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited LIPID NANOPARTICLE CONTAINING NUCLEIC ACID AND USE OF THE SAME
WO2019193183A2 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Curevac Ag Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
DE202019006108U1 (de) 2018-04-17 2024-12-16 CureVac SE Neue RSV-RNA-Moleküle und Zusammensetzungen für die Impfung
AU2019278985A1 (en) 2018-05-30 2020-12-17 Translate Bio, Inc. Vitamin cationic lipids
WO2020002525A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Curevac Ag Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
EP3842412B1 (en) 2018-08-21 2024-04-24 Kabushiki Kaisha Toshiba Biodegradable lipids for delivery of active compounds into tumor cells comprising two or more tertiary amino groups
EP3841208A1 (en) 2018-08-24 2021-06-30 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
MX2021003158A (es) 2018-09-18 2021-07-16 Nikang Therapeutics Inc Derivados de anillo tricíclico condensado como inhibidores de la fosfatasa de homología a src 2.
WO2020061426A2 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
EP4218722A3 (en) * 2018-10-01 2023-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
BR112021006539A2 (pt) 2018-10-09 2021-07-06 Univ British Columbia composições e sistemas competentes de vesículas competentes para transfecção isentas de solventes e detergentes orgânicos e métodos relacionados às mesmas
KR20210080435A (ko) 2018-10-18 2021-06-30 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 T 세포의 활성화/증식을 위한 방법
AU2019384557A1 (en) 2018-11-21 2021-06-10 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mRNA encoding CFTR
US12077483B2 (en) * 2018-12-05 2024-09-03 Intellia Therapeutics, Inc. Modified amine lipids
AU2019394996A1 (en) 2018-12-06 2021-07-29 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
BR112021009422A2 (pt) 2018-12-21 2021-10-26 Curevac Ag Rna para vacinas contra malária
SI3908568T1 (sl) 2019-01-11 2024-11-29 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipidi za dostavo učinkovin z lipidnimi nanodelci
EP3920950A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 CureVac AG Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases
US11510939B1 (en) 2019-04-19 2022-11-29 Apellis Pharmaceuticals, Inc. RNAs for complement inhibition
WO2020254535A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Curevac Ag Rotavirus mrna vaccine
WO2021028439A1 (en) 2019-08-14 2021-02-18 Curevac Ag Rna combinations and compositions with decreased immunostimulatory properties
ES2992930T3 (en) 2019-08-14 2024-12-19 Acuitas Therapeutics Inc Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
AU2020407285A1 (en) 2019-12-20 2022-08-11 CureVac SE Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
JP2023513502A (ja) 2020-02-04 2023-03-31 キュアバック エスイー コロナウイルスワクチン
CA3171219A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
CA3174588A1 (en) 2020-03-30 2021-10-07 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
US12070509B2 (en) 2020-05-01 2024-08-27 Arcturus Therapeutics, Inc. Nucleic acids and methods of treatment for cystic fibrosis
CA3179420A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Avak Kahvejian Coronavirus antigen compositions and their uses
AU2021275213A1 (en) 2020-05-20 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
EP4158032A2 (en) 2020-05-29 2023-04-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and methods relating thereto
MX2022015132A (es) 2020-05-29 2023-03-08 CureVac SE Vacunas combinadas a base de acidos nucleicos.
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
CA3187353A1 (en) 2020-06-15 2021-12-23 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus vector delivery for muscular dystrophies
KR20230050328A (ko) 2020-07-08 2023-04-14 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 Hbv에 대한 rna 레플리콘 백신
BR112023000327A2 (pt) 2020-07-16 2023-01-31 Acuitas Therapeutics Inc Lipídeos catiônicos para o uso em nanopartículas lipídicas
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
MX2023001853A (es) 2020-08-14 2023-07-07 Arcturus Therapeutics Inc Método de liofilización de nanopartículas lípidicas.
WO2022043551A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Curevac Ag Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
IL300947A (en) 2020-09-03 2023-04-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
JP2024501288A (ja) 2020-12-23 2024-01-11 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 修飾ｔｒｅｍの組成物及びその使用
EP4267740A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
IL303845A (en) 2021-01-20 2023-08-01 Beam Therapeutics Inc Nanomaterials comprising a biodegradable feature
WO2022162027A2 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Curevac Ag Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
WO2022168884A1 (ja) 2021-02-04 2022-08-11 塩野義製薬株式会社 カチオン性脂質
CN117098558A (zh) * 2021-02-09 2023-11-21 塞瑞纳治疗公司 聚噁唑啉-脂质缀合物及包含其的脂质纳米颗粒和药物组合物
WO2022200574A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
WO2022207862A2 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Curevac Ag Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna
WO2022212784A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
EP4319803A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Vaxthera SAS Coronavirus vaccine comprising a mosaic protein
WO2022214026A1 (zh) * 2021-04-08 2022-10-13 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种聚乙二醇化脂质及其修饰的脂质体、含该脂质体的药物组合物及其制剂和应用
CN115197080A (zh) * 2021-04-08 2022-10-18 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种聚乙二醇化脂质及其修饰的脂质体、含该脂质体的药物组合物及其制剂和应用
US20240148664A1 (en) 2021-04-09 2024-05-09 Sogo Pharmaceutical Co., Ltd. Lipid and composition
CA3171589A1 (en) 2021-05-03 2022-11-03 Moritz THRAN Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
CN115385820A (zh) * 2021-05-09 2022-11-25 英维沃生物科技(苏州)有限公司 阳离子脂质及其应用
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
CA3171750A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tim SONNTAG Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
WO2023023055A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Compositions and methods for optimizing tropism of delivery systems for rna
WO2023031394A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
AU2022336664A1 (en) 2021-09-03 2024-01-18 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
EP4402121A1 (en) 2021-09-14 2024-07-24 Renagade Therapeutics Management Inc. Acyclic lipids and methods of use thereof
WO2023044333A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and methods of use thereof
IL311450A (en) 2021-09-17 2024-05-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
CN118382705A (zh) 2021-10-18 2024-07-23 旗舰创业创新六公司 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
US20250027108A1 (en) 2021-10-29 2025-01-23 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
US20250049948A1 (en) 2021-11-16 2025-02-13 Sail Biomedicines, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
KR20240128683A (ko) 2021-11-22 2024-08-26 세일 바이오메디슨스, 인크. 신규한 이온화 가능 지질 및 지질 나노입자, 및 이를 사용하는 방법
EP4436983A1 (en) 2021-11-24 2024-10-02 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
AU2022398478A1 (en) 2021-11-24 2024-06-13 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
IL312965A (en) 2021-11-24 2024-07-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and their uses
KR20240123832A (ko) 2021-12-16 2024-08-14 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노입자 제형에 사용하기 위한 지질
KR20240118174A (ko) 2021-12-17 2024-08-02 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 변성 조건 하에서의 원형 rna의 풍부화를 위한 방법
JP2025501731A (ja) * 2021-12-20 2025-01-23 ビーム セラピューティクス インク． イオン化可能なアミン脂質及び脂質ナノ粒子
WO2023122745A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
EP4452928A1 (en) 2021-12-23 2024-10-30 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
CN114409554A (zh) * 2022-01-27 2022-04-29 英维沃生物科技(苏州)有限公司 一种新型阳离子脂质化合物及其组合物和用途
WO2023147090A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
AU2023239151A1 (en) 2022-03-25 2024-10-03 Sail Biomedicines, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
CN116354836A (zh) * 2022-03-25 2023-06-30 深圳市新合生物医疗科技有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统
AU2023251104A1 (en) 2022-04-07 2024-10-17 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
EP4504252A2 (en) 2022-04-08 2025-02-12 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Vaccines and related methods
EP4522743A1 (en) 2022-05-09 2025-03-19 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
IL316630A (en) 2022-05-13 2024-12-01 BioNTech SE HIV-targeted RNA complexes
CN119487196A (zh) 2022-05-13 2025-02-18 旗舰创业创新七公司 双链dna组合物及相关方法
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2023230295A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 BioNTech SE Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods
CN119562807A (zh) 2022-05-30 2025-03-04 生物技术公司 用于递送核酸的复合物
CN117263818A (zh) * 2022-06-14 2023-12-22 杭州高田生物医药有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
AU2023316579A1 (en) 2022-07-29 2025-02-13 Fujifilm Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF THE SIGNAL REGULATORY PROTEIN ALPHA (SIRPα) GENE
AU2023320333A1 (en) 2022-08-01 2025-01-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
AU2023334610A1 (en) 2022-08-31 2025-03-13 Sail Biomedicines, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024053648A1 (ja) 2022-09-06 2024-03-14 国立大学法人九州大学 脂質ナノ粒子
CN115197431B (zh) * 2022-09-15 2022-11-29 清华大学 脂质偶联完全可降解水溶性聚合物的合成及应用
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064934A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064931A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024074634A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074211A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
US12186389B2 (en) 2022-10-28 2025-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
TW202434728A (zh) 2022-11-08 2024-09-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於產生環狀多核糖核苷酸的組成物和方法
WO2024121814A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Modified immunomodulators
EP4385523A1 (en) 2022-12-14 2024-06-19 Beijing Jitai Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Lipid-based topical injection formulations
TW202430215A (zh) 2022-12-14 2024-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法
WO2024130421A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Nanovation Therapeutics Inc. Sulfur-containing ionizable lipids for the delivery of nucleic acids and other therapeutic agents
WO2024141955A1 (en) 2022-12-28 2024-07-04 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
US20240238473A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
US20240252520A1 (en) 2023-01-09 2024-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Therapeutic agents and their use for treating chronic wounds
US20240269251A1 (en) 2023-01-09 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
US20240293318A1 (en) 2023-02-13 2024-09-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cleavable linker-containing ionizable lipids and lipid carriers for therapeutic compositions
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024173828A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified uracil
US20240293582A1 (en) 2023-02-17 2024-09-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified cytosine
WO2024184500A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 CureVac SE Novel lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2024192420A1 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising polyribonucleotides and uses thereof
WO2024192422A1 (en) 2023-03-15 2024-09-19 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
WO2024200823A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
WO2024200820A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
WO2024210160A1 (en) 2023-04-07 2024-10-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Conjugation complex
WO2024216191A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Modified trems, compositions, and related methods thereof
WO2024216128A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trems for use in correction of missense mutations
WO2024216109A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Formulations for oligonucleotide delivery
WO2024220746A2 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rnai agents targeting fatty acid synthase and related methods
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024223728A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
US20240401025A1 (en) 2023-05-03 2024-12-05 Manifold Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for high-throughput protein delivery, screening, and detection
WO2024228150A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 BioNTech SE Optimized csp variants and related methods
WO2024228044A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 BioNTech SE Optimized csp variants and related methods
WO2024230934A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 CureVac SE Therapeutic nucleic acid for the treatment of ophthalmic diseases
WO2024236504A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sequences and methods for delivery of dna and rna
WO2024236361A1 (en) 2023-05-15 2024-11-21 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods for delivery of nucleic acids to cells
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025006684A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2025008774A1 (en) 2023-07-05 2025-01-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
WO2025024335A2 (en) 2023-07-21 2025-01-30 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025024324A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025024337A1 (en) 2023-07-24 2025-01-30 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025024486A2 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
WO2025027089A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thiolipids and uses thereof
WO2025027116A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Institut Curie Nanoparticles comprising nucleic acid sequences encoding cyclic gmp-amp synthase
WO2025026545A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thioplipids and uses thereof
WO2025030097A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2025027579A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2025030154A1 (en) 2023-08-03 2025-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus glycoprotein b antigens and related methods
WO2025027576A2 (en) 2023-08-03 2025-02-06 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2025042786A1 (en) 2023-08-18 2025-02-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025054556A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 BioNTech SE Rna compositions for delivery of mpox antigens and related methods
WO2025057088A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 BioNTech SE Rna compositions for delivery of incretin agents
WO2025056938A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 BioNTech SE Rna compositions for delivery of incretin agents
WO2025064475A2 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
WO2025064850A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 BioNTech SE Rna constructs with n-terminal degrons to enhance an immune response
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
CN119143714A (zh) * 2023-12-11 2024-12-17 仁景(苏州)生物科技有限公司 用于递送的脂质化合物和脂质纳米颗粒
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
CH624011A5 (zh) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
AU587989B2 (en) 1984-10-16 1989-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins
AU580145B2 (en) 1985-02-13 1989-01-05 Scios Nova Inc. Human metallothionein-ii promoter in mammalian expression system
EP0239631A4 (en) 1985-10-04 1989-01-12 Biotech Res Partners Ltd RECOMBINANT APOLIPOPROTEINS AND METHODS.
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
GB8712540D0 (en) 1987-05-28 1987-07-01 Ucb Sa Expression of human proapolipoprotein a-i
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5168045A (en) 1989-08-18 1992-12-01 The Scripps Research Institute Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e
US5182364A (en) 1990-02-26 1993-01-26 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E
US5473039A (en) 1989-08-18 1995-12-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E, diagnostic systems and methods using the analogs
US5177189A (en) 1989-08-18 1993-01-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of Apolipoprotein E
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
DE4013632A1 (de) * 1990-04-27 1991-10-31 Max Planck Gesellschaft Liposomen mit positiver ueberschussladung
WO1993000443A1 (en) 1991-06-26 1993-01-07 Bio-Technology General Corp. Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria
SE9103701D0 (sv) 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein
US6372886B1 (en) 1992-06-23 2002-04-16 Arch Development Corp. Expression and purification of kringle domains of human apolipoprotein (a) in E. coli
SE9203753D0 (sv) 1992-12-11 1992-12-11 Kabi Pharmacia Ab Expression system for producing apolipoprotein ai-m
KR100334858B1 (ko) * 1993-02-19 2006-01-27 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 핵산공중합체를함유하는의약조성물
US5532130A (en) 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
WO1995025749A2 (en) 1994-03-22 1995-09-28 Research Corporation Technologies, Inc. Eating suppressant peptides
US5534499A (en) 1994-05-19 1996-07-09 The University Of British Columbia Lipophilic drug derivatives for use in liposomes
US6027726A (en) 1994-09-30 2000-02-22 Inex Phamaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
SE9500778D0 (sv) 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5672685A (en) 1995-10-04 1997-09-30 Duke University Source of apolipoprotein E and method of isolating apolipoprotein E
JP3563505B2 (ja) * 1995-10-16 2004-09-08 花王株式会社 新規な第４級アンモニウム塩及びその製造方法、並びにそれを含有する毛髪化粧料
JPH09278726A (ja) * 1996-04-11 1997-10-28 Takeshi Imanishi 新規リポソーム
JPH09301936A (ja) * 1996-05-09 1997-11-25 Kao Corp 新規第４級アンモニウム塩、その製造方法及びそれを含有する柔軟仕上剤並びに毛髪化粧料
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US20030229037A1 (en) * 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
AU2003245160B2 (en) 2002-06-28 2009-09-24 Arbutus Biopharma Corporation Method and apparatus for producing liposomes
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
JP5777846B2 (ja) * 2005-06-15 2015-09-09 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アミン含有脂質およびその使用
WO2007012191A1 (en) 2005-07-27 2007-02-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
EP2034019B1 (en) * 2006-06-30 2014-08-20 Hokkaido System Science Co., Ltd. Composition for nucleic-acid introduction
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
FR2909378B1 (fr) * 2006-12-05 2012-01-13 Biochimie Appliquee Soc Ceramides ou pseudo-ceramides quaternises et les compositions cosmetiques en contenant
TW201002126A (en) * 2007-12-21 2010-01-01 Du Pont Encapsulation assembly for electronic devices
EP3100718B1 (en) * 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5777519B2 (ja) 2008-10-09 2015-09-09 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
KR102264822B1 (ko) 2008-11-10 2021-06-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
US8722082B2 (en) 2008-11-10 2014-05-13 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
TW201021852A (en) * 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
CA2751342C (en) 2009-01-29 2019-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
CN102421417B (zh) 2009-05-05 2016-03-02 阿尔尼拉姆医药品有限公司 脂质组合物
DK2575764T3 (en) * 2010-06-03 2017-08-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc BIODEGRADABLE LIPIDS FOR THE ACTIVATION OF ACTIVE AGENTS
ES2921724T1 (es) * 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
JP6315156B2 (ja) 2016-03-08 2018-04-25 Dic株式会社 液晶組成物及びそれを使用した液晶表示素子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis of a single-tailed cationic lipid and investigation of its transfection;Fuxing Tang, et al;《Journal of Controlled Release》;19991231;第62卷;第345–358页，尤其是第346页右栏第1-7行 *
Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery;Hongtao Lv, et al;《Journal of Controlled Release》;20060513;第114卷;第100-109页，尤其是第101页右栏第3段，fig1、2 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ605079A (en) 2015-08-28
KR20190039347A (ko) 2019-04-10
US10266484B2 (en) 2019-04-23
SG186085A1 (en) 2013-01-30
EP3254672A1 (en) 2017-12-13
IL259334B2 (en) 2023-07-01
CA2800401C (en) 2020-09-15
US9682922B2 (en) 2017-06-20
JP5893611B2 (ja) 2016-03-23
AU2024205466A1 (en) 2024-08-22
JP6409011B2 (ja) 2018-10-17
CN103096875A (zh) 2013-05-08
JP2019011345A (ja) 2019-01-24
KR20130082141A (ko) 2013-07-18
AU2018203382A1 (en) 2018-05-31
EP4481047A2 (en) 2024-12-25
EP2575764B1 (en) 2017-04-19
AU2020200286B2 (en) 2022-03-17
WO2011153493A3 (en) 2012-01-19
US20120027803A1 (en) 2012-02-02
EP4481047A3 (en) 2025-04-16
IL300109A (en) 2023-03-01
JP2016121174A (ja) 2016-07-07
AU2020200286A1 (en) 2020-02-06
KR101967411B1 (ko) 2019-04-10
AU2022204146A1 (en) 2022-06-30
ES2634087T3 (es) 2017-09-26
EP2575764A2 (en) 2013-04-10
CA2800401A1 (en) 2011-12-08
MX2012014079A (es) 2013-04-05
DK2575764T3 (en) 2017-08-07
US20180065920A1 (en) 2018-03-08
IL259334A (en) 2018-07-31
US9012498B2 (en) 2015-04-21
AU2011261247B2 (en) 2016-08-25
IL259334B1 (en) 2023-03-01
US20160009637A1 (en) 2016-01-14
AU2011261247A1 (en) 2012-12-20
IL223207B (en) 2018-05-31
MX341332B (es) 2016-08-16
IL223207A0 (en) 2013-02-03
WO2011153493A2 (en) 2011-12-08
AU2016210739A1 (en) 2016-08-25
AU2022204146B2 (en) 2024-06-27
JP2013533224A (ja) 2013-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103096875B (zh) 用于递送活性剂的生物可降解脂质
JP6505912B2 (ja) 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
CN104873464B (zh) 改进的脂质制剂
AU2019203374A1 (en) Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EA039892B1 (ru) Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant