[go: up one dir, main page]

CN118382705A - 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法 - Google Patents

用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118382705A
CN118382705A CN202280069794.XA CN202280069794A CN118382705A CN 118382705 A CN118382705 A CN 118382705A CN 202280069794 A CN202280069794 A CN 202280069794A CN 118382705 A CN118382705 A CN 118382705A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polyribonucleotide
target region
polyribonucleotides
oligonucleotide
cyclic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280069794.XA
Other languages
English (en)
Inventor
瓦迪姆·杜德金
白基英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flagship Venture Six
Original Assignee
Flagship Venture Six
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flagship Venture Six filed Critical Flagship Venture Six
Publication of CN118382705A publication Critical patent/CN118382705A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/131—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a member of a cognate binding pair, i.e. extends to antibodies, haptens, avidin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本披露涉及用于分离和/或纯化多核糖核苷酸的组合物和方法。所述多核糖核苷酸可从多核糖核苷酸与寡核苷酸的混合物中分离出来，并可作为治疗剂使用，所述寡核苷酸与多核糖核苷酸的靶区域杂交。

Description

用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
背景技术
多核糖核苷酸可用于多种治疗和工程应用。因此，用于分离和纯化多核糖核苷酸的新型组合物和方法是有用的。
发明内容
在一方面，本发明的特征在于从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸的方法。在此方法中，提供了包含所述多种多核糖核苷酸的样品。样品中所述多种多核糖核苷酸的子集具有靶区域。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸。
在另一方面，本发明的特征在于从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸混合物的多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的线性多核糖核苷酸的方法。在此方法中，提供了包含所述多种多核糖核苷酸的样品。样品中所述多种线性多核糖核苷酸的子集具有靶区域。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，具有靶区域的多核糖核苷酸缺乏polyA序列(即，polyA尾)。在一些实施例中，靶区域不位于具有所述靶区域的多核糖核苷酸的3'或5'末端。环状多核糖核苷酸或其子集可能没有靶区域。
在另一方面，本发明的特征在于从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸的方法。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集具有所述靶区域。所述靶区域不位于具有所述靶区域的多核糖核苷酸的3’或5’末端(即，所述靶区域位于多核糖核苷酸内部)。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸。
在另一方面，本发明的特征在于将具有靶区域的线性多核糖核苷酸与具有所述靶区域的多种环状多核糖核苷酸分离的方法。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品。所述方法进一步包括使样品与寡核苷酸接触。所述寡核苷酸以第一结合亲和力与线性多核糖核苷酸的靶区域杂交，并且所述寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与环状多核苷酸的靶区域杂交，并将具有与寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸与样品中的多种环状多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，第一结合亲和力小于第二结合亲和力，并且寡核苷酸优先与线性多核糖核苷酸结合。
在另一方面，本发明的特征在于将具有靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与具有所述靶区域的第二构象的多种多核糖核苷酸分离的方法。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品。所述方法进一步包括使样品与寡核苷酸接触。寡核苷酸以第一结合亲和力与第一构象的多核苷酸的靶区域杂交，并且所述寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与第二构象的多核苷酸的靶区域杂交，并将具有与寡核苷酸杂交的靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与样品中第二构象的多种多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，第一结合亲和力小于第二结合亲和力，并且寡核苷酸优先与第一构象的多核糖核苷酸结合。
在本文所述任何方面的一些实施例中，分离包括将寡核苷酸固定。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域不位于具有靶区域的多核糖核苷酸的5’或3’末端。例如，靶区域可以位于多核糖核苷酸内部。在一些实施例中，靶区域不位于多核糖核苷酸的3’末端。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域位于多核糖核苷酸的5’或3’末端，并且靶区域不含polyA序列。在一些实施例中，靶区域位于多核糖核苷酸的3’末端并且不含polyA序列。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域不含polyA序列。
在以上任何方面的一些实施例中，寡核苷酸与颗粒缀合。颗粒可以是例如磁性颗粒或珠。珠可以是例如交联琼脂糖(例如，)珠。
在以上任何方面的一些实施例中，寡核苷酸与第一捕获剂缀合。
在一些实施例中，寡核苷酸通过化学接头与第一捕获剂或颗粒缀合。化学接头可以包括，例如三乙二醇。在一些实施例中，化学接头与寡核苷酸的3’端或5’端缀合。
在一些实施例中，第一捕获剂包括抗原(例如，生物素)。
在一些实施例中，所述方法进一步包括使样品与和第一捕获剂结合的第二捕获剂接触。第二捕获剂可以包括，例如抗体或其抗原结合片段(例如，链霉亲和素)。
在一些实施例中，第二捕获剂与颗粒缀合。颗粒可以是例如磁性颗粒或珠。珠可以是例如交联琼脂糖(例如，)珠。在一些实施例中，第二捕获剂通过化学接头与颗粒缀合。化学接头可以包括，例如三乙二醇。
在一些实施例中，具有靶区域的多核糖核苷酸包括内含子或其部分(例如，半内含子(half-intron))。靶区域可以包括内含子或其部分。在一些实施例中，内含子或其部分是催化内含子(例如，I型催化内含子或II型催化内含子)或其部分。在一些实施例中，内含子或其部分的长度为至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸。在一些实施例中，内含子或其部分的长度为20个至500个、20个至400个、20个至300个、20个至200个、20个至100个、50个至500个、50个至400个、50个至300个、50个至200个、100个至500个、100个至400个、100个至300个或100个至200个核苷酸。
在一些实施例中，靶区域包括半内含子(例如，催化内含子的5’或3’部分)。在一些实施例中，靶区域包括5’半内含子(例如，对应于催化内含子5’部分的5’半内含子)。在一些实施例中，靶区域包括3’半内含子(例如，对应于催化内含子3’部分的3’半内含子)。在一些实施例中，靶区域包括I型催化内含子的5’一半。在一些实施例中，I型催化内含子的5’一半来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫(Tetrahymena)前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的5’部分。在一些实施例中，靶区域包括I型催化内含子的3’一半。在一些实施例中，I型催化内含子的3’一半选自来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的3’部分。
靶区域可以位于内含子或其部分的5’或3’，或可以包括位于内含子或其部分5’或3’的区域的部分。
在一些实施例中，所述方法包括将剪接的多核糖核苷酸与非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸缺乏内含子或其部分(例如，剪接的多核糖核苷酸缺乏催化内含子，比如I型催化内含子或其部分)。
在一些实施例中，所述方法富集了相对于样品至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)的量的剪接的多核糖核苷酸。
在一些实施例中，具有内含子或其部分的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸的长度为至少5个核苷酸(例如，至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为，例如5-100个、5-95个、10-90个、10-80个、12-60个、15-50个、15-40个、15-30个、18-30个、20-25或20-22个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为23个核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸可以具有以下的解链温度(Tm)：例如约45℃至约75℃，例如约46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃。在一些实施例中，寡核苷酸具有约45℃至约65℃的Tm。
在一些实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：将具有靶区域的捕获的多核糖核苷酸洗涤(例如，接触后和/或分离步骤后)一次或多次(例如，两次、三次、四次、五次或更多次)。在一些实施例中，所述方法进一步包括将第一和/或第二捕获剂洗涤一次或多次(例如，两次、三次、四次、五次或更多次)。
在一些实施例中，所述方法进一步包括进行第一洗脱步骤以释放捕获的具有靶区域的多核糖核苷酸的步骤。第一洗脱步骤可以包括，例如添加第一缓冲剂和/或将样品加热至例如至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高。
在一些实施例中，所述方法进一步包括进行第二洗脱步骤。第二洗脱步骤可以包括添加第二缓冲剂和/或将样品加热至例如至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高。在一些实施例中，第二缓冲剂包括变性剂，例如甲酰胺或尿素。第二缓冲剂可以包括，例如约40％至约60％的甲酰胺(例如，约40％、45％、50％、55％或60％的甲酰胺)。
在一些实施例中，所述方法包括将样品与寡核苷酸(例如，与第一捕获剂缀合的寡核苷酸)一起孵育至少十分钟(例如，至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟或更长)。
在一些实施例中，所述方法包括收集未被寡核苷酸结合的样品部分。在一些实施例中，所述方法包括收集未被捕获剂(例如，第一和/或第二捕获剂)结合的样品部分。
在一些实施例中，所述方法包括提供多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸都与不同的靶区域杂交。在一些实施例中，每种寡核苷酸都与第一捕获剂缀合。
在一些实施例中，所述方法包括提供与多个靶区域杂交的寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括提供与3’半内含子和5’半内含子杂交的单寡核苷酸。
在一些实施例中，所述方法包括提供与3’半内含子杂交的第一寡核苷酸以及与5’半内含子杂交的第二寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括提供多种寡核苷酸，每种寡核苷酸都与3’半内含子和/或5’半内含子上的不同区域杂交。
在一些实施例中，寡核苷酸与靶区域的等长部分具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)互补性。
在一些实施例中，所述方法包括提供与多核糖核苷酸的摩尔比为10:1至1:10(例如，10:1、5:1、2:1、1:2、1:5或1:10)的寡核苷酸。
在另一方面，本发明的特征在于通过本文所述的任何实施例的方法产生的多核糖核苷酸群体。所述群体可以包括例如缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述环状多核糖核苷酸包括组合物中总多核糖核苷酸的至少1％(例如，至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多)(mol/mol)。
在一些实施例中，所述群体具有少于50％(例如，少于40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％)(mol/mol)的线性多核糖核苷酸。
在另一方面，本发明的特征在于包括多核糖核苷酸混合物的组合物。所述混合物的第一子集包括缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述多种多核糖核苷酸的第二子集包括具有靶区域的线性多核糖核苷酸。第一子集包括组合物中总多核糖核苷酸的至少1％(例如，至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多)(mol/mol)。
在另一方面，本发明的特征在于包括具有靶区域的多核糖核苷酸以及配置为与所述靶区域杂交的寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸与第一捕获剂(例如抗原，比如生物素)缀合。所述组合物可进一步包含例如缺乏靶区域的多核糖核苷酸。缺乏靶区域的多核糖核苷酸可以是，例如环状多核糖核苷酸。所述组合物可以进一步包括配置为与第一捕获剂结合的第二捕获剂(例如抗体或其抗原结合片段，比如链霉亲和素)。第二捕获剂可以与颗粒缀合。
在一些实施例中，通过如本文所述的方法产生所述组合物。
在如本文所述的任何组合物的一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括内含子或其部分。靶区域可以包括内含子或其部分。靶区域可以位于内含子或其部分的5’或3’。
在以上任何方面的一些实施例中，多核糖核苷酸和/或寡核苷酸可以是经修饰的。
在另一方面，本发明的特征在于包括如本文所述的组合物(例如，通过如上所述的方法产生的组合物)以及稀释剂、载剂或赋形剂的药物组合物。
定义
为了促进对本披露的理解，下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如与本披露相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语比如“一个/种(a、an)”和“该”并不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例来说明的一般类别。术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代物或者替代物相互排斥，尽管本披露支持仅指替代物和“和/或”的定义。本文的术语用于描述特定实施例，但它们的使用不应被视为限制，除非在权利要求中列出。
如本文所用，在值的范围内提供的任何值都包括上限和下限、以及该上限和下限内含有的任何值。
如本文所用，术语“约”是指列举值的±10％内的值。
如本文所用，术语“载剂”是通过对环状多核糖核苷酸的共价修饰、经由部分或完全包封剂或者它们的组合促进组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送到细胞中的化合物、组合物、试剂或分子。载剂的非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，经酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外泌体、蛋白质载剂(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。
如本文所用，术语“环状多核糖核苷酸”、“环状RNA”和“circRNA”可互换使用，并且意指具有无游离端(即，无游离3'或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或无端结构的多核糖核苷酸分子。环状多核糖核苷酸可以是例如共价闭合的多核糖核苷酸。
如本文所用，术语“疾病”、“障碍”和“病症”均指亚健康状态，例如由或通常将由医疗专业人员诊断或治疗的状态。
“异源”意指发生在与天然存在的(天然的)背景不同的背景中。“异源”多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在该序列的天然基因组中发现的方式不同的方式使用。例如，“异源启动子”用于驱动序列的转录，该序列不是由该启动子天然转录的序列；因此，“异源启动子”序列通常通过重组核酸技术包括在表达构建体中。术语“异源”也用于指被置于与另一序列的非天然存在的关系中的给定序列；例如，异源编码或非编码核苷酸序列通常通过基因组转化技术被插入基因组中，产生经基因修饰的基因组或重组基因组。
如本文所用，术语“半内含子”是指内含子的部分，其中第一半内含子和第二半内含子一起形成内含子，比如催化内含子。半内含子可以是内含子的5’部分(例如，催化内含子的5’部分)或内含子的3’部分(例如，催化内含子的3’部分)，这样5’半内含子和3’半内含子一起形成功能性内含子，比如能够催化自剪接的功能性内含子。术语半内含子意指内含子分成的两个部分。术语半内含子并非意在指出、暗示或表明这两个部分或两半长度相等。术语半内含子与术语断裂内含子同义使用，并且可以代替术语“内含子片段”使用。
如本文所用，术语“杂质”是存在于组合物(例如，如本文所述的药物组合物)中的不需要的物质。在一些实施例中，杂质是工艺相关杂质。在一些实施例中，杂质是最终组合物中除期望产物之外，例如除如本文所述的活性药物成分(例如，环状多核糖核苷酸)之外的产物相关物质。如本文所用，术语“工艺相关杂质”是在最终的组合物、制剂或产物中，除本文所述的线性多核糖核苷酸外，在组合物、制剂或产物的制造中使用、存在或生成的不需要的物质。在一些实施例中，工艺相关杂质是在多核糖核苷酸的合成或环化中使用的酶。如本文所用，术语“产物相关物质”是在组合物、制剂、或产物或其任何中间体的合成期间产生的物质或副产物。在一些实施例中，产物相关物质是脱氧核糖核苷酸片段。在一些实施例中，产物相关物质是脱氧核糖核苷酸单体。在一些实施例中，产物相关物质是以下的一种或多种：本文所述的多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4个核糖核酸、单核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。
如本文所用，“增加受试者的适应度”或“促进受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学上或受试生物进行的任何活动的任何有利的改变，包括但不限于以下希望效果中的任何一种或多种：(1)对生物或非生物胁迫的耐受性提高；(2)产率或生物量提高；(3)开花时间调整；(4)对有害生物或病原体的抗性提高；(4)对除草剂的抗性提高；(5)受试生物群体(例如，农业上重要的昆虫)增加；(6)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的繁殖速率提高；(7)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的活动能力增强；(8)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的体重增加；(9)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的代谢速率或活性提高；(10)授粉(例如，被授粉植物的数量)增加；(11)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量提高；(12)受试生物(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白质、脂肪酸或氨基酸)含量提高；(13)受试生物对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如硫代磷酸酯，例如杀螟松))的抗性提高；或(14)受试生物(比如，人或非人动物)的健康状况改善或疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物，可以确定宿主适应度的提高。相反地，“降低受试者的适应度”是指由于施用本文所述的肽或多肽而产生的生理学的或受试生物进行的任何活动的任何不利的改变，包括但不限于以下预期效果中的任何一种或多种：(1)对生物或非生物胁迫的耐受性降低；(2)产率或生物量降低；(3)开花时间调整；(4)对有害生物或病原体的抗性降低；(4)对除草剂的抗性降低；(5)受试生物群体(例如，农业上重要的昆虫)减少；(6)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的繁殖速率降低；(7)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的活动能力减弱；(8)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的体重减轻；(9)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)的代谢速率或活性降低；(10)通过受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)进行的授粉(例如，在给定时间内被授粉的植物数量)减少；(11)受试生物(例如昆虫，例如蜂或蚕)副产物(例如，来自蜜蜂的蜂蜜或来自蚕的蚕丝)的产量降低；(12)受试生物(例如，昆虫)的营养物(例如，蛋白质、脂肪酸或氨基酸)含量降低；(13)受试生物对杀有害生物剂(例如，新烟碱(例如，吡虫啉)或有机磷杀昆虫剂(例如硫代磷酸酯，例如杀螟松))的抗性降低；或(14)受试生物(比如，人或非人动物)的健康状况下降或疾病减少。相比于未施用调节剂的受试生物，可以确定宿主适应度的降低。对本领域技术人员而言将显而易见的是，受试者的生理学、表型、或活性的某些变化(例如，植物开花时间的调整)可以被认为提高该受试者的适应度或降低该受试者的适应度，这取决于背景(例如，以适应气候或其他环境条件的变化)。例如，开花时间的延迟(例如，在给定日历日期开花的群体中的植物减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％)可以是对较晚或较凉的春季的有益适应，并因此被认为会提高植物的适应度；相反，在较早或较暖的春季背景下，相同的开花时间的延迟可以被认为会降低植物的适应度。
如本文所用，术语“线性多核糖核苷酸”、“线性RNA”和“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有5’和3’端的多核糖核苷酸分子。5’和3’端中的一者或两者可以是游离端或与另一部分连接。线性多核糖核苷酸可以是未经历环化的(例如，是环化前的)多核糖核苷酸，并且可用作通过例如夹板连接、或化学、酶促、核酶催化或剪接催化的环化方法进行环化的起始材料。
如本文所用，术语“经修饰的寡核苷酸”意指含有具有针对糖、核碱基或核苷酸间键的至少一种修饰的核苷酸的寡核苷酸。
如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指含有具有针对糖、核碱基或核苷间键的至少一种修饰的核苷的核糖核苷酸。
如本文所用，术语“裸递送”是用于在不借助载剂并且不对有助于递送到细胞的部分进行共价修饰的情况下递送到细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载剂的配制品。
如本文所用，术语“经切口的RNA”或“经切口的线性多核糖核苷酸”或“经切口的线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指由于环状RNA切口或降解而产生的具有5’和3’端的多核糖核苷酸分子。“经切口的环状RNA”意指被切口的环状RNA。
如本文所用，术语“任选地取代的X”旨在等同于“X，其中X被任选地取代”(例如“烷基，其中所述烷基被任选地取代”)。并不旨在意指特征“X”(例如，烷基)本身是任选的。如本文所用，术语“任选地取代的”是指具有0个、1个或更多个取代基(例如，0-25个、0-20个、0-10个或0-5个取代基)。例如，C1烷基基团(即，甲基)可以被氧代取代而形成甲酰基并且进一步被-OH或-NH2取代而形成羧基或氨基。
术语“药物组合物”旨在同样披露包括在药物组合物中的环状或线性多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。
如本文所用，术语“多核苷酸”意指包括一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或它们的变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸、核糖核酸或RNA可以指包括通过磷酸二酯键的方式聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。
如本文所用，本文的术语“多核糖核苷酸负载物”包括包含至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个表达(或编码)序列，其中每个表达(或编码)序列编码多肽。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个非编码序列，如具有调节或催化功能的多核糖核苷酸。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括表达序列和非编码序列的组合。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括本文所述的一个或多个多核糖核苷酸序列，诸如一个或多个调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)元件或间隔子序列。
如本文可互换使用，术语“polyA”和“polyA序列”是指核酸分子的长度为至少5个核苷酸并且由腺苷残基组成的非翻译连续区域。在一些实施例中，polyA序列的长度为至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个核苷酸。在一些实施例中，polyA序列位于开放阅读框(例如，编码多肽的开放阅读框)的3’(例如，开放阅读框下游)，并且该polyA序列位于终止元件(例如，终止密码子)的3’，使得该polyA不被翻译。在一些实施例中，polyA序列位于终止元件和3’非翻译区的3’。
如本文所用，如果核酸的元件位于载体上，使得它们可以被转录而形成线性多核糖核苷酸，然后可以使用本文提供的方法将所述线性多核糖核苷酸环化成环状多核糖核苷酸，则这些元件是“可操作地相连的(operably connected)”或“可操作地连接的(operablylinked)”。
多脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸和DNA意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，如例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补A、C、G、T或U有特异性或与嘌呤(即，A或G或其变体)或嘧啶(即，C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。在一些情况下，多核苷酸是短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、质粒DNA(pDNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(pre-mRNA)、反义RNA(asRNA)(仅举几例)，并且包括核苷酸序列及其任何结构实施例，诸如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子的长度可以为至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更长。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。多核苷酸的实施例包括分离和纯化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子以及合成的DNA/RNA类似物。
多核苷酸(例如，多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸)的实施例包括含有一个或多个核苷酸变体(包括非标准核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸类似物或经修饰的核苷酸)的多核苷酸。经修饰的核苷酸的实例包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁苷(butoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸部分中包括修饰，这包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括长度更长的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)和带有硫醇部分(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯)的修饰。在实施例中，核酸分子在碱基部分(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处或者在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸酯主链处被修饰。在实施例中，核酸分子含有胺修饰的基团，比如氨基烯丙基1-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许共价附接胺反应性部分，比如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)。本披露的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供更高的密度(以位/立方毫米计)、更高的安全性(抗天然毒素的偶然或有目的合成)、更容易辨别光程序性聚合酶(photo-programmed polymerases)或较低的二级结构。在Betz K,Malyshev DA,Lavergne T,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,RomesbergFE,Marx A.Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]2012；8:612-4中描述了与用于从头或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过引用并入本文。
如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。多肽可以包括基因产物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述物质的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或多分子复合物，如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包括单链或多链多肽(如抗体或胰岛素)，并且可以是缔合的或连接的。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“植物修饰多肽”是指可以以使得植物生理学或表型发生变化(例如，植物适应度增加或降低)的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、降低基因表达或者以其他方式改变DNA或RNA的核苷酸序列)、表观遗传特性或者生物化学或生理学特性的多肽。
如本文所用，术语“纯化(purify、purifying和purification)”是指从含有环状RNA和线性RNA以及其他物质的混合物的样品中去除杂质(例如，工艺相关杂质(例如，酶)、工艺相关物质(例如，脱氧核糖核苷酸片段、脱氧核糖核苷酸单体))或副产物(例如，线性RNA)的一个或多个步骤或过程，以产生含有富集的环状RNA群体的组合物，其中与原始混合物相比，杂质(例如工艺相关杂质(例如，酶)、工艺相关物质(例如，脱氧核糖核苷酸片段、脱氧核糖核苷酸单体))或副产物(例如，线性RNA)的水平降低，或相对于起始混合物，线性RNA或物质减少了按质量计的40％或更多(例如，50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％或更多)。
如本文所用，术语“纯的”和“纯度”是指分析物(例如，环状RNA)被分离出并且不含其他组分的程度。在核酸(例如，多核糖核苷酸)的背景下，分离的核酸(例如环状RNA)的纯度可以用不含任何污染物、杂质或副产物(例如线性RNA和其他物质)的核酸群体来表示。例如，环状RNA群体的纯度表示按分离材料的总质量计，所述群体中有多少是环状RNA，可以使用例如纯的环状RNA作为参考进行确定。本披露中发现的纯度水平可以为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、大于95％或大于99％(w/w)。在一些实施例中，污染物或杂质或副产物的水平不超过约20％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(w/w)。纯度可以通过以下方式确定：使用凝胶电泳、分光光度法(例如，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)的NanoDrop)或适用于测量核酸群体的纯度的其他技术检测特定分析物(例如，环状RNA)或特定杂质或副产物(例如，线性RNA)的水平，并计算分析物相对于总核酸含量(例如，如通过本领域已知的测定确定的)的百分比(w/w)。
如本文所用，短语“基本上不含一种或多种杂质或副产物”是指样品(比如含有富集的环状RNA群体的样品)不含一种或多种杂质或副产物(例如，本文披露的一种或多种杂质或副产物)或含有最少量的一种或多种杂质或副产物的特性。最少量的一种或多种杂质或副产物可能不超过20％(w/w)(例如，不超过19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％(w/w)或更少)。在另一个实例中，如果一种或多种杂质或副产物以小于15％(w/w)(例如，不超过14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％(w/w)或更少)的量存在，则样品或富集的环状RNA群体基本上不含该一种或多种杂质或副产物。在另一个实例中，如果一种或多种杂质或副产物以小于10％(w/w)(例如，不超过9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％(w/w)或更少)的量存在，则样品或富集的环状RNA群体基本上不含该一种或多种杂质或副产物。在另一个实例中，如果一种或多种杂质或副产物以小于5％(w/w)(例如，不超过4％、3％、2％、1％(w/w)或更少)的量存在，则样品或富集的环状RNA群体基本上不含该一种或多种杂质或副产物。在又另一个实例中，如果一种或多种杂质或副产物以小于1％(不超过0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％(w/w)或更少)的量存在，则样品或富集的环状RNA群体基本上不含该一种或多种杂质或副产物。
如本文所用，“调节元件”是修饰环状或线性多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，比如核酸序列。
如本文所用，“间隔子”是指在两个相邻多核苷酸区域之间提供距离或柔性的任何连续核苷酸序列(例如，一个或多个核苷酸的连续核苷酸序列)。
如本文所用，术语“序列同一性”是通过使用全局或局部比对算法对两个肽或两个核苷酸序列进行比对来确定的。当序列在最佳比对时(例如，当通过程序(如GAP或BESTFIT)使用默认参数进行比对时)共享至少某个最小百分比的序列同一性时，这些序列被称为“基本上相同的”或“基本上相似的”。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度上对其进行比对，从而最大程度地增加了匹配数目并最大程度地减少了空位数目。通常，使用GAP默认参数，空位产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是nwsgapdna，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff,1992,PNAS[美国科学院院报]89,915-19)。序列比对和百分比序列同一性的评分例如使用计算机程序来确定，这些计算机程序如从美国92121-3752加州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的阿赛乐德公司(Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA)获得的GCG Wisconsin软件包10.3版或EmbossWin2.10.0版(使用程序“needle”)。替代性地或额外地，通过例如使用如FASTA、BLAST等的算法对数据库进行搜索来确定同一性百分比。序列同一性是指在序列的整个长度上的序列同一性。
如本文所用，关于RNA的“结构化”是指由RNAFold软件或类似预测工具预测与其自身或相同RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文所用，术语“受试者”是指生物，比如动物、植物或微生物。在实施例中，受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。在实施例中，受试者是人。在实施例中，受试者是非人哺乳动物。在实施例中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如猴、猿)、有蹄类动物(例如家牛、水牛、野牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如狗、猫)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)或兔类动物(例如兔)。在实施例中，受试者是鸟，诸如鸟类类群鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)或鹦形目(例如鹦鹉)的成员。在实施例中，受试者是无脊椎动物，比如节肢动物(例如，昆虫、蛛形纲、甲壳类动物)、线虫、环节动物、蠕虫或软体动物。在实施例中，受试者是无脊椎动物农业有害生物或者寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，受试者是植物，诸如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类或苔藓植物。在实施例中，受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，受试者是具有农业或园艺重要性的植物，诸如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物和草坪草)。
如本文所用，术语“治疗(treat和treating)”是指对受试者的疾病或障碍(例如，感染性疾病、癌症、中毒、或过敏反应)进行预防性或治疗性治疗。治疗的效果可以包括逆转、减轻、降低疾病或者疾病或障碍的一种或多种症状或表现的严重程度，治愈疾病或者疾病或障碍的一种或多种症状或表现，抑制疾病或者疾病或障碍的一种或多种症状或表现的进展，降低疾病或者疾病或障碍的一种或多种症状或表现的复发的可能性，或者与没有治疗性治疗的情况下疾病或障碍的状态或病症相比，稳定(即，不恶化)疾病或障碍的状态或者预防疾病或障碍的扩散。实施例包括治疗植物以控制由无脊椎动物有害生物或微生物(例如，细菌、真菌、卵菌、或病毒)病原体引起或与之相关的疾病或不利病症。实施例包括治疗植物以增加植物的先天防御或免疫能力以耐受有害生物或病原体压力。
如本文所用，“终止元件”是终止环状或线性多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，比如核酸序列。
如本文所用，“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白或肽的转录物产生的蛋白或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统(例如，无细胞的翻译系统，像兔网织红细胞裂解物)中。
如本文所用，“翻译起始序列”是在环状或线性多核糖核苷酸中起始表达序列的翻译的核酸序列。
如本文所用，“治疗性多肽”是指当向受试者施用或在受试者中表达时提供一些治疗性益处的多肽。在实施例中，通过向受试者施用治疗性肽或通过在受试者中表达治疗性多肽，将治疗性多肽用于治疗或预防受试者的疾病、障碍、或病症。在替代性的实施例中，使治疗性多肽在细胞中表达，并且向受试者施用该细胞以提供治疗性益处。
如本文所用，“载体”意指一段DNA，它是合成的(例如，使用PCR)或者取自病毒、质粒或高等生物的细胞，可以或已经将外来DNA片段插入其中以用于克隆或表达目的。在一些实施例中，载体可以稳定地维持在生物中。可选择标志物载体可以包括例如复制起点、可选择标志物或报告基因(诸如抗生素抗性或GFP)或多克隆位点(MCS)。该术语包括线性DNA片段(例如，PCR产物、线性化质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等。在一个实施例中，本文提供的载体包括多克隆位点(MCS)。在另一实施例中，本文提供的载体不包括MCS。
如本文所用，术语“产率”是指纯化步骤或工艺后获得的分析物(例如，环状多核糖核苷酸的群体)与起始材料(例如，多核糖核苷酸的混合群体，比如例如，环状和线性多核糖核苷酸)中分析物的量相比的相对量(w/w)。产率可以表示为百分比。在本披露的背景下，可以使用测定(例如，凝胶电泳或分光光度法)对起始材料中分析物(例如，环状多核糖核苷酸)和纯化步骤后获得的分析物的量进行测量。可以使用本披露的方法产生相对于起始材料(例如，多核糖核苷酸的混合群体)中存在的量约20％(w/w)或更高的环状多核糖核苷酸富集群体的产率。例如，可以使用这些方法产生以下产率的纯化的环状多核糖核苷酸：约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％(w/w)或更高。
附图说明
图1是示出如本文所述方法的示意图。左侧的是线性和环状多核糖核苷酸的混合物，其中一些含有靶区域。将与第一捕获剂缀合的寡核苷酸添加至多核糖核苷酸的混合物中，并与含有靶区域的多核糖核苷酸杂交。与颗粒缀合的第二捕获剂与第一捕获剂结合，从而将含有靶区域的多核糖核苷酸与缺乏靶区域的多核糖核苷酸分离。
图2是示出体外转录(IVT)混合物中线性副产物的凝胶，其中环状RNA通过自剪接生成。该凝胶示出了需要的环状RNA产物、非剪接的线性RNA、部分剪接的线性RNA、经切口的环状RNA和剪接的内含子。
图3是示出用于从自剪接生成的环状RNA中去除线性RNA副产物的方法设计的示意图。
图4是示出通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物的环状RNA富集的凝胶。构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。开放阅读框(ORF)是模型蛋白：高斯萤光素酶(gaussia luciferase，Gluc)。
图5是示出通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物的环状RNA富集的凝胶。构建体设计为从5’至3’包括：催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是萤火虫萤光素酶(Fluc)。
图6是示出通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物的环状RNA富集的凝胶。
图7是示出通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物的环状RNA富集的两种不同方式的凝胶。一种方法是将RNA-寡聚物混合物与链霉亲和素-珠一起在管中孵育(分批法(Batch method))，另一种方法是将珠预装在柱中，并借助重力穿过RNA-寡聚物混合物(柱法)。
图8是示出通过连续线性RNA拉下进一步富集环状RNA的凝胶。
图9A和9B中凝胶示出结合缓冲剂中盐浓度对通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物的环状RNA富集的影响。图9A示出了构建体，其设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是hEPO。图9B示出了与图9A相似的构建体但ORF是SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike)。
图10中凝胶示出通过线性RNA拉下法纯化的环状RNA的增强的表达，线性RNA拉下法用于经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物而富集环状RNA。构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是模型蛋白：高斯萤光素酶(Gluc)
图11中凝胶示出通过线性RNA拉下法纯化的环状RNA的增强的表达，线性RNA拉下法用于经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物而富集环状RNA。构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是hEPO。
图12是示出在本文所述的线性拉下法中使用的3’半内含子(#1至#4)和5’半内含子(#5和#6)的示例性寡聚物设计的示意图。
图13A和13B中凝胶示出使用减少数量的寡聚物对通过线性RNA拉下进行的环状RNA富集的影响，线性RNA拉下通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物进行。
图14A和14B中凝胶示出使用两种寡聚物(即，针对3’半内含子的寡聚物和针对5’半内含子的寡聚物)的组合对通过线性RNA拉下进行的环状RNA富集的影响，线性RNA拉下通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物进行。
图15是示出通过线性RNA拉下法纯化的环状RNA的表达的柱状图，线性RNA拉下法用于通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物来富集环状RNA。
图16是示出同时靶向3’半内含子和5’半内含子的示例性单寡聚物的示意图。
图17A和17B中凝胶示出使用同时靶向3’半内含子和5’半内含子的单寡聚物对通过线性RNA拉下进行的环状RNA富集的影响，线性RNA拉下通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物进行。
具体实施方式
本披露描述了用于加工(例如，纯化)核糖核苷酸的组合物和方法。多核糖核苷酸(比如线性或环状多核糖核苷酸)可用于多种工程或治疗目的。然而，当经由某些生物反应生成多核糖核苷酸时，可能存在多种杂质、副产物或不完全产物。本发明的特征在于可用于从样品中减少或去除这些杂质、副产物或不完全产物的方法，以便产生具有希望的多核糖核苷酸组成、量和/或纯度的组合物，或含有多种具有希望的多核糖核苷酸组成、量和/或纯度的多核糖核苷酸的群体。
在某些实施例中，这些方法可用于纯化已经经历剪接反应的多核糖核苷酸。在这种实施例中，这些方法可用于将剪接的多核糖核苷酸与非剪接的多核糖核苷酸分离，或将非剪接的多核糖核苷酸与剪接的多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，这些方法可用于将环状多核糖核苷酸(例如，已被剪接的环状多核糖核苷酸)与线性多核糖核苷酸分离，或将线性多核糖核苷酸与环状多核糖核苷酸分离。此类含有所需多核糖核苷酸的纯化的组合物可用于多种下游应用，比如将多核苷酸负载物(例如，编码基因或蛋白质)递送至靶细胞。以下更详细地描述了这些组合物和方法。
方法
在一些实施例中，本文所述的方法包括从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品。所述多种多核糖核苷酸的子集具有靶区域。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的所述多种多核糖核苷酸中分离具有与所述寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸(图1)。
在一些实施例中，本文所述的方法包括从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物的多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的线性多核糖核苷酸的步骤。在此方法中，提供了包含所述多种多核糖核苷酸的样品。样品中所述多种线性多核糖核苷酸的子集具有靶区域。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的所述多种多核糖核苷酸中分离具有与所述寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸的步骤。在一些实施例中，具有靶区域的多核糖核苷酸缺乏polyA序列(例如，polyA尾)。在一些实施例中，靶区域不位于具有所述靶区域的多核糖核苷酸的3'或5'末端。环状多核糖核苷酸或其子集可能没有靶区域。
在一些实施例中，本文所述的方法包括从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸的步骤。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集具有所述靶区域。靶区域不位于具有所述靶区域的多核糖核苷酸的3’或5’末端(例如，靶区域位于多核糖核苷酸内部)。所述方法进一步包括使样品与和靶区域杂交的寡核苷酸接触，并从样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸。
在一些实施例中，本文所述的方法包括通过与靶区域的差异结合亲和力分离多核糖核苷酸。当靶结合区存在于差异二级结构元件(调节用于结合的靶位点的进入)内时，可以实现差异结合。例如，寡核苷酸能以第一亲和力与第一结构构象的多核糖核苷酸的靶区域结合，并且以第二亲和力(例如，其不同于第一亲和力)与第二结构构象的多核糖核苷酸的靶区域结合。在一些实施例中，当靶区域存在于线性或环状多核糖核苷酸内，或存在于以两种或更多种不同的结构构象存在的多核糖核苷酸内时，可能出现差异结合或二级结构元件。例如，寡核苷酸能以第一结合亲和力与线性多核糖核苷酸的靶区域结合，并且以第二结合亲和力与环状多核糖核苷酸的靶区域结合。第一结合亲和力可以大于第二结合亲和力。替代性地，第一结合亲和力可以小于第二结合亲和力。较低的结合亲和力使得寡核苷酸优先与靶标结合，例如优先于结合亲和力更大的构象的靶标。
在一些实施例中，本文所述的方法包括将具有靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与具有所述靶区域的第二构象的多种多核糖核苷酸分离。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品。所述方法进一步包括使样品与寡核苷酸接触。寡核苷酸以第一结合亲和力与第一构象的多核苷酸的靶区域杂交，并且所述寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与第二构象的多核苷酸的靶区域杂交，并将具有与寡核苷酸杂交的靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与样品中第二构象的多种多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，第一结合亲和力小于第二结合亲和力，并且寡核苷酸优先与第一构象的多核糖核苷酸结合。
在一些实施例中，所述方法包括使多核糖核苷酸与和颗粒(例如，有或没有捕获剂)缀合的寡核苷酸接触的步骤。
在一些实施例中，本文所述的方法包括将具有靶区域的线性多核糖核苷酸与具有所述靶区域的多种环状多核糖核苷酸分离的步骤。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品。所述方法进一步包括使样品与寡核苷酸接触。寡核苷酸以第一结合亲和力与线性多核苷酸的靶区域杂交，并且寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与环状多核苷酸的靶区域杂交，并将样品中具有与所述寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸与多种环状多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，所述方法包括使多核糖核苷酸与和颗粒(例如，有或没有捕获剂)缀合的寡核苷酸接触的步骤。
在本文所述方法的一些实施例中，寡核苷酸与第一捕获剂缀合。在一些实施例中，所述方法进一步包括提供与第一捕获剂结合的第二捕获剂的步骤。第二捕获剂可以与颗粒缀合。在一些实施例中，第一捕获剂与颗粒缀合。
在一些实施例中，寡核苷酸与颗粒缀合。
在一些实施例中，本文所述的方法包括从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸的步骤。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸和与第一捕获剂缀合的寡核苷酸的样品。所述多种多核糖核苷酸的子集具有靶区域，并且寡核苷酸与靶区域杂交。所述方法进一步包括以下步骤：使样品与和第一捕获剂结合的第二捕获剂接触，并从样品中的多种多核糖核苷酸中分离具有与寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸。
在一些实施例中，本文所述的方法包括将具有靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与具有所述靶区域的第二构象的多种多核糖核苷酸分离的步骤。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸和与第一捕获剂缀合的寡核苷酸的样品。寡核苷酸以第一结合亲和力与第一构象的多核苷酸的靶区域杂交，并且寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与第二构象的多核苷酸的靶区域杂交。所述方法进一步包括以下步骤：使样品与和第一捕获剂结合的第二捕获剂接触，并将样品中具有与寡核苷酸杂交的靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与第二构象的多种多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，第一结合亲和力小于第二结合亲和力，并且寡核苷酸优先与第一构象的多核糖核苷酸结合。
在一些实施例中，本文所述的方法包括将具有靶区域的线性多核糖核苷酸与包含所述靶区域的多种环状多核糖核苷酸分离的步骤。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸和与第一捕获剂缀合的寡核苷酸的样品。寡核苷酸以第一结合亲和力与线性多核苷酸的靶区域杂交，并且所述寡核苷酸以不同于第一结合亲和力的第二结合亲和力与环状多核苷酸的靶区域杂交。所述方法进一步包括以下步骤：使样品与和第一捕获剂结合的第二捕获剂接触，并将样品中具有与寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸与多种环状多核糖核苷酸分离。
在一些实施例中，本文所述的方法包括例如使用没有第一或第二捕获剂的寡核苷酸从多种多核糖核苷酸中分离具有靶区域的多核糖核苷酸的步骤。寡核苷酸可以与颗粒直接缀合。所述方法包括提供包含所述多种多核糖核苷酸和与颗粒缀合的寡核苷酸的样品。所述多种多核糖核苷酸的子集具有靶区域，并且寡核苷酸与靶区域杂交。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域不位于具有靶区域的多核糖核苷酸的5’或3’末端。例如，靶区域可以位于多核糖核苷酸内部。在一些实施例中，靶区域不位于多核糖核苷酸的3’末端。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域位于所述多核糖核苷酸的5’或3’末端，并且靶区域不含polyA序列。在一些实施例中，靶区域位于多核糖核苷酸的3’末端并且不含polyA序列。
在本文所述任何方法的一些实施例中，靶区域不含polyA序列(例如，polyA尾)。
在本文所述任何方法的一些实施例中，分离包括将寡核苷酸固定。所述方法可以包括例如，将寡核苷酸、第一捕获剂、第二捕获剂、颗粒、或其组合固定。
在一些实施例中，颗粒是磁性颗粒。所述方法可以包括向磁性颗粒施加力，比如磁力。颗粒或珠可以是例如交联琼脂糖(例如，)珠。所述方法可以包括向珠或颗粒施加力，比如机械力、光学力、离心力或声学力。
在一些实施例中，具有靶区域的多核糖核苷酸包括内含子或其部分(例如，半内含子)。靶区域可以包括内含子或其部分。在一些实施例中，内含子或其部分是催化内含子(例如，I型催化内含子或II型催化内含子)或其部分。在一些实施例中，内含子或其部分的长度为至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸。在一些实施例中，内含子或其部分的长度为20个至500个、20个至400个、20个至300个、20个至200个、20个至100个、50个至500个、50个至400个、50个至300个、50个至200个、100个至500个、100个至400个、100个至300个或100个至200个核苷酸。
在一些实施例中，靶区域包括半内含子(例如，催化内含子的5’或3’部分)。在一些实施例中，靶区域包括5’半内含子(例如，对应于催化内含子5’部分的5’半内含子)。在一些实施例中，靶区域包括3’半内含子(例如，对应于催化内含子3’部分的3’半内含子)。在一些实施例中，靶区域包括I型催化内含子的5’一半。在一些实施例中，I型催化内含子的5’一半来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的5’部分。在一些实施例中，靶区域包括I型催化内含子的3’一半。在一些实施例中，I型催化内含子的3’一半选自来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的3’部分。
如本文所述的，这些方法可用于将例如剪接的与非剪接的多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，本文所述的方法包括将剪接的多核糖核苷酸与非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分离。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，剪接的多核糖核苷酸缺乏内含子或其部分，例如在生成期间的剪接(例如，自剪接)事件后。在一些实施例中，具有内含子或其部分的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将捕获的具有靶区域和/或捕获剂(例如，第一和/或第二捕获剂)的多核糖核苷酸洗涤一次或更多次(例如，两次、三次、四次、五次或更多次)。洗涤可以在接触后和/或分离步骤后进行。
在一些实施例中，所述方法进一步包括进行第一洗脱步骤，以从具有靶区域的多核糖核苷酸中释放捕获的包括靶区域和/或捕获剂(例如，第一和/或第二捕获剂)的多核糖核苷酸。第一洗脱步骤可以包括添加第一缓冲剂和/或将样品加热至，例如至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高。
在一些实施例中，所述方法进一步包括进行第二洗脱步骤。第二洗脱步骤可以包括添加第二缓冲剂和/或将样品加热至例如至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高。在一些实施例中，第二缓冲剂包括变性剂，例如甲酰胺或尿素。第二缓冲剂可以包括，例如约40％至约60％的甲酰胺(例如，约40％、45％、50％、55％或60％的甲酰胺)。
在一些实施例中，所述方法包括将样品与寡核苷酸和/或捕获剂(例如第一和/或第二捕获剂)一起孵育至少十分钟(例如，至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟或更长)。
在一些实施例中，所述方法包括收集不被捕获剂(例如，第一和/或第二捕获剂)和/或寡核苷酸结合的样品的部分。
在一些实施例中，所述方法包括提供多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸都与不同的靶区域杂交。每种寡核苷酸都可以与例如第一捕获剂或颗粒(例如，磁性颗粒或珠)缀合。
在一些实施例中，所述方法包括提供与多个靶区域杂交的寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括提供与3’半内含子和5’半内含子杂交的寡核苷酸。
在一些实施例中，所述方法包括提供与3’半内含子杂交的第一寡核苷酸以及与5’半内含子杂交的第二寡核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括提供多种寡核苷酸，每种寡核苷酸都与3’半内含子和/或5’半内含子上的不同区域杂交。
在一些实施例中，所述方法包括提供与多核糖核苷酸的摩尔比为10:1至1:10(例如，10:1、5:1、2:1、1:2、1:5或1:10)的寡核苷酸。
在一些实施例中，所述方法包括提供颗粒(例如珠，例如磁珠)的样品。颗粒可以存在于容器(例如，微量离心管)中或填充于柱中。颗粒可以与寡核苷酸缀合。所述方法可以包括使多核糖核苷酸(例如，与和第一捕获剂缀合的寡核苷酸)的混合物流动通过含有颗粒的柱。因此，被寡核苷酸结合的多核糖核苷酸将与柱结合。在一些实施例中，颗粒与第二捕获剂缀合，例如，所述第二捕获剂被配置为与和寡核苷酸缀合的第一捕获剂结合。在其他实施例中，颗粒与寡核苷酸直接缀合，例如所述寡核苷酸被配置为与多核糖核苷酸的靶区域杂交。
在一些实施例中，例如当使用磁性颗粒时，所述方法可以包括例如在容器(例如微量离心管)中通过提供永磁体来粒化磁性颗粒。
在一些实施例中，本文所述的方法富集了样品中一定量的所需多核糖核苷酸。例如，所述方法可富集相对于纯化前样品的至少10％(例如，至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多)的量的所需(例如，剪接的)多核糖核苷酸。
在一些实施例中，纯化方法产生了具有少于50％(mol/mol)(例如，少于40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％(mol/mol))的线性多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸。
寡核苷酸
本文所述的寡核苷酸被配置为与多核糖核苷酸的靶区域杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶区域的等长部分具有至少80％(例如，至少85％、90％、95％、97％、99％或100％)互补性。在一些实施例中，寡核苷酸与多核糖核苷酸的靶区域的错配至多为10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个。在一些实施例中，寡核苷酸与靶区域没有错配。在一些实施例中，寡核苷酸可以是经修饰的寡核苷酸(例如，具有经修饰的磷酸盐、糖或碱基)。在一些实施例中，寡核苷酸含有被配置为与靶区域杂交的部分和不与靶区域(例如，末端区域)杂交的部分。
寡核苷酸的长度可以为例如至少5个核苷酸(例如，至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的长度为，例如5-100个、5-95个、10-90个、10-80个、12-60个、15-50个、15-40个、15-30个、18-30个、20-25或20-22个核苷酸。
寡核苷酸可以例如具有30％-70％(例如，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％)的GC含量。寡核苷酸可以具有例如约45℃至约75℃(例如，约46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃)的解链温度(Tm)。
捕获剂
如本文所述的，寡核苷酸和/或颗粒可以与捕获剂缀合。捕获剂被配置为结合(例如，捕获)靶分子。捕获剂或一组捕获剂(例如，第一和/或第二捕获剂)可以包括任何亲和对，比如抗体或其抗原结合片段和抗原。类似地，亲和对可以包括受体或其片段和其同源配体。第一捕获剂和第二捕获剂可以是配置为以足够的结合能相互作用以允许共价或非共价(例如，离子或范德华力(van der Waals force))相互作用的任何两种分子。
在本文所述组合物或方法中使用的寡核苷酸可以与第一捕获剂缀合。在一些实施例中，第一捕获剂包括抗原。抗原可以是例如，生物素。
如本文所述的，捕获剂或寡核苷酸(例如，与捕获剂缀合的寡核苷酸)可以与第二捕获剂结合或被配置为与第二捕获剂结合。在一些实施例中，第二捕获剂包括抗体或其抗原结合片段，例如，被配置为与抗原结合。第二捕获剂可以是例如，链霉亲和素。在一些实施例中，寡核苷酸不与第一捕获剂缀合或不包括第一捕获剂，并且第二捕获剂直接与寡核苷酸结合。
在一些实施例中，第一捕获剂是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，第二捕获剂是抗原。
颗粒
本文所述的寡核苷酸和/或捕获剂可以与颗粒(例如，磁性颗粒或珠)缀合。在一些实施例中，寡核苷酸和/或捕获剂与多种颗粒缀合。在一些实施例中，颗粒与多种捕获剂和/或寡核苷酸缀合。
磁性颗粒包括至少一种响应于磁力的组分。磁性颗粒可以完全是磁性的或可以含有非磁性组分。磁性颗粒可以是磁珠，例如，基本上呈球形的磁珠。磁性颗粒可以完全是磁性的或可以含有一个或多个磁性核，这些磁性核被一种或多种额外的材料(比如例如，一种或多种官能团和/或用于与一种或多种靶分子结合的修饰)包围。在一些实例中，磁性颗粒可以含有磁性组分和经一种或多种硅烷醇基团修饰的表面。这种类型的磁性颗粒可用于结合靶核酸分子。
颗粒(例如，磁性颗粒或珠)可以是有孔的、无孔的、中空的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，颗粒(例如，珠)可以是可溶解的或可降解的。在一些情况下，颗粒(例如，珠)可能不是可降解的。在一些实施例中，珠由交联琼脂糖(例如，)构成。
颗粒(例如，磁性颗粒或珠)可以包括天然和/或合成材料。例如，颗粒(例如，珠)可以包括天然聚合物、合成聚合物或天然及合成聚合物二者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，比如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、车前草(ispaghula)、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶、琼脂糖、海藻酸、海藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸树脂、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、多元羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯代三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氧亚甲基)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)、和/或其组合(例如，共聚物)。珠也可以由除了聚合物之外的材料形成，这些材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃-陶瓷、复合材料、金属、其他无机材料等。
交联可以是永久的或可逆的，这取决于使用的特定交联剂。可逆交联在适当的条件下可以使得聚合物线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可以使与珠表面结合的材料进行可逆附接。
颗粒(例如，珠或磁性颗粒)可以是大小均匀的或大小不均一的。在一些情况下，颗粒(例如，珠)的直径可以为至少约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更大。在一些情况下，颗粒(例如，珠)的直径可以为小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更小。在一些情况下，颗粒(例如，珠)的直径可以为在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm、或20-500μm、500μm-1mm、1mm-2mm、1-5mm或1-10mm的范围内。
颗粒可以具有任何合适的形状。颗粒(例如，磁性颗粒或珠)形状的实例包括但不限于球形、非球形、卵形、椭圆形、无定形、环状、圆柱形及其变体。
接头
在一些实施例中，接头用于缀合本文所述的组合物或方法中使用的两种或更多种组分。例如，接头可用于将寡核苷酸与捕获剂、捕获剂与颗粒(例如，珠)、寡核苷酸与颗粒(例如，珠)或其任何组合或变体缀合。在一些实施例中，寡核苷酸通过化学接头与第一捕获剂缀合。化学接头可以与寡核苷酸的3’端或5’端缀合。替代性地，化学接头可以与寡核苷酸的内部区域缀合。
在一些实施例中，第二捕获剂与颗粒缀合。颗粒可以是例如磁性颗粒或珠。珠可以是例如交联琼脂糖(例如，)珠。在一些实施例中，寡核苷酸直接与颗粒(例如珠，例如磁珠或交联琼脂糖(例如，)珠)缀合。
化学接头提供例如寡核苷酸与捕获剂(例如，第一捕获剂)和/或捕获剂(例如，第二捕获剂)与颗粒之间的空间、刚性和/或柔性。在一些实施例中，接头可以是键，例如共价键(例如酰胺键、二硫键、C-O键、C-N键、N-N键、C-S键)或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何类型的键。在一些实施例中，接头包括不超过250个原子(例如，1-2个、1-4个、1-6个、1-8个、1-10个、1-12个、1-14个、1-16个、1-18个、1-20个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个、1-50个、1-55个、1-60个、1-65个、1-70个、1-75个、1-80个、1-85个、1-90个、1-95个、1-100个、1-110个、1-120个、1-130个、1-140个、1-150个、1-160个、1-170个、1-180个、1-190个、1-200个、1-210个、1-220个、1-230个、1-240个或1-250个原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个原子)。在一些实施例中，接头包括不超过250个非氢原子(例如，1-2个、1-4个、1-6个、1-8个、1-10个、1-12个、1-14个、1-16个、1-18个、1-20个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个、1-50个、1-55个、1-60个、1-65个、1-70个、1-75个、1-80个、1-85个、1-90个、1-95个、1-100个、1-110个、1-120个、1-130个、1-140个、1-150个、1-160个、1-170个、1-180个、1-190个、1-200个、1-210个、1-220个、1-230个、1-240个或1-250个非氢原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个非氢原子)。在一些实施例中，接头的主链包括不超过250个原子(例如，1-2个、1-4个、1-6个、1-8个、1-10个、1-12个、1-14个、1-16个、1-18个、1-20个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个、1-50个、1-55个、1-60个、1-65个、1-70个、1-75个、1-80个、1-85个、1-90个、1-95个、1-100个、1-110个、1-120个、1-130个、1-140个、1-150个、1-160个、1-170个、1-180个、1-190个、1-200个、1-210个、1-220个、1-230个、1-240个或1-250个原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个原子)。接头的“主链”是指接头中一起形成缀合物的一部分至缀合物的另一部分的最短路径的原子。接头主链中的原子直接参与将缀合物的一部分与缀合物的另一部分连接。例如，接头主链中与碳附接的氢原子不被视为直接参与缀合物的一部分与缀合物的另一部分的连接。
在一些实施例中，接头可以包括衍生自例如，合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)聚合物)的合成基团。化学接头可以包括，例如三乙二醇(TEG)。在一些实施例中，接头可以包括一个或多个氨基酸残基。在一些实施例中，接头可以是氨基酸序列(例如，1-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-9个氨基酸、1-8个氨基酸、1-7个氨基酸、1-6个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸、1-2个氨基酸或1个氨基酸序列)。在一些实施例中，接头可以包括一个或多个任选地取代的C1-C20亚烷基、任选地取代的C1-C20杂亚烷基(例如，PEG单元)、任选地取代的C2-C20亚烯基(例如，C2亚烯基)、任选地取代的C2-C20杂亚烯基、任选地取代的C2-C20亚炔基、任选地取代的C2-C20杂亚炔基、任选地取代的C3-C20环亚烷基(例如，环亚丙基、环亚丁基)、任选地取代的C2-C20杂环亚烷基、任选地取代的C4-C20环亚烯基、任选地取代的C4-C20杂环亚烯基、任选地取代的C8-C20环亚炔基、任选地取代的C8-C20杂环亚炔基、任选地取代的C5-C15亚芳基(例如，C6亚芳基)、任选地取代的C3-C15杂亚芳基(例如，咪唑、吡啶)、O、S、NRi(Ri是H、任选地取代的C1-C20烷基、任选地取代的C1-C20杂烷基、任选地取代的C2-C20烯基、任选地取代的C2-C20杂烯基、任选地取代的C2-C20炔基、任选地取代的C2-C20杂炔基、任选地取代的C3-C20环烷基、任选地取代的C2-C20杂环烷基、任选地取代的C4-C20环烯基、任选地取代的C4-C20杂环烯基、任选地取代的C8-C20环炔基、任选地取代的C8-C20杂环炔基、任选地取代的C5-C15芳基或任选地取代的C3-C15杂芳基)、P、羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酸、磷酰基或亚氨基。
使用接头的缀合物中两种或更多种组分的共价缀合可以使用熟知的有机化学合成技术和方法完成。两种组分上的互补官能团可以彼此反应形成共价键。互补反应官能团的实例包括但不限于，例如马来酰亚胺和半胱氨酸、胺和活化的羧酸、硫醇和马来酰亚胺、活化的磺酸和胺、异氰酸酯和胺、叠氮化物和炔烃、以及烯烃和四嗪。可以使用本领域已知的技术完成与多肽的位点特异性缀合。
组合物
如本文所述的，本发明的特征在于包括通过如本文所述的方法产生的多核糖核苷酸群体的组合物。所述群体可以包括，例如缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述环状多核糖核苷酸包括组合物中总多核糖核苷酸的至少1％(例如至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多)(mol/mol)。在一些实施例中，所述群体具有组合物中小于50％(例如，小于40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％)(mol/mol)的线性多核糖核苷酸。
在其他实施例中，所述群体可以包括例如具有靶区域的第一构象的多核糖核苷酸以及具有靶区域的第二构象的多核糖核苷酸，并且第一构象的多核糖核苷酸包括组合物中总多核糖核苷酸的至少1％，例如至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％或至少40％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多)(mol/mol)。
在如本文所述的一些实施例中，本发明的特征在于包括多核糖核苷酸混合物的组合物。所述混合物的第一子集包括缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述多种多核糖核苷酸的第二子集包括具有靶区域的线性多核糖核苷酸。第一子集包括组合物中总多核糖核苷酸的至少1％，例如，至少5％，例如至少10％、至少20％、至少30％、或至少40％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多)(mol/mol)。
在如本文所述的一些实施例中，本发明的特征在于包含具有靶区域的多核糖核苷酸和配置为与靶区域杂交的寡核苷酸的组合物，其中寡核苷酸与第一捕获剂(例如抗原，比如生物素)缀合。所述组合物可进一步包含例如缺乏靶区域的多核糖核苷酸。缺乏靶区域的多核糖核苷酸可以是，例如环状多核糖核苷酸。所述组合物可以进一步包括配置为与第一捕获剂结合的第二捕获剂(例如抗体或其抗原结合片段，比如链霉亲和素)。第二捕获剂可以与颗粒缀合，例如经由接头。
在如本文所述的任何组合物的一些实施例中，线性多核糖核苷酸包括内含子或其部分。靶区域可以包括内含子或其部分。靶区域可以位于内含子或其部分的5’或3’。
在一些实施例中，多核糖核苷酸可以是经修饰的多核糖核苷酸。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是基于质量至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、或100％(w/w)纯的。纯度可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用HPLC、使用UHPLC等，或通过IC、通过SEC、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素PAGE、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、RNA、毛细管、c-IEF等)，使用基于质谱法、UV-Vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(CD)光谱法、UV或UV-Vis分光光度法、荧光法(例如，Qubit)、RNA酶H分析、表面等离子体共振(SPR)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。
在一些实施例中，可以通过生物学测试方法(例如，基于细胞的或基于受体的测试)来测量纯度。在一些实施例中，本文所述的制剂中总质量核糖核苷酸的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或100％(w/w)以环状多核糖核苷酸分子包含。该百分比可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用HPLC、使用UHPLC等，或通过IC、通过SEC、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素PAGE、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、RNA、毛细管、c-IEF等)，使用基于质谱法、UV-Vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(CD)光谱法、UV或UV-Vis分光光度法、荧光法(例如，Qubit)、RNA酶H分析、表面等离子体共振(SPR)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有至少0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、5000μg/mL、10,000μg/mL、100,000μg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL、500mg/mL、600mg/mL、650mg/mL、700mg/mL、或750mg/mL的环状多核糖核苷酸浓度。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含单核苷酸或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/mL、5000μg/mL、10,000μg/mL、或100,000μg/mL的单核苷酸含量。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/mL、5000μg/mL、10,000μg/mL、或100,000μg/mL的单核苷酸含量。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有基于质量占总核苷酸不超过0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.7％(w/w)、0.8％(w/w)、0.9％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、或其间的任何百分比的单核苷酸含量，其中总核苷酸含量是脱氧核糖核苷酸分子和核糖核苷酸分子的总质量。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL、500mg/mL、600mg/mL、650mg/mL、700mg/mL、或750mg/mL的线性RNA含量，例如线性RNA对应物或RNA片段。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性RNA含量，例如线性RNA对应物或RNA片段。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过10％(w/w)、9.9％(w/w)、9.8％(w/w)、9.7％(w/w)、9.6％(w/w)、9.5％(w/w)、9.4％(w/w)、9.3％(w/w)、9.2％(w/w)、9.1％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的经切口RNA含量。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的经切口RNA含量或基本上不含经切口RNA。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的组合的线性RNA和经切口RNA含量。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的组合的经切口RNA和线性RNA含量或基本上不含经切口和线性RNA。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过分析方法的检测限的线性RNA含量，例如线性RNA对应物或RNA片段，这些分析方法诸如利用以下项的方法：质谱法、UV光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括HPLC的表面等离子体共振(SPR)、通过HPLC、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用银或染料染色或放射性衰变的检测方法、或显微镜法、目测法或分光光度计。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过实例2中的方法测量的不超过0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的线性RNA。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸分子的线性对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括线性对应物(例如，环化前形式)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子片段是长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000个、或更多个核苷酸、或其间的任何核苷酸数的片段。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的从约1.6至约2.3的A260/A280吸光度比。在一些实施例中，A260/A280吸光度比是约1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、或其间的任何数。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的大于约1.8的A260/A280吸光度比。在一些实施例中，A260/A280吸光度比是约1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或更大。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含杂质或副产物。在各种实施例中，包含环状多核糖核苷酸的组合物中至少一种杂质或副产物的水平与在去除杂质或副产物的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种工艺相关杂质或副产物的水平与在去除杂质或副产物的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种产物相关物质的水平与在去除杂质或副产物的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)进一步基本上不含工艺相关杂质或副产物。在一些实施例中，工艺相关杂质或副产物包括蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)、脱氧核糖核酸(例如，细胞脱氧核糖核酸，诸如宿主细胞脱氧核糖核酸)、单脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸分子、酶(例如，核酸酶(诸如核酸内切酶或核酸外切酶)、或连接酶)、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。在一些实施例中，杂质或副产物选自：缓冲试剂、连接酶、核酸酶、RNA酶抑制剂、RNA酶R、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺凝胶碎片、和单脱氧核糖核苷酸分子。在一些实施例中，药物制剂包括少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng的蛋白质污染物、杂质或副产物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质(例如，细胞蛋白质，比如宿主细胞蛋白质)污染物、杂质或副产物。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含DNA含量，例如模板DNA或细胞DNA(例如，宿主细胞DNA)，或具有低至零的DNA含量，或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/mL、5000μg/mL、10,000μg/mL、或100,000μg/mL的DNA含量。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的DNA含量，其中总核苷酸分子是脱氧核糖核苷酸含量和核糖核苷酸分子的总质量。在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的DNA含量，如在通过消化核苷的酶进行总DNA消化后通过定量液相色谱法-质谱法(LC-MS)测量的，其中DNA的含量从如通过LC-MS测量的每种碱基(即，A、C、G、T)的标准曲线反演计算出。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，细胞蛋白质(CP)(例如，酶)、生产相关蛋白(例如，载剂蛋白))污染物、杂质或副产物。在实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测限至0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，生产相关蛋白比如细胞蛋白质(CP)，例如酶)污染物、杂质或副产物。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(CP)，例如酶)污染物、杂质或副产物。在实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测水平至0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白比如细胞蛋白质(CP)，例如酶)污染物、杂质或副产物。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低水平的内毒素或基本上不存在内毒素，例如如通过鲎变形细胞裂解物(LAL)测试测量的。在一些实施例中，药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于20EU/kg(重量)、10EU/kg、5EU/kg、1EU/kg的内毒素，或缺乏内毒素。在实施例中，环状多核糖核苷酸组合物具有低水平或不存在的核酸酶或连接酶。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)包含不大于约50％(w/w)、45％(w/w)、40％(w/w)、35％(w/w)、30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、19％(w/w)、18％(w/w)、17％(w/w)、16％(w/w)、15％(w/w)、14％(w/w)、13％(w/w)、12％(w/w)、11％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)的至少一种酶，例如聚合酶，例如RNA聚合酶。
在实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是无菌的或基本上不含微生物，例如组合物或制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长，组合物或制剂满足USP<71>的标准，和/或组合物或制剂满足USP<85>的标准。在一些实施例中，药物制剂在灭菌之前包含少于100CFU/100ml、50CFU/100ml、40CFU/100ml、30CFU/100ml、200CFU/100ml、10CFU/100ml、或10CFU/100ml的生物负荷。
在一些实施例中，可以使用本领域中已知的去除杂质或副产物的技术(比如柱色谱法或pH、小瓶灭活)进一步纯化环状多核糖核苷酸制剂。
多核苷酸
本发明的特征在于在分离和/或纯化方法中使用的以及存在于本文所述的组合物中的多核糖核苷酸。本文所述的多核糖核苷酸可以是线性多核糖核苷酸、环状多核糖核苷酸或其组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸由线性多核糖核苷酸产生(例如，通过剪接线性多核糖核苷酸的相容端)。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸从脱氧核糖核苷酸模板(例如，载体、线性化载体或cDNA)转录。因此，本发明的特征在于可用于产生多核糖核苷酸的线性脱氧核糖核苷酸、环状脱氧核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸、和环状多核糖核苷酸及其组合物。
线性多核糖核苷酸
本发明的特征在于可以包括以下一种或多种的线性多核糖核苷酸：3’半内含子；3’剪接位点；3’外显子；多核糖核苷酸负载物；5’外显子；5’剪接位点；以及5′半内含子。在一些实施例中，3’半内含子对应于催化I型内含子(例如，来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的催化I型内含子)的3’部分。在一些实施例中，5’半内含子对应于催化I型内含子(例如，来自蓝细菌鱼腥藻属前tRNA-Leu基因、四膜虫前rRNA、T4噬菌体td基因或其变体的催化I型内含子)的5’部分。
线性多核糖核苷酸可以包括例如在以上所述的元件中的任一者之外或之间的额外的元件。例如，如本文所述的，以上元件的任一者可以通过间隔子序列隔开。如本文所述的靶区域可以存在于如本文所述的线性多核糖核苷酸的任何区域。在一些实施例中，靶区域存在于内含子或其部分内。
在某些实施例中，本文提供了一种通过使用本文提供的脱氧核糖核苷酸(例如，载体、线性化载体或cDNA)作为模板(例如，本文提供的载体、线性化载体或cDNA，它们具有位于编码线性多核糖核苷酸的区域上游的RNA聚合酶启动子)在无细胞系统中进行转录(例如，体外转录)来生成线性多核糖核苷酸的方法。
脱氧核糖核苷酸模板可以被转录以产生含有本文所述组分的线性多核糖核苷酸。表达后，线性多核糖核苷酸可以产生剪接相容的多核糖核苷酸，该剪接相容的多核糖核苷酸可以被剪接以产生环状多核糖核苷酸，例如，用于随后使用。
在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的长度为50个至20,000个，例如300个至20,000个(例如，50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,500个、3,000个、3,500个、4,000个、5,000个、6,000个、7,000个、8,000个、9,000个、10,000个、11,000个、12,000个、13,000个、14,000个、15,000个、16,000个、17,000个、18,000个、19,000个或20,000个)核糖核苷酸。线性多核糖核苷酸的长度可以为，例如至少500个、至少1,000个、至少2,000个、至少3,000个、至少4,000个或至少5,000个核糖核苷酸。
环状多核糖核苷酸
在一些实施例中，本发明的特征在于环状多核糖核苷酸。环状多核糖核苷酸可以包括连接5’外显子和3’外显子的剪接点。如本文所述的靶区域可以存在于如本文所述的环状多核糖核苷酸的任何区域。环状多核糖核苷酸可能例如在剪接之后缺乏内含子。
环状多核苷酸可以进一步包含多核糖核苷酸负载物。多核糖核苷酸负载物可以包含表达序列、非编码序列、或表达序列和非编码序列的组合。多核糖核苷酸负载物可以包含编码多肽的表达序列。多核糖核苷酸可以包含与编码多肽的表达序列可操作地连接的IRES。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括IRES与5'外显子片段或3'外显子片段之间的间隔子区域。间隔子区域的长度可以为例如至少5个(例如至少10个、至少15个、至少20个)核糖核苷酸。间隔子区域可以为例如5个至500个(例如，10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个)核糖核苷酸。在一些实施例中，间隔子区域包括polyA序列。在一些实施例中，间隔子区域包括polyA-C、polyA-G、polyA-U或其他异源或随机序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此可以产生至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少1400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文所述的元件。在一些实施例中，这些元件可以通过间隔子序列彼此隔开。在一些实施例中，这些元件可以被1个核糖核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1000个核苷酸、最多约1kb、至少约1000个核苷酸、或其间任意量的核苷酸彼此隔开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此邻接，例如缺乏间隔子元件。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含一个或多个重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文所述的修饰。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸含有至少一个核苷修饰。在一个实施例中，高达100％的环状多核糖核苷酸的核苷被修饰。在一个实施例中，至少一个核苷修饰是尿苷修饰或腺苷修饰。
作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性多核糖核苷酸的特征。例如，环状多核糖核苷酸可以含有比线性多核糖核苷酸更易接近或更难接近的靶区域。在一些实施例中，与线性多核糖核苷酸相比，环状多核糖核苷酸可能较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性多核糖核苷酸更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。环状多核糖核苷酸与线性多核糖核苷酸相比增加的稳定性使得环状多核糖核苷酸作为产生多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性多核糖核苷酸相比，存储更容易且时间更长。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，这些方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。此外，与线性多核糖核苷酸不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。
多核糖核苷酸负载物
本文所述的多核糖核苷酸负载物包括包含至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括表达序列、非编码序列、或表达序列和非编码序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括编码多肽的表达序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括与编码多肽的表达序列可操作地连接的IRES。在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括编码对受试者具有生物学效应的多肽的表达序列。
例如，多核糖核苷酸负载物可以包括至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸、或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括1-20,000个核苷酸、1-10,000个核苷酸、1-5,000个核苷酸、100-20,000个核苷酸、100-10,000个核苷酸、100-5,000个核苷酸、500-20,000个核苷酸、500-10,000个核苷酸、500-5,000个核苷酸、1,000-20,000个核苷酸、1,000-10,000个核苷酸或1,000-5,000个核苷酸。
在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个表达(或编码)序列，其中每个表达(或编码)序列编码多肽。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括一个或多个非编码序列。在实施例中，多核糖核苷酸负载物完全由一个或多个非编码序列组成。在实施例中，多核糖核苷酸负载物包括表达(或编码)和非编码序列的组合。
在一些实施例中，如本文所述制备的多核糖核苷酸用作治疗或农业中的效应子。例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞的方法)制备的环状多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在另一个实例中，可将通过本文所述的方法(例如，本文所述的无细胞方法)制备的环状多核糖核苷酸递送到细胞。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括如PCT公开号WO 2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合，该文献通过引用以其全文特此并入。
在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括开放阅读框。在一些实施例中，开放阅读框与IRES可操作地连接。开放阅读框可以编码RNA或多肽。在一些实施例中，开放阅读框编码多肽，并且例如与编码多肽的线性多核糖核苷酸相比，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)提供增加的多肽表达(例如，增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)。在一些实施例中，例如与环状和线性多核糖核苷酸的群体相比，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)的纯度增加促使多肽的表达增加(例如，增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)。
多肽表达序列
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个表达(或编码)序列，其中每个表达序列编码多肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个表达(或编码)序列。
每个编码的多肽可以是直链或支链的。在实施例中，多肽具有约5至约40,000个氨基酸、约15至约35,000个氨基酸、约20至约30,000个氨基酸、约25至约25,000个氨基酸、约50至约20,000个氨基酸、约100至约15,000个氨基酸、约200至约10,000个氨基酸、约500至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸或它们之间的任何范围的长度。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸或更少的多肽可能是有用的。
本文包括的多肽可包括天然存在的多肽或非天然存在的多肽。在一些实施例中，该多肽是或包括参考多肽的功能性片段或变体(例如，酶的酶活性片段或变体)。例如，该多肽可以是本文所述的任一多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些情况下，多肽可以与目的蛋白具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％、或更大)同一性。
多肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标志物、抗原、治疗性多肽、或用于农业应用的多肽。
治疗性多肽可以是激素、神经递质、生长因子、酶(例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、ATP非依赖性酶、溶酶体酶、去饱和酶)、细胞因子、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，诸如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链或轻链的多肽)、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、干扰素、白介素和溶栓剂。
用于农业应用的多肽可以是细菌素、溶素、抗微生物多肽、抗真菌多肽、根瘤富含C的肽、细菌细胞调节肽、肽毒素、杀虫多肽(例如，杀昆虫多肽或杀线虫多肽)、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，诸如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链或轻链的多肽)、酶(例如，核酸酶、淀粉酶、纤维素酶、肽酶、脂肪酶、几丁质酶)、肽信息素和转录因子。
在一些情况下，多核糖核苷酸表达非人蛋白。
在一些实施例中，多核糖核苷酸表达抗体，例如抗体片段或其部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包括多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成所述抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包括一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
在实施例中，多肽包括多个多肽，例如，一个多肽序列的多个拷贝、或多个不同的多肽序列。在实施例中，多个多肽通过接头氨基酸或间隔氨基酸连接。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码信号肽的序列。已经描述了许多信号肽序列，例如，Tat(双精氨酸易位)信号序列通常是含有共有SRRxFLK“双精氨酸”基序的N末端肽序列，其用于将含有这种Tat信号肽的折叠蛋白易位穿过脂质双层。还参见例如，在www[dot]signalpeptide[dot]de上可公开获得的信号肽数据库。信号肽也可用于将蛋白质导向特定的细胞器；参见例如，Spdb信号肽数据库中披露的实验确定和计算预测的信号肽，该数据库可在proline.bic.nus.edu.sg/spdb公开获得。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码细胞穿透肽(CPP)的序列。已经描述了数百个CPP序列；参见例如，细胞穿透肽数据库CPPsite，可在crdd.osdd.net/raghava/cppsite/上公开获得。常用的CPP序列的实例是聚精氨酸序列，例如八精氨酸或九精氨酸，其可以融合到CGI肽的C末端。
在实施例中，多核苷酸负载物包括编码自组装肽的序列；参见，例如Miki等人(2021)Nature Communications[自然通讯],21:3412,DOI:10.1038/s41467-021-23794-6。
在一些实施例中，表达序列包括poly-A序列(例如，在表达序列的3’端)。在一些实施例中，poly-A序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，poly-A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,500个和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号WO 2019/118919 A1的[0202]-[0204]中poly-A序列的描述设计poly-A序列，该专利公开通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，表达序列缺乏poly-A序列(例如，在表达序列的3’端)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括polyA、缺乏polyA或具有经修饰的polyA以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施例中，缺乏polyA或具有经修饰的polyA的环状多核糖核苷酸改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)、半衰期和/或表达效率。
治疗性多肽
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码治疗性多肽的表达序列。治疗性多肽是当向受试者施用或在受试者中表达时提供一些治疗性益处的多肽。向受试者施用或在受试者中表达治疗性多肽可用于治疗或预防疾病、障碍或病症或其症状。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种治疗性多肽。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括编码治疗性蛋白的表达序列。该蛋白可治疗有需要的受试者的疾病。在一些实施例中，治疗性蛋白可以补偿有需要的受试者中突变的、表达不足的或缺少的蛋白。在一些实施例中，治疗性蛋白可以靶向有需要的受试者中的细胞、组织或病毒，与有需要的受试者中的细胞、组织或病毒相互作用或结合。
治疗性多肽可以是可以从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。
治疗性多肽可以是激素、神经递质、生长因子、酶(例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、ATP非依赖性酶、溶酶体酶、去饱和酶)、细胞因子、转录因子、抗原结合多肽(例如，抗原结合抗体或抗体样片段，诸如单链抗体、纳米抗体或其他含有Ig重链或轻链的多肽)、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、干扰素、白介素、溶栓剂、抗原(例如，肿瘤、病毒或细菌抗原)、核酸酶(例如，核酸内切酶，诸如Cas蛋白，例如Cas9)、膜蛋白(例如，嵌合抗原受体(CAR)、跨膜受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、受体酪氨酸激酶(RTK)、抗原受体、离子通道或膜转运蛋白)、分泌蛋白、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas、TALEN或锌指)或基因书写蛋白(参见例如，国际专利公开号WO 2020/047124，该文献通过引用以其全文并入本文)。
在一些实施例中，治疗性多肽是抗体，例如，全长抗体、抗体片段、或其一部分。在一些实施例中，由多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)表达的抗体可以是任何同种型的，比如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，多核糖核苷酸表达抗体的一部分，如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，多核糖核苷酸可以包括多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成所述抗体。在一些情况下，多核糖核苷酸包括一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。当多核糖核苷酸在细胞中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
在一些实施例中，如本文所述制备的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)在疗法或农业中用作效应子。例如，可向受试者施用通过本文所述的方法制备的多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用或农业组合物中)。在实施例中，受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或两栖动物)。在实施例中，受试者是人。在实施例中，方法受试者是非人哺乳动物。在实施例中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如猴、猿)、有蹄类动物(例如家牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如狗、猫)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)或兔类动物(例如兔)。在实施例中，受试者是鸟，诸如鸟类类群鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)或鹦形目(例如鹦鹉)的成员。在实施例中，受试者是无脊椎动物，诸如节肢动物(例如昆虫、蛛形纲、甲壳类动物)、线虫、环节动物、蠕虫或软体动物。在实施例中，受试者是无脊椎动物农业有害生物或者寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，受试者是植物，诸如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类或苔藓植物。在实施例中，受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，受试者是具有农业或园艺重要性的植物，诸如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物和草坪草)。
植物修饰多肽
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码植物修饰多肽的表达序列。植物修饰多肽是指可以以使得植物生理学或表型发生变化(例如，植物的适应度增加或降低)的方式改变植物的遗传特性(例如，增加基因表达、降低基因表达或者以其他方式改变DNA或RNA的核苷酸序列)、表观遗传特性或者生理学或生物化学特性的多肽。在一些实施例中，多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种不同的植物修饰多肽，或者一种或多种植物修饰多肽的多个拷贝。植物修饰多肽可改变多种植物的生理学或表型或者增加或降低多种植物的适应度，或者可以是在一种或多种特定植物(例如，特定种或属的植物)中实现这种改变的多肽。
可以用于本文的多肽的实例可以包括酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNAse、DNAse或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas核酸内切酶、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣蛋白。
农业多肽
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个编码农业多肽的表达序列。农业多肽是适合于农业用途的多肽。在实施例中，将农业多肽施用于植物或种子(例如，通过叶喷、撒粉、注射或种子包衣)或者植物环境(例如，通过土壤浇灌或颗粒土壤施用)，从而使得植物的生理学、表型或适应度改变。农业多肽的实施例包括改变寄宿于植物或非人动物宿主中或寄宿于其上的一种或多种微生物的水平、活性或代谢的多肽，该改变导致该宿主的适应度提高。在一些实施例中，农业多肽是植物多肽。在一些实施例中，农业多肽是昆虫多肽。在一些实施例中，当与非人类脊椎动物、无脊椎动物、微生物或植物细胞接触时，农业多肽具有生物学作用。
在一些实施例中，多核糖核苷酸编码两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种农业多肽，或者一种或多种农业多肽的多个拷贝。
可用于农业应用的多肽的实施例包括例如细菌素、溶素、抗微生物肽、根瘤富含C的肽和细菌细胞调节肽。此类多肽可以用于改变靶微生物的水平、活性或代谢以增加昆虫(诸如蜜蜂和蚕)的适应度。农业上有用的多肽的实施例包括肽毒素，如由昆虫病原细菌(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、发光杆菌(Photorhabdus luminescens)、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)或嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila))天然产生的那些，如本领域中已知的。农业上有用的多肽的实施例包括用于控制农业上重要的有害生物或病原体的多肽(包括小肽，诸如环二肽或二酮哌嗪)，例如用于控制植物中的疾病的抗微生物多肽或抗真菌多肽，或用于控制无脊椎有害生物诸如昆虫或线虫的杀虫多肽(例如，杀昆虫多肽或杀线虫多肽)。农业上有用的多肽的实施例包括抗体、纳米抗体、及其片段，例如，保留完整抗体或纳米抗体的至少一些(例如，至少10％)特异性结合活性的抗体或纳米抗体片段。农业上有用的多肽的实施例包括转录因子，例如，植物转录因子；参见例如，列出了在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定的转录因子家族的“AtTFDB”数据库，其可在agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/上公开获得。农业上有用的多肽的实施例包括核酸酶，例如核酸外切酶或核酸内切酶(例如，Cas核酸酶，诸如Cas9或Cas12a)。农业上有用的多肽的实施例进一步包括细胞穿透肽、酶(例如，淀粉酶、纤维素酶、肽酶、脂肪酶、几丁质酶)、肽信息素(例如，酵母交配信息素、无脊椎动物繁殖和幼虫信号传导信息素，参见例如Altstein(2004)Peptides[肽],25:1373-76)。
内部核糖体进入位点(IRES)
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，IRES与一个或多个表达序列可操作连接(例如，每个IRES与一个或多个表达序列可操作连接)。在实施例中，IRES位于异源启动子与编码序列的5'端之间。
包括在多核糖核苷酸中的合适的IRES元件包括能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES元件是至少约5nt、至少约8nt、至少约9nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约40nt、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约350nt、或至少约500nt。
在一些实施例中，IRES元件衍生自生物体的DNA，该生物体包括但不限于病毒、哺乳动物和果蝇。此类病毒DNA可以衍生自但不限于小核糖核酸病毒互补DNA(cDNA)、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一个实施例中，衍生IRES元件的果蝇DNA包括但不限于来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足基因。
在一些实施例中，如果存在，IRES序列是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征(Taurasyndrome)病毒、锥猎蝽(Triatoma)病毒、泰勒氏脑脊髓炎病毒(Theiler'sencephalomyelitis virus)、猿猴病毒40、红火蚁(Solenopsis invicta)病毒1、禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)病毒、网状内皮组织增生病毒、福尔曼脊髓灰质炎病毒(fumanpoliovirus)1、普劳提娅失速肠病毒(Plautia stall intestine virus)、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、假桃病毒叶蝉病毒(Homalodisca coagulata virus)-1、人类免疫缺陷病毒1型、假桃病毒叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人类肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖(Ectropis obliqua)小核糖核酸样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒(Hibiscus chlorotic ringspot virus)、经典猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-l、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-l、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、萨里病毒(Salivirus)、科萨病毒(Cosavirus)、副肠孤病毒(Parechovirus)、果蝇无毛、酿酒酵母(S.cerevisiae)TFIID、酿酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-l、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁皱缩病毒(Turnip crinkle virus)、eIF4G的适体、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)B3(CVB3)或柯萨奇病毒A(CVB1/2)。在又另一实施例中，IRES是柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列。在另外的实施例中，IRES是脑心肌炎病毒的IRES序列。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括侧接至少一个(例如2、3、4、5个或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如2、3、4、5个或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧包括一个或多个IRES序列，导致所得肽和/或多肽的分离。
在一些实施例中，多核糖核苷酸负载物包括IRES。例如，多核糖核苷酸负载物可包括环状RNA IRES，例如如Chen等人.Mol.Cell[分子细胞]81:1-19,2021中所述，该文献通过引用以其全文特此并入。
调节元件
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个调节元件。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括调节元件，例如修饰多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。
调节元件可包括与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调节元件可与相邻序列可操作连接。如与不存在调节元件时表达的产物的量相比，调节元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调节元件可增加串联附接的多个表达序列表达的产物的量或数目。因此，一个调节元件可以增强一个或多个表达序列的表达。多个调节元件是本领域普通技术人员熟知的。
在一些实施例中，调节元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或抑制子。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的至少一个翻译调节子。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的翻译调节子。在一些实施例中，翻译调节子存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物例如肽和/或多肽的分离。
在一些实施例中，调节元件是微RNA(miRNA)或miRNA结合位点。
调节元件的其他实例在例如国际专利公开号WO 2019/118919的第[0154]-[0161]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。
翻译起始序列
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与表达序列可操作地连接的翻译起始序列。
在一些实施例中，多核糖核苷酸编码多肽并且可包括翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括Kozak或Shine-Dalgamo序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如Kozak序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如Kozak序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的分离。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列在多核糖核苷酸的基本上单链的区域内。翻译起始序列的其他实例在国际专利公开号WO 2019/118919的第[0163]-[0165]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。
多核糖核苷酸可包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一起始密码子上起始或可以在第一起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，多核糖核苷酸可在不是第一个起始密码子的密码子(例如AUG)处起始。多核糖核苷酸的翻译可以起始于替代的翻译起始序列，如但不限于ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些实施例中，翻译在选择性条件(例如，应激诱导条件)下在替代性翻译起始序列处开始。作为非限制性实例，多核糖核苷酸的翻译可在替代性翻译起始序列(诸如ACG)处开始。作为另一非限制性实例，多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为另一非限制性实例，多核糖核苷酸翻译可以在替代的翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为另一个非限制性实例，多核糖核苷酸可在重复相关的非AUG(RAN)序列(诸如包括短重复RNA段的替代性翻译起始序列(例如，CGG、GGGGCC(SEQ ID NO:1)、CAG、CTG))处开始翻译。
终止元件
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括至少一个终止元件。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括与表达序列可操作地连接的终止元件。在一些实施例中，多核苷酸缺乏终止元件。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可或可不具有终止元件。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得多核糖核苷酸被连续翻译。终止元件的排除可导致表达产物的滚环翻译或连续表达。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可或可不具有终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺乏终止元件，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。由于缺乏核糖体停滞或脱落，终止元件的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续表达。在这种实施例中，滚环翻译通过每个表达序列表达连续表达产物。在一些其他实施例中，表达序列的终止元件可以是交错元件的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个表达序列包含终止元件。然而，在环状多核糖核苷酸中进行滚环翻译或后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的表达。在此类情况下，当核糖体遇到终止元件(例如，终止密码子)并终止翻译时，表达产物可以从核糖体上脱落。在一些实施例中，在核糖体例如核糖体的至少一个亚基与环状多核糖核苷酸保持接触时翻译终止。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的端部包括终止元件。在一些实施例中，一个或多个表达序列连续包含两个或更多个终止元件。在此类实施例中，翻译终止并且滚环翻译终止。在一些实施例中，核糖体与环状多核糖核苷酸完全脱离。在一些此类实施例中，在环状多核糖核苷酸中后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的产生可能需要核糖体在起始翻译之前与环状多核糖核苷酸重新接合。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如UAA、UGA、UAG。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个终止元件是阅读框移位的终止元件，例如但不限于，可终止翻译的脱框(off-frame)或-1及+1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。阅读框移位的终止元件包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体TAA、TAG和TGA。阅读框移位的终止元件可能对防止通常对细胞有害的mRNA误读很重要。在一些实施例中，终止元件是终止密码子。
终止元件的其他实例在国际专利公开号WO 2019/118919的第[0169]-[0170]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。
非翻译区
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非翻译区(UTR)。包括基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。
示例性非翻译区在国际专利公开号WO 2019/118919的第[0197]-[201]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括poly-A序列。示例性poly-A序列在国际专利公开号WO 2019/118919的第[0202]-[0205]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏poly-A序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。
富含UTR AU的元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且ARE的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对ARE进行鉴别和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。
应当理解，可以将来自任何基因的任何UTR掺入环状多核糖核苷酸的相应侧翼区中。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏5'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏3'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏poly-A序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏5'-UTR、3'-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括以下序列中的一种或多种：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调节元件(例如，翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因的一种或多种调节核酸(例如，siRNA、lncRNA、shRNA)和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏5'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏3'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏poly-A序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏5’帽。
交错元件
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的分离。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且该一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，交错元件是与一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括该一个或多个表达序列的表达序列的一部分。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括交错元件。为了避免在保持滚环翻译的同时产生连续表达产物，例如肽或多肽，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3'端。交错元件可以被配置为在环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可包括但不限于2A样或CHYSEL(SEQ ID NO:2)(顺式作用水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C末端共有序列为X1X2X3EX5NPGP的序列，其中X1不存在或G或H，X2不存在或D或G，X3是D或V或I或S或M，X5是任何氨基酸(SEQ ID NO:83)。在一些实施例中，该序列包括具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-D(V/I)EXNPGP，其中x＝任何氨基酸(SEQ IDNO:4)。交错元件的一些非限定性实例包括GDVESNPGP(SEQ ID NO:5)、GDIEENPGP(SEQ IDNO:6)、VEPNPGP(SEQ ID NO:7)、IETNPGP(SEQ ID NO:8)、GDIESNPGP(SEQ ID NO:9)、GDVELNPGP(SEQ ID NO:10)、GDIETNPGP(SEQ ID NO:11)、GDVENPGP(SEQ ID NO:12)、GDVEENPGP(SEQ ID NO:13)、GDVEQNPGP(SEQ ID NO:14)、IESNPGP(SEQ ID NO:15)、GDIELNPGP(SEQ ID NO:16)、HDIETNPGP(SEQ ID NO:17)、HDVETNPGP(SEQ ID NO:18)、HDVEMNPGP(SEQ ID NO:19)、GDMESNPGP(SEQ ID NO:20)、GDVETNPGP(SEQ ID NO:21)、GDIEQNPGP(SEQ ID NO:22)和DSEFNPGP(SEQ ID NO:23)。
在一些实施例中，本文所述的交错元件裂解表达产物，诸如在本文所述的共有序列的G与P之间。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸包括至少一个交错元件以裂解表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译单独肽和/或多肽。
在一些实施例中，交错元件包括一种或多种在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的DNA或RNA。修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如，对连接磷酸盐/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)的修饰以及可以在翻译期间诱导核糖体暂停的它们的任何组合。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。
在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，和将终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。
在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包含第二表达序列的交错元件的对应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和将终止元件与下游翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些此类实例中，环状多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。
在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物分开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中的第一序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在相应环状多核糖核苷酸中的第二表达序列的第二翻译起始序列上游包含交错元件的相应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，相应环状多核糖核苷酸中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是环状多聚核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或大于第一交错元件和第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括多于一个表达序列。
交错元件的实例在国际专利公开号WO 2019/118919的第[0172]-[0175]段中描述，该文献通过引用以其全文特此并入。
非编码序列
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸负载物)包括一个或多个非编码序列，例如不编码多肽表达的序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个非编码序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸不编码多肽表达序列。
非编码序列可以是天然的或合成的序列。在一些实施例中，非编码序列可以改变细胞行为，如例如淋巴细胞行为。在一些实施例中，非编码序列对于细胞RNA序列是反义的。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括调节核酸，这些调节核酸是RNA或RNA样结构，典型地约5-500个碱基对(bp)(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp、IncRNA 200-500bp)并且可以具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。在实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码RNA前体的调节核酸，该RNA前体可以被加工成较小的RNA，例如miRNA前体(其可以是从约50至约1000bp)可以被加工成较小的miRNA中间体或成熟的miRNA。
长非编码RNA(IncRNA)被定义为长于100个核苷酸的非蛋白编码转录物。许多IncRNA被表征为具有组织特异性。在与附近的蛋白编码基因相反的方向上转录的不同IncRNA占很大比例(例如，在哺乳动物基因组中占总IncRNA的约20％)并且可能调节附近的基因的转录。在一个实施例中，本文提供的多核糖核苷酸包括IncRNA的有义链。在一个实施例中，本文提供的多核糖核苷酸包括IncRNA的反义链。
在实施例中，多核糖核苷酸编码与内源基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或至少一个片段基本上互补或完全互补的调节核酸。在实施例中，调节核酸与内含子和外显子之间的边界处、在外显子之间的内部、或与外显子相邻的序列互补，从而防止特定基因的新生成的核RNA转录物成熟化为用于转录的mRNA。与特定基因互补的调节核酸可与该基因的mRNA杂交并防止其翻译。反义调节核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或杂交体。在一些实施例中，调节核酸包括可以与参与内源基因或外源基因的表达调节的蛋白结合的蛋白结合位点。
在实施例中，多核糖核苷酸的长度编码与目的转录物杂交的调节核酸，其中调节RNA的长度为约5个至30个核苷酸，约10至30个核苷酸，或约11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或多于30个核苷酸。在实施例中，调节RNA与靶向转录物的序列同一性程度为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在实施例中，多核糖核苷酸编码与靶基因的约5至约25个连续核苷酸相同的微RNA(miRNA)分子或编码该miRNA的前体。在一些实施例中，miRNA具有允许mRNA识别特定靶mRNA并与其结合的序列。在实施例中，miRNA序列以二核苷酸AA开始，包括约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％或约45％-55％)的GC含量，并且与待引入该序列的受试者(例如，哺乳动物)的基因组中除靶标之外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性，例如如通过标准BLAST搜索确定的。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括至少一个miRNA(或miRNA前体)，例如2、3、4、5、6个或更多个miRNA或miRNA前体。在一些实施例中，多核糖核苷酸包括编码miRNA(或其前体)的序列，该miRNA(或其前体)与靶序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或100％核苷酸序列互补性。
siRNA和shRNA类似于内源性微RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体。在一些实施例中，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然。像siRNA一样，微RNA使用RISC来下调靶基因，但与siRNA不同，大多数动物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或polyA去除和mRNA降解来降低蛋白输出。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3'UTR内；miRNA似乎靶向与从miRNA 5'端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。该区域称为种子区域。因为成熟siRNA和miRNA是可互换的，所以外源性siRNA下调具有与siRNA的种子互补性的mRNA。
已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和产生。此外，存在增加发现有效且特异性的序列基序的机会的计算工具。
蛋白质结合序列
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源性的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸隐藏为外源或外来的核苷酸序列。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5'端的结合。核糖体从5’端迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本披露，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，不依赖帽)不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个RNA序列，该RNA序列包括核糖体结合位点，例如起始密码子。
天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有类似Kozak序列的签名，这些序列众所周知参与核糖体起始多种基因的翻译的过程。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:24)，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延长因子结合的二级结构。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合蛋白质的精氨酸富集区。
在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他结合RNA的蛋白质。
间隔子序列
在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸包括一个或多个间隔子序列。间隔子是指在两个相邻多核苷酸区域之间提供距离或柔性的任何连续核苷酸序列(例如，一个或多个核苷酸的连续核苷酸序列)。间隔子可存在于本文所述的任何核酸元件之间。间隔子也可存在于本文所述的核酸元件内。
间隔子的长度可以为例如至少5个(例如至少10个、至少15个、至少20个)核糖核苷酸。在一些实施例中，每个间隔子区域的长度为至少5个(例如至少10个、至少15个、至少20个)核糖核苷酸。每个间隔子区域的长度可以为例如5至500个(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500个)核糖核苷酸。第一间隔子区域、第二间隔子区域或第一间隔子区域和第二间隔子区域可以包括polyA序列。第一间隔子区域、第二间隔子区域或第一间隔子区域和第二间隔子区域可以包括polyA-C序列。在一些实施例中，第一间隔子区域、第二间隔子区域或第一间隔子区域和第二间隔子区域包括polyA-G序列。在一些实施例中，第一间隔子区域、第二间隔子区域或第一间隔子区域和第二间隔子区域包括polyA-T序列。在一些实施例中，第一间隔子区域、第二间隔子区域或第一间隔子区域和第二间隔子区域包括随机序列。
间隔子也可存在于本文所述的核酸区域内。例如，多核苷酸负载物区可包括一个或多个间隔子。间隔子可以隔开多核苷酸负载物内的区域。
在一些实施例中，间隔子序列的长度可以是例如至少10个核苷酸、至少15个核苷酸或至少30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列的长度是20至50个核苷酸。在某些实施例中，间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
间隔子序列可以是polyA序列、polyA-C序列、polyC序列或poly-U序列。
在一些实施例中，间隔子序列可以是polyA-T、polyA-C、polyA-G或随机序列。
间隔子序列可用于将IRES与相邻结构元件隔开，以保证IRES或相邻元件的结构和功能。可以根据IRES将间隔子特异性工程化。在一些实施例中，可以利用RNA折叠计算机软件(如RNAFold)指导载体的各种元件(包括间隔子)的设计。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括5'间隔子序列(例如，在5'退火区域与多核糖核苷酸负载物之间)。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是至少10个核苷酸。在另一实施例中，5'间隔子序列的长度是至少15个核苷酸。在另外的实施例中，5'间隔子序列的长度是至少30个核苷酸。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，5’间隔子序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，5'间隔子序列的长度是在20与50个核苷酸之间。在某些实施例中，5'间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，5'间隔子序列是polyA序列。在另一实施例中，5'间隔子序列是polyA-C序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括polyA-G序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括polyA-T序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括随机序列。
在一些实施例中，多核糖核苷酸包括3'间隔子序列(例如，在3'退火区域与多核糖核苷酸负载物之间)。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是至少10个核苷酸。在另一实施例中，3'间隔子序列的长度是至少15个核苷酸。在另外的实施例中，3'间隔子序列的长度是至少30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是不多于100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施例中，3'间隔子序列的长度是20至50个核苷酸。在某些实施例中，3'间隔子序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施例中，3'间隔子序列是polyA序列。在另一实施例中，5'间隔子序列是polyA-C序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括polyA-G序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括polyA-T序列。在一些实施例中，5'间隔子序列包括随机序列。
在一个实施例中，多核糖核苷酸包括5'间隔子序列，但不包括3'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸包括3'间隔子序列，但不包括5'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸既不包括5'间隔子序列，也不包括3'间隔子序列。在另一实施例中，多核糖核苷酸不包括IRES序列。在另外的实施例中，多核糖核苷酸不包括IRES序列、5'间隔子序列或3'间隔子序列。
在一些实施例中，间隔子序列包括至少3个核糖核苷酸、至少4个核糖核苷酸、至少5个核糖核苷酸、至少约8个核糖核苷酸、至少约10个核糖核苷酸、至少约12个核糖核苷酸、至少约15个核糖核苷酸、至少约20个核糖核苷酸、至少约25个核糖核苷酸、至少约30个核糖核苷酸、至少约40个核糖核苷酸、至少约50个核糖核苷酸、至少约60个核糖核苷酸、至少约70个核糖核苷酸、至少约80个核糖核苷酸、至少约90个核糖核苷酸、至少约100个核糖核苷酸、至少约120个核糖核苷酸、至少约150个核糖核苷酸、至少约200个核糖核苷酸、至少约250个核糖核苷酸、至少约300个核糖核苷酸、至少约400个核糖核苷酸、至少约500个核糖核苷酸、至少约600个核糖核苷酸、至少约700个核糖核苷酸、至少约800个核糖核苷酸、至少约900个核糖核苷酸或至少约100个核糖核苷酸。
生物反应器
在一些实施例中，本文所述的任何纯化多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)的方法都可以在生物反应器中进行。生物反应器是指在其中进行化学或生物学过程的任何容器，该过程涉及生物或衍生自此类生物的生物化学活性物质。生物反应器可以与本文所述的用于纯化或产生环状RNA的无细胞的方法相容。用于生物反应器的容器可包括培养瓶、培养皿或培养袋，它们可以是一次性使用的(一次性的)、可高压灭菌的或可灭菌的。生物反应器可以由玻璃制成，或者其也可以是基于聚合物的，或者其也可以由其他材料制成。
生物反应器的实例包括但不限于搅拌罐(例如，充分混合的)生物反应器和管式(例如，活塞流)生物反应器、气升式生物反应器、膜搅拌罐、旋转过滤搅拌罐、振动混合器、流化床反应器、和膜生物反应器。操作生物反应器的模式可以是间歇的或连续的过程。当试剂和产物流连续地进出系统时，生物反应器是连续的。间歇式生物反应器可以具有连续的再循环流，但没有连续的试剂进料或产物收获。
本披露的一些方法涉及大规模生产多核糖核苷酸。对于大规模生产方法，所述方法可在1升(L)至50L或更大(例如，5L、10L、15L、20L、25L、30L、35L、40L、45L、50L或更大)的体积中进行。在一些实施例中，所述方法可在5L至10L、5L至15L、5L至20L、5L至25L、5L至30L、5L至35L、5L至40L、5L至45L、10L至15L、10L至20L、10L至25L、20L至30L、10L至35L、10L至40L、10L至45L、10L至50L、15L至20L、15L至25L、15L至30L、15L至35L、15L至40L、15L至45L或15至50L的体积中进行。
在一些实施例中，生物反应器可生产至少1g RNA。在一些实施例中，生物反应器可生产1-200g的RNA(例如，1-10g、1-20g、1-50g、10-50g、10-100g、50-100g或50-200g的RNA)。在一些实施例中，生产的量是每升(例如，每升1-200g)、每批次或反应(例如，每批次或反应1-200g)或每单位时间(例如，每小时或每天1-200g)测量的。
在一些实施例中，可串联使用多于一个生物反应器以增加生产能力(例如，可串联使用一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个生物反应器)。
使用方法
在一些实施例中，如本文所述制备的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)在疗法或农业中用作效应子。
例如，可以向受试者施用通过本文所述的方法纯化的多核糖核苷酸(例如，在药物、兽用、或农业组合物中)。在一些实施例中，受试者是脊椎动物(例如，哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物、或两栖动物)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是非人哺乳动物。在实施例中，受试者是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物(例如猴、猿)、有蹄类动物(例如家牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、美洲驼、羊驼、鹿、马、驴)、肉食动物(例如狗、猫)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)或兔类动物(例如兔)。在实施例中，受试者是鸟，诸如鸟类类群鸡形目(例如鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑)、雁形目(例如鸭、鹅)、古颚下纲(例如鸵鸟、鸸鹋)、鸽形目(例如鸽子、野鸽)或鹦形目(例如鹦鹉)的成员。在实施例中，受试者是无脊椎动物，诸如节肢动物(例如昆虫、蛛形纲、甲壳类动物)、线虫、环节动物、蠕虫或软体动物。在实施例中，受试者是无脊椎动物农业有害生物或者寄生在无脊椎动物或脊椎动物宿主上的无脊椎动物。在实施例中，受试者是植物，诸如被子植物(其可以是双子叶植物或单子叶植物)或裸子植物(例如针叶树、苏铁、买麻藤类植物、银杏)、蕨类、马尾植物、石松类或苔藓植物。在实施例中，受试者是真核藻类(单细胞或多细胞)。在实施例中，受试者是具有农业或园艺重要性的植物，诸如行间作物、生产水果的植物和树木、蔬菜、树木以及观赏植物(包括观赏花、灌木、树木、地被植物和草坪草)。
在一些实施例中，本披露提供了一种通过向受试者提供本文所述的组合物或配制品来改变受试者的方法。在一些实施例中，组合物或配制品是或包括核酸分子(例如，本文所述的DNA分子或RNA分子)，并且向真核受试者提供多核苷酸。在一些实施例中，组合物或配制品是或包括包含本文所述的核酸的真核或原核细胞。
在一些实施例中，本披露提供了一种通过向有需要的受试者提供本文所述的组合物或配制品来治疗受试者的病症的方法。在一些实施例中，组合物或配制品是或包括核酸分子(例如，本文所述的DNA分子或多核糖核苷酸)，并且向真核受试者提供多核苷酸。在一些实施例中，组合物或配制品是或包括包含本文所述的核酸的真核或原核细胞。
在一些实施例中，本披露提供了一种通过向受试者提供包含本文所述的多核苷酸的真核或原核细胞来向受试者提供多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)的方法。
配制品
在本披露的一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)可被配制在组合物中，例如用于递送到细胞、植物、无脊椎动物、非人脊椎动物或人类受试者的组合物，例如农业、兽用或药物组合物。在一些实施例中，多核糖核苷酸被配制在药物组合物中。在一些实施例中，组合物包含多核糖核苷酸和稀释剂、载剂、佐剂或它们的组合。在特定实施例中，组合物包含本文所述的多核糖核苷酸和载剂或不含任何载剂的稀释剂。在一些实施例中，包括多核糖核苷酸和不含任何载剂的稀释剂的组合物用于将多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)裸递送给受试者。
药物组合物可任选地包含一种或多种额外活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。药物组合物可以任选地包含充当本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)的媒介物或介质的非活性物质，诸如由美国食品和药品管理局(United States Foodand Drug Administration)(FDA)批准并且在非活性成分数据中列出的任一种非活性成分。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可在以下文献中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过引用并入本文中)。非活性物质的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油、及其混合物。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用至人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物适合于施用至任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用于各种动物而对适合于施用于人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可仅通过普通实验(如果有的话)来设计和/或进行此种修饰。设想施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如家牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述的药物组合物的配制品可通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
在一些实施例中，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是存在不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。
在一些实施例中，关于制剂中存在的环状多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、99.1％(w/w)、99.2％(w/w)、99.3％(w/w)、99.4％(w/w)、99.5％(w/w)、99.6％(w/w)、99.7％(w/w)、99.8％(w/w)、99.9％(w/w)、或100％(w/w)的分子。
在一些实施例中，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。
在一些实施例中，关于制剂中存在的经切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、或15％(w/w)的经切口多核糖核苷酸分子。
在一些实施例中，关于制剂中存在的组合的经切口和线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)的组合的经切口和线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，药物制剂是最终环状多核糖核苷酸成品药的中间体药物制剂。在一些实施例中，药物制剂是原料药或活性药物成分(API)。在一些实施例中，药物制剂是用于施用至受试者的成品药。
在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的制剂(在减少线性RNA之前、期间或之后)进一步处理以基本上去除DNA、蛋白质污染物、杂质或副产物(例如，细胞蛋白质(比如宿主细胞蛋白质)或蛋白质工艺杂质)、内毒素、单核苷酸分子和/或工艺相关杂质。
盐
在一些情况下，本文提供的组合物或药物组合物包含一种或多种盐。为了控制张度，本文提供的组合物可以包含生理盐诸如钠盐。其他盐可以包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。在一些情况下，所述组合物与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。该一种或多种药学上可接受的盐可以包括无机离子，诸如钠、钾、钙、镁离子等的那些盐。此类盐可以包括与无机酸或有机酸的盐，该无机酸或有机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸。多核糖核苷酸能以线性或环状形式存在。
缓冲剂/pH
本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种缓冲剂，诸如Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(例如，含氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。在一些情况下，包含5-20mM范围内的缓冲剂。
本文提供的组合物或药物组合物可以具有约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约7.0至约7.8的pH。所述组合物或药物组合物可以具有约7的pH。多核糖核苷酸能以线性或环状形式存在。
洗涤剂/表面活性剂
根据预期的施用途径，本文提供的组合物或药物组合物可以包含一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为“吐温(Tween)”)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAXTM商标出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，诸如线性EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧基-l,2-乙二基)基团的数目可以变化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9(Triton X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，比如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚聚氧乙烯醚，诸如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，诸如三乙二醇单月桂基醚(Brij30)；和脱水山梨糖醇酯(通常称为“SPAN”)，诸如脱水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯、辛基酚聚醚(诸如辛基酚聚醚9(Triton X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(“CTAB”)或脱氧胆酸钠。该一种或多种洗涤剂和/或表面活性剂可仅以痕量存在。在一些情况下，所述组合物可以包含小于各1mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非离子表面活性剂。表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡值)进行分类。在一些情况下，表面活性剂的HLB为至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸能以线性或环状形式存在。
稀释剂
在一些实施例中，本披露的组合物包含多核糖核苷酸和稀释剂。在一些实施例中，本披露的组合物包含线性多核糖核苷酸和稀释剂。
稀释剂可以是非载剂赋形剂。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载剂赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、润滑剂、油及其混合物。非载剂赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(FDA)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。非载剂赋形剂可以是适于施用给非人类动物(例如，适合兽医用途)的任何非活性成分。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)来设计和/或进行此类修饰。
在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)可以以裸递送配制品的形式递送，诸如包含稀释剂。裸递送配制品将多核糖核苷酸递送至细胞，无需借助于载剂并且无需对多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其复合物进行修饰或部分或完全包封。
裸递送配制品是不含载剂的配制品并且其中多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的多核糖核苷酸是未与蛋白质、小分子、颗粒、聚合物或生物聚合物共价结合的多核糖核苷酸。没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的多核糖核苷酸不含经修饰的磷酸基团。例如，没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰的多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。
在一些实施例中，裸递送配制品不含任何或所有转染试剂、阳离子载剂、碳水化合物载剂、纳米颗粒载剂或蛋白质载剂。在一些实施例中，裸递送配制品不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐改性的植物糖原β-糊精、脂转染胺(lipofectamine)、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四乙烯亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N-(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白。
在某些实施例中，裸递送配制品包括非载剂赋形剂。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括不表现出细胞穿透作用的非活性成分。在一些实施例中，非载剂赋形剂包括缓冲剂，例如PBS。在一些实施例中，非载剂赋形剂是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂或油。
在一些实施例中，裸递送配制品包括稀释剂。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂是RNA增溶剂、缓冲剂或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺和2-丙醇。缓冲剂的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。
载剂
在一些实施例中，本披露的组合物包含环状多核糖核苷酸和载剂。在一些实施例中，本披露的组合物包含线性多核糖核苷酸和载剂。
在某些实施例中，组合物在囊泡或其他基于膜的载剂中包括如本文所述的环状多核糖核苷酸。在某些实施例中，组合物在囊泡或其他基于膜的载剂中包括如本文所述的线性多核糖核苷酸。
在其他实施例中，组合物在细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂包括环状多核糖核苷酸。在其他实施例中，组合物在细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中或经由细胞、囊泡或其他基于膜的载剂包括线性多核糖核苷酸。在一个实施例中，组合物在脂质体或其他类似囊泡中包括环状多核糖核苷酸。在一个实施例中，组合物在脂质体或其他类似囊泡中包括线性多核糖核苷酸。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其负载物免受血浆酶的降解，并且将其负载转运穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of DrugDelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载剂。用于制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导内容通过引用并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of DrugDelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotechnol[自然生物技术],15:647-52,1997中所述，该文献关于挤出脂质制备的教导内容通过引用并入本文。
在某些实施例中，本披露的组合物包含多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒，例如本文所述的脂质纳米颗粒。在某些实施例中，本披露的组合物包含线性多核糖核苷酸和脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒是为如本文所述的多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。脂质纳米颗粒是为如本文所述的线性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载剂的另一个实例。纳米结构化的脂质载剂(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载剂。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。有关综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
载剂的其他非限制性实例包括碳水化合物载剂(例如，酸酐改性的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载剂(例如，与多核糖核苷酸共价连接的蛋白质或与线性多核糖核苷酸共价连接的蛋白质)或阳离子载剂(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。碳水化合物载剂的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、和酸酐修饰的植物糖原β-糊精。阳离子载剂的非限制性实例包括脂转染胺、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四乙烯亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇盐酸盐)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、和N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)。蛋白质载剂的非限制性实例包括人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白。
外泌体也可用作本文所述的组合物或制剂的药物递送媒介物。外泌体可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报]第6卷第4期,第287-96页；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可用作本文所述组合物或制剂的载剂。离体分化的红细胞也可用作本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂的载剂。参见，例如，国际专利公开号WO2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO 2016/183482；WO2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人.2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人.2017.Nature Communications[自然通讯]8:423；Shi等人.2014.Proc Natl Acad SciUSA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。
例如国际专利公开号WO2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的多核糖核苷酸分子。例如WO 2018/208728中所述的融合体组合物也可以用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作载剂将本文所述的线性多核糖核苷酸分子递送至靶向的细胞。
例如国际专利公开号WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO2020/041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的组合物或制剂。植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸组合物或制剂。
微泡也可以用作载剂递送本文所述的多核糖核苷酸分子。微泡也可用作载剂递送本文所述的线性多核糖核苷酸分子。参见，例如，US 7115583；Beeri,R.等人,Circulation.[循环]2002年10月1日；106(14):1756-1759；Bez,M.等人,Nat Protoc.[自然实验室指南]2019年4月；14(4):1015-1026；Hernot,S.等人,Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2008年6月30日；60(10):1153-1166；Rychak,J.J.等人,Adv Drug Deliv Rev.[高级药物递送综述]2014年6月；72:82-93。在一些实施例中，微泡是白蛋白包被的全氟化碳微泡。
包含本文所述的多核糖核苷酸的载剂可以包含多个颗粒。这些颗粒可具有30至700纳米的中值粒度(例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700纳米)。可以优化颗粒的大小以有利于包括多核糖核苷酸在内的有效载荷沉积到细胞中。多核糖核苷酸沉积到某些细胞类型中可有利于不同的粒度。例如，可以优化粒度以使多核糖核苷酸沉积到抗原呈递细胞中。可以优化粒度以使多核糖核苷酸沉积到树突细胞中。另外，可以优化粒度以使多核糖核苷酸沉积到引流淋巴结细胞中。
脂质纳米颗粒
本披露提供的组合物、方法和递送系统可以采用本文所述的任何合适的载剂或递送形式，在某些实施例中包括脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合的脂质(诸如WO 2019217941的表5中描述的PEG缀合的脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过引用以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)。
可用于形成纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质包括例如WO 2019217941(通过引用并入)的表4中描述的那些—例如，含脂质的纳米颗粒可包含WO 2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的要素，诸如聚合物，诸如WO 2019217941(通过引用并入)的表5中描述的聚合物。
在一些实施例中，缀合的脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些(通过引用并入)和前述的组合。
在一些实施例中，可以掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，诸如W02009/127060或US 2010/0130588(通过引用并入)中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过引用并入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含可电离脂质，其量为总脂质的约20mol％至约90mol％(在其他实施例中，其可为存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)；约50mol％至约90mol％)；非阳离子脂质，其量为总脂质的约5mol％至约30mol％；缀合脂质，其量为总脂质的约0.5mol％至约20mol％；以及固醇，其量为总脂质的约20mol％至约50mol％。总脂质与核酸的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。
在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比)可处于约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。
可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：
在一些实施例中，包含式(i)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(ii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(iii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(v)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(vi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(viii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(ix)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
其中
X1是O、NR1或直接键，X2是C2-5亚烷基，X3是C(＝O)或直接键，R1是H或Me，R3是C1-3烷基，R2是C1-3烷基，或R2与它所附接的氮原子和X2的1-3个碳原子一起形成4-元、5-元或6-元环，或X1是NR1，R1和R2与它们所附接的氮原子一起形成5-元或6-元环，或R2与R3和它们所附接的氮原子一起形成5-元、6-元或7-元环，Y1是C2-12亚烷基，Y2选自
n为0至3，R4为C1-15烷基，Z1为C1-6亚烷基或直接键，
Z2是
(在任一取向上)或不存在，条件是如果Z1是直接键，则Z2不存在；
R5是C5-9烷基或C6-10烷氧基，R6是C5-9烷基或C6-10烷氧基，W是亚甲基或直接键，并且R7是H或Me，或其盐，条件是如果R3和R2是C2烷基，X1是O，X2是直链C3亚烷基，X3是C(＝0)，Y1是直链Ce亚烷基，(Y2)n-R4是
，R4是直链C5烷基，Z1是C2亚烷基，Z2不存在，W是亚甲基，并且R7是H，则R5和R6不是Cx烷氧基。
在一些实施例中，包含式(xii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(xi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
其中
在一些实施例中，LNP包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。
在一些实施例中，包含式(xv)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。
其中
在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制成：
在一些实施例中，包含式(xxi)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，具有式(xxi)的LNP是WO 2021113777描述的LNP(例如，具有式(1)的脂质，比如WO 2021113777的表1的脂质)。
其中
每个n独立地是2-15的整数；L1和L3各自独立地是-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中“*”表示与R1或R3的附接点；
R1和R3各自独立地是任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代的直链或支链C9-C20烷基或C9-C20烯基：氧代、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环基烷基、羟基烷基、二羟基烷基、羟基烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔基、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环基烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基；并且
R2选自由以下组成的组：
在一些实施例中，包含式(xxii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，具有式(xxii)的LNP是WO 2021113777描述的LNP(例如，具有式(2)的脂质，比如WO 2021113777的表2的脂质)。
其中
每个n独立地是1-15的整数；
R1和R2各自独立地选自由以下组成的组：
R3选自由以下组成的组：
在一些实施例中，包含式(xxiii)的LNP用于将本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)组合物递送至细胞。在一些实施例中，式(xxiii)的LNP是WO 2021113777描述的LNP(例如，式(3)的脂质，诸如WO 2021113777的表3的脂质)。
其中
X选自-O-、-S-或-OC(O)-*，其中*表示与R1的附接点；
R1选自由以下组成的组：
且R2选自由以下组成的组：
在一些实施例中，在包含可电离脂质的LNP中提供了本文所述的组合物(例如，核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)或蛋白质)。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM-102)；例如，如US 9,867,888的实例1中所述(通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，可电离脂质是9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯(LP01)，例如，如WO 2015/095340(将其通过引用以其全文并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是二((Z)-非-2-烯-1-基)9-((4-二甲氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，例如，如US 2012/0027803(通过引用以其全文并入本文)的实例7、8或9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)，例如，如WO 2010/053572(通过引用以其全文并入本文)的实例14和实例16中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)脂质(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如来自WO 2020/106946(通过引用以其全文并入本文)的结构(I)。
在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含与以下中的一种或多种一起配制的阳离子脂质：中性脂质、可电离的含胺脂质、可生物降解的炔烃脂质、类固醇、磷脂(包括多不饱和脂质)、结构脂质(例如甾醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pKa。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pKa(例如，大于第一有效pKa)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包含40摩尔％至60摩尔％的包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如RNA(例如环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸))。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。核酸可以吸附到LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，LNP配制品是可生物降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的RNA分子。
可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于WO 2019051289(通过引用并入本文)的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W02013/016058的A；W02012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；W02009/132131的I、II、III或IV；US2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I；和WO 2021/113777的(1)、(2)、(3)或(4)。示例性脂质还包括WO 2021/113777的表1-16中任一个的脂质。
在一些实施例中，可电离脂质是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烷-6,9,28,3l-四烯-l9-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)，例如，如WO 2019051289 A9(通过引用以其全文并入本文)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质ATX-002，例如，如WO 2019051289 A9(通过引用以其全文并入本文)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3,l6-二烯-l-胺(化合物32)，例如，如WO 2019051289 A9(通过引用以其全文并入本文)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例12中所述。
示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、l8-l-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、神经鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反油烯酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、Lys磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、Lys磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为源自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于Kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386(通过引用并入本文)中描述的那些。在一些实施例中，此类脂质包括发现会改善用mRNA进行肝脏转染的植物脂质(例如DGTS)。
适合用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在WO2017/099823或美国专利公开US 2018/0028664中描述，其内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或US 2018/0028664(通过引用以其全文并入)的式I、II或IV的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0-30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％-20％(摩尔)或10％-15％(摩尔)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。
在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a-胆甾烷醇、53-粪甾烷醇、胆甾醇基-(2,-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a-胆甾烷、胆甾烯酮、5a-胆甾烷酮、5p-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。示例性胆固醇衍生物在PCT公开W02009/127060和美国专利公开US 2010/0130588(它们各自通过引用以其全文并入本文)中描述。
在一些实施例中，提供膜完整性的组分(诸如固醇)可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-50％(摩尔)(例如，0-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或40％-50％)。在一些实施例中，这种组分占脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％-50％(摩尔)、30％-40％(摩尔)。
在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。
示例性的PEG-脂质缀合物包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物例如在US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904、US 2018/0028664和WO 2017/099823中描述，所有这些的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-脂质是US2018/0028664(其内容通过引用以其全文并入本文)的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物。在一些实施例中，PEG-脂质具有US20150376115或US 2016/0376224的式II，两者的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕榈基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂质可以是以下的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂酰胺、PEG-二棕榈酰甘油脂酰胺、PEG-二硬脂基甘油脂酰胺、PEG-胆固醇(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实施例中，PEG-脂质包括选自以下的结构：
在一些实施例中，与PEG以外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(GPL)缀合物可用于代替PEG-脂质或与PEG-脂质一起使用。
示例性的缀合脂质(即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS专利申请(所有这些的内容通过引用以其全文并入本文)中描述。
在一些实施例中，PEG或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-20％(摩尔)。在一些实施例中，PEG或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(摩尔)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0-60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0-30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％-40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％-50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，所述组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％-75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计20％-40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％-10％的缀合脂质。所述组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计60％-70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％-35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％-10％的非阳离子脂质。所述组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％-30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0-20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％-25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％-30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％-20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。
在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂)、固醇(例如，胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中对于可电离脂质，脂质的摩尔比在20至70摩尔百分比的范围内，目标为40-60，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30的范围内，目标为0至15，固醇的摩尔百分比在20至70的范围内，目标为30至50，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6的范围内，目标为2至5。
在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。
在一个方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。
在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。
在一些实施例中，LNP包括可生物降解的可电离脂质。在一些实施例中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如，WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在LNP脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据pH是阳离子的。
在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)测量的。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在特定实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径范围为约l mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm，或约38mm至约42mm。
在一些情况下，LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。LNP的多分散性指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施例中，LNP的多分散性指数可为约0.10至约0.20。
LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，LNP的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
蛋白质和/或核酸的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与LNP缔合的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如RNA)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。
LNP可以任选地包括一层或多层包衣。在一些实施例中，LNP可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。
WO 2020/061457和WO 2021/113777(它们各自通过引用以其全文并入本文)教导了LNP的另外的示例性脂质、配制品、方法和表征。Hou等人,Lipid nanoparticles formRNA delivery[用于mRNA递送的脂质纳米颗粒].Nat Rev Mater[自然评论材料](2021).doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0(通过引用以其全文并入本文)教导了LNP的另外的示例性脂质、配制品、方法和表征(参见，例如，Hou等人的图2的示例性脂质和脂质衍生物)。
在一些实施例中，使用MessengerMax(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))或TransIT-mRNA转染试剂(米卢斯生物公司(Mirus Bio))进行体外或离体细胞脂质转染。在某些实施例中，使用GenVoy_ILM可电离脂质混合物(精密纳米系统(Precision NanoSystems))配制LNP。在某些实施例中，使用2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)或二亚油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)配制LNP，其配制和体内用途在Jayaraman等人,Angew Chem Int Ed Engl[德国应用化学]51(34):8529-8533(2012)(通过引用以其全文并入本文)中教导。
优化用于递送CRISPR-Cas系统(例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA)的LNP配制品在两者均通过引用并入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，并且可用于递送本文所述的环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸。
可用于递送核酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)的另外的特定LNP配制品在两者均通过引用并入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称ONPATTRO销售的配制品。
在实施例中，编码本文所述的蛋白质或多肽的至少部分(例如，抗原的部分)的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)被配制在LNP中，其中：(a)LNP包括阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG脂质，(b)LNP的平均粒度为80nm和160nm之间，以及(c)多核糖核苷酸。在实施例中，配制在LNP中的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)是疫苗。
多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)LNP的示例性给药可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(RNA)。在一些实施例中，本文所述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸)抗原的组合物的剂量为30-200mcg之间，例如30mcg、50mcg、75mcg、100mcg、150mcg或200mcg。
实例
提出以下实例是为了向本领域普通技术人员提供可以如何使用、制备和评价本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹作为本披露的示例，而不旨在限制诸位发明人认为是其发明的范围。
实例1：用于富集环状RNA的线性RNA拉下法
此实例描述从通过自剪接生成的环状RNA中去除线性RNA副产物的方法设计。
当通过自剪接生成环状RNA时，体外转录(IVT)混合物中可能有几种主要的线性杂质或副产物：非剪接的线性RNA、部分剪接的线性RNA、经切口的环状RNA和剪接的内含子(图2)。
寡聚物设计为具有针对内含子区域的互补序列。内含子区域中序列不存在于环状RNA产物中、而仅存在于线性副产物中作为线性RNA的一部分或剪接掉的形式(图2和图3)。寡聚物设计为具有通过TEG接头连接的生物素，能以高亲和力与链霉亲和素蛋白结合。一旦寡聚物与含有内含子序列的线性副产物结合，这些副产物可以被链霉亲和素-珠捕获，并且可以富集未结合部分中的环状RNA。
实例2：线性RNA拉下特异性地捕获线性副产物并富集环状RNA
此实例显示通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物对环状RNA的富集。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括开放阅读框(ORF)的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是高斯萤光素酶(Gluc，针对图4)或萤火虫萤光素酶(Fluc，针对图5)。ORF为Gluc时，线性RNA的长度为大约1.4Kb，ORF为Fluc时，线性RNA的长度为大约2.6Kb。
对于去除含有内含子序列的线性副产物的线性RNA拉下(LP)，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种寡聚物针对3’半内含子，两种寡聚物针对5’半内含子。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的或额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与等量的各种寡聚物(每种寡聚物200pmol，寡聚物总共1.2nmol)混合(最终的RNA浓度为400nM)，总共500μl。为了测试RNA:寡聚物比率对LP效率的影响，使用了两倍(800nM)和五倍的寡聚物(2μM)。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。将RNA-寡聚物混合物在室温(RT)下孵育30分钟，然后与100μl链霉亲和素-(西格玛公司(Sigma))混合。将混合物在RT下在转子混合器上孵育1小时，并且通过离心旋转沉降链霉亲和素-珠来收集未结合部分。用1X结合缓冲剂将珠洗涤三次。通过在75℃下、在1X结合缓冲剂的存在下将树脂加热10分钟来洗脱与珠结合的RNA(图4和5中的‘洗脱’)。通过在95℃下、在95％甲酰胺的存在下将珠加热5分钟来洗脱仍与珠结合的RNA(图4和5中的‘树脂’)。通过Qubit测量未结合和洗脱的RNA的浓度，并且通过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳(尿素PAGE)分离200ng的RNA，使用凝胶染色剂染色并且使用成像系统可视化。
在1.4Kb RNA(图4)和2.6Kb RNA(图5)二者中，与输入物相比，在未结合部分有环状RNA的显著富集(1.4Kb RNA中大约90％富集(图4)，2.6K RNA中50％富集(图5))。与树脂结合的大多数RNA是含有内含子区域的线性RNA(线性RNA，图4和5)，这表明寡聚物特异性捕获含有内含子的RNA。在1.4Kb RNA和2.6Kb RNA中，寡聚物浓度的增加均不影响环状RNA富集产率。
实例3：单寡聚物可以捕获线性RNA副产物并富集环状RNA
此实例显示通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物对环状RNA的富集。在此实例中，线性RNA在3’半内含子的5’端包括延伸区域，该区域在自剪接期间被剪接掉。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。构建体包括5’端延伸序列的36个核苷酸。
为了拉下含有延伸序列的线性副产物，设计了针对延伸区域的寡聚物。该寡聚物是36个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的/额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与400pmol寡聚物混合(最终的RNA浓度为400nM，并且寡聚物浓度为800nM)。为了测试RNA:寡聚物比率对线性RNA拉下效率的影响，使用了2.5倍(1μM)或5倍(2μM)的寡聚物。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。将RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分钟，然后与100μl链霉亲和素-(西格玛公司)混合。将混合物在RT下在转子混合器上孵育1小时，并且通过离心旋转沉降珠来收集未结合部分。用1X结合缓冲剂将珠洗涤三次。通过在75℃下、在1X结合缓冲剂的存在下将树脂加热10分钟来洗脱与树脂结合的RNA(图6中的“洗脱”)。通过在95℃下、在95％甲酰胺的存在下将树脂加热5分钟来洗脱仍与珠结合的RNA(图6中的“树脂”)。通过Qubit测量未结合和洗脱的RNA的浓度，并且通过尿素PAGE分离200ng的RNA，使用凝胶染色剂染色并通过使用成像系统可视化。
与输入物相比，在未结合部分中环状RNA有显著的富集(800nM寡聚物中50％富集(图6))。与树脂结合的大多数RNA是含有延伸区域的线性RNA，这表明寡聚物特异性地捕获具有延伸区域的线性RNA(线性RNA，图6)。寡聚物浓度的增加显著影响环状RNA富集产率，富集产率从800nM寡聚物时的50％增加至4μM寡聚物时的96％。
实例4：比较分批纯化法和柱填充法
此实例显示用于通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物而富集环状RNA的两种不同方式。一种方法是将RNA-寡聚物混合物与链霉亲和素-珠一起在管中孵育(分批法)，另一种方法是将珠预填充在柱中，并借助重力穿过RNA-寡聚物混合物(柱法)。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。
为了拉下含有内含子序列的线性副产物，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种寡聚物针对3’半内含子，两种寡聚物针对5’半内含子。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的/额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(1nmol)与2nmol的每种寡聚物混合，总共2.5ml(针对每种寡聚物，最终的RNA浓度为400nM，并且寡聚物浓度为800nM)。将RNA-寡聚物混合物在RT孵育30分钟，伴随或不伴随在75℃下加热3分钟。将没有寡聚物的RNA混合物用作阴性对照。对于分批纯化方法，将500μl链霉亲和素-珠添加至混合物中。然后将混合物在RT下在转子混合器上孵育1小时，并且通过离心旋转沉降珠来收集未结合部分。对于柱纯化，将500μl珠预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Qubit测量未结合的或流通物中的RNA的浓度，并且通过尿素-PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂染色并且使用成像系统可视化。
与输入物相比，未发现分批纯化法和柱纯化法之间在环状RNA富集方面有显著差异(参见例如，泳道3和4分别相对于泳道6和7)(图7)。加热和冷却RNA-寡聚物不会增加环状RNA的富集。此数据表明，线性RNA拉下法(LP)可以通过珠的柱填充扩大。
实例5：当环化效率低时，连续的线性RNA拉下可以进一步富集环状RNA
此实例显示通过连续的线性RNA拉下对环状RNA的富集。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。
为了拉下含有内含子序列的线性副产物，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种针对3’半内含子，两种针对5’半内含子。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的/额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(1nmol)与2nmol的每种寡聚物混合，总共2.5ml(针对每种寡聚物，最终的RNA浓度为400nM，并且寡聚物浓度为800nM)。将RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl珠预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。将收集的流通物与额外的寡聚物(最终800nM)混合，然后穿过新预填充的树脂。收集流通物并通过Qubit测量第一轮和第二轮流通物的浓度。通过尿素-PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂染色并使用成像系统可视化。
在第一轮线性RNA拉下中，有130％的环状RNA富集(图8，第一轮LP；环状RNA纯度从23％至54％)。随着第二轮拉下，有额外的富集，然后最终实现了超过200％的富集(图8，第二轮LP；环状RNA纯度从23％至72％)。
实例6：不同盐浓度下线性RNA拉下的优化
此实例显示结合缓冲剂中盐浓度对通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物来富集环状RNA的影响。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。该ORF是hEPO(hEPO，针对图9A)或SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike，针对图9B)。ORF为hEPO和SARS-CoV-2Spike时，线性RNA的长度分别为大约1.2Kb和大约4.5Kb(在6％尿素PAGE上用2Kb梯度电泳，尽管RNA的大小为4.5Kb)。
为了拉下含有内含子序列的线性副产物，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种针对3’半内含子，两种针对5’半内含子。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的/额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(1nmol)与2nmol的每种寡聚物混合，总共2.5ml(针对每种寡聚物，最终的RNA浓度为400nM，并且寡聚物浓度为800nM)。为了测试盐浓度对环状RNA富集的影响，还测试了500mM、1000mM和2000mM的NaCl浓度。将RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl珠预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。收集流通物并通过Qubit测量流通物中RNA的浓度。通过尿素-PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂染色并使用成像系统可视化。
在1.2Kb RNA的情况下，在不同的盐条件下，环状RNA富集没有显著差异(图9A)。然而，当盐浓度增加时，4.5Kb RNA的环状RNA的富集增加(图9B)。在150mM NaCl时有60％的富集(从输入物20％的环状RNA纯度至32％的环状RNA纯度)，而在2000mM NaCl时有90％的富集(从输入物20％的环状RNA纯度至38％的环状RNA纯度)。此数据表明，在线性RNA拉下(LP)中，更高浓度的盐可以改善长RNA的环状RNA富集。
实例7：线性RNA拉下介导的环状RNA富集增强了下游工艺纯化后的环状RNA表达
此实例显示通过线性RNA拉下法纯化的环状RNA的增强的表达。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是高斯萤光素酶(Gluc，针对图10)或hEPO(针对图11)。
为了拉下含有内含子序列的线性副产物，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种寡聚物针对3’半内含子，两种寡聚物针对5’半内含子。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的/额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(1nmol)与2nmol的每种寡聚物混合，总共2.5ml(针对每种寡聚物，最终的RNA浓度为400nM，并且寡聚物浓度为800nM)。将RNA-寡聚物混合物在RT下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl珠预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Amicon超离心过滤器(100K截止值)将收集的流通物与水进行缓冲剂交换。
使用不同的下游工艺纯化富集的环状RNA。并行纯化未富集的体外转录RNA用于对照。
对于编码Gluc的环状RNA，测试了四种不同的纯化方法。第一种方法是柱纯化，对富集的环状RNA进行柱纯化(Monarch)。第二种方法是凝胶纯化。将编码Gluc的富集环状RNA通过尿素-PAGE纯化，在缓冲剂(0.5M乙酸钠、0.1％ SDS、1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。第三种方法是反相色谱法(RP)。通过反相色谱法纯化编码Gluc的环状RNA，并在Amicon超离心过滤器(100K截止值)中将级分与柠檬酸钠、然后与水进行缓冲剂交换。第四种方法是阴离子交换色谱法(AEX)。通过阴离子交换色谱法(AEX)纯化编码Gluc的环状RNA，并在Amicon超离心过滤器(100K截止值)中将级分与水进行缓冲剂交换。对体外转录RNA进行RP和AEX纯化用于比较。
对于编码hEPO的环状RNA，测试了四种不同的纯化方法。第一种方法不纯化，仅使用缓冲剂交换的环状RNA(BE)。第二种方法是凝胶纯化。将编码hEPO的富集环状RNA通过尿素-PAGE纯化，在缓冲剂(0.5M乙酸钠、0.1％ SDS、1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于无RNA酶的水中。第三种方法是反相色谱法(RP)。通过反相色谱法纯化编码hEPO的环状RNA，并在Amicon超离心过滤器(100K截止值)中将级分与柠檬酸钠、然后与水进行缓冲剂交换。第四种方法是阴离子交换色谱法(AEX)。通过阴离子交换色谱法(AEX)纯化编码hEPO的环状RNA，并在Amicon超离心过滤器(100K截止值)中将级分与水进行缓冲剂交换。对体外转录RNA进行凝胶纯化、RP和AEX纯化用于比较。
为了比较富集的(LP)或未富集的(IVT)环状RNA对Gluc的表达，使用MessengerMax转染试剂(英杰公司(Invitrogen))用0.1pmol纯化环状RNA转染海拉(HeLa)细胞(96孔板中，10,000个细胞/孔)。在6小时、24小时或48小时时收获细胞培养基。为了测量Gluc活性，将10μl收获的细胞培养基转移到白色96孔板中，并根据制造商的说明使用生物发光报告基因测定系统(皮尔斯高斯萤光素酶快速检测试剂盒(Pierce Gaussia Luciferase Flash Assay Kit)，16158，赛默科技公司(ThermoScientific))。在光度计仪器(普洛麦格公司(Promega))中读取板。
为了比较富集的(LP)或未富集的(IVT)环状RNA对hEPO的表达，使用MessengerMax转染试剂(英杰公司)用0.25pmol纯化环状RNA转染海拉细胞(96孔板中，10,000个细胞/孔)。在24小时或48小时时收获细胞培养基。根据制造商的说明通过hEPO ELISA试剂盒(英杰公司)测量分泌的hEPO蛋白的量。
在Gluc RNA和hEPO RNA中，经由线性RNA拉下(LP)纯化的环状RNA均显示出比未富集(如果使用相同的方法纯化环状RNA)时更好的表达(例如，在Gluc的情况下，LP-RP显示出比IVT-RP高出4倍多的表达，在hEPO的情况下，高出2倍)。此数据表明，使用本文所述的方法进行的环状RNA富集增强了表达。
实例8：使用数量减少的寡聚物的线性RNA拉下富集环状RNA
此实例显示使用数量更少的寡聚物时通过经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物对环状RNA的富集。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。对于此实例，ORF是hEPO，并且带有hEPO ORF的线性RNA的长度为大约1.4Kb。
对于去除含有内含子序列的线性副产物的线性拉下，设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物，其中四种寡聚物针对3’半内含子(#1至#4)，两种寡聚物针对5’半内含子(#5和#6)(图12)。每种寡聚物都是23个核苷酸并且具有通过TEG连接的生物素。在此实例中，检验了使用减少数量的寡聚物的拉下效率。
在第一研究中，测试了针对3’半内含子的寡聚物(#1至#4)。在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的或额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与两个不同浓度(2.4μM或4.8μM)的针对3’半内含子的每种寡聚物(#1至#4)混合(最终的RNA浓度为400nM)，共500μl。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。对于阳性对照，使用了所有六种寡聚物(#1至#6)的混合物。将RNA-寡聚物混合物在室温(RT)下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl树脂预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Qubit测量流通物的RNA的浓度，并且通过尿素PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂溶液染色并且使用成像系统可视化。
在2.4μM和4.8μM浓度下，#1和#2寡聚物均显示出与阳性对照相似的富集效率，阳性对照使用了用于拉下的所有六种寡聚物(图13A，6％凝胶)并去除了3’半内含子(图13B，10％凝胶)。
在第二研究中，对针对3’半内含子(#1和#2)和5’半内含子(#5和#6)的寡聚物的组合均进行了测试。在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要另外的或额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与#1寡聚物和#5或#6寡聚物的组合、或#2寡聚物和#5或#6寡聚物的组合混合，总共500μl(最终的RNA浓度为400nM)(最终的寡聚物浓度各自为2.4μM)。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。作为另外的对照，使用了仅#1寡聚物或仅#5寡聚物。对于阳性对照，使用了所有六种寡聚物(#1至#6)的混合物。将RNA-寡聚物混合物在室温(RT)下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl树脂预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Qubit测量流通物中RNA浓度，并且通过尿素PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂染色并且使用成像系统可视化。
针对3’半内含子或5’半内含子的两种寡聚物的组合显示出与使用针对3’半内含子的单寡聚物相似的环状RNA富集效率(图14A，6％凝胶)和更好的内含子去除(图14B，10％凝胶)。#1和#5寡聚物组合显示出与阳性对照(其中使用了用于拉下的所有六种寡聚物)相似的环状RNA富集效率(图14A)和内含子去除效率(图14B)。这些数据证明，使用两种寡聚物与使用六种寡聚物具有等同的环状RNA富集和内含子去除效率。
实例9：使用数量减少的寡聚物进行的线性RNA拉下介导的环状RNA富集促使环状RNA表达
此实例显示通过使用两种寡聚物的线性RNA拉下法纯化的环状RNA表达。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括hEPO ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要额外的反应。
对于去除含有内含子序列的线性副产物的线性拉下，如实例8中所述设计了针对内含子区域的六种不同寡聚物(#1至#6)。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与#1寡聚物和#5或#6寡聚物、或#2寡聚物和#5或#6寡聚物混合，总共500μl(最终的RNA浓度为400nM)(最终的寡聚物浓度各自为2.4μM)。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。作为另一个对照，使用了仅#1寡聚物或仅#5寡聚物。对于阳性对照，使用了所有六种寡聚物(#1至#6)的混合物。将RNA-寡聚物混合物在室温(RT)下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl树脂预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Amicon超离心过滤器(100K截止值)将收集的流通物与水进行缓冲剂交换。
为了比较用不同寡聚物富集的(LP)环状RNA对hEPO的表达，使用MessengerMax转染试剂(英杰公司)用0.25pmol纯化环状RNA转染海拉细胞(96孔板中，10,000个细胞/孔)。在24小时收获细胞培养基。根据制造商的说明通过hEPO ELISA试剂盒(英杰公司)测量分泌的hEPO蛋白的量。
使用两种寡聚物经由线性拉下(LP)纯化的环状RNA与使用所有六种寡聚物(#1至#6)经由LP纯化的环状RNA显示出相当的表达(图15)。特别地，数据显示，环状RNA表达获得自使用两种寡聚物(即，针对3’半内含子的寡聚物和针对5’半内含子的寡聚物)的组合经由LP纯化的环状RNA，并且与从使用所有六种寡聚物经由LP纯化的环状RNA观察到的表达相当。
实例10：使用同时靶向3’半内含子和5’半内含子的单寡聚物的线性RNA拉下
此实例显示环状RNA的富集，方式为用同时靶向3’半内含子和5’半内含子的单寡聚物经由寡聚物-链霉亲和素相互作用捕获线性副产物。
在此实例中，构建体设计为包括催化内含子的3’一半、外显子片段2(E2)、包括ORF的多核糖核苷酸负载物、外显子片段1(E1)和催化内含子的5’一半。ORF是hEPO，并且线性RNA的长度为大约1.4Kb。
在此实例中，设计了两种寡聚物：寡聚物5-Bio_1A5由#1寡聚物(如实例8所述的针对3’半内含子的寡聚物)和随后的#5寡聚物(如实例8所述的针对5’半内含子的寡聚物)组成；寡聚物5-Bio_5A1由#5寡聚物和随后的#1寡聚物组成。5-Bio_1A5和5-Bio_5A1寡聚物在不同的寡聚物序列之间都有八个核苷酸的腺苷接头和通过TEG与寡聚物连接的5’端生物素。在图16中提供了5-Bio_1A5和5-Bio_5A1寡聚物的示意图。
在7.5mM NTP存在下使用T7 RNA聚合酶通过体外转录从DNA模板合成线性RNA。通过用DNA酶处理20分钟去除模板DNA。用RNA纯化试剂盒(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs)，T2050)纯化合成的线性RNA。自剪接在转录期间发生；不需要额外的反应。
在1X结合缓冲剂(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、0.5mM EDTA)的存在下，将自剪接的RNA(200pmol)与同时靶向3’半内含子和5’半内含子的寡聚物5-Bio_1A5或5-Bio_5A1(2.4μM浓度)混合，总体积为500μl(最终的RNA浓度为400nM)。作为阴性对照，使用了无寡聚物的RNA。对于阳性对照，使用了所有六种寡聚物(#1至#6)的混合物。将RNA-寡聚物混合物在室温(RT)下孵育30分钟。对于柱纯化，将500μl树脂预填充在空柱中，并且将RNA-寡聚物混合物置于填充的树脂上。RNA-寡聚物混合物借助重力穿过树脂，并收集流通物。通过Qubit测量流通物中RNA浓度，并且通过尿素PAGE分离200ng RNA，使用凝胶染色剂染色并且使用成像系统可视化。
使用5-Bio_1A5或5-Bio_5A1经由线性拉下法纯化的环状RNA有效地去除了线性RNA(图17A)和内含子RNA(图17B)。环状RNA富集效率(图17A)和内含子去除效率(图17B)与使用了所有六种用于拉下的寡聚物的阳性对照相似。这些数据说明，设计为同时靶向3’半内含子和5’半内含子的单寡聚物可用于线性拉下以富集环状RNA，具有与使用六种寡聚物的LP相当的环状RNA富集和内含子去除效率。
其他实施例
虽然已经结合本发明的特定实施例描述了本发明，但是应当理解，能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖总体上遵循本发明的原理并且包括在本发明所属领域内的已知或常规实践内的与本发明的此类偏离的本发明的任何变化、使用或改编，并且可应用于在上文中阐述的基本特征，并且遵循权利要求的范围。其他实施例在权利要求中。

Claims (62)

1.一种从包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸混合物的多种多核糖核苷酸中分离包含靶区域的线性多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集包含含有所述靶区域的线性多核糖核苷酸；
(b)使所述样品与和所述靶区域杂交的寡核苷酸接触；以及
(c)从所述样品中的多种多核糖核苷酸中分离包含与所述寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸缺乏所述靶区域。
3.一种从多种多核糖核苷酸中分离包含靶区域的多核糖核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品，其中所述多种多核糖核苷酸的子集包含所述靶区域，其中所述靶区域不位于包含所述靶区域的多核糖核苷酸的3’末端或5’末端；
(b)使所述样品与和所述靶区域杂交的寡核苷酸接触；以及
(c)从所述样品中的多种多核糖核苷酸中分离包含与所述寡核苷酸杂交的靶区域的多核糖核苷酸。
4.一种将包含靶区域的线性多核糖核苷酸与包含所述靶区域的多种环状多核糖核苷酸分离的方法，所述方法包括：
(a)提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品；
(b)使所述样品与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸以第一结合亲和力与所述线性多核糖核苷酸的靶区域杂交，并且其中所述寡核苷酸以不同于所述第一结合亲和力的第二结合亲和力与所述环状多核苷酸的靶区域杂交；以及
(c)将所述样品中包含与所述寡核苷酸杂交的靶区域的线性多核糖核苷酸与所述多种环状多核糖核苷酸分离。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一结合亲和力小于所述第二结合亲和力，并且其中所述寡核苷酸优先与所述线性多核糖核苷酸结合。
6.一种将包含靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与包含所述靶区域的第二构象的多种多核糖核苷酸分离的方法，所述方法包括：
(a)提供包含所述多种多核糖核苷酸的样品；
(b)使所述样品与寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸以第一结合亲和力与所述第一构象的多核苷酸的靶区域杂交，并且其中所述寡核苷酸以不同于所述第一结合亲和力的第二结合亲和力与所述第二构象的多核苷酸的靶区域杂交；以及
(c)将所述样品中包含与所述寡核苷酸杂交的靶区域的第一构象的多核糖核苷酸与所述第二构象的多种多核糖核苷酸分离。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一结合亲和力小于所述第二结合亲和力，并且其中所述寡核苷酸优先与所述第一构象的多核糖核苷酸结合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括将所述寡核苷酸固定。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述靶区域缺乏polyA序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸与颗粒缀合。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸与第一捕获剂缀合。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述寡核苷酸通过化学接头与所述第一捕获剂缀合。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述化学接头包含三乙二醇。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述化学接头与所述寡核苷酸的3’端或5’端缀合。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述第一捕获剂包含抗原。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述抗原是生物素。
17.如权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括提供与所述第一捕获剂结合的第二捕获剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述第二捕获剂包含抗体或其抗原结合片段。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是链霉亲和素。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述第二捕获剂与颗粒缀合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒或珠。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中包含所述靶区域的多核糖核苷酸包含内含子或其部分。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述靶区域包含内含子或其部分。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述靶区域位于所述内含子或其部分的5’或3’。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述方法包括将剪接的多核糖核苷酸与非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分离。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述剪接的多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述剪接的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述剪接的多核糖核苷酸缺乏内含子或其部分。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述方法富集了相对于所述样品至少50％的量的所述剪接的多核糖核苷酸。
30.如权利要求22-29中任一项所述的方法，其中所述包含内含子或其部分的多核糖核苷酸是线性多核糖核苷酸。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对捕获的包含所述靶区域的多核糖核苷酸进行一次或多次洗涤。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(c)之后，进行第一洗脱步骤以释放所述捕获的包含靶区域的多核糖核苷酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述第一洗脱步骤包括添加第一缓冲剂和/或加热所述样品。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一洗脱步骤包括将所述样品加热至至少50℃。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述第一洗脱步骤之后，进行第二洗脱步骤。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述第二洗脱步骤包括添加第二缓冲剂和/或加热所述样品。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述第二洗脱步骤包括将所述样品加热至至少50℃。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述第二缓冲剂包含变性剂。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述变性剂包含甲酰胺或尿素。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括将所述样品与所述寡核苷酸一起孵育至少十分钟。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括收集未被所述寡核苷酸结合的所述样品的部分。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述方法包括提供多种寡核苷酸，其中每种寡核苷酸都与不同的靶区域杂交。
43.如权利要求42所述的方法，其中每种寡核苷酸都与第一捕获剂缀合。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述靶区域的等长部分具有至少80％互补性。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述靶区域的等长部分具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％互补性。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括提供与包含所述靶区域的多核糖核苷酸的摩尔比为10:1至1:10的寡核苷酸。
47.一种多核糖核苷酸群体，其通过如权利要求1-46中任一项所述的方法产生。
48.如权利要求47所述的多核糖核苷酸群体，其中所述群体包含缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述环状多核糖核苷酸包含组合物中至少40％(mol/mol)的总多核糖核苷酸。
49.一种组合物，其包含多核糖核苷酸的混合物，其中所述混合物的第一子集包含缺乏靶区域的环状多核糖核苷酸，并且所述多种多核糖核苷酸的第二子集包含含有所述靶区域的线性多核糖核苷酸，其中所述第一子集包含所述组合物中至少40％(mol/mol)的总多核糖核苷酸。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述群体包含少于50％(mol/mol)的线性多核糖核苷酸。
51.一种组合物，其包含含有靶区域的多核糖核苷酸和配置为与所述靶区域杂交的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与第一捕获剂缀合。
52.如权利要求51所述的组合物，其进一步包含缺乏所述靶区域的多核糖核苷酸。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述缺乏靶区域的多核糖核苷酸是环状多核糖核苷酸。
54.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其进一步包含配置为与所述第一捕获剂结合的第二捕获剂。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述第二捕获剂与颗粒缀合。
56.如权利要求51-55中任一项所述的组合物，其中所述第一捕获剂是生物素。
57.如权利要求51-56中任一项所述的组合物，其中所述第二捕获剂是链霉亲和素。
58.如权利要求49-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物通过如权利要求1-46中任一项所述的方法产生。
59.如权利要求49-58中任一项所述的组合物，其中所述线性多核糖核苷酸包含内含子或其部分。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述靶区域包含所述内含子或其部分。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述靶区域位于所述内含子或其部分的5’或3’。
62.一种药物组合物，其包含如权利要求49-61中任一项所述的组合物以及稀释剂、载剂或赋形剂。
CN202280069794.XA 2021-10-18 2022-10-18 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法 Pending CN118382705A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163256703P 2021-10-18 2021-10-18
US63/256,703 2021-10-18
PCT/US2022/046969 WO2023069397A1 (en) 2021-10-18 2022-10-18 Compositions and methods for purifying polyribonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118382705A true CN118382705A (zh) 2024-07-23

Family

ID=84358528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280069794.XA Pending CN118382705A (zh) 2021-10-18 2022-10-18 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240417714A1 (zh)
EP (1) EP4419706A1 (zh)
JP (1) JP2024538144A (zh)
KR (1) KR20240126857A (zh)
CN (1) CN118382705A (zh)
AU (1) AU2022370530A1 (zh)
CA (1) CA3235625A1 (zh)
MX (1) MX2024004618A (zh)
TW (1) TW202322826A (zh)
WO (1) WO2023069397A1 (zh)

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5849727A (en) 1996-06-28 1998-12-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
NZ581166A (en) 2003-09-15 2011-06-30 Protiva Biotherapeutics Inc Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
JP4380411B2 (ja) 2004-04-30 2009-12-09 澁谷工業株式会社 滅菌方法
MX2007007913A (es) 2004-12-27 2007-08-14 Silence Therapeutics Ag Complejos de lipido recubiertos y su uso.
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
JP2009534690A (ja) 2006-07-10 2009-09-24 メムシック，インコーポレイテッド 磁場センサーを用いて偏揺れを感知するためのシステム、および、前記システムを用いた携帯用の電子装置
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
NZ588583A (en) 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009135190A2 (en) 2008-05-01 2009-11-05 Nod Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of making and using same
JP5777519B2 (ja) 2008-10-09 2015-09-09 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
PT2344639E (pt) 2008-10-20 2015-09-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composição e métodos de inibição da expressão de transtirretina
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
KR102264822B1 (ko) 2008-11-10 2021-06-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
US8722082B2 (en) 2008-11-10 2014-05-13 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
NZ622843A (en) 2009-06-10 2015-10-30 Tekmira Pharmaceuticals Corp Improved lipid formulation
CA2767127A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
EP2467357B1 (en) 2009-08-20 2016-03-30 Sirna Therapeutics, Inc. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
WO2011066651A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Snalp formulations containing antioxidants
US9687550B2 (en) 2009-12-07 2017-06-27 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
US20130116419A1 (en) 2010-01-22 2013-05-09 Daniel Zewge Post-synthetic chemical modification of rna at the 2'-position of the ribose ring via "click" chemistry
US20120315324A1 (en) 2010-02-05 2012-12-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal compositions and methods for the treatment of disease
US10077232B2 (en) 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
JP2013527856A (ja) 2010-05-12 2013-07-04 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 陽イオン性脂質およびその使用方法
DK2575764T3 (en) 2010-06-03 2017-08-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc BIODEGRADABLE LIPIDS FOR THE ACTIVATION OF ACTIVE AGENTS
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
RU2577983C2 (ru) 2010-08-31 2016-03-20 Новартис Аг Липиды, подходящие для липосомной доставки кодирующей белок рнк
EP3943114B1 (en) 2010-09-20 2024-08-07 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9029604B2 (en) 2010-09-30 2015-05-12 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20120101478A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Allergan, Inc. Dual Cartridge Mixer Syringe
EP2629802B1 (en) 2010-10-21 2019-12-04 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9617461B2 (en) 2010-12-06 2017-04-11 Schlumberger Technology Corporation Compositions and methods for well completions
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
WO2012162210A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Ring constrained cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9701623B2 (en) 2011-09-27 2017-07-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
MX363734B (es) 2011-10-27 2019-03-29 Massachusetts Inst Technology Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco.
WO2013070324A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived microvesicle compositions for diagnosis and treatment of disease
EP2781507B1 (en) 2011-11-18 2017-03-22 Nof Corporation Cationic lipid having improved intracellular kinetics
US20140308304A1 (en) 2011-12-07 2014-10-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
AU2012347605B2 (en) 2011-12-07 2017-09-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
US9839616B2 (en) 2011-12-12 2017-12-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Lipid nano particles comprising cationic lipid for drug delivery system
WO2013116126A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2817287B1 (en) 2012-02-24 2018-10-03 Arbutus Biopharma Corporation Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
DK2830594T3 (en) 2012-03-27 2018-08-13 Sirna Therapeutics Inc DIETHER-BASED BIOLOGICALLY DEGRADABLE CATIONIC LIPIDS FOR siRNA RELEASE
MX377255B (es) 2013-03-08 2025-03-07 Novartis Ag Lipidos y composiciones de lipidos para el suministro de agentes activos.
CA2919226C (en) 2013-07-23 2024-05-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
US9629804B2 (en) 2013-10-22 2017-04-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger RNA
US9365610B2 (en) 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
CN105873902B (zh) 2013-11-18 2019-03-08 阿克丘勒斯治疗公司 用于rna递送的可电离的阳离子脂质
CA2930665A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
EP3083579B1 (en) 2013-12-19 2022-01-26 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
PL3125927T3 (pl) 2014-04-01 2021-07-19 Rubius Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do immunomodulacji
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
WO2016183482A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
CA2990172A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones and their use in compositions for delivering an agent to a subject or cell
CN107922364B (zh) 2015-06-29 2021-12-31 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒制剂
AU2016288643A1 (en) 2015-07-02 2018-02-22 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived microvesicle compositions for delivery of miRNA and methods for treatment of cancer
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
SMT202300052T1 (it) 2015-10-28 2023-05-12 Acuitas Therapeutics Inc Nuovi lipidi e for­mulazioni di nanoparticelle lipidiche per il rilascio di acidi nucleici
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
CA3007955A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of therapeutic agents
WO2017117528A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
SG10202007639SA (en) 2016-01-11 2020-09-29 Rubius Therapeutics Inc Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for immune indications
WO2017173054A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
WO2018009838A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems expressing exogenous rna
JP2019536793A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 固形腫瘍に浸透させるための細胞系に関連する組成物および方法
AU2018221227A1 (en) 2017-02-17 2019-08-15 Rubius Therapeutics, Inc. Functionalized erythroid cells
WO2018191722A1 (en) * 2017-04-14 2018-10-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for transient gene therapy with enhanced stability
IL270496B2 (en) 2017-05-08 2024-11-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof
US20210059953A1 (en) 2017-09-08 2021-03-04 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
DK3688162T3 (da) 2017-09-29 2024-05-13 Intellia Therapeutics Inc Formuleringer
IL311278A (en) 2017-09-29 2024-05-01 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, preparations, and methods for genome editing
EP3724208A4 (en) 2017-12-15 2021-09-01 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC COMPOSITIONS CONSISTING OF CIRCULAR POLYRIBONUCLEOTIDES AND THEIR USES
CN119570787A (zh) 2018-05-11 2025-03-07 比姆医疗股份有限公司 使用可编程碱基编辑器系统遏止病原性突变的方法
AR116016A1 (es) 2018-08-24 2021-03-25 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Métodos para fabricar paquetes mensajeros vegetales
BR112021003380A2 (pt) 2018-08-28 2021-05-18 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc métodos e composições para modulação de um genoma
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
WO2020081938A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
AU2019384557A1 (en) 2018-11-21 2021-06-10 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mRNA encoding CFTR
CN111607588B (zh) * 2019-02-25 2024-06-25 上海印序生物科技有限公司 环状rna快速富集试剂盒及方法
SG11202111154WA (en) 2019-04-25 2021-11-29 Intellia Therapeutics Inc Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
ES2961245T3 (es) 2019-12-04 2024-03-11 Orna Therapeutics Inc Composiciones y métodos de ARN circular

Also Published As

Publication number Publication date
CA3235625A1 (en) 2023-04-27
MX2024004618A (es) 2024-07-12
KR20240126857A (ko) 2024-08-21
TW202322826A (zh) 2023-06-16
US20240417714A1 (en) 2024-12-19
EP4419706A1 (en) 2024-08-28
AU2022370530A1 (en) 2024-05-02
JP2024538144A (ja) 2024-10-18
WO2023069397A1 (en) 2023-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2994006T3 (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
US20220257794A1 (en) Circular rnas for cellular therapy
CA3077086A1 (en) Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20230104113A1 (en) Delivery of compositions comprising circular polyribonucleotides
KR20240118881A (ko) 항푸소제닉 폴리펩티드를 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드
US20240417714A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
US20250051386A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
CN118401663A (zh) Dna组合物及相关方法
WO2024097664A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102799A1 (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024192420A1 (en) Compositions comprising polyribonucleotides and uses thereof
WO2025006684A1 (en) Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
CN119487196A (zh) 双链dna组合物及相关方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Wadim Dudekin

Inventor after: Bai Qiyong

Inventor before: Wadim Dudekin

Inventor before: Bai Jiying

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Country or region after: U.S.A.

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: Flagship Venture & Innovation No.6 Co.,Ltd.

Address before: Massachusetts, USA

Applicant before: Flagship venture six

Country or region before: U.S.A.