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TW202430215A - 用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法 - Google Patents

用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法 Download PDF

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TW202430215A
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艾瑞安 瑪莉 羅斯柴爾德
尼可拉斯 麥卡尼 普拉吉斯
夏洛特 馬利 尼可
史蒂芬 馬歇爾
史考特 摩爾 卡爾森
比維克 柯赫
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揚恩 保羅 蓋 瑞吉斯 艾伽拉
瑞弗 亞非恩
努巴 伯葛斯 亞非恩
丹尼爾 布羅
弗朗西斯科 哈維爾 庫樂瑞 盧安果
安德魯 詹姆士 金羅奇
拿伯里 阿札
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美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司
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Abstract

提供了大分子組成物和相關方法，其實現治療劑向骨組織中的效應物靶標的靶向遞送，同時最小化或避免向其他細胞、組織或器官的不期望的遞送。描述了與大分子相關的組成物和方法，該等大分子係例如ANDbody™，其包含對效應物靶標特異性的效應物靶標結合結構域和對骨組織特異性的位址結合結構域。

Description

用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法
對於存在於健康組織和患病組織中的原本期望的治療性靶標來說，不期望的脫靶效應係一個問題。
本揭露部分描述了大分子組成物和相關方法，其實現治療劑向骨細胞、組織或器官中的效應物靶標的靶向遞送，同時最小化或避免向其他細胞、組織或器官的不期望的遞送。一般而言，本文所述之組成物包含大分子，例如ANDbody™，其包含對骨特異性的效應物靶標結合結構域和對位址(address)靶標特異性的位址結合結構域。位址靶標通常在受試者中被充分限制以將大分子靶向所期望的骨細胞、組織或器官。在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域在不存在位址靶標結合結構域的情況下不影響效應物靶標。此外，位址靶標結合結構域不影響結合位址靶標後的傳訊。然而，藉由位址靶標結合結構域對效應物靶標結合結構域的定位使得效應物靶標結合結構域能夠充分結合效應物靶標，以引起對靶細胞或組織中效應物靶標的傳訊的影響。另外，本文所述之大分子可以與一個或多個小分子連接。本文所述之組成物可用於例如將治療劑（例如，效應物靶標結合結構域、小分子或兩者）特異性遞送至受試者中的期望位置，例如骨細胞、組織或器官，同時避免不期望的脫靶效應（例如，腦；皮膚；心血管系統，例如心臟或脈管系統中不期望的脫靶效應）和/或避免某些毒性，例如避免心血管疾病，例如中風、心肌梗塞。
一方面，本揭露提供了將大分子定位在受試者的骨組織或骨細胞處之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中 (a) 該第一結合位點對該受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者中的該骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中 (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊；(ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊；並允許該大分子定位於該受試者的該骨組織或骨細胞。
在一些實施方式中，在向受試者投與大分子後1天和7天之間的時間點，在骨組織或骨細胞處檢測到受試者中可檢測的大分子的至少25%。
在一些實施方式中，相對於缺少第二結合位點的參考大分子，骨組織或骨細胞處的第一結合位點的效力顯著增加。
在一些實施方式中，第一結合位點對效應物靶標具有低親和力。
在一些實施方式中，第一結合位點對效應物靶標具有低親合力。
在一些實施方式中，第一結合位點對效應物靶標的親和力低於第二結合位點對位址靶標的親和力。
在一些實施方式中，第一結合位點對效應物靶標的親合力低於第二結合位點對位址靶標的親合力。
在一些實施方式中，相對於缺乏第二結合位點的參考大分子，在受試者的非靶組織或細胞中藉由大分子的效應物靶標傳訊顯著減少。
在一些實施方式中，位址靶標在受試者中區域表現。在一些實施方式中，位址靶標在受試者中局部表現。在一些實施方式中，位址靶標的表現限於受試者中的細胞類型。
在一些實施方式中，位址靶標僅由受試者中的處於特定細胞狀態的細胞表現。在一些實施方式中，位址靶標僅由受試者中的處於疾病狀態的細胞表現。
在一些實施方式中，第一結合位點或第二結合位點包含多胜肽。在一些實施方式中，多胜肽係抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，大分子係抗體，其包含對受試者中的效應物靶標特異性的第一結合位點和對位址靶標特異性的第二結合位點。
在一些實施方式中，多胜肽係效應物靶標的配體或位址靶標的配體。在一些實施方式中，(a) 第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段並且第二結合位點包含位址靶標的配體；或者 (b) 第一結合位點包含效應物靶標的配體並且第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，(a) 第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段並且第二結合位點包含結合位址靶標的小分子；(b) 第一結合位點包含結合效應物靶標的小分子，並且第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，第二結合位點對軟骨黏附素（CHAD）係特異性的。在一些實施方式中，第二結合位點對牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）係特異性的。在一些實施方式中，第二結合位點對骨涎蛋白（IBSP）係特異性的。在一些實施方式中，第二結合位點對滋養層糖蛋白（TPBG）係特異性的。在一些實施方式中，第二結合位點對羥基磷灰石係特異性的。在一些實施方式中，第二結合位點係雙膦酸鹽（例如，阿侖膦酸鹽（alendronate）、瑞索膦酸鹽（risenodrate）、依替膦酸鹽（etidronate）、伊班膦酸鹽（ibandronate）、氯膦酸鹽（clodronate）、替魯膦酸鹽（tiludronate）、帕米膦酸鹽（pamidronate）或唑來膦酸鹽（zoledronate））。
在一些實施方式中，第一結合位點對硬化蛋白（SOST）係特異性的。在一些實施方式中，第一結合位點對dickkopf-1（DKK1）係特異性的。
在一些實施方式中，第二結合位點對干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）係特異性的。在一些實施方式中，第一結合位點對SOST係特異性的。
在一些實施方式中，大分子與小分子連接。在一些實施方式中，小分子係奧當卡替（odanacatib）。在一些實施方式中，小分子係雙膦酸鹽（例如，阿侖膦酸鹽（alendronate）、瑞索膦酸鹽（risenodrate）、依替膦酸鹽（etidronate）、伊班膦酸鹽（ibandronate）、氯膦酸鹽（clodronate）、替魯膦酸鹽（tiludronate）、帕米膦酸鹽（pamidronate）或唑來膦酸鹽（zoledronate））。
在一些實施方式中，大分子和小分子藉由連接子（linker）連接。在一些實施方式中，連接子係可切割連接子。在一些實施方式中，連接子係不可切割連接子。
在下面的描述中闡述了本發明之一個或多個實施方式的細節。從以下附圖和幾個實施方式的詳細描述，以及從所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優點將變得顯而易見。
本文提供了ANDbody TM分子，其包括治療性效應物靶標結合結構域和位址靶標結合結構域，其中位址靶標係骨組織或細胞。在一些實施方式中，ANDbody分子與小分子或多於一個小分子連接。僅當位址靶標結合結構域也接合靶組織或細胞上的位址靶標以將效應物靶標定位於靶細胞或組織時，ANDbody分子上的治療性效應物靶標才有效地接合其治療性效應物靶標，例如以形成邏輯閘的AND-門類型。例如，在一些實施方式中，ANDbody係大分子，其包含至少 (a) 對在哺乳動物受試者上例如細胞表面上表現（例如廣泛表現）的治療性效應物靶標特異性的第一結合位點；以及 (b) 對位址靶標特異性的第二結合位點，其中該位址靶標係骨組織或細胞。在實施方式中，位址靶標的表現限於受試者體內的骨組織或細胞。在一些實施方式中，第一結合位點與治療性效應物靶標的結合弱於第二結合位點與位址標誌物的結合。效應物和位址靶標可以位於同一細胞上，或者位於同一組織內的不同細胞或區室中。
在一些實施方式中，在投與給受試者大分子（例如ANDbody）後1天和7天之間的時間點（例如1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天），在受試者中可檢測到的至少25%的大分子（例如ANDbody）在靶骨組織或細胞處被檢測到。例如，在一些實施方式中，在對受試者投與大分子後1天和7天之間的時間點，在受試者中至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%（例如25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、50%-55%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、或95%-100%）的可檢測大分子在靶骨組織或細胞處被檢測到。
骨效應物靶標
本發明之ANDbody TM包含調節有需要的受試者（例如哺乳動物受試者，例如人）中的治療性效應物靶標的效應物。如本文所用，「效應物靶標」係受試者的細胞或組織的離散結構（例如，細胞表面蛋白、跨膜蛋白、受體），ANDbody的治療性效應物結合結構域可以與其結合並且對受試者發揮調節作用，例如治療作用。本文描述的ANDbody具有對效應物靶標特異性的結合位點。當效應物結合結構域與效應物靶標結合時，效應物調節靶骨細胞或組織以對受試者產生生物學應答，例如治療性效應。然而，在一些實施方式中，本文提供的效應物靶標結合結構域可能不會引發生物學效應，除非它與位址靶向結構域聯合提供以將效應物定位於靶骨細胞或組織中的所期望靶位址。在一些實施方式中，此類治療性傳訊可能需要根據本發明之多個大分子結合多個效應物靶標。
在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域在單獨提供時可以產生小/弱的生物學效應，並且在與將效應物定位和集中/聚集到靶向的骨細胞或組織中期望的靶位址的位址靶向結構域聯合提供時提供更大/更強的生物學效應。在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域在單獨提供時可以產生可接受的生物學效應，並且在與位址靶向結構域聯合提供時提供甚至更大/更強的生物學效應以將效應物靶標結合結構域定位於靶向的骨細胞或組織。在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域在單獨提供時可以產生強生物學效應，並且在與位址靶向結構域聯合提供強的或更強的靶向作用以將效應物靶標結合結構域定位於靶向的骨細胞或組織。在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域當單獨提供時可產生具有不期望的脫靶生物學效應的生物學效應，但當與位址靶向聯合提供時可被靶向、集中和聚集至靶向的骨細胞或組織中的所期望位址以減少或消除不期望的脫靶生物學效應。因此，本技術的效應物靶標結合結構域提供了優異的治療劑，當與本文所述之位址靶標結合結構域聯合提供時，其提供更強的靶向生物學效應且具有更少的副作用，包括更少的非預期的脫靶生物學效應。
此類治療性傳訊效應的實例包括但不限於： (i)        阻斷促進或維持疾病狀態的訊息傳遞途徑； (ii)       活化減少或預防疾病狀態的訊息傳遞途徑； (iii)      促進抗體依賴性細胞毒性（ADCC）； (iv)      誘導靶細胞或組織上的補體活化； (v)       促進吞噬作用； (vi)      阻斷或活化促進細胞分化的訊息傳遞途徑； (vii)     誘導組織重塑以減少或預防纖維化。
在一些實施方式中，治療性效應物靶標在受試者中比位址靶標更廣泛地表現。在一些實施方式中，治療性效應物靶標在生物體中全身、區域或局部表現。治療性效應物靶標的「全身表現」係指治療性效應物靶標在受試生物體的大部分中以基本上相同的水平表現。全身表現涉及多個組織。治療性效應物靶標的「區域表現」係指治療性靶標在小於全身表現但大於局部表現的區域中表現。區域表現不限於單一組織，而是可以發生在多個不同組織中。治療性效應物靶標的「局部表現」係指治療性靶標在單個或少數組織區域中表現。局部表現不限於單個組織，而是可以發生在多個不同組織中。
在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域對效應物靶標具有低親和力。例如，低親和力可以是大於10 nM的親和力（例如，10 nM-1 μM之間的親和力，例如10 nM與100 nM之間的親和力）。在一些方面，效應物靶標結合結構域對於效應物靶標具有等於或小於100 nM的親和力（K D），如使用生物層干涉測量法測量的。
在一些實施方式中，效應物靶標結合結構域對效應物靶標具有低親合力。表1中列出了可用本文揭露的ANDbody靶向的治療性效應物靶標的非限制性實例，以及效應物靶標的示例性功能。
[ 表 1] ：示例性效應物靶標
效應物靶標 效應物結合結構域的類型 示例性效應物結合結構域
硬化蛋白（SOST） SOST抑制劑 Yu等人, Acta Pharm Sin B[製藥學報B], 12(5): 2150-2170, 2022提供的羅莫單株抗體（Romosozumab）、布索組單株抗體（blosozumab）、瑟蘇單株抗體（setrusumab）、SHR-1222、硬化蛋白抑制劑。
Dickkopf-1（DKK1） DKK1抑制劑 Jiang等人, Front Pharmacol[藥理學前沿], 13: 文章編號847387, 2022提供的DKK1抑制劑。
核因子κ-β配體受體活化劑（RANKL） RANKL抑制劑 迪諾舒單株抗體。
組織蛋白酶K 組織蛋白酶K抑制劑 奧當卡替（odanacatib）。
PTHR（GPCR）（序列登錄號：U6CS43） PTHR促效劑（例如，促效胜肽，例如，間歇性促效胜肽）
在一些實施方式中，效應物靶標係硬化蛋白（SOST）並且效應物靶標結合結構域包含SOST抑制劑（例如，Yu等人Acta Pharm Sin B[製藥學報B], 12(5): 2150-2170, 2022中提供的羅莫單株抗體、布索組單株抗體、瑟蘇單株抗體、SHR-1222、或硬化蛋白抑制劑或其抗原結合片段）。
在一些實施方式中，SOST抑制劑係抗SOST抗體，其包含美國專利案號8,017,120 B2的SEQ ID NO: 245、246和247給出的三個重鏈CDR以及美國專利案號8,017,120 B2的SEQ ID NO: 78、79和80給出的三個輕鏈CDR，這六個CDR藉由引用併入。在一些實施方式中，抗SOST抗體係羅莫單株抗體。在一些實施方式中，抗SOST抗體係前述抗體的變體，例如羅莫單株抗體的變體，例如，在一些實施方式中，係至少包含以下的變體：相對於羅莫單株抗體1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代，包括非保守性、保守性或高度保守性取代（或任何組合），視需要其中一個或多個取代係CDR中的保守取代，例如，在某些實施方式中，在除了hCDR3和/或除了lCDR1之外的CDR中。在某些實施方式中，可用於本發明之抗SOST抗體包含促進軛合的取代（例如，包含相對於羅莫單株抗體、相對於包含羅莫單株抗體的6個CDR的抗體、或相對於前述任一者的變體的此類取代），例如S239C取代。
在一些實施方式中，效應物靶標係dickkopf-1（DKK1）並且效應物靶標結合結構域包含DKK1抑制劑（例如，Jiang等人, Front Pharmacol[藥理學前沿], 13: 文章編號847387, 2022中提供的DKK1抑制劑或其抗原結合片段）。
在一些實施方式中，效應物靶標係核因子κ-β配體的受體活化劑（RANKL）並且效應物靶標結合結構域包含RANKL抑制劑（例如，迪諾舒單株抗體或其抗原結合片段）。
在一些實施方式中，效應物靶標係組織蛋白酶K並且效應物靶標結合結構域包含組織蛋白酶K抑制劑（例如，奧當卡替）。
在一些實施方式中，效應物靶標係PTHR並且效應物靶標結合結構域包含PTHR促效劑（例如，促效胜肽，例如間歇性促效胜肽），例如以刺激骨質疏鬆症中的骨生長。
骨位址靶標
本發明之ANDbody還包括位址靶標結合物，其結合到位址靶標以提供效應物的靶向遞送，其中該位址靶標係骨組織或細胞。如本文所用，「位址靶標」係細胞或組織上的結構，其表現在生物體中被充分限制以允許其鑒定生物體（例如，骨組織或細胞）中的目的器官、組織、細胞或細胞狀態。位址靶標可以是例如細胞表面蛋白或定位於細胞外基質的結構。如本文所用，位址靶標的「限制性」表現係指位址靶標具有差異性，例如較不廣泛的體內表現，與全身表現相對。在某些實施方式中，位址靶標在例如哺乳動物受試者（例如人受試者）中的單一骨細胞類型、組織或細胞狀態中表現。
在一些實施方式中，當前提供的位址靶標結合結構域基本上不影響與位址靶標結合後的生物傳訊，例如，不調節靶骨細胞或組織中的訊息傳遞途徑或其他生物學應答。例如，位址靶標結合物可以是惰性的或無活性的，其中它在與位址靶標結合之後缺乏任何額外的活性（除了結合），包括缺乏催化活性。例如，位址靶標結合物結合位址靶標的非傳訊位點或模體。「訊號」在本文中用於指示由於靶標結合而發生的構象、酶促和/或電結果。因此，如本文所述，位址靶標結合結構域在位址靶標結合後不發出訊號。如本文所用，「基本上」不影響生物傳訊的結構域係相對於對照條件（例如，相對於沒有結構域的情況下的傳訊）調節其結合的靶細胞或組織中的訊息傳遞途徑或其他生物學應答不超過25%的結構域。例如，該結構域可以將訊息傳遞途徑或其他生物學應答調節（例如，增加或減少）小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2%或小於1%（例如，20%-25%、15%-20%、10%-15%、5%-10%、2%-5%或1%-2%）。例如，在一些實施方式中，位址靶結合結構域基本上不阻斷軟骨細胞α2β1整合素依賴性黏附，例如對軟骨細胞α2β1整合素依賴性黏附的降低小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2%、或小於1%（例如，20-25%、15-20%、10-15%、5-10%、2-5%、或1-2%）。在一些實施方式中，位址靶標結合結構域基本上不干擾一種或多種成骨相關基因（例如Runx2、ALP和OCN）的表現（例如上調），例如基本上不干擾已經經歷成骨分化的人骨肉瘤SaOS2細胞中一種或多種成骨相關基因的上調。在一些實施方式中，位址靶標結合結構域基本上不阻斷成骨細胞的礦化，例如，對礦化的阻斷小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於2%或小於1%（例如，20-25%、15-20%、10-15%、5-10%、2-5%或1-2%）。
類似地，當效應物靶標結合結構域不被位址靶標結合結構域定位時，效應物靶標結合結構域可以基本上不發訊號，或者可以根本不發訊號。在實施方式中，與當效應物靶標結合結構域不被位址靶標結合結構域定位時的訊號相比，當效應物靶標結合結構域被位址靶標結合結構域定位在骨組織或細胞時，效應物靶標結合結構域發出具有更高效力的訊號（例如，具有更高的親合力）。當效應物靶標結合結構域藉由作為相同大分子的一部分的位址靶標結合結構域定位於靶向的骨細胞或組織時，效應物靶標傳訊可如上文所討論地受到影響。
在一些實施方式中，位址靶標用於器官特異性定址（例如，定址到骨）、組織特異性定址（例如，定址到一種或多種骨組織）、或細胞特異性定址（例如，定址到一種或多種骨細胞類型）。
細胞或組織的位址靶標結合結構域的特異性可以使用本領域已知之方法來檢測。在一個實施方式中，使用基尼係數（GC）評分，其係一種用於評估數據集中特定基因的表現變異之方法。（參見O’Hagan等人, GeneGini: assessment via the Gini coefficient of reference 「housekeeping」 genes and diverse human transporter expression profiles[基因基尼:藉由參考「持家」基因和不同人運輸蛋白表現譜的基尼係數進行評估]。Cell systems[細胞系統]6, 230–244, https://doi.org/10.1016/j. cels.2018.01.003 (2018)；Wright Muelas等人，The role and robustness of the Gini coefficient as an unbiased tool for the selection of Gini genes for normalising expression profiling data[基尼係數作為選擇基尼基因以標準化表現譜數據的無偏工具的作用和穩健性]。Sci Rep[科學報導] 9, 17960 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-54288-7）。可以使用如本文所述之為位址靶標結合物生成的細胞表現數據來鑒定位址靶標結合物（表2A和2B）。在一些實施方式中，位址靶標標誌物表現出大於0.4的基尼分得分，例如在0.74與1.00之間。相反，更全身地表現的非位址標誌物表現出0.15至0.19之間的基尼得分。
在一個實施方式中，使用代表數據集中特定基因的表現變異的Tau得分。計算Tau使用每個組織中基因的表現資訊及其在所有組織中的最大表現，同時還考慮了測量表現的組織數量（參見Itai Yanai 等人, Genome-wide midrange transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification[全基因組中等轉錄譜揭示了人組織特異性的表現水平關係], Bioinformatics[生物資訊學], 第21卷, 第5期, 2005年3月1日, 第650-659頁；Kryuchkova-Mostacci N, Robinson-Rechavi M. A benchmark of gene expression tissue-specificity metrics.[基因表現組織特異性指標的基準]。Brief Bioinform.[生物資訊學簡報].2017年3月1日; 18(2):205-214. doi: 10.1093/bib/bbw008）。在一些實施方式中，位址靶標標誌物表現出大於0.6的Tau分得分，例如在0.74與1.00之間。相反，更全身地表現的非位址標誌物表現出低於0.3的Tau得分，例如0.15至0.19。
在一些實施方式中，位址靶標結合結構域對於特定細胞或組織的特異性，例如由適當的基尼和/或Tau得分指示的特異性，藉由基於組織的分析來確定，該分析不包括具有天然的生物隔離屏障（即血腦屏障）的組織。例如，在一些實施方式中，可以在沒有來自例如（但不限於）以下組織的數據的情況下計算基尼和/或Tau得分：中樞神經系統、腦、眼睛和/或睾丸組織。在一些實施方式中，本文提供的位址靶標鑒定細胞狀態。如本文所用，「細胞狀態」係指細胞的給定生理條件。細胞狀態可以是例如疾病狀態（相對於細胞或組織的非疾病狀態或正常狀態）；或活化狀態（相對於細胞的非活化狀態）。示例性的疾病狀態包括發炎、感染（例如細菌、病毒或真菌感染）和與癌症相關的狀態（例如癌前或癌性細胞狀態）。在一些方面，細胞狀態反映了這樣一個事實：特定類型的細胞可以在一個或多個特徵方面表現出可變性和/或可以存在於多種不同的條件下，同時保留其特定的細胞類型特徵，並且不會獲得導致它們被分類為不同細胞類型的特徵。細胞可以存在的不同狀態或條件可以是特定細胞類型的特徵（例如，可以涉及僅由該細胞類型表現出的性質或特徵和/或涉及僅或主要由該細胞類型執行的功能）或者可以發生在多種不同的細胞類型中。在一些實施方式中，細胞狀態反映細胞應答特定刺激或環境條件的能力（例如，細胞是否將應答，或將引發的應答類型）或者係細胞的狀況由刺激或環境條件引起。處於不同細胞狀態的細胞可以藉由多種方式彼此區分。例如，它們可以表現、產生或分泌一種或多種不同的基因、蛋白質或其他分子（「標誌物」，例如本文提供的位址靶標），表現出蛋白質修飾的差異，例如磷酸化、乙醯化等，或者可能表現出外觀差異。因此，細胞狀態可以是細胞的狀況，其中細胞表現、產生或分泌一種或多種標誌物，表現出一個或多個特定的蛋白質修飾，具有特定的外觀，和/或將表現或將不表現出一種或多種對刺激或環境條件的生物學應答。
在一些實施方式中，位址靶標係牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）。
在一些實施方式中，位址靶標係整合素骨涎蛋白（IBSP）。
在一些實施方式中，位址靶標係滋養層糖蛋白（TPBG）。
在一些實施方式中，位址靶標係羥基磷灰石。
在一些實施方式中，位址靶標在成骨細胞、破骨細胞、骨細胞和/或骨襯細胞上表現。在一些實施方式中，位址靶標在成骨細胞上表現。在一些實施方式中，位址靶標在破骨細胞上表現。下面的表2中提供了本技術的示例性位址靶標。
[ 表 2] ：示例性骨位址靶標
靶標 Uniprot 登錄號
ADAM12 O43184
ADAMTS14 Q8WXS8
ADGRD1 Q6QNK2
ALPL P05186
ANGPT4 Q9Y264
BAMBI Q13145
BGLAP P86546
BMP3 P12645
CD109 Q6YHK3
CD276 Q5ZPR3
CDH15 P55291
CHAD O55226
CHAD O15335
CILP2 Q8IUL8
COL11A1 P12107
COL11A2 P13942
COL12A1 Q99715
COL13A1 Q5TAT6
COL2A1 P02458
COL8A2 P25067
DKK1 O94907
DMP1 O55188
DMP1 Q13316
DSEL Q8IZU8
FAT3 Q8TDW7
FBLN7 Q53RD9
FLRT2 O43155
GALNT5 Q7Z7M9
GJA5 P36382
GPR1 P46091
GPR88 Q9GZN0
GXYLT2 A0PJZ3
IBSP Q61711
IFITM5 A6NNB3
KCNH1 O95259
KCNK2 O95069
LAMC3 Q9Y6N6
LOXL4 Q96JB6
LRRC15 Q8TF66
LRRC15 Q8TF66
MAGI2 Q86UL8
MEPE Q8K4L6
MEPE Q9NQ76
MGAT3 Q09327
NTM Q9P121
OMD Q99983
P4HA3 Q7Z4N8
PCDH18 Q9HCL0
PCDHGC5 Q9Y5F6
PHEX P78562
RHBDL2 Q9NX52
SCARF2 Q96GP6
SEMA3D O95025
SEMA5A Q13591
SEMA7A O75326
SHISAL1 Q3SXP7
SLC6A15 Q8BG16
SLC8A3 P57103
SSP1 P10451
TGFB2 P61812
THBS2 P35442
TMTC2 Q8N394
TNN Q9UQP3
TPBG Q13641
UNC5B Q8IZJ1
WIF1 Q9Y5W5
WIF1 Q9Y5W5
WNT10B O00744
WNT16 Q9UBV4
WNT5B Q9H1J7
WNT5B Q9H1J7
小分子
本發明之大分子（例如ANDbody）可以與小分子連接。大分子和小分子可以藉由可切割連接子連接。可替代地，大分子和小分子可以藉由不可切割連接子連接。為此目的可以使用任何有用的連接子。
一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）小分子可以連接至大分子。如果多個小分子與一個大分子連接，則該等小分子可能是相同的。可替代地，與大分子連接的一個或多個小分子可以是不同的。
與大分子連接的小分子可以是任何所期望的小分子。例如，小分子可以是藉由大分子定位或集中在特定位點的目的治療劑。在一個實例中，小分子可以是與效應物靶標結合位點結構域一起作用或補充效應物靶標結合位點結構域的治療劑。可替代地，小分子可以調節效應物靶標結合位點結構域。在另一個實例中，小分子可以調節位址靶標結合位點結構域。
在一些實施方式中，小分子係組織蛋白酶K抑制劑，例如奧當卡替。
在一些實施方式中，小分子係雙膦酸鹽。在一些實施方式中，雙膦酸鹽係阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽（risedronate）、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽。在一些實施方式中，小分子係阿侖膦酸鹽。
可與根據本發明之大分子連接的小分子的其他示例性類別包括表3中的那些。
[ 表 3] ：示例性小分子類別
類別
1,3 β葡聚糖合成酶（EC 2.4.1.34）抑制劑
11 β羥基類固醇脫氫酶（皮質類固醇11 β脫氫酶或皮質類固醇11還原酶或HSD11或EC 1.1.1.146）抑制劑
16S核糖體RNA（16S rRNA）抑制劑
20s蛋白酶體抑制劑
23S核糖體RNA（23S rRNA）抑制劑
26s蛋白酶體抑制劑
3羥基3甲基戊二醯輔酶A還原酶（HMG CoA還原酶或羥甲基戊二醯CoA還原酶或HMGCR或EC 1.1.1.34）抑制劑
3側氧基5α類固醇4脫氫酶（類固醇5α還原酶或5α還原酶或EC 1.3.1.22）抑制劑
3側氧基5α類固醇4脫氫酶1（類固醇5α還原酶1或SR 1型或SRD5A1或EC 1.3.1.22）抑制劑
3側氧基5α類固醇4脫氫酶2（5α SR2或類固醇5α還原酶2或II型5α還原酶或SR 2型或SRD5A2或EC 1.3.1.22）抑制劑
30S核糖體亞基（30S RNA）抑制劑
4胺基丁酸轉胺酶粒線體（(S) 3胺基2甲基丙酸轉胺酶或GABA轉胺酶或γ胺基N丁酸轉胺酶或L AIBAT或ABAT或EC 2.6.1.22或EC 2.6.1.19）抑制劑
4羥苯基丙酮酸雙加氧酶（4羥苯基丙酮酸氧化酶或4HPPD或HPD或EC 1.13.11.27）抑制劑
50S核糖體亞基（50S RNA）抑制劑
5-羥色胺受體1（5 HT1受體或HTR1）促效劑
5-羥色胺受體1A（5 HT1A或G 21或血清素受體1A或HTR1A）促效劑
5-羥色胺受體1B（5 HT1B或S12或血清素1D β受體或血清素受體1B或HTR1B）促效劑
5-羥色胺受體1D（5 HT1D或血清素1D α受體或血清素受體1D或HTR1D）拮抗劑
5-羥色胺受體1F（5 HT1F或血清素受體1F或HTR1F）促效劑
5-羥色胺受體2（5 HT2受體或HTR2）拮抗劑
5-羥色胺受體2A（5 HT2A或血清素受體2A或HTR2A）拮抗劑
5-羥色胺受體2C（5 HT2C或5羥色胺受體1C或血清素受體2C或HTR2C）拮抗劑
5-羥色胺受體3（5HT3或5 HT3受體或HTR3）拮抗劑
5-羥色胺受體4（5 HT4或血清素受體4或HTR4）促效劑
5-羥色胺受體7（5 HT7或5 HTX或血清素受體7或HTR7）拮抗劑
70S核糖體抑制劑
乙醯膽鹼酯酶（乙醯膽鹼水解酶或Yt血型或細胞凋亡相關乙醯膽鹼酯酶或ACHE或EC 3.1.1.7）活化劑
乙醯膽鹼酯酶（乙醯膽鹼水解酶或Yt血型或細胞凋亡相關乙醯膽鹼酯酶或ACHE或EC 3.1.1.7）抑制劑
腺苷脫胺酶（腺苷胺基水解酶或ADA或EC 3.5.4.4）抑制劑
單磷酸腺苷活化蛋白激酶（[羥甲基戊二醯輔酶A還原酶（NADPH）]激酶或AMPK或EC 2.7.11.31）活化劑
腺苷受體（ADORA）拮抗劑
腺苷受體A2a（ADORA2A）拮抗劑
腺苷受體A2b（ADORA2B）拮抗劑
促腎上腺皮質激素受體（促腎上腺皮質激素受體或黑皮質素受體2或ACTHR或MC2R）促效劑
ALK酪胺酸激酶受體（間變性淋巴瘤激酶或CD246或ALK或EC 2.7.10.1）抑制劑
α1腎上腺素受體（ADRA1）促效劑
α1腎上腺素受體（ADRA1）拮抗劑
α1B腎上腺素受體（α1B腎上腺素受體或ADRA1B）拮抗劑
α2腎上腺素受體（ADRA2）促效劑
α2腎上腺素受體（ADRA2）拮抗劑
α2A腎上腺素受體（α2腎上腺素受體亞型C10或α2A腎上腺素受體或ADRA2A）促效劑
α2C腎上腺素受體（α2腎上腺素受體亞型C4或α2C腎上腺素受體或ADRA2C）拮抗劑
α腎上腺素能受體（ADRA）促效劑
α澱粉酶2B（1,4-αD-葡聚糖葡聚糖水解酶2B或類癌α澱粉酶或AMY2B或EC 3.2.1.1）抑制劑
α半乳糖苷酶A（αD-半乳糖苷酶A或αD半乳糖苷半乳糖水解酶或蜜二糖酶或阿加西酶或GLA或EC 3.2.1.22）活化劑
胺氧化酶[含黃素] A（A型單胺氧化酶或MAOA或EC 1.4.3.4）抑制劑
雄激素受體（二氫睾酮受體或核受體亞家族3 C組成員4或DHTR或NR3C4或AR）促效劑
雄激素受體（二氫睾酮受體或核受體亞家族3 C組成員4或DHTR或NR3C4或AR）拮抗劑
血管生成素1受體（內皮酪胺酸激酶或內膜內皮細胞激酶或具有Ig和EGF同源結構域的酪胺酸激酶2或酪胺酸蛋白激酶受體TEK或酪胺酸蛋白激酶受體TIE 2或p140 TEK或CD202b或TIE2或TEK或EC 2.7.10.1）抑制劑
血管張力素轉換酶（二胜肽基羧胜肽酶I或激胜肽酶II或CD143或ACE或EC 3.4.15.1或EC 3.2.1.）抑制劑
花生四烯酸5脂氧合成酶（5脂氧合成酶或白三烯A4合成酶或ALOX5或EC 1.13.11.34）抑制劑
芳香酶（雌激素合成酶或細胞色素P 450AROM或細胞色素P450 19A1或CYP19A1或EC 1.14.14.14）抑制劑
芳基烴受體（E類鹼性螺旋環螺旋蛋白76或bHLHe76或AHR）促效劑
ATP結合盒亞家族C成員8（磺醯脲受體1或ABCC8）抑制劑
ATP檸檬酸合成酶（ATP檸檬酸（Pro S）裂解酶或檸檬酸裂解酶或ACLY或EC 2.3.3.8）抑制劑
ATP敏感內向整流鉀通道1（鉀通道內向整流亞家族J成員1或內向整流鉀通道Kir1.1或KCNJ1）活化劑
B細胞淋巴瘤2（Bcl 2）抑制劑
細菌細胞膜破壞劑
C55異戊二烯焦磷酸抑制劑
糖皮質激素受體（GR或核受體亞家族3 C組成員1或NR3C1）促效劑
細菌細胞壁破壞劑
Bcr-Abl酪胺酸激酶（EC 2.7.10.2）抑制劑
BDNF/NT 3生長因子受體（GP145 TrkB或神經營養性酪胺酸激酶受體2型或TrkB酪胺酸激酶或原肌球蛋白相關激酶B或NTRK2或EC 2.7.10.1）抑制劑
β1腎上腺素能受體（β1腎上腺素受體或ADRB1）促效劑
β1腎上腺素能受體（β1腎上腺素受體或ADRB1）促效劑
β2腎上腺素受體（β2腎上腺素受體或ADRB2）促效劑
β3腎上腺素受體（β3腎上腺素受體或ADRB3）促效劑
β腎上腺素能受體（ADRB）促效劑
β血紅素（瘧原蟲色素）抑制劑
β內醯胺酶（EC 3.5.2.6）抑制劑
膽汁酸受體（法呢醇X活化受體或法呢醇受體HRR 1或核受體亞家族1 H組成員4或類視黃醇X受體相互作用蛋白14或FXR或NR1H4）促效劑
膽汁酸螯合劑
C5a過敏毒素趨化受體1（CD88或C5AR1）拮抗劑
鈣調磷酸酶（蛋白絲胺酸/蘇胺酸磷酸酶3或蛋白磷酸酶3或EC 3.1.3.16）抑制劑
降鈣素基因相關胜肽1型受體（降鈣素受體樣受體或CALCRL）拮抗劑
鈣活化鉀通道阻斷劑
鈣通道阻斷劑
鈣螯合劑
鈣敏感受體促效劑
大麻素受體1（CB1或CANN6或CNR1）促效劑
大麻素受體2（CB2或CX5或CNR2）促效劑
胺基甲醯磷酸合成酶[氨]粒線體（胺基甲醯磷酸合成酶I或CPS1或EC 6.3.4.16）活化劑
碳酸酐酶（碳酸脫水酶或碳酸酐酶或羧基酐酶或CA或EC 4.2.1.1）抑制劑
碳酸酐酶2（碳酸脫水酶II或碳酸酐酶C或CAC或CA2或EC 4.2.1.1）抑制劑
碳酸酐酶4（碳酸脫水酶IV或CA4或EC 4.2.1.1）抑制劑；γ-胺基丁酸A型受體亞基（GABA(A)受體或GABR）促效劑
兒茶酚O甲基轉移酶（附睾分泌精子結合蛋白Li 98n或COMT或EC 2.1.1.6）抑制劑
C-C趨化因子受體5型（CHEMR13或HIV 1融合輔助受體或CD195或CCR5）拮抗劑
細胞膜破壞劑
神經醯胺葡萄糖基轉移酶（葡萄糖神經醯胺合成酶或GLCT 1或UDP葡萄糖：N醯基鞘胺醇D葡萄糖基轉移酶或UDP葡萄糖神經醯胺葡萄糖基轉移酶或UGCG或EC 2.4.1.80）抑制劑
cGMP特異性3',5'環磷酸二酯酶（cGMP結合性cGMP特異性磷酸二酯酶或PDE5或PDE5A或EC 3.1.4.35）抑制劑
氯離子通道蛋白2（CLCN2）活化劑
膽鹼能受體毒蕈鹼（毒蕈鹼乙醯膽鹼受體或CHRM）拮抗劑
膽鹼能受體毒蕈鹼（毒蕈鹼乙醯膽鹼受體或CHRM）促效劑
膽鹼能受體菸鹼亞基（菸鹼乙醯膽鹼受體或CHRN）促效劑
膽鹼能受體菸鹼亞基（菸鹼乙醯膽鹼受體或CHRN）拮抗劑
膽鹼酯酶（丁醯膽鹼酯酶或乙醯膽鹼醯基水解酶或膽鹼酯酶II或假膽鹼酯酶或BCHE或EC 3.1.1.8）抑制劑
凝血因子X（Stuart Prower因子或Stuart因子或F10或EC 3.4.21.6）抑制劑
銅螯合劑
環核苷酸閘控通道（CNG）阻斷劑
週期蛋白依賴性激酶4（細胞分裂蛋白激酶4或PSK J3或CDK4或EC 2.7.11.22）抑制劑
週期蛋白依賴性激酶6（細胞分裂蛋白激酶6或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶PLSTIRE或CDK6或EC 2.7.11.22）抑制劑
半胱胺醯白三烯受體1（半胱胺醯白三烯D4受體或G蛋白偶聯受體HG55或HMTMF81或CYSLTR1）拮抗劑
半胱胺醯白三烯受體2（G蛋白偶聯受體GPCR21或G蛋白偶聯受體HG57或HPN321或CYSLTR2）拮抗劑
囊性纖維化跨膜電導調節劑（ATP結合盒亞家族C成員7或通道電導控制ATP酶Camp依賴性氯離子通道或ABCC7或CFTR或EC 5.6.1.6）活化劑
胱胺酸消耗劑
胞苷脫胺酶（胞苷胺基水解酶或CDA或EC 3.5.4.5）抑制劑
細胞色素bc1複合物（複合物III）抑制劑
細胞色素c氧化酶（細胞色素a3或靛基酚酶或鐵細胞色素c氧化酶或EC 1.9.3.1）抑制劑
細胞色素P450 11B2粒線體（醛固酮合成酶或細胞色素P450Aldo或細胞色素P450C18或類固醇18羥化酶或CYP11B2或EC 1.14.15.4或EC 1.14.15.5）抑制劑
細胞色素P450 3A4（1,8桉葉素2外切單加氧酶或阿苯達唑單加氧酶或阿苯達唑磺氧化酶或膽固醇25羥化酶或細胞色素P450 3A3或硝苯地平氧化酶或奎寧3單加氧酶或牛磺鵝去氧膽酸6α羥化酶或CYP3A4或EC 1.14.14.或EC 1.14.14.56或EC 1.14.14.73或EC 1.14.14.55）抑制劑
細胞色素P450 3A5（細胞色素P450 HLp2或細胞色素P450 PCN3或CYP3A5或EC 1.14.14.1）抑制劑；HIV 1整合酶（EC 2.7.7.）抑制劑
對表現麩胺酸羧胜肽酶2（葉酸水解酶1或前列腺特異性膜抗原或PSMA或蝶醯聚γ麩胺酸羧胜肽酶或細胞生長抑制基因27蛋白或FOLH1或EC 3.4.17.21）的細胞具有細胞毒性
D1A多巴胺受體（多巴胺D1受體或DRD1）促效劑
D1B多巴胺受體（D5多巴胺受體或D1 β多巴胺受體或多巴胺D5受體或DRD5）促效劑
D2多巴胺受體（多巴胺D2受體或DRD2）促效劑
D3多巴胺受體（多巴胺D3受體或DRD3）促效劑
D4多巴胺受體（D2C多巴胺受體或多巴胺D4受體或DRD4）促效劑
δ型阿片受體（DOR1或OPRD或OPRD1）拮抗劑
二醯基甘油O醯基轉移酶（甘油二酯醯基轉移酶或DGAT或EC 2.3.1.20）抑制劑
二氫葉酸還原酶（DHFR或EC 1.5.1.3）抑制劑
二氫乳清酸脫氫酶（醌）粒線體（二氫乳清酸氧化酶或DHODH或EC 1.3.5.2）抑制劑
二氫蝶酸合成酶（EC 2.5.1.15）抑制劑
二氫嘧啶酶相關蛋白2（塌陷反應介導蛋白2或CRMP2或N2A3或Unc 33樣磷蛋白2或DPYSL2）抑制劑
二胜肽基胜肽酶1（組織蛋白酶C或組織蛋白酶J或二胜肽基轉移酶或DPPI或CTSC或EC 3.4.14.1）抑制劑
二胜肽基胜肽酶4（ADABP或腺苷脫胺酶複合蛋白2或T細胞活化抗原CD26或TP103或CD26或DPP4或EC 3.4.14.5）抑制劑
DNA（胞嘧啶5）甲基轉移酶1（CXXC型鋅指蛋白9或DNA甲基轉移酶HsaI或MCMT或DNMT1或EC 2.1.1.37）抑制劑
DNA定向RNA聚合酶（POLR2或EC 2.7.7.6）抑制劑
DNA定向RNA聚合酶亞基β（RNA聚合酶亞基β或轉錄酶亞基β或rpoB或EC 2.7.7.6）抑制劑
DNA旋轉酶（EC 5.99.1.3）抑制劑
DNA解旋酶（EC 3.6.4.12）抑制劑
DNA抑制劑
DNA連接酶（EC 6.5.1.）抑制劑
DNA聚合酶（EC 2.7.7.7）抑制劑
DNA聚合酶α（POLA或EC 2.7.7.7）抑制劑
DNA引物酶（EC 2.7.7.6）抑制劑
DNA合成抑制劑
DNA拓撲異構酶I（TOP1或EC 5.99.1.2）抑制劑
DNA拓撲異構酶II（EC 5.99.1.3）抑制劑
DNA拓撲異構酶IV（EC 5.99.1.3）抑制劑
多巴胺受體（DRD）促效劑
多巴胺受體（DRD）拮抗劑
雙特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶1（ERK活化激酶1或MAPK/ERK激酶1或MAP2K1或EC 2.7.12.2）抑制劑
雙特異性絲裂原活化蛋白激酶激酶2（ERK活化激酶2或MAPK/ERK激酶2或MAP2K2或EC 2.7.12.2）抑制劑
含內皮PAS結構域蛋白1（鹼性螺旋環螺旋PAS蛋白MOP2或E類鹼性螺旋環螺旋蛋白73或HIF 1α樣因子或缺氧誘導因子2α或含PAS結構域蛋白2或EPAS1）抑制劑
內皮素1受體（內皮素A受體或EDNRA）拮抗劑
內皮素B受體（內皮素受體非選擇性型或EDNRB）拮抗劑
烯醯基[醯基載體蛋白]還原酶[NADH]FabI（NADH依賴性烯醯基ACP還原酶或烯醯基ACP還原酶或EC 1.3.1.9）抑制劑
表皮生長因子受體（原癌基因c ErbB 1或受體酪胺酸蛋白激酶erbB 1或HER1或ERBB1或EGFR或EC 2.7.10.1）抑制劑
平衡核苷運輸蛋白1（平衡硝基苄基巰基嘌呤核苷敏感核苷運輸蛋白或核苷運輸蛋白Es型或溶質載體家族29成員1或SLC29A1）抑制劑
麥角甾醇抑制劑
雌激素受體（ERα或雌二醇受體或核受體亞家族3 A組成員1或NR3A1或ESR1）促效劑
雌激素受體（ERα或雌二醇受體或核受體亞家族3 A組成員1或NR3A1或ESR1）拮抗劑
雌激素受體（ESR）促效劑
雌激素受體（ESR）拮抗劑
雌激素受體（ESR）調節劑
雌激素受體β（ER β或核受體亞家族3 A組成員2或NR3A2或ESR2）促效劑
雌激素受體β（ER β或核受體亞家族3 A組成員2或NR3A2或ESR2）拮抗劑
Exoα唾液酸酶（神經胺酸酶或乙醯神經胺酸酶或EC 3.2.1.18）抑制劑
輸出蛋白1（染色體區域維護1蛋白同源物或XPO1）抑制劑
法呢基焦磷酸合成酶（法呢基二磷酸合成酶或（2E,6E）法呢基二磷酸合成酶或二甲基烯丙基轉移酶或香葉基轉移酶或FDPS或EC 2.5.1.10或EC 2.5.1.1）抑制劑
成纖維細胞生長因子受體1（鹼性成纖維細胞生長因子受體1或Fms樣酪胺酸激酶2或N Sam或原癌基因c Fgr或CD331或FLT2或FGFR1或EC 2.7.10.1）抑制劑
成纖維細胞生長因子受體2（角質形成細胞生長因子受體或K Sam或KGFR或CD332或FGFR2或EC 2.7.10.1）抑制劑
成纖維細胞生長因子受體3（酪胺酸激酶JTK4或羥芳基蛋白激酶或CD333或FGFR3或EC 2.7.10.1）抑制劑
成纖維細胞生長因子受體4（CD334或FGFR4或EC 2.7.10.1）抑制劑
自由基清除劑
G蛋白偶聯受體55（GPR55）拮抗劑
γ-胺基丁酸受體亞基α1（GABA(A)受體亞基α1或GABRA1）促效劑
γ-胺基丁酸受體亞基α3（GABA(A)受體亞基α3或GABRA3）促效劑
γ-胺基丁酸受體亞基γ2（GABA(A)受體亞基γ2或GABRG2）促效劑
γ-胺基丁酸A型受體亞基（GABA(A)受體或GABR）促效劑
γ-胺基丁酸A型受體亞基（GABA(A)受體或GABR）拮抗劑
γ-胺基丁酸A型受體亞基α（GABA(A)受體亞基α或GABRA）促效劑
γ-胺基丁酸B型受體亞基（γ-胺基丁酸（GABA）B受體或GABBR）促效劑
胃三醯甘油脂肪酶（胃脂肪酶或LIPF或EC 3.1.1.3）抑制劑
香葉基香葉基焦磷酸合成酶（香葉基香葉基二磷酸合成酶或二甲基烯丙基轉移酶或法尼基二磷酸合成酶或法尼基轉移酶或香葉基轉移酶或GGPS1或EC 2.5.1.29或EC 2.5.1.1或EC 2.5.1.10）抑制劑
升糖素受體（GL R或GCGR）拮抗劑
糖皮質激素受體（GR或核受體亞家族3 C組成員1或NR3C1）促效劑
糖皮質激素受體（GR或核受體亞家族3 C組成員1或NR3C1）拮抗劑
麩胺酸離子型受體（GRI）拮抗劑
麩胺酸離子型受體AMPA型亞基（AMPA受體或GRIA）拮抗劑
麩胺酸離子型受體紅藻胺酸亞基（紅藻胺酸受體或GRIK）拮抗劑
麩胺酸離子型受體NMDA型亞基（NMDAR或GRIN）拮抗劑
麩胺酸代謝型受體（GRM）促效劑
麩醯胺酸消耗劑
促性腺激素釋放激素受體（GNRHR）促效劑
促性腺激素釋放激素受體（GNRHR）拮抗劑
GTP酶KRas（KRas 2或Ki Ras或c K Ras或KRAS或EC 3.6.5.2）抑制劑
鳥苷酸環化酶（鳥苷醯基環化酶或GTP二磷酸裂解酶（環化）或GC或EC 4.6.1.2）活化劑
H+運輸兩部分ATP酶（F1F0 ATP合成酶或ATP合成酶或粒線體ATP酶或細菌Ca2+/Mg2+ ATP酶或EC 7.1.2.2）抑制劑
肝病毒素（Hepacivirin）（NS3/4A蛋白酶或NS3絲胺酸蛋白酶或EC 3.4.21.98）抑制劑
B型肝炎病毒DNA聚合酶（B型肝炎病毒反轉錄酶或B型肝炎病毒核糖核酸酶H或EC 2.7.7.7或EC 2.7.7.49或EC 3.1.26.4）抑制劑
肝細胞生長因子受體（原癌基因c Met或酪胺酸蛋白激酶Met或HGF/SF受體或散射因子受體或MET或EC 2.7.10.1）抑制劑
高親和力神經生長因子受體（神經營養酪胺酸激酶受體1型或TRK1轉化酪胺酸激酶蛋白或原肌球蛋白相關激酶A或酪胺酸激酶受體或gp140trk或p140 TrkA或NTRK1或EC 2.7.10.1）抑制劑
組胺H1受體（HRH1）拮抗劑
組胺H2受體（胃受體I或HRH2）拮抗劑
組胺H3受體（G蛋白偶聯受體97或GPCR97或HRH3）拮抗劑
組蛋白脫乙醯酶（HDAC或EC 3.5.1.98）抑制劑
組蛋白脫乙醯酶1（HDAC1或EC 3.5.1.98）抑制劑
組蛋白脫乙醯酶2（轉錄調節因子同源物RPD3或YY1相關因子1或HDAC2或EC 3.5.1.98）抑制劑
組蛋白脫乙醯酶3（SMAP45或RPD3 2或HDAC3或EC 3.5.1.98）抑制劑
組蛋白脫乙醯酶6（蛋白磷酸酶1調節亞基90或HDAC6或EC 3.5.1.98）抑制劑
組蛋白離胺酸N甲基轉移酶EZH2（ENX 1或Zeste同源物2的增強劑或離胺酸N甲基轉移酶6或EZH2或EC 2.1.1.43）抑制劑
HIV 1整合酶（EC 2.7.7.）抑制劑
HIV 1逆轉胜肽酶（HIV天冬胺醯蛋白酶或HIV蛋白酶或反轉錄蛋白酶或Gag蛋白酶或HIV天冬胺醯蛋白酶或EC 3.4.23.16）抑制劑
HIV 2胃蛋白酶（HIV 2蛋白酶或EC 3.4.23.47）抑制劑
HIV整合酶（EC 2.7.7.）抑制劑
人巨細胞病毒病毒終止酶抑制劑
次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT1或EC 2.4.2.8）抑制劑
回腸鈉/膽汁酸協同運輸蛋白（頂端鈉依賴性膽汁酸運輸蛋白或ASBT或鈉/牛磺膽酸鹽協同轉運多胜肽回腸或溶質載體家族10成員2或SLC10A2）抑制劑
流感M2質子通道阻斷劑
肌苷單磷酸脫氫酶（肌苷酸脫氫酶或IMP氧化還原酶或IMPDH或EC 1.1.1.205）抑制劑
整合素α2b（GPα IIb或血小板膜糖蛋白IIb或CD41或ITGA2B）拮抗劑
整合素αL（CD11抗原樣家族成員A或白血球黏附糖蛋白LFA 1α鏈或CD11a或ITGAL）拮抗劑
干擾素α/β受體1（細胞介素受體II類成員1或細胞介素受體家族2成員1或I型干擾素受體1或IFNAR1）促效劑
干擾素α/β受體2（干擾素α結合蛋白或I型干擾素受體2或IFNAR2）促效劑
白血球介素1受體相關激酶1（IRAK1或EC 2.7.11.1）抑制劑
鐵螯合劑
鐵替代品
異檸檬酸脫氫酶[NADP]細胞質（草醯琥珀酸脫羧酶或胞質NADP異檸檬酸脫氫酶或IDP或NADP（+）特異性ICDH或IDH1或EC 1.1.1.42）抑制劑
異檸檬酸脫氫酶[NADP]粒線體（NADP（+）特異性ICDH或草醯琥珀酸脫羧酶或ICD M或IDP或IDH2或EC 1.1.1.42）抑制劑
異白胺酸tRNA連接酶胞質（異白胺酸tRNA合成酶或IARS或EC 6.1.1.5）抑制劑
激肽釋放酶（KLK或EC 3.4.21。）抑制劑
κ型阿片受體（KOR1或OPRK或OPRK1）促效劑
κ型阿片受體（KOR1或OPRK或OPRK1）拮抗劑
羊毛甾醇14α脫甲基酶（甾醇14α脫甲基酶或細胞色素P450 14DM或細胞色素P450LI或細胞色素P450 51A1或CYPLI或CYP51A1或EC 1.14.14.154）抑制劑
鉛螯合劑
白胺酸tRNA連接酶胞質（白胺醯tRNA合成酶或LeuRS或LARS或EC 6.1.1.4）抑制劑
白三烯B4（LTB4）抑制劑
白三烯D4（LTD4）抑制劑
白三烯抑制劑
脂氧合成酶（LOX或EC 1.13.11.）抑制劑
巨噬細胞群落刺激因子1受體（CSF 1受體或原癌基因c Fms或CD115或CSF1R或EC 2.7.10.1）抑制劑
主要組織相容性複合物（MHC）抑制劑
麥芽糖酶葡糖澱粉酶（α-1 4-葡萄糖苷酶或MGAM或EC 3.2.1.20）抑制劑
肥大/幹細胞生長因子受體套組（原癌基因c套組或酪胺酸蛋白激酶套組或v套組Hardy Zuckerman 4貓肉瘤病毒癌基因同源物或花斑性狀蛋白或p145 c套組或CD117或KIT或EC 2.7.10.1）抑制劑
褪黑激素受體1A型（MT1或MTNR1A）促效劑
褪黑激素受體1B型（MT2或MTNR1B）促效劑
汞螯合劑
微粒體甘油三酯轉移蛋白大亞基（MTTP）抑制劑
鹽皮質激素受體（核受體亞家族3 C組成員2或鹽皮質激素受體δ或醛固酮受體或MR或NR3C2）促效劑
鹽皮質激素受體（核受體亞家族3 C組成員2或鹽皮質激素受體δ或醛固酮受體或MR或NR3C2）拮抗劑
單胺氧化酶（腎上腺素氧化酶或腎上腺激素氧化酶或MAO或EC 1.4.3.4）抑制劑
Mu型阿片受體（MOR1或Mu阿片受體或Mu阿片受體或OPRM1）拮抗劑
Mu型阿片受體（MOR1或Mu阿片受體或Mu阿片受體或OPRM1）促效劑
毒蕈鹼乙醯膽鹼受體M1（CHRM1）促效劑
毒蕈鹼乙醯膽鹼受體M1（CHRM1）拮抗劑
毒蕈鹼乙醯膽鹼受體M3（CHRM3）促效劑
毒蕈鹼乙醯膽鹼受體M3（CHRM3）拮抗劑
毒蕈鹼乙醯膽鹼受體M4（CHRM4）拮抗劑
肌球蛋白抑制劑
Na+/K+交換ATP酶（鈉鉀ATP酶或鈉鉀泵或EC 7.2.2.13）抑制劑
NAD+ ADP核糖基轉移酶（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶或PARP或EC 2.4.2.30）抑制劑
腦啡胜肽酶（中性胜肽鏈內切酶24.11或心胜肽酶或常見急性淋巴球性白血病抗原或皮膚成纖維細胞彈性蛋白酶或腦啡胜肽酶或CD10或MME或EC 3.4.24.11）抑制劑
尼曼匹克（Niemann Pick）C1樣蛋白1（NPC1L1）抑制劑
非受體酪胺酸蛋白激酶TYK2（TYK2或EC 2.7.10.2）抑制劑
非結構蛋白5A（NS5A）抑制劑
NS5B（非結構蛋白5B聚合酶或EC 2.7.7.48）抑制劑
NT 3生長因子受體（TrkC酪胺酸激酶或GP145 TrkC或神經營養性酪胺酸激酶受體3型或NTRK3或EC 2.7.10.1）抑制劑
核因子紅血球2相關因子2（HEBP1或核因子紅血球衍生2樣2或NFE2L2或NRF2）活化劑
食欲胜肽受體1型（下丘腦分泌素受體1型或HCRTR1）拮抗劑
食欲胜肽受體2型（下丘腦分泌素受體2型或HCRTR2）拮抗劑
P2Y嘌呤受體12（ADP葡萄糖受體或P2Y12血小板ADP受體或SP1999或P2T（AC）或P2Y（AC）或P2Y（cyc）或P2Y12或P2RY12）拮抗劑
p37包膜蛋白（痘苗病毒包膜蛋白）抑制劑
胰腺α澱粉酶（1,4αD葡聚糖葡聚糖水解酶或AMY2A或EC 3.2.1.1）抑制劑
胰三醯甘油脂肪酶（胰脂肪酶或三醯甘油醯基水解酶或PNLIP或EC 3.1.1.3）抑制劑
青黴素結合蛋白（PBP）抑制劑
青黴素結合蛋白（PBP）抑制劑；鉀轉運ATP酶α鏈1（胃H（+）/K（+）ATP酶亞基α或質子泵或ATP4A或EC 7.2.2.19）抑制劑
青黴素結合蛋白1A（PBP1A）抑制劑
青黴素結合蛋白1B（PBP1B）抑制劑
青黴素結合蛋白1C（PBP1C）抑制劑
青黴素結合蛋白2a（PBP2a）抑制劑
青黴素結合蛋白3（PBP3）抑制劑
胜肽聚糖（胞壁質）抑制劑
胜肽基脯胺醯順反異構酶FKBP1A（12 kDa FK506結合蛋白或Calstabin 1或FK506結合蛋白1A或親免素FKBP12或旋轉酶或FKBP12或FKBP1A或EC 5.2.1.8）抑制劑
過氧化物酶體增殖物活化受體α（核受體亞家族1 C組成員1或NR1C1或PPARA）促效劑
過氧化物酶體增殖物活化受體γ（核受體亞家族1 C組成員3或NR1C3或PPARG）促效劑
苯丙胺酸4羥化酶（Phe 4單加氧酶或PAH或EC 1.14.16.1）活化劑
磷酸鹽結合劑
磷脂醯肌醇4,5二磷酸3激酶催化亞單位α異構物（PI3K-α或磷脂醯肌醇4,5二磷酸3激酶110 kDa催化亞單位α或磷酸肌醇3激酶催化α多胜肽或絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶PIK3CA或PIK3CA或EC 2.7.1.137或EC 2.7.1.153）抑制劑
磷酸二酯酶3（PDE3或EC 3.1.4.17）抑制劑
磷酸二酯酶4（PDE4或EC 3.1.4.53）抑制劑
纖溶酶原活化劑（EC 3.4.21.）抑制劑
血小板衍生生長因子受體α（α型血小板衍生生長因子受體或CD140抗原樣家族成員A或血小板衍生生長因子受體2或CD140a或PDGFRA或EC 2.7.10.1）抑制劑
血小板衍生生長因子受體β（β型血小板衍生生長因子受體或CD140抗原樣家族成員B或血小板衍生生長因子受體1或CD140b或PDGFRB或EC 2.7.10.1）抑制劑
聚[ADP核糖]聚合酶1（ADP核糖基轉移酶白喉毒素樣1或NAD(+) ADP核糖基轉移酶1或聚[ADP核糖]合酶1或PARP1或EC 2.4.2.30）抑制劑
聚[ADP核糖]聚合酶2（ADP核糖基轉移酶白喉毒素樣2或NAD(+) ADP核糖基轉移酶2或聚[ADP核糖]合酶2或PARP2或EC 2.4.2.30）抑制劑
聚[ADP核糖]聚合酶3（ADP核糖基轉移酶白喉毒素樣3或NAD(+) ADP核糖基轉移酶3或聚[ADP核糖]合酶3或PARP3或EC 2.4.2.30）抑制劑
聚合酶酸性蛋白（RNA指導的RNA聚合酶亞基P2或PA或EC 3.1.）抑制劑
鉀通道（KCN）活化劑
鉀通道（KCN）阻斷劑
鉀通道電壓閘控（KCNN）阻斷劑
鉀消耗劑
鉀轉運ATP酶α鏈1（胃H（+）/K（+）ATP酶亞基α或質子泵或ATP4A或EC 7.2.2.19）抑制劑
鉀電壓閘控通道亞家族H成員2（HERG或電壓閘控鉀通道亞基Kv11.1或Eag同源物或KCNH2）阻斷劑
黃體酮受體（核受體亞家族3 C組成員3或NR3C3或PGR）促效劑
黃體酮受體（核受體亞家族3 C組成員3或NR3C3或PGR）拮抗劑
前列環素受體（前列腺素I2受體或前列腺素類IP受體或PTGIR）促效劑
前列腺素E2受體EP1亞型（前列腺素類EP1受體或PTGER1）促效劑
前列腺素E2受體EP1亞型（前列腺素類EP1受體或PTGER1）拮抗劑
前列腺素E2受體EP2亞型（前列腺素類EP2受體或PTGER2）促效劑
前列腺素E2受體EP3亞型（PGE2 R或前列腺素類EP3受體或PTGER3）促效劑
前列腺素F2α受體（前列腺素類FP受體或PTGFR）促效劑
前列腺素G/H合成酶（環氧合成酶或COX或PTGS或EC 1.14.99.1）抑制劑
前列腺素G/H合成酶1（環氧合成酶1或COX1或前列腺素內過氧化物合成酶1或前列腺素H2合成酶1或PTGS1或EC 1.14.99.1）抑制劑
前列腺素G/H合成酶2（環氧合成酶2或COX2或前列腺素內過氧化物合成酶2或PHS II或前列腺素H2合成酶2或PTGS2或EC 1.14.99.1）抑制劑
蛋白酶體抑制劑
蛋白質小腦蛋白（Cereblon）（CRBN）活化劑
蛋白酶活化受體1（PAR1或凝血因子II受體或凝血酶受體或F2R）拮抗劑
凝血酶原（凝血因子II或F2或EC 3.4.21.5）抑制劑
原癌基因酪胺酸蛋白激酶受體Ret（鈣黏蛋白家族成員12或原癌基因c Ret或RET或EC 2.7.10.1）抑制劑
原癌基因酪胺酸蛋白激酶ROS（原癌基因c Ros 1或受體酪胺酸激酶c Ros癌基因1或c Ros受體酪胺酸激酶或ROS1或EC 2.7.10.1）抑制劑
丙酮酸激酶PKLR（丙酮酸激酶1或紅血球/肝丙酮酸激酶或R型/L型丙酮酸激酶或丙酮酸激酶同工酶L/R或PKLR或EC 2.7.1.40）活化劑
丙酮酸合成酶（丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶或PFOR或EC 1.2.7.1）抑制劑
受體類型酪胺酸蛋白激酶FLT3（FMS樣酪胺酸激酶3或FL細胞介素受體或幹細胞酪胺酸激酶1或胎兒肝激酶2或CD135或FLT3或EC 2.7.10.1）抑制劑
受體酪胺酸蛋白激酶ERBB 2（轉移淋巴結基因19蛋白或原癌基因Neu或原癌基因C ErbB 2或酪胺酸激酶型細胞表面受體HER2或p185erbB2或HER2或CD340或ERBB2或EC 2.7.10.1）抑制劑
受體酪胺酸蛋白激酶ERBB 4（酪胺酸激酶型細胞表面受體HER4或原癌基因樣蛋白c ErbB 4或p180erbB4或HER4或ERBB4或EC 2.7.10.1）抑制劑
腎素（血管張力素原酶或REN或EC 3.4.23.15）抑制劑
視黃酸受體（RAR）促效劑
視黃酸受體α（RARα或核受體亞家族1 B組成員1或NR1B1或RARA）促效劑
視黃酸受體β（RAR β或HBV活化蛋白或核受體亞家族1 B組成員2或RAR ε或NR1B2或RARB）促效劑
視黃酸受體γ（RAR γ或核受體亞家族1 B組成員3或NR1B3或RARG）促效劑
視黃酸受體RXRα（核受體亞家族2 B組成員1或類視黃酸X受體α或NR2B1或RXRA）促效劑
視黃酸受體RXR β（核受體亞家族2 B組成員2或類視黃酸X受體β或NR2B2或RXRB）促效劑
視黃酸受體RXR γ（核受體亞家族2 B組成員3或類視黃醇X受體γ或NR2B3或RXRG）促效劑
類視黃醇X受體（RXR）促效劑
反轉錄酶（EC 2.7.7.49）抑制劑
Rho相關蛋白激酶2（Rho激酶2或含Rho相關捲曲螺旋蛋白激酶2或p164 ROCK 2或ROCK2或EC 2.7.11.1）抑制劑
Rho激酶（Rho相關捲曲螺旋形成性蛋白激酶或ROCK或EC 2.7.11.1）抑制劑
核糖核苷二磷酸還原酶（核糖核苷酸還原酶或RRM或EC 1.17.4.1）抑制劑
RNA定向RNA聚合酶（EC 2.7.7.48）抑制劑
RNA聚合酶（EC 2.7.7.6）抑制劑
RNA聚合酶II（RNAP II或Pol II或EC 2.7.7.6）抑制劑
RNA合成抑制劑
利阿諾定受體1（骨骼肌鈣釋放通道或骨骼肌利阿諾定受體或1型利阿諾定受體或RYR1）拮抗劑
絲胺酸D型Ala D Ala羧胜肽酶（D丙胺醯D丙胺酸羧胜肽酶或DD轉胜肽酶或EC 3.4.16.4）抑制劑
絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶B Raf（p94或原癌基因B Raf或v Raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1或BRAF或EC 2.7.11.1）抑制劑
絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶mTOR（FK506結合蛋白12雷帕黴素複合物相關蛋白1或FKBP12雷帕黴素複合物相關蛋白或雷帕黴素的哺乳動物靶標或雷帕黴素的機械靶標或雷帕黴素和FKBP12靶標1或雷帕黴素靶蛋白1或MTOR或EC 2.7.11.1）抑制劑
絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶UL97（HSRF3蛋白或更昔洛韋激酶或UL97或EC 2.7.11。）抑制劑
σ非阿片類細胞內受體1（衰老相關基因8蛋白或SR31747結合蛋白或σ1型阿片類受體或SIGMAR1）促效劑
平滑同系物（蛋白質Gx或SMO）拮抗劑
鈉和氯依賴性GABA運輸蛋白1（GAT1或溶質載體家族6成員1或SLC6A1）抑制劑
鈉通道阻斷劑
鈉通道蛋白1型亞基α（鈉通道蛋白腦I亞基α或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.1或SCN1A）阻斷劑
鈉通道蛋白10型亞基α（周圍神經鈉通道3或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.8或SCN10A）阻斷劑
鈉通道蛋白2型亞基α（HBSC II或鈉通道蛋白腦II亞基α或鈉通道蛋白II型亞基α或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.2或SCN2A）阻斷劑
鈉通道蛋白3型亞基α（電壓閘控鈉通道亞基III或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.3或SCN3A）阻斷劑
鈉通道蛋白4型亞基α（鈉通道蛋白骨骼肌亞基α或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.4或SCN4A）阻斷劑
鈉通道蛋白5型亞基α（鈉通道蛋白心肌亞基α或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.5或SCN5A）阻斷劑
鈉通道蛋白8型亞基α（電壓閘控鈉通道亞基αNav1.6或SCN8A）阻斷劑
鈉通道蛋白9型亞基α（神經內分泌鈉通道或外周鈉通道1或電壓閘控鈉通道亞基αNav1.7或SCN9A）阻斷劑
鈉依賴性多巴胺運輸蛋白（DA運輸蛋白或DAT或溶質載體家族6成員3或SLC6A3）抑制劑
鈉依賴性去甲腎上腺素運輸蛋白（去甲腎上腺素運輸蛋白或NET或溶質載體家族6成員2或SLC6A2）抑制劑
鈉依賴性血清素運輸蛋白（5HT運輸蛋白或5HTT或溶質載體家族6成員4或SLC6A4）抑制劑
鈉/葡萄糖協同運輸蛋白2（低親和力鈉-葡萄糖協同運輸蛋白或溶質載體家族5成員2或SGLT2或SLC5A2）抑制劑
鈉/氫交換器3（NHE3或溶質載體家族9成員3或SLC9A3）抑制劑
鈉/碘協同運輸蛋白（鈉碘同向運輸蛋白或溶質載體家族5成員5或SLC5A5）活化劑
可溶性鳥苷酸環化酶（sGC或EC 4.6.1.2）活化劑
溶質載體家族12成員1（布美他尼敏感鈉（鉀）氯協同運輸蛋白2或腎臟特異性Na-K-Cl同向運輸蛋白或SLC12A1）抑制劑
溶質載體家族12成員2（基底外側Na-K-Cl同向運輸蛋白或布美他尼敏感鈉（鉀）氯化物協同運輸蛋白1或SLC12A2或NKCC1）抑制劑
溶質載體家族12成員3（Na-Cl協同運輸蛋白或NCC或Na-Cl同向運輸蛋白或噻𠯤類敏感氯化鈉
鞘胺醇1-磷酸受體（S1PR）調節劑
鞘胺醇1-磷酸受體1（內皮分化G蛋白偶聯受體1或鞘胺醇1磷酸受體Edg 1或CD363或S1PR1）促效劑
鞘胺醇1-磷酸受體4（內皮分化G蛋白偶聯受體6或鞘胺醇1磷酸受體Edg 6或S1PR4）促效劑
鞘胺醇1-磷酸受體5（內皮分化G蛋白偶聯受體8或鞘胺醇1磷酸受體Edg 8或S1PR5）促效劑
角鯊烯單加氧酶（角鯊烯環氧酶或SQLE或EC 1.14.14.17）抑制劑
類固醇17α羥化酶/17,20裂解酶（17α羥孕酮醛縮酶或細胞色素P450 17A1或細胞色素P450 C17或類固醇17α單加氧酶或CYP17或CYP17A1或EC 1.14.14.19或EC 1.14.14.32）抑制劑
P物質受體（速激肽受體1或NK 1受體或NK1R或TACR1）拮抗劑
腸道蔗糖酶異麥芽糖酶（SI或EC 3.2.1.48或EC 3.2.1.10）抑制劑
表面蛋白gp120抑制劑
運動神經元生存蛋白（Gems 1或Gemin 1或SMN1或SMN2的成分）活化劑
突觸囊泡糖蛋白2A（SV2A）結合劑
突觸囊泡胺運輸蛋白（單胺運輸蛋白或溶質載體家族18成員2或囊泡胺運輸蛋白2或VAT2或SLC18A2）抑制劑
四氫生物喋呤（THB或BH4）替代品
硫氧還蛋白二硫化物還原酶（NADPH硫氧還蛋白還原酶或EC 1.8.1.9）抑制劑
血小板生成素受體（骨髓增殖性白血病蛋白或原癌基因c Mpl或CD110或MPL）促效劑
胸苷激酶（TK或EC 2.7.1.21）活化劑
胸苷磷酸化酶（格洛他汀或血小板衍生內皮細胞生長因子或TdRPase或TYMP或EC 2.4.2.4）抑制劑
胸苷酸合成酶（TYMS或EC 2.1.1.45）抑制劑
甲狀腺激素受體促效劑
甲狀腺激素受體α（核受體亞家族1 A組成員1或V erbA相關蛋白7或c erbA 1或c erbAα或EAR7或THRA）促效劑
甲狀腺激素受體β（核受體亞家族1 A組成員2或c erbA 2或c erbA β或ERBA2或THRB）促效劑
甲狀腺過氧化物酶（甲狀腺過氧化物酶或甲狀腺微粒體抗原或TPO或EC 1.11.1.8）抑制劑
Toll樣受體7（TLR7）促效劑
Toll樣受體7（TLR7）拮抗劑
Toll樣受體9（CD289或TLR9）拮抗劑
轉鐵蛋白受體（TFR）促效劑
瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1（辣椒素受體或香草酸受體1或TRPV1）抑制劑
瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1（辣椒素受體或香草酸受體1或TRPV1）活化劑
甲狀腺素運輸蛋白（ATTR或前白蛋白或TBPA或TTR）活化劑
甲狀腺素運輸蛋白（ATTR或前白蛋白或TBPA或TTR）抑制劑
三功能嘌呤生物合成蛋白腺苷3（磷酸核糖甘胺醯胺甲醯轉移酶或磷酸核糖胺甘胺酸連接酶或磷酸核糖甲醯甘胺脒環連接酶或GART或EC 2.1.2.2或EC 6.3.3.1或EC 6.3.4.13）抑制劑
色胺酸5單加氧酶（色胺酸羥化酶或TPH或EC 1.14.16.4）抑制劑
微管蛋白抑制劑
1型血管張力素II受體（AT1AR或AT1BR或血管張力素II 1型受體或AGTR1）拮抗劑
酪胺酸酶（單酚單加氧酶或腫瘤排斥抗原AB或LB24 AB或SK29 AB或TYR或EC 1.14.18.1）抑制劑
酪胺酸3單加氧酶（酪胺酸3羥化酶或TH或EC 1.14.16.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶BTK（布魯頓酪胺酸激酶或B細胞祖激酶或無丙種球蛋白血症酪胺酸激酶或BTK或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶CSK（C Src激酶或蛋白酪胺酸激酶CYL或CSK或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶JAK1（Janus激酶1或JAK1或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶JAK2（Janus激酶2或JAK2或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶JAK3（Janus激酶3或白血球Janus激酶或JAK3或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶受體UFO（AXL癌基因或AXL或EC 2.7.10.1）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶SYK（脾酪胺酸激酶或p72 Syk或SYK或EC 2.7.10.2）抑制劑
酪胺酸蛋白激酶Tec（TEC或EC 2.7.10.2）抑制劑
UDP N-乙醯葡糖胺1羧乙烯基轉移酶（烯醯基丙酮酸轉移酶或UDP N乙醯葡糖胺1羧乙烯基轉移酶或UDP N乙醯葡糖胺烯醇丙酮酸轉移酶或murA或EC 2.5.1.7）抑制劑
脲酶（脲醯胺水解酶或EC 3.5.1.5）抑制劑
血管內皮生長因子受體1（Fms樣酪胺酸激酶1或酪胺酸蛋白激酶受體FLT或酪胺酸蛋白激酶FRT或血管通透性因子受體或VEGFR1或FLT1或EC 2.7.10.1）抑制劑
血管內皮生長因子受體2（胎肝激酶1或激酶插入結構域受體或蛋白酪胺酸激酶受體flk 1或VEGFR2或CD309或KDR或EC 2.7.10.1）抑制劑
血管內皮生長因子受體3（Fms樣酪胺酸激酶4或酪胺酸蛋白激酶受體FLT4或VEGFR3或FLT4或EC 2.7.10.1）抑制劑
加壓素V1a受體（AVPR V1a或抗利尿激素受體1a或血管/肝型精胺酸加壓素受體或AVPR1A）拮抗劑
加壓素V2受體（AVPR V2或抗利尿激素受體或腎型精胺酸加壓素受體或ADHR或AVPR2）拮抗劑
病毒mRNA
維生素D受體（骨化三醇受體）促效劑
維生素D3受體（1,25二羥基維生素D3受體或核受體亞家族1組I成員1或NR1I1或VDR）促效劑
電壓依賴性鈣通道活化劑
電壓依賴性鈣通道阻斷劑
電壓依賴性鈣通道亞基α2/δ1（CACNA2D1）阻斷劑
電壓依賴性鈣通道亞基α2/δ2（CACNA2D2）阻斷劑
電壓依賴性L型鈣通道阻斷劑
電壓依賴性L型鈣通道亞基α1S（電壓閘控鈣通道亞基αCav1.1或CACNA1S）阻斷劑
電壓依賴性N型鈣通道亞基α1B（電壓閘控鈣通道亞基αCav2.2或腦鈣通道III或CACNA1B）阻斷劑
電壓依賴性T型鈣通道阻斷劑
電壓依賴性T型鈣通道亞基α1G（電壓閘控鈣通道亞基αCav3.1或CACNA1G）阻斷劑
電壓閘控鈉通道（SCN）阻斷劑
黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（黃嘌呤脫氫酶或黃嘌呤氧化酶或黃嘌呤氧化還原酶或XDH或EC 1.17.1.4或EC 1.17.3.2）抑制劑
可以與本發明之大分子連接的小分子的具體實例落入例如表3中所示的任何類別中。具體地，示例性糖皮質激素受體促效劑包括但不限於可的松、地塞米松、氟替卡松、莫米松、氟輕鬆、布地奈德、布替考特和倍他米松。示例性酪胺酸蛋白激酶BTK抑制劑包括但不限於阿卡替尼（acalabrutinib）、依伏替尼（evobrutinib）、芬布魯替尼（fenebrutinib）、伊布替尼（ibrutinib）、奧布替尼（orelabrutinib）、吡托布魯替尼（pirtobrutinib）、瑞米布替尼（remibrutinib）、利紮魯替尼（rilzabrutinib）、托勒布替尼（tolebrutinib）和澤布替尼（zanubrutinib）。示例性的PI3K抑制劑包括但不限於阿培利司（alpelisib）、艾德拉尼（idelalisib）、庫潘尼西（copanlisib）和杜韋利西布（duvelisib）。示例性的JAK抑制劑包括但不限於阿布羅替尼（abrocitinib）、巴瑞替尼（baricitinib）、德爾戈替尼（delgocitinib）、非戈替尼（filgotinib）、培菲替尼（peficitinib）、盧梭替尼（ruxolitinib）、托法替尼（tofacitinib）和烏帕替尼（upadacitinib）。示例性組織蛋白酶K抑制劑包括但不限於奧當卡替、瑞拉克替尼（relacatib）、MIV-711和KGP-207。示例性拓撲異構酶抑制劑包括但不限於伊立替康、阿黴素、柔紅黴素、阿黴素、表柔比星、依託泊苷、伊達比星、托泊替康和戊柔比星。
可以使用本領域已知的任何軛合技術將小分子軛合至本發明之大分子。例如，可以使用連接技術將小分子羧基、羥基和胺殘基連接至蛋白質上的胺和巰基殘基。可替代地，兩個組分上的任何互補官能基可用於彼此反應以形成共價鍵。互補反應官能基的實例包括但不限於，例如馬來醯亞胺和半胱胺酸、胺和活化的羧酸、硫醇和馬來醯亞胺、活化的磺酸和胺、異氰酸酯和胺、疊氮化物和炔烴、以及烯烴和四𠯤。此外，任何可用的連接子都可用於本發明，包括允許藉由例如二硫鍵和醯胺鍵連接小分子的異雙官能連接子。
ANDbody 結構
一般來說，ANDbody可以是任何大分子，例如含有效應物靶標結合位點或結合結構域和位址靶結合位點或結合結構域的多胜肽或蛋白質。結合位點可以存在於相同的多胜肽鏈或例如藉由二硫鍵連接在一起的不同的多胜肽鏈上。
在一些實施方式中，ANDbody的效應物靶標的結合位點和位址靶標的結合位點各自包含抗體重鏈和/或輕鏈結構域。在一些實施方式中，ANDbody包含對效應物靶標具有結合特異性的第一抗體可變結構域和對位址靶標具有結合特異性的第二抗體可變結構域。在其他實施方式中，ANDbody包含抗體的第一抗原結合位點和抗體的第二抗原結合位點，該第一抗原結合位點對效應物靶標具有結合特異性，該第二抗原結合位點對位址靶標具有結合特異性。
在一些實施方式中，ANDbody可以具有抗體分子的結構。如本文所用，術語「抗體」包括全長抗體和抗原結合抗體片段（例如，scFv）。在一些實施方式中，抗體分子對多於一種，例如2、3、4種抗原具有特異性，例如，抗體分子包含多個可變結構域序列，其中多個可變結構域序列中的第一可變結構域序列對第一表位（例如效應物靶標）具有結合特異性，並且多個可變結構域序列中的第二可變結構域序列對第二表位（例如，位址靶標）具有結合特異性。
在一些實施方式中，ANDbody係具有結合效應物靶標的臂或結構域和結合位址靶標的臂或結構域的抗體分子。在實施方式中，ANDbody係抗體分子，其包含結合效應物靶標和位址靶標之一的輕鏈和結合效應物靶標和位址靶標中的另一個的重鏈。
在一些實施方式中，ANDbody具有以下的結構：scFv、BsIgG、BsAb片段、BiTE、雙親和力重定向蛋白（DART）、串聯雙抗體（TandAb）、雙抗體、Fab2、di-scFv、化學連接的F(ab’)2、帶有2、3或4個不同的抗原結合位點的Ig分子、DVI-IgG四合一、ImmTac、HSAbody、IgG-IgG、Cov-X-Body、scFv1-PEG-scFv 2、附加的IgG、DVD-IgG、親和體、affilin、affimer、affitin、α體（alphabody）、抗運載蛋白（anticalin）、親和多聚體（avimer）、DARPin、Fynomer、單體、nanoCLAMP、bis-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、線性抗體、scFv、僅具有重鏈的抗體（Humabody）、ScFab、IgG抗體片段、單鏈可變區抗體、單結構域重鏈抗體、雙特異性三體、BiKE、CrossMAb、dsDb、scDb、串聯dAb/VHH、三重dAb VHH、四價dAb/VHH、Fab-scFv、Fab-Fv、或DART-Fc、纖維連接蛋（adnectin）、庫尼茨型抑制劑（Kunitz-type inhibitor）、或受體誘餌。
在一些實施方式中，效應物靶標結合位點和/或位址靶標結合位點包含小分子或由小分子組成。例如，在一些實施方式中，第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段，並且第二結合位點包含結合位址靶標的小分子。在其他實施方式中，第一結合位點包含結合效應物靶標的小分子，並且第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。在其中ANDbody包含小分子和多胜肽組分（例如，抗體或其片段）的方面，可以使用本領域已知的任何軛合技術將小分子軛合至多胜肽（例如，抗體或其片段）。
ANDbody的效應物靶標結合位點和位址靶標結合位點對其各自結合配偶體的親和力可能不同。在一些實施方式中，第一結合位點與其所結合的治療性效應物靶標的親和力弱於第二結合位點與位址靶標的親和力。在一些實施方式中，第一結合位點與其所結合的治療性效應物靶標的親和力比第二結合位點對位址靶標的親和力弱超過2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍。
術語「結合親和力」和「結合活性」係指大分子例如多胜肽分子結合或不結合靶標的傾向。為了組合兩個結合位點的本發明之目的，兩個結合位點的相對親和力可以藉由例如當每個結合位點存在於共同支架上時測量它們各自的親和力來確定，例如以以下形式：單鏈抗體。這種比較允許比較兩個結合位點的親和力，同時消除來自本發明大分子上存在的其他結合位點的任何干擾。
結合親和力可以藉由測定多胜肽及其結合物的解離常數（Kd）來定量。較低的Kd表明對結合配偶體的親和力較高。類似地，多胜肽與其結合配偶體結合的特異性可以根據多胜肽與其結合配偶體的相對解離常數（Kd）來定義，該解離常數與多胜肽和另一種非靶分子的解離常數相比較。
該解離常數的值可以藉由已知之方法測定。例如，可以使用雙濾器硝化纖維素濾膜結合測定來確定Kd，例如Wong & Lohman （Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 90, 5428-5432, 1993）揭露的測定。用於評估配體（例如抗體）對靶的結合能力的其他標準測定係本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流動式細胞測量術分析。抗體的結合動力學（例如，結合親和力）也可以藉由本領域已知的標準測定來評估，例如藉由BiacoreTM系統分析。
作為Kd的替代方案，EC 50或IC 50可用於確定相對親和力。在本文中，EC 50表示多胜肽與固定量的結合配偶體達到其最大結合的50%時的濃度。IC 50表示多胜肽抑制固定量的競爭劑與固定量的結合配偶體的最大結合的50%時的濃度。在這兩種情況下，較低水平的EC 50或IC 50表明對靶標的親和力較高。ANDbody結合位點對其結合配偶體的EC 50和IC 50值均可以藉由熟知之方法例如ELISA來確定。
在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的Kd可以高於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約500 nM或約1 uM（例如，可以在1 pM與10 pM之間、在10 pM與100 pM之間、在100 pM與1 nM之間、在1 nM與10 nM之間、在10 nM與100 nM之間、在100 nM與500 nM之間、或在500 nM和1 uM之間）。在一些實施方式中，位址靶標結合物的Kd可以小於約1 uM、約500 nM、約100 nM、約10 nM、約1 nM、約100 pM、約10 pM或約1pM（例如，可以在1 uM與500 nM之間、在500 nM與100 nM之間、在100 nM與10 nM之間、在10 nM與1 nM之間、在1 nM和100 pM之間、在100 pM與10 pM之間、或在10 pM與1 pM之間）。在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的Kd可以比位址靶標結合物的Kd高約6倍、約5倍、約4倍、約3倍或約2倍。
在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的EC 50可以高於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約500 nM或約1 uM（例如，可以在1 pM與10 pM之間、在10 pM與100 pM之間、在100 pM與1 nM之間、在1 nM與10 nM之間、在10 nM與100 nM之間、在100 nM與500 nM之間、或在500 nM和1 uM之間）。在一些實施方式中，位址靶標結合物的EC 50可以小於約1 uM、約500 nM、約100 nM、約10 nM、約1 nM、約100 pM、約10 pM或約1pM（例如，可以在1 uM與500 nM之間、在500 nM與100 nM之間、在100 nM與10 nM之間、在10 nM與1 nM之間、在1 nM和100 pM之間、在100 pM與10 pM之間、或在10 pM與1 pM之間）。在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的EC50可以比位址靶標結合物的EC50高約6倍、約5倍、約4倍、約3倍或約2倍。
在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的IC 50可以高於約1 pM、約10 pM、約100 pM、約1 nM、約10 nM、約100 nM、約500 nM或約1 uM（例如，可以在1 pM與10 pM之間、在10 pM與100 pM之間、在100 pM與1 nM之間、在1 nM與10 nM之間、在10 nM與100 nM之間、在100 nM與500 nM之間、或在500 nM和1 uM之間）。在一些實施方式中，位址靶標結合物的IC50可以小於約1 uM、約500 nM、約100 nM、約10 nM、約1 nM、約100 pM、約10 pM或約1pM（例如，可以在1 uM與500 nM之間、在500 nM與100 nM之間、在100 nM與10 nM之間、在10 nM與1 nM之間、在1 nM和100 pM之間、在100 pM與10 pM之間、或在10 pM與1 pM之間）。在一些實施方式中，治療性效應物靶標結合物的IC 50可以比位址靶標結合物的IC 50高約6倍、約5倍、約4倍、約3倍或約2倍。
ANDbody結合的效應物靶標和位址靶標的細胞或組織密度可能不同。在實施方式中，由ANDbody的效應物靶標結合位點結合的細胞上的治療性效應物靶標的密度比由位址靶標結合位點結合的細胞上的位址靶標的密度低大於約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約50倍、約100倍、約200倍、約500倍、約1000倍、約10,000倍、約100,000倍。
在一些實施方式中，第一結合位點對其結合的治療性效應物靶標的親和力比第二結合位點對其結合的位址靶標的親和力低約一半（½）X Kd，並且由第一結合位點結合的細胞上的治療性效應物靶標的密度比由第二結合位點結合的細胞上的位址靶標的密度小約一半（½）X Kd。
在一些實施方式中，ANDbody具有如上所述之親和力和密度參數。
在一些實施方式中，ANDbody中的第一結合位點和第二結合位點彼此直接連接。直接連接係指第一結合位點編碼序列鄰接第二結合位點編碼序列並且不存在衍生自其他序列（例如連接子）的序列。在一些實施方式中，ANDbody中的第一結合位點和第二結合位點彼此不直接連接。
如本文所揭露的ANDbody還可以連接至另外的一個或多個部分，例如，細胞外成分、細胞內成分、可溶性因子（例如酶、激素、細胞介素、生長因子、毒素、毒液、污染物等）或跨膜蛋白（例如細胞表面受體）。在一些實施方式中，ANDbody連接至小分子和另外的一個或多個部分。
在一些情況下，效應物靶序列和/或位址靶序列包含全長蛋白質序列和/或具有或不具有訊息胜肽區域的Fc融合序列。在一些實施方式中，本技術的ANDbody包括結合骨位址靶標蛋白或效應物靶標蛋白的結合結構域。在實施方式中，本發明ANDbody的結合結構域可以結合包括訊息胜肽的蛋白質序列。在其他實施方式中，本發明ANDbody的結合結構域可以結合缺乏訊息蛋白的蛋白。在一些實施方式中，本發明ANDbody的結合結構域可以結合全長蛋白。在其他實施方式中，本發明ANDbody的結合結構域可以結合與其他蛋白質（例如Fc序列）融合的蛋白質融合體，例如全長蛋白質序列或其具有或不具有訊息胜肽區域的胜肽片段。在其他實施方式中，本發明ANDbody的結合結構域可以結合包含少於全長蛋白質序列的蛋白質，例如位址靶標或效應物靶標的胜肽片段。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對軟骨黏附素（CHAD）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對Dickkopf-1（DKK1）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對軟骨黏附素（CHAD）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對骨涎蛋白（IBSP）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對滋養層糖蛋白（TPBG）特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
在一些實施方式中，本發明之ANDbody包含 (a) 對硬化蛋白（SOST）特異性的第一結合位點（效應物靶標結合位點）和 (b) 對羥基磷灰石特異性的第二結合位點（位址靶標結合位點）。
ANDbody 組成物的生產
ANDbody 多胜肽的生產
本發明之ANDbody多胜肽可以藉由任何合適之方法產生。例如，ANDbody的全部或部分可以由包含編碼ANDbody的核苷酸的宿主細胞表現。此類製備治療性多胜肽之方法係本領域的常規方法。通常，參見Smales和James（編輯）, Therapeutic Proteins: Methods and Protocols [治療性蛋白：方法和方案] (Methods in Molecular Biology[分子生物學方法]), Humana Press [胡瑪納出版社] (2005)；以及Crommelin, Sindelar和Meibohm（編輯），Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications [藥物生物技術：基礎與應用], Springer[斯普林格出版社] (2013)。
用於生產ANDbody之方法可以涉及在哺乳動物細胞中表現，儘管重組蛋白也可以使用昆蟲細胞、酵母、細菌或在適當啟動子控制下的其他細胞來生產。哺乳動物表現運載體可以包含非轉錄元件，如複製起點、合適的啟動子和增強子、以及其他5'或3’側翼非轉錄序列、以及5'或3'非轉譯序列，如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和接受位點、以及終止序列。來源於SV40病毒基因組的DNA序列，例如，SV40起點、早期啟動子、增強子、剪接和聚腺苷酸化位點可以用於提供異源DNA序列表現所需的其他遺傳元件。在以下文獻中描述了用於與細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適當的選殖和表現載體：Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖-實驗室手冊]（第四版）, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社] (2012)。
可以採用各種哺乳動物細胞培養系統來表現和製造本文描述的ANDbody。哺乳動物表現系統的實例包括但不限於CHO細胞、COS細胞、HeLA和BHK細胞株。在以下文獻中描述了用於生產蛋白治療劑的宿主細胞培養的過程：例如，Zhou和Kantardjieff（編輯），Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing[用於生物製品製造的哺乳動物細胞培養] (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化學工程/生物科技的進展]), Springer[斯普林格出版社] (2014)。在以下文獻中描述了蛋白治療劑的純化：Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization[蛋白生物技術：分離、表徵、和穩定化], Humana Press [胡瑪納出版社] (2013)；以及Cutler, Protein Purification Protocols [蛋白純化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物學方法]), Humana Press [胡瑪納出版社] (2010)。以下文獻中描述了蛋白治療劑的配製物：Meyer（編輯）, Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic[治療性蛋白藥物產品：實驗室、製造和臨床中配製物的實踐方法], Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列] (2012)。
抗體生產技術係已知的。例如，參見Zhiqiang (編輯), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic.[治療性單株抗體:從實驗室到臨床]第1版.Wiley 2009; Greenfiel (編輯) Antibodies: A Laboratory Manual.[抗體：實驗室手冊]。（第二版）冷泉港實驗室出版社2013；Ferrara 等人2012.Using Phage and Yeast Display to Select Hundreds of Monoclonal Antibodies: Application to Antigen 85, a Tuberculosis Biomarker.[使用噬菌體和酵母展示篩選數百種單株抗體:應用於抗原85（一種結核病生物標誌物）]PLoS ONE[公共科學圖書館-綜合] 7(11): e49535，獲得製造重組抗體之方法，包括抗體工程改造、簡併寡核苷酸的使用、5'-RACE、噬菌體展示、以及誘變；抗體測試和表徵；抗體藥物動力學和藥效動力學；抗體純化和儲存；以及篩選和標記技術。
ANDbody RNA 的生產
在一些實施方式中，可以生產ANDbody RNA，例如用於遞送至受試者。一般來說，治療性mRNA由體外轉錄產生。修飾（例如摻入經修飾的鹼基、5’帽類似物和聚A尾）可以最佳化活性和功能。例如，mRNA的轉譯和穩定性可以藉由帽和聚A尾修飾來實現。例如，將ARCA（抗反向帽類似物）等帽類似物和100-200 bp的聚(A)尾摻入體外轉錄（IVT）mRNA中可提高表現和穩定性（Kaczmarek等人 Genome Medicine[基因組醫學] (2017) 9:60）。新型帽類似物，例如1,2-二硫代二磷酸修飾的帽，可以進一步提高轉譯效率（Strenkowska等人 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2016;44:9578–90）。密碼子最佳化還可以提高蛋白質合成的效率，並限制稀有密碼子造成的mRNA不穩定（Presnyak 等人 Cell.[細胞] 2015;160:1111–24. 93; Thess等人 Mol Ther.[分子療法] 2015; 23: 1456-64）。修飾包含負責募集RNA結合蛋白（RBP）和miRNA的序列的3'和5'非轉譯區（UTR）可以提高蛋白質產物（Kaczmarek）的水平。此外，可以修飾UTR來編碼調控元件（例如K轉角模體和miRNA結合位點），以便以細胞特異性方式控制RNA表現（Wroblewska等人. Nat Biotechnol.[自然生物技術] 2015;33:839–41）。RNA鹼基修飾（例如，摻入mRNA的假尿苷，例如N1-甲基-假尿苷）有助於掩蓋mRNA免疫刺激活性，並藉由增強轉譯起始來增加mRNA轉譯（Andries等人 J Control Release.[控釋雜誌] 2015; 217:337–44; Svitkin等人 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2017; 45:6023–36）。mRNA組成物及其製造方法係已知的並且揭露於例如以下中：WO 2016011306；WO 2016014846；WO 2016022914；WO 2016077123；WO 2016164762；WO 2016201377；WO 2017049275；US 9937233；US 8710200；US 10022425；US 9878056；US 9572897；Jemielity等人 RNA. 2003;9:1108–22.90; Mockey等人 Biochem Biophys Res Commun.[生化及生物物理研究通訊] 2006;340:1062–8. 91; Strenkowska的 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2016;44:9578–90. 92; Presnyak等人 Cell.[細胞] 2015;160:1111–24. 93; Kaczmarek等人 Genome Medicine[基因組醫學] (2017) 9:60。
親和力改變的 ANDbody 的生產
具有親和力改變的結合位點的ANDbody可以使用本領域已知之方法來製備，例如，ANDbody可被工程改造以具有對效應物靶標的親和力降低的靶標結合位點。參見，例如，美國專利案號10,654,928。一般而言，ANDBody可被修飾以改變效應物靶標結合位點與其效應物靶標的親和力或改變位址靶標結合位點與其位址靶標的親和力。修飾可以增加或減少與結合位點的結合配偶體的親和力。
靶標和位址評估
可以使用本領域已知之方法在RNA或蛋白質水平評估治療性靶標的表現。在實施方式中，藉由測量RNA表現來評估治療性靶標的表現，例如使用RNA序列數據集作為蛋白質表現水平的代表。RNA數據集包括那些基因型組織表現（GTEx）數據集（參見，例如https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project）或人蛋白質圖譜（HPA）數據集（https://www.proteinatlas.org/）。
可以評估治療性靶標表現的組織的非限制性清單包括例如骨組織和/或骨細胞、小唾液腺、甲狀腺、肺、乳腺（乳腺組織）、胰腺、腎上腺、肝、腎（皮質）、腎（髓質）、脂肪內臟（大網膜）、小腸-回腸末端、輸卵管、卵巢、子宮、未暴露在陽光下的皮膚（恥骨弓上）；子宮頸—子宮頸內膜、子宮頸—外子宮頸、陰道、暴露在陽光下的皮膚（小腿）、前扣帶皮層細胞（BA24）、尾狀核（基底神經節）、殼核（基底神經節）、伏核（基底神經節）、下丘腦、杏仁核、海馬、小腦/小腦半球、黑質、垂體、脊髓（頸部）、動脈-主動脈、心臟-心耳、動脈-冠狀動脈-心臟、左心室、食管-黏膜、食管-肌層、食管-胃食管交界處、脾臟、胃、橫結腸、乙狀結腸、睾丸、全血、細胞（EBV轉化的淋巴細胞、動脈-脛骨或神經-脛骨組織。在一些實施方式中，位址靶標的表現在骨組織中顯著高於在任何其他組織中。在一些實施方式中，位址靶標的表現限於骨組織。
可以使用本領域熟知之方法來評估位址標誌物，例如，可以使用RNA印跡、cDNA或寡核苷酸微陣列或定序（例如RNA-Seq）在mRNA水平評估基因表現，或者使用蛋白質微陣列、蛋白質印跡、流動式細胞測量術、免疫組織化學等在蛋白質表現水平評估基因表現。例如，可以使用對蛋白質的特定修飾形式具有特異性的抗體（例如磷酸特異性抗體）或質譜法來評估修飾。
ANDbody 之用途
本文提供的ANDbody及其藥物組成物適合投與於需要其的受試者，其中受試者係人或非人動物，例如適合於人治療或獸醫用途。
獸醫用途包括用於治療哺乳動物，包括商業有關的哺乳動物， 例如寵物和牲畜動物，諸如牛、豬、馬、綿羊、山羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括與商業有關的鳥類，諸如鸚鵡、家禽、雞、鴨、鵝、母雞或公雞和/或火雞；動物園動物，例如貓科動物；非哺乳類動物，例如爬行動物、魚類、兩棲動物等。
本發明還關於包含本文所述之ANDbody組成物的受試者或受試者細胞。在一些實施方式中，受試者或受試者細胞係植物、昆蟲、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（ 例如，人）或其他生物體或細胞。
在一些實施方式中，使受試者或受試者細胞與ANDbody組成物接觸（例如遞送或投與）。在一些實施方式中，受試者係哺乳動物（如人）。可以在投與後的任何時間測量受試者中ANDbody組成物、表現產物或兩者的量。
在一些實施方式中，投與本文提供的ANDbody或ANDbody組成物的受試者患有骨疾病、障礙或病症。例如，在一些實施方式中，受試者患有骨密度疾病（例如，低骨密度、骨質減少或骨質疏鬆症）、與骨中鈣瀝濾相關的腎病（例如，腎性骨病、慢性腎病（CKD）（例如，與礦物質和骨病相關的CKD，或腎性骨營養不良）、骨關節炎、類風濕性關節炎、成骨不全、佩吉特病、纖維發育不良、骨軟化症、佝僂病、骨壞死、骨癌（例如骨肉瘤或尤文肉瘤）、骨髓炎、或骨感染。
藥物組成物
多胜肽藥物組成物
本文描述的ANDbody組成物（例如ANDbody多胜肽或RNA組成物）可以投與於有需要的受試者。本發明包括藥物組成物，其包含與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合的ANDbody組成物。
蛋白質治療劑的配製係常規的。參見，例如，Ribeiro等人, Insights on the Formulation of Recombinant Proteins.[對重組蛋白配製的見解]Adv Biochem Eng Biotechnol.[高級生物化學工程生物技術] 2020; 171:23-54. doi: 10.1007/10_2019_119. PMID: 31844925。
RNA 藥物組成物
編碼ANDBody的核酸（例如RNA）可以替代地或另外地投與於受試者。一般來說，治療性mRNA由體外轉錄產生。修飾（例如摻入經修飾的鹼基、5’帽類似物和聚A尾）可以最佳化活性和功能。例如，mRNA的轉譯和穩定性可以藉由帽和聚A尾修飾來實現。例如，將ARCA（抗反向帽類似物）等帽類似物和100-200 bp的聚(A)尾摻入體外轉錄（IVT）mRNA中可提高表現和穩定性（Kaczmarek等人 Genome Medicine[基因組醫學] (2017) 9:60）。新型帽類似物，例如1,2-二硫代二磷酸修飾的帽，可以進一步提高轉譯效率（Strenkowska等人 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2016;44:9578–90）。密碼子最佳化還可以提高蛋白質合成的效率，並限制稀有密碼子造成的mRNA不穩定（Presnyak 等人 Cell.[細胞] 2015;160:1111–24. 93; Thess等人 Mol Ther.[分子療法] 2015; 23: 1456-64）。修飾包含負責募集RNA結合蛋白（RBP）和miRNA的序列的3'和5'非轉譯區（UTR）可以提高蛋白質產物（Kaczmarek）的水平。此外，可以修飾UTR來編碼調控元件（例如K轉角模體和miRNA結合位點），以便以細胞特異性方式控制RNA表現（Wroblewska等人. Nat Biotechnol.[自然生物技術] 2015;33:839–41）。RNA鹼基修飾（例如，摻入mRNA的假尿苷，例如N1-甲基-假尿苷）有助於掩蓋mRNA免疫刺激活性，並藉由增強轉譯起始來增加mRNA轉譯（Andries等人 J Control Release.[控釋雜誌] 2015; 217:337–44; Svitkin等人 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2017; 45:6023–36）。mRNA組成物及其製造方法係已知的並且揭露於例如以下中：WO 2016011306；WO 2016014846；WO 2016022914；WO 2016077123；WO 2016164762；WO 2016201377；WO 2017049275；US 9937233；US 8710200；US 10022425；US 9878056；US 9572897；Jemielity等人 RNA.2003; 9:1108–22.90; Mockey等人 Biochem Biophys Res Commun.[生化及生物物理研究通訊]2006; 340:1062–8.91; Strenkowska的 Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2016; 44:9578–90.92; Presnyak等人 Cell.[細胞] 2015; 160:1111–24.93; Kaczmarek等人Genome Medicine[基因組醫學] (2017) 9:60。
在實施方式中，RNA係環狀RNA。參見例如WO 2019118919，描述了從環狀RNA表現治療性RNA，例如抗體RNA。在一些實施方式中，本發明包括環狀多核糖核苷酸，其包含 (a) 內部核糖體進入位點（IRES）、(b) 編碼本文所述之ANDbody並且缺乏聚-A序列的表現序列，和 (c) 終止元件。編碼本文所述之ANDbody的環狀RNA可以裸（即，不與載劑配製）遞送或與載劑一起遞送。
組合療法
在一些實施方式中，本文提供的ANDbody或ANDbody組成物與一種或多種另外的治療劑，例如一種或多種另外的骨治療劑組合投與。例如，ANDbody或ANDbody組成物可以與用於治療以下的藥劑組合投與：骨密度疾病（例如，低骨密度、骨質減少或骨質疏鬆症）、與骨中鈣瀝濾相關的腎病（例如，腎性骨病、CKD（例如，與礦物質和骨病相關的CKD），或腎性骨營養不良）、骨關節炎、類風濕性關節炎、成骨不全、佩吉特病、纖維發育不良、骨軟化症、佝僂病、骨壞死、骨癌（例如骨肉瘤或尤文肉瘤）、骨髓炎、或骨感染。
在一些實施方式中，另外的骨治療劑係用於治療骨質疏鬆症的藥劑，例如雙膦酸鹽（例如阿侖膦酸鹽、伊班膦酸鹽、利塞膦酸鹽或唑來膦酸）。
在一些實施方式中，另外的骨治療劑係硬化蛋白（SOST）抑制劑（例如，羅莫單株抗體、布索組單株抗體、瑟蘇單株抗體、SHR-1222或SOST抑制劑。參見，例如，Yu等人, Acta Pharm Sin B[製藥學報B], 12(5): 2150-2170, 2022），dickkopf-1（DKK1）抑制劑（參見，例如，Jiang等人, Front Pharmacol[藥理學前沿], 13: 文章編號847387, 2022），核因子κ-β配體受體活化劑（RANKL）抑制劑（例如迪諾舒單株抗體）或組織蛋白酶K抑制劑（例如奧當卡替）。
載劑
脂質奈米顆粒
用於與載劑一起體內遞送的本文所述之組成物的配製物（例如，多胜肽或RNA ANDbody組成物）包括脂質奈米顆粒（LNP）配製物。參見，例如，美國專利9,764,036；美國專利9,682,139；Kauffman等人 Nano Lett.[奈米快報]2015; 15: 7300–6. 37; Fenton等人 Adv Mater.[先進材料] 2016;28:2939–43）。在一些實施方式中，LNP包含一種或多種離子脂質，諸如非陽離子脂質（例如，中性或陰離子或兩性離子脂質）；一種或多種軛合脂質（如WO 2019217941的表5中描述的PEG軛合脂質或軛合至聚合物的脂質；其藉由援引以其全文併入本文）；一種或多種固醇（例如，膽固醇）；以及，視需要，一種或多種靶向分子（例如，軛合的受體、受體配體、抗體）；或前述內容的組合。
可用於奈米顆粒形成的脂質（例如，脂質奈米顆粒）包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其藉由援引併入本文—例如，含脂質的奈米顆粒可包括WO 2019217941的表4中的一種或多種脂質。脂質奈米顆粒可以包括另外的要素，如聚合物，如藉由援引併入的WO 2019217941的表5中描述的聚合物。
在一些實施方式中，軛合脂質，當存在時，可以包括以下的一種或多種：PEG-二醯基甘油（DAG）（如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些（藉由援引併入）和前述的組合。
在一些實施方式中，可摻入脂質奈米顆粒中的固醇包括膽固醇或膽固醇衍生物中的一種或多種，如藉由援引併入的W02009/127060或US 2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括藉由引用併入本文的Eygeris等人 (2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質、抑制顆粒聚集的軛合脂質和固醇。該等組分的量可以獨立地變化，以獲得所需特性。例如，在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包含：可電離脂質，其量係總脂質的約20 mol%至約90 mol%（在其他實施方式中，它可以是存在於脂質奈米顆粒中的總脂質的20-70% (mol)、30-60% (mol)或40-50% (mol)；約50 mol%至約90 mol%）；非陽離子脂質，其量係總脂質的約5 mol%至約30 mol%；軛合脂質，其量係總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%，以及固醇，其量係總脂質的約20 mol%至約50 mol%。總脂質與核酸的比率可以根據需要變化。例如，總脂質與核酸（質量或重量）的比率可為約10 : 1至約30 : 1。
在一些實施方式中，脂質與核酸的比率（質量/質量比率；w/w比率）可以在以下範圍中：約1 : 1至約25 : 1、約10 : 1至約14 : 1、約3 : 1至約15 : 1、約4 : 1至約10 : 1、約5 : 1至約9 : 1、或約6 : 1至約9 : 1。可以調節脂質和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂質奈米顆粒配製物的總脂質含量可在約5 mg/ml至約30 mg/mL的範圍內。
可用於（例如，與其他脂質組分組合）形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA）的脂質奈米顆粒的脂質化合物的一些非限制性實例包括： (i) 。
在一些實施方式中，包含式 (i) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (ii) 。
在一些實施方式中，包含式 (ii) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (iii) 。
在一些實施方式中，包含式 (iii) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (iv) (v) 。
在一些實施方式中，包含式 (v) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (vi) 。
在一些實施方式中，包含式 (vi) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (vii) (viii) 。
在一些實施方式中，包含式 (viii) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (ix) 。
在一些實施方式中，包含式 (ix) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (x) 其中 X 1係O、NR 1或直接鍵，X 2係C2-5伸烷基，X 3係C(=O)或直接鍵，R 1係H或Me，R 3係Ci-3烷基，R 2係Ci-3烷基，或R 2與它所附接的氮原子和X 2的1-3個碳原子一起形成4-元、5-元或6-元環，或X 1係NR 1，R 1和R 2與它們所附接的氮原子一起形成5-元或6-元環，或R 2與R 3和它們所附接的氮原子一起形成5-元、6-元或7-元環，Y 1係C2-12伸烷基，Y 2選自 （在任一取向上）， （在任一取向上）， （在任一取向上）， n係0至3，R 4係Ci-15烷基，Z 1係Ci-6伸烷基或直接鍵， （在任一取向上）或不存在，條件係如果Z 1係直接鍵，則Z 2不存在； R 5係C5-9烷基或C6-10烷氧基，R 6係C5-9烷基或C6-10烷氧基，W係亞甲基或直接鍵，並且R 7係H或Me，或其鹽，條件係如果R 3和R 2係C2烷基，X 1係O，X 2係直鏈C3伸烷基，X 3係C(=0)，Y 1係直鏈Ce伸烷基，(Y 2)n-R 4係 ， R 4係直鏈C5烷基，Z 1係C2伸烷基，Z 2不存在，W係亞甲基，並且R 7係H，則R 5和R 6不是Cx烷氧基。
在一些實施方式中，包含式 (xii) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (xi) 。
在一些實施方式中，包含式 (xi) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， 其中R = (xii) (xiii) (xiv) 。
在一些實施方式中，LNP包含式 (xiii) 的化合物和式 (xiv) 的化合物， (xv) 。
在一些實施方式中，包含式 (xv) 的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肝和/或肝細胞， (xvi) 。
在一些實施方式中，包含式 (xvi) 的配製物的LNP用於將本文所述之ANDbody RNA組成物遞送至肺內皮細胞， (xvii) 其中X = (xviii) (a) (xviii)(b) (xix)。
在一些實施方式中，用於形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA）的脂質奈米顆粒的脂質化合物藉由以下反應之一製成： + (xx) (a) + (xx)(b)。
在一些實施方式中，本文所述之組成物（例如，核酸或蛋白質）在包含可電離脂質的LNP中提供。在一些實施方式中，可電離脂質係十七烷-9-基8-((2-羥乙基)(6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）；例如，如US 9,867,888的實例1中所述（藉由援引以其全文併入本文）。在一些實施方式中，可電離脂質係9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯（LP01），例如，如WO 2015/095340（藉由援引以其全文併入本文）的實例13中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係9-((4-二甲基胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯（L319），例如如US 2012/0027803（藉由援引以其全文併入本文）的實例7、實例8或實例9中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係1,1'-((2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基)氮烷二基)雙(十二烷-2-醇)（C12-200），例如，如WO 2010/053572（藉由援引以其全文併入本文）的實例14和實例16中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係咪唑膽固醇酯（ICE）脂質(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-lH-環戊烯并[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如來自WO 2020/106946（藉由援引以其全文併入本文）的結構 (I)。
在一些實施方式中，可電離脂質可以是陽離子脂質、可電離陽離子脂質，例如可以根據pH以帶正電荷的形式或中性形式存在的陽離子脂質，或可以容易地質子化的含胺脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質係例如在生理條件下能夠帶正電的脂質。示例性的陽離子脂質包括一個或多個帶有正電荷的胺基。在一些實施方式中，脂質顆粒包含與中性脂質、可電離含胺脂質、可生物降解的炔脂質、類固醇、包括多不飽和脂質的磷脂、結構脂質（例如固醇）、PEG、膽固醇和聚合物軛合脂質中的一種或多種配製的陽離子脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質可以是可電離的陽離子脂質。如本文所揭露的示例性陽離子脂質可具有超過6.0的有效pKa。在實施方式中，脂質奈米顆粒可包含具有與第一陽離子脂質不同的有效pKa（例如，大於第一有效pKa）的第二陽離子脂質。脂質奈米顆粒可包括40 mol%至60 mol%的包封在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合的陽離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物軛合脂質和治療劑，例如本文所述之核酸（例如，RNA）。在一些實施方式中，核酸與陽離子脂質共同配製。核酸可以吸附到LNP（例如包含陽離子脂質的LNP）的表面。在一些實施方式中，核酸可以包封在LNP（例如包含陽離子脂質的LNP）中。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包含靶向部分，例如用靶向劑包被的靶向部分。在實施方式中，LNP配製物係生物可降解的。在一些實施方式中，包含一種或多種本文所述之脂質（例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii) 和/或 (ix)）的脂質奈米顆粒包封至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或100%的RNA分子。
可用於脂質奈米顆粒配製物中的示例性可電離脂質包括但不限於藉由援引併入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂質包括但不限於下式中的一種或多種：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US 2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US 2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；W02013/016058的A；W02012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210的；W02009/132131的I、II、III或IV；US 2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269的；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US 2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US 10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I。
在一些實施方式中，可電離脂質係MC3 (6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烷-6,9,28,3 l-四烯-l9-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3），例如，如WO 2019051289A9（藉由引用以其全文併入本文）的實例9中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係脂質ATX-002，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例10中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3, l6-二烯-l-胺（化合物32），例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例11中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入本文）的實例12中所述。
示例性非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-磷脂醯-乙醇胺（DSPE）、單甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-單甲基PE）、二甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-二甲基PE）、l8-l-反式PE、l-硬脂醯-2-油醯-磷脂醯乙醇胺（SOPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、卵磷脂醯膽鹼（EPC）、二油醯磷脂醯絲胺酸（DOPS）、神經鞘磷脂（SM）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油（DMPG）、二硬脂醯磷脂醯甘油（DSPG）、二芥醯基磷脂醯膽鹼（DEPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油（POPG）、二反油醯-磷脂醯乙醇胺（DEPE）、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂（ESM）、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸、溶血磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼或其混合物。應當理解，也可以使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。該等脂質中的醯基基團較佳的是源自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。在某些實施方式中，另外的示例性脂質包括但不限於藉由援引併入本文的Kim等人 (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。在一些實施方式中，這樣的脂質包括發現會改善用mRNA進行肝轉染的植物脂質（例如DGTS）。
適用於脂質奈米顆粒中的非陽離子脂質的其他實例包括但不限於非磷脂質，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙醯基棕櫚酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸鹽、烷基-芳基硫酸鹽、聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂等。其他非陽離子脂質在WO 2017/099823或美國專利公開US 2018/0028664中描述，其內容藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，非陽離子脂質係油酸或藉由援引以其全文併入的US 2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非陽離子脂質可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的例如0-30%（莫耳）。在一些實施方式中，非陽離子脂質含量係脂質奈米顆粒中存在的總脂質的5%-20%（mol）或10%-15%（mol）。在實施方式中，可電離脂質與中性脂質的莫耳比為約2 : 1至約8 : 1（例如，約2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒不包含任何磷脂。
在一些方面，脂質奈米顆粒可進一步包含諸如固醇的組分以提供膜完整性。可用於脂質奈米顆粒中的一種示例性固醇係膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性實例包括極性類似物，諸如5a-膽甾烷醇、53-糞甾烷醇、膽甾醇基-(2,-羥基)-乙基醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5a-膽甾烷、膽甾烯酮、5a-膽甾烷酮、5p-膽甾烷酮和膽甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些實施方式中，膽固醇衍生物係極性類似物，例如，膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚。示例性的膽固醇衍生物在PCT公開WO 2009/127060和美國專利公開US 2010/0130588中描述，其中每個藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，提供膜完整性的組分，諸如固醇，可占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-50%（莫耳）（例如，0-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%或40%-50%）。在一些實施方式中，這樣的組分係脂質奈米顆粒的總脂質含量的20%-50%（mol）、30%-40%（mol）。
在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包含聚乙二醇（PEG）或軛合的脂質分子。通常，該等用於抑制脂質奈米顆粒的聚集和/或提供空間穩定。示例性的軛合脂質包括但不限於PEG-脂質軛合物、聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（如ATTA-脂質軛合物）、陽離子聚合物脂質（CPL）軛合物及其混合物。在一些實施方式中，軛合脂質分子係PEG-脂質軛合物，例如(甲氧基聚乙二醇)軛合脂質。
示例性的PEG-脂質軛合物包括但不限於PEG-二醯基甘油（DAG）（如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽或其混合物。另外的示例性PEG-脂質軛合物例如在US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904和US/099823中描述，所有該等的內容藉由引用以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質係US 2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物，其內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，兩者的內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-DAA軛合物可以是例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕櫚基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂質可以是以下的一種或多種：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油脂醯胺、PEG-二硬脂基甘油脂醯胺、PEG-膽固醇（l-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺基甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)）、PEG-DMB（3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚）和1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包含PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包含選自以下的結構： ，
在一些實施方式中，與PEG以外的分子軛合的脂質也可用於代替PEG-脂質。例如，聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（如ATTA-脂質軛合物）和陽離子聚合物脂質（GPL）軛合物可用於代替PEG-脂質或與PEG-脂質一起使用。
示例性的軛合脂質，即PEG-脂質、（POZ）-脂質軛合物、ATTA-脂質軛合物和陽離子聚合物-脂質在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS專利申請中描述，所有該等的內容藉由援引以其全文併入本文。
在一些實施方式中，PEG或軛合脂質可以占脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-20%（莫耳）。在一些實施方式中，PEG或軛合脂質的含量為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0.5%-10%或2%-5%（mol）。可電離脂質、非陽離子脂質、固醇和PEG/軛合脂質的莫耳比可以根據需要變化。例如，脂質顆粒可包含按組成物的莫耳或總重量計30%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計0-60%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計0-30%的非陽離子脂質和按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。較佳的是，組成物包含按組成物的莫耳或總重量計30%-40%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計40%-50%的膽固醇，和按組成物的莫耳或總重量計10%-20%的非陽離子脂質。在一些其他實施方式中，該組成物係按組成物的莫耳或總重量計50%-75%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計20%-40%的膽固醇和按組成物的莫耳或總重量計5%至10%的非陽離子脂質以及按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。該組成物可以含有按組成物的莫耳或總重量計60%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計25%-35%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質。該組成物還可含有按組成物的莫耳或總重量計至多90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%至15%的非陽離子脂質。配製物也可以是脂質奈米顆粒配製物，例如包含按組成物的莫耳或總重量計8%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計5%-30%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計0-20%的膽固醇；按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%至25%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計10%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計5%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計1%至15%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計2%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-20%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計甚至高達90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%-10%的非陽離子脂質，或按組成物的莫耳或總重量計甚至100%的陽離子脂質。在一些實施方式中，脂質顆粒配製物包含莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇化脂質。在一些其他實施方式中，脂質顆粒配製物包含莫耳比為60 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含可電離脂質、非陽離子脂質（例如磷脂）、固醇（例如膽固醇）和聚乙二醇化脂質，其中可電離脂質的脂質莫耳比在20至70莫耳%的範圍內，目標為40-60莫耳%，非陽離子脂質的莫耳百分比在0至30莫耳%的範圍內，目標為0至15莫耳%，固醇的莫耳百分比在20至70莫耳%的範圍內，目標為30至50莫耳%，並且聚乙二醇化脂質的莫耳百分比在1至6莫耳%的範圍內，目標為2至5莫耳%。
在一些實施方式中，脂質顆粒包含莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質/非陽離子脂質/固醇/軛合脂質。
在一方面，本揭露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺的脂質奈米顆粒配製物。
在一些實施方式中，還可以包括一種或多種另外的化合物。那些化合物可以單獨投與，或者另外的化合物可以包括在本發明之脂質奈米顆粒中。換言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂質奈米顆粒可含有不同於第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以選自由以下組成之群組：小的或大的有機分子或無機分子、單糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、胜肽、蛋白質、其胜肽類似物和衍生物、胜肽模擬物、核酸、核酸類似物和衍生物、由生物材料製成的提取物，或其任何組合。
在一些實施方式中，藉由添加LNP靶向結構域將LNP定向至特定組織。例如，可以將生物配體展示在LNP的表面，以增強與展示同源受體的細胞的相互作用，從而推動與細胞表現受體的組織的締合和向其中的載物遞送。在一些實施方式中，生物配體可以是驅動遞送至肝的配體，例如展示GalNAc的LNP促使核酸載物遞送至展示無唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）的肝細胞。Akinc等人 Mol Ther [分子療法] 18(7):1357-1364 (2010) 的工作傳授了將三價GalNAc配體與PEG-脂質軛合（GalNAc-PEG-DSG）以產生依賴於ASGPR的LNP以獲得可觀察的LNP載物效應（參見，例如，Akinc等人 2010, 同上的圖6）。其他展示配體的LNP配製物，例如摻入葉酸、轉鐵蛋白或抗體的配製物，在WO 2017223135中進行了討論，其藉由引用以其全文併入本文，此外還有在其中使用的參考文獻也併入本文：即，Kolhatkar等人, Curr Drug Discov Technol [當代藥物發現技術].2011 8:197-206；Musacchio和Torchilin, Front Biosci.[生物科學前沿] 2011 16:1388-1412；Yu等人, Mol Membr Biol.[分子膜生物學] 2010 27:286-298；Patil等人, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst [治療性藥物載劑系統的重要評論].2008 25:1-61；Benoit等人, Biomacromolecules [生物大分子].2011 12:2708-2714；Zhao等人, Expert Opin Drug Deliv [藥物遞送專家觀點].2008 5:309-319；Akinc等人, Mol Ther [分子療法].2010 18:1357-1364；Srinivasan等人, Methods Mol Biol [分子生物學方法]. 2012 820:105-116；Ben-Arie等人, Methods Mol Biol [分子生物學方法]. 2012 757:497-507；Peer 2010 J Control Release [控釋雜誌].20:63–68；Peer等人, Proc Natl Acad Sci U S A.[美國國家科學院院刊] 2007 104:4095-4100；Kim等人, Methods Mol Biol.[分子生物學方法] 2011 721:339-353；Subramanya等人, Mol Ther [分子療法].2010 18:2028-2037；Song等人, Nat Biotechnol.[自然生物技術] 2005 23:709-717；Peer等人, Science [科學].2008 319:627-630；以及Peer和Lieberman, Gene Ther [基因療法]. 2011 18:1127-1133。
在一些實施方式中，藉由將選擇性器官靶向（Selective ORgan Targeting，SORT）分子添加至包含傳統組分（例如可電離的陽離子脂質、兩親性磷脂、膽固醇和聚（乙二醇）（PEG））的配製物中來針對組織特異性活性對LNP進行選擇。Cheng等人 Nat Nanotechnol [自然奈米技術] 15(4):313-320 (2020) 的傳授內容證明，添加補充的「SORT」組分可根據SORT分子的百分比和生物物理特性精確地改變體內RNA遞送譜並介導組織特異性（例如，肺、肝、脾臟）基因遞送和編輯。
在一些實施方式中，LNP包含生物可降解的可電離脂質。在一些實施方式中，LNP包含(9Z,l2Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一種可電離脂質。參見，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086，以及其中提供的參考文獻的脂質。在一些實施方式中，在LNP脂質的上下文中術語陽離子和可電離係可互換的，例如，其中可電離脂質根據pH係陽離子的。
在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以在數十nm和數百nm之間，例如藉由動態光散射（DLS）測量的。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以為約40 nm至約150 nm，如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm或約90 nm至約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約70 nm至約100 nm。在特定的實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約80 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑範圍為約l mm至約500 mm、約5 mm至約200 mm、約10 mm至約100 mm、約20 mm至約80 mm、約25 mm至約60 mm、約30 mm至約55 mm、約35 mm至約50 mm，或約38 mm至約42 mm。
在一些情況下，LNP可以是相對均質的。多分散性指數可用於指示LNP的均質性，例如脂質奈米顆粒的粒度分佈。小的（例如，小於0.3）多分散性指數通常指示窄的粒度分佈。LNP的多分散性指數可為約0至約0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施方式中，LNP的多分散性指數可為約0.10至約0.20。
LNP的ζ電位可用於指示組成物的電動電位。在一些實施方式中，ζ電位可以描述LNP的表面電荷。具有相對低電荷（正電荷或負電荷）的脂質奈米顆粒通常是期望的，因為更高電荷的物質可能不理想地與體內的細胞、組織和其他元素相互作用。在一些實施方式中，LNP的ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。
蛋白質和/或核酸的包封效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被包封或以其他方式與LNP締合的蛋白質和/或核酸的量。包封效率理想的是較高（例如，接近100%）。包封效率可以例如藉由比較在用一種或多種有機溶劑或去垢劑破碎脂質奈米顆粒之前和之後含有脂質奈米顆粒的溶液中蛋白質或核酸的量來測量。陰離子交換樹脂可用於測量溶液中游離蛋白質或核酸（例如RNA）的量。螢光可用於測量溶液中游離蛋白質和/或核酸（例如RNA）的量。對於本文所述之脂質奈米顆粒，蛋白質和/或核酸的包封效率可以是至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少80%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少90%。在一些實施方式中，包封效率可以是至少95%。
LNP可以視需要包含一層或多層包衣。在一些實施方式中，LNP可以配製在具有包衣的膠囊、膜或片劑中。包含本文所述之組成物的膠囊、膜或片劑可具有任何可用的尺寸、拉伸強度、硬度或密度。
另外的示例性脂質、配製物、方法和LNP表徵由WO 2020061457傳授，其藉由引用以其全文併入本文。
在一些實施方式中，使用Lipofectamine MessengerMax（賽默飛世爾（Thermo Fisher））或TransIT-mRNA轉染試劑（米盧斯生物（Mirus Bio））進行體外或離體細胞脂質體轉染。在某些實施方式中，使用GenVoy_ILM可電離脂質混合物（精密奈米系統（Precision NanoSystems））配製LNP。在某些實施方式中，使用2,2‐二亞油烯基(dilinoleyl)‐4‐二甲基胺基乙基‐[1,3]‐二氧戊環（DLin‐KC2‐DMA）或二亞油烯基甲基‐4‐二甲基胺基丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3）配製LNP，其配製和體內用途在Jayaraman等人 Angew Chem Int Ed Engl [德國應用化學] 51(34):8529-8533 (2012)中傳授，其藉由援引以其全文併入本文。
最佳化用於遞送CRISPR-Cas系統（例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA）的LNP配製物在兩者均藉由引用併入的WO 2019067992和WO 2019067910中描述。
可用於遞送核酸的另外的特定LNP配製物在兩者均藉由引用併入的US 8158601和US 8168775中描述，其包括帕替西蘭（patisiran）中使用的以名稱ONPATTRO銷售的配製物。
包含本文所述之RNA組成物的LNP的示例性劑量可包括約0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100 mg/kg（RNA）。包含編碼系統的一種或多種組分的核酸的AAV的示例性給藥可包括約1011、1012、1013和1014 vg/kg的MOI。
在一些實施方式中，本發明包括脂質奈米顆粒（LNP），其包含本文所述之ANDbody多胜肽（或編碼其的RNA）、核酸分子或編碼本文所述之ANDbody的DNA。在實施方式中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施方式中，LNP進一步包含一種或多種中性脂質，例如DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM，類固醇，例如膽固醇，和/或一種或多種聚合物軛合的脂質，例如聚乙二醇化脂質，例如PEG-DAG、PEG-PE、PEG-S-DAG、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯。在一些實施方式中，LNP的陽離子脂質具有根據以下的結構： (i)， (ii)，或 (iii)。
有關LNP的綜述，另參見Li等人 2017, Nanomaterials[奈米材料] 7, 122; doi:10.3390/nano7060122。
其他載劑
病毒載體
本文所述之組成物（例如，多胜肽或RNA ANDbody組成物）可以藉由病毒載體（例如，表現RNA的病毒載體）遞送。病毒載體可以投與於細胞或受試者（例如，人受試者或非人動物）。病毒載體可以局部或全身投與。
病毒載體的實例包括反轉錄病毒（例如，反轉錄病毒科病毒載體）、腺病毒（例如Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48）、細小病毒（例如，腺相關病毒）、冠狀病毒、負股RNA病毒（諸如正黏病毒（例如流感病毒）、彈狀病毒（例如狂犬病和水泡性口炎病毒）、副黏病毒（例如麻疹和仙台病毒））、正股RNA病毒（諸如微核糖核酸病毒和甲病毒）、以及雙股DNA病毒（包括腺病毒、皰疹病毒（例如單純皰疹病毒1型和2型、愛潑斯坦-巴爾病毒、巨細胞病毒、複製缺陷皰疹病毒）和痘病毒（例如牛痘、改良安卡拉牛痘（MVA）、雞痘和金絲雀痘））。其他病毒包括例如諾沃克病毒、披膜病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。反轉錄病毒的實例包括：禽白血病肉瘤，禽C型病毒，哺乳動物C型病毒、B型病毒、D型病毒，致癌反轉錄病毒，HTLV-BLV群，慢病毒，α反轉錄病毒，γ反轉錄病毒，泡沫病毒（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication [反轉錄病毒：病毒及其複製], Virology [病毒學] (第三版) Lippincott-Raven [利平科特-瑞文], 費城, 1996）。其他實例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T細胞白血病病毒、狒狒內源病毒、長臂猿白血病病毒、梅森輝瑞（Mason Pfizer）猴病毒、猴免疫缺陷病毒、猴肉瘤病毒、勞斯肉瘤病毒和慢病毒。載體的其他實例描述於例如美國專利案號5,801,030中，其教導以引用的方式併入本文。
指環病毒載體還可用於遞送本文所述之ANDbody組成物。指環載體係本領域已知的並且描述於例如WO 2020123773、WO 2020123816、WO 2018232017和WO 2020123773中。在某些實施方式中，指環載體組成物包含基因組元件，所述基因組元件包含與編碼本文所述之ANDbody的核酸序列可操作地連接的啟動子，所述遺傳元件被包含指環病毒ORF1例如指環病毒衣殼蛋白的蛋白質外部包封。
基於細胞和囊泡的載劑
本文所述之組成物（例如，多胜肽或RNA ANDbody組成物）本文所述可以投與於細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中的細胞。在一個實施方式中，本文所述之組成物和系統可以配製在脂質體或其他類似的囊泡中。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性隔室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可以是陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其貨物免受血漿酶的降解，並將其負載運輸穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。囊泡可以由若干種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成脂質體作為藥物載劑。用於製備多層囊泡脂質之方法係本領域已知的（參見例如美國專利案號6,693,086，其關於多層囊泡脂質製備的傳授內容藉由援引併入本文）。儘管當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可以是自發的，但也可以藉由經由使用均質器、超音波波儀或擠壓設備以振盪的形式施加力來加快囊泡形成（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可以藉由擠出通過具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotech [自然 生物技術], 15:647-652, 1997中所述，該文獻關於擠出脂質製備的傳授內容藉由援引併入本文。
外泌體也可用於作為本文所述之組成物和系統的藥物遞送媒介物。對於綜述，參見Ha等人 2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B [藥學學報] 第6卷第4期, 第287-296頁；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
離體分化的紅血球也可以用於作為本文所述之藥劑（例如，抑制劑），例如本文所述之抗體或核酸的載劑。參見，例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO 2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊]111(28): 10131–10136；美國專利9,644,180；Huang等人 2017. Nature Communications [自然通訊] 8: 423；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA. [美國國家科學院院刊] 111(28): 10131–10136。
融合體組成物，例如，如WO 2018208728中所述，也可用於作為載劑以遞送本文所述之[藥劑]或製劑。
例如如WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526、或WO 2020041784中所述之植物奈米囊泡和植物信使包（PMP）也可以用於作為遞送本文所述之組成物的載劑。
無需進一步詳細闡述，相信熟悉該項技術者可以基於以上描述在其最大程度上利用本發明。因此以下特定實施方式將被解釋為僅是說明性的，並且無論如何並非以任何方式限制本公開的其餘內容。出於本文引用的目的或主題，本文引用的所有出版物及其章節均藉由引用併入本文。
實例
本發明將在以下非限制性實例中進一步說明。
目錄
實例 1 結合軟骨黏附素（CHAD）位址和硬化蛋白（SOST）靶標的ANDbody的設計
實例 2 結合CHAD位址和SOST靶標的ANDbody的產生和表徵
實例 3 結合干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）位址和SOST靶標的ANDbody的設計
實例 4 結合IFITM5位址和SOST靶標的ANDbody的產生和表徵
實例 5 結合CHAD和Dickkopf-1（DKK1）的ANDbody的設計
實例 6 骨靶向ANDbody的藥物動力學和組織分佈
實例 7 骨靶向ANDbody的體內效應
實例 8 結合DMP1位址的ANDbody構築體的產生和表徵
實例 9 結合DMP1位址和SOST靶標的ANDbody的設計
實例 10 骨細胞外基質位址DMP1的驗證
實例 11 結合DMP1位址和SOST靶標的ANDbody的表徵
實例 12 結合IBSP位址和SOST靶標的ANDbody的設計
實例 13 結合IBSP位址和SOST靶標的ANDbody的產生和表徵
實例 14 結合TPBG位址和SOST靶標的ANDbody的設計
實例 15 結合細胞表面TPBG的抗TPBG抗體的評估
實例 16 結合TPBG位址和SOST靶標的ANDbody的產生和表徵
實例 17 結合靶SOST的阿侖膦酸鹽軛合的ANDbody分子的生成
實例 18 雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody在基於細胞的測定中阻斷硬化蛋白
實例 19 阿侖膦酸鹽軛合的ANDbody分子與羥基磷灰石的結合
實例 20 骨靶向ANDbody的藥物動力學和分佈
實例 21 骨靶向ANDbody的體內效應：投與骨靶向ANDbody構築體後小鼠中的P1NP變化
實例 22 設計結合Dickkopf-1（DKK1）和SOST的ANDbody構築體，作為與靶向羥基磷灰石位址的雙磷酸鹽骨定位器軛合的雙特異性致動器
實例 23 在體外基於細胞的測定中評估抗DKK1和抗DKK1抗SOST ANDbody
實例 1 ：結合軟骨黏附素（ CHAD ）位址和硬化蛋白（ SOST ）靶標的 ANDbody 的設計
a. 接種疫苗以產生抗 CHAD 抗體
藉由免疫產生針對人軟骨黏附素（CHAD）細胞外結構域的抗體。與人IgG1 Fc區（UniProt ID P01857位置P100-K330）融合的人CHAD細胞外結構域（NCBI蛋白登錄號NP_001258位置A22-H359）（huCHAD）在HEK293F細胞中表現。簡而言之，DNA序列針對哺乳動物表現進行密碼子最佳化並置於表現載體中。將蛋白質瞬時轉染至細胞（例如HEK293細胞）中，並按照常規方法使用蛋白A親和純化進行純化。50 µg huCHAD-Fc融合蛋白用於藉由腹膜內（i.p.）注射完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑（CFA/IFA佐劑）來免疫雌性BALB/c小鼠。隨後，產生融合瘤（Listek等人, Scientific Reports[科學報導], 10: 1664, 2020）。首先以ELISA形式篩選對用於免疫的huCHAD-Fc融合蛋白具有特異性IgG反應性的殖株，然後使用穩定（CHO）或瞬時（HEK293F）轉染全長huCHAD的細胞進行流動式細胞測量術研究。接下來根據鼠交叉反應性評估抗CHAD融合瘤殖株。使用穩定（CHO）或瞬時（HEK293F）轉染全長小鼠CHAD （mCHAD）的細胞進行流動式細胞測量術研究，並選擇與mCHAD結合的殖株。然後藉由有限稀釋選殖進一步純化表現在人和小鼠之間具有交叉反應性的抗CHAD mAb的陽性殖株。融合瘤在DMEM/2%超低IgG血清中生長，並根據常規方法藉由蛋白G層析法純化mAb。
b. 選擇惰性抗 CHAD 抗體
位址靶標結合位點被設計為不會顯著調節位址靶標的功能。因此，如上所述產生的抗CHAD融合瘤殖株基於其不能阻斷軟骨細胞α2β1整合素依賴性黏附，進一步對其進行評估。重組人CHAD蛋白（R&D系統公司（R&D Systems）目錄號8218-CH-050）用於包被組織培養24孔盤（在變性條件下使用4M鹽酸胍，濃度為5 µg/ml）。過夜孵育後，用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌盤，並使用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS在室溫下封閉非特異性結合1小時。
在存在10 fM至10 µM的來自融合瘤的抗CHAD抗體殖株的情況下，評估鼠軟骨細胞株ATCD5（西格瑪公司（Sigma）目錄號99072806）與孔結合的能力（每個濃度和每個殖株一個條件）。將80,000個ATCD5細胞在抗CHAD抗體存在下鋪盤於組織培養基中1小時，並用PBS洗滌未結合的細胞。使用VYBRANT™細胞黏附測定套組（賽默飛世爾公司（ThermoFisher），目錄號V13181）根據製造商的說明計算貼壁細胞的數量。該測定中使用同種型無關（陰性）人IgG1抗體作為對照。
c. 鑒定與小鼠骨特異性結合的抗 CHAD 抗體
本技術的位址結合靶標，例如示例性的CHAD位址結合靶標，被設計為特異性結合至靶組織或細胞類型，同時最小化與其他組織的結合。因此，進一步評估如上所述產生的抗CHAD融合瘤殖株對骨的特異性。這係藉由兩個步驟實現的，均使用免疫組織化學（IHC）。首先，藉由將固定在載玻片上的脫鈣人骨組織切片與抗CHAD抗體一起孵育來確定與骨基質的結合。藉由孵育與小鼠抗體反應的辣根過氧化物酶（HRP）軛合的二抗來檢測與骨組織結合的抗體。結合的位置和強度藉由添加HRP基質3,3'二胺基聯苯胺（DAB）來確定，在一抗結合位點會產生棕色，與沈積抗體的豐度成比例。細胞核用蘇木精複染以產生藍色。其次，抗CHAD抗體的特異性係藉由對安裝在載玻片上的新鮮冷凍人組織微陣列（TMA）切片進行IHC（如上所述對骨組織）來確定的。TMA包括代表身體其他部位主要組織成分的非骨組織（例如脾、心、腎（髓質和皮質）、肺（上呼吸道和下呼吸道）、皮膚、肝、胰腺、大腸（升結腸、降結腸和橫結腸）、小腸（十二指腸、空腸和回腸）、胃、心臟、骨骼肌和腦）。抗體的特異性由與TMA上任何細胞（不含骨）中的細胞相比與骨的相對反應性決定。
d. 接種疫苗以產生抗 SOST 抗體
硬化蛋白（SOST）蛋白（huSOST）係示例性效應物靶標。與人IgG1的Fc區融合的人SOST蛋白（NCBI蛋白登錄號NP_079513，位置Q24-Y213）係藉由使用與上述CHAD過程類似的過程進行免疫而產生的。免疫和融合瘤生成後，如上所述但針對與全長人和小鼠SOST（而不是CHAD）結合來篩選殖株。然後藉由有限稀釋選殖進一步純化表現在人和小鼠之間具有交叉反應性的抗SOST mAb的陽性殖株。融合瘤在DMEM/2%超低IgG血清中生長，並藉由蛋白G層析法純化mAb。
e. 選擇具有寬範圍抑制濃度和體外功能的抗 SOST 抗體
本技術的效應物靶結合抗體，例如SOST，被設計為幾乎沒有或沒有藥理作用，除非它們定位於靶結合位點，例如CHAD蛋白陽性骨基質。因此，選擇效應物靶標結合抗體，使得與局部靶標的結合對於實現持續的藥理學活性濃度係必要的。
當評估體外阻斷SOST活性的能力時，選擇具有一系列抑制濃度（IC 50）的抗SOST抗體，例如＜ 1 nM至1 µM。SOST阻斷活性藉由β-連環蛋白依賴性Wnt報導基因測定來測量。對於該等測定，使用含有T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）轉基因報導基因的HEK293細胞株，該報導基因驅動螢光素酶表現以測量Wnt傳訊通路的活化（BPS生物科學公司（BPS Bioscience）目錄號60501）。將35,000個細胞在96孔盤中的100 µL含有10 mM氯化鋰（LiCl）的培養基中鋪盤過夜。18小時後，用可溶性重組鼠Wnt1（37 ng/mL）（R&D系統公司目錄號9765-WN-010）或人Wnt3a（111.1 ng/mL）（R&D系統公司目錄號5036-WN）與SOST（1 µg/mL）和抗SOST抗體的系列稀釋液（10 µg/mL和1 : 3稀釋液）一起處理細胞。37°C 5小時後，細胞在100 µL螢光素酶試劑緩衝液（組分A）中裂解，該緩衝液含有1 µL螢光素酶試劑基質（組分B）（BPS生物科學公司目錄號60690），並添加到孔中。使用SPECTRAMAX® i3x多功能微量盤分析儀評估發光。報導細胞的Wnt活化導致螢光素酶活性被SOST阻斷。抗體對SOST活性的阻斷被評估為螢光素酶訊號的增加。
使用MC3T3成骨細胞（ATCC目錄號CRL-2593）進行功能性體外測定。為了評估礦化，將10,000個MC3T3細胞置於24孔盤中並使其達到匯合。添加含有50 µg/mL維生素C、10 mM β-甘油磷酸鹽和20 ng/mL骨成形性蛋白質-2（BMP-2）的礦化培養基。將400 ng/mL的SOST和抗SOST抗體的系列稀釋液（10 µg/mL和1 : 3稀釋液）添加到孔中，並每2-3天更換含有相應添加劑的培養基。8天後，洗滌細胞並在10%福馬林中固定10分鐘，用水洗滌3次，並與500 µl 40mM茜素溶液（密理博西格瑪公司（Millipore Sigma）目錄號TMS-008-C）一起孵育。15分鐘後，用水洗滌細胞3次。對於鈣定量，將500 µl 10%乙酸（v/v）添加到細胞中，在室溫（RT）下放置30分鐘。刮下細胞並轉移至Eppendorf管中，渦旋30秒，並在85°C下孵育15分鐘。將樣品以20,000 x g離心15分鐘，並將250 μl上清液轉移至另一個Eppendorf管中。將100 μl 10% NH 4OH（v/v）添加到樣品中並混合。使用SPECTRAMAX® i3x多功能微量盤分析儀在405 nm處測量吸光度。
f. 降低抗 SOST 抗體的親和力
效應物結合抗體可能需要降低其結合親和力以滿足ANDbody效應物靶結合結構域的設計要求。在示例性抗SOST抗體中，與位址靶結合物相比，對SOST的親和力可能太強。在這種情況下，在生成相應的ANDbody之前執行去成熟。這提供了一系列抗體，有利於靶向骨位址靶標，其中藥效作用係局部靶向的（例如K D＞ 100 nM）。藉由丙胺酸掃描誘變，在抗SOST抗體可變輕鏈（VL）的各個互補決定區（CDR）的選定殘基中進行親和力去成熟（第1階段）。
為了評估抗SOST抗體和位址抗體的結合親和力，使用生物層干涉測量法（GatorPrime）測量抗體與抗原結合的解離常數（K D）、結合速率（k on）和解離速率（k off）。本實驗使用聚丙烯96孔黑色F底盤（RATIOLAB®）。簡而言之，預平衡的抗人IgG Fc捕獲生物感測器吸頭（小鱷生物公司（Gator Bio））在1 × K緩衝液（小鱷生物公司）中進行基線化，並將抗體以2 μg/mL的濃度載入到抗人IgG Fc捕獲吸頭上。在1 × K緩衝液中執行額外的基線步驟，然後使用不同濃度的抗原（0–300 nM）進行締合步驟。為了分析和確定每個抗原/抗體對的K D，使用締合響應大於0.1並且解離導致可測量的解離速率的所有抗原濃度進行全域擬合。所有曲線擬合均採用1 : 1模型。使用GATOR TMGatorOne分析軟體（小鱷生物公司）分析數據。
如果單個VL CDR殘基的變化不會導致親和力等於或小於100 nM範圍，則生成多個組合丙胺酸取代，並評估新合成的構築體的親和力變化（第2階段）。在第1階段和第2階段之後親和力沒有降低，然後在可變重鏈（VH）序列中進行丙胺酸掃描誘變（第3階段），並藉由BLI評估抗體對SOST的親和力。
實例 2 ：結合 CHAD 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的產生和表徵
a. ANDbody 的產生
使用IN-FUSION® HD選殖（寶生物公司（Takara Bio），目錄號638911）將IC 50從＜ 1 nM到5 µM範圍內的編碼10個抗CHAD抗體和10個抗SOST抗體的DNA序列根據「受控Fab-臂交換」（cFAE）方法（Labrijn等人, Nature Protocols[自然方案], 9(10): 2450-2463, 2014）選殖到人IgG1框架（在CH3結構域Fc區域中具有單匹配點突變）中。從瞬時HEK293表現中分別表現抗體並使用蛋白A親和樹脂純化每種抗體後，根據cFAE方法將親本抗體（一個抗CHAD抗體與一個抗SOST抗體的組合）製成抗CHAD/SOST ANDbody。簡而言之，親本抗體在允許的氧化還原條件下混合，以實現半分子的重組。隨後，除去還原劑以允許鏈間二硫鍵的再氧化。最後，使用基於層析或基於質譜之方法定量交換效率。產生了抗CHAD/SOST的約100個變體ANDbody。
b. 體外同時結合 CHAD 和 SOST
為了鑒定滿足所期望效應物靶標並解決靶標結合親和力標準的ANDbody變體，使用如上所述之BLI測定法進行對兩種不同抗原的雙重結合測定，並進行以下修改。簡而言之，將ANDbody候選物載入到用K緩衝液預平衡的感測器吸頭（抗人IgG Fc）上，然後進行基線步驟。將裝載的吸頭浸入含有純化的可溶性CHAD的孔中（第一締合步驟），然後浸入純化的可溶性SOST的孔中（第二締合步驟），然後進行解離步驟。如上所述進行基於BLI的親和力測量。對CHAD的親和力高於SOST的ANDbody變體以及對SOST沒有親和力差異或具有更高親和力的變體用於後續體外和體內實驗。
c. ANDbody 中硬化蛋白阻斷活性的體外測定
本技術的ANDbody必須保留親代效應物靶標結合抗體的功能特性，並且結合親和力必須使得藥理作用可以藉由結合至位址靶標來定位。在抗CHAD/SOST ANDbody的情況下，對SOST的抑制效力（IC 50）藉由在使用TCF/LEF報導細胞的Wnt傳訊測定中測量SOST抑制的緩解並藉由測量MC3T3成骨細胞中礦化抑制的緩解來確定。
d. 抗 CHAD/SOST ANDbody 的組織特異性結合
本技術的ANDbody保留與其親代定位器（位址靶標結合）部分類似的組織和/或細胞結合特性。為了鑒定滿足該標準的ANDbody變體，藉由IHC、鼠組織微陣列上的組織（如上所述，用鼠組織替代人組織）以及用抗人IgG1二抗替代抗小鼠二抗，評估具有一系列親和力的分子（如上文所述之抗CHAD/SOST變體）與鼠骨的結合。
實例 3 ：結合干擾素誘導的跨膜蛋白 5 （ IFITM5 ）位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的設計
a. 接種疫苗以產生抗 IFITM5 抗體
與干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）結合的抗體按照上述針對CHAD之方法產生，不同之處在於人IFITM5的細胞外結構域（NCBI蛋白登錄號NP_001020466，位置M1-H36）與人IgG1融合並用於免疫。人和等效小鼠蛋白質序列用於鑒定抗IFITM5抗體。
b. 選擇惰性抗 IFITM5 抗體
如上所述產生的抗-IFITM5融合瘤殖株基於其無法阻斷成骨細胞株中的礦化，進一步對其進行評估。為此，如上所述，在1、2、5或10 µg/mL選定的抗IFITM5抗體或抗體對照存在下，對MC3T3細胞進行礦化測定。針對它們在體外阻斷SOST活性的能力，選擇不干擾礦化過程的抗體，如在如上所述之β-連環蛋白依賴性Wnt報導基因測定中所測量的。
此外，根據製造商方案，使用Saos-2 CELL AVALANCHE™轉染試劑（EZBIOSYSTEMS TM目錄號EZT-SAOS-1），用選殖到pCDNA3.1中的人IFITM5 cDNA轉染人骨肉瘤SaOS2細胞（ATCC目錄號HTB-85）。為此，在轉染前將1 x 10 4個SaOS2細胞置於96孔盤中24小時。轉染後兩天，在存在1、2、5或10 ug/mL選定的抗IFITM5抗體、ANDbody或抗體對照的情況下，藉由在培養基中補充10 -8M地塞米松、50 µg/mL維生素C和10 mM β-甘油磷酸鹽，使細胞進行成骨分化。三天後，收穫細胞並提取mRNA（RNeasy微量套組，凱傑公司（Qiagen）目錄號74004）並反轉錄為cDNA（第一股cDNA合成，羅氏公司（Roche），目錄號11483188001）。使用APPLIED BIOSYSTEMS TM7500即時PCR系統（應用生物系統公司（APPLIED BIOSYSTEMSTM））進行qPCR（POWERUP™ SYBR™ Green Master Mix，應用生物系統公司，目錄號A25741））。評估的成骨相關基因包括Runx2、ALP和OCN。選擇不干擾上述成骨標誌物上調的抗體用於ANDbody中。
c. 鑒定與小鼠骨特異性結合的抗 IFITM5 抗體
如上所述，使用人骨組織和組織微陣列的IHC分析來評估抗IFITM5抗體的結合強度和特異性。
實例 4 ：結合 IFITM5 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的產生和表徵
a. 將 ANDbody 作為雙特異性抗體進行表現和純化
包含結合IFITM5和SOST的雙特異性抗體的ANDbody如上所述被表現和純化。
b. 體外同時結合 IFITM5 和 SOST
確定ANDbody同時與IFITM5和SOST接合的能力，並使用BLI測量IFITM5和SOST的結合親和力，如上所述。
c. ANDbody 中硬化蛋白阻斷活性的體外測定
如上所述，使用TCF/LEF Wnt報導細胞和MC3T3成骨細胞的礦化來確定靶向IFITM5和SOST的ANDbody抑制SOST活性的能力。
d. 抗 IFITM5/SOST ANDbody 的組織特異性結合
使用IHC來評估靶向IFITM5和SOST的ANDbody與骨組織特異性結合並抑制SOST活性的能力，以測試與鼠骨、鼠組織微陣列上的組織的結合（如上所述，用鼠組織代替人組織），並且用抗人IgG1二抗代替抗小鼠二抗。
實例 5 ：結合 CHAD 和 Dickkopf-1 （ DKK1 ）的 ANDbody 的設計
a. DKK1 抗體
針對Dickkopf-1（DKK1）蛋白（huDKK1）的抗體係本技術的示例性效應物靶標。與人IgG1的Fc區融合的人DKK1蛋白（NCBI蛋白登錄號NP_036374，位置T32-H266）藉由類似於上述CHAD方案的免疫產生。免疫和融合瘤生成後，如上所述但針對與全長人和小鼠DKK1（而不是CHAD）結合來篩選殖株。然後藉由有限稀釋選殖進一步純化表現在人和小鼠之間具有交叉反應性的抗DKK1 mAb的陽性殖株。融合瘤在DMEM/2%超低IgG血清中生長，並藉由蛋白G層析法純化mAb。 b. 選擇具有寬範圍 IC 50 的抗 DKK1 抗體
當評估體外阻斷DKK1活性的能力時，選擇具有一系列抑制濃度（IC 50）的抗DKK1抗體，例如＜ 1 nM至1 µM。DKK1阻斷活性藉由β-連環蛋白依賴性Wnt報導基因測定來測量。對於該等測定，使用含有TCF/LEF轉基因報導基因的HEK（人胚胎腎）293細胞株，該報導基因驅動螢光素酶表現以測量Wnt傳訊通路的活化（BPS生物科學公司（BPS Bioscience）目錄號60501）。將35,000個細胞在96孔盤中的100 µl含有10 mM LiCl的培養基中鋪盤過夜。18小時後，用可溶性重組鼠Wnt1（37 ng/mL）（R&D系統公司目錄號9765-WN-010）或人Wnt3a（111.1 ng/mL）（R&D系統公司目錄號5036-WN）與DKK1（1 µg/mL）和抗DKK1抗體的系列稀釋液（10 µg/mL和1 : 3稀釋液）一起處理細胞。37°C 5小時後，細胞在100 µl螢光素酶試劑緩衝液（組分A）中裂解，該緩衝液含有1 µl螢光素酶試劑基質（組分B）（BPS生物科學公司目錄號60690），並添加到孔中。在室溫下輕輕搖動盤15分鐘，並使用SPECTRAMAX® i3x多功能微量盤分析儀評估發光情況。報導細胞的Wnt活化導致螢光素酶活性被DKK1阻斷。
使用MC3T3成骨細胞（ATCC目錄號CRL-2593）進行功能性體外測定。為了評估礦化，將10,000個MC3T3細胞置於24孔盤中並使其達到匯合。添加含有50 µg/mL維生素C、10 mM β-甘油磷酸鹽和20 ng/mL骨成形性蛋白質-2（BMP-2）的礦化培養基。將400 ng/mL的DKK1和抗DKK1抗體的系列稀釋液（10 µg/mL和1 : 3稀釋液）添加到孔中，並每2-3天更換含有相應添加劑的培養基。8天後，洗滌細胞並在10%福馬林中固定10分鐘，用水洗滌3次，並與500 µl 40 mM茜素溶液一起孵育。15分鐘後，用水洗滌細胞3次。對於鈣定量，將500 µl 10%乙酸（v/v）添加到細胞中，在RT下放置30分鐘。刮下細胞並轉移至Eppendorf管中，渦旋30秒，並在85°C下孵育15分鐘。將樣品以20,000 x g離心15分鐘，並將250 μl上清液轉移至另一個Eppendorf管中。將100 μl 10% NH 4OH（v/v）添加到樣品中並混合。使用SPECTRAMAX® i3x多功能微量盤分析儀在405 nm處測量吸光度。
c. CHAD 和 DKK1 ANDbody 的表現、純化和表徵
如上文針對抗CHAD/SOST ANDbody所述表現和純化包含結合CHAD和DKK1的雙特異性抗體的ANDbody。確定靶向CHAD和DKK1的ANDbody同時與CHAD和DKK1接合的能力，並使用BLI測量對CHAD和DKK1的結合親和力，如上所述。如上所述，使用TCF/LEF Wnt報導細胞和MC3T3成骨細胞的礦化來確定靶向CHAD和DKK1的ANDbody抑制DKK1活性的能力。使用IHC來評估靶向CHAD和DKK1的ANDbody與骨組織特異性結合並抑制DKK1活性的能力，以測試與鼠骨、鼠組織微陣列上的組織的結合（如上所述，用鼠組織代替人組織），並且用抗人IgG1二抗代替抗小鼠二抗。
實例 6 ：骨靶向 ANDbody 的藥物動力學和組織分佈
為了分析ANDbody體內分佈，示例性ANDbody（例如抗CHAD/SOST、抗IFITM5/SOST或抗CHAD/DKK1）以及每種親本抗體（針對ANDbody的cFAE使用的抗CHAD、抗IFITM5、抗SOST或抗DKK1）在雌性Balb/c和C57BL/6小鼠中進行定量。
為了定量組織生物分佈，每種抗體和ANDbody以1 mg/kg、3 mg/kg和10 mg/kg IV（尾靜脈）的劑量單獨注射。還注射等體積的鹽水（PBS）作為對照。在注射後12小時、1天、2天、3天、7天和14天的時間點，使用CO 2對小鼠實施安樂死並且組織（包括骨基質、心臟、肺、脾、血液、腎、肝和腸）被加工成勻漿。使用PIERCE™ Rapid Gold BCA蛋白測定套組（賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific），A53225）測量每個樣品中的總蛋白濃度。ELISA測定用於確定含有0.5 mg蛋白質的勻漿中每種ANDbody或抗體的濃度。
為了定量細胞生物分佈，首先根據製造商的說明（賽默飛世爾科技公司，A20186）使用常規方法用Alexa Fluor 647（AF647）單獨標記ANDbody和抗體。
為了確定細胞生物分佈，在注射後12小時、1天、2天、3天、7天和14天的時間點，使用CO 2對小鼠實施安樂死，並根據之前描述之方法將組織（包括骨基質、心臟、肺、脾、血液、腎、肝和腸道）加工成單細胞懸浮液。簡而言之，藉由心臟穿刺將血液收集到EDTA處理的試管中（BD目錄號365974），並收穫其他組織、稱重、在毛玻璃載玻片之間機械分離，並通過70 μm網篩（密理博西格瑪公司，目錄號CLS431751-50EA）過濾製成單細胞懸浮液。脾細胞、全血和肺用氯化銨鉀（ACK）裂解緩衝液（賽默飛世爾科技公司，目錄號A1049201）處理。心臟用膠原酶消化，並根據以前之方法加工成單細胞懸浮液（Covarrubias等人 2019 Am J Physiol Heart Circ Physiol.[美國生理學雜誌-心臟和循環生理學] 317(3):H658-H666）。使用CD8 T細胞（CD3e+ CD8+）、CD4 T細胞（CD3e+ CD4+ Foxp3-）、調節性T細胞（CD4+ CD25+ FOXP3+）、單核細胞/巨噬細胞（CD3e- CD11b+ CD11c-/lo NK1.1− Ly6G− SSClo）、樹突細胞（CD3e- CD11chi）、NK細胞（NK1.1+ CD3e−）和NKT細胞（NK1.1+ CD3e+）的標誌物使用常規方法對免疫細胞進行流動式細胞測量術。還分析了包括上皮細胞（CD326+CD31−CD45−）、內皮細胞（CD326−CD31+CD45−）和造血譜系（CD326−CD31−CD45+）的肺細胞。
為了藉由IVIS量化組織生物分佈，首先按照製造商的說明用NHS-5/6-FAM（賽默飛世爾科技公司，目錄號46409）單獨標記蛋白質（ANDbody和抗體）。如上所述對小鼠施用每種ANDbody或抗體。在注射後12小時、1天、2天、3天、7天和14天的時間點，使用CO 2對小鼠實施安樂死，收穫包括骨、肺、脾、血液、腎、肝和腸在內的組織，稱重並在IVIS®體內光譜成像系統（卡尺生命科學公司（Caliper Life Sciences）；激發，500 nm；發射，540 nm）上成像。使用LIVING IMAGE®軟體（PERKINELMER®）分析圖像。
實例 7 ：骨靶向 ANDbody 的體內效應
a. 在骨質疏鬆症大鼠模型中測試骨靶向抗體
將十六週大的未生殖雌性Sprague Dawley大鼠（Harlan）進行假手術（Sham）或切除卵巢（OVX），並在8週內不進行任何治療，以使骨質減少發生。用一定濃度範圍（例如5、10、20 mg/kg，每週皮下注射）的對照抗體或ANDbody治療OVX大鼠1、2或4個月。記錄體重，並使用雙能X射線吸收測定（DXA）方法（Hologic FAXITRON® DXA x射線櫃）測定麻醉大鼠體內的面積骨礦物質密度（BMD）。每3週採集BMD記錄和血液樣品，持續9週，直至屍檢。屍檢前兩週和4天，給大鼠皮下注射鈣黃綠素（20 mg/kg；西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））。收集腰椎、脛骨和股骨進行進一步分析，包括動態組織形態計量學、微電腦斷層掃描和生物力學分析。
對於骨組織形態計量學分析，使用低速金剛石鋸解剖股骨和腰椎，在異丙醇中脫水，並嵌入甲基丙烯酸甲酯（MMA）中。使用切片機（萊卡公司（Leica），韋茨拉爾，德國）對固化塊進行切片，並在螢光顯微鏡下檢查5 µm切片以追蹤鈣黃綠素標記。使用ImageJ軟體分析圖像。評估的靜態和動態參數係皮質厚度、皮質厚度、骨內膜和骨膜礦化表面/骨表面、以及礦物質沈積和骨形成速率。
屍檢時骨轉換的生化分析可包括評估骨鈣素的血清水平（大鼠骨鈣素ELISA，諾瓦斯生物製品公司（Novus Biologicals），目錄號NBP2-68153）、P1NP（大鼠原膠原1型N末端前胜肽ELISA，諾瓦斯生物製品公司目錄號NBP2-76467）和大鼠TRACP-5b（抗酒石酸酸性磷酸酶5b）ELISA，伊萊布科學公司（Elabscience），目錄號E-EL-R0939）。
對於μCT分析，使用臺式μCT掃描器（GE eXplore Locus Micro CT掃描器）檢查腰椎、股骨頸和骨幹，並使用軟體演算法分析目的區域。
b. 在血清轉移性關節炎模型中測試骨靶向抗體
關節炎血清從10週大的關節炎K/BxN小鼠中收穫。12週齡雄性野生型小鼠在第0、2和6天靜脈內注射150 μL致關節炎血清以及不同濃度（例如2、10和20 mg/kg皮下注射）的ANDbody，誘導關節炎。第14天處死小鼠，將前爪固定在70%乙醇中用於成像。為了進行組織病理學分析，將膝蓋和腳踝固定在4%多聚甲醛中，在15% EDTA中脫鈣，然後石蠟包埋。獲得4 μm膝蓋和腳踝切片用於標準組織病理學分析。捕獲膝關節和腳踝處骨膜骨形成的各個位點的H&E圖像，並計算每個位點的平均面積。該值乘以通過所獲得的總截面的距離以計算每個位點的總體積。每個膝蓋或腳踝的總骨膜骨體積係藉由將所有位點的骨形成體積總計來確定的。如上所述，還使用微型電腦斷層掃描成像來定量骨膜骨形成。
實例 8 ：結合 DMP1 位址的 ANDbody 構築體的產生和表徵
a. 用於軛合的雙特異性ANDbody的設計、表現和純化
為了產生牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）結合位址組以便隨後軛合成雙特異性結構（例如ANDbody構築體），使用聚乙烯亞胺（PEI）以1 : 2質量比的重鏈 : 輕鏈質體（其編碼位址抗DMP1控制的Fab臂交換（cFAE）F405L單株抗體（mAb））瞬時轉染EXPI293F TM（吉博科公司（Gibco））細胞，並根據製造商的說明（37°C，8% CO 2，在振盪平臺上）維持該等細胞。轉染後4-24小時將培養物補料至終濃度為5% v/v吉博科公司料B、1% v/v L-丙胺醯-麩醯胺酸和4 mM丙戊酸。4-7天後，藉由0.22 μm過濾收穫上清液。過濾的上清液藉由在PBS pH 7.4運行緩衝液和0.1 M檸檬酸鈉pH 3.0洗脫緩衝液中平衡的蛋白A親和層析（思拓凡公司（Cytiva）5 mL MABSELECT TMPrismA柱）進行純化。立即用10% v/v 1 M乙酸鈉（pH 6.0）或10% v/v 1 M Tris（pH 8.0）中和洗脫的蛋白質。藉由在PBS pH 7.4中平衡的尺寸排阻層析法進一步純化蛋白質。
為了生成ANDbody構築體的SOST結合效應物組，以便隨後軛合成雙特異性結構（例如ANDbody構築體），生成效應物抗SOST cFAE K409R FC star（H435R、Y436F）mAb構築體以消除與蛋白A的結合。使用PEI用1 : 2質量比的重鏈 : 輕鏈質體瞬時轉染EXPI293F TM細胞，並根據製造商的說明維持（37°C，8% CO 2，在振盪平臺上）。轉染後4-24小時將培養物補料至終濃度為5% v/v吉博科公司料B、1% v/v L-丙胺醯-麩醯胺酸和4 mM丙戊酸。4-7天後，藉由0.22 μm過濾收穫上清液。過濾的上清液藉由在PBS 7.4運行緩衝液和0.1 M甘胺酸pH 2.7洗脫緩衝液中的蛋白G親和層析（思拓凡公司5 mL HITRAP®蛋白G HP柱）純化。立即用10% v/v的1 M Tris pH 7.5中和洗脫的蛋白質。將蛋白質進行緩衝液交換到PBS中進行軛合。
藉由將上述產物以等莫耳比在PBS pH 7.4中與75 mM 2-MEA混合，將抗DMP1和抗SOST mAb軛合成雙特異性ANDbody。將溶液在31°C下孵育5小時，然後將緩衝液交換為PBS以除去所有2-MEA。除去2-MEA後，將溶液在4°C下孵育16小時。使用40 mM乙酸鈉pH 6、500 mM NaCl至100% 40 mM乙酸鈉pH 3、500 mM NaCl的梯度洗脫從溶液中純化雙特異性ANDbody，以將正確軛合的雙特異性ANDbody與親本mAb分離。
b.與靶標的結合的驗證
結合動力學研究係在基於生物層干涉法（BLI）的GATOR® Plus生物感測器上於25°C下在含有10 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mg/ml BSA、0.04% NaN3、0.05% Tween20、pH 7.4（HBS-BNT）的緩衝液中進行的。藉由將抗人Fc BLI生物感測器（小鱷生物公司 - hFC）浸入含有2 µg/mL抗體的孔中90秒來捕獲ANDbody分子（例如，軛合或未軛合的ANDbody）。然後將生物感測器浸沒在含有不同濃度跨一定值範圍的相關抗原的孔中120秒，然後在HBS-BNT緩衝液中解離300秒。在每個步驟之間，所有感測器均在HBS-BNT緩衝液中清洗。
為了補償基線的任何漂移，將ANDbody捕獲的生物感測器浸入含有HBS-BNT緩衝液的孔中，並從抗原結合獲得的原始數據中減去觀察到的原始數據。隨後使用Langmuir 1 : 1結合模型對該單一參考扣除數據進行全域擬合，並確定了結合動力學參數。
實例 9 ：結合 DMP1 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的設計
a. 接種疫苗以產生抗 DMP1 抗體
如實例1中針對CHAD所述產生與牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）結合的抗體，不同的是人DMP1的全長序列（蛋白質登錄號NP_004398.1）與人IgG1融合並且用於免疫。人和等效小鼠蛋白質序列用於鑒定抗DMP1抗體。
b. 選擇惰性抗 DMP1 抗體
如上所述產生的抗DMP1融合瘤殖株基於其不能阻斷MC3T3成骨細胞中的礦化而被進一步評估，如上所述（參見例如實例3(b)）。
選擇不干擾礦化的抗DMP1抗體用於ANDbody生成。
c. 鑒定與小鼠骨特異性結合的抗 DMP1 抗體
如上所述，使用人骨組織和組織微陣列的IHC分析來評估抗DMP1抗體的結合強度和特異性（參見例如實例1(c)）。
d. 抗 SOST 靶向組
如上文實例1(d)中所述，將抗DMP1抗體與抗SOST靶向組配對，以產生結合DMP1位址和SOST靶標的ANDbody。
實例 10 ：骨細胞外基質位址 DMP1 的驗證
使用基於過氧化物酶的色原檢測系統的免疫組織化學方法被用來評估作為骨位址的DMP1，以及表徵抗DMP1抗體的靶向特異性（圖5）。
使用標準組織學顯微鏡載玻片上的5微米（μm）福馬林固定石蠟包埋（FFPE）脫鈣小鼠股骨切片，測試抗DMP1鼠IgG1k單株抗體Ab349與骨組織的結合。標準脫蠟和再水化後，將樣品浸入pH 9的過量Tris EDTA溶液（載體實驗室（Vector Laboratories #H-3301-250）中，並在37°C水浴中孵育過夜，作為對典型熱誘導表位修復的溫和修飾（HIER）。第二天，用針對內源性組織過氧化物酶的商業封閉試劑（BLOXALL®，載體實驗室#SP-6000-100）處理樣品。為了防止商業辣根過氧化物酶（HRP）聚合物軛合的抗鼠IgG檢測試劑與內源性鼠IgG的非特異性結合，隨後用另外的封閉試劑（封閉+檢測試劑：小鼠對小鼠聚合物IHC套組，艾博抗公司#ab269452）處理組織切片。用PBS洗滌數次後，將樣品用20 μg/ml的抗DMP1抗體在室溫下處理2小時，然後用PBS洗滌幾次。使用小鼠對小鼠聚合物IHC套組（艾博抗公司#ab269452）開發了依賴於結合檢測試劑/抗DMP1抗體/骨DMP1複合物存在的棕色顯色色素。藉由將訊號強度與未用一抗孵育的對照相鄰載玻片的訊號強度進行比較（約兩分鐘）來確定顯色時間。藉由用蒸餾水快速淬滅基質混合物並最終在室溫下在過量的蒸餾水中浸沒5分鐘來停止顯色。所有載玻片的顯色持續時間均受到嚴格控制，以減少載玻片之間的變異性。最後，使用載體蘇木精QS（載體實驗室#H-3404）對切片進行複染，並進行非水封片以進行明場成像。
圖5顯示了使用抗DMP1單株抗體（mAb）染色的小鼠股骨切片中的骨髓和小梁區域（股骨「帽」）的縱向介面，如與對照相比。抗DMP1 mAb在鼠骨組織中表現出很強的免疫反應性。
實例 11 ：結合 DMP1 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的表徵
a. ANDbody 中硬化蛋白阻斷活性的體外測定
如上所述，使用TCF/LEF Wnt報導細胞和MC3T3成骨細胞的礦化來確定靶向DMP1和SOST的ANDbody抑制SOST活性的能力（參見例如實例1(e)）。
b. 抗 DMP1/SOST ANDbody 的組織特異性結合
使用IHC來評估靶向DMP1和SOST的ANDbody與骨組織特異性結合並抑制SOST活性的能力，以測試與鼠骨、鼠組織微陣列上的組織的結合（如上所述，用鼠組織代替人組織），並且用抗人IgG1二抗代替抗小鼠二抗，如上所述（參見例如實例1(c)）。
實例 12 ：結合 IBSP 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的設計
a. 接種疫苗以產生抗 IBSP 抗體
如實例1中針對CHAD所述產生與整合素骨涎蛋白（IBSP）結合的抗體，不同的是人IBSP的全長序列（蛋白質登錄號NP_004958.2）與人IgG1融合並且用於免疫。人和等效小鼠蛋白質序列用於鑒定IBSP抗體。
b. 選擇惰性抗 IBSP 抗體
如上所述產生的抗IBSP融合瘤殖株基於其不能阻斷MC3T3成骨細胞中的礦化而被進一步評估，如上所述（參見例如實例3(b)）。
選擇不干擾礦化的抗IBSP抗體用於ANDbody中。
c. 鑒定與小鼠骨特異性結合的抗 IBSP 抗體
如上所述，使用人骨組織和組織微陣列的IHC分析來評估抗IBSP抗體的結合強度和特異性（參見例如實例1(c)）。
實例 13 ：結合 IBSP 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的產生和表徵
a. 將 ANDbody 作為雙特異性抗體進行表現和純化
包含結合IBSP和SOST的雙特異性抗體的ANDbody如上所述被表現和純化（參見例如實例2A和8A）。
b. 體外同時結合 IBSP 和 SOST
確定ANDbody同時與IBSP和SOST接合的能力，並使用BLI測量IBSP和SOST的結合親和力，如上所述（參見例如實例8B）。
c. ANDbody 中硬化蛋白阻斷活性的體外測定
如上所述，使用TCF/LEF Wnt報導細胞和MC3T3成骨細胞的礦化來確定靶向IBSP和SOST的ANDbody抑制SOST活性的能力（參見例如實例1(e)）。
d. 抗 IBSP/SOST ANDbody 的組織特異性結合
使用IHC來評估靶向IBSP和SOST的ANDbody與骨組織特異性結合並抑制SOST活性的能力，以測試與鼠骨、鼠組織微陣列上的組織的結合（如上所述，用鼠組織代替人組織），並且用抗人IgG1二抗代替抗小鼠二抗，如上所述（參見例如實例1(c)）。
實例 14 ：結合 TPBG 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的設計
a. 接種疫苗以產生抗 TPBG 抗體
如針對CHAD的實例1中所述產生與滋養層糖蛋白（TPBG）結合的抗體，不同之處在於人TPBG的細胞外結構域（NCBI蛋白登錄號NP_001363851.1，位置M1-H355）與人IgG1融合並用於免疫。人和等效小鼠蛋白質序列用於鑒定抗TPBG抗體。
b. 選擇惰性抗 TPBG 抗體
如上所述產生的抗TPBG融合瘤殖株基於其不能阻斷成骨細胞株中的礦化而被進一步評估，如上所述（參見例如實例3(b)）。
選擇不干擾礦化或成骨標誌物上調的抗TPBG抗體用於ANDbody中。
c. 鑒定與小鼠骨特異性結合的抗 TPBG 抗體
如上所述，使用人骨組織和組織微陣列的IHC分析來評估抗TPBG抗體的結合強度和特異性（參見例如實例1(c)）。
實例 15 ：結合細胞表面 TPBG 的抗 TPBG 抗體的評估
識別人和小鼠TPBG的市售抗體作為候選ANDbody定位器（位址靶標結合結構域）在細胞結合測定中並使用原代成骨細胞株MC3T3進行了測試。
抗TPBG抗體MA5-24228（賽默飛世爾科技公司）分別在HEK293T細胞和人MC3T3成骨細胞樣細胞株中使用人和小鼠瞬時過表現的流式細胞儀和免疫螢光進一步針對活細胞結合進行表徵。
全長人和小鼠TPBG在HEK 293T細胞中瞬時表現，然後藉由流動式細胞測量術定量抗TPBG抗體與TPBG的結合。編碼人和小鼠TPBG序列的公共結構域共有序列的定制表現質體係基於其商業表現載體從金斯瑞公司（Genscript）獲得的，該表現載體在與插入的TPBG序列相同的開放閱讀框中包含C末端細胞內親和表位（FLAG標籤）。根據製造商的建議（英傑公司（Invitrogen）#L3000001），藉由與LIPOFECTAMINE TM3000複合，將人或小鼠TPBG質體轉染到接種在96孔盤中的健康293T細胞中。推定的TPBG表現48小時後，使用非破壞性的基於EDTA的VERSENE TM細胞解離試劑（吉博科公司）輕輕收穫細胞，並用確定系列稀釋範圍的選定抗TPBG商品單株或多株抗體或抗FLAG單株抗體進行流動式細胞測量術染色，以代表收穫時存在的重組TPBG-FLAG蛋白的總量。與一抗孵育後，使用螢光團軛合的抗體抗小鼠AF647對細胞進行染色。對於FLAG標籤序列的細胞內染色，根據製造商的方案使用PERM/WASH TM緩衝液（BD生物科學公司（BD Bioscience）#544723）對細胞進行透化，然後使用兔抗FLAG-AF647一抗進行染色。染色後，洗滌細胞，固定在1% PFA中，並藉由流動式細胞測量術進行分析。ZOMBIE AQUA TM用於作為活性染料。使用FlowJo軟體藉由FACS分析獲得活細胞（非死細胞）、單細胞（雙重判別）中每個抗體濃度下所評估抗體的中位螢光強度，以生成劑量-應答曲線和EC 50值。
如圖6所示，抗TPBG單株抗體（mAb）MA5-24228與鼠膜結合的TPBG和人膜結合的TPBG結合。未轉染的細胞染色並單獨用二抗孵育作為陰性對照。小鼠和人TPBG轉染的細胞中FLAG的表現水平相當，有利於比較抗體與小鼠和人TPBG的結合。
為了評估抗TPBG抗體MA5-24228與內源TPBG的活細胞結合，使用成骨細胞MC3T3-E1亞殖株4細胞株（ATCC #CRL-2593）進行免疫螢光分析。將6000個細胞鋪盤於96孔玻璃底孔中的100 µl完全培養基中培養9天。將細胞與抗TPBG MA5-24228一抗在冰上孵育，洗滌並與二抗山羊抗小鼠AF647（A21235）在冰上孵育，洗滌並在1% PFA中輕輕固定。使用EVOS TMM7000成像系統獲得定性圖像。如圖7所示，抗TPBG抗體MA5-24228與細胞的細胞表面結合。
實例 16 ：結合 TPBG 位址和 SOST 靶標的 ANDbody 的產生和表徵
a. 將 ANDbody 作為雙特異性抗體進行表現和純化
包含結合TPBG和SOST的雙特異性抗體的ANDbody如上所述被表現和純化（參見例如實例2A和8A）。
b. 體外同時結合 TPBG 和 SOST
確定ANDbody同時與TPBG和SOST接合的能力，並使用BLI測量TPBG和SOST的結合親和力，如上所述（參見例如實例8B）。
c. ANDbody 中硬化蛋白阻斷活性的體外測定
如上所述，使用TCF/LEF Wnt報導細胞和MC3T3成骨細胞的礦化來確定靶向TPBG和SOST的ANDbody抑制SOST活性的能力（參見例如實例1(e)）。
d. 抗 TPBG/SOST ANDbody 的組織特異性結合
使用IHC來評估靶向TPBG和SOST的ANDbody與骨組織特異性結合並抑制SOST活性的能力，以測試與鼠骨、鼠組織微陣列上的組織的結合（如上所述，用鼠組織代替人組織），並且用抗人IgG1二抗代替抗小鼠二抗（參見例如實例1(c)）。
實例 17 ：結合靶 SOST 的阿侖膦酸鹽軛合的 ANDbody 分子的生成
為了產生用於與連接子軛合的小分子軛合的抗體，使用PEI用質量比為2 : 3的S239C FC變體重鏈 : 輕鏈質體瞬時轉染CHO細胞，並根據製造商的說明維持（37°C，5% CO 2，在振盪平臺上）。轉染後4-24小時將培養物補料至終濃度為5% v/v吉博科公司料B、1% v/v L-丙胺醯-麩醯胺酸和4 mM丙戊酸。4-7天後，藉由0.22 μm過濾收穫上清液。過濾的上清液藉由在PBS pH 7.4運行緩衝液和0.1 M檸檬酸鈉pH 3.0洗脫緩衝液中平衡的蛋白A親和層析（思拓凡公司（Cytiva）5 mL MABSELECT TMPrismA柱）進行純化。立即用10% v/v 1 M乙酸鈉（pH 6.0）中和洗脫的蛋白質。藉由在20 mM His-HAC、150 mM NaCl、pH 5.5的軛合配製緩衝液中平衡的尺寸排阻層析進一步純化蛋白質。
結合SOST和DKK1靶標的抗體構築體藉由兩步過程與具有不同骨礦物質羥基磷灰石結合效力的雙膦酸鹽分子（包括阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽和唑來膦酸鹽）軛合，從而生成ANDbody。
為了生成BIS-L1（阿侖膦酸鹽分子），首先，藉由硫醇化學將BCN-PEG4-馬來醯亞胺在S239C位點軛合抗SOST mAb（羅莫單株抗體，包含S239C胺基酸取代突變）。然後藉由點擊化學將雙膦酸鹽分子軛合至該位點，生成最終藥物（包含BIS-L1的ANDbody）（圖8）。
a. 雙膦酸鹽軛合的 ANDbody 的表徵（純度、藥物 - 抗體比）
為了確定抗體-藥物軛合物（ADC）材料（M5-D7：包含與阿侖膦酸鹽偶聯的抗SOST抗體的ANDbody）的聚集狀態，將20 µL樣品藉由HPLC注射到5/150 SUPERDEX TM增加型200 pg柱（思拓凡公司）上。用1.2柱體積配製緩衝液洗滌柱，以確定ADC和聚集體的洗脫時間。
為了確定軛合的ANDbody材料的藥物-抗體比（DAR）是否在2.0 ± 0.2的目標範圍內，採用疏水相互作用層析（HIC）和液相層析-質譜（LC-MS）。對於LC-MS，使用50 mmol/L DTT以1 mg/mL濃度製備50 µg ADC，並在37°C下孵育以還原ANDbody材料。將樣品注射到用流動相緩衝液A（100% HPLC級水，含0.1%甲酸和0.025%三氟乙酸）平衡的PLRP-S 1000Å，5um，2.1 × 50 mm（安捷倫公司）柱上，並在70°C下用27%-49%-95%梯度的流動相緩衝液B（100%乙腈，含0.1%甲酸和0.025%三氟乙酸）洗滌。對LC數據進行解卷積，以計算每個峰的藥物-抗體比（DAR）。
為了藉由HIC確定DAR，將樣品稀釋到HIC緩衝液A（25 mM磷酸鉀pH 7、1.5 M硫酸銨）中，然後載入到HIC柱（HIC柱，TSKgel丁基NPR，4.8 mm x 3.5 cm）上。用0-100% HIC緩衝液B（25 mM磷酸鉀pH 7）以1 mL/分鐘的流速洗滌柱12分鐘。針對親本ANDbody HIC洗脫分析洗脫峰以確定DAR。
為了確定內毒素水平，按照製造商的說明，在Nexgen多盒PTS系統（查理斯河實驗室（Charles River Laboratories））的每個盒孔中裝載25 µL ANDbody和ADC材料。
結果如表4所示。抗SOST抗體和阿侖膦酸鹽成功軛合生成ANDbody：DAR在可接受的範圍內，聚集狀態沒有明顯變化，內毒素水平足夠低，足以進行體內實驗。
[ 表 4] ： ANDbody 表徵數據
抗體組分 軛合的雙膦酸鹽 組分 ANDbody（ADC） 濃度 （mg/mL） 還原的MS-DAR 無藥物 （%mol/mol） ASEC （% POI） 內毒素
M5：抗SOST mAb（包含S239C胺基酸取代突變的羅莫單株抗體） 阿侖膦酸鹽（BIS-L1） M5-D7：與阿侖膦酸鹽軛合的抗SOST抗體M5 2.59 1.92 ＜ 2（＜ 0.266 µM） 98.96% ＜ 0.093
b. BLI 中阿侖膦酸鹽軛合的 ANDbody 分子與靶蛋白結合的動力學測量
M5-D7 ANDbody和對照抗體的體外表徵藉由BLI進行，如前所述（表5）。親本抗體PRO136（人源化抗SOST mAb）和PRO236（人源化前PRO136的鼠親本版本）用於作為對照抗體。評估分子與人SOST（hSOST）和小鼠SOST（mSOST）的結合。阿侖膦酸鹽的軛合不會破壞或改變親本抗體的動力學參數。
[ 表 5] ：抗 SOST 雙膦酸鹽軛合物的動力學參數
測試的抗體 測試的抗原 kon（1/Ms） koff（1/s） KD（M）
M5-D7 hSOST 2.91E+06 3.83E-04 1.32E-10
M5-D7 mSOST 1.51E+06 1.20E-03 7.95E-10
PRO136 hSOST 4.15E+06 2.19E-04 5.28E-11
PRO136 mSOST 2.07E+06 6.45E-04 3.12E-10
PRO236 hSOST 3.23E+06 2.74E-04 8.49E-11
PRO236 mSOST 5.54E+06 4.93E-03 8.90E-10
PRO236 rSOST 3.61E+06 9.43E-03 2.61E-09
實例 18 ：雙膦酸鹽軛合的抗 SOST ANDbody 在基於細胞的測定中阻斷硬化蛋白
對雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（M5-D7；在本文中也稱為抗-SOST-BIS-L1(2)，其中「2」表示每個抗-SOST mAb分子兩個阿侖膦酸鹽分子的藥物-抗體比）在基於細胞的測定中使用商業HEK293報導細胞株（BPS生物科學公司（BPS Biosciences）#60501）測試其在體外阻斷硬化蛋白和恢復Wnt1傳訊的能力 。在測試之前，Wnt1（R&D系統公司#R&D 9765-WN-010）的EC 50濃度和SOST（阿克若生物系統公司（Acro Biosystems）#HST-H5245）的IC 50相對於Wnt1 EC 50係根據供應商推薦的測定方案確定的。這包括接種並用10 mM LiCl處理每個96孔盤35,000個細胞，第二天Wnt1刺激6小時以誘導螢光素酶表現，然後進行終點細胞裂解和發光定量（ONE-STEP TM螢光素酶測定系統，BPS生物科學公司#60690-2）。測定校準後，藉由添加預孵育步驟（其中ANDbody與SOST的IC 50濃度混合，然後與Wnt1 EC 50混合，並刺激報導細胞6小時），使用增加量的雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（M5-D7）以相同的測定形式進行劑量-應答分析。結果表明，與未軛合的抗SOST親本mAb相比，雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody保留了以相同效力阻斷SOST的能力（圖9）。
實例 19 ：阿侖膦酸鹽偶聯的 ANDbody 分子與羥基磷灰石的體外快速結合
在結合測定中使用羥基磷灰石（Hap）晶體（骨組織的礦物質組分）評估雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（M5-D7）的骨歸巢能力。
將生理相關濃度（約1 nM）的抗SOST（PRO136）或抗SOST-BIS-L1(2)（M5-D7）與過量的羥基磷灰石粉末（西格瑪公司900204，平均粒徑，5 µm）一起孵育以模擬結合體內骨基質的能力。將樣品以5 ml的起始總體積在5 ml蛋白質LoBind管（EPPENDORF®）中混合，並在乾燥的37°C培養箱中保持旋轉。定期地，藉由使用0.2微米旋轉過濾器從具有結合的hIgG的羥基磷灰石晶體分離來收集溶液中剩餘的未結合的mAb，並在4°C下儲存直至收集了所有時間點。藉由夾心ELISA經由測量溶液中剩餘的游離（未結合的）人IgG，並與在沒有羥基磷灰石的情況下孵育hIgG的溶液進行比較，計算隨時間變化的mAb結合百分比。使用相同的PRO136 hIgG抗體（捕獲和檢測抗體：傑克遜免疫研究公司（Jackson ImmunoResearch）#109-005-170、BIO-RAD #STAR127P，TMB基質：賽默飛世爾科技公司#34028）藉由標準曲線確定精確濃度。與羥基磷灰石一起孵育2小時內，抗SOST-BIS-L1(2)從溶液中完全耗盡，表明與未軛合的抗SOST（PRO136）抗體相比，雙膦酸鹽對骨礦物質具有高親和力（圖10）。
實例 20. 骨靶向 ANDbody 的藥物動力學和分佈
向小鼠皮下注射（SQ）20毫克/千克體重（mpk）的雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（M5-D7）、未軛合的抗SOST抗體或對照抗RSV抗體。在第1、3和8天收集股骨並固定、脫鈣並包埋在石蠟塊中。股骨切片使用抗人IgG染色，並使用VECTOR®紅基質（載體實驗室）顯色。使用EVOS TMM7000i細胞成像系統對切片進行成像，並使用HALO®圖像分析平臺進行分析。雙膦酸鹽軛合導致骨皮質中的顯著積累（即骨區室中的富集），這在第1天很容易觀察到，並且與對照抗體分子相比隨著時間的推移而增加（圖11A和11B）。
實例 21 ：骨靶向 ANDbody 的體內效應：投與骨靶向 ANDbody 構築體後小鼠中的 P1NP 變化
向小鼠注射（SQ）20 mpk的雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（M5-D7）、未軛合的抗SOST抗體（PRO136）或對照抗RSV抗體（PRO022）。在第1、3和8天獲取血清樣品，並使用ELISA（艾博抗公司# ab210579）評估骨轉換標誌物1型前膠原N末端前胜肽（P1NP）的血清水平。使用雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody以與未軛合的抗SOST抗體相似的速率觀察到P1NP水平的增加，證明了M5-D7 ANDbody構築體的功效（圖12）。
實例 22 ：設計結合 Dickkopf-1 （ DKK1 ）和 SOST 的 ANDbody 構築體，作為與靶向羥基磷灰石位址的雙磷酸鹽骨定位器軛合的雙特異性致動器
a. 抗 DKK1 和抗 DKK1 抗 SOST 雙特異性抗體構築體的生成
利用本文提供的方案生成抗DKK1抗體構築體和抗DKK1抗SOST雙特異性抗體。
b. 與雙膦酸鹽軛合的抗 DKK1 和抗 DKK1 抗 SOST 雙特異性抗體構築體的生成
將抗DKK1抗體和抗DKK1抗SOST雙特異性抗體構築體軛合至如上所述之雙膦酸鹽分子（參見例如實例17），從而生成 (i) 包含以下的ANDbody：與雙膦酸鹽分子軛合的抗DKK1抗體；和 (ii) ANDbody，其包含與雙膦酸鹽分子軛合的抗DKK1抗SOST雙特異性抗體。
c. 抗 DKK1 抗 SOST 雙特異性抗體構築體的體外表徵
進行抗 DKK1 抗體和抗 DKK1 抗 SOST 雙特異性抗體的體外表徵（表6）。PRO136和PRO236如前所述合成，係對照抗體。評估分子與人DKK1（hDKK1）和人SOST（hSOST）的結合。
[ 表 6] ：抗 DKK1 mAb 和抗 DKK1 抗 SOST 雙特異性抗體的動力學參數
測試的抗體 測試的抗原 kon（1/Ms） koff（1/s） KD（M）
PRO243（抗DKK1） hDKK1 6.83E+05 1.00E-04 1.46E-10
PRO244（抗DKK1） hDKK1 5.94E+05 1.00E-04 1.68E-10
PRO243 hSOST 無結合 無結合 無結合
PRO244 hSOST 1.89E+06 4.62E-04 2.45E-10
PRO396（抗DKK1 x 抗SOST） hDKK1 2.72E+06 1.00E-04 3.68E-11
PRO397（抗DKK1 x 抗SOST） hDKK1 7.26E+05 2.26E-04 3.12E-10
PRO396 hSOST 2.40E+06 3.76E-04 1.56E-10
PRO397 hSOST 1.61E+06 7.20E-04 4.48E-10
實例 23 ：在體外基於細胞的測定中評估抗 DKK1 和抗 DKK1 抗 SOST ANDbody
如上所述，使用HEK293T細胞，在體外基於細胞的測定中測試純化的ANDbody構築體、mAb和雙特異性抗體阻斷DKK1功能的能力，參見例如（實例1(e)）。
VII. 其他實施方式
本文描述的技術的一些實施方式可以根據以下編號的實施方式中的任何一個來定義：
1.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊。
2.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中相對於缺少第二結合位點的參考大分子的定位，該大分子對非靶組織或細胞的定位顯著減少。
3.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中相對於缺少該第二結合位點的參考大分子的定位，該大分子對該骨組織或骨細胞的定位顯著增加。
4.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中在投與後1天至7天之間的時間點在該骨組織或骨細胞處檢測到投與給受試者的該大分子的至少25%。
5.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中該第一結合位點對該效應物靶標的親和力低於該第二結合位點對該位址靶標的親和力。
6.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中該第一結合位點對該效應物靶標的親合力低於該第二結合位點對該位址靶標的親合力。
7.     一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該靶組織或細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並且其中相對於缺少該第二結合位點的參考大分子，該骨組織或細胞處的該第一結合位點的效力顯著增加。
8.     如實施方式1-7中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點對該效應物靶標具有低親和力。
9.     如實施方式1-7中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點對該效應物靶標具有低親合力。
10.   如實施方式1-4和6-9中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點對該效應物靶標的親和力低於該第二結合位點對該位址靶標的親和力。
11.   如實施方式1-10中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點對該效應物靶標的親合力低於該第二結合位點對該位址靶標的親合力。
12.   如實施方式1-11中任一項所述之大分子，其中： (a) 該第一結合位點對該效應物靶標的Kd高於該第二結合位點對該位址靶標的Kd； (b) 該第一結合位點對該效應物靶標的EC 50高於該第二結合位點對該位址靶標的EC 50；或 (c) 該第一結合位點對該效應物靶標的IC 50高於該第二結合位點對該位址靶標的IC 50。
13.   如實施方式1-12中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點對該效應物靶標的親和力比該第二結合位點對該位址靶標的親和力小至少約2倍、至少約5倍或至少約10倍。
14.   如實施方式1-13中任一項所述之大分子，其中該第二結合位點對該位址靶標的親和力具有大於約1 nM、大於約2 nM或大於約50 nm的Kd。
15.   如實施方式1-14中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標係蛋白質、脂質或糖。
16.   如實施方式1-15中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標係細胞膜相關聯靶標。
17.   如實施方式15或16所述之大分子，其中該效應物靶標係蛋白質。
18.   如實施方式17所述之大分子，其中該效應物靶標係分泌型蛋白。
19.   如實施方式1-18中任一項所述之大分子，其中該大分子促效該效應物靶標。
20.   如實施方式1-18中任一項所述之大分子，其中該大分子拮抗該效應物靶標。
21.   如實施方式1-20中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係蛋白質、脂質或糖。
22.   如實施方式21所述之大分子，其中該位址靶標係蛋白質。
23.   如實施方式17-22中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標或該位址靶標的表現係編碼該效應物靶標或該位址靶標的RNA序列的表現。
24.   如實施方式23所述之大分子，其中藉由使用RNA序列數據集來評估該效應物靶標或該位址靶標的表現水平。
25.   如實施方式24所述之大分子，其中該RNA序列數據集係基因型-組織表現（GTEx）數據集或人蛋白質圖譜（HPA）數據集。
26.   如實施方式22所述之大分子，其中該效應物靶標或該位址靶標的表現係蛋白質表現。
27.   如實施方式1-26中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標在該受試者中全身表現。
28.   如實施方式1-26中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標在該受試者中區域表現。
29.   如實施方式1-26中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標在該受試者中局部表現。
30.   如實施方式1-29中任一項所述之大分子，其中該位址靶標在該受試者中區域表現。
31.   如實施方式1-29中任一項所述之大分子，其中該位址靶標在該受試者中局部表現。
32.   如實施方式1-29中任一項所述之大分子，其中該位址靶標的表現限於該受試者中的細胞類型。
33.   如實施方式1-32中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係可溶性蛋白或細胞外基質（ECM）相關聯蛋白並且不以可檢測的量存在於細胞表面上。
34.   如實施方式33所述之大分子，其中該位址靶標在該ECM中表現並且在該受試者的其他地方不以可檢測的量存在。
35.   如實施方式1-34中任一項所述之大分子，其中該位址靶標僅由該受試者中的處於特定細胞狀態的細胞表現。
36.   如實施方式1-35中任一項所述之大分子，其中該位址靶標僅由該受試者中的處於疾病狀態的細胞表現。
37.   如實施方式1-36中任一項所述之大分子，其中該位址靶標不在該第二結合位點與該效應物靶標的結合對該受試者有害的組織中表現。
38.   如實施方式1-37中任一項所述之大分子，其中該位址靶標的結合位點不以可檢測的量與該位址靶標的天然配體的結合位點結合。
39.   如實施方式1-38中任一項所述之大分子，其中該位址靶標的表現在骨組織或骨細胞中顯著高於在任何其他組織或細胞類型中。
40.   如實施方式1-39中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標和位址靶標位於相同細胞上。
41.   如實施方式1-39中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標和位址靶標位於不同細胞上。
42.   如實施方式41所述之大分子，其中該效應物靶標和位址靶標位於相同細胞類型的不同細胞上。
43.   如實施方式41所述之大分子，其中該效應物靶標和位址靶標位於不同細胞類型的不同細胞上。
44.   如實施方式40-43中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標和位址靶標位於該受試者中彼此相距100 nm以內的不同細胞上。
45.   如實施方式40-43中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標或該位址靶標存在於細胞表面上。
46.   如實施方式1-45中任一項所述之大分子，其中該大分子係DNA多核苷酸。
47.   如實施方式1-45中任一項所述之大分子，其中該大分子包含RNA或RNA-多胜肽軛合物。
48.   如實施方式1-45和47中任一項所述之大分子，其中該大分子包含多胜肽。
49.   如實施方式1-45中任一項所述之大分子，其中該大分子係多胜肽。
50.   如實施方式48或49所述之大分子，其中該多胜肽係抗體或其抗原結合片段。
51.   如實施方式50所述之大分子，其中該第一結合位點和該第二結合位點各自包含VH和/或VL。
52.   如實施方式51所述之大分子，其中該大分子係抗體，其包含對該受試者中的該效應物靶標特異性的第一結合位點和對該位址靶標特異性的第二結合位點。
53.   如實施方式51或52所述之大分子，其中該大分子係不對稱抗體或對稱抗體。
54.   如實施方式50-53中任一項所述之大分子，其中該抗體或其抗原結合片段包含scFv、BsIgG、BsAb片段、BiTE、雙親和力重定向蛋白（DART）、串聯雙抗體（TandAb）、雙抗體、Fab2、di-scFv、化學連接的F(ab’)2、帶有2、3或4個不同的抗原結合位點的Ig分子、DVI-IgG四合一、ImmTac、HSAbody、IgG-IgG、Cov-X-Body、scFv1-PEG-scFv 2、附加的IgG、DVD-IgG、親和體、affilin、affimer、affitin、α體（alphabody）、抗運載蛋白（anticalin）、親和多聚體（avimer）、DARPin、Fynomer、單體、nanoCLAMP、bis-Fab、Fv、Fab、Fab'-SH、線性抗體、scFv、僅具有重鏈的抗體（Humabody）、ScFab、IgG抗體片段、單鏈可變區抗體、單結構域重鏈抗體、雙特異性三體、BiKE、CrossMAb、dsDb、scDb、串聯dAb/VHH、三重dAb VHH、四價dAb/VHH、Fab-scFv、Fab-Fv、或DART-Fc、纖維連接蛋（adnectin）、庫尼茨型抑制劑（Kunitz-type inhibitor）、或受體誘餌。
55.   如實施方式48所述之大分子，其中該多胜肽係該效應物靶標的配體或該位址靶標的配體。
56.   如實施方式55所述之大分子，其中該配體係天然配體、經修飾配體或合成配體。
57.   如實施方式55或56所述之大分子，其中該效應物靶標或位址靶標係受體並且該多胜肽係其配體。
58.   如實施方式55-57中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段並且該第二結合位點包含該位址靶標的配體。
59.   如實施方式55-57中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含該效應物靶標的配體並且該第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
60.   如實施方式1-45和48-59中任一項所述之大分子，其中該第一和第二結合位點的胺基酸序列至少約10%相同、至少約20%相同、至少約30%相同、至少約40%相同、至少約50%相同，至少約60%相同或至少約70%相同。
61.   如實施方式1-48中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段，並且該第二結合位點包含結合該位址靶標的小分子。
62.   如實施方式1-48中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含結合該效應物靶標的小分子，並且該第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
63.   如實施方式1-62中任一項所述之大分子，其中該位址靶標具有高於約0.4、約0.5、約0.57、約0.65、約0.7、約0.85、約0.90或約0.95的基尼係數。
64.   如實施方式1-63中任一項所述之大分子，其中該位址靶標具有高於約0.67、約0.75、約0.8、約0.85、約0.90或約0.95的Tau係數。
65.   如實施方式1-64中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標具有低於約0.25、約0.20或約0.15的基尼係數。
66.   如實施方式1-65中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標具有低於約0.25、約0.20或約0.15的Tau係數。
67.   如實施方式1-66中任一項所述之大分子，其進一步包含第三結合位點。
68.   如實施方式67所述之大分子，其中該第三結合位點與該第一結合位點相同。
69.   如實施方式67所述之大分子，其中該第三結合位點與該第二結合位點相同。
70.   如實施方式1-69中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點和第二結合位點在該大分子中直接彼此連接。
71.   如實施方式1-70中任一項所述之大分子，其中該大分子中的第一結合位點和第二結合位點藉由穩定結構域連接。
72.   如實施方式1-71中任一項所述之大分子，其中該位址靶標由選自由表2中列舉的基因組成之群組的基因編碼。
73.   如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係軟骨黏附素（CHAD）。
74.   如實施方式73所述之大分子，其中該第二結合位點係抗CHAD抗體或其抗原結合片段。
75.   如實施方式74所述之大分子，其中該抗CHAD抗體或其抗原結合片段基本上不阻斷軟骨細胞α2β1整合素依賴性黏附。
76.   如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）。
77.   如實施方式76所述之大分子，其中該第二結合位點係抗DMP1抗體或其抗原結合片段。
78.   如實施方式77所述之大分子，其中該抗DMP1抗體或其抗原結合片段基本上不阻斷成骨細胞的礦化。
79.   如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係骨涎蛋白（IBSP）。
80.   如實施方式79所述之大分子，其中該第二結合位點係抗IBSP抗體或其抗原結合片段。
81.   如實施方式80所述之大分子，其中該抗IBSP抗體或其抗原結合片段基本上不阻斷成骨細胞的礦化。
82.   如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係滋養層糖蛋白（TPBG）。
83.   如實施方式82所述之大分子，其中該第二結合位點係抗TPBG抗體或其抗原結合片段。
84.   如實施方式83所述之大分子，其中該抗TPBG抗體或其抗原結合片段基本上不阻斷成骨細胞的礦化。
85.   如實施方式1-72中任一項所述之高分子，其中該位址靶標係羥基磷灰石。
86.   如實施方式85所述之大分子，其中該第二結合位點係雙膦酸鹽，視需要其中雙膦酸鹽係阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽。
87.   如實施方式1-86中任一項所述之大分子，其中該位址靶標係干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）。
88.   如實施方式87所述之大分子，其中該第二結合位點係抗IFITM5抗體或其抗原結合片段。
89.   如實施方式88所述之大分子，其中該抗IFITM5抗體或其抗原結合片段基本上不干擾一個或多個成骨相關基因的表現。
90.   如實施方式89所述之大分子，其中該一個或多個成骨相關基因包括Runx2、ALP和OCN中的一個或多個。
91.   如實施方式87-90中任一項所述之大分子，其中該抗IFITM5抗體或其抗原結合片段基本上不阻斷成骨細胞的礦化。
92.   如實施方式1-91中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標係硬化蛋白（SOST）。
93.   如實施方式92所述之大分子，其中該第一結合位點係抗SOST抗體或其抗原結合片段。
94.   如實施方式92所述之大分子，其中該第一結合位點包含SOST抑制劑。
95.   如實施方式94所述之大分子，其中該SOST抑制劑係羅莫單株抗體、布索組單株抗體、瑟蘇單株抗體或SHR-1222或其抗原結合片段。
96.   如實施方式1-86中任一項所述之大分子，其中該效應物靶標係dickkopf-1（DKK1）。
97.   如實施方式96所述之大分子，其中該第一結合位點係抗DKK1抗體或其抗原結合片段。
98.   如實施方式96或97所述之大分子，其中該第一結合位點包含DKK1抑制劑。
99.   如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含核因子κ-β配體受體活化劑（RANKL）抑制劑。
100. 如實施方式99所述之大分子，其中該RANKL抑制劑係迪諾舒單株抗體或其抗原結合片段。
101. 如實施方式1-72中任一項所述之大分子，其中該第一結合位點包含組織蛋白酶K抑制劑。
102. 如實施方式101所述之大分子，其中該組織蛋白酶K抑制劑係奧當卡替。
103. 如實施方式1-102中任一項所述之大分子，其中該受試者係人。
104. 一種將部分遞送至受試者中的骨組織或骨細胞之方法，該方法包括向該受試者投與如實施方式1-103中任一項所述之大分子，其中該骨組織包含位址靶標。
105. 如實施方式104所述之方法，其中該部分係分子。
106. 如實施方式104或105所述之方法，其中該部分不是毒素。
107. 如實施方式104所述之方法，其中該部分係細胞。
108. 如實施方式107所述之方法，其中該部分不是T細胞或NK細胞。
109. 一種調節骨組織中的效應物靶標之方法，該方法包括向該組織投與如實施方式1-103中任一項所述之大分子，其中該骨組織包含位址靶標和效應物靶標。
110. 一種調節受試者中的骨組織之方法，該方法包括向該受試者投與如實施方式1-103中任一項所述之大分子，其中該骨組織包含位址靶標和效應物靶標。
111. 一種治療患有與效應物靶標相關的疾病或病症的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與如實施方式1-104中任一項所述之大分子，其中該大分子的第一結合位點結合該效應物靶標。
112. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊， 其中該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊，並且 其中該第二結合位點不結合該位址靶標的天然配體的結合位點。
113. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊， 其中該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊，並且 其中該第一結合位點和第二結合位點在該大分子中直接彼此連接。
114. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊， 其中該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊，並且 其中該第一結合位點和第二結合位點藉由穩定結構域彼此連接。
115. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊， 其中該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊，並且 其中該效應物靶標和/或該位址靶標在宿主的結構組織上表現。
116. 一種藥物組成物，其包含如實施方式1-103和112-115中任一項所述之大分子。
117. 一種藥物組成物，其包含大分子和一種或多種藥學上可接受的賦形劑， 其中該大分子包含第一結合位點和第二結合位點，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊，並且 其中該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊。
118. 如實施方式116或117所述之藥物組成物，其中該藥物組成物係RNA藥物組成物。
119. 如實施方式116-118中任一項所述之藥物組成物，其進一步包含載劑。
120. 如實施方式119所述之藥物組成物，其中該載劑係脂質奈米顆粒。
121. 如實施方式119所述之藥物組成物，其中該載劑係病毒載體。
122. 如實施方式119所述之藥物組成物，其中該載劑係基於膜的載劑。
123. 如實施方式119所述之藥物組成物，其中該基於膜的載劑係細胞。
124. 如實施方式119所述之藥物組成物，其中該基於膜的載劑係囊泡。
125. 一種用於調節受試者骨中的效應物靶標的活性之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於該受試者中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於CHAD係特異性的。
126. 一種用於調節受試者骨中的效應物靶標的活性之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於該受試者中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於IFITM5係特異性的。
127. 一種將大分子定位在受試者的骨組織或細胞處之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊；以及 允許該大分子定位於該受試者的該骨組織或骨細胞。
128. 一種在受試者的骨組織或細胞中濃縮大分子之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的；其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊； 並允許該大分子在該受試者的該骨組織或骨細胞處濃縮，其中在向該受試者投與該大分子後1天和7天之間的時間點，在該骨組織或骨細胞處檢測到該受試者中可檢測的該大分子的至少25%。
129. 如實施方式127或128所述之方法，其中相對於缺少該第二結合位點的參考大分子，該骨組織或骨細胞處的該第一結合位點的效力顯著增加。
130. 如實施方式127或128所述之方法，其中相對於缺乏該第二結合位點的參考大分子，在該受試者的非靶組織或細胞中藉由該大分子的效應物靶標傳訊顯著減少。
131. 如實施方式125-130中任一項所述之方法，其中該大分子係如實施方式1-103中任一項所述之大分子。
132. 如實施方式1-103和112-115中任一項所述之大分子，其中該大分子與小分子連接。
133. 如實施方式1-132中任一項所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該大分子和該小分子藉由連接子連接。
134. 如實施方式133所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該連接子係可切割連接子。
135. 如實施方式133所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該連接子係不可切割連接子。
136. 如實施方式1-135中任一項所述之大分子、方法或藥物組成物，其中單個小分子與該大分子連接。
137. 如實施方式1-135中任一項所述之大分子、藥物組成物之方法，其中多個小分子與該大分子連接。
138. 如實施方式137所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該等小分子中的每個係相同的。
139. 如實施方式137所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該等小分子中的至少兩個彼此不同。
140. 如實施方式132-139中任一項所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該小分子係奧當卡替。
141. 如實施方式132-139中任一項所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該小分子係雙膦酸鹽。
142. 如實施方式141所述之大分子、方法或藥物組成物，其中該雙膦酸鹽係阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽。
143. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於軟骨黏附素（CHAD）係特異性的。
144. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）係特異性的。
145. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於Dickkopf-1（DKK1）係特異的，並且 (b) 該第二結合位點對於軟骨黏附素（CHAD）係特異性的。
146. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）係特異性的。
147. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於整合素骨涎蛋白（IBSP）係特異性的。
148. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於滋養層糖蛋白（TPBG）係特異性的。
149. 一種包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於羥基磷灰石係特異性的。
儘管出於清楚理解的目的，已經藉由說明和實例詳細地描述了前述發明，但是描述和實例不應被解釋為限制本發明之範圍。
無
[圖1]係說明示例性ANDbody TM分子及其作為邏輯閘控藥物之用途之示意圖。圖1顯示了沒有位址靶向的人受試者中治療性靶標（右側）（例如效應物靶標）之廣泛分佈，以及具有位址靶向（左側）時的局部和受限分佈，這由位址靶標結合結構域提供。圖1還提供了具有連接至效應物靶標結合結構域的位址靶標結合結構域的ANDbody之代表性二分結構，其包括功能部分，例如調節（例如促效或拮抗）位址靶向細胞或組織中的靶標效應物的部分。位址靶標結合結構域將ANDbody引導至所期望位置，例如靶細胞或組織，從而允許效應物靶標結合結構域接合局部且受限分佈區域中的治療性效應物靶標。在一些實施方式中，可能不需要效應物結構域對靶效應物的高親和力；藉由位址靶標結合結構域對效應物靶標結合結構域的定位使得效應物靶標結合結構域能夠充分結合效應物靶標，以引起對靶細胞或組織中效應物靶標的傳訊的影響，儘管效應物結構域對效應物靶標的親和力低。位址靶標結合結構域可替代地用於將分子或細胞貨物運輸至所期望位址。
[圖2]係顯示示例性效應物靶標的活性之示意圖，藉由開發包含效應物靶向結構域和位址靶向結構域的ANDbody治療劑，可以將效應物靶標限制於目的組織或細胞。根據先前技術，該等ANDbody生物製劑代表了有效的、位址受限的藥物。
[圖3]提供了可以根據本技術進行工程改造的ANDbody生物製劑之示例性結構，該等ANDbody生物製劑包括（但不限於）：不對稱抗體、雙親和力再靶向蛋白（DART）、串聯雙抗體（TandAb）、雙抗體、Fab2、IgG(L,H)-Fv或BiTE。
[圖4]顯示了與具有位址靶標結合結構域和效應物靶結合結構域的示例性雙特異性ANDbody生物製劑（例如di-scFc）的EC 50（實線）相比，示例性單效應物靶向結構域（例如對具有針對效應物靶標的單結合結構域的單特異性生物製劑（例如scFv））之EC 50曲線（虛線），使得單效應物靶向結構域（通常廣泛表現）靶向/限制於局部的、位址靶標特異性組織和/或細胞，從而有效增加效應物靶標結合結構域對效應物靶標結合位點的親和力，如曲線左移所示（較低的EC 50，較高的親和力）。
[圖5]係一組代表性圖像，顯示使用抗牙本質基質酸性磷蛋白1單株抗體（抗DMP1 mAb）染色的（右圖）或僅與辣根過氧化物酶（HRP）二級（2°）試劑一起孵育的（對照；左圖）小鼠股骨切片中的骨髓和小梁區域（股骨「帽」）的縱向介面。HRP 2°試劑來自鼠對鼠聚合物（Mouse on Mouse Polymer）IHC套組（kit）（艾博抗公司（Abcam）ab269452）。
[圖6]係顯示在HEK293T細胞上檢測到的抗TPBG單株抗體（Ab）水平的圖，該等細胞被瞬時轉染以表現在C末端用胞內FLAG胜肽（C’FLAG）標記的全長小鼠或人TPBG構築體。將細胞與連續稀釋的抗TPBG單株抗體一起孵育，然後用螢光團軛合的二抗進行檢測。水平表示為平均螢光強度（MFI）。
[圖7]係一組代表性顯微照片，顯示抗TPBG mAb（左圖）與生長在96孔盤上的MC3T3成骨細胞的結合，如來自螢光團二抗的螢光訊號所示。同等濃度的對照鼠IgG的結合顯示為對照（右圖）。
[圖8]係表示BIS-L1的結構之圖。
[圖9]係顯示用指示量的抗SOST抗體（PRO136）或雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（抗-SOST-BIS-L1(2)）處理的HEK293報導細胞中的Wnt1螢光素酶報導基因測定（以螢光素酶的相對光單位（RLU）測量）結果之圖。
[圖10]係顯示在指示的時間點在體外測定中結合到羥基磷灰石（HA）的抗SOST-BIS-L1(2)或非軛合的抗SOST ANDBody PRO136的比例之圖。
[圖11A]係皮下投與雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（抗SOST-BIS-L1(2)）後八天收集的脫鈣小鼠股骨切片之圖像。ANDbody使用鹼性磷酸酶軛合的抗人IgG抗體進行檢測，該抗體係使用VECTOR® Red基質開發的。
[圖11B]係在皮下投與20毫克/千克體重（mpk）抗SOST ANDbody（抗SOST-PRO136）後八天收集的脫鈣小鼠股骨切片之圖像。ANDbody使用鹼性磷酸酶軛合的抗人IgG抗體進行檢測，該抗體係使用VECTOR® Red基質開發的。
[圖12]係顯示單次皮下注射20 mpk雙膦酸鹽軛合的抗SOST ANDbody（抗SOST-BIS-L1(2)）、抗SOST抗體（抗SOST – PRO136）（陽性對照）、抗RSV抗體（PRO022）（陰性對照）或媒介物對照（PBS）後，在指定時間點小鼠血清中1型前膠原N末端前胜肽（P1NP）水平之圖。D8：第8天。
無

Claims (37)

  1. 一種將大分子定位在受試者的骨組織或骨細胞處之方法，該方法包括向該受試者投與包含第一結合位點和第二結合位點的大分子，其中： (a) 該第一結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中的效應物靶標係特異性的，並且 (b) 該第二結合位點對於該受試者的骨組織或骨細胞中表現的位址靶標係特異性的； 其中： (i) 該第二結合位點將該第一結合位點定位於該位址靶標，使得該第一結合位點影響該骨組織或骨細胞中的效應物靶標傳訊； (ii) 該第二結合位點在結合該位址靶標後基本上不影響傳訊；以及 (iii) 該第一結合位點在沒有被該第二結合位點定位的情況下基本上不影響效應物靶標傳訊；以及 允許該大分子定位於該受試者的該骨組織或骨細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中在向該受試者投與該大分子後1天和7天之間的時間點，在該骨組織或骨細胞處檢測到該受試者中可檢測的該大分子的至少25%。
  3. 如請求項1所述之方法，其中相對於缺少該第二結合位點的參考大分子，該骨組織或骨細胞處的該第一結合位點的效力顯著增加。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該第一結合位點對該效應物靶標具有低親和力。
  5. 如請求項3所述之方法，其中該第一結合位點對該效應物靶標具有低親合力。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該第一結合位點對該效應物靶標的親和力低於該第二結合位點對該位址靶標的親和力。
  7. 如請求項1所述之方法，其中該第一結合位點對該效應物靶標的親合力低於該第二結合位點對該位址靶標的親合力。
  8. 如請求項1所述之方法，其中相對於缺乏該第二結合位點的參考大分子，在該受試者的非靶組織或細胞中藉由該大分子的效應物靶標傳訊顯著減少。
  9. 如請求項1所述之方法，其中該位址靶標在該受試者中區域表現。
  10. 如請求項1所述之方法，其中該位址靶標在該受試者中局部表現。
  11. 如請求項1所述之方法，其中該位址靶標的表現限於該受試者中的細胞類型。
  12. 如請求項1所述之方法，其中該位址靶標僅由該受試者中的處於特定細胞狀態的細胞表現。
  13. 如請求項1所述之方法，其中該位址靶標僅由該受試者中的處於疾病狀態的細胞表現。
  14. 如請求項1所述之方法，其中該第一結合位點或該第二結合位點包含多胜肽。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該多胜肽係抗體或其抗原結合片段。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該大分子係抗體，該抗體包含對該受試者中的該效應物靶標特異性的第一結合位點和對該位址靶標特異性的第二結合位點。
  17. 如請求項14所述之方法，其中該多胜肽係該效應物靶標的配體或該位址靶標的配體。
  18. 如請求項17所述之方法，其中： (a) 該第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段並且該第二結合位點包含該位址靶標的配體；或 (b) 該第一結合位點包含該效應物靶標的配體並且該第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
  19. 如請求項15所述之方法，其中： (a) 該第一結合位點包含抗體或其抗原結合片段，並且該第二結合位點包含結合該位址靶標的小分子；或 (b) 該第一結合位點包含結合該效應物靶標的小分子，並且該第二結合位點包含抗體或其抗原結合片段。
  20. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於軟骨黏附素（CHAD）係特異性的。
  21. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於牙本質基質酸性磷蛋白1（DMP1）係特異性的。
  22. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於整合素骨涎蛋白（IBSP）係特異性的。
  23. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於滋養層糖蛋白（TPBG）係特異性的。
  24. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於羥基磷灰石係特異性的。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該第二結合位點係雙膦酸鹽。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該雙膦酸鹽係阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽。
  27. 如請求項20-26中任一項所述之方法，其中該第一結合位點對於硬化蛋白（SOST）係特異性的。
  28. 如請求項20-26中任一項所述之方法，其中該第一結合位點對於dickkopf-1（DKK1）係特異性的。
  29. 如請求項1所述之方法，其中該第二結合位點對於干擾素誘導的跨膜蛋白5（IFITM5）係特異性的。
  30. 如請求項29所述之方法，其中該第一結合位點對於SOST係特異性的。
  31. 如請求項1-30中任一項所述之方法，其中該大分子與小分子連接。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該小分子係奧當卡替。
  33. 如請求項31所述之方法，其中該小分子係雙膦酸鹽。
  34. 如請求項33所述之方法，其中該雙膦酸鹽係阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽。
  35. 如請求項30-34中任一項所述之方法，其中該大分子和該小分子藉由連接子連接。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該連接子係可切割連接子。
  37. 如請求項35所述之方法，其中該連接子係不可切割連接子。
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