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KR20250021325A - 유전적 동인을 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유전적 동인을 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20250021325A
KR20250021325A KR1020247042276A KR20247042276A KR20250021325A KR 20250021325 A KR20250021325 A KR 20250021325A KR 1020247042276 A KR1020247042276 A KR 1020247042276A KR 20247042276 A KR20247042276 A KR 20247042276A KR 20250021325 A KR20250021325 A KR 20250021325A
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KR
South Korea
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target protein
agent
expression
activity
cell
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247042276A
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English (en)
Inventor
비니드라 마니
에리카 가브리엘 와인스타인
얀 폴 가이 레지스 에첼라드
아바크 카흐베지안
패트릭 셰넌 펜더그라스트
타마라 우스펜스카이아
가브리엘 험프리 빌링스
마힘 게라시첸코
Original Assignee
플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 filed Critical 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은, 다양한 구현예에서, 면역 조절-관련 단백질, 예컨대 사이토카인을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 조성물, 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유전자 편집 시스템, 소분자, 벡터 또는 숙주 세포를 제공한다. 본 개시내용은 또한, 다양한 구현예에서, 면역 조절-관련 단백질을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 사용하여 질병 또는 병태(예를 들어, 게놈 전체 연관 연구(GWAS), 암 게놈 아틀라스(TCGA), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(PheWAS), 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 연구, 또는 이들의 조합과 관련된 질병 또는 병태)를 치료하는 방법, 및 상기 작용제를 확인하는 방법을 제공한다.

Description

유전적 동인을 조절하기 위한 조성물 및 방법
자료의 참조에 의한 통합
본 출원은 2022년 5월 25일에 출원된 미국 가출원 63/345,787의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
XML 자료의 참조에 의한 통합
본 출원은 본원과 동시에 제출되는 하기 XML(eXtensible Markup Language) 파일에 포함된 서열 목록을 참조로 포함한다:
a) 파일명: 57081058002.xml; 2023년 5월 24일 작성됨, 8,059,812 바이트 크기.
진단, 예방 및/또는 치료를 위한 효과적인 치료제 및 방법의 결여는 많은 질병 및 병태에 걸쳐 지속적으로 충족되지 않은 의학적 요구의 근본 원인이 된다. 많은 질병 및 병태는 기능이상에 영향을 미치거나 이를 직접 야기할 수 있는 유전적 구성요소를 갖는다. 질병 또는 병태를 발생시키는 유전적 소인은 단일 유전자좌에서의 변화로 인해 발생할 수 있거나, 집합적으로 많은 유전자좌에서의 변화의 결과일 수 있다. 질병 및 병태의 새로운 유전적 동인을 확인하는 것은 다양한 질병 및 병태에 대한 진단, 예방 및/또는 치료 옵션을 개발 및/또는 개선하는 기회를 제공한다.
본원에 제공되는 개시내용은, 부분적으로, 다양한 질병, 병태, 또는 질병 전단계에서 변경된(예를 들어, 돌연변이된) 비표준 단백질 표적(예를 들어, 비표준 오픈 리딩 프레임(ORF)에 의해 인코딩되는 단백질)의 확인에 기초한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 확인된 표적 단백질(예를 들어, 표 A의 서열 목록의 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체)를 포함하고/하거나 이의 발현 및/또는 활성을 조절하는(예를 들어, 증가시키거나 감소시키는) 작용제(agent)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 작용제는 본원에서 확인된 표적 단백질(예를 들어, 표 A의 서열 목록의 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체)를 포함한다. 특정 구현예에서, 작용제는 본원에서 확인된 표적 단백질(예를 들어, 표 A의 서열 목록의 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체)의 발현 및/또는 활성을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, 작용제는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유전자 편집 시스템, 소분자, 또는 세포(예를 들어, 세포 요법)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 작용제는 본원에서 확인된 표적 단백질의 억제제 또는 활성화제일 수 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 본원에서 확인된 표적 단백질의 발현을 조절한다. 일부 구현예에서, 작용제는 본원에서 확인된 표적 단백질의 활성을 조절한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 확인된 표적 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 확인된 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 본원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 질병 또는 병태를 검출하거나, 질병 또는 병태 발생 가능성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성 수준은 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 질병 또는 병태는 게놈 전체 연관 연구(GWAS, 예를 들어, www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Genome-Wide-Association-Studies-Fact-Sheet 참조), 암 게놈 아틀라스(TCGA, 예를 들어 www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga 참조), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(PheWAS, 예를 들어 https://phewascatalog.org/ 참조), 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 연구(예를 들어, 문헌[Nica & Dermitzakis, Expression quantitative trait loci: present and future, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368(1620):20120362 (2013)] 및 www.ebi.ac.uk/eqtl/ 참조), 또는 이들의 조합(예를 들어, 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)과 관련된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 결정하는 데 유용한 샘플을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 대상체로부터 샘플을 얻거나 이미 얻은 단계;
b) 프로테아제 억제제, 대조 펩티드, 표준 펩티드, 또는 이들의 조합을 샘플에 첨가하여, 암 발생 가능성을 검출하는 데 유용한 샘플을 제조하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 제조된 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계
를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 병태 발생 가능성을 가질 것으로 예측되는 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하며, 이는 유효량의 본원에서 확인된 표적 단백질을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제, 또는 상기 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암을 갖는 인간 대상체)에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본원에서 확인된 표적 단백질을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제, 또는 상기 작용제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 질병 또는 병태의 치료에 적합한 대상체를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계, 및 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성 수준에 따라 질병 또는 병태의 치료에 적합한 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포(예를 들어, 암 세포, 예컨대 대상체 내의 암 세포)에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체의 발현 또는 활성을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포(예를 들어, 시험관내(in vitro), 생체외(ex vivo), 또는 생체내(in vivo))를 본원에서 확인된 표적 단백질을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제, 또는 상기 작용제를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 확인된 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 표적 단백질을 작용제와 접촉시키는 단계; 및
b) 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하며,
여기서, 표적 단백질의 발현 또는 활성에 대한 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 차이는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타낸다.
전술한 내용은 첨부된 도면에 예시된 바와 같이 예시적인 구현예에 대한 다음의 보다 구체적인 설명으로부터 명백해질 것이며, 동일한 참조 부호는 다른 도면 전체에 걸쳐 동일한 부분을 지칭한다. 도면은 반드시 축척에 맞춰진 것은 아니며, 대신 구현예를 예시하는 데 중점을 둔다.
도 1은 결장암 세포주(HCT-116)의 세포 증식에 대한 서열번호 5391의 효과를 나타낸다. 리포펙타민 3000을 사용하여 서열번호 5391을 일시적으로 과발현시켰을 때 세포 생존력 및 성장을 조사하기 위한 HCT-116에 대한 WST-1 검정. 플라스미드 형질감염 후, 48시간 후에 WST-1 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 데이터는 3회 반복하여 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로서 제시된다.
도 2a 내지 도 2c는 폐암(A549), 간암(HepG2), 및 결장암(HCT-116)에 대한 WST-1 검정을 사용한 세포 생존력의 분석을 나타낸다. 세포를 서열번호 4538, 서열번호 5392, 및 서열번호 4335로 개별적으로 형질감염시켰다. 음성 대조군의 경우 pcDNA3.1-Myc 태그를 사용하였다. 플라스미드 형질감염 후, 48시간 후에 WST-1 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 데이터는 3회 반복하여 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로서 제시된다. 도 2a) HCT-116 세포에서의 WST-1 결과. 상부: 저혈청, 하부: 고혈청. 도 2b) HepG2 세포에서의 WST-1 결과. 상부: 저혈청, 하부: 고혈청. 도 2c) A549 세포에서의 WST-1 결과. 상부: 저혈청, 하부: 고혈청.
도 3은 2형 당뇨병에 대한 인간 GWAS 위치에서 아미노산 1개가 다른 4개의 상이한 버전의 서열번호 4371의 상대적 분비 수준을 나타낸다.
도 4는 유방암 세포주(MCF-1)의 세포 증식에 대한 서열번호 5404의 효과를 나타낸다. 안정하게 과발현시켰을 때 세포 생존력 및 성장을 조사하기 위한 MCF-7에 대한 WST-1 검정. WST-1 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다. 데이터는 3회 반복하여 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로서 제시된다.
예시적인 구현예에 대한 설명이 후술된다.
표적 단백질
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 확인된 표적 단백질을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "본원에서 확인된 표적 단백질" 및 "본 개시내용의 표적 단백질"이라는 표현은 서열 목록에 개시된 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 5391, 서열번호 5392, 서열번호 4335, 서열번호 4538, 서열번호 4371, 서열번호 5404, 본원에서 표 C의 서열번호), 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 4335_64NS, 서열번호 4335_P43A, 서열번호 5391_P31L, 서열번호4371 rs221797 V-to-A, V-to-G, 또는 V-to-D로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 표적 단백질), 및 본원의 표 A에 개시된 펩티드를 둘 다 포함한다. 표적 단백질은 재조합적으로(예를 들어, DNA 또는 mRNA를 통해) 또는 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 세포내 단백질이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 세포외 단백질(예를 들어, 분비 단백질)이다. 특정 구현예에서, 표적 단백질은 막관통 단백질이다. 특정 구현예에서, 표적 단백질은 막이 결합된 세포외 단백질이지만, 막관통 단백질은 아니다. 더 특정한 구현예에서, 표적 단백질은 막 내에 매립되지만, 막관통 단백질은 아니다.
다양한 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 치환은 서열 목록 또는 표 A에 있는 아미노산 서열의 N-말단 잔기를 메티오닌(Met) 잔기로 치환하는 것이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열로 이루어지며, 여기서 치환은 서열 목록 또는 표 A에 있는 아미노산 서열의 N-말단 잔기를 메티오닌(Met) 잔기로 치환하는 것이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 이의 N-말단에 메티오닌(Met) 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 서열 목록 또는 표 A에 제시된 아미노산 서열 및 이의 N-말단에 있는 메티오닌(Met) 잔기로 이루어진다.
[표 A] 본 개시내용의 표적 펩티드
이론에 구속되고자 하지 않으면서, 본원에 개시된 특정 표적 단백질의 돌연변이는 질병, 병태, 및/또는 질병 전단계(pre-disease)와 관련되거나, 이에 기여하거나, 이를 초래하는 것으로 여겨지며, 여기서 돌연변이는 질병, 병태, 및/또는 질병 전단계에 기여하거나 이를 경감시키는 생물학적 기능의 손실 또는 이득을 초래한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 및/또는 표적 단백질은 질병, 병태, 및/또는 질병 전단계에 대한 바이오마커 또는 대리물로서 사용된다.
서열 목록 및 표 A의 특정 표적 단백질은 참조 상태(예를 들어, 정상 상태)와 비교하여 GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병, 병태 및/또는 질병 전단계 상태, 또는 이들의 조합(예를 들어, 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)에서 차등적으로 발현되어(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절되어), 표적 단백질의 수준 및/또는 활성의 조절이 질병 또는 병태의 발생을 치료, 호전, 및/또는 예방하는 작용을 하는 것으로 확인되었다.
본원에 사용되는 용어 "차등적 발현"은 단백질 발현에서 적어도 하나의 인식 가능한 차이를 지칭한다. 이는 단백질 발현에서 정량적으로 측정 가능하거나, 반정량적으로(semi-quantitatively) 측정 가능하거나, 정성적으로 검출 가능한 차이일 수 있다. 따라서, 차등적으로 발현되는 단백질 또는 "DEP"는 질병 상태에서보다 참조 상태(예를 들어, 정상 상태)에서 더 높은 발현 수준을 가질 수 있으며, 질병 상태에서는 DEP가 더 낮은 발현 수준을 갖거나 전혀 발현되지 않는다. 역으로, DEP는 참조 상태(예를 들어, 정상 상태)에서보다 질병 상태에서 더 높은 발현 수준을 가질 수 있으며, 참조 상태에서는 DEP가 더 낮은 발현 수준을 갖거나 전혀 발현되지 않는다. 또한, 비교 대상인 2개의 상태 간에 DEP가 인식 가능하게 변화된(예를 들어, 돌연변이된) 경우 발현은 차등적인 것으로 간주될 수 있다. 인식 가능한 변화는 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실(N-말단 및 C-말단 절단을 포함함)뿐만 아니라, 변형(예를 들어, 번역 후 변형)을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "참조"는 비교 목적(들)으로 사용되는 표준을 지칭한다. 당업자는 특정 비교 목적(들)에 대해 적절한 참조를 선택할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질병 상태에 대한 참조는 정상적인 건강한 상태일 수 있고; 돌연변이된 단백질에 대한 참조는 비돌연변이된 단백질일 수 있으며; 질병 치료에 대한 참조는 무치료일 수 있거나 표준 치료(standard of care)일 수 있다. 일부 구현예에서, 구체적으로 표적 단백질의 발현 및/또는 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법을 포함하는 구현예에서, 참조는 작용제 부재 하의 표적 단백질의 활성 및/또는 발현이다. 일부 구현예에서, 참조는 사전결정된 수준에 기초하며, 예를 들어 기능적 발현 또는 경험적 검정에 기초한다. 일부 구현예에서, 참조는 하나의 세포, 샘플 또는 대상체(예를 들어, 특정 질병을 갖지 않는 대상체인 건강한 대상체의 세포 또는 샘플; 특정 질병을 갖지 않는 대상체인 건강한 대상체)로부터 얻는다. 일부 구현예에서, 참조는 하나 초과의(예를 들어, 한 집단의) 세포, 샘플 또는 대상체(예를 들어, 특정 질병을 갖지 않는 대상체인 건강한 대상체의 세포 또는 샘플; 특정 질병을 갖지 않는 대상체인 건강한 대상체)로부터 얻으며, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100개 또는 그 이상, 또는 통계적으로 유의한 수의 세포, 샘플 또는 건강한 대상체로부터 얻는다. 하나 초과의 세포, 샘플 또는 대상체로부터 얻은 참조는 통계치(예를 들어, 평균 또는 중앙값)로 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플로부터 결정된 바와 같은) 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구, 또는 이들의 조합과 관련된 질병 또는 병태)에서의 발현 수준이 참조(예를 들어, 질병 또는 병태를 갖지 않는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플)에서의 표적 단백질 발현 수준보다 적어도 약 0.5배 더 높으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높다(예를 들어, 50배 더 높음, 100배 더 높음).
일부 구현예에서, 표적 단백질은 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직을 포함하거나 그로부터 얻은 샘플로부터 결정된 바와 같은) 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병 또는 병태, 또는 이들의 조합, 예컨대 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)에서의 발현 수준이 참조(예를 들어, 질병 또는 병태를 갖지 않는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플)에서의 표적 단백질 발현 수준보다 적어도 약 0.5배 더 낮으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 낮다(예를 들어, 50배 더 낮음, 100배 더 낮음). 일부 구현예에서, 표적 단백질은 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직을 포함하거나 이로부터 얻은 샘플로부터 결정된 바와 같이) 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병 또는 병태, 또는 이들의 조합, 예컨대 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)에서 발현되지 않거나, 검출 가능하지 않은 수준으로 발현된다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플로부터 결정된 바와 같은) 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병 또는 병태, 또는 이들의 조합, 예컨대 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)에서의 전사체 수준이 참조(예를 들어, 질병 또는 병태를 갖지 않는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플)에서의 표적 단백질 전사체 수준보다 적어도 약 0.5배 더 높으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높다(예를 들어, 50배 더 높음, 100배 더 높음). 특정 구현예에서, 표적 단백질의 전사체 수준의 증가는 본원에 기재된 질병 또는 병태에 기여한다(예를 들어, 질병 또는 병태를 초래한다).
일부 구현예에서, 표적 단백질은 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직을 포함하거나 그로부터 얻은 샘플로부터 결정된 바와 같은) 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병 또는 병태, 또는 이들의 조합, 예컨대 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)에서의 전사체 수준이 참조(예를 들어, 질병 또는 병태를 갖지 않는 대상체의 세포 또는 조직으로부터의 샘플)에서의 표적 단백질 전사체 수준보다 적어도 약 0.5배 더 낮으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 낮다(예를 들어, 50배 더 낮음, 100배 더 낮음). 일부 구현예에서, 표적 단백질의 전사체는 (예를 들어, 질병 또는 병태를 갖는 대상체의 세포 또는 조직을 포함하거나 이로부터 얻은 샘플로부터 결정된 바와 같이) 질병 또는 병태에서 발현되지 않거나, 검출 가능하지 않은 수준으로 발현된다. 특정 구현예에서, 표적 단백질의 전사체 수준의 감소는 본원에 기재된 질병 또는 병태에 기여한다(예를 들어, 질병 또는 병태를 초래한다).
특정 구현예에서, 표적 단백질을 인코딩하는 유전자는 본원에 기재된 질병에서 적어도 하나의 돌연변이(예를 들어, 융합, 결실, 삽입, 점 돌연변이, 및/또는 아미노산 반복부의 확장)를 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이 및/또는 표적 단백질은 질병 또는 병태(예를 들어, GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구와 관련된 질병 또는 병태, 또는 이들의 조합, 예컨대 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병)의 마커로서 사용된다.
특정 구현예에서, 표적 단백질은 본원에 기재된 질병 또는 병태에 연루된 세포 및/또는 조직에서 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 세포 및/또는 조직에서의 발현 수준이 참조(예를 들어, 상이한 세포/조직 유형)에서의 표적 단백질 발현 수준보다 적어도 약 0.5배 더 높으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높다(예를 들어, 50배 더 높음, 100배 더 높음).
특정 구현예에서, 표적 단백질은 본원에 기재된 질병 또는 병태에 연루된 세포 및/또는 조직에서 더 낮은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 세포 및/또는 조직에서의 발현 수준이 참조(예를 들어, 상이한 세포/조직 유형)에서의 표적 단백질 발현 수준보다 적어도 약 0.5배 더 낮으며, 예를 들어 적어도 약 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 낮다(예를 들어, 50배 더 낮음, 100배 더 낮음).
(생물학적) 샘플의 비제한적인 예에는 대상체로부터 단리된 혈액, 혈액 구성요소(예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 조직(예를 들어, 생검 또는 미세생검), 췌장액, 융모막 융모 샘플, 및 세포 등이 포함된다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 비-코딩 RNA로부터 번역된다. 일부 구현예에서, 비-코딩 RNA는 긴 유전자간 비-코딩 RNA(long intergenic non-coding RNA, lincRNA)이다. 특정 구현예에서, 비-코딩 RNA는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)이다. 일부 구현예에서, 비-코딩 RNA는 마이크로RNA(miRNA 또는 miR)이다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 비처리된 전구체 mRNA(전구(pre)-mRNA)의 비-엑손 요소로부터 번역된다. 일부 구현예에서, 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 인트론이다. 일부 구현예에서, 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 5'-비번역 영역(5'-UTR)이다. 일부 구현예에서, 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR)이다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 2,000개 아미노산 이하, 예를 들어 1000개 아미노산 이하, 750개 아미노산 이하, 500개 아미노산 이하, 250개 아미노산 이하, 150개 아미노산 이하 또는 100개 아미노산 이하의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 7개 아미노산 이상, 예를 들어 8, 9, 10, 15, 18, 25, 50, 75 또는 100개 아미노산 이상의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 표적 단백질은 약 50 내지 약 200개의 아미노산, 예를 들어 약 100 내지 약 150개의 아미노산의 길이를 갖는다. 특정 구현예에서, 표적 단백질은 7개 아미노산 이상의 길이를 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 표적 단백질은 약 18개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 표적 단백질은 하나 이상의 GPCR의 조절제이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 하나 이상의 GPCR의 효능제이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 하나 이상의 GPCR의 길항제이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 하나 이상의 GPCR의 직접 조절제, 예컨대 하나 이상의 GPCR에 대한 리간드이다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 하나 이상의 GPCR의 간접 조절제이다.
다양한 GPCR의 발현 및/또는 활성은 표 B에 제시된 것을 포함한 다양한 질병/장애, 병태 및 적응증과 연관되어 있다(예를 들어, 문헌[Kenakin, T., Biased Receptor Signaling in Drug Discovery, Pharmacol Rev 71:267-315, April 2019]; 문헌[Harmar, A.J., et al., IUPHAR-DB: the IUPHAR database of G protein-coupled receptors and ion channels, Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37]; 및 문헌[Davenport AP, Scully CCG, de Graaf C, Brown AJH, and Maguire JJ. Advances in therapeutic peptides targeting G protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov. 2020 Jun.19(6):389-413] 참조; 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 일부 구현예에서, GPCR의 조절제인 본원에 개시된 표적 단백질은 하나 이상의 질병/장애, 병태 및/또는 적응증, 예컨대 암 또는 전암성 병태, 또는 GPCR 발현 및/또는 활성과 관련된 것으로 알려진, 표 B에 열거된 임의의 질병/장애, 병태 및 적응증을 치료 및/또는 진단하는 데 유용하다.
[표 B] 질병과 관련된 GPCR
표적 단백질을 조절하는 작용제
본원에 개시된 표적 단백질, 예컨대 서열 목록 또는 표 A의 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체, 또는 전술한 것들의 단편(예를 들어, 표적 단백질의 생물학적 활성 단편)의 발현을 조절하는 작용제가 본원에 제공된다. 표적 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편의 발현은 표적 단백질 수준의 증가 또는 감소로 이어지는 직접 또는 간접적인 다양한 과정에 의해 조절될 수 있다. 비제한적인 예에는 다음을 변경시키는 것이 포함된다: 표적 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 수, 전사 개시, 신장 또는 종결, RNA 처리, RNA 안정성(예를 들어, mRNA 안정성), RNA 분해, 번역 개시, 단백질의 번역 후 변형, 단백질 안정성, 단백질 분해(예를 들어, 절단, 예컨대 프로테아제 절단), 또는 전술한 것들의 조합.
일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 전사체의 발현을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 활성을 감소시킨다(예를 들어, 억제하거나, 줄이거나 중화시킨다). 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 활성을 증가시킨다(예를 들어, 활성화한다). 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 발현을 감소시킨다(예를 들어, 억제하거나 하향조절한다). 다른 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 발현을 증가시킨다(예를 들어, 활성화하거나 상향조절한다).
본원에 사용되는 용어 "증가시키는" 또는 "증가시키다"는 참조(예를 들어, 작용제에 의한 조절 전 또는 이의 부재 시 수준)에 비해 표적 단백질의 발현, 활성, 기능 또는 이들의 조합, 또는 측정기준(metric)(예를 들어, 암 세포 사멸 또는 표적 부위의 DNA 메틸화)의 더 높은 수준을 초래하는 조절을 지칭한다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 발현 또는 활성, 또는 측정기준을 참조에 비해 적어도 약 5%, 예를 들어 참조에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 증가시킨다.
본원에 사용되는 용어 "감소시키는" 또는 "감소시키다"는 참조(예를 들어, 작용제에 의한 조절 전 또는 이의 부재 시 수준)에 비해 표적 단백질의 발현, 활성, 기능 또는 이들의 조합, 또는 측정기준(예를 들어, 암 세포 사멸 또는 표적 부위의 DNA 메틸화)의 더 낮은 수준을 초래하는 조절을 지칭한다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 발현 또는 활성, 또는 측정기준을 참조에 비해 적어도 약 5%, 예를 들어 참조에 비해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 감소시킨다.
측정기준의 비제한적인 예에는 간에서의 에너지 생성 또는 에너지 변환(예를 들어, ATP 합성의 조절, B-산화, 당분해로부터 유래된 대사물의 산화, 아미노산으로부터 유래된 대사물의 산화), 미토콘드리아 전사, 미토콘드리아 리보솜 조립, 미토콘드리아 번역, 미토콘드리아 열발생, 호르몬 신호전달(예를 들어, 미토콘드리아 에스트로겐 수용체(mtER) 신호전달), 산화환원 유지(예를 들어, NADH 및/또는 FADH2), 세포 주기 조절, 세포 이동, 세포 형태, 아폽토시스, 괴사, 막전위, 이온(예를 들어, 칼슘 또는 아연) 저장, 이온(예를 들어, 칼슘 또는 아연) 항상성, 대사물 합성(예를 들어, 헴(heme) 생합성 또는 스테로이드 생합성), 영양소 감지, 접히지 않은 단백질 스트레스 반응 경로, 신호전달 과정(예를 들어, 칼슘 신호전달)이 포함된다.
일부 구현예에서, 표적 단백질의 발현, 활성, 기능 또는 이들의 조합, 또는 측정기준의 수준은, 예를 들어 치료 요법(treatment regimen)이 시작된 후, 적어도 약 1일, 예를 들어 적어도 약 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 8일, 9일, 10일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 동안, 작용제가 (예를 들어, 세포와) 접촉되거나 (예를 들어, 대상체에게) 투여된 후에 측정된다.
일부 구현예에서, 작용제는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유전자 편집 시스템, 소분자, 또는 세포(예를 들어, 세포 요법)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 표적 단백질은 면역 세포를 활성화하고, 작용제는 표적 단백질의 발현, 활성, 기능 또는 이들의 조합의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, 표적 단백질은 면역 세포를 억제하고(예를 들어, 면역 세포의 활성화를 억제하거나, 면역 세포 사멸(예를 들어, 아폽토시스)을 유도하거나, 또는 이들의 조합), 작용제는 표적 단백질의 발현, 활성, 기능 또는 이들의 조합의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다).
특정 구현예에서, 작용제는 본원에 기재된 질병 또는 병태, 또는 전술한 것들의 조합에 연루된 세포 및/또는 조직에서의 표적 단백질의 발현, 활성, 기능, 또는 이들의 조합의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다).
일부 구현예에서, 작용제는 본원에 기재된 질병 또는 병태, 또는 전술한 것들의 조합에 연루된 단백질 기능 및/또는 신호전달 경로를 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다).
일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 하향조절을 유도하거나(예를 들어, 표적 단백질 분해를 증가시킴); 표적 단백질의 다량체화(예를 들어, 이량체화)를 방지하거나; 표적 단백질(예를 들어, 분비된 표적 단백질)을 격리시키거나; 표적 단백질의 알려진 기능을 조절하거나(예를 들어, 효능작용하거나, 길항작용하거나, 파괴함); (예를 들어, 입체 장애를 통해) 표적 단백질과 결합 파트너 간의 결합을 감소시키거나; 표적 단백질을 발현하는 세포의 항체-의존적 세포 살해, 식세포작용, 및/또는 옵소닌화를 유도하거나; 전술한 것들의 조합을 수행한다. 특정 구현예에서, 작용제에는 표적 단백질에 대한 효능적 활성이 결여되어 있다. 특정 구현예에서, 작용제는 표적 단백질에 대한 효능적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 작용제에는 표적 단백질에 대한 길항적 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질에 대한 길항적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 작용제는 결합 파트너에 대한 결합에 관여하는 표적 단백질의 적어도 하나의 잔기에 결합한다. 일부 구현예에서, 작용제는 결합 파트너에 대한 표적 단백질의 결합에 관여하는 표적 단백질의 하나 이상의 결합 부위 및/또는 도메인에 결합한다.
본 개시내용의 표적 단백질의 결합 파트너는 포유류(예를 들어, 인간) 게놈에서의 임의의 알려진 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 결합 파트너의 하향조절을 유도하거나; 표적 단백질의 결합 파트너(예를 들어, 분비된 결합 파트너)를 격리시키거나; 표적 단백질의 결합 파트너의 다량체화(예를 들어, 이량체화)를 방지하거나; 표적 단백질의 결합 파트너(예를 들어, 분비된 결합 파트너)를 격리시키거나; 표적 단백질의 결합 파트너를 발현하는 세포의 항체-의존적 세포 살해, 식세포작용, 및/또는 옵소닌화를 유도하거나; 표적 단백질의 결합 파트너의 알려진 기능을 조절하거나(예를 들어, 효능작용하거나, 길항작용하거나, 파괴하거나); (예를 들어, 입체 장애를 통해) 표적 단백질과 결합 파트너 간의 결합을 감소시키거나; 전술한 것들의 조합을 수행한다. 특정 구현예에서, 작용제에는 표적 단백질의 결합 파트너에 대한 효능적 활성이 결여되어 있다. 특정 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 결합 파트너에 대한 효능적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 작용제에는 표적 단백질의 결합 파트너에 대한 길항적 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적 단백질의 결합 파트너에 대한 길항적 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 작용제는 결합 파트너의 표적-결합 부위에 결합한다. 특정 구현예에서, 작용제는 표적 단백질과 표적 단백질의 결합 파트너 간의 결합에 관여하는 표적 단백질의 결합 파트너의 적어도 하나의 잔기에 추가로 결합한다. 더 구체적인 구현예에서, 작용제는 표적 단백질과 표적 단백질의 결합 파트너 간의 결합에 관여하는 표적 단백질의 결합 파트너의 하나 이상의 결합 부위 및/또는 도메인에 추가로 결합한다.
일부 구현예에서, 작용제는 면역 신호전달, 사이토카인 신호전달, 염증 신호전달, 또는 전술한 것들의 조합을 조절한다(예를 들어, 활성화하거나 억제한다).
일부 구현예에서, 작용제는 T 세포 활성화 및/또는 생존에 관여하는 신호를 향상시킨다. 특정 구현예에서, 작용제는 자극성 관문 분자를 활성화한다. 자극성 관문 분자의 비제한적인 예에는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, 유도성 T-세포 공동자극제(inducible T-cell costimulator, ICOS)가 포함된다. 특정 구현예에서, 작용제는 CD28에 대한 효능제이다.
일부 구현예에서, 작용제는 T 세포 무반응(anergy) 및/또는 소진에 관여하는 신호를 감소시킨다. 특정 구현예에서, 작용제는 억제성 관문 분자를 억제한다. 억제성 관문 분자의 비제한적인 예에는 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CTLA-4, A2AR, CD276, B7-H4, BTLA, IDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLECs 7 및 SIGLECs 9가 포함된다.
특정 구현예에서, 작용제는 TNFα의 기능을 감소시킨다(예를 들어, 차단 항체).
특정 구현예에서, 작용제는 본원에 개시된 표적 단백질의 변이체의 발현, 활성, 기능, 또는 이들의 조합의 수준을 조절한다(예를 들어, 증가시키거나 감소시킨다). 일부 구현예에서, 변이체는 본원에 개시된 표적 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 변이체에 대한 서열 동일성은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 약 70 내지 99%, 75 내지 99%, 75 내지 95%, 80 내지 99%, 80 내지 98%, 80 내지 95%, 80 내지 90%, 85 내지 98%, 85 내지 97%, 85 내지 90%, 90 내지 97%, 90 내지 96%, 90 내지 85%, 90 내지 80% 또는 95 내지 99%이다. 일부 구현예에서, 변이체는 본원에 개시된 표적 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 백분율로 표시되는 최대 수준의 동일성을 달성하기 위해 서열이 정렬될 때 2개의 뉴클레오티드 서열 또는 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 정도를 지칭한다. 서열 정렬 및 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열이 참조 서열로 지정되고, 테스트 서열이 이에 대해 비교된다. 참조 서열과 테스트 서열 사이의 서열 동일성은 최대 수준의 동일성을 달성하기 위해 참조 서열과 테스트 서열의 정렬 시 참조 서열과 테스트 서열이 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산을 공유하는 참조 서열의 전체 길이에 걸친 위치의 백분율로 표현된다. 예를 들어, 최대 수준의 동일성을 달성하기 위해 정렬할 때 테스트 서열이 참조 서열 전체 길이에 걸쳐 동일한 위치의 70%에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 가질 때 두 개의 서열은 70% 서열 동일성을 갖는 것으로 간주된다.
최대 수준의 동일성을 달성하기 위한 비교를 위한 서열 정렬은 적절한 정렬 방법 또는 알고리즘을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 일부 경우에, 정렬은 최대 수준의 동일성을 제공하기 위해 도입된 갭을 포함할 수 있다. 예는 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 로컬 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 및 육안 검사(일반적으로 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology] 참조)를 포함한다.
서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 후속 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 이어서 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 참조 서열에 대한 테스트 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 도구는 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 의학 도서관(National Library of Medicine)의 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 이용 가능한 단백질 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLASTP)이다(Altschul외 다수, 1990).
일부 구현예에서, 본원에 개시된 표적 폴리펩티드의 변이체의 아미노산 서열은 표적 단백질의 아미노산 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 표적 단백질의 아미노산 서열에 비해 변이체의 아미노산 치환의 수는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60개이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 수는 적어도 약 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60개이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 수는 최대 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 6 또는 5개이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 수는 약 1 내지 60개, 1 내지 55개, 2 내지 55개, 2 내지 50개, 3 내지 50개, 3 내지 45개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 5 내지 40개, 5 내지 35개, 6 내지 35개, 6 내지 30개, 7 내지 30개, 7 내지 25개, 8 내지 25개, 8 내지 20개, 9 내지 20개, 9 내지 15개, 10 내지 15개, 5 내지 60개, 10 내지 60개, 10 내지 55개, 15 내지 55개, 15 내지 50개, 20 내지 50개, 20 내지 45개, 25 내지 45개, 25 내지 40 또는 30 내지 40개이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환의 수는 약 10 내지 35개, 10 내지 33개, 11 내지 33개, 11 내지 31개, 12 내지 31개, 12 내지 29개, 13 내지 29개, 13 내지 27개, 14 내지 27 또는 14 내지 25개이다.
변이체의 아미노산 치환(들)은 표준 아미노산 또는 비표준 아미노산으로의 치환일 수 있다. 비표준 아미노산은 D 아미노산, 예컨대 표준 L-아미노산의 D 버전을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 용어 "보존적 아미노산 치환(들)" 또는 "보존적 치환(들)"은 BLOSUM62에서 0 이상의 값을 갖는 아미노산 치환을 지칭한다.
일부 구현예에서, 아미노산 치환은 고도로 보존적인 치환이다. 용어 "고도로 보존적인 아미노산 치환(들)" 또는 "고도로 보존적인 치환(들)"은 BLOSUM62에서 적어도 1(예를 들어, 적어도 2)의 값을 갖는 아미노산 치환을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 표적 단백질의 변이체는 본원에 개시된 표적 단백질의 아미노산 서열에 비해 약 5 내지 60개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 적어도 하나의 보존적 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 적어도 하나의 고도로 보존적인 치환을 포함한다.
A. 폴리펩티드 작용제
용어 "폴리펩티드" "펩티드" 또는 "단백질"은 길이 또는 번역후 변형(예를 들어, 글리코실화 또는 인산화)에 관계없이 아미드 결합에 의해 공유적으로 결합된 적어도 2개의 아미노산의 중합체를 나타낸다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 L- 및/또는 D-아미노산, 예를 들어 일반적인 α-아미노산(예를 들어, 알라닌, 글리신, 발린), 비-α-아미노산(예를 들어, β-알라닌, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 사르코신, 스타틴) 및 특이한 아미노산(예를 들어, 시트룰린, 호모시트룰린, 호모세린, 노르류신, 노르발린, 오르니틴)을 포함할 수 있다. 펩티드 상의 아미노, 카복실 및/또는 기타 관능기는 유리(예를 들어, 변형되지 않은)이거나 적합한 보호기로 보호될 수 있다. 아미노 및 카복실기에 적합한 보호기 및 보호기를 첨가하거나 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌[Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis," John Wiley and Sons, 1991]에 개시되어 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 관능기는 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 유도체화(예를 들어, 알킬화) 또는 표지화(예를 들어, 형광원 또는 합텐과 같은 검출 가능한 표지 이용)될 수 있다. 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 원하는 경우 하나 이상의 변형(예를 들어, 아미노산 링커, 아실화, 아세틸화, 아미드화, 메틸화, 말단 변형자(예를 들어, 고리화 변형), N-메틸-α-아미노 기 치환)을 포함할 수 있다. 또한, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드는 공지된 및/또는 천연-발생 펩티드의 유사체, 예를 들어 보존적 아미노산 잔기 치환(들)을 갖는 펩티드 유사체일 수 있다.
일부 구현예에서, 작용제는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다(예를 들어, 생물학적 샘플 또는 공급원으로부터 단리되거나 추출된다). 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 및/또는 활성의 억제제(예를 들어, 직접 억제제 또는 간접 억제제)이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 및/또는 활성의 활성화제(예를 들어, 직접 활성화제 또는 간접 활성화제)이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 또는 활성을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질 또는 이의 일부분(예를 들어, 이의 생물학적 활성 부분, 예컨대 표적 단백질의 생물학적 활성 단편)이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 면역글로불린 분자, 예컨대 항체(예를 들어, 전체 항체, 온전한 항체) 또는 항체의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질에 결합한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 전장 항체 또는 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, 힌지 CH2 및 CH3 포함)을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR) 내에 산재된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. VH 및 VL은 각각 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR 세그먼트를 포함한다. 항체는 설치류(예를 들어, 뮤린, 래트, 기니피그) 항체, 인간 항체와 같은 임의의 종의 항체일 수 있거나, 항체는 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2) 중쇄 불변 영역, IgD 중쇄 불변 영역, IgE 중쇄 불변 영역, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2(예를 들어, IgG2a, IgG2b 또는 IgG2c), IgG3 또는 IgG4) 중쇄 불변 영역 또는 IgM 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 κ 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 λ 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 다중클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체 또는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 영장류화(primatized)(예를 들어, 인간화)된다. 일부 구현예에서, 항체는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 삼중특이적, 또는 사중특이적이다. 일부 구현예에서, 항체는 이종접합 항체이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 작용제는 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체)의 항원-결합 단편이다. 용어 "항원-결합 단편"은 모 전장 항체의 항원 결합 특성을 보유하는 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체)의 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편의 비제한적 예는 VH 영역, VL 영역, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 및 하나의 VH 도메인 또는 하나의 VL 도메인 등으로 이루어진 도메인 항체(dAb)를 포함한다. VH 및 VL 도메인은 합성 링커를 통해 함께 연결되어 VH 및 VL 도메인이 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 디아바디와 같은 1가 항원 결합 부위를 형성하기 위해 별도의 사슬에 의해 발현되는 경우에 VH/VL 도메인은 분자 내에서 또는 분자간에서 쌍을 이루는 다양한 유형의 단일-사슬 항체 설계를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 이황화물-연결된 Fvs(sdFv, 예를 들어 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디), scFv, SMIP 또는 rlgG로부터 선택되는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 scFv이다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기법, 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해, 또는 특정 경우에 당업계에 알려진 화학적 펩티드 합성 절차에 의해 생성될 수 있다.
폴리펩티드 작용제(예를 들어, 단일클론 항체)는 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 단일특이적 항체는 1개의 항원 에피토프에 결합한다. 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체는 용어 단일클론 항체에 포함된다.
"다중특이적"은 적어도 2개의 별개의 항원 또는 이러한 항원 내의 적어도 2개의 별개의 에피토프, 예를 들어 3개, 4개 또는 5개의 별개의 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. "이중특이적"은 2개의 별개의 항원 또는 동일한 항원 내의 2개의 별개의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다(예를 들어, 단리된 항-표적 단백질 항체에는 표적 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 이중특이적 항체의 경우, 이중특이적 항체는 2개의 관심 항원에 특이적으로 결합하고, 2개의 관심 항원 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 작용제(예를 들어, 단일클론 항체)는 적어도 80% 순도, 예를 들어 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 표적 단백질(예를 들어, 참조 상태에 비해 암 상태에서 발현 또는 활성이 증가된 표적 단백질)에 결합하는 길항제 항체이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질에 결합하는 길항제 항체이다. 본원에 사용되는 용어 "길항제 항체"는 항원(예를 들어, 표적 단백질, 또는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질)에 결합 시 항원의 기능을 감소시키는(예를 들어, 억제하는) 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 수용체이고, 길항제 항체는 수용체의 리간드-결합 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원은 막관통 단백질이고, 길항제 항체는 막관통 단백질의 세포외 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원은 효소 또는 신호전달 분자이고, 길항제 항체는 효소의 활성을 감소시키거나, 신호전달 분자에 의해 매개된 신호 형질도입 경로를 감쇠시킨다. 일부 구현예에서, 길항제 항체는 항원 기능을 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 감소시킨다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 표적 단백질(예를 들어, 참조 상태에 비해 암 상태에서 발현 또는 활성이 감소된 표적 단백질)에 결합하는 효능제 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질에 결합하는 효능제 항체이다. 본원에 사용되는 용어 "효능제 항체"는 항원(예를 들어, 표적 단백질, 또는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질)에 결합 시 항원의 기능을 증가시키는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원은 수용체이고, 효능제 항체는 수용체의 리간드-결합 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원은 막관통 단백질이고, 효능제 항체는 막관통 단백질의 세포외 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원은 효소 또는 신호전달 분자이고, 효능제 항체는 효소의 활성을 증가시키거나, 신호전달 분자에 의해 매개된 신호 형질도입 경로를 활성화한다. 일부 구현예에서, 효능제 항체는 항원 기능을 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1,000% 증가시킨다.
일부 구현예에서, 효능제 항체는 다음 기능적 특성 중 적어도 하나를 발휘하지 않는다: 항원의 활성을 감소시킴(예를 들어, 억제함); (예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 또는 호산구에 의해) 항원을 발현하는 세포의 항체-의존적 세포 살해를 유도함; (예를 들어, 대식세포에 의해) 항원을 발현하는 세포의 식세포작용을 유도함; 항원을 발현하는 세포의 옵소닌화를 유도함; 및 (예를 들어, 항원을 초가교결합(hyper-crosslinking) 또는 클러스터링하여 내재화 및 분해를 유도함으로써) 세포 표면 상의 항원의 하향조절을 유도함.
항원에 대한 치료 항체의 제조 및 사용을 위한 적합한 기법, 검정 및 시약이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 항체 조작을 포함한, 재조합 항체의 제조 방법, 축퇴 올리고뉴클레오티드의 사용, 5'-RACE, 파지 디스플레이, 및 돌연변이생성; 항체 시험 및 특성화; 항체 약동학 및 약력학; 항체 정제 및 보관; 및 스크리닝 및 표지화 기법에 대해 문헌[Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (Zhiqiang An eds., 1st ed. 2009)]; 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual (Edward A. Greenfield eds., 2d ed. 2013)]; 문헌[Ferrara et al., Using Phage and Yeast Display to Select Hundreds of Monoclonal Antibodies: Application to Antigen 85, a Tuberculosis Biomarker, PLoS ONE 7(11): e49535 (2012)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 본원에 개시된 표적 단백질에 결합하는 항체 모방체이다. 용어 "항체 모방체"는, 항원에 결합하는 항체의 능력을 모방할 수 있지만, 천연 항체 구조와 구조적으로 상이한 폴리펩티드를 지칭한다. 항체 모방체의 비제한적인 예에는 애드넥틴(Adnectin), 아피바디(Affibody), 아필린(Affilin), 아피머(Affimer), 아피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 안티칼린(Anticalin), 아비머(Avimer), DARPin, 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드, 모노바디, 나노바디, 나노CLAMP, 및 버사바디(Versabody)가 포함된다.
일부 구현예에서(예를 들어, 참조 상태에 비해 질병 상태에서 표적 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는 경우), 작용제는 표적 단백질의 적어도 일부분(예를 들어, 생물학적 활성 부분 또는 단편)과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)이다. 예를 들어, 퍼센트 동일성은 전장(full-length) 표적 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분 또는 단편에 대해 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 전장 표적 단백질의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전장 표적 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 전장 표적 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 합성 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)는 표적 단백질에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 치환의 수는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 또는 약 1 내지 20개, 1 내지 19개, 2 내지 19개, 2 내지 18개, 2 내지 17개, 3 내지 17개, 3 내지 16개, 4 내지 16개, 4 내지 15개, 5 내지 15개, 5 내지 14개, 6 내지 14개, 6 내지 13개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 8 내지 12개, 8 내지 11개 또는 9 내지 11개일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 고도로 보존적인 치환이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질의 적어도 일부분과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 퍼센트 동일성은 적어도 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 치환의 수는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 또는 약 1 내지 20개, 1 내지 19개, 2 내지 19개, 2 내지 18개, 2 내지 17개, 3 내지 17개, 3 내지 16개, 4 내지 16개, 4 내지 15개, 5 내지 15개, 5 내지 14개, 6 내지 14개, 6 내지 13개, 7 내지 13개, 7 내지 12개, 8 내지 12개, 8 내지 11개 또는 9 내지 11개일 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 고도로 보존적인 치환이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 세포-침투 펩티드이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 세포-침투 펩티드에 연결된다. 적합한 세포-침투 펩티드 서열은 단백질-유래 서열, 설계된 서열, 또는 키메라(변형된) 서열일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Regberg, et al., Applications of cell-penetrating peptides for tumor targeting and future cancer therapies, Pharmaceuticals 5(9): 991-1007 (2012)]을 참조한다. 세포-침투 펩티드의 비제한적인 예에는 TAT(48-60), 페네트라틴(Penetratin), pVEC, MPG8, 트랜스포르탄(Transportan), 트랜스포르탄10, PepFect3, PepFect 6, PepFect 14, 폴리아르기닌, 스테아릴-폴리아르기닌, Pep-1, Pep-3, CADY, YTA2, YTA4, SynB1, SynB3, 마우로칼신(Maurocalcine) 및 PTD4가 포함된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 순환 인자(circulating factor)(예를 들어, 사이토카인)이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)와 표적 단백질의 생물학적 특성(예를 들어, 생물학적 활성 또는 반감기)은 유사하다. 생물학적 활성의 비제한적인 예에는 특히 효소 활성 또는 효소 특성(예를 들어, 선택성, 안정 상태 또는 동역학), 결합 활성(예를 들어, 핵산(DNA, RNA) 결합 단백질 결합) 또는 결합 특성(예를 들어, 특이성, 친화성 또는 동역학), 세포 신호전달 활성, 면역학적 활성, 및 구조적 활성(예를 들어, 세포 부착)이 포함된다. 효소 활성의 비제한적인 예에는 트랜스퍼라제 활성(예를 들어, 작용기를 한 분자에서 다른 분자로 전달함), 산화환원효소 활성(예를 들어, 산화-환원 반응을 촉매함), 가수분해효소 활성(예를 들어, 가수분해를 통해 화학 결합을 절단함), 리아제 활성(예를 들어, 이중 결합을 생성함), 리가제 활성(예를 들어, 공유 결합을 통해 2개의 분자를 연결함), 및 이소머라제 활성(예를 들어, 한 이성질체로부터 다른 이성질체로 분자 내 구조적 변화를 촉매함)이 포함된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)는 재조합 단백질이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드(예를 들어, 단리된 폴리펩티드)는 합성 단백질이다. 치료용 폴리펩티드의 생성 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Mark C. Smales & David C James eds., 2005)]; 문헌[Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications (Daan J. A. Crommelin, Robert D. Sindelar & Bernd Meibohm eds., 2013)]을 참조한다. 폴리펩티드는 적절한 프로모터의 제어 하에서 포유류 세포, 곤충 세포, 효모 또는 세균 등을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 번역 후 변형 또는 기타 다른 화학적 변형을 포함한다. 번역 후 변형의 비제한적인 예에는 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 글리코실화, 하이드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 인산화, 탈아미드화, 프레닐화(예를 들어, 파르네실화, 제라닐화 등), 유비퀴틸화, 리보실화 및 황산화(sulphation)가 포함된다. 인산화는 아미노산, 예컨대 티로신, 세린, 트레오닌, 또는 히스티딘 상에서 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, 표적 단백질 또는 이의 일부분, 표적 단백질을 조절하는 폴리펩티드 작용제)는, 예를 들어 절단(예를 들어, 프로테아제 절단) 또는 번역 후 변형에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, 변형(들)은, 예를 들어 비활성 폴리펩티드를 활성으로 만듦으로써 또는 폴리펩티드의 활성 수준을 변경(예를 들어, 증가, 감소)시킴으로써, 폴리펩티드의 활성에 영향을 미칠 것이다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 전구약물로서 제공되며, 예를 들어 이는 (예를 들어, 단백질 분해적 절단, 번역 후 변형에 의해) 생체내에서 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 번역 후 변형 또는 기타 다른 화학적 변형을 포함한다. 번역 후 변형의 비제한적인 예에는 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 글리코실화, 하이드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 인산화, 탈아미드화, 프레닐화(예를 들어, 파르네실화, 제라닐화 등), 유비퀴틸화, 리보실화 및 황산화(sulphation)가 포함된다. 인산화는 아미노산, 예컨대 티로신, 세린, 트레오닌, 또는 히스티딘 상에서 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 표 A의 서열 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 신생항원, 또는 전술한 것들의 변이체를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "신생항원"은 본원에 기재된 표적 단백질로부터 발생하는 종양 항원을 지칭한다. 일부 구현예에서, 신생항원은 암-특이적 신생항원이다. 신생항원을 생성하는 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 신생항원은 폴리펩티드로서 시험관내에서 생성된 후, 신생종 백신 또는 면역원성 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 약제학적 조성물은 유효량의, 하나 이상의 신생항원 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 아쥬반트 또는 첨가제를 추가로 포함한다.
대안적으로, 신생항원은 신생항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터(예를 들어, 바이러스 발현 벡터)를 (예를 들어, 필요로 하는 대상체의) 세포 또는 조직 내로 도입함으로써 생체내에서 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 신생항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 T 세포 인핸서 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 인핸서는 불변 사슬, 조직-유형 플라스미노겐 활성화제의 리더 서열, PEST 서열, 사이클린 파괴 박스, 유비퀴틴화 신호, 및 SUMO화 신호로 구성되는 군으로부터 선택된다.
B. 폴리뉴클레오티드 작용제
일부 구현예에서, 작용제는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체는 표적 단백질의 억제제이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체는 표적 단백질의 활성화제이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 감소시킨다(예를 들어, 줄이거나 중화시킨다). 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 유사체 또는 유도체는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킨다.
폴리뉴클레오티드는 천연 발생 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체, 비천연 발생 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 함유하는 서열을 가질 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 천연 발생 염기(예를 들어, A, G, C, 또는 T)를 포함하는 뉴클레오티드, 및 변형된 염기(예를 들어, 7-데아자구아노신, 이노신, 또는 메틸화 뉴클레오티드, 예컨대 5-메틸 dCTP 및 5-하이드록시메틸 시토신)를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 비제한적인 예에는 2'-플루오로, 2'-o-메틸, 2'-데옥시, 잠금 해제 핵산, 2'-하이드록시, 포스포로티오에이트, 2'-티오우리딘, 4'-티오우리딘 및 2'-데옥시우리딘이 포함된다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레아제 저항성을 증가시키거나, 혈청 안정성을 증가시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 전술한 것들의 조합을 수행한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 분자이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터(예를 들어, 발현 벡터, 플라스미드)이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 유사체 또는 유도체는 펩티드 핵산(PNA)이다. 일부 구현예에서, 유사체 또는 유도체는 잠금 핵산(LNA)이다. 일부 구현예에서, 유사체 또는 유도체는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 포스포로티오에이트-결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 데옥시리보핵산 구아니딘(DNG) 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 리보핵산 구아니딘(RNG) 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 표 A의 표적 단백질(예를 들어, 서열 목록의 표적 단백질), 또는 이의 일부분(예를 들어, 이의 생물학적 활성 부분 또는 단편)을 인코딩하는 핵산의 발현 및/또는 활성을 조절한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 전사체의 적어도 일부분에 상보적인(예를 들어, 완전 상보적이거나 부분 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 폴리뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 생리학적 조건 하에서) 유전자 또는 유전자 전사체에 혼성화되거나 어닐링될 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 전사체의 적어도 일부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 표적 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 이의 생물학적 활성 변이체) 또는 이의 일부분(예를 들어, 이의 생물학적 활성 부분 또는 단편)을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 표적 단백질 또는 이의 변이체, 또는 이의 일부분(예를 들어, 단편)을 인코딩하는 핵산은 유전자 서열 또는 이의 일부분이다. 일부 구현예에서, 인코딩 핵산은 비처리된 RNA 전사체(예를 들어, 전구-mRNA) 또는 이의 일부분(예를 들어, 5'-UTR, 3'-UTR, 인트론)이다. 일부 구현예에서, 인코딩 핵산은 mRNA 분자 또는 이의 일부분이다. 일부 구현예에서, 인코딩 핵산은 비-코딩 RNA(예를 들어, 긴 유전자간 비-코딩 RNA(lincRNA), 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 또는 miRNA)에 존재한다.
인코딩 핵산은 표준 오픈 리딩 프레임(ORF) 또는 비표준 ORF를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인코딩 핵산은 비표준 ORF를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds)일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥(ds)이다. 일부 구현예에서, ds 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 50개의 염기쌍, 예를 들어 약 15 내지 45개, 15 내지 40개, 15 내지 35개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 18 내지 50개, 18 내지 45개, 18 내지 40개, 18 내지 35개, 18 내지 30개, 18 내지 25개, 20 내지 50개, 20 내지 45개, 20 내지 40개, 20 내지 35개, 20 내지 30개, 20 내지 25개, 25 내지 50개, 25 내지 45개, 25 내지 40개, 25 내지 35개, 25 내지 30개, 30 내지 50개, 30 내지 45개, 30 내지 40개, 30 내지 35개, 35 내지 50개, 35 내지 45개, 35 내지 40개 또는 40 내지 50개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 19 내지 23개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 21개의 염기쌍이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(ss)이다. 일부 구현예에서, ss 폴리뉴클레오티드의 길이는 약 15 내지 50개의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 15 내지 45개, 15 내지 40개, 15 내지 35개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 18 내지 50개, 18 내지 45개, 18 내지 40개, 18 내지 35개, 18 내지 30개, 18 내지 25개, 20 내지 50개, 20 내지 45개, 20 내지 40개, 20 내지 35개, 20 내지 30개, 20 내지 25개, 25 내지 50개, 25 내지 45개, 25 내지 40개, 25 내지 35개, 25 내지 30개, 30 내지 50개, 30 내지 45개, 30 내지 40개, 30 내지 35개, 35 내지 50개, 35 내지 45개, 35 내지 40개 또는 40 내지 50개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 새로 생성된 핵 RNA 전사체가 전사를 위해 mRNA로 성숙되는 것을 방지한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 인트론 및 엑손의 경계에 있는 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 (예를 들어, 생리학적 조건 하에서) 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA에 혼성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드 또는 약 10 내지 30개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 20 내지 25개의 뉴클레오티드이다.　일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 표적화된 전사체와 동일한 안티센스 서열과 적어도 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 오버행 서열(예를 들어, 코어 서열에 의한 이중 나선 구조의 형성에 직접 관여하지 않는, 쌍이 형성되지 않은 오버행 뉴클레오티드)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 3' 오버행, 5' 오버행, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 오버행은 약 1 내지 5개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 오버행은 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드, 예를 들어 티오포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 데옥시뉴클레오티드 역위(3'-3' 연결된) 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법에 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오티드 작용제의 비제한적인 예에는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안타고미르, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 모르폴리노 핵산(MNA), 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 압타머 및 가이드 RNA(gRNA)가 포함된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 (예를 들어, RNA 간섭(RNAi)의 생물학적 과정을 통해) 유전자 발현을 억제한다. RNA 간섭에 적절한 폴리뉴클레오티드는 계산 도구를 포함한 당업계에 알려진 기법, 검정 및 시약을 사용하여 당업자가 용이하게 설계하고 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pei et al. 2006], 문헌[Reynolds et al. 2004], 문헌[Khvorova et al. 2003], 문헌[Schwarz et al. 2003], 문헌[Ui-Tei et al. 2004], 문헌[Heale et al. 2005], 문헌[Chalk et al. 2004], 문헌[Amarzguioui et al. 2004]을 참조한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 길이가 약 22개의 뉴클레오티드이다. miRNA는 mRNA 분자 상의 표적 부위에 결합하고, 예를 들어 mRNA의 절단, mRNA의 불안정화, 또는 mRNA의 번역의 억제를 야기함으로써 mRNA를 침묵시킨다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 siRNA이다. 일부 구현예에서, siRNA는 표적 단백질을 인코딩하는 약 15 내지 25개의 연속 mRNA 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 약 19 내지 25개의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, siRNA는 디뉴클레오티드 AA로 개시된다. 일부 구현예에서, siRNA는 GC-함량이 약 30 내지 70%, 예를 들어 약 30 내지 65%, 30 내지 60%, 30 내지 55%, 30 내지 50%, 40 내지 70%, 40 내지 65%, 40 내지 60%, 40 내지 55%, 45 내지 70%, 45 내지 65%, 45 내지 60% 또는 45% 내지 55%이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 shRNA이다. shRNA는 RNAi를 통해 표적 유전자의 발현을 감소시키는 헤어핀 턴을 포함하는 RNA 분자이다. shRNA는, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 또는 형질도입에 의해, 플라스미드, 예를 들어 바이러스 또는 세균 벡터의 형태로 세포에 전달될 수 있다.
siRNA 및 shRNA는 내인성 마이크로RNA(miRNA) 유전자의 처리 경로에서의 중간체와 유사하다(예를 들어, 문헌[Bartel, Cell 116:281-97 (2004)] 참조). 일부 구현예에서, siRNA는 miRNA로서 기능하고; 다른 구현예에서, miRNA는 siRNA로서 기능한다(예를 들어, 문헌[Zeng et al., Mol Cell 9:1327-33 (2002)]; 문헌[Doench et al., and Genes Dev 17:438-42 (2003)] 참조). 마이크로RNA는 siRNA와 같이 RISC를 사용하여 표적 유전자를 하향조절하지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 출력을 감소시킨다(예를 들어, 문헌[Wu et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4034-39 (2006)] 참조). 알려진　miRNA　결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 있으며; miRNA는 miRNA의　5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8과 거의 완전한 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 문헌[Rajewsky, Nat Genet 38 Suppl: S8-13 (2006)] 및 문헌[Lim et al., Nature 433:769-73 (2005)] 참조).)). 이 영역은 시드 영역으로 알려져 있다. siRNA와 miRNA는 상호교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA와 시드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다(예를 들어, 문헌[Birmingham et al., Nat Methods 3:199-204 (2006)] 참조). 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공한다(예를 들어, 문헌[Doench et al., Genes Dev 17: 438-42 (2003)] 참조).
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 표적 단백질 또는 이의 변이체(예를 들어, 적어도 약 70% 동일한(예를 들어, 야생형 단백질과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한) 변이체)를 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA) 또는 원형 RNA(circRNA)이다. 일부 구현예에서, mRNA는 (예를 들어, 단백질 합성의 효능을 개선하고, 희귀한 코돈에 의한 mRNA 불안정화를 제한하도록) 코돈 최적화된다(예를 들어, 문헌[Presnyak et al., Cell. 160 (6): 1111-24 (2015)] 및 문헌[Thess et al., Mol Ther. 23(9): 1456-64 (2015)] 참조).
일부 구현예에서, RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된다. 일부 구현예에서, RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로 발현된다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내에서 전사된다. RNA 치료제의 제조 및 사용은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[RNA Therapeutics: Function, Design, and Delivery (Mouldy Sioud eds., 2010)] 및 문헌[Kaczmarek et al., Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality, Genome Medicine 9:60 (2017)]을 참조한다.
일부 구현예에서, mRNA는 시험관내 전사에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, mRNA는 그의 활성을 최적화도록 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA는 변형된 염기, 5' 캡, 5' 캡 유사체, 항-역전 캡 유사체(anti-reverse cap analog, ARCA), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 폴리(A) 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 약 100 내지 200개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 테일은 mRNA의 발현 및/또는 안정성을 개선한다(예를 들어, 문헌[Kaczmarek et al., Genome Medicine 9:60 (2017)] 참조).
일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 캡 유사체는 1,2-디티오디포스페이트-변형된 캡이다(예를 들어, 문헌[Strenkowska et al., Nucleic Acids Res. 44:9578-90 (2016)] 참조).
일부 구현예에서, mRNA는 변형된 3' 비번역 영역(UTR), 5' UTR, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 UTR은 (예를 들어, 단백질 생성물의 수준을 향상시키기 위해) RNA-결합 단백질(RBP) 및 miRNA의 동원을 담당하는 서열을 포함한다(예를 들어, 문헌[Kaczmarek et al., Genome Medicine 9:60 (2017)] 참조). 일부 구현예에서, 3' UTR, 5' UTR, 또는 둘 다는 조절 요소를 인코딩하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 세포-특이적 방식으로 RNA 발현을 제어하기 위해 K-턴 모티프, miRNA 결합 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 문헌[Wroblewska et al., Nat Biotechnol. 33:839-41 (2015)] 참조).
일부 구현예에서, mRNA는 RNA 염기 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 슈도우리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 (예를 들어 면역-자극 활성을 차폐하고 번역 개시를 향상시키기 위해) N1-메틸-슈도우리딘을 포함한다(예를 들어, 문헌[Andries et al., J Control Release 217:337-44 (2015)] 및 문헌[Svitkin et al., Nucleic Acids Res. 45:6023-36 (2017)] 참조).
일부 구현예에서, RNA(예를 들어, mRNA)는 원형 RNA이다.
mRNA를 생성하기 위한 조성물 및 방법이 개시되며, 예를 들어 WO2016011306, WO2016014846, WO2016022914, WO2016077123, WO2016164762, WO2016201377, WO2017049275, US9937233, US8710200, US10022425, US9878056, US9572897, WO2010084371, US9353153, WO2015034925 및 WO2019236673을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌[Jemielity et al., RNA 9(9):1108-22 (2003)]; 문헌[Mockey et al., Biochem Biophys Res Commun. 340: 1062-88 (2006)]; 문헌[Strenkowska et al. Nucleic Acids Res. 44: 9578-90 (2016)]; 문헌[Presnyak et al., Cell 160: 1111-24 (2015)] 및 문헌[Kaczmarek et al., Genome Medicine 9:60 (2017)]을 참조한다. 일부 구현예에서, mRNA는 지질 나노입자(LNP) 제형으로 제조된다(예를 들어, 생체내 전달에 대해, 예를 들어 미국 특허 9,764,036, 미국 특허 9,682,139, 문헌[Kauffman et al., Nano Lett. 15: 7300-6 (2015)] 및 문헌[Fenton et al., Adv Mater. 28: 2939-43 (2016)] 참조).
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 압타머이다. 특정 구현예에서, 압타머는 본원에 개시된 표적 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, 압타머는 본원에 개시된 표적 단백질의 결합 파트너에 결합한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 전달 중합체에 (예를 들어 공유적으로) 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드와 전달 중합체 간의 링크는 가역적이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 생리학적으로 불안정한 링커를 통해 전달 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 생리학적으로 불안정한 링커는 이황화물 결합이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 과량의 중합체의 존재 하에서 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 과량의 중합체는 (예를 들어, 세포 또는 대상체에 대한) 투여 전에 제거된다.
당업자는 본원 및 표 A에 포함된 서열 목록에 포함된 단백질 서열의 유전자좌 정보, 예컨대 염색체 위치, 시작 및 종료 뉴클레오티드 위치, 및 다형성 확인(polymorphism identification)을 사용하여 본원에 기재된 조성물, 키트 및 방법에 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오티드 작용제를 용이하게 제조할 수 있다.
C. 유전자 편집 시스템을 포함하는 작용제
일부 구현예에서, 작용제는 유전자 편집 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 표적 단백질을 인코딩하는 유전자에서 뉴클레오티드의 결실, 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드의 부가 또는 전술한 것들의 조합을 생성한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 트랜스포존-기반 유전자 편집 시스템, 또는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템이다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 클래스 II CRISPR/Cas 시스템이다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 (예를 들어, 유전자 녹아웃(gene knockout)을 통해) 표적 단백질의 발현을 감소시키거나(예를 들어, 줄이거나, 억제하거나) 또는 제거한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 (예를 들어, 유전자 녹아웃을 통해) 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질의 발현을 감소시키거나(예를 들어, 줄이거나, 억제하거나) 또는 제거한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 (예를 들어, 유전자 녹인 또는 유전자 대체를 통해) 표적 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)은 (예를 들어, 유전자 녹인 또는 유전자 대체를 통해) 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질의 발현을 증가시킨다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 표적 단백질을 인코딩하는 유전자의 절단을 특이적으로 촉매하며, 이를 통해 상기 유전자를 불활성화한다. 비상동성 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ)을 통한 핵산 가닥 절단의 복구는 종종 절단 부위에서 DNA 서열에 변화를 초래하며, 이는 짧은 삽입 또는 결실(Indel)을 초래한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 녹아웃하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 상동성 유도 복구(HDR)는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자를 동시에 불활성화하고 불활성화된 유전자좌 내로 이종 서열을 삽입하는 데 사용된다. 녹아웃 및/또는 녹인 사건이 발생한 세포는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 확인 및/또는 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 단일 Cas 엔도뉴클레아제, 또는 단일 Cas 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas9, Cpf1, C2C1 또는 C2C3이다. 일부 구현예에서, 단일 Cas 엔도뉴클레아제는 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes)의) Cas9이다. 일부 구현예에서, 단일 Cas 엔도뉴클레아제는 Cpf1이다. 일부 구현예에서, Cpf1은 AsCpf1(아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.) 유래) 또는 LbCpf1(라크노스피라세아이 종(Lachnospiraceae sp.) 유래)이다. 뉴클레아제 및 gRNA(들)의 선택은 통상적으로 표적화된 서열에 대한 뉴클레오티드(들)의 결실, 치환, 또는 부가가 요구되는지 여부에 따라 결정될 것이다.
일부 구현예에서, II형 Cas 엔도뉴클레아제는 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스의) Cas 9이다. 일부 구현예에서, 변형된 Cas9는 닉카제 Cas9, 사멸 Cas9(dCas9) 또는 eSpCas9이다. 일부 구현예에서, 닉카제 Cas9는 Cas9 D10A이다. 일부 구현예에서, dCas9는 D10A 또는 H840A이다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 (예를 들어, 더 정확한 게놈 편집을 달성하기 위해) 이중 닉카제 Cas9를 포함한다(예를 들어, 문헌[Ran et al., Cell 154: 1380-89 (2013)] 참조). 야생형 Cas9는 gRNA에 의해 표적화된 특이적 DNA 서열에서 이중 가닥 절단(DSB)을 생성한다. 닉카제 Cas9는 단지 단일 가닥 절단만을 생성한다. dCas9는 촉매적으로 비활성이다. 일부 구현예에서, dCas9는 뉴클레아제(예를 들어, 2개의 gRNA와 상동성인 표적 서열에서 DSB를 생성하는 FokI)에 융합된다. 다양한 CRISPR/Cas9 플라스미드가 Addgene 리포지토리(Addgene, Cambridge, MA: addgene.org/crispr/)로부터 공개적으로 입수 가능하다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 다음을 포함한다:
a) 야생형 또는 변형된 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 또는 야생형 또는 변형된 II형 Cas 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
b) CRISPR RNA("crRNA"); 및
c) 트랜스-활성화(trans-activating) crRNA("tracrRNA").
일부 구현예에서, crRNA는 적어도 1개의 "가이드 RNA"(sgRNA), 예를 들어 적어도 2개, 3개 또는 4개의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 단백질의 유전자 서열의 일부분과 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질의 유전자 서열의 일부분과 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 적어도 약 16개의 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 약 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드; 또는 약 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드; 또는 약 16 내지 24개, 17 내지 24개, 17 내지 23개, 18 내지 23개, 18 내지 22개, 19 내지 22개 또는 19 내지 21개 또는 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, sgRNA는 화학적으로 변형된다.
유전자 편집을 위한 gRNA 서열의 설계는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Cong et al., Science, 339: 819-23 (2013)] 및 문헌[Ran et al., Nature Protocols 8: 2281-308 (2013)]을 참조한다. Cas9는 DNA를 절단하기 위해 gRNA 서열의 뉴클레오티드가 적어도 약 16개 또는 17개 필요하고, Cpf1은 DNA를 절단하기 위해 gRNA 서열의 뉴클레오티드가 적어도 약 16개 필요하다. 실제로, gRNA 서열은 약 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드) 길이를 가지며, 표적 유전자와 상보적이다. 맞춤형 gRNA 생성기 및 알고리즘은 구매 가능하다. 화학적으로 변형된 sgRNA가 또한 게놈 편집에 효과적인 것으로 입증되어 있다(예를 들어, 문헌[Hendel et al., Nature Biotechnol., 985-91 (2015)] 참조).
일부 구현예에서, crRNA는 tracrRNA에 결합할 수 있는 서열을 추가로 포함한다. 결합 시, 부분 이중 가닥 구조는 RNase III에 의해 절단되고, 생성되는 crRNA/tracrRNA 혼성체는 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식 및 절단하도록 유도한다.
일부 구현예에서, 표적 DNA 서열은 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"("PAM")와 비슷하다. PAM 서열은 주어진 게놈 전체에 걸쳐 나타난다. 다양한 원핵생물종의 CRISPR 엔도뉴클레아제는 고유한 PAM 서열 요건을 갖는다. PAM 서열의 비제한적인 예에는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR3) 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)가 포함된다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-NGG와 관련되며, PAM 부위의 상류(5')에 3개 뉴클레오티드가 있는 위치에서 표적 DNA의 평활 말단(blunt-end) 절단을 수행한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 다음을 포함한다:
a) 야생형 또는 변형된 II형 Cas 엔도뉴클레아제, 또는 야생형 또는 변형된 II형 Cas 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
b) crRNA.
Cpf1-관련 CRISPR 어레이는 tracrRNA의 요건 없이 성숙 crRNA로 처리된다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-TTN과 관련되어 있다. Cpf1은 또한 5'-CTA PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은, 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행을 갖는 오프셋 또는 엇갈린(staggered) 이중 가닥 절단을 도입함으로써 표적 DNA를 절단하며, 예를 들어 코딩 가닥 상의 PAM 부위의 하류(3')에 18개 뉴클레오티드, 및 상보적 가닥 상의 PAM 부위로부터 하류에 23개 뉴클레오티드가 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 엇갈린 절단으로 표적 DNA를 절단한다. 그러한 오프셋 절단으로부터 생성되는 5-뉴클레오티드 오버행은, 평활-말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다, 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 더 정확한 게놈 편집을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al., Cell 163:759-71 (2015)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 표적 유전자의 전사를 활성화하거나 억제한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 다음을 포함한다:
a) dCas9 및 하나 이상의 이펙터 도메인을 포함하는 키메라 단백질; 및
b) 하나 이상의 sgRNA.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 표적 단백질의 발현을 억제한다(CRISPRi). 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 표적 단백질의 발현을 활성화한다(CRISPRa). 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 sgRNA에 의해 인식되는 DNA 서열을 메틸화한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 sgRNA에 의해 인식되는 DNA 서열을 탈메틸화한다.
이펙터 도메인은 이펙터 단백질(예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제제)의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 1개의 이펙터 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 편집 시스템은 적어도 2개의 이펙터 도메인, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 이펙터 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 KRAB를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 VP64를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 VP64, p65 및 Rta를 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9는 D10A이다. 일부 구현예에서, dCas9는 H840A이다.
dCas9는 촉매적으로 비활성이기 때문에, dCas9는 표적 DNA를 절단하지 않지만, 입체 장애에 의해 전사를 방해한다. 하나 이상의 gRNA에 의해 표적 유전자의 전사 개시 부위(TSS)의 상류 서열로 가이드되는 dCas9 키메라 단백질(예를 들어, dCas9-VPR)은 표적 유전자의 전사를 조절한다. 예를 들어, 문헌[Gilbert et al., CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes, Cell 154, 442-51 (2013)]; 문헌[Cheng et al., Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system, Cell Res. 23: 1163-71 (2013)]; 문헌[Gilbert et al., Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation, Cell 159: 647-61 (2014)]; 문헌[Tanenbaum et al., A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging, Cell 159: 635-46 (2014)]; 문헌[Konermann et al., Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Nature 517: 583-88 (2015)]; 문헌[Chavez et al., Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming, Nat. Methods. 12: 326-28 (2015)]; 문헌[Zalatan et al., Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds, Cell 160: 339-50 (2015)]; 문헌[Horlbeck et al., Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation, eLife. 5: e19760 (2016)]; 문헌[Chavez et al., Comparison of Cas9 activators in multiple species, Nat Methods. 7: 563-67 (2016)]을 참조한다.
진핵생물의 유전자를 편집하기 위한 CRISPR 기술은 미국 특허 출원 공개 2016/0138008A1 및 US2015/0344912A1, 및 미국 특허 8,697,359, 8,771,945, 8,945,839, 8,999,641, 8,993,233, 8,895,308, 8,865,406, 8,889,418, 8,871,445, 8,889,356, 8,932,814, 8,795,965, 및 8,906,616에 개시되어 있다. Cpf1 엔도뉴클레아제 및 상응하는 가이드 RNA 및 PAM 부위는 미국 특허 출원 공개 2016/0208243 A1에 개시되어 있다. 미토콘드리아 게놈에서 mtDNA 기능이상을 발생시키기 위한 CRISPR 기술은 문헌[Jo et al., BioMed Res. Int. 2015: 305716 (2015)]에 개시되어 있다. 나노입자로 Cas9와 sgRNA를 공동전달하는 것은 문헌[Mout et al., ACS Nano 11(3): 2452-58 (2017)]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 작용제는 트랜스포존-기반 유전자 편집 시스템을 포함한다. 본원에 제공된 본 개시내용에 사용하기에 적합한 트랜스포존-기반 유전자 편집 시스템의 한 예는 2020년 3월 5일에 공개된 국제 공개 WO 2020/047124에 기재된 Gene Writer 시스템이며, 이의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 작용제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템을 포함한다. TALEN-기반 시스템은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이들은 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합함으로써 제조된다. 상기에 기재된 FokI 제한 효소는 TALEN-기반 유전자-조절 시스템에 사용하기에 적합한 예시적인 효소 도메인이다.
TAL 이펙터는 크산토모나스(Xanthomonas) 세균이 식물을 감염시킬 때 III형 분비 시스템을 통해 분비하는 단백질이다. DNA 결합 도메인은, 12번째 및 13번째 아미노산이 서로 다른, 반복되고 고도로 보존된 33 내지 34개의 아미노산 서열을 함유한다. 반복 가변 2잔기(Repeat Variable Diresidue, RVD)로 지칭되는 이들 2개의 위치는 매우 가변적이며, 특이적 뉴클레오티드 인식과 강한 상관관계가 있다. 따라서, TAL 이펙터 도메인은 적절한 RVD를 함유하는 반복 세그먼트들의 조합을 선택함으로써 특이적 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. RVD 조합에 대한 핵산 특이성은 다음과 같다: HD는 시토신을 표적화하고, NI는 아데닌을 표적화하고, NG는 티민을 표적화하고, NN은 구아닌을 표적화한다(하지만, 일부 구현예에서, NN은 또한 더 낮은 특이성으로 아데닌에 결합할 수 있다).
일부 구현예에서, TAL 이펙터 도메인은 표적 단백질의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, TAL 이펙터 도메인은 게놈 좌표 세트에 의해 정의되는 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 TAL 이펙터-융합 단백질을 포함하며, 각각은 TAL 이펙터 도메인을 포함하고, 여기서 TAL 이펙터 도메인 중 적어도 하나는 표적 단백질의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 TAL 이펙터 도메인 중 적어도 하나는 게놈 좌표 세트에 의해 정의되는 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
TAL-이펙터 반복부를 조립하기 위한 방법 및 조성물이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Cermak et al, Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Res 39(12): e82 (2011)]을 참조한다. TAL-이펙터 반복부의 작제를 위한 플라스미드는, 예를 들어 Addgene으로부터 구매 가능하다.
일부 구현예에서, 작용제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템을 포함한다. ZFN 도메인은 구매 가능한 플라스미드, 예컨대 Sigma Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 플라스미드 쌍(CSTZFN-1KT COMPOZR® 맞춤형 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) R-3257609)을 사용하여 생성될 수 있다. 플라스미드는 제조자의 프로토콜에 따라 상업용 시스템(예를 들어, NEB Monarch Miniprep(Cat# T1010), New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 작용제는 통상적인 유전자 요법(예를 들어, 상동성 재조합을 통한 유전자 녹아웃 또는 녹인)을 전달하도록 설계된 벡터를 포함한다. 상기 벡터의 비제한적인 예에는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스 5), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 나노입자 및 DNA 트랜스포존이 포함된다.
D. 소분자 작용제
일부 구현예에서, 작용제는 소분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 소분자는 표적 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 소분자는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 소분자는 표적 단백질의 억제제(예를 들어, 직접 억제제, 간접 억제제)이다. 일부 구현예에서, 소분자는 표적 단백질의 활성화제(예를 들어, 직접 활성화제 및 간접 활성화제)이다.
소분자의 예에는 유기 화합물; 유기금속 화합물; 무기 화합물; 및 유기, 유기금속 또는 무기 화합물의 염이 포함된다. 소분자의 원자들은 통상적으로 공유 결합 및/또는 이온 결합을 통해 함께 연결된다. 특정 구현예에서, 소분자는 유기 소분자이다. 유기 소분자의 원자들의 배열은 사슬(예를 들어, 탄소-탄소 사슬 또는 탄소-헤테로원자 사슬)을 나타낼 수 있거나, 탄소 원자를 함유하는 고리, 예를 들어 벤젠 또는 폴리사이클릭 시스템, 또는 탄소와 헤테로원자의 조합, 즉, 헤테로사이클, 예컨대 피리미딘 또는 퀴나졸린을 나타낼 수 있다. 소분자는 다양한 분자량을 가질 수 있지만, 일반적으로 약 5,000 달톤 미만인 분자를 포함한다. 예를 들어, 그러한 소분자는 약 1000 달톤 미만일 수 있거나, 바람직하게는 약 750 달톤 미만이거나, 더 바람직하게는 약 500 달톤 미만이다. 소분자는 자연에서 발견(예를 들어, 확인, 단리, 정제)될 수 있고/있거나, (예를 들어, 전통적인 유기 합성, 바이오-매개 합성, 또는 이들의 조합에 의해) 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ganesan, Drug Discov. Today 7(1): 47-55 (January 2002)]; 문헌[Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (December 2001)]을 참조한다. 천연 발생 소분자의 예에는 호르몬, 신경전달물질, 뉴클레오티드, 아미노산, 당, 지질, 및 이들의 유도체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 작용제는 단백질 가수분해 표적화 키메라(proteolysis targeting chimera, PROTAC)를 포함한다.
본 개시내용의 조성물, 키트 및 방법에 사용하기에 적합한 소분자는 본원에 개시된 임의의 스크리닝 방법을 사용하여 당업자가 확인할 수 있다.
E. 치료용 세포 및 세포-기반 요법
일부 구현예에서, 작용제는 치료용 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료용 세포는 본원에 기재된 표적 단백질(예를 들어, 표 A의 서열 목록의 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체), 폴리펩티드(예를 들어, 항체, 항원-결합 단편, 또는 표적 단백질의 적어도 일부분과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드), 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 재조합 DNA, RNA, 예컨대 mRNA 또는 siRNA), 및/또는 유전자 편집 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)을 발현하고/하거나 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)가 세포-기반 요법에 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 조작된 T 세포 수용체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체(CAR)(예를 들어, T(CAR-T) 세포, 자연 살해(CAR-NK) 세포 또는 대식세포(CAR-M) 세포에서 발현됨)이다. 일부 구현예에서, CAR은 막관통 도메인 및 항원-인식 모이어티(moiety)를 포함하며, 여기서 항원-인식 모이어티는 표적 단백질에 결합한다.
본 개시내용의 조성물, 키트 및 방법에 사용하기에 적합한 치료용 세포는 당업자에게 알려진 방법으로 생성되고/되거나, 확인되고/되거나, 풍부화될 수 있다. 상기 방법의 비제한적인 예에는 대상체(예를 들어, 인간)의 세포를 특정 세포 생성물로 정제, 증식 및/또는 분화시키는 것; 유전자 요법을 위해 체세포를 조작하는 것; 세포 불멸화; (예를 들어, 바이러스 벡터 및/또는 지질 나노입자 전달 기술을 사용한) 세포의 생체외 유전자 변형; (예를 들어, 바이러스 벡터 및/또는 지질 나노입자 전달 기술을 사용한) 세포의 생체내 유전자 변형; 게놈 편집; 세포 가소성(cell plasticity) 기술; 유전자 변형; 및 유세포 분석이 포함된다. 일부 구현예에서, 치료용 세포는 자가(autologous) 또는 동종(syngeneic) 세포이다. 다른 구현예에서, 치료용 세포는 동종이계(allogeneic) 세포이다.
발현 벡터 및 숙주
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
용어 "발현 벡터"는 발현 벡터가 적합한 발현 숙주 세포로 형질전환될 때 하나 이상의 단백질이 발현될 수 있는 복제 가능한 핵산을 지칭한다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열, 선택 가능한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 인핸서 서열, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열은 유도성 프로모터 서열을 포함한다. "프로모터"라는 용어는 RNA 중합효소가 결합하여 유전자의 전사를 개시하는 DNA 영역을 지칭한다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산이 연결된 요소(예를 들어, 프로모터)의 제어 하에 핵산의 발현을 가능하게 하는 방식으로 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 벡터에 위치함을 의미한다. "선택 가능한 마커 요소"라는 용어는 인공 선택에 적합한 특성을 부여하는 요소이다. 선택 가능한 마커 요소는 음성 또는 양성 선택 마커일 수 있다. 세균, 진균, 효모, 및 포유류 세포 숙주와 사용하기 위한 발현 벡터의 비제한적인 예는 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Michael R. Green & Joseph Sambrook eds., 4th ed. 2012)]에 기재되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 발현 숙주 세포를 제공한다.
용어 "발현 숙주 세포"는 벡터를 수용, 유지, 재생산 및/또는 증폭하는 데 유용한 세포를 지칭한다.
발현 숙주 세포의 비제한적인 예에는 포유류 세포, 예컨대 하이브리도마 세포, 새끼 햄스터 신장 섬유아세포(BHK 세포), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, HeLa 세포, 및 인간 배아 신장(HEK), 효모 세포, 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포, 또는 세균 세포, 예컨대 DH5α 등이 포함된다. 예를 들어, 단백질 치료제의 생성을 위한 숙주 세포 배양 과정에 대해서는 문헌[Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Weichang Zhou & Anne Kantardjieff eds., 2014)]을; 단백질 치료제의 정제에 대해서는 문헌[Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization (Felix Franks eds., 2013)] 및 문헌[Protein Purification Protocols (Paul Cutler eds., 2010)]을, 단백질 치료제의 제형화에 대해서는 문헌[Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic (Brian K Meyer eds., 2012)]을 참조한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터는 형질전환, 전기천공, 및 형질도입을 포함한 당업계에 알려진 기법을 사용하여, 적합하거나 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입된 핵산은 숙주 세포에서 염색체외에 존재하거나, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 약제학적 조성물은 본원에 개시된 작용제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 암을 완화, 치료, 또는 예방하는 데 있어서 약리학적 활성 또는 기타 다른 직접적인 효과를 갖는 조성물, 또는 이의 완성된 투여 형태 또는 제형을 지칭한다.
일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제 또는 강화제를 포함한다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 안정화제, 희석제 또는 강화제의 비-제한적 예는 완충제(예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 또는 메티오닌), 방부제, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 친수성 중합체, 아미노산, 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 당(예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨), 염-형성 반대-이온(예를 들어, 나트륨), 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 비-이온성 계면활성제(예를 들어, 트윈), PLURONICS™ 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 작용제(예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 소분자)는 변형되며, 예를 들어 이종 모이어티에 접합된다. 용어 "접합된"은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 부착된 것을 지칭한다. 접합은 임의의 적합한 결합제(linking agent)를 사용할 수 있으며; 비제한적인 예에는 펩티드 링커, 화합물 링커, 및 화학적 가교결합제가 포함된다.
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 마커(예를 들어, 형광 또는 방사성 마커), 작용제를 안정화하는 분자, 작용제를 (예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 통과하는 것을 용이하게 하거나 방지하기 위해 특정 세포 또는 조직으로) 표적화하는 분자, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 헥사데칸산, 하이드로겔, 나노입자, 다량체화 도메인 및 담체 펩티드이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 지질 나노입자이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 중합체 나노입자이다. 일부 구현예에서, 중합체는 양친매성 중합체이다. 다른 구현예에서, 중합체는 소수성 또는 친수성 중합체이다. 중합체의 비제한적인 예에는 폴리(락트산)-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트산-코-글리콜산)-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)-d-α-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트, 폴리(락트산-코-글리콜산)-에틸렌 옥사이드 푸마레이트, 폴리(글리콜산)-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리카프로락톤-폴리(에틸렌 글리콜), 또는 이들의 임의의 염이 포함된다. 일부 구현예에서, 중합체 나노입자는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 적합한 투여 일정 및 경로를 위해 제형화된다. 투여 경로의 비-제한적 예는 경구, 직장, 점막, 정맥내, 근육내, 피하 및 국소 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 수용액 또는 건조 제형(예를 들어, 동결건조) 형태로 저장된다. 일부 구현예에서, 조성물은 주입(예를 들어, 정맥내 주입)에 의해 투여되도록 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 병용 요법으로서 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 (예를 들어, 제2 치료제와) 투여되도록 제형화된다. 본원에 사용되는 "병용 요법" 또는 "병용 투여되는"은 2개(또는 그 이상)의 상이한 작용제 또는 치료제가 특정 질병 또는 병태에 대해 규정된 치료 요법의 일부로서 대상체에게 투여된다는 것을 의미한다. 추가의 작용제 또는 치료제의 비제한적인 예에는 본원에 개시된 질병 또는 병태(예를 들어, 암)에 영향을 미치는 생물학적 제제(예를 들어, 항체, 펩티드), 세포 요법, 유전자 요법, 면역요법, 및 소분자가 포함된다.
치료 요법은 대상체에 대한 개별 작용제들의 효과가 중첩되도록 각각의 작용제 투여의 용량 및 주기성을 규정한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 작용제는 처방된 요법의 일부로서 순차적인 방식으로 투여된다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 작용제의 전달은 동시적 또는 병행적이다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 작용제는 공동제형화된다. 일부 구현예에서, 병용된 2개 이상의 작용제 또는 치료제의 투여는 증상, 또는 장애와 관련된 기타 다른 파라미터의 감소가, 하나의 작용제 또는 치료제가 단독으로, 또는 다른 작용제 또는 치료제의 부재 하에 전달되는 경우 관찰되는 것보다 더 크도록 한다. 2개 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나, 상가적보다 더 클 수 있다(예를 들어, 상승적). 2개 이상의 치료제 각각은 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 2개 이상의 치료제는 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은, 예를 들어 세포를 바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 바이러스 벡터에 의해 전달되거나, 종양에 국부 투여되거나(예를 들어, 주사되거나), 또는 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 전신(예를 들어, 정맥내 또는 경구) 투여된다.
바이러스 게놈은 외인성 유전자를 포유류 세포 내로 효율적으로 전달하는 데 사용될 수 있는 벡터의 풍부한 공급원을 제공한다. 바이러스 게놈은 그러한 게놈 내에 함유된 폴리뉴클레오티드가 통상적으로 일반화 또는 특수화된 형질도입에 의해 포유류 세포의 핵 게놈 내로 통합되기 때문에 유전자 전달에 특히 유용한 벡터이다. 이들 과정은 천연 바이러스 복제 주기의 일부로서 일어나며, 유전자 통합을 유도하기 위한 단백질 또는 시약의 첨가를 필요로 하지 않는다. 바이러스 벡터의 비제한적인 예에는 레트로바이러스(예를 들어, 레트로바이러스과(Retroviridae family) 바이러스 벡터), 아데노바이러스(예를 들어, Ad5, Ad26, Ad34, Ad35, 및 Ad48), 파르보바이러스(예를 들어, 아데노-관련 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토믹소바이러스(예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역 및 센다이(Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코르나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중 가닥 DNA 바이러스(아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 거대세포바이러스, 복제 결핍 헤르페스 바이러스)를 포함함), 및 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아, 변형된 백시니아 안카라(modified vaccinia Ankara, MVA), 계두(fowlpox) 및 카나리폭스(canarypox))가 포함된다. 추가의 비제한적인 예에는, 예를 들어 노르워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인간 거품 바이러스(human foamy virus), 및 간염 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스의 비제한적인 예에는 조류 백혈병-육종, 조류 C형 바이러스, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, 온코레트로바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 알파레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 스푸마바이러스가 포함된다(예를 들어, 문헌[Coffin JM. Retroviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM et al, eds. Fundamental Virology. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1996:763-843] 참조). 추가의 비제한적인 예에는 뮤린 백혈병 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 마우스 유선 종양 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 고양잇과 백혈병 바이러스, 고양잇과 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스, 개코원숭이 내인성 바이러스, 긴팔 원숭이(Gibbon ape) 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이(Mason Pfizer monkey) 바이러스, 시미안 면역결핍 바이러스, 시미안 육종 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 렌티바이러스가 포함된다. 벡터의 추가의 비제한적인 예가, 예를 들어 미국 특허 5,801,030에 기재되어 있으며, 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 원위치(in situ)에서 막-기반 담체에 의해 전달되도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 막-기반 담체는 세포-기반 담체(예를 들어, 포유류, 예컨대 인간 세포)이다. 일부 구현예에서, 막-기반 담체는 소포(vesicle)-기반 담체이다. 일부 구현예에서, 막-기반 담체는 본원에 기재된 하나 이상의 벡터(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 또는 비로좀)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 리포좀에 의해 전달되도록 제형화된다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단층(unilamellar) 또는 다층(multilamellar) 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외부 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소포 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성, 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성이고, 비독성이며, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 다를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 문헌[Spuch and Navarro, J Drug Deliv. 2011: 469679 (2011)] 참조).
소포는 여러 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만, 인지질이 약물 담체로서의 리포좀을 생성하는 데 가장 일반적으로 사용된다. 다층 소포 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 6,693,086을 참조하며, 다층 소포 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다). 소포 형성은 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 자발적일 수 있지만, 또한 균질화기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 진탕 형태로 힘을 가함으로써 촉진될 수 있다(예를 들어, 문헌[Spuch and Navarro, J Drug Deliv. 2011: 469679 (2011)] 참조). 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-52, 1997]에 기재된 바와 같이, 크기가 감소하는 필터를 통해 압출함으로써 압출된 지질이 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 지질 나노입자(LNP)에 의해 전달되도록 제형화된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물을 포함하는 LNP 제제는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는다: (a) LNP 제제는 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤, 및 PEG 지질을 포함하고, (b) LNP 제제는 평균 입자 크기가 80 nm 내지 160 nm이다.
나노구조화된 지질 담체(NLC)는 SLN의 특성을 유지하고, 약물 안정성 및 로딩 능력을 개선하고, 약물 누출을 방지하는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 중합체 나노입자(PNP)는 약물 전달의 중요한 구성요소이다. 이들 나노입자는 약물을 특이적 표적으로 효과적으로 전달하고, 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선할 수 있다. 리포좀과 중합체를 조합하는 새로운 유형의 담체인 지질-중합체 나노입자(PLN)가 또한 사용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP와 리포좀의 상보적인 이점을 갖는다. PLN은 코어-쉘 구조로 구성되며; 중합체 코어는 안정한 구조를 제공하고, 인지질 쉘은 우수한 생체적합성을 제공한다. 이와 같이, 2개의 구성요소는 약물 캡슐화 효율을 높이고, 표면 개질을 촉진시키고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 예를 들어, 문헌[Li et al., Nanomaterials 7(6): 122 (2017)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질)에 의해 전달되도록 제형화된다. 탄수화물 담체의 비제한적인 예에는 피토글리코겐 옥테닐 석시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 및 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질)에 의해 전달되도록 제형화된다. 단백질 담체의 비제한적인 예에는 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 및 글로불린이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 지질중합체 또는 형질감염 시약)에 의해 전달되도록 제형화된다. 양이온성 담체의 비제한적인 예에는 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복스아미도) 에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N-(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE) 및 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC)가 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 엑소좀, 지방세포 및/또는 적혈구에 의해 전달되도록 제형화된다. 예를 들어, 문헌[Ha et al., Acta Pharm Sin B. 6(4): 287-96 (2016)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 푸소좀(Fusosome)에 의해 전달되도록 제형화된다. 푸소좀은 융합 및 페이로드(payload) 전달을 위해 표적 세포 특이성을 부여하도록 조작되어, 프로그램 가능 세포 특이성을 갖는 전달 비히클의 생성을 가능하게 하였다. 예를 들어, 특허 출원 WO2020014209를 참조하며, 푸소좀 설계, 제조, 및 사용에 관한 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 생체외 분화된 적혈구에 의해 전달되도록 제형화된다. 예를 들어, WO2015073587; WO2017123646; WO2017123644; WO2018102740; WO2016183482; WO2015153102; WO2018151829; WO2018009838; 문헌[Shi et al., PNAS, 111(28): 10131-36 (2014)]; 미국 특허 9,644,180; 문헌[Huang et al., Nature Communications 8: 423 (2017)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 마이크로솜, 바이러스-유사 입자(VLP) 또는 식물 나노소포 및 식물 메신저 팩(plant messenger pack, PMP)에 의해 전달되도록 제형화된다. 예를 들어, WO2011097480, WO2013070324, WO2017004526 및 WO2020041784를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 작용제 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 아넬로좀(anellosome)에 의해 전달되도록 제형화된다. 치료용 생성물의 전달에 사용되는 아넬로좀의 제조 및 용도는 미국 특허 11,166,996에 기재되어 있으며, 아넬로좀 설계, 제조, 및 사용에 관한 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함된다.
표적 단백질의 조절 방법
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포(표적 세포, 표적 조직의 세포)에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질, 또는 이의 변이체의 발현 또는 활성을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포(예를 들어, 시험관내, 생체외, 또는 생체내)를 본원에서 확인된 표적 단백질을 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제, 또는 상기 작용제를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
표적 세포는 임의의 포유류(예를 들어, 인간) 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 본원에 기재된 질병 또는 병태에 연루된 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 암 세포(예를 들어, 전이성 암 세포), 종양 미세환경 내의 세포(예를 들어, 간질 세포), 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 전이성 암 세포이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 염증에 연루되고/되거나 관여한다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 상피 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 비면역 세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 섬유증, 노화, 및/또는 세포노화에 연루되고/되거나 관여한다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 상피 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 비면역 세포, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 이펙터 T 세포, 헬퍼 T 세포, Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 선천성 림프계 세포(예를 들어, ILC1 세포, ILC2 세포, ILC3 세포), 대식세포(예를 들어, M1 대식세포, M2 대식세포), 단핵구, 및/또는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포), 또는 전술한 것들의 조합이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 표적 단백질은 세포 집단(예를 들어, 암 세포, 예컨대 종양 세포의 집단; 면역 세포의 집단)의 고갈을 매개하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 표적 단백질은, 예를 들어 표면 마커의 결합제로서, 세포 표적화(예를 들어, 세포 유형-특이적 방식으로 치료제를 전달함)를 용이하게 한다.
표적 조직은 신체의 임의의 조직일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 조직은 본원에 기재된 질병 또는 병태에 연루된 조직이다.
특정 구현예에서, 표적 조직은 종양, 종양 미세환경, 전이 부위, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 조직은 면역 조직이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 비면역 조직이다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 림프절, 비장, 2차 림프계 기관, 3차 림프계 기관, 장벽 조직, 피부, 장, 기도, 상처, 면역 조직, 비면역 조직, 또는 전술한 것들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 유효량은 표적 세포 및/또는 표적 조직에서 표적 단백질의 발현을 감소시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 상기 감소는 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 상기 감소는 약 10 내지 99%, 예를 들어 약 10 내지 98%, 15 내지 98%, 15 내지 97%, 20 내지 97%, 20 내지 96%, 25 내지 96%, 25 내지 95%, 30 내지 95%, 30 내지 94%, 35 내지 94%, 35 내지 93%, 40 내지 93%, 40 내지 92%, 45 내지 92%, 45 내지 91%, 50 내지 91%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 70 내지 75%이다.
특정 구현예에서, 유효량은 표적 세포 및/또는 표적 조직에서 표적 단백질의 발현을 증가시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 상기 증가는 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 상기 증가는 약 10 내지 99%, 예를 들어 약 10 내지 98%, 15 내지 98%, 15 내지 97%, 20 내지 97%, 20 내지 96%, 25 내지 96%, 25 내지 95%, 30 내지 95%, 30 내지 94%, 35 내지 94%, 35 내지 93%, 40 내지 93%, 40 내지 92%, 45 내지 92%, 45 내지 91%, 50 내지 91%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 70 내지 75%이다. 일부 구현예에서, 상기 증가는 약 1 내지 100배, 예를 들어 약 1 내지 75배, 1 내지 50배, 1 내지 25배, 1 내지 20배, 1 내지 15배, 1 내지 10배, 1 내지 8배, 1 내지 6배, 1 내지 5배, 1 내지 4배, 1 내지 3배 또는 1 내지 2배이다.
일부 구현예에서, 유효량은 핵 인자 카파 B(NF-κB) 신호전달, 성장-인자 신호전달, 세포 사멸(예를 들어, 아폽토시스), 세포 주기(예를 들어, 유사분열), 세포 이동, 염증, 또는 전술한 것들의 조합을 조절하기에 충분하다.
진단 및 치료 방법
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 질병 또는 병태를 검출하거나, 질병 또는 병태 발생 가능성(또는 위험 수준)을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 샘플에서의 표적 단백질의 발현 또는 활성 수준은 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된 약물 및/또는 진단 검사에 의해 표적화된 질병이다. 특정 구현예에서, 질병 또는 병태는 임상 연구 중인 약물 및/또는 진단 검사에 의해 표적화된 질병이다. 일부 구현예에서, 질병은 면역 매개 질병, 특발성 질병, 유전적 질병, 암(예를 들어, 종양), 대사 질병, 또는 이들의 조합이다. 특정 구현예에서, 질병 또는 병태는 GWAS, TCGA, 전체 게놈 서열분석, PheWAS, eQTL 연구, 또는 이들의 조합과 관련된다(예를 들어, 단락 [0219] 및 [0220]에 열거된 질병, 병태 또는 질병 전단계).
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 예측된 질병 또는 병태 발생 가능성에 기초하여 대상체를 분류하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체의 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계; 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성에 기초하여 질병 또는 병태 발생 가능성을 예측하는 단계; 및 예측된 가능성에 기초하여 환자를 분류하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 질병 또는 병태를 갖는 대상체 세트를 계층화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세트 내의 개별 대상체의 샘플에서 표적 단백질의 발현 및/또는 활성을 정량화하는 단계; 및 샘플에서 표적 단백질의 발현 및/또는 활성의 개별 대상체 수준에 따라 치료를 위한 대상체 세트를 계층화하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 적절한 대조군(예를 들어, 참조 표준)에 비해, 대상체의 샘플에서의 표적 단백질의 더 높은 발현 또는 활성 수준은 질병 또는 병태를 나타내거나 질병 또는 병태 발생 가능성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 적절한 대조군(예를 들어, 참조 표준)에 비해, 대상체의 샘플에서의 표적 단백질의 더 낮은 발현 또는 활성 수준은 질병 또는 병태를 나타내거나 질병 또는 병태 발생 가능성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 병태 발생 가능성을 갖는(또는 위험이 있는) 것으로 결정되거나 예측되는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 작용제 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 질병 또는 병태 발생 가능성을 갖는 것으로 결정되거나 예측되는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 작용제 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 검출하는 데 유용한 샘플의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 대상체로부터 샘플을 얻거나 이미 얻은 단계;
b) 프로테아제 억제제, 대조 펩티드, 표준 펩티드, 또는 이들의 조합을 샘플에 첨가하여, 암 발생 가능성을 검출하는 데 유용한 샘플을 제조하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 제조된 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계
를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본원에 개시된 작용제 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본원에 개시된 작용제 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 대상체는 본원에 개시된 표적 단백질의 발현 및/또는 활성의 변경된 수준을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료" 및 "치료하는"은 질병, 병리학적 병태 또는 장애를 개선, 완화, 안정화(즉, 악화하지 않음), 예방 또는 치유하려는 의도로 대상체의 의학적 관리를 지칭한다. "치료"는 적극적인 치료(질병, 병리학적 병태 또는 장애를 개선하기 위한 치료), 인과적 치료(연관 질병, 병리학적 병태 또는 장애의 원인에 대한 치료), 완화 치료(증상 완화를 위해 고안된 치료), 예방적 치료(연관 질병, 병리학적 병태 또는 장애의 발병을 최소화하거나 부분적으로 또는 완전히 억제하는 치료); 및 지지 치료(다른 요법을 보완하기 위해 사용되는 치료)를 포함한다. 치료는 또한 검출 가능 여부에 관계없이 질병 또는 병태의 범위를 감소시키는 것; 질병 또는 병태의 확산 방지; 질병 또는 병태의 진행을 지연시키거나 늦추는 것; 질병 또는 병태의 개선시키거나 완화시키는 것; 및 관해(부분 또는 전체)를 포함한다. 질병 또는 병태의 "개선" 또는 "완화"는 치료가 없을 때 정도 또는 시간 경과와 비교하여 질병, 장애 또는 병태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되고/되거나 진행의 시간 경과가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 포함한다. 치료를 필요로 하는 사람은 병태 또는 장애가 이미 있는 사람뿐만 아니라 병태 또는 장애가 있는 경향이 있는 사람 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 동물이다. 다른 구현예에서, 대상체는 조류, 예를 들어 암탉, 수탉, 칠면조 또는 앵무새이다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 비인간 포유동물의 비제한적인 예에는 소(예를 들어, 젖소 또는 육우), 양, 염소, 돼지, 말, 개, 고양이, 마우스, 래트 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 인간은 신생아이다. 일부 구현예에서, 인간은 소아 환자이다. 일부 구현예에서, 인간은 청소년이다. 일부 구현예에서, 인간은 성인이다. 일부 구현예에서, 인간은 18세 미만이다. 일부 구현예에서, 인간은 적어도 18세이다. 일부 구현예에서, 인간은 18세 내지 25세이다. 일부 구현예에서, 인간은 적어도 25세, 예를 들어 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80세이다.
본원에 사용되는 용어 "유효량", "치료적 유효량", 또는 "충분한 양"은 대상체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간 암 환자)에게 투여될 때, 세포, 조직 또는 임상 수준 등에서의 효과를 포함한, 치료를 달성하기에(예를 들어, 유익하거나 원하는 결과를 생성하기에) 충분한 양을 지칭한다. 이와 같이, 이 용어는 적용되는 맥락에 따라 달라진다. 예를 들어, 암을 치료하는 맥락에서, 이는 작용제를 투여하지 않고 얻은 반응과 비교하여 반응을 달성하기에 충분한 작용제의 양이다. 그러한 양에 상응하는 본원에 기재된 주어진 조성물의 양은 주어진 작용제, 약제학적 제형, 투여 경로, 질병 또는 장애의 유형, 대상체의 특성(예를 들어, 연령, 성별, 체중) 또는 치료를 받는 숙주 등과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이지만, 그럼에도 불구하고 당업자가 일상적으로 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물의 "치료적 유효량"은 (예를 들어, 대조군과 비교하여) 대상체에서 유익하거나 원하는 결과를 초래하는 양이다. 본 개시내용의 조성물의 치료적 유효량은 당업계에 알려진 일상적인 방법에 의해 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 투여 요법(dosage regimen)은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
본원에 기재된 치료제는, 예를 들어 경구, 식이, 국소, 경피, 직장, 비경구(예를 들어, 동맥내, 정맥내, 근육내, 피하 주사, 피내 주사), 정맥내 주입 및 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내 또는 경구 흡입, 비강내 점적제) 투여 경로를 포함하는, 화합물 및 치료할 특정 질병 또는 병태에 따라 달라지는 다양한 투여 경로로 투여될 수 있다. 투여는 지시된 바와 같이 국소적이거나 전신적일 수 있다. 바람직한 투여 방식은 선택된 특정 화합물에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가의 치료제(예를 들어, 제2 치료제)의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
2개 이상의 치료제의 투여는 약제학적 조합과 같이 실질적으로 동시적인 방식으로 치료제를 동시 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 치료제에 대한 다중 용기 또는 별도의 용기(예를 들어, 캡슐, 분말 및 액체)에서의 동시 투여를 포함한다. 이러한 투여는 또한 거의 동시에 또는 상이한 시간에 순차적인 방식으로 치료제를 사용하는 것을 포함한다. 2개 이상의 치료제가 투여되는 경우, 치료제는 동일한 투여 경로를 통해 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질 또는 이의 변이체의 발현 또는 활성을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를 본원에 개시된 작용제 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 표적 단백질(예를 들어, 서열 목록의 표적 단백질)의 발현 및/또는 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 표적 단백질을 포함하는 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플, 예컨대 세포 또는 조직)을 작용제(예를 들어, 표적의 발현 및/또는 활성을 조절하는 능력에 대해 시험되는 후보 작용제)와 접촉시키는 단계; 및
b) 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하며,
여기서, 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 차이는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 단백질의 발현 또는 활성에서의 적어도 약 10%의 차이는 작용제가 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 차이는 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 또는 그 이상이다.
일부 구현예에서, 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 감소는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 억제한다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 참조와 비교하여 단백질의 발현 또는 활성에서의 증가는 작용제가 단백질의 발현 또는 활성을 활성화한다는 것을 나타낸다.
적응증의 비제한적인 예
GWAS-관련 질병 또는 병태
일부 구현예에서, GWAS-관련 질병 또는 병태는 복부 대동맥류, 염색체 분리의 비정상, 이완불능증, 여드름, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 애디슨병, 청소년 특발성 척추측만증, 성인 발병 천식, 연령-관련 청력 손상, 연령-관련 황반 변성, 연령-관련 핵백내장, AIDS, 알코올 남용, 알코올 의존증, 알코올성 간경변증, 알코올성 췌장염, 알레르기성 비염, 알레르기, 탈모증, 원형 탈모증, 알츠하이머병, 약시, 근위축성 측삭 경화증, 안드로겐성 탈모증, 빈혈, 협심증, 발목 손상, 강직성 척추염, 항문직장 기형, 신경성 식욕부진, 전안방 포도막염, 항-호중구 항체 관련 혈관염, 항-토포이소머라제-I-항체-양성 전신 경피증, 불안, 아스파라기나제-유도 급성 췌장염, 아스퍼거 증후군, 아스피린-유도 천식, 천식, 아토피성 천식, 아토피성 습진, 심방 세동, 위축성 위염, 위축성 황반 변성, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 비정형 대퇴 골절, 자폐 스펙트럼 장애, 자가면역 질병, 자가면역 간염, 자가면역 갑상선 질병, 무정자증, 요통, 세균성 수막염, 대머리(balding), 기저 세포 암종, B-세포 급성 림프아구성 백혈병, 베체트 증후군, 벨 마비, 양성 전립선 비대증, 담즙성 간경변증, 양극성 장애, 방광 암종, 골절, 뇌 동맥류, 뇌경색, 유방 암종, 신경성 과식증, 수포성 유사천포창, 암, 심부정맥, 심장 비대, 심장독성, 심혈관 질병, 심혈관 질병, 심근 경색, 손목 터널 증후군, 백내장, 복강 질병, 중추 신경계 암, 중추 신경계 비호지킨 림프종, 뇌 아밀로이드 맥관병증, 경부 암종, 경부 상피내 신생물 등급 2/3, 샤가스 심근병증, 소아 발병 천식, 담낭염, 담석증, 맥락막 흑색종, 만성 중심성 중증 망막병증, 만성 B형 간염 바이러스 감염, 만성 C형 간염 바이러스 감염, 만성 신장 질병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 폐색성 폐 질병, 만성 비부비동염, 흡연 중독, 간경변증, 구순열, 구개열, 클론성 조혈증, 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 감염, 코카인 의존증, 결장 용종, 결직장 선종, 결직장암, 행동 장애, 선천성 좌심장 병변, 원추동맥간 심장 기형(conotruncal heart malformation), 관상 동맥류, 관상 동맥 질병, 피질기저핵 변성, COVID-19, 크로이츠펠트-야콥병, 크론병, 피부 비만세포증, 피부 흑색종, 피부 편평 세포 암종, 치매, 뎅기 출혈열, 치아 우식증, 우울증, 피부근염, 발달성 고관절 이형성증, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 망막병증, 미만성 대 B-세포 림프종, 소화기계 감염성 질병, 확장 심근병증, 게실 질병, 게실염, 약물 유발성 무과립증, 약물 유발성 간 손상, 십이지장 궤양, 듀푸이트렌 구축(Dupuytren contracture), 섭식 장애, 습진, 자궁내막 암종, 자궁내막 신생물, 자궁내막증, 호산구성 식도염, 상피모양 세포 포도막 흑색종, 엡스타인-바 바이러스 감염, 식도 선암종, 식도 정맥류, 본태성 진전, 에스트로겐-수용체 음성 유방암, 유잉 육종, 박피 증후군, 탐색적 안구 운동 측정, 간외 담관 암종, 안면 주름, 가족성 QT 간격 연장 증후군, 가족성 동기능부전 증후군, 열성 발작(3개월 내지 6세 연령 범위 이내), 여성 생식기계 질병, 국소 분절 사구체경화증, 전두부 섬유화 탈모증, 동결견(frozen shoulder), 담석, 위선암종, 위암종, 위궤양, 위식도 역류 질병, 녹내장, 신경교종, 당뇨(glycosuria), 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 두경부 악성 신생물, 두경부 편평 세포 암종, 청력 손실, 심부전, 혈뇨, 치질, 헤노흐-쇤라인 자반증, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 헤로인 의존증, 대상 포진, 해마 위축증, 히르슈스프룽병(Hirschsprung disease), HIV-1 감염, 호지킨 림프종, 인간 유두종 바이러스 감염, 헌팅턴병, 원시(hypermetropia, hyperopia), 고혈압, 갑상선 기능항진증, 고트리글리세라이드혈증, 비대성 심근병증, 고뇨산혈증, 저알부민혈증, 요도하혈, 갑상선 기능저하증, 특발성 폐 섬유증, IGA 사구체신염, 면역계 질병, 영아 비대성 유문 협착증, 염증성 장 질병, A형 인플루엔자(H1N1) 감염, 서혜부 탈장, 불면증, 간질성 폐 질병, 뇌내 출혈, 과민성 장 증후군, 허혈성 뇌졸중, 청소년 특발성 관절염, 각질세포 암종, 원추각막, 무릎 통증, 언어 장애, 대동맥 뇌졸중, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병, 후발성 알츠하이머병, 후발성 중증 근무력증, 나병, 백혈구감소증, 루이소체형 치매, 국한성 경피증, 간 질병, 간 신생물, 요추간판 변성, 폐 선암종, 폐 암종, 루푸스 신장염, 당뇨병의 대혈관 합병증, 황반 모세혈관확장증 2형, 주요 우울 장애, 말라리아, 남성 불임, 변연부 B-세포 림프종, 비만세포증, 흑색종, 막성 사구체신염, 월경과다증, 정신 황폐(mental deterioration), 대사율 측정, 대사 증후군, 전이 측정, 전이성 결직장암, 편두통 장애, 중등도 알부민뇨, 어금니-절치 저광화증(molar-incisor hypomineralization), 단일클론 감마병증, 기분 장애, 모야모야병, 점막피부 림프절 증후군, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 다발성 전신 위축증, 골수증식성 장애, 심근 경색, 근시, 근염, 탈력발작을 동반하는 기면증, 비강 용종, 비인두 신생물, 신생아 전신 홍반성 루푸스, 신증후군, 신경아세포종, 신경증 장애, 니코틴 의존증, 결절성 경화증, 호지킨 림프종, 비알코올성 지방간 질병, 비알코올성 지방성 간염, 비엽상 뇌내 출혈, 비흑색종 피부 암종, 비폐색성 관상동맥 질병, 비소세포 폐암 암종, 비만, 식도 암종, 강박 장애, 안구 유육종증, 소수관절형 청소년 특발성 관절염, 개방각 녹내장, 오피오이드 사용 장애, 구강암, 구강 궤양, 구인두암, 변형성 골염, 골관절염, 고관절 골관절염, 무릎 골관절염, 골괴사, 골다공증, 골육종, 난소 암종, 난소 자궁내막모양 암종, 난소 장액성 암종, 통증, 췌장 암종, 공황 장애, 파킨슨병, 병리학적 근시, 심상성 천포창, 소화성 궤양 질병, 치주염, 말초 동맥 질병, 말초 신경병증, 인공관절 주변 골용해증, 폐렴, 다발성근염, 담낭의 용종, 수술 후 감각 장애, 자간전증, 원발성 폐쇄각 녹내장, 원발성 담즙성 간경변증, 프리온병, 진행성 핵상 마비, 증식성 당뇨병성 망막병증, 전립선 암종, 단백뇨, 가뇌종양, 건선, 심상성 건선, 폐 비결핵성 마이코박테리아 감염, 난치성 아토피성 피염, 신세포 암종, 호흡기계 질병, 열공성 망박 박리, 류마티스성 심장 질병, 류마티스성 관절염, 회전근개 파열, SAPHO 증후군(활막염, 여드름, 농포증, 골과형성, 골염 증후군), 유육종증, 성홍열, 정신분열병, 경화성 담관염, 계절성 알레르기성 비염, 선택적 IgA 결핍 질병, 패혈증, 어깨 충돌 증후군, 쇼그렌 증후군, 피부암, 피부 신생물, 일광에 대한 피부 민감성, 소세포 폐 암종, 소혈관 뇌졸중, 자발성 조산, 산발성 근위축성 측삭 경화증, 산발성 크로이츠벨트-야콥병, 산발성 크로이츠벨트-야콥병, 편평 세포 암종, 편평 세포 폐 암종, 협착성 건초염, 스티븐스-존슨 증후군, 위 용종, 스트레스-관련 장애, 뇌졸중, 물질 남용, 급성 심정지, 일광화상, 전신 청소년 특발성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 전신 비만세포증, 전신 경피증, 타카야스 동맥염, 고환 암종, 고환 생식 세포 종양, 갑상선 암종, 갑상선 중독성 주기성 마비, 이명, 치아 발육 부전, 치아 우식증, 뚜렛 증후군, 삼중 음성 유방암, 열대성 강직성 하반신 마비, 결핵, 1형 진성 당뇨병, 2형 진성 당뇨병, 궤양성 결장염, 단극성 우울증, 상부 호흡소화관 신생물, 요로결석증, 자궁 근종, 포도막 흑색종, 정맥류, 혈관성 치매, 정맥 혈전색전증, 비타민 D 결핍증, 백반증, 또는 습성 황반 변성, 또는 이들의 조합이다.
TCGA-관련 질병 또는 병태
일부 구현예에서, TCGA-관련 질병 또는 병태는 담도암, 방광 요로상피암, 골암, 뇌 다형성 교아세포종, 뇌 저등급 신경교종, 유방암, 경부 편평 세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 장애, 결장 선암종, 조기 발병 전립선암, 식도 선암종, 위 선암종, 위암, 두경부 편평 세포 암종, 발생성 신세포 암종, 신장 투명 신세포 암종, 신장 유두상 신세포 암종, 간암, 폐 선암종, 폐 편평 세포 암종, 림프성 신생물 미만성 대 B-세포 림프종, 악성 림프종, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 흑색종, 또는 자궁체부 자궁내막 암종, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 질병 또는 병태의 발생을 둔화시킨다(예를 들어, 억제한다)(예를 들어, 암 세포 성장, 증식, 전이, 침습 및/또는 이동을 억제한다).
일부 구현예에서, 유효량은 본원에 기재된 질병 또는 병태의 발생을 둔화시키기에(예를 들어, 억제하기에) 충분하다.
일부 구현예에서, 유효량은 질병 또는 병태의 발생을 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 둔화시키기에 충분하다. 특정 구현예에서, 유효량은 질병 또는 병태의 발생을 약 10 내지 99%, 예를 들어 약 10 내지 98%, 15 내지 98%, 15 내지 97%, 20 내지 97%, 20 내지 96%, 25 내지 96%, 25 내지 95%, 30 내지 95%, 30 내지 94%, 35 내지 94%, 35 내지 93%, 40 내지 93%, 40 내지 92%, 45 내지 92%, 45 내지 91%, 50 내지 91%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 70 내지 75% 둔화시키기에 충분하다.
일부 구현예에서, 치료는 본원에 기재된 질병 또는 병태의 증상을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 유효량은 본원에 기재된 질병 또는 병태의 증상을 감소시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, 감소는 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 일부 구현예에서, 감소는 약 10 내지 99%, 예를 들어 약 10 내지 98%, 15 내지 98%, 15 내지 97%, 20 내지 97%, 20 내지 96%, 25 내지 96%, 25 내지 95%, 30 내지 95%, 30 내지 94%, 35 내지 94%, 35 내지 93%, 40 내지 93%, 40 내지 92%, 45 내지 92%, 45 내지 91%, 50 내지 91%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 70 내지 75%이다.
일부 구현예에서, 유효량은 대상체의 사망을 방지하기에 충분하며, 이를 통해 사망률을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 사망률의 감소는 적어도 약 10%, 예를 들어 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 특정 구현예에서, 사망률의 감소는 약 10 내지 99%, 예를 들어 약 10 내지 98%, 15 내지 98%, 15 내지 97%, 20 내지 97%, 20 내지 96%, 25 내지 96%, 25 내지 95%, 30 내지 95%, 30 내지 94%, 35 내지 94%, 35 내지 93%, 40 내지 93%, 40 내지 92%, 45 내지 92%, 45 내지 91%, 50 내지 91%, 50 내지 90%, 55 내지 90%, 55 내지 85%, 60 내지 85%, 60 내지 80%, 65 내지 80%, 65 내지 75%, 또는 70 내지 75%이다.
일부 구현예에서, 유효량은 본원에 기재된 질병 또는 병태에 연루된 세포에서 표적 단백질의 발현을 조절하기에(예를 들어, 증가시키거나 감소시키기에) 충분하다.
일부 구현예에서, 유효량은, 예를 들어 본원에 기재된 질병 또는 병태에 대한 신체 반응을 조절하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 면역계를 활용하는 치료(예를 들어, 면역-항암요법)를 제공한다. 또 다른 추가의 구현예에서, 면역계는 선천 면역계이다. 일부 구현예에서, 면역계는 적응 면역계이다. 또 다른 추가의 구현예에서, 치료는 체액성 면역 또는 항체-매개 면역에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 치료는 세포-매개 면역, 예컨대 암에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 초기 병기 질병 진행 시 또는 그 전의 치료에 관한 것인 한편, 다른 구현예에서, 상기 방법은 말기 병기 질병 진행 시의 치료 또는 말기 병기 질병 진행의 예방에 관한 것이다.
일부 구현예(예를 들어, 면역-항암요법 특이적 치료)에서, 유효량은 면역 세포-관련 판독값, 면역 세포(예를 들어, 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포 및/또는 대식세포) 및/또는 T 세포)의 이동, 면역 세포의 증식, 면역 세포(예를 들어, 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포 및/또는 대식세포), 단핵구, T 세포, 및/또는 B 세포)의 동원, 림프절 신경지배, 면역 세포(예를 들어, 수지상 세포 및/또는 T 세포)의 림프절 귀소, 면역 세포(예를 들어, 수지상 세포 및/또는 T 세포)의 림프절 배출, 면역 세포의 분화, 면역 세포의 활성화, 면역 세포의 극성화, 사이토카인 생성(예를 들어, 전염증성 사이토카인 생성 증가, 전염증성 사이토카인 생성 감소, 항염증성 사이토카인 생성 증가, 항염증성 사이토카인 생성 감소), 면역 세포의 탈과립화, 면역 세포의 성숙, 면역 세포의 ADCC, 면역 세포의 ADCP, 항원 제시, 표적 단백질 발현, 또는 전술한 것들의 조합을 조절하기에(예를 들어, 증가시키거나 감소시키기에) 충분하다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어 또는 전문 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖고자 한다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에 이러한 정의를 포함하는 것이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어서는 안 된다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의된 용어와 같은 용어는 관련 기술의 맥락 및/또는 본원에서 달리 정의된 바와 같은 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다는 것이 추가로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하고자 함이 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 부정관사("a", "an") 및 "그"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본원 및 이어지는 청구범위 전체에서, 단어 "포함하다" 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은, 예를 들어 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 포함함을 의미하는 것으로 이해될 것이고 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 제외하 것을 의미하지 않는다. 본원에서 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이루어진"은 청구 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때, "필수적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. "포함하는", "함유하는", "포함하는" 및 "갖는"이라는 용어 중 임의의 것은 본 개시내용의 양태 또는 구현예의 맥락에서 본원에서 사용될 때마다 일부 구현예에서, 본 개시내용의 범주를 다양하게 하기 위해 용어 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"으로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 선택 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소가 없는 두 번째 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소를 함께 적용할 수 있는 가능성을 지칭한다. 이들 옵션 중 임의의 하나는 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 충족한다. 하나 이상의 옵션을 동시에 적용할 수 있는 것도 의미에 속하는 것으로 이해되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 충족한다.
목록이 제시될 때, 달리 언급되지 않는 한, 그 목록의 각각의 개별 요소 및 그 목록의 모든 조합은 별개의 구현예라는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, "A, B, 또는 C"로 제시된 구현예의 목록은 "A", "B", "C", "A 또는 B", "A 또는 C", "B 또는 C" 또는 "A, B 또는 C"같은 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1: 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질의 검증
이 실시예는 지금까지 알려지지 않은 작용 기전을 갖는 질병과 연관된 (게놈 전체 연관 연구(GWAS)에 의해 결정된) 돌연변이(들)를 함유하는 본 개시내용의 표적 단백질의 검증을 보여준다. 구체적으로, Th17 자가면역 질병과 연관된 GWAS는, 주석이 달린 단백질은 없지만 본 개시내용의 방법에 의해 확인된 표적 단백질이 있는 유전자간 좌(intergenic locus)에 매핑된다.
일시적 녹아웃(knock-out) 및 녹인(knock-in) 세포주는 표적 단백질이 녹아웃되거나 대체 SNP 대립유전자 표적 단백질이 야생형을 대체하는 1차 PHA 블라스트 T-세포에서 CRISPR-Cas9에 의해 생성한다. STAT3, STAT1, 및 IL-6 활성화 수준은 IL-23, IL-12 및 IL-6에 의한 짧은 자극의 전과 후에 평가된다. IL-23 및 IL-17은 STAT3 활성화를 자극하는 Th17 경로-유도 사이토카인이다(doi:10.1038/cmi.2017.128). 가설: 표적 단백질의 SNP 대립유전자는 야생형 대립유전자보다 유의하게 더 높은 수준으로 STAT3을 유도하지만 STAT1 또는 NF-kb는 그렇지 않다. 표적 단백질의 녹아웃은 STAT3 활성을 감소시킨다.
재료 및 방법:
PHA 블라스트 생성: 신선한 또는 냉동된 1차 인간 PBMC를 10 ng/ml의 rhIL-2를 첨가한 PBMax 핵형분석(Karyotyping) 배지에 3 내지 4일 동안 넣어둔다.
표적 단백질의 녹아웃 및 녹인은 표적 단백질에 특이적인 가이드를 사용하여 전기천공(Idtdna.com)을 통해 형질감염된 RNP 입자를 통해 CRISPR-Cas9Alt-R 녹아웃으로 달성된다.
STAT3, STAT1, 및 NF-kB 활성화 검정: PHA 블라스트 세포를 약 1000만개의 세포/ml로 80 μl로 96웰 플레이트에 넣는다. 세포를 3 내지 4시간 동안 혈청을 결핍시키고, 이어서 IL-23, IL-12 또는 IL-6을 30분 동안 첨가한다. 세포를 수집하고, 세포 추출물을 포스포(phospho)-STAT3, STAT1, 또는 NF-kB ELISA에 의해 검정한다.
종합하면, 이들 시험은 자가면역 질병과 연관된 GWAS 대립유전자를 함유하는 표적 단백질이 STAT3에 대해서는 더 두드러진 활성화 효과를 갖지만 STAT1 또는 NF-kB에 대해서는 그렇지 않다는 것을 입증하며, 이는 표적 단백질이 자가면역 질병의 호전을 위한 잠재적인 표적임을 강력하게 시사한다.
실시예 2: 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질의 검증. 예측된 TM 단백질의 과발현은 종양 세포의 증식 증가로 이어진다. 해당 단백질의 알려진 TCGA 돌연변이체는 더 강한 효과를 갖는다.
이 실시예는, 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질, 서열번호 5391의 검증을 보여준다. 구체적으로, 서열번호 5391은 결장 선암종을 앓고 있는 환자들의 상당한 부분에서 발생하는 알려진 TCGA 돌연변이체를 함유하는 표적 단백질이다. 본 발명자들은 결장암 세포주 HCT116 세포에서 과발현된 서열번호 5391이 그러한 세포의 증식을 유의하게 증가시킴을 입증한다. 중요한 점은, TCGA P31L 돌연변이를 함유하는 서열번호 5391의 돌연변이체 버전이 야생형 서열번호 5391보다 유의하게 더 강한 효과를 가지고 있다는 것이며, 이는 TCGA 돌연변이체가 암성 표현형에 대한 유전적 동인이라는 것과 일치한다.
실험 설계:
표적 단백질 또는 대조군을 인코딩하는 단백질 과발현 플라스미드를 다수의 세포주 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, WST-1 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다.
재료 및 방법:
100 μL의 세포 배양 배지 중 웰당 4,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트 내로 관심 세포를 시딩한다. 세포를 5% CO2가 포함된 37℃의 가습 인큐베이터 내에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 리포펙타민 3000(Thermo Fisher)을 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher) 중에 희석하여 최종 농도가 30 μL/mL가 되도록 한다. DNA(관련 대조군 또는 표적 단백질을 인코딩하는 pcDNA3.1 과발현 플라스미드(Thermo Fisher)) 및 P3000을 Opti-MEM 배지 중에 희석하여 최종 농도가 10 μg/mL(DNA) 및 20 μL/mL(P3000)가 되도록 한다. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민 3000 시약과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 세포에 적가하고, 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하여 혼합물을 균일하게 분포시킨다. 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 10 μL의 WST-1 시약(Abcam)을 웰에 직접 첨가하고, 빛으로부터 보호된 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터 내에서 37℃에서 45분 동안 플레이트를 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 650 nm의 참조 파장을 사용하여 백그라운드 흡광도를 보정할 수 있다. 각각의 웰의 흡광도로부터 블랭크(배지 단독)의 흡광도를 차감하고, 결과를 대조군의 백분율로서 표현함으로써 각각의 웰 내의 생존가능 세포의 백분율을 계산한다.
결론:
서열번호 5391은 고혈청 조건 하에서 결장암 세포(HCT116 세포주)의 증식을 증가시키는, 신규의 주석이 달리지 않은 단백질이다. 흥미롭게도, 서열번호 5391은 다수의 암 환자에서 발생하는 것으로 알려진 TCGA 돌연변이(P31L)를 함유하지만, 종양형성 과정 및 기전에 대한 중요성은 이전에 알려지지 않았다. 본 발명자들은 P31L 돌연변이가 과발현된 표적 단백질 내에 포함되었을 때, 증식에 대한 효과가 유의하게 더 두드러진다는 것을 입증한다. 따라서, 서열번호 5391 및 서열번호 5391_P31L은 둘 다 암의 유전적 동인이며 항암 요법을 위한 표적 단백질이다(도 1).
실시예 3: 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질의 검증. 예측된 TM 단백질의 과발현은 종양 세포의 증식 증가로 이어진다.
이 실시예는, 질병의 유전적 동인으로서의 다수의 표적 단백질, 서열번호 4538, 서열번호 5392, 서열번호 4335의 검증을 보여준다. 본 발명자들은 다수의 세포주에서의 이들 막관통 단백질의 유전적 과발현이 그러한 세포의 증식을 유의하게 증가시킴을 입증한다. 따라서, 이들 세포외 막관통 단백질은 항증식성 암 약물에 대한 매력적인 표적이 되게 한다.
실험 설계: 표적 단백질 또는 대조군을 인코딩하는 단백질 과발현 플라스미드를 다수의 세포주 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후에, WST-1 검정을 사용하여 세포 증식을 측정하였다.
재료 및 방법: 100 μL의 세포 배양 배지 중 웰당 4,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트 내로 관심 세포를 시딩한다. 세포를 5% CO2가 포함된 37℃의 가습 인큐베이터 내에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 리포펙타민 3000(Thermo Fisher)을 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher) 중에 희석하여 최종 농도가 30 μL/mL가 되도록 한다. DNA(관련 대조군 또는 표적 단백질을 인코딩하는 pcDNA3.1 과발현 플라스미드(Thermo Fisher)) 및 P3000을 Opti-MEM 배지 중에 희석하여 최종 농도가 10 μg/mL(DNA) 및 20 μL/mL(P3000)가 되도록 한다. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민 3000 시약과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 세포에 적가하고, 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하여 혼합물을 균일하게 분포시킨다. 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 10 μL의 WST-1 시약(Abcam)을 웰에 직접 첨가하고, 빛으로부터 보호된 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터 내에서 37℃에서 45분 동안 플레이트를 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 650 nm의 참조 파장을 사용하여 백그라운드 흡광도를 보정할 수 있다. 각각의 웰의 흡광도로부터 블랭크(배지 단독)의 흡광도를 차감하고, 결과를 대조군의 백분율로서 표현함으로써 각각의 웰 내의 생존가능 세포의 백분율을 계산한다.
서열번호 5391은 고혈청 조건 하에서 결장암 세포(HCT116 세포주)의 증식을 증가시키는, 신규의 주석이 달리지 않은 단백질이다(도 2, 또한 표 C 참조).
[표 C]
실시예 4. 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질의 검증.
목적: 열거된 이 실시예는 신규 ORF의 아미노산 서열을 변경시키는 유전적 변이체에 의한 순환 인자의 조절을 검증한다. 서열번호 4371은 대사 질병, 즉, 2형 당뇨병과 관련된 인간 유전적 변이체(rs221797)를 함유한다. 서열번호 4371의 4개의 유전적 버전(V, A, G, D)은 HiBiT 검정을 사용하여 분비에서 변이체-의존적 차이를 나타내는 신규 펩티드이다. 이는 신규 펩티드의 질병-관련 버전이 분비 수준을 조절하는 방법을 입증하였으며, 이는 유전적 질병 조절제의 분비된 버전을 확인하는 데 잠재적인 치료적 관련성을 갖는다.
실험 설계: Promega의 Nano-Glo® HiBiT 용해 검출 시스템(Lytic Detection System)(Cat No N3030)을 사용하여, 분비 조절에 대한 GWAS 변이체의 효과를 평가하였다. 서열의 상이한 버전을 함유하는 HiBiT 발현 벡터를 HEK293T 세포 내로 형질감염시키고, 세포 용해물에서 HiBiT-태그된 단백질의 발광을 측정함으로써 분비를 결정하였다.
방법 및 재료: 서열번호 4371의 유전적 버전 각각을 HiBiT 발현 벡터 내로 클로닝하였다. HEK293T 세포를 웰당 50k로 96웰 플레이트 내로 플레이팅하고, 리포펙타민 3000 및 DNA(서열을 함유하는 HiBiT 발현 벡터)로 형질감염시켰다. Promega의 Nano-Glo® HiBiT 용해 검출 시스템(Lytic Detection System)(Cat No N3030)을 사용하여 분비를 측정하였다. Nano-Glo® HiBiT 용해 검출 시스템은 간단한 첨가-혼합-판독(add-mix-read) 검정 프로토콜을 사용하여 세포 용해물에서 HiBiT-태그된 단백질을 민감하게 정량화한다. HiBiT는, 관심 단백질의 N 또는 C 말단에 융합되거나 단백질 구조 내의 접근 가능한 위치 내로 삽입된 11-아미노산 펩티드 태그이다. 세포에서 발현되는 HiBiT-태그된 단백질의 양은 기질 푸리마진 및 NanoLuc® Binary Technology(NanoBiT®; 1)에서 사용되는 큰 하위단위인 Large BiT(LgBiT)를 함유하는 용해 검출 시약을 첨가함으로써 결정된다. HiBiT는 LgBiT에 단단히 결합하여(KD = 0.7 nM), 세포 용해물에서 복합체 형성을 촉진시켜 밝은 발광 효소를 생성한다. 발광의 양은 세포 용해물에서 HiBiT-태그된 단백질의 양에 비례한다. 관심 단백질은 HiBiT 발현 벡터를 사용하여 N 또는 C 말단에서 HiBiT로 태그될 수 있다.
결론: 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 4371의 인간 유전적 변이체는 이들 펩티드의 분비 수준을 변화시킨다. rs221797 V-to-A는 분비에 효과가 없는 한편(1개의 소수성 아미노산이 또 다른 소수성 아미노산으로 대체됨), rs221797 V-to-G 및 V-to-D는 분비를 유의하게 감소시키며, 하전된 아미노산(D)으로 치환한 것이 가장 큰 효과를 갖는다. 이는 질병-관련 유전적 변이가 순환계에서 이들 펩티드의 상대적 수준을 조절하는 방법을 입증하였다.
실시예 5. 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질의 검증. 신규 ORF의 안정한 과발현은 종양 세포의 증식 증가로 이어진다.
목적: 이 실시예는, 질병의 유전적 동인으로서의 표적 단백질, 서열번호 5404의 검증을 보여준다. 구체적으로, 서열번호 5404는 유방암 세포주 MCF-7 세포에서 과발현될 때 그러한 세포의 증식을 유의하게 증가시키는 표적 단백질이다.
실험 설계: 표적 단백질 또는 대조군을 인코딩하는 단백질 과발현 플라스미드를 다수의 세포주 내로 형질감염시켰다. 안정하게 발현하는 세포를 선택한 후, WST-1 검정을 사용하여 증식을 측정하였다.
재료 및 방법: 안정한 세포주: 항생제가 없는 2 mL의 세포 배양 배지 중 웰당 500,000개 세포의 밀도로 6웰 플레이트 내로 MCF-7 세포주를 시딩한다. 세포를 5% CO2가 포함된 37℃의 가습 인큐베이터 내에서 인큐베이션한다. 리포펙타민 3000(Thermo Fisher)을 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher) 중에 희석하여 최종 농도가 30 μL/mL가 되도록 한다. DNA(서열번호 5404를 인코딩하는 pcDNA3.1 과발현 플라스미드) 및 P3000(Thermo Fisher)을 Opti-MEM 배지 중에 희석하여 최종 농도가 10 μg/mL(DNA) 및 20 μL/mL(P3000)가 되도록 한다. 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민 3000 시약과 혼합하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 혼합물을 세포에 적가하고, 플레이트를 부드럽게 소용돌이치게 하여 혼합물을 균일하게 분포시킨다. 세포를 CO2 인큐베이터 내에서 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 10일 동안 퓨로마이신(2 μg/mL)을 사용하여 세포를 선택하였다.
WST-1 검정: 100 μL의 세포 배양 배지 중 웰당 4,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트 내로 관심 세포를 시딩한다. 세포를 5% CO2가 포함된 37℃의 가습 인큐베이터 내에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 10 μL의 WST-1 시약(Abcam)을 웰에 직접 첨가하고, 빛으로부터 보호된 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터 내에서 37℃에서 45분 동안 플레이트를 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 650 nm의 참조 파장을 사용하여 백그라운드 흡광도를 보정할 수 있다. 각각의 웰의 흡광도로부터 블랭크(배지 단독)의 흡광도를 차감하고, 결과를 대조군의 백분율로서 표현함으로써 각각의 웰 내의 생존가능 세포의 백분율을 계산한다.
결론: 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 5404는 저혈청 및 고혈청 조건 하에서 유방암 세포(MCF-7 세포주)의 증식을 증가시키는, 신규의 주석이 달리지 않은 단백질이다. 따라서, 서열번호 5404는 암의 유전적 동인이며 항암 요법을 위한 표적 단백질이다.
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고 문헌의 교시 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
예시적인 구현예를 구체적으로 나타내고 기재하였지만, 당업자는 첨부된 청구범위에 포함된 구현예의 범주 벗어나지 않고 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (55)

  1. 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질 또는 이의 변이체를 포함하고/하거나 이의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제(agent).
  2. 제1항에 있어서, 표적 단백질을 포함하는, 작용제.
  3. 제1항에 있어서, 표적 단백질의 발현을 조절하는, 작용제.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 전사체의 발현을 조절하는, 작용제.
  5. 제1항에 있어서, 표적 단백질의 활성을 조절하는, 작용제.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 소분자를 포함하는, 작용제.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는, 작용제.
  8. 제7항에 있어서, 표적 단백질의 억제제를 포함하는, 작용제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 억제제는 폴리펩티드인, 작용제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 표적 단백질에 결합하는 길항제 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 작용제.
  11. 제8항에 있어서, 상기 억제제는 폴리뉴클레오티드인, 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 유전자 전사체의 적어도 일부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 작용제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하는, 작용제.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함하는, 작용제.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 마이크로RNA(miRNA), 안타고미르, 가이드 RNA(gRNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 모르폴리노 핵산(MNA)인, 작용제.
  16. 제8항에 있어서, 상기 억제제는 소분자인, 작용제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 소분자는 표적 단백질에 결합하며, 이를 통해 표적 단백질의 활성을 감소시키는, 작용제.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는, 작용제.
  19. 제18항에 있어서, 표적 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 표적 단백질 또는 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드인, 작용제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 이의 변이체는 재조합 단백질 또는 합성 단백질인, 작용제.
  21. 제18항에 있어서, 상기 작용제는 표적 단백질의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 표적 단백질 또는 이의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드인, 작용제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA를 포함하는, 작용제.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터를 포함하는, 작용제.
  24. 제21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA를 포함하는, 작용제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 RNA는 메신저 RNA(mRNA) 및/또는 원형 RNA(circRNA)인, 작용제.
  26. 제18항에 있어서, 표적 단백질의 활성화제를 포함하는, 작용제.
  27. 제26항에 있어서, 상기 활성화제는 폴리펩티드인, 작용제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 표적 단백질에 결합하는 효능제(agonist) 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 작용제.
  29. 제26항에 있어서, 상기 활성화제는 소분자인, 작용제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 소분자는 표적 단백질에 결합하며, 이를 통해 표적 단백질의 활성을 증가시키는, 작용제.
  31. 제1항 내지 제8항, 제18항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 편집 시스템을 포함하는, 작용제.
  32. 제31항에 있어서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 트랜스포존-기반 유전자 편집 시스템, 및 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 시스템인, 작용제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 비-코딩 RNA로부터 번역되는, 작용제.
  34. 제33항에 있어서, 상기 비-코딩 RNA는 긴 유전자간 비-코딩 RNA(long intergenic non-coding RNA, lincRNA)인, 작용제.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 비처리된 전구체 mRNA(전구(pre)-mRNA)의 비-엑손 요소로부터 번역되는, 작용제.
  36. 제35항에 있어서, 상기 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 인트론인, 작용제.
  37. 제35항에 있어서, 상기 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 5'-비번역 영역(5'-UTR)인, 작용제.
  38. 제35항에 있어서, 상기 비-엑손 요소는 전구-mRNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR)인, 작용제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 작용제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 벡터인, 약제학적 조성물.
  41. 세포에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질 또는 이의 변이체의 발현 또는 활성을 조절하는 방법으로서,
    세포를 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 작용제 또는 제39항 또는 제40항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 작용제는 세포에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 작용제는 세포에서 표적 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대상체에 존재하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 게놈 전체 연관 연구(Genome-Wide Association Study, GWAS), 암 게놈 아틀라스(Cancer Genome Atlas, TCGA), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(phenome-wide association study, PheWAS), 발현 양적 형질 유전자좌(expression quantitative trait locus, eQTL) 연구, 또는 이들의 조합과 관련된 질병 또는 병태를 갖는, 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 표적 단백질의 발현 또는 활성을 적어도 10% 조절하는, 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 적어도 10% 조절하며, 이를 통해 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는, 방법.
  48. 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 예측하는 방법으로서,
    대상체의 샘플에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 샘플에서 표적 단백질의 발현 또는 활성 수준은 대상체의 암 발생 가능성을 나타내고, 질병 또는 병태는 게놈 전체 연관 연구(GWAS), 암 게놈 아틀라스(TCGA), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(PheWAS), 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 연구, 또는 이들의 조합과 관련되는, 방법.
  49. 대상체의 질병 또는 병태 발생 가능성을 검출하는 데 유용한 샘플을 제조하는 방법으로서,
    a) 대상체로부터 샘플을 얻거나 이미 얻은 단계;
    b) 프로테아제 억제제, 대조 펩티드, 표준 펩티드, 또는 이들의 조합을 샘플에 첨가하여, 암 발생 가능성을 검출하는 데 유용한 샘플을 제조하는 단계; 및
    c) 단계 b)에서 제조된 샘플에서 표 A의 서열 목록에서 확인된 표적 단백질, 또는 전술한 것들의 변이체의 발현 또는 활성을 정량화하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 질병 또는 병태는 게놈 전체 연관 연구(GWAS), 암 게놈 아틀라스(TCGA), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(PheWAS), 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 연구, 또는 이들의 조합과 관련되는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 대상체가 암 발생 가능성을 가질 것으로 예측되는 경우, 유효량의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 작용제 또는 제39항 또는 제40항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 질병 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    유효량의 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 작용제 또는 제39항 또는 제40항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 질병 또는 병태는 게놈 전체 연관 연구(GWAS), 암 게놈 아틀라스(TCGA), 전체 게놈 서열분석, 표현형 전체 연관 연구(PheWAS), 발현 양적 형질 유전자좌(eQTL) 연구, 또는 이들의 조합과 관련되는, 방법.
  52. 서열 목록에서 확인된 표적 단백질 또는 이의 변이체의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 확인하는 방법으로서,
    a) 서열 목록에서 확인된 단백질 또는 이의 변이체를 작용제와 접촉시키는 단계; 및
    b) 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하며,
    여기서, 표적 단백질의 발현 또는 활성에 대한 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 차이는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타내는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 적어도 10%의 차이는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타내는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 참조와 비교하여 작용제와 이미 접촉한 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 감소는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 억제한다는 것을 나타내는, 방법.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서, 참조와 비교하여 표적 단백질의 발현 또는 활성에서의 증가는 작용제가 표적 단백질의 발현 또는 활성을 활성화한다는 것을 나타내는, 방법.
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