KR20190117667A - 기능화된 적혈구 세포 - Google Patents

Abstract

본원에는 기능화된 적혈구 세포의 신규한 제조물 및 인간 약학 용도 및 수의학 용도로 사용하기 위한 관련 조성물, 시약, 및 방법이 기재된다.

Description

기능화된 적혈구 세포

관련 출원

본 출원은 2017년 2월 17일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/460,589 및 2017년 8월 7일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/542,142에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 2018년 2월 15일에 생성된 상기 ASCII 카피는 R2081-7021WO_SL.txt로 명명되며, 51,103 바이트 크기이다.

적혈구와 같은 적혈구 세포는, 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호(Rubius Therapeutics, Inc.)에 기재된 바와 같이, 다수의 상이한 질병을 치료하기 위해 매우 다양한 외인성 치료 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 이 조작은 적혈구 세포 전구체 내로 전이유전자를 도입하고, 이어서 전이유전자를 분화시키고 발현시키도록 전구체를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 단백질은 발현시키기가 어려운데, 예를 들어, 이는 그러한 단백질이 번역후 변형을 필요로 하거나 숙주 세포의 성장 또는 기능을 저해하기 때문이다. 이러한 단백질을 포함하는 세포를 생성하는 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본원에는 인간 약학 용도 및 수의학 용도로 사용하기 위한 유리하고 놀라운 특성을 갖는 기능화된 적혈구 세포의 신규한 제조물 및 관련 조성물, 시약, 및 방법이 기재된다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 치료 용도로 사용하기 위한 최적의 수율, 순도, 안정성, 생존력, 면역원성, 기능, 완전성, 및/또는 생물학적 기능을 갖는 기능화된 적혈구 세포를 제공한다. 본원에 기재된 기능화된 적혈구 세포는 세포의 표면으로의 제제의 전달에 특히 매우 적합하거나, 발현시키기가 복잡하거나 어려운 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 예컨대, 다량체 폴리펩티드; 큰 폴리펩티드; 시험관 내에서 유도체화된 제제, 예를 들어, 폴리펩티드; 적혈구 세포에 대해 독성일 수 있거나 적혈구 세포에서 효율적으로 발현될 수 없는 제제에 특히 매우 적합하다. 제제는 또한 지질, 핵산, 당, 약물, 또는 소분자일 수 있다.

본원에 개시된 방법 및 조성물은 광범위한 적응증에 사용하기 위한, 치료제 또는 진단제로 유도체화된 최적의 적혈구 세포를 제공한다. 최적의 시약, 중간체 및 합성 방법이 또한 제공된다.

일 양태에서, 본 발명은, 세포당 적어도, 또는 약 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 커플링 시약을 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 그물적혈구, 또는 적혈구의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시는, 세포당 적어도 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000개의 커플링 시약을 포함하는, 적혈구 세포의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 제조물은 세포당 최대 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000개의 커플링 시약을 포함한다. 일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 또는 99.9%는 열거된 수준의 커플링 시약, 예를 들어, 세포당 알킨 커플링 시약(KR) 또는 세포당 아지드 커플링 시약(AR)을 갖는다. 일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 약 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30 또는 40%는 세포당 열거된 수준의 제제를 갖는다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도, 또는 약 10,000, 50,000, 100,000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 또는 10⁹개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도, 또는 약 10¹⁰, 10¹¹ 또는 10¹²개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 세포 내부 또는 세포 표면에, 외인성 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 세포당 적어도, 또는 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 또는 5,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 커플링 시약을 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 그물적혈구, 또는 적혈구의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시는 세포당 적어도 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 또는 5,000개의 커플링 시약을 포함하는, 적혈구 세포의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도, 또는 약 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 카피의 제제, 예를 들어, 이종성 제제를 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 그물적혈구, 또는 적혈구의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 잔여 링커는 클릭 기호(click signature)를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시는, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000개의 카피의 이종성 제제를 포함하는 적혈구 세포의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다.

일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 또는 99.9%는 세포당 열거된 수준의 제제를 갖는다. 일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 또는 99.9%는 제1 제제와 제2 제제를 포함하며, 예를 들어, 세포는, 제제의 수준이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%에서 측정된 수준보다 높은 경우 제제에 대해 양성인 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 약 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 또는 40%는 세포당 열거된 수준의 제제를 갖는다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도, 또는 약 10,000, 50,000, 100,000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 또는 10⁹개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도, 또는 약 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 세포를 포함한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 그물적혈구, 예를 들어, 시험관 내에서 확장되고, 분화되고, 제핵된 HSC로부터의 그물적혈구이다. 구현예들에서, 적혈구 세포는 조혈 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포를 포함한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 적혈구, 예를 들어, 혈액으로부터 수득된 적혈구이다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 유전자 변형되며, 예를 들어, 세포는 외인성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA)으로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 외인성 단백질로 캡슐화, 예를 들어, 저장성으로(hypotonically) 로딩된다.

일 구현예에서, 제조물은 유리 커플링 시약, 미반응된 커플링 시약, 유기 용매, 금속(예를 들어, 구리), 촉매, 또는 비표지된 세포 또는 비변형된 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다.

일 구현예에서, 제제는 국제 특허 출원 공개 WO2015/15302호; 또는 WO2015/073587호에 기재된 제제이며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

일 구현예에서, 제제는 펩티드성 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 효소, 또는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 펩티드성 제제는 사이토카인, 수용체, 리간드, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 리소좀 저장 효소, 아스파라기나제, 또는 세포외 도메인, 카운터 리간드(counterligand) 결합 도메인, 또는 다른 생물학적 활성 도메인, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는, 상기한 것들 중 임의의 것의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 항원, 예를 들어, 종양 항원, 및 감염성 질병 항원, 및 자가 항원을 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 지질; 핵산, 예를 들어, RNA, DNA, siRNA; 당; 약물; 또는 소분자를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 약 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 400 킬로달톤을 초과하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 약 1 내지 2, 1 내지 5, 2 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 또는 200 내지 500 kDa의 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 초과 아미노산의 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는 번역후 변형, 예를 들어, 적혈구 세포에 의해 이루어지지 않거나 적혈구 세포에 의해 비효율적으로 이루어지는 번역 후 변형을 포함한다. 구현예들에서, 폴리펩티드, 예를 들어, 항체는 하나 이상의 디술파이드 브리지를 포함한다. 구현예들에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는 번역 후 변형이 결여되거나, 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포에 의해 생성되는 단백질보다 낮은 수준에서의 변형을 포함한다. 구현예들에서, 폴리펩티드(예를 들어, 항체)는 탈당화를 겪는다. 구현예들에서, 탈당화는 더 낮은 ADCC 유도 및/또는 Fc 감마 수용체와의 더 낮은 상호 작용을 가져온다.

일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 인간 세포, 예를 들어, 인간 적혈구 세포에서 생성되는 경우 통상적으로 존재하는 번역 후 변형을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 인간 세포에서 생성되는 경우 통상적으로 존재하는 것보다 낮은 수준, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40% , 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 낮은 수준으로 번역 후 변형을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 제제는 하나 이상의 비-표준 아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은, 예를 들어, p-메톡시페닐알라닌(pMpa); p-아세틸페닐알라닌(pApa); p-벤조일페닐알라닌(pBpa); p-요오도페닐알라닌(pIpa); p-아지도페닐알라닌(pAzpa); p-프로파길옥시페닐알라닌(pPpa); α-아미노카프릴산; o-니트로벤질시스테인(o-NBC); 1,5-단실알라닌; 및 o-니트로벤질세린(o-NBS)일 수 있다.

일 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는 적혈구 세포에 대해 독성이거나 그의 성장, 기능, 수명, 또는 발달을 손상시킨다. 구현예들에서, 세포에 대해 독성인 제제는 세포에 대해 독성인 대사물을 생성하는 제제(예를 들어, 효소)이다.

일 구현예에서, 제제는 다량체 폴리펩티드, 예를 들어, 이량체, 예컨대, 동종이량체 또는 이종이량체, 삼량체, 예컨대, 동종삼량체 또는 이종삼량체, 또는 사량체, 예컨대, 동종사량체 또는 이종사량체, 예컨대, 항체 또는 세포 표면 수용체, 예컨대, 질병 벡터에 대한 수용체, 예컨대, 바이러스, 약물, 또는 독소를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 복수의 시스테인 브리지를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 다량체 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 하나 이상의 시스테인 브리지를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 다량체 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 발현시키기 어려운 단백질을 포함한다. 구현예들에서, 발현시키기 어려운 단백질은 적혈구 세포에서 정상적으로 일어나지 않는 번역 후 변형을 포함하는 단백질이다. 구현예들에서, 번역 후 변형은 적혈구 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 프로테아제에 의한 절단을 포함한다. 구현예들에서, 발현시키기 어려운 단백질은 활성화된 응고 인자를 포함하고, 응고 인자를 활성화시키는 프로테아제는 적혈구 세포에서 통상적으로 발현되지 않는다. 절단에 의해 활성화되는 예시적인 활성화된 응고 인자는 인자 Va, VIIa, VIIIa, IXa, Xa, XIa, XIIIa, 및 트롬빈을 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 다음 중 하나 이상을 포함하는 항체 분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 포함한다: a) 동족 항원을 결합시키기에 충분한 가변 영역, 예를 들어, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; b) CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 불변 서열; c) 기능적 Fc 영역; 및 d) 변형된 또는 비활성 Fc 영역, 예를 들어, 돌연변이적으로 비활성화된 Fc 영역 또는 Fc 활성을 손상시키는 당화 상태를 갖는 Fc 영역, 예를 들어, 탈당화된 Fc 영역. 일 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이특이적 항체이다. 항체의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, 이황화물-결합 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예를 들어, sdAb(VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 항체 단편, 예를 들어, 힌지 영역에서 디술파이드 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 항체의 분리된 에피토프 결합 단편, 맥시바디(maxibodies), 미니바디(minibodies), 나노바디(nanobodies), 인트라바디(intrabodies), 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), v-NAR 및 비스-scFv를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 구현예들에서, CDR은 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트" 번호 매김 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948]("코티아" 번호 매김 체계), 또는 이들의 조합에 따라 규정된다.

일 구현예에서, 제제는 항체, 예를 들어, IgA, IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgE, 또는 IgD를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 항-PDL 1 항체 분자, 항 4-1BB 항체 분자, 또는 항-α4β7 항체 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 항-PDL1 항체, 항 4-1BB 항체, 항-α4β7 항체, 또는 단백질 A/G를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 4-1BBL, 인자 VIIa, 인자 Xa, 아스파라기나제, IL-10, 또는 MOG 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 아스파라기나제를 포함하고, 세포의 아스파라기나제 활성은 약 1x10^-12 내지 1x10^-9 U/세포, 1x10^-12 내지 1x10^-11 U/세포, 1x10^-11 내지 1x10^-10 U/세포, 또는 1x10^-10 내지 1x10^-9 U/세포이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도, 또는 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 카피의 제1 제제, 예를 들어, 이종성 제제; 및 제2 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도, 또는 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 카피의 제2 제제, 예를 들어, 이종성 제제를 포함하는, 적혈구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 그물적혈구, 또는 적혈구의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 본 개시는, 클릭 기호를 갖는 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도 1,000개 카피의 제1 이종성 제제; 및 제2 클릭 기호를 갖는 제2 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도 1,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함하는, 적혈구 세포의 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 잔여 링커는 상이한 구조를 갖는다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 잔여 링커는 동일한 구조를 갖는다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 잔여 링커는 동일한 구조를 갖지만 반대 배향을 갖는다. 구현예들에서, 제1 클릭 기호는 제2 클릭 기호와 상이하다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 2,000개 카피의 제1 이종성 제제 및 적어도 2,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 5,000개 카피의 제1 이종성 제제 및 적어도 5,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 10,000개 카피의 제1 이종성 제제 및 적어도 10,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 50,000개 카피의 제1 이종성 제제 및 적어도 50,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 100,000개 카피의 제1 이종성 제제 및 적어도 100,000개 카피의 제2 이종성 제제를 포함한다.

일 구현예에서, 제조물 중의 세포의 적어도 약 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99, 또는 99.9%는 세포당 열거된 수준의 제제를 갖는다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도, 또는 약 10,000, 50,000, 100,000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 제조물은 적어도 10,000, 50,000, 100,000, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 세포를 포함한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들어, N이 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 또는 200개의 제제인 제N 제제를 추가로 포함하며, 각각의 추가의 제제에 대하여, 세포는, 잔여 링커에 의해 세포에 커플링된, 적어도, 또는 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000개, 또는 이들 각각과 동일하거나 이를 초과하는 수의 카피의 추가의 제제, 예를 들어, 이종성 제제를 포함한다.

일 구현예에서, 본원에 개시된 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물은 유리 커플링 시약, 미반응된 커플링 시약, 유기 용매, 금속(예를 들어, 구리), 촉매, 또는 비표지된 세포 또는 비변형된 세포를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다.

일 구현예에서, 본원에 개시된 세포 또는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물에서, 세포 상의 커플링 시약의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 미만이 미반응된 커플링 시약이다. 일 구현예에서, 본원에 개시된 세포 또는 제조물, 예를 들어, 약학적 제조물에서, 세포 상의 커플링 시약의 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 또는 10% 미만이 미반응된 커플링 시약이다.

일 구현예에서, 제제는 펩티드성 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 단백질 약물, 효소, 항체(예를 들어, scFv), 사이토카인, 사이토카인 수용체, 수용체 분자, 리간드, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 리소좀 저장 효소, 아스파라기나제, 항원(예를 들어, 종양 항원, 감염성 질병 항원, 또는 자가 항원), 또는 면역 자극 분자(예를 들어, 보조 자극 분자)를 포함한다. 구현예들에서, 항체는 전항체, 이의 단편, 단일쇄 항체, 인간화 항체; 뮤린 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로날 항체, 항-이디오타입 항체, 항체 단편, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb, 및 Fd 단편, 디아바디, 및 항체-관련 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 제1 커플링 시약, 예를 들어, GMP 등급 커플링 시약을 적혈구 세포에 커플링시켜 약학적 제조물, 생성물, 또는 중간체를 제조하는 단계를 포함하는, 약학적 제조물, 생성물, 또는 중간체를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 방법은 b) 세포를 제2 커플링 시약, 예를 들어, GMP 등급 커플링 시약에 커플링된 제제와, 예를 들어, 제1 커플링 시약과 제2 커플링 시약의 반응에 적합한 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 방법은, 예를 들어 단계 a) 이전 또는 이후에, 제2 커플링 시약을 제제에 커플링시키는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 단계 a)의 중간체는 단계 b)의 접촉 전에 저장된다. 구현예들에서, 제2 커플링 시약에 커플링된 제제는 단계 b)의 접촉 전에 저장된다.

일 구현예에서, 방법은 a)에서의 커플링을 위해 적혈구 세포 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은 제1 커플링 시약과 반응하는 제조물 내의 엔티티(entities)를 감소시키거나 최소화시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 방법은, 예를 들어 제1 커플링 시약과 반응할 수 있는 세포로부터, 단백질과 같은 비결합 물질을 제거하기 위해 세포를 세척하는 등의 처리를 포함한다.

일 구현예에서, 제2 제제가 세포에 커플링되며, 방법은, c) 제2 커플링 시약, 예를 들어, GMP 등급 커플링 시약을 적혈구 세포에 커플링시키는 단계, 및 d) 세포를 제2 커플링 시약, 예를 들어, GMP 등급 커플링 시약에 커플링된 제2 제제와, 예를 들어, 제1 커플링 시약과 제2 커플링 시약의 반응에 적합한 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함한다.

구현예들에서, 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다:

a) 제1 커플링 시약을 세포에 커플링시키는 단계;

b) 세포를, 제1 커플링 시약과 반응할 수 있는 제2 커플링 시약에 커플링된 제1 제제와 접촉시키는 단계;

c) 제3 커플링 시약을 세포에 커플링시키는 단계; 및

d) 세포를, 제3 커플링 시약과 반응할 수 있는 제4 커플링 시약에 커플링된 제2 제제와 접촉시키는 단계.

구현예들에서, 단계 a), b), c), 및 d)는 다음 순서들 중 하나로 수행된다:

a), 이어서 b), 이어서 c), 그리고 이어서 d)를 수행함;

a), 이어서 c), 이어서 b), 그리고 이어서 d)를 수행함;

a), 이어서 c), 이어서 d), 그리고 이어서 b)를 수행함;

a), 이어서 c), 이어서 b)와 d)를 동시에 수행함;

c), 이어서 d), 이어서 a), 그리고 이어서 b)를 수행함;

c), 이어서 a), 이어서 b), 그리고 이어서 d)를 수행함;

c), 이어서 a), 이어서 d), 그리고 이어서 b)를 수행함;

c), 이어서 a), 이어서 b)와 d)를 동시에 수행함;

a)와 c)를 동시에 수행하고, 이어서 b), 그리고 이어서 d)를 수행함;

a)와 c)를 동시에 수행하고, 이어서 d), 그리고 이어서 b)를 수행함; 또는

a)와 c)를 동시에 수행하고, 이어서 b)와 d)를 동시에 수행함.

일 구현예에서, 커플링 반응의 컨쥬게이션 효율은 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 98%를 초과한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 그물적혈구, 예를 들어, 시험관 내에서 확장되고, 분화되고, 제핵된 HSC로부터의 그물적혈구이다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 적혈구, 예를 들어, 혈액으로부터 수득된 적혈구이다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는 유전자 변형되며, 예를 들어, 세포는 외인성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 예컨대, mRNA)으로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 적혈구 세포는, 세포 단백질, DNA, 또는 RNA에 결합하는 제제인 외인성 단백질로 캡슐화, 예를 들어, 저장성으로 로딩된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 제핵 세포는 그물적혈구, 적혈구, 또는 혈소판이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 본원에 기재된 제조물, 조성물, 또는 세포를 대상체에게 투여함으로써 대상체에게 제제를 투여하는, 예를 들어, 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체에게 제제를 투여하는, 예를 들어, 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 방법은, 예를 들어, 제조하거나 또 다른 엔티티로부터 수득함으로써, 제조물, 조성물, 또는 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 질병 또는 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용하기 위한, 본원에 기재된 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 질병 또는 장애, 예를 들어, 본원에 기재된 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해, 본원에 기재된 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)를 특징으로 한다.

일 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 동종 세포이다.

일 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 자가 세포이다.

일 구현예에서, 제제는 세포에 커플링된다. 일 구현예에서, 제제는 펩티드성 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 효소, 또는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 사이토카인, 수용체, 리간드, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 리소좀 저장 효소, 아스파라기나제, 또는 세포외 도메인, 카운터 리간드 결합 도메인, 또는 다른 생물학적 활성 도메인을 포함하는, 상기한 것들 중 임의의 것의 단편을 포함한다.

일 구현예에서, 제제를 세포에 커플링시키는 단계와 세포를 대상체에게 투여하는 단계 사이에 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만의 기간이 경과한다.

일 구현예에서, 세포는 자가 세포이고, 세포를 대상체로부터 분리하는 단계와 세포를 대상체에게 투여하는 단계 사이에 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 미만의 기간이 경과한다.

일 구현예에서, 세포를 대상체로부터 분리하는 단계와 세포를 대상체(예를 들어, 동일하거나 상이한 대상체)에게 투여하는 단계 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 또는 28일의 기간이 경과한다.

일 구현예에서, 방법은 대상체를 평가하는 단계, 및 평가에 따라 세포에 커플링시키기 위한 제제를 선택하는 단계를 포함한다.

구현예들에서, 커플링 단계는 생체내 또는 생체외에서 발생한다. 예를 들어, 구현예들에서, 커플링 제제는, 커플링 시약이 세포, 예를 들어, 적혈구 세포에 커플링되게 하는 조건 하에서 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 커플링 시약에 커플링된 제제는, 제제가 세포, 예를 들어, 적혈구 세포에 커플링되게 하는 조건 하에서 대상체에게 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 제제, 예를 들어, 대상체의 치료에 적합한 제제의 동일성(identity)을 엔티티로부터 수령하는 단계, 및 본원에 기재된 방법에 의해 제제를 세포에 커플링시킴으로써 제조물, 조성물, 또는 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 제조물, 조성물, 또는 세포를 제공하는 방법을 특징으로 한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 키트를 특징으로 한다: a) 선택적으로, 적혈구 세포; b) 제1 커플링 시약; c) 제2 커플링 시약; d) 제제; e) 선택적으로, 커플링 시약에 커플링된 적혈구 세포; f) 커플링 시약에 커플링된 제제; 또는 g) a 내지 f 중 임의의 것의 존재를 검출하기 위한 시약.

일 구현예에서, 키트는 b, c, d, f, 및 g 중 하나 이상을 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 a) 활성화된 세포(예를 들어, 적혈구 세포), b) 제1의 활성화된 제제, c) 제2의 활성화된 제제, 및 d) 선택적으로, 제3 또는 추가의 활성화된 제제를 포함하는 키트를 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 발명은, a) 하나 이상의 특정된 제제를 갖는 기능화된 세포를 제공하라는 지시를 제3 자(예를 들어, 의사, 진료실, 또는 병원)로부터 접수하는 단계, b) 활성화된 세포를 하나의 제제 또는 복수의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 20개 이상의) 상이한 제제와 접촉시킴으로써 기능화된 세포를 제조하는 단계, 및 c) 기능화된 세포를 제3 자에게 제공하는 단계를 포함하는, 기능화된 세포(예를 들어, 본원에 기재된 기능화된 세포)를 제조하는 방법을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 발명은, a) 하나 이상의 특정된 제제를 갖는 기능화된 세포를 제공하라는 지시를 제3 자(예를 들어, 실험실)에게 전송하는 단계; b) 제3 자로부터 기능화된 세포를 수령하는 단계, 및 c) 기능화된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 기능화된 세포(예를 들어, 본원에 기재된 기능화된 세포)를 수득하는 방법을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 세포(예를 들어, 적혈구 세포 및/또는 제핵 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포)를 특징으로 한다:

세포 표면에 존재하는 제제(예를 들어, 외인성 폴리펩티드), 및

제제를 세포 표면(예를 들어, 세포 표면에 존재하는 폴리펩티드 또는 탄수화물)에 공유 결합시키는 링커, 예를 들어, 잔여 링커로서, 잔여 링커는 클릭 기호를 포함하는, 링커.

일부 구현예에서, 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었다. 일부 구현예에서, 클릭 기호는 본원에 기재된 클릭 기호의 구조를 갖는다.

본 개시는, 일부 양태에서, 세포에 포함된 단백질, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 단백질의 아미노산 측쇄를 통해, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는, 세포(예를 들어, 적혈구 세포 및/또는 제핵 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포)를 제공하며, 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호, 예를 들어, 본원에 기재된 클릭 기호의 구조를 갖는다.

본 개시는, 일부 양태에서, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 각각 공유 결합된, 복수의 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는, 세포(예를 들어, 적혈구 세포 및/또는 제핵 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포)를 제공하며,

세포 상의 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 아미노산 측쇄를 통해 세포에 포함된 단백질, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 단백질에 연결되고,

클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호, 예를 들어, 본원에 기재된 클릭 기호의 구조를 갖는다.

일부 양태에서, 본 개시는, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된 외인성 폴리펩티드 제제의 복수의 카피를 포함하는, 제핵 적혈구 세포를 제공하며, 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호의 구조를 가지며, 본원의 목록 1 중 하나 이상이 적용된다. 일부 구현예에서, 세포는 소르타제 전달 기호(sortase transfer signature)가 결여된다. 일부 구현예에서, 세포는 클릭 기호에 공유 결합된 소르타제 전달 기호를 포함하지 않는다.

일부 양태에서, 본 개시는, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된 외인성 폴리펩티드 제제의 복수의 카피를 포함하는, 제핵 적혈구 세포를 제공하며, 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호의 구조를 가지며, 복수의 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 세포 표면에 대하여 동일한 배향을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포는 소르타제 전달 기호가 결여된다. 일부 구현예에서, 세포는 클릭 기호에 공유 결합된 소르타제 전달 기호를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작되지 않으며, 예를 들어, 외인성 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 세포는 유전자 조작되며, 예를 들어, 외인성 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 비-천연 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 비-천연 아미노산을 갖는 막횡단 단백질을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 π클램프를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 π클램프를 통해 제핵 적혈구 세포에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 ncAA를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 ncAA를 통해 제핵 적혈구 세포에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 2개 이상의 시스테인 잔기를 통해, 예를 들어, 티오링커(ThioLinker)를 통해, 제핵 적혈구 세포에 공유 결합된다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제는 결합 파트너를 결합시키는 펩티드 리간드이다.

일부 구현예에서, 세포는 제2 제제, 예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드 제제를 추가로 포함하며, 예를 들어, 제2 외인성 폴리펩티드 제제는 클릭 기호를 포함하는 제2 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 세포는 제3 제제, 예를 들어, 제3 외인성 폴리펩티드 제제를 추가로 포함하며, 예를 들어, 제3 외인성 폴리펩티드 제제는 클릭 기호를 포함하는 제2 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된다.

일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제는 세포의 내인성 분자, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 내인성 폴리펩티드에 공유 결합된다.

일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 미리 선택된 배향으로 세포 표면에 공유 결합되며, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제의 동일한 모이어티 또는 모이어티들(예를 들어, N-말단, C-말단, 또는 특정 잔기, 예컨대, 특정 ncAA, 또는 복수의 특정 잔기, 예를 들어 2개의 시스테인 잔기)에 의해 부착된다. 본원에 기재된 제조물의 일부 구현예에서, 제조물 중의 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 미리 선택된 배향으로 제핵 적혈구 세포 표면에 공유 결합되며, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제의 동일한 모이어티 또는 모이어티들(예를 들어, N-말단, C-말단, 또는 특정 잔기, 예컨대, 특정 ncAA, 또는 복수의 특정 잔기, 예를 들어 2개의 시스테인 잔기)에 의해 부착된다.

일부 구현예에서, 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제는 세포의 내인성 분자, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 내인성 폴리펩티드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 제제를 세포의 내인성 분자, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 내인성 폴리펩티드 또는 당에 연결시킨다. 일부 구현예에서, 링커는 제제를 세포의 외인성 분자, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 외인성 폴리펩티드 또는 당에 연결시킨다.

일부 구현예에서, 클릭 기호는 시클릭 모이어티, 예를 들어, 헤테로사이클, 예컨대, 트리아졸, 예컨대, 이치환된 트리아졸, 또는 고리화 부가물(cycloadduct)을 포함한다. 일부 구현예에서, 클릭 기호는 시클로알켄, 예를 들어, 시클로헥센, 알킬 술파이드, 디하이드로피라진, 예를 들어, 1,2-디하이드로피라진, 디아졸, 또는 황-함유 링, 예를 들어, 티오피란을 포함한다.

일부 구현예에서, 클릭 기호는 고리 부가반응(예를 들어, 1,3-쌍극성 고리 부가반응 또는 헤테로-딜스-알더 고리 부가반응), 친핵성 개환(예를 들어, 스트레인드(strained) 헤테로시클릭 친전자체, 예컨대, 아지리딘, 에폭사이드, 시클릭 술페이트, 아지리디늄 이온, 및 에피술포늄 이온의 개방), 비-알돌 유형의 카보닐 화학(예를 들어, 우레아, 티오우레아, 히드라존, 옥심 에테르, 아미드, 또는 방향족 헤테로사이클의 형성), 또는 탄소-탄소 다중 결합으로의 부가반응(예를 들어, 에폭시화, 아지리딘화, 디하이드록실화, 술페닐 할라이드 부가반응, 니트로실 할라이드 부가반응, 또는 마이클 부가반응)에 의해 형성되었거나 이에 의해 형성될 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시는, 다음 단계를 포함하는, 제제로 기능화된 세포(예를 들어, 적혈구 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포)를 제조(예를 들어, 제작)하는 방법을 특징으로 한다:

(a) 제1 커플링 모이어티, 예를 들어, 제1 클릭 핸들(click handle)에 결합된, 예를 들어, 공유 결합된 세포를 포함하는 활성화된 세포를 제공하는 단계,

(b) 제1 커플링 모이어티와 반응할 수 있는 제2 커플링 모이어티, 예를 들어, 제1 클릭 핸들과 반응할 수 있는 제2 클릭 핸들에 결합된, 예를 들어, 공유 결합된 제제(예를 들어, 외인성 폴리펩티드)를 포함하는 활성화된 제제를 제공하는 단계, 및

(c) 활성화된 세포를 활성화된 제제와 접촉시킴으로써 제제로 기능화된 세포를 생성하는 단계.

구현예들에서, 방법은, 세포를, 제1 커플링 모이어티, 예를 들어, 제1 클릭 핸들을 포함하는 제1 커플링 시약과 접촉시킴으로써 활성화된 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 방법은, 제제를, 제2 커플링 모이어티, 예를 들어 제2 클릭 핸들을 포함하는 제2 커플링 시약과 접촉시킴으로써 활성화된 제제를 생성하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 방법은, 예를 들어 비-표준 아미노산의 혼입을 통해, 제2 커플링 모이어티, 예를 들어, 제2 클릭 핸들을 함유하도록 제제를 합성하는 단계를 포함한다. 구현예들에서, 방법은, 예를 들어, 제1 커플링 모이어티를 포함하는 비-표준 아미노산의 혼입을 통해 또는 제1 커플링 모이어티를 포함하는 당의 (예를 들어, 탄수화물 내로의) 혼입을 통해, 제1 커플링 모이어티를 포함하는 세포를 제조하는 단계를 포함한다.

구현예들에서, 세포를 제1 커플링 시약과 접촉시키는 단계는 제제를 제2 커플링 시약과 접촉시키기 전 또는 후에 발생한다. 구현예들에서, 세포를 제1 커플링 시약과 접촉시키는 단계 및 제제를 제2 커플링 시약과 접촉시키는 단계는 동시에 일어나며, 예를 들어, 동시에 시작하거나, 동시에 종료하거나, 부분적으로 중첩된다.

구현예들에서, 제1 커플링 시약은 막 불투과성이다. 구현예들에서, 제2 커플링 시약은 막 불투과성이다. 구현예들에서, 제1 커플링 시약은 막 투과성이다. 구현예들에서, 제2 커플링 시약은 막 투과성이다.

일부 양태에서, 본 개시는, 본원의 방법에 의해 생성된 세포, 예를 들어, 적혈구 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 방법은 (a) 제1 클릭 핸들에 공유 결합된 세포를 포함하는 활성화된 세포를 제공하는 단계, (b) 제1 클릭 핸들과 반응할 수 있는 제2 클릭 핸들에 공유 결합된 제제(예를 들어, 외인성 폴리펩티드)를 포함하는 활성화된 제제를 제공하는 단계, 및 (c) 활성화된 세포를 활성화된 제제와 접촉시킴으로써 제제로 기능화된 세포를 생성하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시는, 본원에 기재된 기능화된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병을 치료하는 방법을 특징으로 한다.

일부 구현예에서, 제1 커플링 시약은 제제 상의 다음 모이어티들 중 하나와 반응하는 제1 기질 반응성 모이어티를 포함한다:

a) 예를 들어, 라이신 또는 N-말단 중의, 일차 아민(-NH₂),

b) 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 C-말단 중의, 카르복실(-COOH),

c) 예를 들어, 시스테인 중의, 술프히드릴(-SH), 또는

d) 예를 들어, 당단백질, 예컨대, 산화된 당단백질 중의, 카보닐(-CHO), 예컨대, 케톤 또는 알데히드 기.

일부 구현예에서, 제2 커플링 시약은 세포 상의 다음 모이어티들 중 하나(예를 들어, 세포 상의 단백질 또는 탄수화물의 모이어티)와 반응하는 제1 기질 반응성 모이어티를 포함한다:

a) 예를 들어, 라이신 또는 N-말단 중의, 일차 아민(-NH₂),

b) 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 또는 C-말단 중의, 카르복실(-COOH),

c) 예를 들어, 시스테인 중의, 술프히드릴(-SH), 또는

d) 예를 들어, 당단백질, 예컨대, 산화된 당단백질 중의, 카보닐(-CHO), 예컨대, 케톤 또는 알데히드 기.

일부 구현예에서, 제1 기질 반응성 모이어티 및 제2 기질 반응성 모이어티는 동일한 유형의 모이어티와 반응하며, 예를 들어, 제1 기질 반응성 모이어티는 제1 일차 아민과 반응하고, 제2 기질 반응성 모이어티는 제2 일차 아민과 반응한다. 일부 구현예에서, 제1 기질 반응성 모이어티 및 제2 기질 반응성 모이어티는 상이한 유형의 모이어티와 반응한다.

일부 구현예에서, 제1 또는 제2 커플링 시약은 소르타제 인식 부위, 예를 들어, N-말단 GGG 또는 C-말단 LPXTG(SEQ ID NO: 1)를 포함한다.

일부 구현예에서, 커플링 시약(예를 들어, 제1 또는 제2 커플링 시약)은 클릭 핸들을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 핸들은 알킨, 예를 들어, 스트레인드 알킨, 예컨대, 시클로옥틴, 예컨대, DBCO-술포-NHS 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 클릭 핸들은 아지드, 예를 들어, 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원의 방법은 기능화된 세포를, 단지 하나의 커플링 모이어티, 예를 들어, 하나의 클릭 핸들을 포함하는 종결 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구현예들에서, 종결 시약은 세포 상의 미반응된 클릭 핸들과 반응하여, 세포 상의 미반응된 클릭 핸들의 수를 감소시킬 수 있다. 구현예들에서, 종결 시약은 제제 상의 미반응된 클릭 핸들과 반응하여, 제제 상의 미반응된 클릭 핸들의 수를 감소시킬 수 있다. 구현예들에서, 방법은 기능화된 세포를, 세포 상의 미반응된 클릭 핸들과 반응할 수 있는 종결 시약과 접촉시키는 단계, 및 기능화된 세포를, 제제 상의 미반응된 클릭 핸들과 반응할 수 있는 종결 시약과 접촉시키는 단계를, 어느 순서로든, 순차적으로 포함한다. 구현예들에서, 미반응된 종결 시약은 2가지 접촉 단계들 사이에서 씻겨 나간다. 구현예들에서, 종결 시약은 제제보다 낮은 분자량 및/또는 낮은 입체 장애를 갖는다. 구현예들에서, 종결 시약은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지를 갖는 종결 시약은 기능화된 세포의 배치(batch)의 분취량과 접촉된다. 일부 구현예에서, 기능화된 세포와 반응하는 검출 가능한 표지의 양이 미리 결정된 임계치 미만인 경우, 배치는 승인되거나 방출된다. 일부 구현예에서, 기능화된 세포와 반응하는 검출 가능한 표지의 양이 미리 결정된 임계치를 초과하는 경우, 배치는 보류되거나 추가 처리되며, 예를 들어, 종결 시약과 접촉된다. 구현예들에서, 종결 시약은 아지드 또는 알킨 기를 포함한다. 구현예들에서, 일단 종결 시약이 제제 또는 세포와 반응하면, 이는 실질적으로 반응성이 없으며, 예를 들어, 야생형 인간 글리코포린 A의 N-말단보다 더 반응성이 없다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.5%, 99.8%, 또는 99.9%가 표지되며, 예를 들어, 세포는, 제제의 수준이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%에서 측정된 수준보다 높은 경우 표지된 것으로 간주된다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 세포당 평균 50 내지 200,000개 카피의 제제로 표지되며(또는 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 세포당 50 내지 200,000개 카피의 제제로 표지되며), 예를 들어, 세포당 50 내지 100개 카피, 100 내지 200개, 200 내지 500개, 500 내지 1,000개, 1,000 내지 2,000개, 2,000 내지 5,000개, 5,000 내지 10,000개, 10,000 내지 20,000개, 20,000 내지 50,000개, 50,000 내지 100,000개, 또는 100,000 내지 200,000개 카피의 제제, 또는 세포당 적어도 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 또는 200,000개 카피의 제제, 또는 세포당 최대 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 또는 200,000개 카피의 제제로 표지된다.

일부 구현예에서, 적어도 10⁷, 10⁸, 또는 10⁹개의 제핵 적혈구 세포가 표지된다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포 집단은 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 또는 500 ng의 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드로 표지된다.

일부 구현예에서, 연결된 폴리펩티드 제제는 항-PD-L1, 항-α4β7, 항-m41BBL, 4-1BBL, 인자 VIIa, 인자 Xa, 아스파라기나제, 또는 MOG 펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 표지된 적혈구 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 95, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%는, 예를 들어, 실시예 6의 유동세포분석법 검정에서, 리간드를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 95, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99%는, 예를 들어, 실시예 6의 유동세포분석법 검정에서, 리간드에 결합하는 제제를 포함한다. 구현예들에서, 세포는, 제제가 결여된 것 외에는 유사한 세포의 99%에서 측정된 신호보다 큰 신호를 갖는 경우, 실시예 6의 유동세포분석법 검정에 의해 리간드를 결합시키는 것으로 간주된다.

구현예들에서, 제제는 내인성 폴리펩티드의 아미노산에 연결된다(예를 들어, 개재 원자없이, 또는 제제와 내인성 폴리펩티드 사이에 하나 이상의 원자를 가지며 인접 연결된다). 구현예들에서, 링커는 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 nm의 길이를 갖는다. 구현예들에서, 링커는 약 30 내지 100, 40 내지 90, 50 내지 80, 또는 60 내지 70 nm의 길이를 갖는다. 구현예들에서, 링커는, 제제가 적혈구 세포의 당질층 외부에 있도록 하는 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 PEG, 예를 들어, 약 3 내지 20, 예컨대, 4 내지 13, 예컨대, 약 4, 5, 12, 또는 13의 길이를 갖는 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 성분의 길이는 약 30 내지 60 옹스트롬, 예를 들어, 30 내지 40, 40 내지 50, 또는 50 내지 60 옹스트롬이다. 일부 구현예에서, 링커는 약 50 내지 200, 200 내지 400, 400 내지 600, 600 내지 800 또는 800 내지 1000 옹스트롬의 길이를 갖는 PEG를 포함한다.

일부 구현예에서, 목록 1 중 하나 이상이 적용되며, 목록 1은 다음과 같다:

a) 제제가 내인성 막 단백질의 글리신 이외의 아미노산에 (예를 들어, 잔여 링커를 통해) 연결되며, 예를 들어, 적어도 하나의 비-글리신 잔기에 연결됨;

b) 제제가 내인성 막 단백질의 N-말단 또는 C-말단 이외의 부위에 (예를 들어, 잔여 링커를 통해) 연결됨;

c) 제제가 막 단백질의 N-말단 또는 C-말단 이외의 부위에 (예를 들어, 잔여 링커를 통해) 연결됨;

d) 제제가 전장 내인성 막 단백질에 (예를 들어, 잔여 링커를 통해) 연결됨;

e) 제제가 적어도 10, 20, 50 또는 100개의, 서열 특이적인 폴리펩티드, 예를 들어, 내인성 폴리펩티드에 연결됨;

f) 제제로 기능화된 세포는 LPXTG(SEQ ID NO: 1)와 같은 소르타제 전달 기호(즉, 소르타제 반응에 의해 생성될 수 있는 서열)가 결여됨,

g) 제제가 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

h) 세포 상의 제제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

i) 클릭 기호가 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

j) 세포 상의 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

k) 제제가 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음;

l) 세포 상의 제제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

m) 클릭 기호가 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

n) 세포 상의 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

o) 제제가 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음;

p) 세포 상의 제제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

q) 클릭 기호가 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

r) 세포 상의 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 막횡단 세그먼트의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 세포외 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

s) 제제가, 제제의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

t) 세포 상의 제제의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 제제의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

u) 클릭 기호가, 클릭 기호의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

v) 세포 상의 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 클릭 기호의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 또는 100개 아미노산 내에 있는 소르타제 전달 기호에 연결되지 않음,

w) 제제가 연결된 폴리펩티드, 예를 들어, 내인성 폴리펩티드가 N 또는 C 말단에 상응하는 위치에 소르타제 전달 기호를 갖지 않음;

x) 세포 상의 제제의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 세포에 포함된 단백질, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 단백질의 아미노산 측쇄를 통해 연결되며, 일 구현예에서, 측쇄는, 아미노산 측쇄의 적어도 하나의 원자가 제제와 단백질의 주쇄 사이에 배치되도록 연결된, 라이신, 시스테인, 아스파르트산, 또는 글루탐산의 측쇄임,

y) 제제가 세포 표면 상의 폴리펩티드(예를 들어, 내인성 단백질)에 연결됨,

z) 기능화된 세포가 소르타제와 접촉되지 않았음,

aa) 기능화된 세포가 세포외에 형성된 결합을 포함하는 소르타제 전달 기호를 포함하지 않음,

bb) 세포 상의 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 세포를 커플링 시약과 반응시킴으로써 생성되었음, 또는

cc) 세포가, 세포를 비-천연 당, 예를 들어, 클릭 핸들을 포함하는 당, 또는 이의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 방법에 의해 제조됨.

일부 구현예에서, 세포는 1,000, 5,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000개가 넘는 카피의 제제를 포함한다.

일부 구현예에서:

i) 제제는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 걸쳐 제제의 적어도 20%가 대상체의 순환계에 남아있게 되는 제거율을 가지고,

ii) 세포 집단은, 제제의 적어도 20%가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 걸쳐 대상체의 순환계에 남아있게 되는 제거율을 가지고,

iii) 세포 집단은, 기능성 적혈구 세포의 적어도 20%가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 걸쳐 대상체의 순환계에 남아있게 되는 제거율을 가지고;

iv) 제제는, 1일 후에 대상체의 순환계에 있는 제제의 적어도 20%가 또 다른 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 또는 21일 후에 순환계에 남아있게 되는 제거율을 가지고;

iv) 세포 집단은, 1일 후에 대상체의 순환계에 있는 제제의 적어도 20%가 또 다른 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 또는 21일 후에 순환계에 남아있게 되는 제거율을 가지고;

ⅳ) 세포 집단은, 1일 후에 대상체의 순환계에 있는 세포 집단의 적어도 20%가 또 다른 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 또는 21일 후에 순환계에 남아있게 되는 제거율을 갖는다.

일부 구현예에서, 집단의 적혈구 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99%가 제핵된다.

일부 구현예에서, 세포는 저장성으로 로딩된 세포가 아니다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 다음과 같은 특징들 중 하나 이상을 갖는다:

a) 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성;

b) 약 10 내지 200 fL의 세포 부피, 또는 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론, 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론의 세포 직경;

c) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈; 또는 세포당 적어도 약 20, 25, 또는 30 pg의 헤모글로빈; 또는

d) 외엽의 포스파티딜세린 함량이 아넥신 V 염색에 의해 측정된 바와 같이 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만임.

일부 구현예에서, 잔여 링커 또는 클릭 기호는 세포 상의 폴리펩티드의 아미노산(예를 들어, 표준 아미노산)의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개의 원자 내에 있다. 일부 구현예에서, 잔여 링커 또는 클릭 기호는 세포의 탄수화물 모이어티의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개 원자 내에 있지 않다. 일부 구현예에서, 제제는 당화되지 않은 폴리펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 제제는 당화된 폴리펩티드의 아미노산 측쇄, N-말단, 또는 C-말단에 연결된다.

일부 구현예에서, 잔여 링커는 세포 상의 만노스 모이어티의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개 원자 내에 있지 않다. 일부 구현예에서, 세포 상의 잔여 링커 또는 클릭 기호의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%가 세포 상의 만노스 모이어티의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개 원자 내에 있지 않다. 일부 구현예에서, 잔여 링커는 세포 상의 적어도 2개(예를 들어, 3, 4, 5개 이상)의 유형의 당에 연결된다. 예를 들어, 제1 잔여 링커는 세포 상의 제1 당 모이어티의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개 원자 내에 있을 수 있고, 제2 잔여 링커는 세포 상의 제2 당 모이어티의 1, 2, 5, 10, 20, 또는 50개 원자 내에 있을 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작되지 않는다.

일부 구현예에서, 세포는 비-표준 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 내의 아미노산의 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001% 미만은 비-표준 아미노산이다.

본 개시는 상기 양태 및/또는 구현예 중 어느 하나 이상의 모든 조합뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에 기재된 구현예 중 어느 하나 이상과의 조합을 고려한다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 이들의 전체 내용이 참조로서 포함된다. 예를 들어, 본원의 임의의 표에서 예를 들어, 본원에 참조된 모든 GenBank, Unigene, NCBI, 및 Entrez 서열은 참조로서 포함된다. 달리 명시하지 않는 한, 본원의 임의의 표를 포함하는 본원에 명시된 서열 수탁 번호는 2017년 8월 7일 현재의 데이터베이스 항목을 참조한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁 번호를 언급하는 경우, 서열 변이체 모두가 포함된다.

도 1은 세포 상으로 제제를 클릭하는 방법을 도시하는 도면이다. 활성화된 제제는, 예를 들어, 제제를 제1 기질 반응성 모이어티를 갖는 제1 커플링 시약 및 클릭 핸들인 제1 커플링 모이어티와 접촉시키고, 제1 기질 반응성 모이어티를 제제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 활성화된 세포는, 예를 들어, 세포를 제2 기질 반응성 모이어티를 갖는 제2 커플링 시약 및 클릭 핸들인 제2 커플링 모이어티와 접촉시키고, 제2 기질 반응성 모이어티를 세포와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 활성화된 제제와 활성화된 세포는 제1 클릭 핸들이 제2 클릭 핸들과 반응하게 하는 조건 하에서 조합되어, 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 생성한다.
도 2a 내지 도 2c는 본원에 기재된 커플링 시약을 사용하여 예시적인 제제(항-α4β7 항체)에 커플링된 적혈구 세포의 유동세포분석 이미지이다.
도 3은 항-PD-L1 항체로 기능화된 적혈구 세포 또는 아이소타입 대조군 항체로 기능화된 대조군 세포에 의해 결합된 종양 세포의 백분율을 도시하는 그래프이다.
도 4는 41BBL-RCT로 처리된 마우스 및 미처리된 대조군에서의 종양 크기를 도시하는 시간 경과이다.
도 5는 RCT-아스파라기나제로 처리된 C57BL/6 마우스에서의 시간에 따른 혈청 아스파라긴 수준을 도시하는 그래프이다.
도 6은 RCT-아스파라기나제로 처리된 Rag1-/-마우스에서의 시간에 따른 혈청 아스파라긴 수준을 도시하는 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 Cy5-표지 RCT-아스파라기나제로 처리된 마우스에서의 시간에 따른 형광을 도시하는 그래프이다. 도 7a, 고용량 ASNase mRBC; 도 7b, 저용량 ASNase mRBC.
도 8a 및 도 8b는 티오링커 클릭 핸들을 사용한 HIS6 마우스 41BBL의 배향된 표지화가 커플링된 세포의 기능적 활성 증가를 가져옴을 도시하는 그래프이다. 도 8a, IL-2 분비; 도 8b, 인터페론-γ 분비.
도 9a 및 도 9b는 클릭 가능한 마우스 41BBL을 생성하기 위한, 비-표준 아미노산, 엑소(BCN)-라이신의 마우스 41BBL 내로의 부위-특이적 혼입을 도시한다. 도 9a, 엑소(BCN)-라이신의 화학 구조; 도 9b, 클릭된 마우스 41BBL이 1 mM 이상의 엑소(BCN)-라이신의 농도에서 생성되었음을 나타내는 웨스턴 블롯.

본원에는 세포를 관심 대상 제제(예를 들어, 펩티드성 제제)와 커플링시키기 위한 선택적이고 생체 적합성인 반응을 이용한 적혈구 세포의 기능화를 포함하는 조성물 및 방법이 기재된다. 일부 구현예에서, 반응은 수용성이고 막 불투과성인 시약을 사용한 고리 부가 반응(예를 들어, 휘스겐(Huisgen) 1,3-쌍극성 고리 부가 반응)이다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "클릭 기호"는 엔티티 A와 엔티티 B 사이에 배치되어 이들을 공유 결합시키는 복수의 원자를 지칭하며, 클릭 기호는 엔티티 A와 엔티티 B를 연결하는 클릭 반응의 생성물로서 형성된다. 일 구현예에서, 클릭 기호는 엔티티 A와 엔티티 B를 연결하는 클릭 반응의 생성물로서 형성되는 클릭 기호의 구조를 갖지만, 임의의 특정 공정에 의해 제조된 클릭 기호로 제한되지 않으며, 예를 들어, 클릭 반응에 의해 형성된 클릭 기호로 제한되지 않지만, 또 다른 공정에 의해 형성되거나 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 클릭 기호는 알킨/아지드 클릭 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 트리아졸을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "클릭 반응"은 연결 생성물의 편리한 생성을 위해 제1 모이어티와 제2 모이어티를 공유 결합시키는 데 이용되는 반응의 범위를 지칭한다. 클릭 반응은 전형적으로 다음과 같은 특징들 중 하나 이상을 갖는다: 빠르거나, 특이적이거나, 고수율이거나, 효율적이거나, 자발적이거나, 연결된 엔티티의 생체 적합성을 유의하게 변경시키지 않거나, 높은 반응 속도를 갖거나, 안정한 생성물을 생성하거나, 단일 반응 생성물의 생성을 유리하게 하거나, 높은 원자 경제성을 갖거나, 화학 선택성이거나, 모듈식이거나, 입체 선택적이거나, 산소에 민감하지 않거나, 물에 민감하지 않거나, 고순도이거나, 비크로마토그래피 방법(예를 들어, 결정화 또는 증류)에 의해 제거될 수 있는 무해하거나 비교적 비독성인 부산물만을 생성하거나, 용매를 필요로 하지 않거나, 생리적 조건 하에서 안정한 양성이거나 생리적으로 상용성인 용매, 예를 들어, 물에서 수행될 수 있음. 예로는 알킨/아지드 반응, 디엔/친디엔체(dienophile) 반응, 또는 티올/알켄 반응이 포함된다. 다른 반응이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 클릭 반응은 빠르고, 특이적이고, 고수율이다. 예를 들어, 구현예들에서, 빠른 클릭 반응은, 예를 들어, PBS 중에서 20℃에서, 10 내지 200 M^-1s^-1, 1 내지 20 M^-1s^-1, 또는 적어도 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 60, 100, 200, 500, 1E3, 2E3, 5E3, 1E4, 2E4, 5E4, 1E5, 2E5, 5E5, 또는 1E6 M^-1s^-1의 2차 정방향 속도 상수를 갖는다. 일부 구현예에서, 특이적 클릭 반응은, 개질되지 않은 세포(예를 들어, 말초 순환으로부터 분리된 인간 적혈구)가 클릭 핸들을 갖는 제제와 접촉된 경우, 예를 들어, PBS 중에서 20℃에서 1시간의 반응 시간 후에, 예를 들어, 실시예 21의 검정에서, 세포의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이 제제에 검출 가능하게 연결되어 있는 반응이다. 일부 구현예에서, 고수율 클릭 반응은, 예를 들어, PBS 중에서 20℃에서 1시간의 반응 시간 동안, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 수율을 갖는 반응이다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "클릭 핸들"은 클릭 반응에서 제2 클릭 핸들과 반응하여 클릭 기호를 생성할 수 있는 화학적 모이어티를 지칭한다. 구현예들에서, 클릭 핸들은 커플링 시약에 포함되고, 커플링 시약은 기질 반응성 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "소르타제 전달 기호"는 제1 소르타제 인식 모티프를 제2 소르타제 인식 모티프와 연결하는 소르타제 반응에 의해 생성될 수 있는 서열이며, 소르타제 전달 기호는, 소르타제 반응 동안 제거되는 임의의 아미노산(예를 들어, Gly-Gly)을 제외한, 제1 소르타제 인식 모티프의 아미노산 서열 및 제2 인식 모티프의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, LPXTGG(SEQ ID NO: 2)와 (G)_n의 소르타제-매개 반응은 LPXT(G)_n(SEQ ID NO: 1)의 소르타제 전달 기호를 생성할 수 있다.

세포

본 발명은 기능화된 세포를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법을 특징으로 한다. 구현예들에서, 세포는 적혈구 세포를 포함한다. 구현예들에서, 세포는 혈소판, 혈소판 전구체, 또는 혈소판 전구세포 이외의 세포이다. 구현예들에서, 세포는 유핵 세포 또는 제핵 세포이다. 구현예들에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포이다. 구현예들에서, 세포는 T 세포(예를 들어, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포), B 세포, 자연살 세포, 자연살 T 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 혈소판, 또는 호중구를 포함한다. 구현예들에서, 세포는 내배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 또는 중배엽 유래 세포를 포함한다. 구현예들에서, 세포는 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 심근 세포, 동종 이식용 세포, 이종 이식용 세포, 또는 췌장 베타 세포를 포함한다.

적혈구 세포

본 발명은 기능화된 적혈구 세포를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법을 특징으로 한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "적혈구 세포"는 조혈모세포(HSC), 및 유핵 및 제핵 적혈구 전구체, 제핵 적혈구, 및 HSC와 제핵 적혈구 사이의 임의의 중간체를 포함하는 적혈구 계열의 세포이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포는 전적혈모구, 호염기 적혈모구, 다염적혈모구, 정염적혈모구, 그물적혈구, 및 적혈구이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈모세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 일반 골수성 전구(CMP) 세포, 배반포 콜로니-형성 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 거핵세포-적혈구 전구(MEP) 세포, 적혈구 콜로니-형성 단위(CFU-E), 그물적혈구, 적혈구, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 정염적혈모구, 또는 이들의 조합이다.

구현예들에서, 적혈구 세포는 무한증식 세포 또는 무한증식화 세포이거나 이로부터 유래된다. 예를 들어, 무한증식화 적혈모구 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고 TP53을 억제하는 CD34+ 조혈 전구 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Huang et al. (2013) Mol Ther, epub ahead of print September 3]에 기재된 바와 같음).

구현예들에서, 적혈구 세포는 자가 사용을 목적으로 하거나 동종 수혈을 위한 원천을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포가 배양된다. 일 구현예에서, 적혈구 세포는 제핵 적혈구이다.

구현예들에서, 적혈구 세포는 생물학적 샘플, 예를 들어, 인간 혈액으로부터의 적혈구, 또는 골수로부터의 HSC로부터 수득된다.

구현예들에서, 적혈구 세포는 생체외 또는 시험관내 공정으로부터 수득되며, 예를 들어, 그러한 공정에 의해 전구 세포, 예컨대, 조혈모 세포(예를 들어, 골수, 사이토카인-자극 말초 혈액 또는 제대혈로부터 분리된 인간 조혈모 세포)가 생체외에서 확장 및 또는 분화되고 제핵되어, 예를 들어, 그물적혈구를 생성한다. 줄기 세포로부터 제핵 적혈구 세포(예를 들어, 그물적혈구)를 제작하는 생체외 방법은, 예를 들어, 문헌[Migliaccio and Palis (2011) Drug Discov Today Dis Mech. 8(1-2): e3-e8]; 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호 및 WO2015/153102호에 기술되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 포함된다. 이 공정을 통해 제조된 적혈구 세포, 예를 들어, 그물적혈구는 본원에 기재된 방법에 따라 기능화될 수 있다.

일 구현예에서, 제핵 세포는, 전구 세포, 예를 들어, 조혈모세포(예를 들어, CD34+ 세포), 일반 골수성 전구세포(CMP), 거핵세포-적혈구 전구(MEP) 세포, 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 콜로니-형성 단위 적혈구(CFU-E), 전적혈모구, 초기 호염기 적혈모구, 후기 호염기 적혈모구, 다염적혈모구, 또는 정염적혈모구, 또는 유도 다능성 세포에서 그물적혈구 또는 성숙 적혈구로의 분화를 통해 핵을 상실한 세포이다. 일 구현예에서, 제핵 세포는, 전구 세포, 예를 들어 조혈모세포(예를 들어, CD34+ 세포), 일반 골수성 전구세포(CMP), 거핵세포-적혈구 전구세포(MEP), 대집락 형성 단위-적혈구(BFU-E), 콜로니-형성 단위 적혈구(CFU-E), 전적혈모구, 초기 호염기 적혈모구, 후기 호염기 적혈모구, 다염적혈모구, 또는 정염적혈모구, 또는 유도 다능성 세포에서 그물적혈구 또는 성숙 적혈구로의 시험관내 분화를 통해 핵을 상실한 세포이다.

본원에 기재된 기능화 방법에 사용되는 적혈구 세포는 변형되지 않거나 변형될 수 있으며, 예를 들어, 유전자 조작(예를 들어, 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작)될 수 있고; 외인성 단백질로 캡슐화, 예를 들어, 저장성으로 로딩될 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법에 사용되는 적혈구 세포는 자가, 동종, 또는 이종 적혈구 세포일 수 있다.

본원에 기재된 제조물, 화합물, 방법, 및 키트에 사용하기 위한 예시적인 세포가 본원에 기재되어 있다. 일 구현예에서, 세포, 예를 들어, 적혈구 세포, 예컨대, 적혈구는 다음 성질들 중 하나 이상을 포함한다: a) 혈액, 시험관내 배양물로부터 수득되거나, 시험관 내에서 더욱 원시적인 세포 유형, 예를 들어, 조혈모세포로부터 분화되었음; b) 제제로 저장성으로 로딩되어 있음; 또는 c) 예를 들어, 외인성 제제, 예컨대, 폴리펩티드를 발현하는, 유전자 조작된 적혈구 세포임.

일 구현예에서, 세포는 시험관내에서 더욱 원시적인 세포 유형, 예를 들어, 조혈모세포로부터 분화된다.

일 구현예에서, 세포는, 예를 들어 외인성 제제, 예컨대, 폴리펩티드를 발현하는, 유전자 조작된 적혈구 세포이다.

일 구현예에서, 세포는 혈액으로부터 수득된 적혈구이다.

일 구현예에서, 세포는 제제로 저장성으로 로딩되어 있다.

일 구현예에서, 세포는 시험관내 배양물로부터의 세포이다.

일 구현예에서, 세포는, 예를 들어 외인성 제제, 예컨대, 폴리펩티드를 발현하는, 유전자 조작된 적혈구 세포이다.

제핵 적혈구 세포의 물리적 특징

일부 구현예에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 본원에 기재된 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 물리적 특징, 예를 들어, 삼투 취약성, 세포 크기, 헤모글로빈 농도, 또는 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만 일부 구현예에서 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 유사한 물리적 특징을 갖는다. 대조적으로, 저장성으로 로딩된 적혈구 세포는 때때로 비정상적인 물리적 특징, 예를 들어, 증가된 삼투 취약성, 변경된 세포 크기, 감소된 헤모글로빈 농도, 또는 세포막의 외엽 상에서의 증가된 포스파티딜세린 수준을 나타낸다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포는 안정제가 결여된 조성물에 존재한다.

삼투 취약성

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 분리된 배양되지 않은 제핵 적혈구 세포와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포의 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 미만의 세포 용해의 삼투 취약성을 갖는다. 삼투 취약성은 일부 구현예에서 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호의 실시예 59의 방법을 이용하여 결정된다.

세포 크기

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 대략적인 직경 또는 부피를 갖는다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 약 4, 5, 6, 7, 또는 8 마이크론의 평균 직경을 갖고, 선택적으로 집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3 마이크론 미만이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 적혈구 세포는 약 4 내지 8, 5 내지 7, 또는 약 6 마이크론의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 직경은 약 1 마이크론 미만, 약 20 마이크론 초과, 약 1 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 4 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 6 마이크론 내지 약 20 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 15 마이크론 또는 약 10 마이크론 내지 약 30 마이크론이다. 세포 직경은 일부 구현예에서 Advia 120 혈액학 시스템을 이용하여 측정된다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적의 용적은 10 fL, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL 초과, 또는 150 fL 초과이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL 미만, 또는 200 fL 미만이다. 일 구현예에서, 적혈구 세포의 평균 적혈구 용적은 80 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400, 또는 400 내지 500 펨토리터(fL)이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 본 단락에 기재된 평균 적혈구 용적을 가지며, 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fL 미만이다. 평균 적혈구 용적은 일부 구현예에서 혈액학적 분석 장치, 예를 들어, 쿨터 계수기(Coulter counter)를 이용하여 측정된다.

헤모글로빈 농도

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 유사한 헤모글로빈 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 초과 또는 10% 초과의 태아 헤모글로빈을 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30 pg, 및 선택적으로 최대 약 30 pg의 전체 헤모글로빈을 포함한다. 헤모글로빈 수준은 일부 구현예에서 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호의 실시예 33의 드랍킨 시약(Drabkin's reagent) 방법을 이용하여 결정된다.

포스파티딜세린 함량

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 야생형의 미처리된 적혈구 세포와 대략적으로 동일한 그 세포막의 외엽 상의 포스파티딜세린 함량을 갖는다. 포스파티딜세린은 주로 야생형의 미처리된 적혈구 세포의 세포막의 내엽에 존재하며, 저장성 로딩은 포스파티딜세린이 외엽에 분포하도록 할 수 있으며, 여기서 이는 면역 반응을 촉발시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 아넥신 V 염색에 대해 양성인 약 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 세포를 포함한다. 포스파티딜세린 노출은, 일부 구현예에서, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호의 실시예 54의 방법을 이용하여 PS에 우선적으로 결합하는 아넥신-V-FITC에 대한 염색 및 유동세포분석법에 의한 FITC 형광 측정에 의해 평가된다.

다른 특징

일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 GPA에 대해 양성인 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%(및 선택적으로, 최대 90 또는 100%)의 세포를 포함한다. GPA의 존재는 일부 구현예에서 FACS를 이용하여 검출된다.

일부 구현예에서, 제핵 적혈구 세포는 대상체에서 적어도 30, 45, 또는 90일의 반감기를 갖는다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포를 포함하는 세포의 집단은 약 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 톱니적혈구를 포함한다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포는 제핵된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 적혈구 세포는 비기능성인, 예를 들어, 비활성화된 핵을 함유한다.

만능 공여자 적혈구 세포

일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 세포가 투여될 대상체에 대해 자가이거나 동종이다. 예를 들어, 대상체에 대해 동종인 적혈구 세포는 하나 이상의 혈액형 특이적 적혈구 세포(예를 들어, 세포는 대상체와 동일한 혈액형일 수 있음) 또는 하나 이상의 만능 공여자 적혈구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 제핵 적혈구 세포는 기준 세포와 비교하여 감소된 면역원성을 가지며, 예를 들어, 낮은 하나 이상의 혈액군 항원의 수준을 갖는다.

동종 세포가 수혈에 사용되는 경우, 호환 가능한 ABO 혈액군이 선택되어 급성 혈관내 용혈 수혈 반응을 방지할 수 있다. ABO 혈액형은 적혈구의 표면 상의 혈액형 항원 A 및 B, 당단백질 및 당지질과 관련된 올리고당 사슬의 말단에서 발견되는 단당류 탄수화물 구조의 존재 또는 부재에 기초하여 정의된다(문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)]에서 검토됨). O군 적혈구는 A 항원이나 B 항원을 함유하지 않기 때문에 임의의 ABO 혈액군의 수령자, 예를 들어, A군, B군, AB군, 또는 O군 수령자에게 안전하게 수혈될 수 있다. O군 적혈구는 만능으로 간주되며, 모든 수혈에서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 O형이다. 대조적으로, A군 적혈구 세포는 A군 및 AB군 수령자에게 주어질 수 있고, B군 적혈구 세포는 B군 및 AB군 수령자에게 주어질 수 있고, AB군 적혈구 세포는 AB 수령자에게 주어질 수 있다.

일부 경우에, O군이 아닌 적혈구 세포를 만능 혈액형으로 전환하는 것이 유익할 수 있다. A군 및 B군 적혈구의 표면 상의 면역우성 단당류의 효소적 제거는 O군-유사 적혈구 세포의 집단을 생성시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)] 참조). B군 적혈구 세포는 커피 생두로부터 유래된 α-갈락토시다제를 사용하여 전환될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 이. 메닝고셉티쿰(E. meningosepticum) 박테리아로부터 유래된 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제 효소 활성은, 적혈구 세포 상에 존재하는 경우, 각각 면역우성 A 및 B 항원을 제거하는 데 사용될 수 있다(Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)). 일 예에서, 본원에 기재된 바와 같이 분리된 패킹된 적혈구 세포는 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제(패킹된 적혈구 세포 ml당 약 300 ㎍)의 존재 하에서 200 mM 글리신(pH 6.8) 및 3 mM NaCl 중에서 26℃에서 60분 동안 인큐베이션된다. 처리 후, 적혈구 세포는 원심 분리를 사용한 식염수 중에서의 3회 내지 4회 린스에 의해 세척되고, 표준 혈액 뱅킹 기술에 따라 ABO형이 판별된다.

ABO 혈액군 시스템은 수혈 및 이식에서 가장 중요한 한편, 일부 구현예에서, 투여될 적혈구 세포와 수령자 사이의 다른 혈액군들을 일치시키거나 하나 이상의 다른(예를 들어, 소수의) 혈액군에 대해 만능인 적혈구 세포를 선택하거나 제조하는 것이 유용할 수 있다. 제2 혈액군은 개체가 Rh+ 또는 Rh-일 수 있는 Rh 시스템이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 Rh-이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 O형 및 Rh-이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 1개 이상의 소수 혈액군 항원에 대해 음성, 예를 들어, Le(a-b-)(루이스 항원 시스템의 경우), Fy(a-b-)(Duffy 시스템의 경우), Jk(a-b-)(Kidd 시스템의 경우), M-N-(MNS 시스템의 경우), K-k-(Kell 시스템의 경우), Lu(a-b-)(Lutheran 시스템의 경우), 및 H-항원 음성(봄베이(Bombay) 표현형), 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포는 또한 O형 및/또는 Rh-이다. 소수 혈액군은, 예를 들어, 문헌[Agarwal et al "Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north India" Blood Res. 2013 Mar; 48(1): 51-54] 및 문헌[Mitra et al "Blood groups systems" Indian J Anaesth. 2014 Sep-Oct; 58(5): 524-528]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함되어 있다.

적혈구 세포 조성물

일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%(및 선택적으로, 최대 약 80, 90, 또는 100%)의 제핵 적혈구 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 1% 미만의 살아 있는 유핵 세포를 함유하고, 예를 들어, 검출 가능한 살아 있는 유핵 세포를 함유하지 않는다. 제핵은 일부 구현예에서 핵 염색을 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(및 선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 적혈구 세포는 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4개 이상)의 제제를 포함한다. 제제의 존재는 일부 구현예에서 제제를 결합시키는 표지된 단백질(예를 들어, 항체)을 이용한 FACS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 집단 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80%(및 선택적으로, 최대 약 70, 80, 90, 또는 100%)의 적혈구 세포는 제핵되고, 하나 이상의 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 적혈구 세포의 집단은 약 1x10⁹ 내지 2x10⁹, 2x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 2x10¹⁰, 2x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 1x10¹¹ 내지 2x10¹¹, 2x10¹¹ 내지 5x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 2x10¹², 2x10¹² 내지 5x10¹², 또는 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 세포를 포함한다.

클릭 가능한 형식의 세포

일부 구현예에서, 세포는 세포를 컨쥬게이션 제제와 화학적으로 반응시키는 단계를 필요로 함이 없이 컨쥬게이션 제제를 포함한다. 예를 들어, 세포는 대사물(예를 들어, 아미노산 또는 당) 및 커플링 모이어티(예를 들어, 클릭 핸들)를 포함하는 분자와 접촉될 수 있다. 이어서, 세포는 대사물이, 예를 들어, 세포의 표면 상의, 예를 들어, 단백질 또는 탄수화물 내로 혼입되게 한다. 대사물은, 예를 들어, 비-표준 아미노산일 수 있다. 구현예들에서, 대사물은, 대사물을 특정 위치, 예를 들어, 앰버(Amber) 정지 코돈에 의해 인코딩되는 위치 내로 유도하는 tRNA/아미노-아실-tRNA-신타제 쌍을 사용하여 혼입된다. 생성된 활성화된 세포는 커플링 모이어티(예를 들어, 클릭 핸들)를 포함한다. 이어서, 활성화된 세포는 활성화된 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 활성화된 제제와 접촉될 수 있다.

대사물 및 커플링 모이어티를 포함하는 다양한 분자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 구현예들에서, 분자는 다음으로부터 선택된다:

예를 들어, 스트레인(strain)-촉진 알킨-아지드 고리 부가(SPAAC) 반응에 사용하기 위한, SCO-라이신;

예를 들어, 스트레인-촉진 역-전자-요구 딜스-알더 고리 부가(SPIEDAC) 반응에 사용하기 위한, 시클로프로펜 라이신;

예를 들어, SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, TCO*A-라이신;

예를 들어, SPAAC 반응에 사용하기 위한, 엑소-BCN-라이신;

예를 들어, SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, NBO-라이신;

예를 들어, SPAAC 반응에 사용하기 위한, rac-BCN-라이신;

예를 들어, SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, TCO-라이신;

예를 들어, SPAAC 반응에 사용하기 위한, 엔도-BCN-라이신

예를 들어, SPAAC 또는 SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, PrK-HCL-염;

예를 들어, SPAAC 또는 SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, N3-라이신;

예를 들어, (예를 들어, DBCO-아민에 의해 매개되는) 부위-특이적 옥심 리게이션에, 그 이은 SPAAC에 사용하기 위한, p-아세틸페닐알라닌;

예를 들어, SPAAC 또는 SPIEDAC 반응에 사용하기 위한, p-아지도메틸페닐알라닌; 또는

예를 들어, 말레이미드와의 반응을 위한, 셀레노-시스테인.

커플링 시약

본원에는 제제로 기능화된 적혈구 세포의 조성물이 기재되며, 세포와 제제는 이특이적 커플링 시약의 세트를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 이특이적 커플링 시약의 세트는 제1 커플링 시약과 제2 커플링 시약을 포함한다. 제1 커플링 시약은, 제2 커플링 시약 상의 커플링 모이어티, 예를 들어, 아지드와 특이적으로 반응하는 커플링 모이어티, 예를 들어, 알킨 모이어티를 포함한다. 커플링 모이어티는 자기-반응하지 않는다. 구현예들에서, 커플링 모이어티는 클릭 핸들이다. 클릭 핸들은 아지드 또는 알킨을 포함할 수 있다.

각각의 커플링 시약은, 예를 들어, 관심 대상 기질, 예를 들어, 적혈구 세포에 (예를 들어, 공유) 결합하기에 적합한 기질 반응성 모이어티, 또는 적혈구 세포로의 부착을 위한 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 지질, 핵산, 당, 약물, 소분자를 또한 포함한다. 구현예들에서, 기질 반응성 모이어티는 기질과 비-효소적으로 반응할 수 있다. 구현예들에서, 기질 반응성 모이어티는 소르타제 반응 이외에 기질과 반응할 수 있다.

구현예들에서, 커플링 시약은 제1 엔티티(예를 들어, 세포)를 제2 엔티티(예를 들어, 외인성 폴리펩티드)와 공유 결합시킬 수 있다.

제1 커플링 시약은 그의 기질 반응성 모이어티를 통해 제1 기질, 예를 들어, 적혈구 세포에 연결될 수 있다. 제2 커플링 시약은 그의 기질 반응성 모이어티를 통해 제2 기질, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 약물에 연결될 수 있다. 이어서, 이렇게 유도체화된 기질들은 서로 연결될 수 있다.

2개의 기질의 연결은 전형적으로 제1 기질과 제2 기질 사이에 잔여 링커를 생성시킨다. 예를 들어, 아지드 및 알킨을 포함하는 커플링 시약의 경우, 트리아졸(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)을 포함하는 잔여 링커가 형성될 수 있다. 예시적인 커플링 시약은 알킨 커플링 시약(KR) 및 아지드 커플링 시약(AR)을 포함한다.

일부 구현예에서, 커플링 시약은 알킨 커플링 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킨 커플링 시약은 프로파길 모이어티 또는 시클로옥티닐 모이어티를 포함한다. 예시적인 알킨 커플링 시약은 디아릴시클로옥틴(DBCO)-술포-NHS-에스테르, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-PEG-NHS-에스테르, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-C6-NHS-에스테르, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-NHS-에스테르, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-아민, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-산, 술포 디아릴시클로옥틴(DBCO)-말레이미드, 디아릴시클로옥틴(DBCO)-말레이미드, 비스-술폰-PEG-디아릴시클로옥틴(DBCO), 프로파길-NHS 에스테르, 프로파길-말레이미드, 알킨-PEG-NHS 에스테르, 알킨-PEG-말레이미드, 또는 이의 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, 커플링 시약은 아지드 커플링 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 아지드 커플링 시약은 아지도알킬 모이어티, 아지도아릴 모이어티, 또는 아지도헤테로아릴 모이어티를 포함한다. 예시적인 아지드 커플링 시약은 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르, 아지도아세트산 NHS 에스테르, 아지도-PEG-NHS 에스테르, 아지도프로필아민, 아지도-PEG-아민, 아지도-PEG-말레이미드, 비스-술폰-PEG-아지드, 또는 이의 유도체를 포함한다.

커플링 시약은 알켄 모이어티, 예를 들어, 트랜스시클로알켄 모이어티, 옥사노보나디엔 모이어티, 또는 테트라진 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 추가 커플링 시약은 문헌[Click Chemistry Tools (https://clickchemistrytools.com/)], 문헌[Lahann, J (ed) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science], 문헌[McKay et al, "Click chemistry in complex mixtures: bioorthogonal bioconjugation" Chem Biol. 2014 Sep 18;21(9):1075-101], 문헌[Becer et al. "Click chemistry beyond metal-catalyzed cycloaddition" Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(27):4900-8], 및 문헌[Hein et al. "Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences" Pharm Res. 2008 Oct;25(10):2216-30]에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

구현예들에서, 커플링 시약은, 예를 들어, 알켄 모이어티와의 반응을 위한, 테트라진 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 구현예들에서, 테트라진은 1,2,4,5 테트라진이고, 알켄은 스트레인드 알켄이다. 구현예들에서, 알켄 커플링 시약은 트랜스-시클로옥텐, (E)-시클로옥트-4-에놀, (E)-시클로옥트-4-에닐 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 카보네이트, 5-노보넨-2-아세트산 숙신이미딜 에스테르, 5-노보넨-2-엔도-아세트산, TCO PEG4 숙신이미딜 에스테르, TCO-아민, 또는 TCO-PEG3-말레이미드를 포함한다. 구현예들에서, 테트라진 커플링 시약은 (4-(1,2,4,5-테트라진-3-일)페닐)메탄아민 또는 2,5-디옥소-1-피롤리디닐 5-[4-(1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질아미노]-5-옥소펜타노에이트, 5-[4-(1,2,4,5-테트라진-3-일)벤질아미노]-5-옥소펜탄산을 포함한다. 구현예들에서, 테트라진 및 알켄은 딜스-알더 고리 부가반응으로 반응하여 안정한 공유 결합을 생성한다. 구현예들에서, 촉매는 필요하지 않다. 구현예들에서, 유일한 부산물은 이질소이다. 구현예들에서, 반응은 아지드-시클로옥틴 기반 클릭 화학보다 적어도 10배 빠르다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 테트라진/알켄 반응은 저농도의 반응물(예를 들어, 제제)과 함께 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 각각의 커플링 시약의 커플링 모이어티들은 아지드-알킨 휘스겐 고리 부가반응을 통해 반응한다. 일부 구현예에서, 아지드-알킨 휘스겐 고리 부가반응은 구리(I)-촉매 아지드-알킨 고리 부가반응 또는 스트레인-촉진 아지드-알킨 고리 부가반응을 포함한다.

일부 구현예에서, 각각의 커플링 시약의 커플링 모이어티들은 반응하여 헤테로아릴, 예를 들어, 트리아졸을 형성한다. 일부 구현예에서, 트리아졸은 1,2,3-트리아졸, 예를 들어, 1,4-이치환된 1,2,3-트리아졸 또는 1,5-이치환된 1,2,3-트리아졸을 포함한다.

일부 구현예에서, 커플링 시약은, 커플링 시약을 제제(예를 들어, 본원에 기재된 제제)에 연결시키기 위한 기질 반응성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 반응성 모이어티는 카보닐, 에스테르, 카복실산, 아민, 또는 술프히드릴 기와 반응한다. 일부 구현예에서, 기질 반응성 모이어티는 숙신이미드(예를 들어, NHS-에스테르), 말레이미드, 아민, 히드라진, 알콕시아민, 카복실산, 알데히드, 케톤, 이황화물, 아실 할라이드, 이소티오시아네이트, 또는 이의 유도체를 포함한다.

일부 구현예에서, 기질 반응성 모이어티는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 직쇄이다. 일부 구현예에서, 링커는 분지쇄이다.

일부 구현예에서, 커플링 시약은 알킨을 포함하고, 아민과 반응한다. 일부 구현예에서, 커플링 제제는 시클로옥틴을 포함하고, 아민과 반응한다. 일부 구현예에서, 커플링 제제는 디아릴시클로옥틴(DBCO)-술포-NHS-에스테르 또는 디아릴시클로옥틴(DBCO)-PEG5-NHS-에스테르이다.

일부 구현예에서, 커플링 제제는 아지드를 포함하고, 아민과 반응한다. 일부 구현예에서, 커플링 제제는 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르 또는 아지도-PEG4-NHS-에스테르이다.

일 구현예에서, 커플링 시약은 수용성이다. 일 구현예에서, 커플링 시약은 막 불투과성이며, 예를 들어, 막이 불투과성이 되도록 하기에 충분한 전하를 갖는다. 일 구현예에서, 커플링 시약은 하전되며, 예를 들어, 양 하전되거나 음 하전된다. 일 구현예에서, 커플링 시약은 양이온성 모이어티 또는 음이온성 모이어티, 예를 들어, SO₃ 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 커플링 제제는, 예를 들어, 기능화된 적혈구 세포의 검출에 유용한, 검출제를 포함한다. 예시적인 검출제는 형광 분자(예를 들어, 시아닌 염료, 예컨대, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 또는 Cy7.5), 금속 킬레이트, 조영제, 방사성 핵종, 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상화제, 적외선 영상화제, 근적외선 영상화제, 컴퓨터 보조 단층 촬영(CAT) 영상화제, 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 영상화제(예를 들어, DFO가 지르코늄-89를 킬레이팅하는 DIBO-DFO), X-선 영상화제, 또는 자기 공명 영상화(MRI)제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 커플링 시약은 GMP 등급 물질이다.

일부 구현예에서, 클릭 반응은 고리 부가반응(예를 들어, 1,3-쌍극성 고리 부가반응 또는 헤테로-딜스-알더 고리 부가반응), 친핵성 개환(예를 들어, 스트레인드 헤테로시클릭 친전자체, 예컨대, 아지리딘, 에폭사이드, 시클릭 술페이트, 아지리디늄 이온, 및 에피술포늄 이온의 개방), 비-알돌 유형의 카보닐 화학(예를 들어, 우레아, 티오우레아, 히드라존, 옥심 에테르, 아미드, 또는 방향족 헤테로사이클의 형성), 또는 탄소-탄소 다중 결합으로의 부가반응(예를 들어, 에폭시화, 아지리딘화, 디하이드록실화, 술페닐 할라이드 부가반응, 니트로실 할라이드 부가반응, 또는 마이클 부가반응)이다. 이러한 유형의 클릭 반응의 예는 문헌[Hein et al., Pharm. Res. 2008 October; 25(10):2216-2230]에 더욱 상세히 기재되어 있고, 이 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 구현예들에서, 클릭 반응은 금속 비함유 [3+2] 고리 부가 반응, 딜스-알더 반응, 또는 티올-알켄 라디칼 반응이다. 이러한 유형의 클릭 반응의 예는 문헌[Becer et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 4900-4908]에 더욱 상세히 기재되어 있고, 이 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

일 구현예에서, 클릭 기호는 알킨/아지드 클릭 기호(예를 들어, 알킨은 시클로옥틴, 활성화된 알킨, 또는 전자-결핍 알킨임)이며, 예를 들어, 클릭 기호는 트리아졸, 예를 들어, 1,2,3-트리아졸 및/또는 이치환된 트리아졸을 포함한다. 일 구현예에서, 클릭 기호는 디엔/친디엔체 클릭 기호(예를 들어, 친디엔체는 알켄 모이어티를 포함함)이며, 예를 들어, 클릭 기호는 시클로알켄, 예를 들어, 이치환된 알켄을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 기호는 테트라진/알켄 클릭 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 디하이드로피라진, 예를 들어, 1,2-디하이드로피라진을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 기호는 테트라졸/알켄 클릭 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 디아졸을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 기호는 디티오에스테르/디엔 클릭 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 황-함유 링, 예를 들어, 테트라하이드로티오펜, 예를 들어, 이치환된 테트라하이드로티오펜을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 기호는 디티오에스테르/디엔 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 황-함유 링, 예를 들어, 티오피란을 포함한다. 구현예들에서, 클릭 기호는 티올/알켄 클릭 기호이며, 예를 들어, 클릭 기호는 알킬 술파이드를 포함한다.

구현예들에서, 클릭 반응은 촉매를 필요로 하지 않는다. 구현예들에서, 클릭 반응은 구리 이온을 필요로 하지 않으며, 예를 들어, 문헌[Tornoe, C. W. et al (2002). "Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides"]에 기재된 조건 하에서, 예를 들어, 구리 이온의 존재 하에서와 실질적으로 동일한 속도로 구리 이온의 부재 하에서 진행한다. 구현예들에서, 클릭 반응은 약 10 내지 40, 20 내지 40, 20 내지 30, 20 내지 25, 30 내지 40, 또는 35 내지 40, 또는 약 37℃의 온도에서 효율적으로 진행한다. 구현예들에서, 클릭 반응은 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20℃ 미만의 온도에서 효율적으로 진행한다.

구현예들에서, 클릭 반응에 대한 활성화 장벽은 24 내지 30, 25 내지 29, 또는 26 내지 28 kcal/mol, 예를 들어, 약 27.8 kcal/mol 또는 26 kcal/mol이다. 구현예들에서, 클릭 반응에 대한 활성화 장벽은, 예를 들어, 문헌[Hein et al. Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences" Pharm Res. 2008 Oct;25(10):2216-30]에 기재된 바와 같은, 아지드와 말단 알켄 사이의 휘스겐 Cu-촉매 고리 부가 반응의 활성화 장벽과 동일하거나 이와 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이상 상이하다.

구현예들에서, 클릭 반응은 에너지 방출성이며, 예를 들어, -10 내지 -100, -20 내지 -90, -30 내지 -70, -40 내지 -70, -50 내지 -60, 또는 약 -61 kcal/mol의 ΔG°를 갖는다. 구현예들에서, 클릭 반응에 대한 ΔG°는 아지드와 말단 알켄 사이의 휘스겐 Cu-촉매 고리 부가 반응의 ΔG°와 동일하거나 이와 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 이상 상이하다.

구현예들에서, 클릭 반응은 -30 내지 -140, -40 내지 -130, -50 내지 -120, -60 내지 -110, -70 내지 -100, -80 내지 -90, 또는 약 84 kJ/mol의 ΔG°를 갖는다.

고리 부가 반응의 하나의 예는 친쌍극자체와 5원 (헤테로)사이클을 생성하는 1,3 쌍극성 성분과의 휘스겐 1,3-쌍극성 고리 부가반응이다. 친쌍극자체의 예는 알켄, 알킨, 및 카보닐 및 니트릴과 같은 관련 헤테로원자 작용기를 갖는 분자이다. 구체적으로, 또 다른 예는 알킬 아지드와 아세틸렌의 2+3 고리 부가반응이다. 다른 고리 부가 반응은 컨쥬게이션된 디엔과 친디엔체(예를 들어, 알킨 또는 알켄)의 딜스-알더 반응을 포함한다. 고리 부가 반응의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제9,517,291호에 기재되어 있으며, 이 특허의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

클릭 반응의 다른 예는 H--Si와 단순 비-활성화된 비닐 화합물의 수소화규소첨가 반응, 알코올 및 이소시아네이트로부터의 우레탄 형성, 3차 아민과 알킬 요오다이드 또는 알킬 트리플루오로메탄술포네이트의 멘슈트킨(Menshutkin) 반응, 마이클 부가반응, 예를 들어, 매우 효율적인 말레이미드-티올 반응, --SO₂Cl과 올레핀(R¹, R²-C=C-R³, R⁴) 사이의 원자 이동 라디칼 부가 반응, 복분해반응, 포스핀과 알킬 아지드의 슈타우딩거(Staudinger) 반응, 티올의 산화성 커플링, 친핵성 치환, 특히 에폭시 및 아지리딘 화합물과 같은 작은 스트레인드 링의 친핵성 치환, 우레아의 형성과 같은 카보닐 화학, 및 디하이드록실화와 같은 탄소-탄소 이중 결합으로의 부가 반응을 포함한다. 따라서, 부착된 작용기성은 아세틸렌 결합, 아지도-기, 니트릴 기, 아세틸렌, 아미노 기, 포스피노 기로부터 선택될 수 있다. 클릭 화학 반응은 아미노, 1차 아미노, 하이드록실, 술포네이트, 벤조트리아졸, 브로마이드, 클로라이드, 클로로포르메이트, 트리메틸실란, 포스포늄 브로마이드, 또는 폴리펩티드, 단백질 및 핵산을 포함하는 생체 반응성 작용기로부터 선택된 작용기의 부가를 가져올 수 있다.

따라서, 적합한 커플링 시약은, 예를 들어, 아민, 술페이트, 티올, 하이드록실, 아지드, 알킨, 알켄, 카르복실 기, 알데히드 기, 술폰 기, 비닐술폰 기, 이소시아네이트 기, 산 무수물 기, 에폭사이드 기, 아지리딘 기, 에피술파이드 기, --CO₂N(COCH₂)2, --CO₂N(COCH₂)₂, --CO₂H, --CHO, --CHOCH₂, --N=C=O, --SO₂CH=CH₂, --N(COCH)₂, --S--S--(C₅H₄N)와 같은 기, 및 X가 할로겐이고 R이 수소 또는 C₁ 내지 C₄ 알킬인 다음과 같은 구조의 기를 포함할 수 있다:

일부 구현예에서, 클릭 반응은 매우 에너지 효율적인 탄소-헤테로원자 결합, 특히 개환 친핵성 반응 또는 고리 부가 반응을 형성한다. 클릭 화학에서 널리 나타나는 반응 유형은 상기 언급된 Cu(I)로 촉매된 알킨-아지드 고리 부가반응이다. 클릭 반응의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제9,453,843호에 또한 기재되어 있으며, 이 특허의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.

클릭 화학은 소형 모듈 단위들을 함께 결합시킴으로써 물질을 빠르고 신뢰할 만하게 생성할 수 있다(예를 들어, 각각의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된, 문헌[Kolb et al. (2001) Angewandte Chemie Intl. Ed. 40:2004-2011]; 문헌[Evans (2007) Australian J. Chem. 60:384-395]; 문헌[Carlmark et al. (2009) Chem. Soc. Rev. 38:352-362]을 참조). 클릭 화학의 예는, 예를 들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 8,912,323에 기재되어 있다.

제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제

본 발명은 제제로 기능화된 적혈구 세포의 조성물, 및 이를 포함하는 방법, 제조물, 및 키트를 특징으로 한다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적인 제제가 본원에 기재되어 있다.

일 구현예에서, 제제는, 각각의 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는, 국제 특허 출원 공개 WO2015/15302호 또는 WO2015/073587호에 기재된 제제이다.

일 구현예에서, 제제는 펩티드성 제제, 예를 들어, 폴리펩티드, 효소, 또는 항체를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 그 유형의 야생형 세포에 의해 생성되지 않거나 외인성 폴리펩티드를 함유하는 세포에서보다 야생형 세포에서 더 낮은 수준으로 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 세포의 표면에 컨쥬게이션된 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 세포 내로 도입된 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드이며, 이 핵산은 선택적으로 세포에 의해 보유되지 않는다.

일 구현예에서, 제제는 사이토카인, 수용체, 리간드, 호르몬, 성장 인자, 혈액 인자, 리소좀 저장 효소, 아스파라기나제, 또는 세포외 도메인, 카운터 리간드 결합 도메인, 또는 다른 생물학적 활성 도메인을 포함하는, 상기한 것들 중 임의의 것의 단편을 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 항원, 예를 들어, 종양 항원, 및 감염성 질병 항원, 및 자가 항원을 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 지질, 핵산, 예를 들어, RNA, DNA, siRNA, 당, 약물, 또는 소분자를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 약 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 400 킬로달톤을 초과하는 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는 번역 후 변형, 예를 들어, 적혈구 세포에 의해 이루어지지 않거나 적혈구 세포에 의해 비효율적으로 이루어지는 번역후 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 제제, 예를 들어, 폴리펩티드는 적혈구 세포에 대해 독성이거나 그의 성장, 기능, 수명, 또는 발달을 저해한다.

일 구현예에서, 제제는 다량체 폴리펩티드, 예를 들어, 이량체, 예컨대, 동종이량체 또는 이종이량체, 삼량체, 예컨대, 동종삼량체 또는 이종삼량체, 또는 사량체, 예컨대, 동종사량체 또는 이종사량체, 예컨대, 항체 또는 세포 표면 수용체, 예컨대, 질병 벡터에 대한 수용체, 예컨대, 바이러스, 약물, 또는 독소를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 복수의 시스테인 브리지를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 다량체 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 하나 이상의 시스테인 브리지를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 다량체 폴리펩티드를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 발현시키기 어려운 단백질을 포함한다. 예를 들어, 구현예들에서, 폴리펩티드 제제는, 적혈구 세포에서 유전적으로 발현되는 경우, 세포당 1,000, 500, 200, 또는 100개 미만의 카피의 단백질의 카피 수에 도달하는 아미노산 서열을 갖는다. 구현예들에서, 폴리펩티드 제제는, 적혈구 세포에서 유전적으로 발현되는 경우, 비효율적인 번역 또는 전사를 갖는, 예를 들어, 기준 값, 예컨대, 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호에 기재된 바와 같은 ADA와 같은 대조 단백질의 발현의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1% 미만의 단백질 또는 mRNA 수준에 도달하는 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 폴리펩티드 제제는, 적혈구 세포에서 유전적으로 발현되는 경우, 가장 풍부한 아이소형이 아닌, 예를 들어, 가장 풍부한 아이소형의 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 낮은 수준으로 존재하는 아이소형, 예를 들어, 스플라이스 변이체를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 항체 분자, 예를 들어, 다음 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다: a) 동족 항원을 결합시키기에 충분한 가변 영역, 예를 들어, HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3; b) CH1, CH2, 및 CH3 중 하나 이상을 포함하는 중쇄 불변 서열; c) 기능적 Fc 영역; 및 d) 변형된 또는 비활성 Fc 영역, 예를 들어, 돌연변이적으로 비활성화된 Fc 영역 또는 Fc 활성을 손상시키는 당화 상태를 갖는 Fc 영역, 예를 들어, 탈당화된 Fc 영역.

일 구현예에서, 제제는 항체, 예를 들어, IgA, IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgE, 또는 IgD를 포함한다.

일 구현예에서, 제제는 항-PDL1 항체, 항 4-1BB 항체, 항-α4β7 항체, 또는 단백질 A/G를 포함한다.

일부 구현예에서, 제제는 탈당화된다. 예를 들어, 당화된 전구체가 탈당화 효소(예를 들어, EndoS)로 처리되어 제제를 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 제제는 다음과 같은 부류 중 하나 이상으로부터 선택되거나 이로부터 유래되는 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 효소, 프로테아제, 뉴클레아제, 글리코시다제, 리파아제, DNase, 항원, 항체-유사 분자(예를 들어, 나노바디, scFv, 듀오바디(duobody), 또는 다중특이적 항체), 항체의 리간드, 성장 인자, 전달체, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 효소 인식 서열, 트랜스펩티다제 인식 서열, 프로테아제 인식 서열, 절단 가능 도메인, 인테인(intein), DNA 결합 단백질, RNA 결합 단백질, 보체 조절 분자, 보체 캐스케이드 분자, 응고 캐스케이드 분자, 킬레이터, 보체 조절 도메인, SCR 도메인, CCP 도메인, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 도메인, 아르마딜로 반복체, 류신 지퍼, 데스 효과기(death effector) 도메인, 카드헤린 반복체, EF 핸드(hand), 포스포티로신 결합 도메인, 플렉스트린(pleckstrin) 상동성 도메인, SCR 상동성 2 도메인, 징크 핑거 도메인, 시클릭 펩티드, 세포-침투 펩티드, 샤퍼론 분자, 인테그린, 콜라겐, 캐리어 단백질(예를 들어, 알부민), 독소 결합 펩티드(예를 들어, 세균, 기생충, 진균 또는 환경으로부터의 독소에 결합하는 펩티드), 미엘린화 분자, 프리온 단백질 결합 분자, 분화 클러스터(CD) 분자, 면역 조절 분자(예를 들어, 보조자극 분자, 보조자극 분자의 활성제, 보조자극 분자의 억제제, 보조억제 분자, 보조억제 분자의 억제제 또는 보조억제 분자의 활성제), 암 항원 또는 암세포 마커, 항원-제시 분자, 전구-아폽토시스 분자, 표적화 모이어티, Fc 수용체 결합 분자, 종양 기아 효소, DNA 손상 억제제, 세포-주기 억제제, 가요성 링커, 또는 에피토프 태그. 제제, 예를 들어, 폴리펩티드의 특정 예는, 예를 들어, 각각의 전체 내용이 참조로서 포함된, 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호, WO2015/153102호, 및 WO2016/183482호에서 찾아볼 수 있다.

일부 구현예에서, 제제는 하나 이상의 비-표준 아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은, 예를 들어, p-메톡시페닐알라닌(pMpa); p-아세틸페닐알라닌(pApa); p-벤조일페닐알라닌(pBpa); p-요오도페닐알라닌(pIpa); p-아지도페닐알라닌(pAzpa); p-프로파길옥시페닐알라닌(pPpa); α-아미노카프릴산; o-니트로벤질시스테인(o-NBC); 1,5-단실알라닌; 및 o-니트로벤질세린(o-NBS), 및 예를 들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 제9,624,485호에 기재된 다른 아미노산을 포함한다.

일부 구현예에서, 제제는 폴리펩티드 이외의 것이다. 예를 들어, 제제는 탄수화물, 소분자, 지질, 핵산, 치료제, 자연 발생적 화합물 또는 합성 화합물, 또는 이들의 조합일 수 있다.

예시적인 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표 1의 폴리펩티드 제제 또는 이의 변이체는 다음을 포함한다:

a) 자연 발생적 형태의 폴리펩티드;

b) 2017년 8월 7일자 데이터베이스, 예를 들어, GenBank 데이터베이스에 출현하는 서열을 갖는 폴리펩티드;

c) a) 또는 b)의 서열과 1, 2, 3, 4, 5 또는 10개 미만의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드;

d) a) 또는 b)의 서열과 1, 2, 3, 4, 5 또는 10% 미만의 그의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드;

e) a) 또는 b)의 서열과 실질적으로 상이하지 않은 서열을 갖는 폴리펩티드; 또는

f) a) 또는 b)의 서열을 갖는 단백질과 생물학적 활성, 예를 들어, 효소 활성(예를 들어, 특이성 또는 회전율) 또는 결합 활성(예를 들어, 결합 특이성 또는 친화성)이 실질적으로 상이하지 않은 c), d), 또는 e)의 서열을 갖는 폴리펩티드.

구현예들에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 예를 들어, 이전 단락의 a), b), c), d), e), 또는 f)의 폴리펩티드의 전부 또는 이의 단편을 포함한다.

구현예들에서, 제제는 표 1의 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.

[표 1] 예시적인 제제의 아미노산 서열

일부 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드는 길이가 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 또는 800개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 외인성 폴리펩티드는 길이가 200 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 600, 600 내지 700, 또는 700 내지 800개 아미노산이다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포, 예를 들어, 제핵 적혈구 세포는 적어도 1,000, 5,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000, 30,000, 50,000, 100,000, 200,000, 또는 500,000개 카피의 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드, 예를 들어, 표 1의 외인성 폴리펩티드를 포함한다.

구현예들에서, 제제는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 번역 후 변형은 절단(예를 들어, 단백질분해 절단), 고리화, 당화, 인산화, 소수성 기에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 프레닐화, 또는 글리피화), 보조인자에 대한 컨쥬게이션(예를 들어, 리포일화(lipoylation), 플라빈 모이어티(예를 들어, FMN 또는 FAD), 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화(phosphopantetheinylation), 또는 레티닐리덴 쉬프 염기 형성), 디프타미드 형성, 에탄올아민 포스포글리세롤 부착, 하이푸신(hypusine) 형성, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, 또는 S-아실화), 포르밀화, 아세틸화, 알킬화(예를 들어, 메틸화 또는 에틸화), 아미드화, 부티릴화, 감마-카르복실화, 말로닐화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 예를 들어, ADP-리보실화, 산화, 포스페이트 에스테르(O-결합) 또는 포스포르아미데이트(N-결합) 형성(예를 들어, 인산화 또는 아데닐릴화), 프로피오닐화, 피로글루타메이트 형성, S-글루타티오닐화, S-니트로실화, 숙시닐화, 황산화, ISG화(ISGylation), 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화, 네딜화(Neddylation), 또는 아미노산의 화학적 변형(예를 들어, 시트룰린화, 탈아미드화, 엘리미닐화(eliminylation), 또는 카르바밀화), 디술파이드 브리지의 형성, 라세미화(예를 들어, 프롤린, 세린, 알라닌, 또는 메티오닌의 라세미화), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 구현예들에서, 당화는 당단백질을 발생시키는 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시라이신, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 트립토판으로의 글리코실기의 첨가를 포함한다. 구현예들에서, 당화는, 예를 들어, O-결합 당화 또는 N-결합 당화를 포함한다.

구현예들에서, 세포는 복수의 제제, 예를 들어, 적어도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1,000개의 상이한 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 제제는 복수의 백신 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 제제는 서로에 대해 서열 유사성을 갖지만, 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 아미노산 위치에서 서로 다르다. 일부 구현예에서, 복수의 각 제제는 복수의 다른 각 제제에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 각 제제는 적어도 1, 2, 5, 10, 20, 50, 또는 100개의 복수의 다른 제제에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는다.

제제에 대한 커플링 시약의 기하학

커플링 제제는 제제 상의 여러 가지 다양한 위치에 부착될 수 있다. 커플링 제제는, 예를 들어, 제제(예를 들어, 폴리펩티드)와 같은 기질에 결합(예를 들어, 공유 결합)하기에 적합한 기질 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 커플링 제제는 커플링 모이어티, 예를 들어, 제2 커플링 제제에 결합(예를 들어, 공유 결합)하기에 적합한, 예를 들어, 클릭 커플링 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 기질 반응성 모이어티는 커플링 제제와 제제(예를 들어, 폴리펩티드)의 부착을 유도하도록 선택될 수 있다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 기질 반응 모이어티는, 예를 들어, 제제의 라이신의 측쇄 또는 N 말단 상의 NH₂ 기와 반응할 수 있다. NH₂ 기와 반응할 수 있는 기질 반응 모이어티의 예는 NHS 에스테르, 이미도에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 또는 하이드록시메틸 포스핀이다. 일부 구현예에서, 기질 반응 모이어티는, 예를 들어, 제제의 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄 또는 C-말단 상의 제제의 카르복실과 반응할 수 있다. 카르복실과 반응할 수 있는 기질 반응 모이어티의 예는 카르보디이미드이다. 일부 구현예에서, 기질 반응 모이어티는, 예를 들어, 시스테인의 측쇄 상의 제제의 술프히드릴과 반응할 수 있다. 술프히드릴과 반응할 수 있는 기질 반응 모이어티의 예는 말레이미드, 할로아세틸(예를 들어, 브로모- 또는 요오도-), 피리딜디술파이드, 티오술포네이트, 또는 비닐술폰이다. 디술파이드 브리지를 갖는 제제는, 디술파이드 브리지를 술프히드릴로 전환시키기 위해 환원 조건 하에 놓여질 수 있다. 일부 구현예에서, 기질 반응 모이어티는 제제의 카보닐과 반응할 수 있다. 예를 들어, 케톤 또는 알데히드 기는, 예를 들어, 다당류 번역 후 변형을, 예를 들어 메타-과요오드산나트륨으로 산화시킴으로써 당 단백질에서 생성될 수 있다. 카보닐과 반응할 수 있는 기질 반응 모이어티의 예는 히드라지드 또는 알콕시아민이다.

제제 상의 모이어티는 세포 상의 미리 선택된 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제 상의 NH₂ 기는 세포의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 제제 상의 카복실 기는 세포의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 제제 상의 술프히드릴 기는 세포의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 제제 상의 카보닐 기는 세포의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다.

클릭 가능한 형식의 제제

일부 구현예에서, 제제는 미리 결정된 아미노산에 연결된 커플링 제제를 갖는 폴리펩티드이다. 간략하게 말하면, 폴리펩티드 제제는 제1 커플링 시약을 포함하는 비-표준 아미노산(ncAA)이 폴리펩티드 제제의 하나 이상의 아미노산 위치에 존재하도록 제1 세포("팩토리(factory) 세포")에서 생성될 수 있다. 이어서, 제제가 세포 표면에 제2 커플링 시약을 갖는 제2 세포에 커플링되어, 폴리펩티드 제제를 제2 세포에 커플링시킬 수 있다. 이 기술은 ncAA의 부위-특이적 혼입을 이용하여 세포 표면 상의 제제의 배향이 제어되도록 할 수 있다.

예를 들어, ncAA는, 예를 들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 문헌[Nikic et al. Nature Protocols 2015]에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 제제를 인코딩하는 핵산 내의 관심 대상 부위에 앰버 정지 코돈(TAG)을 유전적으로 혼입시킴으로써 폴리펩티드 제제 내로 도입될 수 있다. 앰버 정지 코돈은, 예를 들어, 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 내부에 혼입될 수 있다. 폴리펩티드 제제를 인코딩하는 이 플라스미드는, 숙주의 번역 기구에 오르소고날(orthogonal)인 아미노아실-tRNA 신타제/tRNA 쌍을 인코딩하는 또 다른 플라스미드와 함께 팩토리 세포(예를 들어, HEK293 또는 CHO 세포) 내로 공동-트랜스펙션될 수 있다. ncAA가 존재하는 경우, 앰버 코돈 및 ncAA의 혼입이 판독된다. 예를 들어, Y306A 및 Y384F 돌연변이를 갖는 M. mazei 피롤리신 아미노아실-tRNA 신타제/tRNA(PylRS/tRNAPyl) 및 다음과 같은 ncAA를 사용할 수 있다: 시클로옥틴-라이신(SCO), 엔도 비시클로 [6.1.0] 노닌-라이신(엔도BCN), 엑소 비시클로 [6.1.0] 노닌-라이신(엑소BCN), 또는 Rac 비시클로 [6.1.0] 노닌-라이신(racBCN). 다른 적합한 ncAA는 본원에 "클릭 가능한 형식의 세포”라는 제목의 섹션에 기재되어 있다. 플라스미드는 단백질의 분비를 유도하는 서열을 추가로 인코딩할 수 있다. 일시적인 트랜스펙션 또는 안정한 세포주가 사용될 수 있다.

일단 클릭 가능한 형식의 단백질이 생성되면, 이는 제2 커플링 제제를 갖는 세포와 반응할 수 있다. 예를 들어, 세포는 클릭 링커, 예를 들어, 아지드를 포함하는 클릭 링커를 갖는 적혈구 세포일 수 있다.

세포에 대한 커플링 시약의 기하학

커플링 제제는 세포 상에 여러 가지 다양한 위치에 부착될 수 있다. 커플링 제제는, 예를 들어, 세포(예를 들어, 세포 상의 폴리펩티드 또는 탄수화물 모이어티)와 같은 기질에 결합(예를 들어, 공유 결합)하기에 적합한 기질 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 커플링 제제는 커플링 모이어티, 예를 들어, 제2 커플링 제제에 결합(예를 들어, 공유 결합)하기에 적합한, 예를 들어, 클릭 커플링 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 기질 반응성 모이어티는 커플링 제제와 세포의 부착을 유도하도록 선택될 수 있다.

적합한 기질 반응 모이어티는 본원에, 예를 들어, "제제에 대한 커플링 시약의 기하학"이라는 제목의 섹션에 기재되어 있다.

세포 상의 모이어티는 제제 상의 미리 선택된 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 상의 NH₂ 기는 제제의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 세포 상의 카복실 기는 제제의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 세포 상의 술프히드릴 기는 제제의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다. 구현예들에서, 세포 상의 카보닐 기는 제제의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐에 연결된다.

소르타제 및 클릭

일부 구현예에서, 링커를 제제 또는 세포에 부착시키는 데 소르타제 반응과 같은 트랜스펩티다제 반응이 이용된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 폴리펩티드 제제는 트랜스펩티다제 인식 서열, 예를 들어, 소르타제 인식 서열을 포함한다. 폴리펩티드 제제는 소르타제 및 호환 가능한 소르타제 인식 서열을 갖는 커플링 시약과 접촉되어, 커플링 시약을 폴리펩티드 제제 상으로 소르태깅(sortagging)시킬 수 있다. 이어서, 폴리펩티드 제제는 제2 커플링 제제를 갖는 세포와 반응할 수 있다. 제2 커플링 제제는, 예를 들어, 세포의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐 상에 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 세포 상의 폴리펩티드 또는 탄수화물)는 트랜스펩티다제 인식 서열, 예를 들어, 소르타제 인식 서열을 포함한다. 예를 들어, 세포는 세포 표면에서 소르타제 인식 서열을 포함하는 막횡단 단백질을 유전적으로 발현할 수 있다. 세포는 소르타제 및 호환 가능한 소르타제 인식 서열을 갖는 커플링 시약과 접촉되어, 커플링 시약을 세포 상으로 소르태깅시킬 수 있다. 이어서, 세포는 제2 커플링 제제를 갖는 폴리펩티드 제제와 반응할 수 있다. 제2 커플링 제제는, 예를 들어, 폴리펩티드 제제의 NH₂ 기, 카복실, 술프히드릴, 또는 카보닐 상에 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 제제는 트랜스펩티다제 인식 서열, 예를 들어, 소르타제 인식 서열을 포함하지 않는다. 구현예들에서, 세포는 외인성 트랜스펩티다제 인식 서열, 예를 들어, 소르타제 인식 서열을 포함하지 않는다. 구현예들에서, 방법은 소르태깅 단계를 포함하지 않는다. 구현예들에서, 기능화된 적혈구 세포는 소르타제 전달 기호를 포함하지 않는다.

소르타제는 2개의 소르타제 인식 모티프를 함께 효소적으로 컨쥬게이션시킬 수 있다. 제1 소르타제 인식 모티프는 소르타제 도너 모티프일 수 있고, 제2 소르타제 인식 모티프는 소르타제 억셉터 모티프일 수 있다.

소르타제 인식 모티프는 LPXTA(SEQ ID NO: 18) 및 LPXTG(SEQ ID NO: 1)를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기이다. 하나의 예시적인 소르타제 인식 모티프는 LPXTG(SEQ ID NO: 1)이며, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기(자연 발생적 또는 비-표준 아미노산 잔기), 예를 들어, 살아있는 유기체에서 발견되는 단백질에서 가장 통상적으로 발견되는 20개의 표준 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 일부 예에서, 인식 모티프는 LPXTG(SEQ ID NO: 19) 또는 LPXT이며, 여기서 X는 D, E, A, N, Q, K, 또는 R 이다. 다른 예에서, X는 소르타제 A에 의해 인식 가능한 LPXTG(SEQ ID NO: 20) 또는 LPXT 모티프 중의 K, E, N, Q, 또는 A로부터 선택된다. 또 다른 예에서, X는 부류 C 소르타제에 의해 인식 가능한 LPXTG(SEQ ID NO: 21) 또는 LPXT 모티프 중의 K, S, E, L, A, 또는 N으로부터 선택된다. 예시적인 소르타제 인식 모티프는 LPKTG(SEQ ID NO: 22), LPITG(SEQ ID NO: 23), LPDTA(SEQ ID NO: 24), SPKTG(SEQ ID NO: 25), LAETG(SEQ ID NO: 26), LAATG(SEQ ID NO: 27), LAHTG(SEQ ID NO: 28), LASTG(SEQ ID NO: 29), LPLTG(SEQ ID NO: 30), LSRTG(SEQ ID NO: 31), LPETG(SEQ ID NO: 32), VPDTG(SEQ ID NO: 33), IPQTG(SEQ ID NO: 34), YPRRG(SEQ ID NO: 35), LPMTG(SEQ ID NO: 36), LAFTG(SEQ ID NO: 37), LPQTS(SEQ ID NO: 38), LPXT, LAXT, LPXA, LGXT, IPXT, NPXT, NPQS(SEQ ID NO: 39), LPST(SEQ ID NO: 40), NSKT(SEQ ID NO: 41), NPQT(SEQ ID NO: 42), NAKT(SEQ ID NO: 43), LPIT(SEQ ID NO: 44), LAET(SEQ ID NO: 45), LPXAG(SEQ ID NO: 46), LPNAG(SEQ ID NO: 47), LPXTA(SEQ ID NO: 18), LPNTA(SEQ ID NO: 48), LGXTG(SEQ ID NO: 49), LGATG(SEQ ID NO: 50), IPXTG(SEQ ID NO: 51), IPNTG(SEQ ID NO: 52), IPETG(SEQ ID NO: 53), NPXTX, NP[Q/K]-[T/s]-[N/G/s], NPQTN(SEQ ID NO: 54), NPKTG(SEQ ID NO: 55), NSKTA(SEQ ID NO: 56), NPQTG(SEQ ID NO: 57), NAKTN(SEQ ID NO: 58), NPQSS(SEQ ID NO: 59), NA-[E/A/S/H]-TG(SEQ ID NO: 60), LAXTG(SEQ ID NO: 61), QVPTGV(SEQ ID NO: 62), LPXTX, LP[Q/K]T[A/S]T(SEQ ID NO: 63), 또는 LPXT[A/S]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

소르타제 억셉터 모티프는 올리고글리신 또는 올리고알라닌, 예를 들어, 1-5 글리신 단편 또는 1-5 알라닌 단편을 포함한다. 일부 예에서, 올리고글리신은 3 또는 5개의 글리신 잔기로 구성된다. 다른 예에서, 올리고알라닌은 3 또는 5개의 알라닌 잔기로 구성된다.

소르타제 전달 기호는 소르타제 반응에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, LPXTGG(SEQ ID NO: 2)와 (G)_n의 소르타제-매개 반응은 LPXT(G)_n(SEQ ID NO: 1)의 소르타제 전달 기호를 생성할 수 있다. 구현예들에서, 소르타제 전달 기호는 본원에, 예를 들어, 이 섹션에 기재된 소르타제 인식 모티프의 서열을 포함한다. 구현예들에서, 소르타제 전달 기호는, 예를 들어, 소르타제 인식 모티프의 서열의 C-말단에, 하나 이상의 알라닌 또는 글리신 아미노산을 추가로 포함한다.

다양한 소르타제가, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2014/183071호(예를 들어, 그 안의 33 내지 37 페이지)에 기재되어 있으며, 이 출원은 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.

다양한 방법에 의해 첨가된 제2 제제

일부 구현예에서, 본원에 기재된 세포(예를 들어, 제핵 적혈구 세포)는 (그의 제1 제제에 더하여) 제2 제제, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 제제는, 예를 들어, 클릭 화학을 이용하여, 세포에 컨쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 세포 또는 그의 전구체 내로 도입된 외인성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)으로부터 발현된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 세포 상으로 소르태깅된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 세포 내로 저장성으로 로딩된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 클릭 기호 또는 잔여 링커에 공유 결합되지 않는다.

제제를 세포에 첨가하는 비-컨쥬게이션 방법

많은 구현예에서, 예를 들어, 클릭 화학을 이용하여, 제제가 세포에 컨쥬게이션되지만, 본원에 기재된 임의의 제제는 또한 다양한 방법을 이용하여 세포에 첨가될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시는 제제, 예를 들어, 본원에 기재된 외인성 폴리펩티드 제제, 예컨대, 표 1의 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 세포(예를 들어, 적혈구 세포, 예컨대, 제핵 적혈구 세포)를 제공한다. 세포는, 예를 들어, 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 또는 이의 전구체 내로 도입함에 의해, 소르태깅에 의해, 저장성 로딩에 의해, 또는 화학적 컨쥬게이션에 의해 제조될 수 있다.

본원의 조성물, 예를 들어, 적혈구 세포를 이용한 처리 방법

조작된 적혈구 세포를 투여하는 방법은, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개WO2015/153102호 및 WO2015/073587호에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 포함된다.

구현예들에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간에게 투여된다. 치료될 수 있는 예시적 포유동물은 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물(예를 들어, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니 피그 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법은 인간 요법 및 수의 적용 둘 모두에 적용 가능하다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는, 패혈증, 자가 면역 질병, 암, 및 미생물 감염을 포함하는, 염증 및 염증과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위해 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구 세포는 자가면역 질병, 예를 들어, 다발성 경화증, 제1 형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 막성 신염, 또는 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2015/153102호의 표 F에 열거된 임의의 질병에 걸린 대상체에게 투여된다.

일부 양태에서, 본 개시는, 본원에 기재된 조성물, 예를 들어, 본원에 기재된 적혈구 세포를 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암, 예를 들어, 본원에 기재된 암이다. 일부 양태에서, 본 개시는, 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한, 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는, 본원에 기재된 질병 또는 질환, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본원에 기재된 적혈구 세포의 용도를 제공한다. 예시적인 암은 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 국제 특허 출원 공개 WO2015/073587호에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 적혈구 세포는 정맥내로, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해 투여된다.

본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.

실시예

본원에 기재된 발명이 더욱 완전하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 기재된다. 본 출원에 기재된 실시예는 본원에 제공된 조성물, 제조물, 및 방법을 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 클릭 핸들을 포함하는 적혈구 세포의 준비

적혈구 세포 집단을 커플링 시약으로 표지하기 위해 준비하였다. 전혈로부터 수득된 적혈구를 여과하고, 3.31x10⁹개 세포/mL의 밀도로 농축시켰다. 세포를 빙냉 인산염-완충 식염수(PBS, 2x1 mL)로 2 회 세척하고, 잔여 부피를 피펫에 의해 제거하였다. 이어서, pH 8의 PBS(100 uL)를 세포에 첨가하였다.

다음과 같은 커플링 시약의 저장 용액을 1 mM로 준비하고(DBCO-술포-NHS 에스테르, DBCO-PEG5-NHS 에스테르, 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르, 및 아지도-PEG4-NHS 에스테르), 0.1 mM 또는 0.04 mM의 최종 커플링 시약 농도를 위해 각 용액을 세포 샘플에 첨가하였다. 반응을, 10분마다 약하게 교반하면서, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

각각의 반응에 1 mL PBSA(0.1% BSA가 함유된 PBS)를 첨가하고, 각각의 반응을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킴으로써, 표지화 반응을 켄칭시켰다. 세포를 원심분리(2500 rpm에서 5분)에 의해 펠릿화하고, 상등액을 흡인에 의해 제거하였다. 이어서, 세포 펠릿을 PBS(1 mL)로 세척하고 다시 펠렛화(2500 rpm에서 5분)하였고, 상등액을 흡인에 의해 제거하였다.

표지화 수준을 검출하기 위해, Cy5-바이오틴-아지드 또는 Cy5-DBCO를 포함하는 검출 시약 저장 용액을 100 nM로 준비하였다. 검출 시약(100 uL)을 각 반응에 첨가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표지화 효율을 유동세포분석법에 의해 결정하였고, 이는 하기 표 2에 요약되어 있다.

[표 2] 클릭 반응의 컨쥬게이션 효율

실시예 2: 클릭 핸들을 포함하는 제제의 준비

커플링 시약을 사용한 표지화에 의한 적혈구 세포로의 커플링을 위해 관심 대상 단백질을 준비하였다. 표지화용 예시적인 단백질은 항체(예를 들어, 항-PDL1(래트 항-마우스 PDL1 항체) 및 항-α4β7(래트 항-마우스 α4β7 항체)), 4-1BB 리간드, 및 단백질 A/G를 포함하였다. 단백질을 전형적으로 탈염하고, 완충액을 PBS로 교환하고, 표지화 전에 1 mg/mL 이상으로 농축하고, pH를 pH 7 내지 8로 조정하였다. 항체를 엔도글리코시다제(예를 들어, EndoS)로 일상적으로 탈당화시켜 ADCC를 방지하고; 엔도글리코시다제는 커플링 시약의 첨가 전에 친화성 정제를 이용하여 제거하였다.

커플링 시약의 저장 용액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 준비하였다. 5 mg/mL 초과의 농도를 갖는 단백질 용액의 경우, 커플링 시약을 단백질 농도에 비해 10배 몰 과량으로 첨가하였다. 5 mg/mL 미만의 농도를 갖는 단백질 용액의 경우, 커플링 시약을 단백질 농도에 비해 20배 내지 50배 몰 과량으로 첨가하였다. 단백질 표지화 반응을, 10분마다 약하게 교반하면서, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

표지화 수준을 검출하기 위해, Cy5-바이오틴-아지드 또는 WS-DBCO-바이오틴을 포함하는 검출 시약 저장 용액을 준비하여 각 반응에 첨가하고, 반응을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 검출용 항-바이오틴 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 표지화 효율을 결정하였다.

표지화도에 대한 대안적 검출 방법으로, 나노드롭(Nanodrop) UV-Vis 프로그램을 이용하여 750 nm에서의 기준선 보정과 함께 흡광도 280 nm 및 309 nm에서 대략 1 내지 3 μL의 표지된 단백질을 판독하였다.

실시예 3: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의한 세포 표면에 공유 결합된 제제를 포함하는 제핵 적혈구 세포의 생성

하기 기재된 일반적인 절차에 따라 단백질을 적혈구 세포에 커플링시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(표 2의 샘플 #11)로 표지된 적혈구 세포를 DBCO-술포-NHS 에스테르 또는 DBCO-PEG5-NHS 에스테르로 표지된 1.5 내지 3 몰 당량의 항-α4β7(마우스) 항체와 함께 인큐베이션하고, 반응을 실온 또는 4℃에서 최대 12시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS 또는 PBSA로 세척하고, 검출 제제에 연결된 항-마우스 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 표지화 효율을 결정하였다. 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같이, 단백질 표지화 효율은 DBCO-술포-NHS 에스테르-결합 항-α4β7 항체에 대해 98.4%로 결정되었고(도 2b), DBCO-PEG5-NHS 에스테르-결합 항-α4β7 항체에 대해 94.4%로 결정되었다(도 2c).

또 다른 실험에서, 고농도의 단백질을 사용하여 작은 반응 부피로 단백질을 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하였다. 항-α4β7(래트) 항체를 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS) 또는 DBCO-PEG5-NHS 에스테르(DP)로 표지하였다. 표지된 세포를 5 내지 10 μL의 부피로 희석되지 않은 상태로 세포당 1 내지 20E6 몰 당량의 항-α4β7 항체와 함께 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광단(플루오레세인 이소티오시아네이트)에 연결된 항-래트 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 단백질 클릭 효율은 98.9 내지 99.8%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은, 예를 들어, 작은 반응 부피 및 많은 양의 단백질을 사용하여, 매우 높은 백분율의 세포를 단백질로 표지할 수 있음을 나타낸다. 이 실험은 세포에 다량체를 연결할 수 있음을 또한 나타내는데, 이는 항체가 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 가지고 있기 때문이다. 본 실시예는 큰 모이어티를 세포에 연결할 수 있음을 또한 나타내는데, 이는 항체가 약 150 kDa의 분자량을 가지기 때문이다.

[표 3] 항-α4β7로 세포를 표지하는 효율

실시예 4: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 적혈구 세포로의 항체 제제의 커플링

다수의 서브유닛 및/또는 번역 후 변형을 갖는 단백질을 세포에 컨쥬게이션시키는 것이 때때로 바람직하다. 본 실시예는 세포 표면으로의 항체의 컨쥬게이션을 기술한다.

항-PD-L1 항체(aPD-L1)(래트 IgG2b)를 표 4에 기재된 상이한 반응 조건 하에서 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 0.1 mM AS의 표지화 농도를 위해 0.1 mM 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)(DMSO에 재현탁됨)로 표지하였다. aPD-L1을 10x 과량의 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)(20 ul의 10 mM DS)로 표지하였다. 표지된 세포를 표 4에 나타낸 농도, 부피 및 양의 표지된 aPD-L1과 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 형광단(PE)에 연결된 항-래트 카파 경쇄 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 표지화 효율을 결정하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 단백질 표지화 효율은 99.7 내지 99.9%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 세포당 존재하는 aPD-L1 분자의 수가 결정되었고, 이는 세포당 7000 내지 15000개 분자의 aPD-L1인 것으로 밝혀졌다. 세포당 클릭된 단백질의 양(ng)을 또한 결정하였고, 이를 표 4에 나타낸다. 일반적으로, 더 높은 농도의 단백질을 첨가하면, 변형되는 세포의 백분율이 더 높아지고 세포당 컨쥬게이션된 분자의 수가 더 많아졌다. 이 실험은 단백질을 사용한 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포 집단의 생성을 입증하며, 예를 들어, 세포당 7000 내지 14,000개 분자의 범위에서 세포당 평균 분자 수를 달성한다. 이 실험은 다량체가 세포에 연결될 수 있음을 또한 입증하는데, 이는 항체가 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 가지고 있기 때문이다. 실험은, 예를 들어, 1E8 또는 1E9개의 적혈구 세포를 갖는, 큰 세포 집단이 표지될 수 있음을 또한 나타내는데, 높은 백분율의 세포가 표지되고 세포당 요망되는 양의 단백질이 달성된다.

[표 4] aPD-L1로 세포를 표지화하는 효율

실시예 5: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 적혈구 세포로의 단백질 리간드 제제의 커플링

41BB 리간드(m41BBL)를 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, m41BBL을 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를 1 내지 5 mg/ml의 표지된 m41BBL과 함께 10 내지 30 ㎕의 부피로 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하고, 형광 검출 시약(항-m41BBL-PE)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 단백질 클릭 효율은 1.14 내지 99.9%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은 단백질 리간드를 사용한 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포 집단의 생성을 입증한다.

[표 5] m41BBL로 세포를 표지화하는 효율

실시예 6: 적혈구 세포에 커플링된 단백질 리간드는 결합 활성을 갖는다

높은 백분율의 표지된 세포 및 세포당 높은 수준의 클릭된 단백질을 갖는 세포 집단을 생성하는 것이 대체로 바람직하다. 동시에, "과잉-표지화(over-labeling)", 예를 들어, 단백질 상의 너무 많은 부위에 링커를 컨쥬게이션시킴으로써 단백질의 작용기성을 파괴하는 것을 피하는 것이 일반적으로 바람직하다. 결과적으로, 클릭된 단백질을 갖는 기능화된 적혈구 세포를, 생리학적 리간드를 결합시키는 능력에 대해 시험하였다.

41BB 리간드(m41BBL)를 실시예 5에 기재된 바와 같이 적혈구 세포에 커플링시켰다. 이어서, 세포를 41BB(41BBL의 동족 결합 파트너), 41BB를 결합시키는 피코에리트린-표지 항체, 및 41BB를 결합시키는 알로피코시아닌(APC)-표지 항체와 접촉시켰다. 세포로의 41BB의 결합은 41BBL이 세포 상에 존재할뿐만 아니라 그의 결합 부위가 결합을 허용하도록 기능적이며 배향되어 있음을 나타낸다. 항-41BBL 항체의 결합은 41BBL이 세포 상에 존재함을 확인해준다. 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 표지화 효율을 결정하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 41BB 결합은 71.4 내지 97.0%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 큰 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은 “과잉-표지화”가 없는, 예를 들어, 리간드의 결합 부위를 파괴함이 없는, 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포의 생성을 입증한다.

[표 6] 41BB로의 적혈구 세포-m41BBL의 결합

실시예 7: 적혈구 세포에 커플링된 항체는 결합 활성을 갖는다

"과잉-표지화"없이 높은 백분율의 표지된 세포 및 세포당 높은 수준의 클릭된 단백질을 갖는 세포 집단을 생성하는 것이 대체로 바람직하다. 결과적으로, 클릭된 항체를 그의 항원을 결합시키는 능력에 대해 시험하였다.

항-PD-L1을 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, aPD-L1을 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를 20 ul의 부피로 2 ㎎/㎖의 표지된 항 PD-L1과 함께 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 Fc 키메라 태그를 갖는 재조합 마우스 PD-L1과 접촉시켰다. 이는 항 Fc 항체로 검출될 수 있다. aPD-L1으로 클릭된 마우스 적혈구 세포의 재조합 단백질로의 결합은, 모든 세포가 래트 항체(항체의 존재를 나타냄)뿐만 아니라 Fc 태그(재조합 단백질로의 결합을 나타냄)에 대하여 이중 양성이 되도록 하는 집단의 완전한 시프트(shift)에 의해 입증되었다.

추가로, PD-L1을 발현하는 뮤린 종양 세포주에 결합하는, aPD-L1 표지된 적혈구 세포의 능력을 평가하였다. 먼저 CT-26, B16F.10 및 A20의 3가지 세포주에서 24시간 동안 IFNg 자극(이는 종양 세포 상에서 PD-L1 발현을 유도함)의 존재 또는 부재 하에서 PD-L1 발현을 평가하였다. PD-L1의 발현을 아이소타입 대조 항체와 비교하여 aPD-L1 항체를 사용한 염색에 의해 평가하였다. aPD-L1로 클릭된 적혈구 세포의 PD-L1 발현 세포로의 결합은, 세포 추적 파 레드(cell trace Far red)로 사전 표지된 암세포 및 적혈구 세포를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다. 세포 현탁액을 항-카파 사슬 항체로 염색하고, 유동세포분석기로 평가하였다. 파 레드 및 카파에 대해 이중 양성인 집단은 적혈구 세포가 종양 세포에 결합되어 있음을 나타낸다. 이 실험은 IFNg 사전 인큐베이션이 존재하거나 부재하는 조건을 평가하고, aPD-L1 클릭된 적혈구 세포를 아이소타입 대조 항체로 클릭된 세포와 비교하였다. aPD-L1 마우스 적혈구 세포에 결합된 종양 세포의 백분율은 종양 세포주에서의 PD-L1 발현 수준에 따라 60 내지 99% 범위였다(도 3). 아이소타입 대조 클릭된 마우스 적혈구 세포에 결합된 종양 세포의 백분율은 예상된 바와 같이 PD-L1 발현 수준과 상호 관련되지 않았다. 전반적으로, aPD-L1 마우스 적혈구 세포의 종양 세포로의 결합은 PD-L1 발현이 증가함에 따라 유의하게 향상되었다. aPD-L1을 발현하는 적혈구 세포의 재조합 PD-L1 및 PD-L1을 발현하는 종양 세포로의 결합은 항-PD-L1이 세포 상에 존재할뿐만 아니라 그 결합 부위가 기능적이며 결합을 허용하도록 배향되어 있음을 나타낸다.

실시예 8: 세포 및 단백질 상의 미반응된 커플링 시약의 정량

일부 구현예에서, 미반응된 클릭 링커는 그가 연결되는 세포 상 및 단백질 상에 없거나 매우 낮은 수준으로 존재하는 것이 바람직하다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 낮은 수준의 미반응된 클릭 링커는 기능화된 세포의 낮은 면역원성과 관련된다. 본 실시예는 세포 상에 존재하는 미반응된 클릭 링커 및 단백질의 정량을 기술한다.

세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)와 반응시켜 표지하고, m41BBL 단백질을 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)와 반응시켜 표지하였다. 이어서, 세포와 단백질을 조합하여 단백질을 세포 표면에 컨쥬게이션시켰다. 이어서, 형광 표지된 링커를 첨가함으로써 잔여 미반응 링커를 검출하였으며, Cy5 DBCO의 첨가는 세포 상의 잔여 링커와 반응하여 이를 확인하였고, Cy5 바이오틴 아지드의 첨가는 단백질 상의 잔여 링커와 반응하여 이를 확인하였다. 실험은 단백질 상의 낮은 수준의 미반응 링커, 구체적으로, 11.2%를 나타내었다. 본 실시예는, 예를 들어, 품질 제어 시험으로서, 제작된 세포 및 단백질 상의 이전의 미반응 링커 부위를 검출하는 능력을 입증한다. 또한, 본 실시예는, 제작된 세포 및 단백질을 링커, 예를 들어, 입체 장애가 적은 링커와 반응시킴으로써 그러한 세포 및 단백질 상의 미반응 링커 부위의 수를 감소시키는 능력을 입증한다.

실시예 9: 다양한 세포 유형 상으로의 외인성 폴리펩티드 제제의 컨쥬게이션

마우스 비장으로부터 적혈구를 기계적 파괴 및 용해시켜 세포 혼합물을 수득하였다. 나머지 세포를 0.1 mM 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하였다. 정제된 대장균 아스파라기나제를 DBCO로 표지하였다. 이어서, 표지된 세포와 단백질을 조합하여 컨쥬게이션시켰다. 표면 아스파라기나제를 토끼 항-아스파라기나제 항체 및 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 657로 표지된 항-토끼 2차 항체로 검출하였다. 표 7에 기재된 마커를 사용하여 각 세포 유형의 동일성을 검출하였다. 세포를 유동세포분석법에 의해 분석하였다. 실험은, 집단 내의 여러 유형의 세포를 구별하도록 설계된 게이팅(gating) 전략을 이용하여, 표 7에 나타낸 바와 같이 시험된 모든 세포 유형의 유의한 표지화를 나타내었다.

[표 7] 여러 세포 유형의 표지화 효율

실험은 면역 세포, 유핵 세포, 및 제핵 세포를 포함한 수많은 세포의 표면으로의 효소의 컨쥬게이션을 또한 입증한다.

실시예 10: 외인성 폴리펩티드 제제에 컨쥬게이션된 적혈구 세포는 생체내에서 종양 성장을 지연시킨다

결장암에 대한 MC38 마우스 모델 시스템을 사용하여 기능화된 적혈구 세포가 종양 성장에 미치는 영향을 시험하였다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 41BBL은 선천성 및 적응성 면역 무기(immune arms) 둘 모두에 대한 다양한 면역 효과기 반응을 유도함으로써 종양 성장을 지연시키는 것으로 생각된다. 가장 강력한 반응은 CD8+ 세포독성 T 세포를 자극하여 증식시키고, 증가된 인터페론 감마 생성 및 다수의 그랜자임의 발현을 통해 그의 효과기 잠재력을 증가시킨다. 대조적으로 다수의 4-1BB 효능제를 사용한 공개된 전임상 데이터는 MC38 또는 다른 모델에서 단일 제제 항종양 활성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않았다(Chen, et al, 2014; Kudo-Saito, et al, 2006; Kocak, et al, Canc Res 2006; Tirapu, et al, Int J Cancer 2004; John, et al, Canc Res 2012). 이러한 활성의 차이는, 4-1BB-L-발현 적혈구 세포에 의한 세포 제시를 이용하여 4-1BB 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)의 세포-세포 결합을 재현하는 것이 항-종양 반응을 자극하는 데에 있어서 효능제 항체-기반 접근법보다 더 효과적임을 시사한다.

실시예 5에 기재된 바와 같이 세포를 41BBL과 컨쥬게이션시켰다. 본 연구에서, 94.7%의 세포를 m4-1BB-L로 표지하였다. 세포당 표지된 분자의 양을 유동세포분석법을 이용하여 정량화하였다. 동물 투여의 경우, 용량당 평균 1.1e9개의 m4-1BB-L mRBC가 투여되었고, 세포당 평균 36,200개의 m4-1BB-L 분자는 용량당 0.084 mg/kg의 m4-1BB-L에 상응하였다.

5 x 10⁵개의 MC-38 세포를 14마리의 6주 내지 8주령 암컷 C57/B6 마우스의 좌측 옆구리에 피하 접종하였다. 동물의 무게와 상태를 매일 기록하고, 종양을 주당 3회 측정하였다.

각 종양을 2차원으로 측정함으로써 종양을 일주일에 3회 측정하였다. 종양 부피는 다음의 표준 공식을 이용하여 계산하였다: (LxW²)/2. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차를 각 시점에서 각 그룹에 대해 계산하였다.

미처리된 대조군과 비교하여 관찰된 m4-1BB-L mRBC의 항-종양 활성은 도 4에 도시되고, m4-1BB-L mRBC로 처리된 마우스에서 종양 성장의 감소를 나타낸다. 종양 부피 분포는 연구 초기인 5일째 내지 9일째까지 그룹들 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(P<0.05, T 테스트).

체중을 매일 기록하였다. 체중의 변화는 1일째에 기록된 체중에 비례하여 각 마우스에 대해 계산하였다. 처리는 대부분의 마우스에 대해 체중의 전반적인 증가에 의해 나타나는 바와 같이 잘 용인되었다. 약간의 체중 감소를 나타낸 마우스는 연구 전체에 걸쳐 총 체중의 5% 이상을 잃지 않았다.

이러한 데이터는 효능제 항체 접근법에 대한 적혈구 세포를 통해 4-1BB-L의 세포 제시의 유의한 효능 및 효력 이점을 지지한다. MC38 모델에서 m4-1BB-L mRBC로 유의한 항종양 활성이 관찰되었는데, 이는 동일한 모델에서 m4-1BB-L보다 10배 높은 수준으로 투여된 4-1BB 효능제 항체로는 이전에 보이지 않았다(Chen, et al, 2014). 효능제 항체 접근법과 비교되는 m4-1BB-L mRBC의 증가된 효력 및 활성은, 4-1BB-L 세포 제시 및 4-1BB를 통한 강력한 신호전달을 유도하는 데 필요하고(Bremer, 2013) 면역 시냅스 내에서 정상적으로 발생하는 상응하는 4-1BB 수용체 다량체화와 일치한다.

실시예 11: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된 3가지 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는 적혈구 세포

복수의 제제로 세포를 표지하는 능력을 시험하기 위해, 적혈구 세포를 3가지 상이한 제제로 기능화시켰다. 3가지 제제(인자 VIIa, 인자 Xa, 및 Cy5)를 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하거나 DBCO 표지된 것(즉, Cy5)으로서 구입하였다. 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하였다. 표지된 세포를 표지된 제제와 조합하여 컨쥬게이션이 일어나게 하였다. 유동세포분석법에 의해 세포 상의 3가지 제제의 존재를 검출하였다. 실험은 33.6%의 세포가 모든 3가지 제제에 대해 양성임을 나타내었다.

실시예 12: 당에 연결된 제제

제제는, 예를 들어, 앞서 기재된 바와 같이, 세포 표면 상의 단백질에 직접 연결될 수 있다. 그러나, 제제는 세포 표면 상의 당, 예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같은 당단백질 상의 글리칸 사슬에 또한 연결될 수 있다. 세포 표면에 글리칸을 갖는 세포는 하나의 클릭 핸들 및 글리칸과 반응하는 하나의 기를 갖는 이작용성 링커로 표지된다.

하나의 접근법에서, 클릭 핸들은, 항체 상의 글리칸을 표지하기 위해 개발된 상업적으로 이용 가능한 키트의 적합화를 이용하여 글리칸에 첨가된다. 이 적합화에서, 항체보다는 세포를 먼저 엔도글리코시다제로 처리하여 코어 GlcNAc 다음에 있는 글리칸을 가수 분해한다. 이어서, 세포를 세척하고 조작된 갈락토실 트랜스퍼라제인 GalT(Y289L) 및 GalNAzide로 처리하였다. GalT는 노출된 GlcNAc에 GalNAzide 잔기를 부착시켜, 알킨 변형된 단백질과의 생체 적합성 스트레인-촉진 아지드-알킨 화학 반응에 이용 가능한 아지드를 생성한다.

또 다른 접근법에서, 문헌[de Bank et al Biotechnol Bioeng 81: 800-808, 2003]에 기재된 방법론을 이용하여 비시날 디올의 미약한 과요오드화물-매개 산화를 통해 알데히드 및 케톤을 생성하도록 글리칸 내의 당 모이어티를 먼저 변형시킨다. 이어서, 각각 알킨 히드라지드 또는 에티밀 히드라지드를 사용하여 알킨 함유 또는 아지드 함유 클릭 핸들을 생성된 알데히드 및 케톤 기에 첨가할 수 있다. 이어서, 상기 다른 실시예에서 기재된 바와 같이, 상응하는 아지드 또는 알킨으로 제제를 표지할 수 있다. 이어서, 표지된 제제를 표지된 세포와 함께 인큐베이션하여 컨쥬게이션이 일어나게 한다. 세포로의 제제의 연결은, 예를 들어, 앞서 기재된 바와 같이, 유동세포분석법에 의해 검출될 수 있다.

연결은 제제 상의 당을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 당을 갖는 제제(예를 들어, 외인성 단백질 또는 항체)는 하나의 클릭 핸들 및 글리칸과 반응하는 하나의 기를 갖는 이작용성 링커, 예를 들어, 앞서 기재된 링커 중 하나로 표지될 수 있다. 세포는 제2 링커, 예를 들어, 세포 표면의 단백질 또는 당과 반응하는 링커로 표지될 수 있다. 이어서, 표지된 세포와 표지된 제제를 함께 혼합하여 컨쥬게이션이 일어나게 한다. 세포로의 제제의 연결은, 예를 들어, 앞서 기재된 바와 같이, 유동세포분석법에 의해 검출될 수 있다.

실시예 13: 기능화된 적혈구 세포의 면역원성 측정

일부 구현예에서, 기능화된 적혈구 세포는 낮은 면역원성을 갖는다. 면역원성은 적혈구 또는 다른 세포 상에서 발현된 단백질에 대해 생성된 항체의 측정에 의해 시험될 수 있다. 이러한 항체를 측정하는 한 가지 표준 방법은 직접 ELISA를 이용하는 것이다. 적혈구 세포에 연결된 단백질 또는 제제에 대한 면역원성은, 기능화된 적혈구 세포를 동물 또는 환자에게 투여한 후 수일 또는 수주의 기간에 걸쳐 혈장 또는 혈청 샘플을 수득함으로써 측정될 수 있다. 샘플의 연속 희석액을 준비하고, 이어서 적혈구 세포를 기능화하는 데 사용되는 단백질 또는 제제로 사전 코팅된 ELISA 플레이트 웰에서 10 내지 120분 동안 인큐베이션하여 단백질 또는 제제에 대해 생성된 임의의 항체가 결합할 수 있게 한다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 단백질 또는 제제에 결합한 임의의 항체에 결합하는 효소-표지(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제) 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 웰을 세척하고, 웰에 남아있는 효소 활성의 수준을 측정하여 적혈구 세포를 기능화하는 데 사용되는 단백질 또는 제제에 대해 생성된 항체의 수준을 평가한다.

실시예 14: 적혈구 세포 세포독성제를 사용한 적혈구 세포의 기능화

본 실시예는 독성 제제, 예를 들어, 적혈구 세포에서 발현되는 경우 그에 독성인 제제, 예컨대, 성장 속도, 생존력, 세포 수명, 또는 기능을 감소시키는(적혈구 세포 세포독성) 제제로 세포를 기능화할 수 있는 방법을 기술한다. 세포독성제는, 예를 들어, 아미노산을 분해하여 세포의 성장 및 확장을 손상시키는 효소 단백질, 주요 대사 분자 또는 분자 중간체를 변형시키거나 분해하는 데 관여하는 효소, 또는 중요한 세포 과정을 방해하는 단백질 또는 분자, 예를 들어, 리신(ricin)을 포함한다.

적혈구 세포 세포독성제의 일 예는 암세포를 기아 상태로 만드는 데 임상적으로 사용되는 아스파라기나제이다. 성숙한 적혈구 세포에서의 아스파라기나제의 과발현은 세포 성장 및 세포 성숙을 방해한다.

세포, 예를 들어, B6.129S7-Rag1^tm1MomIJ(Rag1 녹아웃 마우스)로부터의 뮤린 적혈구는, 마우스에 2 mg의 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르를 주사하고, 이어서 2일 후에 세포를 수거함으로써 생체 내에서 표지된다.

적혈구 세포 세포독성제, 예를 들어, 아스파라기나제는 25℃에서 30분 동안 5x 및 2.5x 몰 과량의 DBCO-술포-NHS 에스테르로 표지된다. 5x 몰 과량의 DBCO-술포-NHS 에스테르는 아스파라기나제 단량체당 약 2개의 표지를 생성시키고, 2.5x 몰 과량의 DBCO-술포-NHS 에스테르는 아스파라기나제 단량체당 약 1.2개의 표지를 생성시킨다.

이어서, 표지된 세포를 2가지 상이한 농도의 아스파라기나제-표지 DBCO와 서로 다르게 60분 동안 조합하여, 컨쥬게이션이 일어나게 하고 서로 다르게 표지된 세포를 얻는다. 세포의 표면 상의 제제의 존재는, 아스파라기나제에 대한 항체를 사용한 유동세포분석법을 이용하여, 아스파라기나제에 대한 활성 검정을 이용하여 검출될 수 있다.

[표 8] 표지된 세포의 아스파라기나제 활성

시간 경과에 따른 혈청 아스파라기나제를 고갈시키는 적혈구 컨쥬게이션된 아스파라기나제 대 컨쥬게이션되지 않은 아스파라기나제의 상대적 능력을 마우스에서 시험할 수 있다. 표 9에 나타낸 바와 같이 마우스에 대조 적혈구, 다량 또는 소량의 아스파라기나제가 함께 표지된 RBC, 또는 소량, 중간 양, 또는 다량의 컨쥬게이션되지 않은 재조합 아스파라기나제를 주사하였다. 대조군 및 아스파라기나제 컨쥬게이션된 RBC를 형광 태그인 Cy5로 추가로 표지하여, 주사 후 RBC의 약물 동력학을 결정하였다. 이어서, 주사 후 혈액 샘플을 다양한 시간에서 채취하여, 아스파라긴의 수준 및 표지된 RBC 수준을 결정한다.

[표 9] 마우스에서의 아스파라기나제-표지 세포의 주사를 위한 설정.

0.39, 2.8, 또는 15 마이크로그램의 재조합 아스파라기나제를 마우스 내로 주사된 C557BL/6 마우스 내로 주사하였을 때, 혈청 아스파라긴은 주사 후 6시간째에 거의 0으로 감소하였다(도 5). 그러나, 0.39 ug 그룹의 경우, 혈청 아스파라긴 수준이 주사 후 1일째에 이르러 거의 정상 수준으로 상승한 반면, 2.8 및 15 ug 투여 그룹은 4일째에 이르러 거의 정상 수준 또는 그 초과 수준으로 상승하였다. 대조적으로, 아스파라긴 수준은, 적혈구에 커플링된 소량 또는 다량의 아스파라기나제가 투여된 C57BL/6 마우스에서 6시간째부터 8일째 사이에 0에 가깝게 감소하였고, 수준은 11일째에 이르러 다시 상승하기 시작하였다(도 5). 유사한 결과가 Rag1 마우스에서 수득되었지만(도 6); C57BL/6 마우스와 대조적으로, 아스파라긴 수준은 29일째까지 거의 0으로 유지되었다(도 6). 유동세포분석법을 이용하여 주사 후 다양한 시간에서 Cy5-양성 세포의 백분율을 검출함으로써 ASNase 컨쥬게이션된 세포의 약물 동력학을 또한 측정한다. 주사 후 1일째에, 나머지 ASNase-컨쥬게이션 세포의 제거율은 Cy5-표지 세포와 유사하였다(도 7a 및 도 7b). 1일째에 순환에 존재하는 RBC의 대략 20%는 18일째까지 혈액 내에 남아있었다. 높은 수준의 ASNase를 가진 세포의 경우, 세포의 초기의 신속한 제거율이 낮은 수준의 ASNase를 가진 세포의 경우보다 더 높았다. 이러한 초기의 신속한 제거율에도 불구하고, 첫날 이후에 순환에 남아있는 세포는 적어도 22일째까지 순환에 검출 가능하게 남아있었다. 이 실험은 적혈구로의 아스파라기나제의 컨쥬게이션이 혈액 내에서의 아스파라기나제의 순환 시간을 극적으로 개선시킨다는 것을 입증한다. 이 향상된 노출은 단일 투여에 의한 수일 및 수주에 걸쳐 혈청 아스파라긴 수준을 감소시키는 능력의 극적인 개선과 관련된다.

또한, 아스파라기나제-표지 RBC에 대한 약물 동력학적 프로파일은 또한 반복 투여시에도 변하지 않았으며, 이는 이 검정에 의해 검출 가능한 바와 같이 모든 3가지 아스파라기나제 수준에 대하여 아스파라기나제-표지 RBC에 대한 면역원성 반응의 결여를 나타낸다.

실시예 15: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 적혈구 세포로의 효소 제제의 커플링

인자 Xa(FXa)를 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 1e9 내지 1.36e10개 세포/ml의 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, FXa를 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를, 10 μL 내지 3 mL의 부피로, 0.5 내지 1.7 mg/ml의 표지된 FXa와 함께 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광 검출 시약(항-FXa-PE)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 단백질 클릭 효율은 99%의 범위인 것으로 결정되었다. 이 실험은 효소를 사용한 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포 집단의 생성을 입증한다.

세포당 인자 Xa 단백질 분자의 수는 항체 결합 용량에 의해 세포당 1,000 내지 250,000개 분자인 것으로 정량화되었다. 세포당 단백질의 수는, 예를 들어, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 단백질 농도, 세포 수, 및 반응 부피를 사용하여 조정될 수 있다.

인자 Xa의 활성은 TGA 활성에 의해 세포당 최대 14,000개의 활성 분자로서 정량화되었다.

실시예 16: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 인간 적혈구 세포로의 단백질 제제의 커플링

인자 Xa(FXa)와 아스파라기나제(ASNase)를 인간 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, Fxa와 ASNase를 각각 DBCO-PEG5-NHS 에스테르(DP)와 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를, 10 μL 부피로, 1.03 mg/ml의 표지된 FXa 및 4.535 mg/ml의 ASNase와 함께 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광 검출 시약(항-FX-PE 및 항-ASNase-AlexaFluor 488)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 단백질 클릭 효율은 FXa의 경우 99.9%의 범위이고, ASNase의 경우 71.1%의 범위인 것으로 결정되었다. 이 실험은 상이한 단백질을 사용한 매우 높은 표지화 효율을 갖는 인간 적혈구 세포 집단의 생성을 입증한다.

실시예 17: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 적혈구 세포로의 펩티드 제제의 커플링

바이오티닐화 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 35-55(MOG) 펩티드를 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 상이한 양(다량 및 소량)의 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, MOG 펩티드를 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를, 10 μL의 부피로, 2.7 mg/ml의 표지된 MOG-DBCO와 함께 23℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광 검출 시약(항-바이오틴-PE)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 펩티드 클릭 효율을 결정하였다. 펩티드 클릭 효율은 MOG의 경우 67.4% 내지 91.8%의 범위인 것으로 결정되었다. 이 실험은 펩티드를 사용한 조정 가능한 정도의 표지화 효율을 갖는 세포 집단의 생성을 입증한다. 이 실험은 짧은 펩티드(약 20개 아미노산)가 적혈구 세포 상으로 효율적으로 클릭될 수 있음을 또한 입증한다.

실시예 18: 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커를 통한 적혈구 세포로의 사이토카인 제제의 커플링

인간 IL10(hIL10)을 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, hIL10을 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 표지하였다. 표지된 세포를, 2 μL의 부피로, 0.24 내지 0.79 mg/ml의 표지된 hIL10과 함께 23℃에서 1 내지 3시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광 검출 시약(항-hIL10-PE)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 표 10에 나타낸 바와 같이, 단백질 클릭 효율은 76.7 내지 100%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은 매우 높은 표지화 효율, 예를 들어, 세포당 200,000개가 넘는 분자를 갖는 세포 집단의 생성을 입증한다.

[표 10] hIL10으로 세포를 표지하는 효율

실시예 19: 적혈구 세포에 커플링된 사이토카인은 결합 활성을 갖는다

클릭된 단백질을 갖는 기능화된 적혈구 세포를, 생리학적 리간드를 결합시키는 능력에 대해 시험하였다. 상기 논의된 바와 같이, 단백질의 결합 활성을 보존하면서 높은 백분율의 표지된 세포 및 세포당 높은 수준의 클릭된 단백질을 갖는 것이 대체로 바람직하다.

인간 IL10(hIL10)을 실시예 18에 기재된 바와 같이 적혈구 세포에 커플링시켰다. 이어서, 세포를 인간 IL10 수용체 알파 Fc 융합체(hIL10의 동족 결합 파트너)와 접촉시키고, Fc를 결합시키는 알로피코시아닌(APC)-표지 항체를 사용하여 세포 상으로 클릭된 hIL10의 상호작용 및 인간 IL10 수용체 알파로의 그의 결합을 검출하였다. 세포로의 hIL10 수용체 알파의 결합은 hIL10이 적혈구 세포 상에 존재할뿐만 아니라 그 결합 부위가 결합을 허용하도록 기능적이며 배향되어 있음을 나타낸다. 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 표지화 효율을 결정하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, hIL10 결합은 90.0 내지 95.0%의 범위인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은 “과잉-표지화”가 없는, 예를 들어, 리간드의 결합 부위를 파괴함이 없는, 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포의 생성을 입증한다.

[표 11] hIL10 수용체 알파로의 적혈구 세포-hIL10의 결합

실시예 20: 적혈구 세포로의 표적화 모이어티와 조합된 사이토카인의 커플링

인간 IL10(hIL10)을 항-α4β7 Fab와 조합하여 적혈구 세포에 커플링시켰다. 반응을 수행하기 위해, 적혈구 세포를 3-아지도프로피온산 술포-NHS 에스테르(AS)로 표지하고, hIL10 및 항-α4β7 Fab를 DBCO-술포-NHS 에스테르(DS)로 개별적으로 표지하였다. 표지된 세포를, 30 μL 부피로 0.583 mg/ml의 표지된 hIL10과 함께, 그리고 19.35 μL의 부피로 2.434 mg/ml의 표지된 항-α4β7 Fab와 함께, 23℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1% 소 혈청 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수로 세척하고, 형광 검출 시약(항-hIL10-BV421 및 항-래트 카파 경쇄-PE)으로 염색하였다. 이어서, 세포를 유동세포분석법을 통해 분석하여 단백질 클릭 효율을 결정하였다. 이중 단백질 클릭 효율은 대략 98.3%인 것으로 결정되었다. 세포는 그의 형광이 다른 점에서는 유사한 비표지된 세포의 99%보다 높은 경우 형광에 대해 양성으로 간주된다. 이 실험은 사이토카인 및 표적화 모이어티를 사용한 매우 높은 표지화 효율을 갖는 세포 집단의 생성을 입증한다.

실시예 21: 클릭 특이성

본 실시예는 클릭 표지화의 특이성을 입증한다. 3가지 샘플을 검정하였다. 첫 번째로, 미처리된 뮤린 적혈구(클릭 핸들이 결여됨)를 DBCO 클릭 핸들을 갖는 단백질 제제(항-a4b7 Fab)와 혼합하였다. 두 번째로, 아지드 클릭 핸들을 갖는 뮤린 적혈구를 클릭 핸들이 결여된 항-a4b7 Fab과 혼합하였다. 세 번째로, 아지드 클릭 핸들을 갖는 뮤린 적혈구를 호환 가능한 DBCO 클릭 핸들을 갖는 항-α4b7 Fab과 혼합하였다. 반응을 PBS 중에서 실온에서 1시간 동안 진행시켰다. 이어서, 세포를, PE(피코에리트린) 항체와 컨쥬게이션된 항-래트 IgG 카파와 접촉시키고 유동세포분석법을 수행함으로써 항-α4b7 Fab의 존재에 대해 검정하였다. 세포는 그의 신호가 검출 시약의 존재 하에 그러나 항-a4b7 Fab 단백질의 부재 하에서 다른 점에서는 유사한 미처리 세포의 99%의 신호보다 큰 경우 형광에 대해 양성으로 간주되었다. 예상된 바와 같이, 제1 샘플과 제2 샘플은 낮은 형광을 보이는(각각 세포의 1.81% 및 1.53%가 형광를 나타냄) 반면, 세 번째 샘플은 높은 형광을 보였다(세포의 95.2%가 형광을 나타냄). 본 실시예는 클릭 표지화가 매우 특이적임을 입증한다.

실시예 22: 제제의 N-말단으로의 클릭 핸들의 컨쥬게이션

예를 들어, C-말단 도메인의 작용기성을 더 잘 보존하기 위해, 예를 들어, 표지화를 관심 대상 단백질의 N-말단쪽으로 편향시킴으로써, 단백질 생물학의 파괴를 방지하는 것이 대체로 바람직하다. 관심 대상 단백질은, 커플링 시약을 사용한 표지화에 의해 적혈구 세포로의 커플링을 위해 준비되었다. 인간 IL10의 작용기성을 더 잘 보존하기 위해, NHS 에스테르 화학을 N 말단 표지화쪽으로 편향시켰다. 단백질을 탈염시키고, 완충액을 PBS로 교환하고, 이어서 표지화 전에 1 mg/mL 이상으로 농축시켰다. pH는 중성 pH, 대략 7 내지 7.4로 유지하였다.

커플링 시약의 저장 용액을 실시예 1에 기재된 바와 같이 준비하였다. 커플링 시약을 단백질 농도에 대해 1:1 몰비로 첨가하였다. 단백질 표지화 반응을 실온에서 1시간 내지 1시간 30분 동안, 10분마다 약하게 교반하면서, 인큐베이션하였다. 표지화 수준을 검출하기 위해, 나노드롭 UV-Vis 프로그램을 이용하여 750nm에서의 기준선 보정과 함께 흡광도 280 nm 및 309 nm에서 대략 1 내지 3 μL의 표지된 단백질을 판독하였다. 표지화도는 단백질당 0.63 내지 1.39개의 DBCO 클릭 핸들 분자 범위였다.

실시예 23: 말레이미드 화학을 이용한, 예를 들어, π클램프에 위치한, 유리 시스테인 잔기를 포함하는 제제로의 클릭 핸들의 컨쥬게이션

예를 들어, 부위 특이적 말레이미드 화학 컨쥬게이션을 위해 관심 대상 단백질 내로 유리 시스테인을 도입함으로써, 단백질 생물학을 더 잘 보존하는 것이 바람직할 수 있다. 관심 대상 단백질(예를 들어, 마우스 41BBL)은, 커플링 시약을 사용한 표지화에 의해 적혈구 세포로의 커플링을 위해 준비되었다. 단백질 작용기성을 더 잘 보존하기 위해, 부위 특이적 말레이미드 화학 컨쥬게이션을 위해 "π클램프"로 알려진 4개의 아미노산 서열(FCPF, SEQ ID NO: 64)로 재조합 41BBL 단백질 내로 유리 시스테인을 도입하였다. 본 실시예에서는 π클램프가 사용되지만, 임의의 유리 시스테인 잔기가, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은, 부위 특이적 컨쥬게이션을 위해 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 단백질을 탈염시키고, 완충액을 PBS로 교환하고, 표지화 전에 1 mg/mL 이상으로 농축시켰다. 단백질을 1mM DTT로 환원시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, NAP5 컬럼 상에서 탈염시켰다.

말레이미드 커플링 시약을 단백질 농도에 비해 5배 몰 과량으로 첨가하였다. 단백질 표지화 반응을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하고, NAP10 컬럼을 사용하여 탈염시켰다. 표지화 수준을 검출하기 위해, 나노드롭 UV-Vis 프로그램을 이용하여 750 nm에서의 기준선 보정과 함께 흡광도 280 nm 및 309 nm에서 대략 1 내지 3 μL의 표지된 단백질을 판독하였다. 표지화도는 단백질당 6 내지 7.6개의 DBCO 클릭 핸들 분자 범위였다.

실시예 24: 티오링커 화학을 이용한, 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 제제로의 클릭 핸들의 컨쥬게이션

관심 대상 단백질 내의 특정 부위에 및/또는 특정 배향으로 클릭 핸들을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 관심 대상 단백질은, 커플링 시약을 사용한 표지화에 의해 적혈구 세포로의 커플링을 위해 준비되었다. 한 가지 방법에서, 이황화물 결합의 브리징을 통한 부위 특이적 클릭 핸들 컨쥬게이션을 위해 티오링커 화학을 재조합 항-CTLA4 Fab 단백질에 도입하였다. Fab을 탈염시키고, 완충액을 PBS로 교환하고, 표지화 전에 1 mg/mL 이상으로 농축시켰다. 이어서, Fab를 5 mM DTT로 환원시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 완충액을 PBS로 교환하였다. 환원된 이황화물 결합을 표지하기 위해 티오링커 커플링 시약을 단백질 농도에 비해 15배 몰 과량으로 첨가하였다. 단백질 표지화 반응을 4℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이션하고, Zeba 컬럼을 사용하여 탈염시켰다. 표지화 수준을 검출하기 위해, 나노드롭 UV-Vis 프로그램을 이용하여 750nm에서의 기준선 보정과 함께 흡광도 280 nm 및 309 nm에서 대략 1 내지 3 μL의 표지된 단백질을 판독하였다. 표지화도는 단백질당 8.3개의 DBCO 클릭 핸들 분자였다. 항-CTLA-4 Fab 상에서의 티오링커 배향된 클릭 핸들 표지화를 다른 클릭 핸들 시약과 비교하였고, 이는 세포의 실질적인 표지화를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 티오링커-표지 항-CTLA-4는 재조합 CTLA4로의 기능적 결합을 유의하게 증가시키는 것으로 또한 밝혀졌다.

또 다른 방법에서, HIS6 정제 태그를 통해 재조합 단백질(HIS6 마우스 41BBL)을 부위 특이적으로 표지하기 위해 티오링커 화학을 이용하였다. 단백질을 전형적으로 탈염시키고, 완충액을 PBS로 교환하고, 표지화 전에 1 mg/mL 이상으로 농축시켰다. 이어서, (비환원된) 단백질의 HIS6 태그를 표지하기 위해 티오링커 커플링 시약을 단백질 농도에 비해 20배 몰 과량으로 첨가하였다. 단백질 표지화 반응을 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하고, Zeba 탈염 칼럼을 사용하여 완충액을 PBS로 교환하였다. AS-표지 RBC 상으로 클릭된 HIS6 마우스 41BBL의 티오링커 표지화는, 각각 IL-2 생성(도 8a) 및 인터페론-γ(IFN-γ) 생성(도 8b)에 의해 나타나는 바와 같이, 41BBL-클릭 세포가 면역 세포를 활성화시키는 기능적 능력을 증가시켰다. HIS6 마우스 41BBL의 배향된 연결은 무작위 연결과 비교하여 실질적으로 더 큰 IL-2 및 IFN-γ 분비를 가져왔지만, 후자는 클릭 CTL 대조군(AS-표지 RBC 단독)보다 유의하게 큰 사이토카인 분비를 유도하는 것으로 관찰되었다.

실시예 25: 비-표준 아미노산(ncAA)을 포함하는 제제의 생성

예를 들어, 비-표준 아미노산(ncAA)을 부위-특이적 방식으로 관심 대상 단백질 내로 혼입시킴으로써, 관심 대상 단백질 내의 특정 관심 대상 부위에 커플링 시약을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 본 실시예에서, 관심 대상 단백질은, tRNA/아미노-아실-tRNA 신타제 쌍을 함유하는 플라스미드 및 앰버 정지 코돈(TAG)이 관심 대상 부위에 혼입된 관심 대상 단백질(mIg-마우스 41BBL)을 인코딩하는 플라스미드를 사용한 Expi293 세포의 공동-트랜스펙션을 통해 생성되었다. 세포를 플레이팅하고, 1일째에 ExpiFectamine 키트를 사용하여 1.5μg/mL의 각각의 플라스미드로 플라스미드를 트랜스펙션시켰다. 동일한 날에 앰버 정지 코돈 대신 부위 특이적 혼입을 위해 상이한 농도(2mM, 1.3mM, 1mM, 250μM)의 ncAA(엑소(BCN)-Lys; 도 9a)를 트랜스펙션된 세포에 첨가하였다. 트랜스펙션 후 3일째에, 배지를 수거하여 분비된 단백질을 수득하였다. 분비된 단백질은 실온에서 30분 동안 아지드-바이오틴 Cy5와의 인큐베이션을 통해 부위 특이적 ncAA 혼입을 갖는 것으로 확인되었고, 이어서 이를 웨스턴 블롯 분석하였다. 항-41BBL 항체 및 2차 HRP 항체로 단백질을 검출하고, 항-바이오틴-HRP 항체로 클릭 핸들 혼입을 검출하였다.

[표 12] 클릭된 단백질

도 9b에 도시된 바와 같이, ncAA 엑소(BCN)-라이신의 부위-특이적 혼입은 클릭 가능한 뮤린 41BBL의 생성을 가져왔다.

실시예 26: 클릭 기호를 갖는 링커를 통한 적혈구 세포로의 우레이트 옥시다제의 커플링

재조합 칸디다 유틸리스(Candida utilis) His₆-우레이트 옥시다제를 대장균으로부터 발현시켜 정제하고, DBCO-술포-NHS 에스테르로 표지하여 단량체당 대략 1개 표지의 비율로 우레이트 옥시다제를 생성하였다. 뮤린 적혈구(RBC)를 6-아지도헥산산 술포-NHS 에스테르로 표지하였다. 1e9개의 표지된 뮤린 RBC를 0 uM 또는 75 uM DBCO-표지 우레이트 옥시다제의 존재 하에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하는 커플링 반응을 수행하였다. 우레이트 옥시다제 컨쥬게이션의 정도는, His₆-우레이트 옥시다제에 대한 뮤린 RBC를 DyLight 488-표지 항-His₆ 항체로 염색한 후, 유동세포분석법에 의해 평가되었다. 75 uM 우레이트 옥시다제와 함께 인큐베이션한 RBC의 100%가 효소로 표지되었고; 대조적으로, 0 uM 우레이트 옥시다제로 처리된 음성 대조 세포의 0.16%만이 이 검정에서 양성 형광을 나타내었다. 우레이트 옥시다제에 커플링된 RBC는 요산을 효과적으로 고갈시킬 수 있었고, 세포당 약 4.6e 내지 12개 단위의 우레이트 옥시다제 활성을 나타내었다.

실시예 27: 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 활성이다

제핵 적혈구 세포를 그의 표면에서 항-PD-L1과 컨쥬게이션시키고, 마우스의 종양에 침윤하는 능력에 대해 시험하였다.

마우스에게 B16F10 세포를 피하 접종하였다. 투여 전에 종양을 400 입방 ㎜까지 성장시켰다. 뮤린 RBC를 항 뮤린 PD-L1 및 아이소타입 대조군으로부터의 단편 항체(Fab)와 컨쥬게이션시켰다. 컨쥬게이션된 뮤린 RBC를 제조업체의 프로토콜에 따라 CTFR로 표지하였다. 세포를 동물에게 주입하였다. 주입 1일 후, 종양을 수집하였다. 종양을 절편화하고, 항 CD31로 염색하여 종양 혈관구조 및 DAPI를 시각화하고, 염색하여 핵을 시각화하였다. 염색된 절편을 스캔하고 사진을 찍었다. Halo 소프트웨어를 이용하여 종양 영역과 혈관구조 영역을 확인하였다. 이 두 영역에서의 표지된 RBC의 총 세포의 수를 아이소타입 대조군과 항 PD-L1 둘 모두에 대해 취하였다. 종양에서 발견된 RBC와 혈관에서 발견된 RBC 사이의 비를 계산하였다. 혈관 내의 RBC와 종양 내의 RBC 사이의 비는 아이소타입 대조 컨쥬게이션된 RBC에 대해 1(8마리 마우스의 종양에서의 측정치의 평균)이며, 이는 종양과 혈관구조에서의 유사한 양을 나타낸다. 혈관 내의 RBC와 종양 내의 RBC 사이의 비는 항 PD-L1 처리된 마우스에 대해 1.7이며, 이는 아이소타입 대조 마우스와 비교하여 항-PD-L1 그룹에서의 종양 내의 RBC의 농축을 나타낸다. 두 그룹 간의 비의 차이는 P<0.01(스튜던트 T 테스트)로 통계적으로 유의하였다.

이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 고수준의 PD-L1을 발현하는 종양은 저수준의 PD-L1을 발현하는 종양보다 항-PD-L1을 포함하는 RCT에 더 잘 반응할 수 있다. B16F10 세포는 10 ng/㎕의 IFN-감마로 자극하였을 때 PD-L1의 세포 당 약 300,000개 카피를 발현하였다. 대조적으로, 동일한 조건 하에서, CT26 세포는 PD-L1의 세포당 약 150,000개 카피를 발현하였고, A20 세포는 PD-L1의 세포당 약 100,000개 카피를 발현하였다. PD-L1 카피 수는 퀀텀 심플리 셀룰라 키트(Quantum Simply Cellular kit)(Bangs Laboratories)를 사용하여 측정하였다. 항-PD-L1 항체를 그의 표면에 포함하는 적혈구 세포는 A20 세포에 대해서보다 IFN-감마 처리된 B16F10 세포 및 CT26에 대해 더 높은 결합을 나타내었고, 이는 종양 세포로의 적혈구 세포의 증가된 결합을 유발하는 종양 세포 상에서의 더 높은 PD-L1 발현 수준과 일치한다.

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preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 20 Leu Pro Lys Thr Gly 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> /replace="Ser" or "Glu" or "Leu" or "Ala" or "Asn" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 21 Leu Pro Lys Thr Gly 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 22 Leu Pro Lys Thr Gly 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 23 Leu Pro Ile Thr Gly 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 24 Leu Pro Asp Thr Ala 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 25 Ser Pro Lys Thr Gly 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 26 Leu Ala Glu Thr Gly 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 27 Leu Ala Ala Thr Gly 1 5 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 28 Leu Ala His Thr Gly 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 29 Leu Ala Ser Thr Gly 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 30 Leu Pro Leu Thr Gly 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 31 Leu Ser Arg Thr Gly 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 32 Leu Pro Glu Thr Gly 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 33 Val Pro Asp Thr Gly 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 34 Ile Pro Gln Thr Gly 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 35 Tyr Pro Arg Arg Gly 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Sortase recognition site sequence" <400> 36 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Claims (27)

1. 세포 표면에 존재하는 단백질의 아미노산 측쇄를 통해, 클릭 기호(click signature)를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합된 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는 제핵 적혈구 세포로서, 상기 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호의 구조를 갖는, 제핵 적혈구 세포.
2. 클릭 기호를 포함하는 잔여 링커에 의해 세포 표면에 각각이 공유 결합된, 복수의 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는, 제핵 적혈구 세포로서,
   상기 세포 상의 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 10%는 아미노산 측쇄를 통해 세포 표면에 존재하는 단백질에 연결되고,
   상기 클릭 기호는 클릭 반응의 생성물로서 형성되었거나 클릭 기호의 구조를 갖는, 제핵 적혈구 세포.
3. 제2항에 있어서, 상기 세포 상의 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%는 아미노산 측쇄를 통해 세포 표면에 존재하는 단백질에 연결되는, 제핵 적혈구 세포.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작되지 않은, 제핵 적혈구 세포.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비천연 아미노산을 포함하지 않는, 제핵 적혈구 세포.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 π-클램프를 포함하는, 제핵 적혈구 세포.
7. 제6항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 상기 π-클램프를 통해 상기 제핵 적혈구 세포에 공유 결합되는, 제핵 적혈구 세포.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 비-표준 아미노산(ncAA)을 포함하는, 제핵 적혈구 세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 상기 ncAA를 통해 상기 제핵 적혈구 세포에 공유 결합되는, 제핵 적혈구 세포.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 소르타제 전달 기호(sortase transfer signature)가 결여된, 제핵 적혈구 세포.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 알파4베타7 항체, IL10, 효소, 예를 들어 아스파라기나제, 또는 응고 인자, 예를 들어 인자 Xa로부터 선택되는, 제핵 적혈구 세포.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 또는 200,000개 카피의 상기 외인성 폴리펩티드 제제, 또는 5,000 내지 10,000, 10,000 내지 50,000, 50,000 내지 100,000, 또는 100,000 내지 200,000개 카피의 상기 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는, 제핵 적혈구 세포.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 결합 파트너를 결합시키는 펩티드 리간드인, 제핵 적혈구 세포.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제의 적어도 20%가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일에 걸쳐 대상체의 순환계에 남아있게 되는 제거율을 갖는, 제핵 적혈구 세포.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 상의 커플링 시약의 10% 미만이 미반응된 커플링 시약인, 제핵 적혈구 세포.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 외인성 폴리펩티드 제제를 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 제2 외인성 폴리펩티드 제제는 클릭 기호를 포함하는 제2 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합되는, 제핵 적혈구 세포.
17. 제16항에 있어서, 제3 외인성 폴리펩티드 제제를 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 제3 외인성 폴리펩티드 제제는 클릭 기호를 포함하는 제2 잔여 링커에 의해 세포 표면에 공유 결합되는, 제핵 적혈구 세포.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 미리 선택된 배향으로 세포 표면에 공유 결합되며, 예를 들어, 상기 외인성 폴리펩티드 제제의 동일한 모이어티(예를 들어, N-말단, C-말단, 또는 특정 잔기, 예컨대, 시스테인)에 의해 부착되는, 제핵 적혈구 세포.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 폴리펩티드 제제는 상기 세포의 내인성 분자, 예를 들어, 세포 표면에 존재하는 내인성 폴리펩티드에 공유 결합되는, 제핵 적혈구 세포.
20. 적어도 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 제핵 적혈구 세포를 포함하는 제조물.
21. 제20항에 있어서, 상기 제조물 중의 상기 제핵 적혈구 세포의 적어도 70%는 제제를 포함하는, 제조물.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 제조물 중의 상기 제핵 적혈구 세포의 적어도 70%는, 예를 들어, 실시예 6의 유동세포분석법 검정에서, 리간드를 결합시키는 외인성 폴리펩티드 제제를 포함하는, 제조물.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제조물 중의 상기 외인성 폴리펩티드 제제의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 미리 선택된 배향으로 제핵 적혈구 세포 표면에 공유 결합되며, 예를 들어, 상기 외인성 폴리펩티드 제제의 동일한 모이어티(예를 들어, N-말단, C-말단, 또는 특정 잔기, 예컨대, 시스테인)에 의해 부착되는, 제조물.
24. 제제로 기능화된 제핵 적혈구 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제1 클릭 핸들에 공유 결합된 세포를 포함하는 활성화된 세포를 제공하는 단계,
    (b) 상기 제1 클릭 핸들과 반응할 수 있는, 제2 클릭 핸들에 공유 결합된 제제(예를 들어, 외인성 폴리펩티드)를 포함하는 활성화된 제제를 제공하는 단계, 및
    (c) 상기 활성화된 세포를 상기 활성화된 제제와 접촉시킴으로써 상기 제제로 기능화된 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
25. 제24항의 방법에 의해 생성된 제핵 적혈구 세포.
26. 인간 대상체에게 제제를 투여하는 방법으로서, 유효한 수의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 세포를 상기 인간 대상체에게 투여함으로써 상기 제제를 상기 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
27. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 세포.

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