ES2981623T3 - Proteínas F de RSV de prefusión y su uso - Google Patents
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Abstract
Se describen antígenos del virus respiratorio sincitial (VRS) que incluyen una proteína F del VRS recombinante estabilizada en una conformación de prefusión. También se describen ácidos nucleicos que codifican los antígenos y métodos para producir los antígenos. También se describen métodos para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunas realizaciones, el método es un método para tratar o prevenir una infección por VRS en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno al sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas F de RSV de prefusión y su uso
SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reivindica prioridad de las Solicitudes Provisionales de EE.UU. N° 61/780.910, presentada el 13 de marzo de 2013, N° 61/798,389, presentada el 15 de marzo de 2013, N° 61/857.613, presentada el 23 de julio de 2013 y N° 61/863.909, presentada el 9 de agosto de 2013.
CAMPO
Esta divulgación se refiere a polipéptidos, polinucleótidos, composiciones y métodos de su uso, para la inducción y detección de una respuesta inmune al virus sincitial respiratorio (RSV, por sus siglas en inglés).
ANTECEDENTES
El virus sincitial respiratorio (RSV) es un virus de ARN de cadena negativa, no segmentado, con envoltura en la familia Paramyxoviridae, géneroPneumovirus.Este es la causa más común de la bronquiolitis y neumonía entre los niños en su primer año de vida. El RSV también causa infecciones repetidas incluyendo la enfermedad del tracto respiratorio inferior severa, que se puede presentar en cualquier edad, especialmente entre la gente de edad avanzada o aquellos con sistemas cardíacos, pulmonares o inmunes comprometidos. La inmunización pasiva se utiliza actualmente para prevenir la enfermedad grave provocada por la infección por RSV, especialmente en niños con prematuridad, displasia broncopulmonar o enfermedad cardiaca congénita. El tratamiento actual incluye la administración de un anticuerpo neutralizante de RSV, Palivizumab (SYNAGIS®; MedImmune, Inc.), que une un epítopo conformacional, lineal, de 24 aminoácidos en la proteína de Fusión (F) de RSV.
En la naturaleza, la proteína F de RSV se expresa inicialmente como un solo precursor de polipéptido, designado F<0>. F<0>se trimeriza en el retículo endoplasmático y se procesa por una proteasa similar a furina celular en dos sitios conservados, generyo los polipéptidos F<1>, F<2>y Pep27. El polipéptido Pep27 se escinde y no forma parte de la proteína F madura. El polipéptido F<2>proviene de la porción N-terminal del precursor F<0>y se enlaza al polipéptido F<1>por la vía de dos enlaces disulfuro. El polipéptido F<1>proviene de la porción C-terminal del precursor F<0>y ancla la proteína F madura en la membrana a través de un dominio de transmembrana, el cual se enlaza a una cola citoplásmica de ~24 aminoácidos. Tres protómeros del heterodímero F<2>-F<1>se ensamblan para formar una proteína F madura, la cual adopta una conformación de prefusión metaestable que se activa para someterse a un cambio conformacional que fusiona las membranas virales y de la célula diana. Debido a su papel obligatorio en la entrada de RSV, la proteína F de RSV es el objetivo de los anticuerpos neutralizantes y el sujeto del desarrollo de vacuna; sin embargo, de manera similar a otros antígenos de RSV, los esfuerzos previos para desarrollar una vacuna a base de proteína F de RSV han demostrado no tener éxito.
Margoet al.(2012) PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 109x, n° 8 pp 3089 3094 describe anticuerpos que se unen a la proteína RSV humana. McLellanet al.(2013) SCIENCE, Vol. 340, n° 6136, pp 1113-1117 describen la estructura de la proteína F de RSV de prefusión.
COMPENDIO
La invención se define en las reivindicaciones. Las realizaciones y/o los ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención. Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico.
Como se describe en la presente, se dilucidó la estructura tridimensional de la proteína F de RSV en su conformación de prefusión. La divulgación revela por primera vez los detalles al nivel atómico de la conformación de prefusión de F de RSV, que presenta un sitio antigénico único (“sitio antigénico0”) en su ápice distal a la membrana. Utilizyo la estructura tridimensional de F de prefusión como una guía, se diseñaron y se construyeron formas estabilizadas de F de prefusión (antígenos “PreF”), y se utilizaron para generar respuestas inmunes neutralizantes de RSV muchas veces más gryes que las logradas con los inmunógenos basados en proteína F de RSV previos, y que proporcionan protección contra la estimulación de RSV en modelos de animales. Los antígenos PreF se pueden utilizar, por ejemplo, tanto como vacunas potenciales contra el RSV como en calidad de moléculas de diagnóstico.
Se describen proteínas F de RSV recombinantes, aisladas que se estabilizan en una conformación de prefusión, así como moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas F de RSV recombinantes. En varias realizaciones, las proteínas F de RSV recombinantes se estabilizan en una conformación de prefusión mediante sustituciones S155C, S290C, S190F y V207L (en comparación con una proteína F de RSV como se recoge en una de SEQ ID NOs: 1-184), de modo que las proteínas F de RSV se pueden unir específicamente al anticuerpo D25 específico de prefusión. En varias realizaciones, la proteína F de RSV recombinante comprende un sitio 0 antigénico que comprende los residuos 62-69 y 196-209 de una secuencia de proteína F de rSv , tal como SEQ ID NO: 370. En algunas realizaciones, el inmunógeno se puede unir específicamente al anticuerpo después de que el inmunógeno se incube a 20 °C en solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico durante al menos 24 horas en ausencia del anticuerpo. En realizaciones adicionales, el inmunógeno puede formar una población homogénea cuyo se disuelve en solución acuosa, en donde por lo menos 90 % del inmunógeno en la población se puede unir específicamente al anticuerpo específico de prefusión.
En algunas realizaciones, los polipéptidos F<2>y F<1>comprenden las posiciones 62-69 y 196-209 de F de RSV, respectivamente, y el polipéptido F<2>comprende o consiste en 8-84 residuos de las posiciones 26-109 de F de RSV, y los polipéptidos F<1>comprenden o consisten en 14-393 residuos de las posiciones 137-529 de F de RSV, en donde las posiciones de F de RSV corresponden a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido F<0>de referencia recogido como SEQ ID NO: 124.
En varias realizaciones, la proteína F de RSV recombinante incluye las sustituciones de aminoácido S155C, S290C, S190F y V207L que estabilizan la proteína en la conformación de prefusión, por ejemplo, que estabilizan la porción distal a la membrana de la proteína F (incluyendo la región N-terminal del polipéptido F1) en la conformación de prefusión. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido puede introducir un enlace disulfuro no natural o puede ser una sustitución de aminoácido de relleno de la cavidad. En varias realizaciones, la proteína F de RSV recombinante incluye las sustituciones S155C y S290C que forman un enlace disulfuro no natural que estabiliza la proteína en una conformación de prefusión; es decir, en una conformación que específicamente se une a uno o más anticuerpos de especificación de prefusión, y/o presenta un sitio antigénico, tal como el sitio antigénico 0, que está presente en la conformación de pre- pero no de post-fusión de la proteína F de RSV. En realizaciones adicionales, la proteína F de RSV recombinante puede incluir, además, una sustitución F, L, W, Y, H o M en la posición 190, posición 207, o las posiciones 190 y 207. En un ejemplo no limitante, la proteína F de RSV recombinante incluye las sustituciones S155C, S290C, S190F y V207L (a las que se alude en la presente como “DSCav1”).
En realizaciones adicionales, la proteína F de RSV recombinante puede incluir una o más modificaciones al extremo C del polipéptido F1 (tales como truncamientos y sustituciones de aminoácido) que, junto con las modificaciones que estabilizan la región distal a la membrana del polipéptido F, pueden incrementar la estabilización de la proteína F recombinante en la conformación de prefusión. Modificaciones ejemplares incluyen el enlace del polipéptido F<1>a un dominio de trimerización (tal como un dominio foldon) o la introducción de uno o más residuos de cisteína en la región C-terminal del polipéptido F1 (por ejemplo, en las posiciones 512 y 513) que pueden formar enlaces disulfuro de inter-protómero.
El antígeno PreF se puede incluir en una nanopartícula de proteína, o en una partícula similar a viral. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican los antígenos PreF. En algunas realizaciones, el antígeno PreF incluye una proteína F de RSV recombinante que es una proteína F de RSV de una cadena sencilla.
Realizaciones adicionales incluyen una proteína de armazón de epítopo que incluye las posiciones 62-69 y 196 209 de F de RSV, o un permutante circular de la misma, enlazado a una proteína de armazón heterólogo, en donde la proteína de armazón de epítopo se une específicamente a un anticuerpo específico de prefusión.
También se proporcionan composiciones que incluyen los antígenos PreF, nanopartícula de proteína, molécula de ácido nucleico o vector. La composición puede ser una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto, y también puede estar contenida en una forma de dosificación unitaria. Las composiciones pueden incluir, además, un adyuvante.
Se describen composiciones inmunogénicas para uso en métodos para generar una respuesta inmune en un sujeto que lo necesite, como son composiciones inmunogénicas para uso en métodos para tratar, inhibir o prevenir una infección de RSV en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones de los métodos, a un sujeto, tal como un sujeto humano o bovino, se le administra una cantidad eficaz de un antígeno descrito y/o una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno descrito. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la administración de una composición inmunogénica que incluye un adyuvante seleccionado para inducir una respuesta inmune desviada de Th1 en un sujeto. En realizaciones adicionales, los métodos incluyen una inmunización prime boost (cebado-refuerzo), utilizo las proteínas F de RSV del subtipo A humano y subtipo B humano estabilizadas en una conformación de prefusión con las modificaciones descritas en la presente. Se describen métodos para detectar o aislar un anticuerpo de unión de RSV en un sujeto infectado con RSV. En algunas realizaciones, las proteínas F de RSV recombinantes se pueden utilizar para detectar y cuantificar anticuerpos objetivo en una respuesta de suero policlonal.
Lo anterior y otros objetivos, características y ventajas de las realizaciones resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras acompañantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
LasFIGs. 1A-1Cson un conjunto de gráficas y un diagrama que ilustra la neutralización de RSV, el reconocimiento de glicoproteína F, y la estructura cristalina del anticuerpo humano D25 en complejo con el trímero F de RSV de prefusión. La conformación de prefusión de F de RSV es metaestable, y cuyo se expresa en una forma soluble fácilmente adopta el estado de post-fusión; un número de anticuerpos potentes, que incluyen D25, se unen a un sitio antigénico recientemente revelado en la parte superior de la glicoproteína F de prefusión. (A) Neutralización de RSV por anticuerpos que incluyen palivizumab, el anticuerpo profiláctico aprobado por la FDA para prevenir la enfermedad de RSV grave. (B) Ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) que mide la unión del anticuerpo a la glicoproteína F de post-fusión. (C) Estructura del trímero F de D25-RSV en representaciones de cinta y de superficie molecular. Un protómero del trímero de glicoproteína F se muestra como cintas. Las superficies moleculares se muestran para los otros dos protómeros F. El Fab de D25 enlazado al protómero F mostrado en cintas también se exhibe en la representación de cinta, con la cadena pesada sombreada en gris oscuro y la cadena ligera sombreada en gris claro. Los otros Fabs de D25 se sombrean de la misma manera, pero se muestran en representación de superficie.
LasFIGs. 2A y 2Bson un conjunto de diagramas y una secuencia alineada con la estructura secundaria de RSV que ilustra el reordenamiento estructural de F de RSV. Para mediar en la entrada célula-virus, la glicoproteína F de RSV pasa de una conformación de prefusión metaestable a una conformación de post-fusión estable. (A) Estructuras de prefusión y post-fusión. Las imágenes exteriores exhiben estructuras triméricas de prefusión (izquierda) y de post-fusión (derecha), sombreadas lo mismo que en la FIG. 1C. Un glicano complejo, mostrado como palitos, se modela en cada uno de los tres sitios de glicosilación W-enlazados encontrados en la proteína madura. Las imágenes interiores exhiben un protómero F de RSV individual en representación de cinta. (B) La secuencia F de RSV y la estructura secundaria. Los sitios de glicosilación N-enlazados son resaltados por triángulos negros, los sitios antigénicos son marcados y las flechas hacia abajo indican la posición de los sitios de escisión de furina. Las estructuras secundarias se muestran abajo de la secuencia (s Eq ID NO: 370), con cilindros que representan hélices a y flechas que representan cadenas p. Los residuos desordenados o perdidos están indicados por una “X”; los residuos que se mueven por encima de 5 A entre las conformaciones de prefusión y post-fusión se muestran con sombra gris y están encuadrados.
LasFIGs. 3A-3Cmuestran un conjunto de diagramas y un alineamiento de secuencia que ilustra la interfase F de RSV con D25. El anticuerpo D25 se une a un epítopo cuaternario que abarca dos protómeros en el ápice del trímero F de prefusión. (A) Acercamiento de la interfase entre D25 y F de RSV. Las cadenas laterales de los residuos F que interactúan con D25 están marcadas y se muestran como palitos. Los átomos de oxígeno se sombrean en gris claro y los átomos de nitrógeno se sombrean en gris oscuro. Los enlaces hidrógeno se representan como líneas discontinuas. Las dos imágenes se relacionan por una rotación de 90° alrededor del eje vertical. (B) Posición y conformación del epítopo D25 en las moléculas F de prefusión y post-fusión. Se muestran los residuos F de RSV en la interfase D25. La polaridad de a4 y a5post indicada con flechas, con los fragmentos N- y C-terminales indicados. (C) conservación de secuencia de los residuos F en regiones reconocidas por D25. Los aminoácidos en el subtipo B de RSV humano (hRSV/B) o en RSV bovino (bRSV) que difieren de hRSV/A están subrayados. El ectodominio se define como los residuos 26-109 y 137-524 de F.
LasFIGs. 4A-4Dson series de gráficas e imágenes digitales concernientes al sitio antigénico 0. Los anticuerpos neutralizantes de RSV altamente efectivos fijan como objetivo un sitio en el ápice distal a la membrana del trímero F de prefusión. (A) La capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de D25 a las células infectadas con RSV se midió como una función de la concentración de anticuerpo. (B) El análisis de los complejos F/Fab de RSV mediante microscopía electrónica de tinción negativa: (Izquierda) Reproyección de un corte de 12 A a través de la estructura cristalina de F de RSV Fab de D25 filtrado a una resolución de 10 A y cortado para incluir la cavidad del trímero F. (Parte Media) Promedio alineado de 263 partículas de F de RSV Fab de D25. (Derecha) Promedio alineado de 550 partículas de F de RSV Fab de AM22. La barra de escala en el panel medio es 50 A. (C) Inhibición de la fusión y (D) actividad de inhibición de unión para los anticuerpos que fijan como objetivo el sitio antigénico 0 y los anticuerpos específicos de F que fijan como objetivo otros sitios antigénicos. Para el ensayo de inhibición de unión, se utilizó heparina como un control positivo.
LaFIG.5muestra un diagrama esquemático que ilustra los métodos utilizados para expresar complejos de F de RSV y D25. Los plásmidos que expresan Fd F(+) de RSV (círculo F), la cadena ligera de D25 (círculo L) y la cadena pesada de D25 (con o sin un codón de parada en la región de bisagra, círculo H) se transfectaron simultáneamente en células HEK293 en suspensión. Alternativamente, el plásmido Fd F(+) de RSV podría ser transfectado, con Fab o IgG de D25 purificado añadido a las células 3 horas de post-transfección. Los mejores rendimientos se obtuvieron al expresar simultáneamente F y Fab de D25 (~1.0 mg de complejo purificado por litro de células).
LaFIG.6muestra un conjunto de diagramas de cinta que ilustran la comparación de F de RSV unido a D25 a F de PIV5 de prefusión. La representación de cinta de Fd F(+) de RSV unida a D25 (izquierda) y F de PIV5-GCNt (derecha). Hay un acuerdo excelente de los elementos de estructura secundaria entre las dos proteínas, a pesar de tener únicamente ~12%de identidad de secuencia. Una de las diferencias más acentuadas es la ubicación del péptido de fusión (N-terminal de la subunidad Fi), también mostrado en la FIG. 7. La estructura F de PIV5 se describió como que consiste en tres dominios: I, II y III (Yinet al., Nature,439, 38 (2006)). El dominio III llamado el lóbulo distal a la membrana, mientras que los dominios I y II abarcan el barril central y el lóbulo proximal a la membrana. La estructura PIV5 escindida mostrada aquí se generó a partir de PDB ID: 4GIP (Welchet al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A.109, 16672 (2012)).
LaFIG. 7muestra una serie de diagramas que ilustran glicoproteínas virales de prefusión Tipo I. Las estructuras de prefusión de F de RSV, F de PIV5 (PDB ID: 4GIP (Welchet al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A.109, 16672 (2012)), HA de la gripe (PDB ID: 2HMG; Wilsonyet al., Nature,289, 366 (1981)) y GP de Ébola (PDB ID: 3CSY; Leeet al., Nature,454, 177 (2008)) se muestran como superficies moleculares, con cada uno de los protómeros coloreado de manera diferente. En la fila inferior se muestra una esfera para el residuo C-terminal de F<2>(RSV y PIV5) o HA<1>(Gripe), y se muestra una esfera para el residuo N-terminal del péptido de fusión. El RSV y PIV5 son ambos paramixovirus y sus proteínas F comparten ~12 % de identidad de secuencia. Aunque el GP de Ébola es una proteína de fusión tipo I, éste carece de un péptido de fusión N-terminal libre en GP2 y, en cambio, contiene un bucle de fusión interno que se observa comúnmente en las proteínas de fusión tipo II y tipo III. Por lo tanto, el GP de Ébola se omitió de la comparación del péptido de fusión.
LaFIG.8es un conjunto de gráficas que se refieren a la neutralización de RSV por IgG y Fab. D25, AM22 y Motavizumab neutralizan RSV igualmente bien como IgG o Fab. Obsérvese que el eje x para la gráfica de Motavizumab es diferente que las otras.
LasFIGs. 9A y 9Bson una serie de diagramas y gráficas que ilustran las propiedades de sitios antigénicos en la glicoproteína F de RSV. Únicamente los anticuerpos dirigidos al sitio antigénico 0 se unen específicamente a la conformación de prefusión y tienen potencia de neutralización excepcional. (A) Para el sitio 0, se muestra una imagen de un solo enlace de Fab de D25 al trímero F de RSV de prefusión, junto con curvas de neutralización para AM22 y D25. Para el sitio I, las flechas apuntan a Pro389, una mutación de escape conocida (Lopezet al., J. Virol.,72, 6922 (1998)). Se muestra una curva de neutralización para el anticuerpo 131-2a. De manera similar al anticuerpo 2F (Magroet al., J. Virol.,84, 7970 (2010)), el anticuerpo 131-2a únicamente neutraliza ~ 50 % del virus. (B) Para los sitios antigénicos II y IV, los modelos de la unión de Motavizumab (sitio II) y 101F (sitio IV) a las estructuras F de prefusión y de post-fusión (McLellanet al., J. Virol.,85, 7788 (2011)) se hicieron utilizyo las coordenadas de las estructuras de anticuerpo-péptido (McLellanet al., J. Virol.,84, 12236 (2010); McLellanet al., Nat. Struct. Mol. Biol.,17, 248 (2010)).
LaFIG. 10muestra una imagen de un gel de poliacrilamida que ilustra la expresión de la construcción de proteína F de RSV recombinante con la sustituciones de aminoácido S155C y S290C y un dominio Foldon enlazado al extremo C de F<1>, y un conjunto de diagramas que ilustran que el enlace disulfuro entre S155C y S290C puede únicamente formarse en la conformación de prefusión de la proteína F de RSV.
LaFIG. 11es un conjunto de gráficas que muestran los resultados de ELISA y los ensayos de filtración en gel utilizyo la construcción de proteína F de RSV recombinante con las sustituciones de aminoácido S155C y S290C y un dominio Foldon enlazado al extremo C de F<1>. Los datos de ELISA indican que la construcción S155C/S290C se une específicamente por los anticuerpos específicos de prefusión de F de RSV. Los perfiles de filtración en gel muestran que la construcción S155C/S290C existe solamente como un trímero, mientras que los agregados y las rosetas se forman en solución con una construcción F de RSV de control que carece de las sustituciones S155C/S290C.
LaFIG. 12muestra imágenes de microscopía electrónica de tinción negativa de la construcción de proteína F de RSV recombinante con las sustituciones de aminoácido S155C y S290C y un dominio Foldon enlazado al extremo C de F1. Las imágenes abajo del panel grye son promedios 2D de partículas individuales. Los resultados indican que la construcción S155C/S290C se estabiliza en la conformación de prefusión.
LasFIGs. 13-14muestran un conjunto de gráficas que ilustran la respuesta del anticuerpo neutralizante de los ratones a los que se administraron RSV nativo (RSV), RSV inactivado con formalina (FI-RSV), la construcción de proteína F de RSV recombinante con sustituciones de aminoácido S155C y S290C y un dominio Foldon enlazado al extremo C de F<1>(F de prefusión), o una construcción de proteína F de RSV estabilizada en la conformación de post-fusión (RSV de post-fusión). Se muestra la respuesta del anticuerpo a las 5 semanas (FIG.
13) y 7 semanas (FIG. 14) de inmunización post-inicial.
LaFIG. 15muestra imágenes digitales de los cristales de una proteína F de RSV recombinante soluble estabilizada en una conformación de prefusión mediante las sustituciones S155C y S290C. Izquierda, imágenes claras estándares; Derecha, imágenes ultravioleta, indicativas de proteínas. La formación de cristales a partir de soluciones tamponadas acuosas demuestra que esta proteína es sustancialmente homogénea en solución. LaFIG. 16muestra el diseño de un antígeno basado en proteína F de RSV (RSV_A F(+)FdTHS) estabilizado por mutaciones de unión de disulfuro modificadas por ingeniería genética S155C y S290C (“DS”), mutaciones de relleno de cavidad S190F y V207L (“Caví”) y el dominio de trimerización heterólogo C-terminal anexo (Fd). La estructura F de RSV unida a D25 se muestra con dos de los protómeros exhibidos como una superficie molecular de color rosa y canela, y el tercer protómero exhibido como cintas. Se muestran los residuos N- y C-terminal de Fí que se mueven más de 5 A entre la conformación de pre y post-fusión. Los recuadros muestran el enlace disulfuro modificado por ingeniería genética entre los residuos Sí55C y S290C (denominado “DS”), así como las mutaciones de cavidad de relleno del espacio S190F y V207L (denominadas “Caví”). Un modelo del dominio de trimerización de fibritina de fago T4 se muestra en la base del trímero de prefusión. La proteína F de RSV que incluye las sustituciones S155C y S290C, y S190F y V207L en el subtipo A de RSV humano, y el dominio Foldon heterólogo C-terminal anexo, se denomina RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. Las mutaciones compatibles con el reconocimiento de D25, pero insuficientemente estables para permitir la purificación como un trímero homogéneo, se marcan y se muestran en representación de palitos negros.
LaFIG. 17muestra la caracterización antigénica de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. Las velocidades de asociación y disociación de D25 soluble, AM22, 5C4, 101F, Motavizumab y la interacción de Fab de Palivizumab con RSV_A F(+)FdTHS DSCaví inmovilizado se midieron utilizyo un instrumento OctetRED 384TM (ForteBio, Menlo Park, CA). Se proporcionan las constantes de disociación en equilibrio para cada uno de los anticuerpos.
LaFIG. 18muestra la cromatografía de exclusión por tamaño de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. La proteína purificada, después de la segmentación de trombina para eliminar las etiquetas, se hizo pasar sobre una columna de exclusión por tamaño í6/70 Superose 6. El volumen de elución es consistente con un trímero glicosilado.
LaFIG. 19muestra una tabla que lista las características antigénicas y físicas de las variantes RSV_A F(+)FdTHS estabilizadas por alteraciones DS, Caví o DSCaví. La columna más a la izquierda define la variante F de RSV, y el resto de las columnas proporcionan propiedades variantes, incluyendo el rendimiento de plásmidos transitoriamente expresados, la antigenicidad contra diversos sitios antigénicos y la retención de unión de D25 (proporcionada como una cantidad fraccionaria) después de í hora de incubación en diversas temperaturas, pHs y osmolalidad, o para í0 ciclos de congelación-descongelación. La variante DSCaví conserva el reconocimiento del sitio antigénico 0, con estabilidad física mejorada, como se estimó por la retención más alta de la reactividad de D25 después de exposición a extremos de temperatura, pH, osmolalidad y congelación-descongelación, luego cualquiera de las variantes DS o Caví.
LaFIG. 20muestra una representación de cinta de la estructura cristalina de 3.í A de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. Las cintas más gruesas corresponden a factores B incrementados. A pesar de las mutaciones estabilizantes, el sitio antigénico 0, en el ápice del trímero, conserva una flexibilidad significativa.
LaFIG. 21muestra la comparación de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví a F de RSV unida a D25. La representación de cinta de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví, superpuesta con una representación de cinta de F de RSV unida a D25 de color blanco (PDB ID 4JHW). Las imágenes se relacionan por una rotación de 90° alrededor del eje vertical. LaFIG. 22muestra las mutaciones estabilizantes en la estructura RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. La representación de bola y palito de la estructura cristalina RSV_A F(+)FdTHS DSCaví con la densidad de electrones 2Fo-Fc contorneada en<íct>se muestra como una malla. Estas imágenes indican que se observa la densidad de electrones correspondiente al enlace disulfuro entre los residuos de cisteína í 55 y 290 (izquierda), así como el residuo Pheí90 de relleno de la cavidad (derecha).
LaFIG. 23muestra la inmunogenicidad de ratón de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. Diez ratones CB6 por grupo se inmunizaron con í0 |ig de proteína RSV_A F(+)FdTHS DSCaví mezclada con 50 |ig de adyuvante poli I:C. Las inmunizaciones ocurrieron en 0 y 3 semanas, y los sueros de la semana 5 y la semana 7 se testaron para la neutralización de RSV subtipo A (RSV_A) y B (RSV_B). Los valores medios se indican por líneas horizontales. LaFIG.24muestra la inmunogenicidad de primate no humano (NHP) de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví. Cuatro macacos Rhesus no tratados con RSV por grupo se inmunizaron con 50 |ig de proteína RSV_A F(+)FdTHS DSCaví mezclada con 500 |ig de adyuvante poli I:C. Las inmunizaciones se ocurrieron a las semanas 0 y 4, y los sueros de la semana 6 se testaron para la neutralización de RSV subtipo A (izquierda) y B (derecha). Los valores medios se indican por líneas horizontales.
LasFIGs. 25A-25Cmuestran mapas de plásmido de vectores de expresión. (A) Un mapa del vector de expresión de RSV_A F(+)FdTHS DSCaví (SEQ ID NO: 384) para expresar la proteína F de RSV recombinante del subtipo A humano que incluye las sustituciones de aminoácido Sí55C, S290C, Sí90F y V207L, condensadas a un dominio Foldon C-terminal, el sitio de escisión de trombina, etiqueta 6xHis y un StrepTag II. (B) Un mapa del vector de expresión RSV_B (Bí) F(+)FdTHS DSCaví paH (SEQ ID NO: 386) para expresar la proteína F de RSV recombinante del subtipo B humano (cepa Bí) que incluye las sustituciones de aminoácido Sí55C, S290C, Sí90F y V207L, condensado a un dominio Foldon C-terminal, el sitio de escisión de trombina, etiqueta 6xHis y un StrepTag II. (C) Un mapa del vector de expresión RSV_B (í8537) F(+)FdTHS DSCaví paH (SEQ ID NO: 388) para expresar la proteína F de RSV recombinante del subtipo B humano (cepa 18537) que incluye las sustituciones de aminoácido S155C, S290C, S190F y V207L, condensada a un dominio Foldon C-terminal, el sitio de escisión de trombina, etiqueta 6xHis y un StrepTag II.
LasFIGs. 26A-26Dilustran el diseño de vacuna basado en la estructura para RSV: un paradigma del supersitio. (A) La infección natural por RSV induce anticuerpos diversos, con una gama de potencias de neutralización viral. (B) Una agrupación de epítopos para anticuerpos altamente potentes, inducidos de forma natural define un supersitio de vulnerabilidad viral. Se muestran los fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo potentemente neutralizante D25 que reconoce un epítopo en el ápice del trímero F de RSV. Los epítopos espacialmente solapantes en el ápice de trímero también son reconocidos por los anticuerpos AM22 y 5C4, que comparten las mismas características de neutralización deseadas que D25. Estos epítopos de solapamiento definen el sitio antigénico 0 como un supersitio de vulnerabilidad de RSV. (C) Después de la selección de un supersitio objetivo, un proceso iterativo de diseño, la caracterización de las propiedades antigénicas y físicas, la determinación de la estructura al nivel atómico y la estimación de inmunogenicidad permite la optimización basada en la estructura de antígenos de vacuna que codifican el supersitio objetivo. (D) Debido al supersitio de vulnerabilidad viral que induce de forma natural anticuerpos altamente protectores, la inmunización con “inmunógenos del supersitio” induce más fácilmente la respuesta protectora que los inmunógenos basados en las regiones virales reconocidas por anticuerpos subdominantes o no potentemente neutralizantes.
LaFIG. 27muestra el diseño Fs de RSV estabilizadas en el sitio trimérico 0 soluble. Se diseñaron más de 100 variantes de F de RSV que contenían el dominio de trimerización de fibritina T4 (foldon) para el sitio antigénico 0 de retención más estable. Se muestra aquí la estructura del trímero F de RSV en su conformación unida a D25 con el foldon modelado. El trímero se exhibe con dos protómeros como superficies moleculares sombreadas en gris claro, canela y rosa, y el tercer promotor como cintas. La cinta se sombrea en blanco en regiones en donde es relativamente fijada entre la pre- y la post-fusión, mientras que los residuos N- y C-terminales que se mueven más de 5 A entre las conformaciones de pre- y post-fusión se sombrean en gris más oscuro. Las mutaciones compatibles con la expresión y el reconocimiento de D25 inicial, pero insuficientemente estables para permitir la purificación como un trímero homogéneo se marcan y se muestran en representación de palitos negros. Los recuadros muestran acercamientos de las mutaciones estabilizantes en representación de palitos para las variantes DS, Caví y TriC, todas las cuales retienen establemente el sitio antigénico 0 (FIG. 31).
LasFIGs. 28A-28Cmuestran estructuras de los trímeros F de RSV, diseñados para preservar el sitio antigénico 0. (A-C) Se muestran seis estructuras para las variantes F de RSV, marcadas por la mutación estabilizante (DS, Caví, DS-Caví y DS-Caví-TriC) y por la red (cúbica y tetragonal) y el pH de cristalización. (A) Los trímeros F de RSV se exhiben en una representación de gusano Ca, coloreada de acuerdo con el factor de movilidad atómico. Las regiones pérdidas se muestran como líneas discontinuas. Estas se producen en la región próxima de la membrana C-terminal, donde el motivo foldon no se observa, excepto en la estructura DS-Caví-TriC (más a la derecha). En la estructura DS, dos bucles en la región de cabeza también están desordenados. (B) El sitio antigénico 0 de un protómero F de RSV se exhibe en el diagrama de cinta, con la estructura de F de RSV unida a D25 en gris y diferentes variantes indicadas. Las mutaciones estabilizantes se marcan y se muestran en representación de palitos. (C) Los detalles del nivel atómico se muestran en representación de palitos, con las regiones de F de RSV que cambian la conformación entre la conformación de prefusión y post-fusión en gris oscuro, y aquellas que permanecen constantes en gris más claro. Se indican los átomos de carbono estabilizantes para estabilizar las mutaciones. En Caví (pH 5.5) y en DS-Caví (pH 5.5) se observaron características novedosas que implican la interacción del extremo C del péptido F<2>con un ion sulfato y el péptido de fusión. En la estructura DS-Caví-TriC, las mutaciones D486H-E487Q-F488W-D489H interactúan con los dos protómeros vecinos alrededor del eje del trímero.
LasFIGs. 29A-29Bmuestran resultados relacionados con la inmunogenicidad de trímeros F de RSV modificados por ingeniería genética. Las proteínas F de RSV modificadas por ingeniería genética para exhibir establemente el sitio antigénico 0 inducen títulos neutralizantes significativamente más altos que los inducidos por la F de post-fusión. (A) Los títulos de neutralización de sueros de ratones inmunizados con í0 |ig de F de RSV (izquierda). La F de post-fusión, así como la F de RSV unida por los anticuerpos AM22 o D25, se inmunizaron a razón de 20 |ig por ratón (derecha). La media geométrica se indica por una línea horizontal. (B) Los títulos de neutralización de sueros de macaco Rhesus inmunizados con 50 |ig de variantes de proteína F de RSV. La media geométrica se indica por una línea horizontal. El umbral protector está indicado por una línea discontinua, y el valorpproporcionado para la post-fusión contra DS-Caví.
LasFIGs. 30A-30Dmuestran como las propiedades físicas, estructurales y antigénicas de la F de RSV estabilizada con el sitio antigénico 0 se correlacionan con la inmunogenicidad. (A) Estabilidad física del sitio 0 frente a la inmunogenicidad. El diagrama muestra la estabilidad física de transFer de información según se determina por 7 mediciones de la retención de D25 de la actividad en FIG. 3í que se promediaron (eje horizontal) y se compararon con los títulos protectores de RSV inducidos de la FIG. 29 (eje vertical). (B) La imitación estructural del sitio 0 frente a la inmunogenicidad. El diagrama muestra la transferencia de información.
La imitación estructural (eje horizontal) es la rmsd (siglas inglesas de desviación cuadrática media) entre las diferentes estructuras (FIG. 28) y F de RSV unida a D25 para todos los átomos dentro de 10 A de D25. Esto es para comparar los títulos protectores de RSV inducidos de la FIG. 29 (eje vertical). (C) Análisis antigénicos de sueros de macacos inmunizados. La unión de sueros a DS-Cav1 inmovilizados (izquierda) o F de post-fusión (derecha) se midió directamente (Blanco, barras negras) o después de la incubación con la F de post-fusión en exceso (barras grises oscuras) o DS-Cav1 (barras grises claras). Se representa la respuesta media de los cuatro sueros del macaco, con las barras de error para la desviación estándar. (D) Correlación de la inmunogenicidad y antigenicidad de los sueros NHP. Los títulos de neutralización medios de los cuatro sueros de los macacos en cada uno de los grupos se representan frente a la relación de respuestas de unión a DS-Cav1 y F de post-fusión. LasFIGs. 31A-31Bson una tabla que muestra los resultados de la caracterización antigénica y física de los inmunógenos de proteína F de RSV. #Definido para el estado trimérico, pero si no se pudo purificar el estado trimérico, entonces el estado oligomérico de la especie oligomérica dominante. Si el rendimiento total es < 0.1 mg/l, entonces el estado oligomérico no se determina (N.D.). *El rendimiento se muestra para el estado oligomérico específico. > 1000 nM = ninguna unión a la concentración de 1 |iM. N/A = no aplicable. ;LaFIG. 32muestra la ubicación de S155 y S290 en las estructuras F de RSV de pre- y post-fusión. Los carbonos p de los residuos de serina 155 y 290 están 4.4 A separados en la estructura F de RSV unida a D25 y 124.2 A separados en la estructura de post-fusión. Las mutaciones S155C y S290C (denominado “DS”) restringieron la estructura en la conformación de prefusión. ;LasFIGs. 33A-33Cmuestran la tinción negativa de la proteína F estabilizada. A) y B) muestran campos representativos de muestras negativamente teñidas para DS y DS-Cav1. Las proteínas son altamente homogéneas con < 1% y < 0.1 % de conformaciones post-F observadas en DS y DSCav1, respectivamente. Ejemplos de conformaciones post-F se indican por flechas negras. Barra = 50 nm. Los promedios de partícula 2D se muestran como recuadros en la esquina derecha superior en dos veces el aumento. Barra = 5 nm. C) Muestra una comparación de los promedios 2D con el promedio del complejo F+D25 (McLellan et al. ;2013). Barra = 5 nm. ;LaFIG. 34muestra que el ELISA basado en el anticuerpo D25 de los sobrenadantes de cultivo bruto se correlaciona (Spearman R = 0.7752 y un valor P = 0.0041) con el rendimiento de variantes de glicoproteína F de RSV oligomérica purificada. La producción de glicoproteína F de RSV por células 293 Expi se determinó mediante ELISA de D25 de los sobrenadantes de cultivo bruto a 4 °C una semana después de la recolección y se encontraron que se correlacionaban con el rendimiento de las variantes de glicoproteína F de RSV oligoméricas puras (Tabla 1). ;LaFIG.35muestra el ELISA basado en el anticuerpo motavizumab de los sobrenadantes de cultivo bruto frente al rendimiento de variantes de glicoproteína F de RSV purificadas. (A) La producción de glicoproteína F de RSV por células 293 Expi se determinó mediante ELISA de motavizumab de los sobrenadantes de cultivo bruto a 4 °C inmediatamente tras la recolección y (B) una semana después de la recolección. Los datos del ELISA se representan frente al rendimiento de las variantes de glicoproteína F de RSV después de la afinidad estreptactina. Curiosamente, tres proteínas, RSV F(+) Fd y dos variantes F137W-F140W y T357C-N371C se detectaron como altamente expresadas por ELISA de motavizumab, pero se obtuvieron bajos rendimientos después de la purificación a gran escala (puntos mostrados a lo largo de la ordenada). ;LaFIG. 36muestra la caracterización de las glicoproteínas F de RSV diseñadas utilizyo la cromatografía de exclusión por tamaño. Las variantes F de RSV, a: Cav1; b: Cav1-TriC; c: DS-Cav1-TriC; d: F488W; e: DS-Cav1; f: TriC, g: DS-TriC; h: DS; exhiben perfiles de elución característicos de una proteína trimérica globular, mientras que las variantes F de RSV i: S190F-V296F; j: K87F-V90L; k: V207L-V220L; l: V178N; m: S403C-T420C; n: I506K; o: V185E; p: F137W-F140W-F488W; q: D486H-E487Q-D489H exhiben perfiles de elución característicos de especies oligoméricas más altas. Los estándares de proteína de peso molecular conocido se marcan en la base del cromatograma. ;LaFIG. 37muestra el sitio antigénico 0 mostrado desde arriba. Las regiones de DS que no son visibles se representan por líneas discontinuas. ;LasFIGs. 38A-38Bmuestran resultados relacionados con la caracterización antigénica de los complejos de inmunógeno-adyuvante para la inmunización de primates no humanos. (A) post-fusión F de RSV, DS y la reactividad de muestra DS-Cav1 se estimó contra el fragmento de unión a antígeno D25 de 1 |iM menos de 3 h después de la formulación del inmunógeno con Poli I:C e inmunizaciones de NHP el día 0 y (B) la semana 4. LasFIGs. 39A-39Bmuestra el análisis antigénico de sueros de ratones inmunizados y macacos Rhesus. A) Los sueros de los ratones inmunizados con múltiples variantes F de RSV estabilizadas se estimaron para el enlace a DS-Cav1 inmovilizado que se midió directamente o DS-Cav1 después de la incubación con D25 en exceso o fragmentos de unión a antígeno de motavizumab para estimar las respuestas del sitio 0 o el sitio II. B) Los sueros de los macacos Rhesus se estimaron para la unión a las variantes F de RSV DS-Cav1 o de post-fusión inmovilizadas que también se bloquearon con fragmentos de unión a antígeno de D25 o de motavizumab. La respuesta media de los sueros de los animales se muestra, con barras de error para la desviación estándar. ;LaFIG. 40muestra la colección de datos cristalográficos y las estadísticas de refinamiento. ;;LaFIG. 41muestra el efecto de utilizar construcciones de RSV subtipo B con las sustituciones DS y que adyuvantes que incluyen agonistas de TLR4 pueden trabajar con la proteína F estabilizada. Los ratones CB6F1/J se inmunizaron con 10 |ig de la versión DS S155C/S290C de la F de prefusión estabilizada formulada con 50 |il de Ribi (sistema adyuvante Ribi, Sigma). Los ratones se inocularon a las 0 y 3 semanas ya sea con la construcción del subtipo A (SEQ ID NO: 185), la construcción del subtipo B (SEQ ID NO: 1479) o ambos (10 |ig de cada una). En el momento de 5 semanas (2 semanas después de la segunda inyección), se obtuvo el suero para ensayos de neutralización. Los dos descubrimientos principales de este experimento fueron que 1) preFA-DS y preFB-DS indujeron niveles iguales de actividad neutralizante contra RSV subtipo A, mientras que preFB-DS indujo un nivel más alto de actividad neutralizante que preFB-DS contra RSV subtipo B. Esto sugiere que la utilización de las construcciones RSV subtipo B puede tener un mejor potencial neutralizante cruzado que los construcciones de subtipo A o que se pueden preferir versiones híbridas de F de RSV que incluyen elementos de ambos subtipos. 2) El adyuvante Ribi es una emulsión de aceite en agua que contiene el monofosforil lípido A, que es un agonista de TLR4 y representativo de algunos de los adyuvantes comerciales. Estos datos demuestran que, además de poliI:C (un agonista de TLR3), los adyuvantes que incluyen los agonistas de TLR4 funcionan con la proteína F de prefusión estabilizada como un antígeno de vacuna. ;;LaFIG. 42muestra que la F de prefusión estabilizada se puede formular en aluminio así como poliI:C y puede conservar la inmunogenicidad conferida por las respuestas de anticuerpo al sitio antigénico 0. Ratones BALB/c se inmunizaron con 20 |ig de la versión DS S155C/S290C de F de prefusión estabilizada derivada del subtipo A y se formuló con aluminio (gel de hidróxido de aluminio 10 mg/ml, Brenntag, Frederikssund, Dinamarca) o poliI:C. Los ratones se inocularon a las 0 y 3 semanas, y en el momento de 5 semanas (2 semanas después de la segunda inyección), se obtuvo el suero para ensayos de neutralización. ;;LaFIG. 43es un diagrama esquemático que ilustra un esquema de diseño ejemplar para antígenos F de RSV de cadena sencilla (scF) estabilizados en prefusión, que incluyen las variables que están implicadas con varios diseños de scF de RSV diferentes. Los elementos de diseño que pertenecen a scF de RSV n° 9 (BZGJ9 DS-Cav1; SEQ ID NO: 669) se perfilan en gris oscuro. ;;LasFIGs. 44A y 44Bilustran el diseño de la construcción F de RSV de cadena sencilla n° 9 (scF n° 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669). La numeración indica las ubicaciones de residuo de los diversos componentes descritos más adelante. (A) Representaciones esquemáticas de la glicoproteína F(+) de RSV escindida con furina como se muestra en la FIG. 44B (parte superior) y el diseño de scF de RSV n° 9 (parte inferior), que muestra el dominio de trimerización foldon (óvalo gris), y el enlazador artificial (cuadrado gris), que puentea las cadenas principales de polipéptido de F<2>(izquierda) y F<1>(derecha). (B) Base estructural para el diseño de scF de RSV n° 9 utilizyo una estructura F(+) de RSV estabilizada en prefusión como un modelo (PBD ID: 4MMV). F(+) de RSV se muestra en representación de dibujo y el dominio de trimerización foldon se muestra en representación de esfera. Mostrado a la izquierda está el trímero F(+) de RSV estabilizado en prefusión, con los tres protómeros coloreados en negro, gris y blanco. Mostrado a la derecha está un protómero F(+) de RSV individual que muestra F<1>(gris mediano), F<2>(gris oscuro), el péptido de fusión (indicado) y el dominio de trimerización foldon (gris claro, indicado). El recuadro muestra el péptido de fusión en representación de palitos, y la ubicación de la secuencia enlazadora flexible (línea discontinua) que une los residuos 104 y 147. ;;LaFIG. 45muestra una tabla relacionada con el diseño, estado oligomérico y rendimiento de producción de construcciones F de RSV de cadena sencilla diseñados expresados en células HEK293-F. Se indican la construcción F de RSV n° 9 DSCav1 (scF n° 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669), construcción F de RSV n° 10 DSCav1 (scF n° 10; BZGJ10 DSCav1; SEQ ID NO: 670), construcción F de RSV n° 11 DSCav1 (scF n° 11; BZGJ11 DSCav1; SEQ ID NO: 671). Las secuencias de enlazador proporcionadas incluyen GSGNIGLGG (SEQ ID NO: 364), GSGGNGIGLGG (SEQ ID NO: 359), GSGNVLGG (SEQ ID NO: 361) y GSGNVGLGG (SEQ ID NO: 362). (%) Las mutaciones estabilizantes de prefusión incluyen las siguientes: S155C y S290C (DS); S190F y V207L (Cav1); mutaciones no adicionales (a). Todas las variantes contienen la mutación puntual L373R. (==) Los dominios de trimerización incluyen lo siguiente: L512C y L513C (CC); D486C, E487P y F489C (CPC). (#) Frecuentemente se observó que las variantes existen en una mezcla de estados de oligómero en la cromatografía por tamaño. Si se observó una fracción trimérica mensurable, entonces el estado oligomérico se enumera como “Trímero”. Si no se observó fracción trimérica, entonces se proporciona el estado oligomérico de la especie dominante. Si el rendimiento total antes de la cromatografía por tamaño fue < 0.1 mg/L, entonces el estado oligomérico se enumera como no determinado (N.D.). Si el estado oligomérico era indistinguible mediante la cromatografía de exclusión por tamaño, el estado oligomérico se enumera como “Agregado”. (*) El rendimiento mostrado se calculó de la post-purificación deStrepTagy se enumera para el estado oligomérico específico. (O) El rendimiento de HEK 293F se estima en base a la relación observada entre el rendimiento de expresión Expi293F y el rendimiento de expresión Freestyle293F observado en las construcciones scF (~2:1).
LasFIGs. 46A y 46Bson un conjunto de gráficas que ilustran la caracterización de las glicoproteínas F de RSV de cadena sencilla, modificadas por ingeniería genética mediante la cromatografía por exclusión de tamaño. (A) Perfiles de exclusión por tamaño de las variantes scF de RSV (scF n° 3, 4, 6, 8 a 11) y mutaciones estabilizantes DS-Cav1 que contienen RSV F(+). Las construcciones de cadena sencilla se expresaron en células HEK293F y F(+) DS-Cav1 se expresó en células Expi 293-F. F(+) DS-Cav1 y scF n° 3 DS-Cav1, n° 4 DS-Cav1, n° 6 DS-Cav1 y n° 9 DS-Cav1 exhiben características de perfiles de elución de una proteína trimérica globular, mientras que scF n° 11 DSCavI exhibe un perfil de elución característico de una proteína monomérica globular. RSV scF n° 8 DS-Cav1 y scF n° 10 DS-Cav1 exhiben perfiles de elución que sugieren una mezcla heterogénea de especies tanto monoméricas como triméricas. (B) Perfiles de exclusión por tamaño de RSV F(+) DS-Cav1 y RSV scF n° 9 que contienen diferentes mutaciones estabilizantes. F(+) DS-Cav1 y scF n° 9 Cav1 se expresaron en células Expi 293-F y las variantes scF n° 9 restantes se expresaron en células HEK293F. La desviación ligera en los perfiles de elución de las variantes scF n° 9 sugieren que scF n° 9 discurre en un peso molecular más alto que F(+) trimérico. Un asterisco indica que las etiquetas de purificación se segmentaron antes de la filtración en gel.
LaFIG. 47es una tabla que resume los resultados de la caracterización antigénica de scF de RSV n° 9 DS-Cav1.
LaFIG. 48es una tabla que muestra los datos cristalográficos y la estadística de refinamiento para la estructura tridimensional de scF de RsV n° 9 DS-Cav1.
LasFIGs. 49A y 49Bmuestran una serie de diagramas relacionados con la estructura cristalina del trímero scF de RSV n° 9 DS-Cav1. La orientación del protómero exhibió una representación de dibujo (gris oscuro) que se mantiene constante. Las líneas discontinuas gruesas representan el motivo foldon C-terminal ubicado en la región próxima de la membrana, que no está visible en la estructura de cristal. (A) El trímero scF de RSV n° 9 DS-Cav1 se exhibe con protómeros en representación de dibujo y representación de cinta (gris oscuro) y la representación de superficie molecular (gris claro). El recuadro muestra el agryamiento del bucle enlazador scF “GS” n° 9 (indicado) y el protómero adyacente (gris oscuro), ambos en representación de palitos. (B) Las mutaciones estabilizantes de prefusión en la estructura scF de RSV n° 9 DS-Cav1. Las mutaciones estabilizantes de prefusión de DS y Cav1 se indican y se muestran en representación de palitos.
LaFIG. 50es un diagrama que ilustra el alineamiento estructural de scF de RSV n° 9 DS-Cav1 (gris medio) con la estructura F(+) DS-Cav1 (gris claro; rmsd = 0.839 A) y con la estructura F(+) unida a D25 (gris oscuro; rmsd = 0.534 A), todos exhibidos en representación de dibujo. El recuadro muestra un acercamiento del bucle enlazador de scF n° 9 y los péptidos de fusión de la estructura F(+) DS-Cav1 y la estructura F(+) unida a D25.
LaFIG. 51muestra diagramas que ilustran la comparación de los diseños de scF de RSV n° 3, 4, 6, 8-11 utilizyo la estructura cristalina de scF de RSV n° 9 DS-Cav1. Las líneas discontinuas gruesas representan el motivo foldon C-terminal. El protómero scF de RSV n° 9 DS-Cav1 exhibido en representación de dibujos (gris oscuro). El recuadro muestra el agradamiento del bucle enlazador scF “GS” n° 9 en representación de palitos que unen los residuos 105 (F<2>) y 145 (F<1>). Las ubicaciones predichas de las secuencias de enlazador flexibles para los diseños de scF n° 3, 4, 6 y 8 (línea discontinuas finas) que unen los residuos 97 (F<2>) y 150 (F<1>) se mapean en la estructura cristalina scF n° 9 DS-Cav1. Las ubicaciones predichas de las secuencias de enlazador para los diseños de scF n° 3, 4, 6 y 8 (líneas discontinuas finas) se mapean en la estructura del trímero scF n° 9 DS-Cav1. Se aproximan las ubicaciones del residuo puntual de extremo de enlazador.
LaFIG. 52muestra un conjunto de imágenes digitales relacionadas con la caracterización de las glicoproteínas F de RSV de cadena sencilla diseñadas, caracterizadas por la purificación postStrepTagde electroforesis en gel SDS-PAGE. Las construcciones scF de RSV se expresaron en células HEK293F y se purificaron mediante la cromatografía de afinidad de His6-tag y StrepTag.
LaFIG.53es un conjunto de gráficas y una tabla que proporciona los datos de neutralización de la semana 5 para las construcciones indicadas (10 animales/grupo). Inmunizaciones en la Semana 0 y la Semana 3 con 10 |ig de proteína 50 |ig de Poli I:C por animal.
LaFIG. 54es un diagrama de cinta y palitos que resalta el residuo de Prolina en la posición F 101 de RSV en la estructura tridimensional de scF de RSv n° 9 (SEQ ID NO: 669). La estructura indica que la región de enlazador de cadena sencilla se puede mejorar al eliminar la Prolina 101 o al acortar/mutar los residuos de enlazador y los residuos adyacentes.
LaFIG. 55es una gráfica y un alineamiento de secuencia que ilustra la modificación de la construcción scF n° 9 (SEQ ID NO: 669) para generar las construcciones BZG J9-1 a BZG J9-10. El alineamiento de secuencia muestra las secuencias BZG J9-1 a BZG J9-10 correspondientes a los residuos F de RSV 97-159 de SEQ ID NOs: 698-707, respectivamente. Estas construcciones se expresaron en células Expi y se estimaron mediante la filtración en gel (izquierda).
LaFIG. 56es una serie de gráficas y diagramas esquemáticos que ilustran una nanopartícula de ferritina que incluye la proteína scF n° 9, que se generó al enlazar el extremo C del polipéptido F1 en scF n° 9 a una subunidad de ferritina. Esta construcción se denomina “BZGJ9-DS-Cav1-EnlaceLargo-Ferritina” y se proporciona como SEQ ID NO: 1429.
LaFIG. 57es un conjunto de gráficas que ilustran la estabilidad física de BZGJ9-DS-Cav1-EnlaceLargo-Ferritina en comparación con scF de RSV DS-Cav1.
LasFIGs. 58A-58Cson un conjunto de gráficas y una tabla que ilustra la inmunogenicidad de diferentes proteínas F de RSV estabilizadas en prefusión. Las tres construcciones testadas fueron F de RSV DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-EnlaceLargo-Ferritina (SEQ ID NO: 1429) y scF n° 9 (también denominada bZg J9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). A animales Macaca mulata de origen indio que pesaban 8.26-11,34 kg se les inyectaron por vía intramuscular inmunógenos en la semana 0 con 50 |ig de proteína 500 |ig de Ribi por animal, Refuerzo en la Semana 4 con 50 |ig de proteína 500 |ig de Ribi por animal; la inmunogenicidad se estimó en la semana 3.5.
LasFIGs. 59A y 59Bson un conjunto de diagramas que ilustran la estructura tridimensional de la proteína F de RSV de la cepa B18537 con las mutaciones DSCav1 (SEQ ID NO: 372). (A) Representación de dibujo de un protómero de F de RSV. (B) Forma trimérica de la glicoproteína de fusión con los protómeros adicionales mostrados en representaciones de superficie y de cinta.
LasFIGs. 60A-60Dson un conjunto de imágenes que ilustran los detalles a nivel atómico de la glicoproteína F de RSV B18537 con sustituciones DSCav1, y muestran que las sustituciones DSCav1 se pueden introducir en una glicoproteína F de RSV subtipo B para estabilizar el sitio antigénico 0. (A) Las mutaciones de DS-Cav1 están resaltadas. (B) El sitio antigénico 0 ubicado en el ápice del trímero se muestra en representación de palitos en gris oscuro. (C) La interacción entre el péptido de fusión y las cadenas p 15, 16 y 19 para formar una lámina alargada inter-protomérica. (D) La interacción entre el extremo C de F2 y el péptido de fusión.
LasFIGs. 61A y 61Bson un conjunto de gráficas e imágenes digitales que ilustran la caracterización antigénica de la glicoproteína de fusión RSV B18537 con sustituciones DSCav1. (A) Las mediciones de interferometría de biocapa de anticuerpos específicos del sitio prototípico se llevaron a cabo mediante la dilución en serie de cada una de las moléculas Fab y se midieron las velocidades de asociación y disociación a las proteínas F B18537 DSCav1 inmovilizadas. (B) Comparación estructural de sitio antigénico 0 de la cepa B18537 y A2. Residuos expuestos en la superficie que difieren entre las dos cepas están marcados.
LasFIGs. 62A y 62Bson gráficas que ilustran la purificación de la proteína F de la cepa B18537 de RSV con DSCav1. A. SDS-PAGE de la fracción de elución (reducida y no reducida) y la fracción de flujo pasante después de la purificación de afinidad de StrepTag II. B. Filtración en gel de la glicoproteína F B18537 de RSV en tampón GFB en una columna de exclusión por tamaño Superdex-200 de 120 ml.
LasFIGs. 63-68ilustran el diseño y la producción de proteínas F de RSV recombinantes triméricas estabilizadas en una conformación de prefusión sin un dominio de trimerización C-terminal para mantener la estabilidad del lóbulo proximal a la membrana de F de RSV. En lugar del dominio de trimerización C-terminal, se introduce un anillo de enlaces disulfuro en el extremo C del polipéptido F1 al sustituir los residuos cisteína con los aminoácidos de la hélice a10.
LasFIGs. 69A-69Eson un conjunto de tablas que muestran los datos de ELISA para las variantes F de RSV recombinantes indicadas. La expresión y estabilidad antigénica de las variantes F de RSV (SEQ ID NOs: 859 1018). El ADN que codifica estas variantes F de RSV se transfectó en la célula en el formato de 96 pocillos bajo condiciones en las que las proteínas F de RSV recombinantes se secretan de las células en el medio celular. Cada una de las construcciones contiene una secuencia conductora que provoca que la proteína penetre en el sistema secretorio y sea secretada. El medio se centrifugó después y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de antigenicidad para la unión al anticuerpo D25 específico del sitio 0 y el anticuerpo Motavizumab específico del sitio II (“Mota”, FIGs. 69A-69E). Las condiciones testadas incluyen la unión D25 y Mota el día 0 (condiciones 1 y 2), el enlace de D25 y Mota el día 0 después de la incubación a 70 °C durante una hora (condiciones 3 y 4) y el enlace D25 y Mota después de 1 semana a 4 °C (condiciones 5 y 6). El control es la construcción DSCav1 con un dominio foldon. Los datos de antigenicidad específica para cada una de las construcciones se proporcionan en las FIGs. 69A-69E, con las condiciones testadas que se observan en las filas superiores.
LasFIGs. 70A-70Eson un conjunto de diagramas esquemáticos que ilustran diferentes estrategias de diseño para generar Inmunógenos del Sitio Antigénico 0 de F de RSV. El sitio antigénico 0 incluye el sitio de reconocimiento D25 en la superficie exterior de la hélice a4 de F de RSV de prefusión y el bucle precisamente N-terminal a la hélice a1 de cada uno de los protómeros. Se utilizaron cinco métodos para presentar epítopos del Sitio 0 aislados en la superficie de un inmunógeno: A) permutación circular (es decir, la alteración de los
Claims (30)
1. Un inmunógeno aislado, que comprende:
una proteína F de RSV recombinante o fragmento de la misma que comprende sustituciones de aminoácidos comparada con una proteína F de RSV nativa como se recoge como una de SEQ ID NOs: 1-184 que estabiliza la proteína F de RSV recombinante en una conformación de prefusión que específicamente se une a un anticuerpo específico de prefusión de F de RSV, en donde:
la proteína F de RSV recombinante está estabilizada en la conformación de prefusión de proteína F de RSV mediante sustituciones S155C, S290C, S190F y V207L,
la conformación de prefusión de proteína F de RSV recombinante o fragmento de la misma comprende un sitio antigénico 0 que comprende los residuos 62-69 y 196-209 de una secuencia de proteína F de rSv nativa como se recoge como una de SEQ ID NOs: 1-184,
el inmunógeno específicamente se une al anticuerpo específico de prefusión después de la incubación a 20 °C en solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico durante al menos 24 horas en ausencia del anticuerpo específico de prefusión, y
y el anticuerpo específico de prefusión de F de RSV no se une a una proteína F de RSV en una conformación de postfusión, y
el anticuerpo específico de prefusión es un anticuerpo D25 que comprende los dominios VH y VL establecidos en los SeQ ID NOs 368 y 369, respectivamente.
2. El inmunógeno de la reivindicación 1, en donde la proteína F de RSV recombinante comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-513, respectivamente, o 26-103 y 145-513, respectivamente, o 26-105 y 145-513, respectivamente, de una de SEQ ID NOs: 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B) o 373 (DSCav1, bovino).
3. El inmunógeno de la reivindicación 2, en donde la proteína F de RSV recombinante comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-513, respectivamente, o 26-103 y 145-513, respectivamente, o 26-105 y 145-513, respectivamente, de s Eq ID NO: 371 (DS-Cav1, subtipo A).
4. El inmunógeno de la reivindicación 2, en donde la proteína F de RSV recombinante comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-513, respectivamente, o 26-103 y 145-513, respectivamente, o 26-105 y 145-513, respectivamente, de<s>E<q>ID NO: 372 (DS-Cav1, subtipo B).
5. El inmunógeno de la reivindicación 2, en donde la proteína F de RSV recombinante comprende los residuos 26-109 y 137-513, respectivamente, o 26-103 y 145-513, respectivamente, o 26-105 y 145-513, respectivamente, de SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, subtipo A).
6. El inmunógeno de la reivindicación 2, en donde la proteína F de RSV recombinante comprende los residuos 26-109 y 137-513, respectivamente, o 26-103 y 145-513, respectivamente, o 26-105 y 145-513, respectivamente, de SEQ ID NO: 372 (DSCav1, subtipo B).
7. El inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende un multímero de la proteína F de RSV recombinante o fragmento de la misma de acuerdo con las reivindicaciones 1-7.
8. El inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la proteína F de RSV recombinante o fragmento de la misma de acuerdo con las reivindicaciones 1-7 está enlazada a un dominio de trimerización.
9. El inmunógeno de la reivindicación 8, en donde el extremo C del polipéptido F1 de la proteína F de RSV recombinante está enlazado al dominio de trimerización.
10. El inmunógeno de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el dominio de trimerización es un dominio Foldon.
11. El inmunógeno de la reivindicación 8, en donde la proteína F de RSV recombinante enlazada al dominio de trimerización comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-544 o 26-103 y 145-544 de una de SEQ ID NOs: 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B) o 373 (DSCav1, bovino).
12. El inmunógeno de la reivindicación 11, en donde la proteína F de RSV recombinante enlazada al dominio de trimerización comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-544 o 26-103 y 145-544 de SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, subtipo A).
13. El inmunógeno de la reivindicación 11, en donde la proteína F de RSV recombinante enlazada al dominio de trimerización comprende o consiste en una secuencia de aminoácido que comprende al menos 80 % de identidad con los residuos 26-109 y 137-544 o 26-103 y 145-544 de SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, subtipo B).
14. El inmunógeno de la reivindicación 11, en donde la proteína F de RSV recombinante enlazada al dominio de trimerización comprende los residuos 26-109 y 137-544 o 26-103 y 145-544 de SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, subtipo A).
15. El inmunógeno de la reivindicación 11, en donde la proteína F de RSV recombinante enlazada al dominio de trimerización comprende los residuos 26-109 y 137-544 o 26-103 y 145-544 de SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, subtipo B).
16. Una partícula similar a virus, que comprende el inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
17. Una nanopartícula de proteína, que comprende el inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 15.
18. Una molécula de ácido nucleico, que codifica el inmunógeno o la nanopartícula de proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17.
19. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18, enlazada operativamente a un promotor.
20. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.
21. El vector de la reivindicación 20, en donde el vector es un vector viral.
22. La molécula de ácido nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, que comprende la secuencia de nucleótidos recogida como SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 o SEQ ID NO: 386.
23. Una composición inmunogénica que comprende una cantidad efectiva del inmunógeno, la partícula similar a virus, la nanopartícula de proteína, la molécula de ácido nucleico nucleico o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, y un soporte farmacéuticamente aceptable.
24. La composición inmunogénica de la reivindicación 23, para uso en un método para generar una respuesta inmune a F de RSV en un sujeto que lo necesite, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de la composición inmunogénica para generar la respuesta inmune.
25. La composición inmunogénica para uso de la reivindicación 24, en donde el método comprende una administración de cebado-refuerzo de la composición inmunogénica.
26. La composición inmunogénica para uso de la reivindicación 24 o 25, en donde el sujeto es un ser humano o un sujeto veterinario.
27. La composición inmunogénica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, en donde el sujeto es de menos de un año, de más de 65 años, o una mujer embarazada.
28. Un kit que comprende el inmunógeno, la partícula similar a virus, la nanopartícula de proteína, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped o la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-27; e instrucciones para utilizar el kit.
29. El inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso para inhibir una infección por RSV en un sujeto.
30. El inmunógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para uso en un método para inducir una respuesta inmune a una proteína F de RSV en un sujeto.
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