KR20230018394A - 조작된 코로나바이러스 스파이크(들) 단백질 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는 조작된 SARS-CoV-2 S 단백질과 같은 조작된 코로나바이러스 S 단백질이 제공된다. 일부 측면에서, 조작된 S 단백질은 향상된 형태 안정성 및/또는 항원성을 나타낸다. 진단제로서, 스크리닝 플랫폼에서 및/또는 백신 조성물에서 조작된 단백질을 사용하기 위한 방법이 또한 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2020년 5월 29일에 출원된 미국 가출원 제63/032,502호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
연방 후원 연구에 관한 성명서
본 발명은 국립보건원에서 수여한 허가 번호 R01 AI127521 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며 이로써 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2021년 5월 19일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 UTFBP1251WO_ST25.txt이고 크기는 41.8킬로바이트이다.
1. 분야
본 발명은 일반적으로 의학, 바이러스학, 면역학 및 단백질 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 조작된 코로나바이러스 S 단백질 및 약물 설계 및 백신 제형화에서의 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
2019년 12월 중국에서 시작된 코로나바이러스 SARS-CoV-2 감염으로 인한 질병인 COVID-19의 발병은 수백만 건의 감염과 10만 명 이상의 사망을 초래하였다. 몇 년 전 SARS 발병을 일으킨 바이러스인 SARS-CoV와 마찬가지로, SARS-CoV-2 바이러스는 이들의 스파이크 단백질을 사용하여 숙주 세포 수용체 안지오텐신-전환 효소 2(ACE2)에 결합한다. 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)과 전장 인간 ACE2 단백질 간의 상호작용. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 서열과 구조는 알려져 있지만(예를 들어, 참조: Wrapp et al. 2020) 약물 후보를 식별하고 S 단백질에 대한 효과적인 면역 반응을 자극하는 데 사용될 수 있는 안정화된 S 단백질에 대한 필요성이 남아 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90%의 동일성(identity)을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인(engineered coronavirus S protein ectodomain)을 포함하는 조작된 단백질을 제공하며, 상기 조작된 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 다음을 포함한다:
(1) 조작된 디설파이드 결합;
(2) 공동 충전 치환(cavity filling substitution);
(3) 정전기 또는 극성 상호작용을 제공하는 치환; 및/또는
(4) 프롤린 치환.
추가의 측면에서, 조작 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합 및 적어도 하나의 공동 충전 치환을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합 및 정전기 또는 극성 상호작용을 제공하는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합 및 적어도 하나의 프롤린 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작 단백질은 적어도 하나의 공동 충전 치환 및 정전기 또는 극성 상호작용을 제공하는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작 단백질은 적어도 하나의 공동 충전 치환 및 적어도 하나의 프롤린 치환을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작 단백질은 정전기 또는 극성 상호작용을 제공하는 적어도 하나의 치환 및 적어도 하나의 프롤린 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함하는 조작된 단백질을 제공하며; 여기서 조작된 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 서열에 대해 하기 치환을 포함한다: F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, 및 V987P. 추가의 측면에서, 조작된 코로나바이러스 S 단백질은 (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90%의 동일성을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함하는 조작된 단백질을 제공하며, 상기 적어도 하나의 돌연변이는 다음을 포함한다:
(i) T724, T752, T778, T961, I1013, H1058, S735, T859, I770, A1015, L727, S1021, Q901, S875, T912, H1088, L1141, V1040, L966, A766, T778, L938, V963, V911, N1108, V705, A893, N703, A672, A694, A1080, I1132, P862, T547, N978, S758, Q762, D1118, S659, S698, R1039, V722, A930, A903, Q913, S974, D979, P728, V951, V736, L858, S884, P807, T791, A879, G799, A924, V826, A899, Q779, F817, L865, T866, A892, A899, A570, T874, S1055, V729, A1022, L894, A713, L828, L822, A1056, Q965, S1003, A972, Q992, I980, A1078, V1133, T1120, I870, T1117, D1139, T1116, Y1138, I896, G885, F1103, P1112, G889, L1034, E819, A972, I980, I1081, N1135, E819, Q1054, Q957, I1130, V1040, V1104, R1000, A944, T724, A944, S730, G769, Q895, K921, L922, A942, G946, S975, A890에 상응하는 위치에서의 치환; 및
(ii) 위치 829-851, 675-686, 673-684, 1161-1208, 또는 1142-1208에 상응하는 결실; 및
(iii) 아미노산 위치 673-686에 대한 두 개의 아미노산의 치환.
추가의 측면에서, 조작된 코로나바이러스 S 단백질은 (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 동일성을 갖는다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 하기에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환(paired cysteine substitution)을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다: S735C 및 T859C; I770C 및 A1015C; L727C 및 S1021C; V911C 및 N1108C; A672C 및 A694C; A1080C 및 I1132C; S659C 및 S698C; V722C 및 A930C; A903C 및 Q913C; S974C 및 D979C; P728C 및 V951C; V736C 및 L858C; S884C 및 A893C; P807C 및 S875C; T791C 및 A879C; G799C 및 A924C; A570C 및 V963C; T874C 및 S1055C; V729C 및 A1022C; L822C 및 A1056C; Q965C 및 S1003C; A972C 및 Q992C; I980C 및 Q992C; A1078C 및 V1133C; H1088C 및 T1120C; I870C 및 S1055C; T1117C 및 D1139C; T1116C 및 Y1138C; I896C 및 Q901C; G885C 및 Q901C; F1103C 및 P1112C; G889C 및 L1034C; E819C 및 S1055C; A972C 및 I980C; I1081C 및 N1135C; 또는 E819C 및 Q1054C.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 하기에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다: A903C 및 Q913C; S884C 및 A893C; T791C 및 A879C; Q965C 및 S1003C; 또는 T1117C 및 D1139C. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 S884C 및 A893C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 추가의 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T791C 및 A879C; 또는 G799C 및 A924C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 A903C 및 Q913C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 추가의 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 Q965C 및 S1003C; S884C 및 A893C; T791C 및 A879C; 또는 G799C 및 A924C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A903C 및 Q913C; 및/또는 Q965C 및 S1003C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 T724, I1013, H1058, Q901, S875, H1088, L1141, V1040, T778, L938, V963, R1039, V826, A899, Q779, L894, V1040, V1104, R1000, A944, S730, A890, D1118, 또는 S1003에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T778, L938, V963, 또는 H1088에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 T724M, I1013F, H1058W, Q901M, S875F, H1088W, L1141F, V1040F, T778L, L938F, V963L, R1039F, V826L, A899F, Q779M, L894F, H1058F, H1058Y, V1040Y, H1088Y, V1104I, R1000Y, R1000W, A944F, T724I, A944Y, S730L, A890V, D1118F, 또는 S1003V로부터 선택된 공동 충전 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T778L, L938F, V963L, 또는 H1088Y로부터 선택된 공동 충전 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 L938에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 L938F 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 V963에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 V963L 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 F817P, L865P, T866P, A892P, A899P, T912P, A893P, Q895P, K921P, L922P, N978P, A942P, G946P, 또는 S975P로부터 선택된 프롤린 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 F817P, A892P, A899P, 또는 A942P로부터 선택된 프롤린 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 프롤린 치환 F817P를 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 S884C 및 A893C; 또는 T791C 및 A879C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 S884C 및 A893C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 V987P 및/또는 K986P에 추가의 프롤린 치환을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 프롤린 치환 A892P를 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A942P; A899P; 및/또는 F817P에 추가의 프롤린 치환을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 A892P; A942P; A899P; 및/또는 F817P로부터 선택된 적어도 2개의 프롤린 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A892P; A942P; A899P; 및/또는 F817P로부터 선택된 적어도 3개의 프롤린 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A892P; A942P; A899P; 및 F817P에 프롤린 치환을 포함한다. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 프롤린 치환 A899P 또는 T912P를 포함한다. 여전히 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 프롤린 치환 A892P 및 T912P를 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 T752, T912, L966, L828, S730, T961, A766, P862, T859, Q957, 또는 G769에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T961, L966, T859, 또는 G769에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T961D 또는 T961E의 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T961D의 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 L966D 또는 L966E 치환, 바람직하게는 L966E 치환을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 조작된 단백질은 T752K, T912R, L966D, L828K, L828R, S730R, T961D, A766E, P862E, T859K, Q957E, 또는 G769E로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 T961D, L966D, T859K, 또는 G769K로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 추가 측면에서, 정전기적 상호작용 치환은 T961D, T859K, 또는 G769K로부터 선택된다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T778, A713, 또는 I1130에 상응하는 위치에 정전기적 또는 극성 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 T778Q, A713S, 또는 I1130Y로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 위치 F817P에 정전기적 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함한다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 L984, D985, K986, 및/또는 V987에 상응하는 위치에 치환을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 글리신 또는 프롤린에 대한 L984, D985, K986, 및/또는 V987에 상응하는 위치에 치환을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 K986P 및 V987P 치환을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A570, T572, F855, 및/또는 N856에 상응하는 위치에 치환을 추가로 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 A570, T572, F855, 및/또는 N856에 상응하는 위치에 공동-충전 치환을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합 및 적어도 하나의 프롤린 치환의 조합을 포함한다. 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 공동 충전 치환 및 적어도 하나의 프롤린 치환의 조합을 포함한다. 여전히 추가의 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 프롤린 치환 및 적어도 하나의 정전기적 상호작용 치환의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합, 적어도 하나의 공동 충전 치환, 적어도 하나의 프롤린 치환 및 적어도 하나의 정전기적 상호작용 치환의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 위치 16-1208에 대해 95% 동일성을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 단백질은 퓨린 절단 부위(furin cleavage site)를 제거하는 돌연변이를 포함하는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함한다. 추가의 측면에서, 퓨린 절단 부위를 제거하는 조작된 단백질 돌연변이는 위치 682-685에 GSAS 치환을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 치환은 하기 변형 중 임의의 하나 이상을 갖는 코로나바이러스 S 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 코로나바이러스 S 단백질 변이체로 조작될 수 있다(서열 번호 2 참조): L5F, S13I, L18F, T19R, T20N, P26S, Q52R, A67V, H69del, V70del, V70I, D80A, T95I, D138Y, Y144del, Y144V, W152C, E154K, R190S, D215G, L242del, A243del, L244del, D253G, W258L, K417N, K417T, L452R, S477N, T478K, E484K, E484Q, E484K, N501Y, A570D, D614G, H655Y, Q677H, P681R, P681H, A701V, T716I, F888L, D950N, S982A, T1027I, D1118H 및 V1176F. 이러한 변형의 예시적인 조합이 표 5에 제공된다.
일부 측면에서, 조작된 단백질은 삼량체화 도메인(trimerization domain)에 융합 또는 접합된다. 추가의 측면에서, 단백질은 삼량체화 도메인에 융합된다. 일부 측면에서, 삼량체화 도메인은 S 단백질 엑토도메인에 대해 C-말단에 위치된다. 일부 측면에서, 삼량체화 도메인은 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 단백질은 막관통 도메인(transmembrane domain)에 융합 또는 접합된다. 일부 측면에서, 단백질은 막관통 도메인에 융합된다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 코로나바이러스 스파이크 단백질 막관통 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 SARS-CoV 또는 SARS-CoV-2 막관통 도메인을 포함한다.
여전히 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 적어도 하나의 서브유닛(subunit)을 포함하는 조작된 코로나바이러스 삼량체를 제공한다. 일부 측면에서, 삼량체는 야생형 S 단백질 서브유닛의 삼량체에 비해 융합전 형태(prefusion conformation)에서 안정화된다. 일부 측면에서, 삼량체는 서브유닛 사이에 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합을 포함한다. 추가의 측면에서, 서브유닛 사이의 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합이 선택된다: V705C 및 A983C; T547C 및 N968C; T961C 및 S758C; 및/또는 T961C 및 Q762C.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용되는 담체; 및 (i) 본 개시내용의 조작된 단백질, 또는 (ii) 본 개시내용의 조작된 삼량체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 조성물은 보조제(adjuvant)를 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 조작된 단백질의 아미노산 서열을 암호화(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 측면에서, 핵산은 DNA 발현 벡터를 포함한다. 다른 측면에서, 핵산은 mRNA를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 항체에 결합된 본 개시내용의 조작된 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체(subject)에서 코로나바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체에게 치료학적 유효량의 실시양태의 조작된 S 단백질을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에서 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 자극한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 코로나바이러스에 감염되는 대상체의 폐에서 염증을 감소시킨다. 일부 측면에서, 대상체는 SARS-CoV 또는 SARs-CoV-2에 감염된다. 일부 측면에서, 대상체는 SARS-CoV 또는 SARs-Cov-2에 감염될 위험이 있는 비감염 대상체이다. 일부 측면에서, 대상체는 폐렴에 대한 증가된 위험을 갖는다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에게 추가의 항바이러스 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 대상체 또는 대상체로부터의 샘플을 본 개시내용의 조작된 S 단백질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 조작된 S 단백질에 대한 상기 항체 또는 세포의 결합을 검출하는 단계를 포함하여, 샘플 또는 대상체에서 코로나바이러스, 코로나바이러스 S 단백질-결합 항체 및/또는 코로나바이러스-감염된 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 샘플은 체액 또는 생검이다. 일부 측면에서, 샘플은 혈액, 골수, 객담, 눈물, 타액, 점액, 혈청, 소변, 대변 또는 비강 면봉이다. 일부 측면에서, 검출은 면역조직화학, 유세포 분석, FACS, ELISA, RIA 또는 웨스턴 블롯을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 단계 (a) 및 (b)를 두 번째 수행하고 첫 번째와 비교하여 검출 수준의 변화를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 조작된 S 단백질은 표지를 추가로 포함하거나 표면 상에 고정화된다. 추가의 측면에서, 상기 표지는 펩티드 태그, 효소, 자성 입자, 발색단, 형광 분자, 화학발광 분자, 또는 염료이다. 일부 측면에서, 조작된 S 단백질은 리포좀 또는 나노입자에 접합된다.
본원에 기술된 임의의 방법 또는 조성물이 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대하여 구현될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 특정 실시양태를 나타내기는 하지만, 개시내용의 취지 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련가드에게 명백해질 것이기 때문에 단지 예시로서 주어진 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시양태의 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 스파이크 안정화를 위한 예시적인 치환을 보여준다. 융합전 형태의 삼량체 SARS-CoV-2 스파이크 엑토도메인의 측면도(PDB ID: 6VSB). S1 도메인은 투명한 표면으로 표시된다. 각 프로토머(protomer)에 대한 S2 도메인은 리본 다이어그램으로 표시된다. 각 삽도는 4가지 유형의 스파이크 변이체(프롤린, 염교, 디설파이드물, 공동 충전) 중 하나에 상응한다. 각 삽도의 측면 사슬은 다음과 같다: 상단 좌측(프롤린), 하단 좌측(디설파이드물), 상단 우측(염교) 및 하단 우측(공동 충전).
도 2a 내지 도 2g는 단일-치환 스파이크 변이체의 특성화를 보여준다. (도 2a) SARS-CoV-2 S-2P 및 단일-치환 스파이크 변이체의 SDS-PAGE. 분자량 표준은 kDa로 왼쪽에 표시된다. (도 2b 내지 도 2d) 유형별로 그룹화된 정제된 스파이크 변이체의 크기 배제 크로마토그래피 (도 2b, 디설파이드 변이체; 도 2c, 공동-충전 및 염교; 도 2d, 프롤린). S-2P에 대한 대표적인 데이터는 각 그래프에 검은색 점선으로 표시된다. 수직 점선은 S-2P에 대한 특징적인 피크 유지량을 나타낸다. 도 2b의 상단 라인은 Q965C, S1003C이다. 도 2d의 상단 라인은 A942P이고, 도 2d의 상단 라인으로부터의 두 번째는 F817P이다. (도 2e) 4가지 변이체에 대한 대표적인 음성 염색 전자현미경 사진. (도 2f) 스파이크 변이체 열안정성의 시차 주사 형광계(DSF) 분석. 수직 점선은 S-2P에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타낸다. 약 47℃에 밸리를 갖는 라인은 A942P이다. 약 67℃에 밸리를 갖는 라인은 A892P이다. (도 2g) 정량적 생물층 간섭계에 의해 결정된 배양 배지에서의 개별 변이체의 농도. 변이체는 유형별로 정렬된다. 점선은 비교를 위한 대조군으로 사용된 S-2P의 계산된 농도를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 다중-치환 스파이크 변이체의 특성화를 보여준다. (도 3a) SARS-CoV-2 Combo 변이체의 SDS-PAGE. 분자량 표준은 kDa로 왼쪽에 표시된다. (도 3b) S-2P, A892P 및 4개의 Combo 변이체에 대한 SEC 트레이스. 수직 점선은 S-2P에 대한 최대 유지량을 나타낸다. (도 3c) Combo 변이체 열안정성의 DSF 분석. 왼쪽 수직 점선은 S-2P에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타내고 오른쪽 수직 점선은 Combo47(HexaPro)에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타낸다. (도 3d) 정제된 Combo47의 음성 염색 전자현미경 사진.
도 4a 내지 도 4h는 HexaPro가 S-2P에 비해 향상된 발현 및 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. (도 4a) FreeStyle 293 세포의 2L 배양물로부터 정제한 후 HexaPro의 SEC 트레이스. (도 4b) FreeStyle 293 세포로부터 정제된 HexaPro의 음성 염색 전자현미경 사진. (도 4c) ExpiCHO 세포의 2L 배양물로부터 정제한 후 HexaPro의 SEC 트레이스. (도 4d) ExpiCHO 세포의 2L 배양물로부터 정제된 HexaPro의 음성 염색 전자현미경 사진. (도 4e & 도 4f) 표면 플라스몬 공명에 의해 평가된 ACE2에 대한 S-2P(도 4e) 및 HexaPro(도 4f)의 결합. 결합 데이터는 검은색 선으로 표시되고 1:1 결합 모델에 대한 최량 적합도는 빨간색 선으로 표시된다. (도 4g & 4h) 음성 염색 전자현미경에 의한 단백질 안정성의 평가. (도 4g) 및 (도 4h)에서 현미경 사진의 상단 행은 S-2P에 상응하고, 하단 행은 HexaPro에 상응한다.
도 5a 내지 도 5c는 HexaPro의 고해상도 Cryo-EM 구조를 보여준다. (도 5a) 삼량체 HexaPro의 EM 밀도 맵. (도 5b) HexaPro(녹색 리본)와 S-2P(흰색 리본, PDB ID : 6VSB)의 정렬. 1-RBD-up 형태를 채택한 단독 프로토머가 표시된다. (도 5c) HexaPro 고유의 4가지 프롤린 치환의 확대도. EM 밀도 맵은 투명한 표면으로 표시되고, 개별 원자는 스틱으로 표시된다.
도 6은 왼쪽-이동된 SEC 피크를 갖는 변이체의 음성-염색 EM 이미지를 보여준다.
도 7은 잘 접힌 입자의 음성-염색 EM 이미지를 보여준다.
도 8a 내지 도 8b는 디설파이드 및 공동-충전 조합 변이체(Combo23)의 특성화를 보여준다. (도 8a) S-2P, Combo23 및 부모 변이체 S884C/A893C(디설파이드 결합) 및 L938F(공동 충전)의 SEC 트레이스. 상단 라인은 Combo23이다. (도 8b) S-2P, Combo23 및 이의 부모 변이체의 DSF 용융 온도 분석. 왼쪽 수직 점선은 S-2P의 Tm을 나타내고 오른쪽 수직 점선은 S884C/A893C의 Tm을 나타낸다.
도 9는 Cryo-EM 데이터 처리 워크플로우를 보여준다.
도 10은 Cryo-EM 구조 검증을 보여준다. cryoSPARC v2.15에서 생성된 FSC 곡선 및 보기 분포도는 2-RBD-up(왼쪽) 및 1-RBD-up(오른쪽) 재구성 둘 다에 대해 표시된다. 각 재구성의 Cryo-EM 밀도는 로컬 해상도에 따라 표시되며 밀도를 통한 중앙 슬라이스가 오른쪽에 표시된다.
도 1은 SARS-CoV-2 스파이크 안정화를 위한 예시적인 치환을 보여준다. 융합전 형태의 삼량체 SARS-CoV-2 스파이크 엑토도메인의 측면도(PDB ID: 6VSB). S1 도메인은 투명한 표면으로 표시된다. 각 프로토머(protomer)에 대한 S2 도메인은 리본 다이어그램으로 표시된다. 각 삽도는 4가지 유형의 스파이크 변이체(프롤린, 염교, 디설파이드물, 공동 충전) 중 하나에 상응한다. 각 삽도의 측면 사슬은 다음과 같다: 상단 좌측(프롤린), 하단 좌측(디설파이드물), 상단 우측(염교) 및 하단 우측(공동 충전).
도 2a 내지 도 2g는 단일-치환 스파이크 변이체의 특성화를 보여준다. (도 2a) SARS-CoV-2 S-2P 및 단일-치환 스파이크 변이체의 SDS-PAGE. 분자량 표준은 kDa로 왼쪽에 표시된다. (도 2b 내지 도 2d) 유형별로 그룹화된 정제된 스파이크 변이체의 크기 배제 크로마토그래피 (도 2b, 디설파이드 변이체; 도 2c, 공동-충전 및 염교; 도 2d, 프롤린). S-2P에 대한 대표적인 데이터는 각 그래프에 검은색 점선으로 표시된다. 수직 점선은 S-2P에 대한 특징적인 피크 유지량을 나타낸다. 도 2b의 상단 라인은 Q965C, S1003C이다. 도 2d의 상단 라인은 A942P이고, 도 2d의 상단 라인으로부터의 두 번째는 F817P이다. (도 2e) 4가지 변이체에 대한 대표적인 음성 염색 전자현미경 사진. (도 2f) 스파이크 변이체 열안정성의 시차 주사 형광계(DSF) 분석. 수직 점선은 S-2P에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타낸다. 약 47℃에 밸리를 갖는 라인은 A942P이다. 약 67℃에 밸리를 갖는 라인은 A892P이다. (도 2g) 정량적 생물층 간섭계에 의해 결정된 배양 배지에서의 개별 변이체의 농도. 변이체는 유형별로 정렬된다. 점선은 비교를 위한 대조군으로 사용된 S-2P의 계산된 농도를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 다중-치환 스파이크 변이체의 특성화를 보여준다. (도 3a) SARS-CoV-2 Combo 변이체의 SDS-PAGE. 분자량 표준은 kDa로 왼쪽에 표시된다. (도 3b) S-2P, A892P 및 4개의 Combo 변이체에 대한 SEC 트레이스. 수직 점선은 S-2P에 대한 최대 유지량을 나타낸다. (도 3c) Combo 변이체 열안정성의 DSF 분석. 왼쪽 수직 점선은 S-2P에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타내고 오른쪽 수직 점선은 Combo47(HexaPro)에 대한 제1 겉보기 용융 온도를 나타낸다. (도 3d) 정제된 Combo47의 음성 염색 전자현미경 사진.
도 4a 내지 도 4h는 HexaPro가 S-2P에 비해 향상된 발현 및 안정성을 나타낸다는 것을 보여준다. (도 4a) FreeStyle 293 세포의 2L 배양물로부터 정제한 후 HexaPro의 SEC 트레이스. (도 4b) FreeStyle 293 세포로부터 정제된 HexaPro의 음성 염색 전자현미경 사진. (도 4c) ExpiCHO 세포의 2L 배양물로부터 정제한 후 HexaPro의 SEC 트레이스. (도 4d) ExpiCHO 세포의 2L 배양물로부터 정제된 HexaPro의 음성 염색 전자현미경 사진. (도 4e & 도 4f) 표면 플라스몬 공명에 의해 평가된 ACE2에 대한 S-2P(도 4e) 및 HexaPro(도 4f)의 결합. 결합 데이터는 검은색 선으로 표시되고 1:1 결합 모델에 대한 최량 적합도는 빨간색 선으로 표시된다. (도 4g & 4h) 음성 염색 전자현미경에 의한 단백질 안정성의 평가. (도 4g) 및 (도 4h)에서 현미경 사진의 상단 행은 S-2P에 상응하고, 하단 행은 HexaPro에 상응한다.
도 5a 내지 도 5c는 HexaPro의 고해상도 Cryo-EM 구조를 보여준다. (도 5a) 삼량체 HexaPro의 EM 밀도 맵. (도 5b) HexaPro(녹색 리본)와 S-2P(흰색 리본, PDB ID : 6VSB)의 정렬. 1-RBD-up 형태를 채택한 단독 프로토머가 표시된다. (도 5c) HexaPro 고유의 4가지 프롤린 치환의 확대도. EM 밀도 맵은 투명한 표면으로 표시되고, 개별 원자는 스틱으로 표시된다.
도 6은 왼쪽-이동된 SEC 피크를 갖는 변이체의 음성-염색 EM 이미지를 보여준다.
도 7은 잘 접힌 입자의 음성-염색 EM 이미지를 보여준다.
도 8a 내지 도 8b는 디설파이드 및 공동-충전 조합 변이체(Combo23)의 특성화를 보여준다. (도 8a) S-2P, Combo23 및 부모 변이체 S884C/A893C(디설파이드 결합) 및 L938F(공동 충전)의 SEC 트레이스. 상단 라인은 Combo23이다. (도 8b) S-2P, Combo23 및 이의 부모 변이체의 DSF 용융 온도 분석. 왼쪽 수직 점선은 S-2P의 Tm을 나타내고 오른쪽 수직 점선은 S884C/A893C의 Tm을 나타낸다.
도 9는 Cryo-EM 데이터 처리 워크플로우를 보여준다.
도 10은 Cryo-EM 구조 검증을 보여준다. cryoSPARC v2.15에서 생성된 FSC 곡선 및 보기 분포도는 2-RBD-up(왼쪽) 및 1-RBD-up(오른쪽) 재구성 둘 다에 대해 표시된다. 각 재구성의 Cryo-EM 밀도는 로컬 해상도에 따라 표시되며 밀도를 통한 중앙 슬라이스가 오른쪽에 표시된다.
예시적인 실시양태의 설명
본원에는 조작된 코로나바이러스 스파이크 단백질이 제공된다. 일부 측면에서 실시양태의 단백질은 막 융합 전에 존재하는 형태에서 안정화된다. 이러한 조작된 단백질은, 예를 들면, 항-코로나바이러스 S 단백질 특이적 면역 반응을 자극하는 데 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 조작된 S 단백질은 샘플에서 S 단백질 결합 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 조작된 단백질은 코로나바이러스에 대한 백신접종을 위한 보다 효과적인 방법을 가능하게 할 뿐만 아니라 항-코로나바이러스 항체, 예를 들어 생물학적 샘플을 검출하기 위한 신규한 분석 방법을 가능하게 한다.
I. 정의
전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 다는 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 특별히 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including)" 뿐만 아니라 "포함하다(includes)" 및 "포함하는(included)"과 같은 다른 형태들의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어는, 달리 특별히 언급되지 않는 한, 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 성분 및 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 요소 및 성분을 둘 다 포함한다. 또한, 용어 "부분"의 사용은 모이어티의 일부 또는 전체 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 본원에 사용된 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 양, 시간적 지속 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때, 지정된 값으로부터 최대 ±10%의 변동을 포괄하는 것을 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량, 반응 조건 등과 같은 특성을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구항에 제시된 수치 파라미터는 개시된 주제에 의해 수득하고자 하는 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 균등론의 적용을 청구항의 범위로 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 광범위한 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 예에 제시된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치 값은 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차에서 발생하는 특정 오류를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 명시된 성분의 관점에서 "본질적으로 없는"은 명시된 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재한다는 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로부터 야기되는 명시된 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 명시된 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출할 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
용어 "항체"는 표적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 무손상 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 이소형의 무손상 면역글로불린, 또는 이의 단편을 지칭하며, 예를 들어 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이 항체를 포함한다. "항체"는 항원 결합 단백질의 종이다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 예에서는 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타과에서 자연적으로 발생하는 항체와 같은 더 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터 단독으로 유래될 수 있거나, "키메라"일 수 있고, 즉, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이 항체의 상이한 부분이 2개의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄을 포함하는 항체 이외에, 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예는 아래에 기술되어 있다. 더욱이, 명백하게 배제되지 않는 한, 항체는 단클론 항체, 이중특이 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 이들의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 또한 펩티바디를 포함한다.
자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 전형적으로 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 전장 "경쇄"(특정 실시양태에서, 약 25kDa) 및 하나의 전장 "중쇄"(특정 실시양태에서, 약 50-70kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 몇 가지 서브클래스를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 서브클래스를 갖는다. IgA는 유사하게 IgA1 및 IgA2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 서브클래스로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 접합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)(모든 목적을 위해 전문이 참고로 포함됨)]을 참조한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에 대략 아미노-말단 120 내지 130개 아미노산 및 경쇄에 약 100 내지 110개 아미노산 말단 아미노산을 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체들 사이에서도 아미노산 서열에 있어 광범위하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 이의 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.
가변 영역은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 접합된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특정 에피토프에 대한 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 전형적으로 면역학적 관심 단백질의 Kabat 서열의 정의에 따른다(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987) or Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989).
특정 실시양태에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄의 부재하에 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄의 부재하에 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄의 부재하에 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄의 부재하에 항원에 결합한다. 특정 실시양태에서, 개별 가변 영역은 다른 가변 영역의 부재하에 항원에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, CDR의 확정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해결하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해결함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 X선 결정학과 같은 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR 영역을 확인하거나 근사화하기 위해 다양한 분석 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 Kabat 정의, Chothia 정의, AbM 정의 및 contact 정의를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
Kabat 정의는 항체의 잔기 번호를 매기기 위한 표준이며 전형적으로 CDR 영역을 식별하는 데 사용된다. 예를 들어, 문헌[Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28:214-8 (2000)]을 참조한다. Chothia 정의는 Kabat 정의와 유사하지만, Chothia 정의는 특정 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다. 예를 들어, 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]을 참조한다. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 분자 그룹에 의해 제조된 통합 컴퓨터 프로그램 제품군을 사용한다. 예를 들어, 문헌[Martin et al., Proc Natl Acad Sci (미국), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd]를 참조한다. AbM 정의는 문헌[Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999)]에 기술된 것과 같이 지식 데이터베이스와 Ab initio 방법의 조합을 사용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다. contact 정의는 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 예를 들어, 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996)]을 참조한다.
관례적으로, 중쇄 내의 CDR 영역은 전형적으로 H1, H2, 및 H3으로 지칭되고, 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호매겨진다. 경쇄 내의 CDR 영역은 전형적으로 L1, L2, 및 L3으로 지칭되고, 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 순차적으로 번호매겨진다.
용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 포함한다.
용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 및 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카복실-말단에 있으며, CH3는 폴리펩티드의 카복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다.
이중특이성 또는 이관능성 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)]을 참조한다.
용어 "항원"은 적응 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 구체적으로, 항원은 적응 면역 반응의 수용체에 대한 표적으로서 역할을 하는 물질이다. 전형적으로, 항원은 항원-특이 수용체에 결합하지만 그 자체로는 체내에서 면역 반응을 유도할 수 없는 분자이다. 항원은 통상적으로 단백질 및 다당류이며, 덜 빈번하게는 지질이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항원은 또한 면역원 및 합텐을 포함한다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 이상의 디설파이드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역이 결여되어 있다.
특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적"인 항체는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토 프에 실질적으로 결합하지 않으면서 그 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 예를 들면, 본 발명의 코로나바이러스 S 단백질 특이 항체는 코로나바이러스 S 단백질에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는 항체는 
100 nM, 
10 nM, 
1 nM, 
0.1 nM, 
0.01 nM, 또는 
0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다..
용어 "경쟁하다"는, 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)의 맥락에서 사용될 때, 시험되는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)이 공통 항원(예를 들어, 코로나바이러스 S 단백질 또는 이의 단편)에 대한 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 리간드, 또는 기준 항체)의 특이적 결합 을 방지하거나 억제(예를 들어, 감소)하는 검정에 의해 결정된 바와 같은 항원 결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다. 다수 유형의 경쟁적 결합 분석, 예를 들어: 고체상 직접 또는 간접 방사면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 검정(예를 들어, 참조: Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 참조: Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정(예를 들어, 참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); 1-125 표지를사용하는 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 참조: Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 참조: Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al. , 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)이 하나의 항원 결합 단백질이 다른 항원 결합 단백질과 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 고체 표면 또는 이들 중 어느 하나를 보유하는 세포에 결합된 정제된 항원, 표지되지 않은 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 기준 항원 결합 단백질의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항원 결합 단백질(경쟁 항원 결합 단백질)은 기준 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 입체 장애가 발생하도록 기준 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가의 세부사항은 본원의 실시예에 제공되어 있다. 통상적으로, 경쟁 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 공통 항원에 대한 기준 항원 결합 단백질의 특이 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 이상으로 억제(예를 들어, 감소)할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 이상으로 억제된다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 그룹을 지칭한다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구조적 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성되고, 이의 1차 구조에 기반하여 항체와 상호작용한다. 반면에 구조적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 부분으로 구성되며 항원의 3D 구조에 기반하여 항체와 상호작용한다. 일반적으로, 에피토프는 대략 5개 또는 6개의 아미노산 길이이다. 2개의 항체는 이들이 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타내는 경우 항원 내에서 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되었거나 형질전환될 수 있어 관심 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어는 관심 유전자가 존재하는 한 자손이 원래 부모 세포와 형태 또는 유전적 구성이 동일한지 여부에 관계없이 부모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬 및 비교함으로써 결정된 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트"는 비교된 분자 내의 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자 중 가장 작은 것의 크기에 기초하여 계산된다. 이러한 계산을 위해, 정렬에서의 갭(존재하는 경우)은 바람직하게는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결된다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기술된 것을 포함한다.
동일성 퍼센트를 계산하는 데 있어서, 비교되는 서열은 전형적으로 서열들 간에 가장 큰 일치를 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 한 가지 예는 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트가 결정될 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 정렬하는데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 최적 일치를 위해 정렬된다(알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "일치된 스팬"). 갭 오프닝 페널티(평균 대각선의 3×로 계산되고, 여기서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 일치에 할당된 점수 또는 숫자이다) 및 갭 확장 페널티(통상적으로 갭 오프닝 페널티의 1/10배임) 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 실시양태에서, 표준 비교 매트릭스(참조; Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있는 파라미터의 예는 문헌[Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453]에서 찾을 수 있다.
2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 방식은 2개의 서열의 짧은 영역만을 매칭하는 결과를 초래할 수 있고, 이러한 작은 정렬된 영역은 2개의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩티드의 적어도 50개 또는 다른 수의 연속 아미노산에 걸쳐 있는 정렬을 초래하도록 원하는 경우 조정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결"은 분자내 상호작용, 예를 들어, 공유 결합, 금속 결합, 및/또는 이온 결합, 또는 분자간 상호작용, 예를 들어, 수소 결합 또는 비공유 결합을 통한 회합을 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 그렇게 설명된 성분들이 이들의 통상의 기능을 수행하도록 구성되는 요소들의 정열을 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드에 작동 가능하게 연결된 주어진 신호 펩티드는 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 지시한다. 프로모터의 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터가 코딩 서열의 발현을 지시할 것이다. 프로모터 또는 다른 제어 요소는 이들이 이의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 예를 들면, 개재된 번역되지 않았지만 전사된 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 지시되지 않는 한 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본 개시내용은 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 다를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 염기 변형, 예를 들어 브로모우리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예를 들어 2',3'-디데옥시리보스, 및 인터뉴클레오티드 결합 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자, 즉, 자연 발생 및 비-재조합 세포에 의해 생산된 단백질을 의미하거나; 이것은 유전적으로 조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산되고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 부가, 및/또는 치환을 갖는 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산 및 중합체의 화학적 유사체인 아미노산 중합체를 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 특히 항원-결합 단백질의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 추가 및/또는 치환을 갖는 코로나바이러스 S 단백질 결합 단백질, 항체 또는 서열을 포함한다. 용어 "폴리펩티드 단편"은 전장 천연 단백질과 비교하여 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 단편은 또한 천연 단백질과 비교하여 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단편은 약 5 내지 500개 아미노산 길이이다. 예를 들면, 단편은 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450개 아미노산 길이일 수 있다. 유용한 폴리펩티드 단편은 결합 도메인을 포함하는 항체의 면역학적으로 기능적인 단편을 포함한다. 코로나바이러스 S 단백질-결합 항체의 경우, 유용한 단편은 CDR 영역, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 일부 또는 2개의 CDR을 포함하는 이의 가변 영역 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 본원에 개시된 융합 단백질의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다. 일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 통상적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형잡힌 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는, 예를 들면, 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적-중성 담체 이외에, 투여되는 약제학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 인간은 출생 전후의 형태를 포함한다. 다수의 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있으며, 이는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시하는 인간을 지칭한다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호 교환가능하게 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 걸리기 쉽지만 질환 또는 장애의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효 투여량"은 질환 또는 병태를 치료하는데 효과적인 약물의 투여량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들면, 바이러스 감염을 치료하기 위해 본원에 개시된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 사용과 관련하여.
본원에 사용된 병태의 "치료하는" 또는 "치료"는 병태를 예방 또는 경감시키는 것, 병태의 발병 또는 발달 속도를 늦추는 것, 병태를 발달시킬 위험을 감소시키는 것, 병태와 관련된 증상의 발달을 예방 또는 지연시키는 것, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키는 것, 병태의 완전한 또는 부분적 퇴행을 생성하는 것, 병태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내로 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생성하는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 복제 기점과 같이 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 선택 가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시킬 수 있고, 이에 의해 세포가 세포에 고유한 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하게 한다. 벡터는 임의로 세포 내로의 핵산의 진입을 달성하는 것을 돕는 물질, 예를 들어 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅 등을 포함한다.
II. 코로나바이러스 스파이크 단백질
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질은 숙주 세포 내로의 바이러스 진입에서 필수적인 역할을 하며 이에 따라 항체를 중화시켜 주요 표적이 된다. 스파이크 단백질은 수용체 결합 및 막 융합을 담당하는 N-말단 S1 서브유닛 및 C-말단 S2 서브유닛을 포함한다. S1 서브유닛은 N-말단 도메인, 수용체-결합 도메인(RBD), 서브도메인 1(SD1) 및 서브도메인 2(SD2)로 더욱 나뉘어지며, S2 서브유닛은 융합 펩티드(FP), 헵타드 반복 1(HR1) 및 헵타드 반복 2(HR2)로 더욱 나뉘어진다. 스파이크는 RBD를 통해 세포 수용체에 결합하며, 이것은 스파이크의 구조적 변화를 유발한다. 활성화된 스파이크는 S1/S2 부위에서 프로테아제(예를 들어 SARS-CoV 및 SARS-CoV-2에 대한 TMPRSS2)에 의해 절단되어 S1 서브유닛을 방출하고 S2 서브유닛에 FP를 노출시킨다. HR1 및 HR2는 막 융합 35을 유도하기 위해 융합-후 형태로 재폴딩된다. S1의 기능 및 더 높은 면역원성으로 인해, 현재까지 코로나바이러스를 특징으로 하는 대부분의 중화 항체는 S1 서브유닛을 표적으로 한다. 주요 과제는 막 융합 동안 S2 형태가 매우 동적이어서 스파이크 단백질 항원을 제조하고 스파이크에 대한 효과적인 면역 반응(예를 들어, 중화 항체 생성)을 생성하기 어렵다는 것이다. 스파이크 단백질 안정화 전략은 스파이크 단백질 코딩 서열의 돌연변이에 의해 본원에서 입증되었다. 본원에서 분석되고 제공되는 돌연변이는 하기 표 1 내지 3에 상세히 기술되어 있다. 돌연변이 단백질은 실시예에 상세히 기술된 바와 같이 발현되었고, 생성된 단백질 및 삼량체 복합체의 양을 결정하였다.
표 1. 스파이크 단백질 치환 및 돌연변이.
표 2. 추가 돌연변이.
표 3. 추가 스파이크 단백질 돌연변이.
표 4 (파트 1). 올리고.
표 4 (파트 2). 올리고.
표 5. SARS-CoV-2 변이체 분류 및 정의.
III. 약제학적 제형
본 개시내용은 조작된 코로나바이러스 S 단백질, 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 및 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 포함하고/하거나 이의 게놈 물질 내에 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 암호화하는 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 백신 제형의 일부와 같은 면역 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다.
조작된 코로나바이러스 S 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 약제학적 조성물에 사용되는 경우, 핵산 분자는 함께 공유 결합된 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하지만, 일부 경우에는 적어도 하나의 상이한 결합, 예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미다이트 연결, 및 펩티드 핵산 백본 및 연결을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있고; 대안적으로, 상이한 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 자연 발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 핵산 분자는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예를 들어 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자를 둘 다 포함한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 용어 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 알려지거나 예측된 2개의 상보적인 단일-가닥 형태 각각을 모두 포함한다. 핵산 분자는 4가지 뉴클레오티드 염기: 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 폴리뉴클레오티드가 RNA일 때 티민 대신 우라실(U)의 특정 서열로 구성된다. 따라서, 용어 "핵산 서열"은 핵산 분자의 알파벳순 표현이다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 지시된 서열 뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 동의 코돈 치환) 및 상보적 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 동의 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산은 변형된 당 모이어티를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드를 포함하는 이러한 화합물은 자연 발생 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드만을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 비해 향상된 뉴클레아제 안정성 또는 표적 핵산과의 증가된 결합 친화도와 같은 바람직한 특성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 치환된 당 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 당 대리물이다. 이러한 당 대리물은 치환된 당 모이어티의 것에 상응하는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 2' 및/또는 5' 위치에서의 치환체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 비-가교 당 치환체를 포함하는 치환된 당 모이어티이다. 2'-위치에 적합한 당 치환체의 예는 2'-F, 2'-OCH3("OMe" 또는 "O-메틸"), 및 2'-O(CH2)2OCH3("MOE")을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 2' 위치에서의 당 치환체는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, O-C1-C10 치환된 알킬; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), 및 O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)로부터 선택되고, 여기서 각 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬이다. 5'-위치에서의 당 치환체의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 5'-메틸(R 또는 S); 5'-비닐 및 5'-메톡시. 일부 실시양태에서, 치환된 당은 하나 이상의 비-가교 당 치환체, 예를 들면, T-F-5'-메틸 당 모이어티를 포함한다(예를 들어, 추가적인 5',2'-비스 치환된 당 모이어티 및 뉴클레오시드에 대해서는 PCT 국제 출원 제WO 2008/101157호 참조).
2'-치환된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드는 2'-치환된 뉴클레오시드로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 할로, 알릴, 아미노, 아지도, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S 또는 N(Rm)-알킬; O, S 또는 N(Rm)-알케닐; O, S 또는 N(Rm)-알키닐; O-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴, O-아르알킬, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn) 또는 O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)으로부터 선택된 2'-치환체를 포함하고, 여기서, 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H, 아미노 보호 그룹 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬이다. 이들 2'-치환체 그룹은 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카복시, 벤질, 페닐, 니트로(NO2), 티올, 티오알콕시(S-알킬), 할로겐, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체 그룹으로 추가로 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, NH2, N3, OCF3, O--CH3, O(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, O--CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 N-치환된 아세트아미드(O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn)로부터 선택된 2'-치환체 그룹을 포함하고, 여기서 각각의 Rm 및 Rn은, 독립적으로, H, 아미노 보호 그룹 또는 치환되거나 치환되지 않은 C1-C10 알킬이다.
일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, OCF3, O-CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 O--CH2--C(=O)--N(H)CH3로부터 선택된 2'-치환체 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 F, O--CH3, 및 OCH2CH2OCH3로부터 선택된 2'-치환체 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 뉴클레오시드는 하나 이상의 변형되지 않은 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 뉴클레오시드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 핵염기는 다음으로부터 선택된다: 본원에 정의된 바와 같은 보편적 염기(universal base), 소수성 염기, 무차별적 염기(promiscuous base), 크기-확장된 염기, 및 플루오르화 염기. 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실을 포함한 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌, 본원에 정의된 바와 같은 보편적 염기, 소수성 염기, 무차별적 염기, 크기-확장된 염기, 및 플루오르화 염기. 추가의 변형된 핵염기는 트리사이클릭 피리미딘, 예를 들어 페녹사진 시티딘([5,4-b][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예를 들어 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-13][1,4]벤즈옥사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 핵염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 기시된 것들, 및 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859; those disclosed by Englisch et al., 1991; and those disclosed by Sanghvi, Y. S., 1993]에 개시된 것들을 포함한다.
상기 언급된 특정 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 제한 없이, 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제5,763,588호; 제5,830,653호 및 제6,005,096호를 포함하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
추가의 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 개시내용의 리간드 접합된 올리고뉴클레오티드의 하나의 추가적인 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 추가적인 비-리간드 모이어티 또는 접합체에 대한 화학적 연결을 포함한다. 이러한 잔기는 지질 모이어티, 예를 들어 콜레스테롤 잔기(Letsinger et al., 1989), 콜산(Manoharan et al., 1994), 티오에테르, 예를 들어 헥실-5-트리틸티올(Manoharan et al., 1992; Manoharan et al., 1993), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., 1992), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., 1991; Kabanov et al., 1990; Svinarchuk et al., 1993), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., 1995; Shea et al., 1990), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., 1995), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., 1995), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., 1995), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., 1996)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 변형된 RNA, 예를 들어 변형된 mRNA이다. 변형된 (m)RNA는 mRNA에 증가된 안정성 및 낮은 면역원성을 부여하여 치료적으로 중요한 단백질의 발현을 촉진하는 특정 화학적 변형을 고려한다. 예를 들어, N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ)은 번역 용량 측면에서 여러 다른 뉴클레오시드 변형 및 이들의 조합을 능가한다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 (m)RNA 분자는 우라실을 슈도우라실, 예를 들어 1-메틸-3'-슈도우리딜릴 염기로 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 우라실의 일부가 대체되지만, 다른 실시양태에서는, 모든 우라실이 대체되었다. (m)RNA는 5' 캡, 5' UTR 요소, 임의로 코돈 최적화된 개방 판독 프레임, 3' UTR 요소, 및 폴리(A) 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
핵산 분자는, 천연이든 변형되었든, 네이키드 핵산 분자로서 또는 전달 비히클, 예를 들어 지질 나노입자로 전달될 수 있다. 지질 나노입자는 약 5:1 내지 약 1:100의 지질 나노입자에 대해 중량비로 존재하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자에 대한 핵산의 중량비는 약 5:1, 2.5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 1:100, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 값이다.
일부 실시양태에서, 본원에 사용된 지질 나노입자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 지질을 함유할 수 있다. 이러한 지질은 트리글리세리드, 인지질, 스테로이드 또는 스테롤, PEG화 지질, 또는 알킬 아민과 같은 이온화 가능한 그룹 및 하나 이상의 소수성 그룹, 예를 들어 C6 또는 그 이상의 알킬 그룹을 갖는 그룹을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 몇몇 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체와 혼합된다. 일부 실시양태들에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 임의의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 용어 "스테로이드"는 알킬 그룹, 알콕시 그룹, 하이드록시 그룹, 옥소 그룹, 아실 그룹, 또는 2개 이상의 탄소 원자 사이의 이중 결합을 포함하는 하나 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있는 4개의 환 17개 탄소 사이클릭 구조를 갖는 화합물의 부류이다.
본 개시내용의 몇몇 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 PEG화된 지질 (또는 PEG 지질)과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 PEG 그룹이 부착된 임의의 지질을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG 지질은 글리세롤 그룹에 부착된 PEG 쇄를 또한 포함하는 디글리세리드이다. 다른 실시양태에서, PEG 지질은 PEG 쇄를 갖는 링커 그룹에 부착된 하나 이상의 C6-C24 장쇄 알킬 또는 알케닐 그룹 또는 C6-C24 지방산 그룹을 함유하는 화합물이다. PEG 지질의 일부 비제한적인 예는 PEG 변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG 세라마이드 접합된, PEG 변형된 디알킬아민 및 PEG 변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민, PEG 변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG 변형된 디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 또는 PEG 변형된 디미리스토일-sn-글리세롤을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG 변형은 지질의 PEG 성분의 분자량에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, PEG 변형은 약 100 내지 약 15,000의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 분자량은 약 200 내지 약 500, 약 400 내지 약 5,000, 약 500 내지 약 3,000, 또는 약 1,200 내지 약 3,000이다. PEG 변형의 분자량은 약 100, 200, 400, 500, 600, 800, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,250, 2,500, 2,750, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 12,500, 내지 약 15,000이다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 지질의 일부 비제한적인 예는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,820,873호, 제WO 2010/141069호, 또는 미국 특허 제8,450,298호에 의해 교시된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 인지질과 혼합된다. 일부 실시양태에서, 임의의 지질은 또한 포스페이트 그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인지질은 1 또는 2개의 장쇄 C6-C24 알킬 또는 알케닐 그룹, 글리세롤 또는 스핑고신, 1 또는 2개의 포스페이트 그룹, 및 임의로, 작은 유기 분자를 함유하는 구조이다. 일부 실시양태에서, 작은 유기 분자는 아미노산, 당, 또는 아미노 치환된 알콕시 그룹, 예를 들어 콜린 또는 에탄올아민이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린이다. 일부 실시양태에서, 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민이다. 일부 실시양태에서, 다른 쯔비터이온성 지질이 사용되며, 여기서 쯔비터이온성 지질은 양전하 및 음전하 둘 다를 갖는 지질 및 지질-유사 분자를 정의한다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 친유성 및 양이온성 성분을 함유하는 화합물을 함유하는 지질 나노입자가 제공되며, 여기서 양이온성 성분은 이온화 가능하다. 일부 실시양태에서, 양이온성 이온화 가능한 지질은 생리학적 pH에서 양성자화되지만 8, 9, 10, 11 또는 12 이상의 pH에서 탈양성자화될 수 있고 전하를 갖지 않는 하나 이상의 그룹을 함유한다. 이온화 가능한 양이온성 그룹은 생리학적 pH에서 양이온성 그룹을 형성할 수 있는 하나 이상의 양성자화 가능한 아민을 함유할 수 있다. 양이온성 이온화 가능한 지질 화합물은 또한 C6-C24 알킬 또는 알케닐 탄소 그룹을 갖는 2개 이상의 지방산과 같은 하나 이상의 지질 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지질 그룹을 에스테르 결합을 통해 부착될 수 있거나, 황 원자에 마이클 부가를 통해 추가로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 화합물은 덴드리머, 덴드론, 중합체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 개시내용의 일부 측면에서, 친유성 및 양이온성 성분을 함유하는 화합물을 함유하는 조성물이 제공되며, 여기서 양이온성 성분은 이온화 가능하다. 일부 실시양태에서, 이온화 가능한 양이온성 지질은 전하(pKa)를 획득할 수 있는 질소 원자를 갖는 지질 및 지질-유사 분자를 지칭한다. 이들 지질은 양이온성 지질로서 문헌에 공지되어 있을 수 있다. 아미노 그룹을 갖는 이들 분자는 전형적으로 2 내지 6개의 소수성 쇄, 종종 C6-C24 알킬 또는 알케닐 그룹과 같은 알킬 또는 알케닐 그룹을 갖지만, 적어도 1개 또는 6개 이상의 꼬리를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물에 캡슐화된 핵산 분자를 갖는 지질 나노입자의 양은 약 0.1% w/w 내지 약 50% w/w, 약 0.25% w/w 내지 약 25% w/w, 약 0.5% w/w 내지 약 20% w/w, 약 1% w/w 내지 약 15% w/w, 약 2% w/w 내지 약 10% w/w, 약 2% w/w 내지 약 5% w/w, 또는 약 6% w/w 내지 약 10% w/w이다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물에 캡슐화된 핵산 분자를 갖는 지질 나노입자의 양은 약 0.1% w/w, 0.25% w/w, 0.5% w/w, 1% w/w, 2.5% w/w, 5% w/w, 7.5% w/w, 10% w/w, 15% w/w, 20% w/w, 25% w/w, 30% w/w, 35% w/w, 40% w/w, 45% w/w, 50% w/w, 55% w/w, 60% w/w, 65% w/w, 70% w/w, 75% w/w, 80% w/w, 85% w/w, 90% w/w, 내지 약 95% w/w, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물로 제형화된 하나 이상의 당을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 당은 당류이다. 이들 당류는 건조 공정 동안 약제학적 조성물을 불안정화로부터 보호하는 동결방지제(lyoprotectant)로서 작용하는데 사용될 수 있다. 이러한 수용성 부형제는 탄수화물 또는 당류, 예를 들어 이당류, 예를 들어 수크로스, 트레할로스, 또는 락토스, 삼당류, 예를 들어 프럭토스, 글루코스, 라피노스를 포함하는 갈락토스, 다당류, 예를 들어 전분 또는 셀룰로스, 또는 당 알코올, 예를 들어 크실리톨, 소르비톨, 또는 만니톨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 부형제는 실온에서 고체이다. 당 알코올의 일부 비제한적인 예는 에리트리톨, 트레이톨, 아라비톨, 크실리톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 이소말트, 말티톨, 락티톨, 말토트리톨, 말토테트라이톨, 또는 폴리글리시톨을 포함한다.
일부 실시양태에서, 약제학적 조성물 중 당의 양은 약 25% w/w 내지 약 98% w/w, 40% w/w 내지 약 95% w/w, 50% w/w 내지 약 90% w/w, 50% w/w 내지 약 70% w/w, 또는 약 80% w/w 내지 약 90% w/w이다. 일부 실시양태에서, 약제학적 조성물 중 당의 양은 약 10% w/w, 15% w/w, 20% w/w, 25% w/w, 30% w/w, 35% w/w, 40% w/w, 45% w/w, 50% w/w, 52.5% w/w, 55% w/w, 57.5% w/w, 60% w/w, 62.5% w/w, 65% w/w, 67.5% w/w, 70% w/w, 75% w/w, 80% w/w, 82.5% w/w, 85% w/w, 87.5% w/w, 90% w/w, 내지 약 95% w/w, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위이다.
일부 실시양태에서, 약제학적으로 허용되는 중합체는 공중합체이다. 약제학적으로 허용되는 중합체는 중합체 서브유닛의 별개의 상이한 유형의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 서브유닛을 추가로 포함할 수 있다. 이들 중합체 서브유닛은 폴리옥시프로필렌, 폴리옥시에틸렌, 또는 유사한 서브유닛을 포함할 수 있다. 특히, 약제학적으로 허용되는 중합체는 적어도 하나의 소수성 서브유닛 및 적어도 하나의 친수성 서브유닛을 포함할 수 있다. 특히, 공중합체는 소수성 유닛의 각 측면에 친수성 서브유닛을 가질 수 있다. 공중합체는 폴리옥시에틸렌인 친수성 서브유닛과 폴리옥시프로필렌인 소수성 서브유닛을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 발현 카세트는 후속 정제 및 세포/대상체로의 전달을 위해, 또는 바이러스-기반 전달 접근법에서 직접 사용하기 위해, 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 발현하기 위해 사용된다. 본원에는 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 발현 벡터가 제공된다.
발현은 벡터에 적절한 신호가 제공되고 세포에서 조작된 코로나바이러스 S 단백질의 발현을 유도하는 바이러스 및 포유류 공급원 둘 다로부터의 인핸서/프로모터와 같은 다양한 조절 요소를 포함하는 것을 필요로 한다. 본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 카세트"는 서열을 암호화하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사 및 번역될 수 있는, 즉, 프로모터의 제어하에 있는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 포함하는 것을 의미한다. "프로모터"는 유전자의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기계, 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "전사 제어하에"는 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산과 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있음을 의미한다. "발현 벡터"는 복제할 수 있고 이에 따라 복제 기점, 전사 종결 신호, 폴리A 영역, 선택 가능한 마커, 및 다목적 클로닝 부위 중 하나 이상을 포함하는 유전자 작제물에 포함된 발현 카세트를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 프로모터라는 용어는 RNA 중합효소 II에 대한 개시 부위 주위에 클러스터링되어 있는 전사 제어 모듈의 그룹을 지칭하기 위해 사용될 것이다. 프로모터가 어떻게 조직되는지에 대한 많은 생각은 HSV 티미딘 키나제(tk) 및 SV40 초기 전사 단위에 대한 프로모터를 포함한 여러 바이러스 프로모터의 분석에서 비롯된다. 보다 최근의 연구에 의해 보강된 이러한 연구들은 프로모터가 각각 약 7-20 bp의 DNA로 구성되고 전사 활성화제 또는 억제제 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 개별 기능 모듈로 구성된다는 것을 보여주었다.
각각의 프로모터 내의 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 위치시키는 기능을 한다. 이것의 가장 잘 알려진 예는 TATA 상자이지만, 포유동물 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같은 TATA 상자가 결여된 일부 프로모터에서는, 시작 부위 자체를 덮는 별개의 요소가 개시 장소를 고정하는 것을 돕는다.
추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 상류 30-110 bp 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 최근 시작 부위의 하류에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소들 사이의 간격은, 요소들이 서로에 대해 반전 또는 이동될 때 프로모터 기능이 보존되도록, 종종 유연하다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
특정 실시양태에서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제와 같은 바이러스 프로모터는 관심있는 코딩 서열의 높은 수준의 발현을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 발현의 수준이 주어진 목적에 충분한 한, 관심있는 코딩 서열의 발현을 달성하기 위해 당업계에 잘 알려져 있는 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용이 또한 고려된다. 잘 알려진 특성을 갖는 프로모터를 사용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후 관심 단백질의 발현의 수준 및 패턴이 최적화될 수 있다. 또한, 특정 생리학적 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 유전자 산물의 유도성 발현을 허용할 수 있다.
인핸서는 동일한 DNA 분자의 먼 위치에 위치한 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 유전적 요소이다. 인핸서는 프로모터와 매우 유사하게 조직된다. 즉, 이들은 각각 하나 이상의 전사 단백질에 결합하는 많은 개별 요소로 구성된다. 인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 작동적 차이이다. 인핸서 영역은 전체적으로 멀리서 전사를 자극할 수 있어야 한다; 이것은 프로모터 영역 또는 이의 성분 요소에는 적용될 필요가 없다. 다른 한편으로, 프로모터는 특정 부위 및 특정 배향에서 RNA 합성의 개시를 지시하는 하나 이상의 요소를 가져야 하는 반면 인핸서는 이러한 특이성이 결여되어 있다. 프로모터와 인핸서는 종종 겹치고 인접하며, 종종 매우 유사한 모듈식 조직을 갖는 것으로 보인다.
아래는 발현 작제물에서 관심 유전자를 암호화하는 핵산과 조합하여 사용될 수 있는 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서의 목록이다. 추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합(진핵 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따라)이 또한 유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 진핵 세포는 전달 복합체의 일부로서 또는 추가 유전적 발현 작제물로서 적절한 박테리아 중합효소가 제공되는 경우 특정 박테리아 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
프로모터 및/또는 인핸서는, 예를 들면, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, T-세포 수용체, HLA DQ a 및/또는 DQ β, β-인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-2 수용체, MHC 클래스 II 5, MHC 클래스 II HLA-Dra, β-액틴, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 프리알부민(트랜스티레틴), 엘라스타제 I, 메탈로티오네인(MTII), 콜라게나제, 알부민, α-태아단백질, t-글로빈, β-글로빈, c-fos, c-HA-ras, 인슐린, 신경 세포 부착 분자(NCAM), α1-안티트립파인, H2B (TH2B) 히스톤, 마우스 및/또는 유형 I 콜라겐, 글루코스-조절 단백질(GRP94 및 GRP78), 래트 성장 호르몬, 인간 혈청 아밀로이드 A(SAA), 트로포닌 I(TN I), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), SV40, 폴리오마, 레트로바이러스, 유두종 바이러스, B형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스일 수 있다.
cDNA 삽입물이 사용되는 경우, 전형적으로 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 수행하기 위해 폴리아데닐화 신호를 포함시키고자 할 것이다. 인간 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐화 신호와 같은 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다. 또한 발현 카세트의 요소로서 고려되는 것은 종결인자이다. 이러한 요소는 메시지 수준을 향상시키고 카세트에서 다른 서열로의 리드를 최소화하는 역할을 할 수 있다.
발현 벡터가 세포 내로 도입될 수 있는 다수의 방법이 있다. 특정 실시양태에서, 발현 작제물은 바이러스 게놈으로부터 유래된 바이러스 또는 조작된 작제물을 포함한다. 특정 바이러스가 수용체-매개 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가고, 숙주 세포 게놈에 통합되고, 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현하는 능력은 이들을 외래 유전자를 포유류 세포로 전달하기 위한 매력적인 후보로 만들었다. 이들은 외래 DNA 서열에 대한 용량이 상대적으로 낮고 제한된 숙주 스펙트럼을 갖는다. 또한, 허용 세포에서의 이들의 발암 가능성 및 세포변성 효과는 안전성 문제를 제기한다. 이들은 최대 8kB의 외래 유전 물질만 수용할 수 있지만 다양한 세포주 및 실험실 동물에 쉽게 도입될 수 있다.
생체내 전달을 위한 한가지 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지원하고 (b) 그 안에 클로닝된 조작된 코로나바이러스 S 단백질을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 이들 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 맥락에서, 발현은 유전자 산물이 합성되는 것을 필요로 하지 않는다.
발현 벡터는 아데노바이러스의 유전자 조작된 형태를 포함한다. 36kB, 선형, 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 조직에 대한 지식은 아데노바이러스 DNA의 큰 조각을 최대 7kB의 외래 서열로 대체할 수 있게 한다. 레트로바이러스와 달리, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전독성 없이 에피솜 방식으로 복제될 수 있기 때문에 염색체 통합을 초래하지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하며, 광범위한 증폭 후 게놈 재배열이 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 세포 주기 단계에 관계없이 거의 모든 상피 세포를 감염시킬 수 있다. 지금까지, 아데노바이러스 감염은 인간의 급성 호흡기 질환과 같은 경미한 질환에만 관련이 있는 것으로 보인다.
아데노바이러스는 중간 크기의 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염성으로 인해 유전자 전달 벡터로 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양쪽 말단에는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소인 100-200개의 염기쌍 역위 반복체(ITR)가 함유되어 있다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 나누어지는 상이한 전사 단위를 포함한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 몇 가지 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질의 합성을 초래한다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단에 관여한다. 대부분의 바이러스 캡시드 단백질을 포함한 후기 유전자의 산물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 발행된 단일 1차 전사체의 유의한 처리 후에만 발현된다. MLP(16.8m.u.에 위치)는 감염의 후기 단계 동안 특히 효율적이며, 이 프로모터로부터 발행된 모든 mRNA는 5'-삼원 리더(tripartite leader)(TPL) 서열을 보유하여 이들을 번역에 바람직한 mRNA로 만든다. 하나의 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이의 상동 재조합으로부터 생성된다. 2개의 프로바이러스 벡터 사이의 가능한 재조합으로 인해, 야생형 아데노바이러스가 이 과정으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 개별 플라크로부터 바이러스의 단일 클론을 단리하고 이의 게놈 구조를 조사하는 것이 중요한다.
본 발명의 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 Ad5 DNA 단편에 의해 인간 배아 신장 세포로부터 형질전환되어 E1 단백질을 구성적으로 발현하는, 293으로 명명된 독특한 헬퍼 세포주에 의존한다. E3 영역은 아데노바이러스 게놈에서 필수 불가결하기 때문에, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 도움으로 E1, D3 또는 두 영역 모두에서 외래 DNA를 운반한다. 사실상, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%를 패키징할 수 있어, 약 2kb의 추가 DNA 용량을 제공한다. E1 및 E3 영역에서 대체 가능한 약 5.5kb의 DNA와 결합하면 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 최대 용량은 7.5kb 미만이거나 벡터의 전체 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 바이러스 게놈의 80% 이상이 벡터 백본에 남아 있으며 벡터 매개 세포독성의 원천이다. 또한, E1-결실된 바이러스의 복제 결핍이 불완전한다.
헬퍼 세포주는 인간 세포, 예를 들어 인간 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 다른 인간 배아 중간엽 또는 상피 세포로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 헬퍼 세포는 인간 아데노바이러스에 대해 허용되는 다른 포유동물 종의 세포로부터 유래될 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어 Vero 세포 또는 다른 원숭이 배아 중간엽 또는 상피 세포를 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
본 개시내용의 아데노바이러스는 복제 결함, 또는 적어도 조건부로 복제 결함이 있다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 혈청형 또는 하위그룹 A-F 중 임의의 것일 수 있다. 하위그룹 C의 아데노바이러스 타입 5는 본 개시내용에서 사용하기 위한 조건부 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 수득하는데 사용될 수 있는 하나의 예시적인 출발 물질이다.
다른 바이러스 벡터가 본 개시내용에서 발현 작제물로서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유류 세포에 몇 가지 매력적인 특징을 제공한다.
실시양태, 특정 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다. AAV는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. AAV는 현재 질환을 일으키는 것으로 알려져 있지 않다. 바이러스는 매우 경미한 면역 반응을 일으켜 명백한 병원성 부족을 더욱 뒷받침한다. 다수의 경우에, AAV 벡터는 숙주 세포 게놈에 통합되며, 이는 특정 용도에는 중요할 수 있지만 원치 않는 결과를 가질 수도 있다. AAV를 사용하는 유전자 요법 벡터는 분열 세포 및 휴지기 세포 둘 다를 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않으면서 염색체외 상태로 지속될 수 있지만, 천연 바이러스에서는 숙주 게놈 내로의 바이러스로 운반되는 유전자의 일부 통합이 일어난다. 이러한 특징은 AAV로 하여금 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터를 생성하고 동종 인간 질환 모델을 생성하는데 매우 매력적인 후보로 만든다. 망막에서의 유전자 요법을 위해 AAV를 사용하는 최근의 인간 임상 시험이 가능성을 보여주었다. AAV는 데펜도파르보바이러스 속(genus Dependoparvovirus)에 속하며, 이것은 파르보바이러스 과(family Parvoviridae)에 속한다. 상기 바이러스는 작은(20nm) 복제-결함 비외피 바이러스이다.
야생형 AAV는 많은 특징으로 인해 유전자 요법 연구자들로부터 상당한 관심을 끌었다. 이들 중 가장 중요한 것은 바이러스의 명백한 병원성 부족이다. 이것은 또한 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며 인간 19번 염색체의 특정 부위(AAVS1로 지정됨)에서 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합되는 능력을 갖는다. 이러한 특징은 이들을 때때로 암 발병이 뒤따르는 무작위 삽입 및 돌연변이 유발의 위협을 나타내는 레트로바이러스보다 다소 더 예측 가능하게 만든다. AAV 게놈은 언급된 부위로 가장 빈번하게 통합되는 반면, 게놈으로의 무작위 통합은 무시할 수 있는 빈도로 발생한다. 그러나, 유전자 요법 벡터로서의 AAV의 개발은 벡터의 DNA로부터 rep 및 cap을 제거함으로써 이러한 통합 능력을 제거하였다. 유전자의 전사를 유도하기 위한 프로모터와 함께 원하는 유전자는 단일-가닥 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 중합효소 복합체에 의해 이중-가닥 DNA로 전환된 후 핵에서 연쇄체(concatemer) 형성을 돕는 역위 말단 반복체(ITR) 사이에 삽입된다. AAV-기반 유전자 요법 벡터는 숙주 세포 핵에서 에피솜 연쇄체를 형성한다. 비-분열 세포에서, 이들 연쇄체는 숙주 세포의 수명 동안 온전한 상태로 유지된다. 분열 세포에서, AAV DNA는 에피솜 DNA가 숙주 세포 DNA와 함께 복제되지 않기 때문에 세포 분열을 통해 손실된다. 숙주 게놈으로의 AAV DNA의 무작위 통합은 검출 가능하지만 매우 낮은 빈도에서 발생한다. AAV는 또한 중화 항체의 생성에 국한된 것처럼 보이는 매우 낮은 면역원성을 나타내지만 명확하게 정의된 세포독성 반응을 유도하지 않는다. 이 특징은, 휴지기 세포를 감염시키는 능력과 함께, 인간 유전자 요법을 위한 벡터로서 아데노바이러스를 능가하는 이들의 우위를 나타낸다.
AAV 게놈은 약 4.7킬로베이스 길이의 양성- 또는 음성-센스의 단일-가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 말단에 있는 역위 말단 반복체(ITR) 및 두 개의 개방 판독 프레임(ORF): rep 및 cap을 포함한다. 전자는 AAV 수명 주기에 필요한 Rep 단백질을 암호화하는 4개의 중첩 유전자로 구성되고, 후자는 캡시드 단백질의 중첩 뉴클레오티드 서열: VP1, VP2 및 VP3을 함유하며, 이들은 함께 상호작용하여 정사면체 대칭의 캡시드를 형성한다.
역위 말단 반복체(ITR) 서열은 각각 145개의 염기를 포함한다. 이들은 이들의 대칭 때문에 그렇게 명명되었으며, 이것은 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필요한 것으로 나타났다. 이 특성을 제공하는 이러한 서열의 특징은 헤어핀을 형성하는 이들의 능력이며, 이것은 두 번째 DNA 가닥의 프리마제-비의존적 합성을 가능하게 하는 소위 자가-프라이밍에 기여한다. ITR은 또한 숙주 세포 게놈(인간의 19번째 염색체)으로의 AAV DNA의 통합 및 이로부터의 구출 뿐만 아니라 완전히 조립된 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자의 생성과 결합된 AAV DNA의 효율적인 캡시드화에 필요한 것으로 나타났다.
유전자 요법과 관련하여, ITR은 치료 유전자 바로 옆에 시스로(in cis) 요구되는 유일한 서열인 것으로 보인다: 구조적 (cap) 및 패키징 (rep) 단백질은 트랜스로(in trans) 전달될 수 있다. 이러한 가정으로 리포터 또는 치료 유전자를 함유하는 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 효율적인 생산을 위한 많은 방법들이 확립되었다. 그러나, ITR이 효과적인 복제 및 캡시드화를 위해 시스로 필요한 유일한 요소는 아니라는 것도 발표되었다. 몇몇 연구 그룹은 rep 유전자의 코딩 서열 내부에 시스-작용 Rep-의존성 요소(CARE)로 지정된 서열을 확인하였다. CARE는 시스로 존재할 때 복제 및 캡시드화를 증가시키는 것으로 나타났다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 염을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 염은 무기 칼륨 또는 나트륨 염, 예를 들어 염화칼륨, 염화나트륨, 인산칼륨 이염기성, 인산칼륨 일염기성, 인산나트륨 이염기성, 또는 인산나트륨 일염기성일 수 있다. 약제학적 조성물은 포스페이트 완충 용액을 생성하는 하나 이상의 포스페이트 염을 포함할 수 있다. 상기 포스페이트 완충 용액은 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0, 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위의 pH로 용액을 완충시키기 위해 각각의 포스페이트를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 약제학적 조성물로 제형화되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. "부형제"는 대상체로의 API의 투여 또는 전달을 용이하게 하기 위해 사용되거나 대상체의 작용 부위로의 전달을 위해 약제학적으로 사용될 수 있는 약물 제형으로의 API의 처리를 용이하게 하기 위해 사용되는 상대적으로 불활성 물질인 약제학적으로 허용되는 담체를 지칭한다. 더욱이, 이들 화합물은 환자에게 용이하게 측정 또는 투여될 수 있는 투여량을 수득하기 위해 희석제로서 사용될 수 있다. 부형제의 비제한적인 예는 중합체, 안정화제, 계면활성제, 표면 개질제, 용해도 증진제, 완충제, 캡슐화제, 항산화제, 보존제, 비이온성 습윤 또는 청정화제, 점도 증가제, 및 흡수-증진제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 특히 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 등재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물일 수 있고, 바람직하게는 보조제를 포함할 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 주사, 예를 들어 근육내 주사에 의해 투여될 때의 특정 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 은 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액에 사용될 수 있다. 다른 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
조성물은, 경우에 따라, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 제제의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 적절한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항체 또는 이의 단편의 예방학적 또는 치료학적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 하며, 이것은 경구, 정맥내, 동맥내, 구강내, 비강내, 분무, 기관지 흡입일 수 있거나 기계적 환기에 의한 전달될 수 있다.
본 개시내용의 조작된 단백질을 암호화하는 조작된 단백질 또는 핵산은, 본원에 기술된 바와 같이, 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 예를 들어 피내, 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사용으로 제형화될 수 있다. 제형은 대안적으로 점막에 직접 국소 경로에 의해, 예를 들면 비강 점적, 흡입, 또는 분무기에 의해 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 염 및 무기 산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예를 들어 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성되는 것을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 제2철 수산화물, 및 유기 염기, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 조성물의 성분들은 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰트와 같은 기밀하게 밀봉된 용기 중에 단위 투여 형태, 예를 들어 건조 동결건조된 분말 또는 물-비함유 농축물로서 개별적으로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이것은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 음이온으로 형성된 것 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2철 수산화물, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것과 같은 양이온으로 형성된 것을 포함한다.
투약은 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정에 의해 이루어질 수 있다. 다중 용량은 1차 면역화 일정 및/또는 추가 면역화 일정에서 사용될 수 있다. 다중 용량 일정에서 다양한 용량은 동일하거나 상이한 경로에 의해 제공될 수 있다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격으로 투여될 것이다(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등).
본원에 개시된 조성물은 어린이 및 성인 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 인간 대상체는 1세 미만, 1-5세, 5-16세, 16-55세, 55-65세, 또는 적어도 65세일 수 있다.
바람직한 투여 경로는 근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내 및 안구내 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 투여 경로는 근육내, 피내 및 피하 주사를 포함한다.
IV. 면역검출 방법
여전히 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 코로나바이러스 S 단백질을 결합, 정제, 제거, 정량화 및 달리 일반적으로 검출하기 위한 면역검출 방법에 관한 것이다. 이러한 방법이 전통적인 의미로 적용될 수 있지만, 또 다른 용도는 백신 재고의 품질 관리 및 모니터링에 있을 것이며, 여기서 본 개시내용에 따른 항체는 항원의 양 또는 완전성(즉, 장기 안정성)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 적절한/원하는 반응성 프로파일에 대해 다양한 항체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
일부 면역검출 방법은, 몇 가지만 언급하자면, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA), 면역방사 분석, 형광면역분석, 화학발광 분석, 생물발광 분석 및 웨스턴 블롯을 포함한다. 특히, 코로나바이러스 S 단백질의 검출 및 정량화를 위한 경쟁적 분석도 제공된다. 다양한 유용한 면역검출 방법의 단계가 예를 들어, 문헌[Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)]와 같은 과학 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 면역결합 방법은 코로나바이러스 S 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 수득하는 단계, 및 경우에 따라, 면역복합체의 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 본 개시내용에 따라 샘플을 제1 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
이들 방법은 샘플로부터 코로나바이러스 S 단백질 또는 코로나바이러스 S 단백질을 검출하거나 정제하는 방법을 포함한다. 항체는 바람직하게는 컬럼 매트릭스의 형태와 같은 고체 지지체에 연결될 것이며, 코로나바이러스 S 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 고정화된 항체에 적용될 것이다. 원치 않는 성분은 컬럼으로부터 세척되어, 코로나바이러스 S 단백질-발현 세포가 고정화된 항체에 면역복합체화된 채로 남아 있으며, 이것은 그후 컬럼으로부터 유기체 또는 항원을 제거함으로써 수집된다.
면역결합 방법은 또한 샘플에서 코로나 바이러스 S 단백질 또는 관련 성분의 양을 검출 및 정량화하는 방법 및 결합 과정 동안 형성된 임의의 면역 복합체의 검출 및 정량화를 포함한다. 여기에서, 코로나바이러스 S 단백질을 함유한 것으로 의심되는 샘플을 수득하고 샘플을 코로나바이러스 S 단백질 또는 이의 성분과 결합하는 항체와 접촉시킨 다음 특정 조건하에서 형성된 면역 복합체의 양을 검출하고 정량화한다. 항원 검출의 측면에서, 분석된 생물학적 샘플은 코로나바이러스 S 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플, 예를 들어 조직 절편 또는 시편, 균질화된 조직 추출물, 혈액 및 혈청을 포함하는 생물학적 유체(예를 들어, 비강 면봉), 또는 분비물, 예를 들어 대변 또는 소변일 수 있다.
선택된 생물학적 샘플을 면역 복합체(1차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 효과적인 조건하에서 항체와 접촉시키는 것은 일반적으로 간단히 항체 조성물을 샘플에 첨가하고 항체가 코로나 바이러스 S 단백질와 면역 복합체를 형성하기에, 즉 이에 결합하기에 충분할 정도로 긴 기간 동안 혼합물을 배양하는 문제이다. 이 시간 후, 샘플-항체 조성물, 예를 들어 조직 절편, ELISA 플레이트, 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯은 일반적으로 세척되어 임의의 비특이적으로 결합된 항체 종을 제거하여, 1차 면역 복합체 내에 특이적으로 결합된 항체만 검출될 수 있게 한다.
일반적으로, 면역복합체 형성의 검출은 당업계에 잘 알려져 있고 수많은 접근법의 적용을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 방사성, 형광성, 생물학적 및 효소적 태그 중 임의의 것과 같은 표지 또는 마커의 검출에 기반한다. 이러한 표지의 사용에 관한 특허는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호를 포함한다. 물론, 당업계에 공지된 바와 같이, 제2 항체 및/또는 비오틴/아비딘 리간드 결합 배열과 같은 2차 결합 리간드의 사용을 통해 추가적인 이점을 발견할 수 있다.
검출에 사용된 항체는 그 자체가 검출 가능한 표지에 연결될 수 있으며, 여기서 그후 단순히 이 표지를 검출하여 조성물 중의 1차 면역 복합체의 양이 결정될 수 있게 된다. 대안적으로, 1차 면역 복합체 내에 결합되는 제1 항체는 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제2 결합 리간드에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우, 제2 결합 리간드는 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 제2 결합 리간드는 그 자체가 종종 항체이며, 따라서 "2차" 항체로 지칭될 수 있다. 1차 면역 복합체는 2차 면역 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 효과적인 조건하에서 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체와 접촉된다. 그후 2차 면역 복합체를 일반적으로 세척하여 비특이적으로 결합된 표지된 2차 항체 또는 리간드를 제거한 다음 2차 면역 복합체에 남아 있는 표지를 검출한다.
추가의 방법은 2-단계 접근법에 의한 1차 면역 복합체의 검출을 포함한다. 제2 결합 리간드, 예를 들어 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 항체는 상기한 바와 같이 2차 면역 복합체를 형성하기 위해 사용된다. 세척 후, 2차 면역 복합체를 다시 면역 복합체(3차 면역 복합체)의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안 효과적인 조건하에서 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 결합 리간드 또는 항체와 접촉시킨다. 제3 리간드 또는 항체는 검출 가능한 표지에 연결되어, 이렇게 형성된 3차 면역 복합체의 검출을 가능하게 한다. 이 시스템은 원하는 경우 신호 증폭을 제공할 수 있다.
면역검출의 한 가지 방법은 두 가지 상이한 항체를 사용한다. 제1 비오티닐화 항체는 표적 항원을 검출하는데 사용되고, 제2 항체는 그후 복합체화된 비오틴에 부착된 비오틴을 검출하는데 사용된다. 그 방법에서, 시험하고자 하는 샘플을 먼저 제1 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양한다. 표적 항원이 존재하면, 항체의 일부가 항원에 결합하여 비오티닐화 항체/항원 복합체를 형성한다. 그후 항체/항원 복합체를 스트렙타비딘(또는 아비딘), 비오티닐화 DNA 및/또는 상보적인 비오티닐화 DNA의 연속 용액에서 배양하여 증폭시키며, 각 단계는 항체/항원 복합체에 추가 비오틴 부위를 추가한다. 증폭 단계는 적절한 수준의 증폭이 달성될 때까지 반복되며, 이 시점에서 샘플은 비오틴에 대한 제2 단계 항체를 함유하는 용액에서 배양된다. 이러한 제2 단계 항체는 예를 들어 발색 기질을 사용하는 조직효소학에 의해 항체/항원 복합체의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 효소로 표지된다. 적절한 증폭으로, 육안으로 볼 수 있는 접합체를 생성할 수 있다.
면역검출의 또 다른 공지된 방법은 면역-PCR(중합효소 연쇄 반응) 방법론을 이용한다. PCR 방법은 비오티닐화 DNA와 함께 배양하는 것까지는 Cantor 방법과 유사하지만, 여러 차례의 스트렙타비딘 및 비오티닐화 DNA 배양을 사용하는 대신 DNA/비오틴/스트렙타비딘/항체 복합체를 항체를 방출하는 낮은 pH 또는 높은 염 완충액으로 세척한다. 그후 생성된 세척액을 사용하여 적절한 대조군을 갖는 적합한 프라이머로 PCR 반응을 수행한다. 적어도 이론적으로는, PCR의 엄청난 증폭 능력 및 특이성을 사용하여 단일 항원 분자를 검출할 수 있다.
A. ELISA
면역분석은 가장 간단하고 직접적인 의미에서 결합 분석이다. 특정한 바람직한 면역분석은 당업계에 공지된 다양한 유형의 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사면역분석(RIA)이다. 조직 절편을 사용한 면역조직화학적 검출도 특히 유용하다. 그러나, 검출이 이러한 기술에 제한되지 않으며, 웨스턴 블로팅, 도트 블로팅, FACS 분석 등이 또한 사용될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
하나의 예시적인 ELISA에서, 본 개시내용의 항체는 폴리스티렌 미세역가 플레이트에서 웰과 같은 단백질 친화도를 나타내는 선택된 표면 상에 고정화된다. 그후, 코로나 바이러스 S 단백질을 함유한 것으로 의심되는 시험 조성물을 웰에 첨가한다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항원이 검출될 수 있다. 검출은 검출 가능한 표지에 연결된 또 다른 항-코로나바이러스 S 단백질 항체의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 이 유형의 ELISA는 단순 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 제2 항-코로나 바이러스 S 단백질 항체를 첨가한 다음 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 항체를 첨가함으로써 달성될 수 있으며, 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
또 다른 예시적인 ELISA에서, 코로나바이러스 S 단백질을 함유하는 것으로 의심되는 샘플(예를 들어, 잠재적으로 감염된 세포)을 웰 표면 상에 고정화한 다음 본 개시내용의 항-코로나바이러스 S 단백질 항체와 접촉시킨다. 결합 및 비특이적으로 결합된 면역 복합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 항-코로나바이러스 S 단백질 항체가 검출된다. 초기 항-코로나바이러스 S 단백질 항체가 검출 가능한 표지에 연결된 경우, 면역 복합체가 직접 검출될 수 있다. 다시, 면역 복합체는 제1 항-코로나바이러스 S 단백질 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제2 항체를 사용하여 검출될 수 있으며, 제2 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다.
사용된 형식에 관계없이, ELISA는 코팅, 배양 및 결합, 비특이적으로 결합된 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합된 면역 복합체 검출과 같은 특정 공통된 특징을 갖는다. 이들은 아래에 기술되어 있다.
플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는데 있어서, 일반적으로 밤새 또는 지정된 기간 동안 항원 또는 항체의 용액과 함께 플레이트의 웰을 배양한다. 그후 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡착된 물질을 제거한다. 그후 웰의 임의의 나머지 이용 가능한 표면을 시험 항혈청과 관련하여 항원적으로 중성인 비특이 단백질로 "코팅"한다. 이들은 소 혈청 알부민(BSA), 카제인 또는 분유 용액을 포함한다. 코팅은 고정 표면 상의 비특이적 흡착 부위의 차단을 가능하게 하여 표면에 대한 항혈청의 비특이적 결합에 의해 유발되는 배경을 줄이다.
ELISA에서는, 직접적인 절차보다는 2차 또는 3차 검출 수단을 사용하는 것이 아마도 더 통상적이다. 따라서, 단백질 또는 항체를 웰에 결합시키고, 배경을 감소시키기 위해 비반응성 물질로 코팅하고, 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, 고정화 표면을 면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서 시험하고자 하는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 그후 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 및 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로 한다.
"면역 복합체 (항원/항체) 형성을 허용하기에 효과적인 조건하에서"는 상기 조건이 바람직하게는 항원 및/또는 항체를 BSA, 소 감마 글로불린(BGG) 또는 인산염 완충 염수(PBS)/Tween과 같은 용액으로 희석하는 것을 포함한다는 것을 의미한다. 이러한 추가된 제제는 또한 비특이적 배경의 감소를 돕는 경향이 있다.
"적합한" 조건은 또한 배양이 효과적인 결합을 허용하기에 충분한 온도 또는 기간 동안 이루어짐을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4시간 정도, 바람직하게는 25℃ 내지 27℃ 정도의 온도이거나, 약 4℃ 정도에서 밤새 이루어질 수 있다.
ELISA에서 모든 배양 단계 후, 접촉된 표면은 비-복합체화된 물질을 제거하도록 세척된다. 바람직한 세척 절차는 PBS/Tween, 또는 붕산염 완충액과 같은 용액으로 세척하는 것을 포함한다. 시험 샘플과 원래 결합된 물질 사이의 특정 면역 복합체의 형성에 이은 후속 세척 후, 심지어 미세한 양의 면역 복합체의 발생이 결정될 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해, 제2 또는 제3 항체는 검출을 허용하는 관련 표지를 가질 것이다. 바람직하게는, 이것은 적절한 발색 기질과 함께 배양시 발색을 생성하는 효소일 것이다. 따라서, 예를 들면, 제1 및 제2 면역 복합체를 추가의 면역 복합체 형성의 발달에 유리한 기간 및 조건하에서 우레아제, 글루코스 옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제-접합된 항체와 접촉시키거나 배양하고자 할 것이다(예를 들어, PBS-Tween과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 배양).
표지된 항체와 함께 배양한 후, 및 결합되지 않은 물질을 제거하기 위한 세척에 이어서, 표지의 양을, 예를 들어 우레아, 또는 브로모크레졸 퍼플, 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS), 또는 효소 표지로서 퍼옥시다아제의 경우 H2O2와 같은 발색 기질과 함께 배양함으로써 정량화한다. 그후 정량화는, 예를 들어, 가시 스펙트럼 분광광도계를 사용하여 생성된 색상의 정도를 측정함으로써 달성된다.
B. 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯(대안적으로, 단백질 면역블롯)은 조직 균질액 또는 추출물의 주어진 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술이다. 이것은 겔 전기영동을 사용하여 폴리펩티드의 길이(변성 조건) 또는 단백질의 3D 구조(천연/비변성 조건)에 의해 천연 또는 변성 단백질을 분리한다. 그후 단백질은 막(일반적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮겨지며, 여기서 이들은 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 프로빙(검출)된다.
샘플은 전체 조직 또는 세포 배양물으로부터 채취될 수 있다. 대부분의 경우, 고형 조직은 먼저 블렌더(더 큰 샘플 용적의 경우)를 사용하거나, 균질화기(더 작은 용적)를 사용하거나, 초음파 처리에 의해 기계적으로 분해된다. 세포는 또한 상기 기계적 방법 중 하나에 의해 분해 개방될 수 있다. 여러가지 세제, 염 및 완충액이 세포의 용해를 촉진하고 단백질을 가용화하기 위해 사용될 수 있다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 종종 자체 효소에 의한 샘플의 소화를 방지하기 위해 첨가된다. 조직 준비는 종종 단백질 변성을 피하기 위해 냉온에서 수행된다.
샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다. 단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하, 또는 이들 인자의 조합에 의해 이루어질 수 있다. 분리의 성질은 샘플의 처리 및 겔의 성질에 따라 좌우된다. 이것은 단백질을 결정하는 매우 유용한 방법이다. 단일 샘플로부터의 단백질을 2차원으로 퍼뜨리는 2차원(2D) 젤을 사용하는 것도 가능하다. 단백질은 1차원에서 등전점(중성 순 전하를 갖는 pH)에 따라, 및 2차원에서 분자량에 따라 분리된다.
단백질이 항체 검출에 접근 가능하게 하기 위해, 이들은 겔 내부에서 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)로 만들어진 막으로 이동된다. 막은 젤의 상단에 배치되고, 그 위에 여과지 스택이 배치된다. 전체 스택은 모세관 작용에 의해 종이 위로 이동하여 단백질을 가져오는 완충 용액에 배치된다. 단백질을 전달하는 또 다른 방법은 전기블로팅이라고 하며 전류를 사용하여 겔에서 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 끌어 당긴다. 단백질은 겔 내에서 이들이 가진 조직을 유지하면서 젤 내부에서 막으로 이동한다. 이러한 블로팅 과정의 결과로, 단백질은 검출을 위한 얇은 표면층에 노출된다(아래 참조). 두 종류의 막이 이들의 비특이적 단백질 결합 특성을 위해 선택된다(즉, 모든 단백질을 동등하게 잘 결합시킨다). 단백질 결합은 소수성 상호작용 뿐만 아니라 막과 단백질 사이의 하전된 상호작용을 기반으로 한다. 니트로셀룰로스 막은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 더 취성이며 반복적인 프로빙에 잘 견디지 못한다. 겔에서 막으로의 단백질 전달의 균일성 및 전반적인 효과는 Coomassie Brilliant Blue 또는 Ponceau S 염료로 막을 염색하여 확인할 수 있다. 일단 전달되면, 단백질은 표지된 1차 항체 또는 표지되지 않은 1차 항체를 사용하여 검출된 다음 표지된 단백질 A 또는 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 2차 표지된 항체를 사용하여 간접 검출된다.
C. 면역조직화학
본 개시내용의 항체는 또한 면역조직화학(IHC)에 의한 연구를 위해 제조된 신선-동결된 및/또는 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 조직 블록 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 이들 미립자 표본으로부터 조직 블록을 제조하는 방법은 다양한 예후 인자에 대한 이전의 IHC 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
간략하게 말해서, 동결-절편은 실온에서 50ng의 동결된 "분쇄된" 조직을 작은 플라스틱 캡슐 중의 인산염 완충 염수(PBS)에서 재수화시키고; 원심분리에 의해 입자를 펠렛화하고; 점성 포매 배지(OCT)에 재현탁시키고; 캡슐을 뒤집고/뒤집거나 원심분리에 의해 다시 펠렛화하고; -70℃ 이소펜탄에서 순간-동결시키고; 플라스틱 캡슐을 절단 및/또는 조직의 동결된 실린더를 제거하고; 조직 실린더를 저온 유지 마이크로톰 척 상에 고정하고; 및/또는 캡슐로부터 25-50개의 일련의 절편을 절단함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 전체 동결 조직 샘플은 연속 절편 절단에 사용될 수 있다.
영구-절편은 플라스틱 미세원심분리 튜브에서 50mg 샘플의 재수화; 펠렛화; 4시간 고정 동안 10% 포르말린에 재현탁; 세척/펠릿화; 가온된 2.5% 한천에 재현탁; 펠렛화; 한천을 경화시키기 위해 빙수에서 냉각; 튜브로부터 조직/한천 블록 제거; 블록을 파라핀에 침윤 및/또는 포매; 및/또는 최대 50개의 일련의 영구 절편 절단을 포함하는 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다시, 전체 조직 샘플은 대체될 수 있다.
D. 면역검출 키트
여전히 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 상기한 면역검출 방법과 함께 사용하기 위한 면역검출 키트에 관한 것이다. 항체는 코로나바이러스 S 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있으므로, 항체가 키트에 포함될 수 있다. 따라서 면역검출 키트는 적합한 용기 수단에 코로나바이러스 S 단백질에 결합하는 제1 항체, 및 임의로 면역검출 시약을 포함할 것이다.
특정 실시양태에서, 항체는 미세역가 플레이트의 컬럼 매트릭스 및/또는 웰과 같은 고체 지지체에 사전-결합될 수 있다. 키트의 면역검출 시약은 주어진 항체와 연관되거나 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 다양한 형태 중 어느 하나를 취할 수 있다. 2차 결합 리간드와 연관되거나 이에 부착되는 검출 가능한 표지가 또한 고려된다. 예시적인 2차 리간드는 제1 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 이차 항체이다.
본 발명의 키트에 사용하기에 추가로 적합한 면역검출 시약은 제2 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 제3 항체와 함께 제1 항체에 대한 결합 친화도를 갖는 2차 항체를 포함하는 2-성분 시약을 포함하며, 여기서 제3 항체는 검출 가능한 표지에 연결된다. 상기 주지된 바와 같이, 다수의 예시적인 표지들이 당업계에 공지되어 있고, 이러한 모든 표지들은 본 개시내용와 관련하여 사용될 수 있다.
키트는 검출 분석을 위한 표준 곡선을 제조하는 데 사용될 수 있는 바와 같이, 표지 또는 비표지 여부에 관계없이 코로나바이러스 S 단백질의 적절하게 분취된 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 완전히 접합된 형태, 중간체의 형태, 또는 키트의 사용자에 의해 접합되는 별개의 모이어티로서 항체-표지 접합체를 함유할 수 있다. 키트의 성분들은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다.
키트의 용기 수단은 일반적으로 항체가 배치될 수 있거나, 또는 바람직하게는, 적합하게 분취되는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 본 개시내용의 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀착 감금된 항체, 항원, 및 임의의 다른 시약 용기를 함유하는 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 유지되는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
E. 유세포 분석 및 FACS
본 개시내용의 항체는 또한 유세포 분석 또는 FACS에 사용될 수 있다. 유세포 분석은 세포 계수, 세포 분류, 바이오마커 검출 및 단백질 조작을 포함한 다수의 검출 분석에 사용되는 레이저- 또는 임피던스-기반 기술이다. 이 기술은 세포를 유체 스트림에 현탁시키고 전자 검출 장치를 통과시켜 초당 최대 수천 개의 입자의 물리적 및 화학적 특성의 동시 다중매개변수 분석을 가능하게 한다. 유세포 분석은 진단 장애, 특히 혈액 암에 일상적으로 사용되지만, 기초 연구, 임상 실습 및 임상 시험에서 많은 다른 응용 분야를 가지고 있다.
형광-활성화 세포 분류(FACS)는 특수한 유형의 세포분석이다. 이것은 생물학적 세포의 이질적인 혼합물을 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성에 기초하여 한 번에 하나의 세포로 두 개 이상의 용기에 분류하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 기술은 좁고 빠르게 유동하는 액체 스트림의 중심에 동반된 세포 현탁액을 포함한다. 유동은 직경에 비해 세포 사이에 큰 간격이 있도록 정렬된다. 진동 메커니즘은 세포 스트림이 개별 액적으로 부서지게 한다. 스트림이 액적으로 분해되기 직전에, 유동은 각 세포의 형광을 측정하는 형광 측정 스테이션을 통과한다. 전기 충전 링은 스트림이 액적으로 부서지는 바로 그 지점에 배치된다. 형광 강도가 측정되기 직전에 링에 전하가 배치되고, 스트림으로부터 부서짐에 따라 반대 전하가 액적에 포획된다. 그후 하전된 액적은 이들의 전하에 기반하여 액적을 용기 내로 우회시키는 정전기 편향 시스템으로 빠진다.
특정 실시양태에서, 유세포 분석 또는 FACS에 사용되기 위해, 본 개시내용의 항체는 형광단으로 표지되고, 그후 관심 세포에 결합하도록 허용되며, 이는 유세포 분석기에서 분석되거나 FACS 기계에 의해 분류된다.
V. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술들이 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자에 의해 발견된 기술들을 나타내고, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업계의 숙련가들에 의해 인지되어야 한다. 그러나, 당업계의 숙련가들은, 본 개시내용에 비추어, 개시된 특정 실시양태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 여전히 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 같거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인지해야 한다.
실시예 1 - SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 조작
A. 방법
융합전 안정화된 nCoV 스파이크 변이체를 위한 설계 계획. SARS-CoV-2 S-2P 변이체가 모든 후속 설계를 위한 기본 작제물로서 사용되었다20. S-2P 염기 작제물은 잔기 986 및 987에서 치환된 프롤린, 퓨린 절단 부위(잔기 682-685)에서 치환된 "GSAS", T4 피브리틴의 삼량화 폴돈 모티프, HRV3C 프로테아제 인식 부위, 포유류 발현 플라스미드 pαH에서 트윈-스트렙-태그 및 옥타-히스티딘 태그를 갖는 SARS-CoV-2 S(GenBank: MN908947)의 잔기 1-1208을 포함한다. 이 플라스미드를 주형으로 사용하여, SARS-CoV-2 S 유전자 내의 선택된 위치에 원하는 돌연변이를 도입하였다. cryo-EM 구조를 기반으로 하여, 베타-탄소 원자가 4.6Å 미만으로 떨어져 있는 잔기의 쌍이 디설파이드물 설계를 위해 고려되었다. 융합-전에서 융합-후로의 이행 동안 급격하게 이동하는 영역이 특히 FP, CR 및 HR1과 같이 표적화되었다. 염교 변이체에서는 돌연변이된 잔기의 하전된 그룹이 4.0Å 이내인 것으로 예측되어야 한다. 루프의 잔기의 경우, 4.0Å보다 약간 더 긴 간격이 허용되었다. 기존 내부 공동에 인접한 측쇄를 갖는 코어-대향 잔기는 보다 벌크한 공동-충전 잔기에 대한 잠재적인 치환에 대해 조사하였다. 프롤린 치환은 FP, CR 또는 HR1에서 설계되었으며 가요성 루프 또는 나선의 N-말단에 배치되었다. 원하는 모든 치환은 다음을 피하는 것을 최대화하였다: 1. 인접한 잔기와의 충돌 생성, 2. 더 큰 소수성 공동의 생성, 3. 인접한 잔기와의 극성 상호작용 상실, 4. 불리한 이면각, 5. 기존 N-글리코실화 부위 상실 또는 새로운 N-글리코실화 부위 생성. 동일한 유형의 설계(즉, 디설파이드물/디설파이드물) 또는 상이한 유형의 설계(예를 들어, 디설파이드물/프롤린)의 쌍이 스파이크 발현 및 안정성에 부가적인 효과를 초래할 수 있는지 테스트하기 위해 조합을 선택하였다. 디설파이드 결합 형성에 관여하는 인접한 시스테인의 가요성을 제한할 수 있는 프롤린과 같이 잠재적으로 서로 간섭할 것으로 예측되는 치환은 피하였다.
단백질 발현 및 정제. S 변이체를 암호화하는 플라스미드를 폴리에틸렌이민을 사용하여 FreeStyle293F 세포(Thermo Fisher)로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 4일 후, 배양물을 수확하고, 배지를 원심분리에 의해 세포로부터 분리하였다. 상청액을 0.22μm 필터에 통과시킨 다음 스트렙탁틴 수지(IBA) 위에 통과시켰다. S 변이체를 2mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl 및 0.02% NaN3으로 구성된 완충액 중에서 Superose 6 10/300 컬럼(GE Healthcare)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 초기 정제 및 특성화를 위해, 단일-치환 및 Combo S 변이체를 40mL 배양물로부터 정제하였다. HexaPro 변이체는 2L 배양물로부터 정제하였다.
시차 주사 형광법. 96웰 qPCR 플레이트에서, 최종 농도의 5X SYPRO Orange Protein Gel Stain(ThermoFisher) 및 0.25mg/mL 스파이크를 갖는 용액을 제조하였다. 연속 형광 측정(λex=465nm, λem=580nm)은 4.4°/분의 온도 램프 속도를 사용하여 25℃에서 95℃로 증가키면서 Roche LightCycler 480 II를 사용하여 수행하였다. 데이터는 용융 곡선의 도함수로 플롯팅되었다.
음성 염색 EM. 정제된 2019-nCoV S 변이체를 2mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl 및 0.02% NaN3에서 0.04mg/mL의 농도로 희석하였다. 각 단백질을 4:1 비율의 O2/H2로 Solarus 950 플라즈마 클리너(Gatan)에서 30초 동안 플라즈마 세척된 CF-400-CU 그리드(Electron Microscopy Sciences)에 침착시키고 메틸아민 텅스텐산염(Nanoprobes)을 사용하여 염색하였다. 그리드를 Ceta 16M 검출기(Thermo Fisher Scientific)가 장착된 Talos F200C TEM 현미경에서 92,000X(보정된 픽셀 크기 1.63Å/pix에 상응함)의 배율로 이미지화하였다. S-2P 및 HexaPro를 사용한 안정성 실험은 액체 질소로 세 차례 순간 동결 및 해동한 후, 샘플을 실온에서 1-2일 동안 보관한 후, 또는 50℃, 55℃ 또는 60℃에서 30분 동안 배양한 후 상기와 같이 샘플을 이미지화함으로써 수행하였다.
단백질 발현의 정량화를 위한 생물층 간섭법. FreeStyle293F 세포(Thermo Fisher)를 3mL 최소 배지에서 형질감염시키고, 형질감염 4일 후에 수확하였다. 원심분리 후, 상청액을 10mM hepes pH 7.5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20 및 1mg/mL 소 혈청 알부민으로 구성된 완충액으로 5배 희석하였다. 항-폴돈 IgG를 Octet RED96e(ForteBio)를 사용하여 항인간 포획(AHC) 센서팁(ForteBio)에 고정화하였다. 센서팁을 개별 스파이크 변이체를 함유하는 웰에 침지하였다. 표준 곡선은 10μg/mL에서 0.16μg/mL 범위의 농도에서 정제된 S-2P의 2배 연속 희석을 측정함으로써 결정하였다. 데이터를 기준-차감하고, IgG 포획 후 기준선에 정렬하고, Octet 데이터 분석 소프트웨어 v11.1을 사용하여 각 결합 곡선을 초기 기울기의 선형 피팅을 기반으로 정량화하였다.
표면 플라스몬 공명. His-태그된 HexaPro를 Biacore X100(GE Healthcare) 및 10mM Hepes pH 8.0, 150mM NaCl 및 0.05% Tween 20으로 구성된 실행 완충액을 사용하여 ~800 반응 단위(RU) 수준으로 되도록 NiNTA 센서칩(GE Healthcare)에 고정화하였다. 정제된 hACE2의 연속 희석물을 250 내지 15.6nM 범위의 농도로 주입하였다. 반응 곡선은 Biacore X100 평가 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 1:1 결합 모델에 피팅하였다.
Cryo-EM 샘플 제조 및 데이터 수집. 정제된 HexaPro를 2mM Tris pH 8.0, 200mM NaCl, 0.02% NaN3에서 0.35mg/mL의 농도로 희석하고, 플라스마-세척된 CF-400 1.2/1.3 그리드에 적용한 다음 Vitrobot Mark IV(ThermoFischer)에서 6초 동안 블롯팅하고 액체 에탄에 플런지 동결시켰다. 현미경 사진은 K3 직접 전자 검출기(Gatan)가 장착된 FEI Titan Krios(ThermoFischer)를 사용하여 단일 그리드로부터 수집하였다. 데이터는 1.08Å/pix의 보정된 픽셀 크기에 해당하는 46,296x의 배율로 수집되었다. 데이터 수집 매개변수에 대한 전체 설명은 표 S5에서 찾을 수 있다.
Cryo-EM 데이터 처리. 모션 보정, CTF-추정 및 입자 선택은 Warp에서 수행하였다33. 그후 입자를 2D 분류, 순이론적(ab initio) 3D 재구성, 이종 3D 정제 및 불균일 동종 정제를 위해 cryoSPARC v2.15.0로 불러왔다34. 반복적인 모델 구축 및 개선이 Coot, Phenix 및 ISOLDE에서 수행되었다35-37.
B. 결과
융합전-안정화된 SARS-CoV-2 스파이크의 구조-기반 설계. 원래 S-2P 변이체20보다 더 잘 발현되고 더 안정한 융합전-안정화된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 생성하기 위해, SARS-CoV-2 S-2P Cryo-EM 구조(PDB: 6VSB)를 분석하고 클래스 I 융합 단백질 기능 및 일반적인 단백질 안정성 원칙에 대한 지식을 기반으로 치환을 설계하였다. 이러한 전략은 융합전에서 융합후로의 이행 동안 구조적 변화를 방지하기 위한 디설파이드 결합의 도입, 전하 불균형을 중화하기 위한 염교, 내부 공동을 채우기 위한 소수성 잔기, 및 나선을 캡핑하거나 융합전 상태에서 루프를 안정화시키기 위한 프롤린을 포함하였다. 100개의 단일 S-2P 변이체를 클로닝하여 이들의 상대적 발현 수준을 특성화하고, 잘 발현된 변이체의 경우, 이들의 단분산성, 열안정성 및 4차 구조를 특성화하였다(표 6). S2 서브유닛이 융합전에서 융합후로의 이행 동안 대규모 재접힘을 겪는다는 점을 감안하여, S2를 안정화시키는데에 노력을 집중하였다. 각 카테고리의 치환은 융합전 형태를 유지하면서 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 1 & 2a). 전반적으로, 100개의 변이체 중 28개가 S-2P보다 잘 발현되었으며 음성-염색 EM에 의해 평가된 바와 같이 융합전 형태를 유지하였다.
표 6.
a크기-배제 삼량체 피크의 곡선하 면적을 사용하여 정량화함
bSDS-PAGE 밴드 강도를 사용하여 정량화함
단일-치환 스파이크 변이체. 디설파이드 결합의 도입에는 두 가지 치환이 필요하지만, 이들은 이러한 목적을 위한 단일 치환으로 간주된다. 스파이크와 같은 클래스 I 융합 단백질을 안정화시키는 하나의 일반적인 전략은 디설파이드 결합을 통해 구조적 변화를 겪는 영역을 구조적 변화를 겪지 않는 영역에 공유적으로 연결하는 것이다. 예를 들면, Q965C/S1003C 치환은 HR1을 중심 나선에 연결하려고 시도하는 반면 G799C/A924C는 HR1을 상류 나선에 연결하는 것을 목표로 한다. 이러한 두 가지 변이체는 S-2P에 비해 단백질 발현을 각각 3배 및 2배 증가시켰다(도 2b). 그러나, 두 변이체의 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 트레이스는 S-2P에 비해 왼쪽으로 이동을 보였으며, 이는 단백질이 예상보다 크게 실행되고 있음을 나타내며, 이것은 부분적으로 잘못 접힌 스파이크 입자를 보여주는 음성 염색 전자현미경(nsEM) 결과와 잘 일치하였다. 이에 반해, S884C/A893C 및 T791C/A879C 변이체는 S-2P와 유사한 용적으로 SEC에서 용출되었으며 nsEM에 의해 잘 접힌 삼량체 입자로 나타났다(도 2e). 이러한 변이체는 동일한 α-나선을 인접한 프로토머에 대해 패킹하는 두 개의 상이한 가요성 루프에 연결한다(도 1). 특히, S884C/A893C는 S-2P보다 2배 더 높은 발현을 가지며 또한 열안정성을 증가시켰다(도 2f).
선별된 공동-충전 치환 및 염교의 도입은 전반적인 접힘을 방해하지 않으면서 단백질 안정성을 개선해야 한다. 공동 충전은 RSV F 및 HIV-1 Env의 융합전 형태를 안정화시키는데 특히 도움이 되었다15,22. 여기서, 많은 공동-충전 및 염교 설계가 S-2P에 비해 단백질 발현을 개선하는 것으로 밝혀졌다(도 2g). 예를 들면s, L938F 및 T961D는 모두 단백질 수율에서 ~2배 증가하였고, 또한 스파이크의 정확한 4차 구조를 유지하였지만(도 2c & 2e), 시차 주사 형광계(DSF)에 의해 평가된 바와 같은 변이체 둘 다의 열안정성은 S-2P와 동일하게 유지되었다(도 2f).
프롤린 치환을 사용한 이전의 성공은 프롤린이 융합 펩티드(FP), 커넥터 영역(CR) 및 HR1에서 나선의 N-말단 또는 가요성 루프로 치환된 14개의 개별 변이체를 시도하도록 고무시켰다(표 1 및 도 1g). 예상된 바와 같이, 다수의 프롤린 변이체는 단백질 발현을 높이고, 열안정성을 증가시켰다(도 2d & 2f). 가장 성공적인 치환 중 두 가지인 F817P 및 A942P는 S-2P와 대조적으로 단백질 수율이 각각 2.3배 및 4배 증가한 것으로 나타났다. A942P 치환은 용융 온도 (Tm)를 ~3℃ 더 증가시켰으며, 두 변이체 모두 nsEM에 의해 잘 접힌 삼량체로 보였다(도 2e).
다중-치환 스파이크 변이체. 유익한 단일 치환의 잠재적인 부가 또는 상승 효과를 조사하기 위해, 초기 조합("Combo") 변이체를 다음을 고려하여 생성하였다: 치환은 공간에서 서로 근접해서는 안되며, 작제물 당 최대 2개의 디설파이드 결합. 2개의 디설파이드 결합을 함유하는 Combo 변이체는 일반적으로 단일 디설파이드 변이체의 ~50%인 발현 수준을 가졌으며, 이는 2개의 치환이 서로 간섭함을 시사한다(표 2). 단일 프롤린 변이체(F817P)에 하나의 디설파이드(S884C/A893C)를 추가하면 또한 발현 수준이 감소하지만 스파이크의 4차 구조는 잘 유지되었다(표 7). 디설파이드 결합의 유익한 효과는 공동-충전 변이체인 L938F와 조합할 때 가장 두드러졌다. Combo23(S884C, A893C, L938F)은 이의 부모 변이체보다 단백질 수율이 높았지만 Combo23의 Tm은 S884C/A893C에 비해 추가로 증가하지는 않았다. 또한, 2가지 공동-충전 치환을 조합(Combo18)하거나 하나의 공동-충전 치환을 하나의 프롤린 치환과 혼합(Combo20)하면 L938F 단독에 비해 발현이 증가하였다(표 7).
표 7.
가장 현저한 결과는 다중 프롤린 치환의 조합으로부터 나왔다(도 3a). A892P 및 A942P를 함유한 Combo14는 A892P 단독에 비해 단백질 수율이 6.2배 증가하였다(도 3b 및 3c). Combo14에 A899P가 첨가되면, Combo45는 Combo14와 동일한 발현 수준을 갖지만 +1.2℃ Tm을 갖는 것으로 나타났다(도 3c). Combo46은 A892P, A899P 및 F817P의 조합이며, A892P에 비해 단백질 수율이 3.4배 증가하고 Tm이 3.3℃ 상승하였다. 원래 S-2P 외에도, Combo47은 모든 4가지 유익한 프롤린 치환을 함유하며, 이것은 S-2P보다 단백질 발현을 9.8배 높일 뿐만 아니라 Tm의 ~5℃ 증가로 단백질을 안정화시킨다. 가장 중요하게도, 프롤린 치환을 갖는 모든 Combo 변이체는 nsEM에 의해 밝혀진 바와 같이 잘 접힌 삼량체였다(도 3e). Combo47은 총 6개의 프롤린 치환을 포함하므로 HexaPro로 명칭이 변경되었으며 현재까지 최고의 작제물이다.
HexaPro 대규모 발현 및 응력 시험. 잠재적인 백신 항원 또는 진단 시약으로서 HexaPro의 생존력을 평가하기 위해, FreeStyle 293 세포에서의 대규모 생산, ExpiCHO 세포에서의 단백질 발현의 실행 가능성, 에피토프 무결성 및 단백질 안정성을 종합적으로 조사하였다. 2L의 FreeStyle 293 세포로부터 ~12mg의 HexaPro 또는 6mg/L가 생성되었으며, 이는 S-2P에 비해 10배 이상의 개선을 나타낸다. 대규모 HexaPro 제제의 SEC 프로파일은 삼량체의 크기에 상응하는 단분산 피크였다(도 4a). HexaPro의 4차 구조도 잘 유지되었으며, nsEM에 기반하여 S-2P와 구별할 수 없었다(도 4b). 통상적으로, 재조합 단백질의 산업적 생산은 HEK293 세포보다는 CHO 세포에 의존하고, 따라서 ExpiCHO 세포에서 HexaPro의 발현은 일시적인 형질감염을 통해 조사하였다. ExpiCHO 세포는 배양물 40mL 당 1.3mg의 HexaPro 또는 32.5mg/L를 생산하였으며 단백질은 잘 접혔다(도 4c 및 4d). 천연 수용체 인간 ACE2에 대한 HexaPro의 결합 동역학은 또한 각각 13.3nM 및 11.3nM의 친화도로 S-2P의 결합 동역학(도 4f & 4e)에 필적하였다. 중요하게도, HexaPro는 동결-해동의 3 사이클, 실온에서 2일간 배양 또는 55℃에서 30분 후 융합전 형태로 접혀서 유지되었다(도 4g & 4h). 이와 달리, S-2P는 동결-해동의 3주기 후에 응집의 징후를 보였으며, 50C에서 30분 후에 펴지기 시작하였다. 종합적으로, 이러한 데이터는 HexaPro가 최적의 특성을 가지고 있음을 나타내며 SARS-CoV-2 백신 개발을 위한 유망한 후보가 될 수 있음을 시사한다.
SARS-CoV-2 S HexaPro의 Cryo-EM 구조. 안정화 치환이 의도하지 않은 구조적 변화를 일으키지 않는지 확인하기 위해, SARS-CoV-2 S HexaPro의 Cryo-EM 구조를 알아보았다. 단일 그리드로부터, S의 두 가지 별개의 형태에 대한 고해상도 3D 재구성이 수득되었다: 하나는 업 형태로 단일 RBD를 갖고 다른 하나는 업 형태로 두 개의 RBD를 갖는다. 이러한 2-RBD-업 형태는 SARS-CoV-2 S-2P의 이전 구조적 특성화 동안 관찰되지 않았으며 HexaPro에서 S2의 향상된 안정성이 이러한 덜 안정한 중간체를 관찰할 수 있게 한다고 추측하고 싶지만 이 가설을 검증하려면 추가 조사가 필요할 것이다. 관찰된 입자의 대략 3분의 1(30.6%)이 두 개의 RBD 업 형태에 있었으며 3.20Å 재구성으로 이어졌다. 나머지 입자는 1-RBD-업 형태로 포획되었지만, 수용체-접근 가능 RBD의 위치에서 약간의 유연성으로 인해 이 도메인에 대한 명확한 밀도가 결여된 1-RBD-업 입자의 하위세트를 제거하게 되어 3.21Å 재구성으로 이어진 85,675개의 입자의 최종 세트가 생성되었다(도 5a). 1-RBD-업 HexaPro 구조와 이전에 결정된 3.46Å S-2P 구조의 비교가 도 5b에 예시되어 있다. 이러한 재구성의 상대적으로 높은 해상도는 또한 안정화 프롤린 치환을 포함하는 4개의 위치 모두에서 밀도를 관찰할 수 있게 하여, 각 치환이 스파이크 단백질에 적절하게 도입되었고 이러한 치환이 S2 서브유닛의 형태에 해로운 영향을 미치지 않았음을 확인시켜 주었다(도 5c).
C. 논의
융합전-안정화된 클래스 I 바이러스 융합 단백질은, 일반적으로, 더 강력한 중화 항체를 유도하고, 이들의 불안정화된 대응물보다 더 우수한 백신 항원으로서 기능한다15,23. COVID-19 대유행에 대한 예방 대책에 대한 긴급한 요구에 대응하기 위해, 융합잔-안정화된 SARS-CoV-2 S-2P 구조20를 가이드로서 사용하여 발현 또는 안정성을 증가시키기 위한 100개의 단일 치환 변이체를 설계하였다. HIV-1 gp41 또는 RSV F와 같은 S2 서브유닛이 막 융합을 촉진하기 위해 대규모 재접힘을 겪는다는 점을 감안할 때, 노력은 특히 스파이크의 이 부분에 집중되었다. 사용된 전략 중 하나는 디설파이드 결합의 도입이며, 여기서 적어도 하나의 시스테인이 융합전 및 융합후 상태 사이에 형태를 변화시키는 영역에 있다. 이 방법은 HIV-1 Env (SOSIP) 및 RSV F (DS-Cav1)의 경우 성공적이지만23,24, S2에 도입된 디설파이드물은 일반적으로 해로운 영향을 미쳤다. 예를 들면, 서브유닛간 디설파이드물(예를 들어, S659C/S698C)은 단백질 발현을 60% 감소시켰고, Q965C/S1003C 치환은 부분적으로 잘못 접힌 스파이크를 초래하였다(도 2). 프로토머간 디설파이드물은 HIV-1 Env의 삼량체 완전성 및 RSV F의 안정성을 개선하는 것으로 나타났지만25,26, 프로토머간 T961C/S758C 치환은 S-2P에 비해 발현을 절제하였다. 대조적으로, 프로토머 계면에 위치한 가요성 루프를 안정화시키는 것이 유익한 것으로 밝혀지지 않았다. S884C/A893C 및 T791C/A879C 둘 다 열 안정성과 발현을 증가시켜 천연 삼량체 구조를 생성하였다. 가요성 루프를 비교적 단단한 α-나선에 고정하는 것이 프로토머 d어셈블리를 도울 수 있다.
HIV-1 gp120-gp41 계면에 염교를 도입하면 단백질 발현이 증가할 뿐만 아니라 삼량체-특이적 항체의 결합이 향상되며, 이는 천연 4차 구조의 유지가 개선되었음을 시사한다22. 유사한 원리에 기초하여, T961D 치환이 도입되어 인접한 프로토머로부터 Arg765와 정전기적 상호작용을 형성하였다(도 1). 마찬가지로, G769E 치환은 Arg1014와 프로토머간 염교를 형성하기 위한 것이었다. 두 변이체 모두 발현을 증가시켰고, 또한 잘 접힌 삼량체 스파이크와 유사하였다(도 2). 염교 외에도, 단백질이 다시 접힐 수 있도록 느슨하게 채워진 소수성 코어를 채우면 RSV F 및 HIV-1 Env의 이전 공동-충전 치환에 의해 나타낸 바와 같이 융합전 상태를 안정화하는 데 도움이 될 수 있다23,24,27. 여기서, L983F 치환은 HR1, FP 및 β-헤어핀에 의해 부분적으로 형성된 공동을 충전하도록 설계되었다. 이 변이체는 발현이 2배 증가하였으며(도 2) 디설파이드 또는 프롤린 치환과 쌍을 이룰 때 부가 효과를 갖는 것으로 보였다.
발견된 최고의 단일-치환 변이체 중에는 F817P 및 A942P가 있으며, 이들 둘 다는 스파이크의 품질과 양을 실질적으로 개선하였다(도 2). 이들을 A892P 및 A899P 치환과 추가로 조합함으로써, 현재까지 최고의 작제물을 구조인 HexaPro를 생성하였다. 이러한 결과는 HIV-1 Env, RSV F, hMPV F, MERS-CoV S 및 에볼라 GP에 대한 프롤린 치환의 이전의 성공적인 적용을 연상시킨다23,24,28-30. 또한, 융합 펩티드 근처의 소수성 잔기의 용매 접근성은 인플루엔자 HA 줄기-전용 설계에 대한 우려였으며, 유사하게 노출된 Phe817을 Pro로 대체함으로써 이 문제를 여기에서 해결하였다(도 5c). A942P 치환은 커넥터 영역과 HRX 사이의 가요성 루프에 강성을 부과하며, Ebola GP을 안정화하는 데 도움이 되는 것으로 밝혀진 T577P 치환과 유사하다28.
HexaPro cryo-EM 데이터세트에서, SD1을 S2에 더 가깝게 만들어 RBD를 업 위치로 렌더링하는 4개의 소수성 치환을 포함하는 변형된 스파이크로 최근 구조가 결정될 때까지 SARS-CoV-2 스파이크에 대해 이전에 관찰되지 않았던 2-RBD-업 형태의 입자 중 1/3이 관찰되었다32. HexaPro에서의 더 안정한 S2가 S1의 트리거링 및 해리 전에 일시적으로 존재할 수 있는 이러한 상대적으로 불안정한 형태를 포획할 수 있도록 한다는 가설이 세워진다. 이것은 안정한 MERS-CoV S-2P 스파이크의 구조에서 관찰된 것과 유사하며, 여기서는 심지어 3-RBD-up 형태도 관찰될 수 있다30. HexaPro 스파이크는 또한 동결-해동, 실온 보관 및 열 응력 후에도 융합전 상태를 유지할 수 있었으며, 이는 서브유닛 백신 항원으로서 HexaPro 스파이크의 개발을 가능하게 할 것이다. 또한, 재조합 단백질의 산업적 생산은 종종 CHO 세포에서 대규모 발현에 의해 수행된다. 1L의 Expi-CHO 세포로부터 32.5mg의 잘 접힌 HexaPro를 수득하여, 산업적 생산을 위한 실행 가능성을 제공하였다. HexaPro 스파이크는 또한 핵산 분자당 더 많은 항원을 생성하여 DNA 또는 mRNA-기반 백신을 개선시킬 수 있어, 동일한 용량에서 효능을 개선하거나 더 낮은 용량에서 효능을 유지할 수 있다.
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참고문헌
하기 참고문헌은 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 내용을 보충하는 기타 세부사항을 제공하는 범위 내에서 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
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Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
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930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
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965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
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1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
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1055 1060 1065
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1220 1225 1230
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1250 1255 1260
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Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1280 1285
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<211> 1208
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 ectodomain consensus sequence for wild-type and variants
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa is Leu or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa is Leu or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa is Thr or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
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<220>
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<223> Xaa is Gln or Arg
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
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450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Xaa Pro Cys
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485 490 495
Phe Gln Pro Thr Xaa Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
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Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
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Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Xaa Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Xaa Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
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625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu Xaa Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Xaa Thr Asn Ser Xaa Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Xaa Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Xaa Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Xaa Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
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Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Xaa Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Xaa Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
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Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
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Leu Gly Lys Leu Gln Xaa Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
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Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Xaa Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
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Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
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Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
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Leu Ala Ala Xaa Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
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Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
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Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
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Ile Ile Thr Thr Xaa Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
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Gly Lys Tyr Glu Gln
1205
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 26
gtgggagaac tgtgcagccg ttgaa 25
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 27
tcacatgtgg gtggacattt ggcgccggcg cctgcctgca 40
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 28
tgcaggcagg cgccggcgcc aaatgtccac ccacatgtga 40
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 29
aggcttagaa ggatcacaga gaatctggct 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 30
agccagattc tctgtgatcc ttctaagcct 30
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 31
tcagtacacc tgtgccctgc tggct 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 32
agccagcagg gcacaggtgt actga 25
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 33
aagcagatct acaagtgccc acctatcaag 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 34
cttgataggt gggcacttgt agatctgctt 30
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35
tctgccctgc tgtgtggcac catca 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 36
tgatggtgcc acacagcagg gcaga 25
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 37
ctggctaaag ttaaagcagc cgaagtcctt 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 38
aaggacttcg gctgctttaa ctttagccag 30
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 39
aaccagaagc tgatctgtaa ccagttcaat tct 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 40
agaattgaac tggttacaga tcagcttctg gtt 33
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41
cggccagggt gagcttgttg aac 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42
gttcaacaag ctcaccctgg ccg 23
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 43
aggccatctg catgaaaaag gggatctg 28
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44
cagatcccct ttttcatgca gatggcct 28
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45
gatcctcgat agggctccgc ttgc 24
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46
gcaagcggag ccctatcgag gatc 24
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 47
gacaaaaata ccatggaggt gttcgccc 28
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
gggcgaacac ctccatggta tttttgtc 28
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
tcgtcggtcg gcagaggtgg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
ccacctctgc cgaccgacga 20
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
gccgcagaag tcaacgaatt tagactgtcc cagc 34
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
gctgggacag tctaaattcg ttgacttctg cggc 34
<210> 53
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
ggcttctgga gggtccagtg gagacaggat atcgttc 37
<210> 54
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
gaacgatatc ctgtctccac tggaccctcc agaagcc 37
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
cttcggcttc tggagggtcc ggtctagaca ggatatcg 38
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
cgatatcctg tctagaccgg accctccaga agccgaag 38
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
ggacttcggc ttctggaggg ggcagtctag acagg 35
<210> 58
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
cctgtctaga ctgccccctc cagaagccga agtcc 35
<210> 59
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
ggtcttggtc atgctcacgc acaggatctc tgttgtg 37
<210> 60
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
cacaacagag atcctgtgcg tgagcatgac caagacc 37
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
gggcgttctg attcacgcag tcctgcagtt tgccc 35
<210> 62
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
gggcaaactg caggactgcg tgaatcagaa cgccc 35
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 63
cagttacgag tgcgacatcc ctatcggc 28
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 64
ccctgaacac cctggtgaag cagc 24
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 65
ccctgatcag ctgttgggtc acg 23
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
cagcacctcc agggatctgc cc 22
<210> 67
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
ctggttttca tacagcacgt tgcaggtcac gccgattccg ttgaatctat agcacatctg 60
catggcaaag gggatc 76
<210> 68
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 68
gatccccttt gccatgcaga tgtgctatag attcaacgga atcggcgtga cctgcaacgt 60
gctgtatgaa aaccag 76
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 69
gcaggagctc ggcaaatacg agcagggatc 30
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 70
gccagaagtc agatgctcaa ggggc 25
<210> 71
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 71
cttctcgaac tgggggtggg accaggcgct atgatggtgg tgatg 45
<210> 72
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 72
tgataatgac tcgagcgata attcactcct caggtgcagg ctgcc 45
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 73
atgatggtgg tgatggtggt gatggcctgg gc 32
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 74
cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagct 36
<210> 75
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 75
gatccgcccc ctccactacc tcatcacttc tcgaactggg ggtggg 46
<210> 76
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 76
cccaccccca gttcgagaag tgatgaggta gtggaggggg cggatc 46
<210> 77
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
ctcgaactgg gggtgggacc atcatcaatg atggtggtga tggtggtg 48
<210> 78
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
caccaccatc accaccatca ttgatgatgg tcccaccccc agttcgag 48
<210> 79
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
cagggcgctg ggggtagagg agagggagtc ctggatcttg 40
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
tcctctaccc ccagcgccct gggcaaac 28
Claims (73)
- (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인(engineered coronavirus S protein ectodomain)을 포함하고, 서열 번호 1 또는 2의 서열에 대해 하기 치환을 포함하는 조작된 단백질: F817P, A892P, A899P, A942P, K986P, 및 V987P.
- (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90% 동일성(identity)을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함하고,
서열 번호 1 또는 2의 서열에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 하나의 돌연변이가
(1) 조작된 디설파이드 결합;
(2) 공동 충전 치환(cavity filling substitution); 및/또는
(3) 정전기 또는 극성 상호작용을 제공하는 치환을 포함하는 조작된 단백질. - (a) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1208; (b) 서열 번호 1 또는 2의 위치 14-1160; 또는 (c) 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함하고,
서열 번호 1 또는 2의 서열에 대해 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 상기 적어도 하나의 돌연변이가
(i) T724, T752, T778, T961, I1013, H1058, S735, T859, I770, A1015, L727, S1021, Q901, S875, T912, H1088, L1141, V1040, L966, A766, T778, L938, V963, V911, N1108, V705, A893, N703, A672, A694, A1080, I1132, P862, T859, T547, N978, T961, S758, Q762, D1118, S659, S698, R1039, V722, A930, A903, Q913, S974, D979, P728, V951, V736, L858, S884, A893, P807, S875, T791, A879, G799, A924, V826, A899, Q779, F817, L865, T866, A892, A899, T912, A570, V963; T874, S1055, V729, A1022, L894, A713, L828, H1058, L822, A1056, Q965, S1003, A972, Q992, I980, A1078, V1133, H1088, T1120, I870, S1055, T1117, D1139, T1116, Y1138, I896, G885, Q901, F1103, P1112, G889, L1034, E819, S1055, A972, I980, I1081, N1135, E819, Q1054, Q957, I1130, V1040, H1088, V1104, R1000, A944, T724, A944, S730, S730, G769, A893, Q895, K921, L922, N978, A942, G946, S975, A890, S1003에 상응하는 위치에서의 치환; 및/또는
(ii) 위치 829-851, 675-686, 673-684, 1161-1208, 또는 1142-1208에 상응하는 결실; 및/또는
(iii) 아미노산 위치 673-686에 대한 두 개의 아미노산의 치환을 포함하는 조작된 단백질. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, S735C 및 T859C; I770C 및 A1015C; L727C 및 S1021C; V911C 및 N1108C; A672C 및 A694C; A1080C 및 I1132C; S659C 및 S698C; V722C 및 A930C; A903C 및 Q913C; S974C 및 D979C; P728C 및 V951C; V736C 및 L858C; S884C 및 A893C; P807C 및 S875C; T791C 및 A879C; G799C 및 A924C; A570C 및 V963C; T874C 및 S1055C; V729C 및 A1022C; L822C 및 A1056C; Q965C 및 S1003C; A972C 및 Q992C; I980C 및 Q992C; A1078C 및 V1133C; H1088C 및 T1120C; I870C 및 S1055C; T1117C 및 D1139C; T1116C 및 Y1138C; I896C 및 Q901C; G885C 및 Q901C; F1103C 및 P1112C; G889C 및 L1034C; E819C 및 S1055C; A972C 및 I980C; I1081C 및 N1135C; 또는 E819C 및 Q1054C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환(paired cysteine substitution)을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 조작된 단백질.
- 제4항에 있어서, A903C 및 Q913C; S884C 및 A893C; T791C 및 A879C; Q965C 및 S1003C; 또는 T1117C 및 D1139C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 조작된 단백질.
- 제4항에 있어서, S884C 및 A893C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 조작된 단백질.
- 제6항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제7항에 있어서, T791C 및 A879C; 또는 G799C 및 A924C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제5항에 있어서, A903C 및 Q913C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 조작된 단백질.
- 제9항에 있어서, 적어도 하나의 추가의 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제10항에 있어서, Q965C 및 S1003C; S884C 및 A893C; T791C 및 A879C; 또는 G799C 및 A924C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제11항에 있어서, A903C 및 Q913C; 및/또는 Q965C 및 S1003C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T724, I1013, H1058, Q901, S875, H1088, L1141, V1040, T778, L938, V963, R1039, V826, A899, Q779, L894, V1040, V1104, R1000, A944, S730, A890, D1118, 또는 S1003에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제13항에 있어서, T778, L938, V963, 또는 H1088에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제13항에 있어서, T724M, I1013F, H1058W, Q901M, S875F, H1088W, L1141F, V1040F, T778L, L938F, V963L, R1039F, V826L, A899F, Q779M, L894F, H1058F, H1058Y, V1040Y, H1088Y, V1104I, R1000Y, R1000W, A944F, T724I, A944Y, S730L, A890V, D1118F, 또는 S1003V로부터 선택된 공동 충전 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제15항에 있어서, T778L, L938F, V963L, 또는 H1088Y로부터 선택된 공동 충전 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제13항에 있어서, L938에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제17항에 있어서, L938F 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, V963에 상응하는 위치에 공동 충전 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제19항에 있어서, V963L 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, F817P, L865P, T866P, A892P, A899P, T912P, A893P, Q895P, K921P, L922P, N978P, A942P, G946P, 또는 S975P로부터 선택된 프롤린 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제21항에 있어서, F817P, A892P, A899P, 또는 A942P로부터 선택된 프롤린 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제21항에 있어서, 프롤린 치환 F817P를 포함하는 조작된 단백질.
- 제23항에 있어서, 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제24항에 있어서, S884C 및 A893C; 또는 T791C 및 A879C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제25항에 있어서, S884C 및 A893C에 상응하는 위치에 쌍을 이루는 시스테인 치환을 포함하는 조작된 디설파이드 결합을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제21항에 있어서, V987P 및/또는 K986P에 추가의 프롤린 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제21항에 있어서, 프롤린 치환 A892P를 포함하는 조작된 단백질.
- 제28항에 있어서, A942P; A899P; 및/또는 F817P에 추가의 프롤린 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제21항에 있어서, A892P; A942P; A899P; 및/또는 F817P로부터 선택된 적어도 두 개의 프롤린 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제30항에 있어서, A892P; A942P; A899P; 및/또는 F817P로부터 선택된 적어도 세 개의 프롤린 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제31항에 있어서, A892P; A942P; A899P; 및 F817P에 프롤린 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제28항에 있어서, 프롤린 치환 A899P 또는 T912P를 포함하는 조작된 단백질.
- 제28항에 있어서, 프롤린 치환 A892P 및 T912P를 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T752, T912, L966, L828, S730, T961, A766, P862, T859, Q957, 또는 G769에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제35항에 있어서, T961, L966, T859, 또는 G769에 상응하는 위치에 정전기적 상호작용 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제36항에 있어서, T961D 또는 T961E의 정전기적 상호작용 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제38항에 있어서, T961D의 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, L966E 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제35항에 있어서, T752K, T912R, L828K, L828R, S730R, T961D, A766E, P862E, T859K, Q957E, 또는 G769E로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제40항에 있어서, T961D, L966D, T859K, 또는 G769K로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T778, A713, 또는 I1130에 상응하는 위치에 정전기적 또는 극성 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제35항에 있어서, T778Q, A713S, 또는 I1130Y로부터 선택된 정전기적 상호작용 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 위치 F817P에 정전기적 상호작용 치환을 제공하는 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, L984, D985, K986, 및/또는 V987에 상응하는 위치에 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제44항에 있어서, 글리신 또는 프롤린에 대한 L984, D985, K986, 및/또는 V987에 상응하는 위치에 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, K986P 및 V987P 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, A570, T572, F855, 및/또는 N856에 상응하는 위치에 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제48항에 있어서, A570, T572, F855, 및/또는 N856에 상응하는 위치에 공동-충전 치환을 추가로 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합, 적어도 하나의 공동 충전 치환, 적어도 하나의 프롤린 치환, 및 적어도 하나의 정전기적 상호작용 치환의 조합을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1 또는 2의 위치 319-1208에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1 또는 2의 위치 16-1208에 대해 95% 동일성을 갖는 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 코로나바이러스 S 단백질 엑토도메인이 퓨린 절단 부위(furin cleavage site)를 제거하는 돌연변이를 포함하는 조작된 단백질.
- 제53항에 있어서, 퓨린 절단 부위를 제거하는 돌연변이가 위치 682-685에 GSAS 치환을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 삼량체화 도메인(trimerization domain)에 융합 또는 접합되는 조작된 단백질.
- 제55항에 있어서, 단백질이 삼량체화 도메인에 융합되는 조작된 단백질.
- 제55항에 있어서, 삼량체화 도메인이 S 단백질 엑토도메인에 대해 C-말단에 위치되는 조작된 단백질.
- 제56항에 있어서, 삼량체화 도메인이 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 막관통 도메인(transmembrane domain)에 융합 또는 접합되는 조작된 단백질.
- 제59항에 있어서, 단백질이 막관통 도메인에 융합되는 조작된 단백질.
- 제59항에 있어서, 막관통 도메인이 코로나바이러스 스파이크 단백질 막관통 도메인을 포함하는 조작된 단백질.
- 제61항에 있어서, 막관통 도메인이 SARS-CoV-2 막관통 도메인을 포함하는 조작된 단백질.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따르는 적어도 하나의 서브유닛(subunit)을 포함하는 조작된 코로나바이러스 삼량체.
- 제63항에 있어서, 삼량체가 야생형 S 단백질 서브유닛의 삼량체에 비해 융합전 형태(prefusion conformation)에서 안정화되는 조작된 삼량체.
- 제63항에 있어서, 삼량체가 서브유닛 사이에 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합을 포함하는 조작된 삼량체.
- 제65항에 있어서, 서브유닛 사이의 적어도 하나의 조작된 디설파이드 결합이 V705C 및 A983C; T547C 및 N968C; T961C 및 S758C; 및/또는 T961C 및 Q762C로부터 선택되는 조작된 삼량체.
- 약제학적으로 허용되는 담체; 및 (i) 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조작된 단백질, 또는 (ii) 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항의 조작된 삼량체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제67항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조작된 단백질의 아미노산 서열을 암호화(encoding)하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 제69항에 있어서, DNA 발현 벡터를 포함하는 핵산.
- 제69항에 있어서, mRNA를 포함하는 핵산.
- 대상체(subject)에게 제67항 또는 제68항에 따르는 약제학적 조성물 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 따르는 핵산 분자의 유효량을 투여함을 포함하여, 대상체에서 코로나바이러스 감염 또는 코로나바이러스 감염과 관련된 질환을 예방하는 방법.
- 항체에 결합된 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조작된 단백질을 포함하는 조성물.
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