KR102531775B1

KR102531775B1 - Rsv f 항체 또는 이의 항원 결합 단편

Info

Publication number: KR102531775B1
Application number: KR1020220150632A
Authority: KR
Inventors: 최장훈; 이동훈; 류정상
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2023-05-15
Anticipated expiration: 2042-11-11

Abstract

본 발명은 호흡기세포융합바이러스(RSV) F 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이들의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함함으로써 호흡기세포융합바이러스(RSV) F 단백질에 대한 결합력이 우수한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편{Antibodies or fragments thereof binding to RSV F and use thereof}

본 발명은 호흡기세포융합바이러스(RSV) F 단백질에 특이적으로 결합하는 RSV F 항체에 관한 것이다.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 폐렴구균과에 속하는 엔벨로프 바이러스(envelope virus)이다. RSV 게놈은 비구조 단백질 1과 2(NS1과 NS2), 뉴클레오 단백질(N), 포스포 단백질(P), 매트릭스 단백질(M), 소분자 하이드로포빈(SH), 융합 단백질(F), 부착 당단백질(G), large RNA 의존성 RNA 폴리메라아제(L), 항전사 종결 단백질(M2-1) 및 M2-2 단백질이라는 11종의 단백질을 코딩하는 10개의 유전자로 이루어진다. RSV는 소아 급성 하기도 감염 및 입원의 주요 원인이다. 전세계에서 매년 RSV 감염으로 인해 병에 걸리는 5세 미만의 소아는 3380만명이며, 그 중 급성 하기도 감염으로 입원이 필요한 소아는 340만명이다.

한편, 세계적으로 RSV에 대한 백신 개발 연구가 진행 중이지만, 아직까지 승인받은 백신은 없으며, 시판되고 있는 항체치료제(팔리비주맙, Palivizumab)의 경우 그 효과에 대해 논란이 있어 새로운 RSV 백신 및 항체치료제의 보급이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-2450375호

본 발명은 호흡기세포융합바이러스(RSV) F항원을 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 호흡기세포융합바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 호흡기세포융합바이러스 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 호흡기세포융합바이러스 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.

2. 위 1에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.

3. 위 1에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진, RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.

4. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자.

5. 위 1 내지 3 중 어느 하나의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

6. 위 1 내지 3중 어느 하나의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스 검출용 키트.

7. 호흡기세포융합바이러스가 포함된 시료에 청구항 1 내지 3중 어느 하나의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편을 처리하여 RSV 항원-항체복합체를 형성하는 단계; 및 상기 RSV 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 호흡기세포융합바이러스 검출 방법.

8. 위 7에 있어서, 상기 RSV 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 이뤄지는, 호흡기세포융합바이러스 검출 방법.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 신규한 서열의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 RSV F 단백질에 대한 결합력이 우수하다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 호흡기세포융합바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 호흡기세포융합바이러스 검출에 이용될 수 있다.

도 1은 마우스에 불활화 RSV를 투여한 후 면역화 여부를 확인하기 위한 항혈청 분석결과를 나타낸다.
도 2는 일 실시예에 따른 본 발명 RSV F 항체(8E9)의 정제 결과를 나타낸다. 빨간색 상자: 중쇄 가변 영역 밴드, 노란색 상자: 경쇄 가변 영역 밴드.
도 3은 재조합 RSV F단백질에 대한 마우스 항체의 결합력 확인결과를 나타낸다.
도 4는 웨스턴블랏을 이용한 RSV F 단백질에 대한 항체 결합력 분석결과를 나타낸다.

본 발명은 호흡기세포융합바이러스(RSV)의 F 단백질(fusion protein, 융합단백질)에 특이적으로 결합하는 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명에서 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 호흡기세포융합바이러스(RSV)의 F 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다.

항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA2 등) 또는 하위클래스의 것일 수 있다.

항원 결합 단편에는 (i) VH, VL, CH1 및 CL 도메인으로 이루어진 1가(monovalent) 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가(bivalent) 단편인 F(ab')₂ 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iv) 항체의 하나의 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어져 있는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성되는 단일 도메인 또는 dAb 단편; (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결된 2개 이상의 분리된 CDR의 조합이 포함된다.

또한, Fv 단편의 VL 도메인 및 VH 도메인은 분리된 유전자에 의해 암호화되지만 이들은 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이룸으로써 1가 분자를 갖는 단일 단백질 사슬[단일 사슬 Fv(scFv) 또는 단일 사슬 항체라 불림]을 생성할 수 있도록 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체(scFv) 또한 항원 결합 단편에 포함된다.

항원 결합 단편은 당해 분야에 공지된 기존의 기술을 사용하여 수득되며, 단편의 기능적 스크리닝은 온전한(intact) 항체와 동일한 방식으로 사용된다. 항원 결합 부위는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 파괴에 의해 생산될 수 있다. 항체는 상이한 표현형, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체로 존재할 수 있다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 중쇄 가변 영역은 서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)을 포함한다.

본 발명의 경쇄 가변 영역은 서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)을 포함한다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편은 위와 같은 상보성 결정영역을 포함하기만 하면 프레임워크 서열에 무관하게 RSV F 단백질에 특이적으로 결합한다.

서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR)이 포함된 본 발명의 중쇄 가변 영역은 예컨대, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR)이 포함된 본 발명의 경쇄 가변 영역은 예컨대, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명은 전술한 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자는 발현 벡터에 포함될 수 있다. 발현 벡터는 프로모터, 프로모터와 작동 가능하게 연결된 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편 유전자, 제한효소 절단자리 등을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 벡터 또는 리포좀 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물 등의 진핵 세포일 수 있으며, 예컨대 NS0 세포, Vero 세포, Hela 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포, MDCKII 세포, Sf9 세포 등일 수 있다.

본 발명의 숙주 세포는 원핵 세포일 수 있으며, 예컨대 대장균, 고초균 등일 수 있다.

본 발명은 전술한 숙주 세포를 배양하여 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고 배양 온도, 배양 시간 및 배지 종류 및 pH 등의 조건은 세포의 종류 등에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법은 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리, 정제하여 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 회수를 위해 여과, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, HPLC 등의 방법이 있다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 RSV 면역화 마우스의 B세포와 미엘로마 (myeloma) 세포를 융합시킨 하이브리도마 세포주로부터 제조될 수 있다.

본 발명은 전술한 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 호흡기세포융합바이러스(RSV)의 F 단백질에 함으로써 호흡기세포융합바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며 담체와 함께 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.

액상 조성물의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함한다. 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 제형에 있어 제한이 없다. 예컨대 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 보다 구체적으로 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 근육내, 피하 및 정맥 내 투여를 포함한다. 또한 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 있다. 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 유효성분의 효능 정도에 따라 달라질 수 있다.

일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC₅₀을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1 kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분의 용해성 및 흡수성을 유지 내지 증가시키는 성분을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명은 전술한 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스(RSV) 검출용 키트를 제공한다.

용어 “검출”은 특정 물질에 대한 선택적 반응을 통해 상기 특정 물질의 존재를 확인하는 모든 행위(예를 들면, 형광 변화, 흡광 변화 등)를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대 호흡기세포융합바이러스(RSV)가 포함되어 있는 것으로 의심되는 시료로부터 RSV의 존재 여부를 확인하고 동정하는 것일 수 있다.

용어 "시료"는 "생물학적 시료" 및 "비생물학적 시료"를 포함한다. "생물학적 시료"는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변, 땀 등을 포함한다. "비생물학적 시료"는 흙, 물, 공기, 음식 등의 환경시료를 포함한다.

구체적으로, "검출"은 여러 가지 표지물질을 사용하여 본 발명의 키트에서의 항원-항체 복합체의 존재 여부를 확인하는 것을 의미한다. 상기 "항원-항체 복합체"는 시료로부터 RSV의 존재 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 RSV F 단백질과 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 쌍과의 결합물을 의미한다. 또한, 호흡기세포융합바이러스 자체와 본 발명의 항체 쌍과의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 형성여부는 예컨대 비색법(Colorimetric method), 전기화학법(Electrochemical method), 형광법(Fluorometric method), 발광법 (Luminometry), 입자계수법(Particle counting method), 흡광법(Absorbance measurement), 분광법 (Spectrometric method), 라만분광법(Raman spectroscopic method), 표면플라즈몬공명법(Surface Plasmon Resonance method), 육안측정법(Visual assessment), 및 섬광계수법(Scintillation counting method)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 확인될 수 있다.

항원-항체 복합체 검출은 공지된 다양한 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 포함한다. 예컨대 직접 ELISA, 간접 ELISA, 이중항원 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA를 포함하는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 및 RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예컨대 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

각 면역분석방법의 필요에 따라 공지된 적절한 시약 또는 물질들을 이용할 수 있다. 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다.

본 발명은 호흡기세포융합바이러스가 포함된 시료에 전술한 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하여 RSV 항원-항체복합체를 형성하는 단계; 및 상기 RSV 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 호흡기세포융합바이러스 검출 방법을 제공한다.

항원-항체 복합체 검출은 앞서 설명한 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 방사상면역분석, 웨스턴 블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 이뤄질 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

실시예

1. 실험동물(마우스) 항혈청 분석

불활화 호흡기세포융합바이러스(RSV) (1x10⁶ TCID₅₀/ml)를 2주 간격으로 실험동물(마우스, Balb/c 8주령)에 3회 처리하여 면역화를 진행하였다. 면역화가 끝난 후 두 마리의 마우스(mouse_1 및 mouse_2)를 채혈하여 모세관채혈튜브에 모아 4℃, 6000rpm으로 5분 원심분리하여 면역화된 마우스의 혈청을 확보하였다.

RSV F 특이 마우스 항체가 형성되었는지 ELISA 방법으로 항혈청 분석을 수행하였다. ELISA 코팅 용액(BupH carbonate-bicarbonate buffer)과 RSV F 단백질(항원단백질, 0.5 ㎍/ml)을 섞은 후 ELISA 96 wells 플레이트(넝크 임뮤노 플레이트(Nunc-Immuno Plate))에 넣어준 후, 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시켜 항원단백질을 플레이트에 코팅하였다. 실험 전, 항원단백질을 코팅한 플레이트를 PBST로 3회 세척 후, 5% skim milk/PBS로 5시간 동안 블로킹을 진행하였다.

블로킹 용액을 제거한 후 1:100부터 1:500,000 비율로 5% skim milk에 희석된 마우스 혈청을 플레이트(100 ul/well)에 넣어주었다. 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG-HRP)를 5% skim milk에 1:1000비율로 희석한 후 플레이트(100 ul/well)에 넣어준 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 용액을 버린 후 PBST로 7회 세척하였다.

ELISA 반응 substrate인 OPD(O-Phenylenediamine dihydrochloride)를 substrate 버퍼 용액(Phosphate-citrate buffer with sodium perborate, 1 capsule/100 ml DW) 20ml에 OPD tablet 1개를 넣어 OPD 용액을 만들었다. 제조된 OPD 용액을 플레이트(100 ul/well)에 분주하였다. 상온에서 10분 동안 발색 반응을 확인한 뒤, 0.5M sulfuric acid를 플레이트(100 ul/well)에 넣어서 발색반응을 중지시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490nm 흡광도를 측정하여 항혈청에서 RSV F 특이 항체가 생성되었는지 확인하였다.

두 마리의 마우스 모두(mouse_1 및 mouse_2)에서 항혈청 1:10000 희석 샘플에서 흡광도 0.15 이상으로 측정되어 마우스의 면역화가 이뤄진 것을 확인하였다(도 1 및 표 1).

표 1은 혈청 농도에 따른 항혈청분석 결과를 나타낸 것이다.

구분	항혈청 희석샘플	RSV F 단백질 처리(0.5ug/ml)
구분	항혈청 희석샘플	마우스 1(mouse_1)	마우스 2(mouse_2)
OD 값	1:100	3.243	3.222
	1:1,000	1.072	0.932
	1:5,000	0.283	0.248
	1:10,000	0.185	0.150
	1:50,000	0.079	0.071
	1:100,000	0.064	0.066
	1:500,000	0.061	0.057
	Blank	0.054	0.056
*Blank는 RSV F 단백질(항원)을 코팅하지 않은 웰에 항혈청을 처리한 음성대조군

2. RSV F 항체 생산 하이브리도마(Hybridoma) 제작 및 항체 정제

위와 같이 마우스 항혈청 분석에서 RSV 바이러스에 대한 면역화가 잘 이루어진 것을 확인한 후 마우스 B세포를 분리하여 하이브리도마를 제작하였다. RSV 면역화 마우스의 림프절에서 면역세포를 수집하여 10% FBS를 첨가한 Hybrodoma-SFM(gibco)으로 면역세포를 배양하였다. 그 다음, 하이브리도마를 제작하기 위해 Hybrodoma-SFM에서 골수종 세포(X63-Ag8.653)를 준비하였다. 면역세포와 골수종 세포를 각각 세포 수를 계산하여 섞어준 후 Hybrodoma-SFM 배지로 1회 세척해주었다. 3x10⁸개의 섞어준 세포당 1.5ml 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 천천히 넣어주었다. 37℃에서 1분 반응시킨 후에 1 ml Hybrodoma-SFM 배지를 넣어주고, 다시 37℃에서 1분 반응시킨 후 3 ml Hybrodoma-SFM 배지를 넣어주었다. 마지막으로 37℃에서 1분 반응시킨 후 16 ml Hybrodoma-SFM 배지를 넣어 최종적 20 ml Hybrodoma-SFM 배지가 되도록 하였다. 반응이 끝난 세포를 300g에서 5분간 원심분리를 한 후, 25 ml Hybrodoma-SFM 배지로 재현탁시켜 세포 분주를 준비하였다. 200 ml HAT(Hypoxathine, Aminopterin, Thymidine)가 함유된 Hybrodoma-SFM 배지에 융합된 세포 25 ml을 넣고 잘 섞어 주었다. 융합된 세포 수를 계산하여 96 wells 세포배양 플레이트에 세포가 1개가 들어갈 수 있도록 계산하여 세포를 분주하였다. 인큐베이터에서 계속 배양하여 세포가 살아있는 웰을 확인하고, 하이브리도마가 생성한 항체를 확인하기 위해 배지를 이용하여 ELISA를 진행하였다.

RSV F 단백질(항원단백질, 0.5 ㎍/ml)로 코팅된 ELISA 96 wells 플레이트에 배지를 넣어 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG-HRP)를 5% skim milk/PBS에 1:1000비율로 희석한 후 플레이트(100 ul/well)에 넣어준 후 상온에서 1시간 반응시킨 후 PBST로 7회 세척하였다.

HRP substrate인 OPD의 발색반응을 이용하여 RSV F 단백질에 대한 결합력은 확인하였다. Substrate 버퍼 용액 20 ml에 OPD tablet 1개를 넣어 OPD 용액을 만들었다. 제조된 OPD 용액을 플레이트(100 ul/well)에 분주하였다. 상온에서 10분 동안 발색 반응을 확인한 뒤, 0.5M sulfuric acid를 플레이트(100 ul/well)에 넣어서 발색반응을 중지시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490nm 흡광도를 측정하였다.

하이브리도마 세포주를 배양한 후 세포 스톡을 만들기 전 ELISA를 이용하여 항체 생성 유무를 확인하였다. 1차 항체 선별 결과, 총 9개의 하이브리도마 세포주를 확보하였다.

9개의 하이브리도마 세포주에서 생산한 항체를 정제하기 위해 Protein G 크로마토그래피 방법(Pierce?? Chromatography Cartridges Protein G, Thermo)을 사용하였다. Protein G 컬럼 카트리지과 모든 버퍼를 상온에서 평형(equilibrate)을 유지시킨 후 버퍼를 채워 항체 정제를 준비하였다. Protein G 컬럼은 바인딩 버퍼(Protein G IgG Binding Buffer, Thermo)를 1 ml/분의 유속으로 흘려주었다. 항체를 포함한 배지와 바인딩 버퍼를 1:1 비율로 희석하여 준비가 끝난 Protein G 컬럼에 넣어서 1~2 ml/분의 유속으로 흘려주었다. 그 다음 컬럼의 5~10배 양의 바인딩 버퍼를 넣어서 세척을 진행하였다. 세척이 끝난 Protein G 컬럼에 그 양의 2배의 Elution 버퍼(Pierce IgG Elution Buffer, Thermo)를 넣어서 항체를 수집하였다. 수집이 끝난 항체 1 ml당 100 ul의 중화 버퍼(High ionic strength alkaline buffer/1M Tris at pH 7.5)를 넣어서 수집된 항체를 pH를 바로 조정하였다. 수집된 항체 샘플을 SDS-PAGE로 분리한 뒤 Coomassie blue 염색(InstantBlue Coomassie protein stain, Abcam)을 이용하여 상온에서 15분 동안 반응시킨 후 정제가 잘된 것을 확인하고, 버퍼를 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, protease inhibitor)가 포함된 PBS로 교체하기 위해 투석(Slide-A-Lyzer?? Dialysis Cassettes)을 진행하였다. 정제 후 1개의 마우스 RSV F 특이 항체(8E9)가 RSV F 항원에 대한 결합력이 우수한 것을 확인하였다(도 2 및 표 2).

구분	항체 종류	농도
본 발명의 항체 (8E9)	IgG1, kappa	2.488 mg/ml

3. 정제한 RSV F 항체를 이용하여 RSV F 단백질 결합력 확인

확보한 본 발명 항체(8E9)의 RSV F단백질에 대한 결합력을 분석하였다. ELISA 코팅 용액(BupH carbonate-bicarbonate buffer)과 RSV F 단백질(sino bio, #11049-V08B)을 섞어준 후 ELISA 플레이트(넝크 임뮤노 플레이트(Nunc-Immuno Plate)에 500 ng/well로 분주하였다. 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시켜 RSV F 단백질을 플레이트에 코팅하였다. 실험 전, 항원단백질을 코팅한 플레이트를 PBST로 3회 세척 후, 5% skim milk/PBS로 5시간 동안 블로킹을 진행하였다. 항체의 결합력을 확인하기 위해 본 발명의 RSV F 특이 항체(8E9)와 팔리비주맙을 RSV F 단백질이 코팅된 플레이트에 분주하여 최종 농도가 0, 0.01, 0.1, 1 ㎍/ml 되도록 하였다. 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG-HRP)를 5% skim milk/PBS에 1:1000비율로 희석한 후 플레이트(100 ul/well)에 넣어준 후 상온에서 1시간 반응시킨 후 PBST로 7회 세척하였다.

HRP substrate인 OPD(O-Phenylenediamine dihydrochloride)의 발색반응을 이용하여 RSV F 단백질에 대한 결합력은 확인하였다. Substrate 버퍼 용액(Phosphate-citrate buffer with sodium perborate, 1 capsule/100ml DW) 20ml에 OPD tablet 1개를 넣어 OPD 용액을 만들었다. 제조된 OPD 용액을 플레이트(100 ul/well)에 분주하다. 상온에서 10분 동안 발색 반응을 확인한 뒤, 0.5M sulfuric acid를 플레이트(100 ul/well)에 넣어서 발색반응을 중지시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490nm 흡광도를 측정하였다.

ELISA를 이용하여 본 발명 항체의 RSV F 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과, 제작한 마우스 RSV F 항체(8E9)의 RSV F 단백질에 대한 결합력은 시판중인 팔리비주맙과 유사함을 확인하였다(도 3).

웨스턴 블랏을 이용하여 확보한 RSV F 항체(8E9)의 RSV F 단백질에 대한 결합력을 추가적으로 분석하였다. 전체 바이러스 샘플과 RSV F 단백질 샘플은 5X sample buffer와 섞어준 후 가열한 뒤 SDS-PAGE(NuPAGE®, 4-12% Bis-Tris protein gels, MES SDS running buffer, Invitrogen)로 단백질을 크기 별로 분리하였다.

SDS-PAGE로 분리된 단백질은 Semi-dry-blot(iBOT®2 PVDF regular stocks)을 이용하여 폴리비닐리덴 플로오라이드 (PVDF) 멤브레인으로 이동되었다. 멤브레인은 10ml 블로킹용액(5% skim milk/TBST)에 상온에서 한시간 반응하였다. 이후, 본 발명에서 제작한 항체(8E9)와 팔리비주맙을 5% skim milk/TBST에 1:1000비율로 희석하여 멤브레인과 4℃에서 오버나잇(overnight)으로 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후, 멤브레인은 10ml TBS/Tween에서 3회 세척되었다. 멤브레인은 홀스래디쉬 과산화효소가 결합된 2차 항체(항-생쥐 항체, anti-mouse conjugated IgG, 1: 10000 in blocking buffer)로 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS/Tween에서 3회 세척 후 멤브레인을 화학발광 검출 시약(ECL plus western blotting detection reagent, Thermo)으로 5분간 인큐베이션 후 본 발명의 항체(8E9)와 팔리비주맙의 RSV F 단백질에 대한 결합력을 분석하였다.

RSV 바이러스 샘플(lane 1)과 RSV F 재조합 단백질 샘플(lane 2)에서 RSV F 단백질 밴드를 확인하였다. 인간화 항체인 팔리비주맙을 처리한 Lane 2에서 RSV F 단백질 밴드 외에 여러 밴드가 확인되었으며, 이를 통해 팔리비주맙은 RSV F에 대한 결합력은 좋으나 비특이 반응을 나타냄을 알 수 있었다. 이에 반해, 본 발명의 RSV F 항체(8E9)는 RSV F 단백질과의 결합력이 우수하면서, RSV F 단백질에만 특이적으로 결합함을 알 수 있었다(도 4).

4 RSV F 항체(8E9)의 CDR 서열 분석

하이브리도마에서 얻어진 RNA를 이용하여 cDNA 제작하였다. 그 후 8E9 단클론항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 분석하기 위해서 IMGT 분석을 수행하였다. 이를 통해 서열번호 1 내지 3의 중쇄 상보성 결정 영역 아미노산 서열, 그리고 서열번호 4 내지 6의 경쇄 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 확인하였다.

서열번호	명칭	아미노산서열
1	중쇄 CDR1	GFSLTSYG
2	중쇄 CDR2	WRGGST
3	중쇄 CDR3	AKKRNDYDLGWFAY
4	경쇄 CDR1	KSVSTSGYSY
5	경쇄 CDR2	LAS
6	경쇄 CDR3	QHSRELPYT
7	중쇄가변영역	EVQLEESGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGEGLEWLGVIWRGGSTDYNTAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQGDDTAIYYCAKKRNDYDLGWFAYWGQGTLVTVSA
8	경쇄가병영역	DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCWASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPYTFGGGTKLEIK

Claims

서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 4의 CDR1, 아미노산 서열이 LAS인 CDR2 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.
청구항 1에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진, RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.
청구항 1에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진, RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 유전자.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 RSV F 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1 내지 3중 어느 한 항의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편을 포함하는 호흡기세포융합바이러스 검출용 키트.
호흡기세포융합바이러스가 포함된 시료에 청구항 1 내지 3중 어느 한 항의 RSV F 항체 또는 이의 항원결합 단편을 처리하여 RSV 항원-항체복합체를 형성하는 단계; 및 상기 RSV 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 호흡기세포융합바이러스 검출 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 RSV 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 이뤄지는, 호흡기세포융합바이러스 검출 방법.