JP2022023814A - 組換え生産された三量体型のｒｓｖタンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、組換え生産された三量体型のＲＳＶ Ｆタンパク質の精製方法に関する。
【解決手段】本発明によれば、方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーステップ、ｃＨＡクロマトグラフィーステップ、およびＨＩＣステップを順次含む。本発明はまた、このような方法によって精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質を含む医薬製品も対象とする。
【選択図】図１

Description

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に出願され、電子的に提出される．ｔｘｔフォーマットの配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２１年７月１日に作成され、サイズが１，２７５ＫＢである「ＰＣ０７２６５１Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称が付けられた配列表が収められている。この．ｔｘｔファイルに収められた配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本文書に援用される。

技術分野
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンの製造方法、より詳細には、組換え生産された三量体型のＲＳＶ Ｆタンパク質の精製方法に関する。

治療または予防の目的のために使用されるものなどの組換えタンパク質は、遺伝子改変された宿主細胞において生産され、バイオリアクターから収穫され、次いで、最終生産物の純度が高度になるように設計された制御された多段階工程において精製される。

ＷＯ２０１７／１０９６２９から公知の、そのようなＲＳＶ Ｆタンパク質の生産に使用される細胞培養法によって生じるのは、通常、
－三量体型であり、反応型である当該タンパク質であり、こうしたタンパク質は、融合前の特異的抗体を結合し、高レベルの中和抗体を誘導するという結果を生じる。この型では、タンパク質は、球状の融合前コンフォメーションをとる。
－三量体型であるが非反応性であるタンパク質であり、こうしたタンパク質は、融合前特異的抗体を結合せず、高レベルの中和抗体を誘導しないという結果を生じる。この型では、タンパク質は、細長いコンフォメーションをとり、融合前コンフォメーションをとらない。
－アミノ酸のグリコシル化を免れている、またはプロテアーゼ（たとえば、トリプシン）部位における不完全な切断を含むプロトマーに相当する、部分的にプロセシングされたタンパク質である。

このようなＲＳＶタンパク質に適する精製方法は、バイオリアクターからの細胞培養液の最初の清澄化、引き続いて、第１の限外濾過ステップを含むことになる。次いで、生産物は、複数のクロマトグラフィーステップ、次いで、ウイルス濾過ステップおよび第２の限外濾過ステップに順次かけられる。

クロマトグラフィーステップについては、種々の技術が利用可能である。このようなタンパク質に適することがわかっているクロマトグラフィーの序列は、通常、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーステップ、炭酸含有ヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーステップ、および陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップからなる。

こうした序列は、治療用タンパク質の生産に使用される宿主細胞によって発現されたタンパク質である残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを最小限に抑えるのに特に適していた。規制の観点からは、すべてのバイオ医薬製品について、定められた許容ＨＣＰレベルにならなくてもよいのではあるが、個々の場合に応じて、関連する安全性リスクおよび有効性に対するマイナスの影響を最小限に抑えるために、ＨＣＰのレベルを最小限に抑えることが必要である。

しかし、このようなクロマトグラフィーステップを含んだ精製方法は、（１０％未満という）低い生産物全収率を伴い、非反応性三量体タンパク質を減らす効率が不十分であることがわかっている。

したがって、収率がより高く、非反応性種のレベルを下げることについて効率がより高く、ＨＣＰおよび他の不純物の排除にマイナスの影響を及ぼさない、改良された精製方法が求められていた。

ＷＯ２０１７／１０９６２９ ＷＯ２０１４／１６０４６３

本発明者らは、特に、陽イオン交換クロマトグラフィーステップによって、かなりの反応性三量体（ＲＴ）画分が非反応性三量体（ＮＲＴ）に変換されていたことを見出した。したがって、これが生産物全収率に影響を及ぼしていた。

前述の問題に対処する精製方法について以下に記載する。

本発明の第１の態様によれば、組換え生産された三量体型のＲＳＶ Ｆタンパク質の精製方法は、（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーステップ、（ｂ）ｃＨＡクロマトグラフィーステップ、および（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップを順次含む。

このように定められた、陽イオン交換クロマトグラフィーを含まない方法では、全生産物収率が５～１０％から２０％～４０％に増大し、非反応性三量体種の排除が強化される。本発明の方法によって精製されるタンパク質の安定性および生物活性は、公知の方法に比べて、マイナスの影響を受けない。

本発明の好ましい実施形態によれば、
－陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、結合および溶出モードで実施され、
（ａ．１）ＲＳＶ Ｆタンパク質を含むローディング溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー媒質と接触させ、その結果、ＲＳＶ Ｆタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィー媒質に結合させるステップと、
（ａ．２）陰イオン交換クロマトグラフィー媒質を、少なくとも１種の、ｐＨが３．０～６．５の間であるより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄するステップと、
（ａ．３）陰イオン交換クロマトグラフィー媒質からＲＳＶ Ｆタンパク質を溶出させ、それによって、陰イオン交換溶出プールを得るステップと
を含み、
－ローディング溶液のｐＨは、７．０～８．５の間、好ましくは、約７．５であり、
－前記より低いｐＨ洗浄溶液のｐＨは、４．０～６．０の間、好ましくは、４．５～５．５の間、好ましくは、約５．０であり、
－前記より低いｐＨ洗浄溶液は、５６ｍＭ～８４ｍＭの間、好ましくは、６３ｍＭ～７７ｍＭの間、好ましくは、約７０ｍＭの濃度の酢酸塩を含み、
－陰イオン交換クロマトグラフィー媒質をより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄する前に、陰イオン交換クロマトグラフィー媒質は、少なくとも、ｐＨが７．０～８．０の間、好ましくは約７．５である第１のより高いｐＨの洗浄溶液で洗浄され、
－前記第１のより高いｐＨの洗浄溶液は、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のトリスを含み、
－前記第１のより高いｐＨの洗浄溶液は、４５ｍＭ～５５ｍＭの間、好ましくは、約５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、
－陰イオン交換クロマトグラフィー媒質をより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄した後、かつＲＳＶ Ｆタンパク質を溶出させる前に、陰イオン交換クロマトグラフィー媒質は、少なくとも、ｐＨが７．０～８．０の間、好ましくは約７．５である第２のより高いｐＨの洗浄溶液でさらに洗浄され、
－前記第２のより高いｐＨの洗浄溶液は、４５ｍＭ～５５ｍＭの間、好ましくは、約５０ｍＭの濃度のトリスを含み、
－前記第２のより高いｐＨの洗浄溶液は、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、７．０～８．０の間、好ましくは、約７．５のｐＨを有する溶出溶液で溶出され、
－前記溶出溶液は、１４６ｍＭ～１８０ｍＭの間、好ましくは、約１６３ｍＭの濃度のＮａＣｌを含み、
－前記溶出溶液は、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のトリスを含み、
－ｃＨＡクロマトグラフィーステップは、フロースルーモードで実施され、
（ｂ．１）陰イオン交換溶出プールにリン酸塩を加え、それによって、コンディショニングされたｃＨＡローディング溶液を得るステップと、
（ｂ．２）ＲＳＶ Ｆタンパク質および不純物を含む、前記コンディショニングされたｃＨＡローディング溶液をｃＨＡ媒質と接触させ、その結果、不純物が媒質に結合し、ＲＳＶ Ｆタンパク質は媒質中を流れる、ステップと、
（ｂ．３）ｃＨＡクロマトグラフィー媒質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるｃＨＡ洗浄溶液で洗浄するステップと、
（ｂ．４）ＲＳＶ Ｆタンパク質をフロースループールに集めるステップと
を含み、
－ｃＨＡ洗浄溶液は、約２０ｍＭの濃度のトリス、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、および約１３ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含み、
－ＨＩＣステップは、結合および溶出モードで実施され、
（ｃ．１）ｃＨＡクロマトグラフィーステップからのフロースループールにリン酸塩を加え、それによって、コンディショニングされたＨＩＣローディング溶液を得るステップと、
（ｃ．２）ＲＳＶ Ｆタンパク質を含む、前記コンディショニングされたＨＩＣローディング溶液をＨＩＣ媒質と接触させ、その結果、ＲＳＶ Ｆタンパク質をＨＩＣ媒質に結合させるステップと、
（ｃ．３）ＨＩＣ媒質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるＨＩＣ洗浄溶液で洗浄するステップと、
（ｃ．４）ＨＩＣ媒質から、ＲＳＶ Ｆタンパク質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるＨＩＣ溶出溶液で溶出させるステップと
を含み、
－ＨＩＣ洗浄溶液は、約１．１Ｍの濃度のリン酸カリウムを含み、
－ＨＩＣ溶出溶液は、約４４８ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含み、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶサブグループＡからのタンパク質であり、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶサブグループＢからのタンパク質であり、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションの状態であり、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、１つまたは複数の導入突然変異を含んでいる、いずれかのＲＳＶサブグループについての野生型Ｆタンパク質の突然変異体であり、
－ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、融合前コンフォメーションの状態で安定化され、
－ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、抗体Ｄ２５またはＡＭ１４に特異的に結合し、
－ＲＳＶ Ｆタンパク質は、注射用医薬製品として使用されるように製剤化される。

本発明のさらなる態様では、本発明の第１の態様に従う方法によって精製されたＲＳＶタンパク質を含む医薬製品が提供される。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶ Ｆタンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶサブグループＡからのＲＳＶ Ｆタンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶサブグループＢからのＲＳＶ Ｆタンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、融合前コンフォメーションの状態のＲＳＶ Ｆタンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、融合前コンフォメーションの状態で安定化されたＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質である。

一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、三量体型のＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質である。

好ましい一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、三量体型であり、融合前コンフォメーションの状態で安定化されている、ＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質である。

最も好ましい一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、三量体型のＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質であって、前記Ｆ突然変異体タンパク質のＦ１ポリペプチドのＣ末端に連結された三量体形成ドメインを含み、融合前コンフォメーションの状態で安定化されているＲＳＶ Ｆ突然変異体タンパク質である。

特定の一実施形態では、前記三量体形成ドメインは、Ｔ４フィブリチンフォルドンドメインである。

特定の一実施形態では、前記Ｔ４フィブリチンフォルドンドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４０）を有する。

好ましい一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、抗体Ｄ２５および／またはＡＭ１４に特異的に結合するＲＳＶ Ｆ突然変異体である。

本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、抗体Ｄ２５およびＡＭ１４に特異的に結合するＲＳＶ Ｆ突然変異体であることが好ましい。

異なるＲＳＶサブタイプからの多数の未変性ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列、およびそのようなタンパク質をコードする核酸配列が、当業界で公知である。たとえば、いくつかのサブタイプＡ、Ｂ、およびウシＲＳＶ Ｆ０前駆体タンパク質の配列が、ＷＯ２０１７／１０９６２９、配列番号１、２、４、６、および８１～２７０に示されており、これらの配列を、本文書と共に提出される配列表に明記している。本明細書における配列番号への言及は、ＷＯ２０１７／１０９６２９における配列番号に対するものであり、その配列番号は、本明細書の一部として提出される．ｔｘｔファイルに収められた配列表に含まれており、その配列表は、その全体が参照により本文書に援用される。

未変性ＲＳＶ Ｆタンパク質は、すべてのＲＳＶサブタイプにわたる顕著な配列保存を示す。たとえば、Ｆ０前駆体分子全域において、ＲＳＶサブタイプＡとＢは、配列同一性が９０％であり、ＲＳＶサブタイプＡおよびＢはそれぞれ、ウシＲＳＶ Ｆタンパク質との配列同一性が８１％である。Ｆ０配列同一性は、ＲＳＶサブタイプ内ではいっそう高く、ＲＳＶ Ａ、Ｂ、およびウシそれぞれのサブタイプ内で、ＲＳＶ Ｆ０前駆体タンパク質は、約９８％の配列同一性を有する。特定されたＲＳＶ Ｆ０前駆体配列はほぼすべて、長さが５７４アミノ酸からなり、通常はＣ末端細胞質側末端の長さによる、長さの違いは軽微である。種々の未変性ＲＳＶ Ｆタンパク質すべてにわたる配列同一性が、当業界で公知である（たとえば、ＷＯ２０１４／１６０４６３を参照されたい）。Ｆタンパク質の配列保存のレベルについてさらに例証するために、代表的なＲＳＶ Ａ株およびＲＳＶ Ｂ株からのＦ０前駆体ポリペプチド配列における非コンセンサスアミノ酸残基が、それぞれ、ＷＯ２０１４／１６０４６３のＴａｂｌｅ１７および１８に示されている（非コンセンサスアミノ酸は、ＲＳＶ Ａ株からの選択されたＦタンパク質配列を、ＣｌｕｓｔａｌＸ（ｖ．２）を用いて整列化した後に特定された）。

一部の詳細な実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、ＷＯ２０１７／１０９６２９において「改変ジスルフィド結合突然変異」と呼ばれる一対のシスチン突然変異を含むＲＳＶ Ｆ突然変異体であり、この突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ１および４～６に示されている例示的な突然変異体のいずれかにあるものと同じ導入突然変異を含む。ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ１および４～６に示されている例示的なＲＳＶ Ｆ突然変異体は、１０２、３７９、および４４７位に３つの自然発生置換を有する、ＲＳＶ Ａ２株の同じ未変性Ｆ０配列（配列番号３）を主体としている。突然変異体のそれぞれにおける同じ導入突然変異を、他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列に生じさせると、配列番号１、２、４、６、および８１～２７０のいずれかに明記される未変性Ｆ０ポリペプチド配列などの、異なるＲＳＶ Ｆ突然変異体に到達しうる。他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列を主体とし、改変ジスルフィド突然変異のいずれかを含むＲＳＶ Ｆ突然変異体も、本発明の範囲内にある。一部の特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、Ｓ５５ＣとＬ１８８Ｃ、Ｓ１５５ＣとＳ２９０Ｃ、Ｔ１０３ＣとＩ１４８Ｃ、Ｌ１４２ＣとＮ３７１Ｃなどの、５５Ｃと１８８Ｃ、１５５Ｃと２９０Ｃ、１０３Ｃと１４８Ｃ、および１４２Ｃと３７１Ｃからなる群から選択される少なくとも１つの改変ジスルフィド突然変異を含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

他の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、１つまたは複数の空隙充填突然変異を含むＲＳＶ Ｆ突然変異体である。用語「空隙充填突然変異」とは、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質におけるアミノ酸残基の、成熟ＲＳＶ Ｆタンパク質の内部空隙を満たすことが予想されるアミノ酸による置換を指す。一適用例では、そのような空隙充填突然変異は、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体の融合前コンフォメーションの安定化に寄与する。ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションにおける空隙は、融合前コンフォメーションの状態にあるＲＳＶ Ｆの結晶構造の目視観察や、計算タンパク質設計ソフトウェア（たとえば、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）［ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、ニューヨーク、２０１５］、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）［Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、サンディエゴ、２０１５］、ＭＯＥ（商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、モントリオール、２０１５］、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）［Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、シアトル、２０１５］）の使用などの、当業界で公知の方法によって特定することができる。空隙充填突然変異のために置き換えられるアミノ酸としては、通常、小さい脂肪族（たとえば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ）または小さい極性アミノ酸（たとえば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）が挙げられる。こうしたアミノ酸には、融合前コンフォメーションの状態では埋まっているが、後のコンフォメーションの状態では溶媒に曝されるアミノ酸も含まれうる。補充アミノ酸は、大きい脂肪族アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）または大きい芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）にすることができる。たとえば、いくつかの実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、Ｔ５４Ｈ突然変異を含む。

一部の詳細な実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、
１）５５、６２、１５５、１９０、または２９０位にあるＳのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
２）５４、５８、１８９、２１９、または３９７位にあるＴのＩ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
３）１５１位にあるＧのＡまたはＨによる置換、
４）１４７または２９８位にあるＡのＩ、Ｌ、Ｈ、またはＭによる置換、
５）１６４、１８７、１９２、２０７、２２０、２９６、３００、または４９５位にあるＶのＩ、Ｙ、Ｈによる置換、および
６）１０６位にあるＲのＷによる置換
からなる群から選択される１つまたは複数の空隙充填突然変異を含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

一部の詳細な実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、１つまたは複数の空隙充填突然変異を含むＲＳＶ Ｆ突然変異体であり、この突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ２、４、および６に示されている突然変異体のいずれかにある空隙充填突然変異を含む。こうしたＴａｂｌｅ２、４、および６に示されているＲＳＶ Ｆ突然変異体は、１０２、３７９、および４４７位に３つの自然発生置換を有する、ＲＳＶ Ａ２株の同じ未変性Ｆ０配列（配列番号３）を主体としている。突然変異体のそれぞれにおける同じ導入突然変異を、他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列に生じさせると、配列番号１、２、４、６、および８１～２７０のいずれかに明記される未変性Ｆ０ポリペプチド配列などの、異なるＲＳＶ Ｆ突然変異体に到達しうる。他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列を主体とし、１つまたは複数の空隙充填突然変異のいずれかを含むＲＳＶ Ｆ突然変異体も、本発明の範囲内にある。一部の特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、Ｔ５４Ｈ、Ｓ１９０Ｉ、およびＶ２９６Ｉからなる群から選択される少なくとも１つの空隙充填突然変異を含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

さらに他の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、１つまたは複数の静電突然変異を含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。用語「静電突然変異」とは、折り畳み構造において互いに近接する、タンパク質中の残基間のイオン反発を低減する、またはイオン誘引を増大させる、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質に導入されたアミノ酸突然変異を指す。水素結合は、イオン誘引の特殊な事例であるため、静電突然変異によって、このような近接した残基間の水素結合が増強される場合もある。一例では、静電突然変異を導入して、三量体安定性を向上させることができる。一部の実施形態では、静電突然変異が導入されて、その融合前コンフォメーションではＲＳＶ Ｆ糖タンパク質中で極めて近接しているが、その融合後コンフォメーションではそうでない残基間の反発性のイオン相互作用が低減され、または（水素結合を潜在的に含む）誘引性のイオン相互作用が増強される。たとえば、融合前コンフォメーションでは、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質三量体の１つのプロトマーからのＡｓｐ４８６の酸性側鎖が、三量体境界面に位置しており、別のプロトマーからのＧｌｕ４８７およびＡｓｐ４８９の他の２つの酸性側鎖の間に挟まれる構造になっている。他方、融合後コンフォメーションにおいて、Ａｓｐ４８６の酸性側鎖は、三量体表面に位置し、溶媒に曝される。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体は、ＲＳＶ Ｆ三量体の別のプロトマーからのＧｌｕ４８７およびＡｓｐ４８９の酸性残基との、反発性のイオン相互作用を低減し、または誘引性のイオン相互作用を増強する静電Ｄ４８６Ｓ置換を含む。したがって、一実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、静電Ｄ４８６Ｓ置換を含む。通常、静電突然変異の導入によって、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションまたは融合前三量体コンフォメーションの溶融温度（Ｔｍ）は上昇する。

融合前または融合前三量体コンフォメーションにおける好ましくない静電相互作用は、融合前または融合前三量体コンフォメーションの状態にあるＲＳＶ Ｆの結晶構造の目視観察や、計算タンパク質設計ソフトウェア（たとえば、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）［ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、ニューヨーク、２０１５］、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）［Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、サンディエゴ、２０１５］、ＭＯＥ（商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、モントリオール、２０１５］、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）［Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、シアトル、２０１５］）の使用などの、当業界で公知の方法によって特定することができる。

一部の詳細な実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、
１）８２、９２、または４８７位にあるＥのＤ、Ｆ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、またはＨによる置換、
２）３１５、３９４、または３９９位にあるＫのＦ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、Ｑ、またはＴによる置換、
３）３９２、４８６、または４８９位にあるＤのＨ、Ｓ、Ｎ、Ｔ、またはＰによる置換、および
４）１０６または３３９位にあるＲのＦ、Ｑ、Ｎ、またはＷによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つの静電突然変異を含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

一部の詳細な実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、１つまたは複数の静電突然変異を含むＲＳＶ Ｆ突然変異体であり、この突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ３、５、および６に示されている突然変異体のいずれかにある静電突然変異を含む。こうしたＴａｂｌｅ３、５、および６に示されているＲＳＶ Ｆ突然変異体は、１０２、３７９、および４４７位に３つの自然発生置換を有する、ＲＳＶ Ａ２株の同じ未変性Ｆ０配列（配列番号３）を主体としている。突然変異体のそれぞれにおける同じ導入突然変異を、他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列に生じさせると、配列番号１、２、４、６、および８１～２７０のいずれかに明記される未変性Ｆ０ポリペプチド配列などの、異なるＲＳＶ Ｆ突然変異体に到達しうる。他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列を主体とし、１つまたは複数の静電突然変異のいずれかを含むＲＳＶ Ｆ突然変異体も、本発明の範囲内にある。一部の特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、突然変異Ｄ４８６Ｓを含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

Ｂ－２（ｄ）改変ジスルフィド結合突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異の組合せ
別の態様では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、それぞれ本文書において上述したとおりの、改変ジスルフィド結合突然変異、空隙充填突然変異、および静電突然変異から選択される２つ以上の異なるタイプの突然変異の組合せを含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。

一部の実施形態では、突然変異体は、少なくとも１つの改変ジスルフィド結合突然変異と、少なくとも１つの空隙充填突然変異とを含む。一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ４に示されているとおりの突然変異の組合せを含む。

一部のさらなる実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、少なくとも１つの改変ジスルフィド突然変異と、少なくとも１つの静電突然変異とを含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ５に示されているとおりの突然変異の組合せを含む。

さらに他の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、少なくとも１つの改変ジスルフィド突然変異と、少なくとも１つの空隙充填突然変異と、少なくとも１つの静電突然変異とを含むＲＳＶ Ｆタンパク質突然変異体である。一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ６に示されているとおりの突然変異の組合せを含む。

一部の特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、
（１）Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（２）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（３）Ｔ５４Ｈ、Ｔ１０３Ｃ、Ｉ１４８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｖ２９６Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（４）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、およびＮ３７１Ｃの組合せ、
（５）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（６）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、およびＳ１９０Ｉの組合せ、
（７）Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（８）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（９）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＤ４８６Ｓの組合せ、
（１０）Ｔ５４Ｈ、Ｓ５５Ｃ、Ｌ１４２Ｃ、Ｌ１８８Ｃ、Ｖ２９６Ｉ、Ｎ３７１Ｃ、Ｄ４８６Ｓ、Ｅ４８７Ｑ、およびＤ４８９Ｓの組合せ、ならびに
（１１）Ｔ５４Ｈ、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｉ、Ｓ２９０Ｃ、およびＶ２９６Ｉの組合せ
からなる群から選択される突然変異の組合せを含むＲＳＶ Ｆ突然変異体である。

一部の詳細な実施形態では、ＲＳＶ Ｆ突然変異体は、導入突然変異の組合せを含み、ＷＯ２０１７／１０９６２９のＴａｂｌｅ４、５、および６に示されている突然変異体のいずれかにおける突然変異の組合せを含む。こうしたＴａｂｌｅ４、５、および６に示されているＲＳＶ Ｆ突然変異体は、１０２、３７９、および４４７位に３つの自然発生置換を有する、ＲＳＶ Ａ２株の同じ未変性Ｆ０配列（配列番号３）を主体としている。突然変異体のそれぞれにおける同じ導入突然変異を、他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列に生じさせると、配列番号１、２、４、６、および８１～２７０のいずれかに明記される未変性Ｆ０ポリペプチド配列などの、異なるＲＳＶ Ｆ突然変異体に到達しうる。他のいずれかのＲＳＶサブタイプまたは株の未変性Ｆ０ポリペプチド配列を主体とし、突然変異の組合せのいずれかを含むＲＳＶ Ｆ突然変異体も、本発明の範囲内にある。

一部の他の特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製される、組換え生産されたＲＳＶタンパク質は、１０３位（１０３Ｃ）および１４８位（１４８Ｃ）にあるシステイン（Ｃ）、１９０位（１９０Ｉ）にあるイソロイシン（Ｉ）、ならびに４８６位（４８６Ｓ）にあるセリン（Ｓ）を含むＲＳＶ Ｆ突然変異体であり、突然変異体は、
（１）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４２のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（２）配列番号４１のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４２のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（３）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４４のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（４）配列番号４３のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４４のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（５）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（６）配列番号４５のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４６のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（７）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（８）配列番号４７のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号４８のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（９）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号５０のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１０）配列番号４９のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号５０のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１１）配列番号２７９のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８０のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１２）配列番号２７９のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８０のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１３）配列番号２８１のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８２のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１４）配列番号２８１のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８２のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１５）配列番号２８３のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８４のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１６）配列番号２８３のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８４のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１７）配列番号２８５のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８６のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１８）配列番号２８５のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８６のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（１９）配列番号２８７のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８８のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（２０）配列番号２８７のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２８８のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、
（２１）配列番号２８９のアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２９０のアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド、ならびに
（２２）配列番号２８９のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ２ポリペプチド、および配列番号２９０のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも９７％、９８％、または９９％であるアミノ酸配列を含むＦ１ポリペプチド
からなる群から選択されるＦ１ポリペプチドおよびＦ２ポリペプチドを含む。

一部の詳細な実施形態では、Ｆ突然変異体タンパク質のＦ１ポリペプチドのＣ末端に、三量体形成ドメインが連結されている。特定の一実施形態では、三量体形成ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４０）などの、Ｔ４フィブリチンフォルドンドメインである。

ＲＳＶ Ａローディング溶液について、各洗浄溶液で得られた収率値（生産物回収の百分率）を、ｐＨ値に対してプロットした図である。 ＲＳＶ Ｂローディング溶液について、各洗浄溶液で得られた収率値（生産物回収の百分率）を、ｐＨ値に対してプロットした図である。

定義
発明の詳細な説明および特許請求の範囲では、以下の定義が使用される。
－用語「収穫された細胞培養液」（または「収穫ＣＣＦ」）とは、同じく存在する他の物質から精製されようとする少なくとも１種の目的物質を含有する溶液を指す。収穫ＣＣＦは、往々にして、多くの生体分子（タンパク質、抗体、ホルモン、ウイルスなど）、低分子（塩、糖、脂質など）、および粒子状物質さえ含有する複雑な混合物である。生体起源の典型的な収穫ＣＣＦは、水溶液または水性懸濁液となりうるが、溶媒沈殿、抽出などの早期の分離ステップにおいて使用された有機溶媒を含有する場合もある。本発明の種々の実施形態による精製の対象となる、価値のある生体物質を含有しうる収穫ＣＣＦの例には、限定はしないが、バイオリアクターからの培養上清、均質化された細胞懸濁液、血漿、血漿画分、および乳汁が含まれる。
－用語「ローディング」とは、細胞培養物（収穫ＣＣＦ）またはクロマトグラフィーステップ（すなわち、部分的に精製されている）のいずれかから得られ、クロマトグラフィー媒質にかけられる、目的物質を含有するいずれかの材料を指す。
－用語「ローディング負荷量」とは、媒質の単位体積あたりの物質の質量という単位で測定される、クロマトグラフィーステップのローディングサイクルにおいてクロマトグラフィー媒質にかけられる物質の合計質量を指す。
－用語「不純物」とは、当該タンパク質（または目的タンパク質）とは異なるものであり、最終治療用タンパク質製剤からは排除されることが望ましい、収穫ＣＣＦ中の材料を指す。典型的な不純物には、核酸、タンパク質（ＨＣＰおよび低分子量種を含む）、ペプチド、内毒素、ウイルス、および低分子が含まれる。
－用語「原薬」とは、本発明の方法によって取得可能であるような、活性医薬成分としての治療用タンパク質を指す。
－用語「薬物製品」とは、治療用タンパク質を賦形剤と併せて含有する完成剤形を指す。
－用語「賦形剤」とは、最終治療用タンパク質製剤の、治療用タンパク質ではない構成物を意味する。賦形剤には、通常、タンパク質安定剤、界面活性剤、たとえばタンパク質安定化に寄与するアミノ酸などが含まれる。
－別段明記しない限り、数値と関連する用語「約」は、前記値の±５％の範囲を意味する。

「ＨＣＰの減少」または「ＨＣＰの除去を強化する」とは、治療用タンパク質を基準とした存在するＨＣＰ種の濃度を、溶出プールにおいて低下させることを意味する。ＨＣＰの全般的な減少は、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ（最重要ツールとして使用されるのが普通である）やＬＣ－ＭＳ／ＭＳなどの、当業界で公知の方法によって測定することができる。

本発明者らは、（ａ）ＣＥＸクロマトグラフィーステップ、（ｂ）ｃＨＡクロマトグラフィーステップ、および（ｃ）陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップの序列を使用する最高技術水準の精製工程から出発して、収率に影響を及ぼす主要な要素を決定することを目指した。

特に、ＣＥＸステップが、他のクロマトグラフィーステップとは関係なくそれ自体で、低い収率（１５～２０％）と関連したことが認められた。

本発明者らは、低いＣＥＸステップ収率が特定のＣＥＸ樹脂のせいであったのかを明らかにするために実験作業を行った。そのために、２種の異なるＣＥＸ樹脂、すなわち、樹脂ビーズ上の高分子テンタクルに結合した官能基を有する、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡから入手可能なＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）－ＳＯ３、およびＢＩＯ－ＲＡＤから入手可能なＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）－ＳＯ３を調べた。

精製された反応性三量体を両方の樹脂にかけ、次いで、溶離させた。ローディングおよび溶出画分の両方を、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析法（疎水性相互作用クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー）によって分析した。

実験によって、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）樹脂上ではＲＴのおよそ４５％がＮＲＴに変換され、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ樹脂上ではＲＴの２５％がＮＲＴに変換されたことが明らかになった。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）上のテンタクルは、高めの変換率の一因になると考えられる。

ＲＴのＮＲＴへの変換を防ぎ、そして生産性を高めるために、ＣＥＸステップを有利になるように外し、別のクロマトグラフィーステップで置き換えることが決定された。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、詳細には、ＲＴのＮＲＴへの変換が妨げられ、または少なくとも最小限に抑えられたという理由で、ＣＥＸステップの置き換えに適することがわかった。

工程フローにＨＩＣステップを配置することは、必要となる限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）単位操作の数に影響を及ぼすことがわかった。ＨＩＣがキャプチャーカラムとして、または２番目の位置で使用された場合、次のカラムの中に移す前に、追加のＵＦＤＦステップが必要となる。したがって、ＨＩＣステップの好ましい位置は、最終ポリッシングステップであることが見出された。

また、２番目の位置のｃＨＡステップは、著しいウイルスクリアランスをもたらすため、新たな工程でもその位置のままにしておくことが決定された。その結果、新たな工程では、ＡＥＸステップが、最終クロマトグラフィーステップから最初のクロマトグラフィーステップに移り、ＨＩＣステップは、３番目に位置付けられ、したがって、ｃＨＡおよびＨＩＣステップは、ポリッシングステップとなる。

ここで、組換え生産されたＲＳＶタンパク質に適用され、種々のＡＥＸクロマトグラフィー洗浄戦略を用いて評価された精製工程に相当する以下の実施例によって、本発明をさらに例証する。実施例は、例証する目的のためだけに提供され、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでない。

例証となる実施例において、ＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶ Ａタンパク質またはＲＳＶ Ｂタンパク質のいずれかである。

この実施例において、バイオリアクターから集められたローディング溶液中に存在するＲＳＶタンパク質は、
－最初の遠心分離および深層濾過ステップ、
－第１の限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ、
－ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡから入手可能なＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ（Ｍ）といった媒質を含むクロマトグラフィーカラムにおいて実施される、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップ。ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥから入手可能なＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、もしくはＣａｐｔｏＱ ＩｍｐＲｅｓ（商標）樹脂、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥからのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ（商標）Ｑ－６５０Ｍ樹脂、またはＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡからのＥｓｈｍｕｎｏ（商標）Ｑ樹脂などの別の媒質を使用してもよい。樹脂は、最初に平衡化緩衝液で平衡化される。次いで、カラムにローディングして、目的タンパク質が樹脂に結合するようにする。引き続いて、樹脂を１種または複数の洗浄溶液で洗浄し、溶出緩衝液を適用し、その結果、目的タンパク質が樹脂から溶出プールに溶出される。ＡＥＸクロマトグラフィーステップの主目的は、工程由来不純物からのＲＳＶタンパク質の分離である。
－ ＢＩＯ－ＲＡＤから入手可能なＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ ４０μｍなどの、炭酸含有ヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーステップ、
－ ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥから入手可能なＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商標）樹脂などの媒質を含むクロマトグラフィーカラムにおいて実施される疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ステップ、
－ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡから入手可能なＶｉｒｅｓｏｌｖｅＰｒｏ（商標）フィルターを使用するウイルス濾過ステップ。別法として、旭化成から入手可能なＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルターをこのウイルス濾過ステップに使用してもよい。
－第２の限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ、および
－最終製剤および濾過ステップ
を順次含む多段階精製工程によって精製される。

陰イオン交換クロマトグラフィー－洗浄緩衝液評価
目的タンパク質（ＲＳＶ ＡまたはＲＳＶ Ｂ）を含み、ｐＨが７．５±０．２であるローディング溶液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ（Ｍ）カラムにローディングした。カラムを、次の平衡化緩衝液、すなわち、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．５で平衡化した。実験は、種々のローディング負荷量の条件で実施し、カラムを、以下で表１に表すとおりの種々の洗浄溶液で洗浄した後、２０ｍＭのトリス、１６３ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．５溶出緩衝液でタンパク質を溶出させた。

当該タンパク質は、反応性三量体型（表１では「三量体」）である。表１において参照される「対照ｐＨ７．５洗浄」は、ｐＨ７．５のトリス、ＮａＣｌ洗浄溶液である。

この実験から、より低いｐＨの洗浄条件では、ｐＨ７．５のより慣例的な洗浄溶液に比べて、生産物損失を最小限に抑えながら、ＨＣＰ減少が（約１ｌｏｇ）強化されうることを認めることができる。このようなより低いｐＨの洗浄条件では、三量体純度も向上する（８６および８９％対７２％）。

実験により、より低いｐＨの洗浄条件（本実施例におけるｐＨ４．８）では、ローディング負荷量（表１における「樹脂負荷量」）が増大するにつれて、低ｐＨ洗浄中の生産物損失が増加することが示唆されている。

酢酸塩洗浄溶液について、種々のｐＨ、酢酸塩濃度、およびローディング負荷量で行った別の実験では、より低い洗浄ｐＨが、より良好なＨＣＰ除去と対応することが示唆されている。より低い質量負荷量は、より良好なＨＣＰ除去およびより良好な収率と対応する。より高い酢酸塩濃度は、より低い収率と対応する。

結果は、試験した要素の中で、ｐＨ条件がＨＣＰ減少の最も重要な要素であること、および生産物回収率については、緩衝液強度が最も重要な要素であることを示している。

上述の実験において使用した酢酸塩以外に、クエン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩化物といった別の陰イオン溶液をこの方法に使用してもよい。

陰イオン強度の異なる種々の緩衝液種の影響を評価し、ＨＣＰ除去に最適な条件を特徴付けるために、さらなる実験を行った。

以下の表２に、評価した洗浄条件（塩、濃度、ｐＨ）を示す。

図１および図２では、それぞれ、ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂローディング溶液について、各洗浄溶液で得られた収率値（生産物回収の百分率）を、ｐＨ値に対してプロットしている。

図１では、ＲＳＶ Ａについて、
（ｉ）緩衝剤強度が増すと、低ｐＨ洗浄中の生産物損失のために、収率がより低くなること、
（ｉｉ）酢酸塩およびクエン酸塩は、収率が洗浄ｐＨとの相関を示すこと、
（ｉｉｉ）リン酸塩および硫酸塩は、ｐＨ３．５でより高い収率を示し、ｐＨにそれほど左右されないこと
が認められる。

図２において示されるデータからは、ＲＳＶ Ｂについて、
（ｉ）ＲＳＶ Ａについてと同様の傾向が酢酸塩で認められる、すなわち、より低いｐＨおよび強度の増大がより低い収率をもたらすこと、
（ｉｉ）収率が、ＲＳＶ Ａほどは、高い緩衝剤強度に左右されないこと、
（ｉｉｉ）ＲＳＶ Ｂでは、ＲＳＶ Ａに比べて低い回収率が認められること
が示唆される。

さらなる実験において、ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂ両方についての複数の洗浄条件（緩衝液タイプ、濃度、ｐＨ）の成果を、ＨＣＰ減少および収率について評価し、好ましい洗浄溶液、すなわち、７０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０と比較した。

生成されたデータを、以下の表３として照合した。

表３において、終わりから２番目の縦列に示される、高処理スクリーニング（ＨＴＳ）法を用いて好ましい洗浄溶液（７０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０）について得られたデータは、史的データに基づいて正規化されており、
－ＲＳＶ Ａについては、７０％という収率、および０．９～１．１の間のＨＣＰの対数減少値（ＬＲＶ）、
－ＲＳＶ Ｂについては、６５％という収率、および０．９～１．４の間のＬＲＶ
を示している。

実施された洗浄選別により、緩衝剤強度が増すと、洗浄中の収率減少につながり、洗浄ｐＨが下がると、ＨＣＰ除去がより良好になることが示唆されている。ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂは、収率およびＨＣＰで同様の傾向を示し、ＲＳＶ Ｂの方が低い収率を示した。

異なる緩衝液、特に、リン酸塩および硫酸塩は、表３における正規化されたデータを基準として、ＨＣＰ除去か収率かにおいて一定範囲の有効性を示しており、これらは、酢酸塩の代替物として力強い選択肢である。

最後に、ｐＨが７．０～８．５の間、より詳細には、約７．５であるローディング溶液、および陰イオン交換クロマトグラフィー媒質１ｍｌあたり７．５ｍｇ～１５．０ｍｇの間からなるローディング負荷量では、ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂの両方に適用可能である、ＡＥＸクロマトグラフィーカラムのための好ましい低ｐＨ洗浄条件は、７０ｍＭの酢酸塩およびｐＨ５．０である。

前述の実験を根拠として、低ｐＨ洗浄溶液について許容されるｐＨの範囲は、３．０～６．５の間、より好ましくは、４．０～６．０の間、最も好ましくは、４．５～５．５の間となりうる。

こうした操作条件では、リン酸塩および硫酸塩が、酢酸塩の代替品として力強い選択肢である。

実際の方法では、目的タンパク質（ＲＳＶ ＡまたはＲＳＶ Ｂ）を含むローディング溶液をＡＥＸカラムにローディングする前に、カラムは、平衡化溶液、すなわち、２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．５で平衡化される。

ローディング後、カラムは、３種の洗浄溶液で連続的に洗浄され、２回目がより低いｐＨ洗浄溶液、１回目および３回目がより高いｐＨの洗浄溶液である。
－洗浄１回目：２０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、
－洗浄２回目：７０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０、
－洗浄３回目：５０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５。

洗浄溶液についての上述のｐＨ値および組成は、好ましいものではあるが、しかし、ＨＣＰ減少および収率に関しての許容される成果は、次の条件下でも得られる場合がある。
－第１のより高いｐＨの洗浄溶液（洗浄１回目）は、ｐＨが７．０～８．０の間でもよい。トリス濃度は、１８ｍＭ～２２ｍＭの間でもよく、ＮａＣｌ濃度は、４５ｍＭ～５５ｍＭの間でもよい。
－より低いｐＨ洗浄溶液（洗浄２回目）中の酢酸塩の濃度は、５６ｍＭ～８４ｍＭの間、より好ましくは、６３ｍＭ～７７ｍＭの間でもよい。上で論じたような許容されるｐＨの範囲は、３．０～６．５、好ましくは、４．０～６．０、より好ましくは、４．５～５．５である。
－第２のより高いｐＨの洗浄溶液（洗浄３回目）は、ｐＨが７．０～８．０の間でもよい。トリス濃度は、４５ｍＭ～５５ｍＭの間でもよく、ＮａＣｌ濃度は、１８ｍＭ～２２ｍＭの間でもよい。

３種の洗浄溶液で連続的にカラムを洗浄することにより行われる洗浄ステップの後、ＲＳＶタンパク質が溶出溶液で溶出される。溶出溶液は、１４６ｍＭ～１８０ｍＭの間、好ましくは、約１６３ｍＭの濃度のＮａＣｌと、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のトリスとを含む。溶出溶液のｐＨは、７．０～８．０の間であり、好ましくは、約７．５である。

実施例の後続のクロマトグラフィーステップは、以下の条件で操作されることが好ましい。

ｃＨＡクロマトグラフィー
生産物をｃＨＡクロマトグラフィーカラムにローディングする前に、カラムは、第１の平衡化緩衝液である０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、次いで、第２の平衡化緩衝液である２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１３ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で平衡化される。

ＡＥＸクロマトグラフィーカラムから集められ（すなわち、ＡＥｘ溶出プール）、リン酸塩を加えて調整された生産物プールは、濾過後、ｃＨＡクロマトグラフィーカラムにローディングされる。カラムにローディングする前にリン酸塩を加えてｃＨＡローディング溶液をコンディショニングするのは、生産物がカラムに結合するのを防ぐことを目的としている。ローディングのｐＨは、７．１±０．３の値に設定され、ローディング負荷量は、媒質１ｍｌあたり８．０ｍｇ～１２．０ｍｇの間からなる。

カラムは、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１３ｍＭのリン酸ナトリウムを含むｐＨ７．０の洗浄溶液で洗浄される。

カラムは、フロースルーモードで操作され、つまり、ローディング流体がカラムにローディングされると、目的タンパク質はカラムを通過し、不純物は媒質に結合する。洗浄は、意図せずに結合された目的タンパク質をカラムから洗い落とすためのものである。

ＨＩＣ
生産物をＨＩＣカラムにローディングする前に、カラムは、２０ｍＭのリン酸カリウムを含むｐＨ７．０の第１の平衡化緩衝液、次いで、１．１Ｍのリン酸カリウムを含むｐＨ７．０の第２の平衡化緩衝液で平衡化される。

ｃＨＡクロマトグラフィーカラムから集められ（すなわち、ｃＨＡクロマトグラフィーステップからのフロースループール）、リン酸カリウムを加えて調整された生産物プールは、濾過後、ＨＩＣカラムにローディングされる。カラムにローディングする前にリン酸塩を加えてＨＩＣローディング溶液をコンディショニングするのは、生産物を確実にカラムに結合させることを目的としている。ローディングのｐＨおよび電気伝導度は、それぞれ、７．０±０．３および１０４±１０ｍＳ／ｃｍに調整される。ローディング負荷量は、媒質１ｍｌあたり８．０ｍｇ～１２．０ｍｇの間からなる。

カラムは、結合および溶出モードで操作され、その結果、カラムにローディングされた目的タンパク質は、媒質に結合し、次いで、溶出緩衝液の適用によって溶出される。溶出緩衝液を適用する前に、カラムは、媒質に結合した不純物を洗い落とすため、洗浄溶液で洗浄される。

このＨＩＣステップに使用される洗浄溶液は、１．１Ｍのリン酸カリウム、ｐＨ７．０であり、溶出緩衝液は、４４８ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０である。

上述の方法は、組換え生産されたＲＳＶタンパク質を、前記タンパク質を医薬製品の調製に使用することができるような十分な純度で精製するのに適する。特に、そのような精製されたＲＳＶタンパク質は、適切な賦形剤を加えることにより、注射用医薬製品として使用されるように製剤化することができる。

Claims (35)

1. （ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーステップ、（ｂ）ｃＨＡクロマトグラフィーステップ、および（ｃ）ＨＩＣステップを順次含む、組換え生産された三量体型のＲＳＶ Ｆタンパク質を精製する方法。
2. 陰イオン交換クロマトグラフィーステップが、結合および溶出モードで実施され、
   （ａ．１）ＲＳＶ Ｆタンパク質を含むローディング溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー媒質と接触させ、それによって、ＲＳＶ Ｆタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィー媒質に結合させるステップと、
   （ａ．２）陰イオン交換クロマトグラフィー媒質を、少なくとも１種の、ｐＨが３．０～６．５の間であるより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄するステップと、
   （ａ．３）陰イオン交換クロマトグラフィー媒質からＲＳＶ Ｆタンパク質を溶出させ、それによって、陰イオン交換溶出プールを得るステップと
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. ローディング溶液のｐＨが、７．０～８．５の間、好ましくは、約７．５である、請求項２に記載の方法。
4. 前記より低いｐＨ洗浄溶液のｐＨが、４．０～６．０の間、好ましくは、４．５～５．５の間、好ましくは、約５．０である、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記より低いｐＨ洗浄溶液が、５６ｍＭ～８４ｍＭの間、好ましくは、６３ｍＭ～７７ｍＭの間、好ましくは、約７０ｍＭの濃度の酢酸塩を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 陰イオン交換クロマトグラフィー媒質をより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄する前に、陰イオン交換クロマトグラフィー媒質が、少なくとも、ｐＨが７．０～８．０の間、好ましくは約７．５である第１のより高いｐＨの洗浄溶液で洗浄される、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１のより高いｐＨの洗浄溶液が、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のトリスを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１のより高いｐＨの洗浄溶液が、４５ｍＭ～５５ｍＭの間、好ましくは、約５０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項６または７に記載の方法。
9. 陰イオン交換クロマトグラフィー媒質をより低いｐＨ洗浄溶液で洗浄した後、かつＲＳＶ Ｆタンパク質を溶出させる前に、陰イオン交換クロマトグラフィー媒質が、少なくとも、ｐＨが７．０～８．０の間、好ましくは約７．５である第２のより高いｐＨの洗浄溶液でさらに洗浄される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第２のより高いｐＨの洗浄溶液が、４５ｍＭ～５５ｍＭの間、好ましくは、約５０ｍＭの濃度のトリスを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記第２のより高いｐＨの洗浄溶液が、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項９または１０に記載の方法。
12. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、７．０～８．０の間、好ましくは、約７．５のｐＨを有する溶出溶液で溶出される、請求項２から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記溶出溶液が、１４６ｍＭ～１８０ｍＭの間、好ましくは、約１６３ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記溶出溶液が、１８ｍＭ～２２ｍＭの間、好ましくは、約２０ｍＭの濃度のトリスを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
15. ｃＨＡクロマトグラフィーステップが、フロースルーモードで実施され、
    （ｂ．１）陰イオン交換溶出プールにリン酸塩を加え、それによって、コンディショニングされたｃＨＡローディング溶液を得るステップと、
    （ｂ．２）ＲＳＶ Ｆタンパク質および不純物を含む、前記コンディショニングされたｃＨＡローディング溶液をｃＨＡ媒質と接触させ、それによって、不純物が媒質に結合し、ＲＳＶ Ｆタンパク質は媒質中を流れる、ステップと、
    （ｂ．３）ｃＨＡクロマトグラフィー媒質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるｃＨＡ洗浄溶液で洗浄するステップと、
    （ｂ．４）ＲＳＶ Ｆタンパク質をフロースループールに集めるステップと
    を含む、請求項２から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. ｃＨＡ洗浄溶液が、約２０ｍＭの濃度のトリス、約１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、および約１３ｍＭの濃度のリン酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
17. ＨＩＣステップが、結合および溶出モードで実施され、
    （ｃ．１）ｃＨＡクロマトグラフィーステップからのフロースループールにリン酸塩を加え、それによって、コンディショニングされたＨＩＣローディング溶液を得るステップと、
    （ｃ．２）ＲＳＶ Ｆタンパク質を含む、前記コンディショニングされたＨＩＣローディング溶液をＨＩＣ媒質と接触させ、それによって、ＲＳＶ Ｆタンパク質をＨＩＣ媒質に結合させるステップと、
    （ｃ．３）ＨＩＣ媒質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるＨＩＣ洗浄溶液で洗浄するステップと、
    （ｃ．４）ＨＩＣ媒質から、ＲＳＶ Ｆタンパク質を、ｐＨが６．０～８．０の間、好ましくは約７．０であるＨＩＣ溶出溶液で溶出させるステップと
    を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
18. ＨＩＣ洗浄溶液が、約１．１Ｍの濃度のリン酸カリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
19. ＨＩＣ溶出溶液が、約４４８ｍＭの濃度のリン酸カリウムを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、ＲＳＶサブグループＡからのタンパク質である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、ＲＳＶサブグループＢからのタンパク質である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
22. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、融合前のコンフォメーションの状態である、請求項２０または２１に記載の方法。
23. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、１つまたは複数の導入突然変異を含んでいる、いずれかのＲＳＶサブグループについての野生型Ｆタンパク質の突然変異体である、請求項２２に記載の方法。
24. ＲＳＶ Ｆ突然変異体が、融合前のコンフォメーションの状態で安定化される、請求項２３に記載の方法。
25. ＲＳＶ Ｆ突然変異体が、抗体Ｄ２５またはＡＭ１４に特異的に結合する、請求項２３または２４に記載の方法。
26. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、注射用医薬製品として使用されるように製剤化される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 請求項２６に記載の方法によって精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質を含む医薬製品。
28. ＲＳＶタンパク質が、ＲＳＶサブグループＡからのタンパク質である、請求項２７に記載の医薬製品。
29. ＲＳＶタンパク質が、ＲＳＶサブグループＢからのタンパク質である、請求項２７に記載の医薬製品。
30. ＲＳＶタンパク質がＲＳＶ Ｆタンパク質である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の医薬製品。
31. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、融合前のコンフォメーションの状態である、請求項３０に記載の医薬製品。
32. ＲＳＶ Ｆタンパク質が、１つまたは複数の導入突然変異を含んでいる、いずれかのＲＳＶサブグループについての野生型Ｆタンパク質の突然変異体である、請求項３１に記載の医薬製品。
33. ＲＳＶ Ｆ突然変異体が、融合前のコンフォメーションの状態で安定化されている、請求項３２に記載の医薬製品。
34. ＲＳＶ Ｆ突然変異体が、抗体Ｄ２５またはＡＭ－１４に特異的に結合する、請求項３２または３３に記載の医薬製品。
35. ＲＳＶタンパク質が、注射用医薬製品として使用されるように製剤化されている、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の医薬製品。

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