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CN119431524A - Rsv融合前构象f蛋白的突变体及其应用 - Google Patents

Rsv融合前构象f蛋白的突变体及其应用 Download PDF

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CN119431524A
CN119431524A CN202410953045.4A CN202410953045A CN119431524A CN 119431524 A CN119431524 A CN 119431524A CN 202410953045 A CN202410953045 A CN 202410953045A CN 119431524 A CN119431524 A CN 119431524A
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王弈
毕帅
康微
李丹丹
万季
潘有东
赵钊
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Shenzhen Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
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Shenzhen Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Beijing Xinhe Ruien Biomedical Technology Co ltd
Shenzhen Neocura Biotechnology Corp
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Abstract

本发明涉及一种RSV融合前构象F蛋白的突变体，所述突变体相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493或493附近位置的氨基酸被C取代，突变后的392C和493C或493C附近位置之间形成二硫键。本发明还提供了相关的DNA编码序列、重组质粒和mRNA序列和相应RSV疫苗。本发明通过引入合适位置的二硫键，以及与空腔填充、静电突变、脯氨酸突变等组合，显著提高具有融合前后构象和三聚化构象的F蛋白的表达和稳定性，并且显著抑制F蛋白转变为融合后构象。本发明所述突变体也应用于制备RSV疫苗和用于呼吸道合胞病毒感染检测。

Description

RSV融合前构象F蛋白的突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及呼吸道合胞病毒F蛋白的融合前构象的突变体及其在呼吸道合胞病毒疫苗开发及呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，以下简称RSV)感染导致婴幼儿和老年人的大量发病率和死亡率，全球每年估计有6400万例感染和160,000例死亡，RSV感染引起的肺炎是导致临床死亡病例的首要原因。迄今为止，单克隆抗体的被动预防部分由于其适度的功效而仅限于高风险婴儿。目前我国还没有批准上市的针对RSV感染的安全有效的疫苗，突出了提供保护性免疫应答的RSV疫苗的迫切需求。
RSV基因组全长约15Kb，包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白(F、G、M2-1、M2-2、SH、N、P、L)和3种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3)。其中融合糖蛋白(fusionglycoprotein,F)和粘附糖蛋白(attachment glycoprotein,G)是两个主要的包膜糖蛋白。F蛋白属于I型病毒融合蛋白，介导病毒与宿主细胞的膜融合，使病毒包膜与宿主细胞膜融合形成多合胞体。针对F蛋白的中和抗体能有效抑制RSV病毒的感染，人体自然感染RSV诱导的中和抗体主要是针对F蛋白；F蛋白的氨基酸序列在RSV亚型间超过93％的一致性，遗传稳定性远远高于G蛋白，此外F蛋白是诱导机体产生CD8+T细胞的重要靶点。因此RSV F蛋白是开发RSV疫苗开发的重要靶点。
RSV的F蛋白为三聚体结构，通过构象变化来介导病毒包膜和宿主细胞的融合。在融合启动前，F蛋白采用融合前构象，这种构象是不稳定的，具有较低的能量屏障。在RSV病毒感染宿主细胞的过程中，通过F蛋白构象由融合前构象转变为融合后构象，介导病毒与宿主细胞膜融合，处于融合后构象的F蛋白非常稳定。融合前构象的F蛋白与融合后构象的F蛋白结构上有很大不同，具有不同的抗原表位。F蛋白的融合前构象具有针对RSV感染的关键中和表位，当F蛋白转变为融合后构象时，就丧失了多数关键中和表位，因此，保持F蛋白融合前三聚体构象的稳定性至关重要。
为了解决融合前构想F蛋白(pre-F)结构不稳定的问题，通过在该蛋白特殊氨基酸位点引入突变对蛋白结构进行稳定，增加稳定性的同时也保留了F蛋白pre-F构象的中和敏感性表位。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种RSV融合前构象F蛋白的突变体及其应用，所述融合前构象F蛋白的突变体能提高融合前三聚化构象F蛋白的表达水平和稳定性。
为实现上述目的，可包括如下技术方案。
本发明的第一方面，是提供一种RSV融合前构象F蛋白的突变体，所述突变体相对于野生型RSVF蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493的氨基酸或者位置493位附近的位置氨基酸分别被半胱氨酸取代，突变后的392C与493C之间，或者突变后的392C与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键。
在其中一些实施例中，所述493位附近位置包括491位，其突变为491C。
在其中一些实施例中，所述野生型RSVF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在其中一些实施例中，所述突变体还引入空腔填充突变，所述空腔填充突变选自以下至少一种：E60I、E60Y、S62V、K80M、K87M、K87Y、V90I、S150L、S150V、S150F、S150W、V154L、K168Y、K168L、K191V、K191L、K191M、K427Y、D448V、S190F和V207L、E60I和K191V、S150L和K191V、K191V和D448V、D448Y、V154L和K191V、K168Y和K191V、K191V和K427Y、S150L和V154L、K427Y和D448V、E60I和S62V、S190F和V207L，或者上述突变位点被任意疏水性氨基酸替代。
进一步优选地，所述空腔填充突变选自以下至少一种：K80M、K87M、K87Y、V90I、V154L、K427Y、D448Y、以及190F和V207L。
在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括选自K80M、K87M、K87Y、V154L、D448Y、S190F和V207L中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的D392C与S491C之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括S190F和V207L突变。
在其中一些实施例中，还引入脯氨酸突变，所述脯氨酸突变选自以下至少一种：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P。
在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及K87M，或S190F与V207L的空腔填充突变，还包括选自以下至少一种脯氨酸突变：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P。
在其中一些实施例中，所述突变体包括突变后的D392C与S491C之间突变后形成二硫键，以及S190F,V207L空腔填充突变，还包括I214P突变。
在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在其中一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39任一所示。
本发明的第二方面，是提供编码所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的编码DNA序列。
在其中一些实施例中，所述编码序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40任一所示。
本发明的第三方面，是提供一种重组质粒，其插入有上述编码任一种所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的编码序列。
本发明的第四方面，是提供编码所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的mRNA序列,其可以通过对插入有上述编码任一种所述突变体的编码序列的重组质粒进行酶切和转录得到。
本发明的第五方面，是提供上述mRNA序列、或所述突变体在制备RSV疫苗中的应用。
本发明的第六方面，是提供所述突变体在呼吸道合胞病毒感染检测中的应用。
本发明的第六方面，是提供一种呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其特征在于，其包含至少一种核糖核酸聚核苷酸，其具有编码上述任一项RSV融合前构象F蛋白的突变体或其免疫原性片段的开放阅读框架，及医药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.通过引入合适位置(采用392位氨基酸与493位或者491位氨基酸)的能够达到限制(HRB)区域的位置移动的效果，二硫键即可稳定F蛋白融合前后构象和三聚化构象，并且显著抑制F蛋白转变为融合后构象。
2.在二硫键D392C-S491C的基础上，引入单点空腔填充突变，或者D392C-S493C的基础上，引入特定的单点空腔填充突变和双点空腔填充突变，更有助于稳定F蛋白的构象和提高蛋白表达量。
3.本发明所述的二硫键与空腔填充、静电突变、在特定位置引入脯氨酸突变等组合，更能进一步显著提高具有融合前后构象和三聚化构象的F蛋白的表达和稳定性，并且显著抑制F蛋白转变为融合后构象。
附图说明
图1：pNeoCura-Bvac质粒图谱。
图2：RF-NeoC-K1 mRNA转染细胞与单克隆抗体结合分析，其中，A.与单克隆抗体D25结合的平均荧光强度，B.与单克隆抗体AM14结合的平均荧光强度，C.与单克隆抗体4D7结合的平均荧光强度，D.与单克隆抗体D25结合的比例,E.与单克隆抗体AM14结合的平均荧光强度，F.与单克隆抗体4D7结合的比例。
图3：RF-NeoC-K24和RF-NeoC-K35 mRNA转染的细胞与单克隆抗体结合分析，其中，A.D25单克隆抗体,B.AM14单克隆抗体,C.4D7单克隆抗体。
图4：mRF-NeoC-K133 mRNA转染细胞与单克隆抗体结合分析，其中，A.D25单克隆抗体,B.AM14单克隆抗体,C.4D7单克隆抗体。
图5：含有二硫键突变的突变体mRNA相对编码RSV野生型F蛋白mRNA的蛋白表达水平,其中，A.与D25单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前构象F蛋白的表达水平；B.AM14单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前三聚体构象F蛋白的表达水平；C.4D7单克隆抗体结合的蛋白，表示融合后构象F蛋白的表达水平。
图6：含有二硫键突变和单个空腔填充突变的突变体mRNA相对编码RSV野生型F蛋白mRNA的蛋白表达水平，其中，A.与D25单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前构象F蛋白的表达水平；B.AM14单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前三聚体构象F蛋白的表达水平；C.4D7单克隆抗体结合的蛋白，表示融合后构象F蛋白的表达水平。
图7：含有二硫键突变和两个个空腔填充突变的突变体mRNA相对编码RSV野生型F蛋白mRNA的蛋白表达水平，其中，A.与D25单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前构象F蛋白的表达水平；B.AM14单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前三聚体构象F蛋白的表达水平；C.4D7单克隆抗体结合的蛋白，表示融合后构象F蛋白的表达水平。
图8：含有二硫键突变、单个空腔填充突变和链接α螺旋与α螺旋或者β折叠的铰链区位置脯氨酸突变的突变体mRNA相对编码RSV野生型F蛋白mRNA的蛋白表达水平，其中，A.与D25单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前构象F蛋白的表达水平；B.AM14单克隆抗体结合的蛋白，表示融合前三聚体构象F蛋白的表达水平；C.4D7单克隆抗体结合的蛋白，表示融合后构象F蛋白的表达水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
二硫键(disulfide bond)是连接不同肽链或同一肽链中，两个不同半胱氨酸残基之巯基的化学键。
pre fusion融合前构象。
(1)二硫键：如表1中，D392C和S493C发生突变，使其之间形成二硫键。
(2)空腔填充：构象两个凹槽部位进行了修饰(如表1中S190F,V207L)，使其得到填充，如RF-KW5～RF-KW34所示。
本发明通过在呼吸道合胞体病毒(RSV)的F蛋白序列中引入氨基酸位点的点突变，形成二硫键，和/或空腔填充，和/或二硫键与空腔填充的组合，从而显著提高融合前构象F的蛋白的表达；此融合前F蛋白能够形成稳定的三聚体，并且具有稳定三聚化构象。采用突变体F蛋白作为免疫原或者疫苗能够显著提高诱导针对RSV的中和抗体水平。
本发明实施例采用RSVA2毒株的F蛋白序列作为突变体突变的基础序列，但本发明突变体突变的基础序列不限于RSVA2毒株，还包括RSV其他型如B型及临床毒株。
众所周知，RSV具有两个抗原性亚型A和B。两个亚型的成熟加工的F蛋白质的氨基酸序列约93％一致。如在本发明中所使用，氨基酸位置参考来自A2病毒株的RSVF蛋白质(F蛋白或F蛋白的突变体)的序列(SEQ ID NO:1)给出。如在本发明中所使用，措辞“RSV F蛋白质的位置“x”上的氨基酸因此意指与SEQ ID NO:1的RSVA2病毒株的RSV F蛋白质中位置“x”上的氨基酸相对应的氨基酸。注意，在本发明中所使用的序列编号系统中，1是指一个未成熟F蛋白质的N-末端氨基酸(对应于SEQ ID NO:1的第一个氨基酸)。当使用一种RSV病毒株而不是A2病毒株时，F蛋白质的氨基酸位置将通过在必要时插入空位使其他RSV病毒株的序列与SEQ ID NO:1的F蛋白质比对，参考SEQ ID NO:1的A2病毒株的F蛋白质的编号来编号。可以使用本领域中众所周知的方法，例如通过CLUSTALW、Bioedit或CLC工作台来进行序列比对。
以下例举部分突变改造后的F蛋白的氨基酸序列和核酸序列，其他未给出的氨基酸和核酸序列，可以根据表1中给出的突变位置，参照给出的野生型序列以及以下序列，按照常规技术，获得相应的氨基酸和核酸序列。
SEQ ID NO.1
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO.2
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACGACTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO.3(RF-NeoC-K1)
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SEQ ID NO.4(dRF-NeoC-K1)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO.5(RF-NeoC-K24)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYCCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASICQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO.6(dRF-NeoC-K24)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCTTCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTCAACAAGCAGAGCTGCAGCCCAAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:7(RF-NeoC-K35)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSPSNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYCCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASICQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:8(dRF-NeoC-K35)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCTTCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTCAACAAGCAGAGCTGCAGCCCAAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:9(RF-NeoC-K131)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYCCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDACISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:10(dRF-NeoC-K131)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGCTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCTGCATCAGCCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:11(RF-NeoC-K132)
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SEQ ID NO:12(dRF-NeoC-K132)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCTTTAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGCTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCTGCATCAGCCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:13(RF-NeoC-K133)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSPSNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYCCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDACISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:14(dRF-NeoC-K133)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCTTTAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCCTGAACAAGCAGAGCTGCAGCCCCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGCTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCTGCATCAGCCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:15(RF-NeoC-K5)
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SEQ ID NO:16(dRF-NeoC-K5)
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SEQ ID NO:17(RF-NeoC-K6)
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SEQ ID NO:18(dRF-NeoC-K6)
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SEQ ID NO:19(RF-NeoC-K7)
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SEQ ID NO:20(dRF-NeoC-K7)
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SEQ ID NO:21(RF-NeoC-K21)
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SEQ ID NO:22(dRF-NeoC-K21)
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SEQ ID NO:23(RF-NeoC-K82)
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SEQ ID NO:24(dRF-NeoC-K82)
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SEQ ID NO:25(RF-NeoC-K83)
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SEQ ID NO:26(dRF-NeoC-K83)
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SEQ ID NO:27(RF-NeoC-K84)
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SEQ ID NO:28(dRF-NeoC-K84)
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SEQ ID NO:29(RF-NeoC-K85)
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SEQ ID NO:30(dRF-NeoC-K85)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACCCTGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:31(RF-NeoC-K89)
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SEQ ID NO:32(dRF-NeoC-K89)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCCCCAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:33(RF-NeoC-K93)
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SEQ ID NO:34(dRF-NeoC-K93)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGCCTGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:35(RF-NeoC-K94)
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SEQ ID NO:36(dRF-NeoC-K94)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCCTAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:37(RF-NeoC-K96)
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SEQ ID NO:38(dRF-NeoC-K96)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGGAGGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCCCTCCCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA
SEQ ID NO:39(RF-NeoC-K103)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKVKLIKQELDKYMNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLPPEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYCCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASICQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
SEQ ID NO:40(dRF-NeoC-K103)
ATGGAGCTGCTGATCCTGAAGGCCAATGCCATCACCACAATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGTTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAGTTCTACCAAAGCACCTGTTCTGCCGTGAGCAAGGGATACCTGAGCGCTCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTGAAGCTGATCAAGCAGGAGCTGGACAAGTACATGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGTCTACACAGGCCACCAACAACAGAGCCAGGAGAGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAGAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGAGGAAGAGACGGTTTCTGGGATTCCTGCTGGGAGTGGGATCTGCTATCGCCAGCGGAGTGGCCGTGAGCAAAGTGCTGCACCTGCCTCCCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAAGCCGTGGTTTCTCTGAGCAATGGCGTGAGCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGACCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACCGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAGATCACCCGGGAATTTAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACACCCGTGAGCACATACATGCTGACAAACTCTGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAGAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACAGCATCATGAGCATCATCAAGGAGGAAGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTATGGAGTGATCGATACCCCATGTTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACAAAGGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCAGAACCGACAGAGGATGGTACTGCGACAATGCCGGCAGCGTTAGCTTTTTCCCCCAGGCCGAGACCTGCAAGGTGCAGAGCAACAGAGTGTTCTGCGATACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCCAAGTACTGTTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCAGCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGAGCTGTTATGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTATGTGAGCAACAAGGGCGTGGACACCGTGAGCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAGCAGGAGGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCACTGGTGTTCCCAAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCTGTCAGGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATTCGCAAGAGCGACGAGCTGCTGCATAACGTGAATGCCGGCAAGAGCACCACCAACATCATGATCACCACCATCATTATCGTGATCATCGTGATCCTGCTGAGCCTGATCGCCGTGGGCCTCCTGCTGTATTGTAAGGCCAGAAGCACCCCCGTGACACTGAGCAAGGACCAGCTGTCTGGCATCAACAACATCGCCTTCAGCAACTGA。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1编码RSV野生型F蛋白及突变体质粒模板的制备。
基于RSVA2毒株的野生型F蛋白序列(如SEQ ID NO:1所示)和优化的编码RSVA2毒株的野生型F蛋白序列的DNA序列(如SEQ ID NO:2所示)，通过基因合成的方式将野生型F蛋白序列的DNA序列重组至pNeoCura-Bvac质粒载体的酶切位点BamHⅠ和SacⅠ序列之间，得到重组质粒pNeoCura-Bvac-WT，作为制备编码野生型F蛋白mRNA(mWT)的质粒模板。
根据表1所示突变体氨基酸序列对应位点，在重组质粒pNeoCura-Bvac-WT上进行点突变，得到对应的重组质粒pNeoCura-Bvac-RF-NeoC-K1至pNeoCura-Bvac-RF-NeoC-K133(DNA序列：dRF-NeoC-K1～dRF-NeoC-K133)。我们还构建了重组质粒pNeoCura-Bvac-Ds-Cav1，编码与Ds-Cav1相同的氨基酸突变位点，但F1的C端保留原有F1的跨膜区(transmembraneregion,TM区)及胞内区(cytoplasmicregionCT区)氨基酸序列。
表1：
实施例2编码RSV野生型F蛋白及突变体mRNA的制备
2.1.线性化模板制备
分别采用限制性内切酶BspQ I(NEB,货号：R0712L)对重组质粒进行酶切，使用VAHTSDNA Clean Beads(诺唯赞，N411-01)对酶切后线性化质粒进行纯化。
2.2体外转录制备mRNA
按照体外转录试剂盒T7High Yield RNA Transcription Kit(N1-Me-PseudoUTP)(诺唯赞，DD4202)说明书步骤，以2.1制备的线性化质粒为模板，进行体外转录得到mRNA。使用VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme,N412-01)，按照说明书步骤纯化mRNA。
2.3加帽及纯化
使用加帽试剂盒mRNA Cap2’-O-Methyltransferase(诺唯赞，DD4110)进行对纯化后的mRNA进行加帽反应。使用VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme,货号：N412-01)对加帽后的mRNA纯化，得到对应序列的mRNA。
实施例3mRNA转染细胞与细胞表面F蛋白的表达检测
3.1HEK293T细胞铺板
HEK293T细胞接种24孔板(2.5～3×105/孔)，采用含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)37℃，5％CO2培养18小时,转染前细胞密度达到80％融合度。
3.2mRNA转染HEK293T细胞
细胞培养基更换为无血清的Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，mRNA(0.3μg或1μg RNA/孔)与LipofectamineTMMessenger MAXTM转染试剂(Thermo FisherScientific)混合后转染细胞。6小时后，将细胞培养基替换为含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific)，继续培养24小时。
3.3流式细胞术检测HEK293T细胞表面F蛋白的表达
转染细胞培养24小时后，1000g离心10分钟，收集细胞，与荧光标记的单克隆抗体孵育。流式细胞术(BD，FACS Celesta)检测与单克隆抗体D25、单克隆抗体AM14结合或者单克隆抗体4D7结合的细胞表面的F蛋白的平均荧光强度(MFI)和细胞比例。本发明中的单克隆抗体D25：(D25使用McLellan,J.S.,Chen,M.,Leung,S.,Graepel,K.W.,Du,X.,Yang,Y.,Zhou,T.,Baxa,U.,Yasuda,E.,Beaumont,T.,Kumar,A.,Modjarrad,K.,Zheng,Z.,Zhao,M.,Xia,N.,Kwong,P.D.,&Graham,B.S.(2013).Structure of RSV fusion glycoproteintrimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody.Science(NewYork,N.Y.),340(6136),1113-1117.https://doi.org/10.1126/science.1234914公开的方法制备得到)，D25与细胞表面F蛋白的结合的平均荧光强度值(MFI)表征处于融合前构象表位的F蛋白表达水平；
本发明中的单克隆抗体AM14：(AM14使用Gilman,M.S.,Moin,S.M.,Mas,V.,Chen,M.,Patel,N.K.,Kramer,K.,Zhu,Q.,Kabeche,S.C.,Kumar,A.,Palomo,C.,Beaumont,T.,Baxa,U.,Ulbrandt,N.D.,Melero,J.A.,Graham,B.S.,&McLellan,J.S.(2015).Characterization of a Prefusion-Specific Antibody That Recognizes aQuaternary,Cleavage-Dependent Epitope on the RSV Fusion Glycoprotein.PLoSpathogens,11(7),e1005035.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005035公开的方法制备得到)。AM14与细胞表面F蛋白的结合的平均荧光强度值(MFI)表征处于融合前三聚化构象表位的F蛋白表达水平；
本发明中的单克隆抗体4D7：(4D7使用Zhang,L.,Durr,E.,Galli,J.D.,Cosmi,S.,Cejas,P.J.,Luo,B.,Touch,S.,Parmet,P.,Fridman,A.,Espeseth,A.S.,&Bett,A.J.(2018).Design and characterization of a fusion glycoprotein vaccine forRespiratory Syncytial Virus with improved stability.Vaccine,36(52),8119-8130.https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.10.032公开的方法制备得到)。4D7与细胞表面F蛋白的结合的平均荧光强度值(MFI)表征处于融合后构象表位的F蛋白表达水平。
实验结果：
(1)第二七肽重复(HRB)区域是不稳定区域之一，它形成F蛋白融合前构象中的三聚的螺旋状茎区。在由融合前构象转变为融合后构象，第二七肽重复(HRB)区域参与形成融合后构象六螺旋束中的三个α螺旋。采用392位氨基酸与493位或者491位氨基酸形成二硫键，限制(HRB)区域的位置移动，从而稳定融合前构象。
如图2结果显示：与编码野生型F蛋白的WTmRNA相比，RF-NeoC-K1mRNA转染细胞与D25结合的平均荧光强度(MFI)和比例显著升高(图2A和图2D)，说明二硫键D392C-S493C突变显著提高F蛋白的融合前构象蛋白的表达水平和比例。RF-NeoC-K1mRNA转染细胞与AM14结合的平均荧光强度(MFI)和比例显著升高(图2B和图2E)，说明二硫键D392C-S493C突变还能显著提高F蛋白的融合前构象蛋白三聚体的表达水平和比例。此外，WTmRNA编码的野生型F蛋白由于构象不稳定，因此WTmRNA转染的细胞与4D7结合的平均荧光强度(MFI)和比例处于高水平，而mRF-NeoC-K1mRNA转染细胞与4D7结合的平均荧光强度(MFI)和比例显著降低(图2C和图2F),与未转染mRNA组(nomRNA)接近。说明二硫键D392C-S493C突变显著降低F蛋白的融合后构象蛋白三聚体的表达水平和比例。
二硫键D392C-S493C与空腔填充、特定位置的脯氨酸突变的组合，如RF-NeoC-K24和RF-NeoC-K35转染的细胞与D25和AM14结合的平均荧光强度(MFI)显著高于现有技术中的Ds-Cav1(已经公开的含有RSVF跨膜结构域的稳定化的融合前F蛋白)，说明RF-NeoC-K24和RF-NeoC-K35编码的融合前构象三聚化的F蛋白水平显著高于Ds-Cav1(图3A和3B)；RF-NeoC-K24和RF-NeoC-K35转染的细胞与表征融合后构象抗体4D7的平均荧光强度(MFI)显著低于Ds-Cav1，说明RF-NeoC-K24和RF-NeoC-K35编码的融合后构象三聚化的F蛋白水平显著低于Ds-Cav1，具有更为稳定的融合前构象(图3C)。
我们还发现当在493位置附近的氨基酸(如491位)突变为半胱氨酸，392C和491C之间形成二硫键,也能有助于稳定F蛋白的融合前构象，如图4所示。与野生型F蛋白序列(WT)相比，二硫键D392C-S491C与空腔填充、特定位置的脯氨酸突变的组合，如RF-NeoC-K133转染的细胞与D25和AM14结合的平均荧光强度(MFI)显著升高，说明RF-NeoC-K133编码的融合前构象三聚化的F蛋白水平显著提高于mDs-Cav1(图4中A，图4中B)；RF-NeoC-K131，RF-NeoC-K132，RF-NeoC-K133转染的细胞与表征融合后构象抗体4D7的平均荧光强度(MFI)显著降低，说明RF-NeoC-K131，RF-NeoC-K132，RF-NeoC-K133编码的F蛋白融合后构象水平显著降低，具有更为稳定的融合前构象(图4C)。虽然只有392C和491C突变的情况下没有显著性提高细胞表面F蛋白与D25和AM14结合的平均荧光强度(MFI)显著升高，可能是由于RF-NeoC-K131转染细胞后F蛋白整体水平没有提升的原因；但是392C和491C突变极显著的降低融合后F蛋白构象的表达，说明392C和491C突变能有效的使F蛋白稳定的处于融合前三聚化化构象。综上所述，392C与493位置附近氨基酸位点(如491位)突变为半胱氨酸(C)后，也能有效稳定F蛋白的融合前构象，有效抑制F蛋白融合后构象的转变。
为了进一步评估位置392和493的氨基酸或者位置493位附近位置氨基酸分别被半胱氨酸取代。突变后的392C与493C之间，或者突变后的392C与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键的作用，采用392位氨基酸与491位氨基酸引入半胱氨酸突变D392C-S491C。
结果显示：与编码野生型F蛋白的WT mRNA相比，RF-NeoC-K131的mRNA转染细胞与D25，AM14，4D7结合的平均荧光强度(MFI)和比例极低(图5)；说明D392C-S491C突变显著降低融合后构象F蛋白的表达。
引入疏水氨基酸突变填充空腔有助于稳定F蛋白的构象和提高蛋白表达量。在二硫键D392C-S491C的基础上，引入单点空腔填充突变，如图6结果所示：空腔填充突变K80M，K87M，K87Y,V154L,K427Y能进一步提高F蛋白的融合前(图6A)、融合前三聚体构象(图6B)F蛋白的表达，同时降低融合后构象(图6C)F蛋白的表达。
进一步的在二硫键D392C-S491C的基础上，引入两个空腔填充突变，如图7结果所示：空腔填充突变S190F，V207的组合能进一步提高F蛋白的融合前(图7A)、融合前三聚体构象(图7B)F蛋白的表达，同时降低融合后构象(图7C)F蛋白的表达。
在二硫键D392C-S491C的基础上，引入两个空腔填充突变的组合：E60I,K191V；E60I,K191V；S150L,K191V，K191V,D448V；V154L,K191V；K168Y,K191V；K191V,K427Y；S150L,V154L；K427Y,D448V；E60I,S62V则降低蛋白融合前(图7A)、融合前三聚体构象(图7B)、融合后构象(图7C)F蛋白的表达。
进一步的，在链接α螺旋与α螺旋或者β折叠的铰链区位置引入特定的脯氨酸突变有助于稳定F蛋白的构象和提高蛋白表达量。在二硫键D392C-S491C，空腔填充K87M突变的基础(RF-NeoC-K6)上加入脯氨酸突变。结果显示：相比未加入脯氨酸突变位点的设计RF-NeoC-K6，RF-NeoC-K82(含有I214P)，RF-NeoC-K83(含有S215P)，RF-NeoC-K93(含有E161P)，RF-NeoC-K94(含有Q210P)均进一步提高融合前构象F蛋白的表达量；RF-NeoC-K82(含有I214P)，RF-NeoC-K83(含有S215P)，RF-NeoC-K85(含有I217P)，RF-NeoC-K93(含有E161P)，RF-NeoC-K95(含有S213P,I214P),RF-NeoC-K96(含有I214P,S215P),RF-NeoC-K97(含有S21PP,N216P)均进一步提高融合前三聚体构象F蛋白的表达量；同时，如图8所示，脯氨酸突变位点的加入没有增加融合后构象F蛋白的表达。
在RF-NeoC-K132设计含有二硫键D392C-S491C和空腔填充突变S190F，V207的基础上加入脯氨酸突变I214P，提高F蛋白的融合前(图8A)、融合前三聚体构象(图8B)F蛋白的表达，同时降低融合后构象(图8C)F蛋白的表达。
综上，本发明设计的二硫键，和/或与空腔填充、特定位置的脯氨酸突变的组合能显著提高具有融合前三聚化构象F蛋白的表达水平，保持F蛋白融合前三聚体构象的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种RSV融合前构象F蛋白的突变体，其特征是，所述突变体相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含氨基酸突变，所述氨基酸突变为位置392和493的氨基酸或者位置493位附近位置氨基酸分别被半胱氨酸取代，突变后的392C与493C之间，或者突变后的392C与493位附近位置突变为半胱氨酸后形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述493位附近位置包括491位，其突变为491C。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入空腔填充突变，所述空腔填充突变选自以下至少一种：E60I、E60Y、S62V、K80M、K87M、K87Y、V90I、S150L、S150V、S150F、S150W、V154L、K168Y、K168L、K191V、K191L、K191M、K427Y、D448V、D448Y、S190F和V207L、E60I和K191V、S150L和K191V、K191V和D448V、V154L和K191V、K168Y和K191V、K191V和K427Y、S150L和V154L、K427Y和D448V、E60I和S62V、S190F和V207L，或者上述突变位点被任意疏水性氨基酸替代；优选地，所述空腔填充突变选自以下至少一种：K80M、K87M、K87Y、V90I、V154L、K427Y、D448Y以及190F和V207L。
4.根据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括选自K80M、K87M、K87Y、V154L、D448Y、S190F和V207L中的至少一种；或
所述突变体包括突变后的D392C与S491C之间突变后形成二硫键，以及空腔填充突变，所述空腔填充突变包括S190F和V207L突变。
5.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体还引入脯氨酸突变，所述脯氨酸突变选自以下至少一种：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P。
6.根据权利要求1-4任一项所述的突变体，其特征是，所述突变体包括突变后的D392C与S493C之间突变后形成二硫键，以及K87M，或S190F与V207L的空腔填充突变，还包括选自以下至少一种脯氨酸突变：Q210P、S213P、I214P、S215P、N216P、I217P、N183P、S182P、N175P、S173P、G162P、E161P、S213P和I214P、I214P和S215P、S215P和N216P、N216P和I217P、E161P和G162P；或
所述突变体包括突变后的D392C与S491C之间突变后形成二硫键，以及S190F,V207L空腔填充突变，还包括I214P突变。
7.据权利要求1所述的突变体，其特征是，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：39任一所示。
8.一种编码权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的DNA编码序列。
9.根据权利要求8所述的DNA编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40任一所示。
10.一种重组质粒，其插入有权利要求8-9任一项所述DNA编码序列。
11.编码权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体的mRNA序列。
12.一种呼吸道融合病毒(RSV)疫苗，其特征在于，其包含至少一种核糖核酸聚核苷酸，其具有编码权利要求1-7任一项RSV F蛋白融合前构象的突变体或其免疫原性片段的开放阅读框架，及医药学上可接受的载体。
13.权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体、权利要求10所述的mRNA序列在制备RSV疫苗中的应用。
14.权利要求1-7任一项所述RSV融合前构象F蛋白的突变体在呼吸道合胞病毒感染检测中的应用。
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