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CN109069616A - 稳定化的可溶性融合前rsv f蛋白 - Google Patents

稳定化的可溶性融合前rsv f蛋白 Download PDF

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CN109069616A
CN109069616A CN201780021720.8A CN201780021720A CN109069616A CN 109069616 A CN109069616 A CN 109069616A CN 201780021720 A CN201780021720 A CN 201780021720A CN 109069616 A CN109069616 A CN 109069616A
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Janssen Vaccines and Prevention BV
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Abstract

本发明提供了稳定的融合前呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(或其片段)、包含所述蛋白的组合物以及其用于预防和/或治疗RSV感染的用途。

Description

稳定化的可溶性融合前RSV F蛋白
本发明涉及医学领域。本发明特别地涉及重组融合前RSV F蛋白及其例如作为疫苗的用途。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是一种高度传染性的呼吸道儿童病原体，据信这种病原体导致每年约200,000例儿童死亡。在2岁以下的儿童中，由于呼吸道感染，RSV占住院治疗的约50％，其中住院治疗高峰期在2-4个月大发生。据报道，几乎所有儿童在2岁时都会感染RSV，并且在生命中反复感染归因于低天然免疫。在老年人中，RSV疾病负担与由非大流行性A型流感感染引起的那些相似。
为了感染宿主细胞，RSV与其他包膜病毒如流感病毒和HIV一样，需要将病毒膜与宿主细胞膜融合。对于RSV，保守的融合蛋白(RSV F蛋白)融合病毒膜和宿主细胞的细胞膜。在目前的模型中，基于副粘病毒研究，RSV F蛋白最初折叠成“融合前”构象。最近，已经解决了与稳定中和抗体Fab片段复合的亚稳结构(McLellan等人，Science[科学]340(6136):1113-7,2013)。在细胞进入期间，融合前构象经历重折叠和构象变化成为其“融合后”构象(McLellan,J.Virol[病毒学杂志]85(15):7788-96,2010；Swanson,PNAS[美国科学院报]108(23):9619-24,2011)。因此，RSV F蛋白是亚稳蛋白，该亚稳蛋白通过最初折叠成亚稳态形式(融合前构象)，该亚稳态形式随后经历离散/逐步构象变化，成为较低能量构象(融合后构象)将不可逆蛋白重折叠与膜并置相结合来驱动膜融合。这些观察结果表明融合前和融合后RSV F蛋白在抗原性上是不同的(Calder,L.J.等人Virology[病毒学]271,122-131(2000))。从RSV-F的电子显微镜可以清楚地看出，融合前和融合后F三聚体之间存在很大的结构差异，最近已经通过晶体学证实了这一点(McLellan J.S.等人Science[科学]340(6136):1113-7(2013)和McLellan J.S.等人Science[科学]342(6158):592-8(2013))并且已示出，RSV阳性个体血清中的大多数中和抗体与融合前F结合(Ngwuta等人，ScienceTranslational Medicine[科学转化医学],7(309):309ra162,1-9)。
当前不存在针对RSV感染的疫苗，但是其是被希望的。基于RSV F蛋白的疫苗候选物由于例如稳定性、纯度、可再现性和效力的问题而失败。如上所述，晶体结构揭示了融合前状态和融合后状态之间的大的构象变化。重排的程度表明，只有一部分针对RSV-F融合后构象的抗体能够与病毒表面上的融合前刺突的天然构象发生交叉反应。因此，产生针对RSV的疫苗的努力集中于开发含有RSV F蛋白的融合前形式的疫苗(参见例如WO 20101149745、WO 2010/1149743、WO 2009/1079796、WO 2012/158613)。然而，这些努力尚未产生可用于人类测试的候选物稳定的融合前RSV F蛋白。
因此，仍然需要有效的疫苗和针对RSV接种疫苗的方法，特别是包含融合前构象的RSV F蛋白。本发明的目的是提供此类的疫苗和用于以安全和有效的方式针对RSV接种疫苗的方法。
发明内容
本发明提供稳定的、重组的、融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，即处于融合前构象是稳定的可溶形式(即非膜结合的)的重组RSV F蛋白，其中RSV F蛋白包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列或其片段。
在某些实施例中，该RSV F或其片段包含至少一个对该融合前构象F蛋白质具有特异性的表位，其中该至少一个表位被以下蛋白识别：一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:4的重链CDR1区、SEQ ID NO:5的重链CDR2区、SEQ IDNO:6的重链CDR3区和SEQ ID NO:7的轻链CDR1区、SEQ ID NO:8的轻链CDR2区以及SEQ IDNO:9的轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:10的重链CDR1区、SEQ ID NO:11的重链CDR2区、SEQ ID NO:12的重链CDR3区和SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:15的轻链CDR3区。
在某些实施例中，该RSV F蛋白是三聚体的。
本发明还提供了编码根据本发明的融合前RSV F蛋白或其片段的核酸分子和包含此类核酸分子的载体。
本发明还涉及组合物，优选地是免疫原性组合物，其包含所述RSV融合前F蛋白(或其片段)、编码所述RSV融合前F蛋白的核酸分子，并且涉及其在诱导针对RSV F蛋白的免疫应答中的用途，特别涉及其作为疫苗的用途。本发明还涉及用于在受试者中诱导抗呼吸道合胞病毒(RSV)免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者有效量的融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体。优选地，该诱导免疫应答特征在于对RSV的中和抗体和/或针对RSV的保护性免疫。在具体的方面中，本发明涉及一种用于在受试者中诱导中和抗呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白抗体的方法，该方法包括给予受试者有效量的包含融合前RSV F蛋白、编码所述RSV F蛋白的核酸分子、和/或包含所述核酸分子的载体的免疫原性组合物。
附图说明
图1.RSV F变体的示意图。SCDM-单链双重突变体，SCTM-单链三重突变体，PRQM-经加工的四重突变体以及PRPM-经加工的五重突变体。呈递了不含信号肽和p27片段的分泌的蛋白。指示F1和F2结构域，以及融合肽(FP)、次要纤蛋白三聚化结构域(foldon)和F2和F1之间的单链蛋白中的接头(GSGSG)。三个稳定突变(N67I、S215P和D386N)(黑色菱形)。两种可改善与循环菌株(K66E和I76V)的抗原匹配的突变(灰色菱形)。残基位置如在包括信号肽的全长野生型蛋白中进行编码。
图2.具有多个氨基酸取代的经加工的RSV F PR-A2变体的蛋白表达水平和融合前稳定性。转染后72小时，通过与CR9501和CR9503的定量八隅体(Q-Octet)(左边的条形)，以及在收获当天和在4℃储存指定的时间后与融合前特异性CR9501抗体结合的RSV F蛋白的级分(右边的条形)测试细胞培养物上清液中的蛋白表达水平。条形表示2-4次测量的平均值，线条表示值的范围。
图3.纯化的RSV-F蛋白的熔解温度(Tm)。每个测量用点表示。
图4.K66E和I76V氨基酸取代对F蛋白表达水平和融合前稳定性没有影响。转染后96小时，通过与CR9501和CR9503的Q-Octet(左边的条形)，以及在收获当天和在4℃储存指定的时间后与融合前特异性CR9501抗体结合的RSV F蛋白的级分(右边的条形)测试细胞培养物上清液中的蛋白表达水平。条形表示2次测量的平均值，线条表示值的范围。
图5：F蛋白变体在CHO细胞培养上清液中的融合前稳定性。转染后96小时，通过与CR9501和CR9503的Q-Octet，以及在收获当天和在4℃储存指定的时间后与融合前特异性CR9501抗体结合的RSV F蛋白的级分测试细胞培养物上清液中的蛋白表达水平。条形表示2次测量的平均值，线条表示值的范围。PRQM-具有N67I、S215P、K66E和I76V的PR-A2；PRPM-具有N67I、S215P、K66E、I76V和D486N的PR-A2。
图6：本发明的RSV F蛋白在pH 5的CHO细胞培养上清液中保持完整。将含有F蛋白变体的细胞培养上清液的pH调节至pH 5，并在有或没有蛋白酶抑制剂的情况下将样品孵育7天。在还原条件下在SDS-PAGE上分析样品。每种凝胶的第一道是分子量标准标志物；表明了标准蛋白的大小。样品：1-第0天样品；2-第7天在4℃孵育的样品；3-第7天在4℃与蛋白酶抑制剂一起孵育的样品；4-第0天样品；5-第7天在室温孵育的样品；6-第7天在室温与蛋白酶抑制剂一起孵育的样品；7-第0天样品；8-第7天在37℃孵育的样品；9-第7天在37℃与蛋白酶抑制剂一起孵育的样品。在经蛋白加工的样品中，较低的条带代表F1结构域，并且较高的条带代表部分经加工的蛋白(F1+p27)或未经加工的蛋白(F1+F2)。在单链蛋白样品中，条带是F1+F2结构域。PRQM-具有N67I、S215P、K66E和I76V的PR-A2；PRPM-具有N67I、S215P、K66E、I76V和D486N的PR-A2。LNR：K683-065。
图7 RSV F蛋白在CHO细胞培养上清液中的温度稳定性。将上清液样品在45℃-65℃的温度经受热处理30min。用CR9501抗体在ELISA中测量样品中的融合前蛋白的量。将这些值标准化为未处理的样品(20℃)。示出了每种蛋白单独的曲线和所有曲线的叠加(在右下方)。每个点代表重复测量。进行两次测定，每次技术重复2次。使用非线性回归变量斜率方程(GraphPad Prism)拟合曲线；熔解温度(Tm)计算为IC50值。PRQM-具有N67I、S215P、K66E和I76V的PR-A2；PRPM-具有N67I、S215P、K66E、I76V和D486N的PR-A2。
图8：用RSV A2激发后5天，肺和鼻中的RSV滴度。用RSV A2激发后5天，肺(上图)和鼻(下图)中的RSV滴度。较低的检测水平(LOD)由点线表示。平均滴度(log10pfu/克组织)用横条图表示。通过Cochran-Mantel-Haenszel检验(CMH检验)在所有剂量内比较有佐剂的和无佐剂的PRPM组，并且在图(i.m.：肌肉内；i.n：鼻内)中指示了统计学差异。
图9：在初免后第49天针对棉鼠血清中RSV A Long的RSV中和滴度。在初免后第49天在棉鼠血清中测定使用基于ELISA的读数针对RSV A Long的RSV中和滴度(IC50(log2))。每组的平均值用横条图表示。检测限(LOD)设置为3.0(log2并用短划线表示)。通过ANOVA在所有剂量内比较通过有佐剂和无佐剂引起的VNA滴度诱导的PRPM，并且结果示出在图中(i.m.：肌肉内；i.n：鼻内)。
具体实施方式
呼吸道合胞病毒(RSV)的融合蛋白(F)参与了病毒膜与感染所需的宿主细胞膜的融合。将RSV F mRNA翻译成称为F0的574个氨基酸的前体蛋白，该前体蛋白含有在N末端具有26个氨基酸的信号肽序列，该信号肽序列被内质网中的信号肽酶除去。F0在两个位点(在氨基酸残基109/110和136/137之间)处被转运高尔基氏体中的细胞弗林蛋白酶样蛋白酶切割，去除短的糖基化间插序列(也称为p27区域)，包含氨基酸残基110至136，并产生称为F1和F2的两个结构域或亚基。F1结构域(氨基酸残基137-574)在其N-末端含有疏水性融合肽，并且C-末端含有跨膜(TM)(氨基酸残基530-550)和胞质区(氨基酸残基551-574)。F2结构域(氨基酸残基27-109)通过两个二硫键共价连接至F1。F1-F2异二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。
当前不存在针对RSV感染的疫苗，但是其是被希望的。一种产生疫苗的潜在方法是基于纯化的RSV F蛋白的亚基疫苗。然而，对于这种方法，理想的是，纯化的RSV F蛋白处于与RSV F蛋白的融合前状态的构象相似的构象，并且该构象随时间的推移是稳定，并且可以足够的量产生。此外，对于基于亚基的疫苗，RSV F蛋白需要通过缺失跨膜(TM)和胞质区域来截短以产生可溶性的分泌的F蛋白(sF)。因为该TM区域负责膜的锚定和三聚化，所以无锚定的可溶性F蛋白比全长蛋白明显地更不稳定，并且将容易地重折叠成融合后的末端状态。为了获得呈稳定的融合前构象的显示高表达水平和高稳定性的可溶性F蛋白，因此需要将该融合前构象进行稳定化。
先前已在WO 2014/174018和WO 2014/202570中描述了使处于融合前构象的RSV F蛋白稳定的若干种突变。根据本发明的RSV F蛋白包含与两个另外的突变结合的前面描述的突变的独特和特异性子集。根据本发明，已经示出本发明的突变的这种独特的组合导致RSV F蛋白表达水平增加和融合前构象的稳定性增加。
因此，本发明提供了新颖的稳定的可溶性融合前RSV F蛋白，即处于融合前构象稳定的可溶性RSV F蛋白，或其片段。根据本发明的RSV F蛋白包含选自由SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列。
在导致本发明的研究中，将突变的独特组合与异源三聚化结构域一起引入，以获得所述稳定的可溶性融合前RSV F蛋白。本发明的稳定的融合前RSV F蛋白处于融合前构象，即它们包含(展示)至少一个对融合前构象F蛋白具有特异性的表位。对融合前构象F蛋白具有特异性的表位是在融合后构象中不存在的表位。不希望被任何具体的理论所束缚，相信RSV F蛋白的融合前构象可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSV F蛋白上的那些相同的表位，并且因此可以提供用于引发保护性的中和抗体的优点。
在某些实施例中，本发明的RSV融合前F(或其片段)包含至少一个表位，该至少一个表位被以下蛋白识别：一种融合前特异性单克隆抗体(此后称为CR9501)，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:4的重链CDR1区、SEQ ID NO:5的重链CDR2区、SEQ ID NO:6的重链CDR3区和SEQ ID NO:7的轻链CDR1区、SEQ ID NO:8的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:9的轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体(称为CR9502)，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:10的重链CDR1区、SEQ ID NO:11的重链CDR2区、SEQ ID NO:12的重链CDR3区和SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:15的轻链CDR3区。CR9501和CR9502包含重链和轻链可变区域，并且因此分别包含抗体58C5和30D8的结合特异性，抗体58C5和30D8先前已经显示出以其融合前构象而不是融合后构象与RSVF蛋白特异性结合(如在WO 2012/006596中所披露)。
在某些实施例中，该重组的融合前RSV F蛋白是三聚体的。
如贯穿本申请所使用的，核苷酸序列是从5'到3'方向提供，并且氨基酸序列是从N-末端到C-末端提供，如本领域中所习惯的。
如上所述，本发明还涵盖融合前RSV F蛋白的片段。该片段可以来自氨基末端(例如，通过切割信号序列)和羧基末端缺失之一或两者。可以选择片段以包含F蛋白的免疫活性片段，即在受试者中引起免疫应答的部分。这可以使用计算机模拟、体外和/或体内方法容易地确定，这些对于技术人员都是常规的。
在某些实施例中，根据本发明的编码的蛋白包含信号序列，也称为前导序列或信号肽，其对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸1-26。信号序列通常是短(例如5-30个氨基酸长)的氨基酸序列，这些氨基酸序列存在于大多数新合成的蛋白的N-末端，这些新合成的蛋白指向分泌途径，并且通常被信号肽酶切割以产生游离信号肽和成熟蛋白。
在某些实施例中，根据本发明的蛋白不包含信号序列。
本发明进一步提供了编码根据本发明的RSV融合前F蛋白或其片段的核酸分子。
在优选实施例中，对编码根据本发明的RSV F蛋白的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞，优选地人类细胞中表达。密码子优化的方法已知并且已经在先前描述(例如WO 96/09378)。如与野生型序列相比，如果至少一个非优选密码子被更优选的密码子置换，那么认为序列是密码子优化的。在此，非优选密码子是在一种生物体中不如另一个编码相同氨基酸的密码子经常地使用的密码子，并且更优选的密码子是在一种生物体中比一个非优选密码子更经常地使用的密码子。对于特定生物体的密码子使用的频率可见于密码子频率表，如在http://www.kazusa.or.jp/codon中。优选地多于一个非优选密码子，优选地最多的或所有非优选密码子，被更优选的密码子置换。优选地，在一种生物体中最经常使用的密码子用于一种密码子优化的序列。被优选的密码子置换一般导致更高表达。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸分子可以编码相同的蛋白。还应当理解，技术人员可以使用常规技术制造不影响由核酸分子编码的蛋白序列的核苷酸取代，以反映有待表达蛋白的任何具体宿主生物体的密码子使用。因此，除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并型式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括或可以不包括内含子。
核酸序列可以使用常规的分子生物学技术克隆，或通过DNA合成重新产生，这可以通过在DNA合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(GeneArt)、基斯奎思公司(GenScripts)、英杰公司(Invitrogen)、欧陆公司(Eurofins))使用常规程序执行。
在某些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO.21、22或23的核苷酸序列。
本发明还提供了包含如上所述的核酸分子的载体。在某些实施例中，因此根据本发明的核酸分子是载体的一部分。这些载体可以通过本领域技术人员熟知的方法容易地操作，并且可以例如被设计为能在原核和/或真核细胞中复制。此外，许多载体可以用于真核细胞的转化并将整个或部分整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所使用的载体可以是适合克隆DNA并且可以用于转录感兴趣的核酸的任何载体。本领域技术人员能够选择合适的表达载体，并以功能性方式插入本发明的核酸序列中。
包含编码融合前RSV F蛋白的核酸分子的宿主细胞也形成本发明的一部分。融合前RSV F蛋白可以通过重组DNA技术产生，该重组DNA技术涉及在宿主细胞、或转基因动物或植物中表达这些分子，宿主细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人类细胞系(例如HEK293细胞、PER.C6细胞)或酵母、真菌、昆虫细胞等。在某些实施例中，细胞是来自多细胞的生物，在某些实施例中，它们是脊椎动物或无脊椎动物来源的。在某些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施例中，细胞是人类细胞。通常，宿主细胞中一种重组蛋白例如本发明的融合前RSV F蛋白的产生包括将以可表达形式的编码蛋白的异源核酸分子引入该宿主细胞中，在有助于该核酸分子表达的条件下培养这些细胞，以及允许蛋白在所述细胞中表达。以可表达形式编码蛋白的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够引起核酸表达的序列，例如增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。启动子可以是组成型或调节型的，并且可以从不同的来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或人工设计的。
细胞培养基可从不同的供应商获得，并且可以常规地选择合适的培养基用于宿主细胞以表达感兴趣的蛋白，在此是融合前RSV F蛋白。合适的介质可以含有或可以不含有血清。
“异源核酸分子”(在此还被称为“转基因”)是非天然存在于宿主细胞中的核酸分子。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体中。一般地，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。可以添加另外调节序列。许多启动子可用于表达一种或多种转基因，并为技术人员所知，例如这些可以包含病毒、哺乳动物、合成启动子等。用于获得在真核细胞中的表达的适合的启动子的非限制性实例是CMV-启动子(US 5,385,839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含来自CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735到+95。聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素聚A信号(US 5,122,458)可以存在于该(这些)转基因后面。可替代地，若干广泛使用的表达载体在本领域中可获得并且可获自商业来源，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、碧迪科学公司(BD Sciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于重组表达所关注的蛋白，或获得适合的启动子和/或转录终止子序列、聚A序列等。
细胞培养物可以是任何类型的细胞培养物，包括贴壁细胞培养物，例如，附着于培养容器表面或微载体的细胞，以及悬浮培养物。大部分的大规模悬浮培养物是作为分批工艺或分批补料工艺操作，因为它们操作和规模扩大最直接了当。如今，基于灌注原理的连续工艺正变得更常见的并且也是适合的。合适的培养基也是技术人员熟知的，并且通常可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的合适条件是已知的(参见例如TissueCulture[组织培养]，学术出版社(Academic Press)，Kruse和Paterson编辑(1973)，以及R.I.Freshney，Culture of animal cells:A manual of basic technique[动物细胞培养：基本技术手册]，第四版(威利利斯公司，2000，ISBN 0-471-34889-9))。
本发明进一步提供了包含如上所述的融合前RSV F蛋白和/或核酸分子，和/或载体的组合物。本发明因此提供了包含融合前RSV F蛋白(该融合前RSV F蛋白显示在RSV F蛋白的融合前构象中存在但在融合后构象中不存在的一种表位)，或其片段的组合物。本发明还提供了包含编码此类的融合前RSV F蛋白或其片段的核酸分子和/或载体的组合物。如上所述，组合物优选地是包含融合前RSV F蛋白和/或核酸分子和/或载体的免疫原性组合物。本发明还提供稳定的融合前RSV F蛋白或编码根据本发明的所述RSV F蛋白的核酸分子在受试者中诱导针对RSV F蛋白的免疫应答的用途。进一步提供了用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白的免疫应答的方法，这些方法包括给予受试者根据本发明的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体。还提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体，用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白的免疫应答。进一步提供了根据本发明的融合前RSV F蛋白、和/或核酸分子、和/或载体用于制造用于在受试者中诱导针对RSV F蛋白的免疫应答的药剂的用途。
本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子或载体可以用于预防(防治)和/或治疗RSV感染。在某些实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受RSV感染的患者群组。这样的患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁并且优选地≥65岁)、年幼者(例如≤5岁、≤1岁)、住院的患者、以及已经用抗病毒化合物进行治疗但已经显示出不充分抗病毒应答的患者。
根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体可以用于例如由RSV所引起的疾病或病状的独立治疗和/或防治，或与其他防治和/或治疗性治疗，例如(现有或将来)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体组合。
本发明进一步提供了利用根据本发明的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法。在特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗RSV感染的方法包括给予对其有需要的受试者有效量的如上所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体。治疗有效量是指蛋白、核酸分子或载体有效用于预防、缓解和/或治疗由被RSV感染所引起的疾病或病状的量。预防涵盖抑制或减少RSV的传播或抑制或减少与被RSV感染有关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的，改善可以是指减少流感感染的可见或可察觉的疾病症状、病毒血症、或任何其他可测量的表现形式。
为给予受试者，例如人类，本发明可以采用医药组合物，这些医药组合物包含如在此所述的融合前RSV F蛋白、核酸分子和/或载体以及医药学上可接受的载剂或赋形剂。在本上下文中，术语“医药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。这些药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(参见Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]，第18版，A.R.Gennaro编辑，马克出版公司(Mack Publishing Company)[1990]；PharmaceuticalFormulation Development of Peptides and Proteins[肽和蛋白的制药配方开发]，S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑，Taylor和Francis[2000]；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients[药用辅料手册]，第3版，A.Kibbe编辑，英国医药出版社(Pharmaceutical Press)[2000])。尽管还可以运用冻干制剂，但RSV F蛋白、或核酸分子优选地是作为无菌溶液配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的pH通常在pH 3.0到9.5，例如pH 5.0到7.5范围内。RSV F蛋白典型地在具有适合的药学上可接受的缓冲液的溶液中，并且该组合物还可以含有盐。任选地，可以存在稳定剂，例如白蛋白。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，可以将RSV F蛋白配制成可注射制剂。
在某些实施例中，根据本发明的组合物进一步包含一种或多种佐剂。佐剂在本领域中已知来进一步提高对一种所施加的抗原决定簇的免疫应答。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在此可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的RSV F蛋白的免疫应答。合适的助剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如MF59(参见例如WO 90/14837)；皂苷配制品，例如像QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US 5,057,540、WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质A(MPL)、3-O-脱酰基MPL(3dMPL)、含CpG基序的寡核苷酸、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体(例如大肠杆菌热不稳定肠毒素LT、霍乱毒素CT等)；真核蛋白(例如，其抗体或片段(例如针对抗原本身或CD1a，CD3，CD7，CD80)和受体的配体(例如，CD40L，GMCSF，GCSF等)，其在与受体细胞相互作用时刺激免疫应答。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05mg-5mg，例如每剂量铝含量为0.075mg-1.0mg。
这些融合前RSV F蛋白也可以与纳米颗粒组合或与纳米颗粒缀合施用，例如像，聚合物、脂质体、病毒体、病毒样颗粒或自组装蛋白颗粒。这些融合前F蛋白可以在有或者没有佐剂下与纳米颗粒组合、用纳米颗粒壳体包裹或与纳米颗粒结合。封装在脂质体内描述于例如US 4,235,877中。与大分子结合披露在例如US 4,372,945或US 4,474,757中。
在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。
在某些实施例中，本发明提供了用于产生针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗的方法，这些方法包括提供根据本发明的组合物并且将其配制成一种医药学上可接受的组合物。术语“疫苗”是指含有在受试者中有效诱导一定程度的针对某一病原体或疾病的免疫性的活性组分的药剂或组合物，它将引起与被该病原体或该疾病感染有关的症状的严重程度、持续时间或其他表现的至少降低(多达完全缺乏)。在本发明中，该疫苗包含有效量的融合前RSV F蛋白和/或编码融合前RSV F蛋白的核酸分子和/或包含所述核酸分子的载体，它导致针对RSV F蛋白的免疫应答。这提供了在受试者中预防引起住院治疗的严重下呼吸道疾病并且降低由RSV感染和复制引起的并发症例如肺炎和细支气管炎的频率的方法。根据本发明的术语“疫苗”表示它是一种医药组合物，并且因此典型地包括医药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。它可以包含或可以不包含另外的活性成分。在某些实施例中，它可以是一种组合疫苗，该组合疫苗进一步包含了诱发例如针对RSV的其他蛋白和/或针对其他传染物的免疫应答的其他组分。另外的活性组分的给予可以例如通过分开给予或通过给予本发明的疫苗与其他活性组分的组合产物来进行。
可以将组合物给予受试者，例如人类受试者。用于单独给予的组合物中的RSV F蛋白的总剂量可以是例如约0.01μg至约10mg，例如1μg-1mg，例如10μg-100μg。确定所推荐的剂量将通过实验进行并且对本领域技术人员来说是常规的。
根据本发明的组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实施例包括不经肠给予，例如皮内、肌内、皮下、经皮、或粘膜给予，例如鼻内、经口等。在一个实施例中，通过肌内注射来给予组合物。技术人员已知给予组合物(例如疫苗)以便诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同的可能性。
如在此所使用的受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、棉鼠、或非人类灵长类动物或人类。优选地，该受试者为人类受试者。
蛋白、核酸分子、载体、和/或组合物还可以在同源或异源初免-加强方案中作为初次来给予或作为加强来给予。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在该组合物第一次给予受试者(在这些情况下这被称为“初次疫苗接种”)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时间处给予至同一受试者。在某些实施例中，给予包括初次给予和至少一次加强给予。
此外，本发明的蛋白可以用作诊断工具，例如通过确定这样的个体的血清中是否存在能够结合本发明的蛋白的抗体来测试个体的免疫状态。因此,本发明还涉及用于检测患者中RSV感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括步骤：a)使获得自所述患者的生物样品与根据本发明的蛋白接触；以及b)检测抗体-蛋白复合物的存在。
实例
实例1：产生稳定的融合前RSV F蛋白
产生了若干种融合前RSV F蛋白变体，其示意性地示于图1中。所有候选物包含与RSV A2 F1结构域的氨基酸残基495连接的次要纤蛋白三聚化结构域(foldon)(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL；SEQ ID NO:20)。
在RSV F的经加工版本中(即切割去除p27区域的版本)，N67I取代对表达水平和稳定性具有最强的影响，但仅在67和215取代组合时获得完全稳定的融合前F蛋白，导致表达水平增加20倍(图2)。如通过在4℃的储存稳定性所测量的，添加第三个氨基酸取代没有改善表达水平或稳定性。然而，当RSV F蛋白被纯化并进一步表征时，结果表明，如通过更严格的温度稳定性测试(通过差示扫描荧光测定法-DSF)测量，额外的第三个取代显著地稳定了融合前F蛋白(图3)。
因为用作先前(WO 2014/174018和WO 2014/202570)描述的RSV F蛋白变体的亲本序列的A2菌株是细胞系适应实验室菌株，其在顶点(K66和I76)中积累了两个独特且罕见的突变，决定了突变这两个残基以匹配天然临床分离株(K66E、I76V)。K66E和I76V突变包含在新的经加工的蛋白设计中，以使序列更接近天然病毒分离株。在选定的稳定化变体中测试K66E+I76V取代，以证明氨基酸取代对蛋白表达或稳定性没有负面影响。结果示出，蛋白在细胞培养上清液中是稳定的，持续超过2周。对F蛋白的表达水平没有负面影响，相反地，具有N67I、S215P、K66E和I76V突变的RSV F蛋白表达水平高于仅具有N67I和S215P的蛋白(图4)。
将具有N67I、S215P、K66E和I76V的经蛋白加工的RSV F(针对经加工的四重突变体命名为PRQM)和具有N67I、S215P、K66E、I76V和D486N的经加工的RSV F蛋白(针对经加工的五重突变体命名为PRPM)进行纯化和进一步表征。
在悬浮HEK细胞(FreeStyle 293F)中进行RSV F蛋白的稳定突变的筛选。这些细胞便于在研究实验室中使用，因为它们适用于简单的转染方案并且高水平表达蛋白。对于大规模和GMP蛋白生产，CHO细胞通常是选择的细胞系。因此，在悬浮CHO细胞(FreeStyle CHO-S)中测试了若干种优选的F蛋白设计的表达和稳定性。CHO-S细胞难以转染，并且因此预期总体表达水平低于HEK细胞中的表达水平。因此，在分析过程中，我们关注蛋白的相对表达及其稳定性。
选择五种经蛋白加工的用于测试。5种变体均含有取代K66E、I76V、N67I和S215P。如上所述，需要后2者使处于融合前构象的蛋白稳定；前两者被包括在内以使序列更接近天然存在的分离株(如前一节中所述)。蛋白的不同在于额外的突变E161P、D486N和E487Q。选择这些是因为高表达水平、储存稳定性和对抗原性的低影响。所有蛋白在CHO细胞中表达并具有相当的储存稳定性。当在4℃在细胞培养物上清液中储存持续2周时，处于融合前构象的RSV F蛋白是稳定的(图5)。此外，测试了RSV F蛋白在pH 5的CHO细胞培养上清液中的稳定性。如图6所示，检测到在不同温度孵育蛋白样品持续7天后没有降解。
总之，本发明的RSV F蛋白在CHO细胞中表达并且在细胞培养上清液中是稳定的。另外，测试了蛋白的温度稳定性。对细胞培养上清液进行热处理，并在ELISA中用CR9501抗体测量样品中融合前蛋白的量(图7)。
具有D486N(PRPM蛋白)的变体对温度应力最稳定。与具有最小量修饰的蛋白(PRQM)相比，添加K498R突变似乎没有优势。具有E161P突变的变体具有最高的表达水平(数据未示出)。然而，这种氨基酸取代的缺点是残基161位于蛋白表面和CR9501抗体表位的边缘。
根据本发明，因此示出处于融合前构象的作为具有最少的所需序列修饰的经加工的融合前蛋白的PRPM(具有次要纤蛋白三聚化结构域(foldon)且具有突变N67I、S215P、K66E、I76V和D486N的RSV F蛋白，SEQ ID NO:1)和PRQM(具有次要纤蛋白三聚化结构域(foldon)且具有N67I、S215P、K66E、和I76V的RSV F蛋白，SEQ ID NO:2)，以及PRQM+S46G或PRPM+S46G变体均是稳定的并示出高Tm(表1)。具有S46G取代的后一种变体具有显著更高的表达水平。
表1.
实例2：PRPM在有和没有佐剂的情况下诱导的免疫原性和保护作用
在同源RSV-A2激发棉鼠模型中存在或不存在佐剂的情况下，进行实验以确定重组PRPM蛋白的免疫原性和预防功效。在第0天和第28天用2剂PRPM(5μg和0.5μg)，无佐剂或有佐剂100μg Adjuphos的情况下，对动物进行i.m.免疫。在第49天用105(pfu)RSV A2激发动物。激发后5天处死动物，并在肺和鼻中测量滴度。
结果
用有佐剂的PRPM免疫诱导肺和鼻中的完全保护，除了1只在鼻上示出突破的动物外。接受5μg和0.5μg无佐剂的PRPM的大多数动物在肺和鼻上都示出突破，并且在接受有佐剂的和无佐剂的蛋白的组之间存在显著差异(图8)。与免疫后第49天的无佐剂的蛋白相比，有佐剂的蛋白诱导了显著更高的VNA滴度(图9)。
表1.抗体序列
序列
SEQ ID NO:1:PRPM
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:2 PRQM
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:3 PRPM+S46G
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYV RKDGEWVLLSTFL
CR9501重链(SEQ ID NO:16)：
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501轻链(SEQ ID NO:17)：
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CR9502重链(SEQ ID NO:18)：
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502轻链(SEQ ID NO:19)：
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
编码PRPM的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)：
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCATTGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCGGAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTG
编码PRQM的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)：
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGGTCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGCGAGCTGCCCCGGTTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCTCTGCCATTGCTAGCGGCGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTGTCATTCTTTCCACAGGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCAGCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGTCCGCCATCGGCGGCTACATCCCCGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTACGTGCGGAAGGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGTCTACCTTCCTG
编码PRPM+S46G的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)：
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGCTTTGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTATCTGGGCGCCCTGAGAACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAAGAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAGTGAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAATGCCGTGACCGAACTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGAAGAGAACTGCCCAGATTCATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTTCTGCTGGGAGTGGGAAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCCGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGAGCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCTCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAACAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCTGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGTCCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATTATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCTCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCTCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACAGAGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCTCCGTCTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAATCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACAAGCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCTGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCAACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAAGTGAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGTCCGATGAGCTGCTGAGCGCCATCGGCGGCTACATCCCTGAGGCCCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTGCGGAAGGACGGCGAATGGGTGCTGCTGTCTACCTTTCTG

Claims (11)

1.一种重组融合前呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白，其包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的氨基酸序列，或其片段。
2.根据权利要求1所述的融合前RSV F或其片段，其包含至少一个对该融合前构象F蛋白质具有特异性的表位，其中该至少一个表位被以下蛋白识别：一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:4的重链CDR1区、SEQ ID NO:5的重链CDR2区、SEQ ID NO:6的重链CDR3区和SEQ ID NO:7的轻链CDR1区、SEQ ID NO:8的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:9的轻链CDR3区；和/或一种融合前特异性单克隆抗体，该融合前特异性单克隆抗体包含SEQ ID NO:10的重链CDR1区、SEQ ID NO:11的重链CDR2区、SEQ ID NO:12的重链CDR3区和SEQ ID NO:13的轻链CDR1区、SEQ ID NO:14的轻链CDR2区以及SEQ ID NO:15的轻链CDR3区。
3.根据权利要求1或2所述的融合前RSV F蛋白或其片段，其中该蛋白是三聚体的。
4.一种编码根据权利要求1、2或3中任一项所述的融合前RSV F蛋白或其片段的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中已经将该核酸分子密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。
6.根据权利要求4或5所述的核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23组成的组的核苷酸序列。
7.一种载体，其包含根据权利要求4、5或6所述的核酸分子。
8.一种组合物，其包含根据权利要求1、2或3所述的融合前RSV F蛋白或其片段、根据权利要求4、5或6所述的核酸分子、和/或根据权利要求7所述的载体。
9.根据权利要求8所述的组合物，用于诱导针对RSV F蛋白的免疫应答。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，用于预防和/或治疗RSV感染。
11.一种针对RSV疫苗，其包含权利要求1、2或3所述的融合前RSV蛋白或其片段、根据权利要求4、5或6所述的核酸分子和/或根据权利要求7所述的载体。
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