MD3439672T2 - Proteine F RVS de pre-fuziune solubile stabilizate pentru utilizare în profilixia infecţiilor cu RSV - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la proteine F de pre-fuziune stabilizate (sau fragmentul acestora) ale virusului sinciţial respirator (RSV), la compoziţii care cuprind proteinele menţionate şi utilizări ale acestora pentru profilaxia şi/sau tratamentul infecţiei cu RSV.

Description

Prezenta invenţie se referă la domeniul medicinei. Invenţia se referă în special la proteine F RSV recombinante de pre-fuziune şi la utilizări ale acestora, de ex., ca vaccin.

Stadiul tehnicii

Virusul respirator sinciţial (RVS) este un agent patogen al copilăriei extrem de contagios al căilor respiratorii, despre care se crede că este responsabil pentru ∼200.000 de decese anual în copilărie. La copiii cu vârsta mai mică de 2 ani, RVS reprezintă aproximativ 50% dintre spitalizările din cauza infecţiilor respiratorii, cu un vârf de spitalizare care are loc la vârsta de 2-4 luni. S-a raportat că aproape toţi copiii au avut infecţie cu RSV până la vârsta de doi ani, iar infecţia repetată în timpul vieţii este atribuită imunităţii naturale scăzute. La vârstnici, efectul bolii RSV este similar cu cel cauzat de infecţiile cu gripă A nepandemică.

Pentru a infecta o celulă gazdă, RSV, ca şi alţi viruşi anvelopaţi, cum ar fi, virusul gripal şi HIV, necesită fuziunea membranei virale cu membrana celulei gazdă. Pentru RSV proteina de fuziune conservată (proteina F RSV) fuzionează membranele celulare virale şi ale celulelor gazdă. În modelele actuale, bazate pe studii de paramixovirus, proteina F RSV se pliază iniţial într-o conformaţie "pre-fuziune". Structura metastabilă a fost recent soluţionată în complex cu un fragment Fab de anticorp neutralizant stabilizator (McLellan ş.a., Science 340 (6136): 1113-7, 2013). În timpul intrării celulei, conformaţia pre-fuziune suferă modificări conformaţionale şi de re-pliere a conformaţiei sale "post-fuziune" (McLellan, J. Virol 85 (15): 7788-96, 2010; Swanson, PNAS 108 (23): 9619-24, 2011). Astfel, proteina F RSV este o proteină metastabilă care antrenează fuziunea membranei prin cuplarea re-plierii ireversibile a proteinei la juxtapunerea membranei prin plierea iniţială într-o formă metastabilă (conformaţie pre-fuziune) care ulterior suferă modificări conformaţionale discrete/treptate la o conformaţie de energie inferioară (conformaţie post-fuziune). Aceste observaţii sugerează că proteina F RSV de pre-fuziune şi post-fuziune sunt distincte antigenic (Calder, L. J. ş.a. Virology 271, 122-131 (2000)). Din microscopia electronică a RSV-F este clar că există diferenţe structurale mari între trimerul F de pre-fuziune şi post-fuziune, care au fost confirmate recent prin cristalografie (McLellan J.S. ş.a. Science 340 (6136): 1113-7 (2013)) şi McLellan J.S. ş.a. Science 342 (6158): 592-8 (2013))) şi s-a arătat că majoritatea anticorpilor neutralizanţi din serul indivizilor RSV-pozitivi se leagă de F de pre-fuziune (Ngwuta et. al., Science Translational Medicine, 7 (309): 309ra162, 1-9).

Un vaccin împotriva infecţiei cu RSV nu este disponibil în prezent, dar este dorit. Candidaţii la vaccin pe baza proteinei F RSV au eşuat din cauza problemelor cu, de ex., stabilitatea, puritatea, reproductibilitatea şi eficienţa. Aşa cum s-a indicat anterior, structurile cristaline au dezvăluit o mare schimbare conformaţională între stările de pre-fuziune şi post-fuziune. Amploarea rearanjării a sugerat că doar o porţiune de anticorpi direcţionaţi către conformaţia post-fuziune a RSV-F va putea reacţiona încrucişat cu conformaţia nativă a vârfului de pre-fuziune de pe suprafaţa virusului. În consecinţă, eforturile de a produce un vaccin împotriva RSV s-au concentrat pe dezvoltarea vaccinurilor care conţin forme de pre-fuziune ale proteinei F RSV (a se vedea, de ex., WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, WO2012/158613). Cu toate acestea, aceste eforturi nu s-au obţinut încă proteine F RSV stabile de pre-fuziune, care ar putea fi utilizate ca candidaţi pentru testare la oameni.

Prin urmare, rămâne o nevoie de vaccinuri eficiente şi metode de vaccinare împotriva RSV, în special care cuprind proteine F RSV în conformaţia de pre-fuziune. Prezenta invenţie îşi propune să furnizeze astfel de vaccinuri şi metode pentru vaccinarea împotriva RSV într-un mod sigur şi eficient.

Rezumatul invenţiei

Invenţia este definită în revendicări.

Prezenta invenţie furnizează o proteină de fuziune (F) a virusului respirator sinciţial pre-fuzionat recombinant (RSV), care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SECV ID NR: 1 pentru utilizare în profilaxia infecţiei cu RSV.

Prezenta dezvăluire oferă proteine de fuziune (F) stabile, pentru virusul respirator sinciţial (RSV) recombinant de pre-fuziune, adică proteine F RSV recombinante în formă solubilă (adică nu sunt legate de membrană) care sunt stabilizate în conformaţia pre-fuziune, în care proteina F RSV cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul care constă din SECV ID NR: 1, SECV ID NR: 2 şi SECV ID NR: 3, sau fragmente ale acestora.

În anumite exemple de realizare, proteina de pre-fuziune F RSV pentru utilizare conform invenţiei cuprinde cel puţin un epitop care este specific proteinei F de conformaţie pre-fuziune, în care cel puţin un epitop este recunoscut de un anticorp monoclonal specific pre-fuziune care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID NR: 4, o regiune CDR2 a lanţului greu din SECV ID NR: 5, o regiune CDR3 a lanţului greu din SECV ID NR: 6 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SECV ID NR: 7, o regiunea CDR2 a lanţului uşor din SECV ID NR: 8 şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR: 9 şi/sau un anticorp monoclonal specific de pre-fuziune, care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID NR: 10, o regiune CDR2 a lanţului greu din SEQ ID NR: 11, o regiune CDR3 a lanţului greu din SEQ ID NR: 12 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SEQ ID NR: 13, o regiune CDR2 a lanţului uşor din SEQ ID NR: 14 şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR. 15.

În anumite exemple de realizare, proteina F RSV de pre-fuziune pentru utilizare conform invenţiei este trimerică.

Dezvăluirea furnizează, de asemenea, molecule de acid nucleic care codifică proteinele F RSV de pre-fuziune, sau fragmente ale acestora şi vectori care cuprind astfel de molecule de acid nucleic.

Dezvăluirea se referă, de asemenea, la compoziţii, preferabil compoziţii imunogene, care cuprind proteina F RSV de pre-fuziune (sau fragmente ale acesteia), molecula de acid nucleic care codifică respectiva proteină F RSV de pre-fuziune şi la utilizarea acestora în inducerea unui răspuns imun împotriva proteinei F RSV, în special pentru utilizarea acestora ca vaccin. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la metode pentru inducerea unui răspuns imun la virusul sinciţial anti-respirator (RSV) la un subiect, care cuprinde administrarea unui subiect a unei cantităţi eficiente de proteină F RSV de pre-fuziune, a unei molecule de acid nucleic care codifică respectiva proteină F RSV, şi/sau un vector care cuprinde molecula de acid nucleic menţionată. De preferinţă, răspunsul imun indus este caracterizat prin neutralizarea anticorpilor la RSV şi/sau imunitatea de protecţie împotriva RSV. În anumite aspecte, dezvăluirea se referă la o metodă pentru inducerea anticorpilor de proteină F (RSV) a virusului sinciţial anti-respirator la un subiect, care cuprinde administrarea unui subiect a unei cantităţi eficiente dintr-o compoziţie imunogenă care cuprinde o proteină F RSV de pre-fuziune, o moleculă de acid nucleic care codifică proteina F RSV menţionată şi/sau un vector care cuprinde molecula de acid nucleic menţionată.

Scurtă descriere a figurilor

FIG 1. Reprezentarea schematică a variantelor F RSV. SCDM - mutant dublu monocatenar, SCTM - mutant triplu monocatenar, PRQM - mutant cvadruplu procesat şi PRPM - penta-mutant procesat. Proteinele secretate sunt prezentate fără peptidă semnal şi fragment p27. Sunt indicate domeniile F1 şi F2, precum şi peptida de fuziune (FP), domeniul de trimerizare a fibritinei (foldon) şi linkerul în proteinele monocatenare dintre F2 şi F1 (GSGSG). Trei mutaţii stabilizatoare (N67I, S215P şi D486N) (romburi negre). Două mutaţii pentru îmbunătăţirea potrivirii antigenice cu tulpinile circulante (K66E şi I76V) (romburi gri). Poziţia restului este numerotată ca în proteina de tip sălbatic de lungime completă, inclusiv peptida semnal.

FIG. 2. Nivelurile de exprimare a proteinelor şi stabilitatea de pre-fuziune a variantelor RSV F PR-A2 procesate cu substituţii multiple de aminoacizi. Nivelurile de exprimare a proteinelor în supernatantele de cultură celulară au fost testate la 72 de ore după transfecţie prin octet cantitativ (Q-Octet) cu CR9501 şi CR9503 (bare în stânga) şi fracţia de proteină F RSV care se leagă la anticorpul CR9501 specific de pre-fuziune în ziua recoltării şi după depozitare la 4°C pentru perioada de timp indicată (bare în dreapta). Barele reprezintă media a 2-4 măsurători, liniile reprezintă intervalul de valori.

FIG. 3. Temperaturile de topire (Tm) ale proteinelor RSV-F purificate. Fiecare măsurare este reprezentată printr-un punct.

FIG. 4. Substituţiile de aminoacizi K66E şi I76V nu au avut efect asupra nivelurilor de exprimare a proteinelor F şi asupra stabilităţii pre-fuziunii. Nivelurile de exprimare a proteinelor în supernatantele de cultură celulară au fost testate la 96 de ore după transfecţie prin Q-Octet cu CR9501 şi CR9503 (bare în stânga) şi fracţia de proteină F RSV care se leagă la anticorpul CR9501 specific de pre-fuziune în ziua recoltării şi după depozitare la 4°C pentru perioada de timp indicată (bare în dreapta). Barele reprezintă media a 2 măsurători, liniile reprezintă intervalul de valori.

FIG. 5: Stabilitatea pre-fuziune a variantelor de proteină F în supernatantul de cultură de celule CHO. Nivelurile de exprimare a proteinelor în supernatantele culturii celulare au fost testate la 96 de ore după transfecţie prin Q-Octet cu CR9501 şi CR9503 şi fracţia de legare a proteinelor F RSV la anticorpul CR9501 specific de pre-fuziune în ziua recoltării şi după depozitare la 4°C pentru perioada indicată de timp. Barele reprezintă media a 2 măsurători, liniile reprezintă intervalul de valori. PRQM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E şi I76V; PRPM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E, I76V şi D486N.

FIG. 6: Proteinele F RSV ale invenţiei rămân intacte în supernatantul culturii de celule CHO la pH5. pH-ul supernatanţilor de cultură celulară care conţin variante de proteine F a fost ajustat la pH5 şi probele au fost incubate la 7 zile, cu sau fără inhibitori de protează. Probele au fost analizate pe SDS-PAGE în condiţii de reducere. Prima bandă a fiecărui gel este un marker de greutate moleculară standard; este indicată dimensiunea proteinelor standard. Probele: 1 - probă de ziua 0; 2 - probă de ziua 7 incubată la 4°C; 3 - probă de ziua 7 incubată la 4°C cu inhibitori de protează; 4 - probă de ziua 0; 5 - probă de ziua 7 incubată la temperatura camerei; 6 - proba de ziua 7 incubată la temperatura camerei cu inhibitori de protează; 7 - proba de ziua 0; 8 - proba de ziua 7 incubată la 37°C; 9 - probă de ziua 7 incubată la 37°C cu inhibitori de protează. În probele de proteine procesate, banda inferioară reprezintă domeniul F1, iar banda superioară reprezintă proteina parţial procesată (F1 + p27), sau proteina F1 + F2 neprocesată). În proba de proteine monocatenare, banda este domeniile F1+F2. PRQM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E şi I76V; PRPM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E, I76V şi D486N. LNR:K683-065.

FIG. 7 Stabilitatea la temperatură a proteinelor F RSV în supernatantul de cultură de celule CHO. Probele de supernatant au fost supuse tratamentului termic timp de 30 min la temperaturi de 45-65°C. Cantitatea de proteină de pre-fuziune din probă a fost măsurată în ELISA cu anticorpi CR9501. Valorile au fost normalizate la proba netratată (20°C). Curbele sunt prezentate individual pentru fiecare proteină şi o suprapunere a tuturor curbelor (în dreapta jos). Fiecare punct reprezintă o măsurătoare replicată. Au fost efectuate două teste cu câte 2 replici tehnice fiecare. Curbele au fost montate utilizând ecuaţia pantei variabile de regresie neliniară (GraphPad Prism); temperaturile de topire (Tm) au fost calculate ca valori IC50. PRQM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E şi I76V; PRPM - PR-A2 cu N67I, S215P, K66E, I76V şi D486N.

FIG. 8: titruri de RSV în plămâni şi nas la 5 zile după provocarea cu RSV A2. Titrurile RSV în plămâni (panoul superior) şi nas (panoul inferior) la 5 zile după provocarea cu RSV A2. Nivelul inferior de detectare (LOD) este indicat printr-o linie punctată. Titrurile medii (log10 pfu pe gram de ţesut) sunt indicate cu bare orizontale. Grupurile PRPM adjuvantate şi non-adjuvantate au fost comparate în lungul dozei printr-un test Cochran-Mantel-Haenszel şi diferenţele statistice sunt indicate în figură. i.m.: intramuscular; i.n: intranazal.

FIG. 9: Titruri de neutralizare a RSV împotriva RSV A Lung în seruri de şobolani de bumbac în ziua 49 după amorsare. Titrurile de neutralizare a RSV (IC50 (log2)) împotriva RSV A Long folosind o citire bazată pe ELISA au fost determinate în seruri de şobolan de bumbac în ziua 49 după pregătire. Media fiecărui grup este indicată cu o bară orizontală. Limita de detectare (LOD) este setată la 3.0 (log2 şi indicată cu o linie punctată). Titrurile VNA induse de PRPM prin adjuvant şi non-adjuvant au fost comparate în doză de ANOVA şi rezultatele sunt indicate în figură. i.m.: intramuscular; i.n: intranazal.

Descriere detaliată a invenţiei

Invenţia este definită în revendicări.

Proteina de fuziune (F) a virusului sincictial respirator (RSV) este implicată în fuziunea membranei virale cu membrana celulei gazdă, care este necesară pentru infecţie. mARN al RSV F este translatat într-o proteină precursor de 574 aminoacizi denumită F0, care conţine o secvenţă de peptidă semnal de 26 de aminoacizi la capătul N-terminal care este îndepărtat de o peptidază semnal în reticulul endoplasmatic. F0 este clivată în două situsuri (între resturile de aminoacizi 109/110 şi 136/137) prin proteaze celulare de tip furină în trans-Golgi, îndepărtând o scurtă secvenţă intermediară glicozilată (menţionată, de asemenea, la o regiune p27, care cuprinde resturile de aminoacizi 110 până la 136 şi generează două domenii, sau subunităţi denumite F1 şi F2. Domeniul F1 (resturile de aminoacizi 137-574) conţine o peptidă de fuziune hidrofobă la capătul său N-terminal şi capătul C-terminal conţine transmembrana (TM) (resturile de aminoacizi 530-550) şi regiunea citoplasmatică (resturile de aminoacizi 551-574). Domeniul F2 (resturile de aminoacizi 27-109) este legat covalent de F1 prin două punţi disulfură. Heterodimerii F1-F2 sunt asamblaţi ca homotrimeri în virion.

Un vaccin împotriva infecţiei cu RSV nu este disponibil în prezent, dar este dorit. O abordare potenţială a producerii unui vaccin este un vaccin subunitar pe bază de proteină F RSV purificată. Cu toate acestea, pentru această abordare este de dorit ca proteina F RSV purificată să aibă o conformaţie care seamănă cu conformaţia stării de pre-fuziune a proteinei F RSV şi care este stabilă în timp şi poate fi produsă în cantităţi suficiente. În plus, pentru un vaccin pe bază de subunităţi, proteina F RSV trebuie tăiată prin ştergerea transmembranei (TM) şi a regiunii citoplasmatice pentru a crea o proteină F secretată solubilă (sF). Deoarece regiunea TM este responsabilă pentru ancorarea şi trimerizarea membranei, proteina F solubilă fără ancoră este considerabil mai labilă decât proteina de lungime completă şi se va re-plia cu uşurinţă în starea finală post-fuziune. Pentru a obţine proteina F solubilă în conformaţia stabilă pre-fuziune care prezintă niveluri ridicate de expresie şi stabilitate ridicată, conformaţia pre-fuziune trebuie astfel stabilizată.

Mai multe mutaţii care stabilizează proteina F RSV în conformaţia pre-fuziune au fost descrise anterior în WO2014/174018 şi WO2014/202570. Proteinele F RSV pentru utilizare conform prezentei invenţii cuprind un subgrup unic şi specific de mutaţii descrise anterior în combinaţie cu alte două mutaţii. Conform dezvăluirii s-a arătat că această combinaţie unică de mutaţii rezultă în niveluri crescute de exprimare a proteinei F RSV şi stabilitatea conformaţiei pre-fuziune.

Prezenta dezvăluire oferă astfel noi proteine RSV F solubile stabile de pre-fuziune, adică proteine F RSV solubile care sunt stabilizate în conformaţia pre-fuziune, sau fragmente ale acestora. Proteinele F RSV conform prezentei dezvăluiri cuprind o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul care constă din SECV ID NR: 1, SECV ID NR: 2 şi SECV ID NR: 3.

În cercetarea care a condus la prezenta invenţie, a fost introdusă o combinaţie unică de mutaţii împreună cu un domeniu de trimerizare heteroloagă pentru a obţine proteinele F RSV solubile stabile de pre-fuziune. Proteinele RS-F stabile de pre-fuziune pentru utilizare conform invenţiei sunt în conformaţia de pre-fuziune, adică ele cuprind (afişează) cel puţin un epitop care este specific proteinei F de conformare de pre-fuziune. Un epitop care este specific conformaţiei de pre-fuziune a proteinei F este un epitop care nu este prezentat în conformaţia post-fuziune. Fără dorinţa de a fi legat de vreo teorie anume, se crede că conformaţia pre-fuziune a proteinei RSV F poate conţine epitopi care sunt identici cu cei de pe proteina F RSV exprimată pe virioni RSV naturali şi, prin urmare, poate oferi avantaje pentru obţinerea anticorpilor neutralizanţi de protecţie.

În anumite exemple de realizare, proteinele F de pre-fuziune RSV pentru utilizare conform invenţiei cuprind cel puţin un epitop care este recunoscut de un anticorp monoclonal specific de pre-fuziune, care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID NR: 4, o regiune CDR2 a lanţului greu din SECV ID NR: 5, o regiune CDR3 a lanţului greu din SECV ID NR: 6 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SECV ID NR: 7, o regiunea CDR2 a lanţului uşor din SECV ID NR: 8 şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR: 9 (denumită în continuare CR9501) şi/sau un anticorp monoclonal specific de pre-fuziune, care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID NR: 10, o regiune CDR2 a lanţului greu din SEQ ID NR: 11, o regiune CDR3 a lanţului greu din SEQ ID NR: 12 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SEQ ID NR: 13, o regiune CDR2 a lanţului uşor din SEQ ID NR: 14 şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR. 15. (denumită în continuare CR9502). CR9501 şi CR9502 cuprind regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor şi, prin urmare, specificităţile de legare, ale anticorpilor 58C5 şi respectiv 30D8, care s-au dovedit anterior că se leagă în mod specific la proteina F RSV în conformaţia sa de pre-fuziune şi nu la conformaţia post-fuziune (aşa cum este prezentat în WO2012/006596).

În anumite exemple de realizare, proteinele recombinante F RSV de pre-fuziune sunt trimerice.

Aşa cum se utilizează pe parcursul prezentei cereri, secvenţele de nucleotide sunt furnizate de la direcţia 5' la 3' şi secvenţele de aminoacizi de la N-terminal la C-terminal, aşa cum se obişnuieşte în domeniu.

Aşa cum s-a indicat anterior, sunt, de asemenea, dezvăluite fragmente ale proteinei F RSV de pre-fuziune.

Fragmentul poate rezulta din una sau ambele ştergeri amino-terminale (de ex., prin scindarea secvenţei semnalului) şi carboxi-terminale. Fragmentul poate fi ales pentru a cuprinde un fragment activ imunologic al proteinei F, adică o parte care va da naştere unui răspuns imun la un subiect. Acest lucru poate fi uşor determinat folosind metode in silico, in vitro şi/sau in vivo, toate de rutină pentru persoanele de specialitate în domeniu.

În anumite exemple de realizare, proteina codificată pentru utilizare conform invenţiei cuprinde o secvenţă semnal, denumită şi secvenţă lider sau peptidă semnal, care corespunde aminoacizilor 1-26 din SECV ID NR: 1. Secvenţele semnal sunt de obicei secvenţe de aminoacizi scurte (de ex., 5-30 aminoacizi lungi) prezente la capătul N-terminal al majorităţii proteinelor nou sintetizate care sunt destinate spre calea secretorie şi sunt de obicei scindate de peptidază semnal pentru a genera o peptidă semnal liberă şi o proteină matură.

În anumite exemple de realizare, proteinele utilizate conform invenţiei nu cuprind o secvenţă semnal.

Prezenta dezvăluire oferă, în plus, molecule de acid nucleic care codifică proteinele F de pre-fuziune RSV, sau fragmente ale acestora, conform dezvăluirii.

În aspectele preferate ale dezvăluirii, moleculele de acid nucleic care codifică proteinele F RSV sunt optimizate cu codoni pentru exprimare în celule de mamifere, preferabil celule umane. Metodele de optimizare a codonilor sunt cunoscute şi au fost descrise anterior (de ex., WO 96/09378). O secvenţă este considerată optimizată pentru codoni dacă cel puţin un codon nepreferat în comparaţie cu o secvenţă de tip sălbatic este înlocuit cu un codon care este mai preferat. Aici, un codon nepreferat este un codon care este utilizat mai rar într-un organism decât un alt codon care codifică acelaşi aminoacid şi un codon care este mai preferat este un codon care este utilizat mai frecvent într-un organism decât un codon nepreferat. Frecvenţa utilizării codonilor pentru un anumit organism poate fi găsită în tabelele de frecvenţă ale codonilor, cum ar fi, în http://www.kazusa.or.jp/codon. De preferinţă, mai mult de un codon nepreferat, preferabil majoritatea, sau toţi codonii nepreferaţi, sunt înlocuiţi cu codoni care sunt mai preferaţi. De preferinţă, codonii cei mai frecvent utilizaţi într-un organism sunt utilizaţi într-o secvenţă optimizată pentru codoni. Înlocuirea cu codoni preferaţi duce în general la o expresie mai mare.

O persoană de specialitate va înţelege că numeroase polinucleotide şi molecule de acid nucleic diferite pot codifica aceeaşi proteină ca urmare a degenerării codului genetic. Se înţelege, de asemenea, că persoanele calificate pot, folosind tehnici de rutină, să facă substituţii de nucleotide care nu afectează secvenţa de proteine codificată de moleculele de acid nucleic pentru a reflecta utilizarea codonilor ai oricărui anumit organism gazdă în care proteinele trebuie exprimate. Prin urmare, dacă nu se specifică altfel, o "secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă de aminoacizi" include toate secvenţele de nucleotide care sunt versiuni degenerate una de alta şi care codifică aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Secvenţele de nucleotide care codifică proteinele şi ARN-ul pot include sau nu introni.

Secvenţele de acid nucleic pot fi clonate folosind tehnici de rutină de biologie moleculară, sau generate de novo prin sinteza ADN-ului, care poate fi realizată folosind proceduri de rutină de către companiile de servicii care au activităţi în domeniul sintezei ADN şi/sau clonării moleculare (de ex., GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).

În anumite aspecte ale dezvăluirii, moleculele de acid nucleic cuprind o secvenţă de nucleotide din SECV ID NR 20, 21 sau 22.

Dezvăluirea oferă, de asemenea, vectori care cuprind o moleculă de acid nucleic aşa cum s-a descris anterior. În anumite aspecte, o moleculă de acid nucleic conform dezvăluirii face astfel parte dintr-un vector. Astfel de vectori pot fi manipulaţi cu uşurinţă prin metode bine cunoscute persoanei de specialitate în domeniu şi pot fi, de exemplu, proiectaţi pentru a fi capabili de replicare în celule procariote şi/sau eucariote. În plus, mulţi vectori pot fi utilizaţi pentru transformarea celulelor eucariote şi se vor integra total sau parţial în genomul acestor celule, rezultând celule gazdă stabile care cuprind acidul nucleic dorit în genomul lor. Vectorul utilizat poate fi orice vector care este adecvat pentru clonarea ADN-ului şi care poate fi utilizat pentru transcrierea unui acid nucleic de interes. Persoana de specialitate în domeniu este capabilă să aleagă vectorii de expresie adecvaţi şi să introducă secvenţele de acid nucleic ale dezvăluirii într-un mod funcţional.

Celulele gazdă care cuprind moleculele de acid nucleic care codifică proteinele F RSV de pre-fuziune formează, de asemenea, o parte a dezvăluirii. Proteinele F RSV de pre-fuziune pot fi produse prin tehnologia ADN-ului recombinant care implică expresia moleculelor în celulele gazdă, de ex., Celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), linii de celule tumorale, celule BHK, linii de celule umane cum ar fi, celule HEK293, celule PER.C6, sau celule de drojdie, ciuperci, insecte şi altele asemenea, sau animale sau plante transgenice. În anumite aspecte, celulele provin dintr-un organism multicelular, în anumite aspecte, sunt de origine vertebrată sau nevertebrată. În anumite aspecte, celulele sunt celule de mamifere. În anumite aspecte, celulele sunt celule umane. În general, producţia de proteine recombinante, cum ar fi, proteinele F RSV de fuziune din dezvăluire, într-o celulă gazdă cuprinde introducerea unei molecule de acid nucleic heterolog care codifică proteina în format expresibil în celula gazdă, cultivarea celulelor în condiţii care conduc la exprimarea moleculei de acid nucleic şi care permit exprimarea proteinei în respectiva celulă. Molecula de acid nucleic care codifică o proteină în format expresibil poate fi sub forma unei casete de expresie şi de obicei necesită secvenţe capabile să producă expresia acidului nucleic, cum ar fi, amplificator(i), promotor, semnal de poliadenilare şi altele asemenea. Persoana de specialitate în domeniu ştie că pot fi utilizaţi diverşi promotori pentru a obţine expresia unei gene în celulele gazdă. Promotorii pot fi constitutivi sau reglementaţi şi pot fi obţinuţi din diverse surse, care includ viruşi, procariote sau eucariote, sau proiectate artificial.

Mediile de cultură celulară sunt disponibile de la diferiţi furnizori şi un mediu adecvat poate fi ales în mod obişnuit pentru ca o celulă gazdă să exprime proteina de interes, aici proteinele F RSV de pre-fuziune. Mediul adecvat poate conţine sau nu ser.

O "moleculă de acid nucleic heteroloagă" (denumită aici "transgenă") este o moleculă de acid nucleic care nu este prezentă în mod natural în celula gazdă. Aceasta este introdusă, de exemplu, într-un vector prin tehnici standard de biologie moleculară. O transgenă este în general legată operaţional de secvenţele de control al expresiei. Acest lucru se poate face, de exemplu, prin plasarea acidului nucleic care codifică transgena(ele) sub controlul unui promotor. Se pot adăuga secvenţe de reglare suplimentare. Mulţi promotori pot fi utilizaţi pentru exprimarea transgenelor şi sunt cunoscuţi de către persoanele de specialitate în domeniu, de ex., acestea pot cuprinde promotori virali, de mamifere, sintetici şi alţii asemenea. Un exemplu nelimitativ de promotor adecvat pentru obţinerea expresiei în celule eucariote este un promotor CMV (US 5.385,839), de ex., promotorul timpuriu imediat CMV, de exemplu, care cuprinde nt. -735 la +95 de la stimulatorul/promotorul timpuriu imediat al genei CMV. Un semnal de poliadenilare, de exemplu, semnalul poliA al hormonului de creştere bovin (US 5.122.458), poate fi prezent în spatele transgenei(lor). Alternativ, mai mulţi vectori de expresie utilizaţi pe scară largă sunt disponibili în domeniu şi din surse comerciale, de ex., seriile vectoriale pcADN şi pEF de la Invitrogen, pMSCV şi pTK-Hyg de la BD Sciences, pCMV-Script de la Stratagene, etc., care pot fi utilizaţi pentru exprimarea recombinantă a proteinei de interes sau pentru a obţine promotori adecvaţi şi/sau secvenţe de terminare a transcripţiei, secvenţe polyA şi altele asemenea.

Cultura celulară poate fi orice tip de cultură celulară, inclusiv cultura celulară aderentă, de ex., celule ataşate la suprafaţa unui vas de cultură, sau la micropurtători, precum şi cultura în suspensie. Cele mai multe culturi în suspensie la scară largă sunt operate ca procese discontinue, sau alimentate în şarjă, deoarece sunt cele mai simple de operat şi de extins. În prezent, procesele continue bazate pe principiile perfuziei devin din ce în ce mai frecvente şi sunt, de asemenea, adecvate. Mediile de cultură adecvate sunt, de asemenea, bine cunoscute persoanei de specialitate în domeniu şi pot fi obţinute în general din surse comerciale în cantităţi mari sau personalizate conform protocoalelor standard. Cultivarea se poate face, de exemplu, în vase, sticle rotative, sau în bioreactoare, utilizând sisteme discontinue, alimentate în şarjă, sisteme continue şi altele asemenea. Sunt cunoscute condiţiile adecvate pentru cultivarea celulelor (vezi de ex., Tissue Culture, Academic Press, Kruse şi Paterson, editori (1973), şi R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, ediţia a patra (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).

Dezvăluirea furnizează în plus compoziţii care cuprind o proteină F RSV de pre-fuziune şi/sau o moleculă de acid nucleic şi/sau un vector, aşa cum s-a descris anterior. Dezvăluirea oferă astfel compoziţii care cuprind o proteină F RSV de pre-fuziune care prezintă un epitop care este prezent într-o conformaţie de pre-fuziune a proteinei F RSV, dar este absentă în conformaţia post-fuziune, sau un fragment al acesteia. Dezvăluirea furnizează, de asemenea, compoziţii care cuprind o moleculă de acid nucleic şi/sau un vector, care codifică o astfel de proteină F RSV de pre-fuziune, sau fragmentul acesteia. Compoziţiile sunt, de preferinţă, compoziţii imunogene care cuprind o proteină F RSV de pre-fuziune şi/sau o moleculă de acid nucleic şi/sau un vector, aşa cum s-a descris anterior. Invenţia furnizează o proteină de fuziune (F) a virusului sinciţial respirator de pre-fuziune recombinant (RSV), care cuprinde un aminoacid din SECV ID NR: 1 pentru utilizare în inducerea unui răspuns imun profilactic împotriva proteinei F RSV la un subiect. Mai este dezvăluită utilizarea proteinelor F RSV de pre-fuziune şi/sau a moleculelor de acid nucleic şi/sau a vectorilor conform dezvăluirii pentru fabricarea unui medicament pentru utilizare în inducerea unui răspuns imun împotriva proteinei F RSV la un subiect.

Proteina F RSV de fuziune pentru utilizare conform invenţiei este destinată utilizării în prevenirea (profilaxia) infecţiilor cu VRS. În anumite exemple de realizare, prevenirea poate fi direcţionată către grupurile de pacienţi care sunt susceptibili la infecţia cu VRS. Astfel de grupuri de pacienţi includ, dar nu se limitează la de ex., pacienţi vârstnici (de ex., ≥ 50 de ani, ≥ 60 de ani şi, de preferinţă, ≥ 65 de ani), tinerii (de ex., ≤ 5 ani, ≤ 1 an), spitalizaţi şi pacienţii care au fost trataţi cu un compus antiviral, dar au prezentat un răspuns antiviral inadecvat.

Proteina F RSV de pre-fuziune pentru utilizare conform invenţiei poate fi utilizată de ex,. în profilaxia autonomă a unei boli, sau afecţiuni cauzate de RSV, sau în combinaţie cu alte tratamente profilactice şi/sau terapeutice, cum ar fi, vaccinuri, agenţi antivirali şi/sau anticorpi monoclonali.

Invenţia oferă, în plus, metode pentru prevenirea infecţiei cu RSV la un subiect care utilizează proteina F RSV de pre-fuziune, care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SECV ID NR.1. Într-un exemplu de realizare specific, o metodă pentru prevenirea infecţiei cu RSV la un subiect cuprinde administrarea unui subiect care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficiente de proteină F RSV de pre-fuziune care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SECV ID NR.1.

O cantitate eficientă terapeutic se referă la o cantitate de proteină, moleculă de acid nucleic sau vector, care este eficientă pentru prevenirea, ameliorarea şi/sau tratarea unei boli sau afecţiuni rezultate din infecţia cu RSV. Prevenirea cuprinde inhibarea sau reducerea răspândirii RSV, sau inhibarea sau reducerea debutului, dezvoltării sau progresiei unuia sau mai multor simptome asociate cu infecţia cu RSV. Ameliorarea, aşa cum este utilizată aici, se poate referi la reducerea simptomelor vizibile sau perceptibile ale bolii, a viremiei sau oricărei alte manifestări măsurabile a infecţiei cu RSV.

Pentru administrarea la subiecţi, cum ar fi oamenii, invenţia poate folosi compoziţii farmaceutice care cuprind o proteină RSV de pre-fuzione care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SECV ID NR.1 şi un purtător sau excipient acceptabil farmaceutic. În contextul actual, termenul "acceptabil farmaceutic" înseamnă că purtătorul sau excipientul, la dozele şi concentraţiile utilizate, nu va provoca efecte nedorite sau dăunătoare subiecţilor cărora li se administrează. Astfel de purtători şi excipienţi acceptabili farmaceutic sunt bine cunoscuţi în domeniu (a se vedea Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 18-a, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company \tab Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer şi L. Hovgaard, Eds., Taylor şi Francis \tab şi Handbook of Pharmaceutical Excipients, ediţia a III-a, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press \tab. Proteinele F RSV sunt formulate şi administrate, de preferinţă, ca o soluţie sterilă, deşi poate fi, de asemenea, posibil să se utilizeze preparate liofilizate. Soluţiile sterile sunt preparate prin filtrare sterilă, sau prin alte metode în sine cunoscute în domeniu. Soluţiile sunt apoi liofilizate sau umplute în recipiente farmaceutice de dozare. pH-ul soluţiei este în general în domeniul pH-ului de la 3,0 până la 9,5, de ex., pH 5,0 până la 7,5. Proteinele F RSV sunt de obicei într-o soluţie care are un tampon farmaceutic acceptabil adecvat şi compoziţia poate conţine, de asemenea, o sare. Opţional poate fi prezent agent de stabilizare, cum ar fi, albumina. În anumite exemple de realizare, se adaugă detergent. În anumite exemple de realizare, proteinele F RSV pot fi formulate într-un preparat injectabil. În anumite exemple de realizare, o compoziţie pentru utilizare conform invenţiei mai cuprinde unul sau mai mulţi adjuvanţi. Adjuvanţii sunt cunoscuţi în domeniu pentru a creşte în continuare răspunsul imun la un determinant antigenic aplicat. Termenii "adjuvant" şi "stimulent imun" sunt utilizaţi aici în mod interschimbabil şi sunt definiţi ca una sau mai multe substanţe care determină stimularea sistemului imunitar. În acest context, un adjuvant este utilizat pentru a spori un răspuns imun la proteinele F RSV pentru utilizare conform invenţiei. Exemplele de adjuvanţi adecvaţi includ sărurile de aluminiu, cum ar fi, hidroxidul de aluminiu şi/sau fosfatul de aluminiu; compoziţii ulei-emulsie (sau compoziţii ulei-în-apă), inclusiv emulsii squalenă-apă, cum ar fi, MF59 (vezi de ex., WO 90/14837); formulări de saponină, cum ar fi, de exemplu QS21 şi Complexe de Imunostimulare (ISCOMS) (vezi de ex., US 5.057.540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivaţi bacterieni sau microbieni, dintre care exemplele sunt lipida Al monofosforil (MPL), MPL 3-O-deacilat (3dMPL), motivul CpG care conţine oligonucleotide, toxine bacteriene ADP-ribozilante, sau mutanţi ai acestora, precum E. coli enterotoxina LT labilă la căldură, toxina holerei CT şi altele asemenea; proteine eucariote (de ex., anticorpi sau fragmente ale acestora (de ex., îndreptate împotriva antigenului însuşi, sau CD1a, CD3, CD7, CD80) şi liganzi la receptori (de ex., CD40L, GMCSF, GCSF, etc.), care stimulează răspunsul imun la interacţiunea cu celulele receptor. În anumite exemple de realizare compoziţiile pentru utilizare conform invenţiei cuprind aluminiu ca adjuvant, de ex., sub formă de hidroxid de aluminiu, fosfat de aluminiu, fosfat de aluminiu şi potasiu, sau combinaţii ale acestora, în concentraţii de 0,05 - 5 mg, de ex., de la 0,075-1,0 mg, de conţinut de aluminiu pe doză. Proteinele F RSV de pre-fuziune pot fi administrate, de asemenea, în combinaţie cu, sau conjugate cu nanoparticule, cum ar fi, de ex., polimeri, lipozomi, virozomi, particule de tip virus, sau particule de proteine auto-asamblate. Proteinele F de pre-fuziune pot fi combinate cu, încapsulate sau conjugate cu nanoparticulele cu, sau fără adjuvant. Încapsularea în lipozomi este descrisă, de ex., în US 4.235.877. Conjugarea cu macromoleculele este dezvăluită, de exemplu, în US 4.372,945 sau US 4.474.757. În alte exemple de realizare, compoziţiile nu cuprind adjuvanţi. În anumite aspecte, dezvăluirea furnizează metode pentru prepararea unui vaccin împotriva virusului sinciţial respirator (RSV), care cuprind furnizarea unei compoziţii conform dezvăluirii şi formularea acesteia într-o compoziţie acceptabilă farmaceutic. Termenul "vaccin" se referă la un agent, sau la o compoziţie care conţine o componentă activă, eficientă pentru a induce un anumit grad de imunitate la un subiect împotriva unui anumit agent patogen, sau a unei boli, care va avea ca rezultat cel puţin o scădere (până la absenţa completă) a severităţii, duratei sau a altei manifestări a simptomelor asociate cu infecţia prin agentul patogen sau a bolii. În prezenta dezvăluire, vaccinul cuprinde o cantitate eficientă de proteină F RSV pre-fuziune şi/sau o moleculă de acid nucleic care codifică o proteină F RSV de pre-fuziune şi/sau un vector care cuprinde molecula de acid nucleic menţionată, care are ca rezultat un răspuns imun împotriva proteinei F RSV. Aceasta oferă o metodă de prevenire a bolilor grave ale tractului respirator inferior, care duc la spitalizare şi de scădere a frecvenţei complicaţiilor, cum ar fi, pneumonia şi bronşiolita datorate infecţiei cu RSV şi replicării la un subiect. Termenul "vaccin" conform dezvăluirii implică faptul că este o compoziţie farmaceutică şi, prin urmare, include în mod uzual un diluant, purtător sau excipient acceptabil farmaceutic. Acesta poate conţine, sau nu alte ingrediente active. În anumite exemple de realizare acesta poate fi un vaccin combinat care cuprinde, în plus, alte componente care induc un răspuns imun, de ex., împotriva altor proteine ale RSV şi/sau împotriva altor agenţi infecţioşi. Administrarea altor componente active se poate face, de exemplu, prin administrare separată sau prin administrarea de produse combinate ale vaccinurilor din dezvăluire şi ale altor componente active. Compoziţiile pot fi administrate unui subiect, de ex., un subiect uman. Doza totală de proteine F RSV într-o compoziţie pentru o singură administrare poate fi, de exemplu, de aproximativ 0,01 µg până la aproximativ 10 mg, de ex., 1 µg - 1 mg, de ex., 10 µg - 100 µg. Determinarea dozei recomandate va fi efectuată prin experimentare şi este de rutină pentru specialiştii în domeniu. Administrarea compoziţiilor conform invenţiei poate fi realizată folosind căi standard de administrare. Exemplele nelimitative includ administrarea parenterală, cum ar fi, administrarea intradermică, intramusculară, subcutanată, transcutanată sau mucozală, de ex,. intranazal, oral şi altele asemenea. Într-un exemplu de realizare, o compoziţie este administrată prin injecţie intramusculară. Persoana de specialitate în domeniu cunoaşte diferitele posibilităţi de administrare a unei compoziţii, de ex., un vaccin, pentru a induce un răspuns imun la antigenul(ii) în vaccin. Un subiect aşa cum este utilizat aici este de preferinţă un mamifer, de ex., un rozător, de ex., un şoarece, un şobolan de bumbac, sau un primat non-uman, sau un om. De preferinţă, subiectul este un subiect uman. Proteinele, moleculele de acid nucleic, vectorii şi/sau compoziţiile pot fi, de asemenea, administrate, fie ca prim, fie ca rapel, într-un regim homolog sau heterolog de prim-rapel. Dacă se efectuează o vaccinare de rapel, de obicei, o astfel de vaccinare de rapel va fi administrată aceluiaşi subiect la un moment cuprins între o săptămână şi un an, de preferinţă între două săptămâni şi patru luni, după administrarea compoziţiei subiectului pentru prima dată (care este, în astfel de cazuri, denumită 'vaccinare iniţială'). În anumite exemple de realizare, administrarea cuprinde o administrare primă şi cel puţin una de rapel. În plus, proteinele din dezvăluire pot fi utilizate ca instrument de diagnosticare, de exemplu, pentru a testa starea imunitară a unei persoane, stabilind dacă există anticorpi în serul unei astfel de persoane capabili să se lege de proteina dezvăluirii. Dezvăluirea se referă, de asemenea, la o metodă de diagnosticare in vitro pentru detectarea prezenţei unei infecţii cu RSV la un pacient, metoda menţionată cuprinzând etapele a) contactării unei probe biologice obţinute de la pacientul menţionat cu o proteină conform invenţiei; şi b) detectarea prezenţei complecşilor anticorp-proteină.

Exemple

EXEMPLUL 1: Generarea proteinei F RSV de pre-fuziune stabile

Au fost produse mai multe variante de proteină F RSV de pre-fuziune, care sunt reprezentate schematic în Fig.1. Toţi candidaţii cuprind un domeniu de trimerizare a fibritinei (foldon) (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), legat de restul de aminoacizi 495 al domeniului RSV A2 F1.

În versiunile procesate ale F RSV (adică versiunile care sunt scindate înlăturând regiunea p27) substituţia N67I a avut cel mai puternic efect atât asupra nivelului de expresie, cât şi asupra stabilităţii, dar proteina F de pre-fuziune complet stabilă a fost obţinută numai atunci când substituţiile 67 şi 215 au fost combinate, rezultând o creştere a nivelului de expresie de 20 de ori (Fig. 2). Adăugarea unei a treia substituţii de aminoacizi nu a îmbunătăţit nivelul de expresie sau stabilitatea măsurată prin stabilitatea la depozitare la 4°C. Cu toate acestea, când proteinele F RSV au fost purificate şi caracterizate în continuare, s-a dovedit că a treia substituţie suplimentară stabilizează semnificativ proteina F de pre-fuziune, măsurată prin testul de stabilitate la temperatură mai strictă (prin testul de Fluorimetrie de Scanare Diferenţială - DSF) (Fig. 3).

Deoarece tulpina A2 care a fost utilizată ca secvenţă parentală pentru variantele de proteină F RSV descrise anterior (WO2014/174018 şi WO2014/202570) este o tulpină de laborator adaptată liniei celulare care a acumulat două mutaţii unice şi rare în apexul K66 şi I76), s-a decis mutarea acestor două resturi pentru a se potrivi izolatelor clinice naturale (K66E, I76V). Mutaţiile K66E şi I76V au fost incluse în noul design de proteine procesate pentru a face secvenţa mai aproape de izolatele virale naturale. Substituţiile K66E + I76V au fost testate în variante stabilizate selectate pentru a demonstra că substituţiile de aminoacizi nu au avut efect negativ asupra expresiei sau stabilităţii proteinelor. S-a arătat că proteinele au fost stabile în supernatantele culturii celulare mai mult de 2 săptămâni. Nu a existat niciun efect negativ asupra nivelului de expresie al proteinelor F, dimpotrivă, proteinei F RSV cu mutaţii N67I, S215P, K66E şi I76V exprimate la un nivel mai înalt decât proteina doar cu N67I şi S215P (Fig. 4).

Proteinele F RSV procesate cu N67I, S215P, K66E şi I76V (denumite PRQM pentru cvadruplu-mutant procesat) şi cu N67I, S215P, K66E, I76V şi D486N (denumite PRPM pentru penta-mutant procesat) au fost purificate şi caracterizate în continuare.

Screeningul mutaţiilor stabilizatoare pentru proteina F RSV a fost efectuat în celule HEK în suspensie (FreeStyle 293F). Aceste celule sunt convenabile de utilizat într-un laborator de cercetare deoarece sunt adaptate la protocolul simplu de transfecţie şi exprimă proteinele la un nivel ridicat. Pentru producţia de proteine pe scară largă şi GMP, celulele CHO sunt adesea linia celulară aleasă. Prin urmare, expresia şi stabilitatea mai multor modele de proteine F preferate au fost testate în celule CHO în suspensie (FreeStyle CHO-S). Celulele CHO-S sunt dificil de transfectat şi, prin urmare, se aştepta ca nivelurile generale de expresie să fie mai mici decât în celulele HEK. Prin urmare, în timpul analizei ne-am concentrat asupra exprimării relative a proteinelor şi a stabilităţii acestora.

Cinci proteine procesate au fost selectate pentru test. Cele 5 variante conţineau toate substituţiile K66E, I76V, N67I şi S215P. Aşa cum s-a descris anterior, ultimele 2 sunt necesare pentru a stabiliza proteina în conformaţia pre-fuziune; primele două au fost incluse pentru a face secvenţa mai aproape de izolatele naturale (aşa cum a fost descris în secţiunea anterioară). Proteinele s-au deosebit de mutaţiile suplimentare E161P, D486N şi E487Q. Acestea au fost alese datorită nivelului ridicat de expresie, stabilităţii la stocare şi impactului redus asupra antigenicităţii. Toate proteinele au fost exprimate în celule CHO şi au stabilitate comparabilă la depozitare. Proteinele F RSV au fost stabile în conformaţia pre-fuziune atunci când au fost depozitate în supernatante de cultură celulară timp de 2 săptămâni la 4°C (Fig. 5). De asemenea, a fost testată stabilitatea proteinelor F RSV în supernatantul culturii celulare CHO la pH5. Aşa cum se arată în Fig. 6 nu a fost detectată nici o degradare după incubarea probelor de proteine timp de 7 zile la temperaturi diferite.

În concluzie, proteinele F RSV ale invenţiei s-au exprimat în celule CHO şi au fost stabile în supernatanţii culturii celulare. În plus, a fost testată stabilitatea la temperatură a proteinei. Supernatanţii de cultură celulară au fost supuşi tratamentului termic şi cantitatea de proteină de pre-fuziune din probe a fost măsurată în ELISA cu anticorp CR9501 (Fig. 7).

Varianta cu D486N (proteina PRPM) a fost cea mai stabilă împotriva stresului de temperatură. Adăugarea mutaţiei K498R părea să nu aibă niciun avantaj în comparaţie cu proteina cu cantitate minimă de modificare (PRQM). Exemplele cu mutaţie E161P au avut cele mai ridicate niveluri de expresie (datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, dezavantajul acestei substituţii de aminoacizi a fost că restul 161 este situat pe suprafaţa proteinei şi pe marginea epitopului pentru anticorpul CR9501.

Conform prezentei invenţii, s-a arătat astfel că PRPM (proteina F RSV cu domeniu de trimerizare a foldonului cu fibritină şi cu mutaţii N67I, S215P, K66E, I76V şi D486N, SECV ID NR: 1) şi PRQM (proteina F RSV cu fibritină domeniu de trimerizare a foldonului şi cu N67I, S215P, K66E şi I76V, SECV ID NR: 2) ca proteină prelucrată de pre-fuziune cu minimum de modificări necesare ale secvenţei, precum şi variantele PRQM + S46G, sau PRPM + S46G, toate sunt stabilizate în conformaţia pre-fuziune şi prezintă un Tm ridicat (Tabelul 1). Ultimele variante cu substituţie S46G au un nivel de expresie semnificativ mai ridicat.

Tabelul 1.

ID proteină Stabilitate la îngheţ-dezgheţ Tm (°C) PRQM S46G Stabilă pentru 3 cicluri, agregare după 5 cicluri 56,2 PRPM S46G Stabil pentru 5 cicluri 63,6 PRPM Stabil pentru 5 cicluri 65,0

EXEMPLUL 2: Imunogenitatea şi protecţia induse de PRPM cu şi fără adjuvant

A fost efectuat un experiment pentru a determina eficacitatea imunogenă şi profilactică a proteinei PRPM recombinantă în prezenţa sau absenţa unui adjuvant într-un model de şobolan de bumbac de provocare cu RSV-A2 omolog. Animalele au fost imunizate i.m. în ziua 0 şi 28 cu 2 doze de PRPM (5 şi 0,5 µg), non-adjuvant sau adjuvant cu 100 µg Adjuphos. Animalele au fost provocate în ziua 49 cu 105 (pfu) RSV A2. Animalele au fost sacrificate la 5 zile după provocare şi titrurile au fost măsurate în plămâni şi nas.

Rezultate

Imunizarea cu PRPM adjuvantat a indus o protecţie completă în plămâni şi nas, cu excepţia unui animal care a prezentat o dezvoltare în nas. Majoritatea animalelor cărora li s-au administrat 5 şi 0,5 µg PRPM neadjuvantat au prezentat o dezvoltare în plămâni şi nasuri şi a existat o diferenţă semnificativă între grupurile care au primit proteina adjuvantată şi cea neadjuvantată (Figura 8). Proteina adjuvantată a indus titruri de VNA semnificativ mai mari comparativ cu proteina neadjuvantată în ziua 49 după imunizare (Figura 9).

Secvenţe

Claims (3)

1. Proteină de fuziune (F) a virusului sinciţial respirator (RSV) de pre-fuziune recombinant, care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a SECV ID NR: 1 pentru utilizare în profilaxia infecţiei cu RSV.

2. Proteina F RSV de fuziune; pentru utilizare conform revendicării 1, care cuprinde cel puţin un epitop care este specific proteinei F de conformaţie pre-fuziune, în care cel puţin un epitop este recunoscut de un anticorp monoclonal specific de pre-fuziune, care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID. NR: 4, o regiune CDR2 a lanţului greu din SECV ID NR: 5, o regiune CDR3 a lanţului greu din SECV ID NR: 6 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SECV ID NR: 7, o regiune CDR2 a lanţului uşor din SECV ID NR: 8, şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR: 9 şi/sau un anticorp monoclonal specific de pre-fuziune, care cuprinde o regiune CDR1 a lanţului greu din SECV ID NR: 10, o regiune CDR2 a lanţului greu din SECV ID NR: 11, o regiune CDR3 a lanţului greu din SECV ID NR: 12 şi o regiune CDR1 a lanţului uşor din SECV ID NR: 13, o regiune CDR2 a lanţului uşor din SECV ID NR: 14 şi o regiune CDR3 a lanţului uşor din SECV ID NR: 15.

3. Proteină F RSV de pre-fuziune pentru utilizare conform revendicării 1 sau 2, în care proteina este trimerică. 4. 999. SDODR 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44.