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CN117050149A - 包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN117050149A
CN117050149A CN202310842646.3A CN202310842646A CN117050149A CN 117050149 A CN117050149 A CN 117050149A CN 202310842646 A CN202310842646 A CN 202310842646A CN 117050149 A CN117050149 A CN 117050149A
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CN
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sequence
amino acid
protein
hrsvf
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CN202310842646.3A
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彭育才
李江龙
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Zhuhai Lifanda Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhuhai Lifanda Biotechnology Co ltd
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Abstract

本公开涉及基因药物技术领域，尤其是涉及一种包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，所述人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原为融合前hRSVF蛋白。

Description

包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物及其制备方法和 应用
本申请要求申请日为2023年05月19日的中国专利申请(申请号：202310570847.2，发明名称：呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法和应用)的优先权，该中国专利申请的部分内容通过引用方式整体并入到本申请。
技术领域
本公开涉及基因药物技术领域，尤其是涉及一种包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，所述人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原为融合前hRSVF蛋白。
背景技术
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是婴幼儿细支气管炎和肺炎最常见的病原，严重危害婴幼儿的健康。RSV感染后不能获得持久免疫力，因此，重复感染十分常见。RSV感染发病呈全球性，局部可暴发流行，已成为世界性公共卫生问题。但目前还没有被批准的RSV疫苗。
RSV基因组大小约15～16kb，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白和3种非结构蛋白(NS1、NS2和M2-2)，结构蛋白包括3种跨膜表面蛋白(G、F、SH)、2种基质蛋白(M和M2-1)、3种核壳蛋白(L、N和P)。G蛋白介导病毒与宿主细胞的结合，F蛋白介导病毒与宿主细胞膜的融合，使病毒进入细胞内，二者对于病毒复制至关重要，且均含有B细胞和T细胞表位，是刺激机体产生体液和细胞免疫最重要的病毒抗原蛋白。G蛋白编码区变异大，基于其变异可分为A亚型和B亚型，G蛋白诱导的中和抗体具有亚型特异性；F蛋白编码区高度保守，A亚型和B亚型的F蛋白氨基酸序列至少有90％相同，故F蛋白诱导的中和抗体可以同时抑制A、B亚型RSV感染。F蛋白结构呈动态变化，首先在宿主细胞中被转录翻译为单个无活性多肽(F0)；接着经宿主细胞弗林蛋白酶(furinprotease)第1次切割，生成部分切割的融合前祖蛋白(prefusogenicprotein)；随后发生第2次弗林蛋白酶切割，生成F2和F1亚基，2个亚基以2个二硫共价键连接为一个单体，然后3个单体形成亚稳态的功能性融合前F蛋白(prefusionprotein)三聚体；此后无须进一步处理即可进行构象重排形成热力学稳定的融合后F蛋白(postfusionprotein)；两次弗林蛋白酶切割、构象重排的时间和细胞位置尚不完全清楚，诱发构象重排的条件也不明确。F蛋白表面，与中和活性有关的抗原表位主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、和6种，其中表位Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ是存在于融合前和融合后的F蛋白；Ⅴ和/>是融合前F蛋白特异性抗原位点，融合后F蛋白没有这2种表位。流行病学研究表明，RSV中和抗体可预防严重的RSV-ALRI，表位/>单抗的中和活性是表位Ⅱ单抗的10～100倍，表位Ⅷ单抗的中和活性也很高，因此，血清中大多数RSV中和活性仅针对融合前F蛋白抗原位点。诱导高滴度的中和抗体是开发RSV疫苗的主要目标，具有特异性抗原表位的融合前F蛋白则成为最热门的RSV疫苗靶标，但融合前F蛋白本质上是一种不稳定的蛋白，对其进行多种稳定性修改但又不损失重要的抗原表位，是RSV疫苗研发中的难点之一。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供了包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，所述抗原能针对人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原，引发有效中和抗体反应。
本公开的一些方面提供了一种包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，所述免疫组合物选自核酸免疫组合物、多肽免疫组合物或病毒免疫组合物。
在一些实施方案中，所述人呼吸道合胞病毒抗原为融合前hRSVF蛋白，所述融合前hRSVF蛋白的F1序列如Seq ID NO.10～11所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F2序列如Seq ID NO.2～5所示，或，包含与Seq ID NO.2～5至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.2～5至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.6～9所示，或，包含与Seq IDNO.6～9至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.6～9至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.12～20、SeqID NO.88～93所示，或，包含与Seq ID NO.12～20、Seq ID NO.88～93至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.12～20、Seq ID NO.88～93至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57、Seq IDNO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如Seq ID NO.76所示；F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，或，包含与Seq ID NO.4至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.4至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，或，包含与Seq ID NO.4至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.4至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.8所示，或，包含与Seq ID NO.8至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.8至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.11所示，或，包含与Seq ID NO.11至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.11至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.17所示，或，包含与Seq ID NO.17至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.17至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq IDNO.78、Seq ID NO.95～97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.78、Seq ID NO.95～97至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.64、Seq IDNO.78、Seq ID NO.95～97至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq IDNO.97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的F2序列104～109位氨基酸连续或间隔缺失至少1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸残基，或，RR1序列137～144位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR2序列504～524位氨基酸连续或间隔缺失至少1个的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白P27序列被GS-linker序列取代，所述GS-linker序列选自(GnS)m、((GGGGS)o、GGSGGGGSGG、GGSGGGGG、GSGSGSGS、(Gly)p、(EAAAK)q中的一种；其中n为1～10、15或20；m为1～10、15或20；o是1～5的整数；p是1～40的整数；q为1～5的整数。
在一些实施方案中，所述免疫组合物为核酸免疫组合物，所述核酸免疫组合物包含编码融合前hRSVF蛋白的DNA分子和/或RNA分子。
在一些实施方案中，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子。在一些实施方案中，所述RNA分子包括mRNA分子或环形RNA分子。在一些实施方案中，所述所述RNA分子为mRNA。
在一些实施方案中，所述mRNA分子包括开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、SeqID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq IDNO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq IDNO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、SeqID NO.111～112至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述mRNA分子包括开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq IDNO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述mRNA分子的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团。在一些实施方案中，所述mRNA分子的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。
在一些实施方案中，所述mRNA分子的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200。
在一些实施方案中，所述mRNA分子还含有5’UTR。在一些实施方案中，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’UTR核苷酸序列如SEQ ID.NO.58～60所示。
在一些实施方案中，所述mRNA片段还含有3’UTR。在一些实施方案中，3’UTR序列如SEQ ID.NO.61～63所示。
在一些实施方案中，mRNA分子中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换；在一些实施方案中，所述置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，所述核酸免疫组合物包括与核酸适配的载体。
在一些实施方案中，所述载体选自脂质体纳米颗粒、阳离子纳米乳、LLP。
本公开的一些方面提供了一种以上任一项所述的免疫组合物的制备方法，其特征在于，通过将含有上述mRNA分子的水相与含有载体组分的有机相混合，得到核酸免疫组合物。在一些实施方案中，所述载体包括脂质体纳米颗粒；
在一些实施方案中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；20％～50％的DSCP，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；5％～20％的胆固醇，例如可以为但不限于为5％、10％、15％或20％；和1％～5％的PEG-DMG，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％。
在一些实施方案中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
在一些实施方案中，所述核酸免疫组合物中mRNA与全体脂质的质量比选自5：1～40：1、8：1～40：1、10：1～30：1、15：1～30：1、10：1～25：1、5：1～25：1、12：1～18：1、14：1～17：1、15：1～16：1。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的直径小于约200nm；在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于小于约150nm；在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于100nm；在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径约55nm至约90nm。
在一些实施方案中，其特征在于，mRNA分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸免疫组合物。
在一些实施方案中，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，优选为1:3。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，优选为柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，所述缓冲液的pH为3～7，优选为4。
在一些实施方案中，水相中核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，优选为0.1mg/mL。
在一些实施方案中，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，优选为无水乙醇。
在一些实施方案中，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，优选为6mg/mL。
在一些实施方案中，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂。
优选地，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min。
在一些实施方案中，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使mRNA分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，优选为100μg/mL。
本公开的一些方面提供了一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码人呼吸道合胞病毒抗原的核酸，所述人呼吸道合胞病毒抗原为融合前hRSVF蛋白。
在一些实施方案中，所述人呼吸道合胞病毒抗原为融合前hRSVF蛋白，所述融合前hRSVF蛋白的F1序列如Seq ID NO.10～11所示，或，包含与Seq ID NO.10～11至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10～11至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F2序列如Seq ID NO.2～5所示，或，包含与Seq ID NO.2～5至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.2～5至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.6～9所示，或，包含与Seq ID NO.6～9至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.6～9至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.12～20、Seq ID NO.88～93所示，或，包含与Seq ID NO.12～20、Seq ID NO.88～93至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.12～20、Seq ID NO.88～93至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如Seq ID NO.76所示，或，包含与Seq ID NO.76至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.76至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SeqID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq IDNO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.85～87所示，或，包含与Seq ID NO.85～87至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.85～87至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.3所示，或，包含与Seq ID NO.3至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.3至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，或，包含与Seq ID NO.4至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.4至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.7所示，或，包含与Seq ID NO.7至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.7至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.10所示，或，包含与Seq ID NO.10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.91所示，或，包含与Seq ID NO.91至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.91至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，或，包含与Seq ID NO.4至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.4至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR1序列如Seq ID NO.8所示，或，包含与Seq ID NO.8至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.8至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；F1序列如Seq ID NO.11所示，或，包含与Seq ID NO.11至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.11至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；RR2序列如Seq ID NO.17所示，或，包含与Seq ID NO.17至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.17至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；C末端序列如Seq ID NO.21～57所示，或，包含与Seq ID NO.21～57至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.21～57至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C末端序列如Seq ID NO.41所示，或，包含与Seq ID NO.41至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.41至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq IDNO.97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白的F2序列104～109位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR1序列137～144位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR2序列504～524位氨基酸连续或间隔缺失至少1个的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述融合前hRSVF蛋白P27序列被GS-linker序列取代，所述GS-linker序列选自(GnS)m、((GGGGS)o、GGSGGGGSGG、GGSGGGGG、GSGSGSGS、(Gly)p、(EAAAK)q中的一种；其中n为1～10、15或20；m为1～10、15或20；o是1～5的整数；p是1～40的整数；q为1～5的整数。
在一些实施方案中，编码人呼吸道合胞病毒抗原的核酸包括DNA分子和/或RNA分子。在一些实施方案中，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子。在一些实施方案中，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA。
在一些实施方案中，所述mRNA分子包括开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、SeqID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq IDNO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq IDNO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、SeqID NO.111～112至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述mRNA分子包括开放阅读框(ORF)，所述开放阅读框(ORF)的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq IDNO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列，例如可以为但不限于为包含与Seq IDNO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子可以通过序列优化手段优化mRNA序列，改善与体内施用后的表达功效相关的特性：例如提高mRNA稳定性、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡、增加和/或减少蛋白质聚集，得到改善特性的mRNA。序列优化的目的还包括：保持结构和功能完整性的同时优化基于核酸的治疗剂的配制和递送的特征；克服表达的阈值；提高表达率；半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；以及避免不利的生物响应如免疫响应和/或降解途径。序列优化手段包括：(1)根据特定器官和/或宿主生物体中的密码子频率进行密码子优化以确保恰当折叠和适当表达；(2)调节G/C含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；(4)定制转录和翻译控制区；(5)减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。
两个核苷酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同氨基酸的百分比。
术语「％同一性」或类似术语是指，在最佳比对下，待比较序列之间相同核苷酸或氨基酸之百分比。该百分比为纯粹统计学的，且两个序列之间的差异可能为(但不一定)随机分布于待比较序列之整个长度上。两个序列之比较通常藉由在最佳比对之后，相对于片段或「比较窗口」比较改等序列而进行，以鉴别对应序列之局部区。
在一些实施方案中，所述mRNA分子的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团。在一些实施方案中，所述mRNA分子的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。
在一些实施方案中，所述mRNA分子的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200。
在一些实施方案中，所述mRNA分子还含有5’UTR。在一些实施方案中，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸。在一些实施方案中，所述5’UTR核苷酸序列如SEQ ID.NO.58～60所示。
在一些实施方案中，所述mRNA片段还含有3’UTR。在一些实施方案中，3’UTR序列如SEQ ID.NO.61～63所示。
在一些实施方案中，基于提供的RNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的DNA序列(例如尿嘧啶转换为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的DNA序列，本领域普通技术人员将得到相应的RNA序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。在一些实施方案中，基于提供的RNA或DNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的氨基酸序列。
在一些实施方案中，mRNA分子中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换；在一些实施方案中，所述置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
附图说明
为了更清楚地说明本公开具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本公开的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示了hRSVF蛋白野生型的示意图。
图2显示了hRSVF蛋白变异体的示意图。
图3显示了实施例5中ELISA检测小鼠血清中RSVF蛋白特异性IgG抗体。
图4显示了实施例5中流式检测TNF-α+CD4+和TNF-α+CD8+的T细胞。
图5显示了实施例5中ELISA检测细胞培养基上清中的IFN-γ和IL-4。
图6显示了实施例5中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图7显示了实施例6中ELISA检测小鼠血清中RSVF蛋白特异性IgG抗体。
图8显示了实施例6中ELISA检测细胞培养基上清中的IFN-γ和IL-4。
图9显示了实施例6中流式检测TNF-α+CD4+和TNF-α+CD8+的T细胞。
图10显示了实施例6中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图11显示了实施例7中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图12显示了实施例8中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图13显示了实施例9中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图14显示了实施例10中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图15显示了实施例11中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图16显示了实施例12中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图17显示了实施例13中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
图18显示了实施例14中的小鼠血清中RSV中和抗体滴度。
具体实施方式
图1显示了hRSVF蛋白野生型的示意图；图2显示了hRSVF蛋白变异体的示意图。
↓为弗林蛋白酶切割；SP为信号肽序列；p27为切割后去除27aa肽序列；RR1为重复折叠区1，横跨hRSVF蛋白(野生型)的137至216氨基酸残基，包括融合肽和七肽重复序列A(HRA)；RR2为重复折叠区2，其在融合前hRSVF蛋白尖峰中形成C末端茎，包括重新定位到RSVF蛋白头部另一侧的七肽重复序列B(HRB)；TM为跨膜区序列。
F2通常含有F0前体的第26～109位氨基酸残基；F1通常包含F0前体的第137～574位氨基酸残基；F1和F2通过二硫键连接形成异二聚体，该异二聚体被称为RSVF“原聚体”。
C末端可以缺失、或选自TM跨膜序列、多聚化元件序列中的至少一种。在一些实施方案中，hRSVF蛋白变异体的C末端为缺失。在一些实施方案中，hRSVF蛋白变异体的C末端为TM跨膜序列。在一些实施方案中，hRSVF蛋白变异体的C末端为依次依次连接的TM跨膜序列和多聚化元件序列，其中TM跨膜序列的C端与多聚化元件序列的N端连接。在一些实施方案中，hRSVF蛋白变异体的C末端为多聚化元件序列。
本公开中所述的hRSVF蛋白变异体为经人工突变和改造的F蛋白，所述突变和改造(包括但不限于对氨基酸序列进行氨基酸残基取代、氨基酸残基插入和/或添加、氨基酸残基缺失和共价修饰等)为经野生型突变和改造得到符合hRSVF蛋白的氨基酸序列；在本公开中“hRSVF蛋白变异体”、“本公开中hRSVF蛋白”或“hRSVF蛋白”皆指代“hRSVF蛋白变异体”，而“hRSVF蛋白野生型”或“hRSVF蛋白(野生型)”皆指代野生型的hRSVF蛋白，未经过人工修饰或变异。另，除特殊说明，本公开除背景技术部分外，其他部分的“hRSVF蛋白”或“F蛋白”皆指代“hRSV F蛋白变异体”。
本公开中所述的氨基酸序列的位置，如S46G取代、E92D取代、P102A取代、A149C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代、Y458C取代、K465Q取代、D486C取代、D489C取代是以图1显示的hRSVF蛋白野生型全长氨基酸序列定位。例如S46G取代为以hRSVF蛋白野生型为基础，将图1显示hRSVF蛋白野生型全长氨基酸的第46位的S氨基酸残基替换为G氨基酸残基，该突变发生在F2序列中。
本公开中所述的多聚化元件包括二聚化元件、三聚化元件、四聚化元件和低聚化元件，当与本公开中hRSVF蛋白联合使用时，可导致多聚hRSVF蛋白复合物的形成；多聚化元件可以位于hRSVF蛋白的N-末端或C-末端，在核酸水平上其编码序列通常被置于编码序列的5'或3'的框中。
其中，二聚化元件可以选自例如热休克蛋白的二聚化元件/结构域、免疫球蛋白Fc结构域和亮氨酸拉链(碱性区域亮氨酸拉链类转录因子的二聚化结构域)，具体氨基酸序列参见如SEQ ID NO.21～24。三聚体化和四聚体化元件可选自例如工程化亮氨酸拉链(采用平行三聚体状态的工程化-螺旋螺旋卷肽)、肠杆菌噬菌体T4的纤蛋白折叠结构域、GCN4PLL、CCN4-PLI、p53、GCN4，具体氨基酸序列参见SEQ ID NO.25～53和SEQ ID NO.54～57(四聚体化))。
在一些实施方案中，本公开中所述的多肽免疫组合物是按照人呼吸道合胞病毒抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术或基因工程技术制备的免疫组合物。在一些实施方案中，本公开中所述的多肽免疫组合物是按照人呼吸道合胞病毒融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列，结合人工突变和改造，再通过化学合成技术制备的免疫组合物。在一些实施方案中，本公开中所述的多肽免疫组合物是按照人呼吸道合胞病毒融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列，结合人工突变和改造，再通过基因工程技术(如通过基因工程技术手段构建基因工程菌等)发酵后获得。
在一些实施方案中，本公开中所述的病毒免疫组合物将人呼吸道合胞病毒抗原基因通过无害的微生物载入人体内，诱导机体的免疫系统做出免疫应答。诱导细胞免疫试验中使用的重要病毒有：牛症病毒的变体、脊髓灰质炎病毒等。
在一些实施方案中，本公开中所述的mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端的序列组成。
在一些实施方案中，本公开中所述的mRNA还携带一个能够表达RNA聚合酶(RNA依赖RNA聚合酶，RdRP)的序列，具体将中国专利CN202110424124.2关于自复制mRNA的序列设计内容引入本公开中。
本公开中所述的5′非翻译区(UTR)是指不编码多肽的mRNA的位于起始密码子正上游的序列。当产生RNA转录物时，5′UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。5′UTR的RNA序列如Seq ID NO.58、Seq ID NO.59或Seq ID NO.60之一所示，或者也可以将本公开申请日之前公开的5’UTR序列引入到本公开。
本公开中所述的3’非翻译区(UTR)，是指不编码多肽的mRNA的位于终止密码子下游的序列。3’UTR的RNA序列如Seq ID NO.61、Seq ID NO.62或Seq ID NO.63之一所示，或者也可以将本公开申请日之前公开的3’UTR序列引入到本公开。
本公开中所述的多聚(A)尾，是mRNA的位于含有多个连续单磷酸腺苷的3′UTR的下游序列。多聚(A)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。在细胞中和/或在体内，多聚(A)尾用于保护mRNA免于酶促降解，并帮助转录终止，和/或mRNA从细胞核输出和翻译。
在可选的实施方式中，本公开中所述的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物还可以包含至少一种冷冻保护剂。在可选的实施方式中，所述冷冻保护剂选自蔗糖、甘油中的至少一种。在可选的实施方式中，所述包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物的冷冻保护剂选自5％(w/v)～18％(w/v)蔗糖、6％(w/v)～16％(w/v)蔗糖、7％(w/v)～14％(w/v)蔗糖、7％(w/v)～12％(w/v)蔗糖、8％(w/v)～11％(w/v)的蔗糖中的一种。在可选的实施方式中，所述包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物的冷冻保护剂选自1％(w/v)～9％(w/v)甘油、1.5％(w/v)～7％(w/v)甘油、1.75％(w/v)～6％(w/v)甘油、1％(w/v)～6％(w/v)甘油、3％(w/v)～6％(w/v)甘油中的一种。在可选的实施方式中，所述包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物的冷冻保护剂选自5％(w/v)～18％(w/v)蔗糖和1％(w/v)～9％(w/v)甘油组合、6％(w/v)～16％(w/v)蔗糖和1.5％(w/v)～7％甘油组合、7％(w/v)～14％(w/v)蔗糖和1.75％(w/v)～6％(w/v)甘油组合、7％(w/v)～12％(w/v)蔗糖和1％(w/v)～6％(w/v)甘油组合、8％(w/v)～11％(w/v)的蔗糖和3％(w/v)～6％(w/v)甘油组合中的一种。
本公开所述的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可通过以下，但不限于以下途径给药：肌内注射、皮下注射、口腔吸入给药、滴鼻给药、鼻喷给药、口鼻吸入给药。
本文所述的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可配制成以下，但不限于以下的剂型：注射剂、气雾剂、干粉吸入剂/粉雾剂、喷雾剂和/或雾化吸入溶液。
本公开的气雾剂、干粉吸入剂/粉雾剂、喷雾剂和/或雾化吸入溶液通常包含待递送的药物，任选地与表面活性剂，例如非离子表面活性剂(例如，聚山梨醇酯～80)，以及一种或多种缓冲剂一起配制，条件是包含表面活性剂不破坏脂质制剂的结构。在可选的实施方式中，气雾剂、干粉吸入剂/粉雾剂、喷雾剂和/或雾化吸入溶液还包含推进剂。气雾剂、、喷雾剂和/或雾化吸入溶液的pH值为6.8～7.2。所用的药物溶剂也可以是pH值4～6的微酸性水性缓冲液。可以添加其他组分以增强或维持化学稳定性，包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。
为了配制本公开用于口腔吸入给药、滴鼻给药、鼻喷给药、口鼻吸入给药的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，包含mRNA和LNP的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可与各种药学上可接受的添加剂。所述添加剂选自包括pH值控制剂、局部麻醉剂、吸附抑制剂、等渗剂、溶解度增强剂、稳定剂、还原剂中的一种或几种。所述pH值控制剂选自精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸中的一种或几种。所述局部麻醉剂选自苯甲醇)。所述等渗剂选自氯化钠、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。所述吸附抑制剂选自吐温80。所述溶解度增强剂选自环糊精及其衍生物中的一种或几种。所述稳定剂选自血清白蛋白。所述还原剂选自谷胱甘肽。
包含mRNA和LNP的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可分散在碱或媒介物中，所述碱或媒介物可包含具有分散包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物的能力的亲水性化合物和任何所需的添加剂。碱可选自宽范围的合适载体，包括但不限于聚羧酸或其盐、羧酸酐(选自马来酸酐)与其它单体选自(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)的共聚物、亲水性乙烯基聚合物如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素衍生物如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等，以及天然聚合物如壳聚糖、胶原、藻酸钠、明胶、透明质酸及其无毒金属盐。通常，选择可生物降解的聚合物作为碱或媒介物，例如，聚乳酸、聚(乳酸～乙醇酸)。共聚物、聚羟基丁酸、聚(羟基丁酸-乙醇酸)共聚物、及其混合物。可选地或另外地，合成的脂肪酸酯如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等可用作媒介物。亲水性聚合物和其他载体可以单独或组合使用，并且可以通过部分结晶、离子键合、交联等赋予载体增强的结构完整性。媒介物可以以多种形式提供，包括流体或粘性溶液、凝胶、糊剂、粉末、微球和用于直接施用至鼻粘膜的膜。在这种情况下使用选择的媒介物可导致包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物的吸收的促进。
本公开的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可替代地包含接近生理条件所需的作为药学上可接受的载体物质，例如pH值调节剂和缓冲剂、张力调节剂和润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、以及它们的混合物。对于固体包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，可使用常规无毒的药学上可接受的载体，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
在可选的实施方式中，本公开的包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物可以在施用于受试者之前或之后被雾化或以其他方式作为颗粒液体或固体递送。用于施用此类固体或液体颗粒包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物为雾化水溶液或悬浮液，装载在易于产生被受试者呼吸或吸入的颗粒的至少一种合适的装置中。在可选的实施方式中，所述装置选自定量吸入器、喷射喷雾器、超声喷雾器、干粉吸入器、基于推进剂的吸入器或吹入器。
实施例1：RNA制备LNP的工艺
一种包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA50％、DOPG20％、胆固醇29％和PEG-DMG1％。
制备方法如下：(a)将RNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为55ug/ml，得到包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例2
利用荧光素酶作为报告基因，通过活体荧光成像技术研究不同疫苗载体的配方(如下表1所示，“MC3”是指Dlin-MC3-DMA，“+”：给药后通过小动物活体荧光成相系统检测到小鼠体内荧光素酶表达)在小鼠体内递送编码荧光素酶基因的mRNA的效率，并检测不同复合制剂(制备方法参见实施例1)的理化指标，结果如表1所示。通过研究发现，提高脂质与mRNA质量比有利于增加mRNA在脂质纳米颗粒中的包封率从而使其具有更高的稳定性，此外适度提高配方中聚乙二醇(PEG)的含量有利于提高mRNA在体内的表达效率。因此综合考虑mRNA包封率以及mRNA体内递送效率等因素，选取了3和4号配方用于后续mRNA疫苗的研究。
表1
实施例3
不同配方的阳离子脂质纳米颗粒包裹编码荧光素酶的mRNA的能力及形成纳米颗粒的粒度数据如表2所示，几种配方均能将荧光素酶mRNA压缩成粒径100nm以下表面电位净中性的纳米颗粒，同时均能包裹至少50％的mRNA，因此均可具备一定的体内递送效果。“MC3”是指Dlin-MC3-DMA。
表2
实施例4
选取BALB/c小鼠(雌性5-6周龄，平均体重20-25g，购自珠海百试通生物科技有限公司)，进行疫苗免疫原性评价。
实验动物随机分组，每组5只小鼠。免疫剂量为15μg/只，疫苗接种后2周给予相同剂量的强化免疫，二次免疫12天后，检测细胞免疫应答及体液免疫应答指标。
其中小鼠的淋巴细胞按照下面的方法进行分离：断颈处死小鼠，浸泡于75％的乙醇中；在超净台中取出小鼠脾脏；在35mm培养皿中放入4mL-5mL小鼠淋巴细胞分离液(取用前恢复至室温并摇匀)；研磨，把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15mL离心管中，室温，水平转子800g离心30min。离心结束后吸出淋巴细胞层，再加入10mL RPMI 1640培养基，颠倒洗涤。室温离心收集细胞。
1、ELISA检测小鼠血清中RSV-F蛋白特异性IgG抗体
用洗涤液将稀释至2μg/mL的hRSVF蛋白(HisTag)(2mg/mL)加入多孔板(每孔100μL)，包被过夜。洗涤，加入2％BSA溶液封闭。用洗涤液将所有待测血清样品从1∶100开始，按10倍梯度进行稀释，稀释至1∶100万，阴性对照样品与待测血清样品保持一致，进行相同倍数的稀释，共有6个梯度的样品。将配制好的血清样品溶液加于酶标的多孔板上，孵育后洗涤，加入稀释好的酶标抗体溶液，孵育后洗涤，显色处理，在酶标仪上450nm/630nm测OD值。取阴性血清样本信号的算数平均值2.1倍作为Cutoff值。
2、流式检测TNFα+CD4+和TNF-α+CD8+的T细胞
取分离的小鼠淋巴细胞，加入肽库刺激，置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h。使用BD GolgiPlμgTM(含布雷非德菌素A)蛋白转运抑制剂(含BSA)溶液刺激过夜。将小鼠淋巴细胞悬液离心留沉淀。重悬小鼠淋巴细胞沉淀，加入特异性单克隆荧光抗体，如CD4、CD8等，孵育离心留小鼠淋巴细胞沉淀。加入固定/渗透溶液，孵育离心留小鼠淋巴细胞沉淀。在小鼠淋巴细胞沉淀中加入缓冲液，混匀离心留小鼠淋巴细胞沉淀。用染色缓冲液重悬小鼠淋巴细胞沉淀，加入细胞因子荧光抗体，如IFN-γ、TNF-α等，避光孵育离心留小鼠淋巴细胞沉淀。然后用染色缓冲液重悬小鼠淋巴细胞沉淀，上流式细胞仪检测。通过流式检测了CD3+/CD4+及CD3+/CD8+T淋巴细胞中TNF-α的表达。
3、ELISA检测细胞培养基上清中的IFN-γ和IL4
取分离的小鼠淋巴细胞，加入肽库刺激，置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h，将小鼠淋巴细胞悬液离心取上清液。使用小鼠IL-4ELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)和小鼠IFN-γELISA试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)检测上清液IFN-γ和IL4含量。
4、血清的中和活性
免疫组血清的中和活性检测方法如下：
消化HEp-2细胞，调整细胞密度，接种至96孔板，培养过夜。多孔板的阳性孔中加入各小鼠血清稀释液和病毒稀释液，阴性孔加入病毒稀释液，再在多孔板的阳性孔和阴性孔中加入稀释的病毒，培养中和。将多孔板的阳性孔和阴性孔中的中和产物分别加入到装有消化完毕的HEp-2细胞多孔板中，培养；将中和产物吸出，每孔加入DMEM+2％FBS培养基继续培养。细胞弃上清，每孔加入4％多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤液洗涤，用4％BSA和0.2％triton的1:1混合溶液封闭细胞。弃去封闭液，加入F6-6-488抗体稀释液，孵育洗涤；甩干多孔板，使用CTL设备读数。
实施例5
表格3中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格3所述的mRNA序列按照实施例1所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒。
编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了表格中的阅读框序列外，还包括5’帽子、5’UTR(如Seq ID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
表3
样品Y1为包含编码RSVF蛋白野生型氨基酸序列(Wt，氨基酸序列如Seq ID NO.66所示)的RNA的脂质纳米颗粒；样品Y2编码的氨基酸序列以RSVF蛋白野生型为基础，将TM序列去除，在C末端添加Fibritin Dominain(Fibritin Dominain氨基酸序列如Seq ID NO.41所示)；样品Y3编码的氨基酸序列以RSVF蛋白野生型为基础，将P27序列去除，在F2序列和RR1序列中间用GS-linker-linker连接；Y4编码的氨基酸序列发生S155C/S190F/V207L/S290C位点突变，将TM序列去除，在C末端添加Fibritin Dominain(Fibritin Dominain氨基酸序列如Seq ID NO.41所示)；Y5编码的氨基酸序列发生N67I/S215P位点突变，删除P27序列，在F2序列的末端氨基酸Arg前中加入GS-linker连接序列，将TM序列去除，在C末端添加Fibritin Dominain(Fibritin Dominain氨基酸序列如Seq ID NO.41所示)；Y6编码的氨基酸序列发生N67I/S155C/S190F/V207L/S215P/S290C/D486C/D489C位点突变，Y6编码的氨基酸序列如Seq ID NO.78所示，包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.85-87所示的末端序列。
按照实施例4的方法对制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒进行疫苗免疫原性评价。
1、ELISA检测小鼠血清中RSV-F蛋白特异性IgG抗体
实验结果如图Fig.3A-3E所示。Fig.3A-3E分别为将血清从100倍-100万倍稀释后，通过间接ELISA测定的OD450。样本OD450≥最小稀释倍数(1:100)阴性对照OD450平均值的2倍，则判定为阳性，具体Fig.3A-3E上的虚线为cutoff线。其中，Y1免疫组直到稀释至100万倍时，样本才未出现阳性值。Fig.3F为血清IgG抗体效价的测定。
结果表明，RSVF蛋白变体mRNA疫苗免疫组IgG抗体效价均显著高于PBS对照组，Y1免疫组(编码野生型的RSVF蛋白的mRNA疫苗免疫组)显著高于其它免疫组。
2、流式检测TNFα+CD4+和TNF-α+CD8+的T细胞
除Y5免疫组外，其余免疫组较PBS对照组有显著增高。结果表明，RSVF蛋白变体mRNA疫苗可刺激小鼠的Th1型细胞免疫应答。
3、ELISA检测细胞培养基上清中的IFN-γ和IL4
RSVF蛋白变体mRNA疫苗免疫组的IFN-γ较PBS对照组有显著升高(P<0.01)(Th1型细胞免疫应答)，而RSV-F突变体mRNA疫苗免疫组的IL-4较PBS对照组也有显著增高(P<0.01)。
4、血清的中和活性
小鼠血清中RSV中和抗体滴度结果如图所示，与PBS对照组相比，所有RSVF蛋白变体mRNA免疫组的RSV中和抗体滴度均有显著增高。编码RSVF蛋白变体的Y2、Y3、Y4和Y6mRNA免疫组中和抗体效价较高。
实施例6
样品Y7编码的氨基酸序列以样品Y6编码的RSVF蛋白突变体为基础，将P27去除，在F2序列和RR1序列中间用GS-linker-linker连接，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq IDNO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.85-87所示的末端序列，其ORF的mRNA序列如Seq IDNO.80所示。
样品Y8编码的氨基酸序列以样品Y6编码的RSVF蛋白突变体为基础，将TM序列去除，在末端序列添加Fibritin Dominain，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、SeqID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、SeqID NO.41所示的末端序列Fibrintin Dominain，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.81所示。
Y9编码的氨基酸序列发生S46G/E92D/A149C/S155C/S190F/V207L/S215P/S290C/Y458C/K465Q位点突变，删除P27序列，在F2序列和RR1序列中加入GS-linker-linker连接序列，将TM序列去除，在C末端添加Fibritin Dominain(氨基酸序列如Seq ID NO.41所示)，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.82所示。(DS2突变体)
Y10编码的氨基酸序列以样品Y7编码的RSVF蛋白突变体为基础，将TM序列去除，在末端序列添加Fibritin Dominain，发生S46G/E92D位点突变，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列如Seq ID NO.95所示，包括如Seq IDNO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.41所示的末端序列Fibrintin Dominain，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.83所示；
Y11编码的氨基酸序列以样品Y7编码的RSVF蛋白突变体为基础，发生Y458C/K465Q/A149C位点突变，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列如Seq ID NO.96所示，包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、SeqID NO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.41所示的末端序列Fibrintin Dominain，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.84所示。
Y12编码的氨基酸序列以样品Y10编码的RSVF蛋白突变体为基础，发生S46G/E92D位点突变，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列如Seq ID NO.97所示，包括如Seq IDNO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq ID NO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.41所示的末端序列Fibrintin Dominain，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.94所示。
按照上述描述以及实施例2所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒，分别为样品Y7-Y12。
编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述的阅读框序列外，还包括5’帽子、5’UTR(如Seq ID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
按照实施例4的方法对制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒进行疫苗免疫原性评价。
(1)ELISA检测血清中RSV-F蛋白的特异性IgG
Fig.7A-7D分别为将血清从100倍-100万倍稀释后，通过间接ELISA测定的OD450。样本OD450≥最小稀释倍数(1:100)阴性对照OD450平均值的2倍，则判定为阳性，具体Fig.7A-7D上的虚线为cutoff线。其中，Y6免疫组直到稀释至1万倍时，样本才未出现阳性值。Fig.7E为血清IgG抗体效价的测定。
结果表明，RSVF蛋白变体mRNA疫苗免疫组IgG抗体效价均显著高于PBS对照组。
(2)ELISA检测细胞培养基上清中的IFN-γ和IL4
RSVF蛋白变体mRNA疫苗免疫组的IFN-γ较PBS对照组有显著升高(P<0.01)(Th1型细胞免疫应答)；RSVF蛋白变体mRNA疫苗免疫组的IL-4较PBS对照组也有显著增高(P<0.01)。
(3)流式检测TNFα+CD4+和TNF-α+CD8+的T细胞
免疫12d后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，通过流式检测了CD3+/CD4+及CD3+/CD8+T淋巴细胞中TNF-α的表达，RSVF蛋白变体免疫组较PBS对照组有显著增高。
结果表明，RSVF蛋白变体mRNA疫苗可刺激小鼠的Th1型细胞免疫应答。
(4)血清中RSV中和抗体滴度
二免12d后，RSV活病毒嗜班减少实验检测小鼠血清中RSV中和抗体滴度。如图所示，与PBS对照组相比，所有RSVF蛋白变体mRNA免疫组的RSV中和抗体滴度均有显著增高。
实施例7
以样品Y6编码的RSVF蛋白突变体(氨基酸序列如Seq ID NO.78所示)为基础，将F2序列、RR1序列和RR2序列的部分位点或序列进行突变，以样品Y6编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.79所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，分别按照实施例2所述的方法制备得到样品Y6-1、样品Y6-2、样品Y6-3、样品Y6-4、样品Y6-5、样品Y6-6、样品Y6-7和样品Y6-8的编码合胞病毒RNA疫苗的脂质纳米颗粒。
具体来说，样品Y6-1用氨基酸序列如Seq ID NO.2的F2序列替换；样品Y6-2用氨基酸序列如Seq ID NO.6的RR1序列替换；样品Y6-3用氨基酸序列如Seq ID NO.88的RR2序列替换；样品Y6-4用氨基酸序列如Seq ID NO.89的RR2序列替换；样品Y6-5用氨基酸序列如Seq ID NO.90的RR2序列替换；样品Y6-6用氨基酸序列如Seq ID NO.92的RR2序列替换；样品Y6-7用氨基酸序列如Seq ID NO.93的RR2序列替换；样品Y6-8用氨基酸序列如Seq IDNO.2的F2序列、如Seq ID NO.6的RR1序列和如Seq ID NO.88的RR2序列替换。
除上述的核苷酸ORF序列外，这些RNA疫苗的序列还包括包括5’帽子、5’UTR(如SeqID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
制备获得的脂质纳米颗粒样品Y6-1、样品Y6-2、样品Y6-3、样品Y6-4、样品Y6-5、样品Y6-6、样品Y6-7和样品Y6-8，按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价。实验结果见图11。
实施例8
用氨基酸序列如Seq ID NO.90的RR2序列替换样品7编码的RSVF蛋白突变体RR2序列，以样品Y7编码的RSV F蛋白突变体如Seq ID NO.80所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y7-1。
用氨基酸序列如Seq ID NO.89的RR2序列替换样品7编码的RSVF蛋白突变体RR2序列，以样品Y11编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.80所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子获得氨基酸突变位点的RNA序列，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y7-2。
用氨基酸序列如Seq ID NO.92的RR2序列替换样品8编码的RSVF蛋白突变体RR2序列，以样品Y8编码的RSV F蛋白突变体如Seq ID NO.81所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y8-1。
用氨基酸序列如Seq ID NO.2的F2序列、如Seq ID NO.7的RR1序列和如Seq IDNO.88的RR2序列替换替换样品8编码的RSVF蛋白突变体的F2序列，以样品Y8编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.81所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y8-2。
用氨基酸序列如Seq ID NO.88的RR2序列替换样品10编码的RSVF蛋白突变体的RR2序列，以样品Y10编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.83所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y10-1。
用氨基酸序列如Seq ID NO.93的RR2序列替换样品10编码的RSVF蛋白突变体的RR2序列，以样品Y10编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.83所示的核苷酸ORF序列为基础，以人类的常用密码子对突变位点进行替换，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y10-2。
除上述的核苷酸ORF序列外，这些RNA疫苗的序列还包括包括5’帽子、5’UTR(如SeqID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
制备获得的脂质纳米颗粒样品Y7-1、Y7-2、样品Y8-1、样品Y8-2、样品Y10-1和样品Y10-2，按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价。实验结果见图12。
实施例9
样品Y12-1编码的氨基酸序列以样品Y12编码的RSVF蛋白突变体为基础，其编码的RSVF蛋白突变体的氨基酸序列如Seq ID NO.64所示，包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.5所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.9所示的RR1序列、Seq ID NO.11所示的F1序列、Seq ID NO.12所示的RR2序列、Seq ID NO.41所示的末端序列，其ORF的mRNA序列如Seq ID NO.98所示。
用氨基酸序列如Seq ID NO.13-Seq ID NO.20的RR2序列替换样品12-1编码的RSVF蛋白突变体的RR2序列，以样品Y12-1编码的RSVF蛋白突变体如Seq ID NO.98所示的核苷酸ORF序列为基础，按照实施例2所述的方法制备得到样品Y12-2、Y12-3、Y12-4、Y12-5、Y12-6、Y12-7、Y12-8和Y12-9。
除上述的核苷酸ORF序列外，这些RNA疫苗的序列还包括包括5’帽子、5’UTR(如SeqID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
制备获得的脂质纳米颗粒样品Y12-2、Y12-3、Y12-4、Y12-5、Y12-6、Y12-7、Y12-8和Y12-9，按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价。实验结果见图13。
实施例10
样品Y6.1、样品Y6.2、样品Y6.3、样品Y6.4、样品Y6.5、样品Y6.6为按照实施例2所述的方法制备的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒。
样品Y6.1中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.21所示的二聚化元件序列；所述二聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.99所示。
样品Y6.2中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.25所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.100所示。
样品Y6.3中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.31所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.101所示。
样品Y6.4中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.42所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.102所示。
样品Y6.5中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.48所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.103所示。
样品Y6.6中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.3所示的F2序列、Seq ID NO.76所示的P27序列、Seq ID NO.7所示的RR1序列、Seq ID NO.10所示的F1序列、Seq ID NO.91所示的RR2序列、Seq ID NO.54所示的四聚化元件序列；所述四聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.104所示。
编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述表格中的阅读框序列外，还包括5’帽子、5’UTR(如Seq ID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
将制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒按照实施例4所述方法进行疫苗免疫原性评价。检测结果见图。
本申请还将多聚化元件分别用氨基酸序列如Seq ID NO.21-Seq ID NO.57所示的序列进行替换，得到新的呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的氨基酸序列，根据新氨基酸序列设计和制备相应的包含编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA脂质纳米颗粒，并按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价，其中二聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约3000；三聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约3300；四聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约3200。
实施例11
样品Y12.1、样品Y12.2、样品Y12.3、样品Y12.4、样品Y12.5、样品Y12.6为按照实施例2所述的方法制备的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒。
样品Y12.1中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.22所示的二聚化元件序列；所述二聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.105所示。
样品Y12.2中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.26所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.106所示。
样品Y12.3中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.37所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.107所示。
样品Y12.4中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.50所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.108所示。
样品Y12.5中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.53所示的三聚化元件序列；所述三聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.109所示。
样品Y12.6中的编码呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的mRNA脂质纳米颗粒，所述的原hRSVF蛋白氨基酸序列包括如Seq ID NO.1所示的SP序列、Seq ID NO.4所示的F2序列、Seq ID NO.77所示的GS-linker-linker序列、Seq ID NO.8所示的RR1序列、Seq IDNO.11所示的F1序列、Seq ID NO.17所示的RR2序列、Seq ID NO.57所示的四聚化元件序列；所述四聚化元件序列的RNA序列如Seq ID NO.110所示。
编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗除了上述表格中的阅读框序列外，还包括5’帽子、5’UTR(如Seq ID NO.58所示)、3’UTR(如Seq ID NO.61所示)和100个polyA的3’尾。
将制备的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒按照实施例4所述方法进行疫苗免疫原性评价。检测结果见图。
本申请还将多聚化元件分别用氨基酸序列如Seq ID NO.21-Seq ID NO.57所示的序列进行替换，得到新的呼吸道合胞病毒抗原hRSVF蛋白变体的氨基酸序列，根据新氨基酸序列设计和制备相应的包含编码编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA脂质纳米颗粒，并按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价，其中二聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约3800；三聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约4000；四聚化元件的实验小鼠血清的中和活性NT50约3700。
实施例12
表格7中所述的核苷酸序列为mRNA序列，将表格7所述的mRNA序列按照实施例2所述的方法分别制备为包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒。
制备的脂质纳米颗粒，按照实施例4的方法进行疫苗免疫原性评价。实验结果见图。
表格7
序号 名称 ORF核苷酸序列 3’UTR 5’UTR
1 Y13 Seq ID NO.94 Seq ID NO.63 Seq ID NO.60
2 Y14 Seq ID NO.94 Seq ID NO.62 Seq ID NO.60
3 Y15 Seq ID NO.94 Seq ID NO.61 Seq ID NO.60
4 Y12 Seq ID NO.94 Seq ID NO.61 Seq ID NO.58
5 Y16 Seq ID NO.98 Seq ID NO.63 Seq ID NO.59
6 Y17 Seq ID NO.98 Seq ID NO.62 Seq ID NO.59
7 Y18 Seq ID NO.98 Seq ID NO.61 Seq ID NO.59
8 Y12-1 Seq ID NO.98 Seq ID NO.61 Seq ID NO.58
9 Y19 Seq ID NO.79 Seq ID NO.63 Seq ID NO.58
10 Y20 Seq ID NO.79 Seq ID NO.62 Seq ID NO.58
11 Y6 Seq ID NO.79 Seq ID NO.61 Seq ID NO.58
实施例13
取实施例5中的Y6、Y12、Y12-1制备的包含编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA的脂质纳米颗粒，以及合胞病毒F糖蛋白(购自ATCC)，按照实施例4所述的方法进行疫苗免疫原性评价。结果如图所示。
实施例14
异源蛋白表达需要进行密码子优化，选择高丰度的tRNA对应的同义密码子，提升蛋白翻译效率。在2006年，Grzegorz Kudla等人发表文章High Guanine and CytosineContent Increases mRNALevels in Mammalian Cells，发现在哺乳动物细胞中，富含GC的基因表达效率要比低GC含量的基因高出几倍到一百倍，这种现象是由于富含GC的基因更加高效的mRNA转录或者加工，产生更多的处于稳定状态的mRNA。
密码子适应指数CAI(CodonAdaption Index)，指异源mRNA序列中密码子和宿主细胞最佳密码子使用频率的相符程度，此数值越接近1，理论上，外源mRNA在宿主细胞中的蛋白表达越高。因此密码子优化最基本的原则就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换外源mRNA序列中的密码子，保证外源mRNA序列中的密码子和宿主细胞的密码子使用偏向性更加契合，避免出现稀有密码子。但是，我们需要知道，密码子并不是影响蛋白表达的唯一因素，还存在其他因素，例如稀有密码子，GC含量，二级结构(自由能)等。当把外源mRNA序列中的密码子全部更换为宿主细胞的最佳密码子，可能反而导致蛋白无法表达，因为由一些蛋白的表达需要稀有密码子的存在，延缓核糖体前进的速度，为蛋白质的正确折叠来提供足够的时间。
2021年10月，张贺等人发表文章LinearDesign:Efficient Algorithms forOptimized mRNA Sequence Design，开发了一种新的算法来更加有效地优化mRNA序列，网站http://rna.baidu.com/，算法兼顾了mRNA的密码子适应指数CAI和折叠自由能MFE，能够获得结构更加稳定的mRNA，延长mRNA半衰期和蛋白表达时间，从而提升细胞内mRNA终产量。
样品Y21、样品Y22、样品Y23分别为包含阅读框序列如Seq ID NO.65、Seq IDNO.111、Seq ID NO.112所示的RNA序列的编码呼吸道合胞病毒抗原的RNA疫苗LNP，除了所述的阅读框序列外，mRNA还包括5’帽子、5’UTR(如Seq ID NO.58所示)、3’UTR(如Seq IDNO.61所示)和100个polyA的3’尾。样品Y21、样品Y22、样品Y23和Y12-1的RNA疫苗LNP中包含的阅读框序列采用不同的优化方法获得，利用在线工具对四个阅读框序列的ΔG、GC含量及CAI等进行测算，结果如下：Seq ID NO.65的ΔG＝-879.60kcal/mol，GC＝52.24％，CAI＝0.73；Seq ID NO.98的ΔG＝-493.20kcal/mol，GC＝53.57％，CAI＝0.93；Seq ID NO.111的ΔG＝-413.30kcal/mol，GC＝46.92％，CAI＝0.81；Seq ID NO.112的ΔG＝-483.70kcal/mol，GC＝53.84％,CAI＝0.93。
按照实施例4的方法，对样品Y21、样品Y22、样品Y23、样品Y12-1进行疫苗免疫原性评价。实验结果见图18。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物，其特征在于，所述免疫组合物选自核酸免疫组合物、多肽免疫组合物或病毒免疫组合物；所述人呼吸道合胞病毒抗原为融合前hRSVF蛋白；所述融合前hRSVF蛋白的F1序列如Seq ID NO.10～11所示，F2序列如Seq IDNO.2～5所示，RR1序列如Seq ID NO.6～9所示，RR2序列如Seq ID NO.12～20、Seq IDNO.88～93所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57、Seq ID NO.85～87所示。
2.如权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如Seq ID NO.76所示，F2序列如Seq ID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如SeqID NO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.85～87所示；
所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如SeqID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq IDNO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.85～87所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如Seq ID NO.76所示，F2序列如Seq ID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq ID NO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq IDNO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，RR1序列如Seq ID NO.8所示，F1序列如Seq ID NO.11所示，RR2序列如Seq ID NO.17所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq IDNO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq ID NO.78、Seq IDNO.95～97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.78、Seq ID NO.95～97至少80％同一性的氨基酸序列；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq ID NO.97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的免疫组合物，其特征在于，所述融合前hRSVF蛋白的F2序列104～109位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR1序列137～144位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR2序列504～524位氨基酸连续或间隔缺失至少1个的氨基酸残基；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白P27序列被GS-linker序列取代，所述GS-linker序列选自(GnS)m、((GGGGS)o、GGSGGGGSGG、GGSGGGGG、GSGSGSGS、(Gly)p、(EAAAK)q中的一种；其中n为1～10、15或20；m为1～10、15或20；o是1～5的整数；p是1～40的整数；q为1～5的整数。
4.如权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述免疫组合物为核酸免疫组合物，所述核酸免疫组合物包含编码融合前hRSVF蛋白的DNA分子和/或RNA分子；优选的，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子；优选的，所述RNA分子包括mRNA分子或环形RNA分子；
优选的，所述所述RNA分子为mRNA，所述mRNA分子包括开放阅读框，所述开放阅读框的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、SeqID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq IDNO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列；
优选的，所述mRNA分子包括开放阅读框，所述开放阅读框的核苷酸序列如Seq IDNO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列；
优选的，所述mRNA分子的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团；优选的，所述mRNA分子的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP；优选的，所述mRNA分子的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200；
优选的，所述mRNA分子还含有5’UTR；优选的，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；优选的，所述5’UTR核苷酸序列如SEQID.NO.58～60所示；
优选的，所述mRNA片段还含有3’UTR；优选的，3’UTR序列如SEQID.NO.61～63所示；
优选的，mRNA分子中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换；优选的，所述置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
5.如权利要求4所述的免疫组合物，其特征在于，所述核酸免疫组合物包括与核酸适配的载体；优选的，所述载体选自脂质体纳米颗粒、阳离子纳米乳、LLP。
6.如权利要求4所述的免疫组合物的制备方法，其特征在于，通过将含有上述mRNA分子的水相与含有载体组分的有机相混合，得到核酸免疫组合物；优选的，所述载体包括脂质体纳米颗粒；优选的，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质，20％～50％的DOPG，5％～20％的胆固醇；和1％～5％的PEG-DMG；
优选的，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
7.如权利要求6所述免疫组合物的制备方法，其特征在于，mRNA分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸免疫组合物。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码人呼吸道合胞病毒抗原的核酸，所述人呼吸道合胞病毒抗原为融合前hRSVF蛋白；所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如SeqID NO.76所示，F2序列如Seq ID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq IDNO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.85～87所示；
所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如SeqID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq IDNO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.85～87所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的P27序列如Seq ID NO.76所示，F2序列如Seq ID NO.3所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq ID NO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，RR1序列如Seq ID NO.7所示，F1序列如Seq ID NO.10所示，RR2序列如Seq ID NO.91所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq IDNO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的所述F2序列通过GS-linker序列连接RR1序列，F2序列如Seq ID NO.4所示，RR1序列如Seq ID NO.8所示，F1序列如Seq ID NO.11所示，RR2序列如Seq ID NO.17所示，C末端序列如Seq ID NO.21～57所示；优选的，C末端序列如Seq IDNO.41所示；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq ID NO.78、Seq IDNO.95～97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.78、Seq ID NO.95～97至少80％同一性的氨基酸序列；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.64、Seq ID NO.97所示，或，包含与Seq ID NO.64、Seq ID NO.97至少80％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述融合前hRSVF蛋白的F2序列104～109位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR1序列137～144位氨基酸连续或间隔缺失至少1个氨基酸残基，或，RR2序列504～524位氨基酸连续或间隔缺失至少1个的氨基酸残基；
优选的，所述融合前hRSVF蛋白P27序列被GS-linker序列取代，所述GS-linker序列选自(GnS)m、((GGGGS)o、GGSGGGGSGG、GGSGGGGG、GSGSGSGS、(Gly)p、(EAAAK)q中的一种；其中n为1～10、15或20；m为1～10、15或20；o是1～5的整数；p是1～40的整数；q为1～5的整数。
10.如权利要求8～9所述核酸分子，其特征在于，编码人呼吸道合胞病毒抗原的核酸包括DNA分子和/或RNA分子；优选的，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子；优选的，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA；所述mRNA分子包括开放阅读框，所述开放阅读框的核苷酸序列如Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq IDNO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.80～81、Seq ID NO.83～84、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列；
优选的，所述mRNA分子包括开放阅读框，所述开放阅读框的核苷酸序列如Seq IDNO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112所示，或，包含与Seq ID NO.65、Seq ID NO.79、Seq ID NO.94、Seq ID NO.98、Seq ID NO.111～112至少80％同一性的核苷酸序列。
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