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CN118440937B - 新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗 - Google Patents

新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗 Download PDF

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CN118440937B CN202410420671.7A CN202410420671A CN118440937B CN 118440937 B CN118440937 B CN 118440937B CN 202410420671 A CN202410420671 A CN 202410420671A CN 118440937 B CN118440937 B CN 118440937B
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Abstract

本发明提供了一种重组人合胞病毒RSV B pre F mRNA，以及利用所述mRNA制备的人合胞病毒疫苗及其应用。本发明通过病毒株的筛选、修饰，以及对mRNA序列优化获得了一种重组人合胞病毒mRNA，进一步成功获得了人合胞病毒mRNA/LNP纳米颗粒疫苗。制备的疫苗免疫小鼠后可以产生特异性抗体和中和抗体，疫苗的保护时效检测表明人合胞病毒疫苗免疫保护期限可达一年以上。病毒感染后再给予加强疫苗，则极大地提高了抗体含量，预示着人合胞病毒疫苗具有非常好的病毒保护效果。棉鼠肺部实验证明所述疫苗能够有效地控制RSV病毒在肺部的扩增，且免疫效果明显优于市售同类合胞病毒疫苗产品。

Description

新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域。具体涉及新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗的设计及应用，属于免疫药物技术领域。
背景技术
基于核酸等生物大分子的细胞内递送技术，近年来得到了创新药研发领域的广泛关注,其中，基于mRNA技术的新型疫苗在紧急需求之下，研发、临床试验及上市批准被迅速推进，向世界第一次展现了mRNA技术平台的临床有效性，安全性和商业价值。
与传统的直接以蛋白质或多肽作为药物活性成分的药物相比，mRNA技术有诸多优势：1)更高的生物活性与安全性：mRNA技术的药物，其蛋白表达、相关结构的糖基化、末端修饰、去甲基化等复杂的蛋白修饰过程皆在人体自身细胞内按照天然路径完成。无论是从合成原料的分子结构还是合成环境上考虑，都与人体高度同源。因此，相比于传统蛋白质制剂体外细菌体系或细胞体系，基于mRNA序列的内源性蛋白质产物具有更准确的作用特异性，更高的亲和力和与之伴随的更值得期待的生物活性。2)更长的生物半衰期：现有实验结果证实，包括抗体在内，通过mRNA来生成的蛋白质，尤其是采用自复制核酸或环状核酸，可以维持较长时间的有效血液浓度，从而降低用药频率和用药量，降低药物副作用，提高患者顺应性。3)更多的应用场景:通过基于递送技术的剂型和多样化的给药方式的开发，mRNA制剂可以接触到多种临床作用靶点，提高药物活性成分的局部区域浓度和药效，在丰富了新药开发的范围的同时，也丰富临床上患者治疗方式的选择。4)快速响应：mRNA疫苗在产品开发流程中应用到的技术多为基本的分子生物学方法，技术转移相对容易。一个成熟的mRNA平台，从针对不同病原体的基因测序、设计至生产，只需要数周的时间，在对于时间要求比较紧急的疫情中能迅速应对，及时发挥疫苗的重要作用。
人类呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,hRSV)是副粘病毒科肺病毒属的一种有包膜的不分节段负链RNA病毒，是一种长期全球高度流行的，传染性很强的呼吸道病毒。其传染性和致病性仅次于流感，导致婴儿患细支气管炎、成人患普通感冒，以及老年人和免疫功能低下者患上更严重的呼吸道疾病，例如肺炎。每年在世界范围内影响超过6400万人。由于2023年以前没有预防性疫苗或有效的抗病毒药物，RSV感染带来巨大的健康隐患和经济负担。每年因RSV感染造成全球超过300万人住院，近6万人死亡，其中近一半发生在6个月以内的婴儿。仅在美国，老年人的RSV感染每年导致17.7万人住院，1.4万人死亡，住院费用超过10亿美元。
RSV基因组总长约为15,000个核苷酸，由10个基因组成，编码11种蛋白质。病毒颗粒的内部是由核蛋白(N)、四聚体磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)结合病毒RNA组成，它被基质蛋白(M)包围，并被包裹在脂质双层中，双层中分布着融合蛋白F,糖蛋白G和小疏水蛋白SH。根据F和G蛋白对单克隆抗体的反应情况，RSV病毒分为两种抗原亚型：A型和B型，这二种亚型在当地流行病中同时或交替传播。由于F蛋白在RSV进入宿主细胞过程中发挥着重要作用，同时具有跨毒株型保守性，蛋白稳定性，和较少的糖基修饰性，它最终成为疫苗的热门抗原。
F蛋白序列在毒株之间高度保守，并以二种构象形式存在。融合前是Pre-F状态，蛋白质以三聚体形式存在，并包含主要抗原位点在与宿主细胞表面的靶标结合后，为拉近病毒膜和细胞膜的距离，Pre-F会发生构象变化，位点会因包被到内部而丢失，转变为较稳定的融合后Post-F构象。在细胞中，最初F蛋白表达为单一多肽前体F0，在弗林蛋白酶酶切下，形成F1、F2和Pep27多肽。其中F1和F2通过两个二硫键连接，形成成熟的F蛋白，并以三聚体的结构锚定在病毒膜中。由于RSV F蛋白在RSV进入细胞过程中发挥着重要作用，因此它是中和抗体的目标，也是疫苗开发的主体。然而，与其他RSV抗原一样，先前基于RSV F蛋白的疫苗开发努力已被证明并不成功。
自1957年RSV首次在人群中被发现，对RSV疫苗的尝试几十年来从未间断过。然而，由于技术的滞后，从灭活疫苗造成更为严重的感染，到后来的蛋白疫苗，病毒载体疫苗，研究者一直在效价，G蛋白，F蛋白，还是N蛋白作为抗原，主要是诱导T细胞的细胞免疫还是B细胞的体液免疫，等诸多问题上纠结，积累了大量的经验，但始终没有获得成功的RSV疫苗。
近年来，随着结构分子生物学的介入，人们对疫苗的工作原理有了突破性的认识，使得最初二款RSV蛋白疫苗(GSK和Pfizer)得以问世。我们的设计，正是结合了最新的抗原蛋白结构生物学发现和对病毒流行病学和毒株的深入的了解，设计和合成了我们独有的RSV B mRNA/LNP疫苗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中RSV疫苗不足或效果不理想的问题，提供一种RSV B mRNA/LNP疫苗。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种重组人合胞病毒mRNA疫苗，所述与疫苗RSV B-F相对应的DNA编码序列如SEQ ID NO:1，mRNA序列如SEQ ID NO:2，蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明公开了表达载体，所述表达载体所述的DNA分子。
优选的，所述表达载体的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明公开了细胞，所述细胞包含所述的表达载体。
本发明公开了重组蛋白，所述重组蛋白由所述的mRNA翻译获得。
优选的，所述重组蛋白的序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明公开了核苷酸，所述核苷酸编码所述的重组蛋白。
本发明公开了质粒，所述质粒包含所述的核苷酸。
本发明公开了mRNA/LNP复合物，包括所述的mRNA分子和脂质纳米颗粒。
本发明公开了mRNA/LNP复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将所述的mRNA溶解在醋酸盐缓冲液中；
2)将可电离阳离子、DSPC、胆固醇、PEG-2000按比例配置成混合溶液；
3)将步骤2)中的溶液与步骤1)中的溶液在微流控中高速对冲混合，并进行稀释和提升pH值，获得mRNA/LNP复合物。
优选的，所述mRNA经体外转录加帽获得。
优选的，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.0，浓度为50mM。
本发明公开了mRNA/LNP复合物，所述复合物按照所述的方法制备得到。
本发明公开了疫苗组合物，所述疫苗组合物包括所述的mRNA和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mRNA/LNP复合物。
本发明公开了所述的mRNA和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mRNA/LNP复合物在制备人合胞病毒疫苗组合物中的应用。
本发明公开了所述的mRNA和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mRNA/LNP复合物在制备治疗合胞病毒感染导致的疾病的药物中的用途。
优选的，所述疾病为呼吸道疾病，所述呼吸道疾病为肺炎或细支气管炎或感冒。
本发明公开了所述的mRNA和/或所述的表达载体和/或所述的重组蛋白和/或所述的核苷酸和/或所述的质粒和/或所述的mRNA/LNP复合物在制备治疗患有合胞病毒感染导致的疾病的患者的药物中的用途。
优选的，所述疾病为呼吸道疾病，所述呼吸道疾病为肺炎或细支气管炎或感冒。
优选的，所述患者先前已经感染过合胞病毒。
优选的，所述感染次数为一次或多次。
本发明通过病毒株的筛选、修饰，以及对mRNA序列优化获得了一种重组人合胞病毒mRNA。进一步将所述mRNA的编码基因构建质粒在体外实现了高效转录和加帽，通过pH提升而形成mRNA包裹在其中的脂质纳米颗粒，包封率达到91％以上，成功获得了mRNA/LNP纳米颗粒疫苗。并对RSV F mRNA/LNP纳米颗粒在细胞中的表达进行了了western鉴定。免疫小鼠后产生特异性抗体和中和抗体，疫苗的保护时效检测表明免疫六个月时，抗体水平才表现出下降，但幅度非常有限，证明了制备的疫苗对病毒是有长期保护能力的。病毒感染后再给予加强疫苗，则极大地提高了抗体含量，预示着具有非常好的病毒保护效果，棉鼠肺部实验证明所述疫苗能够有效地控制RSV病毒在肺部的扩增，且免疫效果明显优于市售同类合胞病毒疫苗产品。
附图说明
图1.JY-B-009-V02-2疫苗序列。A)RSV-F抗原编码DNA序列(SEQ ID NO:1)；B)RSV-F抗原编码相对应的RNA序列(SEQ ID NO:2)C)RSV-F抗原蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；D)质粒DNA全序列(SEQ ID NO:4)。
图2.质粒JY-B-009-V02-2图谱。
图3.质粒JY-B-009-V02-2限制性内切酶检测。
图4.由线性化质粒JY-B-009-V02-2转录合成的mRNA特性分析。其中，图4A为毛细管电泳分析mRNA的纯度；图4B为SEC-HPLC聚集体含量分析mRNA的纯度；图4C为mRNA加帽率分析。
图5.Western Blot检测JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP纳米颗粒转染至293T细胞后在细胞中的表达。
图6.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导的抗体反应。
图7.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗抗体反应的体内剂量效应，其中图7A为不同剂量一剂肌注免疫后的抗体滴度，展现出免疫后不同剂量与时间的变化关系；图7B是与图7A相对应的每组平均值(n＝5)；图7C是以免疫后的21天和28天为例，15μg和200μg相比，抗体滴度在21天没有显著差异，在28天的差异为p<0.05。
图8.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导的体液免疫具有长效性。
图9.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗在小鼠体内诱导中和抗体的鉴定。其中，图9A为中和RSV A2病毒；图9B为中和RSV B 18537病毒。
图10.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗可以作为加强针在已经感染过RSV病毒的动物中诱导出高滴度的体液免疫。其中，图10A为实验设计；图10B为二免或一次感染后的血清抗体滴度；图10C为二免后，感染/免疫后，或仅感染后的血清抗体滴度。
图11.JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗具有降低RSV在棉鼠肺部感染的效果。其中，图11A和B为实验设计；图11C为最终定量检测棉鼠肺组织中RSV病毒含量。
图12.与已经上市的RSV疫苗相比，JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗诱导的病毒特异性抗体具有优势。其中，图12A为实验设计；图12B为一免或一次感染后血清中的抗体滴度；图12C为二免，或感染/免疫后血清中的抗体滴度。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1病毒株的筛选、修饰和mRNA序列优化
1.1起始病毒株筛选
按照传统的血清学分类，RSV病毒可以分成A亚型和B亚型。在流行病学中它们几乎等重，表现在流行年份和地区上的随机，致病程度上的相当。因而，无论将设计的重点放在哪个亚型，意义都是一样的。本专利主要专注于RSV B亚型，所列举的设计序列均起始于RSVB亚型。
目前病毒疫苗的通用设计是以传统的RSV最原始的菌株RSV-A2的F融合蛋白基因为起点，这样的疫苗所诱导的免疫反应，尤其是抗病毒抗体，与RSV-A2有着完全相同的“钥匙与锁”的匹配关系，可以较好地中和RSV-A2病毒株，达到免疫的效果。然而，病毒基因序列是会随着病毒反复感染宿主不断地传代而发生遗传变异的，结果势必造成RSV-A2这一1962年分离出来的原始菌株所诱导产生的免疫反应难以完全控制六十年以后的现代菌株。为此，我们在搜寻了几百个RSV B血清型的F基因序列后，根据病毒流行的地理位置和时间，挑选出一个临床毒株序列作为我们设计的起始点:RSV B,BE/5150/08,2008,from Belgium,GenBank:JX576730.1。
1.2序列优化：
mRNA序列设计是mRNA整个制药过程中最核心最关键的问题之一，跟mRNA成药性密不可分，它影响mRNA体外转录的产量、mRNA分子的免疫原性、翻译效率和mRNA分子的稳定性。目前通用的mRNA是由5'cap(帽结构)、5'UTR(非编码区域)、ORF(编码蛋白的开放阅读框)、3'UTR和3'poly A尾(多聚腺苷酸尾)这5个元件构成的。
5′Cap结构可保护mRNA不被胞质外切酶Xrn1和核内Xrn2酶降解。加帽的mRNA比没有加帽的mRNA具有更长的半衰期和更高的稳定性，明显提高了细胞内蛋白质合成的产量。帽子结构的化学本质是mRNA转录过程中发生修饰所形成的位于mRNA 5'端的一个特殊结构，即m7GPPPN结构，又称甲基鸟苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，鸟苷酰转移酶，mRNA(鸟嘌呤-N7)甲基转移酶和mRNA(核苷-2’)甲基转移酶共同催化作用下形成的。根据甲基化修饰的程度不同，帽可分为3种结构：Cap 0、Cap 1和Cap 2。由于未加帽mRNA或Cap 0结构会被天然免疫受体RIG-1识别，而Cap 1和Cap 2可保护其自身不被先天免疫感应器识别，我们的设计是普遍使用的Cap1结构。
T7启动子序列可以分为两个结构域：结合结构域和转录起始结构域。对于转录起始结构域来说，任何碱基的替换都会严重影响到启动子的强度。我们的设计是TAATACGACTCACTATA，后面直接接agg。Kozak是GCCGCCACC。
真核mRNA翻译起始调控主要由5′UTR特征决定，包括二级结构、序列元件和5′UTR长度，都会影响mRNA的稳定性。我们的设计是采用蛋白表达相对高的人细胞色素B-245α多肽(CYBA)UTR。当然UTR的表现也取决于细胞类型。
对RSV的蛋白序列而言，为了疫苗诱导的抗体能够更有效地阻断病毒，选用亚稳态的预融合形式是关键，它可以通过点突变来实现结构的稳定性。我们在原始序列上安排了四个点突变：DS的S155C和S290C突变，引入非天然二硫键；Cav1的S190F和V207L突变，空腔填充氨基酸。同时，为了引发均匀的更显著的免疫反应，去掉了C端的跨膜段(TM)和胞内段，替换为一个Fibritin序列，这样，F蛋白就可以以较稳固的三聚体的形式呈现。对RSV-F的DNA序列而言，选择合适的密码子可以优化mRNA的整体翻译效率。一是整体靠拢宿主细胞，也就是人的细胞中使用频率高的同义密码子去替换病毒序列中的密码子，保证密码子使用偏向性更加契合，避免出现过多的稀有密码子。但也注意到保留少量的病毒密码子，延缓核糖体前进的速度，为蛋白质的正确折叠提供足够的时间，从而更准确地还原病毒的抗原蛋白结构。另一个注意点是GC含量，略高的GC含量，据认为是可以增加mRNA的稳定性和提高体内的蛋白表达量。最后，mRNA序列的二级结构也在考量中。据报道，二级结构的发夹结构，可以影响mRNA的降解，有助于mRNA的稳定性。
与5′UTR相似，3′UTR也包含了许多调控元件，对mRNA的稳定性、亚细胞定位和翻译效率有重要作用。我们使用的3‘UTR来自human AES/TLE5 gene。
Poly A尾在蛋白翻译过程中起着不可缺或的作用，它与poly A尾结合蛋白(PAPB)结合，PAPB再跟翻译起始因子eIF4G相互作用，形成“闭环”结构，募集40S翻译起始复合物到mRNA上，与5'末端帽子结构协同作用，共同刺激翻译起始。在细菌扩增过程中，携带长的poly A核苷酸序列的质粒会产生不可预测的重组事件，质粒上的poly A尾巴随着细菌的不断扩增发生缩短，给质粒的克隆和扩增造成麻烦。有研究表明，把poly A序列间隔开来，可以显著减少质粒DNA扩增时的重组事件，维持尾巴长度，同时不影响体外转录生成的mRNA的翻译效率和半衰期。遵循这一原则，我们的polyA是40-间隔-80碱基。
获得的优化后的RSV-F编码序列如图1所示。图1A展示的是JY-B-009-V02-2疫苗的RSV-F抗原编码DNA序列(SEQ ID NO:1)；图1B是其转录后的mRNA序列(SEQ ID NO:2)；图1C是其翻译后的蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:3)；图1D则是将RSV-F抗原的DNA序列加上了N端的T7转录酶结合位点，5’UTR，Kozak，C端的终止码，3’UTR，poly(A)，然后通过HindIII和SapI位点插入载体。
实施例2 mRNA疫苗的质粒合成和DNA提取
2.1质粒合成
质粒序列设计完成后，由CRO公司合成(图2)。
2.2质粒DNA提取
2.2.1试剂配制
平板和液体LB培养基，含蛋白胨，氯化钠，酵母提取物和相应的抗生素。
2.2.2质粒转化
质粒DNA加入感受态细胞中，冰盒中静置30min；42℃水浴热激45秒，迅速置于冰盒中2min，加入500μl无抗性素LB培养液，37℃摇床培养1h，随后涂板，37℃培养过夜。第二天平板挑克隆。
2.2.3质粒DNA提取
过夜培养的菌液采取小提或大提试剂盒的方法提取。
2.3质粒DNA酶切验证
采用限制性内切酶进行单酶切，双酶切和三酶切验证。合格的质粒进入下一步实验。根据序列设计，进行三组酶双酶切验证(图3)。第一组酶为EcoR I和Hind III，酶切后的理论大小为1723bp+3279bp；第二组酶为Pml I和SnaB I，酶切后的理论大小为1179bp+3823bp；第三组酶为Pme I和Bbs I，酶切后的理论大小为211bp+4791bp。
实施例3 RSV B的体外转录加帽、纯化以及质量检测
3.1质粒DNA线性化
本设计采用在polyA的3’端设置反向的BspQI来线性化质粒。50℃反应3小时后，通过SDS-PAGE凝胶电泳来判断酶切是否完全。采用3M醋酸钠沉淀法进行纯化；随后Nanodrop法测定DNA浓度。
3.2体外转录加帽和纯化
JY-B-009-V02-2质粒设计是在T7聚合酶结合位点和5‘UTR之间加了agg，故体外转录适合于采用共转录法。共转录IVT体系中包含模板DNA，NTP(UTP为假尿嘧啶)，Capanalogs，T7转录酶，10X转录缓冲溶液，焦磷酸酶，RNA酶抑制酶，以及DEPC水，DNA模板用量和定容的体积视具体实验而定。37℃反应3小时后，加入DNase I清除DNA模板，SDS-PAGE凝胶判断mRNA合成和DNA模板消化情况。纯化方法为氯化锂沉淀法。
3.3 mRNA完整性和加帽率检测
mRNA质量，很大程度上决定了最终产品的质量。由于mRNA本身的不稳定，极易被无处不在的核酸酶降解或水解，使得mRNA疫苗在生产、工艺、长期储存等过程存在挑战。因此，一种简单高效的mRNA疫苗纯度分析和分子大小表征方法对其质量、疗效、安全性和优化制造工艺至关重要。
3.3.1.毛细管凝胶电泳(CE)
以毛细管凝胶电泳来判定不完整或片段mRNA在DS中的比例，方法参数如下：
使用Agilent 5200片段分析仪，采用Agilent DNF-471RNA分析试剂盒进行分析。供试样品稀释至20μg/mL后和Ladder在70℃下加热变性2分钟，立即冷却至4℃并保持在冰上，向96孔PCR板中加入22μL RNA Diluent Marker(15nt)溶液，再加入2μL供试样品或Ladder溶液，混匀后将96孔PCR板放到5200片段分析仪中。在8.0kV条件下分离40min。如图4A所示，我们的mRNA样品纯度达到97.1％。
3.3.2SEC-HPLC分析
以SEC-HPLC在聚集体含量的角度来分析mRNA的纯度。方法参数如下：使用流动相为150mM PB，pH 7.0，在色谱柱上以一个20min，流速为1.0mL/min等度洗脱的色谱条件进行分析，上样量为2000ng，检测波长为260nm,柱温为30℃。结果如图4B显示，mRNA纯度为98.42％。
3.3.3加帽率分析
mRNA的5’端帽子结构起到防止mRNA降解，延长半衰期及提供mRNA翻译能力的作用，是mRNA药物的关键质量属性。以RNaseH酶和特异性探针结合方式，对5’端加帽核酸片段进行特异性酶切，再以链霉亲和素偶联磁珠对加帽片段进行纯化，以离子对反向色谱法(IP-RP-HPLC)对加帽和非加帽核酸片段进行分离，并以面积归一化法计算mRNA的加帽率。
RNaseH酶特异性酶切：向样品中加入酶切探针，缓冲液和补加无酶水，混匀后置于PCR仪上，从95℃缓慢降温退火至22℃。随后加入磁珠，室温孵育30min，再加入RNase H(50μnits)，37℃孵育3h。酶切结束后，磁力架富集去除上清，然后用无酶水润洗3次。接着，加入75％甲醇置于80℃孵育3min，以磁力架富集方式收集洗脱液。将洗脱液置于真空离心浓缩仪中干燥，最后加入重悬液(100μM EDTA/1％甲醇)，即可用于后续的IP-RP-HPLC分析。
IP-RP-HPLC分析：使用流动相A为200mM六氟异丙醇+8.15mM三乙胺，流动相B为MeOH，在色谱柱上以一个20min内流速为0.3mL/min条件下将流动相B的比例从5％升到75％的梯度进行洗脱，上样量为100ng，检测波长为260nm,柱温为75℃。结果如图4C显示，mRNA加帽率为90.45％。
实施例4 mRNA/LNP纳米颗粒制备
本研究采用业内通用的纳米颗粒LNP的制备方法。
LNP由可电离阳离子(ionizable lipid)：DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)：胆固醇(cholesterol)：DMG-PEG-2000以50：10：38.5：1.5的比例，与溶解在pH 4醋酸盐缓冲液中的mRNA，在高对冲纳米颗粒制备设备中混合，并随着紧接着的稀释和pH提升而形成mRNA包裹在其中的脂质纳米颗粒(mRNA/LNP)。通过超滤离心浓缩和纯化样品。最终产物检测粒径，PDI，ZP，包封率和有效mRNA浓度。
4.1.缓冲液配制
所有试剂121℃高压灭菌20min，使用DEPC水配制。
1)50mM醋酸盐缓冲液,pH4.0
2)25mM Tris-HCL缓冲液,pH7.5
3)0.6g/mL蔗糖溶液
4.2脂质溶液及mRNA溶液的配置
表1:脂质溶液的配制
1)脂质称重之前，需恢复至室温；
2)所有成分溶解在无水乙醇中，为使溶解完全，利用超声仪。
3)将上述配置好的脂质溶液，按照1:1:1:1的比例混合，即得符合配方的12mg/mL脂质混合溶液。
表2:mRNA溶液的配制
按照上表所示计算方法和缓冲液种类稀释实施例3制备的体外转录及加帽的mRNA原液至所需浓度0.2mg/mL。
4.3制备mRNA/LNP(以总体积4mL为例)
4.3.1迈安纳快速纳米药物制备系统INano LTM。根据需要设置参数。
4.3.2芯片的使用前润洗
准备5mL注射器3支，其中1支吸取无水乙醇，1支吸取醋酸盐缓冲液，1支空气。左侧醋酸盐缓冲液5mL→空气3次；右侧乙醇5mL→乙醇的5mL→空气3次，手推清洗芯片。清洗后将芯片装入卡槽。
4.3.3运行微流控设备制备LNP
用3ml注射器吸取上述配置mRNA溶液3mL，并排除气泡，装入机器左侧注射器卡槽。用1ml注射器吸取上述所配置脂质混合溶液1mL，并排除气泡，装入机器右侧注射器卡槽。于机器废液收集处与样品收集处各插入一只15ml离心管用于废液与样品的收集。参数确认无误后，点击“开始”，迈安纳快速纳米药物制备系统INano LTM将立即运行，即进行LNP的制备。制备结束后，取出样品收集处的离心管。
4.3.4芯片的使用后清洗
LNP制备结束后立即使用左5mL DEPC水，右乙醇5mL→乙醇5mL→空气3x的顺序，将注射器装入芯片进样口，手推清洗芯片，然后自然晾干。
4.3.5收集mRNA/LNP样品的处理
收集的mRNA/LNP悬浮液立即用25mM Tris-Hcl pH7.5缓冲盐稀释至mRNA/LNP体积的约25倍，然后超滤离心，3000rpm，4℃，1h。重复此过程至溶液体积小于等于稀释前体积(3.6mL，即总体积4mL减去废液0.4mL)。接着，过0.22μm滤膜除菌，并添加0.2倍溶液体积的0.6g/mL蔗糖溶液，最终得到mRNA/LNP制剂产品。
4.3.6mRNA/LNP物理性质检测
制备完成的mRNA/LNP应尽快进行物理性质检测以确定产品的质量，便于下一步的生物活性研究。检测使用马尔文Zetasizer，可获得粒径，PDI，ZP数据。
包封率分析：
分别使用1X TE Bμffer和2％ Triton TE Bμffer将mRNA对照品(100μg/ml)从2000ng/mL稀释7个标准曲线点(2000，1600，1200,800，400，200ng/mL)。测量总RNA含量时，使用2％ Triton TE Buffer将供试品LNP稀释50倍，测量游离RNA含量时，使用1X TEBuffer将供试品稀释20倍。各转移100μL上述标准曲线溶液和供试品溶液于黑色酶标板中，再分别加入100μL 0.005×Ribogreen(200倍稀释液)后，室温避光反应2-5min，以酶标板读取荧光响应值(激发波长480nm,发射波长520nm),按照以下公式计算包封率：
包封率EE(％)＝(C总RNA-C游离RNA)/C总RNA*100％.
根据以上方法得到的供试品包封率为：91.56％。
实施例5 RSV F mRNA/LNP纳米颗粒转染至293T细胞的表达
为确定在脂质纳米颗粒中的mRNA能够表达出正确的蛋白，首先第一步是将特定的mRNA/LNP转染至合适的细胞，然后可以用Elisa，Western Blot，流式细胞仪等方法去检测蛋白表达的正确性。
5.1细胞转染
在转染的前一天，将293T(CRL-3216，ATCC)细胞以2x10^5/孔铺在24孔板内，完全培养基是DMEM加上10％胎牛血清及双抗，培养条件是37℃，5％ CO2。第二天，吸去每孔的细胞培养液，并用PBS轻轻冲洗；加入每孔500μl完整培养基后，再向细胞中加入0.5至3μgRNA/孔不等的梯度RSV F mRNA/LNP纳米颗粒。轻轻晃匀分散纳米颗粒后，置于37℃，5％ CO2培养48-72小时。
5.2Western Blot(WB)法检测抗原蛋白的表达
通过WB方法，可以定性地检测mRNA/LNP在进入细胞后翻译成正确的抗原目的蛋白。由于设计的抗原蛋白带有信号肽，故在此测定胞外蛋白。
5.2.1电泳样品准备
收集48-72小时转染后的细胞上清液，2500rpm，5min，4℃离心，取上清于新的1.5mL管中。若表达量过低，可选择合适规格的Millipore超滤管先做适度浓缩。随后进行蛋白含量测定，并将每个样品调到相同的加样量，加入6×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。上样前将样品92℃加热5min使蛋白变性。
5.2.2SDS－PAGE电泳
电泳采用10％分离胶，4％浓缩胶，样品加热后立即上样。电泳时，浓缩胶段电压110V，分离胶段电压150V。
5.2.3转膜
根据分子量的大小，选用nitrocellulose膜或PVDF膜。一般用80V转移1h，或60V转移2h，冰袋控热。转完后用1×丽春红染液染5min检测转膜效果。
5.2.4封闭与免疫反应
首先将膜用5％no fat milk 4℃摇床封闭过夜。第二天，PBST溶液洗3遍后，加适量稀释的一抗(鼠抗RSV-F)杂交，室温摇床90min。然后用PBST溶液摇床洗3遍，每次5～10分钟。二抗为抗鼠-HRP，室温摇床60min。随后也用PBST溶液摇床洗3遍，每次5～10分钟
5.2.5显影与曝光
按照ECL试剂盒说明书，将试液A和试液B按1：1混合放入膜中，在暗室中适当摇匀反应，然后在化学发光图像分析仪曝光检测。根据marker条带来确定目标蛋白大小的正确性。
结果如图5显示，JY-B-009-V02-2转染293T细胞后，mRNA/LNP得以内吞入细胞，在溶酶体酸性环境下释放到细胞质，在内质网和高尔基体中完成蛋白翻译和修饰，并且在信号肽的引导下释放到胞外。编码的RSV-F抗原蛋白可以和F抗体结合，蛋白特异性，蛋白分子量也符合设计要求。
实施例6 JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗免疫小鼠及病毒特异性抗体的表达鉴定
为检测疫苗在in vivo环境下抗原的表达和表现情况，我们采用小鼠作为动物模型来检测。
6.1动物免疫
Balb/c小鼠，雌性，6周龄，到达动物房后，会在那里适应一周。疫苗是实例4制备的JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗。肌注，给药量为10μg/mouse，分二次间隔为14天注射。分别在一免前一天和二免后的7天取血，血清用作后续抗体Elisa检测。
6.2Elisa检测抗RSV抗体
疫苗的关键指标之一是在动物体内诱导出特异性的抗病毒抗体。我们用Elisa法来检测抗RSV-F抗体表达量。
6.2.1抗原的包被
将抗原(RSV-A2，F)用PBS稀释至62.5ng/mL，在96孔酶标板板中进行抗原的包被，每孔100μl，4℃，16h。
6.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板，用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5％milk)，室温，30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
6.2.3样品稀释及加样
将免疫小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后，取100μl加入到酶标板中，三复孔，室温孵育1.5h后，用300μL/孔PBST洗板3次。
6.2.4加检测抗体
根据需要加样的孔的数量，取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L)，稀释至0.8ng/mL后，每孔加入80μL，室温孵育1h后，用300μL/孔PBST洗板5次。
6.2.5显色及终止
按照1：1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB)，每孔加入100μL，室温放置15-30分钟后，每孔加入30μL 1MHCL终止液，然后用酶标仪于450nm读数。
6.2.6标准曲线
若需要绝对定量，将购买的抗RSV-F抗体，根据抗体蛋白量配成合适的由低到高浓度范围，与样品同时做Elisa，结果以抗体蛋白量作为横坐标，OD450作为纵坐标做图。
从图6的结果可以看出，JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗可以在小鼠体内诱导出较强的抗体反应，中位血清稀释值在32K以上。
实施例7 JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗的剂量探索
作为疫苗，剂量是一个关键考察因素。我们首先研究了JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗的剂量效应和IgG抗体产生的时间框架。
7.1动物免疫
Balb/c小鼠，雌性，6周龄，到达动物房后，会在那里适应一周。疫苗是mRNA/LNP剂型，分别单剂肌注给药15，30，45，60，75，90，120，200μg/只。
7.2Elisa检测抗RSV抗体
7.2.1抗原的包被
将抗原(RSV-A2，F)用PBS稀释至62.5ng/mL，在96孔酶标板板中进行抗原的包被，每孔100μl，4℃，16h。
7.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板，用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5％milk)，室温，30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
7.2.3样品稀释及加样
将免疫小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后，取100μl加入到酶标板中，三复孔，室温孵育1.5h后，用300μL/孔PBST洗板3次。
7.2.4加检测抗体
根据需要加样的孔的数量，取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L)，稀释至0.8ng/mL后，每孔加入80μL，室温孵育1h后，用300μL/孔PBST洗板5次。
7.2.5显色及终止
按照1：1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB)，每孔加入100μL，室温放置15-30分钟后，每孔加入30μL 1M HCL终止液，然后用酶标仪于450nm读数。
7.2.6.标准曲线
为了抗体绝对定量，购买抗RSV-F抗体，根据抗体蛋白量配成合适的由低到高浓度范围，与样品同时做Elisa，结果以抗体蛋白量作为横坐标，OD450作为纵坐标做图。血清中抗RSV F抗体的绝对量则根据标准曲线回算。
剂量探索结果如图7显示，JY-B-009-V02-2的mRNA/LNP疫苗可以在动物体内诱导出高滴度的病毒特异性抗体，剂量15至200μg间无大的显著差异，抗体浓度在免疫后的28-35天趋于稳定，但仍然表现出小幅度的提升，尤其在高剂量组，这可能与RSV F蛋白抗原点突变修饰后的稳定性有关。这一结果，为后续实验设计和疫苗开发奠定了基础。
实施例8检测JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗的长期保护效果
疫苗的保护时效是考察疫苗的重要指标，一个有效的能够在感染季节起到保护作用的疫苗，其有效期应该在至少四个月以上。为此，我们考察了JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗的保护时效。
8.1动物免疫
Balb/c小鼠，雌性，6周龄，到达动物房后，会在那里适应一周。疫苗是mRNA/LNP剂型，肌注给药15μg/只，一次免疫二次加强，三剂同量，间隔14天。血样分别是免疫前，最后一次注射后的7天，21天，6个月，12个月。
8.2 Elisa检测抗RSV抗体
8.2.1抗原的包被
将抗原(RSV-A2，F)用PBS稀释至62.5ng/mL，在96孔酶标板板中进行抗原的包被，每孔100μl，4℃，16h。
8.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板，用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5％milk)，室温，30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
8.2.3样品稀释及加样
将免疫小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后，取100μl加入到酶标板中，三复孔，室温孵育1.5h后，用300μL/孔PBST洗板3次。
8.2.4加检测抗体
根据需要加样的孔的数量，取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L)，稀释至0.8ng/mL后，每孔加入80μL，室温孵育1h后，用300μL/孔PBST洗板5次。
8.2.5显色及终止
按照1：1的比例混匀显色液A(含有H2O2)以及显色液B(含有TMB)，每孔加入100μL，室温放置15-30分钟后，每孔加入30μL 1M HCL终止液，然后用酶标仪于450nm读数。
结果如图8所示，在疫苗加强针后的第7天，病毒特异性抗体就达到了非常高的滴度；21天的抗体滴度保持在同一水平，中位血清稀释度均在32k以上。到六个月时，表现出下降，但幅度非常有限。一年时，则下降明显，但仍然有中位血清稀释度6-7K左右的滴度。数据表明JY-B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗对病毒是有长期保护能力的。
实施例9抗体对病毒的中和能力检测
疫苗的黄金检测指标之一，是检测其在动物体内诱导出的特异性抗病毒抗体是否具有中和病毒，阻止病毒感染的能力。中和病毒检测就是为这个目的设计划的。由于RSV属于生物安全二级病毒，下面所有步骤必须在生物安全二级实验室按照相应的要求和规范完成。
9.1准备细胞
HEp-2(ATCC,CCL-23)人喉部表皮样癌细胞，是最合适的RSV生长细胞。在中和实验的前一天，将细胞消化并重悬清洗后，接种于24孔板，2x10^5/孔，MEM 10％FBS完全培养基，37℃5％ CO2培养过夜。
9.2抗体与病毒中和
9.2.1血清梯度稀释
本实验室常用的血清稀释梯度和稀释方法如下表6所示，就RSV而言，血清稀释用培养基为Opti-MEM，不加胎牛血清。
表3，血清稀释度和稀释方法
9.2.2血清抗体和病毒中和
RSV病毒的用量以30-40PFμ/孔(24孔板)为好，稀释培养基为Opti-MEM，不加胎牛血清。取120μl病毒稀释液加到稀释的血清孔里，轻轻混匀。需要设置病毒对照组(即未添加稀释血清的病毒液)。置37℃培养箱孵育1h。
9.2.3接种细胞
取上述病毒抗体混合液70μl分别加到细胞已长成单层的24孔细胞培养板中，每一种稀释度接种3孔细胞。同时设4孔正常细胞对照和设4孔病毒对照组。培养板置于37℃，5％CO2培养箱中孵育1h，每隔15min轻轻摇晃一次。孵育结束后弃掉孔中混合液，加入预先配好温热的培养基500μl/孔，培养基为MEM，3％FBS，0.75％methylcellulose。37℃，5％ CO2培养4天。
9.3结果显色
9.3.1病毒和细胞固定
在培养的第四天，弃掉孔中培养液，再用PBS洗一遍，然后加入预冷的85％甲醇150μl/孔，4℃固定1小时。之后弃掉孔中溶液，再用PBS洗一遍。
9.3.2封闭和洗板
加入300μL封闭液(5％milk)，室温，摇床轻轻晃动，30min。接着用500μL/孔PBST洗板3次。
9.3.3加检测抗体
根据需要加样孔的数量，取相匹配的检测抗体(Anti-RSV-F IgG,H+L,HRPConjugated)，合适倍数稀释后，每孔加入150μL，室温孵育90min后，用500μL/孔PBST洗板3次。
9.3.4加二抗
取相匹配的二抗，1：1000至1：5000合适倍数稀释后，每孔加入150μL，室温孵育60min后，用500μL/孔PBST洗板5次。
9.3.5显色及终止
在每孔加入150μL的TrueBlueTMPeroxidase Substrate，轻轻摇晃，病毒阳性斑块会很快出现。随后用水洗去反应液。避光干燥。第二天即可计数病毒斑块。
可以看出，就RSV A2病毒而言(图9A)，无论是RSV B型的B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗单独免疫，还是和A型疫苗(#7)联用，疫苗诱导的抗体对病毒的中和能力相当，EC50为10K血清稀释度。当中和RSV B 18537病毒时(图9B)，EC50类似或略高，以RSV B型的B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗为好。结果表现出JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗良好的交叉保护效果。
实施例10模拟真实世界，对已经感染过RSV病毒的动物进行免疫加强
RSV病毒呼吸道感染是一个非常常见的呼吸道感染疾病，除新生婴儿周岁以内首次感染外,几乎所有人都面临着环境带来的病毒的反复感染。对于具有完善免疫系统的大部分人来说，再次感染并不是一个非常严重的问题，但对于免疫系统尚在发育中的低龄儿童，免疫系统衰退的老年人，以及免疫系统有缺陷的患者来说，RSV感染常常是一个严重的威胁。本实验设计是想了解疫苗对于曾经RSV感染过的动物是否有保护作用，以及保护作用的程度。
10.1动物免疫
10.1.1动物
所使用的动物为Balb/c小鼠，雌性，6周龄。动物到达CRO生物安全二级动物房后，会在那里适应一周。
10.1.2免疫和取样
免疫和取样的时间点如图10A所示。
第一天，眼眶取免疫前血样。每次取血后，样品在4℃放置2个小时，然后2500rpm，5min，4℃离心，取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。
第二天，第一组肌肉注射10μg/只JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗；第二组和第三组鼻腔感染105PFU/只RSV A2；第四组为PBS对照。
一免后的第十四天，第一组小鼠进行第二次免疫，种类，剂量和免疫途径与第一次相同。
二免后的第十五天，所有动物眼眶取血，这是第一次免疫或感染后的血。取血后的第二天，也就是小鼠感染RSV病毒后的第30天，第二组小鼠肌注10μg/只JY-B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗作为加强针。
十四天后，所有动物眼眶取血，这是第二次免疫或感染后的血。
取血后的第二天，所有小鼠以RSV A2,105PFU/只鼻腔攻毒。
感染后的第四天，试验终结。动物吸入麻醉安乐死后，按照SOP解剖流程，取完整肺脏并称重。
10.2Elisa检测抗RSV抗体
第一次和第二次免疫或感染后的血清分别用Elisa来检测其特异抗体含量。
10.2.1抗原的包被
将包被抗原(RSV-A2，F)用PBS稀释至62.5ng/mL，在96孔酶标板板中进行抗原的包被，每孔100μl，4℃，16h。
10.2.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板，用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5％milk)，室温，30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
10.2.3样品稀释及加样
将小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后，取100μl加入到酶标板中，室温孵育1.5h后，用300μL/孔PBST洗板3次。
10.2.4加检测抗体
根据需要加样孔的数量，取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L)，稀释至0.8ng/mL后，每孔加入60μL，室温孵育1h后，用300μL/孔PBST洗板5次。
10.2.5显色及终止
按照1：1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB)，每孔加入100μL，室温放置15-30分钟后，每孔加入30μL 1M HCL终止液，然后用酶标仪于450nm读数。
10.2.6标准曲线
若需要绝对定量，将购买的抗RSV-F抗体，根据抗体蛋白量配成合适的由地到高浓度范围，与样品同时做Elisa，结果以抗体蛋白量作为横坐标，OD450作为纵坐标做图。
结果见图10，小鼠给予二剂免疫所诱导的抗体量和经历一次病毒感染后的抗体量相当(图10B)。然而，病毒感染后再给予加强疫苗，则极大地提高了抗体含量(图10C)，预示着具有非常好的病毒保护效果。也就是说，在人群中给予加强免疫，可以极大的控制RSV病毒感染。
实施例11 JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗抑制RSV病毒对棉鼠肺部的感染
疫苗的终极检测指标，是检测疫苗在体内诱导出的特异免疫反应是否具有保护宿主减少病毒感染的效率。
11.1动物模型和免疫
11.1.1动物模型
RSV相对理想的动物模型是棉鼠，因为RSV病毒感染棉鼠后，可以在其肺部发生病毒的复制增殖，并且免疫反应和肺的结构也更接近人类。本实施例采用的动物模型正是棉鼠。
11.1.2免疫和取样
8周龄雌性棉鼠，在生物安全动物房进行如图11A，11B所示实验。每次操作，棉鼠都经异氟烷麻醉后进行。
第一天，眼眶取免疫前血样，样品在4℃放置2个小时，然后2500rpm，5min，4℃离心，取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。
第二天，第三组动物鼻腔感染RSV A2，10^5/rat。二周后，第一组JY-B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗免疫，肌肉注射，60μg/rat；第二组JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗和RSVA2-#7B疫苗各30μg/rat，肌肉注射。第四组为对照组，注射PBS。
又过了三周，眼眶取血。取血后的第二天，第一，二组各自给与和第一次免疫一样的疫苗。而先前RSV感染的第三组，则给以JY-B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗肌注60μg/rat的加强针，以此模仿现实世界普遍先感染，后加强的情况。
二周后，又一轮抽血。取血后的第二天，以RSV B18537,5x10^5/rat鼻腔攻毒。
攻毒后的第四天，试验终结。动物吸入麻醉安乐死后，按照SOP解剖流程，取棉鼠完整肺脏并称重。
11.2肺脏病毒载量检测
11.2.1准备肺匀浆
准备冻存管，加入2mL 4℃预冷的病毒保护液；将新鲜的肺组织放于装有病毒保护液的冻存管内，同一天匀浆，避免冻融影响实验结果。使用高通量组织研磨器在保持低温状态下匀浆肺组织至无明显颗粒，吸取组织液至1.5mL EP管中，分管冻存-80℃。
11.2.2准备细胞板
病毒滴度测定的细胞是Hep-2喉上皮癌细胞。在病毒滴定的前一天，将细胞消化并重悬清洗后，接种于24孔板，2x10^5/孔，MEM 10％FBS完全培养基，37℃5％ CO2培养过夜。
11.2.3病毒感染
将肺匀浆按照1:10,1:102,1:103,1:104,1:105,1:106稀释，稀释培养基为Opti-MEM，不加胎牛血清。然后将前一天铺好的24孔板轻轻地用PBS洗一遍后，每孔加入100μl稀释的病毒液，每个浓度3复孔。同时设4孔正常细胞对照和设4孔病毒对照组。培养板置于37℃，5％ CO2培养箱中孵育1h，每隔15min轻轻摇晃一次。孵育结束后弃掉孔中混合液，加入预先配好温热的培养基500μl/孔，培养基为MEM，3％FBS，0.75％methylcellulose。37℃，5％ CO2培养4天。
11.2.4病毒和细胞固定
在培养的第四天，弃掉孔中培养液，再用PBS洗一遍，然后加入预冷的85％甲醇100μl/孔，4℃固定1小时。之后弃掉孔中溶液，再用PBS洗一遍。
11.2.5封闭和洗板
加入300μL封闭液(5％milk)，室温，摇床轻轻晃动，30min。接着用500μL/孔PBST洗板3次。
11.2.6加检测抗体
根据需要加样孔的数量，取相匹配的检测抗体(Anti-RSV-F IgG,H+L,HRPConjugated)，合适倍数稀释后，每孔加入150μL，室温孵育90min后，用500μL/孔PBST洗板3次。
11.2.7加二抗
取相匹配的二抗，1：1000至1：5000合适倍数稀释后，每孔加入150μL，室温孵育60min后，用500μL/孔PBST洗板5次。
11.2.8显色及终止
在每孔加入150μL的TrueBlueTMPeroxidase Substrate，轻轻摇晃，病毒阳性斑块会很快出现。随后用水洗去反应液。避光干燥。第二天即可计数病毒斑块。
结果如图11显示，JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗能够有效地控制RSV病毒在肺部的扩增。给予60μg/只的免疫剂量，30+30μg/只的二价苗，以及感染后加强针这三种情况，虽然诱导的抗体滴度有差异，但在肺病毒量上却没有看出差别，这是否与病毒检测方法有关尚待进一步研究。因为PCR法以病毒核酸为基础，无法区分有感染力的活病毒和已经被中和没有感染力的病毒；而免疫菌斑法检测到的只是有感染力的活病毒。
实施例12 JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗与Pfizer疫苗的免疫效果比较
ABRYSVO(Pfizer)是一种蛋白二价疫苗，旨在提供针对所有RSV病毒亚组的广泛保护，不仅针对普通人群，也已推广到老年人和婴儿。以ABRYSVO这一世界领头疫苗为对照，我们进行了JY-B-009-V02-2mRNA/LNP疫苗与Pfizer的疫苗的免疫效果对比。
12.1动物免疫
12.1.1动物
所使用的动物为Balb/c小鼠，雌性，6周龄。动物到达CRO生物安全二级动物房后，会在那里适应一周。
12.1.2免疫和取样
免疫和取样的时间点如图12A所示。
12.2免疫和取样
所使用的动物为Balb/c小鼠，雌性，6周龄。动物到达CRO生物安全二级动物房后，会在那里适应一周。
第一天，眼眶取免疫前血样，样品在4℃放置2个小时，然后2500rpm，5min，4℃离心，取上清并分装。血清储存于-80℃低温冰箱。
第二天，第三组动物鼻腔感染RSV A2,5.5x10^4/mouse
二周后，第一组JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗免疫，肌肉注射，20μg/mouse；第二组JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗和RSV A2-#7B疫苗各10μg/mouse，肌肉注射；第四组肌肉注射10μg/mouse ABRYSVO；第五组肌肉注射20μg/mouse ABRYSVO；第六组为对照组，注射PBS。
又过了二周，眼眶取血。这是一免后的血样。
取血后的第二天，第一，二，四，五组各自给予和第一次免疫一样的疫苗。而先前RSV感染的第三组，则给以JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗肌注20μg/rat的加强针，以此模仿现实世界普遍先感染，后加强的情况。
二周后，又一轮抽血。这是一免后的血样。
取血后的第二天，以RSV B-18537,6.8x10^4/mouse鼻腔攻毒。
攻毒后的第四天，试验终结。动物吸入麻醉安乐死后，按照SOP解剖流程，取完整肺脏并称重。
12.3 Elisa检测抗RSV抗体
第一次和第二次免疫或感染后的血清分别用Elisa来检测其特异抗体含量。
12.3.1抗原的包被
将包被抗原RSV-A2，F用PBS稀释至62.5ng/mL，在96孔酶标板板中进行抗原的包被，每孔100μl，4℃，16h。
12.3.2洗板和封闭
取出已包被抗原的酶标板，用300μL/孔PBST洗板1次。随后加入100μL封闭液(5％milk)，室温，30min。接着用300μL/孔PBST洗板3次。
12.3.3样品稀释及加样
将小鼠的血清样品进行合适的递减4倍的梯度稀释后，取100μl加入到酶标板中，室温孵育1.5h后，用300μL/孔PBST洗板3次。
12.3.4加检测抗体
根据需要加样孔的数量，取相匹配的适量检测抗体(Goat Anti-Mouse IgG,Peroxidase-Conjugated,H+L)，稀释至0.8ng/mL后，每孔加入60μL，室温孵育1h后，用300μL/孔PBST洗板5次。
12.3.5显色及终止
按照1：1的比例混匀显色液A(含有H202)以及显色液B(含有TMB)，每孔加入100μL，室温放置15-30分钟后，每孔加入30μL 1M HCL终止液，然后用酶标仪于450nm读数。
12.3.6.标准曲线
若需要绝对定量，将购买的抗RSV-F抗体，根据抗体蛋白量配成合适的由地到高浓度范围，与样品同时做Elisa，结果以抗体蛋白量作为横坐标，OD450作为纵坐标做图。
结果如图12B所示，JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗，无论是单独使用，还是以总量相同的二价苗形式，所诱导的F蛋白特异性抗体都是相当，高于10或20μg/mouse的蛋白苗ABRYSVO，并且表现出良好的交叉保护的特性，因为Elisa的包被蛋白是RSV-A2F蛋白。很有意义的是，对于先前RSV A2感染过的小鼠，在感染的五星期后给予JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗作为加强针，抗体滴度有了极大的飙升，很可能预示着对于一般先前已经感染了RSV病毒普通人群，JY-B-009-V02-2 mRNA/LNP疫苗作为加强针，会有非常好的保护效果。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.表达载体，其特征在于，所述表达载体的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1所述的表达载体。
3.疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括权利要求1所述的表达载体。
4.权利要求1所述的表达载体在制备人合胞病毒疫苗组合物中的应用。
5.权利要求1所述的表达载体在制备预防合胞病毒感染导致的疾病的疫苗药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述疾病为呼吸道疾病，所述呼吸道疾病为肺炎或细支气管炎。
7.权利要求1所述的表达载体在制备治疗患有合胞病毒感染导致的疾病的患者的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疾病为呼吸道疾病，所述呼吸道疾病为肺炎或细支气管炎。
9.根据权利要求7-8任一所述的用途，其特征在于，所述患者先前已经感染过合胞病毒。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述感染次数为一次或多次。
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