CN115960262A

CN115960262A - 展示cdv抗原表位的犬细小病毒样颗粒及构建方法和应用

Info

Publication number: CN115960262A
Application number: CN202211281421.7A
Authority: CN
Inventors: 颜其贵; 李强; 杨智捷; 孙珊珊; 余佩伦; 彭茜翎; 史纪强; 胡洹圆
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明公开了一种展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒及构建方法和应用。本发明提供了展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒为嵌合型病毒样颗粒，由来源于犬细小病毒的VP2蛋白与来源于犬瘟热病毒的N蛋白的CTL‑B表位和F蛋白的Th‑T‑B表位组成。包括VP2‑N‑VLPs和VP2‑L‑VLPs两种类型。本发明的病毒样颗粒为直径约25nm的圆形粒子，形态结构与CPV天然病毒粒子相似，具有良好的反应原性与免疫原性，能够与抗犬瘟热病毒单克隆抗体与抗犬细小病毒单克隆抗体反应，能较好的诱导机体产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答，可用于制备预防犬瘟热病毒与犬细小病毒引起的疾病的疫苗。

Description

展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒及构建方法和应用。

背景技术

CPV是引起犬细小病（Canine parvovirus infection，CP）的病原微生物，受感染的动物通常会出现出血性肠炎或非化脓性心肌炎。起初，CPV的天然宿主仅为犬及其他犬科动物如狐、郊狼、鬣狗等。但随着病毒抗原漂移，使得小熊猫、貉、大熊猫等野生动物也对其易感，高易感率和致死率使其成为威胁家犬及野生动物的烈性传染病病原。

1987年，邬捷通过对成都、重庆两地动物院圈养大熊猫的血清学调查，首次发现了大熊猫感染CPV并导致出血性肠炎的情况。2012年，梁萌从来自成都大熊猫基的大熊猫肠组织病料中分离出了一株CPV病毒，遗传进化分析结果表明，此株病毒有CPV和FPV重组的特征。郭玲等通过PCR方法检测大熊猫基地采集的52份健康大熊猫粪便，通过对8份CPV阳性样本进行遗传进化分析得出，所检测的大熊猫源犬细小病毒属于New CPV-2a型。陈珍容等使用实时荧光环介导等温扩增(LAMP)的方式，对成都和都江堰两地的84份大熊猫粪便进行检测，有16份呈CPV阳性，阳性率为19.0%。表明大熊猫受CPV的感染，需要加强CPV防控。目前使用的商品化CPV疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，灭活苗安全性较好，但免疫后很难产生和维持高水平的抗体。目前，对于CPV的预防免疫，主要采用的是犬用五联、六联苗。虽然大熊猫在接收免疫后能产生并维持较高的HI抗体滴度，但有研究发现，在注射犬源CPV弱毒苗后，会导致部分小熊猫出现CPV感染的临床症状，这提示了大熊猫使用犬源CPV弱毒疫苗可能存在着一定的安全风险，对于此类珍稀动物在疫苗选择方面还需多加考虑。

CDV是引起犬瘟热（Canine distemper，CD）的病原微生物，主要通过口鼻感染，受感染动物的主要表现为非化脓性脑膜脑脊髓炎，上呼吸道、肺和胃肠道的卡他性炎症，在受感染细胞的胞浆或核内能观察到有包涵体形成。CDV传染性强，不但可以感染犬科动物，还能感染鼬科、浣熊科和猫科等多种动物，其感染后的高死亡率对于犬类和野生动物造成了巨大的危害。CDV感染大熊猫的病例在1983年被首次报道。随后，有研究者在大熊猫血清中检测出了CDV中和抗体，证明CDV已经在大熊猫群体中传播。

对于CDV防治的最佳方案是接种疫苗，CDV疫苗主要有重组疫苗、弱毒疫苗和灭活疫苗。其中，灭活疫苗效果最差，有研究者使用CDV灭活苗免疫两只大熊猫后，诱导机体产生的中和抗体效价小于1：5；对于重组疫苗，冯娜评价了犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热活载体疫苗免疫大熊猫，60只大熊猫免疫后虽然均产生了中和抗体，但个体之间抗体水平波动较大，存在个体差异；目前大熊猫CDV免疫采用的主要是犬用弱毒联苗，但有研究者对犬瘟热弱毒苗接种大熊猫后的免疫效果进行评价，认为在现有的免疫程序下，很难产生充足的CDV中和抗体，并且也有大熊猫在注射犬源CDV弱毒活疫苗2周后，发生感染而死亡的报道。CDV在大熊猫种群中的流行趋势不断上升，并且无大熊猫的专用疫苗，而传统的犬源疫苗的免疫效果也不太理想，并且存在着安全隐患，因此研发一种安全高效的大熊猫CDV专用疫苗具有重大意义。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒及构建方法和应用。

本发明的技术方案如下：

展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，所述颗粒为嵌合型病毒样颗粒，由来源于犬细小病毒的VP2蛋白与来源于犬瘟热病毒的N蛋白的CTL-B表位和F蛋白的Th-T-B表位组成。

优选地，所述颗粒包括VP2-N-VLPs和/或VP2-L-VLPs；

所述VP2-N-VLPs由VP2-N蛋白组装而成，所述VP2-N蛋白由所述VP2蛋白在N端依次插入N蛋白的CTL-B表位和F蛋白的Th-T-B表位构成；

所述VP2-L-VLPs由VP2-L蛋白组装而成，所述VP2-L蛋白由所述VP2蛋白在N端插入F蛋白的Th-T-B表位和在VP2蛋白的Loop2区域缺失218-233氨基酸后插入N蛋白的CTL-B表位构成。

优选地，所述N蛋白的CTL-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.2和SEQID NO.3；

所述F蛋白的Th-T-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

其中，各所述表位序列之间经柔性肽GGGGS和/或GG连接。

优选地，所述VP2-N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述VP2-L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，编码所述VP2-N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

和/或，编码所述VP2-L蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，编码所述VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

如以上任一项所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，包括如下步骤：

S1、获取VP2基因片段，将所述VP2的基因片段与表达载体pColdTF连接，获得pColdTF-VP2重组质粒；

S2、将所述pColdTF-VP2重组质粒转化到BL21（DE3）表达菌中，诱导表达，获得VP2蛋白；

S3、将所述VP2蛋白与N蛋白的CTL-B表位和F蛋白的Th-T-B表位重组，获得VP2-N或VP2-L蛋白；根据所述VP2-N或VP2-L蛋白的氨基酸序列信息，分析、合成VP2-N或VP2-L的基因片段；

S4、将所述VP2-N或VP2-L的基因片段连接到表达载体pColdTF上，获得pColdTF-VP2-N或pColdTF-VP2-L重组质粒；

S5、将所述pColdTF-VP2-N或pColdTF-VP2-L重组质粒转化到BL21（DE3）表达菌中，诱导表达，获得VP2-N或VP2-L蛋白；

S6、将所述VP2-N或VP2-L蛋白置于透析缓冲体系中进行重组，获得展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒。

优选地，在步骤S2和S5中，所述BL21（DE3）表达菌诱导表达后，通过Ni-NTA亲和层析分离纯化，分别获得携带TF标签的VP2、VP2-N或VP2-L蛋白，然后经Thrombin凝血酶切除TF标签，再经Ni-NTA亲和层析分离纯化获得VP2、VP2-N或VP2-L蛋白。

优选地，所述透析缓冲体系包括14kD的透析袋和足量装入所述透析袋内的透析缓冲液；所述透析缓冲液包括50mM NaH2PO4、250mM NaCl、0.5%Triton X-100和2mM DTT，pH调至8.0。

如以上任一项所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒在治疗和预防犬瘟热病毒与犬细小病毒引起的疾病的药物中的应用。

理论依据：

CPV的基因编码非结构蛋白（NS1、NS2）和结构蛋白(VP1、VP2)。其中，结构蛋白VP1与VP2蛋白共同构成CPV的病毒衣壳，结构蛋白VP1约占组成部分的10%，VP1的N末端是介导病毒感染的必须区域，但不是组装病毒衣壳的必须区；结构蛋白VP2上含有CPV病毒的主要抗原表位以及病毒与宿主受体的结合位点，单独表达的VP2在一定条件下可以在体外自组装形成形态结构与天然CPV病毒相似的VLPs，并且VP2的N端和Loop2区域属于其“VLPs组装非必须区”，即可在此区域内插入或替换一定长度的氨基酸序列而不影响VLPs的形成。

CDV的基因，3’端有前导肽序列，5’端有引导序列，依次编码核衣壳蛋白（proteinN）、磷蛋白（protein P）、基质膜蛋白（protein M）、融合蛋白（protein F）、附着或血凝蛋白（protein H）和大蛋白（protein L）在内的6种蛋白。其中，N蛋白是CDV的核衣壳蛋白，其上具有多个抗原表位，在病毒感染过程中能刺激机体产生中和抗体；F蛋白是组成CDV病毒囊膜的一种糖蛋白，这种蛋白均可诱导中和抗体的产生，在抗CDV感染中发挥重要的作用，此外F蛋白还具有与宿主细胞膜受体识别、结合和膜融合的功能，在病毒吸附和入侵细胞的过程中起决定作用。

注释：病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLPs），是由病毒的一个或多个结构蛋白组装形成的中空的蛋白粒子，其形态与结构与天然病毒粒子相似，内部不含遗传物质，在保留了天然病毒的生物学活性及免疫原性的同时又有具有较好的安全性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，是在犬细小病毒的结构蛋白VP2上嵌合CDV的抗原表位，形成的与天然病毒相似的病毒样颗粒；其中，VP2蛋白包含CPV的主要抗原表位和与宿主受体的结合位点；N蛋白是CDV的衣壳蛋白，其上具有多个抗原表位，在病毒感染过程中能刺激机体产生中和抗体；F蛋白是融合蛋白，组成CDV病毒囊膜的糖蛋白，可诱导产生中和抗体。该展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒既具有犬细小病毒的免疫原性，又具有犬瘟热病毒的免疫原性，且反应原性良好，能有效诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。

2、本申请中F蛋白Th-T-B表位的氨基酸序列设计为原F蛋白中402-416aa、518-528aa和241-257aa三个表位序列的串联组合，使得其免疫机体后可同时产生体液免疫和细胞免疫应答，抗体产生迅速，可以维持在较高水平，且其中，241-257aa序列的选择对另外两个序列的免疫应答具有协同促进作用；N蛋白CTL-B表位的氨基酸序列设计为原N蛋白中352-362aa和283-291aa两个表位序列的串联组合，能促进细胞免疫应答，且具有与全长N蛋白相似的免疫效果。

3、该展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，在蛋白层面上，将CDV的抗原表位修饰结合到VP2蛋白上获得重组蛋白，再根据重组蛋白的氨基酸序列信息分析获得重组蛋白的核苷酸序列信息，合成重组蛋白的基因片段，利用该基因片段实现重组蛋白（VP2-N、VP2-L）的直接表达，该方法利于规模化生产应用，安全性高，成本较低。

4、该展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，从大熊猫源的CPV病毒中扩增获取VP2的基因片段，使得最终构建的病毒样颗粒（VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs）为大熊猫源展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，可在预防大熊猫犬瘟热病毒及犬细小病毒引起疾病的疫苗中进行应用，对大熊猫种群安全性更高。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中VP2基因的PCR扩增电泳图，M：DL2000 DNA分子质量标准；1~5：VP2基因PCR产物。

图2为本发明实施例2中重组表达质粒pColdTF-VP2的酶切鉴定，M1：DL2000 DNA分子质量标准；M2:DL10000 DNA分子质量标准；1-3：pColdTF-VP2。

图3为本发明实施例3中重组蛋白TF-VP2的纯化，M：蛋白分子量Marker；1：pColdTF-VP2表达产物上清；2~4：Washing Buffer洗脱；5：Elution Buffer洗脱。

图4为本发明实施例4中VP2-N嵌合表位VP2蛋白构建示意图。

图5为本发明实施例4中VP2-L嵌合表位VP2蛋白构建示意图。

图6为本实施例6中病毒样颗粒的透射电镜分析图，A：VP2-VLPs；B：VP2-L-VLPs；C：VP2-N-VLPs。

图7为本发明实施例7中病毒样颗粒的血凝试验结果。

图8为本发明实施例8中重组蛋白的Western blotting分析，A：以CPV作为益康孵育；B：以CDV单抗作为一抗孵育；1：VP2-L；2：VP2-N；3：VP3。

图9为本发明实施例9中血清中CPV特异性抗体水平检测结果。

图10为本发明实施例9中血清中CDV特异性抗体水平检测结果。

图11为本发明实施例9中各免疫组血清中血凝抑制（HI）抗体效价结果。

图12为本发明实施例9中各免疫组（56d）血清中CDV中和抗体效价结果。

图13为本发明实施例9中MTT法检测脾淋巴细胞的增值结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1 VP2基因的扩增与克隆

通过检索NCBI上已登录的CPV病毒的VP2序列，获得序列JX624771，运用Oligo7.0和Primer 5软件，设计带有酶切位点（Xho I、Hind III）的VP2全长引物，VP2的上游引物（VP2 F）：CCGCTCGAGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACG；VP2的下游引物（VP2 R）：CCCAAGCTTTTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAG，该引物由擎科生物有限公司合成。

将适量-80℃保存的大熊猫CPV病毒液，5000rmp离心10min去除细胞碎片，收集上清病毒液。将收集到的上清液利用病毒DNA提取试剂盒按照说明书进行DNA的抽提，抽提完成后的DNA保存至-20℃。以提取的大熊猫源犬细小病毒DNA为模板，利用上述VP2全长引物，通过PCR反应进行目的片段VP2的扩增。其冰上操作混匀反应体系，具体为Mix 25μL，VP2 F1μL，VP2 R 1μL，DNA 2μL，ddH2O 11μL；混合后放入PCR仪，程序设置为98℃ 2min，98℃15s，65℃ 15s，72℃ 130s（至第二步30个循环），72℃ 10min，12℃ Forever进行反应，完成后取PCR产物进行电泳鉴定，电泳图如图1所示。使用PCR产物纯化试剂盒进行产物（VP2基因）的纯化回收，-20℃保存，备用。纯化获得的VP2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

使用试剂盒DNA A-Tailing Kit为获得的VP2基因片段加上A尾，然后将VP2基因片段与克隆载体pMD19T Vector连接，连接体系为pMD19T Vector 1.0μL，VP2 DNA 3.0μL，Solution I 5.0μL，ddH2O 1.0μL，16℃连接过夜。

取连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌落接种LB液体培养基进行扩大培养，菌液使用OMEGA质粒小提试剂盒进行质粒的抽提，获得含有VP2基因片段的质粒，-20℃保存，备用。

实施例2 重组表达载体的构件

将含有VP2基因片段的质粒与表达载体pColdTF一起使用限制性内切酶Xho I和Hind III进行双酶切，反应体系为：目的片段25.0μL，Hind III 1.0μL，Xho I 1.0μL，10×SmartCut Green Buffer 5.0μL，ddH2O 18.0μL，37℃酶切30min后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示。

切下含有VP2基因片段和表达载体的胶条，使用OMEGA胶回收试剂盒按说明书操作回收产物。将酶切后胶回收的表达载体pColdTF与VP2基因片段利用DNA连接酶进行连接，获得pColdTF-VP2重组质粒，连接体系为VP2片段3.0μL，表达载体1.0μL，Solution I 5.0μL，ddH2O 1.0μL，16℃连接过夜。取反应过夜后的连接液，转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单菌进行扩大培养，提取质粒进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒（pColdTF-VP2重组质粒）-20℃保存备用，菌液加入终浓度为15%的甘油保种。

实施例3 VP2的表达及纯化

将构建好的pColdTF-VP2重组质粒转化到BL21（DE3）表达菌中，进行诱导表达。

将转化有pColdTF-VP2重组质粒的表达宿主菌接种于LB液体培养基(含100μg/mLAmp)中，37℃ 200rmp振荡培养复苏16h作为种子液。将种子液按1:50的浓度加入200mL的LB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养至OD600值至0.4-0.6后拿出冰浴降温，15℃放置30min。加入终浓度为0.2mM的IPTG，放入恒温空气摇床中15℃，100rmp诱导表达24h。诱导完成后，4℃下10000rmp离心1min收集菌体，加入20mL PBS缓冲液洗涤重悬菌体，冰浴中超声破碎，4℃下12000rmp离心20min收集上清。

收集超声破碎菌体后的上清液，通过Ni-NTA亲和层析，纯化上清中的重组蛋白。具体地，将上清液用0.45μm的滤膜过滤，转移至用10倍柱体积的Binding Buffer（50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，5mM咪唑，pH调节至8.0）平衡后的Ni柱，轻柔摇动混匀，4℃结合30min后除去下端封闭盖子收集流穿液，然后用5倍柱体积的Washing Buffer（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM咪唑，pH调节至8.0）洗涤2次收集流穿液，最后用5倍柱体积的ElutionBuffer（50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH调节至8.0）快速洗脱柱上残留的蛋白，收集洗脱液，获得纯化的重组蛋白液。

此时纯化的重组蛋白液中，重组蛋白携带有TF标签（即为TF-VP2）。需将将纯化的重组蛋白液超滤去咪唑，加入适量的Thrombin凝血酶，4℃酶切过夜切除TF标签。

由于被切除的TF标签上带有6×His标签，因此再通过Ni-NTA亲和层析的方法，将酶切完成后的蛋白溶液再次通过Ni柱，收集流穿液，得到纯度较高的可溶性VP2蛋白。经SDS-PAGE电泳纯化，电泳结果如图3所示。

实施例4 嵌合CDV抗原表位的PV2重组蛋白的构建

如图4所示，在VP2蛋白的N端依次插入犬瘟热病毒N蛋白（CDV-N蛋白）的CTL-B表位和犬瘟热病毒F蛋白（CDV-F蛋白）的Th-T-B表位，获得重组蛋白VP2-N。

如图5所示，在VP2蛋白的N端插入CDV-F蛋白的Th-T-B表位，在VP2蛋白的Loop2区域缺失218-233氨基酸后插入CDV-N蛋白的CTL-B表位，获得重组蛋白VP2-L。

该CDV-N蛋白的CTL-B表位为原N蛋白中352-362aa和283-291aa两个表位序列的串联组合，即该CDV-N蛋白的CTL-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3；两个表位序列的前后顺序可做调整。CDV-F蛋白的Th-T-B表位为原F蛋白中402-416aa、518-528aa和241-257aa三个表位序列的串联组合，该CDV-F蛋白的Th-T-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；三个表位序列的前后顺序可做调整。

如图4、图5和SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，在CDV-F蛋白的Th-T-B表位和CDV-N蛋白的CTL-B表位中，各表位序列之间经柔性肽GGGGS和/或GG进行连接，使得各表位序列之间相对独立并有利于抗原的呈递。

根据获得的重组蛋白VP2-N和VP2-L，分析获得其氨基酸序列和核苷酸序列信息。其中，重组蛋白VP2-N的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；重组蛋白VP2-L的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

利用生物信息学软件将VP2-N、VP2-L的基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，并在两端添加酶切位点Xho I和Hind III，由擎科生物公司进行合成，获得VP2-N基因片段和VP2-L基因片段；并分别插入pMD19T克隆载体，获得pColdTF-VP2-N和pColdTF-VP2-L重组质粒。将pColdTF-VP2-N和pColdTF-VP2-L重组质粒分别转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并分别将含目的基因重组质粒的DH5α甘油菌5mL接种于含终浓度为100µg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜；离心收集菌体，提取并保存质粒。

实施例5 VP2-N、VP2-L重组蛋白的表达及纯化

参照实施例3中pColdTF-VP2表达的条件，将测序无误的pColdTF-VP2-N和pColdTF-VP2-L重组质粒分别转化至表达宿主菌中，进行诱导表达。然后参照实施例3中的纯化条件，使用Ni-NTA亲和层析的方法对表达的重组蛋白VP2-N和VP2-L进行纯化。纯化后的重组蛋白，超滤浓缩并去除咪唑，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度的测定。

实施例6 病毒样颗粒的组装及形态观察

将纯化后的VP2、VP2-N、VP2-L蛋白样品分别置于14kD的透析袋内，放入足量的透析缓冲液中，透析缓冲液包括50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、0.5%Triton X-100和2mM DTT，pH调至8.0。整个缓冲体系置于磁力搅拌器上轻微搅拌，4℃透析16h，期间换液3次。分别获得组装好的VP2-VLPs、VP2-N-VLPs、VP2-L-VLPs病毒样颗粒。

分别取透析组装后的VP2-VLPs、VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs病毒样颗粒样品20µL滴于铜网上，放置2min后用滤纸吸去多余液体，滴加磷钨酸染液负染2-3min，用滤纸吸取多余液体，通过透射电镜（TEM）观察病毒样颗粒的形态。观察结果如图6所示，表明VP2-VLPs、VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs均形成了直径约为25nm的圆形粒子，形态结构与CPV天然病毒粒子相似。

实施例7 病毒样颗粒的血凝活性检测

将制备的VP2-VLPs、VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs进行血凝试验(HA)检测。具体步骤为：

吹打混匀保存在阿氏液中的醛化猪红细胞，4℃下1000rmp离心10min，用PBS洗涤三次，配制成浓度为1%的红细胞悬液；

取96孔V型血凝板，向每孔中加入25µL的PBS；

向第一孔中加入25µL的待测样品，吹打混匀后吸出25µL加入第二孔中，以此类推作倍比稀释到第十二孔，每个待测样品设置三个重复，并设置一排阴性对照(加PBS)；

吸取1%猪红细胞悬液，从第十二孔倒加至第一孔，悬空加入避免每孔间交叉污染影响检测结果。

轻叩血凝板振荡混匀，将其置于4℃下1h进行结果判定。

将能凝集50%猪红细胞的最高稀释倍数作为血凝价终点。检测结果如图7所示，VP2-VLPs的血凝价终点为256（即2⁸）；VP2-L-VLPs的血凝价终点为128（即2⁷）；VP2-N-VLPs的血凝价终点为64（即2⁶），血凝价终点即为一个血凝单位。

实施例8 病毒样颗粒的Western blotting检测

取纯化透析后的样品VP2-VLPs、VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs进行Western blotting检测，分别使用CDV/CPV单克隆抗体作为一抗，以检验制备的VP2-VLPs、VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs的反应原性。具体步骤为：

处理样品进行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳，电泳完成后切下凝胶，裁剪出大小合适的硝酸纤维素膜（Nitrocellulose filter membrane，NC膜）；

将凝胶、NC膜、滤纸放入转膜缓冲液中浸泡15min；

用半干转印法，按照负极到正极的顺序，在电泳夹板上依次放置三层滤纸、电泳凝胶、NC膜、三层滤纸，用滚筒排出NC膜和胶之间的气泡；

设定转膜电压为25V，恒压转膜30min；

转膜结束后，用Tris-B uffered-Saline and Tween 20（TBST）洗膜3次，每次5min，加入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)在摇床上低速振摇，室温封闭2h；

TBST洗膜3次，每次5min，加入1:5000稀释的一抗，4℃孵育过夜；

TBST洗膜3次，每次5min，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）标记的二抗，在摇床上低速振摇，室温孵育1h；

TBST洗膜5次，每次5min，避光加入Enhanced chemiluminescence（ECL）化学发光显色液进行显色处理，使用凝胶成像仪拍照，结果如图8所示。

如图8中A图所示，表明VP2-L、VP2-N和VP2均与CPV单克隆抗体发生特异性反应，具有CPV的抗原表位；如图8中B图所示，VP2-L和VP2-N与CDV单克隆抗体发生特异性反应，具有CDV的抗原表位，VP2与CDV单克隆抗体未发生特异性反应，不具有CDV的抗原表位。

实施例9 病毒样颗粒免疫原性实验

将50只6-8周龄的BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只。分别为VP2-VLPs组、VP2-L-VLPs组、VP2-N-VLPs组、阳性对照组(使用英特威二联弱毒苗)和阴性对照组，经皮下多点注射免疫。每组免疫剂量为VP2-VLPs 50μg/只，VP2-L-VLPs 50μg/只，VP2-N-VLPs 50μg/只，CPV/CDV二联弱毒苗 1/10头份，PBS 100μL/只。各组于0d初免后，在第14d、28d各加强免疫一次。同时各组于0d、14d、28d、42d、56d后进行采血，血样4℃放置过夜，4℃ 3500g离心15min取上清血清，分装冻存于-70℃。

（1）ELISA检测血清中的特异性抗体

重组蛋白VP2、VP2-L、VP2-N免疫实验动物后，血清中含有抗重组蛋白各表位上的抗体IgG。为确定血清中这些IgG是否能特异性的与CDV、CPV反应。使用ELISA的方法来进行血清中特异性抗体水平的检测，具体步骤为：

将CPV或CDV抗原使用包被缓冲液稀释至适当浓度，按100μL/孔加入96孔板中，盖上封板膜4℃包被过夜。

弃去包被液，每孔中加入250μL的磷酸盐吐温缓冲液（PBST）进行洗涤，重复三次，在吸水纸上拍干；每孔加入250μL封闭液，37℃封闭2h，用PBST洗涤3次并拍干。

将待检血清用PBST按1:100稀释，每孔100μL加入到反应孔中，盖上封板膜37℃避光孵育1h，甩干板中液体，用洗涤液PBST清洗3遍并拍干。

每孔加入100μL按1:5000倍稀释的HRP标记的IgG，盖上封板膜37℃孵育1h，甩干板中液体，用PBST洗涤3次并拍干。

每孔加入100μL的TMB底物显色工作液，37℃显色15min；每孔加入100μL浓度为2M的H₂SO₄终止显色。

使用酶标仪在450nm波长下读取OD值进行计算。

参见图9和图10，结果显示，在免疫后，注射PBS的阴性对照组几乎没有抗体的产生，各蛋白免疫组的特异性抗体水平在不断上升，在三免后两周(42d)时达到顶峰，之后也维持在较高水。PBS组和未嵌合CDV抗原表位的VP2-VLPs组的血清中没有检测到CDV抗体水平的变化。这表明所构建的嵌合型VLPs能较好的展示CDV的抗原表位，使其被机体识别，有效地刺激小鼠产生CDV特异性抗体。

（2）血凝抑制试验（HI）

通过血凝抑制试验来检测血清样本对CPV或VLPs血凝作用的抑制效果，来评价免疫后血清中CPV中和抗体的产生情况，具体步骤为：

根据实施例7的血凝试验（HA）的试验结果配制4血凝单位（4HAU）的抗原。

取96孔V型血凝板，向每孔中加入25µL的PBS。向第一孔中加入25μL待检血清，吹打混匀后吸取25μL加入第二孔中，依此类推倍比稀释至第12孔，从第12孔吸取25μL弃去，每份样品设置3个重复，同时每板设置阴性对照和阳性对照。

向每孔加入4HAU的血凝抗原25μL，4℃静置15min；

向每孔加入25μL的1%猪红细胞悬液，轻叩血凝板使其混匀，4℃静置1h，进行结果观察。

参见图11，结果显示，各免疫组HI抗体增涨趋势相近，在42d达到峰值，在三免后的变化趋于平稳，与疫苗组相比具有显著差异（P＜0.05），且各蛋白免疫组间无显著差异（P＞0.05），PBS组无HI抗体的产生。

（3）血清中和试验

利用血清中和试验来分析嵌合有CDV抗原表位的VLPs，在免疫动物后，是否针对CDV表位产生了中和抗体。具体步骤为：

将Vero-SLAM细胞传代接种于96孔板中，细胞数量在24h达到90%为宜。

将待检血清于56℃水浴灭活30min，进行2倍倍比稀释，再分别与100个TCID₅₀的CDV病毒稀释液在无菌EP管内等体积混合，在37℃细胞培养箱中孵育1-2h。

将病毒-血清混合液及对照组以每孔20μL接种于96孔板中。阳性对照为100个TCID₅₀的CDV病毒稀释液，阴性对照为阴性血清。

将96孔板置于37℃、5%CO₂恒温细胞培养箱中，连续7天观察记录出现细胞病变效应(CPE)的情况，按Karder法计算中和效价。

结果如图12所示，在首免56d后，嵌合有CDV抗原表位的VP2-L-VLPs、VP2-N-VLPs免疫组和弱毒疫苗组均有一定的CDV中和抗体的产生。

比较两个嵌合CDV抗原表位的VLPs，VP2-N-VLPs组的平均中和抗体效价为1:2^6.65，略高于VP2-L-VLPs组的1:2^6.58，经分析无显著差异(P＞0.05)，弱毒疫苗组所产生的中和抗体效价为1:2^6.21，与VP2-L-VLPs和VP2-N-VLPs免疫组均有显著性差异（P＜0.05）。而VP2-VLPs免疫组和PBS组均未产生CDV中和抗体。

（4）MTT法检测小鼠T淋巴细胞增殖

第一次免疫后56d，折颈处死小鼠，无菌摘取脾脏。在玻璃皿中加入3mL的1640培养基，取铜网置于其上并放入脾脏，使用注射器芯研磨（铜网不要接触平皿底部），再加入3mL的1640培养基反复冲洗铜网，得到脾脏细胞悬液。

把脾细胞悬液延管壁缓慢转移至装有淋巴细胞分离液的离心管中，3000rmp离心15min，可见分离液和培养基中间有明显的白色的淋巴细胞层。小心吸出淋巴细胞层，加入5mL的1640培养基重悬，1500rmp离心10min洗涤，重复2次。

在细胞计数板上计数，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL。以每孔100μL/孔的量向96孔板中加入稀释好的脾淋巴细胞悬液，用100个TCID₅₀的病毒进行刺激，阴性对照组加入PBS，每份样品3个重复。

将96孔细胞培养板放入恒温培养箱中，37℃培养72h。第68h时取出细胞培养板，每孔加入50μL的MTT溶液(5mg/mL)。继续培养4h后，轻轻吸出培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡培养板使得结晶物充分溶解。

使用酶标仪在490nm下测定每孔的吸光度，并计算淋巴细胞增殖指数（SI），SI=刺激组OD₄₉₀值/阴性对照组OD₄₉₀值。

结果如图13所示，在CPV病毒的刺激作用下，除PBS组外，各免疫组的脾淋巴细胞均能在刺激下进行增殖，且VP2-N-VLPs增值指数最高，与弱毒疫苗组相比具有极显著差异（p＜0.001），各蛋白免疫组间无显著差异（P＞0.05）。在CDV病毒的刺激作用下，嵌合有CDV抗原表位的VLPs的免疫组脾淋巴细胞均能响应刺激，进行显著的增殖，VP2-N-VLPs组的刺激指数为2.18，与VP2-L-VLPs相比具有显著差异(p＜0.05)。

综上，通过实施例7至9的试验结果表明，采用实施例1至6的构建方法制得的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其重组蛋白（VP2-N和VP2-L）能够在体外组装成病毒样颗粒，具有良好的反应原性和免疫原性，能够与抗犬瘟热病毒单克隆抗体与抗犬细小病毒单克隆抗体反应；免疫试验表明该展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒（VP2-N-VLPs和VP2-L-VLPs）具有良好的免疫性，能较好的诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答；可用于制备预防犬瘟热病毒与犬细小病毒引起的疾病的疫苗，尤其是用于预防大熊猫种群中的犬瘟热病毒与犬细小病毒引起的疾病。

Claims

1.展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，所述颗粒为嵌合型病毒样颗粒，由来源于犬细小病毒的VP2蛋白与来源于犬瘟热病毒的N蛋白的CTL-B表位和F蛋白的Th-T-B表位组成。

2.根据权利要求1所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，所述颗粒包括VP2-N-VLPs和/或VP2-L-VLPs；

3.根据权利要求2所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，所述N蛋白的CTL-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；

所述F蛋白的Th-T-B表位的氨基酸序列包括表位序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6；

其中，各所述表位序列之间经柔性肽GGGGS和/或GG连接。

4.根据权利要求2或3所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，所述VP2-N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述VP2-L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求4所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，编码所述VP2-N蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

和/或，编码所述VP2-L蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.根据权利要求1所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒，其特征在于，编码所述VP2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求1至6任一项所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、获取VP2的基因片段，将所述VP2的基因片段与表达载体pColdTF连接，获得pColdTF-VP2重组质粒；

8.根据权利要求7所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，在步骤S2和S5中，所述BL21（DE3）表达菌诱导表达后，通过Ni-NTA亲和层析分离纯化，分别获得携带TF标签的VP2、VP2-N或VP2-L蛋白，然后经Thrombin凝血酶切除TF标签，再经Ni-NTA亲和层析分离纯化获得VP2、VP2-N或VP2-L蛋白。

9.根据权利要求7所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒的构建方法，其特征在于，所述透析缓冲体系包括14kD的透析袋和足量装入所述透析袋内的透析缓冲液；所述透析缓冲液包括50mM NaH2PO4、250mM NaCl、0.5%Triton X-100和2mM DTT，pH调至8.0。

10.如权利要求1至6任一项所述的展示CDV抗原表位的犬细小病毒样颗粒在治疗和预防犬瘟热病毒与犬细小病毒引起的疾病的药物中的应用。