PT1054955E

PT1054955E - Composições compreendendo vírus e métodos para concentrar preparações virais

Info

Publication number: PT1054955E
Application number: PT99906690T
Authority: PT
Inventors: Pui-Ho Yuen; Andreas Frei; Henry K H Kwan; Varda E Sandweiss; Gary J Vellekamp; Laureano L Bondoc; Frederick William Porter; John Chu-Tay Tang; Peter Ihnat
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2007-01-31
Also published as: KR20010072547A; EP1526173A3; NO20004104L; CN1297478A; TWI232107B; EP1526174A3; EP1054955B1; JP2002503484A; ES2290613T3; PE20000265A1; EP1526173A2; EP1054955A2; EP1741777A1; DK1054955T3; ID28298A; CO4820440A1; AR063315A2; CN101164623B; KR20090127947A; CA2320419C

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO VÍRUS E MÉTODOS PARA CONCENTRAR PREPARAÇÕES VIRAIS"

I. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições contendo vírus, em particular vectores virais, com uma estabilidade significativamente melhorada. Os compostos da presente invenção são úteis para manter a estabilidade dos vírus durante o armazenamento e as composições contendo vírus da presente invenção são particularmente úteis para utilizações terapêuticas, como a terapia genética. Novos métodos para concentrar e purificar preparações com vírus são igualmente discutidos.

II. ANTECEDENTES

Os vírus tornaram-se cada vez mais importantes para fins terapêuticos, como a vacinação e a terapia genética, e existe uma necessidade de desenvolver e preparar compostos estáveis contendo vírus que possam ser facilmente armazenados e transportados, mas que conservem uma segurança e eficácia suficientes. Em particular, dado o uso extensivo de vectores virais em terapia genética, é importante desenvolver e preparar formulações que consigam 2 ΡΕ1054955 preservar, de forma estável, vírus recombinantes vivos quando estes veiculem transgenes terapêuticos.

Mais ainda, existe uma necessidade critica de formulações capazes de estabilizar preparações virais a temperaturas acima dos -80°C por períodos prolongados. Os compostos contendo vírus exigem normalmente um armazenamento a -80°C, não podendo ser guardados às temperaturas normais de refrigeração ('por exemplo. 2°C a 8°C ou superiores) durante períodos consideráveis de tempo. Esta limitação constitui um sério impedimento, não só relativamente ao armazenamento, mas também ao processamento, distribuição e uso clínico alargado.

Existe ainda a necessidade de desenvolver compostos contento vírus que conservem o pH na faixa entre cerca de 7 a cerca de 8,5 por períodos prolongados, apesar de expostos a temperaturas de refrigeração e não obstante o facto de serem sujeitos a condições adversas como a congelação e descongelação, em especial ao ritmo lento de congelação/descongelação que pode ocorrer em associação com uma produção, manuseamento ou distribuição em maior escala. A manutenção do pH é importante para as preparações virais, pois a um pH abaixo de 7,0 e acima de 8,5 as partículas virais vivas são vulneráveis à perda de viabilidade por instabilidade física e biológica.

Problemas adicionais relacionam-se com as concen- 3 ΡΕ1054955 trações virais. As concentrações elevadas de vírus, em particular, contribuem significativamente para a instabilidade dos vírus. Contudo, cada vez são necessárias concentrações mais elevadas de vírus e vectores virais para fins terapêuticos. Por este motivo, existe uma necessidade crítica de desenvolver formulações que estabilizem concentrações relativamente elevadas de vírus, em especial sob as condições adversas mencionadas acima. E, para além disso, existe uma necessidade especial de desenvolver novos métodos de concentração de preparações virais preexistentes de modo a conseguir preparações estáveis com níveis de concentração mais elevados. Os problemas da instabilidade associada às concentrações mais elevadas de vírus são significativamente exacerbados se se tentar concentrar uma preparação de vírus preexistente. Isto deve-se parcialmente às forças mecânicas de cisalhamento que é forçoso suportar durante os esforços para se aumentar a concentração de uma preparação virai preexistente. Se fosse possível encontrar um método de concentrar uma preparação virai sem prejuízo substancial da estabilidade dos vírus, então facilmente seriam preparadas doses clínicas em qualquer concentração (mesmo partindo de materiais com uma concentração mais baixa) e, muito importante, a capacidade de concentrar os vírus poderia eliminar constrições problemáticas e outros problemas que vão escalando durante o processo de purificação ao permitir um rendimento significativamente mais elevado durante os vários passos do processamento, como a cromatografia de exclusão molecular. 4 ΡΕ1054955

Existe, portanto, uma necessidade de materiais e métodos para conseguir os objectivos que se seguem.

III. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um composto destinado a manter a estabilidade dos adenovirus, contendo adenovirus numa formulação compreendendo 20 a 200 mg/ml de glicerol, sacarose e um sistema tampão que mantém o pH numa faixa entre cerca de 7 e cerca de 8,5 a uma temperatura num intervalo de cerca de 2°C a 27°C, em que o sistema de tampão compreende fosfato de sódio monobásico di-hidratado a uma concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml e trometamina a uma concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml. São igualmente discutidos métodos para concentrar uma preparação virai preexistente, que permita a selecção e preparação rápida de doses clínicas numa vasta gama de concentrações desejadas. Um método para concentrar uma preparação de vírus compreende: (a) a adição de um poli-hidroxi-hidrocarboneto a uma preparação virai, de modo a obter uma concentração final de poli-hidroxi-hidrocarboneto de cerca de 20% ou superior e (b) a sujeição da preparação virai a um processo de filtração em que a concentração de vírus seja aumentada através da aplicação de pressão à prepa- 5 ΡΕ1054955 ração, de forma a que o solvente seja removido da preparação virai através de um filtro enquanto que o vírus é retido.

Também é discutido aqui um método para concentrar uma preparação virai compreendendo: (a) a centrifugação de uma composição que compreenda uma primeira camada contendo um poli-hidroxi-hidro-carboneto numa concentração de 35% a 80% (v/v), estando esta primeira camada sobreposta a uma segunda camada contendo um poli-hidroxi-hidrocarboneto numa concentração de 5% a 30% (v/v), estando esta segunda camada sobreposta a uma terceira camada contendo vírus; e (b) a recuperação do vírus da primeira camada.

Mais ainda, os presentes inventores descobriram que o seu novo método para aumentar a concentração dos vírus possui a vantagem adicional de melhorar o processamento subsequente (por exemplo: reduzindo ou eliminando constrições problemáticas durante o processo de purificação subsequente ao permitir um rendimento significativamente mais elevado durante os passos do processamento, como a cromatografia de exclusão molecular). Portanto, o método de para concentrar preparações virais compreende ainda um passo subsequente de purificação (por exemplo: cromatogra-fia de exclusão molecular) . No que a isso diz respeito, o 6 ΡΕ1054955 método é particularmente útil quando um passo de cromato-grafia de exclusão molecular é executado subsequentemente à cromatografia de troca iónica e a preparação de vírus é concentrada após a cromatografia de troca iónica mas antes da cromatografia de exclusão molecular. As fracções virais obtidas por cromatografia de troca aniónica, por exemplo, contêm tipicamente níveis elevados de sais, e possivelmente de outras impurezas, que comprometem ainda mais a estabilidade dos vírus durante os processos de concentração. Assim sendo, é também discutido um método de purificação de uma preparação virai compreendendo: (a) a sujeição da preparação virai a uma cromatografia de troca aniónica, em que o vírus é eluído como um produto de preparação virai resultante de um meio de cromatografia de troca aniónica; (b) a adição de um poli-hidroxi-hidrocarboneto ao produto de preparação virai do passo (a), de modo a que a concentração de poli-hidroxi-hidrocarboneto na preparação atinja uma concentração final de cerca de 25% ou mais; e (c) o aumento da concentração de vírus no produto de preparação virai do passo (b) aplicando pressão à preparação de forma a que o solvente seja removido da preparação virai através de um filtro enquanto o vírus é retido; e 7 ΡΕ1054955 (d) a sujeição do produto de preparação virai concentrada do passo (c) a um ou mais passos de processamento adicionais. São também discutidas preparações virais concentradas e/ou purificadas pelos métodos que se seguem.

IV. DESCRIÇÃO DETALHADA

Conforme mencionado acima, o presente pedido apresenta novos compostos contendo virus, assim como novos métodos de concentração e purificação de compostos contendo virus.

No que diz respeito aos compostos, os presentes inventores desenvolveram uma nova formulação tamponada que é capaz de preservar as preparações virais com maior estabilidade. Em particular, a formulação é capaz de estabilizar preparações virais a temperaturas bastante acima de -80°C. Mais importantes ainda, os compostos da presente invenção são estáveis às temperaturas típicas da refrigeração, por exemplo: 2 a 8°C ou superiores, por períodos consideráveis de tempo, preferencialmente por vários meses ou mais. Esta é uma vantagem crítica pois, conforme referido acima, para conseguir ir ao encontro das necessidades clínicas, é impraticável manter as preparações virais congeladas a -80°C durante o armazenamento e transporte . ΡΕ1054955

Uma característica importante dos compostos da presente invenção é a adição de um poli-hidroxi-hidrocar-boneto, nomeadamente o glicerol. Neste contexto, um poli-hidroxi-hidrocarboneto significa um composto ramificado, linear ou cíclico, substituído com 2 ou mais (preferencialmente 2 a 6, e melhor ainda 2 a 4) grupos hidroxi. Os poli-hidroxi-hidrocarbonetos são compostos alquilo (ramificados ou não) substituídos com poli-hidroxi, contendo preferencialmente 2 a 7 átomos de carbono e incluem, por exemplo, o glicerol, o sorbitol e o polipropanol. Confirme evidenciado pelos dados fornecidos em baixo, os presentes inventores descobriram que o glicerol proporciona níveis surpreendentemente elevados de estabilidade durante períodos de tempo prolongados mesmo nas condições normais de refrigeração.

Uma quantidade de glicerol eficaz para os compostos da presente invenção é uma quantidade suficiente para estabilizar os vírus da formulação da presente invenção sem afectar adversamente a eficácia destes para as suas finalidades, em especial nos casos em que o vírus contém um transgene para uso em terapia genética. O glicerol está presente numa concentração final de cerca de 20 a 200 mg/ml. Um intervalo mais estreito poderá ser de 80 a 120 mg/ml. Pode ser usado mais do que um poli-hidroxi-hidrocarboneto.

Os poli-hidroxi-hidrocarbonetos podem, opcionalmente, conter um grupo aldeído. Em particular, um poli- 9 ΡΕ1054955 hidroxi-hidrocarboneto pode ser um dissacarídeo como a sacarose. Mais ainda, o glicerol não contém um grupo aldeído e o composto inclui adicionalmente um dissacarídeo, nomeadamente a sacarose, enquanto agente estabilizador e regulador da tonicidade. 0 composto da presente invenção contém glicerol e sacarose enquanto agente estabilizador ou regulador da tonicidade adicional. A sacarose está preferencialmente presente num intervalo de 5 a 25 mg/ml, com maior preferência a 20 mg/ml.

Sais metálicos bivalentes estabilizadores, farma-ceuticamente aceitáveis, como os sais de magnésio, de zinco e de cálcio, são usados em formas de realização preferenciais do composto da presente invenção. De preferência, o sal é um cloreto ou um sal de magnésio, sendo este último especialmente preferido. Preferencialmente, o sal (por exemplo: o sal de magnésio) está presente numa quantidade de cerca de 0,1 a 1 mg/ml, com maior preferência numa quantidade de cerca de 0,4mg/ml.

Sais metálicos monovalentes estabilizadores, farmaceuticamente aceitáveis, como os sais de potássio, sódio, lítio e césio podem ser incluídos em formas de realização preferenciais da presente invenção como estabilizadores opcionais. De preferência, o sal é o cloreto de sódio, presente na dose de 0,6 a 10,0 mg/ml, com maior preferência numa dose de cerca de 5,8 mg/ml.

Para além de estabilizar o composto, o cloreto de 10 ΡΕ1054955 sódio pode eliminar a taxa e a extensão do aparecimento de subprodutos da fermentação, resultando numa apresentação f armaceuticamente mais elegante e que pode ter um menor potencial antigénico resultante de agregados de proteínas. A adição de cloreto de sódio não afecta o pH da formulação. A composição da presente invenção é capaz de manter um pH no intervalo de cerca de 7 a cerca de 8,5 durante longos períodos de tempo, mesmo quando sujeita a condições adversas como a refrigeração e a congelação/ descongelação. Mais ainda, as composições podem permanecer estáveis e manter o intervalo necessário de pH mesmo quando sujeito à taxa relativamente lenta de congelação /descongelação que pode ocorrer em associação com uma produção, distribuição e manuseamento em maior escala. Conforme referido em cima, a manutenção do pH é importante para as preparações virais, porque a um pH inferior a 7,0 e superior a 8,5 as partículas virais vivas podem tornar-se instáveis e degradar-se. A composição particular dos vírus torna-os difíceis de estabilizar e preservar.

De forma a conseguir a manutenção do pH em condições adversas, a presente invenção compreende um sistema de tampão que consegue manter um pH óptimo num intervalo entre cerca de 7,0 a cerca de 8,5, apesar do armazenamento entre -80°C e 27°C e apesar de ser submetida a condições de congelação / descongelação. Uma vez que o pH pode variar com a temperatura, os intervalos de pH da presente invenção são mais especificamente ilustrados em 11 ΡΕ1054955 baixo, com referência a intervalos específicos de temperatura. Por exemplo, à temperatura de refrigeração (por exemplo: cerca de 2°C a 8°C) o intervalo preferencial de pH é de cerca de 7,7 a cerca de 8,3, com maior preferência entre cerca de 7,9 e cerca de 8,2. À temperatura ambiente, (por exemplo: a cerca de 20°C a 27°C, de preferência 22°C a 25°C), um intervalo de pH preferencial será de cerca de 7,3 a cerca de 8,2, com maior preferência de cerca de 7,4 a cerca de 7,9. A composição da presente invenção compreende um sistema tampão contendo fosfato de sódio monobásico di-hidratado numa concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml e trometamina numa concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml. (a trometamina é também conhecida como TRIS ou "Trizma" disponível em Sigma Chemical Co.). Contudo, outros sistemas de tampão são discutidos. Por exemplo, o fosfato de sódio monobásico di-hidratado pode ser usado se associado a uma forma acídica do tampão Tris. Numa forma de realização especialmente preferida, o sistema de tampão compreende fosfato de sódio monobásico di-hidratado numa concentração de cerca de 7 mg/ml e trometamina numa concentração de cerca de 1,7 mg/ml e possui a capacidade de manter a formulação num intervalo óptimo de pH de cerca de 7,3 a cerca de 7,9 a 25°C. A formulação da presente invenção possui a vantagem adicional de ter a capacidade de estabilizar concentrações elevadas de vírus nas condições adversas 12 ΡΕ1054955 mencionadas acima (como temperaturas de refrigeração e processamentos envolvendo congelação /descongelação). Em particular, a formulação da presente invenção é capaz de manter a estabilidade dos virus em concentrações que atingem até 1 X 1013 particulas/ml. Um intervalo preferencial da concentração de virus a usar nesta invenção está na gama das 1 x 109 a 1 X 1013 particulas/ml, com maior preferência até 1 x 1012 particulas/ml, por exemplo: 1 x 109 (ou 1 x IO10) a 1 x 1012. O termo "solvente" conforme usado aqui pode compreender um solvente (por exemplo: água, preferivelmente água estéril) ou uma mistura de um solvente e outros ingredientes, como solventes adicionais, estabilizadores adicionais, tampões adicionais e/ou outras substâncias que não afectem adversamente a segurança, eficácia e estabilidade da formulação. No que respeita a solventes, estabilizantes, tampões e afins, pode ser feita referência, por exemplo, à Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia.

Um surfactante, de preferência um detergente não iónico como um éster do ácido gordo polioxietileno (por exemplo: polioxietileno-sorbitanos, como o Polissorbato 20, Polissorbato 40, Polissorbato 60 ou Polissorbato 80 da ICI Américas, Inc., Wilmington Delaware, ou Tween 20, Tween, 40, Tween 60 e Tween 80 da Sigma, St. Louis, Mo.), podem, opcionalmente, ser incluídos na composição da presente invenção. De preferência, o detergente não iónico é um 13 ΡΕ1054955 éster do ácido gordo polioxiet ileno e o éster do ácido gordo polioxietileno é preferencialmente o Polissorbato 80, que pode actuar como estabilizante na composição da presente invenção. A concentração do detergente não iónico está preferencialmente no intervalo entre 0,03 e 0,3 mg/ml, sendo com maior preferência 0,15 mg/ml.

As composições da presente invenção podem ainda conter um ou mais agentes facilitadores da distribuição. Agente facilitador da distribuição refere-se a qualquer agente que melhore o aporte de um gene terapêutico, como um gene supressor de tumores a um tecido ou órgão canceroso. Exemplos deste tipo de agentes melhoradores da distribuição incluem, sem se limitar a, detergentes, álcoois, glicóis, surfactantes, sais biliares, antagonistas da heparina, inibidores da ciclo-oxigenase, soluções hipertónicas de sais e acetatos.

Os detergentes (conforme o termo é aqui usado) podem incluir detergentes aniónicos, catiónicos, zwiterió-nicos e não-iónicos. Exemplos de detergentes incluem, sem se limitar a, taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloreto de benzalcónio, detergente ZWITTER-GENT® 3-14, CHAPS (3-[3-Colamidopropil) dimetilamoniol]-1-propanesulfonato hidratado, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, detergente TRITON®-X-l00, C12E8, Octil-B-D-Gluco-piranosido, detergente PLURONIC®-F68, detergente TWEEN® 20 e detergente TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals). 14 ΡΕ1054955 O uso de agentes melhoradores da distribuição está descrito em detalhe na Pedido de Patente U.S. co-pendente U.S.S.N. 08/889,335 apresentado em 8 de Julho de 1997 e da International Application Publication No. WO 97/25072, 17 de Julho de 1997 e na U.S. Patent Application U.S.S.N. 09/112,074, submetido em 8 de Julho de 1998, International Application PCT/US 98114241. Para além disso, o uso de inibidores da calpaína em conjunto com vectores virais para aumentar a eficiência da transdução está descrito nos Pedidos de patente U.S. U.S.S.N. 09/172,685 e 60/104321 apresentados em 15 de Outubro del998.

Uma vasta gama de vírus é aqui discutida, incluindo adenovírus, poxvírus, herpesvírus, papovavírus, paramixovirus, ortomixovírus, retrovirus, vírus adenoas-sociados, vírus vaccínia, rotavírus, etc. (ver, por exemplo., Anderson, Science (1992) 256: 808-813). Os vírus utilizados na presente invenção são adenovírus, preferencialmente virus recombinantes, mas podem incluir isolados clínicos, estirpes vacinais atenuadas e outros. Assim sendo, por exemplo, um exemplo de adenovírus recombinante que pode ser utilizado em compostos da invenção é o A/C/N/53, descrito na PCT Pattent Application n°. WO 95/11984. A formulação da presente invenção é particularmente adequada para estabilizar um vírus recombinante, como por exemplo um adenovírus recombinante (ou "vector virai"), para fins terapêuticos em terapia genética. Por exemplo, o 15 ΡΕ1054955 vírus utilizado na presente invenção pode compreender um gene de supressão tumoral, como o gene wild-type p53 ou um gene Rb (por exemplo, pll ORB ou p56 RB), e com transgenes como o p53 wild-type inserido num vector virai, a composição da presente invenção pode ser usada como uma composição terapêutica para o tratamento do cancro. A este respeito, as formulações da presente invenção possuem uma capacidade notável para manter a viabilidade dos vírus vivos, em especial de vectores virais nos quais foi inserida uma sequência nucleotídica codif-cando para um transgene como o p53. Esta característica permite que os vírus mantenham a sua capacidade de infectar células-alvo, de forma que a proteína terapêutica codificada pelo transgene inserido seja produzida de forma adequada.

No que respeita especif icamente ao p53 e suas utilizações, é referido que a mutação do gene p53 é a alteração genética mais comum nos cancros humanos (Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). A introdução do p53 wild-type em células cancerosas de mamífero sem a proteína p53 wild-type endógena elimina o fenótipo neoplásico dessas células (ver, por exemplo., a U.S. Pattent 5.532.220).

Nos exemplos abaixo, o vírus é um adenovírus recombinante vivo contendo o gene p53 wild-type. A construção do vector virai em particular usado nestes exemplos 16 ΡΕ1054955 é aqui referida como "A/C/N/53". 0 A/C/N/53 (também conhecido por "ACN53") é uma construção para vectores virais particularmente preferido descrita no pedido co-pendente USSN 08/328,673 submetido em 25 de Outubro de 1994 e no WO 95/11984 (4 de Maio de 1995), expressamente incorporado aqui como referência.

Uma fórmula representativa das formas de realização preferenciais para a presente invenção contendo Polissorbato 80 está descrita abaixo: Fórmula representativa

Substância activa

Tampão

Estabilizador/agente de tonicidade Estabilizadores A/C/N/53 Fosfato de sódio monobásico Trometamina Sacarose 1 x 109 a 1 x 1013 particulas/ml 0,5 a 10 mg/ml 0,5 a 10 mg/ml 5 a 25 mg/ml

Solvente

Glicerol Cloreto de magnésio Polissorbato 80 Água para injectáveis q.b.p. 20 a 200 mg/ml 0,5 a 10 mg/ml 0,03 a 0,3 mg/ml 1 ml (As composições são tipicamente armazenadas em doses de 1,0 ml. "q.b.p." na fórmula acima significa adicionar solvente suficiente para atingir o volume total de 1 ml).

Quatro formas de realização particularmente 17 ΡΕ1054955 preferenciais estão descritas abaixo. (0 Polissorbato 80 está presente nos exemplos 1 e 2, mas < ausente nos exemplos 3 e 4. Exemplo 1 Exemplo 2 A/C/N/53 7,5 x 1011 particulas/ml 7,5 x 1010 particulas/ml Fosfato de sódio mono- 1,7 mg/ml 1,7 mg/ml básico di-hidratado Trometamina 1,7 mg/ml 1,7 mg/ml Cloreto de magnésio 0,4 mg/ml 0,4 mg/ml hexa-hidratado Sacarose 20 mg/ml 20 mg/ml Polissorbato 80 0,15 mg/ml 0,15 mg/ml Glicerol 100 mg/ml 100 mg/ml Água para injectáveis 1 ml 1 ml q.b.p. pH 7,4 to 7,8 7,4 to 7,8 Exemplo 3 Exemplo 4 A/C/N/53 7,5 x 1011 partículas/ml 7,5 x 1010 particulas/ml Fosfato de sódio mono- 1,7 mg/ml 1,7 mg/ml básico di-hidratado Trometamina 1,7 mg/ml 1,7 mg/ml Cloreto de magnésio 0,4 mg/ml 0,4 mg/ml hexa-hidratado Sacarose 20 mg/ml 20 mg/ml Glicerol 100 mg/ml 100 mg/ml Água para injectáveis lml lml q.b.p. pH 7,4 to 7,9 7,3 to 7,8

Os ingredientes seguintes: fosfato de sódio mono-básico di-hidratado, trometamina, cloreto de sódio hexa-hidratado, sacarose e glicerol podem ser todos eles obti- 18 ΡΕ1054955 dos, por exemplo, em EM Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532. O Polissorbato 80 está disponível, por exemplo em ICI Américas, Inc., Wilmington Delaware, 19897.

Os compostos da presente invenção podem ser preparados durante a purificação do vírus numa coluna de cromatografia de filtração em gel, combinando-se os ingredientes (excepto o Polissorbato 80) nas concentrações desejadas na coluna de filtração em gel. (No que respeita aos métodos de filtração em gel, pode ser feita referência, por exemplo, à secção V, em baixo) . Posteriormente, se se pretender diluir a concentração do vírus ou incorporar Polissorbato 80, podem preparar-se solventes segundo as técnicas padrão. Em seguida descreve-se um exemplo:

Colocar e dissolver fosfato de sódio monobásico di-hidratado, trometamina, cloreto de sódio hexa-hidratado, sacarose e glicerol em aproximadamente 75% do volume total de água para injectáveis à temperatura ambiente, num recipiente de inox equipado com agitador. Completar o solvente resultante com água para injectáveis até ao volume final. Verificar o pH. Calcular o volume necessário da substância activa A/C/N/53 (adenovírus com p53 wild-type como transgene) em suspensão e o volume necessário de solvente para a injecção de A/C/N/53. Se a injecção final de A/C/N/53 contiver Polissorbato 80, preparar uma solução de stock contendo um excesso de 10% de Polissorbato 80 no solvente. Colocar as quantidades calculadas de substância 19 ΡΕ1054955 activa A/C/N/53 à suspensão e o solvente num recipiente de inox e misturar. Carregar a solução de Polissorbato 80 -antes de juntar a totalidade do solvente - com base em 10% do volume total da injecção de A/C/N/53, se necessário. Filtrar assepticamente a suspensão através de um filtro esterilizado (0,22 pm ou equivalente). Testar a integridade do filtro após a filtração. Recolher a suspensão esterilizada e distribuir por frascos-ampola com o volume adequado. Rolhar e selar os frascos-ampola.

Os dados de estabilidade para os Exemplos 1, 2, 3, e 4 estão discriminados, respectivamente, nas Tabelas 1, 2, 3 e 4, abaixo.

Nas tabelas abaixo, o ensaio de anti-proliferação é um bioensaio utilizado para medir a capacidade do produto para eliminar células cancerosas e baseia-se, em geral, em procedimentos usados por Wills, et al., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088. Os números apresentados indicam actividade, enquanto que o controlo não possui actividade. O "ensaio de placas " mede as partículas virais em cultura ao contar o número de placas virais em função da diluição e baseia-se, na generalidade, em procedimentos descritos em Graham, FL, e Prevec, L., Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E.J. Murray, ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pp. 109-128 (1991); ver também Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., e Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pp 59-74 (1977). 20 ΡΕ1054955 A análise de "FACS" mostra a capacidade do vírus para infectar células e estas medições baseiam-se, na generalidade, em métodos descritos, por exemplo, na International Pattent Application PCT/US97/11865 (WO 98/01582, publicado em 15 de Janeiro de 1998). Na coluna que se segue à direita, os valores apresentados sob o cabeçalho "Concentração " representam a concentração do número total de partículas virais. Por fim, os valores sob o cabeçalho "Razão partículas/FACS" representam a razão entre o número total de partículas virais e o número de partículas virais infecciosas, indicando assim a potência relativa da preparação virai.

Os dados sob o cabeçalho "UV" indicam a agregação das partículas virais indicada pela razão da absorvância de U.V. entre os comprimentos de onda A320/A260 como indicadora da dispersão da luz. Basicamente, a absorvância a 320 nanometros de comprimento de onda mede a quantidade de dispersão de luz, enquanto que a absorvância a 260 nanometros de comprimento de onda se correlaciona com a quantidade de ADN. As temperaturas listadas na segunda coluna das tabelas, sob o cabeçalho "condição" representam a temperatura de armazenamento. Os ensaios fisiológicos são efectuados a 3 7°C e o pH da última coluna é medido à temperatura ambiente, aproximadamente 25°C. ΡΕ1054955 21

Tabela 1

Dados de estabilidade do Exemplo 1 Estabi- Condi- Ensaio de Ensaio de FACS Concentração Razão UV lidade ção Anti-proli- placas Parti- Tempo °c feração xlO8 i nlO xlO xlO11 par t./ml cuias A32O/-^-260 pH xl05 SPU/ml PFU/ml U/ml FACS inicial 3,3 5,8 3, 86 7,95 21 0,23 7, 53 1 semanas 25 4,9 10 2,27 8,06 36 0,24 7,53 2 semanas 4 3,1 6,6 3,41 7,84 23 0,23 7, 49 4 semanas 4 3,4 17 3,91 7, 79 20 0,23 7,63 8 semanas 4 5, 8 8,8 3,38 7,80 23 0,24 7,61 12 semanas 4 3,9 36 2,24 7,80 35 0,24 7, 72 5 meses 4 não testado não tstado 1, 57 8,21 52 0,26 7,60 6 meses 4 3,0 7,6 2, 74 7,68 28 0,28 7, 58 9 meses 4 3,1 19 3, 47 7,191 21 0, 28 7, 58 11 meses 4 não testado não testado nt 6, 71 - 0, 29 nt 12 meses 4 2,6 10 0,81 6,13 76 0, 30 7,62 *Novo teste de amostras UV com 9 meses: 6 ,89 x 1011 particulas/ml. A320 /â-260 = 0, 28

Tabela 2

Dados de estabilidade do Exemplo 2

Estabili- Condição Ensaio de Ensaio FACS Concentração Razão UV dade Anti-proli de placas Parti- Tempo °C feração xlO7 xlO9 xlO10part. /ml cuias A32o/A260 pH x 104SPU/ml PFU/ml U/ml FACS inicial 3,3 4,8 1,99 10, 0 50 0, 24 7,36 1 semanas 25 2, 4 7,1 1,64 nd1 - 0, 46 7, 42 2 semanas 4 2, 4 6, 9 2,13 9, 79 46 0, 24 7, 51 4 semanas 4 3,2 8,4 2,50 9,24 37 0, 22 7, 55 8 semanas 4 6, 9 8,6 2,60 8,10 31 0, 25 7, 54 12 semanas 4 5, 5 8,3 1,09 8,60 79 0,24 7,64 5 meses 4 não testado não testado 1, 74 8, 03 46 0,27 7, 55 6 meses 4 3,3 7,3 2,10 8,25 39 0,23 7, 52 9 meses 4 2,3 13 1,97 7, 59 39 0,242 7, 53 11 meses 4 não testado (nt) Não testado nt 7, 48 - 0,23 nt 12 meses 4 1, 8 9,4 0,60 4, 94 82 0,26 7,59 1 Não determinado devido a interferência do teste 2

Novo teste de amostras UV com 9 meses: 7,37 x IO10 partículas/ml. A320/A26o = 0,24. ΡΕ1054955 22

Tabela 3

Dados de estabilidade do Exemplo 3

Estabili- Condi- Ensaio Ensaio de FACS Concentração Razão uv dade ção de Anti- placas Parti- Tempo °c proliferação xlO8 xlO10 xlOnpart./ml cuias A320/^260 pH x 105SPU/ml PFU/ml U/ml FACS inicial 3,2 6,3 2,59 7, 45 29 0,24 7,67 1 semanas 25 4,4 4,3 1,65 7, 49 45 0,24 7,68 2 semanas 4 2,3 8,0 3,62 7,27 20 0,24 7, 49 4 semanas 4 2,7 7,6 4,08 6,97 17 0,24 7, 75 8 semanas 4 5,9 8,7 2,69 7,00 26 0,25 7, 82 12 semanas 4 3,0 15 0, 70 7,10 101 0,25 7, 80 6 meses 4 2,4 6,4 2, 45 7,12 29 0,25 7, 76 9 meses 4 2,8 9,4 2, 51 7,06 28 0,26 7,81 11 meses 4 não testado (nt) nt nt 6, 71 - 0,25 nt 12 meses 4 2,2 9,8 0, 74 6, 75 91 0,26 7,81

Tabela 4

Dados de estabilidade do Exemplo 4

Estabi- Condi- Ensaio Ensaio de FACS Concentração Razão UV 1idade ção de Anti- placas Parti- Tempo °c proliferação xlO7 xlO9 xlO10part./ml cuias A320/-^260 pH xl04SPU/ml PFU/ml U/ml FACS inicial 3, 3 4, 7 2,36 8, 91 38 0,23 7, 37 1 semanas 25 2, 3 9,3 1, 40 8,25 59 0,24 7,37 2 semanas 4 2, 8 8, 0 2,16 8, 80 41 nd* 7,37 4 semanas 4 2, 9 6,6 2, 54 9,35 37 0,20 7,63 8 semanas 4 6, 9 1,2 2,56 7,60 30 0,24 7,60 12 semanas 4 4,4 8,6 1,45 7,20 50 0,23 7, 73 6 meses 4 3,6 7,1 2,85 7,92 28 0,21 7,58 9 meses 4 2,9 11 1,87 7,26 39 0,20 7,60 11 meses 4 não testado (nt) nt nt 6,93 - 0,22 nt 12 meses 4 2,4 22 0, 70 7,15 102 0,23 7,61 * Não determinado devido a interferência do teste ΡΕ1054955 23 - 24 - ΡΕ1054955 EXEMPLO 5

Formulação para o Exemplo 5: A/C/N/53 (7,5x1o11

Partículas/ml) , Trometamina (TRIS) (1,7 mg/ml), fosfato de sódio monobásico di-hidratado (1,7 mg/ml), sacarose (20 mg/ml), cloreto de magnésio hexa-hidratado (0,4 mg/ml), glicerol (100 mg/ml), cloreto de sódio (5,8 mg/ml), Volume total = 10 ml.

Tabela 5

Dados de estabilidade do Exemplo 5

Estabi- Condi- Ensaio FACS Concentração Razão UV lidade ção de Anti- Parti- Tempo °c proliferação i nlO xlO xlO11 part./ml cuias A-320 /A-260 pH xlO5 SPU/ml U/ml FACS inicial 4,5 1, 87 7,81 42 0,23 7,80 1 mês 4 8, 0 1,67 7,83 47 0,23 7,80 4 meses 4 13, 0 1, 58 7,84 50 0,23 7, 70

Nalguns casos, observou-se a formação de precipitados na formulação durante o armazenamento a 4°C. A análise dos precipitados por SDS-PAGE sugere que os precipitados são compostos por impurezas mínimas (i.e., proteínas adicionais e algumas partículas virais imaturas), e, portanto, estes precipitados não afectam a fiabilidade da formulação. De qualquer forma, a fim de melhor clarificar a formulação (para evitar a possível formação de precipitados) pode ser efectuado um passo adicional de microfiltração, de forma a remover eventuais precipitados 25 ΡΕ1054955 em potencial com pouca perda de partículas virais. (Ao efectuar a microfiltração deve ter-se em conta que a existência de uma área de superfície de membrana suficiente por volume de filtração é um factor crítico para evitar que ocorra perda de vírus aquando da remoção do precipitado.)

Para além disso, os presentes inventores descobriram que a agitação, como por exemplo ao mexer, pode acelerar a formação de precipitado e é, portanto, um passo opcional adicional no processo de clarificação. Assim sendo, foi demonstrado que mexer lentamente (por exemplo, durante a noite, a 10°C, usando uma barra magnética) e em seguida microfiltrar, remove os precipitados de forma que estes não se voltam a formar ao mexer novamente.

Descobriu-se também que ciclos de sucessivo congelamento/descongelamento podem promover a formação de precipitados ao voltar a mexer. Assim, podem opcionalmente efectuar-se um ou mais ciclos de congelamento/descongelamento, mexendo em seguida e depois efectuando uma micro-filtração com o intuito de prevenir a formação de precipitados durante o armazenamento do produto virai final à temperatura de refrigeração (por exemplo. 4°C). Métodos de concentração e purificação de compostos contendo vírus: O presente pedido apresenta ainda um novo método para concentrar, de forma estável, uma preparação virai 26 ΡΕ1054955 preexistente utilizando a filtração de fluxo tangencial (por vezes aqui referida como "FFT "), permitindo que se seleccionem e preparem rapidamente as doses clinicas numa vasta gama de concentrações desejadas. O novo método de concentração de uma preparação virai compreende: (a) a adição de um poli-hidroxi-hidrocarboneto a uma preparação virai, de modo a obter uma concentração final de poli-hidroxi-hidrocarboneto de cerca de 20% ou superior; e sujeição da preparação virai a um processo de filtração em que a concentração do vírus é aumentada através da aplicação de pressão ao composto de forma a que o solvente seja removido da preparaçao virai através de um filtro enquanto que o vírus é retido.

Os métodos são aplicáveis a uma vasta gama de virus, incluindo mas não se limitando a adenovirus, poxvirus, iridovirus, herpesvírus, papovavirus, paramixo-virus, ortomixovirus, retrovirus, virus adenoassociados, virus vaccinia, rotavirus, etc., sendo os adenovirus especialmente preferidos. Os virus são preferencialmente virus recombinantes, mas podem incluir isolados clínicos, estirpes vacinais atenuadas, etc. Os métodos são particularmente úteis para concentrar vírus recombinantes contendo um transgene homólogo para utilização em terapia genética. Tais vírus são especialmente vulneráveis a forças 27 ΡΕ1054955 potencialmente destabilizadoras, como as forças mecânicas de cisalhamento adicionais que acompanham os métodos de concentração de preparações virais. Um exemplo de adenovirus recombinante que pode ser utilizado em compostos da invenção é o A/C/N/53, descrito na PCT Pattent Application n°. WO 95/11984. 0 processo de filtração usado para concentrar os vírus pode incluir qualquer processo de filtração (por exemplo, a ultrafiltração) em que a concentração de vírus seja aumentada ao forçar a passagem de um solvente através de um filtro de forma a que este solvente seja removido da preparação virai enquanto que o vírus é incapaz atravessar o filtro, permanecendo por isso, de forma concentrada, na preparação virai. A ultrafiltração está descrita em pormenor, por exemplo, em Microfiltration and Ultrafil-tration: Principies and Applications, L. Zeman e A. Zydney (Mareei Dekkar, Inc., Nova Iorque, NY, 1996). Um processo de filtração especialmente preferido é a Filtração de Fluxo Tangencial ("FFT"), conforme descrita, por exemplo no catálogo MILLEPORE intitulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). Aparelhos de FFT preferenciais incluem os sistemas de filtração Pellicon II ou Pellicon XL da Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts (endereço electrónico: www.millipore.com), sendo particularmente preferido o sistema Pellicon XL. Os métodos podem ser executados a temperaturas no intervalo de cerca de 2°C a 27°C. 28 ΡΕ1054955

Outros processos de concentração podem ser empregues para concentrar preparações virais. Por exemplo, a utilização de um poli-hidroxi-hidrocarboneto pode ser vantajosamente levada a cabo para concentrar uma preparação virai por centrifugação. Assim sendo, descreve-se aqui um método para concentrar uma preparação virai compreendendo: (a) a centrifugação de uma composição que compreenda uma primeira camada contendo um poli-hidroxi-hidro-carboneto a uma concentração de 35% a 80% (v/v) , estando esta primeira camada sobreposta a uma segunda camada contendo um poli-hidroxi-hidrocarboneto a uma concentração de 5% a 30% (v/v) , e estando a segunda camada sobreposta a uma terceira camada contendo virus e (b) a recuperação do virus da primeira camada. A titulo de exemplo, uma preparação de adenovirus pode ser concentrada por centrifugação a baixa velocidade a 3200 g utilizando rotores basculantes de uma centrífuga Beckman. Para o conseguir, a preparação virai pode ser colocada em diversos tubos de 5ml, cada um deles contendo 6,25% de volume de glicerol a 70% num primeiro estrato no fundo do tubo, sobreposto por 2,5% de volume de glicerol a 20%, com a preparação virai disposta por cima. A preparação é então centrifugada a 3200 g a 4°C durante aproximadamente 16 horas, de forma a depositar o vírus concentrado num pellet nos estratos de glicerol. Em seguida, a preparação 29 ΡΕ1054955 virai recém-concentrada é subsequentemente recuperada a partir do primeiro estrato. Os vírus concentrados pelos processos descritos acima possuem boas características dispersoras da luz e propriedades infecciosas adequadas.

No que respeita ao poli-hidroxi-hidrocarboneto usado nos métodos descritos, "poli-hidroxi-hidrocarboneto" significa um composto ramificado, linear ou cíclico com 2 ou mais (de preferência 2 a 6, e preferencialmente 2 a 4) grupos hidroxi substituídos e uma quantidade eficaz de poli-hidroxi-hidrocarboneto é uma quantidade suficiente para estabilizar os vírus contra eventuais forças desta-bilizadoras, como as forças mecânicas de cisalhamento que ocorrem durante o processo de concentração. Preferencialmente, o poli-hidroxi-hidrocarboneto, nos métodos de concentração de vírus, está presente numa concentração mínima de 20%, com maior preferência 25%. Os poli-hidroxi-hidrocarbonetos são preferencialmente compostos alquilo (ramificados ou não) substituídos com grupos poli-hidroxi de preferência contendo 2 a 7 átomos de carbono e podem incluir o glicerol, o sorbitol e o polipropanol. O glicerol é especialmente preferido. 0 novo método dos inventores para aumentar a concentração de vírus possui a vantagem adicional de melhorar o processamento, por exemplo, ao eliminar constrições problemáticas ao permitir um rendimento significativamente mais elevado durante os diversos passos do processamento, como a cromatografia de exclusão molecular. 30 ΡΕ1054955

Portanto, o método de para concentrar preparações virais pode ser aplicado a métodos de purificação de vírus em que seja utilizado em passo de cromatografia de exclusão molecular (por exemplo, filtração em gel) subsequentemente à cromatografia de troca aniónica. Neste método existem ameaças adicionais à estabilidade dos vírus, derivadas não só das forças mecânicas de cisalhamento necessárias para concentrar os vírus antes do passo da cromatografia de troca aniónica, que limita a velocidade do processo, mas também devido ao facto de a preparação virai eluída a partir do passo da cromatografia de troca aniónica conter tipicamente níveis elevados de sais e outras impurezas que comprometem ainda mais a estabilidade dos vírus. Assim sendo, um outro método é um método de purificação de uma preparação virai compreendendo: (a) a sujeição da preparação virai a uma cromatografia de troca aniónica, em que o vírus é eluído como um produto de preparação virai resultante de um meio de cromatografia de troca aniónica; (b) a adição de um poli-hidroxi-hidrocarboneto ao produto de preparação virai do passo (a) , de modo a que a concentração de poli-hidroxi-hidrocarboneto na preparação atinja uma concentração final de cerca de 25% ou mais; e (c) o aumento da concentração de vírus no produto de preparação virai do passo (b) aplicando pressão à 31 ΡΕ1054955 preparação de forma a que o solvente seja removido da preparação virai através de um filtro enquanto o vírus é retido; e (d) a sujeição do produto de preparação virai concentrada do passo (c) a um ou mais passos de processamento adicionais.

No método ligado à cromatografia de troca anióni-ca descrito acima, o nível mínimo de glicerol é de 25% (em lugar do nível mínimo de 20% para as aplicações gerais dos métodos de concentração descritos acima), pois esta aplicação em particular deve ter em consideração a ameaça adicional à estabilidade colocada pelas concentrações elevadas de sal no produto eluído a partir da coluna de troca aniónica. A adição de glicerol a 25% (preferencialmente 30%) resulta na estabilidade do pool de DEAE, que contém sais, durante mais de 10 dias a, por exemplo, 4°C. Assim sendo, os passos subsequentes da concentração de vírus e/ou filtração em gel podem ser executados em dias diferentes, com bastante flexibilidade, ao longo de um período de 10 dias. Tal como será apreciado, o emprego de um poli-hidroxi-hidrocarboneto na concentração superior de 25% ou mais pode também ser usado nos métodos supracitados quando uma preparação virai contém um elevado teor de sais devido a outras condições de processamento.

V. EXEMPLOS DE MÉTODOS 32 ΡΕ1054955

Os exemplos seguintes ilustram os métodos conforme descritos acima.

Breve descrição - Um lote concentrado começa enquanto produto virai bruto congelado, recuperado a partir de processos de fermentação. Num dos métodos, o produto de adenovirus é primeiro purificado por cromatografia de troca aniónica. Em seguida, antes colocar a preparação numa coluna de exclusão molecular, o pool de troca aniónica pode ser concentrado por filtração de fluxo tangencial (FFT) na presença de glicerol a 30% (v/v). Em alternativa, num outro método, o passo de concentração em FFT pode ser executado em presença de glicerol a 20% (v/v) ou mais (de preferência 25%) após cromatografia de exclusão molecular.

* Preparação das matérias primas por Cromatografia de Troca Aniónica anterior à FFT

Num método preferencial, um pool de adenovirus resultante de troca aniónica é preparado para a concentração como se segue. A matéria-prima virai congelada resultante dos passos de fermentação e recuperação é descongelada e filtrada através de uma membrana hidrofilica com 0,45 ym de poro. A concentração salina do filtrado é ajustada adicionando cloreto de sódio 4M. Esta solução de alimentação é então aplicada a uma coluna de Fractogel EMD DEAE-650M pré-equilibrada com fosfato de sódio 50 mM com pH 7,5, cloreto de sódio 260 mM, cloreto de magnésio 2 mM e 33 ΡΕ1054955 sacarose a 2% (p/v) (Tampão A) . 0 adenovírus liga-se à resina de troca aniónica, enquanto que a maior parte do meio e das impurezas das células hospedeiras passa através da coluna, terminando na carga da coluna restante. A coluna é inicialmente lavada com 4 volumes de tampão A, seguindo-se uma segunda eluição isocrática com 8 volumes de cama com 94% de tampão A e 6% de tampão B (fosfato de sódio 50mM com pH 7,5, cloreto de sódio 600 mM, cloreto de magnésio 2 mM e sacarose a 2% (p/v)) a fim de remover impurezas adicionais. O vírus é eluído da coluna com um gradiente linear de 30 volumes de cama com 6% a 100% de tampão B. O pico de adenovírus do perfil de eluição conforme determinado por A28o é recolhido. Adiciona-se, então, glicerol ao pool de DEAE a uma concentração final de 30% (v/v) para posterior processamento. * Concentração do pool de DEAE utilizando a Filtração de Fluxo Tangencial O pool de DEAE (preparado de acordo coma descrição acima) é concentrado 10 a 20 vezes usando uma unidade de FFT da Millipore (Pellicon XL System) com membranas Biomax com um cut-off de massa molecular de um milhão. O processo é efectuado a 2-10°C ou à temperatura ambiente (25°C). Os parâmetros de filtração que se seguem são usados neste processo: pressão média de entrada = 14 psi; pressão média de permeação = 0 psi; taxa de fluxo média = 13 litros/hora/metro quadrado. A concentração final de adenovírus atinge aproximadamente 1,0-2,0 x 1013 partículas 34 ΡΕ1054955 por ml. Com base na HPLC em coluna Resource Q e na análise da absorvância de UV (A260 ), a recuperação do passo de concentração é>80% sem agregação significativa (ensaio de dispersão da luz por A320/A260) · • Permuta de tampões por Cromatografia de Exclusão Molecular (Filtração em gel) A preparação concentrada de adenovírus é aplicada a uma coluna de exclusão molecular Superdex-200 pré-equilibrada com fosfato de sódio 20 mM com pH 8.0, cloreto de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 2 mM, sacarose a 2% (p/v) e glicerol a 10% (Tampão C) ou fosfato de sódio 11 mM, Tris 14 mM, cloreto de magnésio 2 mM, sacarose a 2% (p/v), glicerol a 10% e pH 7,8 (Tampão D). A coluna é eluida com tampão de equilíbrio. 0 pico de adenovirus do perfil de eluição conforme determinado por A28o é recolhido. A preparação concentrada de adenovirus é filtrada através de uma membrana hidrofílica Durapore com 0,2pm (Stericup, Millipore) a 2 a 10°C e pode ser armazenada a -80°C ou a temperaturas superiores (como 2 a 10°C). * Concentração do pool de Superdex-200 Pool utilizando Filtração de Fluxo Tangencial

Conforme discutido acima, um método preferencial envolve a concentração dos vírus após cromatografia de troca aniónica mas antes da filtração em gel. Contudo, num 35 ΡΕ1054955 outro método, os métodos apresentados para concentrar preparações virais podem também ser usados depois do passo da filtração em gel (mesmo se não for empregue qualquer passo de concentração de vírus entre o passo de troca aniónica e o passo de filtração em gel) . Neste caso, os parâmetros de filtração são os mesmos utilizados para a concentração do pool de DEAE, excepto que o poli-hidroxi-hidrocarboneto (por exemplo, glicerol) pode ser adicionado ao pool de Superdex-200 a uma concentração final tão baixa quanto 20% (v/v), uma vez que já não é necessário lidar com as concentrações elevadas de sais no pool de DEAE. A este respeito, deve notar-se que, nos casos em que a adição de poli-hidroxi-hidrocarboneto é adiada até depois da filtração em gel, o pool de DEAE deve ser imediatamente aplicado à coluna de filtração em gel (devido à vulnerabilidade do pool de DEAE, com a sua elevada concentração de sais). Assim, pode admitir-se que uma vantagem adicional da adição de poli-hidroxi-hidrocarboneto ao pool de DEAE é o aumento da flexibilidade, em termos do intervalo de tempo, para as opções de armazenamento durante o período entre a cromatografia de troca aniónica e o processamento subsequente.

Os métodos de concentração de preparações virais podem ser aplicados em conjunto com uma série de métodos de purificação. Para informação adicional sobre métodos de purificação pode fazer-se referência, por exemplo, a Huyghe et ai., Human Gene Therapy, Vol. 6, pp. 1403-1416 (19.95) e 36 ΡΕ1054955 à U.S. Patent Application Serial N° 08/989,227, expressamente aqui incorporada para referência.

VI. DADOS DE ESTABILIDADE PARA MÉTODOS DE CONCENTRAÇÃO DE PREPARAÇÕES VIRAIS UTILIZANDO FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL

Conforme demonstrado pelos dados experimentais em baixo, os métodos discutidos atrás permitem uma estabilidade dos vírus muito melhorada, apesar das forças mecânicas de cisalhamento usadas para concentrar os vírus e apesar das condições adversas, como os níveis elevados de sais num pool de DEAE. Assim, os métodos mencionados acima, permitem, inter alia, (1) a preparação rápida de doses clínicas em qualquer concentração desejada (mesmo partindo de compostos com uma concentração mais baixa), (2) a melhoria do processamento (por exemplo, ao permitir um rendimento significativamente mais elevado durante a cromatografia de exclusão molecular) e (3) a estabilidade do pool de DEAE contendo sais durante mais de 10 dias a 2-10°C (permitindo assim que sejam executados passos subsequentes de concentração de vírus e/ou filtração em gel em dias diferentes e com uma flexibilidade substancial ao longo de um período de 10 dias).

A. Concentração de vírus subsequente à Cromatografia DEAE

Nos três exemplos que se seguem, prepararam-se concentrações estáveis de adenovírus concentrando pools de DEAE em glicerol a 30% (de acordo com os métodos supra- 37 ΡΕ1054955 citados). As preparações foram então sujeitas a uma purificação adicional através de cromatografia de filtração em gel Superdex-200, de modo a obter a formulação final a testar.

Exemplo D-l

Formulação final: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, sacarose a 2%, glicerol a 10%, pH 8 a 2-10°C. Resultados: Particulas/FACS = 24; Dispersão de luz (Α320Μ260) = 0,22;

Cone. = 1,6 x 1013 partículas/ml.

Exemplo D-2

Formulação final: Tris base 14 mM, NaPi 11 mM, MgCl2 2 mM, sacarose a 2%, glicerol a 10%, pH 7,8 a 2-10°C.

Resultados: Particulas/FACS = 17; Dispersão de luz (A320M260) = 0,25; Cone. = 1,5 x 1013 particulas/ml

Exemplo D-3

Formulação final: NaPi 20 mM, NaClOO mM, MgCl2, 2 mM, sacarose a 2%, glicerol a 10%, pH 8 a 2-10°C

Resultados: Particulas/FACS = 24; Dispersão de luz (A320/A260) = 0,25; Cone. = 1,3 x 1013 particulas/ml. B. Concentração de vírus subsequentes à filtração em gel 38 ΡΕ1054955

Exemplo S-l

No exemplo que se segue, a preparação virai foi concentrada em glicerol a 20% subsequentemente à filtração em gel.

Formulação final: NaPi 16 mM, NaCl 80 mM, MgCl2 1,6 mM, sacarose a 1,6%, glicerol a 20%, pH 8 a 2-10°C.

Resultados: Particulas/FACS = 72; Dispersão de luz (A32o/A26o) = 0,26; Cone. = 1,66 x 1013 particulas/ml.

Lisboa, 27 de Dezembro de 2006

Claims

ΡΕ1054955 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para manter a estabilidade de adenovirus, compreendendo adenovirus numa formulação contendo 20 a 200 mg/ml de glicerol, sacarose e um sistema tampão que mantém o pH num intervalo entre cerca de 7 e cerca de 8,5 a uma temperatura na faixa entre cerca de 2°C e 27°C, em que o sistema de tampão compreende fosfato de sódio monobásico di-hidratado numa concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml e trometamina numa concentração de cerca de 0,5 a 10 mg/ml.
2. Composição da reivindicação 1, em que a sacarose está presente numa concentração de 5 a 25 mg/ml.
3. Composição de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 contendo também um sal metálico bivalente estabilizador.
4. Composição da reivindicação 3, em que o sal metálico bivalente estabilizador é o cloreto de magnésio.
5. Composição da reivindicação 4, em que o cloreto de magnésio está presente numa concentração de cerca de 0,1 a 1 mg/ml
6. Composição de qualquer uma das reivindi cações 1-5 compreendendo também um surfactante.
7. Composição da reivindicação 6, em que o 2 ΡΕ1054955 surfactante é um polioxietileno-sorbitano.
8. Composição da reivindicação 7, em que o polioxietileno-sorbitano é o polissorbato 80.
9. Composição da reivindicação 8, em que o polissorbato 80 está presente numa concentração de cerca de 0,03 a 0,3 mg/ml.
10. Composição de qualquer uma das reivindi cações 1-9 compreendendo também um solvente contendo água.
11. Composição de qualquer uma das reivindi cações 1-10, em que o adenovírus está presente numa concentração de cerca de 1 x 109 a 1 X 1013 partículas virais/ml.
12. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o adenovírus é um adenovírus recom-binante.
13. Composição de qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, em que o adenovírus é estável na composição durante pelo menos duas semanas às temperaturas de refrigeração.
14. Composição da reivindicação 13, em que a temperatura de refrigeração está na faixa entre cerca de 2°C e 8°C. 3 ΡΕ1054955
15. Composição da reivindicação 14, em que a temperatura de refrigeração é de cerca de 4°C. das reivindi-é estável na à temperatura
16. Composição de qualquer uma cações 11 ou 12, em que o adenovirus composição durante pelo menos uma semana ambiente.
17. Composição da reivindicação 16, em que a temperatura ambiente é de cerca de 25°C. Lisboa, 27 de Dezembro de 2006