ES2272053T3

ES2272053T3 - Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus.

Info

Publication number: ES2272053T3
Application number: ES99906690T
Authority: ES
Inventors: Andreas Frei; Henry K. H. Kwan; Varda E. Sandweiss; Gary J. Vellekamp; Pui-Ho Yuen; Laureano L. Bondoc, Jr.; Frederick William Porter, Iv; John Chu-Tay Tang; Peter Ihnat
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: DE69933433T2; PL197747B1; ATE341614T1; ATE478945T1; KR100918187B1; KR20080065614A; KR101018992B1; CN101164623A; WO1999041416A2; CA2723040A1; KR100991683B1; DE69942708D1; KR100862169B1; EP1526173B1; ES2290613T3; KR20090038927A; CN1297478A; KR20080065615A; IL137510A0; CO4820440A1

Abstract

Una composición para mantener la estabilidad de adenovirus, que comprende adeno- virus en una formulación que comprende 20 a 200 mg/mL de glicerol, sacarosa, y un sistema tampón que mantiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproxi- madamente 8, 5 a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC, en donde el sistema tampón comprende fosfato sódico monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0, 5 a 10 mg/mL y trometamina en una concentra- ción de aproximadamente 0, 5 a 10 mg/mL.

Description

Composiciones que comprenden virus y métodos para concentrar preparaciones de virus.

I. Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden virus, especialmente vectores virales, que tienen una estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones de la presente invención son útiles en mantener la estabilidad de los virus durante la conservación, y las composiciones que contienen virus de la presente invención son particularmente útiles para usos terapéuticos, tales como terapia de genes. También se describen nuevos métodos para concentrar y purificar preparaciones de virus.

II. Fundamento

Los virus han llegado a ser cada vez más importantes para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y terapia génica, y existe la necesidad de desarrollar y preparar composiciones estables que contienen virus que puedan ser fácilmente conservadas y transportadas, pero reteniendo suficiente seguridad y eficacia. En particular, dado el extensivo uso de los vectores virales en terapia génica, es importante desarrollar y preparar formulaciones que puedan conservar virus recombinantes vivos cuando llevan transgenes terapéuticos.

Además, hay una necesidad crítica de formulaciones que puedan estabilizar las preparaciones de virus a temperaturas superiores a -80ºC durante periodos prolongados de tiempo. Las composiciones que contienen virus requieren normalmente conservación a -80ºC y no pueden ser conservadas a temperaturas de refrigeración estándares (por ejemplo, 2ºC a 8ºC, o superiores) durante periodos sustanciales de tiempo. Esta limitación representa un serio impedimento no solo para el almacenamiento, sino también para el procesamiento, distribución y amplio uso clínico.

También existe la necesidad de desarrollar composiciones que contienen virus que puedan mantener el pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados de tiempo a pesar de estar expuestos a temperaturas de refrigeración, y a pesar de ser sometidos a condiciones duras, tales como congelación/descongelación, especialmente las bajas velocidades de congelación/descongelación que puede ocurrir en relación con la producción, manipulación o distribución a gran escala. El mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales debido a que a pH inferior a 7,0 y superior a 8,5 las partículas virales vivas son vulnerables a perder viabilidad debido a la inestabilidad física y biológica.

Otros problemas se refieren a aumentar las concentraciones de virus. En particular, las altas concentraciones de virus contribuyen significativamente a la inestabilidad de los virus. Sin embargo, se requieren concentraciones progresivamente crecientes de virus y vectores virales para uso terapéutico. Por consiguiente, existe la necesidad crítica de desarrollar formulaciones que estabilicen concentraciones relativamente altas de virus, especialmente en las duras condiciones mencionadas anteriormente. Y además, existe la necesidad particular de desarrollar nuevos métodos de concentrar una preparación de virus existente para conseguir preparaciones estables a niveles de concentración superiores. Los problemas de inestabilidad asociados con concentraciones superiores de virus se exacerban significativamente si se intenta concentrar una preparación de virus existente. Este se debe en parte a las fuerzas de cizallamiento mecánico adicionales que vienen a producirse durante los esfuerzos de aumentar la concentración de una preparación de virus. Si se pudiera encontrar un método de concentrar, una preparación de virus sin perjudicar sustancialmente la estabilidad del virus, entonces podrían prepararse fácilmente dosis clínicas a cualquier concentración deseada, (incluso cuando se parte de materiales que tienen una menor concentración) y, importantemente, la capacidad de concentrar virus podría eliminar problemáticos cuellos de botella y otros problemas de aumento de escala durante el proceso de purificación permitiendo rendimientos significativamente mayores durante diversas etapas del proceso, tales como la cromatografía de exclusión por tamaño molecular.

Existe por tanto la necesidad de materiales y métodos para conseguir los anteriores objetivos.

III. Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición para mantener la estabilidad de adenovirus que comprende adenovirus en una formulación que comprende 20 a 200 mg/mL de glicerol, sacarosa y un sistema tampón que mantiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC, en donde el sistema tampón comprende fosfato de sodio monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL y trometamina en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL.

También se describen nuevos métodos de concentrar una preparación de virus existente que permiten que se seleccione y preparen fácilmente dosis clínicas en un amplio intervalo de concentraciones deseadas. Un método de concentrar una preparación de virus comprende:

(a): añadir un hidrocarburo polihidroxilado a una preparación de virus hasta una concentración final de hidrocarburo polihidroxilado de aproximadamente 20% o más: y

(b): someter la preparación de virus a un proceso de filtración en donde la concentración del virus se aumenta aplicando presión a la preparación, de tal modo que el diluyente se separa de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus.

También se describe en la presente memoria un método para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a): centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 35% a 80% (v/v), teniendo la primer capa superpuesta una segunda capa que comprende hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 5% a 30% (v/v), teniendo la segunda capa superpuesta una tercera capa que comprende virus; y

(b): recuperar el virus de la primera capa.

Además, los autores de la presente invención encontraron que su nuevo método de aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de mejorar el tratamiento posterior (por ejemplo, reduciendo o eliminado problemáticos cuellos de botella durante la purificación subsiguiente permitiendo mayores rendimientos durante etapas de proceso, tales como cromatografía de exclusión por tamaño molecular). Por tanto, el método de concentrar preparaciones de virus comprende además una etapa de purificación subsiguiente (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño molecular). A este respecto, el método es particularmente útil cuando se realiza una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño molecular después de una cromatografía de intercambio aniónico, y la preparación de virus se concentra después de la cromatografía de intercambio aniónico, pero antes de la cromatografía de exclusión por tamaño molecular. Las fracciones virales obtenidas de la cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, contiene típicamente altos niveles de sales y posiblemente otras impurezas que comprometen más la estabilidad del virus durante los métodos de concentración. Por tanto, también se describe un método de purificar una preparación de virus que comprende:

(a): someter la preparación de virus a cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto de una preparación de virus de un medio de cromatográfico de intercambio aniónico;

(b): añadir un hidrocarburo polihidroxilado a la preparación de producto de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; y

(c): aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se separe diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y

(d): someter el producto de la preparación concentrada de virus de la etapa (c) a una o más etapas de tratamientos adicionales.

También se describen preparaciones de virus concentradas y/o purificadas por los métodos anteriores.

IV. Descripción detallada

Como se ha indicado anteriormente, la presente solicitud describe nuevas composiciones que contienen virus, así como nuevos métodos de concentrar y purificar composiciones que contienen virus.

Con respecto a las composiciones, los autores de la presente invención han desarrollado una nueva formulación tamponada que puede conservar las preparaciones virales con una estabilidad mejorada. En particular, la formulación puede estabilizar preparaciones virales a temperaturas muy por encima de -80ºC. Más importante todavía, las composiciones de la presente invención son estables a temperaturas de refrigeración típicas, por ejemplo, 2º a 8ºC, o superiores, durante periodo sustanciales de tiempo, preferiblemente durante varios meses o más. Esta es una ventaja crítica porque, como se ha mencionado antes, para satisfacer las necesidades clínicas no es práctico mantener las preparaciones virales congeladas a -80ºC durante la conservación y transporte.

Un aspecto importante de las composiciones de la presente invención es la adición de un hidrocarburo polihidroxilado, concretamente glicerol. Como se emplea en la presente memoria, hidrocarburo polihidroxilado significa un compuesto lineal, ramificado o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente 2 a 6, más preferiblemente 2 a 4) grupos hidroxi. Los hidrocarburos polihidroxilados son compuestos de alquilo sustituido (lineal o ramificado) sustituido con polihidroxi, que tienen preferiblemente 2 a 7 átomos de carbono, e incluyen, por ejemplo, glicerol, sorbitol y polipropanol. Como muestran los datos proporcionados más adelante, los autores de la presente invención encontraron que el glicerol permite niveles sorprendentemente altos de estabilidad durante periodos prolongados de tiempo incluso bajo condiciones de refrigeración estándares.

Una cantidad eficaz de glicerol para las composiciones de la presente invención es una cantidad suficiente para estabilizar el virus en la formulación de la presente invención sin afectar adversamente a la eficacia del virus para uso posterior, especialmente en casos en los que el virus contiene un transgen para uso en terapia génica. El glicerol está presente a una concentración final de aproximadamente 20 a 200 mg/mL. Un intervalo más estrecho puede ser 80 a 120 mg/mL. Puede usarse más de un hidrocarburo polihidroxilado.

Los hidrocarburos polihidroxilados pueden contener opcionalmente un grupo aldehído. En particular, el hidrocarburo polihidroxilado puede ser un disacárido, tal como sacarosa. Además, el glicerol no contiene un grupo aldehído y la composición adicionalmente incluye un disacárido, concretamente sacarosa, como estabilizador y agente de ajuste de la tonicidad. La composición de la presente invención contiene glicerol y sacarosa como un estabilizador o agente de ajuste de la tonicidad adicional. La sacarosa está presente preferiblemente en un intervalo de 5 a 25 mg/mL, más preferiblemente 20 mg/mL.

Los estabilizadores constituidos por sales metálicas divalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales de magnesio, sales de zinc y sales de calcio se usan en realizaciones preferidas de la composición de la presente invención. Preferiblemente, la sal es una sal cloruro o una sal de magnesio, siendo las sales de magnesio particularmente preferidas. Preferiblemente, la sal (por ejemplo, la sal de magnesio) está presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 1 mg/mL, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 0,4 mg/mL.

Los estabilizadores constituidos por sales metálicas monovalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales metálicas como sales de potasio, sodio, litio y cesio pueden estar incluidos en las realizaciones preferidas de la presente invención como estabilizadores opcionales. Preferiblemente, la sal es cloruro de sodio presente en la cantidad de 0,6 a 10,0 mg/ml, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 5,8 mg/ml.

Además de estabilizar la composición, el cloruro de sodio puede suprimir la velocidad y extensión de la aparición de sub-productos de fermentación, dando como resultado una presentación farmacéuticamente más elegante que puede tener un potencial de antigenicidad reducido debido a los aglomerados de proteínas. La adición de cloruro de sodio no afecta al pH de la formulación.

La composición de la presente invención puede mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados de tiempo, incluso cuando se somete a condiciones duras, tales como refrigeración y congelación/descongelación. Además, las composiciones pueden permanecer estables y mantener el intervalo de pH requerido incluso cuando se someten a una velocidad relativamente lenta de congelación/descongelación lo que puede ocurrir en relación con la producción, distribución y manipulación a gran escala. Como se ha indicado antes, el mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales, debido a que a un pH inferior a 7,0 y superior a 8,5 las partículas de virus vivos pueden llegar a ser inestables y degradarse. La composición particular de virus hace a los virus difíciles de estabilizar y conservar.

Para conseguir un mantenimiento del pH en condiciones duras, la presente invención comprende un sistema tampón que puede mantener un pH óptimo en un intervalo de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5 a pesar de conservación entre -80ºC y 27ºC y a pesar de ser sometido a condiciones de congelación/descongelación. Puesto que el pH puede variar dependiendo de la temperatura, los intervalos de pH de la presente invención se ilustran más específicamente mas adelante con referencia a los intervalos de temperatura específicos. Por ejemplo, a temperaturas de refrigeración (por ejemplo, aproximadamente 2ºC a 8ºC) un intervalo de pH preferido es aproximadamente 7,7 a aproximadamente 8,3, más preferiblemente aproximadamente 7,9 a aproximadamente 8,2. A temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20ºC a 27ºC, preferiblemente 22ºC - 25ºC), un intervalo de pH preferido es aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,2, más preferiblemente aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,9.

La composición de la presente invención comprende un sistema tampón que comprende fosfato sódico monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL y trometamina en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL. (La trometamina también es conocida como TRIS o "Trizma" disponible en Sigma Chemical Co.). Sin embargo, se describen otros sistemas tampones. Por ejemplo, puede usarse fosfato sódico dibásico dihidratado si está acoplado con una forma ácida de tampón Tris. En una realización particularmente preferida, el sistema tampón comprende fosfato sódico monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 1,7 mg/mL y trometamina en una concentración de aproximadamente 1,7 mg/mL, y tiene la capacidad de mantener la formulación en un intervalo de pH óptimo de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,9 a 25ºC.

La formulación de la presente invención tiene la ventaja adicional de tener la capacidad de estabilizar altas concentraciones de virus en las duras condiciones antes mencionadas (tales como temperaturas de refrigeración y procesamiento de congelación/descongelación). En particular, la formulación de la presente invención puede mantener la estabilidad del virus a concentraciones que llegan a ser de 1 x 10^{13} partículas/mL. Un intervalo preferido de concentraciones de virus para uso en la presente invención está en una cantidad de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{13} partículas/mL., más preferiblemente, hasta 1 x 10^{12} partículas/mL, por ejemplo, 1 x 10^{9} (o 1 x 10^{10}) a 1 x 10^{12}.

El término "diluyente" tal como se usa en la presente memoria puede comprender un disolvente (por ejemplo, agua, preferiblemente agua estéril) o una mezcla de un disolvente y otros ingredientes, tales como disolventes adicionales, estabilizadores adicionales, tampones adicionales, y/o otras sustancias que no afecten adversamente a la seguridad, eficacia y estabilidad de la formulación. Con respecto a los diluyentes, los estabilizadores, tampones y similares, se puede hacer referencia a, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

En la composición de la presente invención puede incluirse opcionalmente un tensioactivo, preferiblemente un detergente no iónico, tal como un éster de ácido graso de polioxitileno, tal como (por ejemplo, polioxietilensorbitanos tales como polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 o polisorbato 80 de ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, o Twen 20, Twen, 40, Twen 60 y Twen 80 de Sigma, St. Louis, Mo.). Preferiblemente, el detergente no iónico es un éster de ácido graso de polioxietileno, y el éster de ácido graso de polioxietileno es preferiblemente polisorbato 80, que puede actuar como estabilizador en la composición de la presente invención. La concentración del detergente no iónico está preferiblemente en un intervalo de 0,03 a 0,3 mg/mL; más preferiblemente,
0,15 mg/mL.

Las composiciones de la presente invención pueden contener además uno o más "agentes que mejoran la administración". Un "agente que mejora la administración" se refiere a cualquier agente que mejora la administración de un gen terapéutico, tal como un gen supresor de tumor a un tejido u órgano canceroso. Ejemplos de tales agentes que mejoran la administración incluyen, pero sin limitación: detergentes, alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de ciclooxigenasa, soluciones hipertónicas de sales y acetatos.

Los detergentes (tal como se usa el término en la presente memoria) pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos, de ion híbrido y no iónicos. Detergentes ilustrativos incluyen pero sin limitación: taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benzalconio, y detergente ZWITTERGENT® 3-14, CHAPS (hidrato de 3-[3-colamidopropil)dimetilamoniol]-1-propanosulfonato, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, el detergente TRITON®-X-100, C12E8, Octil-B-D-glucopiranósido, el detergente PLURONIC® - F68, el detergente TWEN® 20, y el detergente TWEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).

El uso de agentes que mejoran la administración se describe en detalle en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación U.S.S.N. 08/889,335 presentada el 8 de julio de 1997, y la Publicación de la solicitud de patente internacional Nº WO 97/25072, del 17 de Julio de 1997, y en la solicitud de patente de EE.UU. U.S.S.N 09/112,074 presentada el 8 de julio de 1998, la solicitud de patente internacional PCT/US 98/14241. Además, se describe el uso de inhibidores de uso de calpaína junto con vectores virales para aumentar la eficacia de la transducción en las solicitudes de patentes de EE.UU. U.S.S.N. 09/172685 y 60/104321 presentada el 15 de octubre de 1998.

En la presente memoria se describen una amplia gama de virus, incluyendo adenovirus, virus de la viruela, iridovirus, virus del herpes, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, rotavirus, etc. (véase, por ejemplo, Anderson, Science (1992) 256: 808-813). Los virus usado en la presente invención son adenovirus preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacunas atenuadas, y similares. Así, por ejemplo, un adenovirus recombinante ilustrativo que puede usarse en las composiciones de la invención es A/C/N/53, que se describe en la solicitud de patente PCT nº WO 95/11984.

La formulación de la presente invención es particularmente muy adecuada para estabilizar un virus recombinante, tal como un adenovirus recombinante vivo (o "vector viral"), para uso terapéutico en terapia génica. Por ejemplo, el virus usado en la presente invención puede comprender un gen supresor, tal como un gen p53 de tipo silvestre o un gen Rb (por ejemplo, p110^{RB} o p56 ^{RB}),ycon transgenes tales como p53 de tipo salvaje insertado en un vector viral, la composición de la presente invención puede usarse como composición farmacéutica para tratamiento de
cáncer.

A este respecto, las formulaciones de la presente invención tienen una notable capacidad de mantener la viabilidad de virus vivos, en particular un vector viral en el cual se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un transgen tal como p53. Este aspecto permite al virus mantener su capacidad de infectar células dianas de modo que se produce la proteína terapéutica codificada por el gen insertado.

Con relación específica a p53 y sus usos, se advierte que la mutación del gen p53 es la alteración genética más común en cánceres humanos (Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703, Hollestein (1991) Science, 253: 49-53). La introducción de p53 de tipo salvaje en células cancerosas de mamíferos que carecen de la proteína p53 de tipo salvaje endógena suprime el fenotipo neoplástico de estas células (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU.
5.532.220).

En los ejemplos que siguen, el virus es un adenovirus recombinante vivo que contiene el gen p53 de tipo salvaje. La construcción de vector viral particular usada en estos ejemplos se denomina en la presente memoria "A/C/N/53". A/C/N/53 (también se denomina "ACN53") es una construcción de vector viral particularmente preferida descrita en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación USSN 08/328,673 presentada el 25 de octubre de 1994 y en la solicitud de patente internacional WO 95/11984 (del 4 de mayo de 1995), expresamente incorporadas en la presente memoria como referencias.

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Una formulación representativa para las realizaciones preferidas de la presente invención que contiene polisorbato 80 es como se expone a continuación:

	Fórmula respresentativa
Sustancia activa	A/C/N/53	1 x 10^{9} a 1 x 10^{13} partículas/mL
Tampón	Fosfato sódico monobásico	0,5 a 10 mg/mL
	Trometamina	0,5 a 10 mg/mL
Estabilizador/Agente de tonicidad	Sacarosa	5 a 25 mg/mL
Estabilizadores	Glicerol	20 a 200 mg/mL
	Cloruro de magnesio	0,1 a 1 mg/mL
	Polisorbato 80	0,03 a 0,3 mg/mL
Disolvente	Agua para inyección q. s. ad.	1 mL

\begin{minipage}[t]{155mm} (Las composiciones se conservan típicamente en dosis de 1,0 mL, "q. s. ad" en la formulación anterior significan añadir suficiente disolvente para alcanzar el volumen total de 1 mL). \end{minipage}

A continuación se exponen cuatro realizaciones particularmente preferidas. (El polisorbato 80 está presente en los Ejemplos 1 y 2, pero ausente en los Ejemplos 3 y 4).

	Ejemplo 1	Ejemplo 2
A/C/N53	7,5 x 10^{11} partículas	7,5 x 10^{10} partículas
Fosfato sódico monobásico dihidratado	1,7 mg/mL	1,7 mg/mL
Trometamina	1,7 mg/mL	1,7 mg/mL
Cloruro magnésico hexahidratado	0,4 mg/mL	0,4 mg/mL
Sacarosa	20 mg/mL	20 mg/mL
Polisorbato 80	15 mg/mL	0,15 mg/mL
Glicerol	100 mg/mL	100 mg/mL
Agua para inyección c.s. ad	1 mL	1 mL
pH	7,4 a 7,8	7,4 a 7,8

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	Ejemplo 3	Ejemplo 4
A/C/N53	7,5 x 10^{11} partículas	7,5 x 10^{10} partículas
Fosfato sódico monobásico dihidratado	1,7 mg/mL	1,7 mg/mL
Trometamina	1,7 mg/mL	1,7 mg/mL
Cloruro magnésico hexahidratado	0,4 mg/mL	0,4 mg/mL
Sacarosa	20 mg/mL	20 mg/mL
Glicerol	100 mg/mL	100 mg/mL
Agua para inyección c.s. ad	1 mL	1 mL
pH	7,4 a 7,9	7,3 a 7,9

Los siguientes ingredientes: fosfato sódico monobásico dihidratado, trometamina, cloruro de magnesio hexahidratado, sacarosa y glicerol pueden todos obtenerse de, por ejemplo, en EM Industries, Inc., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532. El polisorbato 80 está disponible en, por ejemplo, ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, 19897.

Las composiciones de la presente invención pueden prepararse durante la purificación del virus en una columna cromatográfica de filtración por gel combinando los ingredientes (excluyendo el polisorbato-80) a las concentraciones deseadas en la columna de filtración por gel. (Con respecto a los métodos de filtración por gel, puede hacerse referencia, por ejemplo, al apartado V más adelante). Luego, si se desea diluir la concentración del virus, o incorporar polisorbato-80, entonces pueden prepararse los diluyentes por técnicas estándares. A continuación se expone un ejemplo:

Se carga y disuelve el fosfato sódico monobásico dihidratado, la trometamina, la sacarosa, el cloruro de magnesio hexahidratado y el glicerol en aproximadamente 75% de volumen de lote de agua para inyecciones a temperatura ambiente en un recipiente de acero inoxidable equipado con un agitador. El lote de diluyente resultante se lleva hasta el volumen final con agua para inyección. Se comprueba el pH. Se calcula el volumen requerido de A/C/N/53 (adenovirus con p53 de tipo salvaje como transgen) sustancia farmacéutica en suspensión y el volumen requerido de diluyente para preparar una inyección de A/C/N/53. Si la inyección de A/C/N/53 final contendrá polisorbato 80, se prepara una solución madre que contiene 10% en exceso de polisorbato 80 en diluyente. Se cargan las cantidades calculadas de A/C/N/53 sustancia farmacéutica en suspensión y diluyente en un recipiente de acero inoxidable y se mezcla. Se carga la solución de polisorbato 80, antes de añadir todo el diluyente, basado en el 10% del volumen del lote de inyección de A/C/N/53 si se requiere. Se filtra asépticamente la suspensión a través de un filtro esterilizado (0,22 \mum o equivalente). Se examina la integridad del filtro después de la filtración. Se recoge y filtra la suspensión esterilizada en viales que tienen el volumen apropiado. Se tapan y se cierran los viales.

Los datos de estabilidad para los Ejemplos 1, 2, 3, y 4 se exponen más adelante en la Tablas 1, 2, 3 y 4 respectivamente.

En las Tablas siguientes, el ensayo anti-proliferación es un bioensayo usado para medir la capacidad de los productos para suprimir células cancerosas y está basado generalmente en los métodos usados por Wills, et al., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088. Los números recogidos indican actividad, mientras que el control no tiene actividad.

El "ensayo en placas" mide partículas de virus en cultivo puntuando el número de placas virales en función de la dilución y está basado generalmente en los métodos descritos en Graham, F.L., y Prevec, L., Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E. J. Murray, ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pp. 109-128 (1991); véase también Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., y Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pp. 59-74 (1977).

El ensayo FACS muestra la capacidad del virus para infectar células, y estas medidas se basan generalmente en métodos descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional PCT/US97/11865 (WO 98/01582, publicada el 15 de enero de 1998). En la columna siguiente a la derecha, los números presentados bajo el encabezamiento "Concentración" representan la concentración del número total de partículas virales. Finalmente, los números bajo el encabezamiento "relación partículas/FACS" representan la relación del número total de partículas virales en comparación con el número de partículas virales infecciosas, indicando así la potencia relativa de la preparación de virus.

Los datos bajo el encabezamiento "UV" indican la agregación de las partículas virales como es mostrada por la relación de absorbancia UV para las longitudes de onda A_{320}/A_{260} como una indicación de la dispersión de la luz. Básicamente, la absorbancia a una longitud de onda de 320 nanómetros mide la cantidad de dispersión de luz, mientras que la absorbancia a una longitud de onda de 260 nanómetros está correlacionada con la cantidad de DNA.

Las temperaturas listadas en la segunda columna de las tablas bajo el encabezamiento "condición" representan la temperatura de conservación. Los ensayos fisiológicos se realizan a 37ºC y el valor del pH en la última columna se mide a temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC.

TABLA 1 Datos de estabilidad en el Ejemplo 1

1

TABLA 2 Datos de estabilidad en el Ejemplo 2

2

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TABLA 3 Datos de estabilidad en el Ejemplo 3

3

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TABLA 4 Datos de estabilidad en el Ejemplo 4

4

Ejemplo 5

Formulación para el Ejemplo 5: A/C/N/53 (7,5 x 10^{11} partículas/mL), trometamina (TRIS) (1,7 mg/mL), fosfato sódico monobásico dihidratado (1,7 mg/mL), sacarosa (20 mg/mL), cloruro de magnesio hexahidratado (0,4 mg/mL), glicerol (100 mg/mL), cloruro de sodio (5,8 mg/mL). Volumen de relleno = 10 mL.

TABLA 5 Datos de estabilidad en el Ejemplo 5

5

En algunos casos se ha observado que se forman partículas en la formulación durante el almacenamiento a 4ºC. El análisis de las partículas por SDS-PAGE sugiere que dichas partículas se componen de impurezas secundarias (es decir, proteínas adicionales y algunas partículas virales inmaduras), y por tanto estas partículas no afectan a la viabilidad de la formulación. No obstante, para clarificar más la formulación (impedir la posible formación de partículas), puede realizarse una etapa de microfiltración opcional para separar cualesquiera partículas potenciales con poca pérdida de partículas virales. (Cuando se lleva a cabo la microfiltración, debe tenerse en cuenta que es crítica el área superficial de la membrana de microfiltración por volumen de filtración para evitar pérdidas de virus a medida que se separan las partículas).

Además, los autores de la presente invención han encontrado que la agitación, tal como agitación circular, puede acelerar la formación de partículas y por lo tanto es una etapa opcional adicional en el proceso de clarificación. Así, la agitación suave (por ejemplo, durante una noche, a 10ºC, usando una barra agitadora magnética) seguida por microfiltración demostró separaba las partículas, de tal modo que no podrían volverse a formar partículas por nueva agitación.

También se encontró que los ciclos de congelación/descongelación promovían la formación de partículas durante la nueva agitación. Así, se pueden llevar a cabo opcionalmente uno o más ciclos de congelación/descongelación, seguido por agitación, y luego microfiltración, para impedir la formación de partículas durante la conservación del producto de virus final a las temperaturas de refrigeración (por ejemplo, 4ºC).

Métodos de concentrar y purificar composiciones que contienen virus

La presente solicitud también describe un nuevo método de concentrar establemente una preparación existente de virus empleando filtración con flujo tangencial (en lo sucesivo denominada "FTF"), permitiendo fácilmente seleccionar y preparar dosis clínicas en un amplio intervalo de concentraciones deseadas. El nuevo método de concentrar una preparación de virus comprende:

(a): añadir un hidrocarburo polihidroxilado a una preparación de virus hasta una concentración final de hidrocarburo polihidroxilado de aproximadamente 20% o más; y

(b): someter la preparación de virus a un proceso de filtración, en donde se aumenta la concentración de virus aplicando presión a la preparación, de tal modo que se separa diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus.

Los métodos son aplicables a una amplia gama de virus, incluyendo pero sin limitación: adenovirus, virus de la viruela, iridovirus, virus de herpes, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, rotavirus, etc.; siendo los adenovirus particularmente preferidos. Los virus son preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacunas atenuadas, y similares. Los métodos son particularmente útiles para concentrar virus recombinantes que llevan un transgen heterólogo para uso en terapia génica. Dichos virus son especialmente vulnerables a fuerzas potencialmente desestabilizantes, tales como las fuerzas de cizallamiento mecánico adicionales que acompañan a los métodos de concentrar preparaciones de virus. Un adenovirus recombinante ilustrativo que puede concentrarse por el método de la invención es A/C/N/53, que se describe en la solicitud de patente PCT nº WO 95/11984.

El proceso de filtración usado para concentrar el virus puede incluir cualquier proceso de filtración (por ejemplo, ultrafiltración) en donde la concentración de virus se aumenta forzando al diluyente a pasar a través de un filtro, de modo que el diluyente se separa de la preparación de virus, mientras que el virus es incapaz de pasar a través del filtro y por tanto permanece, en forma concentrada, en la preparación del virus. La ultrafiltración se describe en detalle en, por ejemplo, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman y A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New York, NY, 1996). Un proceso de filtración particularmente preferido es la filtración con flujo tangencial ("FFT") tal como se describe, por ejemplo, en el catálogo de MILLEPORE titulado "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96). El aparato de FFT comprende un sistema de filtro Pellicon II o Pellicon XL de Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts (dirección de internet: www.millipore.com), siendo particularmente preferido un sistema Pellicon XL. Los métodos pueden llevarse a cabo a temperaturas en un intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.

Para concentrar preparaciones de virus pueden emplearse otros procesos de concentración. Por ejemplo, el empleo de un hidrocarburo polihidroxilado puede usarse ventajosamente para concentrar una preparación de virus por centrifugación. Por tanto, se describe en la presente memoria un método para concentrar una preparación de virus que comprende:

(a): centrifugar una composición que comprende una primera capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 35% a 80% (v/v), teniendo dicha primera capa superpuesta una segunda capa que comprende un hidrocarburo polihidroxilado en una concentración de 5% a 30% (v/v), teniendo la segunda capa superpuesta una tercera capa que comprende virus; y

(b): recuperar el virus de la primera capa.

A modo de ejemplo, una preparación de adenovirus puede concentrarse por centrifugación a baja velocidad a 3200 g usando rotores de cubo oscilante de una centrífuga Beckman. Para conseguir esto, la preparación de virus puede colocarse en tubos múltiples de 5 ml, que contiene cada tubo 6,25% en volumen de glicerol al 70% en una primera capa en el fondo del tubo, que tiene superpuesta una segunda capa de 2,5% en volumen de glicerol al 20% y con la preparación de virus colocada encima. La preparación se centrifuga luego a 3.200 g a 4ºC durante aproximadamente 16 horas para peletizar el virus concentrado en las capas de glicerol y luego se recupera la preparación de virus recién concentrada de la primera capa. El virus concentrado por los métodos anteriormente descritos tenía buenas características de difusión de la luz y tenía adecuadas propiedades de infectividad.

Con respecto al hidrocarburo polihidroxilado usado en los métodos descritos, un "hidrocarburo polihidroxilado" significa un compuesto lineal, ramificado o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente 2 a 6, más preferiblemente 2 a 4) grupos hidroxi, y una cantidad eficaz de hidrocarburo polihidroxilado es una cantidad suficiente para estabilizar el virus contra fuerzas potencialmente desestabilizantes, tales como las fuerzas de cizallamiento mecánico que ocurren durante el proceso de concentración. Preferiblemente, el hidrocarburo polihidroxilado en los métodos de concentrar virus está presente en una concentración mínima de 20%, más preferiblemente 25%. Los hidrocarburos polihidroxilados son preferiblemente compuestos alquílicos (ramificados o no ramificados) sustituidos con polihidroxi que tienen preferiblemente 2 a 7 átomos de carbono, y pueden incluir glicerol, sorbitol y polipropanol. El glicerol es particularmente preferido.

El nuevo de los inventores para aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de mejorar el tratamiento, por ejemplo, eliminando problemáticos cuellos de botella permitiendo significativamente un mejor rendimiento durante las diversas etapas de tratamiento, tales como cromatografía de exclusión por tamaño molecular. Por tanto, el método de concentrar preparaciones de virus puede aplicarse a métodos de purificar virus en los que se realizar una etapa de cromatografía de exclusión por tamaño molecular (por ejemplo, filtración por gel) subsiguientemente a una cromatografía de intercambio aniónico. En este método, hay amenazas adicionales para la estabilidad del virus que proceden no solamente de las fuerzas de cizallamiento mecánico necesarias para concentrar el virus antes de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño molecular limitante de la velocidad, sino también debido al hecho de que la preparación de virus eluída de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico contiene típicamente altos niveles de sales y otras impurezas que comprometen más la estabilidad del virus. Por tanto, otro método se refiere a purificar una preparación de virus, que comprende:

(a): someter la preparación de virus a una cromatografía de intercambio aniónico, en donde el virus se eluye como un producto preparación de virus procedente de un medio cromatográfico de intercambio aniónico;

(b): añadir un hidrocarburo polihidroxilado al producto de la preparación de virus de la etapa (a) de modo que la concentración de hidrocarburo polihidroxilado en la preparación alcance una concentración final de aproximadamente 25% o más; y

(c): aumentar la concentración de virus en el producto de la preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión a la preparación de tal modo que se retira diluyente de la preparación de virus a través de un filtro mientras que se retiene el virus; y

(d): someter la preparación concentrada de producto de virus de la etapa (c) a una o más etapas de proceso adicionales.

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En el método antes expuesto en relación con la cromatografía de intercambio aniónico, el nivel mínimo de glicerol es 25% (en lugar del nivel mínimo de 20% que es el habitual en aplicaciones generales de los métodos de concentración antes mencionados) debido a que esta aplicación particular debe tener en cuenta la amenaza adicional a la estabilidad planteada por las altas concentraciones de sales en el producto eluído de la columna de cromatografía de intercambio aniónico. La adición de glicerol al 25% (preferiblemente 30%) da como resultado la estabilidad de las fracciones de elución reunidas (en lo sucesivo denominadas simplemente mezcla de elución), procedente de la columna de DEAE que contiene sal, de >10 días a, por ejemplo, 4ºC; por lo tanto las etapas subsiguientes de concentración de virus y/o filtración por gel pueden realizarse en días separados con una sustancial flexibilidad a través de un periodo de 10 días. Como se apreciará, el empleo del hidrocarburo polihidroxilado en una concentración más elevada del 25% o más también puede usarse en los métodos antes mencionados cuando la preparación de virus contenga un alto contenido de sal debido a otras condiciones del proceso.

V. Ejemplos de métodos

Los siguientes ejemplos ilustran los métodos que se han descrito anteriormente.

Breve descripción general - Una tanda o lote concentrado comienza con materiales virales brutos congelados que proceden de la recuperación de caldos de fermentación. En un método, el producto adenovirus se purifica primeramente por cromatografía de intercambio aniónico. Luego, antes de cargar la preparación sobre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular, la mezcla de elución de la cromatografía de intercambio aniónico puede ser concentrada por filtración por flujo tangencial (FFT) en presencia de glicerol al 30% (v/v). Alternativamente, en otro método, la etapa de concentración por FFT puede llevarse acabo en presencia de glicerol al 20% (v/v) o más preferiblemente al 25% (v/v) después de la cromatografía de exclusión por tamaño molecular.

\bullet Preparación de los materiales de partida por cromatografía de intercambio aniónico antes de la FFT

En un método preferido, la mezcla de elución de cromatografía de intercambio aniónico de adenovirus se prepara para concentración como sigue. El material viral congelado procedente de las etapas de fermentación y recuperación se descongela y filtra a través de una membrana hidrófila de 0,45 \mum. La concentración de sal del filtrado se ajusta añadiendo cloruro de sodio 4M. Esta solución de alimentación se aplica luego a una columna Fractogel EM DDEAE-650M pre-equilibrada con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 260 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2%(p/v) (Tampón A). Los adenovirus se fijan a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayoría de los medios y las impurezas de las células hospedantes pasan a través de la columna que termina en la carga agotada. La columna se lava inicialmente con 4 volúmenes de tampón A seguido por un segundo lavado isocrático de 8 volúmenes de lecho de 94% de tampón A y 6% de tampón B (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 600 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) para separar las impurezas adicionales. El virus se eluye de la columna con un gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho desde 6% a 100% de tampón B. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución según se determina por A_{280}. Luego se añade glicerol a la mezcla de elución de la columna de DEAE hasta una concentración final de 30% (v/v) para posterior tratamiento.

\bullet Concentración de la mezcla de elución de la columna de DEAE usando filtración con flujo tangencial (FFT)

La mezcla de elución de la columna de DEAE (preparada de acuerdo con la descripción anterior) se concentran 10 a 20 veces usando una unidad de FFT de Millipore (Pellicon XL System) con membranas Biomax de un umbral de exclusión de peso molecular de 1 millón. El proceso se lleva a cabo a 2-10ºC o temperatura ambiente (25ºC). En este método se usaron los siguientes parámetros de filtración: presión media en la entrada = 0,097 MPa (14 psi); presión media del producto permeado = 0 MPa (0 psi); caudal medio = 13 litros/hora-metro cuadrado. La concentración final de adenovirus consigue aproximadamente 1,0-2,0 x 10^{13} partículas por ml. Basándose en los recursos de Q-HPLC y el análisis por absorbancia de UV (A_{260}), la recuperación de la etapa de concentración es >80% sin agregación significativa (análisis de dispersión de luz para A_{320}/A_{260}).

\bullet Cambio de tampón por cromatografía de exclusión por tamaño molecular (filtración por gel)

La preparación de adenovirus concentrada se aplica a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular Superdex-200 pre-equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 100 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10% (Tampón C) o fosfato de sodio 11 mM, Tris 14 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10%, pH 7,8 (Tampón D). La columna se eluye con tampón estabilizante del equilibrio. Se recogen y reúnen las fracciones correspondientes al pico de adenovirus del perfil de elución según se determina por A_{280}. La preparación de adenovirus concentrada se filtra a través de una membrana hidrófila de 0,2 \mum Durapore (Stericup, Millipore) a 2 a 10ºC, y puede ser conservada a -80ºC o a temperaturas superiores (tales como 2 a 10ºC).

\bullet Concentración de la mezcla de elución de Superdex-200 usando filtración de flujo tangencial

Como se ha estudiado antes, un método preferido implica concentrar el virus después de la cromatografía de intercambio aniónico, pero antes de la filtración por gel. Sin embargo, en otro método, los métodos descritos de concentrar preparaciones de virus también pueden usarse después de la etapa de filtración por gel (incluso si no se empleó etapa de concentración del virus entre la etapa de cromatografía de intercambio aniónico y la etapa de filtración por gel). En este caso, los parámetros de filtración son los mismo que para la concentración de la mezcla de elución de DEAE, excepto que el hidrocarburo polihidroxilado (por ejemplo, glicerol) puede añadirse a la mezcla de elución de Superdex-200 a una concentración final tan baja como 20% (v/v), puesto que ya no es necesario tratar con las altas concentraciones de sales en la mezcla de elución de DEAE. A este respecto, debe advertirse que en casos en los que la adición de hidrocarburo polihidroxilado se pospone hasta después de la filtración por gel, la mezcla de elución de DEAE deben aplicarse inmediatamente a la columna de filtración (debido a la vulnerabilidad de las fracciones reunidas de DEAE con su alta concentración de sal). Por tanto, puede verse que una ventaja adicional de añadir hidrocarburo polihidroxilado a las fracciones reunidas de DEAE es la mayor flexibilidad en términos de intervalo de tiempo y opciones de conservación durante el periodo de tiempo entre la cromatografía de intercambio aniónico y el tratamiento subsiguiente.

Los métodos de concentrar preparaciones de virus pueden aplicarse en relación con una variedad de métodos de purificación. Para una información adicional de métodos de purificación, puede hacerse referencia, por ejemplo, a Huyghe et al., Human Gene Therapy, Vol. 6, pp. 1403-1416 (1995) y a la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/989227, expresamente incorporada en la presente memoria como referencia.

VI. Datos de estabilidad para métodos de concentrar preparaciones de virus usando filtración con flujo tangencial

Como muestran los datos experimentales indicados más adelante, los métodos antes estudiados permiten una estabilidad de virus grandemente aumentada, a pesar de las fuerzas de cizallamiento mecánico empleadas en concentrar el virus, y a pesar de las duras condiciones, tales como elevados niveles de sales en la mezcla de elución de DEAE. Por tanto, los métodos antes mencionados permiten, entre otras cosas: (1) fácil preparación de dosis clínicas a cualquier concentración deseada (incluso cuando se parte de un material que tiene una concentración inferior), (2) mejora del procesamiento (por ejemplo, permitiendo una producción significativamente superior durante la cromatografía de exclusión por tamaños), y (3) estabilidad de la mezcla de elución de DEAE durante >10 días a 2-10ºC (permitiendo así que la etapa subsiguiente de concentración de virus y/o filtración sea realizada en días separados con flexibilidad sustancial a través de un periodo de 10 días).

A. Concentración de virus después de la cromatografía sobre DEAE

En los tres Ejemplos siguientes, se prepararon concentraciones estables de adenovirus concentrando la mezcla de elución de DEAE en glicerol al 30% (de acuerdo con los métodos antes mencionados). Las preparaciones se sometieron a más purificación por cromatografía de filtración por gel de Superdex-200 para obtener la formulación final para ensayo.

Ejemplo D-1

Formulación final:: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2%, 10% de glicerol, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados:: Partículas/FACS = Dispersión de luz 24 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,22 = 1,6 x 10^{13} partículas/ml

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Ejemplo D-2

Formulación final:: Tris base 14 mM, NaPi 11 mM, MgCl_{2}2 mM, sacarosa al 2%, 10% de glicerol, pH 7,8 a 2-10ºC.

Resultados:: Partículas/FACS = Dispersión de luz 17 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,25 = 1,5 x 10^{13} partículas/ml

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Ejemplo D-3

Formulación final:: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados:: Partículas/FACS = Dispersión de luz 24 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,25= 1,3 x 10^{13} partículas/ml.

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B. Concentración de virus después de la filtración por gel

Ejemplo S-1

En el siguiente Ejemplo la preparación de virus se concentró en glicerol al 20% después de la filtración por gel.

Formulación final:: NaPi 16 mM, NaCl 80 mM, MgCl_{2} 1,6 mM, sacarosa al 1,6%, glicerol al 20%, pH 8 a 2-10ºC.

Resultados:: Partículas/FACS = Dispersión de la luz 72 (A_{320}/A_{260}) = Conc. 0,26 =1,66 x 10^{13} partículas/ml.

Claims

1. Una composición para mantener la estabilidad de adenovirus, que comprende adenovirus en una formulación que comprende 20 a 200 mg/mL de glicerol, sacarosa, y un sistema tampón que mantiene un pH en un intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC, en donde el sistema tampón comprende fosfato sódico monobásico dihidratado en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL y trometamina en una concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/mL.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la sacarosa está en una concentración de 5 a 25 mg/mL.

3. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además un estabilizador de sal metálica divalente.

4. La composición de la reivindicación 3, en donde el estabilizador de sal metálica divalente es cloruro de magnesio.

5. La composición de la reivindicación 4, en donde el cloruro de magnesio está en una concentración de aproximadamente 0,1 a 1 mg/mL.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además un tensioactivo.

7. La composición de la reivindicación 6, en donde el tensioactivo es un polioxietilensorbitano.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde el polioxietilensorbintano es polisorbato 80.

9. La composición de la reivindicación 8, en donde el polisorbato 80 está en una concentración de aproximadamente 0,03 a 0.3 mg/mL.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además un diluyente que comprende agua.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el adenovirus está en una concentración de aproximadamente 1 x 10^{9} a 1 x 10^{13} partículas virales/mL.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el adenovirus es un adenovirus recombinante.

13. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el adenovirus es estable en la composición durante al menos dos semanas a las temperaturas de refrigeración.

14. La composición de la reivindicación 13, en donde la temperatura de refrigeración está en el intervalo de aproximadamente 2ºC-8ºC.

15. La composición de la reivindicación 14, en donde la temperatura de refrigeración es aproximadamente 4ºC.

16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en donde el adenovirus es estable en la composición durante una semana a temperatura ambiente.

17. La composición de la reivindicación 16, en donde la temperatura ambiente es aproximadamente 25ºC.