KR102500970B1 - Rsv에 대한 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 융합 전 RSV F 단백질 또는 이의 면역 활성 부분을 암호화하는 신규한 핵산 분자에 관한 것으로, 융합 전 RSV F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 핵산 분자의 용도, 또는 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)에 대한 백신으로서 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
Description
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RSV에 대한 백신에 관한 것이다.
호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV)는 호흡기관의 대단히 전염성이 강한 아동기 병원균으로, 매년 약 200,000명의 아동 사망의 원인이 된다고 여겨진다. 2세 미만의 아동에서, RSV는 호흡기 감염으로 인한 입원의 입원의 대략 50%를 차지하며, 2개월 내지 4개월령에서 입원이 정점에 이른다. 거의 모든 아동이 2세까지 RSV 감염을 겪었을 것으로 보고된 바 있고, 일생 동안 반복되는 감염은 낮은 자연 면역에 기인한다. 노인에서, RSV 질환 부담은 비 유행성 인플루엔자 A 감염에 의해 야기되는 것과 유사하다. RSV에 대한 백신은 현재 이용 가능하지 않지만 높은 질환 부담으로 인해 요망된다.
RSV는 뉴모비리네(pneumovirinae)의 아과에 속하는 파라믹소바이러스이다. 이의 게놈은 중화 항체에 대한 주요 항원 표적인 RSV 당단백질(G) 및 RSV 융합(F) 단백질로 알려져 있는 막단백질을 포함하는 다양한 단백질을 암호화한다.
RSV G 단백질과 달리, F 단백질은 RSV 균주 사이에서 보존되는데, 이러한 이유로 광범위하게 중화 항체를 유도할 수 있는 매력적인 백신 후보물질이 된다. F 단백질은 막관통 단백질이고, 바이러스 출현 중에 세포막으로부터 비리온 막에 통합된다. RSV F 단백질은 바이러스 막과 숙주 세포 막을 융합시켜 감염을 촉진한다. 융합 과정에서, F 단백질은 불안정한 융합 전 형태로부터 안정적인 융합 후 형태로 비 가역적으로 다시 접힌다. 단백질 전구체인 F0는 세포 내 성숙 중에 퓨린 유사 프로테아제에 의한 절단을 필요로 한다. 두 개의 퓨린 자리가 있는데, 이의 절단은 p27 펩티드의 제거 및 두 개의 도메인: N 말단의 F2 도메인 및 C 말단의 F1 도메인의 형성을 가져온다(도 1). F2 및 F1 도메인은 두 개의 시스테인 다리에 의해 연결된다. 융합 단백질에 대한 항체는 세포에서 바이러스 흡수를 방해할 수 있어서, 중화 효과를 가질 수 있다. 중화 항체에 대한 표적이 되는 것 이외에도, RSV F는 세포독성 T 세포 에피토프를 함유한다(Pemberton et al, 1987, J. Gen.Virol. 68: 2177~2182).
50년의 연구에도 불구하고, RSV에 대한 인가된 백신은 여전히 존재하지 않는다. 백신 개발에 대한 한 가지 주요한 장애물은 포르말린 불활성화(FI) RSV 백신을 이용한 1960년대 임상 시험에서의 백신 강화된(vaccine-enhanced) 질병의 유산이다. FI-RSV 백신을 접종한 아동은 자연 감염에 대하여 보호되지 않았으며, 감염된 아동은 2건의 사망을 포함하여 백신 비접종 아동보다 더 심각한 질환을 경험하였다. 이 현상은 '강화된 질병'이라고 지칭된다.
FI-RSV 백신을 이용한 시험 이래로, RSV 백신을 생성하기 위한 다양한 접근법이 계속되어 왔다. 이러한 시도에는 RSV의 고전적인 생 약독화(live attenuated) 저온 계대 배양(cold passaged) 또는 온도 민감성 돌연변이 균주, (키메라) 단백질 서브유닛 백신, 펩티드 백신 및 아데노바이러스 벡터를 포함한 재조합 바이러스 벡터로부터 발현된 RSV 단백질이 포함된다. 이들 백신의 일부는 전도 유망한 전임상 데이터를 보여주었지만, 안전성 우려 또는 효능 부족으로 인하여 어떠한 백신도 인간 사용에 대해 인가되지 않았다.
그러므로, 효율적인 백신 및 RSV에 대한 백신 접종 방법, 특히 강화된 질병으로 이어지지 않는 백신에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 그러한 백신 및 안전하고 효과적인 방식으로 RSV에 대한 백신을 접종하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 안정적인 RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 신규한 핵산 분자를 제공하며, RSV 융합 전 F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
특정 구현예에서, RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 3 또는 4의 핵산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, RSV F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터는 인간 재조합 아데노바이러스이다.
특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 혈청형이 26 또는 35이다.
특정 구현예에서, 재조합 인간 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에서의 결실, E3 영역에서의 결실 또는 E1 및 E3 영역 둘 다에서의 결실을 갖는다.
특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 이의 5' 말단부에 서열 CTATCTAT를 포함하는 게놈을 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는, 조성물, 예컨대, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신을 제공한다.
본 발명은 추가로, RSV에 대하여 대상체에 백신을 접종하는 방법으로, 이 방법은 본 발명에 따른 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, RSV에 대하여 대상체에 백신을 접종하는 방법은 (바람직하게는 약학적 조성물로서 제형화되어, 단백질 백신인) RSV F 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 더 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대, 대상체의 비관 및 폐에서, RSV의 감염 및/또는 복제를 감소시키는 방법을 제공한다. 이는 대상체에서 RSV 감염으로부터 야기되는 부작용을 감소시켜, 조성물의 투여 시 이러한 부작용에 대한 대상체 보호에 기여할 것이다. 특정 구현예에서, RSV 감염의 부작용은 본질적으로 예방될 수 있다. 즉, 임상적으로 RSV 감염의 부작용이 관련되지 않은 낮은 수준까지 감소될 수 있다.
본 발명은 또한, RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주 세포로서, RSV 융합 전 F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 숙주 세포를 제공한다. 특정 구현예에서, RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 3 또는 4의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 전 F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 인간 아데노바이러스를 제공하는 단계, 상기 재조합 아데노바이러스를 숙주 세포의 배양물에서 증식시키는 단계, 재조합 아데노바이러스를 단리 및 정제하는 단계, 및 약학적으로 허용 가능한 조성물에 재조합 아데노바이러스를 제형화하는 단계를 포함하는 RSV에 대한 백신의 제조 방법으로서, RSV 융합 전 F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, RSV에 대한 백신의 제조 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 재조합 아데노바이러스는 혈청형이 26 또는 35이다.
도 1: RSV F 단백질의 개략도. 단백질 전구체는 F2 도메인과 F1 도메인 및, 퓨린 유사 프로테아제를 이용한 절단에 의해 성숙한 단백질로부터 제거되는 p27 펩티드를 포함한다. 절단 자리는 화살표로 나타내었다. 박스 상단의 숫자는 신호 펩티드를 제외한 전체 길이 단백질에서 아미노산 위치를 나타낸다. F1에서는, 구조적 요소를 나타내었다: 융합 펩티드(FP), 헵타드 반복부(heptad repeat) A(HRA)를 포함한 재접힘 영역 1(RR1) 및 헵타드 반복부 B(HRB)를 포함한 재접힘 영역 2(RR2).
도 2: F 단백질 변이체의 상대적인 표면 발현. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 세포를 항-RSV F 항체(CR9503)로 착색시키고 유세포 계측법(FACS)으로 분석하였다. 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI) 값을 계산하고, 대조군 F 야생형(Fwt) 형질감염 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. Fwt의 MFI를 1로 설정하였다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
도 3: 세포 표면에서의 융합 전 F 단백질의 비율. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 세포를 항-RSV F 항체 CR9503 및 항-융합 전 RSV F 항체 CR9501로 착색시키고 유세포 계측법으로 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, CR9501에 의해 측정한 MFI를 CR9503에 의해 측정한 MFI에 대해 정규화하였다. 정규화된 MFI 값은 세포 표면의 pre-F의 비율을 나타낸다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
FIG.4: F 단백질 변이체의 상대적인 표면 발현. F 단백질의 막관통 영역 및 세포질 영역이 결실된 가용성 버전(Fsl) 및 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 가용성 단백질의 발현 수준을 옥텟에 의해 배양물 상청액에서 측정하였고, 전체 길이의 발현체는 항-RSV F 항체(CR9503)를 이용한 세포 염색으로 시험하고 유세포 계측법으로 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, 대조군 F 야생형(Fwt) 형질감염 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. Fwt의 MFI를 1로 설정하였다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
도 5: F 단백질 변이체의 온도 안정성. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 열 충격 후, 세포를 항-RSV F 항체(CR9501 - 실선, CR9503 - 파선)로 착색시키고 유세포 계측법으로 분석하였다. 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 결정하였다. 기호는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다. (A) 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 결정하였다. (B) 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, 37℃ 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. 37℃ 샘플의 MFI를 1로 설정하였다. 점선은 60℃에서의 배경 염색에 해당한다.
도 6: F 단백질의 안정성. 열 스트레스 분석법에서 세포 표면에서의 융합 전 형태에서 PreF는 FA2 단백질보다 안정적이다. A549 세포를 표시된 MOI에서 삽입체 FA2(wt RSV F, 회색 막대) 또는 융합 전 F 안정화 삽입체(preF2.2, 검은색 막대)를 포함하는, Ad26 및 Ad35로 감염시켰다. 세포를 염색 전 15분 동안 표시된 온도에서 온도 처리하였다. 위: (CR9501 항체에 의해 검출된) 세포 표면 상에 융합 전 F를 제시하는 세포의 백분율; 아래: (CR9503 항체에 의해 검출된) 융합 전 및 융합 후 F 단백질의 임의의 형태를 제시하는 세포의 백분율. 37℃ 샘플에 대해 값을 정규화하였다. 모든 막대는 단일 측정을 나타낸다.
도 7: Ad26.RSV.preF2.1 및 F2.2는 마우스에서 단일 투여 후 세포 면역 반응을 유도한다. 수평 막대는 그룹 내에서 반응의 기하 평균을 도시한다. 배경 수준은 자극되지 않은 비장세포에서 관찰된 점 형성 단위(spot forming unit, SFU)의 95% 백분위수로서 계산되며, 점선으로 나타내었다.
도 8: Ad26.RSV.preF2.1 및 F2.2는 마우스에서 단일 면역화 후 Ad26.RSV.FA2와 비교했을 때 증가된 바이러스 중화 항체를 유도한다. Balb/c 마우스(그룹당 n=4)를 108 내지 1010 바이러스 입자(viral particle, vp) Ad26.RSV.FA2 또는 Ad26.RSV.preF2.1 또는 Ad26.RSV.preF2.2의 표시된 용량으로, 또는 제형 완충액으로 면역화하고, 면역화 8주 후 분리된 혈청에서 체액성 면역 반응을 분석하였다. (A) ELISA 기반의 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법을 이용하여 RSV A Long에 대한 바이러스 중화 항체를 결정하였다. IC50의 로그2 값으로 역가를 제공하였다. (B) 융합 전 또는 융합 후 F 항체 역가를 ELISA로 결정하였고, 정량 하한(LLoQ)을 초과하는 융합 전 및 융합 후 F 역가를 보여준 모든 샘플에 대하여 융합 전 및 융합 후 F 항체 사이의 비율을 계산하였다. (C) 코팅 시약으로 융합 후 RSV F A2를 이용하여 하위 클래스 ELISA를 수행하였고, IgG2a/IgG1 비율(로그10)을 도표화하였다. Th1(RSV F 발현 아데노바이러스 벡터로 면역화한 동물로부터 유래된 혈청) 및 Th2(FI-RSV 면역화한 동물로부터 유래된 혈청) 기준 샘플에 대해 관찰된 비율을 파선으로 나타내었다. LLoQ는 점선으로 나타내었고(패널 A), 수평 막대는 그룹당 평균 반응을 나타낸다.
도 9: Ad26.RSV.preF2.2는 광범위한 RSV 단리물을 중화하는 항체 반응을 이끌어낸다. 1010 바이러스 입자(vp) Ad26.RSV.FA2(n=3) 또는 Ad26.RSV.preF(n=4) 또는 제형 완충액(n=2)으로 면역화한 Balb/c 마우스의 혈청을, 표시된 RSV A(윗 패널) 및 B 균주(아래 패널)를 이용한 바이러스 중화 분석법(ELISA 기반 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법)에 사용하였다. IC50의 로그2 값으로 역가를 제공하였고, 수평 막대는 그룹당 평균 반응을 나타낸다. LLoQ는 파선으로 나타내었다.
도 10: 낮은 용량의 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2 단일 면역화는 동족 RSV A2로의 시험감염에 대해 목화쥐를 보호한다. 목화쥐(Sigmodon hispidus)(그룹당 n=7 내지 9)를 표시된 용량(마리당 vp 단위)의 Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2(왼쪽 패널), Ad35.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.FA2(오른쪽 패널)를 단일 근육 내 투여에 의해 면역화하였다. 제형 완충액, FI-RSV, 또는 낮은 용량의 RSV A2의 비강 내 적용으로 대조군 면역화를 수행하였다. 면역화 후 7주째에 105 pfu RSV A2를 동물의 비강 내로 시험감염시켰다. 시험감염 5일 후에 폐(A~B) 및 코 바이러스 역가(C~D)를 플라크 분석법에 의해 결정하였다. 시험감염 직전에 채취한 혈청(E~F)을 이용하여 RSV A Long 균주를 이용한 바이러스 중화 분석(ELISA 기반 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법)을 수행하였다. 점선은 정량 하한(LLoQ)을 나타낸다. 수평 막대는 그룹당 평균 역가를 나타낸다.
도 11: 목화쥐의 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2 면역화는 RSV A2 시험감염 후 증가된 폐포염 점수를 초래하지 않는다. 목화쥐(Sigmodon hispidus)(그룹당 n=7 내지 9)를 표시된 용량(마리당 vp 단위)의 Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2(윗 패널), Ad35.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.FA2(아래 패널)를 단일 근육 내 투여에 의해 면역화하였다. 제형 완충액, FI-RSV, 또는 낮은 용량의 RSV A2의 비강 내 적용으로 대조군 면역화를 수행하였다. 면역화 후 7주째에 105 pfu RSV A2를 동물의 비강 내로 시험감염시켰다. 폐포염은 0일에서 4일까지의 비 선형 척도에서 시험감염 5일 후에 한쪽 폐엽의 조직병리학적 검사로 점수화하였다. 수평 점선은 ERD를 유발하지 않는 RSV에 대한 자연 노출을 모방하기 위한 시험감염 전에 RSV-A2에 사전 노출시킨 대조군 동물의 최대 점수를 표시한다.
도 2: F 단백질 변이체의 상대적인 표면 발현. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 세포를 항-RSV F 항체(CR9503)로 착색시키고 유세포 계측법(FACS)으로 분석하였다. 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI) 값을 계산하고, 대조군 F 야생형(Fwt) 형질감염 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. Fwt의 MFI를 1로 설정하였다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
도 3: 세포 표면에서의 융합 전 F 단백질의 비율. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 세포를 항-RSV F 항체 CR9503 및 항-융합 전 RSV F 항체 CR9501로 착색시키고 유세포 계측법으로 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, CR9501에 의해 측정한 MFI를 CR9503에 의해 측정한 MFI에 대해 정규화하였다. 정규화된 MFI 값은 세포 표면의 pre-F의 비율을 나타낸다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
FIG.4: F 단백질 변이체의 상대적인 표면 발현. F 단백질의 막관통 영역 및 세포질 영역이 결실된 가용성 버전(Fsl) 및 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 가용성 단백질의 발현 수준을 옥텟에 의해 배양물 상청액에서 측정하였고, 전체 길이의 발현체는 항-RSV F 항체(CR9503)를 이용한 세포 염색으로 시험하고 유세포 계측법으로 분석하였다. 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, 대조군 F 야생형(Fwt) 형질감염 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. Fwt의 MFI를 1로 설정하였다. 막대는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다.
도 5: F 단백질 변이체의 온도 안정성. F 단백질의 전체 길이 변이체를 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 열 충격 후, 세포를 항-RSV F 항체(CR9501 - 실선, CR9503 - 파선)로 착색시키고 유세포 계측법으로 분석하였다. 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 결정하였다. 기호는 평균값을 나타내고, 에러 바는 값의 범위를 나타낸다. (A) 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 결정하였다. (B) 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, 37℃ 세포 샘플의 MFI에 대해 정규화하였다. 37℃ 샘플의 MFI를 1로 설정하였다. 점선은 60℃에서의 배경 염색에 해당한다.
도 6: F 단백질의 안정성. 열 스트레스 분석법에서 세포 표면에서의 융합 전 형태에서 PreF는 FA2 단백질보다 안정적이다. A549 세포를 표시된 MOI에서 삽입체 FA2(wt RSV F, 회색 막대) 또는 융합 전 F 안정화 삽입체(preF2.2, 검은색 막대)를 포함하는, Ad26 및 Ad35로 감염시켰다. 세포를 염색 전 15분 동안 표시된 온도에서 온도 처리하였다. 위: (CR9501 항체에 의해 검출된) 세포 표면 상에 융합 전 F를 제시하는 세포의 백분율; 아래: (CR9503 항체에 의해 검출된) 융합 전 및 융합 후 F 단백질의 임의의 형태를 제시하는 세포의 백분율. 37℃ 샘플에 대해 값을 정규화하였다. 모든 막대는 단일 측정을 나타낸다.
도 7: Ad26.RSV.preF2.1 및 F2.2는 마우스에서 단일 투여 후 세포 면역 반응을 유도한다. 수평 막대는 그룹 내에서 반응의 기하 평균을 도시한다. 배경 수준은 자극되지 않은 비장세포에서 관찰된 점 형성 단위(spot forming unit, SFU)의 95% 백분위수로서 계산되며, 점선으로 나타내었다.
도 8: Ad26.RSV.preF2.1 및 F2.2는 마우스에서 단일 면역화 후 Ad26.RSV.FA2와 비교했을 때 증가된 바이러스 중화 항체를 유도한다. Balb/c 마우스(그룹당 n=4)를 108 내지 1010 바이러스 입자(viral particle, vp) Ad26.RSV.FA2 또는 Ad26.RSV.preF2.1 또는 Ad26.RSV.preF2.2의 표시된 용량으로, 또는 제형 완충액으로 면역화하고, 면역화 8주 후 분리된 혈청에서 체액성 면역 반응을 분석하였다. (A) ELISA 기반의 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법을 이용하여 RSV A Long에 대한 바이러스 중화 항체를 결정하였다. IC50의 로그2 값으로 역가를 제공하였다. (B) 융합 전 또는 융합 후 F 항체 역가를 ELISA로 결정하였고, 정량 하한(LLoQ)을 초과하는 융합 전 및 융합 후 F 역가를 보여준 모든 샘플에 대하여 융합 전 및 융합 후 F 항체 사이의 비율을 계산하였다. (C) 코팅 시약으로 융합 후 RSV F A2를 이용하여 하위 클래스 ELISA를 수행하였고, IgG2a/IgG1 비율(로그10)을 도표화하였다. Th1(RSV F 발현 아데노바이러스 벡터로 면역화한 동물로부터 유래된 혈청) 및 Th2(FI-RSV 면역화한 동물로부터 유래된 혈청) 기준 샘플에 대해 관찰된 비율을 파선으로 나타내었다. LLoQ는 점선으로 나타내었고(패널 A), 수평 막대는 그룹당 평균 반응을 나타낸다.
도 9: Ad26.RSV.preF2.2는 광범위한 RSV 단리물을 중화하는 항체 반응을 이끌어낸다. 1010 바이러스 입자(vp) Ad26.RSV.FA2(n=3) 또는 Ad26.RSV.preF(n=4) 또는 제형 완충액(n=2)으로 면역화한 Balb/c 마우스의 혈청을, 표시된 RSV A(윗 패널) 및 B 균주(아래 패널)를 이용한 바이러스 중화 분석법(ELISA 기반 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법)에 사용하였다. IC50의 로그2 값으로 역가를 제공하였고, 수평 막대는 그룹당 평균 반응을 나타낸다. LLoQ는 파선으로 나타내었다.
도 10: 낮은 용량의 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2 단일 면역화는 동족 RSV A2로의 시험감염에 대해 목화쥐를 보호한다. 목화쥐(Sigmodon hispidus)(그룹당 n=7 내지 9)를 표시된 용량(마리당 vp 단위)의 Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2(왼쪽 패널), Ad35.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.FA2(오른쪽 패널)를 단일 근육 내 투여에 의해 면역화하였다. 제형 완충액, FI-RSV, 또는 낮은 용량의 RSV A2의 비강 내 적용으로 대조군 면역화를 수행하였다. 면역화 후 7주째에 105 pfu RSV A2를 동물의 비강 내로 시험감염시켰다. 시험감염 5일 후에 폐(A~B) 및 코 바이러스 역가(C~D)를 플라크 분석법에 의해 결정하였다. 시험감염 직전에 채취한 혈청(E~F)을 이용하여 RSV A Long 균주를 이용한 바이러스 중화 분석(ELISA 기반 정보 판독을 수반한 미세 중화 분석법)을 수행하였다. 점선은 정량 하한(LLoQ)을 나타낸다. 수평 막대는 그룹당 평균 역가를 나타낸다.
도 11: 목화쥐의 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2 면역화는 RSV A2 시험감염 후 증가된 폐포염 점수를 초래하지 않는다. 목화쥐(Sigmodon hispidus)(그룹당 n=7 내지 9)를 표시된 용량(마리당 vp 단위)의 Ad26.RSV.preF2.2, Ad26.RSV.FA2(윗 패널), Ad35.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.FA2(아래 패널)를 단일 근육 내 투여에 의해 면역화하였다. 제형 완충액, FI-RSV, 또는 낮은 용량의 RSV A2의 비강 내 적용으로 대조군 면역화를 수행하였다. 면역화 후 7주째에 105 pfu RSV A2를 동물의 비강 내로 시험감염시켰다. 폐포염은 0일에서 4일까지의 비 선형 척도에서 시험감염 5일 후에 한쪽 폐엽의 조직병리학적 검사로 점수화하였다. 수평 점선은 ERD를 유발하지 않는 RSV에 대한 자연 노출을 모방하기 위한 시험감염 전에 RSV-A2에 사전 노출시킨 대조군 동물의 최대 점수를 표시한다.
RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 인간 아데노바이러스를 포함하는 RSV 백신은 이전에 WO2013/139911 및 WO2013/139916에 기술된 바 있다. RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 혈청형 26 또는 35의 재조합 아데노바이러스는 잘 확립된 목화쥐 모델에서 RSV에 대해 매우 효과적인 백신이며, RSV F 단백질을 암호화하는 Ad5에 대해 이전에 기술된 데이터와 비교하여 개선된 효능을 갖는다는 점이 이 문헌에서 밝혀졌다. RSV F를 암호화하는 Ad26 또는 Ad35의 단일 투여는, 근육 내로 투여되어도, 시험감염 RSV 복제에 대해 완전한 보호를 제공하기에 충분하다는 점이 증명되었다.
그러나 RSV F 단백질의 불안정성 때문에, RSV F 단백질은 더욱 안정적인 융합 후 형태로 미성숙하게 다시 접히는 경향이 있다. 이 현상은 용액 중에서, 그리고 비리온의 표면 위에서 이 단백질의 고유한 특징이다. 그러나 인간 혈청에서 대부분의 RSV 중화 항체는 융합 전 형태의 RSV F에 대해 유도된다. 따라서, 본 발명으로 이어진 연구에서는 전체 길이의 단백질에서 RSV F 단백질을 그것의 융합 전 형태로 안정화하는 변형을 확인하고자 노력을 기울였다.
RSV F 단백질을 융합 전 형태로 안정화하는 몇몇 가능한 돌연변이는 이전에 WO2014/174018 및 WO2014/202570에서 기술된 바 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 독특하고 특이적인 돌연변이 서브세트를 포함하는 RSV F 단백질을 암호화한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 이 독특한 돌연변이의 조합은 증가된 RSV F 단백질 발현 수준 및 융합 전 형태의 RSV F 단백질의 안정성을 가져온다는 점이 밝혀졌다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자는 융합 전 형태에서 안정화된 RSV F 단백질을 암호화하며, (WO2013/139911 및 WO2013/139916에 개시된 바와 같은) 야생형 RSV F 단백질과 비교하여 더 높은 역가의 중화 항체를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 융합 전 호흡기 세포융합 바이러스 F 단백질(RSV 융합 전 F 단백질 또는 RSV pre-F 단백질)을 암호화하는 신규한 핵산 분자로서, RSV pre-F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 신규한 핵산 분자를 제공한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 RSV pre-F 단백질을 암호화한다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, 용어 핵산, 핵산 분자, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드는 서로 교환 가능하게 사용되며, 모두 DNA 및 RNA를 포함하는, 뉴클레오티드로부터 만들어진 선형 바이오고분자(사슬)를 지칭한다.
유전자 코드의 축중(degeneracy)의 결과로 다수의 상이한 핵산 분자가 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 점은 당업자에 의해 이해된다. 당업자는 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정한 숙주 유기체의 코돈 활용을 반영하기 위하여 통상적인 기법을 이용하여 통상적인 기법에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화된 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 제조할 수 있다는 것도 알고 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자"는 서로의 축중 형태이면서 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 본 설명에서 서열은 업계의 관행인 바와 같이, 5'에서 3'의 방향으로 제공된다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 융합 전 RSV F의 단편을 암호화한다.
특정 구현예에서, RSV 융합 전 F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자는 인간 세포와 같은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 코돈 최적화 방법은 알려져 있고 앞서 기술된 바 있다(예를 들어, WO 96/09378).
특정 구현예에서, RSV 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질을 암호화하는 핵산은 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, RSV F 단백질을 암호화하는 핵산은 서열 번호 3 또는 4의 핵산 서열로 구성된다.
본 설명에 사용되는 용어 "단편"은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 및/또는 내부 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열은 전체 길이의 RSV F 단백질의 서열, 예를 들어, 서열 번호 1 또는 2의 RSV F 단백질에서 상응하는 위치와 동일한 펩티드를 지칭한다. 면역 반응을 유도하기 위하여, 그리고 일반적으로 백신 접종의 목적을 위하여, 단백질은 전장 길이일 필요도 없고, 그것의 모든 야생형의 기능을 가질 필요도 없으며, 단백질의 단편이 똑같이 유용하다는 점은 이해될 것이다. 또한, 당업자는 예컨대, 통상적인 분자 생물학 절차를 이용하여, 예컨대, 아미노산 치환, 결실, 부가 등에 의하여 단백질에 변화를 일으킬 수 있음을 알 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 면역원성의 손실 없이 적용될 수 있다. 이는 당업자에게 주지된 통상적인 절차에 따라 용이하게 점검될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 융합 전 RSV F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벡터는 재조합 DNA 절차에 의해 용이하게 처리될 수 있고 본 발명의 핵산 분자의 발현을 가져올 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입되는 숙주 세포와 벡터와의 적합성에 달려있을 것이다.
특정 구현예에서, 벡터는 인간 재조합 아데노바이러스이고, 재조합 아데노바이러스 벡터라고도 지칭된다. 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 본 설명에 사용되는 바와 같이, 아데노바이러스에 대한 '재조합'이라는 용어는 아데노바이러스가 인간의 손에 의해 변형되었고, 예컨대, 아데노바이러스가 그 안에 활발하게 클로닝된 변경된 말단부를 가지고/가지거나 이종유전자(heterologous gene)을 포함함, 즉, 자연 발생적인 야생형 아데노바이러스가 아님을 내포한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 바이러스 복제에 요구되는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, 예컨대, E1a 영역 및/또는 E1b 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 기능이 결핍되어 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 필수 유전자 기능 및 필수적이지 않은 E3 영역의 적어도 일부가 결핍되어 있다. 아데노바이러스 벡터는 "다중적으로 결핍"될 수 있는데, 이는 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 게놈의 둘 이상의 영역 각각에서 하나 이상의 필수적인 유전자 기능이 결핍되어 있음을 의미한다. 예를 들면, 위에서 언급된 E1-결핍된 또는 E1-, E3-결핍된 아데노바이러스 벡터는 E4 영역의 적어도 하나의 필수적인 유전자 및/또는 E2 영역(예컨대, E2A 영역 및/또는 E2B 영역)의 적어도 하나의 필수적인 유전자가 더 결핍되어 있을 수 있다.
아데노바이러스 벡터, 이의 구축 방법 및 이의 증식 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 미국 특허 제5,559,099호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,994,106호, 제5,994,128호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제6,040,174호, 제6,020,191호 및 제6,113,913호 및 문헌[Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", Chapters 67 and 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996)] 및 그 안에 언급된 기타 참고문헌에 기술되어 있다. 전형적으로, 아데노바이러스 벡터의 구축은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 문헌[Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995)] 및 그 안에 언급된 기타 참고문헌에 기술된 것과 같은, 일반적인 분자 생물학 기법의 이용을 수반한다.
특정 구현예에서, 아데노바이러스는 혈청형 26 또는 35의 인간 아데노바이러스이다. 이러한 혈청형을 기반으로 한 본 발명에 따른 백신은 Ad5를 기초로 한 선행 기술에 기재된 백신보다 더욱 강력한 것으로 보이는데, 후자는 단일 근육 내 투여 후, RSV 시험감염 복제에 대해 완전한 보호를 제공하는 데 실패했기 때문이다(Kim et al, 2010, Vaccine 28: 3801~3808; Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601~12610; Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375). 본 발명의 혈청형은 또한, 일반적으로 인간 개체군에서 낮은 혈청유병률(seroprevalence) 및/또는 낮은 기존의 중화 항체 역가를 갖는다. 이들 혈청형 및 상이한 이식 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터는 임상 시험에서 평가되어서, 이제까지는 우수한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 보인다. rAd26 벡터의 제조는 예를 들어, WO 2007/104792 및 문헌[bbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654~63]에 기술되어 있다. Ad26의 예시적인 게놈 서열은 GenBank 등록번호 EF 153474 및 WO 2007/104792의 서열 번호1에서 확인된다. rAd35 벡터의 제조는, 예를 들어 미국 특허 제7,270,811호, WO 00/70071, 및 문헌[Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263~71]에 기술되어 있다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 GenBank 등록번호 AC_000019 및 WO 00/70071의 도 6에서 확인된다.
본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 복제-가능(replication-competent) 또는 복제-결핍(replication-deficient)일 수 있다. 특정 구현예에서 아데노바이러스는, 예를 들어 게놈의 E1 영역에 결실을 함유하기 때문에, 복제 결핍이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 아데노바이러스 게놈으로부터 필수적인 영역이 결실된 경우, 이들 영역에 의해 암호화되는 기능은 트랜스로, 바람직하게는 생산자 세포에 의해 제공되어야 한다. 즉, E1, E2 및/또는 E4 영역의 일부 또는 전체가 아데노바이러스로부터 결실될 때, 이들은 생산자 세포에, 예를 들어 이의 게놈에 통합되어 존재해야 하거나 소위 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 형태로 존재하여야 한다. 아데노바이러스는 또한, E3 영역에서 결실을 가질 수 있는데, 이는 복제에 불필요하므로 이러한 결실은 보완될 필요가 없다.
이용될 수 있는 생산자 세포(때때로 당해 분야 및 본 설명에서 '포장 세포(packaging cell)' 또는 '보충 세포(complementing cell)' 또는 '숙주 세포'라고도 지칭됨)는 원하는 아데노바이러스가 증식될 수 있는 임의의 생산자 세포일 수 있다. 예를 들어, 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스에서의 결핍을 보완하는 생산자 세포에서 행해진다. 이러한 생산자 세포는 바람직하게는 이들의 게놈에 적어도 아데노바이러스 E1 서열을 갖고, 이에 의해 E1 영역에서 결실을 갖는 재조합 아데노바이러스를 보완할 수 있다. E1에 의하여 불멸화된 인간 망막 세포, 예컨대, 911 또는 PER.C6 세포(미국 특허 제5,994,128호 참조), E1-형질전환된 양막세포(유럽 특허 제1230354호 참조), E1-형질전환된 A549 세포(예컨대, WO 98/39411, 미국 특허 제5,891,690호 참조), GH329:HeLa(Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213~219), 293 등과 같은 임의의 E1-보충 생산자 세포가 이용될 수 있다. 특정 구현예에서 생산자 세포는, 예를 들어 HEK293 세포, 또는 PER.C6 세포, 또는 911 세포, 또는 IT293SF 세포 등이다.
Ad35(서브그룹(subgroup) B) 또는 Ad26(서브그룹 D)와 같은 비-서브그룹 C E1-결핍된 아데노바이러스의 경우, 이들 비-서브그룹 C 아데노바이러스의 E4-orf6 코딩 서열을 Ad5와 같은 서브그룹 C의 아데노바이러스의 E4-orf6으로 교환하는 것이 바람직하다. 이는 예를 들면, 293 세포 또는 PER.C6 세포와 같이, Ad5의 E1 유전자를 발현하는 주지된 보충 세포주에서 그러한 아데노바이러스의 증식을 가능케 한다(예컨대, 본 설명에 전체가 참조로 포함된 문헌[Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135~2143]; WO 03/104467 참조). 특정 구현예에서, 이용될 수 있는 아데노바이러스는 RSV F 단백질 항원을 암호화하는 핵산이 클로닝된 E1 영역에 결실이 있고 Ad5의 E4 orf6 영역이 있는 혈청형 35의 인간 아데노바이러스이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물의 아데노바이러스는 RSV F 단백질 항원을 암호화하는 핵산이 클로닝된 E1 영역에 결실이 있고, Ad5의 E4 orf6 영역이 있는, 혈청형 26의 인간 아데노바이러스이다.
대안적인 구현예에서, 아데노바이러스 벡터 내에서 이종 E4orf6 영역(예컨대, Ad5의 E4orf6 영역)의 위치를 지정할 필요는 없지만, 대신에 E1-결핍 비-서브그룹 C 벡터는 E1 및 양립 가능한 E4orf6 둘 다를 발현하는 세포주, 예컨대, Ad5로부터 E1 및 E4orf6 둘 다를 발현하는 293-ORF6 세포주에서 증식된다(예컨대, 293-ORF6 세포의 생성을 기술하는 문헌[Brough et al, 1996, J Virol 70: 6497~501]; 각각 그러한 세포주를 이용한 E1 결실된 비-서브그룹 C 아데노바이러스 벡터의 생성을 기재하고 있는 문헌[Abrahamsen et al, 1997, J Virol 71: 8946~51] 및 문헌[Nan et al, 2003, Gene Therapy 10: 326~36] 참조).
대안적으로는, 증식 대상이 되는 혈청형으로부터 E1을 발현하는 보충 세포가 이용될 수 있다(예컨대, WO 00/70071, WO 02/40665 참조).
E1 영역에 결실이 있는, Ad35와 같은, 서브그룹 B 아데노바이러스의 경우, 아데노바이러스의 E1B 55K 개방형 해독틀의 3' 말단, 예를 들어, pIX 개방형 해독틀의 바로 상류의 166 bp 또는 (Ad35 게놈의 Bsu36I 제한효소 자리에 의한 5' 말단에 표시된) pIX 개시 코돈의 바로 상류의 243 bp 단편과 같은 이를 포함하는 단편을 보유하는 것이 바람직한데, 이는 pIX 유전자의 프로모터가 이 영역에 일부 존재하기 때문에 이것이 아데노바이러스의 안정성을 증가시키기 때문이다(예컨대, 본 설명에 참조로 포함된, 문헌[Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135~2143]; WO 2004/001032 참조).
본 발명의 아데노바이러스에서 (본 설명에서 '이식 유전자'로도 지칭되는) "이종 핵산"은 아데노바이러스에 자연적으로 존재하지 않는 핵산이다. 이종 핵산은 예를 들면, 일반적인 분자 생물학 기법에 의하여 아데노바이러스 내로 도입된다. 본 발명에서, 이종 핵산은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 RSV pre-F 단백질(또는 이의 단편)을 암호화한다. 이종 핵산은 예를 들면, 아데노바이러스 벡터의 결실된 E1 또는 E3 영역 내로 클로닝될 수 있다. 이식 유전자는 일반적으로 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이것은, 예를 들어 이식 유전자(들)를 암호화하는 핵산을 프로모터의 조절 하에 위치시킴으로써 수행될 수 있다. 추가적인 조절 서열이 부가될 수 있다. 많은 프로모터들이 이식 유전자(들)의 발현에 이용될 수 있고, 당업자에게 알려져 있다. 진핵세포에서 발현을 획득하기에 적합한 프로모터의 비 제한적인 예는 CMV-프로모터(미국 제5,385,839호), 예를 들어, CMV 전초기 프로모터, 예를 들어 CMV 전초기 유전자 인핸서/프로모터로부터 nt. -735 내지 +95를 포함하는 CMV 전초기 프로모터이다. 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리A 신호(미국 제5,122,458호)가 이식 유전자(들) 뒤에 존재할 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 재조합 아데노벡터는 5' 말단 뉴클레오티드로서 뉴클레오티드 서열: CTATCTAT를 포함한다. 이러한 벡터는 전체가 본 설명에 참조로 포함된 본래의 5' 말단 서열(일반적으로 CATCATCA)을 갖는 벡터(Crucell Holland B.V.의 이름 하에 2012년 3월 12일에 출원된 'Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends'라는 명칭의 특허 출원 제PCT/EP2013/054846호 및 미국 제13/794,318호 참조)와 비교하여 생산 공정에서 향상된 복제성을 나타내어 향상된 균일성을 갖는 아데노바이러스의 배치를 가져오므로 이러한 구현예는 유리하다. 따라서, 본 발명은 또한, RSV F 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 재조합 아데노바이러스의 배치로서, RSV F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하며, 배치 내의 아데노바이러스의 본질적으로 전부(예컨대, 적어도 90%)는 말단 뉴클레오티드 서열 CTATCTAT가 있는 게놈을 포함하는 것인, 재조합 아데노바이러스의 배치를 제공한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자는 RSV의 융합 전 F 단백질의 단편을 암호화할 수 있다. 단편은 아미노 말단 및 카르복시 말단 결실 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 기인할 수 있다. 결실의 정도는 예를 들면, 재조합 아데노바이러스의 더 양호한 산출을 달성하도록 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 단편은 F 단백질의 면역 활성 단편, 즉, 대상체에서 면역 반응을 일으킬 부분을 포함하도록 선택될 것이다. 이는 당업자에게 모두 일상적인 컴퓨터 내(in silico), 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 방법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
나아가, 본 발명은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 융합 전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 설명에 기술된 바와 같은 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물은 대상체에서 RSV의 감염 및/또는 복제를 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 바람직한 구현예에서, 조성물은 RSV에 대한 백신으로서의 사용을 위한 것이다. 용어 "백신"은 특정한 병원균 또는 질병에 대하여 대상체 내에서 치료적인 정도의 면역을 유도하기에 효과적인 유효 성분을 함유하는 작용제 또는 조성물을 지칭한다. 본 발명에서, 백신은 RSV의 F 단백질에 대해 면역 반응을 생성하는 유효한 양의, 서열 번호 1 또는 2를 포함하는 RSV 융합 전 F 단백질 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이는 입원하게 하는 심각한 하기도 질병을 방지하는 방법을 제공하고 대상체에서 RSV 감염 및 복제로 인한 폐렴 및 세기관지염과 같은 합병증들의 빈도를 감소시킨다. 따라서, 본 발명은 또한, RSV pre-F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 심각한 하기도 질병의 예방 또는 감소, 입원의 예방 또는 감소(예컨대, 단축) 및/또는 대상체에서 RSV에 의해 유발된 폐렴 또는 세기관지염의 빈도 및/또는 중증도의 감소 방법으로서, RSV F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 용어 "백신"은 그것이 약학적 조성물이고, 따라서 전형적으로 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함함을 내포한다. 백신은 추가적인 유효 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서 백신은, 예를 들어 RSV의 다른 단백질 및/또는 다른 감염성 작용제에 대한 면역 반응을 유도하는 다른 성분을 더 포함하는 조합 백신일 수 있다.
특정 구현예에서, 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물은 하나 이상의 애주번트를 더 포함하거나, 하나 이상의 애주번트와 함께 투여된다. 적용된 항원성 결정부위에 대한 면역 반응을 더 증가시키는 애주번트가 당해 분야에 알려져 있으며, 아데노바이러스 및 적당한 애주번트를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, 본 설명에 참조로 포함된 WO 2007/110409에 개시되어 있다. 용어 "애주번트" 및 "면역 자극제"는 본 설명에서 서로 교환 가능하게 사용되고, 면역계의 자극을 초래하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이러한 맥락에서, 애주번트는 본 발명의 RSV F 융합 전 F 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 사용된다. 적합한 애주번트의 예는 수산화 알루미늄 및/또는 인산 알루미늄 같은 알루미늄 염; MF59(예를 들어, WO 90/14837 참조)와 같은 스쿠알렌-물 에멀젼을 비롯한 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물); 예를 들어 Q21 및 면역 자극 복합체(ISCOMS)(예를 들어, US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620 참조)와 같은 사포닌 제형; 박테리아 또는 미생물 유도체, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-탈아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, 대장균 이열성 엔테로톡신 LT, 콜레라 독소 CT 등과 같은 ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이를 포함한다. 예컨대, 관심 항원으로 C4-결합 단백질(C4bp)의 올리고머화 도메인의 융합체를 암호화하는 이종 핵산을 이용함으로써, 벡터-암호화된 애주번트를 이용할 수도 있다(예컨대, 문헌[Solabomi et al, 2008, Infect Immun 76: 3817~23]). 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 애주번트로서 알루미늄을, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 인산 알루미늄 칼륨, 또는 이의 조합의 형태로, 용량당 알루미늄 함량 0.05 내지 5 mg, 예를 들어, 0.075 내지 1.0 mg의 농도로 포함한다.
다른 구현예에서, 조성물은 애주번트를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 조성물, 예컨대, 백신과 조합하여, 추가적인 유효 성분을 투여하는 것 또한, 본 발명에 따라 가능하다. 그러한 추가적인 유효 성분은 예컨대, 다른 RSV 항원 또는 이들을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 그러한 벡터는 다시 비-아데노바이러스성 또는 아데노바이러스성일 수 있으며, 이중 후자는 임의의 혈청형일 수 있다. 다른 RSV 항원의 예는 RSV F 또는 G 단백질 또는 이의 면역 활성 부분을 포함한다. 예를 들면, G 글리코단백질의 가용성 중심 도메인(아미노산 130 내지 230)을 발현시키는 비강 내로 적용되는 재조합 복제-결핍성 Ad5 계 아데노벡터 rAd/3xG는 쥐 모델에서 보호성이 있었으며(Yu et al, 2008, J Virol 82: 2350~2357), 근육 내로 적용되는 경우 보호성이 없었다고 하지만, 이 데이터로부터 RSV G는 보호성 반응을 유도하는데 적합한 항원이라는 점이 명백하다. 추가적인 유효 성분 또한, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충 등과 같은 다른 병원균들로부터의 비-RSV 항원을 포함할 수 있다. 추가적인 유효 성분의 투여는, 예를 들어 개별 투여에 의해 또는 본 발명의 백신 및 추가적인 유효 성분의 조합 제품을 투여하는 것에 의해 행하여질 수 있다. 특정한 구현예에서, (RSV.F 이외에도) 추가적인 비-아데노바이러스 항원은 본 발명의 벡터 내에서 암호화될 수 있다. 따라서, 특정한 구현예에서, 단일 아데노바이러스로부터 둘 이상의 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있으며, 그러한 경우, 예를 들면 더 많은 코딩 서열이 연결되어 단일 발현 카셋트로부터 단일 전사체를 형성할 수 있거나, 아데노바이러스 게놈의 상이한 부분에서 클로닝된 2개의 분리된 발현 카셋트 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물, 예컨대, 아데노바이러스 조성물은 대상체, 예컨대, 인간 대상체에 투여될 수 있다. 1회 투여하는 동안 대상체에 제공된 아데노바이러스의 총 용량은 숙련된 의사에게 공지된 바와 같이 다를 수 있으며, 일반적으로는 1x107 바이러스 입자(vp) 내지 1x1012 vp, 바람직하게는 1x108 vp 내지 1x1011 vp, 예를 들어, 3x108 및 5x1010 vp, 예를 들어, 109 내지 3x1010 vp이다.
조성물의 투여는 일반적인 투여 경로를 이용하여 수행될 수 있다. 비 제한적인 구현예는 예컨대, 피부 내, 근육 내 등, 또는 피하, 경피와 같은 주사에 의한 비경구 투여, 또는 예컨대, 비강 내, 경구 등의 점막 투여를 포함한다. 비강 내 투여는 일반적으로 RSV에 대한 백신을 위한 바람직한 경로로 간주되었다. 비강 내 생백신 전략(live intranasal strategy)의 가장 중요한 이점은 국소 기도 면역의 직접적인 자극 및 연관된 질병 강화의 결여이다. 현재 소아용으로 임상 평가 중인 유일한 백신은 비강 내 생백신이다(Collins and Murphy. Vaccines against human respiratory syncytial virus). In: Perspectives in Medical Virology 14: Respiratory Syncytial Virus (Ed. Cane, P.), Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp233~277). 비강 내 투여는 또한, 본 발명에 따른 적합한 바람직한 경로이다. 근육 내 투여의 이점은 간단하고 잘 확립되어 있으며, 6개월 미만의 영아에게서 비강 내 적용에 대한 안전성 우려가 없다는 점이다. 일 구현예에서 조성물은 근육 내 주사에 의해, 예를 들어 팔의 삼각근 또는 허벅지의 외측 광근 내로 투여된다. 당업자는 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 조성물, 예를 들어 백신을 투여하기 위한 다양한 가능성을 알고 있다.
본 설명에서 사용되는 대상체는 바람직하게는 포유류, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 목화쥐 또는 비 인간 영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상체는 인간 대상체이다. 대상체는 임의의 연령, 예컨대, 약 1개월 내지 100세, 예컨대, 약 2개월 내지 약 80세, 예컨대, 약 1개월 내지 약 3세, 약 3세 내지 약 50세, 약 50세 내지 약 75세 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 1종 이상의 조성물, 예컨대, 백신의 1회 이상의 추가 투여(booster administration)을 제공할 수 있다. 추가 백신 접종이 수행되면, 통상적으로, 그러한 추가 백신 접종은 조성물을 대상체에 최초로 투여(그러한 경우에, '초회 백신 접종(priming vaccination)'이라고 지칭함)한 이후에 동일한 대상체에 1주에서 1년 사이, 바람직하게는 2주에서 4개월 사이의 어느 한 순간에 투여될 것이다. 대안적인 추가 접종법들에서, 상이한 벡터, 예컨대, 상이한 혈청형의 하나 이상의 아데노바이러스, 또는 MVA와 같은 다른 벡터 또는 DNA 또는 단백질을 초회 백신 접종 이후에 대상체에 투여할 수도 있다. 예를 들어, 대상체에 초회 백신으로서 융합 전 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 투여하고, RSV F 단백질을 포함하는 조성물을 추가 접종할 수 있다. 특정 구현예에서, RSV F 단백질 또한, 융합 전 형태로 안정화된다.
특정 구현예에서, 투여는 초회 투여 및 적어도 1회의 추가 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 초회-추가 백신 접종 요법에서 초회 감작 조성물로서 및/또는 추가 감작 조성물로서 투여된다. 이의 특정 구현예에서, 초회 투여는 RSV pre-F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 rAd35('rAd35-RSV.pre-F')로서, 이때, RSV F pre-F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAd35로 하고, 추가 투여는 RSV F 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 rAd26('rAd26-RSV.pre-F')으로서, 이때, RSV pre-F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAd26으로 한다. 이의 다른 구현예에서, 초회 투여는 rAd26-RSV.pre-F로 하고 추가 투여는 rAd35-RSV.pre-F로 한다. 다른 구현예에서, 초회 및 추가 투여 둘 다는 rAd26.RSV.pre-F로 한다. 특정 구현예에서, 초회 투여는 rAd26-RSV.pre-F 또는 rAd35-RSV.pre-F로 하고 추가 투여는 RSV F 단백질로 한다. 이 모든 실시예에서, 동일하거나 다른 벡터 또는 단백질로 또 다른 추가 투여를 제공하는 것이 가능하다. RSV F 단백질을 이용한 추가 투여가 특히 이로울 수 있는 구현예로는 예컨대, 50세 이상의 (예컨대, COPD 또는 천식을 앓는) 위험 그룹의 노년 대상체에서, 또는 60세 이상 또는 65세 이상의 건강한 대상체에서의 구현예를 포함한다.
특정한 구현예에서, 투여는 또 다른 (추가) 투여 없는, 본 발명에 따른 조성물의 단일 투여를 포함한다. 그러한 구현예는 초회-추가 요법과 비교하여 단일 투여 요법의 복잡성 감소 및 비용 감소 측면에서 이점이 있다. 완전한 보호는 본 설명의 실시예에서 목화쥐 모델에서 추가 투여 없이 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터들의 단일 투여 이후에 이미 관찰된다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 RSV F 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 인간 아데노바이러스를 제공하는 단계, 상기 재조합 아데노바이러스를 숙주 세포의 배양물에서 증식시키는 단계, 재조합 아데노바이러스를 단리 및 정제하는 단계, 및 약학적으로 허용 가능한 조성물에 재조합 아데노바이러스를 존재하게 하는 단계를 포함하는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신의 제조 방법으로서, RSV F 단백질은 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신의 제조 방법을 제공한다.
재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스로 감염된 숙주 세포의 세포 배양물을 수반하는 주지된 방법에 따라, 숙주 세포들 내에서 제조되고 증식될 수 있다. 세포 배양은, 부착식 세포 배양, 예를 들어 배양 용기의 표면 또는 마이크로캐리어에 부착된 세포뿐 아니라, 현탁 배양을 포함하는 임의의 유형의 세포 배양일 수 있다.
대부분의 대규모 현탁 배양은 배치식 또는 유가식 공정으로 작동되는데, 이들이 작동 및 규모 확대가 가장 간단하기 때문이다. 요즘에는, 관류 원칙을 기반으로 한 연속 공정이 더 일반적이 되고 있으며, 또한 적합하다(예컨대, 본 설명에 참조로 포함되어 있으며, 대량의 재조합 아데노바이러스를 수득하고 정제하는 적합한 방법을 기재하고 있는 WO 2010/060719 및 WO 2011/098592 참조).
생산자 세포를 배양하여 세포 및 바이러스 수 및/또는 바이러스 역가를 증가시킨다. 세포 배양을 수행하여 세포가 물질대사 및/또는 성장 및/또는 분열 및/또는 본 발명에 따른 관심 바이러스를 생산할 수 있도록 한다. 이는 당업자에게 주지된 방법에 의하여 달성될 수 있으며, 예를 들면, 적절한 배양 배지 내에서 세포에 영양분을 제공하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 배양 배지는 당업자에게 주지되어 있으며, 일반적으로 대량의 상업적 원천들로부터 수득될 수 있거나 일반적인 프로토콜에 따라 주문 제작될 수 있다. 배양은, 예를 들어 접시, 회전 병 또는 생물반응기에서 배치식, 유가식, 연속 시스템 등을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)] 및 문헌[R.I.Freshney, Culture of animal cells: Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9] 참조).
통상적으로, 아데노바이러스는 배양물 내에서 적절한 생산자 세포에 노출되어 바이러스의 섭취를 허용할 것이다. 보통은, 최적의 교반은 약 50 내지 300 rpm이고, 전형적으로는 약 100 내지 200, 예컨대, 약 150이고, 전형적인 DO는 20 내지 60%, 예컨대, 40%이며, 최적 pH는 6.7 내지 7.7이고, 최적 온도는 30 내지 39℃, 예컨대, 34 내지 37℃이고, 최적 MOI는 5 내지 1000, 예컨대, 약 50 내지 300이다. 전형적으로, 아데노바이러스는 생산자 세포를 자발적으로 감염시키며, 생산자 세포를 rAd 입자와 접촉시키는 것은 세포의 감염에 충분하다. 일반적으로, 아데노바이러스 씨드 스톡은 배양물에 첨가되어 감염을 개시하고, 이어서 아데노바이러스가 생산자 세포 내에서 증식한다. 이는 당업자에게 모두 일상적인 것이다.
아데노바이러스의 감염 이후에, 바이러스는 세포 내부에서 복제되고, 이에 의하여 증폭되는데, 본 설명에서는 아데노바이러스의 증식으로 지칭되는 공정이다. 아데노바이러스 감염은 결국 감염되는 세포의 용해를 초래한다. 그러므로 아데노바이러스의 용해 특성은 바이러스 생산의 두 가지 상이한 모드를 가능하게 한다. 제1 모드는 세포를 용해시키는 외부 인자를 이용하여 세포 용해 이전에 바이러스를 수거하는 것이다. 제2 모드는 생산된 바이러스에 의하여 (거의) 완전한 세포 용해 이후에 바이러스 상청액을 수거하는 것이다(예컨대, 외부 인자에 의하여 숙주 세포들을 용해시키지 않고 아데노바이러스를 수거하는 것을 기재하고 있는 미국 특허 제6,485,958호 참조). 아데노바이러스를 수거하기 위하여 세포들을 활발하게 용해시키는 외부 인자를 이용하는 것이 바람직하다.
활성 세포 용해에 사용될 수 있는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 98/22588, p. 28~35에서 논의된 바 있다. 이러한 측면에서 유용한 방법은 예를 들어, 동결-해동, 고체 전단(solid shear), 고장성 및/또는 저장성 용해, 액체 전단(liquid shear), 초음파 처리, 고압 압출, 세제 용해(detergent lysis), 위의 조합 등이다. 본 발명의 일 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 세제를 이용하여 용해된다. 용해를 위한 세제 사용은 용이한 방법이고 용이하게 규모를 변경할 수 있다는 장점이 있다.
이용될 수 있는 세제 및 그것들이 사용되는 방식은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 몇몇 예는 예를 들어, WO 98/22588, p. 29~33에서 논의된다. 세제는 음이온성, 양이온성, 양쪽 이온성 및 비 이온성 세제를 포함할 수 있다. 세제의 농도는 예를 들면, 약 0.1% 내지 5%(w/w)의 범위 내에서 변할 수 있다. 일 구현예에서, 사용된 세제는 트리톤(Triton) X-100이다.
오염시키는 핵산, 즉, 대부분 생산자 세포로부터의 핵산을 제거하기 위하여 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 본 발명의 용도에 적합한 예시적인 뉴클레아제로는 벤조나아제(Benzonase®), 풀모자임(Pulmozyme®) 또는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 임의의 기타 DNA 분해효소 및/또는 RNA 분해효소가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제는 벤조나아제인데, 이것은 특정한 뉴클레오티드 사이에서 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 핵산을 신속하게 가수분해하여 세포 용해물의 점도를 감소시킨다. 벤조나아제는 Merck KGaA(코드 W214950)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 뉴클레아제가 이용되는 농도는 바람직하게는 1 내지 100 단위/ml의 범위 내에 있다. 대안적으로, 또는 뉴클레아제 처리에 더하여, 브롬화 도미펜과 같은 선택적인 침전제를 이용하여, 아데노바이러스 정제를 하는 동안에 아데노바이러스 제제로부터 숙주 세포 DNA를 선택적으로 침전시킬 수도 있다(예컨대, 미국 제7,326,555호; Goerke et al., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12~21; WO 2011/045378; WO 2011/045381 참조).
생산자 세포의 배양물로부터 아데노바이러스를 수거하는 방법은 WO 2005/080556에 광범위하게 기재되어 있다.
특정한 구현예에서, 수거된 아데노바이러스는 더 정제된다. 아데노바이러스의 정제는 정화, 한외여과, 정용여과 또는 예를 들어, 본 설명에 참조로 포함된 WO 05/080556에 기재된 바와 같은 크로마토그래피로의 분리를 포함하는 여러 단계로 수행될 수 있다. 정화는 여과 단계에 의하여 수행되어, 세포 용해물로부터 세포 잔해 및 기타 불순물을 제거할 수 있다. 한외여과는 바이러스 용액을 농축시키는데 이용된다. 정용여과, 또는 울트라필터(ultrafilter)를 이용한 완충액 교환은 염, 당 등의 제거 및 교환을 위한 방법이다. 당업자는 각 정제 단계에 대한 최적 조건을 찾는 법을 안다. 또한, 본 설명에 전체가 참조로 포함된 WO 98/22588은 아데노바이러스 벡터의 생산 및 정제 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 숙주 세포를 키우는 단계, 숙주 세포를 아데노바이러스로 감염시키는 단계, 숙주 세포를 수거하고 용해시키는 단계, 미정제 용해물을 농축하는 단계, 미정제 용해물의 완충액을 교환하는 단계, 용해물을 뉴클레아제로 처리하는 단계 및 크로마토그래피를 이용하여 바이러스를 더 정제하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 정제는 예를 들어, WO 98/22588, p. 61~70에 논의된 바와 같이, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 이용한다. 아데노바이러스의 추가적인 정제에 대해 많은 공정이 기재되어 있으며, 크로마토그래피 단계는 이 공정에 포함된다. 당업자는 이들 공정을 인식할 것이며, 공정을 최적화하는 크로마토그래피 단계를 이용하는 정확한 방법을 바꿀 수 있다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의하여 아데노바이러스를 정제할 수 있으며, 예를 들어, WO 2005/080556 및 문헌[Konz et al, 2005, Hum Gene Ther 16: 1346~1353]을 참조한다. 기타 여러 아데노바이러스 정제 방법이 기재되어 있으며, 당업자의 역량 내에 있다. 아데노바이러스를 생산하고 정제하는 추가적인 방법은 예를 들어, 본 설명에 모두 참조로 포함되어 있는, WO 00/32754; WO 04/020971; US 5,837,520; US 6,261,823; WO 2006/108707; 문헌[Konz et al, 2008, Methods Mol Biol 434: 13~23; Altaras et al, 2005, Adv Biochem Eng Biotechnol 99: 193~260]에 개시되어 있다.
인간에게 투여하기 위하여, 본 발명은 rAd 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 담체 또는 부형제가 이용되는 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상체에 임의의 원치 않거나 유해한 효과를 야기하지 않을 것임을 의미한다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 당해 분야에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조). 정제된 rAd는 동결건조된 제제를 활용할 수 있음에도 불구하고, 바람직하게는 멸균 용액으로 제형화되고 투여된다. 무균 용액은 무균 여과에 의해 또는 당해 분야에 그 자체로 공지된 기타 방법에 의해 제조된다. 이어서, 용액은 동결건조되거나 약제 투약 용기에 채워진다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. rAd는 전형적으로 적합한 약학적으로 허용 가능한 완충액을 갖는 용액 내에 있으며, rAd의 용액은 염도 함유할 수 있다. 선택적으로 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서는, 세정제가 첨가된다. 특정한 구현예에서, rAd는 주사 가능한 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 rAd의 유효량을 함유하고, 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 버전 중 어느 하나이며, 선택적으로는 안정화제 또는 부형제를 함유한다. 아데노바이러스 백신은 비강 내 투여를 위해 에어로졸화될 수도 있다(예컨대, WO 2009/117134 참조).
예를 들어, 아데노바이러스는 아데노바이러스 세계 표준(Adenovirus World Standard)용으로도 이용되는 완충액 내에 저장될 수 있다(Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p. 43~48): 20 mM 트리스(Tris) pH 8, 25 mM NaCl, 2.5% 글리세롤. 인간에 투여하기 적합한 다른 유용한 제형 완충액은 20 mM 트리스, 2 mM MgCl2, 25 mM NaCl, 수크로오스 10% w/v, 폴리소르베이트-80 0.02% w/v이다. 명백하게는, 기타 여러 완충액이 이용될 수 있으며, 저장에 적합한, 그리고 정제된 (아데노)바이러스 제제의 약학적 투여에 적합한 제형의 몇 가지 예는 예를 들어, 유럽 특허 제0853660호, 미국 특허 제6,225,289호 및 국제 특허 출원 WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763, WO 03/078592, WO 03/061708에서 찾을 수 있다.
본 발명은 다음 실시예에서 추가적으로 설명된다. 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명확하게 하도록 제공된다.
실시예
실시예 1.
RSV F 단백질의 융합 전 형태로의 안정화
기본적인 RSV F 서열을 암호화하는 플라스미드를 합성하고, 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 아미노산 치환을 단백질에 도입하였다. 단백질 변이체를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 유세포 계측법으로 세포 표면에서의 상대적인 단백질 발현을 평가하였다. 융합 전 형태에서의 F 단백질의 안정성을 열 안정성 분석법으로 평가하였다.
RSV A2 F 단백질 변이체용으로 사용된 단백질 서열은 GenBank 등록번호 ACO83301.1로부터 검색하였다. 부위 특이적 돌연변이 유도에 의해 아미노산 치환을 서열에 도입하였다(QuikChange II XL 부위 특이적 돌연변이 유도 키트, 애질런트 테크놀로지스(Agilent technologies)). 온라인 툴 프라이머 엑스(PrimerX)를 이용하여 돌연변이 유도 프라이머를 설계하였다. HEK293T 세포(CRL-11268)를 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection)으로부터 구입하여 일반적인 세포 배양 조건((37℃, 10% CO2) 하에서 배양하였다.
중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역을 단일 IgG1 발현 벡터에 클로닝하여 완전히 인간형의 IgG1 항-RSV F 단백질 항체 CR9501 및 CR9503을 구축하였다. IgG1 발현 구성체로 PER.C6® 세포(Crucell)를 형질감염시키고, 발현된 항체를 포러스 Mab포획 A 크로마토그래피(POROS Mabcapture A chromatography, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 이용하여 세포 상청액으로부터 정제한 다음, 50mM NaAc, 50mM NaCl, pH 5.5로 완충액 교환하였다. 280 nm에서의 광흡수에 의해 항체 농도를 측정하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), SDS-PAGE 및 등전점 전기영동에 의해 항체 품질을 확인하였다. 항체 CR9501은 융합 전 형태의 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하지만, 융합 후 형태에는 그렇지 않은 (WO2011/020079에 기술된 바와 같은) 58C5의 VH 및 VL 영역을 포함한다. CR9503은 RSV F의 융합 전 및 융합 후 형태 둘 다를 인식하는 모타비주맙(motavizumab)의 VH 및 VL 영역을 포함한다.
단백질 발현 및 온도 처리:
공급업체의 권고에 따라 293펙틴(Cat# 12347-019) 형질감염 시약(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))을 이용하여 부착형 HEK293T 세포에 플라스미드를 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, EDTA를 함유하는 FACS 완충액(트립신 없음, 다음 섹션 참고)으로 분리하여 세포를 수거하고, 온도 안정성 실험을 위해 세포 현탁액을 수조 또는 PCR 블록 중 어느 하나에서 10분 동안 열 처리하였다. 열 처리 후, 유세포 계측법 분석을 위해 세포를 준비하였다.
아데노 발현된 F 단백질 분석을 위해, 10 000 또는 5000의 MOI의 Ad26 바이러스 및 5000, 2500 또는 1.250의 MOI의 Ad35 바이러스로 A549 세포를 감염시켰다. 48시간 후, 세포를 분리하고 37℃, 50℃ 및 56℃에서 15분 동안 열 처리하였다. 열 처리 시, CR9501-알렉사(Alexa)647 또는 CR9503-알렉사647 및 프로피디움 요오드화물(PI)을 이용하여 세포를 염색하였다. 염색 후, 세포를 고정시키고, BD FACS CANTO II 세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
유세포 계측 분석:
각각의 염색을 위하여, 다음의 대조군을 포함시켰다: 1) 음성 대조군 샘플, 즉, 임의의 처리의 대상이 되지 않았으며, 형광단으로 표지된 임의의 항체로 염색되지 않은 세포; 2) 양성 대조군 샘플, 즉, 오로지 하나의 형광단(실험에 사용되는 각각 중 하나)으로 염색된 세포.
세포를 유세포 계측법(FC 완충액, 5mM EDTA, PBS 중 1% FBS)에 재현탁시키고, 뚜껑이 있는 96웰 플레이트(U- 또는 V-바닥 플레이트)에 웰당 50 μl 부피의 세포 현탁액을 분배하였다. 염색을 위해 2단계 또는 1단계 프로토콜을 사용하였다.
2단계 프로토콜의 경우, 1차 항체(또는 음성 대조군용 완충액) 50 μl를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 비오틴 첨가된 CR9501 및 CR9503을 2 μg/ml(웰에서의 최종 농도 1 μg/ml)로 사용하였다. 인큐베이션 후, 세포를 FC 완충액으로 2회 세척하였다. 그 후, 50 μl의 스트렙타비딘-APC(몰레큘라 프로브(Molecular Probes) cat#SA1005, 0.1 mg/ml을 1:100으로 사용함) 또는 음성 대조군을 위한 완충액을 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 다시 FC 완충액으로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 100 μl의 FC 완충액 +/- 생-사 염색제(인비트로젠(Invitrogen)의 PI, cat#P1304MP, 2 μg/ml의 농도로 사용)에 재현탁시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 200 g(1000 rpm)에서 5분 동안 원심분리하고, PI가 있는 완충액을 제거하고, 세포를 150 μl의 FC 완충액에 재현탁시켰다.
1단계 프로토콜의 경우, 제조업체의 설명에 따라 CR9501 및 CR9503 항체를 형광 프로브 알렉사647(몰레큘라 프로브, cat#A-20186)로 표지하였다. 스트렙타비딘-APC 단계를 제외하고 위의 프로토콜에 따라 세포를 염색하였다.
생 세포 집단으로부터, CR9501/CR9503 항체 결합에 대해 양성인 세포의 백분율을 결정하였다. CR9503 결합에 대해 양성인 세포는 그 표면 상에 RSV F 단백질을 발현한다. CR9501 결합에 대해 양성인 세포는 그 표면 상에 융합 전 RSV F를 발현한다.
항체 염색의 강도(중간 형광 강도 - MFI)는 세포 표면 상의 F 단백질의 양에 비례한다. F 단백질을 발현하는 생 세포 집단으로부터 MFI를 계산하였다.
결과
전체 길이 F 단백질 변이체의 표면 세포 발현:
융합 전 형태에서 RSV F 단백질 엑토도메인의 발현 또는 안정성을 증가시키는 것으로 이전에 확인된 돌연변이 서브세트를 야생형 전체 길이 RSV A2 F 서열(등록번호 Genbank ACO83301)에 도입하였다. 돌연변이를 단독으로 또는 다수의 조합으로 도입하였고, 단백질 발현 및 안정성에 미치는 영향을 평가하였다.
융합 전 및 융합 후 F 단백질 둘 다를 인식하는 CR9503 항체로 염색한 후, 단백질의 발현 수준을 유세포 계측법에 의해 평균 형광 강도(MFI)로서 측정하였다. 가용성 RSV pre-F 단백질의 안정성에 대해 이전에 설명하였던 두 개의 아미노산 치환의 조합(즉, N67I 및 S215P) 또한, 야생형 전체 길이 RSV F에 대해, 전체 길이 RSV F 단백질의 발현 수준을 2.3배 증가시켰다.
3개의 아미노산 치환이 조합된 변이체에 대해서는 눈에 띄는 발현 증가가 관찰되었다. 흥미롭게도, 하나의 변이체 내에서 세 가지가 넘는 돌연변이의 조합은 단백질 발현을 더 증가시키지 않았다. 이는 여러 F 단백질 카피를 수용하는 세포막의 제한된 용량 때문일 수 있다.
융합 전 특이적 항체 CR9501로의 염색으로 세포 표면 상의 융합 전 F의 양을 평가하였다(도 3). 모든 F 변이체로의 세포의 형질 감염은 세포 표면 상에서 다소 비슷한 양의 융합 전 F 단백질을 가져왔다. 막관통 도메인의 존재는 전체 길이의 단백질을 어느 정도 안정화하며, 따라서 융합 전 안정성의 차이는 주위 조건 하에서는 전체 길이 F 단백질 사이에서 분명하지 않다. 따라서, 아래 기술된 바와 같이, 전체 길이 변이체의 안정성을 더 잘 구별하기 위하여 열 안정성 분석법을 개발하였다.
이전에 기술된 F 단백질 변이체에 대해 모 서열로서 사용되었던 A2 균주(WO2014/174018 및 WO2014/202570)는 두 가지의 독특하고 희귀한 돌연변이(즉, 리신 66 및 이소류신 76의 돌연변이)를 축적한 세포주 적응 실험실 균주이다. 본 발명에서, 이들 두 잔기는 천연 임상 분리물과 매치되도록 돌연변이되었다(K66E, I76V). K66E 및 I76V 돌연변이를 선택된 단백질 설계에 포함하였다. Lys66 및 Ile76을 가진 변이체와 비교하여, 66번 위치에 글루탐산(K66E)이 있는 변이체는 약간 더 많이 발현되는 경향이 있다. 76번 잔기에서의 발린의 부가(K66E 및 I76V의 이중 치환)는 K66E 치환을 단독으로 갖는 변이체와 비교하였을 때 발현 수준에 영향을 미치지 않는다(도 4).
세포 표면 상의 전체 길이 F 단백질 변이체의 안정성:
단시간 규모의 주위 조건에서는 상이한 안정화 돌연변이의 조합을 가진 전체 길이 F 변이체 사이에서 융합 전 형태의 안정성에 있어서 유의미한 차이가 전혀 관찰되지 않았다. 상승된 온도는 융합 전으로부터 융합 후 형태로의 RSV F 단백질의 재접힘을 위한 효율적인 시험관 내 방아쇠로 기능한다고 알려져 있다. 따라서, 열 충격 분석법을 확립하여 막결합 전체 길이 단백질의 안정성을 평가하는 데에 이용하였다. 간략히 설명하면, HEK293T 세포를 F 단백질 구성체로 형질감염시키고, 형질감염 48시간 후 분석에 사용하였다. 세포 배양 접시로부터 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 10분 동안 증가하는 온도에서 열 처리하였다. 열 처리 후, 세포를 항-RSV F 항체로 염색하고, 유세포 계측법으로 분석하였다. 유세포 계측법 데이터를 두 가지 상이한 방법으로 분석하였다. 항-F 항체로의 염색에 대해 양성인 세포의 백분율을 분석하였고, 양성 세포의 평균 형광 강도(MFI)도 계산하였다(도 5).
CR9501(융합 전 F 단백질만을 인식하는 항체) 및 CR9503(융합 전 및 융합 후 F 단백질 둘 다를 인식하는 항체)으로의 염색 둘 다를 유세포 계측 분석에 사용하였다. CR9503 항체는 양성 대조군으로 기능하였다. F 단백질이 융합 전 형태를 상실하지만 여전히 세포의 표면에 존재할 경우, 이 단백질은 여전히 CR9503 항체로 검출된다. 두 항체로의 염색의 손실은 단백질이 예컨대, 응집으로 인해 세포 표면 상에서 항체 결합에 이용될 수 없음을 의미한다.
세 가지 이상의 아미노산 치환이 있는 전체 길이 단백질을 이 분석에서 시험하였고, 야생형 RSV F와 비교하였다. 이들 변이체의 발현이 가장 높았고, 따라서 이들 변이체가 바람직한 후보였다. 이 단백질 전부가 N67I 및 S215P 치환을 함유하였고, 하나 또는 두 개의 추가적인 안정화 돌연변이가 부가되었다.
변형되지 않은 야생형 단백질은 꽤 안정적인 CR9503 항체 염색을 나타냈다. CR9503 염색의 MFI는 더 높은 온도에서 높아졌으나, 값의 퍼짐성 또한 매우 높았다. 이는 열 충격 후 어떠한 단백질 응집도 일어나지 않았음을 나타낸다. 증가하는 온도에서의 열 충격 후 야생형 F 샘플에 대한 감소된 CR9501 결합으로 증명된 바와 같이, 융합 전 형태의 절반이 대략 55℃에서 세포를 인큐베이션 한 후에 상실되었고, 60℃에서의 인큐베이션 후에는, 모든 융합 전 형태가 상실되었다.
시험한 모든 융합 전 F 단백질 변이체는 야생형 RSV F보다 안정적이어서, CR9501 염색 대부분이 더 높은 온도에서의 처리 후에도 유지되었다(도 5 및 도 6). K498R 아미노산 치환이 있는 단백질은 나머지보다 덜 안정적이었다. K66E 돌연변이의 첨가는 K498R 아미노산 치환이 있는 변이체가 다른 변이체만큼 안정적이 되었으므로 단백질을 더 안정화시켰으며, 융합 전 형태의 손실은 60℃에서 전혀 관찰되지 않았다. 선택된 안정화 돌연변이 조합만을 K66E 및 I76V과 조합하여 시험하였다. 네 가지의 시험한 단백질 모두가 양성 세포의 백분율을 분석했을 때 안정적이었으나, MFI를 분석하였을 때, K498R이 있는 변이체가 60℃ 처리 후 CR9501 결합에서 분명한 감소를 보여, 이 변이체가 온도 스트레스 분석에서 평가했을 때 덜 안정적임을 나타낸다.
결론적으로, 세 가지의 (N67I 및 S215P를 포함하는) 안정화 돌연변이의 조합은 높은 발현 수준 및 안정성에 충분한 것으로 간주되었다. S46G 또는 D486N 돌연변이를 단백질 구조에서의 위치 때문에 제3의 안정화 돌연변이로 선택하였다. K66E 및 I76V는 단백질 발현 및 안정성에는 부정적인 영향을 미치지 않았지만, 서열을 자연 발생적인 것에 가깝게 만들었으므로, 포함시켰다.
따라서, 돌연변이 K66E, N67I, I76V, S215P 및 D486N이 있는 융합 전 RSV F 단백질(F2.2)(서열 번호 2) 및 돌연변이 K66E, N67I, I76V, S215P 및 S46G가 있는 융합 전 RSV F 단백질(F2.1)(서열 번호 1)을 아데노바이러스 벡터의 구축을 위해 선택하였다. 이들 단백질은 최대 60℃까지의 온도 안정성 분석에서 융합 전 형태로 안정적이며, 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2.
아데노바이러스 벡터의 제조
RSV F 유전자의 Ad35 및 Ad26의 E1 영역으로의 클로닝:
본 발명의 융합 전 F 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 인간 발현을 위해 유전자 최적화하였고, Geneart에 의해 합성하였다. Kozak 서열(5' GCCACC 3')을 ATG 개시 코돈 바로 앞에 포함시키고, 두 개의 정지 코돈(5' TGA TAA 3')을 RSV pre-F 코딩 서열의 말단에 부가하였다. RSV.pre-F 유전자를 HindIII 및 XbaI 자리를 통해 pAdApt35BSU 플라스미드 및 pAdApt26 플라스미드 내에 삽입하였다.
세포 배양:
PER.C6 세포(Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-1917)는 10 mM MgCl2가 첨가된, 10% 우태 혈청(FBS) 함유 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다.
아데노바이러스 생성, 감염 및 계대 배양:
모든 아데노바이러스를 단일 상동 재조합에 의하여 PER.C6® 세포에서 생성하였으며, 이전에 기술된 바와 같이 생산하였다(rAd35의 경우: Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; rAd26의 경우: Abbink et al., 2007, J. Virol. 81: 4654~4663). 간략하게는, 제조업체(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 제공한 지침에 따라 리포펙타민을 사용하여 PER.C6 세포를 Ad 벡터 플라스미드로 형질감염시켰다. 예컨대, RSV.pre-F 이식 유전자 발현 카세트를 전달하는 Ad35 벡터의 구조를 위해, pAdApt35BSU.RSV.pre-F 플라스미드 및 pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6 코스미드를 사용하였고, RSV.pre-F 이식 유전자 발현 카세트를 전달하는 Ad26 벡터를 위해서는, pAdApt26.RSV.pre-F 플라스미드 및 pWE.Ad26.dE3.5orf6.코스미드를 사용하였다. 완전 CPE 1일 후 세포를 수확하였고, 동결-해동하고, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, -20℃에 저장하였다. 다음으로, 바이러스를 플라크 정제하였고, 멀티웰 24 조직 배양 플레이트의 단일 웰에서 배양된 PER.C6 세포에서 증폭시켰다. T25 조직 배양 플라스크 및 T175 조직 배양 플라스크를 이용하여 배양된 PER.C6에서 추가적인 증폭을 수행하였다. T175 미정제 용해물 중에서, 3 내지 5 ml를 이용하여 PER.C6 세포의 70% 컨플루언트(confluent) 층을 함유하는 20 x T175 3중 층 조직 배양 플라스크에 접종하였다. 바이러스를 2단계 CsCl 정제 방법을 사용하여 정제하였다. 최종적으로, 바이러스를 -85℃에서 분취하여 저장되었다.
실시예 3.
융합 전 RSV F를 발현하는 재조합 아데노바이러스 혈청형 26 및 35를 이용한 생체 내 RSV F에 대한 면역 유도
Ad26.RSV.preF2.1 및 Ad26.RSV.preF.2.2의 면역원성을, 동일한 용량의 Ad26.RSV.FA2(즉, 야생형 RSV F 단백질 발현)에 의해 유도된 반응에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응을 비교하여 마우스에서 평가하였다. Balb/c 마우스(그룹당 n=4)를 108 내지 1010 바이러스 입자(vp) Ad26.RSV.FA2 또는 Ad26.RSV.preF2.1 또는 Ad26.RSV.preF2.2의 표시된 용량으로, 또는 제형 완충액으로 면역화하였다. 초회 면역화 8주 후에, 106개의 비장세포당 RSV F A2 특이적 IFNγ 점 형성 단위(SFU)의 수를 ELISpot을 이용하여 측정하였다. Ad26.RSV.preF2.1과 Ad26.RSV.preF.2.2는 광범위한 중화능과 함께, Ad26.RSV.FA2와 비교하여 마우스에서 증가된 체액성 면역 반응을 유도하였고, 세포성 반응을 유지한 것으로 밝혀졌다. Ad26.RSV.preF2.1 및 Ad26.RSV.preF.2.2를 이용한 단일 근육 내 면역화는 IFNγ, IL2 및/또는 TNFα(데이터 미도시)에 양성인 CD8+ T 세포의 유도를 특징으로 하는 세포성 반응을 유도하였다(도 7).
세포성 반응의 양과 질은 Ad26.RSV.preF2.1, Ad26.RSV.preF.2.2 및 Ad26.RSV.FA2 사이에서 비슷하였다. 대조적으로, Ad26.RSV.preF2.1 및 Ad26.RSV.preF.2.2는 Ad26.RSV.FA2보다 유의미하게 더 높은 RSV 중화 항체 역가를 유도하였다. 항체 반응을 더 자세히 분석한 결과, Ad26.RSV.preF2.1 및 Ad26.RSV.preF.2.2가 융합 전 F에 대하여 더 높은 수준의 항체를 유도한 반면, 융합 후 F 역가는 Ad26.RSV.FA2와 비슷하게 유지되어, 유의미하게 증가된 preF/postF 항체 비율을 가져왔다. 또한, 항체 반응의 IgG2a/IgG1 비율은 바뀌지 않은 채 유지되어, Ad26.RSV.FA2에 대해 이전에 증명된 바와 비슷한 체액성 반응의 Th1 왜곡을 증명하였다(도 8).
Ad26.RSV.preF2.2의 경우, 유도된 항체가 Ad26.RSV.FA2에 대해 관찰된 바(도 9)와 유사하게, 다양한 RSV A 및 B 균주, 실험실 균주 및 임상 분리물을 중화시킬 수 있음이 더 증명되었다.
이어서, Ad26.RSV.preF2.2 및 Ad35.RSV.preF2.2 벡터 구성체의 효능 및 면역원성을 목화쥐 모델에서 평가하였다. 이 동물은 인간 RSV의 복제를 허용하며, 폐에서의 피크 RSV 역가는 4일과 5일째에 나타난다. 실험에서의 대조군은 낮은 용량의 RSV A2로 비강 내 감염시킨 그룹을 포함하여 자연적인 노출을 모방하였고, 목화쥐에서 강화된 호흡기 질환(enhanced respiratory disease, ERD)을 유도하는 것으로 밝혀진 희석액에서 임상 연구에서 ERD를 유도한 본래의 로트 100을 이용하여 FI-RSV로 면역화한 그룹을 포함하였다.
105 내지 108 vp/마리 범위 용량의 Ad26.RSV.preF2.2 , 또는 106 내지 109 vp/마리 범위 용량의 Ad35.RSV.preF2.2로의 동물의 1회 근육 내 면역화는 105 vp Ad26.RSV.preF2.2로 면역화된 3마리의 동물을 제외하고는 백신 동종성 RSV A2 균주 감염으로부터 폐의 완전한 보호를 가져왔다(도 10A 및 도 10B). 코에서의 RSV 복제의 용량 의존적 보호는 두 벡터 모두에서 관찰되었다. 이의 범위는 Ad26.RSV.preF2.2의 경우, 108 vp/마리에서의 완전 보호로부터 105 vp에서의 부분 보호까지인 반면, Ad35.RSV.preF2.2의 경우, 109 vp로 면역화된 동물의 코는 RSV A2로부터 완전히 보호되었고, 106 vp는 부분적인 보호를 가져왔다(도 10C 및 10D). 용량 전체에 걸쳐 분석했을 때, Ad26.RSV.preF2.2 및 Ad35.RSV.preF2.2로 면역화된 동물의 코는 각각의 야생형 F 대응물인 Ad26.RSV.FA2 및 Ad35.RSV.FA2로 면역화했을 때보다 RSV A2 감염으로부터 더 잘 보호되었다(p=0.0003 및 p=0.0001). RSV 감염으로부터의 보호는 적용된 가장 낮은 용량의 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2에 의해 이미 유도된 RSV A Long에 대하여 용량 의존적인 바이러스 중화 역가의 유도를 수반하였다(도 10E 및 도 10F). VNA A Long 역가의 용량 전체에 걸친 통계적인 비교 결과, Ad26.RSV.preF2.2가 Ad26.RSV.FA2보다 면역원성이 높았으나(p=0.0414), VNA 역가의 유도는 Ad35.RSV.preF2.2 및 Ad35.RSV.FA2 사이에서 유의미하게 다르지 않은 것으로 드러났다.
추가적으로, Ad26.RSV.preF 및 Ad35.RSV.preF는 시험한 임의의 농도에서, RSV A2 시험감염 후, 강화된 호흡기 질환(ERD)의 조직병리학적 징후를 유도하지 않는 것으로 증명되었다. 목화쥐는 ERD를 모니터하는 데 가장 많이 사용되고 가장 잘 연구된 모델이다. 이 동물 모델에서 FI-RSV로의 백신 접종은 일관되게 RSV 시험감염 후 ERD를 유도하는데, 이는 주로 호중구 침윤물로 구성된 폐포염 및 주로 림프구 침윤물로 구성된 세기관지주위염과 같은 파라미터에 대한 감염된 폐 절편의 조직병리학적 분석에 의해 알아볼 수 있다. 목화쥐에서,이들 파라미터에 대한 FI-RSV에 의해 유도된 점수는 RSV 감염 후 1일부터 관찰될 수 있고, RSV 시험감염 후 4 내지 5일째에 피크를 이룰 수 있다.
폐 염증성 변화의 네 가지 파라미터(세기관지주위염, 혈관주위염, 간질성 폐렴, 폐포염)를 점수화하여 RSV A2 시험감염 5일 후에 ERD를 분석하였다. FI-RSV로의 면역화 결과, 대부분의 조직병리학적 마커에 대한 점수가 향상되었는데, 이전에 ERD의 가장 두드러진 마커로 밝혀진 마커인 폐포염에 대해 특히 분명하였다(도 11). 낮은 친화도 및/또는 낮은 수준의 항체를 유도할 수 있는 낮은 백신 용량에서조차 RSV 시험감염 이후 초회 감작 단독(prime-only) 요법에서 Ad26.RSV.preF2.2 또는 Ad35.RSV.preF2.2에 의해 면역화된 동물에서는 폐포염 또는 임의의 기타 ERD 조직병리학적 마커의 증가가 관찰되지 않았다(도 11). 이것은 Ad26.RSV.FA2 및 Ad35.RSV.FA2 벡터를 사용한 본 발명자들의 이전의 결과를 확인해준다.
따라서, 본 발명에 따르면, Ad26.RSV.preF 및 Ad35.RSV.preF는 융합 전 형태로 안정화된 RSV F A2를 발현하는 강력한 아데노 바이러스 벡터임이 밝혀졌다. 이들 벡터는 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도한다. 유도된 면역 반응은 RSV A2 시험감염에 대한 보호적이며, RSV의 임상 및 실험실 분리물에 대해 시험관 내에서 광범위한 바이러스 중화를 제공한다. 백신 접종된 동물의 RSV 노출 후 목화쥐에서 ERD 유도가 관찰되지 않았고, 따라서 야생형 RSV F A2 항원을 암호화하는 Ad26 및 Ad35로 생성된 데이터를 확인시켜 준다. 마우스도 목화쥐도 Ad26.RSV.preF 또는 Ad35.RSV.preF를 주사한 후에 반응원성의 명시적인 징후를 보이지 않았다.
| 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 RSV 융합 전 F 단백질의 아미노산 서열(돌연변이는 밑줄침) |
| 서열 번호 1: RSV preF2.1 아미노산 서열: |
 |
| 서열 번호 2: RSV preF2.2 아미노산 서열: |
 |
| 본 발명의 바람직한 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 |
| 서열 번호 3: RSV F pre-F2.1 융합 전 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵 |
  |
| 서열 번호 4: RSV F pre-F2.2 융합 전 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 |
 |
SEQUENCE LISTING
<110> Crucell Holland B.V.
<120> Vaccine against RSV
<130> 0270 EP P00 PRI
<140> EP16163807
<141> 2015-04-05
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV preF2.1 amino acid sequence
<400> 1
Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe
20 25 30
Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Gly Ala Leu
35 40 45
Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile
50 55 60
Lys Glu Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu
85 90 95
Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro
100 105 110
Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
130 135 140
Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu
145 150 155 160
Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys
165 170 175
Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val
180 185 190
Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn
195 200 205
Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln
210 215 220
Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu
245 250 255
Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys
260 265 270
Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile
275 280 285
Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro
290 295 300
Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro
305 310 315 320
Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg
325 330 335
Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe
340 345 350
Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp
355 360 365
Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val
370 375 380
Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr
385 390 395 400
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405 410 415
Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile
420 425 430
Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp
435 440 445
Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly
450 455 460
Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro
465 470 475 480
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485 490 495
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<212> DNA
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<223> codon optimized nucleic acid encoding the RSV F pre-F2.1
pre-fusion protein
<400> 3
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tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gagttctacc agagcacctg cagcgccgtg 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon optimized nucleic acid encoding the RSV F pre-F2.2
pre-fusion protein
<400> 4
atggagctgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc cgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gagttctacc agagcacctg cagcgccgtg 120
agcaagggct acctgagcgc cctgagaacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgagcaaca tcaaggagat caagtgcaac ggcaccgacg ccaaggtgaa gctgatcaag 240
caggagctgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc 300
cccgccacca acaacagagc cagaagagag ctgcccagat tcatgaacta caccctgaac 360
aacgccaaga agaccaacgt gaccctgagc aagaagagaa agagaagatt cctgggcttc 420
ctgctgggcg tgggcagcgc catcgccagc ggcgtggccg tgagcaaggt gctgcacctg 480
gagggcgagg tgaacaagat caagagcgcc ctgctgagca ccaacaaggc cgtggtgagc 540
ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtgctgg acctgaagaa ctacatcgac 600
aagcagctgc tgcccatcgt gaacaagcag agctgcagca tccccaacat cgagaccgtg 660
atcgagttcc agcagaagaa caacagactg ctggagatca ccagagagtt cagcgtgaac 720
gccggcgtga ccacccccgt gagcacctac atgctgacca acagcgagct gctgagcctg 780
atcaacgaca tgcccatcac caacgaccag aagaagctga tgagcaacaa cgtgcagatc 840
gtgagacagc agagctacag catcatgagc atcatcaagg aggaggtgct ggcctacgtg 900
gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960
ctgtgcacca ccaacaccaa ggagggcagc aacatctgcc tgaccagaac cgacagaggc 1020
tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgagc ttcttccccc aggccgagac ctgcaaggtg 1080
cagagcaaca gagtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgcccag cgaggtgaac 1140
ctgtgcaacg tggacatctt caaccccaag tacgactgca agatcatgac cagcaagacc 1200
gacgtgagca gcagcgtgat caccagcctg ggcgccatcg tgagctgcta cggcaagacc 1260
aagtgcaccg ccagcaacaa gaacagaggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320
tacgtgagca acaagggcgt ggacaccgtg agcgtgggca acaccctgta ctacgtgaac 1380
aagcaggagg gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440
ctggtgttcc ccagcaacga gttcgacgcc agcatcagcc aggtgaacga gaagatcaac 1500
cagagcctgg ccttcatcag aaagagcgac gagctgctgc acaacgtgaa cgccgtgaag 1560
agcaccacca acatcatgat caccaccatc atcatcgtga tcatcgtgat cctgctgagc 1620
ctgatcgccg tgggcctgct gctgtactgc aaggccagaa gcacccccgt gaccctgagc 1680
aaggaccagc tgagcggcat caacaacatc gccttcagca actga 1725
Claims (17)
- 융합 전 형태에서 안정화된 RSV F 단백질(융합 전 RSV F 단백질)을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 인간 재조합 아데노바이러스 벡터로, RSV F 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 인간 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에서의 결실, E3 영역에서의 결실 또는 E1 및 E3 영역 둘 다에서의 결실을 가지며, 아데노바이러스는 혈청형 26인 것인, 벡터.
- 제1항에 따른 벡터를 포함하는, 대상체에서의 RSV 감염 및/또는 복제 감소용 약학 조성물.
- 제2항에 있어서, RSV에 대해 대상체를 백신접종하기 위한 것인, 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, RSV F 단백질을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항에 따른 재조합 인간 아데노바이러스를 제공하는 단계, 상기 재조합 아데노바이러스를 숙주 세포의 배양물에서 증식시키는 단계, 재조합 아데노바이러스를 단리 및 정제하는 단계, 및 약학적으로 허용 가능한 조성물에 재조합 아데노바이러스를 제형화하는 단계를 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신의 제조 방법.
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