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KR101018992B1 - 바이러스를 포함하는 조성물 - Google Patents

바이러스를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR101018992B1
KR101018992B1 KR1020097022935A KR20097022935A KR101018992B1 KR 101018992 B1 KR101018992 B1 KR 101018992B1 KR 1020097022935 A KR1020097022935 A KR 1020097022935A KR 20097022935 A KR20097022935 A KR 20097022935A KR 101018992 B1 KR101018992 B1 KR 101018992B1
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게리 제이 벨레캄프
푸이-호 옌
로리노 엘 쥬니어 본독
프레데릭 윌리암 4세 포터
존 츄-테이 탕
피터 이나트
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쉐링 코포레이션
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Abstract

약 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 약 7 내지 약 8.5 범위의 pH를 유지하도록 완충된 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제형중에 바이러스를 포함하는 조성물이 기술되어 있다. 바이러스 제제를 농축 및 정제하는 방법도 또한 기술되어 있다.
폴리하이드록시 탄화수소, 바이러스 제제, 바이러스의 안정성

Description

바이러스를 포함하는 조성물{Compositions comprising viruses}
본 발명은 바이러스, 특히 안정성이 상당히 향상된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 보관중에 바이러스의 안정성를 유지하는데 유용하고, 본 발명의 바이러스-함유 조성물은 특히 유전자 치료와 같은 치료학적 용도로서도 유용하다. 또한, 바이러스 제제를 농축하고 정제하는 새로운 방법이 제공된다.
바이러스는 백신접종 및 유전자 치료와 같은 치료학적 용도로서의 중요성이 점차 부각되고 있으며, 용이하게 보관 및 운송이 가능하면서도 충분한 안전성 및 효능을 유지할 수 있는 안정한 바이러스-함유 조성물을 개발하고 제조할 필요성이 있다. 특히, 유전자 치료에 있어 바이러스 벡터의 용도가 광범위하다는 측면에서, 치료학적 형질전환유전자(transgene)를 포함하는 경우 생존 재조합 바이러스를 안정하게 보존할 수 있는 제형을 개발하고 제조하는 것이 중요하다.
게다가, 장기간 동안 -80℃ 이상의 온도에서 바이러스 제제를 안정화시킬 수 있는 제형이 절실히 요구되고 있다. 바이러스-함유 조성물은 통상적으로 -80℃에서의 보관을 필요로 하며, 표준 냉장 온도(예: 2 내지 8℃ 또는 그 이상)에서 상당한 기간 동안 보관될 수 없다. 이러한 한계는 보관에서 뿐만 아니라 가공, 유통 및 광범위한 임상적 사용에 있어서도 심각한 장애가 되고 있다.
냉장 온도에의 노출, 및 동결/해동, 특히 대규모의 제조, 취급 또는 유통과 관련하여 일어날 수 있는 저속의 동결/해동과 같은 악조건하에도 불구하고, 장기간 동안 약 7 내지 8.5범위의 pH를 유지할 수 있는 바이러스-함유 조성물의 개발이 요구되고 있다. pH가 7.0 미만이거나 8.5 초과인 경우 생존 바이러스 입자는 물리적 및 생물학적 불안정성으로 인해 생존능을 상실하기 쉽기 때문에, pH의 유지는 바이러스 제제에 있어 중요하다.
또 다른 문제는 바이러스 농도의 증가에 관한 것이다. 특히, 바이러스의 고농도는 바이러스 불안정성의 주요 원인이 된다. 그러나, 점차 더욱 고농도의 바이러스 및 바이러스 벡터가 치료학적 용도를 위해 요구된다. 따라서, 비교적 고농도의 바이러스를 특히 상기한 악조건하에서 안정화시킬 수 있는 제형의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한, 보다 고농도의 수준에서 안정한 제제를 수득하기 위하여 생존 바이러스 제제를 농축하는 새로운 방법에 대한 개발이 특히 요구되고 있다. 만일 생존 바이러스 제제를 농축하고자 하는 경우, 고농도의 바이러스와 관련된 불 안정성의 문제가 더욱 악화된다. 이는 부분적으로, 생존 바이러스 제제의 농도를 증가시키고자 하는 노력중에 발생하는 추가적 기계적 전단력에 의한 것이다. 바이러스 안정성에 실질적 손상을 주지 않으면서 바이러스 제제를 농축하는 방법을 발견한다면, (저농도의 물질로 부터 출발하는 경우일지라도) 목적하는 임의의 농도의 임상적 투여량이 용이하게 제조될 수 있으며, 중요하게도, 바이러스를 농축시킬 수 있음으로써, 크기 배제 크로마토그래피와 같은 각종 처리 단계 동안의 처리량이 상당히 많아질 수 있으므로 정제 과정중의 병목 문제 및 기타 규모 증가 문제가 해결될 수 있다.
따라서, 전술한 목적을 달성하기 위한 물질 및 방법이 요구되고 있다.
본 발명은, 약 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 약 7 내지 약 8.5 범위의 pH를 유지하도록 완충된 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제형중에 바이러스를 포함하는 안정한 조성물을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다.
또한, 목적하는 광범위한 농도내에서 임상적 투여량을 용이하게 선택 및 제조할 수 있도록 하는, 새로운 생존 바이러스 제제의 농축 방법이 제공된다. 바이러스 제제를 농축하는 바람직한 방법은 (a) 폴리하이드록시 탄화수소를 바이러스 제제에 가하여 최종적으로 약 20% 이상의 폴리하이드록시 탄화수소 농도를 수득하는 단계; 및 (b) 희석제는 여과기를 통해 당해 바이러스 제제로 부터 제거되나 바이러스는 잔류하도록 바이러스 제제에 압력을 적용하는 방법으로 바이러스의 농도를 증가시키는 여과 공정을 통해 당해 바이러스 제제를 여과시키는 단계를 포함한 다.
또한, (a) 35% 내지 80%(v/v) 농도의 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제1층, 제1층 위에 5% 내지 30%(v/v) 농도의 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제2층, 및 제2층 위에 바이러스를 포함하는 제3층을 포함하는 조성물을 원심분리하는 단계; 및
(b) 제1층으로 부터 바이러스를 회수하는 단계를 포함하여, 바이러스 제제를 농축하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 본원의 발명자들은 바이러스 농도를 증가시키는 새로운 방법이 처리 과정을 더욱 향상시키는(예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피와 같은 처리 단계 동안 처리량을 상당히 증가시킴으로써 후속 정제중의 병목 문제를 감소시키거나 제거함으로써 이루어짐) 추가적 이점을 갖는다는 사실을 발견하였다. 따라서, 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 바이러스 제제의 농축 방법은 후속의 정제 단계(예: 크기 배제 크로마토그래피)를 추가로 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은, 크기 배제 크로마토그래피 단계를 이온 교환 크로마토그래피 후에 수행하고, 당해 바이러스 제제를 이온 교환 크로마토그래피 후 크기 배제 크로마토그래피 전에 본 발명에 따라 농축하는 경우, 특히 유용하다. 예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피로 부터 수득된 바이러스 분획물은 통상적으로 고농도의 염 및, 아마도, 농축 과정중에 바이러스 안정성을 추가로 손상시키는 기타 불순물을 함유한다. 따라서, 특히 바람직한 태양에서, 본 발명은, (a) 바이러스가 음이온 교환 크로마토그래피의 매질로 부터 바이러스 제제 산물로서 용출되도록, 음이온 교환 크로마 토그래피에 바이러스 제제를 적용시키는 단계;
(b) 바이러스 제제중의 폴리하이드록시 탄화수소 농도가 최종적으로 약 25% 이상이 되도록, 단계 (a)의 바이러스 제제 산물에 폴리하이드록시 탄화수소를 가하는 단계;
(c) 희석제는 여과기를 통해 바이러스 제제로 부터 제거되나 바이러스는 잔류하도록 당해 제제에 압력을 적용하여, 단계 (b)의 바이러스 제제 산물중의 바이러스 농도를 증가시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 농축된 바이러스 제제 산물을 하나 이상의 추가적 처리 단계에 적용시키는 단계를 포함하여, 바이러스 제제를 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 방법에 의해 농축 및/또는 정제된 바이러스 제제를 제공한다.
상기한 바와 같이, 본원에는 새로운 바이러스-함유 조성물은 물론 바이러스-함유 조성물을 농축 및 정제하는 새로운 방법이 기술되어 있다.
조성물에 관하여, 본원의 발명자들은 안정성이 향상된 바이러스 제제를 보존할 수 있는 새로운 완충된 제형을 개발하였다. 특히, 상기 제형은 -80℃를 휠씬 넘는 온도에서 바이러스 제제를 안정화시킬 수 있다. 더욱 중요하게도, 본 발명의 조성물은 통상적인 냉장 온도, 예컨대 2 내지 8℃, 또는 그 이상의 온도에서 상당한 기간, 바람직하게는 수 개월 이상 동안 안정하다. 이는, 상기한 바와 같이 임 상적 요구를 충족시키기 위해 보관 및 운송중에 -80℃에서 바이러스 제제를 동결된 상태로 유지하는 것이 불가능하기 때문에, 매우 유리하다.
본 발명의 조성물의 중요한 특징은 폴리하이드록시 탄화수소의 첨가이다. 본원에서 사용된 바와 같은, 폴리하이드록시 탄화수소는 2 이상(바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 2 내지 4)의 하이드록시 그룹으로 치환된 측쇄, 직쇄, 또는 사이클릭 화합물을 의미한다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리하이드록시 탄화수소로는 바람직하게는 2 내지 7의 탄소수를 갖는 폴리하이드록시-치환된 알킬 화합물(측쇄 또는 비측쇄형)이 바람직하며, 예를 들면 글리세롤, 소르비톨 및 폴리프로판올이 포함된다. 글리세롤이 특이 바람직하다. 하기 자료에 나타난 바와 같이, 본원의 발명자들에 의해, 글리세롤이 표준 냉장 조건하에서 장기간 동안 놀랍게도 고수준의 안정성을 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 조성물중의 폴리하이드록시 탄화수소의 유효량은, 특히 바이러스가 유전자 치료 용도의 형질전환유전자를 포함하는 경우에, 추가적 용도를 위한 바이러스의 효능에 악영향을 주지 않으면서 본 발명의 제형중의 바이러스를 안정화시키기에 충분한 양이다. 폴리하이드록시 탄화수소는 바람직하게는 약 20 내지 200mg/mL의 최종 농도로 존재한다. 더욱 협소하게는 80 내지 120mg/ml일 수 있다. 하나 이상의 폴리하이드록시 탄화수소를 사용하여, 본 발명의 조성물중의 폴리하이드록시 탄화수소의 목적 총량을 달성할 수 있다.
본 발명의 조성물중의 폴리하이드록시 탄화수소는 임의로 알데히드 그룹을 포함할 수 있다. 특히, 폴리하이드록시 탄화수소는 슈크로즈와 같은 이당류일 수 있다. 게다가, 본 조성물을 위해 선택된 폴리하이드록시 탄화수소가 알데히드 그룹을 포함하지 않는 경우일지라도, 당해 조성물은 안정화제 및 삼투압 조절제로서 슈크로즈와 같은 이당류를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 이미 적당한 폴리하이드록시 탄화수소(예: 글리세롤)을 포함하고 이당류가 추가적 안정화제 또는 삼투압 조절제로서 바람직한 태양에서 사용되는 경우, 당해 이당류는 바람직하게는 5 내지 25mg/ml, 보다 바람직하게는 20mg/ml로 존재하고, 당해 이당류로는 슈크로즈가 바람직하다.
약제학적으로 허용되는 2가 금속 염 안정화제, 예를 들면 마그네슘 염, 아연 염 및 칼슘 염이 본 발명의 조성물의 바람직한 태양에서 사용된다. 바람직하게는, 당해 염은 염화물 염 또는 마그네슘 염이며, 마그네슘 염이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 당해 염(예: 마그네슘 염)은 약 0.1 내지 1mg/ml, 보다 바람직하게는 0.4mg/ml의 양으로 존재한다.
약제학적으로 허용되는 1가 금속 염 안정화제, 예를 들면 칼륨, 나트륨, 리튬 및 세슘 염이 본 발명의 바람직한 태양에서 임의적 안정화제로서 포함될 수 있다. 바람직하게는, 당해 염은 염화나트륨이며, 0.6 내지 10.0mg/ml, 보다 바람직하게는 약 5.8mg/ml의 양으로 존재한다.
조성물을 안정화시키는 것 외에, 염화나트륨은 발효 부산물의 발생 속도 및 정도를 억제함으로써, 더욱 약제학적으로 적절한 외형(presentation)이 수득될 수 있으며, 이는 단백질 응집으로 인한 항원성 잠재능을 저하시킬 수 있다. 염화나트륨의 첨가는 제형의 pH에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 조성물은, 냉장 및 동결/해동과 같은 악조건에 적용되는 경우에도 장기간 동안 약 7 내지 약 8.5 범위의 pH를 유지할 수 있다. 또한, 당해 조성물은 대규모의 제조, 유통 및 취급과 관련하여 일어날 수 있는 비교적 저속의 동결/해동에 처할지라도, 안정성을 유지하고, 요구된 pH 범위를 유지할 수 있다. 상기한 바와 같이, 7.0 미만 또는 8.5 초과의 pH에서는, 생존 바이러스 입자가 불안정해지고 분해될 수 있기 때문에, pH의 유지는 바이러스 제제에 있어 중요하다. 바이러스의 특정 조성물의 경우, 바이러스를 안정화시키고 보존하기가 곤란하다.
악조건하에서 pH를 유지하기 위하여, 바람직하게는 본 발명은 -80℃ 내지 27℃의 보관하 및 동결/해동 조건하에서도, 약 7.0 내지 약 8.5 범위의 최적 pH를 유지할 수 있는 완충 시스템을 포함한다. pH는 온도에 따라 달라질 수 있기 때문에, 본 발명의 pH 범위는 특정 온도 범위와 관련하여 구체적으로 후술될 것이다. 예를 들면, 냉장 온도(예: 약 2 내지 8℃)에서 바람직한 pH 범위는 약 7.7 내지 약 8.3이고, 보다 바람직하게는 약 7.9 내지 약 8.2이다. 실온(예: 약 20 내지 27℃, 바람직하게는 22 내지 25℃)에서 바람직한 pH 범위는 약 7.3 내지 약 8.2이고, 보다 바람직하게는 약 7.4 내지 약 7.9이다.
본 발명의 바람직한 완충 시스템은 약 0.5 내지 10mg/ml 농도의 인산나트륨 일염기성 이수화물 및 약 0.5 내지 10mg/ml 농도의 트로메타민을 포함한다. (트로메타민은 또한 시그마 케미칼 캄파니(Sigama Chemical Co.)로 부터 시판중인 TRIS 또는 "트리즈마(Trizma)"로서 공지되어 있다). 그러나. 다른 완충 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들면, 산성 형의 트리스 완충제와 연관되는 경우, 인산나트륨 이염기성 이수화물이 사용될 수 있다. 특히 바람직한 태양에서, 완충 시스템은 약 1.7mg/ml 농도의 인산나트륨 일염기성 이수화물 및 약 1.7mg/ml 농도의 트로메타민을 포함하고, 25℃에서 최적 pH 범위인 약 7.3 내지 약 7.9의 pH에서 당해 제형을 유지할 수 있다.
본 발명의 제형은 상기한 악조건(예를 들면, 냉장 온도 및 동결/해동 처리)에서 고농도의 바이러스를 안정화시킬 수 있는 추가적 이점을 갖는다. 특히, 본 발명의 제형은, 1 x 1013개 입자/ml 이하 범위의 농도에서 바이러스의 안정성을 유지할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 바이러스의 바람직한 농도 범위는 1 x 109 내지 1 x 1013개 입자/ml, 보다 바람직하게는 1 x 1012개 입자/ml 이하, 예를 들면 1 x 109(또는 1 x 1010) 내지 1 x 1012개의 양이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "희석제"는 용매(예: 물, 바람직하게는 멸균수) 또는 용매와 기타 성분, 예를 들면 추가 용매, 추가 안정화제, 추가 완충제 및/또는 당해 제형의 안전성, 효능 및 안정성에 악영향을 주지 않는 기타 물질과의 혼합물을 포함한다. 희석제, 안정화제, 완충제 등에 관하여는, 펜실베니아주 이스톤에 소재하는 맥 퍼블리싱 캄파니(Mack Publishing Company)에서 발행된 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed.)을 참조한다.
계면활성제, 바람직하게는 비이온성 세제, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(예: 델라웨어주 윌밍톤 소재의 ICI Americas, Inc.로 부터의 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리옥시에틸렌소르비탄, 또는 Sigama(St. Louis, Mo)로 부터의 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60 및 트윈 80)가 본 발명의 조성물중에 임의로 포함될 수 있다. 바람직하게는, 비이온성 세제는 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르이며, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르는 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서 안정화제로 작용하는 폴리소르베이트 80이다. 비이온성 계면활성제의 농도 범위는 바람직하게는 0.03 내지 0.3mg/ml, 보다 바람직하게는 0.15mg/ml이다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 "전달-증진제"를 추가로 포함할 수 있다. "전달-증진제"란 암 조직 또는 기관으로의 치료학적 유전자, 예를 들면 종양 억제 유전자의 전달을 증진시키는 임의의 제제를 의미한다. 이러한 전달-증진제의 예에는 세제, 알코올, 글리콜, 계면활성제. 담즙 염, 헤파린 길항제, 사이클로옥시게나제 억제제, 고장성 염 용액, 및 아세테이트가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세제(본원에서 사용된 용어)에는 음이온성, 양이온성, 양쪽성이온성, 비이온성 세제가 포함된다. 세제의 예에는 타우콜레이트, 데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 세틸피리듐, 베나코늄 클로라이드, ZWITTERGENTR 3-14 세제, CHAPS (3-[3-콜라미도프로필) 디메틸암모니올]-1-프로판설포네이트 하이드레이트, Aldrich), Big CHAP, 데옥시 Big CHAP, TRITONR-X-100 세제, C12E8, 옥틸-B-D-글루코피라노사이드, PLURONICR-F68 세제, TWEENR 20 세제, 및 TWEENR 80 세제(CALBIOCHEMR 바이오케미칼스)이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
전달-증진제의 사용은, 공동 계류중인 미국 특허원 U.S.S.N 08/889,335(1997년 7월 8일 출원) 및 국제출원 공보 WO 97/25072(1997년 7월 17일), 및 미국 특허원 U.S.S.N. 09/112,074(1998년 7월 8일 출원), 국제출원 PCT/US 98/14241에 상세히 기술되어 있다. 또한, 형질도입 효율을 증가시키기 위하여, 바이러스 벡터와 함께 칼파인(calpain) 억제제를 사용하는 방법이 미국 특허원 U.S.S.N. 09/172,685 및 60/104,321(1998년 10월 15일 출원)에 기술되어 있다.
광범위한 바이러스가 본 발명의 조성물중에 사용될 수 있으며, 이에는 아데노바이러스(adenovirus), 두진(pox) 바이러스, 이리도바이러스(iridovirus), 포진(herpes) 바이러스, 파포바바이러스(papovavirus), 파라믹소바이러스 (paramyxovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노-관련 바이러스, 종두(vaccinia) 바이러스, 로타바이러스 (rotavirus), 등[참조 문헌: Anderson, Science (1992) 256: 808-813)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며; 아데노바이러스가 특히 바람직하다. 상기 바이러스는 바람직하게는 재조합 바이러스이지만, 임상 분리체, 약독화된 백신 종, 등이 포함될 수 있다. 따라서, 예컨대 본 발명의 조성물중에 사용될 수 있는 재조합 아데노바이러스의 예로는 A/C/N53이 있으며, 이는 PCT 특허원 WO 95/11984에 기술되어 있다.
본 발명의 제형은 유전자 치료에서의 치료학적 용도로서의 재조합 바이러스, 예를 들면 생존 재조합 아데노바이러스(또는 "바이러스 벡터")를 안정화시키는데 특히 적합하다. 예를 들면, 본 발명에 사용되는 바이러스는 종양 억제 유전자, 예 를 들면 야생형 p53 유전자 또는 Rb 유전자(예: p110RB 또는 p56RB)를 포함하며, 바이러스 벡터내에 삽입된 야생형 p53과 같은 형질전환유전자를 지닌 본 발명의 조성물은 암 치료용 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 조성물은 생존 바이러스, 특히 p53과 같은 형질전환유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 바이러스 벡터의 생존능을 유지시킬 수 있는 놀라운 능력을 갖는다. 이러한 특징에 의해 당해 바이러스는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 능력을 유지할 수 있으므로, 삽입된 형질전환유전자에 의해 암호화된 치료학적 단백질이 적당히 생산될 수 있다.
특히, p53 및 이의 용도와 관련하여, 주목할 점은 p53 유전자의 돌연변이가 사람 암에서의 가장 일반적인 유전자 변형이라는 것이다[참조 문헌: Bartek (1991) Oncogene, 6: 1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53]. 내생의 야생형 p53 단백질이 결핍된 포유류 암세포에 야생형 p53을 도입하는 경우, 이들 세포의 신생물 표현형이 억제된다[참조 문헌: 미국 특허 제5,532,220호].
하기 실시예에서, 바이러스는 야생형 p53 유전자를 포함하는 생존 재조합 아데노바이러스이다. 이들 실시예에 사용되는 특정 바이러스 벡터 작제물은 본원에서 "A/C/N/53"으로 지칭된다. A/C/N/53("ACN53"으로도 지칭됨)로는 본원에 참조로서 명백히 인용된, 공동 계류중인 특허원 USSN 08/328,673(1994년 10월 25일 출원) 및 WO 95/11984(1995년 5월 4일)에 기술된 바이러스 벡터 작제물이 특히 바람직하다.
폴리소르베이트 80을 포함하는 본 발명의 바람직한 태양의 대표적인 제형은 다음과 같다:
대표적인 제형
활성 물질 A/C/N/53 1 x 109 내지 1 x 1013개 입자/ml
완충제 일염기성 인산나트륨
트로메타민		 0.5 내지 10mg/ml
0.5 내지 10mg/ml
안정화제/삼투압제 슈크로즈 5 내지 25mg/ml
안정화제 글리세롤
염화마그네슘
폴리소르베이트 80		 20 내지 200mg/ml
0.1 내지 1mg/ml
0.03 내지 0.3mg/ml
용매 주사용수 q.s.ad 1ml
(당해 조성물은 통상적으로 1.0ml 용량으로 보관된다. 상기 제형에서 "q.s. ad"는 총 용적이 1ml에 이르도록 가해진 충분한 용매를 의미한다.)
4개의 특히 바람직한 태양은 다음과 같다(폴리소르베이트 80은 실시예 1 및 2에는 존재하지만, 실시예 3 및 4에는 부존재한다):
실시예 1 실시예 2
A/C/N/53 7.5 x 1011개 입자/ml 7.5 x 1010개 입자/ml
인산나트륨 일염기성 이수화물 1.7mg/ml 1.7mg/ml
트로메타민 1.7mg/ml 1.7mg/ml
염화마그네슘 헥사하이드레이트 0.4mg/ml 0.4mg/ml
슈크로즈 20mg/ml 20mg/ml
폴리소르베이트 80 0.15mg/ml 0.15mg/ml
글리세롤 100mg/ml 100mg/ml
주사용수 q.s. ad 1ml 1ml
pH 7.4 내지 7.8 7.4 내지 7.8
실시예 3 실시예 4
A/C/N/53 7.5 x 1011개 입자/ml 7.5 x 1010개 입자/ml
인산나트륨 일염기성 이수화물 1.7mg/ml 1.7mg/ml
트로메타민 1.7mg/ml 1.7mg/ml
염화마그네슘 헥사하이드레이트 0.4mg/ml 0.4mg/ml
슈크로즈 20mg/ml 20mg/ml
글리세롤 100mg/ml 100mg/ml
주사용수 q.s. ad 1ml 1ml
pH 7.4 내지 7.9 7.3 내지 7.8
상기 성분인 인산나트륨 일염기성 이수화물, 트로메타민, 염화마그네슘 헥사하이드레이트, 슈크로즈 및 글리세롤은 모두 예를 들면, 뉴욕주 10532 하우톤 스카이라인 드라이브 7 소재의 EM Industries, INC.로 부터 구입할 수 있다. 폴리소르베이트 80은, 예를 들면 델라웨어주 19897 윌밍톤 소재의 ICI Americas에서 시판되고 있다.
본 발명의 조성물은, 겔 여과 칼럼중에 상기 성분(폴라소르베이트 80은 제외)을 목적하는 농도로 합하여 겔 여과 크로마토그래피 칼럼에서 바이러스를 정제하는 동안 제조될 수 있다(겔 여과 방법에 관하여는, 하기 V 절을 참조한다). 이 후, 바이러스의 농도를 희석시키거나, 또는 폴리소르베이트 80을 혼입시키기 바란다면, 희석제를 표준 기술에 의해 제조할 수 있다. 예시적인 실시예는 다음과 같다:
인산나트륨 일염기성 이수화물, 트로메타민, 슈크로즈, 염화마그네슘 헥사하이드레이트 및 글리세롤를, 교반기가 장착된 스테인레스강 용기내에 실온에서 주사용수의 배치 용적의 약 75%로 충전시키고 용해시킨다. 생성된 희석제의 배치에 주사용수를 가하여 최종 용적을 수득한다. pH를 확인한다. 현탁액중의 A/C/N/53(형질전환유전자로서 야생형 p53를 포함하는 아데노바이러스) 약제 물질의 요구량 및 A/C/N/53 주사액를 제조하기 위한 희석제의 요구량을 계산한다. 최종 A/C/N/53 주사액이 폴리소르베이트 80을 함유하려면, 희석제중에 10% 과잉의 폴리소르베이트 80을 함유하는 스톡 용액을 제조한다. 현탁액중의 A/C/N/53 약제 물질 및 희석제의 계산된 양을 스테인레스강 용기에 충전시킨 후 혼합한다. 희석제 전부를 가하 기 전에, 필요한 경우 총 A/C/N/53 주사액 배치 용적의 10%를 기준으로 하여, 폴리소르베이트 80 용액을 충전시킨다. 멸균 여과기(0.22㎛ 또는 등가)를 통해 현탁액을 무균적으로 여과시킨다. 여과후 여과기 보존성을 시험한다. 멸균 현탁액을 수집하여 적당한 용적의 바이알에 채운다. 마개를 닫고 바이알을 밀봉한다.
실시예 1, 2, 3 및 4에 대한 안정성 자료는 각각 하기 표 1, 2, 3 및 4에 기재되어 있다.
하기 표에서, 증식억제 검정은 생성물의 암세포 억제능을 측정하는데 사용되는 생물검정이며, 이는 일반적으로 문헌[Wills, et al., 1994, Human Gene Therapy, 5:1079-1088]에 기술된 방법을 기초로 한다. 기재된 수는 활성을 나타내는 반면, 대조군은 활성을 갖지 않는다.
"플라크 검정"은 희석의 함수로서 바이러스 플라크의 수를 기록하는 방법으로 배지중의 바이러스 입자를 측정하는 것이며, 이는 일반적으로 문헌[Graham, F.L., and Prevec, L., Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, E.J. Murray, ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pp. 109-128 (1991); Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., and Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pp 59-74 (1997)]에 기술된 방법을 기초로 한다.
"FACS" 검정은 바이러스의 세포 감염능을 보여주며, 이들 측정은, 예를 들면 일반적으로 국제출원 PCT/US97/11865(WO 98/01582, 1998년 1월 15일 공개)에 기술된 방법을 기초로 한다. 오른편으로 다음 칸에서, "농도"라는 표제하에 제시된 수는 바이러스 입자의 총수의 농도를 나타낸다. 최종적으로, "입자/FACS 비"라는 표 제하의 수는 감염성 바이러스 입자의 수와 비교한 바이러스 입자의 총수의 비를 나타내므로, 바이러스 제제의 상대적 효능을 보여준다.
"UV" 표제하의 자료는 광산란제의 지표로서 A320/A260 파장에 대한 UV 흡광도 비로써 나타내어진 바이러스 입자의 응집을 보여준다. 기본적으로, 320nm 파장에서의 흡광도는 광산란제의 양을 측정하는 반면, 260 nm 파장에서의 흡광도는 DNA의 양과 관계가 있다.
표의 두번째 칸에 "조건"이란 표제하에 기재된 온도는 보관 온도를 나타낸다. 생리학적 검정은 37℃에서 수행하고, 마지막 칸의 pH는 실온, 약 25℃에서 측정한다.
실시예 1에 대한 안정성 자료
안정성
시간		 조건
℃		 증식억제 검정
x 105
SPU/ml 		플라크
검정
x 108
PFU/ml		 FACS

x 1010
U/ml		 농도

x 1011
입자/ml		 입자/
FACS
비		 UV
A320/A260 		pH
초기 3.3 5.8 3.86 7.95 21 0.23 7.53
1 주 25 4.9 10 2.27 8.06 36 0.24 7.53
2 주 4 3.1 6.6 3.41 7.84 23 0.23 7.49
4 주 4 3.4 17 3.91 7.79 20 0.23 7.63
8 주 4 5.8 8.8 3.38 7.80 23 0.24 7.61
12 주 4 3.9 36 2.24 7.80 35 0.24 7.72
5 개월 4 미시험 미시험 1.57 8.21 52 0.26 7.60
6 개월 4 3.0 7.6 2.74 7.68 28 0.28 7.58
9 개월 4 3.1 19 3.47 7.19* 21 0.28 7.58
11 개월 4 미시험 미시험 nt 6.71 - 0.29 nt
12 개월 4 2.6 10 0.81 6.13 76 0.30 7.62
* 9개월의 재시험 UV 샘플: 6.89 x 1011개 입자/ml; A320/A260 = 0.28
실시예 2에 대한 안정성 자료
안정성
시간		 조건
℃		 증식억제 검정
x 104
SPU/ml 		플라크
검정
x 107
PFU/ml		 FACS

x 109
U/ml		 농도

x 1010
입자/ml		 입자/
FACS
비		 UV
A320/A260 		pH
초기 3.3 4.8 1.99 10.0 50 0.24 7.36
1 주 25 2.4 7.1 1.64 nd* - 0.46 7.42
2 주 4 2.4 6.9 2.13 9.79 46 0.24 7.51
4 주 4 3.2 8.4 2.50 9.24 37 0.22 7.55
8 주 4 6.9 8.6 2.60 8.10 31 0.25 7.54
12 주 4 5.5 8.3 1.09 8.60 79 0.24 7.64
5 개월 4 미시험 미시험 1.74 8.03 46 0.27 7.55
6 개월 4 3.3 7.3 2.10 8.25 39 0.23 7.52
9 개월 4 2.3 13 1.97 7.59 39 0.24** 7.53
11 개월 4 미시험
(nt)		 미시험 nt 7.48 - 0.23 nt
12 개월 4 1.8 9.4 0.60 4.94 82 0.26 7.59
* 검정 방해로 인해 측정하지 못함
** * 9개월의 재시험 UV 샘플: 7.37 x 1010개 입자/ml; A320/A260 = 0.24
실시예 3에 대한 안정성 자료
안정성
시간		 조건
℃		 증식억제 검정
x 105
SPU/ml 		플라크
검정
x 108
PFU/ml		 FACS

x 1010
U/ml		 농도

x 1011
입자/ml		 입자/
FACS
비		 UV
A320/A260 		pH
초기 3.2 6.3 2.59 7.45 29 0.24 7.67
1 주 25 4.4 4.3 1.65 7.49 45 0.24 7.68
2 주 4 2.3 8.0 3.62 7.27 20 0.24 7.49
4 주 4 2.7 7.6 4.08 6.97 17 0.24 7.75
8 주 4 5.9 8.7 2.69 7.00 26 0.25 7.82
12 주 4 3.0 15 0.70 7.10 101 0.25 7.80
6 개월 4 2.4 6.4 2.45 7.12 29 0.25 7.76
9 개월 4 2.8 9.4 2.51 7.06 28 0.26 7.81
11 개월 4 미시험
(nt)		 nt nt 6.71 - 0.25 nt
12 개월 4 2.2 9.8 0.74 6.75 91 0.26 7.81
실시예 4에 대한 안정성 자료
안정성
시간		 조건
℃		 증식억제 검정
x 104
SPU/ml 		플라크
검정
x 107
PFU/ml		 FACS

x 109
U/ml		 농도

x 1010
입자/ml		 입자/
FACS
비		 UV
A320/A260 		pH
초기 3.3 4.7 2.36 8.91 38 0.23 7.37
1 주 25 2.3 9.3 1.40 8.25 59 0.24 7.37
2 주 4 2.8 8.0 2.16 8.80 41 nd* 7.37
4 주 4 2.9 6.6 2.54 9.35 37 0.20 7.63
8 주 4 6.9 7.2 2.56 7.60 30 0.24 7.60
12 주 4 4.4 8.6 1.45 7.20 50 0.23 7.73
6 개월 4 3.6 7.1 2.85 7.92 28 0.21 7.58
9 개월 4 2.9 11 1.87 7.26 39 0.20 7.60
11 개월 4 미시험
(nt)		 nt nt 6.93 - 0.22 nt
12 개월 4 2.4 22 0.70 7.15 102 0.23 7.61
* 검정 방해로 인해 측정하지 못함
실시예 5
실시예 5의 제형: A/C/N/53(7.5 x 1011 입자/ml), 트로메타민(TRIS)(1.7mg/ml), 인산나트륨 일염기성 이수화물(1.7mg/ml), 슈크로즈(20mg/ml), 염화마그네슘 헥사하이드레이트(0.4mg/ml), 글리세롤(100g/ml), 염화나트륨(5.8mg/ml), 충전 용적 = 10ml.
실시예 5에 대한 안정성 자료
안정성
시간		 조건
℃		 증식억제 검정
x 105
SPU/ml 		FACS

x 1010
U/ml		 농도

x 1011
입자/ml		 입자/
FACS
비		 UV
A320/A260 		pH
초기 4.5 1.87 7.81 42 0.23 7.80
1 개월 4 8.0 1.67 7.83 47 0.23 7.80
4 개월 4 13.0 1.58 7.84 50 0.23 7.70
일부 경우에, 4℃에서 보관하는 동안, 제형중에 미립자가 형성되는 것이 관찰되었다. SDS-PAGE에 의한 미립자의 분석이 제시하는 바에 따르면, 미립자는 소량의 불순물(즉, 추가적 단백직 및 일부 미성숙 바이러스 입자)로 이루어지므로, 이들 입자가 제형의 생존능에 영향을 주지 못한다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 태양에서, 제형을 더욱 정화하기 위하여(가능한 미립자 형성을 예방하기 위하여), 미세여과의 임의 단계를 수행하여, 바이러스 입자를 거의 손실하지 않으면서 모든 잠재적 미립자를 제거할 수 있다. (미세여과를 수행하는 경우, 유념해야 할점은 여과 용적당 충분한 미세여과 막 표면적이, 미립자 제거시 바이러스의 손실을 피하는데 있어 중요하다는 것이다.)
또한, 바람직한 태양에서, 본원의 발명자들이 발견한 바에 따르면, 교반이 미립자 형성을 촉진할 수 있으므로, 이는 정화 공정중의 추가적 임의 단계이다. 따라서, 약한 교반(예: 자성 교반막대를 사용하여 10℃에서 밤새) 후, 미세여과함으로써 미립자가 제거되므로, 재교반시 더 이상 미립자가 재형성되지 않는다는 것이 밝혀졌다.
또한, 동결/해동의 순환이 재교반중 미립자 형성을 촉직할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 또 다른 바람직한 태양에서, 1회 이상의 동결/해동 순환을 임의로 수행한 후 교반하고, 이어서 미세여과함으로써, 냉장 온도(예: 4℃)에서 바이러스의 최종 생성물의 보관중에 미립자 형성을 예방할 수 있다.
바이러스-함유 조성물의 농축 및 정제 방법
또한, 본 발명은 접선 유동 여과(이 후, 종종 "TFF(Tangential Flow Filtration)"로 칭해진다)를 사용하여, 생존 바이러스 제제를 안정하게 농축하는 새로운 방법을 개시하고 있으며, 이 방법에 의해 광범위한 목적 농도로 임상적 투여량을 용이하게 선택하여 제조할 수 있다. 바이러스 제제를 농축하는 새로운 방법은 (a) 폴리하이드록시 탄화수소를 바이러스 제제에 가하여 최종적으로 약 20% 이상의 폴리하이드록시 탄화수소 농도를 수득하는 단계; 및 (b) 희석제는 여과기를 통해 당해 바이러스 제제로 부터 제거되나 바이러스는 잔류하도록 바이러스 제제에 압력을 적용하는 방법으로 바이러스의 농도를 증가시키는 여과 공정을 통해 당해 바이러스 제제를 여과시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 아데노바이러스, 두진 바이러스, 이리도바이러스, 포진 바이러스, 파포바바이러스, 파라믹소바이러스, 오르토믹소바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스, 종두 바이러스, 로타바이러스, 등을 포함한 광범위한 바이러스에 적용가능하나, 이에 한정되는 것은 아니며; 아데노바이러스가 특히 바람직하다. 상기 바이러스는 바람직하게는 재조합 바이러스이지만, 임상 분리체, 약독화된 백신 종, 등이 포함될 수 있다. 본 발명은 유전자 치료 용도의 이종 형질전환유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 농축시키는데 특히 유용하다. 이러한 바이러스는 잠재적인 불안정화력, 예를 들면 바이러스 제제를 농축하는 방법에 수반되는 추가적 기계적 전단력에 의해 특히 손상되기 쉽다. 본 발명의 방법에 의해 농축될 수 있는 재조합 아데노바이러스의 예로는 A/C/N53이 있으며, 이는 PCT 특허출원 WO 95/11984에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 바이러스를 농축시키는데 사용되는 여과 방법은, 희석제는 바이러스 제제로 부터 제거되지만 바이러스는 여과기를 통과할 수 없어 바이러스 제제중에 농축된 형태로 잔류되도록 하는 방법으로, 희석제를 강제로 여과기에 통과시켜 바이러스의 농도를 증가시키는 임의의 여과 공정(예: 한외여과)을 포함할 수 있다. 한외여과는 문헌[Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., New York, NY, 1996]에 상세히 기술되어 있다. 특히 바람직한 여과 방법은 문헌["Pharmaceutical Process Filtration Catalogue"라는 명칭의 MILLEPORE 카탈로그 pp.177-202 (Bedford, Massachusetts, 1995/96)]에 기술되어 있는 접선 유동 여과("TFF")이다. 바람직한 TFF 장치는 매사추세츠주 베드포드 아쉬바이 로오드 80 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)(인터넷 주소: www.millipore.com)로 부터 제조된 Pellicon II 또는 Pellicon XL을 포함한다; Pellicon XL이 특히 바람직하다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 방법은 약 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 수행된다.
다른 농축 공정을 사용하여 본 발명에 따른 바이러스 제제를 농축시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리하이드록시 탄화수소를 사용하는 경우, 원심분리에 의해 바이러스 제제를 농축시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명은, (a) 35% 내지 80%(v/v) 농도의 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제1층, 제1층 위에 5% 내지 30%(v/v) 농도의 폴리하이드록시 탄화수소를 포함하는 제2층, 및 제2층 위에 바이러스를 포함하는 제3층을 포함하는 조성물을 원심분리하는 단계; 및 (b) 상기 제1층으로 부터 바이러스를 회수하는 단계를 포함하여, 바이러스 제제를 농축시키는 방법을 제공한다.
예로써, 아데노바이러스 제제를 Beckman 원심분리의 스윙 버킷 회전자를 사용하여 3,200g의 저속 원심분리로 농축시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 바이러스 제제를 여러개의 5ml 시험관에 넣는다. 이때 각각의 시험관은, 시험관 바닥의 제1층에 6.25% 용적의 70% 글리세롤, 그 위에 2.5% 용적의 20% 글리세롤, 및 맨위에 바이러스 제제를 함유한다. 이 후, 당해 제제를 약 16시간 동안 4℃에서 3,200g로 원심분리하여 농축된 바이러스를 글리세롤 층으로 펠릿화한 다음, 새로이 농축된 바이러스 제제를 연속하여 상기 제1층으로 부터 회수한다. 상기한 방법에 의해 농축된 바이러스는 양호한 광산란 특성 및 적합한 감염성을 지닌다.
본 발명의 방법에서 사용된 폴리하이드록시 탄화수소와 관련하여, "폴리하이드록시 탄화수소"는 2 이상(바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는 2 내지 4)의 하이드록시 그룹으로 치환된 측쇄, 직쇄, 또는 사이클릭 화합물을 의미하며, 폴리하이드록시 탄화수소의 유효량은 잠재적인 불안정화력, 예를 들면 농축 공정중에 발생하는 기계적 전단력으로 부터 바이러스를 안정화시키는데 충분한 양이다. 바람직하게는, 본 발명의 바이러스-농축 방법에서 폴리하이드록시 탄화수소는 20%, 보다 바람직하게는 25%의 최소 농도로 존재한다. 본 발명에 사용되는 폴리하이드록시 탄화수소로는 바람직하게는 2 내지 7의 탄소수를 갖는 폴리하이드록시-치환된 알킬 화합물(측쇄 또는 비측쇄형)이 바람직하며, 글리세롤, 소르비톨 및 폴리프로판올이 포함될 수 있다. 글리세롤이 특이 바람직하다.
본원의 발명자들에 의한 바이러스 농도를 증가시키는 새로운 방법은, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피와 같은 각종 처리 단계 동안 처리량을 상당히 증가시켜 병목 문제를 제거하는 방법으로 처리 과정을 향상시키는 추가적 이점을 갖는다. 따라서, 바람직한 태양에서, 본 발명에 따른 바이러스 제제의 농축 방법은, 크기 배제 크로마토그래피(예: 겔 여과)가 이온 교환 크로마토그래피에 후속하여 수행되는 바이러스 정제 방법에 적용될 수 있다. 이러한 태양의 경우, 속도-제한적 크기 배제 크로마토그래피 단계에 앞서 바이러스를 농축시키는데 필요한 기계적 전단력 뿐만 아니라, 음이온 교환 크로마토그래피 단계로 부터 용출된 바이러스 제제가 통상적으로 고농도의 염 및 바이러스 안정성을 추가로 손상시키는 기타 불순물을 함유한다는 사실로 인한 바이러스 안정성에 대한 추가적인 위협이 존재한다. 따라서, 특히 바람직한 태양에서, 본 발명은, (a) 바이러스가 음이온 교환 크로마토그래피의 매질로 부터 바이러스 제제 산물로서 용출되도록, 음이온 교환 크로마토그래피에 바이러스 제제를 적용시키는 단계;
(b) 바이러스 제제중의 폴리하이드록시 탄화수소 농도가 최종적으로 약 25% 이상이 되도록, 단계 (a)의 바이러스 제제 산물에 폴리하이드록시 탄화수소를 가하는 단계;
(c) 희석제는 여과기를 통해 바이러스 제제로 부터 제거되나 바이러스는 잔류하도록 당해 제제에 압력을 적용하여, 단계 (b)의 바이러스 제제 산물중의 바이러스 농도를 증가시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 농축된 바이러스 제제 산물을 하나 이상의 추가적 처리 단계에 적용시키는 단계를 포함하여, 바이러스 제제를 정제하는 방법을 제공한다.
음이온 교환 크로마토그래피과 관련하여 앞서 기술된 바람직한 태양에서, 글리세롤의 최소 농도는 (본 발명의 농축 방법에서 일반적으로 적용되는 20% 최소 농도 보다는) 25%인데, 그 이유는 이러한 특정한 적용시 음이온 교환 칼럼으로 부터 용출되는 산물중의 높은 염 농도로 인한 안정성에 대한 추가적 위협을 고려해야 하기 때문이다. 25% 글리세롤(바람직하게는 30%)를 첨가함으로써, 예를 들면 4℃에서 10일 이상 동안 염-함유 DEAE 푸울(pool)의 안정성이 유지된다; 따라서, 바이러스 농축 및/또는 겔 여과의 후속 단계들은 10일의 기간에 걸쳐 상당한 융통성을 갖고 각각 다른날에 수행될 수 있다. 예견되는 바와 같이, 바이러스 제제가 그밖의 처리 조건으로 인해 염 함량이 높은 경우, 25% 이상의 고농도의 폴리하이드록시 탄화수소가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
V. 본 발명의 방법의 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바림직한 태양을 설명한다: 본 발명의 범위는 이에 의해 제한되는 것으로 간주되지 않는다.
개관 - 발효 회수로 부터 수득된 동결된 조(crude) 바이러스 물질을 사용하여 농축된 배치를 개시한다. 일 태양에서, 아데노바이러스 산물을 먼저 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 이어서, 당해 제제를 크기 배제 칼럼상에 충전시키기 전에, 음이온 교환 푸울을 30%(v/v) 글리세롤의 존재하에 접선 유동 여과(TFF)에 의해 농축시킬 수 있다. 달리, 또 다른 태양에서, TFF 농축 단계를 크기 배제 크로마토그래피 후 20%(v/v) 이상 (바람직하게는 25%)의 글리세롤의 존재하에 수행할 수 있다.
TFF 전에 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 출발 물질의 제조
바람직한 태양에서, 아데노바이러스 교환 푸울을 하기와 같은 농도로 제조한다. 발효 및 회수 단계로 부터의 동결 바이러스 물질을 해동시키고 0.45㎛의 친수성 막을 통해 여과시킨다. 여액의 염 농도를 4M 염화나트륨을 가하여 조절한다. 이어서, 이 공급 용액을, 50mM 인산나트륨 pH 7.5, 260mM 염화나트륨, 2mM 염화마그네슘, 및 2%(w/v) 슈크로즈(완충액 A)로 예비-평형화시킨 Fractogel EMD DEAE-650M 칼럼에 적용한다. 아데노바이러스는 음이온 교환 수지에 결합하는 반면, 대부분의 매질 및 숙주 세포 불순물은 칼럼을 통과하고, 결국 전하는 소비된다. 상기 칼럼을 처음에는 완충액 A의 4 용적으로 세척하고 이어서, 두번째로 94%의 완충액 A 및 6%의 완충액 B(50mM 인산나트륨 pH 7.5, 600mM 염화나트륨, 2mM 염화마그네슘, 및 2%(w/v) 슈크로즈)의 8 베드(bed) 용적으로 동등하게(isocratic) 세척하여 추가적 불순물을 제거한다. 바이러스는 6% 내지 100%의 선형 구배의 30 베드 용적으로 칼럼으로 부터 용출된다. A280에 의해 측정된 바와 같은 용출 프로파일의 아데노바이러스 피크를 수집한다. 이어서, 글리세롤을 추가 공정을 위해 30%의 최종 농도에서 DEAE 푸울에 가한다.
접선 유동 여과를 사용하는 DEAE 푸울의 농축
(상기한 바에 따라 제조된) DEAE 푸울을, 1백만 분자량의 컷-오프 Biomax 막을 가진 Millipore TFF 단위(Pellicon XL 시스템)을 사용하여 10 내지 20배로 농축시킨다. 상기 공정을 2 내지 10℃ 또는 실온(25℃)에서 수행한다. 후술되는 여과 파라미터를 상기 공정에서 사용한다: 평균 입구 압력 = 14psi; 평균 침투 압력 = 0 psi; 평균 유동 속도 = 13리터/시간-평방 미터. 아데노바이러스의 최종 농도는 ml당 약 1.0 내지 2.0 x 1013 입자에 이른다. Resource Q-HPLC 및 UV 흡광도(A260) 분석을 토대로 하는 경우, 농축 단계의 회수율은, 유의할 응집을 보이지 않으면서(A320/A260에 의한 광산란 검정) 80%를 초과한다.
크기 배제 크로마토그래피(겔 여과)에 의한 완충액 교환
농축된 아데노바이러스 제제를, 20mM 인산나트륨 pH 8.0, 100mM 염화나트륨, 2mM 염화마그네슘, 2%(w/v) 슈크로즈 및 10% 글리세롤(완충액 C) 또는 11mM 인산나트륨, 14mM Tris, 2mM 염화마그네슘, 2%(w/v) 슈크로즈 및 10% 글리세롤, pH 7.8(완충액 D)로 예비-평형화시킨 Superdex-200 크기 배제 칼럼에 적용시킨다. 당해 컬럼을 평형 완충액으로 용출시킨다. A280에 의해 측정된 바와 같은 용출 프로파일의 아데노바이러스 피크를 수집한다. 농축된 아데노바이러스 제제를 2 내지 10℃에서 0.2㎛ 친수성 Durapore 막을 통해 여과시키고, -80℃ 또는 보다 높은 온도(예: 2 내지 10℃)에서 보관할 수 있다.
접선 유동 여과를 사용하는 Superdex -200의 농축
상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 태양은 음이온 교환 크로마토그래피후, 그러나 겔 여과 전에 바이러스를 농축하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 또 다른 태양에서, 바이러스 제제를 농축하는 상기 방법은 (바이러스 농축 단계가 음이온 교환 단계와 겔 여과 단계사이에 이용되지 않는 경우에도) 겔 여과 단계 후에 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 여과 파리미터는 DEAE 푸울을 농축시키는 경우의 파라미터가 동일하나, 단 DEAE 푸울중의 고농도의 염을 더 이상 처리할 필요가 없기 때문에 폴리하이드록시 탄화수소(예: 글리세롤)가 20%(v/v)와 같이 낮은 최종 농도에서 Superdex-200 푸울에 가해질 수 있다. 이와 관련하여, 유념해야 할 점은 폴리하이드록시 탄화수소의 첨가를 겔 여과 후로 연기하는 경우에는 DEAE 푸울을 겔 여과 칼럼에 즉시 적용해야 한다는 것이다(고농도의 염으로 인한 DEAE 푸울의 손상가능성 때문). 따라서, (본 발명에 따라) DEAE 푸울에 폴리하이드록시 탄화수소를 가하는 또 다른 이점은 음이온 교환 크로마토그래피와 후속적인 처리과정사이의 소요시간 동안의 보관 선택권 및 시간 간격면에서 융통성이 증가된다는 것이다.
바이러스 제제의 농축 방법은 다양한 정제 방법과 연계되어 적용될 수 있다. 정제 방법에 관한 추가적 정보는 본원에 참조로서 명백히 인용된 문헌[Huyghe et al., Human Gene Therapy, Vol.6, pp. 1403-1416 (1995)] 및 미국 특허원 제08/989,227호를 참조한다.
VI . 접선 유동 여과를 사용한 바이러스 제제의 농측 방법에 대한 안정성 자료
후술되는 실험 자료로 부터 알수 있듯이, 본 발명의 방법은, 바이러스를 농축시키는 기계적 전단력 및 DEAE중의 고농도의 염과 같은 악조건에도 불구하고 바이러스의 안정성을 크게 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히 (1) (저 농도의 물질로 부터 출발하는 경우일지라도) 임의의 목적 농도의 임상적 투여량의 즉석 제제, (2) (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피 동안의 처리량을 상당히 증가시키는 방법에 의한 ) 처리과정의 향상, 및 (3) 2 내지 10℃에서 10일 이상 동안의 염-함유 DEAE 푸울의 안정성 (이로써 바이러스 농축 및/또는 겔 여과의 후속 단계들을 10일간에 걸쳐 상당한 융통성을 갖고 각각 다른 날에 수행할 수 있음)을 제공할 수 있다.
A. DEAE 크로마토그래피 후의 바이러스 농축
아래의 3개의 실시예에서, 아데노바이러스의 안정한 농도는 (본 발명의 방법에 따라) 30% 글리세롤중에 DEAE 푸울을 농축시킴으로써 수득된다. 이어서, 당해 제제를 Superdex-200 겔 여과 크로마토그래피로 추가로 정제하여 시험을 위한 최종 제형을 수득한다.
실시예 D-1
최종 제형: 20mM NaPi, 100mM Nacl, 2mM MgCl2, 2% 슈크로즈, 10% 글리세롤, 2 내지 10℃에서 pH 8.
결과: 입자/FACS = 24, 광산란(A320/A260) = 0.22, 농도 = 1.6 x 1013개 입자/ml
실시예 D-2
최종 제형: 14mM Tris 염기, 11mM NaPi, 2mM MgCl2, 2% 슈크로즈, 10% 글리세롤, 2 내지 10℃에서 pH 7.8.
결과: 입자/FACS = 17, 광산란(A320/A260) = 0.25, 농도 = 1.5 x 1013개 입자/ml
실시예 D-3
최종 제형: 20mM NaPi, 100mM Nacl, 2mM MgCl2, 2% 슈크로즈, 10% 글리세롤, 2 내지 10℃에서 pH 8.
결과: 입자/FACS = 24, 광산란(A320/A260) = 0.25, 농도 = 1.3 x 1013개 입자/ml
B. 겔 여과 후의 바이러스 농축
실시예 S-1
아래의 실시예에서, 바이러스 제제를 겔 여과 후 20% 글리세롤중에 농축시킨다.
최종 제형: 16mM NaPi, 80mM NaCl, 1.6mM MgCl2, 1.6% 슈크로즈, 20% 글리세롤, 2 내지 10℃에서 pH 7.8.
결과: 입자/FACS = 72, 광산란(A320/A260) = 0.26, 농도 = 1.66 x 1013개 입자/ml
본원에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허원은, 각각의 공보, 특허 또는 특허원이 구체적 및 개별적으로 지적되어 참조문헌으로서 인용되는 바와 동일한 정도로 본원에 전문이 참조로써 인용된다.
본 발명의 변형 및 변화가 당업자에게는 명백할 것이다. 본원에 기술된 구체적 태양은 단지 예로서 제시된 것이며, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.

Claims (7)

  1. 20 내지 200 mg/mL의 글리세롤, 5 내지 25 mg/mL의 슈크로즈, 0.1 내지 1 mg/mL의 염화마그네슘, 및 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 7 내지 8.5 범위의 pH를 유지하는 완충 시스템을 포함하는 제형물 중에 재조합 아데노바이러스 A/C/N/53을 포함하고, 상기 완충 시스템이 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 인산나트륨 일염기성 이수화물 및 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 트로메타민을 포함하는 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 완충 시스템이 20 내지 27℃ 범위의 온도에서 7.3 내지 7.9 범위의 pH를 유지하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 20 내지 200 mg/mL의 글리세롤, 5 내지 25 mg/mL의 슈크로즈, 0.1 내지 1 mg/mL의 염화마그네슘, 및 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 7 내지 8.5 범위의 pH를 유지하는 완충 시스템을 포함하는 제형물 중에 재조합 아데노바이러스 A/C/N/53을 포함하고, 상기 완충 시스템이 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 인산나트륨 일염기성 이수화물 및 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 트로메타민을 포함하는 조성물로서, 이의 보관 동안 미립자의 형성을 방지하기 위해 교반에 이어서 미세여과되는 추가적 공정 단계로 처리되는 조성물.
  6. 20 내지 200 mg/mL의 글리세롤, 5 내지 25 mg/mL의 슈크로즈, 0.1 내지 1 mg/mL의 염화마그네슘, 및 2 내지 27℃ 범위의 온도에서 7 내지 8.5 범위의 pH를 유지하는 완충 시스템을 포함하는 제형물 중에 재조합 아데노바이러스 A/C/N/53을 포함하고, 상기 완충 시스템이 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 인산나트륨 일염기성 이수화물 및 0.5 내지 10 mg/mL 농도의 트로메타민을 포함하는 조성물로서, 이의 보관 동안 미립자의 형성을 방지하기 위해 1회 이상의 동결/해동 순환 후, 교반에 이어 미세여과되는 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 0.6 내지 10.0 mg/mL 농도의 1가 금속 염을 추가로 포함하는 조성물.
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