ES2349106T3 - Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. - Google Patents
Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2349106T3 ES2349106T3 ES06019642T ES06019642T ES2349106T3 ES 2349106 T3 ES2349106 T3 ES 2349106T3 ES 06019642 T ES06019642 T ES 06019642T ES 06019642 T ES06019642 T ES 06019642T ES 2349106 T3 ES2349106 T3 ES 2349106T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- concentration
- preparation
- viruses
- concentrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 151
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 title claims description 27
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title description 23
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims abstract description 42
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 42
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 20
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 19
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 14
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 14
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 14
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 11
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 11
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 10
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 5
- -1 sucrose Chemical class 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical class [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 3
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 3
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 3
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].OP(O)([O-])=O VBJGJHBYWREJQD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- ZWEVPYNPHSPIFU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5,6-pentahydroxy-n-[3-[3-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoylamino)propyl-[4-(3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoyl]amino]propyl]hexanamide Chemical compound OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)N(CCCNC(=O)C(O)C(O)C(O)C(O)CO)CCCNC(=O)C(O)C(O)C(O)C(O)CO)C)C1(C)C(O)C2 ZWEVPYNPHSPIFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013175 Crataegus laevigata Nutrition 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229920001219 Polysorbate 40 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 1
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 1
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 108010079785 calpain inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical group 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000002607 heparin antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000076 hypertonic saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 1
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940101027 polysorbate 40 Drugs 0.000 description 1
- 229940113124 polysorbate 60 Drugs 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000011085 pressure filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-HZAMXZRMSA-N 0.000 description 1
- AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N taurodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un procedimiento para concentrar una preparación de virus que comprende: (a) centrifugación a baja velocidad de una composición que comprende una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus; y (b) recuperación del virus de la primera capa.
Description
Composiciones que comprenden virus y
procedimientos para concentrar preparaciones virales.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden virus, especialmente vectores virales, que tienen
estabilidad significativamente mejorada. Las composiciones descritas
en este documento son útiles para mantener la estabilidad de virus
durante el almacenamiento, y las composiciones que contienen virus
descritas en este documento son particularmente útiles para usos
terapéuticos tales como terapia génica. También se proporcionan
nuevos procedimientos para concentrar y purificar preparaciones
virales.
Los virus se han hecho importantes de forma
creciente para usos terapéuticos, tales como vacunaciones y terapia
génica, y existe la necesidad de desarrollar y preparar
composiciones que contienen virus estables que puedan almacenarse y
transportarse fácilmente, reteniendo aún suficiente seguridad y
eficacia. En particular, dado el uso extensivo de los vectores
virales en terapia génica, es importante desarrollar y preparar una
formulación que pueda conservar de forma estable virus
recombinantes vivos cuando llevan transgenes terapéuticos.
Además, existe la necesidad crítica de
formulaciones que puedan estabilizar preparaciones virales a
temperaturas por encima de -80ºC durante periodos prolongados de
tiempo. Las composiciones que contienen virus normalmente requieren
almacenamiento a -80ºC y no pueden almacenarse a temperaturas de
refrigeración convencionales (por ejemplo, de 2ºC a 8ºC, o mayores)
durante periodos sustanciales de tiempo. Esta limitación representa
un serio impedimento no solamente para el almacenamiento, sino
también para el procesamiento, distribución, y uso clínico
extendido.
También existe la necesidad de desarrollar
composiciones que contienen virus que pueden mantener el pH en el
intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 durante
periodos prolongados a pesar de exponerse a temperaturas de
refrigeración, y a pesar de someterse a condiciones duras tales como
congelación/descongelación, especialmente las lentas velocidades de
congelación/descongelación que pueden existir en conexión con
producción, manipulación, o distribución a mayor escala. El
mantenimiento del pH es importante para las preparaciones virales
porque a pH por debajo de 7,0 y por encima de 8,5 las partículas de
virus vivo son vulnerables a la pérdida de viabilidad debido a la
inestabilidad física y biológica.
Los problemas adicionales se refieren a
concentraciones crecientes de virus. En particular, una
concentración elevada de virus contribuye significativamente a la
inestabilidad del virus. Sin embargo, son necesarias concentraciones
crecientemente mayores de virus y vectores virales para uso
terapéutico. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de
desarrollar formulaciones que estabilicen concentraciones
relativamente elevadas de virus, especialmente en las duras
condiciones mencionadas anteriormente. Y además, existe una
necesidad particular de desarrollar nuevos procedimientos para
concentrar una preparación de virus existente para conseguir
preparaciones estables a niveles de concentración mayores. Los
problemas de inestabilidad asociados con concentraciones mayores de
virus se exacerban significativamente si se intenta concentrar una
preparación de virus existente. Esto se debe en parte a las fuerzas
mecánicas de cizalla adicionales que tiene que soportar durante los
esfuerzos para aumentar la concentración de una preparación de
virus existente. Si se pudiera encontrar un procedimiento para
concentrar una preparación de virus sin alteración sustancial a la
estabilidad del virus, entonces podrían prepararse fácilmente
dosificaciones clínicas a cualquier concentración deseada (incluso
cuando se parte de material que tiene una concentración inferior)
y, de forma importante, la capacidad de concentrar el virus podría
eliminar los atascos problemáticos y otros problemas del aumento en
escala durante el procedimiento de purificación permitiendo un
rendimiento significativamente mayor durante diversas etapas de
procesamiento tales como cromatografía por exclusión de tamaño.
Por tanto existe la necesidad de materiales y
procedimientos para conseguir los objetivos anteriores.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un procedimiento para concentrar una preparación de
virus que comprende: (a) centrifugación a baja velocidad de una
composición que comprende una primera capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v),
la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v),
la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus;
y (b) recuperación del virus de la primera capa. Preferiblemente,
el virus es un virus recombinante, que lleva opcionalmente un
transgén terapéutico para su uso en terapia génica.
Preferiblemente, el virus es adenovirus, preferiblemente A/C/N/53.
El polihidroxi hidrocarburo es preferiblemente glicerol.
Se describe en este documento una composición
estable que comprende virus en una formulación que comprende un
polihidroxi hidrocarburo tamponado para mantener un pH en un
intervalo de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5 a una
temperatura en el intervalo de aproximadamente 2ºC a 27ºC.
Se proporcionan nuevos procedimientos para
concentrar una preparación de virus existente que permitan
seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en un
amplio intervalo de concentraciones deseadas. Un procedimiento
descrito para concentrar una preparación de virus comprende:
(a) añadir un polihidroxi hidrocarburo a una
preparación de virus a una concentración final de polihidroxi
hidrocarburo de aproximadamente el 20% o más; y
(b) someter la preparación de virus a un
procedimiento de filtración en el que se aumenta la concentración
de virus aplicando presión a la preparación de modo que se elimine
el diluyente de la preparación de virus a través de un filtro al
tiempo que se retiene el virus.
También se describe en este documento un
procedimiento para concentrar una preparación de virus que
comprende:
(a) centrifugar una composición que comprende
una primera capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una
concentración del 35% al 80% (v/v), la primera capa cubierta con una
segunda capa que comprende un polihidroxi hidrocarburo en una
concentración del 5% al 30% (v/v), la segunda capa cubierta con una
tercera capa que comprende virus; y
(b) recuperar el virus de la primera capa.
Además, los presentes inventores descubrieron
que su nuevo procedimiento de aumentar la concentración de virus
tiene la ventaja adicional de potenciar el procesamiento adicional
(por ejemplo, reduciendo o eliminando los atascos problemáticos
durante la posterior purificación permitiendo un rendimiento
significativamente mayor durante las etapas de procesamiento tales
como cromatografía por exclusión de tamaño). Por tanto, en una
realización preferida, el procedimiento para concentrar las
preparaciones de virus de acuerdo con la presente invención
comprende adicionalmente una etapa de purificación posterior (por
ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño). A este respecto,
el procedimiento de la presente invención es particularmente útil
cuando se realiza cromatografía por exclusión de tamaño posterior a
cromatografía de intercambio iónico, y se concentra la preparación
de virus (de acuerdo con la presente invención) después de la
cromatografía de intercambio iónico pero antes de la cromatografía
por exclusión de tamaño. Las fracciones virales obtenidas de una
cromatografía de intercambio aniónico, por ejemplo, típicamente
contienen elevados niveles de sales y posiblemente otras impurezas
que comprometen adicionalmente la estabilidad del virus durante los
procedimientos de concentración. Se describe en este documento un
procedimiento para purificar una preparación de virus que
comprende:
(a) someter la preparación de virus a
cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye
en forma de un producto de preparación de virus de un medio de
cromatografía de intercambio aniónico;
(b) añadir un polihidroxi hidrocarburo al
productor de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la
concentración de polihidroxi hidrocarburo en la preparación alcance
una concentración final de aproximadamente el 25% o más; y
(c) aumentar la concentración de virus en el
producto de preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión
a la preparación de modo que se retire el diluyente de la
preparación de virus a través de un filtro mientras se retiene el
virus; y
(d) someter el producto de preparación de virus
concentrado de la etapa (c) a una o más etapas de procesamiento
adicionales.
La presente invención también proporciona
preparaciones de virus concentradas y/o purificadas por el
procedimiento de la invención, que es como se define en las
reivindicaciones adjuntas.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
solicitud describe nuevas composiciones que contienen virus, así
como nuevos procedimientos para concentrar y purificar composiciones
que contienen virus.
Con respecto a las composiciones, los presentes
inventores han desarrollado una nueva formulación tamponada que
puede conservar las preparaciones virales con estabilidad
potenciada. En particular, la formulación puede estabilizar las
preparaciones virales a temperaturas muy por encima de -80ºC. Aún
más importante, las composiciones de la presente invención son
estables a temperaturas de refrigeración típicas de, por ejemplo,
2ºC a 8ºC, o mayores, durante periodos sustanciales de tiempo,
preferiblemente durante varios meses o más. Esto es una ventaja
crítica porque, como se ha mencionado anteriormente, para cumplir
las necesidades clínicas, es impracticable mantener las
preparaciones virales congeladas a -80ºC durante el almacenamiento y
el transporte.
Una característica importante de las
composiciones descritas en este documento es la adición de un
polihidroxi hidrocarburo. Como se usa en este documento, un
polihidroxi hidrocarburo significa un compuesto ramificado, lineal,
o cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente de 2 a 6, más
preferiblemente de 2 a 4) grupos hidroxi. Los polihidroxi
hidrocarburos para su uso en la presente invención preferiblemente
son compuestos alquilo polihidroxi-sustituidos
(ramificados o no ramificados), que tienen preferiblemente de 2 a 7
átomos de carbono, y pueden incluir, por ejemplo, glicerol,
sorbitol y polipropanol. El glicerol es particularmente preferido.
Como se muestra por los datos proporcionados a continuación, los
presentes inventores descubrieron que el glicerol permite niveles
sorprendentemente elevados de estabilidad durante periodos
prolongados de tiempo incluso en condiciones de refrigeración
convencionales.
Una cantidad eficaz de polihidroxi hidrocarburo
para la composición descrita en este documento es una cantidad
suficiente para estabilizar el virus en la formulación de la
presente invención sin afectar de forma adversa a la eficacia del
virus para su uso adicional, especialmente en casos en los que el
virus contiene un transgén para su uso en terapia génica. El
polihidroxi hidrocarburo está preferiblemente presente a una
concentración final de aproximadamente 20 a 200 mg/ml. Un intervalo
más estrecho puede ser de 80 a 120 mg/ml. Puede usarse más de un
polihidroxi hidrocarburo para conseguir la cantidad total deseada de
polihidroxi hidrocarburo en la composición descrita en este
documento.
El polihidroxi hidrocarburo puede contener
opcionalmente un grupo aldehído. En particular, el polihidroxi
hidrocarburo puede ser un disacárido tal como sacarosa. Además,
incluso si el polihidroxi hidrocarburo seleccionado para la
composición no contiene un grupo aldehído, la composición puede
incluir adicionalmente un disacárido, tal como sacarosa, como
estabilizador y agente de ajuste de la tonicidad. Cuando la
composición descrita en este documento ya contiene un polihidroxi
hidrocarburo adecuado (tal como glicerol) y se emplea un disacáridos
en las realizaciones preferidas como estabilizador adicional o
agente de ajuste de la tonicidad, el disacárido está
preferiblemente presente en un intervalo de 5 a 25 mg/ml, más
preferiblemente 20 mg/ml, y preferiblemente el disacárido es
sacarosa.
Se usan estabilizadores de sales de metales
divalentes farmacéuticamente aceptables, tales como sales de
magnesio, sales de zinc y sales de calcio, en realizaciones
preferidas de la composición descrita en este documento.
Preferiblemente, la sal es una sal cloruro o una sal de magnesio,
siendo la sal de magnesio particularmente preferida.
Preferiblemente, la sal (por ejemplo, la sal de magnesio) está
presente en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 1 mg/ml, más
preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 0,4 mg/ml.
Pueden incluirse estabilizadores de sales de
metales monovalentes farmacéuticamente aceptables tales como sales
de potasio, sodio, litio y cesio en realizaciones preferidas de la
presente descripción como estabilizadores opcionales.
Preferiblemente, la sal es cloruro sódico presente en la cantidad de
0,6 a 10,0 mg/ml, más preferiblemente en una cantidad de
aproximadamente 5,8 mg/ml.
Además de estabilizar la composición, el cloruro
sódico puede suprimir la velocidad y grado de aparición de
subproductos de fermentación, provocando una presentación
farmacéuticamente más elegante que puede tener potencial reducido
de antigenicidad debido a agregados proteicos. La adición de cloruro
sódico no afecta al pH de la formulación.
La composición descrita en este documento es
capaz de mantener un pH en el intervalo de aproximadamente 7 a
aproximadamente 8,5 durante periodos prolongados de tiempo, incluso
cuando se somete a condiciones duras tales como refrigeración y
congelación/descongelación. Además, las composiciones pueden
permanecer estables y mantener el intervalo de pH requerido incluso
cuando se someten a la velocidad relativamente lenta de
congelación/descongelación que puede suceder en conexión con la
producción, distribución, y manipulación a mayor escala. Como se ha
indicado anteriormente, el mantenimiento del pH es importante para
las preparaciones virales, porque a pH por debajo de 7,0 y por
encima de 8,5, las partículas de virus vivo pueden llegar a ser
inestables y degradarse. La composición particular de virus hace
que los virus sean difíciles de estabilizar y conservar.
Para conseguir el mantenimiento del pH en
condiciones duras, la presente invención comprende preferiblemente
un sistema tampón que puede mantener un pH óptimo en un intervalo de
aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,5 a pesar del
almacenamiento entre -80ºC y 27ºC y a pesar de someterse a
condiciones de congelación/descongelación. Como el pH puede variar
dependiendo de la temperatura, los intervalos de pH de la presente
invención se ilustran más específicamente a continuación con
referencia a intervalos de temperatura específicos. Por ejemplo, a
temperaturas de refrigeración (por ejemplo, de aproximadamente 2ºC a
8ºC) un intervalo de pH preferido es de aproximadamente 7,7 a
aproximadamente 8,3, más preferiblemente de aproximadamente 7,9 a
aproximadamente 8,2. A temperatura ambiente (por ejemplo, de
aproximadamente 20ºC a 27ºC, preferiblemente de 22ºC - 25ºC), un
intervalo preferido de pH es de aproximadamente 7,3 a
aproximadamente 8,2, más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a
aproximadamente 7,9.
Un sistema tampón preferido de la presente
invención comprende fosfato sódico monobásico dihidrato en una
concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml y trometamina en una
concentración de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml. (La trometamina
también se conoce como TRIS o "Trizma" disponible en Sigma
Chemical Co.). Sin embargo, pueden usarse otros sistemas tampón.
Por ejemplo, puede usarse fosfato sódico dibásico dihidrato si está
acoplado con una forma ácida de tampón tris. En una realización
particularmente preferida, el sistema tampón comprende fosfato
sódico monobásico dihidrato en una concentración de aproximadamente
1,7 mg/ml y trometamina en una concentración de aproximadamente 1,7
mg/ml, y tiene la capacidad de mantener la formulación en un
intervalo de pH óptimo de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 7,9
a 25ºC.
La formulación descrita en este documento tiene
la ventaja adicional de tener la capacidad de estabilizar
concentraciones elevadas de virus en las duras condiciones
mencionadas anteriormente (tales como temperaturas de refrigeración
y procesamiento de congelación/descongelación). En particular, la
formulación puede mantener la estabilidad del virus a
concentraciones que varían hasta 1 x 10^{13} partículas/ml. Un
intervalo preferible de concentraciones de virus para su uso en la
presente invención está en una cantidad de 1 x 10^{9} a 1 x
10^{13} partículas/ml, más preferiblemente, hasta 1 x 10^{12}
partículas/ml, por ejemplo de 1 x 10^{9} (o 1 x 10^{10}) a 1 x
10^{12}.
El término "diluyente" como se usa en este
documento, puede comprender un disolvente (por ejemplo, agua,
preferiblemente agua estéril) o una mezcla de un disolvente y otros
ingredientes tales como disolventes adicionales, estabilizadores
adicionales, tampones adicionales, y/u otras sustancias que no
afectan de forma adversa a la seguridad, eficacia y estabilidad de
la formulación. Con respecto a los diluyentes, estabilizadores,
tampones y similares, puede hacerse referencia, por ejemplo, a
Remington's Pharmaceutical Science, 15ª Ed., Mack Publishing
Company, Easton, Pennsylvania.
Puede incluirse opcionalmente un tensioactivo,
preferiblemente un detergente no iónico tal como un éster de ácido
graso de polioxietileno (por ejemplo, polioxietilenosorbitanos tales
como Polysorbate 20, Polysorbate 40, Polysorbate 60, o Polysorbate
80 de ICI Americas, Inc., Wilmington Delaware, o Tween 20, Tween,
40, Tween 60 y Tween 80 de Sigma, St. Louis, Mo.) en la composición
descrita en este documento. Preferiblemente, el detergente no
iónico es un éster de ácidos graso de polioxietileno, y el éster de
ácido graso de polioxietileno es preferiblemente Polysorbate 80,
que puede actuar como estabilizador en la composición de la presente
invención. La concentración del detergente no iónico está
preferiblemente en un intervalo de 0,03 a 0,3 mg/ml; más
preferiblemente, 0,15 mg/ml.
Las composiciones descritas en este documento
pueden contener adicionalmente uno o más "agentes potenciadores
de la administración". Un "agente potenciador de la
administración" se refiere a cualquier agente que potencia la
administración de un gen terapéutico, tal como un gen supresor
tumoral a un tejido u órgano canceroso. Los ejemplos de dichos
agentes potenciadores de la administración incluyen, aunque sin
limitación, detergentes, alcoholes, glicoles, tensioactivos, sales
biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de la
ciclooxigenasa, soluciones salinas hipertónicas, y acetatos.
Los detergentes (como se usa el término en este
documento) pueden incluir detergentes aniónicos, catiónicos,
zwitteriónicos, y no iónicos. Los detergentes ejemplares incluyen,
aunque sin limitación taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato,
octilpiridio, cloruro de benzalconio, detergente ZWITTERGENT®
3-14, CHAPS
(3-[3-Colamidopropil)dimetilamoniol]-1-propanosulfonato
hidrato, Aldrich), Big CHAP, Deoxi Big CHAP, detergente
TRITON®-X-100, C12E8,
Octil-B-D-Glucopiranósido,
detergente PLURONIC® - F68, detergente TWEEN® 20, y detergente
TWEEN® 80 (CALBIOCHEM® Biochemicals).
El uso de agentes potenciadores de la
administración se describe con detalle en la solicitud de Patente de
Estados Unidos relacionada U.S.S.N. 08/89.335 presentada el 8 de
julio de 1997, y la Publicación de Solicitud Internacional Nº WO
97/23072, 17 de julio de 1997, y en la solicitud de Patente de
Estados Unidos U.S.S.N. 09/112.074 presentada el 8 de julio de
1998, Solicitud Internacional PCT/US 98/14241. Además, se describe
el uso de inhibidores de calpaína junto con vectores virales para
aumentar la eficacia de transducción en las Solicitudes de Patente
de Estados Unidos U.S.S.N. 09/172.685 y 60/104321 presentadas el 15
de octubre de 1998.
Puede usarse un amplio intervalo de virus
incluyendo, aunque sin limitación, adenovirus, poxvirus, iridovirus,
herpesvirus, papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus,
virus adeno-asociados, virus vaccinia, rotavirus,
etc. (véase, por ejemplo, Anderson, Science (1992) 256:
808-813); siendo los adenovirus particularmente
preferidos. Los virus son preferiblemente virus recombinantes, pero
pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacuna atenuadas, y
etcétera. Por tanto, por ejemplo, un adenovirus recombinante
ejemplar que puede usarse es A/C/N/53, que se describe en la
Solicitud de Patente PCT WO 95/11984.
La formulación descrita en este documento es
particularmente muy adecuada para estabilizar un virus recombinante,
tal como un adenovirus recombinante vivo (o "vector viral"),
para uso terapéutico en terapia génica. Por ejemplo, el virus usado
en la presente invención puede comprende un gen supresor tumoral,
tal como un gen p53 de tipo silvestre o un gen Rb (por ejemplo,
p110^{RB} o p56^{RB}), y con transgenes tales como p53 de tipo
silvestre insertados en un vector viral, la composición puede
usarse como una composición farmacéutica para el tratamiento del
cáncer.
A este respecto, las formulaciones descritas en
este documento tienen una capacidad remarcable de mantener la
viabilidad de virus vivos, en particular un vector viral en el que
se ha insertado una secuencia de nucleótidos que codifica un
transgén tal como p53. Esta característica permite al virus mantener
su capacidad de infectar células diana de modo que la proteína
terapéutica codificada por el transgén insertado se produzca
adecuadamente.
Específicamente respecto a p53 y sus usos, se
aprecia que la mutación del gen p53 es la alteración genética más
habitual en cánceres humanos (Bartek (1991) Oncogene, 6:
1699-1703, Hollstein (1991) Science, 253:
49-53). La introducción de p53 de tipo silvestre en
células cancerosas de mamífero que carecen de la proteína p53 de
tipo silvestre endógena suprime el fenotipo neoplásico de esas
células (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos
5.532.220).
En los siguientes ejemplos (Ejemplos
1-5, aunque no son procedimientos, se mantienen para
información de los antecedentes), el virus es un adenovirus
recombinante vivo que contiene el gen p53 de tipo silvestre. La
construcción de vector viral particular usada en estos ejemplos se
menciona en este documento como "A/C/N/53". A/C/N/53 (también
mencionada como "ACN53") es una construcción de vector viral
particularmente preferida descrita en la solicitud relacionada USSN
08/328.673 presentada el 25 de octubre de 1994, y en el documento WO
95/11984 (4 de mayo de 1995).
Una fórmula representativa para las
realizaciones preferidas de la presente invención que contienen
Polysorbate 80 se expone a continuación
(Las composiciones se almacenan típicamente en
dosificaciones de 1,0 ml. "añ. c.s." en la fórmula anterior
significa añadir suficiente disolvente para alcanzar el volumen
total de 1 ml).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se exponen cuatro realizaciones
particularmente preferidas. (El Polysorbate 80 está presente en los
Ejemplos 1 y 2, pero ausente en los Ejemplos 3 y 4)
Los siguientes ingredientes: fosfato sódico
monobásico dihidrato, trometamina, cloruro de magnesio hexahidrato,
sacarosa, y glicerol pueden obtenerse todos de, por ejemplo, EM
Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, Nueva York 10532. El
Polysorbate 80 está disponible en, por ejemplo, ICI Americas, Inc.,
Wilmington Delaware, 19897.
Composiciones: pueden prepararse durante la
purificación del virus en una columna de cromatografía de filtración
en gel combinando los ingredientes (excluyendo
Polysorbate-80) a las concentraciones deseadas en la
columna de filtración en gel. (Con respecto a los procedimientos de
filtración en gel, puede hacerse referencia, por ejemplo, a la
siguiente Sección V). Después, si se desea diluir la concentración
del virus, o incorporar Polysorbate-80, entonces
pueden prepararse diluyentes por técnicas convencionales. Se expone
un ejemplo ilustrativo a continuación:
Se carga y disuelve fosfato sódico monobásico
dihidrato, trometamina, sacarosa, cloruro de magnesio hexahidrato y
glicerol en aproximadamente el 75% del volumen del lote de agua para
inyección a temperatura ambiente en un recipiente de acero
inoxidable equipado con un agitador. El lote del diluyente
resultante se lleva al volumen final con agua para inyección. Se
comprueba el pH. Se calcula el volumen necesario de sustancia de
fármaco A/C/N/53 (adenovirus con p53 de tipo silvestre como
transgén) en suspensión y el volumen necesario de diluyente para
preparar una inyección de A/C/N/53. Si la inyección de A/C/N/53
final va a contener Polysorbate 80, se prepara una solución madre
que contiene un exceso del 10% de Polysorbate 80 en diluyente. Se
cargan las cantidades calculadas de sustancia de fármaco A/C/N/53
en suspensión y diluyente en un recipiente de acero inoxidable y se
mezclan. Se carga la solución de Polysorbate 80, antes de añadir
todo el diluyente, en base al 10% del volumen de lote de inyección
de A/C/N/53 total si se requiere. Se filtra asépticamente la
suspensión a través de un filtro esterilizado (0,22 \mum o
equivalente). Se ensaya la integridad del filtro después de la
filtración. Se recoge y se carga la suspensión esterilizada en
viales que tienen el volumen apropiado. Se tapan y se precintan los
viales.
Se exponen los datos de estabilidad de los
Ejemplos 1, 2, 3, y 4, respectivamente, en las siguientes Tablas 1,
2, 3, y 4.
En las siguientes Tablas, el ensayo de
antiproliferación es un bioensayo usado para medir la capacidad del
producto de suprimir las células cancerosas y se basa en líneas
generales en el procedimiento usado por Wills, y col., 1994, Human
Gene Therapy, 5:1079-1088. Los números enumerados
indican la actividad mientras que el control no tiene
actividad.
El "Ensayo de Placa" mide las partículas
virales en cultivo valorando la cantidad de placas virales como
función de la dilución y se basa en líneas generales sobre
procedimientos descritos en Graham, F.L., y Prevec, L., Methods in
Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols,
E.J. Murray, ed. (Humana Press Inc., Clifton NJ) pág.
109-128 (1991); véase también Graham, F.L.,
Smiley, J., Russel, W.C., y Nairn, R., J. Gen. Virol. vol. 36, pág.
59-74 (1977).
El ensayo "FACS" muestra la capacidad del
virus de infectar células, y estas mediciones se basan en líneas
generales en los procedimientos descritos en, por ejemplo, la
Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/11865 (documento WO
98/01582, publicado el 15 de enero de 1998). En la siguiente columna
a la derecha, los números presentados bajo el encabezado
"Concentración" representan la concentración de la cantidad
total de partículas virales. Finalmente, los números bajo el
encabezado "Proporción Partícula/FACS" representan la
proporción de la cantidad total de partículas virales en
comparación con la cantidad de partículas virales infecciosas, que
indica por tanto la potencia relativa de la preparación viral.
Los datos bajo el encabeza "UV" indican la
agregación de las partículas virales mostrada por la proporción de
absorbancia UV para las longitudes de onda A_{320}/A_{260} como
una indicación de la dispersión de luz. Básicamente, la absorbancia
a longitud de onda de 320 nanómetros mide la cantidad de dispersión
de luz, mientras que la absorbancia a longitud de onda de 260
nanómetros se correlaciona con la cantidad de ADN.
Las temperaturas enumeradas en la segunda
columna de las tablas bajo "condición" representan la
temperatura de almacenamiento. Los ensayos fisiológicos se realizan
a 37ºC y el pH en la última columna se mide a temperatura ambiente,
aproximadamente 25ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
5
Formulación para el Ejemplo 5: A/C/N/53
(7,5x10^{11} partículas/ml), Trometamina (TRIS) (1,7 mg/ml),
Fosfato sódico monobásico dihidrato (1,7 mg/ml), Sacarosa (20
mg/ml), Cloruro de magnesio hexahidrato (0,4 mg/ml), Glicerol (100
mg/ml), Cloruro sódico (5,8 mg/ml), Volumen de carga = 10 ml.
\newpage
En algunos casos, se ha observado que se forman
particulados en la formulación durante el almacenamiento a 4ºC. El
análisis de los particulados por SDS-PAGE sugiere
que los particulados están compuestos por impurezas minoritarias
(es decir, proteínas adicionales y algunas partículas virales
inmaduras), y por tanto estos particulados no afectan a la
viabilidad de la formulación. No obstante, en una realización
preferida para aclarar adicionalmente la formulación (para evitar
la posible formación de particulados), puede realizarse una etapa
opcional de microfiltración para eliminar cualquier particulado
potencial con poca pérdida de partículas virales. (Cuando se
realiza la microfiltración, debe apreciarse que es crítica una
suficiente área superficial de la membrana de microfiltración por
volumen de filtración para evitar la pérdida de virus según se
retira el particulado).
Además, en una realización preferida, los
presentes inventores han descubierto que la agitación, tal como
batido, puede acelerar la formulación de particulados y por lo tanto
es una etapa opcional adicional en el procedimiento de aclarado.
Por tanto, la agitación suave (por ejemplo, durante una noche, 10ºC,
usando una barra de agitación magnética) seguido de microfiltración
demostró eliminar los particulados de modo que no volviera a
formarse más particulado después de
re-agitación.
También se descubrió que ciclos de
congelación/descongelación podrían promover la formación de
particulado durante la re-agitación. Por tanto, en
otro procedimiento preferido, pueden realizarse opcionalmente uno o
más ciclos de congelación/descongelación, seguido de agitación, y
después microfiltración, para la prevención de formación de
particulado durante el almacenamiento del producto viral final a
temperaturas de refrigeración (por ejemplo, 4ºC).
La presente solicitud también describe un nuevo
procedimiento para concentrar de forma estable una preparación de
virus existente empleando una función de flujo tangencial (a partir
de ahora mencionado a veces como "TFF"), que permite
seleccionar y preparar fácilmente dosificaciones clínicas en un
amplio intervalo de concentraciones deseadas. El nuevo
procedimiento para concentrar una preparación de virus descrito en
este documento comprende:
(a) añadir un polihidroxi hidrocarburo a una
preparación de virus a una concentración final de polihidroxi
hidrocarburo de aproximadamente el 20% o más; y
(b) someter la preparación de virus a un
procedimiento de filtración en el que se aumenta la concentración
de virus aplicando presión a la preparación de modo que el diluyente
se elimine de la preparación de virus a través de un filtro
mientras se retiene el virus.
Los procedimientos de la presente invención son
susceptibles a un amplio intervalo de virus incluyendo, aunque sin
limitación, adenovirus, poxvirus, iridovirus, herpesvirus,
papovavirus, paramixovirus, ortomixovirus, retrovirus, virus
adeno-asociados, virus vaccinia, rotavirus, etc.;
siendo los adenovirus particularmente preferidos. Los virus son
preferiblemente virus recombinantes, pero pueden incluir aislados
clínicos, cepas de vacuna atenuadas, y etcétera. La presente
invención es particularmente útil para concentrar virus
recombinantes que llevan un transgén heterólogo para su uso en
terapia génica. Dichos virus son especialmente vulnerable a fuerzas
potencialmente desestablizantes, tales como las fuerzas mecánicas de
cizalla adicionales que acompañan a los procedimientos para
concentrar preparaciones de virus. Un adenovirus recombinante
ejemplar que puede concentrarse por el procedimiento de la
invención es A/C/N/53, que se describe en la Solicitud de Patente
PCT Nº WO 95/11984.
El procedimiento de filtración usado para
concentrar el virus de acuerdo con el procedimiento de la presente
descripción puede incluir cualquier procedimiento de filtración (por
ejemplo, ultrafiltración) en el que se aumente la concentración del
virus forzando a un diluyente a pasar a través de un filtro de tal
modo que el diluyente se retire de la preparación de virus mientras
que el virus es incapaz de pasar a través del filtro y por lo tanto
permanece, en forma concentrada, en la preparación de virus. La
ultrafiltración se describe con detalle en, por ejemplo,
Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L.
Zeman y A. Zydney (Marcel Dekkar, Inc., Nueva York, NY, 1996). Un
procedimiento de filtración particularmente preferido es la
filtración de flujo tangencial ("TFF") como se describe en, por
ejemplo, el catálogo MILLEPORE titulado "Pharmaceutical Process
Filtration Catalogue" pág. 177-202 (Bedford,
Massachusetts, 1995/96). El aparato de TFF preferido comprende un
sistema de filtro Pellicon II o Pellicon XL de Millipore
Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts (dirección web:
www.millipore.com), siendo particularmente preferido un sistema
Pellicon XL. En una realización preferida, los procedimientos de la
presente invención se realizan a temperaturas en un intervalo de
aproximadamente 2ºC a 27ºC.
Pueden emplearse otros procedimientos de
concentración para concentrar preparaciones de virus de acuerdo con
la presente invención. Por ejemplo, puede usarse ventajosamente el
empleo de polihidroxi hidrocarburo para concentrar una preparación
de virus por centrifugación. Por tanto, la presente invención
también proporciona un procedimiento para concentrar una
preparación de virus que comprende:
(a) centrifugación a baja velocidad de una
composición que comprende una primera capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v),
la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v),
la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus;
y
(b) recuperación del virus de la primera
capa.
A modo de ejemplo, puede concentrarse una
preparación de adenovirus por centrifugación a baja velocidad a
3.200 g usando rotores de cubeta giratoria de una centrífuga
Beckman. Para conseguir esto, la preparación de virus puede
colocarse en múltiples tubos de 5 ml, conteniendo cada tubo un
volumen del 6,25% del glicerol al 70% en una primera capa en la
parte inferior del tubo, cubierto con un volumen del 2,5% de
glicerol al 20%, con la preparación de virus superpuesta sobre la
parte superior. La preparación después se centrifuga a 3.200 g a
4ºC durante aproximadamente 16 horas para sedimentar el virus
concentrado en las capaz de glicerol y después la preparación de
virus recién concentrada se recupera posteriormente de la primera
capa. El virus concentrado por los procedimientos descritos
anteriormente tenía buenas características de dispersión de luz y
tenía propiedades de infectividad adecuadas.
Con respecto al polihidroxi hidrocarburo usado
en los procedimientos de la presente invención, un "polihidroxi
hidrocarburo" significa un compuesto ramificado, lineal, o
cíclico sustituido con 2 o más (preferiblemente de 2 a 6, más
preferiblemente de 2 a 4) grupos hidroxi, y una cantidad eficaz de
polihidroxi hidrocarburo es una cantidad suficiente para
estabilizar el virus frente a fuerzas potencialmente
desestabilizantes, tales como las fuerzas mecánicas de cizalla que
existen durante el procedimiento de concentración. Preferiblemente,
el polihidroxi hidrocarburo en los procedimientos de concentración
de virus descritos en este documento está presente en una
concentración mínima del 20%, más preferiblemente del 25%. Los
polihidroxi hidrocarburos para su uso en la presente invención
preferiblemente son compuestos alquilo
polihidroxi-sustituidos (ramificados o sin
ramificar), que tienen preferiblemente de 2 a 7 átomos de carbono, y
pueden incluir glicerol, sorbitol y polipropanol. El glicerol es
particularmente preferido.
El nuevo procedimiento de los inventores para
aumentar la concentración de virus tiene la ventaja adicional de
potencial el procesamiento, por ejemplo, eliminando los atascos
problemáticos permitiendo un rendimiento significativamente mayor
durante diversas etapas de prensado tales como cromatografía por
exclusión de tamaño. Por tanto, en una realización preferida, el
procedimiento para concentrar preparaciones de virus de acuerdo con
la presente invención puede aplicarse a procedimientos para
purificar virus en los que se realiza una etapa de cromatografía
por exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración en gel) después de
cromatografía de intercambio aniónico. En esta realización, existen
amenazas adicionales contra la estabilidad del virus provenientes
no solamente de las fuerzas mecánicas de cizalla necesarias para
concentrar el virus antes de la etapa de cromatografía por
exclusión de tamaño limitante de la velocidad, sino también debido
al hecho de que la preparación de virus eluida de la etapa de
cromatografía de intercambio aniónico típicamente contiene elevados
niveles de sales y otras impurezas que comprometen adicionalmente la
estabilidad del virus.
Se describe en este documento un procedimiento
para purificar una preparación de virus que comprende:
(a) someter la preparación de virus a
cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye
en forma de un producto de preparación de virus de un medio de
cromatografía de intercambio aniónico;
(b) añadir un polihidroxi hidrocarburo al
producto de preparación de virus de la etapa (a) de modo que la
concentración de polihidroxi hidrocarburo en la preparación alcance
una concentración final de aproximadamente el 25% o más; y
(c) aumentar la concentración de virus en el
producto de preparación de virus de la etapa (b) aplicando presión
a la preparación de modo que se retire el diluyente de la
preparación de virus o a través de un filtro mientras se retiene el
virus; y
(d) someter el producto de preparación de virus
concentrado de la etapa (c) a una o más etapas de procesamiento
adicionales.
En el procedimiento expuesto anteriormente en
relación con la cromatografía de intercambio aniónico, el nivel
mínimo de glicerol es del 25% (en lugar del nivel mínimo del 20% en
aplicaciones generales de los procedimientos de concentración
descritos en este documento debido a que esta aplicación particular
debe tener en cuenta las amenazas adicionales a la estabilidad
presentadas por las elevadas concentraciones salinas en el producto
eluido de la columna de intercambio aniónico. La adición de glicerol
al 25% (preferiblemente el 30%) provoca la estabilidad de la
combinación DEAE que contiene sales durante >10 días a, por
ejemplo, 4ºC; por lo tanto puede realizarse etapas posteriores de
concentración de virus y/o filtración en gel en días diferentes con
flexibilidad sustancial a través de un periodo de 10 días. Como se
apreciará, el empleo de polihidroxi hidrocarburo en la
concentración más elevada del 25% o más también puede usarse more en
procedimientos de la presente invención cuando la preparación de
virus contiene elevado contenido salino debido a otras condiciones
de procesamiento.
Breve resumen - Se inicia un lote
concentrado con materiales virales brutos congelados que se originan
de la recuperación de fermentación. En una realización, el producto
de adenovirus primero se purifica por cromatografía de intercambio
aniónico. Después, antes de cargar la preparación en una columna de
exclusión de tamaño, puede concentrarse la combinación de
intercambio aniónico por filtración de flujo tangencial (TFF) en
presencia de glicerol al 30% (v/v). Como alternativa, en otra
realización, la etapa de concentración por TFF puede realizarse en
presencia de glicerol al 20% (v/v) o más (preferiblemente el 25%)
después de cromatografía por exclusión de tamaño.
En un caso preferido, se prepara una combinación
adenoviral de intercambio aniónico para su concentración del
siguiente modo. Se descongela el material viral congelado de las
etapas de fermentación y recuperación y se filtra a través de una
membrana hidrófila de 0,45 \mum. La concentración salina del
filtrado se ajusta añadiendo cloruro sódico 4 M. Esta solución de
suministro se aplica después a una columna Fractogel EMD
DEAE-650M pre-equilibrada con
fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro sódico 260 mM, cloruro de
magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) (tampón A). El adenovirus se
une a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayor parte
del medio y las impurezas de las células huésped pasan a través de
la columna acabando en la carga gastada. La columna se lava
inicialmente con 4 volúmenes de tampón A seguido de un segundo
lavado isocrático de 8 volúmenes de lecho de tampón A al 94% y
tampón B al 6% (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro sódico 600 mM,
cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)) para retirar las
impurezas adicionales. El virus se eluye de la columna con un
gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho de tampón B del 6% al
100%. Se recoge el pico de adenovirus del perfil de elución
determinado por A_{280}. Después se añade glicerol a la
combinación DEAE a una concentración final del 30% (v/v) para el
procesamiento adicional.
La combinación DEAE (preparada de acuerdo con la
descripción anterior) se concentra a factor 10 a 20 usando una
unidad Millipore TFF (Pellicon XL System) con membranas Biomax de
punto de corte de peso molecular 1 millón. El procedimiento se
realiza a 2-10ºC o temperatura ambiente (25ºC). Se
usan los siguientes parámetros de filtración en este procedimiento:
presión promedio de entrada = 96,50 kPa (14 psi); presión promedio
de filtración = 0 kPa (0 psi); caudal promedio average = 13
litros/hora-metro cuadrado. La concentración final
de adenovirus consigue aproximadamente 1,0-2,0 x
10^{13} partículas por ml. En base al análisis Resource
Q-HPLC y de absorbancia UV (A_{260}), la
recuperación de la etapa de concentración es de >80% sin
agregación significativa (ensayo de dispersión de luz por
A_{320}/A_{260}).
La preparación de adenovirus concentrada se
aplica a una columna de exclusión de tamaño
Superdex-200 pre-equilibrada con
fosfato sódico 20 mM pH 8,0, cloruro sódico 100 mM, cloruro de
magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), glicerol al 10% (tampón C) o
fosfato sódico 11 mM, Tris 14 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa
al 2% (p/v), glicerol al 10%, pH 7,8 (tampón D). La columna se
eluye con tampón de equilibrado. Se recoge y se combina el pico de
adenovirus del perfil de elución determinado por A_{280}. La
preparación concentrada de adenovirus se filtra a través de una
membrana hidrófila de 0,2 \mum Durapore (Stericup, Millipore) de 2
a 10ºC, y puede almacenarse a -80ºC, o a temperaturas mayores (tal
como de 2 a 10ºC).
Como se ha analizado anteriormente, una
realización preferida de la presente invención implica concentrar
el virus después de cromatografía de intercambio aniónico, pero
antes de filtración en gel. Sin embargo, en otra
realización, los procedimientos descritos para concentrar
preparaciones de virus también pueden usarse después de la
etapa de filtración en gel (incluso si no se emplea una etapa de
concentración de virus entre la etapa de intercambio aniónico y la
etapa de filtración en gel). En este caso, los parámetros de
filtración son los mismos que para la concentración de una
combinación DEAE, excepto en que puede añadirse polihidroxi
hidrocarburo (por ejemplo, glicerol) a la combinación
Superdex-200 a una concentración final tan baja como
del 20% (v/v) ya que ya no es necesario ocuparse de las elevadas
concentraciones salinas en la combinación DEAE. A este respecto,
debe apreciarse que en casos en los se pospone la adición de
polihidroxi hidrocarburo hasta después de la filtración en
gel, la combinación DEAE debe aplicarse inmediatamente a la columna
de filtración en gel (debido a la vulnerabilidad de la combinación
DEAE - con sus elevada concentración salina). Por tanto, puede
observarse que una ventaja adicional de añadir polihidroxi
hidrocarburo a la combinación DEAE (de acuerdo con la presente
invención) es la flexibilidad aumentada en términos de intervalo de
tiempo y opciones de almacenamiento durante el periodo de tiempo
entre la cromatografía de intercambio aniónico y el posterior
procesamiento.
Los métodos para concentrar preparaciones de
virus pueden aplicarse en conexión a una diversidad de
procedimientos de purificación. Para información adicional sobre
procedimientos de purificación, puede hacerse referencia, por
ejemplo, a Huyghe y col., Human Gene Therapy, Vol. 6, pág.
1403-1416 (1995) y la Solicitud de Patente de
Estados Unidos Nº de serie 08/989.227.
Como se muestra por los siguientes datos
experimentales, los procedimientos de la presente descripción
permiten potenciar enormemente la estabilidad de los virus, a
pasear de las fuerzas mecánicas de cizalla para concentrar el
virus, y a pesar de las duras condiciones tales como elevados
niveles salinos en una combinación DEAE. Por tanto, los
procedimientos de la presente invención permite, inter alia,
(1) la preparación fácil de dosificaciones clínicas a cualquier
concentración deseada (incluso cuando se parte de material que tiene
una concentración inferior), (2) la potenciación del procesamiento
(por ejemplo, permitiendo un rendimiento significativamente mayor
durante la cromatografía por exclusión de tamaño), y (3) la
estabilidad de la combinación DEAE que contiene sales durante
>10 días a 2-10ºC (permitiendo por tanto que se
realicen posteriores etapas de concentración de virus y/o
filtración en gel en días diferentes con flexibilidad sustancial a
través de un periodo de 10 días).
En los siguientes tres ejemplos, se prepararon
concentraciones estable de adenovirus concentrando combinaciones
DEAE en glicerol al 30% (de acuerdo con los procedimientos de la
presente invención). Las preparaciones después se sometieron a
purificación adicional por cromatografía por filtración en gel
Superdex-200 para obtener la formulación final para
el ensayo.
Ejemplo
D-1
Formulación final: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM,
MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a
2-10ºC.
Resultados: Partículas/FACS = 24 Dispersión de
luz (A320/A260) = 0,22 Conc. = 1,6 x 10^{13} partículas/ml
Ejemplo
D-2
Formulación final: Tris base 14 mM, NaPi 11 mM,
MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 7,8 a
2-10ºC.
Resultados: Partículas/FACS = 17 Dispersión de
luz (A320/A260) = 0,25 Conc. = 1,5 x 10^{13} partículas/ml
Ejemplo
D-3
Formulación final: NaPi 20 mM, NaCl 100 mM,
MgCl_{2} 2 mM, sacarosa al 2%, glicerol al 10%, pH 8 a
2-10ºC.
Resultados: Partículas/FACS = 24 Dispersión de
luz (A320/A260) = 0,25 Conc. = 1,3 x 10^{13} partículas/ml.
Ejemplo
S-1
En el siguiente ejemplo, la preparación de virus
se concentró en glicerol al 20% después de filtración en gel.
Formulación final: NaPi 16 mM, NaCl 80 mM,
MgCl_{2} 1,6 mM, sacarosa al 1,6%, glicerol al 20%, pH 8 a
2-10ºC.
Resultados: Partículas/FACS = 72; Dispersión de
luz (A320/A260) = 0,26 Conc. = 1,66 x 10^{13} partículas/ml
Las realizaciones específicas descritas en el
presente documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la
invención no debe interpretarse como limitada por las mismas.
Claims (6)
1. Un procedimiento para concentrar una
preparación de virus que comprende:
(a) centrifugación a baja velocidad de una
composición que comprende una primera capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 35% al 80% (v/v),
la primera capa cubierta con una segunda capa que comprende un
polihidroxi hidrocarburo en una concentración del 5% al 30% (v/v),
la segunda capa cubierta con una tercera capa que comprende virus;
y
(b) recuperación del virus de la primera
capa.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el virus es un virus recombinante.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el virus es un virus recombinante que lleva un transgén a
terapéutico para su uso en terapia génica.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polihidroxi hidrocarburo es glicerol.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el virus es adenovirus.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que el virus recombinante es A/C/N/53.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2446298A | 1998-02-17 | 1998-02-17 | |
| US24462 | 1998-02-17 | ||
| US79643 | 1998-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2349106T3 true ES2349106T3 (es) | 2010-12-28 |
Family
ID=21820707
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06019642T Expired - Lifetime ES2349106T3 (es) | 1998-02-17 | 1999-02-12 | Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2349106T3 (es) |
| ZA (1) | ZA991235B (es) |
-
1999
- 1999-02-12 ES ES06019642T patent/ES2349106T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-16 ZA ZA9901235A patent/ZA991235B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA991235B (en) | 2000-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2290613T3 (es) | Composiciones que comprenden virus y metodos para concentrar preparaciones de virus. | |
| US20080293123A1 (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| US8133481B2 (en) | Selectively replicating viral vectors | |
| US20030153065A1 (en) | Composition and method for maintaining non-enveloped viral vectors | |
| ES2349106T3 (es) | Composiciones que comprenden virus y procedimientos para concentrar preparaciones virales. | |
| US20080261289A1 (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| NZ505952A (en) | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations | |
| CZ20002864A3 (cs) | Prostředek obsahující virus, způsoby jeho koncentrace a purifikace |