CN118496324A

CN118496324A - RSV pre-F突变体及其生产方法和用途

Info

Publication number: CN118496324A
Application number: CN202410642357.3A
Authority: CN
Inventors: 崔保峰; 于旭博; 蒋浩然; 王文宇; 滕忠坤; 周茹; 王姗姗; 王婧; 周翠云; 郑海东; 胡浩
Original assignee: Suzhou Ju Microbiology Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Ju Microbiology Technology Co ltd
Priority date: 2024-05-22
Filing date: 2024-05-22
Publication date: 2024-08-16

Abstract

本申请涉及一种RSV融合前F蛋白的突变体及其制备和应用。本申请提供RSV融合前F蛋白的突变体，其F1多肽的α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基α3‑1，β3折叠区域具有半胱氨酸取代基β3‑1和半胱氨酸取代基β3‑2，β4片层具有半胱氨酸取代基β4‑1,所述半胱氨酸取代基β3‑1和所述半胱氨酸取代基β4‑1形成二硫键，所述半胱氨酸取代基α3‑1和所述半胱氨酸取代基β3‑2形成二硫键。相对于传统技术，本申请发现了另外一组二硫键突变位置，主要在α3、β3和β4之间形成二硫键突变，对应形成的突变体能够与识别φ位点的特异性单克隆抗体结合，且表达量高，具有良好的稳定性，具有开发针对RSV疫苗的巨大潜力。

Description

RSV pre-F突变体及其生产方法和用途

技术领域

本申请属于生物技术领域，涉及一种RSV pre-F突变体及其生产方法和用途。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是一种常见的呼吸道病毒，属于病毒科下的单链RNA病毒，它是导致世界范围内婴幼儿和年幼儿童呼吸道感染的主要病原体之一。RSV最常见的流行季节是秋冬季，尤其在幼儿之间传播最为频繁。RSV感染可引起呼吸道病症，包括感冒症状、喉咙痛、咳嗽、打喷嚏、鼻塞和发热。在婴幼儿和免疫系统较弱的人群中，RSV可能导致严重的下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。

在过去的几十年中，许多RSV疫苗候选物已经进行了临床试验，包括减毒病毒疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等。然而，由于复杂的RSV病毒特性和免疫学反应，这些疫苗的开发面临了一些挑战，包括无法获得持久的保护性免疫应答，以及对儿童和老年人等高危人群的有效性可能不足。

尽管如此，科学家和制药公司仍在不断努力，试图寻找到更有效的RSV疫苗。一些研究团队正在专注于了解RSV病毒的免疫学特性，以及如何激发持久性和全面性的免疫反应。同时，一些新的技术平台和策略也在疫苗研发中被尝试，如微粒化疫苗、纳米粒子疫苗和结构特定抗原的设计等。

F蛋白属于I型糖蛋白。在细胞内合成无活性的前体F0，在成熟的过程中，F0由弗林酶切割形成F2(aa:1-109)、P27(aa:110-136)和F1(aa:137-574)，F2与F1以二硫键形成异源二聚体即F蛋白的单体，三个单体组装形成三聚体。F蛋白采用亚稳态的融合前F蛋白(pre-Fusion protein，pre-F)表达在病毒包膜表面，当与宿主细胞膜接触后，F1蛋白N末端的二级结构组件α2、α3及β3、β4和α4经过一系列重排后与其后的α5一同形成了一个更大的α螺旋结构，该系列过程导致了F蛋白由高能级亚稳态的pre-F结构转变为稳定的融合后F蛋白(post-Fusion protein，post-F)结构，相较于post-F，研究表明，绝大多数高效中和抗体靶向表位仅在pre-F，存在于pre-F单体顶端的抗原表位和pre-F三聚体顶端的抗原表位V被证明具有极强的效力。因此pre-F作为靶抗原已成为RSV疫苗的优先选择。

目前RSV疫苗研发方向是寻找构象更稳定的RSV pre-F突变体。基于蛋白质结构和稳定性原理进行设计，DS-Cav1突变体通过空腔填充突变(S190F和V207L)和二硫键替换(S155C和S290C)，将不稳定的F1蛋白N末端固定从而获得稳定且具抗原表位的pre-F蛋白(McLellan等，Science，2013)。美国国立卫生研究院(NIH)基于结构设计的迭代突变体也展示出了稳定的融合前构象(PCT/US2014/026714家族)，辉瑞公司(Pfizer)公开发明的RSV F蛋白突变体(CN 108738312A)设计突变位的策略也大致相似，二硫键替换除S155C和S290C外还有S55C和L188C、T103C和I148C以及L142C和N371C；空腔填充包括190位置被I取代，54位置被H取代等；增加静电突变D486S、E487Q等，同时进行不同的组合突变体。Janssen设计的SC-DM(Anders Krarup等，Nature Commnication，2015)是将弗林酶切割位点及P27删除并替换为GS Linker和引入突变N67I和S215P以维持蛋白稳定，最后运用T4噬菌体纤维蛋白三聚结构域使蛋白分泌表达并形成三聚体；而GSK的Pre-F-GCN4t(Normand Blais等，Journal of Virology，2017)将F0蛋白的跨膜结构域和C-末端结构域被工程化的酿酒酵母GCN4三聚化结构域取代；弗林酶切割位点和P27序列被去除，在F2和融合肽(FP)之间的该位置保留一个赖氨酸残基；增加了突变L112Q、Q471G和L482K以增加蛋白质的均一性和稳定性，并被证明可结合表位特异性单克隆抗体D25。

有上述表述可见，以RSV F蛋白结构为基础，基于不同的设计策略，衍生了多个位点的突变，这些突变均能够阻止RSV F蛋白向post-F蛋白的构象变化，使RSV F蛋白稳定在融合前构象(pre-F)。然而，为了寻找更加稳定的RSV pre-F蛋白构象，目前的研究仍是不充分的，pre-F蛋白的表达量和稳定性仍有提升的空间。因此，新的探索和尝试仍在努力尝试中。

2013年，通过抗体D25发现表位并命名为位点[McLellan,Jason S.,et al."Structure of RSV fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specificneutralizing antibody."Science 340.6136(2013):1113-1117.]，为解决在缺乏D25抗体，位点的不稳定问题，进一步改造获得工程化的稳定的RSV F蛋白融合前构象(pre-F)抗原[McLellan,Jason S.,et al."Structure-based design of a fusion glycoproteinvaccine for respiratory syncytial virus."science 342.6158(2013):592-598.]，主要涉及二硫键突变：DS(S155C、S290C)、空腔填充：Cav1(S190F、V207L)及突变组合DS-Cav1，也包括由其衍生的其他突变体(PCT/US2014/026714家族)。

2015年，Janssen Pharmaceutical发表了其构建的稳定化的pre-F蛋白突变体的研究证据，在F1和F2间引入短链Linker，变体结合纤维蛋白结构域后进行氨基酸突变改造获得SC-DM及SC-TM[Krarup,Anders,et al."A highly stable prefusion RSV F vaccinederived from structural analysis of the fusion mechanism."Naturecommunications 6.1(2015):8143.]，涉及的氨基酸突变包括：SC-DM(N67I，S215P)、SC-TM(N67I，S215P，E487Q)(US_11338031_B2家族)。

GSK公司在DS-Cavl的基础上进行二次开发(US8563002)，重点对弗林蛋白酶酶切割位点和蛋白C端三聚化进行了保护和约束。鉴于其良好的免疫原性和诱导中和抗体的能力，GSK于2022年宣布其RSV疫苗针对60岁以上成人III期临床取得积极结果，并于2023年05月03日获得上市许可(商品名：Arexvy)也是第一个针对RSV病毒的疫苗。

Pfizer基于其结构设计的稳定化的pre-F蛋白突变体(PCT/IB2016/057502家族)主要涉及的突变策略包括二硫键突变和空腔填充，涉及的二硫键突变位点包括：S55C/L188C、S155C/S290C、T103C/I148C、L142C/N371C,以及增强pre-F蛋白稳定性的其他空腔填充和静电突变位点。由于突变体良好的免疫原性和优良的疫苗效力，Pfizer于2022年宣布其二价RSV疫苗III期临床取得积极结果，在2023年5月获得上市许可(商品名：Abrysvo)，成为继Arexvy第二个针对RSV病毒的疫苗。

目前针对稳定化的RSV pre-F蛋白主要是表达量低，长期保存不稳定。针对这一问题需要对RSV F蛋白进行结构设计，寻找更加稳定的突变策略。

发明内容

基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种RSV pre-F突变体及其生产方法和用途。

本申请的一个或者多个实施例提供一种RSV pre-F的突变体，所述突变体的F1多肽满足如下(1)或者(2)所示的条件：

(1)β3片层区域具有半胱氨酸取代基β3-1，β4片层区域具有半胱氨酸取代基β4-1，所述半胱氨酸取代基β3-1和所述半胱氨酸取代基β4-1形成二硫键；

(2)α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基α3-1，β3片层区域具有半胱氨酸取代基β3-1和半胱氨酸取代基β3-2，β4片层具有半胱氨酸取代基β4-1，所述半胱氨酸取代基β3-1和所述半胱氨酸取代基β4-1形成二硫键，所述半胱氨酸取代基α3-1和所述半胱氨酸取代基β3-2形成二硫键；

所述突变体具有以下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合1为S180C和S186C；以及，

组合2为K176C和S190C。

在本申请的一些实施方式中，所述RSV pre-F的突变体的物种来源为人或者牛。

在本申请的一些实施方式中，所述RSV pre-F的F1多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中任一所示，或者与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.71和SEQID NO.72中任一所示的氨基酸序列所存在至少80％的同源性；

可选地，所述F1多肽满足如下条件中的一个或者多个：

(1)不含跨膜结构域，以及

(2)不含胞内结构域；

更进一步可选地，所述F1多肽具有如下突变中的一个或者多个：I379V和M447V。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体具有如下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合3为S180C、S186C、A170C、A177C；

组合4为S180C、S186C、E163C、L181C；

组合5为S180C、S186C、A170C、V179C；

组合6为S180C、S186C、L171C、A177C；

组合7为K176C、S190C、A170C、A177C；

组合8为K176C、S190C、E163C、L181C；

组合9为K176C、S190C、A170C、V179C；以及，

组合10为K176C、S190C、L171C、A177C。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：S55C、S155C、V207L以及S290C。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体不含pep27多肽，F2多肽的C端和所述F1多肽的N端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接；

可选地，所述柔性短肽为GS、G、S、GS、SG、SS、GG、PG、GGG、GGS、SSS、GSG、SGS、GPG、GSGS、GGGS、GPGS、GGGG、GSGG、GGSG、SGGG、GSSG、SGSG、GSSG、GGPGG或者GGGGS。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体的F2多肽满足如下条件中的一个或者多个：

1)C端不含有NN，以及，

2)具有如下突变：P102A；

在本申请的一些实施方式中，所述突变体的C末端连接有标签片段；可选地，所述标签片段包括多聚组氨酸；进一步可选地，所述多聚组氨酸包括8His片段。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体还包括结构性多肽和功能性多肽中的一种或者多种；所述结构性多肽使多个所述突变体的单体形成多聚体，所述功能性多肽增强所述突变体的生物学活性；

可选地，所述结构性多肽包括聚集基序、GCN4亮氨酸拉链和纳米颗粒缀合片段中的一种或者多种；

可选地，所述功能性多肽包括抗原特异性结合片段；

可选地，所述结构性多肽和所述功能性多肽中的一种或者多种。

在本申请的一些实施方式中，所述突变体的序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.70任一所示。

本申请的一个或者多个实施例提供一种核酸分子，其编码所述的突变体。

本申请的一个或者多个实施例提供一种载体，其包括所述的核酸分子。

本申请的一个或者多个实施例提供一种工程细胞，其表达所述的突变体，或者其包括所述的核酸分子或者所述的载体。

本申请的一个或者多个实施例提供一种所述的突变体的生产方法，其包括如下步骤：

培养所述的工程细胞，以及，从所得培养上清中分离出突变体。

本申请的一个或者多个实施例提供一种免疫组合物，其包括所述的突变体、或者所述的核酸分子，以及免疫佐剂；

可选地，所述免疫佐剂包括铝盐佐剂、表面活性剂、多聚核苷酸、脂多糖、脂质体、油乳佐剂中的一种或者多种。

本申请的一个或者多个实施例提供一种所述的突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒中的应用。

本申请的一个或者多个实施例提供一种呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，其包括所述的突变体。

本申请的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本申请的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为用于构建RSV pre-F蛋白的表达质粒；

图2为RSV F0前体多肽结构示意图(A、B、牛)；

图3为稳定化突变单体RSV F蛋白的氨基酸序列示意图；

图4为稳定化突变RSV F蛋白的多聚化结构示意图；

图5为α3、β3和β4位置示意图(局部和整体)；

图6为β3/β4位置中Cα间距离的氨基酸残基对；

图7为α3/β3位置中Cα间距离的氨基酸残基对；

图8为位于β3和β4位置形成的突变体pre-F表达量；

图9为位于β3和β4位置形成的突变体pre-F的热稳定性；

图10为位于α3和β3位置形成的突变体pre-F的表达量；

图11为位于α3和β3位置形成的突变体pre-F的热稳定性；

图12为位于α3/β3与β3/β4位置形成的双二硫键突变体pre-F的表达量；

图13为位于α3/β3与β3/β4位置形成的双二硫键突变体pre-F的热稳定性；

图14为RSV pre-F突变体单体SDS-PAGE鉴定；

图15为RSV pre-F突变体单三聚体SDS-PAGE鉴定；

图16为RSV pre-F突变体单体HPLC鉴定；

图17为RSV pre-F突变体三聚体HPLC鉴定；

图18为RSV pre-F突变体三聚体抗原性鉴定；

图19为RSV pre-F突变体三聚体结合抗体水平；

图20为RSV pre-F突变体三聚体中和抗体水平。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

RSV：呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)是一种病毒科下的单链RNA病毒，是一种常见且具有传染性的病毒，主要影响呼吸道。肺炎病毒科，肺病毒属的一种病毒。RSV基因组全长约15Kb，包含10个基因，编码11种蛋白，其表面展示F蛋白、G蛋白和SH蛋白。RSV通常在大多数人中引起轻度的类似感冒的症状，在婴儿和老年人或心脏、肺或免疫系统受损人员更容易出现严重的RSV症状，可能会导致肺炎、支气管炎、中耳感染。

F蛋白：F蛋白(融合蛋白；Fusion蛋白)是呼吸道合胞病毒(RSV)的一种表面蛋白，它有助于病毒感染人体细胞。其具有融合前和融合后两种状态，在病毒侵染宿主过程中F蛋白由亚稳定状态的融合前构象不可逆的变构成为更稳定状态的融合后构象。在自然状态下F蛋白经翻译形成长度为574个氨基酸的F0前体，在F0成熟过程中其被包含的两个弗林酶切位点切割，分别形成F1多肽、F2多肽和27个氨基酸组成的p27。进一步F1多肽和F2多肽组成三聚体，最终成熟的F蛋白以三聚体形式存在。

融合前F蛋白：RSV F蛋白在位于融合触发前所处的构象。在此构象下F蛋白处于亚稳定状态，可被外界环境或其他原因刺激不可逆的变构成为更稳定状态的融合后构象。在此构象下F蛋白具有区别于融合后构象的表位，如Φ表位V表位。对应的可通过这些表位的特异性单抗(如D25、AM22、5C4、ADI-15568等)确定其是否处于此融合前构象。

融合后F蛋白：RSV F蛋白在经外界环境或其他原因刺激触发后不可逆的变构后的构象。F蛋白在此构象情况下不具有Φ表位V表位，因此不能被表位对应的特异性单抗(如D25、AM22、5C4、ADI-15568等)识别。

F1多肽：RSV F0前体经翻译后修饰和酶切形成的位于F0的第137～574位置氨基酸所形成的多肽片段。其具有胞外结构域(约位于F0的137～524)、跨膜结构域(约位于F0的524～550)和胞内结构域(约位于F0的551～574)。本文所用的F1多肽是指天然状态下的F1多肽或经突变或修饰后形成的与天然F1多肽或与部分天然F1多肽相对应的氨基酸序列。

F2多肽：RSV F0前体经翻译后修饰和酶切形成的位于F0的第26～109位置氨基酸所形成的多肽片段。本文所用的F1多肽是指天然状态下的F1多肽或经突变或修饰后形成的与天然F1多肽或与部分天然F1多肽相对应的氨基酸序列。

DS-Cav1:是指具有与Mclellan等人在Structure-Based Design of a FusionGlycoprotein Vaccine for Respiratory Syncytial Virus，Science.2013November 1；342(6158):592–598.描述的RSV F蛋白相同突变的氨基酸序列。

表位：表位是指蛋白质上的特定区域，这些区域与抗体或淋巴细胞受体发生特异性相互作用。表位通常与抗原识别有关，例如抗体与抗原之间的相互作用。这些表位可以是线性的(沿着蛋白质序列的一部分)或者是三维的(在蛋白质的折叠结构中)。在F蛋白中具有Φ、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等表位。

二硫键替换：二硫键替换是指将RSV F蛋白的合适位置将一对或多对氨基酸替换成为半胱氨酸，从而替换的半胱氨酸之间形成二硫键，进而增强F蛋白处于融合前状态的稳定性，

D25：D25是指WO 2008/147196A2中所述的抗体。其可特异性的与RSV F蛋白的Φ表位结合。

AM22：AM22是指WO 2011/043643Al中所述的抗体。其可特异性的与RSV F蛋白的Φ表位结合。

AM14：AM14是指WO 2008/147196A2中所述的抗体。其可特异性的与三聚体状态下的RSV F蛋白结合。

ADI-15568：ADI-15568是指US2022/0144922Al中所述的抗体。其可特异性的与RSVF蛋白的V表位结合。

本申请实施例的第一方面，提供一种RSV pre-F的突变体，所述突变体的F1多肽满足如下(1)或者(2)所示的条件：

所述突变体具有以下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合1为S180C和S186C；以及，

组合2为K176C和S190C。

本申请发现了一种产生稳定的RSV F蛋白的融合前构象的方法。该方法涉及在β3/β4之间引入半胱氨酸取代形成二硫键，或者同时在β3/β4之间和α3/β3之间的引入半胱氨酸取代形成的双二硫键，能够将RSV的F蛋白维持在融合前构象。本申请发现的这些突变组合，以及由此产生的突变体在现有技术中未被涉及，这是一种产生稳定化RSV pre-F突变体的新的思路。在β3/β4之间引入的二硫键且在α3/β3位置引入二硫键的突变体，能够与识别位点的特异性单克隆抗体结合，具有良好的稳定性和免疫原性，能够诱导能够中和病毒的中和性抗体，具有开发针对RSV疫苗的巨大潜力。

突变、取代基、氨基酸取代：抗原中的一个氨基酸被另一个氨基酸置换或氨基酸的缺失。例如抗原中的氨基酸被来自同源蛋白的氨基酸取代。

同源蛋白：具有类似结构和功能的蛋白质，例如，来自在两种或更多种物种或病毒菌株中具有类似结构和功能的所述两种或更多种物种或病毒菌株的蛋白质。例如，来自RSVA的RSVF蛋白是与来自牛RSV的RSVF蛋白同源的蛋白。同源蛋白共有类似的蛋白质折叠特征并且可以被视为结构同源物。同源蛋白通常共有高程度的序列保守，例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列保守，和高程度的序列同一性，例如至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。

存在RSV的若干亚型，包括人类亚型A、人类亚型B和牛亚型。在RSV亚型内，存在每种亚型的单独的菌株。

在一些实施方案中，所述RSV pre-F的F1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQID NO.72和SEQ ID NO.73中任一所示，或者与SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中任一所示的氨基酸序列所存在至少80％(至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同源性；

可选地，所述F1多肽满足如下条件中的一个或者多个：

(1)不含跨膜结构域，以及

(2)不含胞内结构域；

在一些实施方案中，所述突变体具有如下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合3为S180C、S186C、A170C、A177C；

组合4为S180C、S186C、E163C、L181C；

组合5为S180C、S186C、A170C、V179C；

组合6为S180C、S186C、L171C、A177C；

组合7为K176C、S190C、A170C、A177C；

组合8为K176C、S190C、E163C、L181C；

组合9为K176C、S190C、A170C、V179C；以及，

组合10为K176C、S190C、L171C、A177C。

在一些实施方案中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：S55C、S155C、V207L以及S290C。

在一些实施方案中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。

在一些实施方案中，所述突变体不含pep27多肽，F2多肽的C端和所述F1多肽的N端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接；

在一些实施方案中，所述突变体的F2多肽满足如下条件中的一个或者多个：

1)C端不含有NN，以及，

2)具有如下突变：P102A；

在一些实施方案中，所述突变体的C末端连接有标签片段；可选地，所述标签片段包括多聚组氨酸；进一步可选地，所述多聚组氨酸包括8His片段。

在一些实施方案中，所述突变体还包括结构性多肽和功能性多肽中的一种或者多种；所述结构性多肽使多个所述突变体的单体形成多聚体，所述功能性多肽增强所述突变体的生物学活性；

可选地，所述功能性多肽包括抗原特异性结合片段；

在一些实施方案中，所述突变体的序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25至SEQ IDNO.70中任一序列所示，或者与这些序列具有至少80％(至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同源性。

本申请实施例提供的突变体，其具有稳定的构象，作为抗原/免疫原能引发受试者免疫反应，生产抗体。

受试者为动物。动物为活的多细胞脊椎动物或无脊椎生物体，类别包括例如哺乳动物。术语哺乳动物包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人类和兽医受试者，例如非人类灵长类动物。因此，施用至受试者可包括施用至人类受试者。兽医受试者的非限制性实例包括家养动物(例如猫和狗)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊和山羊)，和实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠和非人类灵长类动物)。

抗体：在自然界中基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(例如抗原或免疫原)，例如RSVF蛋白或其抗原片段。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、6、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本文所用的术语“抗体”包括例如通过完整抗体的修饰和通过使用重组DNA方法的从头合成产生的抗体片段。

抗体例如以完整免疫球蛋白形式和以多种充分表征的抗体片段形式存在。例如，结合于RSVF蛋白的Fab、Fv和单链Fv(SCFv)将是RSVF蛋白特异性结合剂。这包括完整免疫球蛋白和本领域中众所周知的变体和其部分，例如Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定化Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区与免疫球蛋白的重链可变区由连接子结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链已经突变以引入二硫键来稳定化链的缔合。所述术语还包括遗传工程改造形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、异源结合抗体(例如双特异性抗体)。也参见PierceCatalogandHandbook，1994-1995(PierceChemicalCo.，Rockford，IL)；Kuby，J.，Immunology，第3版，W.H.Freeman&Co.，NewYork，1997。

抗体片段定义如下：(1)Fab，含有通过用酶木瓜蛋白酶消化完整抗体以得到完整轻链和一个重链的一部分而产生的抗体分子的单价抗原结合片段的片段；(2)Fab′，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，接着还原以得到完整轻链和重链的一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，通过用酶胃蛋白酶处理完整抗体而无后续还原而获得的抗体的片段；(4)F(ab′)2，通过两个二硫键将两个Fab′片段保持在一起的二聚体；(5)Fv，以两条链表示的含有轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程改造的片段；和(6)单链抗体(“SCA”)，呈遗传融合的单链分子形式的含有通过合适的多肽连接子连接的轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程改造的分子。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链，λ和κ。存在五个主要重链种类(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。所公开的抗体可以种类切换。

每个重链和轻链含有恒定区和可变区，(所述区域也称为“结构域”)。在若干实施方案中，重链和轻链可变域组合以特异性结合抗原。在其他实施方案中，仅需要重链可变域。例如，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下具功能性和稳定性(参见例如Hamers-Casterman等，Nature，363：446-448，1993；Sheriff等，Nat.Struct.Biol.，3：733-736，1996)。轻链和重链可变域含有由三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区(参见例如Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成部分轻链和重链的组合框架区，用于定位和比对三维空间中的CDR。

CDR主要负责结合至抗原的表位。给定CDR的氨基酸序列边界可以容易地使用多种众所周知方案中的任一种来确定，包括由Kabat等(“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，”第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991；“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等(JMB273，927-948，1997；“Chothia”编号方案)和Lefranc等(“IMGTuniquenumberingforimmunoglobulinandTcellreceptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-likedomains，”Dev.Comp.Immunol.，27：55-77，2003；“IMGT”编号方案)所述的那些。

每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3(从N端到C端)，并且通常也通过特定CDR所定位的链来鉴定。因此，VHCDR3位于其所存在的抗体的重链的可变域中，而VLCDR1是来自其所存在的抗体的轻链的可变域的CDR1。轻链CDR有时被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。重链CDR有时被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。

抗原：可以刺激动物中的抗体或T细胞反应的产生的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫性的产品反应，包括由异源抗原诱导的那些，例如所公开的RSV融合前F蛋白的突变体。抗原的实例包括(但不限于)多肽、肽、脂质、多糖、其组合(例如糖肽)和含有抗原决定子的核酸，例如由免疫细胞所识别的那些。在一些实例中，抗原包括源自所关注病原体的肽，例如RSV。在具体实例中，抗原是源自RSV，例如包括稳定在融合前构象的修饰RSVF蛋白的抗原。“表位”或“抗原决定子”是指与B和/或T细胞反应的抗原区域。

免疫原：能够在哺乳动物、例如感染病原体或处于感染病原体的风险下的哺乳动物中诱导免疫反应的蛋白质或其部分。免疫原的施用可导致针对所关注病原体的保护免疫性和/或主动免疫性。如本申请实施例提供的PreF突变体。

免疫反应：免疫系统的细胞如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物的反应。在一个实施方案中，所述反应对特定抗原具特异性(“抗原特异性反应”)。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。

本领域普通技术人员应认识到，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(例如小于20％、15、10、5％等)的单独的取代、缺失或添加是保守变异，其中改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守氨基酸取代是本领域中众所周知的。以下六组各自含有彼此是保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

蛋白质内并非所有的残基位置都将容许原本“保守的”取代。例如，如果氨基酸残基是蛋白质功能所必需的，则甚至原本保守的取代可破坏所述活性，例如抗体与目标表位的特异性结合可被目标表位中的保守突变破坏。

表位：抗原决定子。这些是抗原性分子上的特定化学基团或肽序列，以使得它们诱导特异性免疫反应，例如，表位是与B和/或T细胞反应的抗原区域。抗体结合特定抗原表位，例如RSVF蛋白的表位，例如，RSVF蛋白的融合前构象上存在的D25或AM22表位。表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和核磁共振。表位也可包括氨基酸的翻译后修饰，例如N连接的糖基化。

“目标表位”是抗原上特异性结合所关注抗体如单克隆抗体的特定表位。在一些实例中，目标表位包括接触所关注抗体以使得目标表位可通过确定与所关注抗体接触的氨基酸残基来选择的氨基酸残基。

肽、多肽或蛋白质中的氨基酸通常经由酰胺键(CONH)化学结合在一起。另外，氨基酸可通过其他化学键结合在一起。例如，氨基酸或氨基酸类似物的连接可包括CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH--(顺式和反式)、-COCH2--、-CH(OH)CH2-和-CHH2SO-(这些和其他可见于Spatola，inChemistryandBiochemistryofAminoAcids，Peptides，andProteins，B.Weinstein编，MarcelDekker，NewYork，第267页(1983)；Spatola，A.F.，VegaData(1983年3月)，第1卷，第3期，PeptideBackboneModifications(一般评论)；Morley，TrendsPharmSci第463-468页，1980；Hudson等，IntJPeptProtRes14：177-185，1979；Spatola等，LifeSci38：1243-1249，1986；HarmJ.Chem.SocPerkinTrans.1307-314，1982；Almquist等，J.Med.Chem.23：1392-1398，1980；Jennings-White等，TetrahedronLett23：2533，1982；HolladaV等，Tetrahedron.Lett24：4401-4404，1983；和HrubyLifeSci31：189-199，1982)。

肽修饰：肽例如稳定在融合前构象本申请实施例突变体可以被修饰，例如以包括相比于天然RSV蛋白质序列的氨基酸取代，或通过多种化学技术以产生具有与未修饰肽基本上相同的活性和构象和任选地具有其他所需特性的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论是羧基端或侧链，可以药学上可接受的阳离子的盐形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或转化为式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或组合以形成杂环，例如5元或6元环。肽的氨基，无论是氨基端或侧链，可呈药学上可接受的酸加成盐如HCl、HBr、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐形式，或者可被修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺。

可以使用公认的技术将肽侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯基和苯酚环可以被一个或多个卤素原子如F、Cl、Br或I或用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可以扩展至同源C2-C4亚烷基。硫醇可以用多种公认保护基团如乙酰胺基团中的任一种来保护。

本申请实施例的第二方面，提供一种核酸分子，其编码所述的突变体。

核酸分子、核酸：由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体和其合成的非天然存在的类似物)构成的聚合物、相关的天然存在的结构变体，和其合成的非天然存在的类似物。因此，所述术语包括其中核苷酸和其间的连接包括非天然存在的合成类似物例如并且不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等的核苷酸聚合物。这些聚核苷酸可以例如使用自动化DNA合成器来合成。所述术语“寡核苷酸”通常是指通常不大于约50个核苷酸的短的聚核苷酸。应理解，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，这也包括其中“U”代替“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

“核苷酸”包括(但不限于)包括与糖连接的碱基的单体(例如嘧啶、嘌呤或其合成类似物)或包括与氨基酸连接的碱基的单体(如在肽核酸(PNA)中)。核苷酸是聚核苷酸中的一个单体。核苷酸序列是指聚核苷酸中的碱基序列。

“编码”是指聚核苷酸中的核苷酸如基因、cDNA或mRNA的特定序列的固有特性，所述核苷酸充当在生物过程中用于合成其他聚合物和大分子的模板，其具有限定序列的核苷酸(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的氨基酸和由此产生的生物特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常以序列表形式提供的编码链和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链可以被称为编码所述蛋白质或所述基因或cDNA的其他产物。除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。在一些实例中，核酸编码本申请的突变体。

考虑到简并变体和保守变体，本申请对核酸分子不做特别限定。

简并变体和保守变体：编码包括由于遗传密码而简并的序列的多肽的聚核苷酸。例如，编码包括由于遗传密码而简并的序列的所公开抗原或特异性结合所公开抗原的抗体的聚核苷酸。存在20种天然氨基酸，其中大部分由一个以上的密码子指定。因此，包括所有的简并核苷酸序列，只要由所述核苷酸序列编码的抗原或结合抗原的抗体的氨基酸序列不变即可。由于遗传密码的简并性，大量的功能上相同的核酸编码任何给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在蛋白质编码序列内指定精氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述相应密码子中的任一个而不改变所编码的蛋白质。这样的核酸变异是“沉默变异”，这是保守变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述每种可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可以通过标准技术被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”是隐含在每个所述序列中。

在一些示例中，其被密码子优化以在哺乳动物的细胞中表达，其可操作地连接至启动子。

表达控制序列：调节可操作地连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调节核酸序列的转录和适当时翻译时，表达控制序列可操作地连接至核酸序列。因此表达控制序列可包括适当启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持所述基因的适当阅读框以允许mRNA的适当翻译，和终止密码子。术语“控制序列”旨在最低限度地包括其存在可以影响表达的组分，并且还可包括其存在是有利的其他组分，例如，前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。

启动子是足以引导转录的最小序列。还包括足以使得启动子独立性基因表达关于细胞类型特异性、组织特异性可控或者可通过外部信号或药剂诱导的那些启动子元件；这些元件可位于基因的5′或3′区域中。包括组成性和可诱导启动子(参见例如Bitter等，MethodsinEnzymology153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导启动子如噬菌体λ、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等的pL。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的基因组的启动子(例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。还可使用由重组DNA或合成技术产生的启动子来提供核酸序列的转录。

可将聚核苷酸插入含有启动子序列的表达载体中，所述启动子序列促进宿主的所插入遗传序列的有效转录。所述表达载体通常含有复制起点、启动子，以及允许转化细胞的表型选择的特定核酸序列。

来自不同RSV亚群的RSVF蛋白以及编码这些蛋白质的核酸序列和用于将这些核酸序列操纵和插入载体中的方法是本文中所公开和本领域中已知的(参见例如Tan等，PLOSone，7：e51439，2011；Sambrook等，MolecularCloning，aLaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.(1994))。

本申请实施例的第三方面，提供一种载体，其包括所述的核酸分子。

本申请实施例的第四方面，提供一种工程细胞，其表达所述的突变体，或者其包括所述的核酸分子或者所述的载体。

表达：核酸翻译成蛋白质。蛋白质可被表达并保持在细胞内，变成细胞表面膜的组分，或分泌到胞外基质或培养基中。

工程细胞，宿主细胞：其中载体可繁殖和表达其DNA的细胞。所述细胞可以是原核或真核的。所述术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应理解，所有后代可能与亲本细胞不相同，因为在复制期间可存在突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时包括这些后代。

本申请实施例的第五方面，提供一种所述的突变体的生产方法，其包括如下步骤：

本本申请实施例的第六方面，提供一种免疫组合物，其包括所述的突变体、或者所述的核酸分子，以及免疫佐剂。

免疫佐剂：用于增强抗原性的媒介物。佐剂包括吸附有抗原的矿物(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳液，例如，其中抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包括有杀灭的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或造成巨噬细胞流入)。免疫刺激性寡核苷酸(例如包括CpG基序的那些)也可以用作佐剂。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL和toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR-9激动剂。本领域普通技术人员熟知佐剂(参见例如Singh(编)VaccineAdjuvantsandDeliverySystems.Wiley-Interscience，2007)。佐剂可以与所公开的PreF抗原组合使用。可选地，本申请实施例中的免疫佐剂，铝盐佐剂、表面活性剂、多聚核苷酸、脂多糖、脂质体、油乳佐剂中的一种或者多种。例如为Alum、CpG、Alum+CpG、MF59、AS04、AS01E等。MF59是一种由水混合型佐剂，主要由3部分组成：油相、乳化剂和辅助剂；油相为适合人体注射的微粒化短链三酸甘油酯混合物；乳化剂为表面活性剂，可使油相和水均匀混合；辅助剂主要包括甘油、苏糖醇、ATP等保湿剂和缓冲剂。AS04佐剂是由AS03佐剂和MPL佐剂组成的混合物。AS03佐剂是由脂质体、TWEEN80、SORBITAN三种表面活性剂组成的混合物。AS01E是由DOPC、Chol、MPL和QS-21制备而成的纳米级脂质体溶液。MPL佐剂的主要成分是脂多糖。

免疫组合物(免疫原性组合物)：包括诱导免疫反应、例如针对表达抗原的病毒的可测量CTL反应或针对抗原的可测量B细胞反应(例如抗体产生)的抗原的组合物。因而，免疫原性组合物包括一种或多种抗原(例如，多肽抗原)或抗原表位。免疫原性组合物还可包括能够诱导或增强免疫反应的一种或多种额外组分，例如赋形剂、载体和/或佐剂。在某些情况下，施用免疫原性组合物以诱导免疫反应，其保护受试者免于由病原体诱导的症状或病状。在一些情况下，通过在受试者暴露于病原体(例如，RSV)之后抑制所述病原体的复制来预防(或降低或改善)由所述病原体造成的症状或疾病。在一个实例中，“免疫原性组合物”包括稳定在融合前构象的重组RSVF蛋白，其诱导针对表达RSVF蛋白的病毒的可测量CTL反应，或诱导针对RSVF蛋白的可测量B细胞反应(例如抗体产生)。它进一步指编码抗原的分离核酸，例如可以用于表达抗原(和因此用于诱导针对这种多肽的免疫反应)的核酸。

对于体外使用，免疫原性组合物可包括抗原或编码抗原的核酸。对于体内使用，免疫原性组合物通常将包括在药学上可接受的载体和/或其他药剂中的蛋白质、免疫原性肽或核酸。可通过公认的测定法容易地对任何特定肽，例如稳定在融合前构象的所公开RSVF蛋白或编码稳定在融合前构象的所公开RSVF蛋白的核酸，测试其诱导CTL或B细胞反应的能力。免疫原性组合物可包括本领域技术人员众所周知的佐剂。

免疫学反应条件：包括提及允许针对特定表位产生的抗体结合于所述表位并且其结合程度相比于基本上所有其他表位可检测地更大和/或基本上排除与基本上所有其他表位的结合的条件。免疫学反应条件取决于抗体结合反应形式并且通常是用于免疫测定方案中的那些或体内遭遇的那些条件。所述方法中使用的免疫学反应条件是“生理条件”，其包括提及在活的哺乳动物或哺乳动物细胞内部的典型条件(例如温度、摩尔渗透压浓度、pH)。虽然公认一些器官经受极端条件，但有机体内和细胞内环境通常是约pH7(例如pH6.0至pH8.0，更通常是pH6.5至7.5)，含有水作为主要溶剂，并且在高于0℃并低于50℃的温度下存在。摩尔渗透压浓度在支持细胞活力和增殖的范围内。

本申请实施例的第七方面，提供一种所述的突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒中的应用。

本申请实施例中，所述呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，能够用于检测相应的抗体，抗体的定义参照第一方面，可以是中和抗体，也可以是结合抗体。

本申请实施例的第八方面，提供一种呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，其包括所述的突变体。呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒的定义参照第七方面。

本申请实施例的第九方面，本申请实施例提供一种呼吸道合胞病毒所致下呼吸道感染的防治方法，其包括如下步骤：向受试者施用治疗有效量的第六方面中所述的免疫组合物。

施用：通过所选途径将组合物引入受试者中。施用可以是局部或全身的。例如，如果所选途径是静脉内的，则通过将组合物引入受试者的静脉内来施用所述组合物。

有效量：足以产生所需反应、例如针对RSVF蛋白的免疫反应，或减少或消除病状或疾病如RSV感染的征象或症状的药剂如PreF抗原或编码PreF抗原的核酸或其他药剂的量。例如，这可能是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。一般来说，这种量将足以可测量地抑制病毒(例如，RSV)复制或感染性。当施用至受试者时，通常将使用将达到目标组织浓度(例如，在呼吸组织中)的剂量，其已证明实现病毒复制的体外抑制。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或多种症状和/或潜在病因，例如治疗RSV感染的量。在一个实例中，有效量是治疗有效量。在一个实例中，有效量是预防特定疾病或病状的一种或多种征象或症状(例如与RSV感染相关的一种或多种征象或症状)发展的量。

防治，预防、治疗之意：例如，在处于疾病(例如RSV感染)的风险下的受试者中，抑制疾病或病状的充分发展。“治疗”是指改善疾病或病理状况在其已开始发展后的征象或症状的治疗干预。关于疾病或病理状况的术语“改善”是指任何可观测的有益治疗作用。有益作用可例如由以下证实：易感受试者中的疾病的临床症状的延迟发作，疾病的一些或所有临床症状的严重程度的降低，疾病的较缓慢进展，受试者的总体健康或健康状况的改善，或本领域中众所周知的对特定疾病具特异性的其他参数。“预防性”治疗是出于降低患上病变的风险而向未展现疾病征象或仅展现早期征象的受试者施用的治疗。术语“降低”是相对术语，以使得如果在施用药剂后反应或病状定量减弱，或如果它在施用药剂后相比于参考药剂减弱，则药剂降低反应或病状。类似地，术语“预防”未必是指药剂完全消除反应或病状，只要反应或病状的至少一种特征被消除即可。因此，降低或预防感染或反应(例如病理反应，例如，疫苗增强的病毒疾病)的免疫原性组合物可以但未必完全消除这种感染或反应，只要所述感染或反应相比于在不存在药剂的情况下的感染或反应或相比于参考药剂可测量地减弱，例如，至少约50％，例如至少约70％、或约80％、或甚至约90％(即降至10％或更小)即可。

本申请实施例的第十方面，提供一种用于检测或者分离样本中的RSVF结合抗体的方法，其包括如下步骤：

将第一方面中所述的的突变体与样本中的RSVF结合抗体接触，形成免疫复合物；以及，

检测所述免疫复合物，从而实现检测或者分离样本中的RSV F结合抗体。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

(1)RSV pre-F突变体载体构建

根据突变策略以确定RSV pre-F突变体的氨基酸序列，与之相对应的核酸序列经密码子优化，优化后的密码子利于在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中表达。最终通过BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点连接至pcDNA3.1载体上。

使用ClonExpress II重组克隆试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)进行载体的取代、插入和缺失等操作。通过聚合酶链式反应(PCR)以高保真酶Phanta Max(诺唯赞生物科技有限公司)对突变位点的两端片段分别进行扩增，扩增产物通过胶回收后将两片段进行融合PCR，回收后的融合片段同源重组至被BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的pcDNA3.1载体上。构建的点突变载体经过北京擎科生物科技股份有限公司测序并确认序列无误。图1为用于构建RSV pre-F突变体的表达质粒。

将克隆载体接种于300mL LB(Amp+)培养基中，37℃、180rpm培养16h，利用大量/大型质粒提取试剂盒提取质粒；最终保存于1mL无菌的TE Buffer缓冲液中。对于所有商品试剂盒或试剂均按照制造商说明书执行。

图2描述了野生型RSV病毒F蛋白的pre-F多肽的氨基酸结构示意图，该图示所指的氨基酸序列可来源于人源呼吸道合胞病毒F蛋白的A亚型或者B亚型。天然的F蛋白经核糖体翻译后形成F0前体多肽，前体多肽全长包括约574个氨基酸，分别包括信号肽(1aa-25aa)、F2多肽(26aa-109aa)、pep27多肽(110aa-136aa)、Fl多肽(137aa-574aa)，其中，F1多肽包括跨膜结构域(514aa-550aa)和胞内结构域(551aa-574aa)。对于天然全长的人RSV A2和人RSV B的前体多肽而言，天然全长的牛RSV B的pre-F多肽全长为572aa，Fl多肽对应aa137-572aa，含有弗林蛋白酶切割位点RAKR和KKRKRR。

RSV pre-F的信号肽在内质网易位而被切割，在多肽内含有的两个弗林蛋白酶切割位点(RARR和KKRKRR)被细胞内弗林蛋白酶样蛋白酶加工，产生三个肽段，分别为F1多肽、F2多肽和Pep27多肽，F蛋白成熟过程中pep27多肽被删除，最终包含位于N末端的F2多肽和C末端部分的F1多肽，F1多肽通过2个二硫键与F2多肽相连。成熟F蛋白形成三聚体并且由F1多肽通过跨膜结构域锚定于细胞膜。

图3描述了构建的稳定化RSV pre-F突变单体的结构示意图(SEQ ID NO.11)。与野生型RSV pre-F单体不同的是：1)p27肽由GS取代，不受弗林蛋白酶影响，成熟单体F蛋白将由单链多肽组成；2)同时删除跨膜结构域(TM，514aa-550aa)和胞内结构域(CT，551aa-574aa)，最终单体蛋白以分泌形式表达；3)并在蛋白的C末端添加His-Tag以利于纯化。在无特别说明的情况下，本申请实施例中涉及的其他单体RSV F蛋白突变均在此基础上进行设计，但可以理解的是，基于本申请实施例的设计构思，RSV pre-F突变单体的设计起点多肽并不局限于满足上述条件的SEQ ID NO:10。

图4描述了构建的稳定化RSV pre-F三聚体所含单体的结构示意图(SEQ IDNO.12)。在稳定化RSV pre-F突变单体的基础上，融合了噬菌体T4纤维蛋白(foldon)的三聚化基序(T4foldon)到其C末端，使最终形成的成熟F蛋白形成三聚体，以模拟F蛋白天然三聚体状态，同时在此C末端添加纯化标签。在无特别说明的情况下，在本申请实施例中涉及的其他三聚体RSV pre-F蛋白突变均在此基础上进行设计。涉及基于突变体构建的其他多聚体，如基于抗体Fc片段形成的二聚体，或基于铁纳米颗粒(ferritin)形成的纳米颗粒，可在图例所示的结构中将T4foldon进行替换，替换成相应的抗体Fc片段等。

图5描述了能够稳定化RSV pre-F突变体的突变所在位置的三维结构示意图及局部放大示意图(以绿色标识)，突变位置包括α3螺旋、β3片层和β4片层。示意图显示α3螺旋与β3片层，及β3片层和β4片层平行且距离接近。RSV pre-F构象是亚稳态的，在受到环境触发形成不可逆的重排，从而形成更稳定的非功能性post-F构象。其中，序列中α2、α3、β3、β4、α4和α5变构形成一条长的螺旋束，并与C端形成的长螺旋在三聚体情况下形成6个螺旋组成的长柄是post-F的典型特征。在本申请实施例中，我们发现在位于通过在β3片层和β4片层之间引入半胱氨酸取代可以固定β3片层和β4片层，防止其变构，可使得RSV F蛋白维持在融合前构象。当同时通过二硫键桥的作用固定β3和β4以及α3和β3，可以使得RSV F蛋白处于更加稳定的融合前构象。

图6描述了在本申请实施例中β3/β4位置涉及的氨基酸及易于形成二硫键的两个氨基酸原子间距离形成二硫键的氨基酸包括：181L和185V180S和186S179V和187V178V和188L177A和189T176K和190S

图7描述了在本申请实施例中α3/β3位置涉及的氨基酸及易于形成二硫键的两个氨基酸原子间距离形成二硫键的氨基酸包括：163E和181L166K和179V167I和179V170A和179V170A和177A171L和189T171L和177A191K和175N

表1、RSV F0蛋白中α3螺旋、β3片层和β4片层包含的氨基酸

表2、半胱氨酸突变后易于形成二硫键的氨基酸配对

β4(aa:185V-aa:194D)	β3(aa:176K-aa:181L)	α3(aa:163E-aa:173S)
			190S	176K
189T	177A	170A、171L
			188L	178V
187V	179V	166K、167I、170A
			186S	180S
185V	181L	163E

表3、RSV pre-F突变体位点

表4、

编号	序列编号	突变位点	F2位置	F1位置	Linker
						JW-38	SEQ ID NO.27	S180C、S186C、A170C、V179C	103	145	GS
JW-L10	SEQ ID NO.62	S180C、S186C、A170C、V179C	109	137	/
						JW-L11	SEQ ID NO.63	S180C、S186C、A170C、V179C	105	145	GS
JW-L12	SEQ ID NO.64	S180C、S186C、A170C、V179C	103	145	SS
						JW-L13	SEQ ID NO.65	S180C、S186C、A170C、V179C	103	145	PG
JW-L14	SEQ ID NO.66	S180C、S186C、A170C、V179C	103	145	GPG
						JW-L15	SEQ ID NO.67	S180C、S186C、A170C、V179C	103	145	GSGS
JW-L16	SEQ ID NO.68	S180C、S186C	103	145	PG
						JW-L17	SEQ ID NO.69	S180C、S186C、L171C、A177C	103	145	GSGS
JW-L18	SEQ ID NO.70	S180C、S186C、A170C、A177C、S190F、V207L	105	145	GS

(2)RSV pre-F突变体蛋白的表达

突变蛋白通过ExpiCHO^TM表达系统(Thermofisher)完成表达。瞬转表达完全按照制造商标准方案实施。简单来说，转染前一天(第–1天)，分种ExpiCHO-S^TM培养物，最终密度为3×10⁶～4×10⁶个活细胞/mL。次日(第0天)，测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7×10⁶～10×10⁶个活细胞/mL。存活率应为95％～99％，方可继续转染。使用新鲜的预热至37℃的ExpiCHO^TM表达培养基将细胞稀释至最终密度为6×10⁶个活细胞/mL。轻轻晃动培养瓶，混匀细胞，弃去剩下的细胞。使用冷的试剂(4℃)按照试剂说明书的操作顺序配制ExpiFectamine^TMCHO/质粒DNA复合物。颠倒混匀后向摇瓶中加入ExpiFectamine^TM CHO/DNA复合物，将细胞置于摇床上培养，(8％CO₂，37℃，120rpm)。转染后次日(第1天，转染后18～22小时)添加ExpiFectamine^TMCHO增强剂和ExpiCHO^TM辅料。按照标准试验方案于转染后第8日终止培养，取样检测。

表达量的测定参照“(7)双抗夹心法检测RSV pre-F突变体的含量”。

热稳定性的测定方法：热稳定性通过比较突变体蛋白在热处理前后融合前构象的损失情况进行评价。简单来说将突变体蛋白在50℃进行热处理3h。通过参照“(7)双抗夹心法检测RSV pre-F突变体的含量”检测热处理前后融合前构象蛋白浓度。使用热处理后融合前构象蛋白浓度除以热处理前融合前构象蛋白浓度，以计算剩余百分比，通过此百分比评价突变体的热稳定性。

表5、突变体表达量及热稳定性

图8描述了位于β3和β4位置形成的突变体pre-F表达量。其中，JW-31、JW-34、JW-35在CHO细胞中获得了明显的表达，尤其是JW-31和JW-35的表达量比WT(SEQ ID NO.11)和F0-GS(SEQ ID NO.12)有了显著的提升。而JW-32和JW-33几乎不表达。证实部分β3和β4位置的突变可以产生稳定的pre-F蛋白。

图9描述了位于β3和β4位置形成的突变体pre-F的热稳定性。检测结果显示，与WT和F0-GS相比，pre-F蛋白表达量高的突变体也具有良好的热稳定性。而没有半胱氨酸突变的WT和F0-GS经50℃处理后非常不稳定。

图10描述了位于α3和β3位置形成的突变体pre-F的表达量。在此位置引入的突变中，除JW-03表达量偏低外，其余均比WT和F0-GS的表达量有了显著的提高。证实部分α3和β3位置的突变也可以产生稳定的pre-F蛋白。

图11描述了位于α3和β3位置形成的突变体pre-F的热稳定性。在α3和β3不同位置的突变对于稳定pre-F具有明显的影响。JW-04和JW-06表现出良好的热稳定性。

图12描述了位于α3/β3与β3/β4位置形成的双二硫键突变体pre-F的表达量。

图13位于α3/β3与β3/β4位置形成的双二硫键突变体pre-F的热稳定性。与单二硫键突变相比，双二硫键突变明显改善了突变的热稳定性，使得突变体经50℃处理3h后仍能保持＞60％的pre-F蛋白残留。

(3)重组突变体蛋白的纯化

蛋白纯化使用亲和层析和离子交换层析分两步完成。总的来，表达产物离心(8000rpm，20min)收获培养上清，去除细胞及细胞碎片。将培养物上清经0.45μm滤膜过滤除杂。处理好的上清加至已使用25mM Tris-HCl、0.15M NaCl的平衡缓冲液(Buffer A；pH8.0)平衡好的Ni-Sepharose6FF柱(cytiva)中。之后使用25mM Tris-HCl(150mM NaCl，pH8.0)进一步冲洗至A280至基线水平，使用0～100％洗脱缓冲液(Buffer B:25mM Tris-HCl、150mMNaCl、500mM咪唑，pH8.0)的洗脱缓冲液线性洗脱，收集洗脱液，用平衡缓冲液作为置换液以去除咪唑。

换液完成后使用PBS缓冲液稀释样品，使其电导低于4ms/cm，并调节pH为6.0。将蛋白上样至20mM磷酸盐缓冲液pH6.0平衡后的Capto SPImpres填料(Cytiva)中，上样完成后使用20mM磷酸盐缓冲液pH6.0洗脱至A280至基线水平，使用0～100％B的洗脱缓冲液线性(20mM磷酸盐缓冲液，1MNaCl pH6.0)洗脱，收集洗脱液。用0.2M Na₂HPO₄调节pH至7.4～8.0，经0.45μm滤膜过滤进一步除去不溶性颗粒。

(4)突变体蛋白的SDS-PAGE鉴定

纯化获得的重组蛋白经SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-PolyacrylamideGel Electrophoresis)进行检测。纯化后的检测样品加入含有SDS和还原剂(如二巯基乙醇或巯基乙酸)的样品缓冲液，经沸水浴处理后上样，电泳结束后，使用Coomassie蓝染色方法对凝胶进行蛋白质染色，使用透明扫描仪或者蛋白质成像系统获取凝胶图像。

图14描述了RSV pre-F突变体单体SDS-PAGE鉴定结果。不同突变体仅个别氨基酸发生突变，分子量大小仅发生微小的变化，SDS-PAGE上的电泳条带显示无差异，较理论分子量(50.55kDa)偏大，可能因其糖基化修饰造成条带偏移。

图15描述了RSV pre-F突变体三聚体SDS-PAGE鉴定结果。不同突变体仅个别氨基酸发生突变，分子量大小仅发生微小的变化，SDS-PAGE上的电泳条带显示无差异，较理论分子量(53.99kDa)偏大，可能因其糖基化修饰造成条带偏移。

(5)HPLC检测突变体蛋白的纯度和均一性

采用Thermo U3000高效液相色谱仪和(Thermo)TSKgel UP-SW2000分子排阻柱(TOSOH)色谱柱对突变体蛋白的纯度进行HPLC(High Performance LiquidChromatography)分析。将流动相20mM PBS缓冲液，流速为1mL/min，在280nm处检测洗脱组成。HPLC检测目的蛋白的纯度和均一性。

图16描述了HPLC检测突变体单体JW038的纯度和均一性。突变体单体在18.713min出现特异性色谱峰。且目标峰单一，突变体单体表现出良好的均一性。

图17描述了HPLC检测突变体三聚体JW038-T4的纯度和均一性。突变体三聚体在15.958min出现特异性色谱峰。突变体三聚体表现出良好的均一性。

(6)差式扫描量热法检测突变体蛋白的热稳定性

采用DSC Q2000(TA仪)系统进行差示扫描量热分析(Differential ScanningCalorimetry；DSC)。该装置的温度范围为0℃和400℃，在8mL/min的氮气流中热膨胀率为10℃/min。用在氮气气氛下进行测量。

表6、突变体Tm值检测

根据表6可知不同突变体在使用差式扫描量热法检测中突变体蛋白Tm值中均>60℃，表明突变体蛋白的热稳定性较好，这也与突变体蛋白在50℃如处理中呈现的较好的稳定性相对应。

(7)双抗夹心法检测RSV pre-F突变体的含量

采用双抗夹心ELISA法对RSV pre-F突变体进行定量。以能够同时识别pre-F、post-F和F蛋白的帕利珠单抗(Palivizumab)作为包被抗体，以特异性识别RSV pre-F位点的辣根过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体D25作为检测抗体(D25-HRP)检测。同时分别以纯化的pre-F单体蛋白和三聚体蛋白作为校准品建立标准曲线，待检样品含量通过检测其在OD450下的吸光度及稀释倍数通过标准曲线换算获得。通过该方法可以检测瞬转表达下的突变体pre-F蛋白表达量和突变体热稳定性试验中pre-F突变体蛋白残留含量。样品检测过程如下：取单克隆抗体使用碳酸盐缓冲稀释至1μg/L，包被酶标板(Corning 9018)。每孔100μL，37℃放置1h后，2～8℃放置过夜；废弃96孔板内的液体，用20mM PBS洗3次，之后每孔加入200μL封闭液(2％牛血清白蛋白，组分V)，室温封闭60min；吸出孔内的封闭液，用20mMPBS-T溶液洗涤3遍，将经过一系列3倍稀释的突变的融合前构象的F蛋白到96孔酶标板的第一列孔内，阴性对照为PBS，37℃反应60min，吸出孔内的封闭液，用20mMPBS-T溶液洗涤3遍；取抗HIS-HRP结合物，用酶结合物稀释液1:2000稀释，之后加入到96孔酶标板内，每孔100μL，37℃反应10min；吸出孔内的二抗，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，每孔加入TMB显色液100μL，10min后加入50μL终止液终止反应，之后用酶标仪测定A450和吸光值。

图8，图10和图12显示了单体RSV pre-F突变体蛋白经Expi-CHO细胞瞬时转染后的细胞培养上中Pre-F蛋白表达量。在本实施例中，以能够不依赖于F抗原的构象变化而进行结合的帕利珠单抗(Palivizumab)作为捕获抗体，以辣根过氧化物酶标记的能够特异性检测表位Φ的D25抗体作为检测抗体，同时以纯化的DS-Cav1单体蛋白或三聚体(与检测的目标物的表达形式保持一致)作为参考品建立标准曲线，培养上清中的pre-F蛋白表达量依据标准曲线进行标定和换算。通过以上操作，得到下述结果：显示包含在α3和β3具有半胱氨酸点突变、以形成二硫键的突变体与没有突变的WT和F0-GS(p27肽由GS取代)相比，表位Φ的保守性显著提高，pre-F在Expi-CHO细胞中得到高效表达。在热稳定性方面，通过评估其经50℃处理(1h、2h、3h)后的剩余的与D25单抗结合的蛋白比例来评价蛋白的稳定性，纯化后的蛋白样品经PBS(pH7.4)稀释至0.1mg/mL，经热处理后通过双抗夹心ELSIFA法进行检测，如图9，图11和图13所示。

(8)RSV pre-F突变体的抗原性检测

采用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将各纯化的突变体蛋白以10μg/mL为起始稀释浓度，以3倍进行倍比稀释，然后以100μL/孔包被于96孔酶标板(Corning 9018)。37℃放置1h后，2～8℃放置过夜；废弃96孔板内的液体，用20mM PBS洗3次，之后每孔加入200μL封闭液(2％牛血清白蛋白，组分V)，室温封闭60min；吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍，分别取抗D25-HRP、AM22-HRP、AM14-HRP、ADI-15568-HRP等结合物，用酶结合物稀释液1:2000稀释，之后加入到96孔酶标板内，每孔100μL，37℃反应10min；吸出孔内的多余抗体，用20mMPBS-T溶液洗涤3遍，每孔加入TMB显色液100μL，10min后加入50μL终止液终止反应，之后用酶标仪测定A450和A630吸光值。

图18描述了各突变体的抗原性鉴定结果。图18中A图和B图显示，经纯化的突变体可被表位特异性单克隆抗体D25和AM22所识别，证实突变体能够维持RSV F蛋白的融合前构象(pre-F)。同时突变体也可被识别表位V的ADI-15568单抗识别(图18中D图)。然而，三聚体特异性抗体(AM14)能够识别突变体三聚体但不能识别突变体单体，且不同位置的突变对于三聚体的稳定性存在显著的影响。

(9)RSV pre-F蛋白的免疫原性评价

为了评价不同融合前构象RSV F的免疫原性，使用不同突变体蛋白对小鼠进行免疫。用5μg疫苗抗原加入氢氧化铝作为佐剂，免疫雌性Balb/c小鼠14～16g。在第0周和第4周(28d)肌肉注射。并于加强免疫后2周(42d)采集血清，用以测定总IgG抗体滴度和中和抗体滴度。免疫分组见下表：

表7

(10)抗原特异性抗体水平检测

总IgG抗体检测通过间接ELISA的方法，在96孔板中预先包被Pre F蛋白，在封闭之后加入待测血清，待测血清倍比稀释，起始稀释倍数800倍，随后三倍稀释。洗涤除去未结合血清之后加入HRP标记的羊抗鼠二抗孵育，孵育结束后洗涤除去未结合的二抗，洗涤后加入底物进行显色，通过检测450nm和630nm吸光度，判断小鼠血清滴度。稀释滴度根据稀释至吸光度大于CUT-OFF值的最后一个孔的血清稀释倍数计算。不同突变体三聚体蛋白添加氢氧化铝佐剂免疫BalB/c小鼠。以pre-F突变体三聚体作为包被抗原检测小鼠血清中抗原特异性IgG抗体水平。

图19描述了不同突变体在BalB/c小鼠中诱导的RSV pre-F特异性结合抗体水平。突变体单体和突变体三聚体均具有良好的免疫原性，在小鼠体内诱导了高水平的体液免疫应答。其中，JW-38-T4和JW-48-T4诱导的结合抗体水平优于突变体单体(JW-36)、F0蛋白和post-F蛋白，统计学上具有显著性差异。

(11)中和抗体水平检测

中和抗体滴度检测采用高通量微孔板法检测。具体为，将Hep-2细胞密度调整，接种至96孔板，置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)培养过夜，保证第二天的细胞汇合度为90％左右即可开始试验。然后将血清置于水浴锅内56℃灭活30min，以制备灭活血清。随后，将检测病毒株样本首孔稀释100倍，进行3倍比梯度稀释，共设置8个稀释度(含首孔)，2复孔；然后，根据病毒的PFU值，加入合适的病毒量。样本孔和病毒对照孔分别加入稀释好的病毒，回滴孔依次按照2倍梯度向下稀释共4个稀释度，37℃、5％ CO₂培养箱中中和约1h。然后，将上述病毒与血清中和产物和阳性及回滴孔病毒加入提前准备好的细胞中，每孔加入100μL培养基继续培养约22h。弃上清，将细胞固定后加入荧光标记的检测抗体，使用CTL仪器读板。中和抗体滴度设定为导致感染单位减少50％时的血清稀释倍数(NT50)。

图20描述了不同突变体在小鼠体内诱导的中和抗体水平。结果显示，突变体免疫小鼠血清能够中和RSV:A2型病毒株。不同突变体诱导的中和抗体存在差异，但均优于F0和post-F蛋白。稳定化的pre-F蛋白保留了关键中和表位，诱导了比post-F更高的中和抗体。同时，F0诱导的中和抗体水平也高于post-F蛋白。

本申请实施例提供了一种产生稳定化RSV pre-F蛋白的突变策略，通过在β3和β4之间形成二硫键，或者同时在α3和β3之间、β3和β4之间形成二硫键，阻止了F蛋白的构象变化。这种突变策略与目前的主流突变策略不同，是一种创新的突变，丰富了针对RSV F蛋白的基于结构的抗原设计。二硫键的引入产生了稳定的RSV F蛋白融合前构象(pre-F)，具有高的表达量，CHO细胞瞬转表达中表达量达到300mg/L，且该突变体具有非常高的热稳定性，能够在50℃下处理3h后pre-F蛋白保留85％以上。该突变体具有可被D25抗体识别的位点抗原表位，保留了目前已鉴定的针对RSV F蛋白特异性抗体所识别的其他抗原表位。该突变体免疫能够在动物体内诱导产生较高的中和抗体。该突变体具有疫苗的巨大潜能。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体的F1多肽满足如下(1)或者(2)所示的条件：

所述突变体具有以下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合1为S180C和S186C；以及，

组合2为K176C和S190C。

2.根据权利要求1所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述RSV pre-F的突变体的物种来源为人或者牛。

3.根据权利要求2所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述RSV pre-F的F1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中任一所示，或者与SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72中任一所示的氨基酸序列所存在至少80％的同源性；

可选地，所述F1多肽满足如下条件中的一个或者多个：

(1)不含跨膜结构域，以及

(2)不含胞内结构域；

4.根据权利要求1至3中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，

所述突变体具有如下半胱氨酸突变组合中的一组：

组合3为S180C、S186C、A170C、A177C；

组合4为S180C、S186C、E163C、L181C；

组合5为S180C、S186C、A170C、V179C；

组合6为S180C、S186C、L171C、A177C；

组合7为K176C、S190C、A170C、A177C；

组合8为K176C、S190C、E163C、L181C；

组合9为K176C、S190C、A170C、V179C；以及，

组合10为K176C、S190C、L171C、A177C。

5.根据权利要求4所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：S55C、S155C、V207L以及S290C。

6.根据权利要求1至3、以及5中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。

7.根据权利要求6所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体不含pep27多肽，F2多肽的C端和所述F1多肽的N端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接；

8.根据权利要求1至3、5、以及7中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体的F2多肽满足如下条件中的一个或者多个：

1)C端不含有NN，以及，

2)具有如下突变：P102A。

9.根据权利要求1至3、5、以及7中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体的C末端连接有标签片段；可选地，所述标签片段包括多聚组氨酸；进一步可选地，所述多聚组氨酸包括8His片段。

10.根据权利要求1至3、5、以及7中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体还包括结构性多肽和功能性多肽中的一种或者多种；所述结构性多肽使多个所述突变体的单体形成多聚体，所述功能性多肽增强所述突变体的生物学活性；

可选地，所述功能性多肽包括抗原特异性结合片段；

11.根据权利要求1至3、5、以及7中任一项所述的RSV pre-F的突变体，其特征在于，所述突变体的序列如SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.70任一所示。

12.核酸分子，其编码权利要求1至11中任一项所述的突变体。

13.载体，其包括权利要求12所述的核酸分子。

14.工程细胞，其表达权利要求1至11中任一项所述的突变体，或者其包括权利要求12所述的核酸分子或者权利要求13所述的载体。

15.权利要求1至11中任一项所述的突变体的生产方法，其包括如下步骤：

培养权利要求14所述的工程细胞，以及，从所得培养上清中分离出突变体。

16.免疫组合物，其包括权利要求1至11中任一项所述的突变体、或者权利要求12所述的核酸分子，以及免疫佐剂；

17.权利要求1至11中任一项所述的突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒中的应用。

18.呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，其包括权利要求1至11中任一项所述的突变体。