CN115103682A

CN115103682A - 呼吸道病毒免疫组合物

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Publication number: CN115103682A
Application number: CN202180011671.6A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂娜·肖; 纪尧姆·斯图尔特-琼斯; 伊丽莎白·纳拉亚南; 弗拉迪米尔·普列斯尼亚克; 萨伊达·马哈古卜·埃尔巴希尔
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-09-23
Also published as: KR20220133911A; US20230338506A1; JP2023513073A; MX2022009429A; AU2021214774A1; CA3169664A1; EP4096683A4; EP4096683A1; WO2021155243A8; BR112022015053A2; IL295148A; WO2021155243A1

Abstract

本公开涉及呼吸道病毒核糖核酸(RNA)疫苗以及使用所述疫苗的方法和包含所述疫苗的组合物。

Description

呼吸道病毒免疫组合物

相关申请

本申请根据35 U.S.C.119(e)要求2020年1月30日提交的美国临时申请序列号62/967,888的申请日权益，所述临时申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

呼吸道疾病是一个医学术语，其涵盖影响使高等生物中的气体交换成为可能的器官和组织的病理状况，并且包括上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸的神经和肌肉的疾患。呼吸道疾病的范围从轻度和自限性(例如普通感冒)到危及生命的实体如细菌性肺炎、肺栓塞、急性哮喘和肺癌。呼吸道疾病是世界各地常见且重要的疾病和死亡原因。在美国，每年发生大约10亿例“普通感冒”。呼吸道疾患是儿童住院的最常见原因之一。

人呼吸道合胞病毒(hRSV)是一种肺炎病毒属(Pneumovirinae)的负义单链核糖核酸(RNA)病毒。所述病毒存在于至少两个抗原亚组，称为A组和B组，主要是由于表面G糖蛋白的差异。两种hRSV表面糖蛋白(G和F)介导与呼吸道上皮细胞的附着和附着至呼吸道上皮细胞。F表面糖蛋白介导相邻细胞的聚结。这导致合胞细胞的形成。hRSV是细支气管炎的最常见原因。大多数受感染的成年人会出现轻微的感冒样症状，例如充血、低烧和喘息。婴幼儿可能会出现更严重的症状，例如细支气管炎和肺炎。所述疾病可能经由接触呼吸道分泌物而在人类之间传播。

人偏肺病毒(hMPV)是一种属于肺炎病毒属和副粘病毒科(Paramyxoviridae)的负义单链RNA病毒，并且与禽偏肺病毒(AMPV)亚组C密切相关。其于2001年在荷兰通过使用RAP-PCR(RNA任意引物PCR)技术首次分离以鉴定在培养细胞中生长的未知病毒。作为幼儿病毒性下呼吸道疾病(LRI)的重要病因，hMPV仅次于hRSV。hMPV的季节性流行病学似乎与hRSV相似，但感染和疾病的发生率似乎要低得多。

3型副流感病毒(PIV3)与hMPV一样，也是一种属于肺炎病毒属和副粘病毒科的负义单链RNA病毒，并且是婴儿期和幼儿期普遍存在的急性呼吸道感染的主要原因。它的发病率在4-12个月龄左右达到峰值，并且所述病毒导致3-10％的住院，主要是细支气管炎和肺炎。PIV3可能是致命的，并且在一些情况下与神经系统疾病如热性惊厥相关。它还可导致气道重塑，这是发病的重要原因。在世界发展中地区，婴儿和幼儿的死亡风险最高，无论是原发性PIV3病毒感染还是继发性后果(例如细菌感染)。也与hMPV一样，人副流感病毒(hPIV)1、2和3型(分别为hPIV1、hPIV2和hPIV3)在幼儿病毒性LRI的重要病因中仅次于hRSV。

与hMPV、hPIV3和hRSV相关的持续健康问题受到国际关注，这加强了开发针对这些病毒的有效和安全的候选疫苗的重要性。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供了免疫组合物(例如，RNA疫苗和其他免疫原性组合物)，其包含编码高免疫原性抗原的RNA，所述抗原能够引发针对呼吸道病毒抗原(例如人呼吸道合胞病毒(hRSV)抗原、人偏肺病毒(hMPV)抗原和/或人副流感病毒3(hPIV3)抗原)的有效中和抗体反应。令人惊讶的是，本文提供的数据显示，当向动物施用时，包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白的hRSV RNA的免疫组合物诱导针对hRSV F糖蛋白的高度中和抗体反应，即使在比对照组合物低大约5倍的剂量下也是如此。

本公开的一些方面提供了一种组合物(例如，免疫、免疫原性和/或疫苗组合物)，其包含人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核酸(RNA)，所述核糖核酸(RNA)编码稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体，所述hRSV F糖蛋白变体缺乏胞质尾区并且与野生型hRSV F糖蛋白具有至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性。

本公开的其他方面提供了一种人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核酸(RNA)，其编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的RSV F糖蛋白变体，其中所述RSV F糖蛋白变体与全长野生型RSV F糖蛋白；编码hMPV F糖蛋白的人偏肺病毒(hMPV)RNA；和编码hPIV3 F糖蛋白的人副流感病毒3(hPIV3)RNA具有至少85％的同一性。

本公开的其他方面提供了一种包含开放阅读框的信使核糖核酸(mRNA)，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO：7的序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。本公开的其他方面提供了一种包含与SEQ IDNO：15的序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的信使核糖核酸(mRNA)。在一些实施方案中，所述mRNA编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核F糖蛋白变体，其中所述RSV F糖蛋白变体与全长野生型RSV F糖蛋白具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，所述开放阅读框包含SEQ IDNO：7的序列。在一些实施方案中，所述mRNA被配制在脂质纳米颗粒中。

在一些实施方案中，所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端20-30、20-25、15-30、15-25、15-20、10-30、10-25、10-20、10-15、5-30、5-25、5-20或5-15个氨基酸。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸或10个氨基酸。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的以下C末端氨基酸：CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：25)；TPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：26)；SKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：27)；或SGINNIAFSN(SEQ ID NO：28)。

在一些实施方案中，所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSV F糖蛋白还包含选自由以下组成的组的修饰：P102X取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149X取代、S155X取代、S190X取代、V207X取代、S290X取代、L373X取代、I379X取代、M447X取代和Y458X取代，其中X是任何氨基酸。

在一些实施方案中，所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSV F糖蛋白还包含选自由以下组成的组的修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

在一些实施方案中，所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSV F糖蛋白还包含以下修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

在一些实施方案中，所述野生型hRSV F糖蛋白包含SEQ ID NO：1的序列。

在一些实施方案中，所述hRSV F糖蛋白变体包含与SEQ ID NO：8的序列具有至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hRSV F糖蛋白变体包含SEQ IDNO：8的序列。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA包括包含与SEQ ID NO：7的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：7的序列的ORF。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hRSV RNA包含SEQ ID NO：15的序列。

在一些实施方案中，所述hMPV F糖蛋白包含与SEQ ID NO：11的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hMPV F糖蛋白包含SEQ ID NO：11的序列。

在一些实施方案中，所述hMPV RNA包括包含与SEQ ID NO：10的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的ORF。在一些实施方案中，所述hMPV RNA包括包含SEQ IDNO：10的序列的ORF。

在一些实施方案中，所述hMPV RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′UTR。在一些实施方案中，所述hMPV RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

在一些实施方案中，所述hMPV RNA包含与SEQ ID NO：16的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hMPV RNA包含SEQ ID NO：16的序列。

在一些实施方案中，所述hPIV3 F糖蛋白包含与SEQ ID NO：14的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hPIV3 F糖蛋白包含SEQ ID NO：14的序列。

在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包括包含与SEQ ID NO：13的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的ORF。在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包括包含SEQ IDNO：13的序列的ORF。

在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′UTR。在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包含与SEQ ID NO：17的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述hPIV3 RNA包含SEQ ID NO：17的序列。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA还包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp帽。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA还包含多聚(A)尾，任选地具有50至150个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA包含化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰是1-甲基假尿苷。

在一些实施方案中，组合物包含25μg-200μg的所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA。

在一些实施方案中，组合物还包含脂质混合物，所述脂质混合物包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离阳离子脂质或其任何组合。

在一些实施方案中，脂质混合物包含0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质。

在一些实施方案中，所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000DMG)，所述非阳离子脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离阳离子脂质具有化合物1的结构：

在一些实施方案中，脂质混合物形成脂质纳米颗粒。

在一些实施方案中，所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和所述hPIV3 RNA被配制在脂质纳米颗粒中。

本公开的一些方面提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的组合物以在所述受试者中诱导针对hRSV、hMPV和/或hPIV3的中和抗体反应。

在一些实施方案中，所述受试者是免疫功能低下的。在一些实施方案中，所述受试者患有肺病。

在一些实施方案中，所述受试者为5岁或更年轻。在其他实施方案中，所述受试者为65岁或更老。

在一些实施方案中，方法包括向所述受试者施用至少两个剂量的组合物。

国际申请号PCT/US2016/058327(公开号WO2017/07062)和国际申请号PCT/US2017/065408(公开号WO2018/107088)的全部内容通过引用并入本文。

附图说明

图1显示了RSV F糖蛋白变体(由mRNA-1345编码)和野生型RSV F糖蛋白的示意图。

图2A-2B显示了在两个时间点对HEK293T细胞中具有不同特征的mRNA的体外筛选。AM14是一种特异性针对融合前形式的RSV F糖蛋白的单克隆抗体，其被用于流式细胞术分析。在图2A中，顶部导语显示在转染后24小时和48小时。特征1是指优化的5′UTR并且特征2是指野生型RSV F糖蛋白的F1区内的6个氨基酸点突变(图1)。图2B描绘了三种不同剂量的候选构建体后的表达水平。“dCT”代表编码具有截短的胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA。

图3A-3B显示了小鼠中具有不同特征的mRNA的体内筛选。在两次剂量的mRNA后，测量融合后形式RSV F蛋白水平(图3A)和RSV-A中和滴度(图3B)。

图4A-4B显示了使用编码具有截短的胞质尾区的RSV F糖蛋白的密码子优化mRNA的融合前形式RSV F糖蛋白的体外表达水平。图4A显示了三个不同时间点的结果。图4B比较了两种特征(密码子优化和胞质尾区截短)的组合与个别地具有每个特征的mRNA。AM14和D25是两种融合前RSV F糖蛋白特异性抗体。莫维珠单抗(Motavizumab)检测融合前和融合后的RSV F糖蛋白。

图5A-5B图示了在HEK293T细胞(图5A)和THP-1细胞(图5B)中使用编码具有截短的胞质尾区的RSV F糖蛋白的密码子优化mRNA的融合前形式的RSV F糖蛋白的体外表达水平。

图6A-6B显示了编码具有截短的胞质尾区的融合前形式的RSV F糖蛋白的密码子优化mRNA的体内数据。描绘了在第一次给药后(图6A)和第二次给药后(图6B)由施用mRNA产生的融合后形式的RSV F糖蛋白IgG滴度水平。

图7显示了两个图，其描绘了在与所示的mRNA(对照(编码另一种RSV F糖蛋白的mRNA)、RSV F变体或无mRNA)一起温育24小时(左)和48小时(右)后，融合前形式RSV F糖蛋白阳性CD14+单核细胞的频率。

图8是描绘在与mRNA和所示浓度(对照(编码另一种RSV F糖蛋白的mRNA)、密码子优化的RSV F糖蛋白mRNA、编码具有截短的胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA、编码组合RSV F糖蛋白的mRNA(密码子优化与胞质尾区截短)，或无mRNA)一起温育24小时(左)和48小时(右)后，融合前形式的RSV F糖蛋白阳性CD14+单核细胞的频率的图。

图9是显示显微镜实验后每个细胞的平均强度(平均化)的图。HeLa细胞与200ng所示mRNA(对照(另一种编码RSV F糖蛋白的mRNA)、编码RSV F糖蛋白的密码子优化的mRNA、编码具有截短的胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA、编码组合RSV F糖蛋白的mRNA(密码子优化与胞质尾区截短)，或无mRNA)一起温育24或48小时并测量平均强度。

图10A-10B显示了第56天接种疫苗后的RSV抗体滴度。图10A显示了RSV中和滴度，并且图10B显示了RSV融合前F蛋白IgG滴度。标有星号(*)的组是仅接受一剂所示组合物的组。“Lot100”是指1∶100福尔马林灭活RSV组(FI-RSV)。

图11A-11B显示了RSV攻击后的肺病毒载量(图11A)和鼻病毒载量(图11B)(参见实施例4)。标有星号(*)的组是仅接受一剂所示组合物的组。“Lot100”是指1∶100福尔马林灭活RSV组(FI-RSV)。

具体实施方式

本公开提供了引发针对呼吸道病毒抗原的有效中和抗体的免疫组合物(例如RNA疫苗)。本文中的术语“呼吸道病毒抗原”涵盖由本公开的RNA编码的hRSV抗原(例如，hRSV F糖蛋白)、hMPV抗原(例如，hMPV F糖蛋白)、hPIV3抗原(例如，hPIV3 F糖蛋白)及其任何组合(例如，hRSV和hMPV，hRSV和hPIV3，hMPV和hPIV3，或hRSV、hMPV和hPIV3)。应当理解，术语“RNA”和“RNA构建体”在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，免疫组合物包括编码融合前形式的hRSV F糖蛋白的RNA(例如，信使RNA(mRNA))。在其他实施方案中，免疫组合物还包含编码人偏肺病毒(hMPV)F糖蛋白的RNA(例如，mRNA)。在其他实施方案中，免疫组合物还包含编码人副流感病毒3(hPIV3)F糖蛋白的RNA(例如，mRNA)。在其他实施方案中，免疫组合物包括编码融合前形式的hRSV F糖蛋白的RNA(例如mRNA)、编码hMPV F糖蛋白的RNA(例如mRNA)和编码hPIV3 F糖蛋白的RNA(例如mRNA)。在一些实施方案中，融合前形式的hRSV F糖蛋白、bMPV F糖蛋白和hPIV3 F糖蛋白由相同的(单一)RNA编码，而在其他实施方案中，它们由多种RNA独立编码(一种编码融合前hRSV F，一种编码hMPV F，并且一种编码hPIV3 F)。在一些实施方案中，一种RNA(例如，具有5′UTR、ORF、3′UTR和多聚(A)尾)编码融合前hRSV F糖蛋白，而另一种RNA编码hMPV F糖蛋白和hPIV3 F糖蛋白。

hRSV的包膜含有三种表面糖蛋白：F、G和SH。G和F蛋白是保护性抗原和中和抗体的靶标。然而，F蛋白在hRSV毒株和类型(A和B)中更为保守。hRSV F蛋白是一种在临床分离株之间(包括在hRSV-A和hRSV-B抗原亚组之间)非常保守的I型融合糖蛋白。F蛋白在融合前和更稳定的融合后状态之间转换，从而促进进入靶细胞。hRSV F糖蛋白最初合成为F0前体蛋白。hRSV F0折叠成三聚体，其通过弗林蛋白酶切割成包含F1和F2亚基的成熟融合前蛋白而被激活(Bolt等人，Virus Res.，68：25，2000)。尽管中和单克隆抗体的靶标存在于F蛋白的融合后构象上，但中和抗体反应主要靶向自然感染hRSV的人的F蛋白融合前构象(Magro M等人，Proc Natl Acad Sci USA 2012；109(8)：3089-94；Ngwuta JO等人，Sci Transl Med2015；7(309)：309ra162)。与此一致，在动物模型中在融合前构象中稳定的hRSV F蛋白产生比在融合后构象中稳定的hRSV F蛋白所观察到的更大的中和免疫反应(McLellan等人，Science，342：592-598，2013)。因此，稳定化融合前hRSV F蛋白是包含在hRSV疫苗中的良好候选者。

如本文所用，以不稳定的高能状态存在的稳定化融合前RSV F蛋白是包含突变(例如稳定化突变)以防止蛋白质转变为其融合后构象的那些。例如，在一些实施方案中，稳定化融合前RSV F蛋白包含脯氨酸残基(例如，S215P取代)和/或异亮氨酸(例如，N67I取代)取代。举例来说，DS-Cav1变体(一种稳定化融合前RSV F蛋白)含有一个额外的二硫键(S155C/S290C)以及两个空腔填充突变(S190F/V207L)。另一种稳定化融合前RSV F蛋白是PR-DM，其包含一个脯氨酸取代(S215P)和F₂亚基中的一个突变(N67I)。

本文所述的hRSV RNA疫苗在几个方面优于目前的疫苗。例如，与其他制剂相比，本文使用的脂质纳米颗粒(LNP)递送系统提高了RNA疫苗的功效，包括文献中描述的基于鱼精蛋白的方法。使用这种LNP递送系统能够有效递送化学修饰的RNA疫苗或未修饰的RNA疫苗，而不需要额外的佐剂来产生治疗结果(例如，产生中和抗体滴度)。在一些实施方案中，本文公开的hRSV RNA疫苗在肌肉内(IM)或皮内(ID)施用时优于常规疫苗至少10倍、20倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1,000倍。即使与其他类别的基于脂质的制剂中使用的RNA剂量相比，施用显著更低剂量的RNA(例如，mRNA)时，也可以获得这些结果。

此外，与依赖病毒复制途径以将足够的RNA递送至细胞以产生免疫原性反应的自我复制RNA疫苗不同，本公开的组合物不需要病毒复制来产生足够的蛋白质以导致强烈的免疫反应。因此，本公开的组合物不包括自我复制的RNA并且不包括病毒复制所必需的组分。

本文提供的RNA不受特定病毒株(例如，hRSV、hMPV和/或hPIV3)的限制。mRNA所基于的病毒株可以是任何病毒株。

应当理解，本公开的免疫组合物(例如RNA疫苗)不是天然存在的。也就是说，如本文所提供的编码呼吸道病毒抗原的RNA多核苷酸在自然界中不存在。还应理解，本文所述的RNA多核苷酸是从自然界中存在的病毒蛋白和病毒脂质中分离出来的。因此，如本文所提供，包含在脂质纳米颗粒中配制的RNA的免疫组合物例如排除病毒(即，所述组合物不是病毒，它们也不合病毒)。

抗原

抗原是能够诱导免疫反应(例如，导致免疫系统产生针对抗原的抗体)的蛋白质。在本文中，术语“抗原”的使用涵盖免疫原性蛋白质和免疫原性片段(诱导(或能够诱导)对(至少一种)呼吸道病毒(例如，hRSV，或hRSV、hMPV和hPIV3)的免疫反应的免疫原性片段)，除非另有说明。应当理解，术语“蛋白质”涵盖肽并且术语“抗原”涵盖抗原片段。

表1中提供了本公开的组合物的呼吸道病毒抗原和编码所述呼吸道病毒抗原的RNA的示例性序列。

在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQ ID NO：8的序列的融合前形式的hRSV F糖蛋白的RNA。在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQ ID NO：11的序列的融合前形式的hMPV F糖蛋白的RNA。在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQ ID NO：14的序列的融合前形式的hPIV3 F糖蛋白的RNA。

应当理解，由本文所述的RNA编码的任何一种抗原可以包含或不包含信号序列。

核酸

本公开的组合物包含(至少一种)具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框(ORF)的RNA。在一些实施方案中，所述RNA是信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，所述RNA(例如，mRNA)还包含5′UTR、3′UTR、多聚(A)尾和/或5′帽类似物。

还应理解，本公开的hMPV/hPIV3mRNA疫苗可包括任何5′非翻译区(UTR)和/或任何3′UTR。示例性UTR序列在序列表中提供(例如，SEQ ID NO：2-5)；然而，可以使用其他UTR序列或将其交换为本文所述的任何UTR序列。UTR也可以从本文提供的RNA多核苷酸中省略。

核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸。核酸可以是或可以包括例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2′-氨基官能化的2′-氨基-LNA和具有2′-氨基官能化的2′-氨基-α-LNA)、乙烯核酸(ENA)、环己烯基核酸(CeNA)和/或其嵌合体和/或其组合。

信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(一种天然存在的、非天然存在的或修饰的氨基酸聚合物)并且可在体外、体内、原位或离体翻译以产生编码蛋白质的任何RNA。熟练技术人员将理解，除非另有说明，否则本申请中阐述的核酸序列可以在代表性DNA序列中列举“T”，但在所述序列代表RNA(例如，mRNA)的情况下，“T”将代替“U”。因此，本文中通过特定序列识别号公开和识别的任何DNA也公开了与DNA互补的相应RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。

开放阅读框(ORF)是一段连续的DNA或RNA，以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束。ORF通常编码蛋白质。应当理解，本文公开的序列还可包含额外的元件，例如，5′和3′UTR，但与ORF不同，这些元件不一定存在于本公开的RNA多核苷酸中。

变体

在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码呼吸道病毒抗原变体的RNA。抗原变体或其他多肽变体是指其氨基酸序列与野生型、天然或参照序列不同的分子。与天然或参照序列相比，抗原/多肽变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参照序列具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然或参照序列共享至少80％或至少90％的同一性。

由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可含有赋予多种期望性质中的任一者的氨基酸变化，例如，在受试者中增强其免疫原性、增强其表达和/或改善其稳定性或PK/PD性质。变体抗原/多肽可使用常规诱变技术制备，并且适当时进行测定以确定它们是否具有期望性质。用以确定表达水平和免疫原性的测定是本领域众所周知的，并且示例性的此类测定在实施例部分中阐释。类似地，可使用本领域公认的技术，例如通过测定抗原在接种的受试者中随时间推移的表达和/或通过观察诱导的免疫反应的耐久性，来测量蛋白质变体的PK/PD性质。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可通过测定热稳定性或尿素变性时的稳定性来测量，或者可使用计算机预测来测量。用于此类实验和计算机测定的方法是本领域中已知的。

在一些实施方案中，组合物包含RNA或RNA ORF，其包含本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列(参见例如序列表和表1)，或包含与本文提供的序列中的任一者的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的核苷酸序列。

术语“同一性”是指如通过比较序列确定的两种或更多种多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性也指如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数确定的序列之间或之中的序列相关性程度。同一性度量由特定数学模型或计算机程序(例如，“算法”)处理的具有空位比对(如果有的话)的两个或更多个序列中的较小者间的同一性匹配百分比。相关抗原或核酸的同一性可容易地通过已知方法计算。“同一性百分比(％)”当应用于多肽或多核苷酸序列时，定义为在比对序列并引入空位(必要时)以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)同一的残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的空位和罚分，同一性的值可能不同。通常，特定多核苷酸或多肽(例如抗原)的变体与所述特定参照多核苷酸或多肽具有如通过本文所述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。用于比对的此类工具包括BLAST套件的那些工具(Stephen F.Altschul等人(1997)，“Gapped BLAST andPSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”，Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)。另一种常用局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of common molecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。基于动态程序化的通用全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“A general method applicable to thesearch for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近，已开发出一种快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称其比其他最佳全局比对方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。

因此，编码相对于参照序列、特别是本文公开的多肽(例如抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)可添加至肽序列中(例如，在N末端或C末端)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽的溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区的氨基酸残基可任选地缺失，以提供截短的序列。根据序列的用途，例如作为可溶或连接至固体载体的更大序列的一部分的序列的表达，某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可替代地缺失。在一些实施方案中，信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如，折叠子区)等(或编码其)的序列可用实现相同或相似功能的替代序列取代。在一些实施方案中，可例如通过引入更大的氨基酸填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性。在其他实施方案中，可用疏水性残基置换包埋的氢键网络以改进稳定性。在其他实施方案中，可去除糖基化位点并用适当残基置换。本领域技术人员可容易地鉴定此类序列。还应理解，本文提供的一些序列含有可在例如用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前缺失的序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端)。

如由本领域技术人员认识到，也将蛋白质片段、功能蛋白质结构域和同源蛋白质视为在目标呼吸道病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参照蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参照抗原序列短至少一个氨基酸残基、但在其他方面相同的多肽序列)，条件是所述片段是免疫原性的并赋予针对呼吸道病毒的保护性免疫反应。除了与参照蛋白质相同但截短的变体之外，在一些实施方案中，如本文提供或参考的任何序列中所示，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。抗原/抗原性多肽的长度范围可为约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质。

hRSV抗原变体

在一些实施方案中，组合物包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含hRSV F糖蛋白变体的C末端20-30、20-25、15-30、15-25、15-20、10-30、10-25、10-20、10-15、5-30、5-25、5-20或5-15个氨基酸。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含hRSV F糖蛋白的C末端25个氨基酸(例如，CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：25))。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含hRSV F糖蛋白的C末端20个氨基酸(例如，TPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：26))。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含hRSV F糖蛋白的C末端15个氨基酸(例如，SKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：27))。在一些实施方案中，所述胞质尾区包含hRSV F糖蛋白的C末端10个氨基酸(例如，SGINNIAFSN(SEQ ID NO：28))。

在一些实施方案中，组合物包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RSV F糖蛋白变体与野生型hRSV F糖蛋白(例如，包含SEQ IDNO：1的序列的野生型hRSV F糖蛋白)或缺乏胞质尾区的野生型hRSV F糖蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性。在一些实施方案中，组合物包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RSV F糖蛋白变体与SEQID NO：8的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性。在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQ ID NO：8的序列的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA。

在一些实施方案中，组合物包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ ID NO：7的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的ORF序列。在一些实施方案中，组合物包含编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。

在一些实施方案中，相对于野生型hRSV F糖蛋白(例如，SEQ ID NO：1)，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含选自由以下组成的组的修饰：P102X取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149X取代、S155X取代、S190X取代、V207X取代、S290X取代、L373X取代、I379X取代、M447X取代和Y458X取代，其中X是任何氨基酸(例如A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V)。

在一些实施方案中，相对于野生型hRSV F糖蛋白，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含选自由以下组成的组的修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含P102A取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含用接头分子取代氨基酸104-144。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含A149C取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含S155C取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含S190F取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含V207L取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含S290C取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含L373R取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含I379V取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含M447V取代。在一些实施方案中，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含Y458C取代。

在一些实施方案中，相对于野生型hRSV F糖蛋白，缺乏胞质尾区的hRSV F糖蛋白变体还包含以下修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

hMPV抗原变体

在一些实施方案中，组合物包含编码hMPV F糖蛋白变体的RNA，所述糖蛋白变体与野生型hMPV F糖蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性。在一些实施方案中，组合物包含编码与SEQ ID NO：11的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的hMPV F糖蛋白变体的RNA。在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQ IDNO：11的序列的hMPV F糖蛋白变体的RNA。

在一些实施方案中，组合物包含编码hMPV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ ID NO：10的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的ORF序列。在一些实施方案中，组合物包含编码hMPV F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ IDNO：16的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。

hPIV3抗原变体

在一些实施方案中，组合物包含编码hPIV3 F糖蛋白变体的RNA，所述糖蛋白变体与野生型hPIV3 F糖蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性。在一些实施方案中，组合物包含编码与SEQ ID NO：14的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的hPIV3 F糖蛋白变体的RNA。在一些实施方案中，组合物包含编码包含SEQID NO：14的序列的hPIV3 F糖蛋白变体的RNA。

在一些实施方案中，组合物包含编码hPIV3 F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ ID NO：13的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的ORF序列。在一些实施方案中，组合物包含编码hPIV3 F糖蛋白变体的RNA，其中所述RNA包含与SEQ IDNO：17的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列。

稳定化元件

天然存在的真核mRNA分子除了例如5′-帽结构或3′-多聚(A)尾的其他结构特征之外，还可含有稳定化元件，包括但不限于在其5′端(5′UTR)和/或在其3′端(3′UTR)的非翻译区(UTR)。5′UTR和3′UTR二者都通常是从基因组DNA转录并且是成熟前mRNA的元件。通常在mRNA加工期间向转录的(成熟前)mRNA中添加成熟mRNA的特征性结构特征(例如5′-帽和3′-多聚(A)尾)。

在一些实施方案中，组合物包括具有编码至少一种具有至少一个修饰的抗原性多肽的开放阅读框、至少一个5′末端帽的RNA多核苷酸，并且配制在脂质纳米颗粒内。多核苷酸的5′-加帽可根据制造商的方案在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物同时完成，以产生5′-鸟苷帽结构：3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G[ARCA帽]；G(5′)ppp(5′)A；G(5′)ppp(5′)G；m7G(5′)ppp(5′)A；m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。经修饰的RNA的5′-加帽可在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成，以产生“帽0”结构：m7G(5′)ppp(5′)G(New England BioLabs，Ipswich，MA)。帽1结构可使用牛痘病毒加帽酶和2′-O甲基转移酶产生，以产生：m7G(5′)ppp(5′)G-2′-O-甲基。帽2结构可从帽1结构、接着使用2′-O甲基转移酶对5′-倒数第三个核苷酸进行2′-O-甲基化来产生。帽3结构可从帽2结构、接着使用2′-O甲基转移酶对5′-倒数第四个核苷酸进行2′-O-甲基化来产生。酶可源自重组来源。

3′-多聚(A)尾通常是添加至转录的mRNA的3′端的一段腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，其可包含高达约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3′-多聚(A)尾的长度对于个别mRNA的稳定性可为必需的要素。

在一些实施方案中，组合物包括稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎环。已鉴定茎环结合蛋白(SLBP)，一种32kDa的蛋白质。其与细胞核和细胞质二者中组蛋白信使3′端的组蛋白茎环缔合。其表达水平受细胞周期的调控；其在S期达到峰值，此时组蛋白mRNA水平也升高。已显示所述蛋白质对于U7 snRNP对组蛋白前mRNA的有效3′端加工是至关重要的。SLBP在加工后继续与茎环缔合，然后刺激成熟组蛋白mRNA在细胞质中翻译成组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物和原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎环的5′的至少三个核苷酸和3′的两个核苷酸。

在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)包括编码区、至少一个组蛋白茎环和任选地多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号。所述多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号通常应增强编码的蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所述编码的蛋白质不为组蛋白、报告基因蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、β-半乳糖苷酶、EGFP)或标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。

在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)包括多聚(A)序列或多聚腺苷酸化信号与至少一个组蛋白茎环的组合，即使两者在性质上代表替代机制，但协同地作用以增加蛋白质表达超过用任一个别元件观察到的水平。多聚(A)和至少一种组蛋白茎环的组合的协同效应不依赖于元件的顺序或多聚(A)序列的长度。

在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)不包括组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括在天然存在的茎环的3′的大约15至20个核苷酸的富含嘌呤的多核苷酸段，其代表U7 snRNA的结合位点，所述U7 snRNA参与组蛋白前mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。

RNA(例如mRNA)可含有或可不含有增强子和/或启动子序列，其可经修饰或未经修饰，或者其可经活化或未经活化。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，并且包括由间隔体分开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述间隔体由形成结构的环的短序列组成。未配对的环区通常不能与茎环元件中的任一者碱基配对。其由于是许多RNA二级结构的关键组分而更经常地出现于RNA中，但也可存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于长度、错配或膨出部的数目和配对区的碱基组成。在一些实施方案中，可产生摆动碱基配对(非沃森-克里克碱基配对(non-Watson-Crick basepairing))。在一些实施方案中，至少一种组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)已去除一个或多个富含AU的序列。这些序列有时称为AURES，其是在3′UTR中发现的去稳定化序列。AURES可从RNA疫苗去除。或者，AURES可保留在RNA疫苗中。

信号肽

在一些实施方案中，组合物包含具有ORF的RNA(例如mRNA)，所述ORF编码与呼吸道病毒抗原融合的信号肽。包含蛋白质N末端15-60个氨基酸的信号肽通常是分泌途径上跨膜易位所需要的，并且因此，普遍控制真核生物和原核生物中大部分蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗内质网(ER)膜，并且起始生长的肽链穿过其转运以进行加工。ER加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白切割，或者它们保持未切割并作为膜锚起作用。信号肽也可促进蛋白质靶向细胞膜。

信号肽的长度可为15-60个氨基酸。例如，信号肽的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽的长度为20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸。

来自异源基因的信号肽(其调控自然界中除呼吸道病毒抗原外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试其期望性质，然后并入本公开的核酸中。在一些实施方案中，所述信号肽可包含以下序列之一：MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLPQGVVG(SEQ ID NO：18)、MDWTWILFLVAAATRVHS(SEQ ID NO：19)；METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：20)；MLGSNSGQRVVFTILLLLVAPAYS(SEQ ID NO：21)；MKCLLYLAFLFIGVNCA(SEQ ID NO：22)；MWLVSLAIVTACAGA(SEQ ID NO：23)。

融合蛋白

在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码抗原融合蛋白的RNA(例如，mRNA)。因此，所编码的一种或多种抗原可包括结合在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。在一些实施方案中，RNA编码与hPIV3 F糖蛋白融合的hMPV F糖蛋白。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质不会促进对自身的强烈免疫反应，而是促进对呼吸道病毒抗原的免疫反应。在一些实施方案中，抗原融合蛋白保留了每个原始蛋白的功能特性。

支架部分

在一些实施方案中，如本文提供的RNA(例如，mRNA)疫苗编码包含与支架部分连接的呼吸道病毒抗原的融合蛋白。在一些实施方案中，此类支架部分赋予由本公开的核酸编码的抗原所需的特性。例如，支架蛋白可提高抗原的免疫原性，例如，通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工，和/或使抗原与结合配偶体结合。

在一些实施方案中，所述支架部分是可自组装成高度对称、稳定和结构有序的蛋白质纳米颗粒的蛋白质，其直径为10-150nm，这是高度适合与免疫系统的各种细胞最佳相互作用的尺寸范围。在一些实施方案中，病毒蛋白或病毒样颗粒可用于形成稳定的纳米颗粒结构。此类病毒蛋白的实例是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，所述支架部分是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成平均直径为约22nm且缺乏核酸的球形颗粒，因此是非传染性的(Lopez-Sagaseta，J.等人，Computational and Structural BiotechnologyJournal 14(2016)58-68)。在一些实施方案中，所述支架部分是乙型肝炎核心抗原(HBcAg)自组装成24-31nm直径的颗粒，其类似于从HBV感染的人肝脏获得的病毒核心。HBcAg自组装产生两种类别的不同大小的纳米颗粒，直径为

和

对应于180或240个原体。在一些实施方案中，呼吸道病毒抗原与HBsAG或HBcAG融合以促进展示呼吸道病毒抗原的纳米颗粒的自组装。

在一些实施方案中，可使用细菌蛋白质平台。这些自组装蛋白的非限制性实例包括铁蛋白、2，4-二氧四氢蝶啶(lumazine)和包封蛋白。

铁蛋白是主要功能为细胞内铁储存的蛋白质。铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由自组装成具有八面体对称性的四级结构的四α螺旋束构成(Cho K.J.等人，J MolBiol.2009；390：83-98)。已经确定了若干高分辨率的铁蛋白结构，证实幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白由24个相同的原体组成，而在动物体内，存在可单独组装或以不同的比率组合成24个亚基的颗粒的铁蛋白轻链和重链(Granier T.等人，J BiolInorg Chem.2003；8：105-111；Lawson D.M.等人，Nature.1991；349：541-544)。铁蛋白自组装成纳米颗粒，具有强大的热稳定性和化学稳定性。因此，铁蛋白纳米颗粒非常适合携带和暴露抗原。

2，4-二氧四氢蝶啶合酶(LS)也非常适合用作抗原展示的纳米颗粒平台。LS负责核黄素生物合成中倒数第二个催化步骤，是一种存在于包括古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌的多种生物体中的酶(Weber S.E.Flavins and Flavoproteins.Methods andProtocols，Series：Methods in Molecular Biology.2014)。LS单体长150个氨基酸，并且由β折叠以及两侧的串联α螺旋组成。已经报道了LS的许多不同的四级结构，说明了其形态的多面性：从同五聚体到12个五聚体的对称组装体，形成直径为

的衣壳。甚至已经描述了超过100个亚基的LS笼(Zhang X.等人，J Mol Biol.2006；362：753-770)。

包封蛋白是一种从嗜热生物海栖热袍菌(Thermotoga maritima)分离的新型蛋白质笼形纳米颗粒，也可用作在自组装纳米颗粒表面上呈递抗原的平台。包封蛋白由相同31kDa单体的60个拷贝组装而成，所述单体具有薄的二十面体T＝1对称的笼形结构，其内径和外径分别为20nm和24nm(Sutter M.等人，Nat Struct Mol Biol.2008，15：939-947)。尽管尚未清楚地了解包封蛋白在海栖热袍菌中的确切功能，但最近其晶体结构已得以解决，并且其功能假定为包封例如DyP(染料脱色过氧化物酶)和Flp(铁蛋白样蛋白)的蛋白质的细胞区室，所述蛋白质参与氧化应激反应(Rahmanpour R.等人，FEBS J.2013，280：2097-2104)。

接头和可切割肽

在一些实施方案中，本公开的mRNA编码多于一种多肽，在本文中称为融合蛋白。在一些实施方案中，所述mRNA进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。所述接头可以是例如可切割接头或蛋白酶敏感接头。在一些实施方案中，所述接头选自由F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头及其组合组成的组。该自切割肽接头家族，称为2A肽，已在本领域中描述(参见例如Kim，J.H.等人，(2011)PLoS ONE 6：e18556)。在一些实施方案中，所述接头是F2A接头。在一些实施方案中，所述接头是GGGS接头。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有三个具有插入接头的结构域，具有以下结构：结构域-接头-结构域-接头-结构域。

本领域已知的可切割接头可与本公开结合使用。示例性的此类接头包括：F2A接头、T2A接头、P2A接头、E2A接头(参见例如WO2017127750)。熟练技术人员将理解，其他本领域公认的接头可能适用于本公开的RNA(例如，由本公开的核酸编码)。熟练技术人员同样将理解，其他多顺反子RNA(例如，在同一分子内分别编码多于一种抗原/多肽的mRNA)可能适合如本文所提供的用途。

序列优化

在一些实施方案中，对编码本公开的抗原的ORF进行密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可为密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏向GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；最小化可损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基操作；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；在编码的蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译率以允许蛋白质的各种结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的-非限制性实例包括来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。

在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列ORF(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享小于75％的序列同一性。

在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享介于65％与85％之间(例如，介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如，编码呼吸道病毒抗原的天然存在或野生型mRNA序列)共享介于65％与75％或约80％之间的序列同一性。

在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原与由非密码子优化的序列编码的呼吸道病毒抗原的免疫原性一样，或比其免疫原性更高(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。

经修饰的mRNA在转染至哺乳动物宿主细胞中时具有12-18小时之间或大于18小时、例如24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。

在一些实施方案中，密码子优化的RNA可为其中G/C的水平增加的RNA。核酸分子(例如mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA可在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。举例来说，WO02/098443公开了一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰而稳定化的mRNA。由于遗传密码的简并性，修饰通过用促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子取代现有密码子来起作用。所述方法限于RNA的编码区。

化学上未经修饰的核苷酸

在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如存在于转录的RNA中的那些核苷残基(例如A、G、C或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如dA、dG、dC或dT)。

化学修饰

在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA，其中核酸包含可为标准的(未经修饰的)或如本领域中已知修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可为天然存在的经修饰的核苷酸和核苷或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域中公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分的那些修饰。

在一些实施方案中，本公开的天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于广泛公认的MODOMICS数据库中。

在一些实施方案中，本公开的非天然存在的经修饰的核苷酸或核苷是本领域中通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷的非限制性实例尤其可见于公开的美国申请号PCT/US2012/058519；PCT/US2013/075177；PCT/US2014/058897；PCT/US2014/058891；PCT/US2014/070413；PCT/US2015/36773；PCT/US2015/36759；PCT/US2015/36771；或PCT/IB2017/051367，所述申请都通过引用并入本文。

因此，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。

在一些实施方案中，本公开的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，例如mRNA核酸)包含多种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)分别在细胞或生物体中展现降低的降解。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)可分别在细胞或生物体中展现降低的免疫原性(例如，降低的先天反应)。

在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)包含非天然修饰的核苷酸，其在核酸的合成期间或合成后引入以实现期望功能或性质。修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可用化学合成或用聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。核酸的任何区可经化学修饰。

本公开提供了核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基团的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何有用的方法，例如化学、酶促或重组方法合成，以包括一个或多个经修饰的或非天然的核苷。核酸可包含连接的核苷的一个或多个区。此类区可具有可变的主链键联。键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情形下，核酸将包含核苷酸的区。

经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且还包括在核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间、例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中的氢键。此类非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入本公开的核酸中。

在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)中经修饰的核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如RNA核酸，例如mRNA核酸)中的经修饰的核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括至少两种(例如，2、3、4种或更多种)任何上文所提及的经修饰的核碱基的组合，包括但不限于化学修饰。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置的5-甲基胞苷取代。

在一些实施方案中，本公开的mRNA包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置的尿苷。

在一些实施方案中，对于特定修饰，对mRNA进行均匀修饰(例如，完全修饰、贯穿整个序列中修饰)。例如，核酸可用1-甲基-假尿苷均匀修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基都用1-甲基-假尿苷置换。类似地，通过用经修饰的残基(例如上文所阐释的那些残基)置换，可针对序列中存在的任何类型的核苷残基对核酸进行均匀修饰。

本公开的核酸可沿着分子的整个长度经部分或完全修饰。例如，在本公开的核酸中，或在其预定序列区中(例如，在包括或不包括多聚(A)尾的mRNA中)，可均匀地修饰一种或多种或所有或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任何一种或多种或所有A、G、U、C)。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区中)的所有核苷酸X都是经修饰的核苷酸，其中X可为核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。

所述核酸可含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一者或多者)或任何居间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。应理解，未经修饰的A、G、U或C的存在占任何其余百分数。

mRNA可含有最少1％并且最多100％的经修饰的核苷酸或任何居间百分数，例如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，所述核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，所述核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物置换，或者可由具有不同结构(例如，2、3、4种或更多种独特结构)的多种化合物置换。

非翻译区(UTR)

本公开的mRNA可包含一个或多个充当或用作非翻译区的区域或部分。当mRNA被设计为编码至少一种目标抗原时，核酸可包含这些非翻译区(UTR)中的一者或多者。核酸的野生型非翻译区被转录，但未被翻译。在mRNA中，5′UTR在转录起始位点开始，并继续至起始密码子，但不包括起始密码子；而3′UTR在终止密码子之后立即开始，并继续至转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面所起的调控作用。UTR的调控特征可并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性。还可并入特定特征以确保在转录物被错误导向不期望器官部位的情形下转录物的受控下调。多种5′UTR和3′UTR序列是本领域中已知和可获得的。

5′UTR是mRNA的在起始密码子(核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)正上游(5′)的区。5′UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5′UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有印记如Kozak序列，通常已知所述Kozak序列参与核糖体起始许多基因翻译的过程。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO：29)，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子(AUG)后接另一个‘G’。还已知5′UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。

在本公开的一些实施方案中，5′UTR是异源UTR，即，是在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5′UTR是合成UTR，即，在自然界中不出现。合成的UTR包括已经突变以改善其性质的UTR，例如，增加基因表达的UTR，以及完全合成的UTR。示例性5′UTR包括非洲爪蟾属(Xenopus)或人源a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人类细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶和烟草蚀纹病毒(US8278063、9012219)。还可使用CMV立即早期1(IE1)基因(US20140206753、WO2013/185069)、序列GGGAUCCUACC(SEQ IDNO：30)(WO2014144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5′UTR是缺乏5′TOP基序(寡嘧啶束)的TOP基因的5′UTR(例如，WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738、WO2015024667、WO2015024667)；可使用源自核糖体蛋白大32(L32)基因的5′UTR元件(WO/2015101414、WO2015101415、WO/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5′UTR的5′UTR元件(WO2015024667)或源自ATP5A1的5′UTR的5′UTR元件(WO2015024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5′UTR。

在一些实施方案中，本公开的5′UTR包含选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。

3′UTR是mRNA的在终止密码子(mRNA转录物的发出翻译终止信号的密码子)正下游(3′)的区。3′UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3′UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷的段。这些富AU的印记在具有高周转率的基因中特别普遍。富AU的元件(ARE)基于其序列特征和功能特性可分成三类(Chen等人，1995)：I类ARE在富U区内含有AUUUA基序的若干分散的拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)(SEQ ID NO：31)九聚体。含有这种类型的ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE定义不太明确。这些富U区不含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这种类别的两个充分研究的实例。已知大多数结合至ARE的蛋白质使信使不稳定，而据记载ELAV家族的成员(最著名的是HuR)增加mRNA的稳定性。HuR结合至所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3′UTR中将导致HuR结合，并因此导致体内信使的稳定化。

3′UTR富AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节本公开的核酸(例如RNA)的稳定性。当工程化特定核酸时，可引入ARE的一个或多个拷贝以使本公开的核酸更不稳定，从而缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，可鉴定和去除或突变ARE以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可在相关细胞系中使用本公开的核酸执行转染实验，并且可在转染后的不同时间点测定蛋白质产生。例如，可用不同ARE工程化分子，并且通过对相关蛋白质使用ELISA试剂盒并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质，来转染细胞。

3′UTR可为异源的或合成的。关于3′UTR，球蛋白UTR(包括非洲爪蟾属β-球蛋白UTR和人类β-球蛋白UTR)是本领域中已知的(8278063、9012219、US20110086907)。通过首尾相连地克隆两个连续的人类β-球蛋白3′UTR，已开发在一些细胞类型中具有增强的稳定性的编码经修饰的β-球蛋白的核酸(例如，mRNA)，并且其是本领域中众所周知的(US2012/0195936、WO2014/071963)。另外，a2-球蛋白、a1-球蛋白、UTR和其突变体也是本领域中已知的(WO2015101415、WO2015024667)。在非专利文献中mRNA中阐述的其他3′UTR包括CYBA(Ferizi等人，2015)和白蛋白(Thess等人，2015)。其他示例性3′UTR包括牛或人类生长激素(野生型或经修饰的)(WO2013/185069、US20140206753、WO2014152774)、兔β球蛋白和乙型肝炎病毒(HBV)的3′UTR，α-球蛋白3′UTR和病毒VEEV 3′UTR序列也是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用序列UUUGAAUU(WO2014144196)。在一些实施方案中，使用人类和小鼠核糖体蛋白的3′UTR。其他实例包括rps9 3′UTR(WO2015101414)、FIG4(WO2015101415)和人类白蛋白7(WO2015101415)。

在一些实施方案中，本公开的3′UTR包含选自SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列。

本领域的普通技术人员将理解，异源或合成的5′UTR可与任何期望的3′UTR序列一起使用。例如，异源5′UTR可与合成3′UTR或异源3′UTR一起使用。

非UTR序列也可用作核酸内的区或亚区。例如，内含子或内含子序列的部分可并入本公开的核酸的区中。内含子序列的并入可增加蛋白质产生以及核酸水平。

特征的组合可包括在侧翼区中并且可包含在其他特征内。例如，ORF的侧翼可为5′UTR，其可含有强Kozak翻译起始信号；和/或3′UTR，其可包括用于以模板添加多聚A尾的寡(dT)序列。5′UTR可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开号20100293625和PCT/US2014/069155中所述的5′UTR，所述公开通过引用整体并入本文。

应理解，来自任何基因的任何UTR可并入核酸的区中。此外，可利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不为野生型区的变体的人工UTR也在本公开的范围内。这些UTR或其部分可以与其所选自的转录物中相同的方向放置，或者可在方向或位置上改变。因此，5′或3′UTR可倒置、缩短、延长，与一个或多个其他5′UTR或3′UTR一起制备。如本文所用的术语“改变的”当关于UTR序列时，意指相对于参考序列，UTR已经以某种方式改变。例如，3′UTR或5′UTR可通过如上文教导的方向或位置的改变而相对于野生型或天然UTR改变，或者可通过包括额外核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座而改变。产生“改变的”UTR(无论3′或5′)的这些改变中的任一者包含变体UTR。

在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重UTR，例如5′UTR或3′UTR。如本文所用的“双重”UTR是其中串联或基本上串联编码相同UTR的两个拷贝的UTR。例如，可使用双重β-球蛋白3′UTR，如美国专利公开20100129877中所述，所述专利公开的内容通过引用整体并入本文。

具有模式化UTR也在本公开的范围内。如本文所用的“模式化UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，例如重复一次、两次或超过3次的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平的不同UTR。

在一些实施方案中，侧翼区选自其蛋白质共享共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。例如，目标多肽可属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自这些基因中的任一者的UTR可交换为相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR，以产生新的多核苷酸。如本文所用的“蛋白质家族”以最广泛的意义使用，指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组两种或更多种目标多肽。

非翻译区还可包括翻译增强子元件(TEE)。作为一个非限制性实例，TEE可包括美国申请号20090226470中阐述的那些TEE和本领域中已知的那些TEE，所述申请通过引用整体并入本文。

RNA的体外转录

编码本文所述的多核苷酸的cDNA可使用体外转录(IVT)系统转录。RNA的体外转录是本领域中已知的，并且阐述于国际公开WO/2014/152027中，所述公开通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，所述RNA转录物是使用非扩增的线性化DNA模板在体外转录反应中产生，以产生RNA转录物。在一些实施方案中，所述模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，所述模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，所述cDNA通过RNA多核苷酸(例如但不限于呼吸道病毒mRNA)的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养转染的细胞以复制质粒DNA，然后分离和纯化所述质粒DNA。在一些实施方案中，所述DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于目标基因5′并与其可操作连接的T7启动子。

在一些实施方案中，体外转录模板编码5′非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并编码3′UTR和多聚(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板编码的mRNA。

“5′非翻译区”(UTR)是指不编码多肽的mRNA的位于起始密码子(即，核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)正上游(即，5′)的区。当产生RNA转录物时，5′UTR可包含启动子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。应理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。

“3′非翻译区”(UTR)是指不编码多肽的mRNA的位于终止密码子(即，发出翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)正下游(即，3′)的区。

“开放阅读框”是以起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束的DNA的连续段，并且编码多肽。

“多聚(A)尾”是mRNA的位于含有多个连续单磷酸腺苷的3′UTR的下游、例如正下游(即，3′)的区。多聚(A)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，多聚(A)尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学环境中(例如，在细胞中，在体内)，多聚(A)尾用于保护mRNA免于例如在细胞质中的酶促降解，并帮助转录终止，和/或mRNA从细胞核输出和翻译。

在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸)。

体外转录系统通常包含转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。

所述NTP可在内部制造，可选自供应商，或者可如本文所述合成。所述NTP可选自但不限于本文所述的那些NTP，包括天然和非天然(经修饰的)NTP。

任何数量的RNA聚合酶或变体可用于本公开的方法中。所述聚合酶可选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变型聚合酶，例如但不限于能够并入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除使用DNA酶。

在一些实施方案中，RNA转录物通过酶促加帽来加帽。在一些实施方案中，RNA包含5′末端帽，例如7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp。

化学合成

固相化学合成。本公开的核酸可使用固相技术全部或部分地制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定于固体载体上，并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。

液相化学合成。通过顺序添加单体结构单元来合成本公开的核酸可在液相中实施。

合成方法的组合。上文论述的合成方法各自具有其自身的优点和限制。已尝试组合这些方法以克服所述限制。此类方法的组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶促连接的组合使用提供了产生不能通过单独化学合成获得的长链核酸的有效方式。

核酸区或亚区的连接

还可使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶经由磷酸二酯键的形成促进多核苷酸链的5′端和3′端的分子间连接。核酸(例如嵌合多核苷酸和/或环状核酸)可通过一个或多个区或亚区的连接来制备。DNA片段可通过连接酶催化的反应连接，以产生具有不同功能的重组DNA。两个寡脱氧核苷酸(一个具有5′磷酰基，并且另一个具有游离的3′羟基)用作DNA连接酶的底物。

纯化

本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。净化可通过本领域中已知的方法实施，所述方法例如但不限于

珠粒(BeckmanCoulter Genomics，Danvers，MA)、聚-T珠粒、LNA^TM寡-T捕获探针(

公司，Vedbaek，Denmark)或基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化的”当关于核酸使用时，例如“纯化的核酸”，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一种物质不适合、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以不同于其在自然界中发现的形式或环境存在，或以不同于其在进行处理或纯化方法之前存在的形式或环境存在。

质量保证和/或质量控制检查可使用例如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析型HPLC的方法执行。

在一些实施方案中，核酸可通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法测序。

定量

在一些实施方案中，本公开的核酸可在外泌体中或当衍生自一种或多种体液时定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper′s fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔液和脐带血。或者，外泌体可从选自由以下组成的组的器官中取得：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾脏、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食管、肝脏和胎盘。

可使用抗原特异性探针、血细胞计数法、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱或其组合来实施测定，而外泌体可使用免疫组织化学方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))方法来分离。外泌体也可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离。

这些方法使得研究人员能够实时监测剩余或递送的核酸水平。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。

在一些实施方案中，核酸可使用例如但不限于紫外可见光谱(UV/Vis)的方法来定量。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是

光谱仪(ThermoFisher，Waltham，MA)。可对定量的核酸进行分析，以确定核酸是否可具有适当大小，检查核酸未发生降解。核酸的降解可通过以下方法检查，例如但不限于琼脂糖凝胶电泳；基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)；液相色谱-质谱(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。

脂质纳米颗粒(LNP)

在一些实施方案中，本公开的RNA(例如，mRNA)配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离阳离子脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG脂质组分以及目标核酸货物。本公开的脂质纳米颗粒可使用本领域中通常已知的组分、组合物和方法产生，参见例如PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/52117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575和PCT/US2016/069491，所述专利都通过引用整体并入本文。

本公开的疫苗通常配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含至少一种可电离阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20-60％的可电离阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为20-50％、20-40％、20-30％、30-60％、30-50％、30-40％、40-60％、40-50％或50-60％的可电离阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20％、30％、40％、50％或60％的可电离阳离子脂质。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为5-25％的非阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为5-20％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％或20-25％的非阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为5％、10％、15％、20％或25％的非阳离子脂质。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为25-55％的固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为25-50％、25-45％、25-40％、25-35％、25-30％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、35-55％、35-50％、35-45％、35-40％、40-55％、40-50％、40-45％、45-55％、45-50％或50-55％的固醇。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的固醇。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为0.5-15％的PEG修饰的脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含摩尔比率为0.5-10％、0.5-5％、1-15％、1-10％、1-5％、2-15％、2-10％、2-5％、5-15％、5-10％或10-15％。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的PEG修饰的脂质。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含摩尔比率为20-60％的可电离阳离子脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的固醇和0.5-15％的PEG修饰的脂质。

在一些实施方案中，本公开的可电离阳离子脂质包含式(I)化合物：

或其盐或异构体，其中：

R₁选自由C_5-30烷基、C_5-20烯基、-R*YR″、-YR″和-R″M′R′组成的组；

R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R₂和R₃与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未被取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自碳环、杂环、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN-、N(R)₂、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(R)N(R)₂C(O)OR，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR′)O-、-S(O)₂-、-S-S-、芳基和杂芳基；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

R₉选自由H、CN、NO₂、C_1-6烷基、-OR、-S(O)₂R、-S(O)₂N(R)₂、C_2-6烯基、C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R′独立地选自由C_1-18烷基、C_2-18烯基、-R*YR″、-YR″和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。

在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括以下的那些化合物：其中当R₄是-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR或-CQ(R)₂时，则(i)当n为1、2、3、4或5时，Q不为-N(R)₂，或(ii)当n为1或2时，Q不为5元、6元或7元杂环烷基。

在一些实施方案中，式(I)化合物的另一个子集包括以下的那些化合物：其中

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未被取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环烷基，其被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代基(＝O)、OH、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和C_1-3烷基，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，

或其盐或异构体。

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未被取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂环、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR₉)N(R)₂，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当Q是5至14元杂环并且(i)R₄是-(CH₂)_nQ，其中n为1或2，或(ii)R₄是-(CH₂)_nCHQR，其中n为1，或(iii)R₄是-CHQR和-CQ(R)₂时，则Q是5至14元杂芳基或8至14元杂环烷基；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，

或其盐或异构体。

R₄选自由C_3-6碳环、-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR、-CQ(R)₂和未被取代的C_1-6烷基组成的组，其中Q选自C_3-6碳环、具有一个或多个选自N、O和S的杂原子的5至14元杂芳基、-OR、-O(CH₂)_nN(R)₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX₃、-CX₂H、-CXH₂、-CN、-C(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(R)C(S)N(R)₂、-CRN(R)₂C(O)OR、-N(R)R₈、-O(CH₂)_nOR、-N(R)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(R)C(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)₂、-N(OR)C(S)N(R)₂、-N(OR)C(＝NR₉)N(R)₂、-N(OR)C(＝CHR₉)N(R)₂、-C(＝NR₉)R、-C(O)N(R)OR和-C(＝NR₉)N(R)₂，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₈选自由C_3-6碳环和杂环组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_2-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，

或其盐或异构体。

R₂和R₃独立地选自由H、C_2-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR″、-YR″″和-R*OR″组成的组，或者R₂和R₃与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；

R₄是-(CH₂)_nQ或-(CH₂)_nCHQR，其中Q是-N(R)₂，并且n选自3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_1-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，

或其盐或异构体。

R₂和R₃独立地选自由C_1-14烷基、C_2-14烯基、-R*YR″、-YR″和-R*OR″组成的组，或者R₂和R₃与其所附接的原子一起形成杂环或碳环；

R₄选自由-(CH₂)_nQ、-(CH₂)_nCHQR、-CHQR和-CQ(R)₂组成的组，其中Q是-N(R)₂，并且n选自1、2、3、4和5；

每个R₅独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R₆独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

R₇选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R独立地选自由C_1-3烷基、C_2-3烯基和H组成的组；

每个R″独立地选自由C_3-14烷基和C_3-14烯基组成的组；

每个R*独立地选自由C_1-12烷基和C_1-12烯基组成的组；

每个Y独立地是C_3-6碳环；

每个X独立地选自由F、Cl、Br和I组成的组；并且

m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，

或其盐或异构体。

在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IA)化合物：

或其盐或异构体，其中1选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；M₁是键或M′；R₄是未被取代的C_1-3烷基，或-(CH₂)_nQ，其中Q是OH、-NHC(S)N(R)₂、-NHC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)R₈、-NHC(＝NR₉)N(R)₂、-NHC(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-P(O)(OR′)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基和C_2-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(II)化合物：

或其盐或异构体，其中1选自1、2、3、4和5；M₁是键或M′；R₄是未被取代的C_1-3烷基，或-(CH₂)_nQ，其中n为2、3或4，并且Q为OH、-NHC(S)N(R)₂、-NHC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(R)R₈、-NHC(＝NR₉)N(R)₂、-NHC(＝CHR₉)N(R)₂、-OC(O)N(R)₂、-N(R)C(O)OR、杂芳基或杂环烷基；M和M′独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R′)-、-P(O)(OR′)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且R₂和R₃独立地选自由H、C_1-14烷基和C_2-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IIa)、(IIb)、(IIc)或(IIe)的化合物：

或其盐或异构体，其中R₄如本文所述。

在一些实施方案中，式(I)化合物的子集包括式(IId)化合物：

或其盐或异构体，其中n为2、3或4；并且m、R′、R″和R₂至R₆如本文所述。例如，R₂和R₃可各自独立地选自由C_5-14烷基和C_5-14烯基组成的组。

在一些实施方案中，本公开的可电离阳离子脂质包含具有以下结构的化合物：

在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二-十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18∶0二醚PC)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂和其混合物。

在一些实施方案中，本公开的PEG修饰的脂质包含PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DMG-PEG、PEG-c-DOMG(也称为PEG-DOMG)、PEG-DSG和/或PEG-DPG。

在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含化合物1的可电离阳离子脂质，其中非阳离子脂质是DSPC，结构脂质是胆固醇，并且PEG脂质是DMG-PEG。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含45-55摩尔百分比的可电离阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55摩尔百分比的可电离阳离子脂质。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-15摩尔百分比的DSPC。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15摩尔百分比的DSPC。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含35-40摩尔百分比的胆固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含35、36、37、38、39或40摩尔百分比的胆固醇。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含1-2摩尔百分比的DMG-PEG。例如，所述脂质纳米颗粒可包含1、1.5或2摩尔百分比的DMG-PEG。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含50摩尔百分比的可电离阳离子脂质、10摩尔百分比的DSPC、38.5摩尔百分比的胆固醇和1.5摩尔百分比的DMG-PEG。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约2∶1至约30∶1的N∶P比。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约6∶1的N∶P比。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约3∶1的N∶P比。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10∶1至约100∶1的可电离阳离子脂质组分对RNA的重量/重量比。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约20∶1的可电离阳离子脂质组分对RNA的重量/重量比。

在一些实施方案中，本公开的LNP包含约10∶1的可电离阳离子脂质组分对RNA的重量/重量比。

在一些实施方案中，本公开的LNP具有约50nm至约150nm的平均直径。

在一些实施方案中，本公开的LNP具有约70nm至约120nm的平均直径。

多价疫苗

如本文提供的组合物可包括编码相同或不同种类的两种或更多种抗原的RNA或多种RNA。在一些实施方案中，组合物包括编码两种或更多种呼吸道病毒抗原的RNA或多种RNA。在一些实施方案中，所述RNA可编码1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或更多种呼吸道病毒抗原。

在一些实施方案中，组合物包含编码hRSV F糖蛋白的RNA、编码hMPV F糖蛋白的RNA和hPIV3 F糖蛋白抗原。

在一些实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的RNA(例如，mRNA)配制在相同脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，可将两种或更多种不同的编码抗原的RNA配制在单独脂质纳米颗粒中(每个RNA配制在单一脂质纳米颗粒中)。然后，可将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA)施用，或者可单独施用。

组合疫苗

如本文提供的组合物可包括编码相同或不同病毒株的两种或更多种抗原的RNA或多种RNA。本文还提供了包含编码一种或多种hRSV抗原和不同生物体的一种或多种抗原(例如hMPV和/或hPIV3)的RNA的组合疫苗。因此，本公开的疫苗可为靶向相同株/物种的一种或多种抗原或不同株/物种的一种或多种抗原的组合疫苗，例如诱导对在呼吸道病毒感染风险高的相同地理区域发现的生物体或个体在暴露于呼吸道病毒时有可能暴露于其的生物体的免疫性的抗原。

药物制剂

本文提供了用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物的呼吸道病毒的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。本文提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。它们可用于药物中以预防和/或治疗呼吸道病毒感染。

在一些实施方案中，可将含有如本文所述的RNA的呼吸道病毒疫苗施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，并且RNA多核苷酸在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。

组合物(例如，包含RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或修饰的核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的抗原产生而变化。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。抗原产生增加可通过细胞转染(用RNA疫苗转染的细胞的百分数)增加、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(例如，如通过从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间增加)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应的改变来证明。

术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体诊断或治疗用途。“药学上可接受的载体”在施用给受试者后或在施用给受试者时不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载体在其与活性成分相容并且能够稳定活性成分的意义上必须也是“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶态氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。额外适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于Remington′sPharmaceutical Sciences中。

在一些实施方案中，根据本公开的组合物(包含多核苷酸和其编码的多肽)可用于治疗或预防呼吸道病毒感染。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用给健康个体或在潜伏期(incubation phase)期间或在症状发作后的活动性感染期间的感染早期施用。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的RNA的量可为有效用于免疫预防的量。

组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为一个非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(例如疫苗)时，术语“加强剂”是指额外施用预防性(疫苗)组合物。加强剂(或加强疫苗)可在较早施用预防性组合物之后给予。初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在示例性实施方案中，初始施用预防性组合物与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。

在一些实施方案中，组合物可经肌内、鼻内或真皮内施用，类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用。

根据感染的盛行率或未满足的医疗需要的程度或水平，组合物可用于各种环境。作为一个非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种传染病。RNA疫苗具有优越的性质，这是因为它们比市售疫苗产生大得多的抗体滴度、更好的中和免疫性、产生更耐久的免疫反应和/或更早产生反应。

本文提供了药物组合物，其包括RNA和/或复合体，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。

所述RNA可单独配制或施用，或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可包含其他组分，包括但不限于佐剂。

在一些实施方案中，免疫组合物不包含佐剂(其不含佐剂)。

RNA可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或两者的组合。疫苗组合物可为无菌的、无热原的，或无菌和无热原的。在医药剂(例如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins，2005(其通过引用整体并入本文)。

在一些实施方案中，将免疫组合物施用给人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指RNA疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原的RNA多核苷酸(例如，mRNA多核苷酸)。

本文所述的疫苗组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分(例如mRNA多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合并且然后在必要时和/或需要时将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元的步骤。

根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据组合物待施用的途径而变化。举例来说，所述组合物可包含介于0.1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％与30％之间、介于5％与80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。

在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制RNA以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如，来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如，靶向特定组织或细胞类型)；(5)增加编码的蛋白质在体内的翻译；和/或(6)改变编码的蛋白质(抗原)在体内的释放曲线。除了传统赋形剂(例如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂)之外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合体、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用RNA转染的细胞(例如，用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和其组合。

给药/施用

本文提供了用于预防和/或治疗人类和其他哺乳动物的呼吸道病毒感染的免疫组合物(例如RNA疫苗)、方法、试剂盒和试剂。免疫组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，免疫组合物用于提供对呼吸道病毒感染的预防性保护。在一些实施方案中，免疫组合物用于治疗呼吸道病毒感染。在一些实施方案中，免疫组合物用于引发免疫效应细胞，例如离体激活外周血单核细胞(PBMC)，然后将其输注(再输注)至受试者中。

受试者可为任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。通常，受试者是人类受试者。

在一些实施方案中，将免疫组合物(例如RNA疫苗)以有效量施用给受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人类受试者)以诱导抗原特异性免疫反应。编码呼吸道病毒抗原的RNA在体内表达和翻译以产生抗原，其然后刺激受试者的免疫反应。

在施用本公开的免疫组合物(例如RNA疫苗)之后，可实现对呼吸道病毒的预防性保护。免疫组合物可施用一次、两次、三次、四次或更多次，但有可能施用一次疫苗即为足够的(任选地接着进行单次加强)。尽管不太期望，但可将免疫组合物施用给受感染个体以实现治疗反应。可能需要相应地调整给药。

在本公开的方面中，提供了在受试者中引发针对呼吸道病毒抗原(或多种抗原)的免疫反应的方法。在一些实施方案中，方法包括向受试者施用包含具有编码呼吸道病毒抗原(例如，hRSV F糖蛋白、hMPV F糖蛋白和/或hPIV3 F糖蛋白)的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)的免疫组合物，从而在受试者中诱导对呼吸道病毒抗原特异的免疫反应，其中相对于用预防有效剂量的针对所述抗原的传统疫苗接种的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后受试者中的抗抗原抗体滴度增加。“抗抗原抗体”是特异性结合至抗原的血清抗体。

预防有效剂量是在临床上可接受的水平上预防病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是疫苗的包装插页中列出的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本公开的mRNA疫苗之外的疫苗。例如，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、杀灭的微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、DNA疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已经获得监管部门批准和/或在国家药物监管机构(例如美国食品药品管理局(FDA)或欧洲药物管理局(EMA))注册的疫苗。

在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，相对于用预防有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗接种的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度，疫苗接种后的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。

在本公开的其他方面，提供了在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫反应的方法。所述方法包括向受试者施用包含含有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA多核苷酸的免疫组合物(例如RNA疫苗)，从而在受试者中诱导对呼吸道病毒特异的免疫反应，其中受试者中的免疫反应等同于以相对于免疫组合物2倍至100倍剂量水平用针对呼吸道病毒的传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。

在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物两倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物三倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物10倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物100倍至1000倍的剂量水平用传统疫苗接种的受试者中的免疫反应。

在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白]抗体滴度来评估免疫反应。在其他实施方案中，测试来自经免疫受试者的血清或抗体中和病毒摄取或减少人类B淋巴细胞的呼吸道病毒转化的能力。在其他实施方案中，使用本领域中公认的技术来测量促进稳固T细胞反应的能力。

本公开的其他方面提供了通过向受试者施用包含具有编码呼吸道病毒抗原的开放阅读框的RNA的免疫组合物(例如RNA疫苗)，从而在受试者中诱导对呼吸道病毒抗原特异的免疫反应，而在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫反应的方法，其中相对于在用预防有效剂量的针对呼吸道病毒的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天至10周。在一些实施方案中，在以相对于本公开的免疫组合物2倍至100倍的剂量水平用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中，诱导所述受试者中的免疫反应。

在一些实施方案中，相对于在用预防有效剂量的传统疫苗接种的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中诱导的免疫反应早2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周。

本文还提供了通过向受试者施用具有编码第一抗原的开放阅读框的RNA而在受试者中引发针对呼吸道病毒的免疫反应的方法，其中RNA不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与疫苗共配制或共施用。

免疫组合物(例如RNA疫苗)可通过任何产生治疗有效结果的途径施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用RNA疫苗的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。RNA通常配制成剂量单位形式以便于施用和剂量的均匀性。然而，应理解，RNA的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所采用的具体化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。

如本文提供的RNA的有效量可低至20μg，例如以单一剂量或两个10μg剂量施用。在一些实施方案中，有效量为20μg-300μg或25μg-300μg的总剂量。例如，有效量可为20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μug、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为25μg-300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为25μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。

本文所述的RNA可配制成本文所述的剂型，例如鼻内、气管内或可注射(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。

疫苗功效

本公开的一些方面提供了免疫组合物(例如RNA疫苗)的制剂，其中以有效量配制RNA以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如，产生对呼吸道病毒抗原特异的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫反应的RNA的剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法。

如本文所用，对本公开的疫苗或LNP的免疫反应是在受试者中产生对疫苗中存在的(一种或多种)呼吸道病毒蛋白的体液和/或细胞免疫反应。出于本公开的目的，“体液”免疫反应是指由抗体分子(包括例如分泌性(IgA)或IgG分子)介导的免疫反应，而“细胞”免疫反应是由T淋巴细胞(例如，CD4+辅助细胞和/或CD8+T细胞(例如CTL))和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面包括由细胞溶解性T细胞(CTL)引起的抗原特异性反应。CTL对与主要组织相容性复合体(MHC)编码的蛋白质缔合呈递并在细胞表面上表达的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的破坏或感染此类微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一个方面包括由辅助T细胞引起的抗原特异性反应。辅助T细胞用于帮助刺激功能并且使非特异性效应细胞的活性集中于在表面上展示与MHC分子缔合的肽抗原的细胞。细胞免疫反应还导致产生细胞因子、趋化因子和由活化T细胞和/或其他白细胞产生的其他此类分子(包括源自CD4+和CD8+T细胞的那些)。

在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应通过测量在施用如本文提供的免疫组合物的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度来表征。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原(例如，抗hRSV F糖蛋白)或抗原的表位特异的抗体)的量的测量结果。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。

在一些实施方案中，抗体滴度用于评估受试者是否已经感染或确定是否需要免疫。在一些实施方案中，抗体滴度用于确定自身免疫反应的强度，确定是否需要加强免疫，确定先前的疫苗是否有效，以及鉴定任何最近或先前的感染。根据本公开，抗体滴度可用于确定由免疫组合物(例如RNA疫苗)在受试者中诱导的免疫反应的强度。

在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少1.5、至少2、至少2.5或至少3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1、1.5、2、2.5或3log。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1-3log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加1-1.5、1-2、1-2.5、1-3、1.5-2、1.5-2.5、1.5-3、2-2.5、2-3或2.5-3log。

在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度可相对于对照增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10倍。

在一些实施方案中，抗原特异性免疫反应测量为hRSV、hMPV和/或hPIV3血清中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)的比率，称为几何平均比率(GMR)。几何平均滴度(GMT)是通过将所有值相乘并且取所述数的n次方根来计算的一组受试者的平均抗体滴度，其中n是具有可用数据的受试者的数目。

在一些实施方案中，对照是在未施用免疫组合物(例如RNA疫苗)的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是在施用重组或纯化的蛋白疫苗的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如细菌或酵母)中产生或从大量病原生物体中纯化的蛋白抗原。

在一些实施方案中，在鼠类模型中测量免疫组合物(例如RNA疫苗)有效的能力。例如，可将免疫组合物施用给鼠类模型，并且测定所述鼠类模型的中和抗体滴度的诱导。病毒攻击研究还可用于评估本公开的疫苗的功效。例如，可将免疫组合物施用给鼠类模型，用病毒攻击鼠类模型，并测定鼠类模型的存活和/或免疫反应(例如中和抗体反应、T细胞反应(例如细胞因子反应))。

在一些实施方案中，免疫组合物(例如RNA疫苗)的有效量是与重组蛋白疫苗的标准护理剂量相比减少的剂量。如本文所提供的“照护标准”是指医学或心理学治疗指南，并且可为一般性的或特异性的。“照护标准”基于科学证据和参与给定疾患的治疗的医学专业人士之间的合作来指定适当治疗。其是医师/临床医师对于某种类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。如本文所提供的“照护标准剂量”是指医师/临床医师或其他医学专业人士在遵循用于治疗或预防呼吸道病毒感染或相关疾患的照护标准指南的同时，将施用给受试者以治疗或预防呼吸道病毒感染或相关疾患的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或VLP疫苗的剂量。

在一些实施方案中，在施用有效量的免疫组合物的受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度等同于在施用照护标准剂量的重组或纯化蛋白疫苗、或活的减毒或灭活疫苗、或VLP疫苗的对照受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度。

疫苗功效可使用标准分析来评估(例如，参见Weinberg等人，J Infect Dis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。例如，疫苗功效可通过双盲、随机化、临床对照试验来测量。疫苗功效可表示为未接种疫苗(ARU)和接种疫苗(ARV)的研究同类群组之间疾病罹患率(AR)的成比例降低，并且可使用下式从接种疫苗组中疾病的相对风险(RR)计算：

功效＝(ARU-ARV)/ARU×100；并且

功效＝(1-RR)×100。

同样，疫苗有效性可使用标准分析来评估(例如，参见Weinberg等人，J InfectDis.2010年6月1日；201(11)：1607-10)。疫苗有效性是评估疫苗(其可能已经证明具有高疫苗功效)如何减少群体中的疾病。此量度可评估在自然现场条件下而非在受控临床试验中，疫苗接种程序而不仅仅疫苗本身的益处和不利效应的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受群体中的目标组的免疫程度以及影响住院治疗、流动就诊或费用的“真实世界”结果的其他非疫苗相关因素影响。例如，可使用回溯性病例对照分析，其中比较一组感染病例和适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为比率差异，其中使用针对疫苗接种后仍发生感染的优势比(OR)：

有效性＝(1-OR)×100。

在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物(例如RNA疫苗)的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物的功效可为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。

消除性免疫性。消除性免疫性是指防止病原体有效感染至宿主中的独特免疫状态。在一些实施方案中，有效量的本公开的免疫组合物足以在受试者中提供消除性免疫性至少1年。例如，有效量的本公开的免疫组合物足以在受试者中提供消除性免疫性至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。在一些实施方案中，有效量的本公开的免疫组合物足以在受试者中以相对于对照至少5倍低的剂量提供消除性免疫性。例如，有效量可足以在受试者中以相对于对照至少10倍、15倍或20倍低的剂量提供消除性免疫性。

可检测抗原。在一些实施方案中，有效量的本公开的免疫组合物足以产生可检测水平的呼吸道病毒抗原，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。

滴度。抗体滴度是受试者内抗体(例如，对特定抗原(例如，抗呼吸道病毒抗原)特异的抗体)的量的量度。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)是用于测定抗体滴度的常见测定。

在一些实施方案中，有效量的本公开的免疫组合物足以产生由针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的1,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的1,000-5,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。在一些实施方案中，有效量足以产生由针对呼吸道病毒抗原的中和抗体产生的5,000-10,000中和抗体滴度，如在施用后1-72小时在受试者的血清中所测量。

在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100NT₅₀。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NT₅₀。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000NT₅₀。

在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少100个中和单位/毫升(NU/mL)。例如，所述中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000NU/mL。在一些实施方案中，所述中和抗体滴度是至少10,000NU/mL。

在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少2、3、4、5、6、7、8、9或10log。

在一些实施方案中，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中产生的抗呼吸道病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少3、4、5、6、7、8、9或10倍。

在一些实施方案中，几何平均值，即n个数的乘积的n次方根，通常用于阐述成比例生长。在一些实施方案中，几何平均值用于表征受试者中产生的抗体滴度。

对照可为例如未接种疫苗的受试者，或施用活的减毒病毒疫苗、灭活病毒疫苗或蛋白质亚单位疫苗的受试者。

实施例

研究了不同特征(例如，修饰)对野生型hRSV F糖蛋白的影响。图1是说明编码F蛋白的野生型mRNA与本文所述的RSV F变体之间的差异的示意图。所述RSV F变体是密码子优化的、膜锚定的单链mRNA，除了缺乏胞质尾区外，还包含原体间二硫键稳定化突变和空腔填充突变。

实施例1-mRNA筛选：独立特征

已发现随着细胞上融合前形式的RSV F糖蛋白的增加会增加动物的免疫原性。在该实施例中，设计了多种mRNA以测试不同的特征(例如，不同的密码子优化策略、突变、特定修饰、结构变化)及其对所得表达水平的影响。

用不同浓度的不同mRNA转染HEK293T细胞。24小时和48小时后，通过流式细胞术使用对融合前RSV F糖蛋白(AM14)特异的抗体检测细胞表面融合前RSV F糖蛋白。呈现在图2A中的结果表明，所测试的两种特征、密码子优化和胞质尾区截短(“dCT”)，产生了细胞表面融合前RSV F糖蛋白的最大增加。例如，在48小时组中，在20ng的浓度下，所述两种特征显示比对照(编码不包括所述两种特征的RSV F糖蛋白的mRNA)增加15-31倍。在低至5ng的浓度下也可以看到这种结果(图2B)。

然后在体内筛选密码子优化的mRNA和编码具有胞质尾区截短的RSV F糖蛋白的mRNA。向八周龄BALB/c小鼠(每组n＝8)肌肉内(IM)给予在脂质纳米颗粒(例如，0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质)中配制的候选mRNA。所述mRNA以3周的间隔施用，并且在每次给药后收集血清。用ELISA测定针对F糖蛋白的血清抗体滴度。在两次给药后(在第2次给药后，“PD2”)，测量了融合后F特异性IgG滴度。密码子优化的mRNA和编码具有截短胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA分别显示出为对照(编码不包括所述两种特征的RSV F糖蛋白的mRNA)2-3倍高和2-4倍高的滴度(图3A)。

在第二次给药后(PD2)，也使用微量中和测定法测量RSV中和滴度。使用以下程序评价单个小鼠血清对RSV-A(Long株)的中和作用：

1.将所有血清样品通过置于设定为56℃的干浴温育箱中加热灭活30分钟。然后将样品和对照血清在病毒稀释剂(EMEM中的2％FBS)中1∶3稀释，并将重复样品添加到测定板并连续稀释。

2.将RSV-Long储备病毒从冰箱中取出并在37℃水浴中快速解冻。在病毒稀释剂中将病毒稀释至2000pfu/mL

3.向96孔板的每个孔(一列细胞除外)加入稀释的病毒。

4.将HEp-2细胞胰蛋白酶化，洗涤，以1.5x 105个细胞/毫升重悬于病毒稀释液中，并将100mL悬浮细胞加入96孔板的每个孔中。然后将板在37℃、5％CO2下温育72小时。

5.温育72小时后，用PBS洗涤细胞，并在16-24℃下使用溶解在PBS中的80％丙酮固定10-20分钟。除去固定剂并使板风干。

6.然后用PBS+0.05％Tween充分洗涤板。将检测单克隆抗体143-F3-1B8和34C9稀释至2.5，然后用PBS+0.05％50充分洗涤板，然后用PBS+0.充分洗涤96孔板的孔。然后将板在16-24℃的潮湿室中在摇床上温育60-75分钟

7.温育后，将板充分洗涤。

8.将生物素化的马抗小鼠IgG在测定稀释剂中按1∶200稀释，并加入到96孔板的每个孔中。如上所述温育板并洗涤。

9.在测定稀释剂中制备IRDye 800CW链霉亲和素(1∶1000最终稀释度)、Sapphire700(1∶1000稀释度)和5mM DRAQ5溶液(1∶10,000稀释度)的混合液，并将50mL混合液加入到96孔板的每个孔中。将板如上在黑暗中温育、洗涤并使其风干。

10.然后使用Aerius Imager读取板。然后使用Graphpad Prism中的4参数曲线拟合计算血清中和滴度。

用于小鼠免疫原性研究的在第2次给药后(PD2)测量的血清中和抗体滴度显示在图3B中。密码子优化的mRNA和编码具有胞质尾区截短的RSV F糖蛋白的mRNA具有对照的1-3倍和2-40倍的滴度水平，表明中和抗体滴度是稳健的。因此，在体外和体内均发现这两种mRNA能够增加RSV F糖蛋白的表达和RSV-A中和滴度。

实施例2-mRNA筛选：两种特征

由于密码子优化和胞质尾区截短均显示可改善RSV F蛋白的表达和产生的免疫原性，因此测试了同一mRNA中两种特征的组合(“RSV F变体”)。在体外实验中，HEK293T细胞被20ng或200ng具有不同测试特征组合的mRNA转染。还筛选了单独包含每个特征的MRNA。24小时和48小时后，通过流式细胞术使用对融合前RSV F糖蛋白(AM14)特异的抗体检测细胞表面融合前RSV F糖蛋白。发现密码子优化和胞质尾区截短的组合导致RSV F糖蛋白表达水平相对于对照(编码不包括所述两种特征的RSV F糖蛋白的mRNA)为5-50倍高。单独或彼此组合配对的其他特征均未产生达到所选组合所产生水平的RSV F糖蛋白(数据未示出)。

使用的对照RSV F编码蛋白质如下：相对于野生型RSV F糖蛋白，Ctrl1在F1区含有4个氨基酸突变(图1)，并且不含氨基酸103和145之间的缺失。结果，Ctrl1包括野生型弗林蛋白酶切割位点并保留了细胞质结构域。另一种对照变体Ctrl2源自图1所示的RSV F变体，但不包括C末端缺失或其他RNA优化和增强。

然后进一步筛选RSV F变体。在用500ng mRNA RSV F变体、对照mRNA或无mRNA(阴性对照)转染的HEK293T细胞中测量RSV F糖蛋白的体外表达。然后，24小时、48小时和72小时后，用流式细胞术测量RSV F糖蛋白的水平。三种不同抗体用于测量RSV F糖蛋白：AM14和D25(对融合前形式的RSV F糖蛋白特异的抗体)和

/莫维珠单抗(针对融合前和融合后形式的RSV F糖蛋白共有的表位)。图4A表明RSV F变体导致RSV F糖蛋白在融合前构象中正确折叠，并且与对照相比还具有更高和更长的表达水平。此外，图5A和图5B表明表达趋势不限于HEK293T细胞，并且当在THP-1细胞(人单核细胞系)中进行时得以维持。

在另一项实验中，比较了如通过流式细胞术测定的200ng mRNA(RSV F变体，编码具有截短胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA，编码RSV F糖蛋白的密码子优化的mRNA，Ctrl1和Ctrl2mRNA，或无mRNA)转染后48小时，RSV F糖蛋白在HEK293T细胞中的体外表达。相对于密码子优化的mRNA和编码具有胞质尾区截短的RSV F蛋白的mRNA，RSV F变体显示出至少相加的表达水平(图4B)。

研究了人外周血单核细胞(huPBMC)中RSV F糖蛋白的体外表达。HuPBMC以1x 10⁶个细胞/孔的浓度接种在12孔板中。然后将1000ng mRNA(RSV F变体或编码不包括所述两种特征的RSV F糖蛋白的mRNA)加入到孔中，并将板温育24小时或48小时。温育后，用AM14-FITC(靶向融合前形式的RSV F蛋白)、D25-PE(靶向融合前形式的RSV F蛋白)或莫维珠单抗-APC(靶向融合前和融合后形式的RSV F蛋白共有的表位)将细胞染色。无论使用何种抗体，在24小时时间点和48小时时间点均观察到对照mRNA和未转染细胞的较高水平的RSV F蛋白(图7)。

研究了人肝癌HeP3B(HeP3B)细胞中变体RSV F mRNA的体外表达。将HeP3B细胞接种在24孔板中并用500ng、100ng或20ng的mRNA转染。将板温育24小时或48小时。温育后，细胞用靶向融合前形式的RSV F蛋白的AM14-FITC染色。相对于具有每个单独特征的mRNA(例如，密码子优化的mRNA和编码具有截短胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA)，在与RSV F变体(密码子优化和胞质尾区截短)温育后，观察到较高水平的RSV F蛋白。对照mRNA(编码不包括所述两种特征的RSV F糖蛋白的mRNA)和未转染的细胞(“无mRNA”)显示出比RSV F变体更低的表达水平，特别是在48小时和测试的最低剂量下(图8)。在显微镜实验中，发现HeLa细胞中的表达趋势是一致的。将HeLa细胞接种在96孔板中，然后用200ng的mRNA(RSV F变体、密码子优化的编码RSV F糖蛋白的mRNA、编码具有截短胞质尾区的RSV F糖蛋白的mRNA、不包括所述两种特征的对照mRNA)或无mRNA(作为阴性对照))转染。将板温育24小时或48小时，然后在4％PFA/PBS中固定15分钟并在PBS中洗涤两次。然后将一半的板在0.5％Triton-X中渗透5分钟，然后在PBS中洗涤两次。然后在室温下将细胞在1％BSA/PBS中封闭30分钟。然后，将初级抗体抗RSV抗体(D25，Cambridge Bio)(在1％BSA/PBS中以1∶100稀释)应用一小时，接着在PBS中洗涤两次。然后，将板用1％BSA封闭10分钟。应用二级抗体30分钟(在BSA/PBS中以1∶2000稀释)，然后将板用PBS洗涤两次。然后，应用NucBlue Fixed和CellMaskRed 30分钟，接着用PBS洗涤两次。然后使用ALEXA488^TM测量所得板的蛋白质表达。基于细胞质分割测量每个细胞的平均荧光强度。如图9所示，RSV F变体(密码子优化的编码具有胞质尾区截短的RSV F糖蛋白的mRNA)产生最高水平的RSV F蛋白。发现对照和RSV F变体之间的差异为约两倍。

实施例3-体内免疫原性研究(小鼠)

然后在体内评价RSV F变体(密码子优化的编码具有胞质尾区截短的RSV F糖蛋白的mRNA)。八周龄BALB/c小鼠(每组n＝8)用脂质纳米颗粒(例如，0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质)中配制的RSV F变体或对照mRNA进行肌肉内(IM)免疫。以3周的间隔施用mRNA，并且在每次免疫后收集血清。用ELISA测定针对F糖蛋白的血清抗体滴度。在第一次和第二次给药后，测量了融合后F特异性IgG滴度。RSV F变体在低剂量(200ng)下具有为对照(编码RSV F糖蛋白的替代mRNA)至少3-5倍的滴度(图6A和图6B)。

进行HRSV-A Virospot测定以检测血清样品中的HRSV特异性中和抗体。简言之，通过在56℃下温育30分钟使样品失活。随后，从1∶8的稀释度开始(在1∶16的测试中第一次血清稀释)，在96孔板中在感染培养基中一式三份地制备样品的连续两倍稀释液。然后将样品稀释液与固定量的HRSV-A在37℃下温育1小时。然后，将病毒-抗体混合物转移到具有HEp-2细胞培养单层的板中。在37℃下经过1天的温育期后，将单层固定并染色。去除培养上清液，单层用PBS洗涤一次，然后用50％/50％甲醇/乙醇固定。固定后，使用针对HRSV-A的小鼠单克隆抗体、HRP标记的二级抗小鼠抗体和TrueBlue对板进行染色。使用

分析仪扫描染色板，并使用Zielinska等人(Zielinska，Virology Journal 2005；2(84)：1-5)描述的公式计算50％空斑减少滴度：

X＝(a-b)(e-c)/(c-d)+a

其中：X＝中和结果

a＝50％减少点以上稀释度的log10

b＝50％减少点以下稀释度的log10

c＝50％减少点以上的平均SC(对应于a)

d＝50％减少点以下的平均SC(对应于b)

e＝平均病毒对照计数减少50％的值。

实施例4-体内免疫原性研究(大鼠)

然后在棉鼠体内评价RSV F变体(密码子优化的编码具有胞质尾区截短的RSV F糖蛋白的mRNA)。所述研究旨在评价mRNA疫苗在呼吸道合胞病毒(RSV)棉鼠模型中的免疫原性、功效和安全性，并包括在一系列剂量水平上评价疫苗增强型呼吸道疾病(ERD)的可能性，包括在攻击后诱导次优的中和抗体滴度从而允许可检测的病毒复制的那些。

RSV F变体或对照mRNA在脂质纳米颗粒(例如，0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质)中配制。所述脂质纳米颗粒的组分包含8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(化合物1)；1，2-二肉豆蔻酰基-racn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000-DMG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；和胆固醇。

将雌性棉鼠(6-8周龄)分成14个10只动物的组和四只动物的对照组。根据下表2中所示的时间表对大鼠进行免疫。第1-13组用每只动物100μL剂量的mRNA-LNP组合物进行肌肉内免疫；第14组用每只动物10⁵个空斑形成单位(PFU)的100μL剂量RSV/A2鼻内感染。一些组免疫两次(第0天和第28天)，而其他组仅在第0天免疫，如表2所示。在第56天，用0.1mL的5.0log₁₀RSV/A2鼻内施用对小鼠进行攻击。第61天，将动物处死，采集鼻组织进行病毒滴定测量，并且整体采集肺并三等分；左侧部分用于病毒滴定，舌叶用于定量聚合酶链反应(qPCR)分析，并且右侧部分膨胀并用于增强型RSV病(ERD)和嗜酸性粒细胞增多的组织病理学。

表2.棉鼠研究概要

为了分析，进行了RSV/A2肺和鼻病毒滴定。通过离心澄清肺和鼻匀浆并在伊格尔最低必需培养基(Eagle′s Minimum Essential Medium，EMEM)中稀释。在24孔板中用稀释的匀浆一式两份感染汇合的Hep-2细胞单层。在37℃下在5％CO₂温育箱中温育一小时后，用0.75％甲基纤维素培养基覆盖孔。温育4天后，去除覆盖层，并且将细胞用0.1％结晶紫固定一小时，然后冲洗并风干。对空斑进行计数，并且病毒滴度以每克组织的空斑形成单位表示。病毒滴度计算为一组中所有动物的几何平均值+标准误差。

如实施例3中所述，进行HRSV-A Virospot测定以检测血清样品中的HRSV特异性中和抗体。

进行RSV-F酶联免疫吸附测定(ELISA)以确定动物血清中存在的抗体滴度。简言之，96孔微量滴定板涂有1ug/mL融合前RSV-F蛋白。在4℃温育过夜后，用PBS/0.05％Tween-20将板洗涤4次并在37℃(SuperBlock-Pierce#37515)封闭2小时。洗涤后，加入棉鼠血清的连续稀释液(测定稀释剂为PBS+5％山羊血清)。将板在37℃下温育2小时，洗涤并在测定稀释剂中以1∶10,000的稀释度添加HRP缀合的鸡抗棉鼠IgG(ICL#CCOT-25P)。将板在37℃下温育一小时，然后洗涤。用TMB底物(SeraCare#5120-0077)检测结合的抗体。通过添加TMB终止溶液(SeraCare#5150-0021)终止反应，并在OD_450nm下测量吸光度。使用GraphPad Prism中的四参数逻辑曲线拟合确定滴度，并定义为大约OD_450nm＝1.0的倒数稀释度。

RSV抗体滴度显示在图11A-11B中。发现RSV F变体(密码子优化和截短的胞质尾区)诱导剂量依赖性RSV中和抗体(图10A)和RSV融合前F蛋白特异性IgG结合抗体(图10B)。此外，攻击后的肺(图11A)和鼻(图11B)病毒载量表明RSV F变体保护棉鼠免受攻击(特别是在较高剂量的初始和加强剂量下)。

序列表

野生型RSV F糖蛋白

应理解，本文所述的任何mRNA序列可包括5′UTR和/或3′UTR。所述UTR序列可选自以下序列，或者可使用其他已知UTR序列。还应理解，本文所述的任何mRNA还可包含多聚(A)尾和/或帽(例如，7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp)。此外，尽管本文所述的许多mRNA和编码的抗原序列包括信号肽和/或肽标签(例如，C末端His标签)，但应理解，所指示的信号肽和/或肽标签可替代不同的信号肽和/或肽标签，或者可省略信号肽和/或肽标签。

应进一步理解，本文所述的任何mRNA序列可被完全或部分化学修饰(例如，通过N1-甲基假尿苷)。在下表1中，序列号以未修饰/被N1-甲基假尿苷完全修饰的形式给出)。

5′UTR：GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(SEQ ID NO：2；被N1-甲基假尿苷完全修饰，SEQ ID NO：33)

5′UTR：GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACC(SEQID NO：3；被N1-甲基假尿苷完全修饰，SEQ ID NO：40)

3′UTR：UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCC CCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO：4；被N1-甲基假尿苷完全修饰，SEQ ID NO：35)

3′UTR：UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCC CCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(SEQ ID NO：5；被N1-甲基假尿苷完全修饰，SEQ ID NO：41)

表1.

*应理解，表1中所述的开放阅读框和/或相应氨基酸序列中的任一者可包括或不包括信号序列。还应理解，信号序列可由另一种信号序列代替，例如，SEQ ID NO：18-34中的任一者。

等同形式

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都关于其各自所列举的主题通过引用并入，其在一些情形下可涵盖整个文件。

除非明确指示相反情形，否则如本文在说明书和在权利要求书中所用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为意指“至少一个/种”。还应理解，除非明确指示相反情形，否则在本文所要求的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定受限于列举所述方法的步骤或动作的顺序。

在权利要求书中以及在上文说明书中，所有过渡性短语(例如“包含”、“包括”、“携载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等)应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures)第2111.03节所述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡性短语。

数值前的术语“约”和“基本上”意指所列举的数值的±10％。

在提供值的范围的情况下，本文具体考虑并阐述所述范围的上端和下端之间并包括所述上端和下端的每个值。

国际申请号PCT/US2015/02740、PCT/US2016/043348、PCT/US2016/043332、PCT/US2016/058327、PCT/US2016/058324、PCT/US2016/058314、PCT/US2016/058310、PCT/US2016/058321、PCT/US2016/058297、PCT/US2016/058319和PCT/US2016/058314的整个内容通过引用并入本文。

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核酸(RNA)，所述核糖核酸(RNA)编码稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白变体，所述hRSV F糖蛋白变体缺乏胞质尾区并且与野生型hRSV F糖蛋白具有至少90％的同一性。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端20-30、20-25、15-30、15-25、15-20、10-30、10-25、10-20、10-15、5-30、5-25、5-20或5-15个氨基酸。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸或10个氨基酸。

4.如权利要求3所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的以下C末端氨基酸：CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：25)；TPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQID NO：26)；SKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：27)；或SGINNIAFSN(SEQ ID NO：28)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于野生型hRSV F糖蛋白包含选自由以下组成的组的修饰：P102X取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149X取代、S155X取代、S190X取代、V207X取代、S290X取代、L373X取代、I379X取代、M447X取代和Y458X取代，其中X是任何氨基酸。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于野生型hRSV F糖蛋白包含选自由以下组成的组的修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于野生型hRSV F糖蛋白包含以下修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述野生型hRSV F糖蛋白包含SEQ IDNO：1的序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体包含与SEQ IDNO：8的序列具有至少95％或至少98％同一性的序列。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体包含SEQ ID NO：8的序列。

11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含与SEQ IDNO：7的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列的开放阅读框(ORF)。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：7的序列的ORF。

13.如权利要求11或12所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′非翻译区(UTR)。

14.如权利要求11-13中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

15.如权利要求11-14中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述hRSV RNA包含SEQ ID NO：15的序列。

17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA还包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp帽。

18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA还包含多聚(A)尾，任选地具有50至150个核苷酸的长度。

19.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包含化学修饰。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述hRSV RNA是完全修饰的。

21.如权利要求19或权利要求20所述的组合物，其中所述化学修饰是1-甲基假尿苷。

22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物包含25μg-200μg的所述hRSVRNA。

23.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含脂质混合物，所述脂质混合物包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离阳离子脂质或其任何组合。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述脂质混合物包含0.5-15mol％PEG修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离阳离子脂质。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述脂质混合物包含1-5mol％PEG修饰的脂质；10-20mol％非阳离子脂质；35-45mol％固醇；和40-50mol％可电离阳离子脂质。

26.如权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离阳离子脂质具有化合物1的结构：

27.如权利要求23-26中任一项所述的组合物，其中所述脂质混合物形成脂质纳米颗粒。

28.如权利要求27所述的组合物，其中将所述hRSV RNA配制在所述脂质纳米颗粒中。

29.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在体外将所述组合物递送至哺乳动物细胞后至少24小时导致所述融合前形式的hRSV F糖蛋白的细胞表面表达水平为对照水平的至少5倍。

30.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中在体外将所述组合物递送至哺乳动物细胞后至少48小时导致所述稳定化融合前形式的hRSV F糖蛋白的细胞表面表达水平为对照水平的至少50倍。

31.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1-30中任一项所述的组合物以在所述受试者中诱导针对hRSV的中和抗体反应。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述受试者是免疫功能低下的。

33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述受试者患有肺病。

34.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述受试者为5岁或更年轻。

35.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述受试者为65岁或更老。

36.如权利要求31-35中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两个剂量的所述组合物。

37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述hRSV F糖蛋白变体折叠成稳定化融合前构象。

38.如权利要求31-37中任一项所述的方法，其中在施用后至少24小时，所述hRSV F糖蛋白变体在所述受试者中以相对于对照至少5倍高的水平表达。

39.如权利要求31-38中任一项所述的方法，其中在施用后至少48小时，所述RSV F糖蛋白变体在所述受试者中以相对于对照至少50倍高的水平表达。

40.如权利要求31-39中任一项所述的方法，其中所述RSV F糖蛋白变体在所述受试者中表达相对于对照长至少24小时。

41.如权利要求31-40中任一项所述的方法，其中使用相对于对照至少5倍低的所述组合物的剂量在所述受试者中诱导中和抗体反应。

42.如权利要求31-42中任一项所述的方法，其中所述对照是基线、施用编码野生型RSVF糖蛋白的RSV RNA、或施用编码具有胞质尾区的稳定化融合前形式的RSV F糖蛋白的RSVRNA。

43.一种信使核糖核酸(mRNA)，所述信使核糖核酸(mRNA)包含开放阅读框，所述开放阅读框包含与SEQ ID NO：7的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

44.一种信使核糖核酸(mRNA)，所述信使核糖核酸(mRNA)包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

45.如权利要求43或44所述的mRNA，其中所述mRNA编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核酸F糖蛋白变体，其中所述RSV F糖蛋白变体与全长野生型RSV F糖蛋白具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。

46.如权利要求43-45中任一项所述的mRNA，其中所述开放阅读框包含SEQ ID NO：7的序列。

47.如权利要求43-46中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA包含SEQ ID NO：15的序列。

48.如权利要求43-47中任一项所述的mRNA，所述mRNA配制在脂质纳米颗粒中。

49.如权利要求43-48中任一项所述的mRNA，其中所述脂质纳米颗粒包含0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质。

50.如权利要求49所述的mRNA，其中所述脂质纳米颗粒包含1-5mol％PEG修饰的脂质；10-20mol％非阳离子脂质；35-45mol％固醇；和40-50mol％可电离阳离子脂质。

51.如权利要求43-50中任一项所述的mRNA，其中所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离阳离子脂质具有化合物1的结构：

52.一种组合物，所述组合物包含：

人呼吸道合胞病毒(hRSV)核糖核酸(RNA)，其编码缺乏胞质尾区的稳定化融合前形式的RSV F糖蛋白变体，其中所述RSV F糖蛋白变体与全长野生型RSV F糖蛋白具有至少85％的同一性；

编码hMPV F糖蛋白的人偏肺病毒(hMPV)RNA；和

编码hPIV3F糖蛋白的人副流感病毒3(hPIV3)RNA。

53.如权利要求52所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端20-30、20-25、15-30、15-25、15-20、10-30、10-25、10-20、10-15、5-30、5-25、5-20或5-15个氨基酸。

54.如权利要求53所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的C末端25个氨基酸、20个氨基酸、15个氨基酸或10个氨基酸。

55.如权利要求54所述的组合物，其中所述胞质尾区包含所述hRSV F糖蛋白变体的以下C末端氨基酸：CKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：25)；TPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：26)；SKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO：27)；或SGINNIAFSN(SEQ ID NO：28)。

56.如权利要求52-55中任一项所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSV F糖蛋白还包含选自由以下组成的组的修饰：P102X取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149X取代、S155X取代、S190X取代、V207X取代、S290X取代、L373X取代、I379X取代、M447X取代和Y458X取代，其中X是任何氨基酸。

57.如权利要求56所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSVF糖蛋白还包含选自由以下组成的组的修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

58.如权利要求57所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体相对于所述野生型hRSVF糖蛋白还包含以下修饰：P102A取代、用接头分子取代氨基酸104-144、A149C取代、S155C取代、S190F取代、V207L取代、S290C取代、L373R取代、I379V取代、M447V取代和Y458C取代。

59.如权利要求52-58中任一项所述的组合物，其中所述野生型hRSV F糖蛋白包含SEQID NO：1的序列。

60.如权利要求52-59中任一项所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体包含与SEQID NO：8的序列具有至少95％或至少98％同一性的序列。

61.如权利要求60所述的组合物，其中所述hRSV F糖蛋白变体包含SEQ ID NO：8的序列。

62.如权利要求52-61中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含与SEQ IDNO：7的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列的开放阅读框(ORF)。

63.如权利要求62所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：7的序列的ORF。

64.如权利要求62或63所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′非翻译区(UTR)。

65.如权利要求62-64中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

66.如权利要求62-65中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA包含与SEQ ID NO：15的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

67.如权利要求66所述的组合物，其中所述hRSV RNA包含SEQ ID NO：15的序列。

68.如权利要求52-67中任一项所述的组合物，其中所述hMPV F糖蛋白包含与SEQ IDNO：11的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

69.如权利要求68所述的组合物，其中所述hMPV F糖蛋白包含SEQ ID NO：11的序列。

70.如权利要求52-69中任一项所述的组合物，其中所述hMPV RNA包括包含与SEQ IDNO：10的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列的ORF。

71.如权利要求70所述的组合物，其中所述hMPV RNA包括包含SEQ ID NO：10的序列的ORF。

72.如权利要求70或71所述的组合物，其中所述hMPV RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′UTR。

73.如权利要求70-72中任一项所述的组合物，其中所述hMPV RNA包括包含SEQ ID NO：4的序列的3′UTR。

74.如权利要求70-73中任一项所述的组合物，其中所述hMPV RNA包含与SEQ ID NO：16的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

75.如权利要求74所述的组合物，其中所述hMPV RNA包含SEQ ID NO：16的序列。

76.如权利要求52-75中任一项所述的组合物，其中所述hPIV3 F糖蛋白包含与SEQ IDNO：14的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

77.如权利要求76所述的组合物，其中所述hPIV3 F糖蛋白包含SEQ ID NO：14的序列。

78.如权利要求52-77中任一项所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包括包含与SEQ IDNO：13的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列的ORF。

79.如权利要求78所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包括包含SEQ ID NO：13的序列的ORF。

80.如权利要求78或79所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包括包含SEQ ID NO：2的序列的5′UTR。

81.如权利要求78-80中任一项所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包括包含SEQ IDNO：4的序列的3′UTR。

82.如权利要求78-81中任一项所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包含与SEQ ID NO：17的序列具有至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。

83.如权利要求82所述的组合物，其中所述hPIV3 RNA包含SEQ ID NO：17的序列。

84.如权利要求52-83中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA还包含7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp帽。

85.如权利要求52-84中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA还包含多聚(A)尾，任选地具有50至150个核苷酸的长度。

86.如权利要求52-83中任一项所述的组合物，其中所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA包含化学修饰。

87.如权利要求86所述的组合物，其中所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3RNA是完全修饰的。

88.如权利要求86或权利要求87所述的组合物，其中所述化学修饰是1-甲基假尿苷。

89.如权利要求52-88中任一项所述的组合物，所述组合物包含25μg-200μg的所述hRSVRNA、所述hMPV RNA和/或所述hPIV3 RNA。

90.如权利要求52-89中任一项所述的组合物，所述组合物还包含脂质混合物，所述脂质混合物包含PEG修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离阳离子脂质或其任何组合。

91.如权利要求90所述的组合物，其中所述脂质混合物包含0.5-15％PEG修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离阳离子脂质。

92.如权利要求91所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含1-5mol％PEG修饰的脂质；10-20mol％非阳离子脂质；35-45mol％固醇；和40-50mol％可电离阳离子脂质。

93.如权利要求91或权利要求92所述的组合物，其中所述PEG修饰的脂质是1，2二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2000 DMG)，所述非阳离子脂质是1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离阳离子脂质具有化合物1的结构：

94.如权利要求90-93中任一项所述的组合物，其中所述脂质混合物形成脂质纳米颗粒。

95.如权利要求94所述的组合物，其中将所述hRSV RNA、所述hMPV RNA和所述hPIV3RNA配制在所述脂质纳米颗粒中。

96.一种方法，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求52-95中任一项所述的组合物以在所述受试者中诱导针对hRSV、hMPV和/或hPIV3的中和抗体反应。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述受试者是免疫功能低下的。

98.如权利要求96或97所述的方法，其中所述受试者患有肺病。

99.如权利要求96-98中任一项所述的方法，其中所述受试者为5岁或更年轻。

100.如权利要求96-98中任一项所述的方法，其中所述受试者为65岁或更老。

101.如权利要求96-100中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两个剂量的所述组合物。