CN118108812A - Rsv f蛋白的突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了野生型RSV F蛋白的突变体。通过融合前构象三聚体特异性单抗AM14的结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体能够与AM14单抗具有强结合活性，而人工突变前的野生型RSV F蛋白与AM14单抗无结合活性。加速稳定性试验结果显示，本公开实施方式中所提供的突变体在37℃环境下放置4周，AM14单抗结合活性无明显变化。动物免疫实验结果显示，相对于人工突变前的野生型RSV F蛋白，本公开实施方式中所提供的突变体能够诱导产生更高滴度的中和抗体。
Description
技术领域
本公开涉及生物制药领域，具体地，涉及RSV F蛋白的突变体、RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定方法以及疫苗等产品。
背景技术
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起肺部和呼吸道感染的一种常见病毒，每年在全球导致超过3000多万例的下呼吸道感染，其中约300万人需住院治疗。RSV对于婴幼儿和老年人危害巨大，可引起严重感染，是导致婴幼儿死亡的第二大原因，也是老年人呼吸道疾病发病和死亡的主要原因。目前，尚没有疫苗上市用于RSV感染的预防。
RSV是一种包膜负义单链RNA病毒，属于肺炎病毒科正肺病毒属，其基因组编码11种蛋白，包括9种结构蛋白和2种非结构蛋白。病毒颗粒表面的两种跨膜糖蛋白，即附着蛋白G和融合蛋白F，在病毒感染起始阶段发挥着重要作用，是中和抗体的主要作用靶点。RSV具有两种亚型，即A亚型和B亚型。两种亚型之间，G蛋白差异较大，而F蛋白较为保守，其序列同源性超过90％(Ref:Harshbarger W,et al.PLoS Pathog.,2020,16:e1008943.)。
RSV F蛋白是一种I类型的病毒融合蛋白，负责病毒与宿主细胞的膜融合过程。F蛋白在体内首先翻译为由574个氨基酸构成的单链非活性前体蛋白F0。F0蛋白N-端1～25位氨基酸构成的信号肽由信号肽酶切除。此外，F0的109/110及136/137位氨基酸处存在两个弗林蛋白酶切位点，通过蛋白酶的酶切，将110～136位氨基酸多肽(称为p27)去除，生成137～574位氨基酸构成的F1以及26～109位氨基酸构成的F2。F1和F2之间通过两个二硫键连接在一起，共同构成F蛋白单体。在天然状态下，三个F蛋白单体进一步组装形成同源三聚体，进而发挥其生物学活性。
RSV F蛋白存在两种构象状态，即融合前构象和融合后构象，这两种构象的空间结构已经解析获得(Ref:McLellan J.S.,et al.Science,2013,340:1113-1117.McLellanJ.S.,et al.J.Virol.,2011,85:7788-7796.)。融合前构象三聚体呈棒棒糖状，可以形象地分为远离病毒包膜端的头部结构域和近包膜端的尾部结构域。在病毒侵染宿主细胞过程中，F蛋白头部区域的重折叠区1(refolding region 1,RR1)以及近包膜端的重折叠区2(refolding region 2,RR2)发生大幅度的构象变化。RR1从螺旋、无规卷曲和β片层结构转变为长螺旋结构，并伸展到头部结构域上方，RR2从近包膜端翻转到远包膜端头部结构域上方，并与RR1结合形成六束螺旋结构，此时，F蛋白三聚体从棒棒糖状的融合前构象转变为锥子状的融合后构象，进而导致病毒与宿主细胞膜融合过程的发生(Ref:Krarup A.,etal.Nat.Commun.,2015,6:8143)。
由于F蛋白在RSV感染早期过程中发挥着重要的作用，并且是人体中中和抗体的主要作用靶点，因此，F蛋白是疫苗开发的主要靶抗原之一。然而，人体感染后产生的大部分高活性中和抗体均靶向融合前构象(Ref:Battles M.B.,McLellanJ.S.Nat.Rev.Microbiol.,2019,17:233-245),多项研究成功分离获得了特异性结合F蛋白融合前构象的高亲和力中和抗体，如靶向融合前构象三聚体的不同单体之间界面的AM14单抗(Ref:Gilman M.S.A.et al.PLoS Pathog.,2015,11:e1005035.)等。但是F蛋白融合前构象是一种非稳状态，其很容易自发转变为融合后构象，动物免疫实验表明处于融合前构象的F蛋白诱导产生的中和抗体滴度远高于融合后构象(Ref:Battles M.B.,McLellanJ.S.Nat.Rev.Microbiol.,2019,17:233-245；Krarup A.et al.Nat.Commun.,2015,6:8143)。因此，将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态，阻止其向融合后构象转变，可以作为疫苗开发的优选抗原，为RSV疫苗的研发提供了有效策略。
但是到目前为止，针对RSV F蛋白融合前构象三聚体的疫苗的开发仍无法满足广泛的临床需要。因此，寻找一种新的将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态并且能够诱导产生优秀的中和抗体滴度的RSV F蛋白突变体成为了急需解决的问题。
发明内容
解决的技术问题：
本发明公开的一个方面，是针对现有技术中缺少新的能够稳定维持融合前构象三聚体状态并且能够诱导产生优秀的中和抗体滴度的RSV F蛋白突变体，提供了一种新的RSVF蛋白的突变体以及稳定RSV F蛋白融合前构象三聚体的新的策略。
具体地，本公开实施方式中通过对RSV F蛋白融合前和融合后构象的结构比对，在RSV F蛋白的头部结构域识别出与RR1构象转变相耦合的其它构象变化区域，进而在这些区域引入突变稳定其构象，通过耦合调控作用来阻止RR1的构象转变，和/或直接在RR1涉及到的相互作用区域引入突变来阻止其构象转变。基于这一策略，本公开实施方式中提供了多种突变方案，将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态。同时，本公开实施方式中还通过在尾部结构域引入突变，进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性，从而解决了上述问题。
本公开提供的技术方案：
野生型RSV F蛋白的突变体，所述突变体与人工突变前的野生型RSV F蛋白相比，存在至少一个氨基酸突变位点，所述氨基酸突变位点包括：
(a)第73～96位氨基酸中的任意位点；或
(b)第216～240位氨基酸中的任意位点；或
(c)第141位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸、第195位氨基酸、第199位氨基酸或第373位氨基酸。
本公开实施方式中基于RSV F蛋白融合前和融合后构象的空间结构比对分析，在头部结构域引入突变，阻止RR1的构象转变，将F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态。通过融合前构象三聚体特异性单抗AM14结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体能够与AM14单抗具有一定的结合活性，而人工突变前的野生型RSV F蛋白与AM14单抗无结合活性。帕丽珠单抗结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白均与帕丽珠单抗有强结合活性。上述实验结果表明，所引入的突变成功将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态，且折叠良好。因此，上述本公开实施方式中所提供的技术方案中的任意组合能够解决现有技术中的问题，实现相同或相似的技术效果。
在本公开的实施方式中，上述第73～96位氨基酸和第216～240位氨基酸定位于野生型RSV F蛋白融合前构象三聚体的头部结构域(如图1A所示)的α1螺旋和α5螺旋(如图2所示)。头部结构域是本发明为了对RSV F蛋白的结构进行形象描述而定义的，我们将第1～485位氨基酸定义为头部结构域，第486位氨基酸到F蛋白的C末端定义为尾部结构域，头部结构域和尾部结构域所处的大致空间位置如图1A所示。在本公开的实施方式中，上述α1螺旋或α5螺旋指代头部结构域中N端起始的第一或第五个α螺旋，其在RSV F蛋白的一级结构中大致位于第73～96位氨基酸和第216～240位氨基酸。基于本公开的研究成果，可以认为，RSV F蛋白融合前构象三聚体的头部结构域的α1螺旋或α5螺旋中任意氨基酸的突变均会将RSV F蛋白稳定在融合前构象三聚体状态。因此，本公开中所述的第73～96位氨基酸和第216～240位氨基酸可以存在一个或多个，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸位数的偏移，其也视为包含在本公开的保护范围之内。
在本公开的实施方式中，上述氨基酸的位数编号均以野生型RSV F蛋白作为参照，以其氨基酸序列的第一位氨基酸开始计算。例如，第73位氨基酸，即从野生型RSV F蛋白序列MELPILKA的第一位氨基酸蛋氨酸开始计算。
在本公开的实施方式中，所述人工突变一般可以指对野生型RSV F蛋白中氨基酸残基的取代、缺失或插入。但在一些实施方式中，所述人工突变仅指对氨基酸残基的取代。本公开中所述突变体由上述人工突变获得。
在其他一些实施方式中，所述突变体与人工突变前的野生型RSV F蛋白相比，存在多个氨基酸突变位点，所述多个氨基酸突变位点可以包括：
(a)至少两个选自第73～96位氨基酸中的任意位点；或
(b)至少两个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；或
(c)至少一个选自第73～96位氨基酸中的任意位点，和至少一个选自第216～240位氨基酸中的任意位点。
进一步地，在其他一些实施方式中，所述突变体与人工突变前的野生型RSV F蛋白相比，存在多个氨基酸突变位点，所述多个氨基酸突变位点可以包括选自以下(a)、(b)或(c)中的任意一种情况与(d)的组合：
(a)至少两个选自第73～96位氨基酸中的任意位点；
(b)至少两个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；
(c)至少一个选自第73～96位氨基酸中的任意位点，和至少一个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；
(d)选自L141、S190、L193、L195、I199或L373中的至少一个位点。
在一些实施方式中，所述多个可以为，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。
在一些实施方式中，上述氨基酸突变位点可以为：选自第79位氨基酸、第82位氨基酸、第92位氨基酸、第93位氨基酸、第96位氨基酸、第141位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸、第195位氨基酸、第199位氨基酸、第220位氨基酸、第224位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸、第234位氨基酸、第238位氨基酸或第373位氨基酸中的至少一种。
进一步地，在其他一些实施方式中，所述氨基酸突变位点可以包括以下情况：
(1)第92位氨基酸；或
(2)第96位氨基酸；或
(3)第227位氨基酸；或
(4)第230位氨基酸；或
(5)第238位氨基酸；或
(6)第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(7)第82位氨基酸和第227位氨基酸；或
(8)第89位氨基酸和第227位氨基酸；或
(9)第92位氨基酸和第227位氨基酸；或
(10)第92位氨基酸和第230位氨基酸；或
(11)第96位氨基酸和第227位氨基酸；或
(12)第96位氨基酸和第230位氨基酸；或
(13)第96位氨基酸和第238位氨基酸；或
(14)第93位氨基酸和第227位氨基酸；或
(15)第89位氨基酸和第230位氨基酸；或
(16)第82位氨基酸和第230位氨基酸；或
(17)第93位氨基酸和第230位氨基酸；或
(18)第227位氨基酸和第238位氨基酸；或
(19)第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(20)第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(21)第82位氨基酸和第234位氨基酸；或
(22)第193位氨基酸和第195位氨基酸；或
(23)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第195位氨基酸；或
(24)第193位氨基酸和第199位氨基酸；或
(25)第141位氨基酸和第373位氨基酸；或
(26)第82位氨基酸和第224位氨基酸；或
(27)第92位氨基酸和第238位氨基酸；或
(28)第79位氨基酸和第220位氨基酸；或
(29)第97位氨基酸和第291位氨基酸；或
(30)第93位氨基酸和第234位氨基酸；或
(31)第92位氨基酸和第234位氨基酸；或
(32)第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(33)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(34)第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(35)第190位氨基酸、第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(36)第93位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(37)第93位氨基酸、第193位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(38)第93位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(39)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(40)第93位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(41)第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸；或
(42)第93位氨基酸、第141位氨基酸和第234位氨基酸；或
(43)第93位氨基酸、第141位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(44)第141位氨基酸、第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(45)第227位氨基酸、第230位氨基酸和第373位氨基酸；或
(46)第93位氨基酸、第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(47)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(48)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(49)第227位氨基酸、第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸。
更进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点可以包括以下情况：
(1)第92位氨基酸；或
(2)第96位氨基酸；或
(3)第227位氨基酸；或
(4)第230位氨基酸；或
(5)第238位氨基酸；或
(6)第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(7)第92位氨基酸和第227位氨基酸；或
(8)第92位氨基酸和第230位氨基酸；或
(9)第227位氨基酸和第238位氨基酸；或
(10)第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(11)第93位氨基酸和第234位氨基酸；或
(12)第92位氨基酸和第234位氨基酸；或
(13)第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(14)第190位氨基酸、第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(15)第93位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(16)第93位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(17)第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸；或
(18)第93位氨基酸、第141位氨基酸和第234位氨基酸；或
(19)第93位氨基酸、第141位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(20)第141位氨基酸、第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(21)第227位氨基酸、第230位氨基酸和第373位氨基酸；或
(22)第93位氨基酸、第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(23)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(24)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(25)第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(26)第93位氨基酸、第193位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(27)第93位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(28)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(29)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(30)第227位氨基酸、第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸。
为了进一步提高RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点还包括：至少一个选自第486～513位氨基酸中的任意位点。
通过融合前构象三聚体特异性单抗AM14的结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体能够与AM14单抗具有强结合活性，而人工突变前的野生型RSV F蛋白与AM14单抗无结合活性。帕丽珠单抗结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白均与帕丽珠单抗有强结合活性。上述实验结果表明，所引入的突变成功将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态，且折叠良好。本公开实施方式中还对上述所表达的F蛋白突变体开展了加速稳定性试验，结果显示，在37℃环境下放置4周，AM14单抗结合活性无明显变化，表明突变体蛋白融合前构象三聚体依然保持稳定。本公开实施方式中还开展了动物免疫实验，实验结果显示相对于人工突变前的野生型RSV F蛋白，本公开实施方式中所提供的突变体能够诱导产生更高滴度的中和抗体。因此，上述本公开实施方式中所提供的技术方案中的任意组合能够解决现有技术中的问题，实现相同或相似的技术效果。
在本公开的实施方式中，上述第486～513位氨基酸定位于野生型RSV F蛋白融合前构象三聚体的尾部结构域(如图1A所示)。尾部结构域是本发明为了对RSV F蛋白的结构进行形象描述而定义的，我们将第1～485位氨基酸定义为头部结构域，第486位氨基酸到F蛋白的C末端定义为尾部结构域，头部结构域和尾部结构域所处的大致空间位置如图1A所示。基于本公开的研究成果，可以认为，RSV F蛋白融合前构象三聚体的尾部结构域第486～513位氨基酸中任意氨基酸的突变均会进一步稳定RSV F蛋白融合前构象三聚体结构。因此，本公开中所述的第486～513位氨基酸可以存在一个或多个，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸位数的偏移，其也视为包含在本公开的保护范围之内。
因此，在一些实施方式中，上述氨基酸突变位点还包括：选自第501位氨基酸、第502位氨基酸、第505位氨基酸、第509位氨基酸或第512位氨基酸中的至少一种。
进一步地，在其他一些实施方式中，所述氨基酸突变位点还可以包括以下情况：
(1)第509位氨基酸；或
(2)第505位氨基酸；或
(3)第502位氨基酸；或
(4)第501位氨基酸；或
(5)第505位氨基酸和第509位氨基酸；或
(6)第502位氨基酸和第509位氨基酸；或
(7)第501位氨基酸和第509位氨基酸；或
(8)第502位氨基酸和第505位氨基酸；或
(9)第501位氨基酸和第505位氨基酸；或
(10)第502位氨基酸、第505位氨基酸和第509位氨基酸；或
(11)第501位氨基酸、第505位氨基酸和第509位氨基酸。
更进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸；或
(2)第505位氨基酸；或
(3)第505位氨基酸和第S509位氨基酸；或
(4)第502位氨基酸和第S509位氨基酸；或
(5)第501位氨基酸和第S509位氨基酸。
RSV F蛋白具有A和B两个亚型，两个亚型之间具有非常高的序列保守性，其氨基酸序列同源性达到90％。A亚型和B亚型内部不同毒株之间的氨基酸序列同源性更高。且各种亚型及其毒株的RSV F蛋白均由574个氨基酸组成。鉴于RSV F蛋白不同亚型之间氨基酸序列的高保守性，本公开所提供的突变方案适用于RSV F蛋白A亚型和B亚型的任一毒株序列或将来可能出现的毒株序列。本公开实施方式中野生型RSV F蛋白序列可以是来自于任何已知或将来可能出现的F蛋白序列，包括但不限于来自于A亚型或B亚型任一RSV毒株的F蛋白序列，如SEQ ID NO.1-2所示的A亚型的A2毒株F蛋白序列、SEQ ID NO.3所示的A亚型的ON1毒株F蛋白序列、SEQ ID NO.4-6所示的B亚型毒株的F蛋白序列。正是因为野生型RSV F蛋白的序列在RSV各亚型及毒株之间具有高度的保守性或同一性，因此允许野生型RSV F蛋白序列包含有微小差异，该微小差异可能为氨基酸残基之间的取代、缺失或插入。因此，在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白的序列之间可以具有90％以上同一性，例如，91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，且具有相同或基本相同的生物学功能。
基于本公开的研究结果，在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白可以为以下形式：
(a)包含两个蛋白酶酶切位点的F0前体蛋白；或
(b)不能结合蛋白酶的F0前体蛋白；或
(c)独立的F1多肽和独立的F2多肽的组合；或
(d)F2多肽-连接臂-F1多肽的组合；或
(e)F2’多肽-连接臂-F1’多肽的组合，其中，所述F2’多肽比所述F2多肽在沿N端方向少1～10个氨基酸残基，所述F1’多肽比所述F1多肽在沿C端方向少1～10个氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白可以为原始F0前体蛋白，即包含F1多肽、F2多肽、P27肽，任选地包含跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质。F0前体蛋白中包含有蛋白酶的酶切位点，所述蛋白酶可以为，例如，弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L，等。一般情况下，所述蛋白酶为弗林蛋白酶。其在表达过程中，天然地被表达系统中的蛋白酶切割，从而失去P27肽，F1多肽和F2多肽共同形成成熟形式的F蛋白。在另外一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白可以为不能结合蛋白酶的F0前体蛋白，即包含F1多肽、F2多肽、P27肽，任选地包含跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质，但不能结合蛋白酶，从而保留了P27肽。所述蛋白酶可以为，例如，弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L，等。一般情况下，所述蛋白酶为弗林蛋白酶。上述不能结合蛋白酶的原因可以为结合蛋白酶的酶切位点的氨基酸残基的缺失、取代或插入。在另外一些实施方式中，所述野生型RSVF蛋白可以为独立的F1多肽和独立的F2多肽的组合，可选择性地包含跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质。F1多肽和F2多肽自发形成F2-F1多肽异二聚体。在体外表达时，需要将F1多肽和F2多肽分别表达。在另外一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白可以为F2多肽-连接臂-F1多肽的组合，即包含F1多肽、F2多肽和连接臂(Linker-1)，可选择性地包含跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质。在另外一些实施方式中，所述野生型RSV F蛋白可以为F2’肽-连接臂-F1’肽的组合，其中，所述F2’多肽比所述F2多肽在沿N端方向少1～10个氨基酸残基，所述F1’多肽比所述F1多肽在沿C端方向少1～10个氨基酸残基，即将F0序列中包含P27肽的更长序列用连接臂替换。有研究显示，将P27肽用短的连接臂代替可以提高蛋白的表达量和三聚体含量(Ref:Krarup A.et al.Nat.Commun.,2015,6:8143)。因此，在一个实施方式中，将包含P27肽和弗林酶酶切位点的107～138位序列(RARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRF)替换为QARGSGSGRS序列。
在一些实施方式中，所述人工突变前的野生型RSV F蛋白可以包含如序列表中SEQID No.7-34所示，或与其具有90％以上同一性，例如，91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，且具有相同或基本相同的生物学功能的序列。
基于本公开的研究结果，在一些实施方式中，还提供了所述氨基酸突变位点被取代后的氨基酸残基组合。所述氨基酸突变位点包括以下情况的至少一种：
(1)第79位氨基酸被C取代和第220位氨基酸被C取代；或
(2)第82位氨基酸被C取代和第224位氨基酸被C取代；或
(3)第92位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(4)第93位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(5)第82位氨基酸被L取代；或
(6)第92位氨基酸被L、I、M、F、Y或W取代；或
(7)第96位氨基酸被M或Y取代；或
(8)第141位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(9)第190位氨基酸被V取代；或
(10)第193位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(11)第195位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(12)第199位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(13)第227位氨基酸被A、V、L、I、M、S、T或Q取代；或
(14)第230位氨基酸被F取代；或
(15)第238位氨基酸被L、I、M、F、Y或W取代；或
(16)第373位氨基酸被M、F或Y取代。
进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点包括以下情况：
(1)第92位氨基酸被I、M、F、Y或W取代；或
(2)第96位氨基酸被Y取代；或
(3)第227位氨基酸被M、V或I取代；或
(4)第230位氨基酸被F取代；或
(5)第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(6)第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(7)第82位氨基酸被L取代和第227位氨基酸被M取代；或
(8)第92位氨基酸被M或L取代，和第227位氨基酸被M或V取代；或
(9)第92位氨基酸被M或L取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(10)第96位氨基酸被Y取代和第227位氨基酸被M或V取代；或
(11)第96位氨基酸被Y取代和第230位氨基酸被F取代；或
(12)第96位氨基酸被Y取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(13)第89位氨基酸被L取代和第230位氨基酸被F取代；或
(14)第227位氨基酸被M取代和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(15)第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(16)第193位氨基酸被M取代，和第195位氨基酸被M、F或Y取代；或
(17)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第195位氨基酸被M、F或Y取代；或
(18)第193位氨基酸被M取代，和第199位氨基酸被M或F取代；或
(19)第141位氨基酸被M或F取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(20)第82位氨基酸被C取代和第224位氨基酸被C取代；或
(21)第92位氨基酸被C取代，和第238位氨基酸被C取代；或
(22)第79位氨基酸被C取代和第220位氨基酸被C取代；或
(23)第93位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(24)第92位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(25)第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(26)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(27)第193位氨基酸被M取代和第230位氨基酸被F取代；或
(28)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(29)第93位氨基酸被C取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(30)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(31)第93位氨基酸被C取代，第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(32)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(33)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(34)第93位氨基酸被C取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(35)第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L、I、M或W取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(36)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(37)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(38)第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(39)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(40)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(41)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(42)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L、I、M或W取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代。
更进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点可以包括以下情况：
(1)第92位氨基酸被I、M、F、Y或W取代；或
(2)第96位氨基酸被Y取代；或
(3)第227位氨基酸被M或V取代；或
(4)第230位氨基酸被F取代；或
(5)第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(6)第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(7)第92位氨基酸被M取代，和第227位氨基酸被M或V取代；或
(8)第92位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(9)第227位氨基酸被M或V取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(10)第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(11)第96位氨基酸被Y取代和第227位氨基酸被M或V取代；或
(12)第96位氨基酸被Y取代和第230位氨基酸被F取代；或
(13)第96位氨基酸被Y取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(14)第93位氨基酸被C取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(15)第92位氨基酸被C取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(16)第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(17)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(18)第93位氨基酸被C取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(19)第93位氨基酸被C取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(20)第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L或I取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(21)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(22)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(23)第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(24)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(25)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(26)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(27)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(28)第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(29)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(30)第93位氨基酸被C取代，第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代和第234位氨基酸被C取代；或
(31)第93位氨基酸被C取代，或第227位氨基酸被M或V取代，第193位氨基酸被M取代，和第234位氨基酸被C取代。
(32)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代。
(33)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L或I取代，和第373位氨基酸被M或F取代。
为了进一步提高RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性，在一些实施方式中，还引入了尾部结构域的氨基酸突变位点，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第501位氨基酸被V、L、I、M、F、W、Y、P或R取代；或
(2)第502位氨基酸被V、L、I、M、F、W、Y、P或R取代；或
(3)第505位氨基酸被M或W取代；或
(4)第509位氨基酸被G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、Q、K、R或H取代；或
(5)第512位氨基酸被I、F、M、Y、R或K取代。
进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸被F、M或L取代；或
(2)第505位氨基酸被W取代；或
(3)第502位氨基酸被Y取代；或
(4)第501位氨基酸被M取代；或
(5)第505位氨基酸被W取代和第509位氨基酸被F、L或M取代；或
(6)第502位氨基酸被Y取代和第509位氨基酸被F取代；或
(7)第501位氨基酸被M取代和第509位氨基酸被F取代；或
(8)第502位氨基酸被Y取代和第505位氨基酸被W取代；或
(9)第501位氨基酸被M取代和第505位氨基酸被W取代；或
(10)第502位氨基酸被Y取代，第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F取代；或
(11)第501位氨基酸被M取代，第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F取代。
更进一步地，在一些实施方式中，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸被F、M或L取代；或
(2)第505位氨基酸被W取代；或
(3)第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F或L取代；或
(4)第502位氨基酸被Y取代，和第509位氨基酸被F取代；或
(5)第501位氨基酸被M取代，和第509位氨基酸被F取代。
在一些实施方式中，所述突变体的具体示例可以包含选自如序列表中SEQ IDNo.35-166所示的序列，或与其具有90％以上同一性，例如，91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，且具有相同或基本相同的生物学功能的序列。
全长RSV F蛋白的C-端包含一个跨膜区以及一个胞内区，在一些实施方式中，可以保留或去除上述跨膜区和/或胞内区。为了有助于分泌表达，在一些实施方式中，去除了F蛋白C-末端的跨膜区和胞内区，以获得可溶的F蛋白。在本公开的另外一些实施方式中，可以去除胞内区和全部或一部分的跨膜区，或者去除C-末端包含跨膜区和胞内区的更长的序列。在本公开的一些具体实施例中，C-末端去除514～574位氨基酸。
在一些实施方式中，所述突变体可以为三聚体形式。RSV F蛋白天然结构为同源三聚体。因此，作为优选，在一些实施方式中，所述三聚体形式可以为同源三聚体形式。在保留或去除了跨膜区和胞内区的情况下，F蛋白C-末端可与外源的三聚化结构域直接或间接地连接，以促进三聚体结构的形成。外源的多聚化结构域是本领域已知的，比如GCN4亮氨酸拉链(Ref:Sliepen K.et al.J.Biol.Chem.,2015,290:7436-7442.)、胶原蛋白(Ref:McAlinden A.et al.J.Biol.Chem.,2003,278:42200-42207)、T4 foldon(Ref：1.McLellanJ.S.et al.Science,2013,342:592-598.2.Joyce M.G.et al.Nat.Struct.Mol.Biol.,2016,23:811-820)等。在一些具体实例中，F蛋白的C-末端连接T4 foldon以促进其三聚化。
在一些实施方式中，所述突变体可以经过修饰，其目的是为了实现某些功能而并不影响所述突变体整体的生物学活性，例如，免疫原性。所述修饰可以为选自糖基化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、辅酶修饰或酰基化修饰中的至少一种。
外源的多聚化结构域与F蛋白连接时，可以直接连接到F蛋白的C-端，也可以通过连接体(Linker-2)相连，连接体可长可短，在一些实施方式中，可以为例如，GS的重复序列、GGS的重复序列、SAIG的重复序列、GSS的重复序列或GG的重复序列等。这些连接体以及其它类似的连接体是本领域公知的，其可用于本公开的突变体中。在一些具体实例中，F蛋白与外源多聚化结构域之间通过SAIG连接体进行连接。
为了实现某些特定目的或功能，在一些实施方式中，所述突变体还可以包含功能性标签。其可以添加在合适的位置。例如，所述功能性标签可以选自信号肽、标签或免疫增强肽中的一种或几种。上述信号肽的作用可以是更有利于蛋白质的表达；上述标签可以为，例如，Flag标签、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，等等，其作用可以是用于检测、纯化、分离等等。上述功能性序列可任意组合使用。在一些实施方式中，为了便于纯化目标蛋白，所构建的F蛋白突变体可含有His标签(多个His连接而成)、链霉素标签II、AviTag标签，也可包含TEV蛋白酶切位点用于外加序列的切除，外加序列属于本领域技术人员所熟知的，其添加与否并不影响F蛋白的生物学功能。在另外一些实施例中，F蛋白连接外源多聚化结构域后，通过GSGSGS连接臂，再连接His标签(HHHHHHHH)便于目标蛋白的纯化。在另外一些实施例中，除了His标签外，还连接有链霉素标签II、AviTag标签以及TEV蛋白酶切位点。本公开所公开的突变体序列没有包含这些外加标签序列。
在本公开中，所述野生型RSV F蛋白的突变体可以根据本公开中记载的内容通过现有技术中的常规手段制备，例如将编码所述突变体的核苷酸序列装入合适的载体在相应的表达系统中进行表达并纯化。李启明等人在公布号为CN111166881A、公布号为CN106986942A和公布号为CN106986943A的中国专利中公开了几种针对呼吸道合胞病毒的新的表达载体。RSV F蛋白突变体的表达可以使用现有技术中合适的宿主细胞，例如，大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。大肠杆菌表达系统的示例，例如，GI698、ER2566、BL21(DE3)、XA90、DH(5a)、B834(DE3)、BLR(DE3)。酵母表达系统的示例，例如，酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母。昆虫细胞的示例，例如，如Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞、High Five细胞。哺乳动物细胞的示例，例如，CHO细胞、人类胚肾细胞、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞。可以采用任意合适的方法对获得的蛋白质进行纯化，例如，盐析法、沉淀法、透析或超滤、分子筛层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法。
本发明的另一个方面，是提供了一种病毒样颗粒(VLPs)，所述病毒样颗粒包含本公开所述的突变体。可以采用现有技术中任意合适的方法制备所述病毒样颗粒。例如，利用特定的昆虫或哺乳动物细胞表达系统表达出VLPs。
本发明的另一个方面，是提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码本公开所述的突变体。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子是DNA分子。通常，可以对编码本公开实施方式中所述突变体的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。在另外一些实施方式中，所述分离的核酸分子是RNA分子，所述RNA分子包括mRNA分子。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体中包含本公开所述的核酸分子的序列或本公开所述的突变体。在一些实施方式中，所述载体为蛋白质表达载体。在另一些实施方式中，所述载体为基因递送载体。例如病毒载体或非病毒载体。在另一些实施方式中，所述病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、单疱病毒载体或仙台病毒载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列。在另一些实施方式中，所述载体为非病毒载体。在另一些实施方式中，所述非病毒载体包括，例如，脂质体、阳离子多聚物载体、脂质纳米颗粒载体(LNP)或多功能信封式纳米载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本公开中所述的核酸分子或本发明中所述的载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种蛋白缀合物，所述蛋白缀合物包含本发明中所述的突变体。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包含本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞或本发明中所述的蛋白缀合物，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以为任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、氨基酸以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。在一些实施方式中，所述药物组合物可以为具有免疫原性的组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物为疫苗。所述疫苗中包含本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞或本发明中所述的蛋白缀合物。所述疫苗为预防或治疗性疫苗。在一些实施方式中，所述药物组合物可以包含一种或多种不同的本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞或本发明中所述的蛋白缀合物，例如，两种或三种。在一些实施方式中，所述疫苗为蛋白疫苗、核酸疫苗或载体疫苗。
对于蛋白疫苗，在一些实施方式中，所述疫苗还可以包含免疫调节剂，例如佐剂。可以选择任意合适的佐剂，例如，氢氧化铝、磷酸铝、MF59或CpG，等。在一些实施方式中，所述免疫调节剂还包括免疫增强剂，例如，细胞因子，趋化因子PAMP，TLR-配体，免疫刺激序列，包含CpG的DNA，dsRNA，胞吞模式的识别受体配体，LPS，皂树皂苷，妥卡雷琐，等。
本发明的另一个方面，是提供了本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞、本发明中所述的蛋白缀合物或本发明中所述的药物组合物在制备预防或治疗RSV感染的产品中的用途。
在一些实施方式中，还提供了使受试者产生对RSV的免疫应答的方法。该方法包括向受试者施用有效剂量的本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞、本发明中所述的蛋白缀合物或本发明中所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述免疫应答可以在受试者体内产生一种或多种中和抗体。在一些实施方式中，所述免疫应答可以引发受试者的细胞免疫。在一些实施方式中，所述免疫应答为减少或抑制了RSV在受试者体内的复制。在一些实施方式中，所述施用可以为一次或多次施用。在一些实施方式中，所述施用的方法可以为肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、经黏膜免疫，等。
本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞、本发明中所述的蛋白缀合物或本发明中所述的药物组合物可以与其他包括免疫原性组合物的药物同时或联合施用。
本发明的另一个方面，是提供了本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞或本发明中所述的蛋白缀合物在制备针对RSV F蛋白融合前构象的抗体中的用途。
本发明的另一个方面，是提供了本发明中所述的突变体、本发明中所述的分离的核酸分子、本发明中所述的载体、本发明中所述的宿主细胞或本发明中所述的蛋白缀合物在检测样本中是否存在RSV抗体中的用途。例如，通过检测受试者来源的样本中是否存在RSV抗体来诊断受试者是否存在RSV感染。
本发明的另一个方面，是提供了预防或治疗RSV感染的方法，向患者施用有效剂量的本发明中所述的药物组合物。
本公开的有益效果：
本公开实施方式中基于对RSV F蛋白融合前和融合后构象的结构分析，获得与F蛋白RR1从融合前到融合后构象变化相耦合的其它构象变化区域，通过引入稳定性突变，阻止构象运动的发生，和/或直接在RR1涉及到的相互作用区域引入突变来阻止其构象转变，将F蛋白稳定到融合前构象三聚体状态，此外，在F蛋白尾部结构域引入稳定性突变，进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体结构的稳定性。通过融合前构象三聚体特异性单抗AM14的结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体能够与AM14单抗具有强结合活性，而人工突变前的野生型RSV F蛋白与AM14单抗无结合活性。帕丽珠单抗结合实验显示，本公开实施方式中所提供的突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白均与帕丽珠单抗有强结合活性。上述实验结果表明，所引入的突变成功将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态，且折叠良好。
本公开实施方式中还对上述所表达的F蛋白突变体开展了加速稳定性试验，结果显示，在37℃环境下放置4周，AM14单抗结合活性无明显变化，表明突变体蛋白融合前构象三聚体依然保持稳定。
本公开实施方式中还开展了动物免疫实验，实验结果显示相对于人工突变前的野生型RSV F蛋白，本公开所提供的突变体能够诱导产生更高滴度的中和抗体。
附图说明
图1A为RSV F蛋白融合前构象三聚体结构图，图1B为RSV F蛋白融合后构象三聚体结构图，其中，本发明为了形象描述而定义的头部结构域和尾部结构域在图中标出，F蛋白从融合前构象转变为融合后构象过程中，发生大幅度构象变化的RR1区(位于头部结构域)和RR2区(位于头部结构域的C端和尾部结构域)在图中标出，图1A和图1B分别基于PDB代码为4jhw和3rrr的坐标文件画出；
图2为RSV F蛋白单体融合前构象(浅色)与融合后构象(深色)的结构叠落图，其中，F蛋白从融合前构象转变为融合后构象过程中，头部结构域RR1发生大幅度构象变化的同时，α1和α5也相应地发生了明显的构象运动，右侧放大图显示了α1和α5融合前后的构象变化，F蛋白单体融合前构象和融合后构象分别根据PDB代码为4jhw和3rrr的坐标文件画出；
图3为本公开实施例中头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-25的SDS-PAGE电泳图；
图4为本公开实施例中头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-25以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14单抗结合实验结果图；
图5为本公开实施例中头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-25以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的帕丽珠单抗结合实验结果图；
图6为本公开实施例中所构建的FHCS-1、FHCS-2、FHCS-3、FHCS-4、FHCS-5、FHCM-1、FHCM-2、FHCM-3和FHCM-4突变体蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；
图7A为本公开实施例中所构建的FHCS-1、FHCS-2、FHCS-3、FHCS-4、FHCS-5、FHCM-1和FHCM-2突变体与FHM-24突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14单抗结合实验结果对比图；图7B为本公开实施例中所构建的FHCM-3和FHCM-4突变体与FHM-25突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14单抗结合实验结果对比图；
图8A为本公开实施例中所构建的FHCS-1、FHCS-2、FHCS-3、FHCS-4、FHCS-5、FHCM-1和FHCM-2突变体与FHM-24突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的帕丽珠单抗结合实验结果对比图；图8B为本公开实施例中所构建的FHCM-3和FHCM-4突变体与FHM-25突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的帕丽珠单抗结合实验结果对比图；
图9为本公开实施例中所构建的FHCS-1、FHCS-2、FHCS-3和FHCS-4突变体与FHM-24突变体及人工突变前的野生型RSV F蛋白2的RSV A2毒株活病毒中和抗体检测结果对比图。
序列表
本公开提供的示例性序列如表1-3所示。
表1.野生型RSV F蛋白氨基酸序列
表2.人工突变前的野生型RSV F蛋白的氨基酸序列
表3示例性野生型RSV F蛋白突变体(人工突变后)的氨基酸序列
具体实施方式
本公开公开了RSV F蛋白的突变体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本公开，并且相关人员明显能在不脱离本公开内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本公开技术。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可见Lewin’s GENES XII，JocelynE.Krebs/Elliott S.Goldstein/Stephen T.Kilpatrick，出版Jones&Bartlett，2018。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
为了使本领域的技术人员更好地理解本公开的技术方案，下面结合具体实施例对本公开作进一步的详细说明。
I.定义
术语“野生型”，也可以称作“天然”、“天然的”，是指未加入非天然存在的突变。在一些实施方式中，野生型RSV F蛋白示例性的例子例如SEQ ID No.1-6所示的序列。
术语“突变”是指序列(如核苷酸或氨基酸序列)相对于天然、野生型、标准、或参考形式的相应序列(即非突变序列)的变化。氨基酸突变一般包括对氨基酸残基的取代、缺失或插入。突变可以是人工制造的，也可以是天然形成的。
术语“肽”“多肽”和“蛋白质”可以互换使用并且通常指通过肽键共价连接的氨基酸的肽和蛋白质。术语“蛋白质”涵盖纯化的天然产物，或可以使用重组或合成技术部分或全部生产的产物。术语“肽”和“蛋白质”可以指蛋白质的聚集体，例如二聚体或其他多聚体、融合蛋白、蛋白质变体或其衍生物。该术语还包括蛋白质的修饰，例如，通过糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、泛素化等修饰的蛋白质。蛋白质可包括不由核酸密码子编码的氨基酸。蛋白质可具有长度足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。
术语“蛋白酶的酶切位点”是指蛋白质或融合蛋白氨基酸内的特定氨基酸基序。在蛋白质或融合蛋白的氨基酸序列内，其被识别氨基酸基序的特异性蛋白酶切割。在一些实施方式中，特异性蛋白酶的例子例如弗林蛋白酶、胰蛋白酶、因子Xa、凝血酶或组织蛋白酶L，等。
术语“F0前体蛋白”是指RSV F蛋白在体内首先翻译为由574个氨基酸构成的单链非活性的前体蛋白F0。F0蛋白N-端1～25位氨基酸构成的信号肽由信号肽酶切除。此外，F0的109/110及136/137位氨基酸处存在两个弗林蛋白酶切位点，通过蛋白酶的酶切，将110～136位氨基酸多肽(称为p27)去除，生成137～574位氨基酸构成的F1以及26～109位氨基酸构成的F2。
术语“头部结构域”和“尾部结构域”是本发明为了对RSV F蛋白的结构进行形象描述而定义的，我们将第1～485位氨基酸定义为头部结构域，第486位氨基酸到F蛋白的C末端定义为尾部结构域，头部结构域和尾部结构域所处的大致空间位置如图1A所示。
术语“病毒样颗粒(VLPs)”或称“假病毒”是指由相应天然病毒结构蛋白组成的多蛋白结构，但是缺少全部或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制和传染组分，因此不具复制性和传染性。该多蛋白结构在形态和尺寸上高度模拟其相应的天然病毒颗粒，能在重组表达病毒的结构蛋白后自发形成。
术语“蛋白质递送载体”是指某种蛋白可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)插入表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫系统识别。
术语“免疫原性”是指物质在佐剂存在或不存在的情况下，在动物中引起、引发、刺激或诱导针对特定抗原的免疫应答的能力。
术语“缀合物”通常是指由两个或更多独立的部分接合在一起形成的任何物质。例如，缀合物可以包含由一段多肽与另一段或多段多肽连接而成的物质。缀合物的一部分为蛋白质时，所述缀合物为蛋白缀合物。
II.RSV
F蛋白头部结构域的突变设计，实现将F蛋白稳定到融合前构象三聚体状
态
已有文献报道目前所发现的针对RSV F蛋白的高活性中和抗体大多都靶向融合前构象(Ref:Battles M.B.,McLellan J.S.Nat.Rev.Microbiol.,2019,17:233-245；GilmanM.S.A.et al.PLoS Pathog.,2015,11:e1005035；Harshbarger W.,et al.MAbs,2021,13:1955812.)，处于融合前构象的F蛋白三聚体诱导的中和抗体滴度远高于融合后构象三聚体(Ref：Battles M.B.,McLellan J.S.Nat.Rev.Microbiol.,2019,17:233-245；Krarup A.etal.Nat.Commun.,2015,6:8143)，因此，处于融合前构象的F蛋白三聚体是开发重组亚单位疫苗的优选抗原。然而，F蛋白融合前构象三聚体是一种亚稳状态，很容易从融合前构象(如图1A所示)转变为融合后构象(如图1B所示)。通过关键位点的改造，将F蛋白稳定到融合前构象三聚体状态是重组亚单位疫苗研发需要解决的关键难题之一。
RSV F蛋白融合前和融合后构象三聚体的空间结构已经通过X-射线晶体结构解析实验获得(Ref:McLellan J.S.,et al.Science,2013,340:1113-1117.McLellan J.S.,etal.J.Virol.,2011,85:7788-7796.)，并被提交到蛋白质结构数据库(protein data bank,PDB)，根据PDB代码4jhw和3rrr，可以从PDB数据库下载获得融合前和融合后构象三聚体的空间结构坐标。利用常用的蛋白质结构比对软件，比如Pymol、Chimera等，将融合前和融合后构象进行叠落，如图2所示。从图2的结构比对结果可以看出，从融合前构象到融合后构象，头部结构域的RR1区域，以及位于头部结构域C端和尾部结构域的RR2区域发生了大幅度的构象变化，同时，头部结构域的α1和α5也相应地发生了明显的构象运动，因此，α1和α5的构象变化与RR1的构象变化之间相互耦合。基于上述结构分析，通过在α1或α5区域引入稳定性突变，阻止α1和α5的构象变化，可以通过耦合调控作用，阻止RR1构象变化的发生，将F蛋白稳定在融合前构象状态。此外，也可以直接在RR1涉及到的相互作用区域引入稳定性突变，阻止融合前构象向融合后构象的转变。为此，本公开在α1螺旋(73～96位氨基酸)或α5螺旋(216～240位氨基酸)或直接在RR1涉及到的相互作用区域引入突变，或引入这些突变的任意组合，通过增强残基之间的相互作用来稳定α1、α5或RR1的构象，以此将F蛋白稳定在融合前构象三聚体状态。一些示例性单位点突变设计如表4所示。这些单位点突变可以进行任意的组合，可以具有类似或更强的稳定效果，一些示例性的突变组合如表5所示。
表4RSV F蛋白头部结构域示例性单位点突变设计
表5RSV F蛋白头部结构域示例性位点突变组合设计
III.实施例
实施例1通过头部结构域引入人工突变所设计的突变体(表4和表5)的质粒构建、
重组表达和效果验证
天然的RSV F蛋白为同源三聚体，本实施例为了便于蛋白的分泌表达，在F0全长序列的基础上去除了包含跨膜区和胞内区的514～574位氨基酸，该区域对于F蛋白三聚体的形成具有重要的作用，为了使截取后的序列能够组装形成三聚体，在截取后的序列的C-端通过一个短的连接体(序列为SAIG)连接到外源三聚化结构域(本实施例采用T4 Foldon三聚化基序)。有研究显示去除F0中的p27部分的序列，有助于三聚体的形成(Krarup A.etal.Nat.Commun.,2015,6:8143.)，本实施例将包含p27和弗林酶切位点的107～138位序列(RARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRF)替换为连接臂QARGSGSGRS序列。此外，本发明将序列N-端的1～25位氨基酸构成的信号肽“MELLILKANAITTILTAVTFCFASG”替换为重组表达系统HEK293适用的信号肽序列“MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC”，以促进重组蛋白的分泌表达。在此基础上，根据表4和表5所设计的头部结构域位点突变，构建了相应的RSV F蛋白突变体。所构建的突变体氨基酸序列(不含信号肽、T4 foldon和连接体)如SEQ ID No.35-157所示。
根据SEQ ID No.35-157的氨基酸序列，添加重组表达系统HEK293适用的信号肽、T4 foldon三聚化基序、连接体、以及有助于纯化的外加标签序列，依照HEK293密码子偏嗜性进行密码子优化，形成对应的编码基因序列。采用全基因合成或点突变方式构建所述编码基因序列，在序列前端添加Kozak序列“GCCACC”后连接至重组表达载体pcDNA3.1，形成重组表达质粒。采用Expi293TM瞬时表达系统(Thermo Fisher)对构建的融合前RSV F蛋白突变体进行重组表达，在转染后第5天收获细胞分泌上清。作为对照，基于上述方法我们同时根据SEQ ID No.12重组表达了人工突变前的野生型RSV F蛋白(称为“人工突变前的野生型RSV F蛋白1”)。此外，我们还从义翘神州公司购买了RSV A2毒株F蛋白(Catalog Number:11049-V08B)作为另外一种对照(称为“人工突变前的野生型RSV F蛋白2”)，其氨基酸序列参见SEQ ID No.15。
为了验证引入上述突变是否能够将RSV F蛋白稳定到融合前构象三聚体状态，本实施例利用融合前构象三聚体特异性结合单抗AM14，通过ELISA实验方法检测上述所构建的突变体与AM14抗体的结合活性，并与人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14单抗结合活性进行了比较。已发表的文献显示AM14抗体结合于F蛋白融合前构象三聚体中相邻两个单体之间界面的表位区(Ref:Gilman M.S.A.et al.PLoSPathog.,2015,11:e1005035；Harshbarger W.,et al.MAbs,2021,13:1955812.)，当F蛋白三聚体从融合前构象转变为融合后构象时，该表位被破坏，因此，AM14抗体无法与F蛋白融合后构象结合，该抗体常用于F蛋白融合前构象三聚体结构的特异性识别检测(Ref:GilmanM.S.A.et al.PLoS Pathog.,2015,11:e1005035；Harshbarger W.,et al.MAbs,2021,13:1955812.)，并且，有文献报道AM14单抗的结合活性与免疫动物产生的中和抗体滴度呈现正相关(Ref:Che Y.et al.Sci.Transl.Med.,2023,15:eade6422.)。同时，为了验证所构建的突变体能否表达，本实施例采用His标签抗体检测其表达情况。
转染上清的ELISA检测过程如下：
(1)AM14单抗结合活性的检测
使用包被液(Na2CO3-NaHCO3溶液，pH9.6)将AM14单抗(科斯坦生物)稀释至1μg/ml后包被于96孔酶标板，100μl/孔，4℃包被8～12h；PBST溶液洗板后加入封闭液(20％小牛血清，0.2％酵母提取物，PBST溶解)，100μl/孔，37℃封闭2h；PBST溶液洗板后加入10倍稀释后的重组表达突变体(含人工突变前的野生型RSV F蛋白1)离心后的细胞分泌上清以及2μg/ml的人工突变前的野生型RSV F蛋白2，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的RSV F蛋白兔单抗(1:1000，义翘神州)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液A和B，室温下显色5min，加入终止液C液终止显色反应；在450nm和630nm波长处读取光密度(OD)值。
(2)His标签抗体结合活性的检测
使用包被液将重组表达的突变体(含人工突变前的野生型RSV F蛋白1)离心后的细胞分泌上清10倍稀释后包被于96孔酶标板，同时以2μg/ml的人工突变前的野生型RSV F蛋白2作为对照孔，100μl/孔，4℃包被8～12h；PBST溶液洗板后加入封闭液，100μl/孔，37℃封闭2h；PBST溶液洗板加入稀释后的His标签抗体(1:2000稀释，义翘神州)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(1:10000，中杉金桥)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液A和B，室温下显色5min，加入终止液C液终止显色反应；在450nm和630nm波长处读取OD值。
ELISA检测结果如表6、表7、表8所示，结果显示，大部分突变体的His标签抗体检测具有较高的OD值，表明所构建的大部分突变体均能有效表达。表6显示人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2无AM14单抗结合活性，而表7和表8显示多种头部结构域单位点突变体和多种头部结构域多位点组合突变体能够与AM14单抗结合，包括FHS-1、FHS-4、FHS-5、FHS-6、FHS-11、FHS-12、FHS-14、FHS-26、FHS-45、FHS-46、FHS-47、FHS-48、FHS-49、FHS-50、FHS-65、FHS-66、FHS-67、FHS-68、FHS-69、FHS-76、FHS-78、FHS-84、FHS-87、FHS-88、FHM-1、FHM-2、FHM-5、FHM-9、FHM-12、FHM-13、FHM-15、FHM-16、FHM-18、FHM-19、FHM-20、FHM-22、FHM-23、FHM-24和FHM-25突变体。这些单位点突变体或多位点组合突变体的AM14单抗检测OD值明显高于人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSVF蛋白2，表明引入上述突变成功将RSV F蛋白稳定到融合前构象三聚体状态。
表6人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2与AM14单抗以及His标签抗体的结合活性
表7RSV F蛋白头部结构域引入单位点突变的示例性突变体与AM14单抗以及His标签抗体的结合活性
表8 RSV F蛋白头部结构域引入多位点组合突变的示例性突变体与AM14单抗以及His标签抗体的结合活性
| 突变体编号 | AM14单抗(OD值) | His标签抗体(OD值) |
| FHM-1 | 2.288 | 0.489 |
| FHM-2 | 2.228 | 1.585 |
| FHM-3 | 0.070 | 0.359 |
| FHM-4 | 0.028 | 0.183 |
| FHM-5 | 1.964 | 0.982 |
| FHM-6 | 0.005 | 0.098 |
| FHM-7 | 0.007 | 0.196 |
| FHM-8 | 0.016 | 0.465 |
| FHM-9 | 2.121 | 1.446 |
| FHM-10 | 0.010 | 0.136 |
| FHM-11 | 0.006 | 0.139 |
| FHM-12 | 2.128 | 1.708 |
| FHM-13 | 1.070 | 0.443 |
| FHM-14 | 0.008 | 0.458 |
| FHM-15 | 1.505 | 1.720 |
| FHM-16 | 0.260 | 1.280 |
| FHM-17 | 0.006 | 0.654 |
| FHM-18 | 1.797 | 0.870 |
| FHM-19 | 0.367 | 0.228 |
| FHM-20 | 0.607 | 0.586 |
| FHM-21 | 0.007 | 0.159 |
| FHM-22 | 1.978 | 1.765 |
| FHM-23 | 1.887 | 1.620 |
| FHM-24 | 1.610 | 0.932 |
| FHM-25 | 2.419 | 1.728 |
实施例2实施例1中所表达的头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-
25的纯化、鉴定及生物学活性评价
将构建的RSV F蛋白头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-25(对应的氨基酸序列SEQ ID No.156和SEQ ID No.157)重组表达质粒通过Expi293TM表达系统(Thermo Fisher)瞬时表达，在转染后第5天收获分泌上清。采用进行镍柱(HisTrap FFcrude预装柱)对转染上清进行亲和层析纯化。以平衡缓冲液(20mM磷酸盐-150mM氯化钠，pH7.4)平衡层析柱后上样，在20％、50％洗脱缓冲液(20mM磷酸盐-150mM氯化钠-500mM咪唑，pH7.4)洗脱后收集目的蛋白。将纯化后蛋白进行12％SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，目的蛋白单体条带对应的分子量大小约为50～70kD，与理论值基本一致，表明FHM-24和FHM-25突变体能够正确表达。
获得FHM-24和FHM-25突变体纯化样品后，利用融合前构象三聚体特异性单抗AM14，通过抗体结合实验检测上述两个突变体与AM14单抗的结合活性，以验证其是否被成功稳定到融合前构象三聚体状态。同时，利用帕丽珠单抗进一步验证FHM-24和FHM-25突变体的折叠情况。帕丽珠单抗能够与RSV F蛋白的II表位特异性结合，融合前和融合后的F蛋白均含有相同构象的II表位，因此，帕丽珠单抗既能够与融合前构象F蛋白结合，也能够与融合后构象F蛋白结合。本实验以人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2作为对照。实验具体操作流程如下：将纯化后的FHM-24和FHM-25突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1、人工突变前的野生型RSV F蛋白2利用包被液从80μg/ml(相应一抗为AM14单抗)和10μg/ml(相应一抗为帕丽珠单抗)浓度起始进行2倍系列稀释，100μl/孔包被于酶标板，每个稀释度做3个复孔，4℃包被8～12h，以空白孔为阴性对照；PBST溶液洗板后加入封闭液，37℃封闭2h；PBST溶液洗板后加入稀释后的AM14单抗(0.1μg/ml)或帕丽珠单抗(2ug/ml)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人二抗(1:10000)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBST溶液洗板后先后加入显色液A和B，室温下显色5min，加入终止液C液终止显色反应；在450nm和630nm波长处读取OD值，将不同浓度的复孔OD450/630nm值取均值并计算标准差，以蛋白浓度为横坐标，各浓度对应的OD450/630nm均值为纵坐标，利用Origin软件绘制折线图。
抗体结合实验结果如图4和图5所示。AM14单抗结合实验结果(图4)显示人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2无AM14单抗结合活性，而头部结构域引入突变的示例性突变体FHM-24和FHM-25呈现出AM14单抗结合活性。表明通过在头部结构域引入稳定性突变，能够将RSV F蛋白稳定于融合前构象三聚体状态，阻止其从融合前到融合后构象转变的发生。帕丽珠单抗结合实验结果(图5)显示FHM-24突变体、FHM-25突变体、人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2均具有帕丽珠单抗结合活性。表明这四种蛋白均能够正确折叠。
实施例3在RSV F蛋白头部结构域引入突变的基础上，增加尾部结构域的突变设
计，进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性，从而进一步提高其免疫原性
RSV F蛋白融合前构象三聚体结构的稳定性对其作为抗原的免疫原性有重要的影响。在以上实施例所引入的头部结构域突变的基础上，本实施例在F蛋白尾部结构域也引入突变，通过增强RR2区域三螺旋束之间的相互作用，来提高F蛋白三聚体结构的稳定性，增强AM14单抗的结合活性，从而进一步提高其免疫原性。已有文献报道AM14单抗的结合活性与免疫动物产生的中和抗体滴度呈现正相关(Ref:Che Y.et al.Sci.Transl.Med.,2023,15:eade6422.)。为此，本实施例在RSV F蛋白尾部结构域RR2区域引入单位点突变或多位点突变组合，通过增强RR2区域三螺旋束之间的相互作用来进一步增强F蛋白融合前构象三聚体结构的稳定性。本实施例以头部结构域引入突变的突变体FHM-24(头部结构域引入227N→M和230L→F突变)和FHM-25(头部结构域引入227N→M、230L→F突变、190S→V突变和193L→M突变)为例，通过进一步在尾部结构域引入稳定性突变来进一步增强RSV F蛋白三聚体的稳定性。一些示例性尾部结构域的单位点突变设计如表9所示。这些尾部结构域的单位点突变可以进行任意的组合，可以具有类似或更强的稳定效果，一些示例性的突变组合如表10和表11所示。
表9在FHM-24突变体的基础上，尾部结构域引入的示例性单位点突变设计，以进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性
| 突变体编号 | 头部结构域引入的突变 | 尾部结构域引入的单位点突变 |
| FHCS-1 | 227N→M,230L→F | 509S→M |
| FHCS-2 | 227N→M,230L→F | 509S→F |
| FHCS-3 | 227N→M,230L→F | 509S→L |
| FHCS-4 | 227N→M,230L→F | 505F→W |
| FHCS-5 | 227N→M,230L→F | 502S→Y |
表10在FHM-24突变体的基础上，尾部结构域引入的示例性位点突变组合设计，以进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性
| 突变体编号 | 头部结构域引入的突变 | 尾部结构域引入的位点突变组合 |
| FHCM-1 | 227N→M,230L→F | 505F→W，509S→L |
| FHCM-2 | 227N→M,230L→F | 501Q→M，509S→F |
表11在FHM-25突变体的基础上，尾部结构域引入的示例性位点突变组合设计，以进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性
实施例4实施例3所设计的突变体的质粒构建、重组表达、纯化和生物学活性验证
为了验证尾部结构域所引入的突变是否能够进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体的稳定性，本实施例利用F蛋白融合前构象三聚体特异性结合单抗AM14检测实施例3所设计的突变体的抗体结合活性，并与尾部结构域引入突变前的FHM-24或FHM-25突变体、人工突变前的野生型RSV F蛋白1以及人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14抗体结合活性进行对比，评价尾部结构域所引入的突变对RSV F蛋白融合前构象三聚体稳定性的增强效果。
首先，实施例3中所设计的RSV F蛋白突变体对应的氨基酸序列依次为SEQ IDNo.158-166。根据相应的氨基酸序列，并添加重组表达系统HEK293适用的信号肽、T4foldon三聚化基序、连接体、以及有助于纯化的外加标签序列，依照HEK293密码子偏嗜性进行密码子优化，形成相应的编码基因序列。采用实施例1所述的质粒构建和重组表达操作流程，构建重组表达质粒，并利用Expi293TM瞬时表达系统进行突变体的重组表达，在转染后第5天收获细胞分泌上清。
进而，利用实施例1所述的纯化方法，对实施例3设计的所有突变体进行纯化，获得纯化后的突变体蛋白。将纯化后蛋白进行12％ SDS-PAGE电泳分析，结果如图6所示。目的蛋白单体条带对应的分子量大小约为50～70kD，表明所述突变体能够正确表达。
最后，通过RSV F蛋白融合前构象三聚体特异性结合单抗AM14，对纯化获得的突变体纯化样品，利用实施例2所述的ELISA实验进行AM14单抗结合活性检测，并与尾部结构域引入突变前的FHM-24或FHM-25突变体、人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2的AM14单抗结合活性进行对比，评价尾部结构域所引入的突变对RSV F蛋白融合前头像三聚体稳定性的增强效果。同时，利用帕丽珠单抗进一步验证所构建的突变体的折叠情况。
AM14单抗结合实验结果如图7A、图7B所示，结果显示，人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2无AM14单抗结合活性，而头部结构域和尾部结构域引入突变后的F蛋白突变体，相比未引入尾部结构域突变的突变体(FHM-24、FHM-25)以及人工突变前的野生型RSV F蛋白1和人工突变前的野生型RSV F蛋白2，AM14单抗的结合活性显著提升，结果表明尾部结构域所引入的突变能够进一步增强RSV F蛋白融合前构象三聚体结构的稳定性。帕丽珠抗体结合实验结果如图8A、图8B所示，结果显示人工突变前的野生型RSV F蛋白1、人工突变前的野生型RSV F蛋白2、未引入尾部结构域突变的F蛋白突变体和尾部结构域引入稳定性突变的突变体均有较强的帕丽珠单抗结合活性，表明这些蛋白均能正确折叠。
实施例5所构建的示例性RSV
F蛋白突变体的加速稳定性试验研究
将构建的RSV F蛋白突变体作为抗原开发疫苗，其稳定性是需要关注的一个重要特性，本实施例对所构建的示例性RSV F蛋白突变体FHCS-1、FHCS-2和FHCS-4开展了热加速稳定性试验研究。将表达纯化后获得的突变体样品在37℃环境下分别放置2周和4周，同时，将同样的样品在-80℃环境下放置2周和4周作为对照。利用包被液将稳定性样品从10μg/ml(相应一抗为AM14单抗)和2.5μg/ml(相应一抗为帕丽珠单抗)浓度起始进行2倍系列稀释，100μl/孔包被于酶标板，每个稀释度做2个复孔，然后采用实施例2所述的ELISA方法检测样品的AM14单抗和帕丽珠单抗的结合活性。
热加速稳定性试验结果如表12、13、14、15所示。结果显示，本发明所构建的RSV F蛋白突变体在37℃环境下放置4周后，相对于-80℃环境下放置的样品，其AM14单抗和帕丽珠单抗的结合活性没有发生明显变化，表明所构建的RSV F蛋白突变体融合前构象三聚体结构在37℃环境下放置4周后依然保持稳定。
实施例6所构建的示例性RSV
F蛋白突变体的动物免疫效果评价
为了验证本发明所构建的RSV F蛋白突变体的免疫效果是否明显增强，本实施例对突变体FHCS-1、FHCS-2、FHCS-3和FHCS-4开展了动物免疫效果评价研究，并与人工突变前的野生型RSV F蛋白以及仅引入头部结构域突变的突变体蛋白FHM-24的免疫效果进行了对比。
具体实验方法为：将纯化后的示例性F蛋白突变体以及人工突变前的野生型RSV F蛋白2分别与氢氧化铝佐剂混合后，加入聚肌胞溶液混合制备疫苗。将制备的疫苗免疫BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性，6-8周龄)，每组10只。于第0周和第2周肌肉免疫，抗原量为0.5μg/只小鼠，免疫体积为0.1ml/只，末次免疫后1周采血分离血清。采用RSV A2毒株活病毒中和实验检测免疫血清的中和抗体水平，具体如下：使用维持液(含2％胎牛血清，1％青链霉素的DMEM培养基)对血清进行系列2倍稀释，加入稀释后的RSV A2病毒，100TCID50/孔，每份血清做双复孔；同时设置不含血清的病毒对照孔以及不含血清和病毒的细胞对照孔，4℃条件下孵育2h；以2×104每孔的细胞数加入Hep2细胞悬液，37℃、5％ CO2培养箱中培养3天；采用免疫荧光方法进行中和结果判定，以低于50％病毒对照孔荧斑点均值的血清稀释倍数作为该血清的中和抗体滴度。
结果如图9所示，相比人工突变前的野生型RSV F蛋白，引入头部结构域突变后，中和抗体滴度有所提高，中和抗体几何平均滴度(GMT)从147提高到239。进一步，在引入头部结构域突变的基础上，同时引入尾部结构域突变后，中和抗体滴度进一步明显提高，GMT增加到588～1261，为人工突变前的野生型RSV F蛋白的4～8.58倍。结果表明，本发明通过引入头部结构域和尾部结构域突变，将RSV F蛋白稳定到融合前构象三聚体结构状态，显著提高了蛋白的免疫原性，为重组RSV疫苗的开发提供了具有显著技术优势和免疫活性优势的候选抗原。
以上所述仅是本公开的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本公开的保护范围。
Claims (43)
1.野生型RSV F蛋白的突变体，所述突变体为人工突变体，其特征在于，所述突变体与人工突变前的野生型RSV F蛋白相比，存在至少一个氨基酸突变位点，所述氨基酸突变位点包括：
(a)第73～96位氨基酸中的任意位点；或
(b)第216～240位氨基酸中的任意位点；或
(c)第141位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸、第195位氨基酸、第199位氨基酸或第373位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体与人工突变前的野生型RSVF蛋白相比，存在多个氨基酸突变位点，所述多个氨基酸突变位点包括：
(a)至少两个选自第73～96位氨基酸中的任意位点；或
(b)至少两个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；或
(c)至少一个选自第73～96位氨基酸中的任意位点，和至少一个选自第216～240位氨基酸中的任意位点。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体与人工突变前的野生型RSVF蛋白相比，存在多个氨基酸突变位点，所述多个氨基酸突变位点包括选自以下(a)、(b)或(c)中的任意一种情况与(d)的组合：
(a)至少两个选自第73～96位氨基酸中的任意位点；
(b)至少两个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；
(c)至少一个选自第73～96位氨基酸中的任意位点，和至少一个选自第216～240位氨基酸中的任意位点；
(d)选自第141位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸、第195位氨基酸、第199位氨基酸或第373位氨基酸中的至少一个位点。
4.根据权利要求1、2或3所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括：至少一个选自第486～513位氨基酸中的任意位点。
5.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述野生型RSV F蛋白为A亚型或B亚型。
6.根据权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列为：如SEQ ID No.1-6所示的序列，或与其具有90％以上同一性且具有相同或基本相同生物学功能的序列。
7.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述人工突变前的野生型RSV F蛋白为以下形式：
(a)包含两个蛋白酶酶切位点的F0前体蛋白；或
(b)不能结合蛋白酶的F0前体蛋白；或
(c)独立的F1多肽和独立的F2多肽的组合；或
(d)F2多肽-连接臂-F1多肽的组合；或
(e)F2’多肽-连接臂-F1’多肽的组合，其中，所述F2’多肽比所述F2多肽在沿N端方向少1～10个氨基酸残基，所述F1’多肽比所述F1多肽在沿C端方向少1～10个氨基酸残基。
8.根据权利要求7所述的突变体，其特征在于，所述蛋白酶为弗林蛋白酶。
9.根据权利要求7所述的突变体，其特征在于，所述人工突变前的野生型RSV F蛋白的氨基酸序列为：如SEQ ID No.7-34所示的序列，或与其具有90％以上同一性且具有相同或基本相同生物学功能的序列。
10.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点为：选自第79位氨基酸、第82位氨基酸、第92位氨基酸、第93位氨基酸、第96位氨基酸、第141位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸、第195位氨基酸、第199位氨基酸、第220位氨基酸、第224位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸、第234位氨基酸、第238位氨基酸或第373位氨基酸中的至少一种。
11.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括：选自第501位氨基酸、第502位氨基酸、第505位氨基酸、第509位氨基酸或第512位氨基酸中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点包括以下情况：
(1)第92位氨基酸；或
(2)第96位氨基酸；或
(3)第227位氨基酸；或
(4)第230位氨基酸；或
(5)第238位氨基酸；或
(6)第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(7)第82位氨基酸和第227位氨基酸；或
(8)第89位氨基酸和第227位氨基酸；或
(9)第92位氨基酸和第227位氨基酸；或
(10)第92位氨基酸和第230位氨基酸；或
(11)第96位氨基酸和第227位氨基酸；或
(12)第96位氨基酸和第230位氨基酸；或
(13)第96位氨基酸和第238位氨基酸；或
(14)第93位氨基酸和第227位氨基酸；或
(15)第89位氨基酸和第230位氨基酸；或
(16)第82位氨基酸和第230位氨基酸；或
(17)第93位氨基酸和第230位氨基酸；或
(18)第227位氨基酸和第238位氨基酸；或
(19)第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(20)第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(21)第82位氨基酸和第234位氨基酸；或
(22)第193位氨基酸和第195位氨基酸；或
(23)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第195位氨基酸；或
(24)第193位氨基酸和第199位氨基酸；或
(25)第141位氨基酸和第373位氨基酸；或
(26)第82位氨基酸和第224位氨基酸；或
(27)第92位氨基酸和第238位氨基酸；或
(28)第79位氨基酸和第220位氨基酸；或
(29)第97位氨基酸和第291位氨基酸；或
(30)第93位氨基酸和第234位氨基酸；或
(31)第92位氨基酸和第234位氨基酸；或
(32)第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(33)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(34)第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(35)第190位氨基酸、第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(36)第93位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(37)第93位氨基酸、第L193位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(38)第93位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(39)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(40)第93位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(41)第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸；或
(42)第93位氨基酸、第141位氨基酸和第234位氨基酸；或
(43)第93位氨基酸、第141位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(44)第141位氨基酸、第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(45)第227位氨基酸、第230位氨基酸和第373位氨基酸；或
(46)第93位氨基酸、第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(47)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(48)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(49)第227位氨基酸、第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸。
13.根据权利要求11所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸；或
(2)第505位氨基酸；或
(3)第502位氨基酸；或
(4)第501位氨基酸；或
(5)第505位氨基酸和第509位氨基酸；或
(6)第502位氨基酸和第509位氨基酸；或
(7)第501位氨基酸和第509位氨基酸；或
(8)第502位氨基酸和第505位氨基酸；或
(9)第501位氨基酸和第505位氨基酸；或
(10)第502位氨基酸、第505位氨基酸和第509位氨基酸；或
(11)第501位氨基酸、第505位氨基酸和第509位氨基酸。
14.根据权利要求12所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点包括以下情况：
(1)第92位氨基酸；或
(2)第96位氨基酸；或
(3)第227位氨基酸；或
(4)第230位氨基酸；或
(5)第238位氨基酸；或
(6)第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(7)第92位氨基酸和第227位氨基酸；或
(8)第92位氨基酸和第230位氨基酸；或
(9)第227位氨基酸和第238位氨基酸；或
(10)第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(11)第93位氨基酸和第234位氨基酸；或
(12)第92位氨基酸和第234位氨基酸；或
(13)第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(14)第190位氨基酸、第193位氨基酸、第227位氨基酸和第230位氨基酸；或
(15)第93位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(16)第93位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(17)第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸；或
(18)第93位氨基酸、第141位氨基酸和第234位氨基酸；或
(19)第93位氨基酸、第141位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(20)第141位氨基酸、第230位氨基酸和第238位氨基酸；或
(21)第227位氨基酸、第230位氨基酸和第373位氨基酸；或
(22)第93位氨基酸、第227位氨基酸和第234位氨基酸；或
(23)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第234位氨基酸和第373位氨基酸；或
(24)第190位氨基酸、第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(25)第193位氨基酸和第230位氨基酸；或
(26)第93位氨基酸、第193位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(27)第93位氨基酸、第190位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(28)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第193位氨基酸和第234位氨基酸；或
(29)第93位氨基酸、第227位氨基酸、第230位氨基酸和第234位氨基酸；或
(30)第227位氨基酸、第230位氨基酸、第238位氨基酸和第373位氨基酸。
15.根据权利要求13所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸；或
(2)第505位氨基酸；或
(3)第505位氨基酸和第509位氨基酸；或
(4)第502位氨基酸和第509位氨基酸；或
(5)第501位氨基酸和第509位氨基酸。
16.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点包括以下情况的至少一种：
(1)第79位氨基酸被C取代和第220位氨基酸被C取代；或
(2)第82位氨基酸被C取代和第224位氨基酸被C取代；或
(3)第92位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(4)第93位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(5)第82位氨基酸被L取代；或
(6)第92位氨基酸被L、I、M、F、Y或W取代；或
(7)第96位氨基酸被M或Y取代；或
(8)第141位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(9)第190位氨基酸被V取代；或
(10)第193位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(11)第195位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(12)第199位氨基酸被M、F、Y或W取代；或
(13)第227位氨基酸被A、V、L、I、M、S、T或Q取代；或
(14)第230位氨基酸被F取代；或
(15)第238位氨基酸被L、I、M、F、Y或W取代；或
(16)第373位氨基酸被M、F或Y取代。
17.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括以下情况中的至少一种：
(1)第501位氨基酸被V、L、I、M、F、W、Y、P或R取代；或
(2)第502位氨基酸被V、L、I、M、F、W、Y、P或R取代；或
(3)第505位氨基酸被M或W取代；或
(4)第509位氨基酸被G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、Q、K、R或H取代；或
(5)第512位氨基酸被I、F、M、Y、R或K取代。
18.根据权利要求16所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点包括以下情况：
(1)第92位氨基酸被I、M、F、Y或W取代；或
(2)第96位氨基酸被Y取代；或
(3)第227位氨基酸被M、V或I取代；或
(4)第230位氨基酸被F取代；或
(5)第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(6)第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(7)第82位氨基酸被L取代和第227位氨基酸被M取代；或
(8)第92位氨基酸被M或L取代，和第227位氨基酸被M或V取代；或
(9)第92位氨基酸被M或L取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(10)第96位氨基酸被Y取代和第227位氨基酸被M或V取代；或
(11)第96位氨基酸被Y取代和第230位氨基酸被F取代；或
(12)第96位氨基酸被Y取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(13)第89位氨基酸被L取代和第230位氨基酸被F取代；或
(14)第227位氨基酸被M取代和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(15)第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(16)第193位氨基酸被M取代，和第195位氨基酸被M、F或Y取代；或
(17)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第195位氨基酸被M、F或Y取代；或
(18)第193位氨基酸被M取代，和第199位氨基酸被M或F取代；或
(19)第141位氨基酸被M或F取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(20)第82位氨基酸被C取代和第224位氨基酸被C取代；或
(21)第92位氨基酸被C取代，和第238位氨基酸被C取代；或
(22)第79位氨基酸被C取代和第220位氨基酸被C取代；或
(23)第93位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(24)第92位氨基酸被C取代和第234位氨基酸被C取代；或
(25)第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(26)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(27)第193位氨基酸被M取代和第230位氨基酸被F取代；或
(28)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(29)第93位氨基酸被C取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(30)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(31)第93位氨基酸被C取代，第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(32)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(33)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(34)第93位氨基酸被C取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(35)第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L、I、M或W取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(36)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(37)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(38)第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(39)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(40)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(41)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代；或
(42)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L、I、M或W取代，和第373位氨基酸被M、F或Y取代。
19.根据权利要求17所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸被F、M或L取代；或
(2)第505位氨基酸被W取代；或
(3)第502位氨基酸被Y取代；或
(4)第501位氨基酸被M取代；或
(5)第505位氨基酸被W取代和第509位氨基酸被F、L或M取代；或
(6)第502位氨基酸被Y取代和第509位氨基酸被F取代；或
(7)第501位氨基酸被M取代和第509位氨基酸被F取代；或
(8)第502位氨基酸被Y取代和第505位氨基酸被W取代；或
(9)第501位氨基酸被M取代和第505位氨基酸被W取代；或
(10)第502位氨基酸被Y取代，第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F取代；或
(11)第501位氨基酸被M取代，第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F取代。
20.根据权利要求18所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为：
(1)第92位氨基酸被I、M、F、Y或W取代；或
(2)第96位氨基酸被Y取代；或
(3)第227位氨基酸被M或V取代；或
(4)第230位氨基酸被F取代；或
(5)第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(6)第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(7)第92位氨基酸被M取代，和第227位氨基酸被M或V取代；或
(8)第92位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(9)第227位氨基酸被M或V取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(10)第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(11)第96位氨基酸被Y取代和第227位氨基酸被M或V取代；或
(12)第96位氨基酸被Y取代和第230位氨基酸被F取代；或
(13)第96位氨基酸被Y取代，和第238位氨基酸被L、I、M或W取代；或
(14)第93位氨基酸被C取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(15)第92位氨基酸被C取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(16)第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(17)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(18)第93位氨基酸被C取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(19)第93位氨基酸被C取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(20)第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L或I取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(21)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(22)第93位氨基酸被C取代，第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(23)第141位氨基酸被M或F取代，第230位氨基酸被F取代，和第238位氨基酸被L或I取代；或
(24)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(25)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(26)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第234位氨基酸被C取代，和第373位氨基酸被M或F取代；或
(27)第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(28)第193位氨基酸被M取代，和第230位氨基酸被F取代；或
(29)第93位氨基酸被C取代，第193位氨基酸被M取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代；或
(30)第93位氨基酸被C取代，第190位氨基酸被V取代，第193位氨基酸被M取代和第234位氨基酸被C取代；或
(31)第93位氨基酸被C取代，或第227位氨基酸被M或V取代，第193位氨基酸被M取代，和第234位氨基酸被C取代。
(32)第93位氨基酸被C取代，第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，和第234位氨基酸被C取代。
(33)第227位氨基酸被M或V取代，第230位氨基酸被F取代，第238位氨基酸被L或I取代，和第373位氨基酸被M或F取代。
21.根据权利要求19所述的突变体，其特征在于，所述氨基酸突变位点还包括以下情况：
(1)第509位氨基酸被F、M或L取代；或
(2)第505位氨基酸被W取代；或
(3)第505位氨基酸被W取代，和第509位氨基酸被F或L取代；或
(4)第502位氨基酸被Y取代，和第509位氨基酸被F取代；或
(5)第501位氨基酸被M取代，和第509位氨基酸被F取代。
22.根据权利要求16所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为：如SEQID No.35-166所示的序列，或与其具有90％以上同一性且具有相同或基本相同生物学功能的序列。
23.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为三聚体形式。
24.根据权利要求23所述的突变体，其特征在于，所述三聚体形式为同源三聚体形式。
25.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的C末端缺少跨膜区和胞内区。
26.根据权利要求1或25所述的突变体，其特征在于，所述突变体的C末端直接或间接地连接有三聚化结构域。
27.根据权利要求26所述的突变体，其特征在于，所述三聚化结构域为GCN4亮氨酸拉链、胶原蛋白或T4 foldon。
28.根据权利要求26所述的突变体，其特征在于，所述突变体的C末端通过连接体与所述三聚化结构域连接。
29.根据权利要求28所述的突变体，其特征在于，所述连接体为GS的重复序列、GGS的重复序列、SAIG的重复序列、GSS的重复序列或GG的重复序列。
30.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体还包含功能性标签。
31.病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒包含如权利要求1～30任意一项中所述的突变体。
32.分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码如权利要求1～30任意一项中所述的突变体。
33.载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求30所述的核酸分子的序列或如权利要求1～30任意一项中所述的突变体。
34.根据权利要求33所述的载体，其特征在于，所述载体为蛋白质表达载体、基因递送载体或蛋白质递送载体。
35.根据权利要求34所述的载体，其特征在于，所述基因递送载体为病毒载体或非病毒载体；
所述病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、单疱病毒载体或仙台病毒载体；所述非病毒载体包括脂质体、阳离子多聚物载体、脂质纳米颗粒载体或多功能信封式纳米载体。
36.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求32所述的核酸分子或如权利要求33～35任意一项中所述的载体。
37.蛋白缀合物，其特征在于，所述蛋白缀合物包含如权利要求1～30任意一项中所述的突变体。
38.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含如权利要求1～30任意一项中所述的突变体、如权利要求32所述的分离的核酸分子、如权利要求33～35所述的载体、如权利要求36所述的宿主细胞、如权利要求37所述的蛋白缀合物，以及药学上可接受的载体。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为疫苗。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其特征在于，所述疫苗为蛋白疫苗、核酸疫苗或载体疫苗。
41.如权利要求1～30任意一项中所述的突变体、如权利要求31所述的病毒样颗粒、如权利要求32所述的分离的核酸分子、如权利要求33～35所述的载体、如权利要求36所述的宿主细胞、如权利要求37所述的蛋白缀合物或如权利要求38～40所述的药物组合物在制备预防或治疗RSV感染的产品中的用途。
42.如权利要求1～30任意一项中所述的突变体、如权利要求32所述的分离的核酸分子、如权利要求33～35所述的载体、如权利要求36所述的宿主细胞在制备针对RSV F蛋白融合前构象的抗体中的用途。
43.预防或治疗RSV感染的方法，其特征在于，向患者施用有效剂量的如权利要求38～40所述的药物组合物。
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