UA56132C2

UA56132C2 - Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини

Info

Publication number: UA56132C2
Application number: UA97105147A
Authority: UA
Inventors: Наталі Марі Жозеф Клод Гарсон; Мартін Фріде
Original assignee: Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А.; Смитклайн Бичем Байолоджикалс С.А.
Priority date: 1995-04-25
Filing date: 1996-01-04
Publication date: 2003-05-15
Also published as: AU699213B2; AR001686A1; BR9608199A; ES2140076T3; CZ296216B6; EP0955059A2; DZ2026A1; DE69605296D1; CN1480214A; AU5334596A; SI0955059T1; PT955059E; PL322968A1; ES2293708T3; CZ337997A3; EP0822831A1; MA23850A1; NO974859D0; CN1111071C; SI0822831T1

Abstract

Винахід стосується складу вакцини, що містить антиген, імунологічно активну фракцію сапоніну та стерин.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение касается рецептур новьїх вакцин, способов их изготовления и их использования в 2 медицине. В частности, настоящеє изобретениє касаєтся вакцин, содержащих антиген, иммунологически активную фракцию, извлеченную из корьі ОціМа|да Заропагіа Моїїпа, такую как 0521, и стерин.

Иммунологически активнье фракции сапонина, имеющие активирующую добавку, извлеченнье из корь южно-американского дерева Оціафїа Заропагіа Моїїпа, известньь специалистам в соответствующей области.

Например, 0521, также известная как ОА21, очищенная при помощи жидкостной хроматографии вьісокого 70 давления (Нріс) фракция из дерева Оціїа)да Заропагіа Моїїпа, и способ ее извлечения, раскрьта (как ОА21) в

США, патент Мо5,057,540. СціШаїа сапонин также раскрьт Скоттом (зЗсоїї еї аї, Іпї. Агов. АПегду Аррі Іттип., 1985, 77, 409). Однако, использование 0521, как активирующей добавки, ассоциировалось с определенньім вредом. Например, когда 0521 вводили животньмм в виде свободньїх молекул, наблюдался некроз (песговів), т.е. локальное отмирание ткани в месте иньекции. 19 Как оказалось, некроза в месте иньекциийи можно избежать, если использовать рецептурьі), содержащие комбинацию 002521 и стерина. Предпочтение отдавалось стеринам, которье включали Др-ситостерин, стигмастерин, зргостерин, зргокальциферол и холестерин. Зти стериньї хорошо известньії специалистам соответствующей области, например, холестерин обнаружен (Мегок Іпаех, 11 Едп., раде 341) в жире животньх, как естественно появляющийся стерин. 720 Вследствие зтого, в качестве первой характерной особенности настоящего изобретения предусматривается композиция вакцин, содержащая антиген, иммунологически активную фракцию сапонина и стерин.

Предпочтительно композиции, согласно изобретению, содержат иммунологически активную фракцию сапонина в действительно чистом, беспримесном виде. Предпочтительно композиции, согласно изобретению, содержат 0521 в действительно чистом виде, т.е. 0521 является, по крайней мере на 9095 чистой, предпочтительно по см 25 крайней мере на 9595 чистой и более предпочтительно по крайней мере на 9895 чистой. Другие о иммунологически чистье фракции сапонина, пригоднье для композиций, согласно изобретению, включают

ОА17/20517. Композиции, согласно изобретению, содержащие 0521 и холестерин показьівают уменьшенную реактогенность вакциньі, в то время как в сравниваемь!х композициях, в которьїх холестерин отсутствовал, сч положительньй зффект сохранялся. В дополнение к зтому известно, что у 20521 понижается зффективность 30 при данньїх условиях, когда значение рН около 7 и вьіше. Дополнительноег прейимущество от настоящих (зе) композиций в том, что устойчивость 0521 в гидролизе, в котором в качестве посредника вьіступает основание, в - рецептурах, содержащих холестерин, повьішена.

Предпочтительнье композиции, согласно изобретению, ообразуют структуру липосомь! (Прозоте). «(0

Композиции, где стерин/иммунологически активная фракция сапонина образуют ІЗСОМ структуру, также ю 35 является особенностью данного изобретения.

Обьічно соотношение О521:стерин имеет порядок от 1:100 до 1:11, по весу. Предпочтительно присутствие избиьтка стерина, соотношение 0521:стерин должно, по крайней мере, иметь порядок 1:2, по весу. Для введения человеку обьічно в вакцине 0521 и стерин должнь! присутствовать в диапазоне приблизительно от 1мкг до « приблизительно 10Омкг, предпочтительно в диапазоне от 1Омкг до 5Омкг на дозу. з

Липосомьі, предпочтительно, содержат нейтральньй липид, например, фосфатидилхолин, которьй, с предпочтительно, не кристаллизуется при комнатной температуре, например, фосфатидилхолин яичного :з» желтка, фосфатидилхолин диолеоила или фосфатидилхолин дилаурила. Липосомь! могут также содержать заряженньй липид, которьій повьішает стабильность структурь! липосома-0О521 для липосом, составленньх из насьшщенньїх липидов. В зтих случаях количество заряженньїх липидов, предпочтительно, 1-2095, по весу, сл що найболее предпочтительно, 5-1096. Соотношение стерина и фосфолипиду 1-5095 (по молям), найболее предпочтительно, 20-25905. (22) Предпочтительно композиции, согласно изобретению, содержат МРІ. (3З-деацилированньій монофосфорил - липид А, известньій также как 30О-МРІ). З0О-МРІ. известен из Патента Великобританий В 2 220 211 (Риби), как смесь из 3-х типов Де-О-ацилированного монофосфорил липида А с 4, 5 или б ацилированньми цепочками и (65) 50 произведеньі на Риби Иммунохем, Монтана. Предпочтительней зтот вид отражен в заявке на Международньй

Кз Патент 92/116556.

Соответствующие композиции, согласно изобретению, в виде липосом, первоначально готовили без МРІ, а

МР". затем добавляли, предпочтительно частицами, размером 10Онм. Таким образом, МРІ. не содержит внутри пузьрьковую мембрану (известную как, внешняя МРІ). Композиции, где МРІ содержит внутри пузьірьковую мембрану (известную как, внутреняя МРІ) также составляют особенность данного изобретения. Антиген может (Ф) содержаться внутри пузьірьковой мембраньі или содержаться вне пузьірьковой мембраньі. Предпочтительнь

ГФ растворимье антигеньі, которье являются внешними и гидрофобнье вещества или липиднье антигень, содержащиеся внутри или вне мембрань.

Часто вакцинь, согласно изобретению, не требуют никаких специальньх носителе и могут бьть бо сформировань! в водяном или другом, фармацевтически пригодном, буфере. В некоторьїх случаях может бьть вьгодно, что вакциньі, согласно данному изобретению, будут, кроме того, содержать квасцьі или подань! в масляно-водной змульсий или другом подходящем растворителе, таком, как, например, липосомь!, микросферь или капсулированньсе частички антигена.

Предпочтительно рецептурьї вакциньі будут содержать антиген или антигенную композицию, способнье б5 вьізьівать реакцию иммунитета у людей или животньїх против возбудителей болезней. Антиген или антигеннье композиции, известнье специалистам соответствующей области, могут бьіть использовань! в композициях, согласно изобретению, включающих антигеньі! полисахарида, антиген или антигеннье композиции, вьіведеннье из НІМ-1 (таких как др120 или адр160), любого из вирусов иммунодефицита Фелине, вирусов герпеса людей или Животньх, таких как 9О или производньїх зтого или протеина Іттеадіа(е Еагіу, таких как ІСР27 из НБМ1 или

Н5М2, вируса цитомегалиий (особенно человеческого) (такого как 9В или производньїх зтого), вируса ветряной оспьі, опоясьвающего лишая (МагісеМйа 2о5іег мігив), (таких как орі, ПІ или ІІ), или из вируса гепатита, такого как вируса гепатита В, например, поверхностного антигена Гепатита В или производной зтого, вируса гепатита А, вируса гепатита С, вируса гепатита Е или из других вирусньїх возбудителей болезней, таких как 7/0 респираторного синцитиальюго вируса (например, протеинов НЗКМ Г и б или иммуногеннье фрагменть; раскрьть в Патенте США 5 Раїепі 5,149,650 или полипептидов химерика, содержащего иммуногеннье фрагментьі из протеинов НЗКМ Е и б, гликопротеина БО, раскрьтого в Патенте США 5 Раїепі 5,194,595), антигенов, извлеченньїх из штаммов менингита, таких как менингит А, В, С, пневмоний стрептококковой, вируса человеческой папилломь!і, вируса инфлюзнцьї, инфлюзнцьї Наеторпйиз В (НІіБ), Ерзівїп Ваїтг Мігиз (ЕВМ), или /5 извлеченнье из бактериальньх возбудителей болезней, таких как сальмонелла, нейссерия, боррелия (например, ОвзрА или О5рВ или производньсе их), или хламидия, или бордетелла, например, Р. 69, РТ и ЕНА, или извлеченньсе из паразитов, таких как симпласт или токсоплазма.

НОМ Гликопротеин Ю (90) или производнье зтого являются предпочтительной вакциной антигена. Он обнаружен на вирусной мембране, а также найден в цитоплазме инфицированньмх клеток (Еізепрего КК... еї аї; У ої Міо! 1980 35 428-435). Он содержит в себе 393 аминокислотьї, включая пептидную связь (зідпа! рерііде) и имеет молекулярньй вес приблизительно бОКО. Для всех НЗМ гликопротеийнов такая оболочка, вероятно, наийболее характерна (Сопеп еї а! у). Мігоюду 60 157-166). Іп мімо зто, как известно, играет центральную роль в присоединений вируса на мембранах клетки. Кроме того, гликопротеин ОО показан тем, что он способен извлекать нейтрализующие тела іп мімо и защищать животньїх от летального исхода. Усеченньій вид молекуль! с

ЗО, не имеющей в фиксированной зоне С окончания, может вьірабатьваться в клетках млекопитающих как растворимьй протеин, которьій зкспортируется в отстоявшуюся жидкость клетки данной культурьі. Такие і) растворимье формь! 90 предпочтительньі. Производство усеченньїх видов 90 описана в Европейском Патенте

ЕР 0 139 417. Предпочтительно 90 вьіводили из НЗМ-2. Реализацией настоящего изобретения является усеченньій НОМ-2 гликопротеин ЮО, состоящий из 308 аминокислот, которьій содержит в себе естественно с зо появляющийся гликопротеин из аминокислот с 1-0й по 306б-ую с добавлением аспарагина (Азрагадіпе) и глютамина (СіІшатіпе) на конце фиксированной зоньі С окончания усеченного протеина, лишенного своей о мембраньі. Зтот вид протеина включает пептидную связь, которая расщепляется для того, чтобь! вьіделить «- полностью растворимую 283 аминокислоту протеина из рецепиента клетки.

В качестве другой особенности настоящего изобретения поверхностньій антиген Гепатита В является ісе) з5 предпочтительньм антигеном вакцинь. ю

Использованное здесь вьіражение "поверхностньіїй антиген Гепатита В" или "НВзАд" включает любой НВзАд антиген или его фрагмент, показьвающие антигенность НВМ поверхностного антигена. Зто понимают следующим образом: в дополнение к последовательности из 226 аминокислот НВзАд антигена (смотри ТіоіІаіз еї аїЇ, Майшге, 317, 489 (1985) и ссьілки на него), НВзАд как здесь описьіваеєется, если зто требуется, содержит «

Всю или часть рге-5 последовательности, как описано в вьішеуказанньїх документах и в Европейском Патенте -- с ЕР-А- 0 278 940. В частности, НВзАд может содержать в себе полипептид, содержащий последовательность аминокислот, содержащих остатки 12-52, за которьіми следуют остатки 133-145, за которьіми, в свою очередь, ;» следуют остатки 175-400 І -протеина НВзАЯд, относительно серотипа аденовируса (ай зегоїуре) открьітой для чтения решетки вируса Гепатита В (зтот полипептид обозначают как І", смотри ЕР 0 414 374). НВзАд в рамках

Ннастоящего изобретения может также включать полипептид рге-ЗІ-ргев2-5, описанньій в Европейском Патенте с ЕР 0 198 474 (Епадоїгопісв), или закрьітье аналоги его, такие как описаньі в Европейском Патенте ЕР 0 304 578 (Мс СогтіскК апа допез). НВзАЯ, как здесь описано, может также относиться к мутантам, например, "исчезающий

Ме, мутант" (езсаре тишапі), описанньій в УУО 91/14703 или в заявке на Европейский Патент под номером ЕР 0 511 - 855 АЇ, особенно НВзАа, в котором происходит замена аминокислоть глицина (діусіпе) в позиции 145 на аргинин бо (агдіпіпе). о Обьічно НВзАд существует в виде частиц. Частиць! могут содержать в себе, например, один протеийн 5 или

Ге могут бьіть составньми частицами, например, (17,5), где І", определен вьіше, а З означает 5-протеин НВзгАа.

Указанная частица находится в особенной дрожжевой форме, которая вьіражена в дрожжах. изготовление 5-протеина поверхностного антигена Гепатита В хорошо документировано. Смотри, например, ов Напога ек а! (1983) іп Оемеїор.ВіоЇ.З(апдага 54, страница 125, Сгедд аї а! (1987) іп Віоіеснпоіоду, 95, страница 479, Европейские Патенть! ЕР 0 226 846, ЕР 0 299 108 и настоящий документ. (Ф, Рецептурьі в рамках настоящего изобретения могут также содержать антиопухолевьй антиген и ка использоваться для иммунотерапевтического лечения злокачественньїх опухолей.

Приготовление вакцинь! детально описано в Новьїх Направлениях и Разработках Вакцин, под редакцией во МоПег еї аії, Опімегейу Рагк Ргезв, Балтимор, Мериленд, США, 1978. Инкапсуляция в липосомь! описана, например, Фуллертоном, Патент США 4,235,877. Соединение протеинов в макромолекуль! раскрьто, например,

Ликхайтом, Патент США 4,372,945 и Армором и др., Патент США 4,474,757.

Количество протеийна в каждой дозе вакциньй вьбирается как количество, которое стимулирует иммунозащитную реакцию без существенньїх, вредньх побочньх зффектов в типичньх вакцинах. Зто б5 Количество может отличаться в зависимости от специфики используемого иммуногена и того, как он применяется. Обьчно ожидаєтся, что каждая доза вакциньі будет содержать 1-100Омкг протеийна,

предпочтительно 2-100мкг, найболее предпочтительно 4-40мкг. Оптимальное количество для части вакцин может бьть установлено с помощью стандартньх иссследований путем наблюдения за характерньми иммунньіми реакциями субьектов при поражений болезнью. После первоначальной вакцинации субьекть! могут получать один или несколько активаторов иммунизации адекватно промежутку времени.

Рецептурьї, согласно настоящего изобретения, могут с успехом использоваться как для профилактики, так и для терапии.

Соответственно, к тому же особенностью изобретения является то, что оно обеспечивает использование вакцинь), согласно изобретению, для лечения людей. Мзобретение обеспечивает способ лечения, /о заключающийся в назначений пациенту зффективного количества вакцинь, согласно настоящего изобретения.

В частности, изобретение обеспечиваєт лечение вирусной, бактериальной, паразитической инфекций и злокачественной опухоли путем назначения пациенту зффективного количества вакциньї, согласно настоящего изобретения.

Следующие примерь и даннье иллюстрируют изобретение.

Примерь! 1.1. Способ изготовления липосом :

Смесь липида (такого, как фосфатидилхолин из яичного желтка либо из синтетика) и холестерина в органическом растворителе сушат в вакууме (или, альтернативно, в потоке инертного газа). Водяной раствор (такой, как фосфат, содержащий солевой раствор) затем добавляют и сосуд встряхивают до тех пор, пока все липидь не будут в виде суспензии. Зта суспензия затем микропсевдоожижаєется (тісгоїйІціаізед| до тех пор пока размерь! липосомов не уменьшатся до 10Онм, а затем стерильно фильтруют сквозь 0.2мкм фильтр. Вьітеснение или разрушение клеточной взвеси ультразвуком может заменить зтот шаг.

Обьічно соотношение холестерин: фосфатидилхолин 1:4 (по весу), а водньій раствор добавляют, давая конечную концентрацию холестерина от 5 до 50мг/мл. Если МРІ. в органическом растворе добавляют к липиду в сч об Оорганическом растворе, конечнье липисомь! содержат МР. в мембране (упоминалось, как внутреняя МРІ).

Липосомьі имеют определенньй размер 1О00нм и упоминаются, как ЗОМ (для маленьких однослойньмх і) пузьірьков). Если зтот раствор повторно охладить и оттаять, то пузьірьки сплавятся в большие многослойнье структурьї (МІ М) размером колеблющиеся от 500нм до 15мкм. Липосомь! сами по себе стабильньі! длительное время и не имеют способности вьізьівать слияние клеток. с зо 1.2. Процедура рецептурь!: 521 в водном растворе добавляется к липосомам. Зта смесь добавляется затем к раствору антигена, і, которьїй может, если требуется, содержать МРІ в виде частиц размером 1ООнм. «- 1.3. Литическая активность 20521, сдерживающаяся линосомами, содержащими холестерин.

Когда 0521 добавляют к зритроцитам, они разрушают его, вьіделяя гемоглобин. Зта литическая активность ісе) з5 Может бьть таюке измерена используя липосомь, которье содержат холестерин в своей мембране и ю захваченньій флюоресцент, карбофлюоресцеин - как липосомьі, вбіделяют освобожденную краску и ее можно наблюдать с помощью флюоресцентной спектроскопии. Если флюоресцентнье липосомь! не содержат в своей мембране холестерин, то разрушение липосом не наблюдается. Если 20521 вьіращивается с липосомами, содержащими холестерин, до добавления ее к зритроцитам, то разрушение зритроцитов уменьшается в « зависимости от соотношения 0521 и холестерина. Если используется соотношение 1:1, то литическая з с активность не вьявляется. Если липосомь! не содержат холестерин, то подавление лизиса требует тьісячекратного избьстка фосфолипидов над 0521. ;» С помощью подобньїх захватов, точно использующих флюоресцентирующие липосомьі, можно измерить литическую активность. На графике, приведенном ниже, литическая активность 4мкг 0521, рассматриваемая с липосомами без содержания холестерина (мкг лецитина яичного желтка на мл) или содержащая холестерин с (мкг лецитина, 50Омкг холестерина на мл), бьіла измерена с помощью флюоресценции. (22) Сравненне ослаблення 0521 для липосом, содержащих или шк р Ач ща т несодержащих холестерин о 50 з 2 о) в я 2 800 сікблестерином я 5 5 600

Ф) 5 « т п 400 без холестерина вк - -- и --

Ж 200 і бо в, ка 0 мкл липосомМ б5

Даннье показьшвают, что 0521 соединяется специальньм способом с холестерином, вьізьмввая, таким образом, разрушение (клеток или флюоресцентньїх липосом). Если 0521 соединяется вначале с холестерином в липосомах, зто не является длительно лизирующим по отношению к клеткам или другим липосомам. Зто требует минимального соотношения 0.5:1 холестерин :9521 (по весу).

Холестерин не является растворимьм в водном растворе и не имеет формь! стабильной суспензии. В присуствий фосфолипидов холестерин находится внутри двухслойного (ріауег) фосфолипида и может иметь вид устойчивой суспензии из пузьірьков, назьиваемьх липосомами. Бьіли сделань попьїтки избежать необходимости добавлять к фосфолипидам растворимье производнье. РоїуохуеїпапуіІспоЇезіего! зерасайїе /о вВастворили в воде при бОмг/мл, однако даже избьток, порядка в 2000 раз, (по весу) не вьіявил снижения литической активности 0521. 1.4. Повниішение стабильности 0521 в липосомах, содержащих холестерин. 9521 очень чувствительна к гидролизу при значений рН вьіше 7. Например, график снизу показьваєет, что при рН равном 9 и температуре 37"С, 909о-ная 20521 гидролизуется в течении 16 часов. Если липосомь! /5 бодержащие холестерин, добавляют к 0521 в соотношений 2:1 (холестерин: 0521 по весу), при таких же условиях гидролиз 0521 не вьіявляется. Если соотношение 1:1, то 1095-ная 0521 расщепляется.

Вьгращиванне 20 мкг 0521 при наличие ЗУ, содержащего холестерин при рН равном 9, 16 часов, 372С 20,00 18.00 ; т 16.00 сч х о - 14.00 а 5 12.00 с зо я 10.00 г. со т 800 - о ев со

Я 4.00 ів) 2 , 2.00 0.00 « 47 5 1015..20.25. 30 35. 40 що ; » мкг присутствующего холестерина

Сделаем вьівод, что когда 0521 соединяется с липосомами, содержащими холестерин, становится намного с менее чувствительньім гидролиз, в котором в парентерально (минуя пищеварительньй тракт), следовательно, вакциньї, содержащая (521; сформированнье с рН, имеющим кислую реакцию, и сохраняемье при

Ме. температуре 4"С, содержат полезную композицию. С )использованием липосом можно преодолеть зто - требование. 1.5. Исследования реактогенности: о Мьішам вводили в большеберцовую мьшцу 5мкг 0521 (или дигитонина), добавленного для повьішения

Із количества липосом (вьіражая через мкг холестерина). Литическая активность вьіражаеєтся как зквивалент 0521, которьій означает, что количество 0521, требуемое, чтобь! достигнуть одинакового гемолиза, такое же как стандартное. 5Б Краснота, некроз и токсичность в месте иньекции оцененьії визуально после умерщвления мьішей. о ю 5 свапвиюютою | 00000010 воіновмихоліВЦМІ 011 був 00010116

Диутнин сю | 051

Рв 17111116 11 б5

Данньсе показьвают, что когда литическая активность устраняется при добавлениий липосом, содержащих холестерин, то ожидаемая токсичность 0521 также устраняется.

Данньсе показьвают, что когда литическая активность устраняется при добавлениий липосом, содержащих холестерин, то ожидаемая токсичность 0521 также устраняется. 1.6. Внутримьішечная реактогенность кролей

Числа в О.Л. дроляєми 00000 лов0жоввво/ ла й дроляєе? 00000016) 0068006

Хролиємез ово оме 80000489 дреляєея 00000082» 5

Мролятев 00000зоо 00 твж 0076

С оредняя 0 1зв6) 0005» тв | Среднежвадратичноє 1160) 00147570 4951 двеляев 00000056 л6ю| зво

Мролиємет ово вом вію 00000625 2 Мролиєщев Холестерите 51000000 0873| 0000503 дроляємее вовоме 50000510 66

Мролияємто 01062265

Средне 00000062 лов) 000б6 сч дв (Среднежвадратичнов 23816361 БІ о

ГЕ ЕЕН НИМ НЕ: НИ НЕННЯ ПЕ ЗА НОЯ

Мролиємеіо овотвомю виб; см зо Хролиємеіз олестеринв| 46403600 59 не

Мролиєметя Оу вже А 5м хроляєетв | 03) (ло70000 5800089 -

Средне 00000050 50008533 Ф (среднежвадратичнов | 28501173) 76

Іс)

Мролияємів 0000005ю0т6)0м5 «

Хролияєміт (ов омели 1 Хролиємеів олестериня| 24207000 ов З с Мролиємете воуовоме 82000006 г хроляєетю | п5 (382 102йо 0009

Средне 00000000ло7ловя0тт50 вот (Средне-вадратичноє 1751000) 63600122 (1692) 1 о

Мроляє 0003мюзв - дролиємео? Рв |в 55000005 с Мролияєммоз 00006006 43 хроляєем 0000 013е50000оБ 00 вм го Кролиємеоє| 01429 323163

Средне 00006000 438 Сов) ато ово3) (Средне-вадратичноє | 419 00) 155 (1396)) 210 (2369)

Данньсе показьівают, что добавление липосом, содержащих холестерин, к рецептуре значительно снижает о повьішение СРК (креатинфосфокиназа), вьізванного 50021. Поскольку повьішение СРК является показателем іме) мьшечного повреждения, то зто показьвает уменьшение мьішечного повреждения и подтверждается гистопатологией. 60 1.7. Связьівание комплекса липосома-0521 с квасцом. 0521 вьращивали с нейтральньми липосомами, содержащими избьток холестерина, а также радисактивньй холестерин, а затем вьіращивали с квасцом АКОН)З в РВ5. Поодиночке ни нейтральнье липосомьІ, ни 0521 не связьивались с квасцом в РВ5, но отрицательно заряженье липосомь!ї связьувались посредством 20521. Однако вместе 0521 и нейтральнье липосомь! связьіваются с квасцом. Надосадочная 65 жидкость не содержит ни 0521 (проведен тест огсіпої) ни радиактивньій холестерин.

Зто отражаєт тот факт, что 0521 связана с липосомами и, допускается связь комбинации липосома-(5821 с квасцом. Зто происходит вследствие отрицательного заряда, наложенного на липосомь! или вследствие зкспозиции гидрофобньїх областей на липосомьі. Результатьі также подразумевают, что 0О521НС вьіделяет холестерин из мембрань.

Зто отражает то, что композиции, согласно изобретению, могут бьіть использовань! в вакцинах на основе квасцов. 1.8 Сравнение липосомньїх О521/МРІ и свободньїх О521-МРІ для антител и стимуляции клеточного иммунитета (СМІ).

ЗИМ бьіла приготовлена при помощи вьітеснения (ЕМРС:спо!:МРІ. 20:5:1). 70 Для внешних МРІ. липосомь! готовили без МРІ, а МРІ. добавляли в виде частиц, размером 1ООнм. 0521 раньше добавляли к антигену.

Холестерин : 0521-5:1 (по весам).

МІМ формировали при помощи замораживания-размораживания (ігееге(йамжміпа) ЗОМ Зх до добавления антигена.

Для того, чтобьі захватить антиген, антиген одобавляли ок ЗОМ перед процедурой замораживания-размораживания, а 0521 добавляли после замораживания-размораживания. Инкапсуляция антигена -595 внутренего, 95956 внешнего. Мьішам (ваї!р/с для 90, В'ОВК для КТ55) дваждь! ввели вакцину в подушечку задней лапь. 90 является гликопротеином 0, извлеченньім из вируса простого герпеса. КТ585 является поверхностньім го антигеном гепатита В (НВзАо), генетически модифицированньій так, что содержит зпитоп, извлеченньій из

Ріазтодіїцт Таісірагит зрогогоїї. 15 дней после активации см о

МіМОБМРЦЮ; лю бе 0Т073 0 1ввот см 11111плв кою юю тою о е (Се) зв ю вомовт(месяю фло омт| 52019 « «о З - г» ни и НИ: о ПУ ие (Ге) Даннье показьівают, что при помощи ЗОМ/ОЗАМРІ(оуу легко индуцируются титрь антител, по крайней мере, з так хорошо, как при помощи О521-4МРІ,, в такой же мере включающая 12, которая служит иммунньім маркером для клетки, до тех пор пока ослаблена реактогенность 521. (4) 50 Дополнительнье результатьь из второго зксперимента, сравнивающие 00521 и 0521 при наличий

Кз холестерина (ЗМ) в мьішах (раїр/с) с НУ5 дО в качестве антигена, показань! ниже: 1 ютер маця о з вомсютмвссм бе |0000001000000001000)001 0 в воівмю зв 00000320 15666066; мов 70 (ово о вобме лова) вве 1484 Б 304665 в 1.9 Сравнение др120 плюс липосомнье МРІ/0521 со свободньімми МРІ/0521

Липосомьі -З0М, содержащие в мембране МРІ.

Реакция бьіла протестирована через две недели после первой иммунизации. б5

Рецептура Разрастание ПЕМ-д 12 5

Нг/мл пг/мл пг/мл | мешнавотнда 3 16726 158) во 404

После второй иммунизации:

Рецептура Разрастание ПЕМ-д 1/4 5

Нг/мл пг/мл пг/мл ю вОММРОЯВИтАя 02606 01350020 мешнавотнда | 16726 | во) о Боб

Даннье показьшают, что 0521, ассоциированная с холестерино-содержащими липосомами и МРІ, индуцирует реакцию ТПІ/ТНО, зквивалентно МРІ 0521. В зтом соотношении холестерина и 0521, в кроликах 75 2521 не является токсичной (Бу СРК).

Во втором зксперименте мьши (раІр/с) бьила иммунизированьй в подушечку задней лапьі с ор120 в присутствимй 00521 или 0521-50М, содержащих холестерин. Бьіла измерена цитотоксическая активность

Т-лимфоцитов в клетках селезенки. ня

М врі20 40521 25 І 20 сч 25 - ю 5525 5 :- - 15 Р815 о)

Ф ою « - с г 5 30 е со 0 ' РУЯІ5 БЕ -

Яр -й кі - ні і -- іс), з» в я 8 їй щі

Соотношение Зффектор:Обьект « 40 ші с врі20 4 0521 я 50 У . т " 60 45 50 -5- РВІ5 1

Ф я - Фа й м. 30 -Я-- РВІЗЯ ЕІ (95) -і

Пе 2 20. 0 (ФІ - -- . - - - т і-й р - І навела ний т "з аг че зе «ее в 8 8-2 та - бо Соотнощение Зффектор:Обьект 7

Зто демонстрирует, что 0521 одна индуцирует активность СТІ и, что 0521 в реакции липосом, содержащих холестерин, индуцирует активность СТІ, по крайней мере, так хорошо как или даже лучше, чем одна 0521. 65 2. Вакцинь 2.1. Рецептура НрзАд 17,5 частиц.

10 мкг НВзАд 17,5 частиц/на дозу вьращивали в течение 1 часа при комнатной температуре после встряхивания. Обьем регулируют использующейся для иньекции водой и раствором РВ5 и заканчивают с конечньім обьемом 70 мкл/на дозу с водньім раствором 0521 (1Омкг/на дозу). Значение рН сохраняют в пределах 70.5.

Сходнье рецептурь! могут бьіть приготовленьї, используя 1 и 5О0мкг НВзАд 17,5 и также, используя антиген

НВзАаЯ 5.

Зти рецептурь! могут бьїіть протестированьі с помощью замещающей терапевтической модели УУосасписк, используя антигеньі МУосдсписк НВМ как модель. 70 Модель УУосасписк ро 0521 (те. О521/холестерин или ослабленная 0521) может бьть протестирована с помощью терапевтической модели МУоодсписК, где животнье хронически инфицированьй вирусом. Специфическая вакцина вируса гепатита жосдсписК может бьіть добавлена смешанной с 0521, как таковой, или с БО с или без

МРІ и вводится животньім каждьй месяц на протяжении б месяцев. Зффективность вакцинь! может бьть /5 оценена через вирусную очистку ДНК (ОМА). 2.2. Модель Гвинейская Свинья 2.2.1. Профилактическая модель

Группьї из 12 самок гвинейской свиней Напіеу бьіли инфицировали, каждую, внутримьішечно в 0-ой день и 28-ой день с помощью следующей рецептурь!: 1-й зксперимент: 90 5мкг - 0521 50мкг - ЗОМ, содержащая 5Омкг холестерина 90 5мкг - 0521 100мкг - ЗОМ, содержащая 10Омкг холестерина 90 5мкг - 0521 50мкг - БОМ, содержащая 250мкг холестерина 90 5мкг - 9521 50мкг с 2-й зксперимент:

ОО бмкг о - МР 12.5мкг - 0521 12.5мкг - БОМ, содержащая 62.5мкг холестерина, или оставлень і) неинфицированньми.

Животньм пускают кровь на 14-ьій и 28-0й день после второй иммунизации и титрьї антител сьіворотки 9б-средства протестировали с помощью иммуноферментного твердофазного анализа. с

Животньм затем о внутривагинально ввели 10?ріш опрофильтрованного НОМ-2 М5. Их ежедневно осматривали, начиная с 4 по 12 день, для оценки первичньїх герпетических повреждений. Показания бьли о следующими: --

Вагинальнье повреждения: - кровотечение -0.5 о - краснота для одного или двух дней без кровотечения -0.5 ю - краснота и кровотечение в теченийи дня -1 - краснота без кровотечения в течении, по крайней мере, трех последних дней -1

Внешние герпетические пузьірьки (везикульі): « - « 4 маленьких пузьірьков - »Е 4 маленьких пузьірьков или один большой пузьірек, 4 »- 4 больших повреждений, 8 совмещающихся й с больших повреждений -16 ц - совмещающиеся большие повреждения на всей внешней поверхности гениталий - 32. "» Результать! показаньі в нижеприведенной таблице:

Профилактическая Модель (РгорпуїЇасіїс Моаеї)

Зксперимент 1 (холест. - ссьілка на БОМ, содержащую холестерин) 1 - поврежде-ний 95|повреждених 95 повреждених 95 КОС РІ" поврежде ния

Контроль Средняя | п

Фо з об ле ерюватвюмю 5о111100380000001000017000073193ж001во 6, " холест. 1/5 т вна НБН НЕННЯ НОСА Б) ПОН НБН холест. 1/1 ос внй ШИНИ ННІ НБН ПОНОЕСіННИ ПБЕБЖЯ

Ф) холест. 1/1 о) 2 Необработаннне! 25177710 177175 веб! БОЮ 9 во Зксперимент 2

Го тенннк ш повреж-дения

Ровій | Розі 9 УЗ

2 Необработаннье (00 слоо| сво 0016670010008330000000750000БВ7вО 00000015 10,

Показатели повреждений: нет повреждений (0), вагинальнье повреждения (0.5 или 1), внешние кожнье пузьрьки (2, 4, 8 или 16). "- Первичньй инфекционньй индекс - Сумма (Мах показатель і) х (96 заболевания), где і - 0,0.5,1,2,4,8 или 16

Таблица и график показьівают, что в профилактической моделе очень вьісокий уровень защить! против первичньїх заболеваний, как бьіло ввіявлено во время иммунизации при помощи д0 / МРІ. / 0521 / ЗОМ. Оба вида заболеваний как внешние повреждения так и тяжесть повреждений оказьіваются вьісоко ослабленньіми в 7170 группе животньїх, иммунизированньх при помощи дО / МРІ. / О521/50М. 2.2.2 Терапевтическая Модель

В терапевтической моделе самкам гвинейской свиньи Напіеу сначала введели 107 ріш профильтрованного

Н5БМ-2 М5. Животньх с герпетическими повреждениями затем случайнь!м образом распределили в 16 групп.

На 21 и 42 день, каждую из них иммунизировали при помощи следующей рецептурь!: 90 я- МРГ. 5Омкг ї- 90521 5Омкг - БОМ, содержащая 25Омкг холестерина, 90 ж- АТМОН)З - МРІ БЗОмкго- 00521 5Омкг о - БОМ, содержащая 25Омкг холестерина или оставили неинфицированньми.

За ними ежедневно наблюдали с 22 по 75 день для оценки повторного заболевания. Показания бьіли описань, как для профилактической модели. Результать! показань! в нижеприведенной таблице :

Терапевтическая Модель (Тнегареціїс Моаеї)

Ме РЕЦЕПТУРЬ относитель-но относитель-но относитель-но се контроля контроля контроля по емесовизо 000000100800яж0010т00 в 30мж 00

Лв Неинфлцированння 000001 1571600000030000018500010000-000013501000300 " Сумма повреждений отражает дни с 22-го по 75-й день после инфицирования. Ге " Общее время наблюдения за повторяющимися повреждениями животньх за период с 22-го по 75-й день после инфицирования. "їх Число повторений собьітий за период с 22-го по 75-й день после инфицирования. Одному собьтию предшествует и за ним следует день без со повреждений, которьій характеризуется, по крайней мере, двумя днями с зритемой (показательно-0,5) или одним днем с наружньім пузьірьком (показатель»-2). Иммунологическое лечение вьіполняли от 21 до 42 дней. ч:

Результать! показьівают, что хороший уровень защить! бьил также стимулирован при помощи инфекции со

НБЗМ-2. Иммунизация с 90/МРІ/О521/50М с квасцом или без него отмечает зффект на повторяющихся ю заболеваниях средней тяжести. Зто также незначительно ослабляет количество и продолжительность собьітий (Смотри Таблицу).

Claims

Формула винаходу ч -

с 1. Композиция вакциньї, содержащая антиген, 0521 и стерин, отличающаяся тем, что весовое соотношение :з» 0521 и стерина составляет от 1:1 до 1:100.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что весовое соотношение 0521 и стерина составляет от 1:1 до
1:5.
с З. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что весовое соотношение 0521 и стерина составляет 1:2. (2) 4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что стерином является холестерин.
- 5. Композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 3О-МРІ.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит носитель.
о 7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что носитель вьібран из группьї, включающей змульсий масла в Кз воде, квасцьї, микросферьї и инкапсулированньвєе частиць антигена.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген или антигенную композицию, производную любого человеческого вируса иммунодефицита, вируса иммунодефицита Фелине, вируса ветряной оспь, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, цитомегаловируса человека, гепатита А, В, С или Е, респираторно-синцитиального вируса, вируса человеческой (Ф) инфлюзнць, НІВ, вируса менингита, сальмонелль!, нейссерии, боррелии, хламидии, бордетелльі, плазмодия и ГІ токсоплазмьі!.
9. Композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген, во производньїй неоплазмьі!.
10. Композиция вакциньї, содержащая иммунологически активньій сапонин и стерин, отличающаяся тем, что активирующая комбинация дополнительно содержит носитель или ЗДе-о-ацилированньй монофосфолипид А (30-МРІ).
11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген или антигенную де Композицию, производную любого человеческого вируса иммунодефицита, вируса иммунодефицита Фелине, вируса ветряной оспьії, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, цитомегаловируса человека, гепатита А, В, С или Е, респираторно-синцитиального вируса, вируса человеческой инфлюзнцьї, НІБб, вируса менингита, сальмонелль, нейссерии, боррелии, хламидии, бордетелль, плазмодия и токсоплазмь.
12. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген, производньй Неоплазми!.
13. Композиция вакцинь, содержащая стерин, чистьій 20521 или чистьій 0517 в липосомной структуре.
14. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что 0521 и 0517 имеют, по меньшей мере, 95 95 чистоть.
15. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что 0521 и 0517 имеют, по меньшей мере, 98 95 чистоть.
16. Композиция по любому из пп. 13-15, отличающаяся тем, что она дополнительно включаєт 30О-МРІ, 7/0 содержащийся внутри мембрань! липосомь!.
17. Композиция по любому из пп. 13-16, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген или антигенную композицию, производную любого человеческого вируса иммунодефицита, вируса иммунодефицита Фелине, вируса ветряной оспь, вируса простого герпеса типа 1, вируса простого герпеса типа 2, цитомегаловируса человека, гепатита А, В, С или Е, респираторно-синцитиального вируса, вируса человеческой 7/5 инфлюзнць, Нір, вируса менингита, сальмонелль, нейссерии, боррелии, хламидии, бордетелль, плазмодия й токсоплазмь.
18. Композиция по любому из пп. 13-17, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антиген, производньїй неоплазмь.
19. Способ стабилизаций 0521 по отношению к гидролизу, вьізванному основанием, в котором проводят связьвание 2521 и стерина, содержащего липосомь!.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что стерином является холестерин.
21. Способ стабилизации 0521 по отношению к гидролизу, вьізванному основанием, в котором проводят связьівание 0521 и стерина в весовом соотношении от 1:1 до 1:100.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что стерином является холестерин. сч
23. Способ приготовления композиции вакцинь по п. ї, отличающийся тем, что готовят липидную щі 6) суспензию, содержащую стерин, затем полученную липидную суспензию микрофлюидируют до тех пор, пока размер липосом не уменьшится до 100 нм, и добавляют 2521. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних с зо Мікросхем", 2003, М 5, 15.05.2003. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. о «- (Се) І в)

- . и? 1 (о) - (95) Ко) іме) 60 б5