MX2008012651A

MX2008012651A - Procedimientos y composiciones para vacunacion de aves de corral.

Info

Publication number: MX2008012651A
Application number: MX2008012651A
Authority: MX
Inventors: Julius Tyczkowski; Vivian W Doelling; Rebecca M Poston; Cherilyn L Heggen-Peay; Alan P Avakian
Original assignee: Embrex Inc
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2009-03-06
Also published as: BRPI0710023A2; PT2004220E; KR20080108142A; RU2010136629A; AU2010212448B2; US20070243212A1; CN101460192A; EP2004220B1; RU2561673C2; US20100136049A1; RU2010136627A; EP2004220A2; KR20120042865A; AU2007245198A1; AU2010212449A1; US20100143403A1; RU2008138702A; AU2007245198B2; PL2004220T3; HUE027091T2

Abstract

La presente invención proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra especies de Clostridium en aves, para proteger a las aves de una infección producida por Clostridium y/o para proteger a las aves de trastornos relacionados, tales como enteritis necrótica. Los procedimientos se pueden practicar in ovo y/o después de la eclosión. La invención además proporciona composiciones y procedimientos para administrar una composición de esta invención in ovo directamente en el cuerpo del embrión.

Description

PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA VACUNACION DE AVES DE CORRAL REFERENCIA CRUZADA La presente solicitud reclama beneficio, bajo el 35 U.S.C. § 1 19(e) de la solicitud provisional de EE.UU N° 60/787,567, presentada el 30 de marzo de 2006, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para producir una respuesta inmunitaria en sujetos aviares liberando una composición inmunizante in ovo directamente en el embrión del sujeto aviar. La presente invención además proporciona composiciones inmunogénicas y procedimientos para producir una respuesta inmunitaria a especies de Clostridium en sujetos aviares para proteger a los sujetos aviares de una infección producida por Clostridium y para proteger a los sujetos aviares de trastornos relacionados, tales como enteritis necrótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La vacunación in ovo proporciona varias ventajas a la industria de las aves de corral sobre los procedimientos de control actuales y la posible vacunación posterior a la eclosión de las aves, incluidos la potencial liberación uniforme y automática, co-administración con otras vacunas in ovo, de modo que se reduce la manipulación del ave después de la eclosión y la disminución del uso de antibióticos. El descubrimiento de que ciertas vacunas (por ejemplo vacunas inactivadas o no replicantes) se pueden liberar en el cuerpo del embrión para provocar una respuesta inmunitaria fuerte (similar o mejor a la prevista cuando se vacunan las aves el día de la eclosión) permite el desarrollo de dispositivos automáticos que pueden dirigirse al cuerpo del embrión (evitando específicamente el líquido amniótico que rodea al cuerpo del embrión) durante la aplicación in ovo de tales vacunas. Además, conociendo que las vacunas inactivadas deberían administrarse preferentemente en el cuerpo del embrión permite desarrollar composiciones de vacunas que sean más compatibles con la inyección en el cuerpo del embrión. Antes de este descubrimiento no se habría sabido o revisto que la vacuna inactivadas necesita administrarse preferentemente en el cuerpo del embrión para provocar una respuesta inmunitaria fuerte. Por tanto, la presente invención es una mejora de la técnica, ya que proporciona un modo más eficaz de administrar vacunas inactivadas (muertas) in ovo. Antes de esta invención no se disponía de indicación alguna de que la administración de la vacuna inactivada a los líquidos embrionarios que rodean al embrión (líquido amniótico) fuera diferente de la administración de la vacuna inactivada al cuerpo del embrión. La presente invención demuestra que las vacunas inactívadas requieren administrarse in ovo al propio cuerpo del embrión en lugar de al los líquidos que rodean al cuerpo del embrión. Sabiendo que el cuerpo del embrión es una diana adecuada para una eficacia óptima permite el desarrollo de vacunas inactívadas y procedimientos de administración para la vía in ovo. La invención abarca la administración in ovo de composiciones inmunogénicas a aves de corral y a otras especies de ave. En consecuencia, la presente invención satisface una necesidad en la técnica de mejores composiciones inmunogénicas para la administración in ovo en el embrión y de procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria en aves, para proteger a las aves de las infecciones y/o la contaminación por patógenos aviares y de otros tipos, y para proteger a las aves de trastornos relacionados. Clostridium perfringens se asocia con varias enfermedades en aves de corral, principalmente con enteritis necrótica (C. perfringens de tipo A y de tipo C), aunque también se incluyen colangiohepatitis, celulitis, erosiones en la molleja e infecciones en la parte central. Aunque estas bacterias representan un componente de la flora intestinal normal, varios factores pueden predisponer a las aves al desarrollo de enfermedades. Entre estos factores se incluyan una dieta con niveles elevados de harina de pescado, trigo, cebada o centeno; una cama con un nivel elevado de humedad o exposición a coccidios. Clínicamente, entre los signos de enfermedad se suelen incluir diarrea, disminución del apetito, lesiones intestinales, depresión y mortalidad. Tradicionalmente, estas enfermedades se controlan con antibióticos en el pienso; no obstante el uso excesivo de antibióticos puede conducir al desarrollo de cepas de bacterias resistentes a antibióticos, Que suponen un riesgo considerable para la salud de los seres humanos y de los animales. Además, en ciertas jurisdicciones, el uso de antibióticos se desaconseja encarecidamente o incluso está prohibido. Otros procedimientos para combatir Clostridium incluyen una dieta que evite ingredientes que irriten la mucosa intestinal, por ejemplo una ración de maíz-soja; una cama con un bajo nivel de humedad que tenga material absorbente, tal como virutas de madera o cáscaras de arroz; el uso de un producto de exclusión competitivo para mantener un equilibrio saludable de la microflora intestinal, por ejemplo Primalac (Star-Labs/Forage Research, Inc., Clarksdale, MO), AVIGUARD™ (Bayer Corporation, Kansas City, MO) y BIO-MOS® (Alltech Inc., Nicholasville, KY); e intensa acidificación o desinfección del agua como prevención para minimizar las pérdidas durante un periodo de enfermedad. La vacunación se ha usado para controlar enfermedades producidas por clostridios en otras especies, incluidos ganado vacuno, ganado ovino, ganado caprino y ganado porcino. Para especies distintas a las aves de corral se han desarrollado dos tipos principales de vacunas contra C. perfringens: Toxoides (toxinas inactivadas) y vacuna bacterianas-toxoides (cultivos de bacterias inactivadas ["muertas"] y toxinas inactivadas). Las antitoxinas (anticuerpos específicos para la(s) toxina(s)) también se usan para la prevención y tratamiento de enfermedades producidas por clostridios en especies que no son aves de corral. En la medida de lo que conocen los inventores, no se han producido informes previos que describan la administración in ovo (es decir, en un huevo que contiene un embrión de ave en desarrollo) de una vacuna contra C. perfringens. El uso in ovo de las vacunas existentes con toxoide o con vacuna bacteriana-toxoide es incierto porque estas vacunas normalmente requieren el uso de adyuvantes, que pueden ser perjudiciales para el embrión, pueden inactivar las vacunas vivas contra otros organismos que normalmente se administran durante el periodo in ovo (p. ej., para vacunar contra la enfermedad de Marek) y/o pueden ser incompatibles con el equipo existente para la inyección in ovo. La vacunación in ovo contra C. perfringens proporciona varias ventajas a la industria de las aves de corral sobre los procedimientos de combatel actuales y la posible vacunación posterior a la eclosión de las aves, incluidos la potencial liberación uniforme y automática, co-administración con otras vacunas in ovo, de modo que se reduce la manipulación del ave después de la eclosión y la disminución del uso de antibióticos. En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de mejores composiciones inmunogénicas y procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra Clostridium en aves, para proteger a las aves de las infecciones producida por Clostridium y para proteger a las aves de trastornos relacionados tales como la enteritis necrótica.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En algunas modalidades, la presente invención proporciona un procedimiento para inmunizar un sujeto aviar contra un patógeno (p. ej. , un patógeno aviar o un patógeno no aviar portado por un ave), que comprende administrar in ovo durante el último cuarto de la incubación una dosis inmunizante eficaz de una composición que induce una respuesta inmunitaria contra el patógeno, en el que la composición inmunogénica se administra mediante inyección in ovo directamente en el cuerpo del embrión. En otras modalidades de la invención, la composición induce una respuesta inmunitaria para tratar y/o prevenir la infección y/o la contaminación del ave resultante de la exposición o el contacto con patógenos que causan los siguientes ejemplos no limitantes de enfermedades, infecciones y/o trastornos: coccidiosis, enfermedad de Marek, bursitis infecciosa, enfermedad de Newcastle, infección por la viruela aviar, infección por especies de Clostridium, gripe aviar, bronquitis infecciosa, infección por el virus de la anemia del pollo laringotraqueítis aviar, infección por metaneumovirus aviar, infección por reovirus aviar, infecciones por adenovirus aviar, infección por rotavirus, infección por astrovirus, hepatitis de cuerpos de inclusión, síndrome de caída de la puesta, infección por adenovirus, infección por Escherichia coli, infección por especies de Mycoplasma, infección por especies de Salmonella, infección por especies de Campyiobacter, infección por especies de Listeria, infección por especies de Haemophilus, infección por especies de Pasteurella y cualquier combinación de las mismas. En otras modalidades más de la invención, la composición puede comprender, estar constituida esencialmente por y/o estar constituida por un agente no replicante que induce una respuesta ¡nmunitaria contra un patógeno aviar y/o un patógeno que causa enfermedades transmitidas por los alimentos, tales como infección por especies de Salmonella, infección por especies de Campyiobacter, infección por especies de Listeria, infección por Escherichia coli, tal y como se conocen en la técnica. La presente invención además comprende procedimientos en los que se administra in ovo al embrión una dosis inmunizante eficaz de dos o más composiciones que inducen una respuesta inmunitaria contra el patógeno aviar, en los que las dos o más composiciones se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. También se proporcionan en la presente memoria descriptiva procedimientos en los que se administra in ovo una dosis inmunizante eficaz de dos o más composiciones que inducen una respuesta inmunitaria contra el patógeno aviar y al menos una composición se administra al embrión, en los que las dos o más composiciones se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. La presente invención proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra especies de Clostridium (p. ej. , Clostridium perfringens) en aves para proteger a las aves de una infección producida por Clostridium y/o para proteger a los sujetos aviares de trastornos relacionados, tales como enteritis necrótica. Los procedimientos se pueden practicar in ovo y/o después de la eclosión. La presente invención además proporciona composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmunitaria contra especies de Clostridium en aves, para proteger a las aves de infecciones producidas por Clostridium y de trastornos relacionados, tales como enteritis necrótica. En consecuencia, como un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de inmunización de un sujeto aviar (p. ej. , un pollo) contra la enteritis necrótica, que comprende administrar in ovo (p. ej. , d urante el último cuarto de la incubación) una dosis inmunizante eficaz de una composición inmunogénica que induce una respuesta inmunitaria contra Clostridium perfringens, en el que la composición inmunogénica se administra mediante inyección in ovo. En ciertas formas de modalidad, la composición inmunogénica se administra en el amnios o en el embrión. El procedimiento se puede practica opcionalmente en combinación con otros regímenes de inmunización (p. ej. , vacunación contra la bursitis infecciosa, la enfermedad de Marek, la enfermedad de Newcastle y/o la coccidiosis) y/p la alimentación in ovo con una formulación de nutrientes y/o modulador entérico.

Como otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una dosis inmunizante eficaz de una especie atenuada de Clostridium en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas formas de modalidad, la composición inmunogénica además comprende un adyuvante que puede ser, por ejemplo, un adyuvante de liberación prolongada. Entre los adyuvantes representativos de esta invención se incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio, o alganmulín, y/o también puede ser una sal o geles minerales de calcio, magnesio, hierro y/o cinc, y/o puede ser una suspensión insoluble de tirosina adiada, o azúcares adiados, polisacáridos catiónica o amónicamente derivados, o polifosfacenos, y/o saponinas tales como Quil-A y/o emulsiones oleosas, tales como de agua en aceite y de agua en aceite en agua y/o de Freund completas o incompletas, o cualquier combinación de los mismos. En formas de modalidad representativas, la composición inmunogénica comprende una emulsión de agua en aceite en agua. Opcionalmente, la composición inmunogénica puede comprender además uno o más agentes adicionales que inducen una respuesta inmunitaria contra otros patógenos aviares (p. ej., un agente que induce una respuesta inmunitaria contra Eimeria, el virus de la bursitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek y/o el virus de la enfermedad de Newcastle) y/o u na formulación de nutrientes y/o un modulador entérico. El uno o más agentes adicionales pueden ser agentes inmunizantes que producen una respuesta inmunitaria protectora contra Eimeria, el virus de la bursitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek y/o el virus de la enfermedad de Newcastle. Como otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable: (a) una dosis inmunizante eficaz de un toxoide de Clostridium, u na vacuna bacteriana de Clostridium, una toxina de Clostridium o cualquier combinación de los anteriores; y (b) una dosis inmunizante eficaz de una vacuna contra la coccidiosis, una vacuna contra la enfermedad de Marek, una vacuna contra la bursitis infecciosa, una vacuna contra la enfermedad de Newcastle, una vacuna contra la viruela aviar, o cualquier combinación de los anteriores. La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable: (a) una dosis inmunizante eficaz de un toxoide de Clostridium, u na vacuna bacteriana de Clostridium, una toxina de Clostridium o cualquier combinación de los anteriores; y (b) una emulsión oleosa. Como otro aspecto más, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende en un vehículo farmacéuticamente aceptable: (a) una dosis inmunizante eficaz de un toxoide de Clostridium, u na vacuna bacteriana de Clostridium, una toxina de Clostridium o cualquier combinación de los anteriores; y (b) un adyuvante que comprende un adyuvante derivado de aluminio, una saponina, un aceite o cualquier combinación de los anteriores. En otras formas de modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento de inmunización de un sujeto aviar contra la infección por una especie de Clostridium, que comprende administrar al sujeto aviar una dosis inmunizante eficaz de una composición vacuna bacteriana-toxoide de Clostridium mediante inyección in ovo durante el último cuarto de la incubación. En algunas formas de modalidad de la invención, la especie de Clostridium puede ser Clostridium perfringens. La presente invención también proporciona un procedimiento de inmunización de un sujeto aviar contra la infección por una especie de Clostridium, que comprende administrar al sujeto aviar una dosis inmunizante eficaz de una toxina recombinante o de un fragmento inmunogénico de la misma de una especie de Clostridium mediante inyección in ovo durante el último cuarto de la incubación. En algunas formas de modalidad de la invención, la toxina recombinante o un fragmento inmunogénico de la misma es una toxina de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico de la misma. Estos y otros aspectos de la invención se exponen con más detalle en la descripción de la invención, más adelante.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ciertos aspectos de la presente invención se basan en el descubrimiento inesperado de que ciertas composiciones antigénicas o ¡nmunogénicas permiten una respuesta inmunitaria más eficaz en aves cuando la composición se administra in ovo directamente en el cuerpo del embrión. Por tanto, en una forma de modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento de inmunización de un sujeto aviar contra un patógeno, que puede ser un patógeno aviar y/o un patógeno no aviar portado por un sujeto aviar (p. ej., un patógeno de transmisión por alimentos para humanos), que comprende administrar in ovo durante el último cuarto de la incubación, una dosis inmunizante eficaz de una composición que induce una respuesta inmunitaria contra el patógeno aviar, en el que la composición inmunogénica se administra mediante inyección in ovo directamente en el cuerpo del embrión. En los procedimientos de esta invención, la composición puede administrarse directamente en el tejido de músculo esquelético en el embrión y el tejido de músculo esquelético puede ser, entre otros, tejido de músculo de pechuga y tejido de músculo para la eclosión. En otras formas de modalidad, la composición se puede administrar directamente en el embrión en la cabeza, cuello, hombro, ala, dorso, pechuga, pata o cualquier combinación de los mismos. Además, en los procedimientos de esta invención, la composición se puede administrar por vía subcutánea en el cuerpo del embrión. En otras formas de modalidad, la composición se puede administrar por vía subcutánea en la cabeza, el cuello, el hombro, las alas, el dorso, las patas o cualquier combinación de los mismos. Cualquier vía de administración en el embrión es adecuada para emplear los procedimientos de esta invención. Por ejemplo, la composición se puede administrar en el embrión por vía subcutánea, ¡ntradérmica, intravenosa, intramuscular, intraabdominal o cualquier combinación de los mismos. El sujeto aviar de esta invención puede ser cualquier ave y, en ciertas formas de modalidad, el sujeto puede ser un pollo, pavo, pato, ganso, faisán, codorniz, perdiz, guinea, avestruz, emú o pavo real, así como cualquier otra ave procesada comercialmente y/o cualquier ave a cuyos huevos se pueda acceder para manipular en los procedimientos de esta invención. En las formas de modalidad en las que el sujeto es un pollo, es deseable administrar la composición de esta invención in ovo durante el periodo desde el día 15 hasta el día 20 de incubación, y en formas de modalidad concretas la composición se puede administrar el día 18 o el día 19 de la incubación. Cuando el sujeto es un pavo, la composición de esta invención se puede administrar durante el periodo desde el día 21 hasta el día 28 de la incubación y en formas de modalidad concretas las composiciones se pueden administrar el día 24 o el día 25 de la incubación. En otras formas de modalidad, en las que el sujeto es un ganso, la composición de esta invención se puede administrar durante el periodo desde el día 23 hasta el día 31 de la incubación y en formas de modalidad concretas las composiciones se pueden administrar el día 28 o el día 29 de la incubación. En otras formas de modalidad, en las que el sujeto es un pato , la composición de esta invención se puede administrar durante el periodo desde el día 21 hasta el día 28 de la incubación y en formas de modalidad concretas las composiciones se pueden administrar el d ía 25 o el día 26 de la incubación. Para otras especies de aves, el último cuarto de la incubación y, por tanto, el intervalo óptimo de días para la administración in ovo de una composición de esta invención se puede determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un pato criollo tiene u n periodo de incubación en el intervalo de 33-35 días, un faisán de cuello anular tiene un periodo de incubación en el intervalo de 23-24 días, una codorniz japonesa tiene un periodo de incubación en el intervalo de 17-18 d ías, una codorniz de Virginia tiene un periodo de incubación de 23 días, una perdiz Chukar tiene un periodo de incubación de 22-23 días, una gallina de Guinea tiene un periodo de incubación de 26-28 días y un pavo real tiene un periodo de incubación de 28 días. En formas de modalidad concretas de esta invención, la composición puede comprender, estar constituida esencialmente por y/o estar constituido por, una composición inmunogéníca y un adyuvante. Ejemplos no limitantes de adyuvantes de esta invención incluyen un adyuvante derivado de aluminio, una saponina, geles minerales, polianiones, polioles plurónicos, derivados de saponina, lisolecitina y otras sustancias similares de superficie activa, glicósidos, todos tipos de aceites y cualquier combinación de los mismos. En formas de modalidad concretas de esta invención, la composición puede comprender una emulsión de agua en aceite en agua. Como se contempla en la presente memoria descriptiva, en algunas formas de modalidad de la presente invención, la composición de esta invención puede comprender un adyuvante, que en formas de modalidad concretas, puede ser un adyuvante tal como un adyuvante derivado de aluminio (p. ej. , hidróxido de aluminio), una saponina (p. ej., Quil-A, incluido QuilA QS21 ) o un aceite (tal como adyuvante completo o incompleto de Freund), en cualquier combinación. Otros ejemplos no limitantes de un adyuvante de esta invención incluyen sales minerales (p. ej. , hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato cálcico), emulsiones oleosas y formulaciones con base de tensioactivo (p. ej., adyuvantes de aceite emulsionado de Freund; Arlacel A; aceite mineral; adyuvante de aceite de cacahuete emulsionado (adyuvante 65); MF59 (emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidizado); QS21 (saponina purificada); AS02 [SBAS2] (aceite en agua + MPL + QS21 ); Montanide ISA-51 ; ISA-720 (emulsión de agua en aceite estabilizada), productos bacterianos y derivados [p. ej. , Bordetella pertussis; componente P40 derivado de Corynebacterium granulosum; lipopolisacárido (adyuvante para la inmunidad tanto humoral como mediada por células); Mycobacterium y sus componentes (MDP, no adyuvantes aceptables en seres humanos); toxina del cólera (adyuvante mucoso)], derivados microbianos (naturales y sintéticos) [p. ej. , lípido A monofosforilo (MPL); Detox (MPL + esqueleto de la pared celular de M. phlei); AGP [RC-529] (monosacárido acilado sintético); DC-Chol (¡nmunoestimuladores lipoidales capaces de autoorganizarse en liposomas); OM-174 (derivado de lípido A); motivos CpG (oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG ¡nmunoestimuladores); TL y TC modificadas (toxinas bacterianas modificadas genéticamente para proporcionar efectos adyuvantes no tóxicos)], inmunomoduladores endógenos de pollo [citocinas; anticuerpos; hGM-CSF o hlL-12 (citocinas que se pueden administrar como proteínas o codificadas en plásmidos); Immudaptin (matriz en tándem C3d); Squalene], adyuvantes particulados [virosomas (vehículos liposomales unilamelares que incorporan antígeno); AS04 ([SBAS4] sal de Al con MPL); ISCOM (complejo estructurado de saponinas y lípidos); coglicólido de poliláctido (PLG) y vehículos inertes (partículas de oro; partículas de plata). Adyuvantes adicionales de esta invención pueden incluir geles minerales, polianiones, polioles plurónicos, derivados de saponina, lisolecitina y otras sustancias similares de superficie activa. Otros adyuvantes pueden incluir agonistas del receptor de tipo peaje (TLR), incluidos, por ejemplo, agonistas del TLR-1 (p. ej. , lipopéptidos de tri-acílo); agonistas de TLR-2 [p. ej. , peptidoglucano de bacterias grampositivas como estreptococos y estafilococos; ácido lipoteicoico]; agonistas de TLR-3 (p. ej. , ARN bicatenario y sus análogos, tales como poli 1 :C); agonistas de TLR-4 [p. ej., lipopolisacárído (endotoxina) de bacterias gramnegativas como Salmonella y E. col¡]; agonistas de TLR-5 (p. ej. , flagelina de bacterias móviles como Listeria); agonistas de TLR-6 [p. ej. , con peptidoglicano de TLR-2 y ciertos lípidos (l'ipopéptidos de diacilo)]; agonistas de TLR-7 [p. ej. , genomas de ARN bicatenario (ARNss) de virus tales como gripe, sarampión y paperas; y moléculas antivirales pequeñas sintéticas de base guanosina como loxoribina y ARNss y sus análogos]; agonistas de TLR-8 (p. ej. , de unión a ARNss); agonistas de TLR-9 (p. ej. , CpG no metilado del ADN del patógeno y sus análogos; agonistas de TLR-10 (función no definida) y TLR-1 1 (p. ej. , proteínas de unión expresadas por varios protozoos infecciosos (Apicomplexa). Los pollos tienen un sistema de TLR bien desarrollad con aproximadamente 10 TLR muy similares a los detectados en mamíferos. Más ejemplos de adyuvantes de esta invención incluyen receptores del complemento (RRP secretados), en los que C3d (componente del complemento) se activa mediante CHO microbiana. La vía del complemento condice a la opsonización del patógeno y a la rápida fagocitosis. En otras formas de modalidad, un adyuvante de esta invención puede ser una secuencia de aminoácidos que es un péptido, un fragmento de proteína o una proteína entera que funciona como el adyuvante o el adyuvante puede ser un ácido nucleico que codifica un péptido, un fragmento de proteína o una proteína entera que funciona como el adyuvante. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "adyuvante" describe una sustancia q ue puede ser cualquier sustancia inmunomoduladora capaz de combinarse con la vacuna de polipéptido o de ácido nucleico para potenciar, mejorar o modular de otro modo una respuesta inmunitaria en un sujeto sin efectos nocivos sobre el sujeto. Un adyuvante de esta invención puede ser, entre otros, por ejemplo, una citocina inmunoestimuladora (incluidas, entre otras, GM/CSF, interleucina 2, interleucina 12, interferón gamma, interleucina 4, factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 1 , factor hematopoyético flt3L, CD40L, moléculas coestimuladoras B7.1 y moléculas coestimuladoras B7.2), SYNTEX formulación adyuvante 1 (SAF-1 ) compuesto por un 5 por ciento (p/vol) de escualeno (DASF, Parsippany NJ), 2.5 por ciento de Pluronic, polímero L121 (Aldrich Chemical, Milwaukee) y 0.2 por ciento de polisorbato (Tween 80, Sigma) en solución salina tamponada con fosfato. Entre los adyuvantes adecuados también se incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio o agannmulina, pero también puede ser una sal de calcio, hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónica o aniónicamente derivados o polifosfacenos. En la técnica se conoce bien otros adyuvantes e incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 1 1637, denominado nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilam¡na (CGP 19835A, denominado MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, lípido A monofosforilo, trehalosa dimicolato y esqueleto de pared celular (MPL + TDM + CWS) en emulsión al 2% de escualeno/Tween 80. Adyuvantes adicionales pueden incluir, por ejemplo, una combinación de lípido A monofosforilo, preferentemente lípido A monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema de adyuvante potenciado implica la combinación de un lípido A monofosforilo y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL tal y como se describe en la publicación PCT número WO 94/001 53 (la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia), o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol tal y como se describe en la publicación PCT número WO 96/33739 (la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia). Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en la publicación PCT número WO 95/17210 (la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia). Las composiciones y procedimientos de la presente invención pueden emplearse para inducir una respuesta inmunitaria para tratar y/o prevenir enfermedades y trastornos tales como coccidiosis, enfermedad de Marek, bursitis infecciosa, enfermedad de Newcastle, viruela aviar, infección por especies de Clostridium (p. ej. , enteritis necrótica, dermatitis gangrenosa, colangiohepatitis, celulitis, enteritis ulcerosa, botulismo, enfermedad de Tyzzer), gripe aviar, , bronquitis infecciosa, infección por el virus de la anemia del pollo laringotraqueítis aviar, metaneumovirus aviar, infección por reovirus aviar, infecciones por adenovirus aviar, infección por rotavirus, infección por astrovirus, hepatitis de cuerpos de inclusión, síndrome de caída de la puesta, infección por adenovirus, infección por Escherichia coli, infección por especies de Mycoplasma, infección por especies de Salmonella, infección por especies de Campyiobacter, infección por especies de Listeria, infección por especies de Haemophilus, infección por especies de Pasteurella, infección por especies de Bordetella, especies de Staphylococcus, especies de Streptococcus, especies de Mycobacterium, especies de Erysipelothrix y cualquier combinación de las mismas. Por tanto, en ciertas formas de modalidad, la composición de esta invención puede comprender, consistir esencialmente y/o consistir, un antígeno o inmunógeno del virus de la enfermedad de Marek, virus de la bronquitis infecciosa, especies de Mycoplasma, virus de la leucosis aviar, reovirus, poxvirus, adenovirus, criptosporidium, virus de la anemia infecciosa aviar, especies de Pasteurella, virus de la gripe aviar, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la bursitis infecciosa (IBDV), virus del sarcoma de Rous, Escherichia coli, especies de Eimeria tales como Eimeria tenella (causante de coccidiosis), especies de Haemophilus, Mycoplasma, especies de Listeria, especies de Salmonella, especies de Campyiobacter, especies de Clostridium (p. ej., C. perfringens, C. septicum, C. sordellii, C. difficile, C. novyi, C. botulinum, C. colinum, C. chauvoei, C. fallax, C. sporogenes y C. piliforme) y cualquier combinación de los mismos.

Con la presente invención se pretende abarcar procedimientos y composiciones para inmunizar aves contra patógenos, que pueden ser patógenos que causan enfermedad en aves y/o patógenos portados por aves (aves contaminadas) y que se transmiten a seres humanos y a otros animales que manipulan o comen tales aves contaminadas. Por tanto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden, consisten esencialmente y/o consisten, un agente no replicante que induce una respuesta inmunitaria contra un patógeno aviar y/o contra un patógeno que causa enfermedades en otros animales por contacto o ingestión de huevos o carne u otras partes del cuerpo de un ave contaminada. Tales patógenos pueden incluir, entre otros, especies de Salmonella, especies de Campylobacter, Listeria, Escherichia coli, especies de Erysipelothrix, especies de Mycobacterium, especies de Clostrídium, etc. En algunas formas de modalidad, los procedimientos de la invención descritos en la presente memoria descriptiva pueden además comprender la etapa de administrar una dosis de refuerzo de la composición de esta invención al sujeto aviar tras la eclosión. En otras formas de modalidad de los procedimientos de esta invención, una dosis inmunizante eficaz de dos o más composiciones que induce una respuesta inmunitaria contra el patógeno aviar se administra in ovo al embrión, en la que las dos o más composiciones se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. Por tanto, las composiciones y procedimientos de esta invención se pueden emplear usando aparatos y tecnología que comprende administrar múltiples composiciones en un único punto, múltiples composiciones en múltiples puntos y/o una única composición en múltiples puntos. Tales procedimientos pueden emplear un único punto de entrada en el huevo o múltiples puntos de entrada en el huevo. En la patente de EE.UU. n° 4,903,635, la patente de EE.UU. n° 5, 136,979, la patente de EE.UU. n° RE 35,973, la patente de EE.UU. n° 5,339,766, la patente de EE.UU. n° 6,032,612, la patente de EE.UU. n° 6,286,455, la patente de EE.UU. n° 5, 158,038, la patente de EE.UU. n° 6,601 ,534 y la patente de EE.UU. n° 6,981 ,470, la totalidad de cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia, se describen ejemplos no limitantes de tales aparatos y tecnología. También se incluyen en la presente memoria descriptiva procedimientos en los que se administran in ovo una dosis inmunizante eficaz de dos o más composiciones que inducen una respuesta inmunitaria contra el patógeno aviar, y al menos una composición se administra al embrión, en los que las dos o más composiciones se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. En algunas formas de modalidad de estos procedimientos, al menos una composición se puede administrar en el amnios, que incluye el líquido amniótico, el cuerpo del embrión y el saco vitelino y/o al menos una composición se puede administrar directamente en el líquido amniótico, el cuerpo del embrión y/o el saco vitelino, individualmente o en cualquier combinación. En algunas formas de modalidad de esta invención, los procedimientos pueden además comprender administrar in ovo un estimulante inmunitario en cualquier momento durante la incubación, en los que el estimulante inmunitario y la composición se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. Los procedimientos de esta invención pueden también comprender administrar in ovo una formulación nutriente, un modulador entérico, o una combinación de los mismos, en cualquier momento durante la incubación, en los que la formulación nutriente, el modulador entérico o una combinación de los mismos y la composición se administran de forma simultánea o secuencial en cualquier orden. Existen varios aspectos del desarrollo del embrión aviar que hacen del embrión una atractiva diana para la inmunización. En primer lugar, dado que el mayor periodo del desarrollo embrionario se produce en el huevo fuera del tracto reproductivo materno, se puede acceder fácilmente al embrión para la introducción de composiciones tales como las composiciones inmunogénicas de esta invención. En segundo lugar, el hecho de que el huevo es una unidad de múltiples compartimentos se puede explotar para administrar materiales biológicos en puntos específicos del embrión. Por ejemplo, el saco vitelino en el embrión temprano funciona para fabricar sangre. Inmediatamente antes de la eclosión, el saco vitelino realiza una función principalmente nutritiva y en parte pasa al tracto intestinal y de este modo se transporta a las bolsas cecales durante y después de la eclosión. Por tanto, la administración de materiales en el saco vitelino puede conducir a una liberación del sistema vascular o cecal embrionario. Además, la administración de una composición de esta invención se puede llevar a cabo con eficacia mediante inyección en la membrana corio-alantoidea o en la membrana celular aérea. Por último, el acceso al compartimento de la musculatura embrionaria se puede conseguir mediante inyección directa en el embrión en la transferencia en el último cuarto de la incubación, y en pollos esto se lleva a cabo normalmente desde el d ía 17 hasta el día 1 9 de la incubación. La composición inmunogénica se puede introducir en cualquier región del huevo, incluida la célula aérea, albumen, la membrana coro-alantoidea, el saco vitelino, la yema, el alantoides, el amnios, o directamente en el ave embrionaria. En una forma de modalidad concreta de la invención, la composición se introduce en tejido muscular del ave embrionaria, y en otras formas de modalidad la composición se introduce en tejido muscular esquelético. En ciertas formas de modalidad se puede usar la introducción de u na molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que permanece en el interior de la células muscular para administrar una proteína inmunogénica d irecta y específicamente en células musculares. Como alternativa, se puede introducir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que se secretará desde la célula muscular y este procedimiento se puede usar para administrar una proteína a todo el cuerpo del ave a través del contacto entre el tejido muscular y el plasma. Ejemplos de puntos de introducción de tejido muscular son tejido de músculo de pechuga y de músculo de eclosión, que se localizan cerca de la cáscara del huevo y, por tanto, son relativamente fáciles de alcanzar mediante un aparato de inyección sin producir daños a otras estructuras embrionarias. Se puede usar cualquier medio adecuado para introducir la composición de esta invención in ovo, incluidos inyección in ovo, rociado de alta presión a través de la cascara del huevo y bombardeo balístico del huevo con micropartículas vehículoas de la composición. En algunas formas de modalidad, la composición se administra mediante depósito de una solución acuosa farmacéuticamente aceptable en el músculo, solución que contiene la composición a depositar. Cuando se usa la inyección in ovo, el mecanismo de la inyección no es crucial, pero se prefiere que el procedimiento no dañe innecesariamente los tejidos y órganos del embrión o las membranas extraembrionarias que lo rodean de modo que el tratamiento no disminuya el índice de eclosión. Los puntos de inyección preferidos son intramuscular y subcutáneo. Los puntos de inyección en el tejido muscular preferidos son músculo esquelético y, más particularmente, el tejido muscular de pechuga y el tejido muscular de eclosión, que se localizan cerca de la cáscara del huevo y, por tanto, son relativamente fáciles de alcanzar mediante el aparato de inyección sin dañar las demás estructuras embrionarias y sin comprometer la protección conferida por la cáscara del huevo. Una jeringuilla provista de una aguja de aproximadamente 1 .2 a 0.45 mm es adecuada para el fin. Dependiendo de la etapa precisa de desarrollo y de la posición del embrión, una aguja de 1 .9 a 1 0 cm llegará hasta el líquido encima del polluelo o hasta el propio polluelo.

Se puede perforar o hacer un orificio a través de la cáscara antes de insertar la aguja para prevenir el daño o el deslustrado de la aguja. Si se desea, el huevo se puede sellar con un material de sellado sustancialmente impermeable a las bacterias tales como cera o similares para prevenir la posterior entrada de bacterias no deseadas. En varias formas de modalidad de esta invención, la composición se administra al cuerpo del embrión en una aguja con una longitud de aproximadamente 1 .9 a aproximadamente 10 cm (p. ej., 2.54 cm, 3.2 cm, 4.5 cm, 5 cm, 6.4 cm, 7 cm, 7.6 cm, 8.3 cm, 8.9 cm, 9.5 cm ó 10 cm). Además, una aguja de esta invención puede tener un diámetro variable de 15 g a 28 g (p. ej., 1 .83 mm (15 g), 1 .63 mm (16 g), 1 .42 mm (17 g), 1 .21 mm (18 g), 1 .01 mm (19 g), 0.91 mm (20 g), 0.81 mm (21 g), 0.71 mm (22 g), 0.61 mm (23 g), 0.55 mm (24 g), 0.5 mm (25 g), 0.46 mm (26 g), 0.42 mm (27 g) ó 0.38 mm (28 g). En algunas formas de modalidad, la aguja puede tener un extremo romo y en algunas formas de modalidad la aguja puede tener un extremo biselado con un ángulo de bisel de aproximadamente 10° a aproximadamente 45° (p. ej., 1 1°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16° 17°, 18°, 19°, 20°, 21°, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 37°, 38°, 39°, 40°, 41°, 42°, 43°, 44° o 45°). En formas de modalidad concretas de esta invención, en los procedimientos de administrar una composición de esta invención in ovo, la aguja puede pasar a través de la cáscara por el extremo grande de un huevo a un ángulo de desplazamiento de aproximadamente 1o a aproximadamente 20° (p. ej. , 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 1 1°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 1 8°, 19° ó 20°) desde el eje largo del huevo. La presente invención también proporciona procedimientos en los que la composición de esta invención se administra in ovo con un dispositivo de inyección automático. Se ha previsto que un sistema de inyección automática de alta velocidad para embriones aviares sea particularmente adecuado para practicar la presente invención. Se dispone de numerosos de estos dispositivos, de los cuales son ejemplos el sistema EMBREX INOVOJECT™ (descrito en la patente de EE.UU. N° 4,681 ,063 concedida a Hebrank), y las patentes de EE.UU. n° 4,040,388, 4,469,047 y 4,593,646 concedidas a Miller. La descripción de estas referencias y todas las referencias citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Todos estos dispositivos, adaptados para practicar la presente invención, comprenden un inyector que contiene el ADN tal y como se describe en la presente memoria descriptiva, con el inyector colocado para inyectar en un huevo portado por el apartado con el ADN. Además, se puede proporcionar una aparato para sellar asociado de forma operativa al aparato de inyección para sellar el orificio en el huevo después de la inyección del mismo. El aparato actualmente preferido para practicar la presente invención se describe en la patente de EE.UU. N° 4,681 ,063 concedida a Hebrank y la de EE.UU . N° 4,903,625 concedida a Hebrank, cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia. Este dispositivo comprende un aparato de inyección para administrar sustancias líquidas en una pluralidad de huevos y un aparato de succión que simultáneamente engancha y sube una pluralidad de huevos individuales desde sus porciones colocadas hacia arriba y coopera con el inyector para inyectar en los huevos mientras los huevos son enganchados por el aparato de succión. Las características de este aparato pueden combinarse con las características del aparato descrito en lo que antecede para practicar la presente invención. Los expertos en la técnica apreciarán que este dispositivo se puede adaptar para la inyección en cualquier porción del huevo ajustando la profundidad de penetración del inyector, tal y como se trata con mayor detalle más adelante. En la patente de EE.UU. N° 6,032,612 (aparato de inyección in ovo de múltiples puntos), la patente de EE.UU. N° 6,244,214 (aparato para la inyección in ovo y detección de información sobre el interior del huevo), las patentes de EE.UU. n° 6, 176, 199, 6,510,81 1 y 6,834,615 (procedimientos para localizar líquido alantoideo en un huevo, la patente de EE.UU. 7,089,879 (procedimientos para manipular células aéreas dentro de los huevos de ave) y la patente de EE.UU. 7, 165,507 (procedimientos y aparato para colocar con precisión un dispositivo dentro de la cavidad subterminal de un huevo), cuyos contenidos íntegros de cada una se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia, se describen formas de modalidad de un procedimiento y un aparato de inyección que se puede emplear en la presente invención. Por tanto, en algunas formas de modalidad, el procedimiento y aparato se describe esencialmente en una o más de las patentes indicadas en lo que antecede e implica la colocación de un inyector de elongación o aguja de inyección en el extremo más grande del huevo a un ángulo de desplazamiento (A) desde el eje largo de dicho huevo, de modo que el ángulo se selecciona de forma que la aguja esté dirigida hacia el hombro o la pechuga de dicho embrión. A continuación la aguja se inserta a través de la cáscara del huevo, a lo largo de un recorrido esencialmente lineal, hasta una profundidad suficiente para pasar al hombro o pechuga del embrión. A continuación, la sustancia a depositar en el huevo, que puede ser un líquido o un sólido que se puede introducir con una jeringuilla (p. ej., inyectable) (pero que generalmente es una solución acuosa que contiene la composición de esta invención tal y como se describe en la presente memoria descriptiva), se inyecta mediante la aguja. En algunas formas de modalidad, la aguja se retira a lo largo del recorrido esencialmente lineal y la etapa de inyectar la sustancia se lleva a cabo junto con la etapa de retirada de la aguja de modo que la sustancia se administra a lo largo del recorrido dentro del huevo. El ángulo de desplazamiento (A) es suficiente para potenciar la probabilidad de inyectar en el músculo del hombro o pechuga. Normalmente, el ángulo es de 1 a 20 grados y, preferentemente, el ángulo es de 2 a 3 grados. Como un ejemplo, la aguja se puede insertar hasta una profundidad suficiente entre la cáscara del h uevo para pasar al interior o pasar al interior y a través del hombro o la pechuga del embrión. El aparato puede modificarse de modo que incluya medios asociados operablemente al aparato para colocar el huevo a un ángulo con respecto a la aguja para alcanzar dicho ángulo (A), tal como montar y colocar la(s) aguja(s) a un ángulo con respecto al aparato de succión. En un ejemplo concreto, los procedimientos de la presente invención se pueden practicar con el aparato descrito en la patente de EE.UU. N° 6,244,214 concedida a Hebrank (la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia), en la que un aparato (p. ej., una "sonda Smartprobe" para identificar la estructura y o compartimento específicos dentro de un huevo está en contacto con una aguja que ha penetrado en la cáscara del huevo, y se describen procedimientos para emplear el aparato para administrar composiciones en estructuras y/o compartimentos específicos dentro de un huevo. Por tanto, en ciertas formas de modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento de introducir una sustancia en el músculo de un pollo in ovo, que comprende: a) obtener un huevo de pollo, en el que dicho huevo contiene un embrión de pollo en el último cuarto de incubación antes de la eclosión; b) colocar una aguja de inyección de elongación en el extremo más grande del huevo a un ángulo de desplazamiento de aproximadamente 1 a 5 grados desde el eje largo de dicho huevo, de modo que dicho ángulo se selecciona de forma que la aguja esté dirigida hacia el hombro o la pechuga de dicho embrión; c) insertar dicha aguja a través de la cáscara de dicho huevo a lo largo de un recorrido esencialmente lineal, hasta hacia el hombro o la pechuga de dicho embrión; y d) inyectar dicha sustancia en el huevo a través de dicha aguja. En otras formas más de modalidad, se proporciona un procedimiento en la presente memoria descriptiva para introducir una sustancia en el músculo de un pollo in ovo, que comprende: a) obtener un huevo de pollo, en el que dicho huevo contiene un embrión de pollo de 17-19 días, b) colocar una aguja de inyección alargada en el extremo más grande del huevo a un ángulo de desplazamiento de aproximadamente 1 a 5 grados desde el eje largo de dicho huevo, de modo que dicho ángulo se selecciona de forma que la aguja esté dirigida hacia el hombro o la pechuga de dicho embrión; c) insertar dicha aguja a través de la cáscara de dicho huevo a lo largo de un recorrido esencialmente lineal hasta una profundidad de aproximadamente 2.22 cm a 3.81 cm en el hombro o la pechuga de dicho embrión; y d) inyectar dicha sustancia en el huevo a través de dicha aguja. En dichos procedimientos, la aguja se puede insertar a una pasar al interior o pasar al interior y a través del el hombro o la pechuga del embrión. También se proporciona en la presente memoria descriptiva un aparato para inyectar de forma simultánea en tejido muscular de embriones de pollo en una pluralidad de huevos durante los días 17 a 19 de la incubación, en el que dicho dispositivo comprende: medios de enganche para enganchar d icha pluralidad de huevos; medios de inyección que cooperan con dichos medios de enganche para insertar una aguja alargada a través de las cáscaras de dichos huevos a lo lago de un recorrido esencialmente lineal hasta una profundidad de aproximadamente 2.22 cm a 3.81 cm en el hombro o la pechuga de dicho embrión y medios de colocación para colocar dicha aguja de inyección de elongación en el extremo grande de dicho huevo a un ángulo de aproximadamente 1 a 5 grados de desplazamiento desde el eje largo de dicho huevo de modo que dicha aguja esté dirigida hacia el hombro o la pechuga de dicho embrión. En tal apartado, los medios de enganche pueden comprender medios de succión para subir simultáneamente una pluralidad de huevos individuales. En otras formas de modalidad de esta invención, se proporcionan composiciones y procedimientos para inducir una respuesta ¡nmunitaria a especies de Clostridium en un sujeto aviar. Como ejemplo, la enterotoxemia aguda denominada enteritis necrótica en aves está causada por Clostridium perfringens (los tipos A y C se han asociado con la enfermedad aviar). La enteritis necrótica se puede producir cuando las aves ingieren piensos y camas contaminados con clostridios y el organismo crece en el intestino y, después, forma esporas. Este proceso de esporulación causa la liberación de las toxinas alfa y beta responsables de la necrosis intestinal (particularmente en el yeyuno y el íleon). Entre los signos clínicos se incluyen depresión, disminución del apetito y diarrea. Se puede producir mortalidad aguda. Entre los factores predisponentes a la infección por C. perfringens y enteritis necrótica se incluyen la dieta y el daño en la mucosa intestinal. En el contexto de las aves de corral comerciales, la mayoría de los casos de enteritis necrótica se producen en pollos de engorde de dos a cinco semanas de edad. Por tanto, formas de modalidad concretas de la presente invención están dirigidas a composiciones inmunogénicas y procedimientos que protegen a las aves frente a Clostridium perfringens y la enteritis necrótica, por ejemplo reduciendo las tasas de infección y/o reduciendo la gravedad de la infección y/o de la enfermedad. A continuación se describirá la presente invención con referencia a formas de modalidad concretas de la invención. No obstante, esta invención puede realizarse en formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las formas de modalidad expuestas en la presente memoria descriptiva. En su lugar se proporcionan estas formas de modalidad de modo que esta descripción será exhaustiva y completa, y transmitirá completamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que el que normalmente entiende un experto en la técnica a la que esta invención pertenece. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente memoria descriptiva es con el fin de describir únicamente formas de modalidad concretas y no se pretende que sea limitante de la invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en su totalidad por referencia. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente memoria descriptiva es con el fin de describir únicamente formas de modalidad concretas y no se pretende que sea limitante de la invención. Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, con las formas en singular "uno(a)", "un" y "el(la)" se pretende incluir las formas en plural también, a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Como se usa en la presente memoria descriptiva "y/o" se refiere y abarca cualquiera y todas las posibles combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o"). Además, con el término "aproximadamente", como se usa en la presente memoria descriptiva cuando se hace referencia a un valor mensurable tal como una cantidad de un compuesto o agente de esta invención, dosis, tiempo, temperatura y similares, se quiere abarcar variaciones del ± 20%, ± 10%, + 5%, ± 1 %, ± 0.5% o incluso ± 0.1 % de la cantidad especificada. Con los términos "aviar" y "sujetos aviares" o "ave" y "sujetos ave" como se usa en la presente memoria descriptiva se pretende incluir machos y hembras de cualquier ave o especie de ave y, en particular, se pretende que abarque aves de corral criadas comercíalmente para proporcionar huevos, carne o como mascotas. En consecuencia, los términos "aviar" y "sujeto aviar" o "ave" y "sujetos ave" abarcan pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, periquitos, loros, cacatúas, Carolinas, avestruces, emúes y similares. En formas de modalidad concretas, el sujeto es un pollo o un pavo. Entre las aves de corral comercializadas se incluyen de engorde y ponedores, que se crían para producción de carne y de huevos, respectivamente. En formas de modalidad concretas, el sujeto es uno que esté en riesgo o sea susceptible a sufrir infección o enfermedad causada por especies de Clostridium (p. ej . , enteritis necrótica causada por la infección con Clostridium perfringens). Los factores de riesgo de la enteritis necrótica se conocen en la técnica e incluyen, ente otros, factores relacionados con la dieta (p. ej. , una dieta rica en trigo, cebada, centeno o harina de pescado), malas condiciones de la cama y/o exposición a Eimeria (p. ej. , la exposición natural o vacunas con Eimeria viva). Por tanto, en formas de modalidad concretas, las composiciones y los procedimientos de la invención se pueden emplear ventajosamente para reducir la gravedad y/o la incidencia de la enteritis necrótica entre aves que han sido vacunadas contra la coccidiosis o en bandadas que están experimentando un brote de coccidiosis. Otras enfermedades y trastornos causados por la infección de aves con Clostridium incluyen, entre otros, enteritis necrótica, dermatitis gangrenosa, colangiohepatitis, celulitis, enteritis ulcerosa, botulismo y enfermedad de Tyzzer. Por tanto, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y procedimientos de su uso para proteger a las aves contra la infección producida por, por ejemplo, Clostridium períringens, C. septicum, C. sordellii, C. difficile, C. novyi, C. botulinum, C. colinum, C. chauvoei, C. fallax, C. sporogenes y/o C. piliforme. El sujeto aviar de esta invención puede ser un ave embrionaria viva ¡n ovo o puede ser un ave tras la eclosión, incluidas aves que acaban de eclosionar (es decir, aproximadamente uno, dos o tres días después de la eclosión), adolescentes y adultas. En formas de modalidad concretas, el ave tiene aproximadamente seis, cinco, cuatro, tres, dos o una semana de edad, o menos. En otras formas de modalidad representativas, el sujeto aviar es un sujeto inocente, es decir no expuesto previamente al antígeno contra el que se desea obtener inmunidad. El término "administrar in ovo" o "administración in ovo", como se usa en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, significa administrar una composición inmunogénica (p. ej., una vacuna) a un h uevo de ave que contiene un embrión vivo en desarrollo por cualquier medio de penetrar en la cáscara del huevo e introducir la composición inmunogénica.

Tales medios de administración incluyen, entre otros, la inyección in ovo de la composición inmunogénica. La presente invención proporciona procedimientos de administrar una composición inmunogénica a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra especies de Clostridium, opcionalmente una respuesta inmunitaria protectora, en el sujeto. La composición inmunogénica puede administrarse en cualquier compartimento adecuado del huevo (p. ej. , alantoides, saco vitelino, amnios, célula aérea y/o en el propio embrión aviar), como sería evidente para el experto en la técnica. Entre los procedimientos de administración en el embrión se incluyen, sin limitaciones, la administración parenteral, tal como, por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, intraabdominal, intravenosa y/o intraarticular. En formas de modalidad concretas, la composición inmunogénica se administra en el amnios (p. ej. , mediante inyección axial a través del extremo grande del huevo). La composición inmunogénica se puede administrar en el huevo mediante cualquier procedimiento adecuado. En formas de modalidad concretas, la composición inmunogénica se administra mediante inyección. El mecanismo de inyección en el huevo no es crucial, pero generalmente debe seleccionarse de modo que el procedimiento no daña a los tejidos y los órganos del embrión o las membranas extraembrionarias que lo rodean hasta el extremo tal que el tratamiento reduzca innecesariamente el índice de eclosión. Generalmente, una jeringuilla provista de una aguja de aproximadamente 1 .2 a 0.61 mm es adecuada para el fin. Entre los ejemplos de agujas adecuadas para esta invención se incluyen agujas que tienen los siguientes calibres: 1 .27, 1 .01 , 0.91 , 0.81 , 0.71 ó 0.61 mm. Una aguja de esta invención puede tener una longitud de al menos 1 .27 cm, 2.1 cm, 1 .90 cm, 2.22 cm, 2.54 cm, 2.54 y 0.63 cm, 2.54 y 0.95 cm, 2.54 y 1 .27 cm, 2.54 y 1 .59 cm, 2.54 y 1 .91 cm, 2.54 y 2.22 cm o 5.08 cm. Ejemplos de un intervalo de biseles de una aguja de esta invención es de aproximadamente 5 grados a aproximadamente 45 grados (p. ej. , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44 ó 45 grados). En ciertas formas de modalidad de esta invención, el intervalo de biseles de una aguja de esta invención es de aproximadamente 12 grados a 20 grados. Se puede perforar o hacer un orificio piloto a través de la cáscara antes de insertar la aguja para prevenir el daño o el deslustrado de la aguja. Si se desea, el huevo se puede sellar con un material de sellado sustancialmente impermeable a las bacterias tales como cera o similares para prevenir la posterior entrada de bacterias no deseadas. Un sistema de inyección automática de alta velocidad para embriones aviares es particularmente adecuado para practicar la presente invención. Se dispone de numerosos de estos dispositivos, ejemplos de los cuales son los descritos en las patentes de EE.UU. N° 4,681 ,063 y 4,903,635 concedidas a Hebrank, y las patentes de EE.UU. n° 4,040,388, 4,469,047 y 4 ,593,646 concedidas a Miller, la totalidad de cuyos contenidos se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia. Tales dispositivos, adaptados para practicar la presente invención, generalmente comprenden un inyector que contiene la composición inmunogénica, con el inyector colocado para inyectar en un huevo portado por el apartado con la composición inmunogénica. Además, si se desea, se puede proporcionar una aparato para sellar asociado de forma operativa al aparato de inyección para sellar el orificio en el huevo después de la inyección del mismo.

En una forma de modalidad, el aparato para practicar la presente invención puede ser como se describe en la patente de EE.UU. N° 4,681 ,063 concedida a Hebrank y en la patente de EE.UU. N° 4,903,625 concedida a Hebrank, cuya descripción se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia. Este dispositivo comprende un aparato de inyección para administrar sustancias líquidas en una pluralidad de huevos y un aparato de succión que simultáneamente engancha y sube una pluralidad de huevos individuales desde sus porciones colocadas hacia arriba y coopera con el inyector para inyectar en los huevos mientras los huevos son enganchados por el aparato de succión. Los expertos en la técnica apreciarán que este d ispositivo se puede adaptar para la inyección en cualquier parte del huevo mediante ajuste de la profundidad de penetración del inyector, tal y como se conoce en la técnica. La presente invención también se puede practicar con el aparato y los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. n° 6,244,214 concedida a Hebrank (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia), en los que se describen un aparato para identificar la estructura y o compartimento específicos dentro de un huevo que está en contacto con una aguja que ha penetrado en la cáscara del huevo y p rocedimientos para emplear el aparato para administrar composiciones en estructuras y/o compartimentos específicos dentro de un huevo. El volumen adecuado de la composición inmunogénica a administrar dependerá del tamaño del huevo que se esté tratando, aunque es obvio que los huevos de avestruz son capaces de tomar más volumen que los huevos de pollo. En formas de modalidad concretas, la composición inmunogénica se administra en un volumen de aproximadamente 10 a aproximadamente 500, 1000 o 2000 µ? o más, incluido cualquier número entre 1 0 y 2000, aunque no se cite explícitamente en la presente memoria descriptiva, ejemplos de volúmenes incluyen 1 0, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1 00, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 626, 650, 675, 700, 725, 752, 775, 800, 850, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 µ?. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente otros volúmenes adecuados para administrar la composición inmunogénica. De acuerdo con formas de modalidad concretas de la presente invención, los huevos (es decir, las aves embrionarias) a los que se ha administrado la composición inmunogénica se encuentran en la última mitad o el último cuarto de la incubación in ovo (es decir, del desarrollo embrionario). Por ejemplo, para huevos de pollo, la última mitad de la incubación es de aproximadamente el día duodécimo a vigésimo de la incubación (p. ej. , E12, E 13, E14, E15, E16, E17, E17.5, E1 8, E18.5, E19, E19.5 y/o E20) y el último cuarto de la incubación in ovo es de aproximadamente el decimoquinto al vigésimo día de la incubación (E1 5, E 15.5, E16, E 16.5, E17, E17.5, E18, E 18.5, E19, E 1 9.5 y/o E20). En formas de modalidad concretas de la presente invención, al huevo se le administra la composición inmunogénica aproximadamente el día decimoctavo (E 18 o E 18.5) o decimonoveno (E 19 o E 19.5) de la incubación in ovo. En otras formas de modalidad, a los huevos de pavo se administra la composición inmunogénica aproximadamente del decimocuarto al vigésimo séptimo día de incubación (E14, E 15, E 16, E17, E18, E19, E20, E21 , E21 .5, E22, E22.5, E23, E23.5, E24, E24.5, E25, E25.5, E26 y/o E27) o aproximadamente al vigésimo quinto (E25 o E25.5) día de la incubación . Los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención se puede llevar a cabo en cualquier momento predeterminado in ovo, siempre q ue la administración tenga como resultado una respuesta inmunitaria deseada a la composición inmunogénica sin niveles indebidos de morbididad y/o mortalidad entre los sujetos tratados. Como alternativa o adicionalmente, la invención se puede practicar para administrar una composición inmunogénica a un ave eclosionada, incluidas aves que acaban de eclosionar (es decir, aproximadamente uno, dos o tres días después de la eclosión), adolescentes y adultas. En ciertas formas de modalidad, la administración se realiza dentro de aproximadamente las primeras seis, cinco, cuatro, tres y/o dos semanas después de la eclosión y/o incluso dentro de aproximadamente la primera semana después de la eclosión. De acuerdo con un aspecto de la invención, la administración se realiza dentro de aproximadamente las primeras tres semanas después de la eclosión. En otras formas de modalidad, la composición inmunogénica se administra in ovo (p. ej. , en el último cuarto de la incubación in ovo) y se administra un refuerzo después de la eclosión (p. ej , dentro de los primeros uno, dos o tres días o una, dos o tres semanas después de la eclosión).

Los procedimientos de la invención se pueden distinguir de los enfoques de vacunación materna en que las aves hembra mayores (p. ej., gallinas de aproximadamente 10-15 semanas de edad) se vacuna con el fin de proporciona inmunidad pasiva a su descendencia. Probablemente tales aves no sean inocentes, ya han estado expuestas a Clostridium (p. ej. Clostridium perfringens) y no se les está inmunizando con el fin de proteger al ave vacunada, sino para proteger la descendencia mediante transferencia pasiva de anticuerpos. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención se pueden administrar a aves eclosionadas por cualquier medio adecuado. Ejemplos de los medios son administración oral (p. ej. , en el pienso o el agua de bebida), inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intraabdominal, colirios y/o pulverizador nasal. Además, se puede administrar composiciones inmunogénicas a aves en una campana de pulverización, es decir una campana en la que se coloca a las aves y se les expone a una niebla que contiene la vacuna o mediante pulverización. La invención se puede practicar para proteger un ave de la enteritis necrótica. Con "proteger", "que protege" y "protección" y términos similares se quiere decir cualquier nivel de protección frente a la enteritis necrótica que es de algún beneficio en una población de sujetos, de modo que se produzca una reducción de la incidencia y/o gravedad de la enfermedad entre las aves tratadas ya sea en forma de disminución de la mortalidad, disminución de las lesiones, mejora del peso corporal, mejora de los índices de conversión del pienso y/o la reducción de cualquier otro efecto perjudicial de la enfermedad, con independencia de si la protección es parcial o completa. Los expertos en la técnica entenderán que la protección se puede valorar a partir de una pluralidad de aves tratadas en comparación con aves sin tratar, aunque las aves individuales tratadas no estén protegidas. En formas de modalidad concretas, la invención proporciona un procedimiento para reducir la incidencia de la enteritis necrótica entre una pluralidad de aves a las que se administra las composiciones inmunogénicas de la invención. También se proporciona un procedimiento para reducir la morbididad y/o mortalidad entre una pluralidad de aves tratadas de acuerdo con la presente invención. Con "sensibilizar", "sensibilizado" o "que sensibiliza" (y sus variaciones gramaticales), como se usa en la presente memoria descriptiva, se quiere decir iniciar una respuesta inmunitaria activa que es inferior a la protectora hasta que se ha administrado una segunda dosis (de refuerzo) en un momento posterior después de la eclosión. Con "reducir", "reducido(a)", "que reduce" y "reducción" (y sus variaciones gramaticales), como se usa en la presente memoria descriptiva, se quiere decir una disminución en el parámetro indicado relacionado con la infección, o con la enfermedad, (p. ey., infección, morbididad, mortalidad, incidencia de enteritis necrótica, lesiones y similares) que es de algún valor o beneficio para el usuario (p. ey. , de valor comercial), por ejemplo una d isminución de al menos aproximadamente 20%, 25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o más en comparación con las aves no tratadas. La invención también proporciona procedimientos para proteger aves de la infección por especies de Clostridium, que tiene como resultado cualquier nivel de protección que es de algún beneficio en una población de sujetos, de modo que existe una reducción de la incidencia y/o gravedad de la infección por Clostridium entre las aves tratadas. La invención también puede practicarse para inducir una respuesta inmunitaria a Clostridium. Como se usa en la presente memoria descriptiva, con el término "inducir (o sus variaciones gramaticales) una respuesta inmunitaria contra Clostridium" se pretende abarcar agentes que induzcan una respuesta inmunitaria contra el propio organismo y/o las toxinas producidas por el organismo, por medio de transferencia pasiva o respuesta inmunitaria activa. Opcionalmente, la respuesta inmunitaria inducida es una respuesta inmunitaria protectora, por ejemplo en procedimientos de vacunación. No se requiere protección si existe otro fin para inducir la respuesta inmunitaria por ejemplo para fines de investigación o para producir anticuerpos para inmunizaciones pasivas o como un reactivo (p. ej., para detectar, aislar y/o identificar especies de Clostridium). Como se usa en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, con "C. perfringens" se pretende incluir C. perfringens de tipo A y/o C. perfringens de tipo C y/o cualquier otro tipo de C. perfringens que está implicado en la etiología de la enteritis necrótica en aves. En formas de modalidad concretas, la invención proporciona procedimientos de proteger aves de la infección producida por C. perfringens de tipo A y/o C. perfringens de tipo C. La invención también proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria contra C. perfringens de tipo A y/o C. perfringens de tipo C. En la técnica se conocen bien tipos diferentes de C. perfringens y cepas de la misma. Véase, por ejemplo AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS, A LABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PATHOGENS (3a ED., 1989). El término "dosis inmunizante eficaz", como se usa en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, significa una dosis de la composición inmunogénica suficiente para inducir una respuesta inmunitaria protectora en las aves tratadas que es superior a la inmunidad inherente de las aves no inmunizadas. En el caso de las aves tratadas in ovo, una "dosis inmunizante eficaz" indica una dosis suficiente para inducir una respuesta inmunitaria protectora en las aves eclosionadas que se han tratado in ovo que es superior a la inmunidad inherente de las aves no inmunizadas in ovo. Una dosis inmunizante eficaz en un contexto concreto puede determinarse de forma rutinaria usando procedimientos conocidos en la técnica. Una "dosis inmunizante eficaz" puede comprender una o más dosis (p. ej., dos o tres) de la composición inmunogénica para alcanzar el nivel de protección deseado. Las dosis individuales se pueden administrar in ovo y/o después de la eclosión. Como se ha tratado antes, será evidente para los expertos en la técnica que al tratar una pluralidad de aves (tales como en la producción de aves de corral comerciales), la eficacia de la dosis y/o la composición inmunogénica puede valorarse mediante la evaluación de los efectos de la vacunación en la bandada como un todo. En otras palabras, una dosis inmunizante eficaz o una vacuna eficaz para la bandada como un todo puede, no obstante, inducir una respuesta inmunitaria y/o proporcionar suficiente protección contra la enfermedad en aves individuales. Los términos "vacunación" o "inmunización" son bien entendidos en la técnica y se usan de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, se puede entender que los términos vacunación o inmunización sean un procedimiento que incrementa la reacción inmunitaria de un sujeto a un antígeno (al proporcionar una respuesta inmunitaria activa) y, por tanto, su capacidad para resistir, superar y/o recuperarse de la infección (es decir, una respuesta inmunitaria protectora). Con los términos "inmunidad protectora" o "respuesta inmunitaria protectora", como se usa en la presente memoria descriptiva, se quiere decir q ue el animal huésped forma una respuesta inmunitaria activa a la composición inmunogénica y/o que la composición inmunogénica proporciona una inmunidad pasiva, de modo que tras la posterior exposición o una provocación, el animal es capaz de resistir o superar la infección y/o enfermedad. Por tanto, una respuesta inmunitaria protectora disminuirá la incidencia de la morbididad y/o mortalidad por la posterior exposición al patógeno entre las aves tratadas.

Una "respuesta ¡nmunitaria activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por la "participación de tejidos y células del huésped después de un encuentro con el ¡nmunógeno. Implica diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en tejidos linforreticulares, lo que conduce a la s íntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o a ambos". Herbert 8. Herscowitz, Immunophysio!ogy: Cell Function and Cellular interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 1 17 (Joseph A. Bellanti ed. , 1985). Como se indica alternativamente, el huésped monta una respuesta ¡nmunitaria activa tras la exposición a inmunógenos mediante infección o mediante vacunación. La inmunidad activa puede contrastarse con la inmunidad pasiva, que se adquiere a través de la "transferencia de sustancias preformadas (anticuerpos, factor de transferencia, injerto tímico, interleucina 2) de un huésped inmunizado de forma activa a un huésped no inmune". ID. En la técnica se conocen modelos de enteritis necrótica (EN) para valorar la eficacia de las vacunas y las estrategias de vacunación. Por ejemplo, Hofacre y col. (2003, J. Appl. Poult. Res. 12:60 — 64) describieron un modelo en el que se alimentó a pollos con una dieta de soja de maíz con 26% de harina de pescado desde el día 0 al día 14 después de la eclosión. El día 1 4 se retiró de la dieta la harina de pescado. Las aves se expusieron a coccidios mediante sonda oral el día 14 y después a diario desde los días 17-1 9 con C. períringens mediante sonda oral. El índice de conversión del a limento, el peso corporal y la puntuación de las lesiones intestinales se usaron para valorar la presencia y gravedad de la enteritis necrótica en las aves expuestas. Las lesiones de EN se valoraron el día 22 o el día 28 mediante una escala de 0= ninguna, 1 = leves, 2= moderadas y 3= marcadas/graves. Se pueden usar otros modelos para valorar la eficacia de la vacuna y los regímenes vacunales como se conoce en la técnica. En ciertas formas de modalidad de la presente invención, la administración de una composición de esta invención (p. ej., una cantidad eficaz de una composición de esta invención) puede temer como resultado una reducción de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, m 60, 70, 75, 80, 90 o 1 0%% de las lesiones intestinales y/o variación del peso corporal en animales de este modelo o de otro modelo conocido o aceptado en la técnica, en comparación con animales no inmunizados o control. En formas de modalidad adicionales de esta invención, las composiciones y procedimientos de esta invención se pueden usar para inducir una respuesta de anticuerpos en aves que es al menos superior o igual a aproximadamente 0.5 unidades de antitoxina/ml (p. ej., de al menos aproximadamente 0.5, 1 .0, 1 .5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 o 10 UA de anticuerpos anti-toxina por mi de antisuero del ave). En otras formas de modalidad en las que se emplean las composiciones y procedimientos de esta invención , el porcentaje de huevos de una población de huevos en los que se administra una composición de esta invención en el cuerpo del embrión puede ser de aproximadamente un 70% a aproximadamente un 100% (p. ej., 70, 71 , 72, 73, 74, 75. 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100%) del número total de huevos en la población de huevos a los que se administra la composición. La presente invención también abarca composiciones inmunogénicas que inducen una respuesta inmunitaria activa y/o pasiva contra C. perfringens (incluidos los tipos A y/o C) y que, opcionalmente, se pueden usar para proteger a un ave contra la infección por C. perfringens y/o para proteger contra la enteritis necrótica tal y como se ha descrito con más detalle en lo que antecede. Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden, están constituidas esencialmente por y/o están constituidas por, un agente(s) que induce(n) una respuesta inmunitaria contra Clostrídium. El agente inmunitario de Clostrídium puede ser un antigeno replicante o un antígeno no replicante. Los antígenos replicante o no replicante de esta invención se pueden administrar in ovo en el amnios, el embrión y/o en el amnios y el embrión. Además, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden, consisten esencialmente y/o consisten, una dosis inmunizante eficaz de un agente inmunizante contra Clostrídium en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En formas de modalidad representativas, la composición inmunogénica puede formularse con toxoides y/o vacuna bacterianas de Clostrídium. De acuerdo con esta forma de modalidad, la composición inmunogénica además comprende opcionalmente un adyuvante (véase más adelante). Los toxoides son toxinas inactivadas y pueden derivar de toxinas de Clostridium, incluidos toxoides que son toxinas inactivadas, y pueden derivar de toxinas de Clostridium, incluidas las derivadas de C. perfringens, incluidas toxina alfa, toxina beta, toxina beta 2, enterotoxina, toxina épsilon, toxina iota, toxina kappa, toxina lambda y/o toxina teta; las derivadas de C. sordellii, incluidas la toxina hemorrágica y/o la toxina letal; las derivadas de C. difficile, incluida la toxina A (enterotoxina) y la toxina B (toxina citopática); las derivadas de C. septicum, incluida la toxina alfa; las derivadas de C. novyi, incluidas la toxina alfa y/o la toxina beta; y/o las derivadas de C. botulinum, incluida la toxina de tipo C. Procedimientos de producir toxoides se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, tratamiento con formaldehido o con calor de la toxina (véase, p. ej., Waiker, (1992) Vaccine 10: 977-990). Las vacuna bacterianas son componentes de células bacterianas y pueden derivar de una especie de Clostridium, tal como, por ejemplo, de C. perfringens de tipo A y/o C. perfringens de tipo C. Las vacunas con toxoides de C. perfringens se conocen en la técnica (véase, p. ej., la patente de EE.UU. N° 4. ,292, 306, concedida a Zemlyakova). En otras formas de modalidad, la composición inmunogénica comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, una bacteria Clostridium (es decir, una vacuna bacteriana) muerta (es decir no replicante), opcionalmente en una emulsión de agua en aceite en agua (véase, p. ej., la patente de EE.UU. N° 5,817,320 concedida a Stone, que describe la inmunización in ovo de embriones aviares con vacunas en emulsión oleosa, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia) y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otras formas de modalidad, la composición inmunogénica comprende, consiste esencialmente o consiste, una Clostrídium muerta y un adyuvante (p. ej. , un adyuvante derivado de aluminio tal como, hidróxido de aluminio, una saponina tal como Quíl-A, incluido QuilA QS21 , o un aceite tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, opcionalmente en una emulsión de agua en aceite en agua y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como otra alternativa, la composición inmunogénica comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, un agente inmunitario replicante de Clostrídium, por ejemplo C. perfríngens vivos, que generalmente es C. perfríngens vivos atenuados (es decir, con una virulencia reducida). (Véase, por ejemplo, la publicación PCT N° PCT WO 2005/053737, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia, para las enseñanzas sobra la producción de bacterias vivas atenuadas para usar en vacunas). Procedimientos de producir bacterias atenuadas se conocen en la técnica e incluyen, sin limitaciones,: irradiación, tratamiento químico, pases seriados en cultivos y similares. En ciertas formas de modalidad de la invención, se administran bacterias vivas de Clostrídium (por ejemplo C. perfríngens) en presencia de un agente que protege al sujeto de efectos patológicos del organismo, por ejemplo mediante coadministración de un factor neutralizante tal y como se describe en la patente de EE.UU. N° 6,440,408 concedida a Thoma y col., o ¡nterferón tal y como se describe en la patente de EE.UU. N° 6,506,385 concedida a Poston y col. Opcionalmente, el Clostridium y el factor neutralizante y/o el interferón se administran en la misma formulación. Otros ejemplos de composiciones inmunogénicas incluyen composiciones inmunogénicas que comprenden, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, antitoxinas (es decir, anticuerpos que proporcionan inmunidad pasiva contra las toxinas alfa y/o beta de Clostridium; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5,719,267 concedida a Carroll y col.), péptidos antigénicos que inducen una respuesta inmunitaria contra Clostridium (incluidas las toxinas de C. perfringens; véase por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5,817,317 y 5,851 ,827 concedidas a Titball y col.; la patente de EE.UU. N° 6,610,300 concedida a Segers y col.; la patente de EE.UU. N° 5,695,956 concedida a McCIane y col.) y vacunas recombinantes que comprenden un ácido nucleico portador (p. ej. , un plásmido o un virus) que libera un ácido nucleico que codifica un(os) péptido(s) antigénico(s) o proteína(s) que inducen una respuesta inmunitaria contra Clostridium. En formas de modalidad representativas, la composición inmunogénica comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, una toxina recombinante alfa y/o beta de Clostridium, por ejemplo las toxinas alfa que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N° 2 [secuencia de longitud completa de 370 aminoácidos; N° de registro en GenBank . 1 GYGB (Gl:21730290), cuya secuencia codificadora se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEC ID N° 1 ], SEC ID N° 4 (Cpa247-37o; aminoácidos 247-370 de la SEC ID N° 2; cuya secuencia codificadora se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEC ID N° 3), SEC ID N° 6 (aminoácidos 1 -278 de la SEC ID N° 2; cuya secuencia codificadora se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEC ID N° 5), SEC ID N° 8 (Cpa26i-3oo; aminoácidos 261 -300 de la SEC ID N° 2; cuya secuencia codificadora se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEC ID N° 7) como se describe en la presente memoria descriptiva y/o, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N° 5,817,317 y 5,851 ,827 concedidas a Titball y col. o la SEC ID N° 10 [secuencia de longitud completa de 398 aminoácidos, cuya secuencia codificadora se proporciona en la presente memoria descriptiva como SEC ID N° 9]. En algunas formas de modalidad, la toxina de la presente invención es una composición inmunogénica que comprende los aminoácidos 1 -278 (SEC ID N° 6) de la secuencia de 370 a minoácidos (SEC ID N° 2) de la toxina alfa de C. perfringens. Otros ejemplos de toxinas (incluidos fragmentos inmunogénicos de las mismas) que se pueden usar en las composiciones y procedimientos de esta invención incluyen, entre otras, toxinas de C. perfringens [p. ej., toxina alfa, número de registro CAA35186 (Saint-Joanis y col. Mol. Gen. Genet. 219(3):453-460 (1989)0; toxina beta, número de registro CAA58246 (Steinthorsdottir y col. FEMS Microbio! Lett. 130(2-3):273-278 (1995)); toxina beta, número de registro NP_150010 (Shimizu y col. Proc. Nati. Acad. Sci.

U.S.A. 99(2):996- 1001 (2002)); enterotoxina, número de registro BAE791 12 (Miyamoto y col. J. Bacteriol. 188(4)1585-1 598 (2006)); toxina épsilon número de registro AAA23236 (Havard y col. FEMS Microbiol. Lett. 97:77-82 (1992); toxina iota, número de registro CAA51959 (Perelle y col. Infect. Immun. 61(12):5147-5156 (1993)); toxina kappa número de registro NP_561089, Shimizu y col. Proc. Nati Acad. Set. U.S.A. 99(2):996-1001 (2002)); toxina lambda número de registro CAA35187 (Saint-Joanis y col. Mol. Gen. Genet. 219(3):453-460 (1989)); y toxina teta número de registro NP_561079 (Shimizu y col. Proc. Nati. Acad. Sci U. S.A. 99(2):996-1001 (2002))], toxinas de C. difficile [p. ej., toxina A número de registro A37052 (Wren y col. FEMS Microbiol. Lett 70: 1 -6(1990)); y toxina B número de registro CAA43299 (von Eichel-Streiber y col, Mol. Gen. Genet. 233(1 -2): 260-268 (1992))], toxinas de C. septicum [toxina alfa número de registro AAB32892 (Ballard y col. Infect. Immun. 63(1 ):340-344 (1995))] y toxinas de C. novyi [p. ej., toxina, alfa número de registro AAB272I3 (Ball y col. Infect. Immun. 61(7)2912-2918 (1993))). Los términos "toxina", "toxina alfa", "toxina beta", "toxina épsilon" (o un término similar) etc., como se usan en la presente memoria descriptiva incluyen la toxina de longitud completa, asi como los péptidos antigénicos o inmunogénicos o variantes antigénicas o inmunogénicas de los mismos (p. ej., atenuadas) que inducen una respuesta inmunitaria (opcionalmente, una respuesta inmunitaria protectora) contra Clostridium en el sujeto. En formas de modalidad concretas, péptido antigénico comprende al menos aproximadamente 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 50, 75 ó 100 o más aminoácidos contiguos de la toxina de longitud completa (véase, por ejemplo, la secuencia de la toxina alfa de longitud completa como se muestra en la SEC ID N° 2 en las patentes de EE. UU. N° 5,817,317 y 5,851 ,827 y en la ID N° 2 en la presente memoria descriptiva). Asimismo, se entiende que los fragmentos inmunogénicos de esta invención se pueden combinar en cualquier orden o cantidad. Por ejemplo, el fragmento 1 -10 puede combinarse en cualquier orden o cantidad para producir un fragmento de los aminoácidos 1 -20. Como otro ejemplo, el fragmento 1 -10 puede combinarse con el fragmento 50-60 para producir un único fragmento de esta invención con 31 aminoácidos (AA 10-20 y AA 50-60). Asimismo, los fragmentos pueden estar presentes en múltiples números y en cualquier combinación en un fragmento de esta invención. Por tanto, por ejemplo, el fragmento 1 - 50 se puede combinar con un segundo fragmento 1 -1 50 y/o combinarse con el fragmento 400-500 para producir un fragmento de esta invención. En algunas formas de modalidad, un fragmento antigénico o inmunogénico de una toxina de Clostridium de esta invención puede comprender, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, el dominio amino terminal de la toxina alfa de C. perfringens (aminoácidos 1 -246 de la SEC ID N° 2), el dominio carboxi terminal de la toxina alfa de C. perfringens (aminoácidos 256-370 de la SEC ID N° 2) y/o el fragmento entre estos dominios (aminoácidos 247-255 de la SEC ID N° 2) en cualquier combinación y con cualquier cantidad de superposición en la secuencia de aminoácidos que tiene como resultado un fragmento que tiene actividad inmunogénica. Con este lenguaje se pretende abarcar todos los posibles péptidos y fragmentos de toxinas tal y como se expone explícitamente en la presente memoria descriptiva (p. ej. , cualquier péptido o fragmento que comprende al menos 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 50, 75 ó 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia de la toxina alfa de longitud completa como se muestra en la SEC I D N° 2, en las patentes de EE. UU. N° 5,817,317 y 5,851 ,827 y en la SEC ID N° 2 y la SEC ID N° 10 en la presente memoria descriptiva). En formas de modalidad concretas, el péptido antigénico carece de una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de fosfolipasa C y/o hidrolizante de esfingomielina (p. ej. , un péptido antigénico de toxina alfa puede carecer de los aminoácidos 1 -240). Se ha determinado la localización de algunos epítopos de la toxina alfa de C. perfringens (véase, por ejemplo, Logan y col. , (1992) Infection and Immunity 59: 4338-4382, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia para las enseñanzas de los epítopos de la toxina alfa). Ejemplos adicionales de toxinas recombinantes de Clostridium que se pueden emplear en los procedimientos de esta invención incluyen, entre otros, una toxina beta de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico de la misma, en los que la toxina beta tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID N° 1 1 . La toxina beta de la SEC ID N° 1 1 puede además comprender una mutación en el aminoácido 62, 182, 197 o en una de las regiones entre los aminoácidos número 80-1 03, 145-147,281 -291 , 295-299 o en dirección 3' del aminoácido en posición 292 (tal como se describe en la patente de EE. UU. 6,610,300, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia), en el que la toxina resultante o fragmento de la misma posee actividad inmunogénica. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de las toxinas alfa y beta de C. perfringens se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, los números de registro en GenBank DQ202275; NP_560952; NC_003366; AY823400; AY277724; AF204209; X17300; X1 3608; L43548; L43547; L77965 y L13198. Véase también, Sheedy y col. , Highly Conserved Alpha-Toxin Sequences of Avian Isolates of Clostridium perfringens, J. Clin. Microbio!. 42: 1 345-1347 (2004), que presenta un análisis de las secuencias de la toxina alfa de 25 cepas de C. perfringens derivadas de pollo. En otras formas de modalidad de esta invención, la toxina de Clostridium puede ser una toxina Épsilon (e) de C. perfringens, que tiene una secuencia de aminoácidos tal y como se expone en la SEC ID N° 12 (328 aminoácidos; o la SEC ID N° 1 3). En otras formas de modalidad, la toxina e puede comprender la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 1 3, en la q ue el residuo 2 es una prolina, tal y como se describe en la patente de EE.UU. n° 6,403,094, la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia. En ciertas formas de modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento para inmunización de un sujeto aviar contra la infección por Clostridium, que comprende administrar al sujeto aviar una dosis inmunizante eficaz de una composición vacuna bacteriana-toxoide de Clostridium mediante inyección in ovo durante el último cuarto de la incubación. Los procedimientos de esta invención pueden además comprender la etapa de administrar una dosis de refuerzo de la composición bacteriana-toxoide de Clostridium al sujeto aviar vacuna tras la eclosión. Las especies de Clostridium de esta invención pueden incluir, entre otras, Clostridium perfringens. En formas de modalidad concretas de esta invención, la composición puede comprender una vacuna Vision CD®. En formas de modalidad concretas, en las que el sujeto es un pollo, la composición vacuna bacteriana-toxoide puede administrarse en el líquido amniótico a través de una aguja de 0.91 mm, 2.54 cm el día 18 de la incubación o con una aguja de 0.71 mm, 2.54 cm durante el día 18 de la incubación. En formas de modalidad, adicionales de esta invención se proporcionan procedimientos de inmunización de un sujeto aviar contra la infección por Clostridium, que comprende administrar al sujeto aviar una dosis inmunizante eficaz de una toxina recombinante o de un fragmento inmunogénico de la misma de una especie de Clostridium mediante inyección in ovo durante el último cuarto de la incubación. En algunas formas de modalidad, estos procedimientos pueden además comprender la etapa de administrar al sujeto aviar una dosis de refuerzo de la toxina recombinante o de un fragmento inmunogénico tras la eclosión. En formas de modalidad concretas, la composición empleada en estos procedimientos puede comprender un adyuvante, que puede ser Quil A y adyuvante incompleto de Freund. En formas de modalidad en las que el sujeto es un pollo, la composición vacuna bacteriana-toxoide puede administrarse en el cuerpo del embrión a través de una aguja de 0.61 mm, 3.18 cm durante el día 1 9 de la incubación. En otras formas de modalidad más, cuando el sujeto es un pollo, se puede administrar en el cuerpo del embrión una toxina o fragmento inmunogénico de la misma de esta invención a través de una aguja de 0.91 mm, 3.18 cm durante el día 19 de la incubación. Asimismo, el intervalo de dosificación de una toxina (p. ej. , una toxina alfa) o fragmento inmunogénico de la misma y/u otra subunidad de proteína o glicoproteína u otro tipo de molécula biológica usada como vacuna de esta invención puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente por dosis, con un intervalo de ejemplo d e aproximadamente 55 ximadamente 60 por dosis. Para las composiciones de esta invención que comprenden virus inactivados, la concentración de virus por dosis puede ser de aproximadamente 1 03 DIH50/DICT50 a aproximadamente 012 DIH5o/DICT5o (DIH= dosis infecciosa para el huevo; DICT= dosis infecciosa en cultivo tisular). En las formas de modalidad que comprenden virus activados, la concentración de virus por dosis puede ser de aproximadamente 100 DIH50/DICT5o a aproximadamente 1012 DIH50/DICT50. En formas de modalidad concretas de esta invención, la toxina de esta invención comprende, consiste esencialmente y/o consiste, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 2, 4 , 6, 8 ó 10, incluidas cualquier combinación de las mismas. Como se contempla en la presente memoria descriptiva, en algunas formas de modalidad de la presente invención, la composición de esta invención además comprende un adyuvante, que en formas de modalidad concretas, puede ser un adyuvante tal como un adyuvante derivado de aluminio (p. ej. , hidróxido de aluminio), una saponina (p. ej., Quil-A, incluido QuilA QS21 ) o un aceite (tal como adyuvante completo o incompleto de Freund), en cualquier combinación. Ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden emplearse en cualquiera de los procedimientos de las invenciones descritos en la presente memoria descriptiva se proporcionan en la presente memoria descriptiva. En formas de modalidad representativas, la composición inmunogénica de esta invención comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, una enterotoxina de C. perfringens (CPE), toxina beta 2, toxina épsilon, toxina kappa, toxina lambda, toxina teta y/o toxina iota; opcionalmente además de una toxina alfa y/o beta de C. perfringens. En otras formas de modalidad representativas, la composición inmunogénica comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, un toxoide o toxoide/vacuna bacteriana. La vacuna bacteriana puede ser una vacuna bacteriana de C. perfringens de tipo A y/o tipo C. Por ejemplo, una composición inmunogénica ejemplo comprende consiste esencialmente o consiste, un toxoide alfa y una vacuna bacteriana de C. perfringens de tipo A. Opcionalmente, la composición inmunogénica comprende además un adyuvante tal como un adyuvante derivado de aluminio (p. ej. , hidróxido de aluminio), una saponina (p. ej. , Quil-A, incluido QuilA QS21 ) o un aceite (tal como adyuvante completo o incompleto de Freund). Una composición ¡nmunogénica representativa de la invención comprende, consiste esencialmente y/o consiste, una dosis inmunizante eficaz de un agente inmunizante contra C. perfringens en una emulsión de agua en aceite en agua (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5,817,320 concedida a Stone), opcionalmente en un potador famacéuticamente aceptable. La composición inmunogénica puede opcionalmente comprender dos o más agentes que inducen una respuesta inmunitaria contra C. perfringens (p. ej., cualquier combinación de los agentes descritos en lo que antecede). En formas de modalidad concretas, el agente que induce una respuesta inmunitaria contra C. perfringens (p. ej. , un toroide, vacuna bacteriana, C. perfringens atenuado y/o toxina y similares) es un derivado aviar, opcionalmente una cepa de C. perfringens derivada de pollo. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "constituida esencialmente por" (y variantes gramaticales) quiere decir que la composición inmunogénica no comprende ningún otro agente inmunogénico material distinto a los agentes indicados. El término "constituida esencialmente por" no excluye la presencia de otros componentes, tales como adyuvantes, inmunomoduladores y similares. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere decir un material que no es biológicamente, o de otro modo, indeseado, es decir el material puede administrarse a un sujeto sin causar efectos biológicos no deseados apreciables. Por tanto, tal composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, para preparar composiciones para inmunización. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables pueden contener otros compuestos, incluidos, entre otros, estabilizantes, sales, tampones, adyuvantes y/o conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, antifúngicos y antivirales) como se conocen en la técnica. El vehículo farmacéuticamente aceptable no necesita ser estéril, aunque generalmente será para la administración in ovo a embriones aviares. En formas de modalidad concretas, la composición ¡nmunogénica además comprende un estimulante ¡nmunitario. Como alternativa, el estimulante inmunitario puede administrase a un sujeto en una formulación aparte. Los estimulantes inmunitarios que se pueden usar en los presentes procedimientos incluyen, entre otros, citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, sobrenadantes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos o células de órganos linfoides, preparaciones celulares o extractos celulares (p. ej., preparaciones fijas de Staphylococcus aureus o lipopolisacáridos), mitógenos o adyuvantes, incluidos productos farmacéuticos de bajo peso molecular. Los estimulantes inmunitarios se pueden administrar in ovo en cualquier momento durante la incubación. Opcionalmente, el estimulante inmunitario y el agente que induce una respuesta inmunitaria contra C. perfringens se administran concurrentemente, opcionalmente en la misma formulación. Como se usa en la presente memoria descriptiva, la palabra "concurrentemente" significa lo suficientemente cercano en el tiempo como para producir un efecto combinado (es decir, concurrentemente puede ser simultáneamente o puede se dos o más acontecimientos que se producen en u n corto intervalo de tiempo antes y/o después uno de otro). De acuerdo con la presente invención se puede usar cualquier adyuvante de vacuna adecuado, incluidos inmunoestimulantes químicos y polipeptídicos que potencian la respuesta del sistema inmunitario a los antígenos. Los adyuvantes incluyen, entre otros, un adyuvante derivado de aluminio (p. ej., hidróxido de aluminio), fosfato de aluminio aceites vegetales y animales (p. ej. , adyuvante completo o incompleto de Freund), saponina (p. ej., Quil-A, incluido QuilA QS21 ), Spur® (Intervet) y similares. Adyuvantes representativos de esta invención incluyen, entre otros, una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre), fosfato de aluminio, o alganmulín, pero también pueden ser una sal o geles minerales de calcio, magnesio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónica o amónicamente derivados, o polifosfacenos, o saponinas tales como Quil-A o emulsiones oleosas, tales como de agua en aceite y de agua en aceite en agua o adyuvantes de Freund completos o incompletos, o cualquier combinación de los mismos. La composición inmunogénica puede contener, opcionalmente, uno o más estabilizantes. Se puede usar cualquier estabilizante adecuado, incluidos hidratos de carbono tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina o glucosa; proteínas tales como albúmina o caseína; y tampones tales como fosfato de metal alcalino y similares. A menudo es conveniente inmunizar un ave contra múltiples enfermedades en un único curso de tratamiento. Por tanto, en formas de modalidad concretas, la composición inmunogénica comprende uno o más agentes adicionales que inducen una respuesta inmunitaria contra otros patógenos aviares (p. ej. , virales, bacterianos o fúngicos), opcionalmente agentes inmunizantes que producen una respuesta inmunitaria protectora. Po ejemplo, la composición inmunogénica puede además comprender un agente inmunizante contra la coccidiosis (es decir, Eimeria), bursitís infecciosa, enfermedad de Marek, enfermedad de Newcastle, gripe aviar, viruela aviar, reovirus aviar, metaneumovirus aviar, adenovirus aviar, bronquitis infecciosa, especies de Salmonella, especies de Campylobacter, especies de Pasteurella, Haemophilus paragallinarum y/o Mycoplasma. En la técnica se conocen vacunas aviares adecuadas para usar in ovo o tras la eclosión y están comercialmente disponibles (p. ej., vacuna Bursaplex™ para bursitis; vacuna NewPlex™ para la enfermedad de Newcastle y vacuna Inovocox™ para la coccidiosis, todas disponibles en Embrex, Inc., y vacuna HVT-SB-1 para la enfermedad de Marek, disponible en Merial). Las composiciones inmunogénicas que comprenden agentes de vacunas contra la coccidiosis (es decir, Eimeria) y la enteritis necrótica (es decir, C. perfringens) son particularmente ventajosas porque se sabe que la exposición a Eimeria incrementa la susceptibilidad de las aves a la enteritis necrótica al alterar el ambiente gastrointestinal. Por tanto, como otro aspecto, la invención abarca procedimientos para coadministrar una composición inmunogénica que comprende, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, una dosis inmunizante eficaz de un agente inmunizante de C. perfringens y una dosis inmunizante eficaz de un agente inmunizante que proporciona protección contra una o más enfermedades aviares distintas (como se ha descrito en lo que antecede). Los múltiples agentes inmunizantes se pueden proporcionar en una formulación única o pueden administrarse de forma concurrente o secuencial en cualquier orden en comulaciones distintas. Como se ha tratado antes, este aspecto de la invención es particularmente adecuado para la coadministración de vacunas contra la coccidiosis y la enteritis necrótica. En otra forma de modalidad representativa, el sujeto aviar se inmuniza primero contra la enteritis necrótica y después e inmuniza primero contra la coccidiosis o viceversa. Ambas inmunizaciones se pueden producir in ovo, ambas pueden realizarse después de la eclosión o una in ovo y otra después de la eclosión. Por ejemplo, en una forma de modalidad ilustrativa, el sujeto aviar se inmuniza contra la coccidiosis in ovo y después e inmuniza contra la enteritis necrótica después de la eclosión. La invención también se puede practicar para administrar un agente inmunizante de C. perfringens in ovo o después de la eclosión junto con "alimentación in ovo " {véase la patente de EE.UU. n° 6,92,878; que se incorpora en su totalidad en la presente memoria descriptiva por referencia) del sujeto aviar. Por ejemplo, de acuerdo con ciertas formas de modalidad, un agente inmunizante de C. perfringens y una formulación de nutrientes y/o un modulador entérico se administran a un sujeto aviar in ovo, opcionalmente mediante administración en el amnios. Opcionalmente, las vacunas contra otros agentes infecciosos se administran in ovo y/o después de la eclosión también (como se ha descrito en lo que antecede). El agente inmunizante de C. perfringens y la formulación de nutrientes y/o el modulador entérico se pueden administrar concurrentemente, en la misma composición o en distintas composiciones, y/o pueden administrarse secuencialmente en cualquier orden. Otras formas de modalidad de la presente invención pueden incluir una composición que comprende un antígeno seleccionado del grupo compuesto por un toxoide alfa de C. perfringens, un fragmento antigénico de un toxoide alfa de C. perfringens, un fragmento antigénico inactivo de una toxina alfa de C. perfringens, y cualquier combinación de los mismos; en las q ue una o más dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 .0 mi (p. ej. , 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ó 1.0) por dosis de la composición es suficiente para inducir al menos 0.5 unidades antitoxina (UA) de anticuerpo frente a la toxina alfa por mi de antisuero de un ave (p. ej., un pollo) vacunada con la vacuna. En algunas formas de modalidad, la composición puede inducir al menos aproximadamente 0.5, 1 .0, 1 .5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 ó 10 UA de anticuerpo antitoxina por mi de antisuero del ave. Como se usa en la presente memoria descriptiva, una "unidad antitoxina" o "UA" de anticuerpos antitoxina por mi de antisuero (que se pueden usa de forma intercambiable con unidades de "prueba neutralizante anti-toxina" o unidades de "TNT"), se define por la capacidad del suero para neutralizar los efectos tóxicos de una toxina en un bioensayo con ratones. En esta prueba, una cantidad conocida de toxina, establecida por las normas estándar internacionales tal y como se conocen en la técnica, se mezcla con diluciones seriadas de suero procedente de animales vacunados. La mezcla se incuba una hora a temperatura ambiente y después se inyecta en ratones por vía intravenosa. Los ratones sobrevivirán si la toxina es completamente neutralizada por el suero, en caso contrario morirán. Las unidades antitoxina o el título se determinan como la recíproca de la dilución más elevada del suero que neutralizó la toxina. En otras formas de modalidad, la composición puede comprender un antígeno en una preparación sin células. En otras formas de modalidad, el antígeno puede ser un toroide alfa en un sobrenadante con toxoide alfa de C. perfringens. En ciertas formas de modalidad, la composición puede comprender, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, un antigeno que puede ser un toxoide alfa de C. perfringens de tipo A y/o un toxoide alfa de C. perfringens de tipo C. En algunas formas de modalidad, la composición de esta invención puede comprender toxina beta de C. perfringens, toxina beta 2 de C. perfringens, enterotoxina de C. perfringens, toxina épsilon de C. perfringens, toxina iota de C. perfringens, toxina kappa de C. perfringens, toxina lambda de C. perfringens, toxina teta de C. perfringens, toxina hemorrágica de C. sordellii, toxina letal de C. sordellii, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile, toxina alfa de C. septicum, toxina alfa de C. novyi, toxina beta de C. noi/y/ y/o cualquier combinación de las mismas. Tal composición puede además, comprender, está constituida esencialmente por y/o está constituida por, uno o más antígenos virales, uno o más antígenos bacterianos y/o uno o más antígenos parasitarios tal y como se describe en la presente memoria descriptiva. La presente invención se explica más en los siguientes ejemplos no limitantes. En estos ejemplos, "µ?" significa microlitros, '"Vg" significa microgramos, "mi" significa mililitros, "ce" significa centímetros cúbicos, "mm" significa milímetros, "mM" significa concentración en miiimoles, "mg" significa miligramos, "°C" significa grados centígrados y E18 y E19 significan días de desarrollo embrionarios 18 y 19, respectivamente.

EJEMPLOS EJEMPLO I. Respuesta inmunitaria después de la vacunación in ovo con vacunas comercialmente disponibles contra Clostrídium perfrinqens de tipo C y D (Siteguard G & Vision CP).

Diseño experimental Manualmente se inyectó in ovo en huevos de engorde vacunas comercialmente disponibles con toxoide (Siteguard® G) y con vacuna bacteriana-toxoide (vacuna Vision® CD®)de Clostrídium perfringens. Las aves ya eclosionadas se criaron para medir las respuestas de anticuerpos. Se realizó una evaluación del punto de la inyección. El día 0 (eclosión), los grupos de tratamiento seleccionados recibieron una vacunación posterior a la eclosión. Todas las aves se almacenaron en jaulas (5 aves/jaula). En cada jaula se suministró una dieta de Normal Broiler Starter. El día 14, se pasó a las aves a pienso Broiler Grower Feed. Se extrajo sangre y suero de las aves y se analizó para determina la respuesta de anticuerpos mediante ensayo de neutralización de suero-toxina.

Materiales y Métodos Material de invección (Siteguard® G): Siteguard® G (adyuvante desconocido) es una vacuna de toxoide de C. perfringens de tipos C y D producida por Schering-Plough. Protege al ganado vacuno y ovino frente a enfermedades causadas por las toxinas de tipo C y D. Para la vacunación, se administran 4.0 mi (ganado vacuno) o 2.0 mi (ganado ovino) de la vacuna por vía subcutánea (SC) o intramuscular (IM). Las vacunaciones de refuerzo se administran de tres a cuatro semanas después de la vacunación inicial y anualmente.

Material de inyección (Vision® CP®): Vision® CD® (con el adyuvante patentado "Spur®") es una vacuna de vacuna bacteriana-toxoide de C. perfringens de tipos C y D producida por Intervet. Protege al ganado vacuno, ovino y caprino de la enterotoxemia causada por C. perfringens de tipos C y D. Para la vacunación, se administran 2.0 mi de la vacuna al animal (ganado vacuno, ovino o caprino) por vía subcutánea. De tres a cuatro semanas después de la vacunación inicial, el animal recibe 2.0 mi adicionales (SC) y después se vuelven a vacunar anualmente.

Protocolo de inyección: En E19, se inyectaron los materiales de prueba en huevos de engorde dirigidos al liquido amniótico o al cuerpo del embrión de cada huevo. Además, el día 0 después de la eclosión, los grupos de tratamiento en los que se inyectó in ovo y de forma diferente a in ovo recibieron una vacunación o inmunización de refuerzo de los materiales de prueba. Para la vacunación posterior a la eclosión o la inmunización de refuerzo se administraron 0.5 mi de vacuna mediante inyección subcutánea en el dorso del cuello.

Punto de la inyección En el momento de la inyección, en los huevos asignados para la evaluación del punto de inyección se inyectó colorante. A continuación se procedió a la eutanasia de los huevos y la necropsia de los mismos para la evaluación del punto de la inyección. El punto de la inyección se analizó mediante chi cuadrado de índice de probabilidades (Cuadro 1 ) Extracción de sangre: Los días 7, 14, 21 y 28 después de la eclosión se extrajo sangre de cada ave individual y se combinó en tubos de tipo vacutainer (por grupo de tratamiento). Los días 7, 14 y 21 se extrajo < 0.5 mi de sangre del ala o de la yugular. El día 28 se extrajo > 0.5 mi de sangre a través de punción cardíaca. A continuación, la sangre se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después, las muestras de sangre se introdujeron en una centrífuga de sobremesa a 2400 RPM durante 10 minutos. Se completó una centrifugación, se extrajo el suero de cada muestra de sangre y se almacenó en una placa de almacenamiento de 96 pocilios (2-8°C o -70°C) para futuras evaluaciones de la respuesta inmunitaria.

Prueba de neutralización de la toxina de Clostridium perfrinqens de tipo C (beta) en ratones: Preparación de la muestra para inoculación en ratones A. Materiales 1 . Toxina de Clostridium perfringens de tipo C (beta)- CVBL lote n° IRP513 (04) 2. Toxina de Clostridium perfringens de tipo C (beta)- CVBL lote n° IRP486 (04) Recepción 3. Diluyente- 1 % peptona, NaCI 0.25%, pH 7.2, BBL n° lote 051006, NB ref. - NB 140 p. 87 4. Muestras de suero de pollo- EMHE 1 381 , NB 140 P. 80 a. Muestras números 7, 8, 9, 1 0A, 10B, 1 1 A, 1 1 B, 12A, 12B, 1 3A, 14A, 1 5a 5. Viales estériles de 3 mi y 1 .8 mi.

B. Métodos: 1 . Diluir a 1 :50 la antitoxina beta estándar en diluyente, total de 1 0 mi. a. Descongelar la antitoxina beta a temperatura ambiente. b. Mezclar 200 µ? de antitoxina beta y 9.8 mi de diluyente = 1 :50. c. Mantener en hielo. 2. Diluir a 1 : 120 la toxina beta en diluyente, total de 12 mi. a. Descongelar la toxina beta a temperatura, ambiente. b. Mezclar 200 µ? de toxina beta y 1 .8 mi de diluyente = 1 : 10 c. Mezclar 1 mi de la toxina beta diluida a 1 : 10 con 1 1 mi de diluyente= 1 : 120 d. Mantener en hielo 3. Preparar la muestra control L0. a. Mezclar 0.5 mi de la toxina beta (dilución 1 : 120) con 0.5 mi de d iluyente. b. Añadir 1 mi de antitoxina beta (dilución 1 :50). c. Mezclar e incubar a temperatura, ambiente durante 1 hora. d. Mantener las muestras en hielo. 4. Preparar la muestra control U. a. Mezclar 0.8 mi de la toxina beta (dilución 1 : 120) con 0.2 mi de d iluyente. b. Añadir 1 mi de antitoxina beta (dilución 1 :50). c. Mezclar e incubar a temperatura, ambiente durante 1 hora. d. Mantener las muestras en hielo. 5. Preparar las 12 muestras de suero problema. a. Mezclar 3.25 mi de la toxina beta (dilución 1 : 120) con 3.25 mi de diluyente. b. A cada uno de los doce tubos de 1 .8 mi, añadir 0.5 mi de la toxina de la etapa 5.a. c. Etiquetar cada tubo con el número de muestra y el número de grupo de tratamiento. d. Añadir 0.5 mi de cada suero de pollo sin diluir al tubo adecuadamente etiquetado. e. Mezclar e incubar a temperatura, ambiente durante 1 hora. f. Almacenar las muestras en hielo. 6. Todas las muestras no usadas se almacenan a 2-7°C.

Actividades previas al estudio Para usar en el estudio se adquirieron setenta y ocho ratones blancos hembra Swiss (CD-1 ) (16-20 gramos de peso corporal). Los ratones se enviaron desde el proveedor (Charles River Laboratories) y se transportaron al Centro de Análisis Clínicos. Los ratones se alojaron en jaulas a razón de 2 ratones por jaula para los grupos de suero de pollo y 4 jaulas de 5 ratones por jaula para los grupos control. Los ratones se aclimataron durante un periodo de 5 días antes del inicio del estudio el día 0. Los ratones se alojaron y cuidaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar y se alimentaron con una dieta de laboratorio estándar y se les ofreció agua a demanda.

Día 0 Se examinó a los ratones para comprobar que presentaban un estado de salud y aspecto normales y se reclutaron setenta y seis ratones para la prueba. Dos ratones no fueron reclutados para el estudio y se procedió a su eutanasia. A cada ratón se le inyectó por vía intravenosa (IV) una aguja de 0.46 mm x 3/8 en la vena de la cola según los grupos de tratamiento descritos en la sección DISEÑO DEL ESTUDIO. Se controló a los ratones dos veces al día para determinar signos de shock, dolor o sufrimiento, puestos de manifiesto mediante: Letargo Apiñamiento Pelaje áspero/erizado Postura encorvada Ataxia Anorexia o incapacidad para alcanzar el alimento y el agua Se procedió a la eutanasia de los ratones moribundos mediante sobredosis de CO2 de acuerdo con los procedimientos normalizados de trabajo.

Día 1 (aproximadamente 24 horas después de la inoculación) Se observó a los ratones y se registró el número de mortalidades.

Resultados Se detectó una respuesta de anticuerpos específicos positivos en sueros de aves vacunadas in ovo (dirigido al cuerpo del embrión) con una vacuna con vacuna bacteriana-toxoide de C. perfríngens con y sin un refuerzo posterior a la eclosión usando el ensayo de neutralización de toxina en suero. Estos datos indican que la administración de una vacuna con vacuna bacteriana-toxoide de C. perfríngens in ovo provoca protección parcial y la administración in ovo seguida por un refuerzo posterior a la eclosión confiere protección completa contra C. perfríngens . (Cuadro 2) EJEMPLO II. Respuesta inmunitaria después de la vacunación in ovo con una preparación de vacuna experimental que contiene toxina alfa recombinante.

Diseño experimental El estudio anterior se realizó para determinar si se podía detectar una respuesta inmunitaria humoral (anticuerpos) en aves de engorde tras vacunaciones in ovo, in ovo + después de la eclosión o después de la eclosión con una toxina alfa recombinante de Clostridium perfringens (SEC ID N° 6) (proporcionada por el D. Glenn Songer, Dept. de Ciencias Veterinarias y Microbiología, Universidad de Arizona), adjurada con adyuvante incompleto de Freund y Quil-A. La estrategia de inmunización incluyó inoculación in ovo en el cuerpo del embrión dirigido a E 8 así como una vacunación el día 7 después de la eclosión. La respuesta de anticuerpos se evaluó a los 28 días de edad. El E18, se inyectó manualmente in ovo en los huevos de engorde con materiales control (QuilA; Accurate Chemical & Scientific Corporation, Producto n° AP04991 , grado de adyuvante, Lote n° L77-238) emulsionados con adyuvante incompleto de Freund (IFA; Rockland, Lote n° 1 6235) o toxina alfa recombinante de C. perfringens (55 o 60 con Quil A + IFA como adyuvante (13 o 15 ). La evaluación del punto de la inyección se realizó mediante inyección de colorante. El día 0 (eclosión), las aves se introdujeron en jaulas (5 aves/jaula). Las aves recibieron Normal Broiler Starter. Además, algunas aves se vacunaron el día 7 o 17 según el tratamiento (0.2 mi de vacuna mediante inyección subcutánea en el dorso del cuello). A continuación, los sueros de las aves se evaluaron para determinar la existencia de respuesta de anticuerpos específicos mediante análisis de transferencia de tipo western.

Materiales y procedimientos Inyección: El E18, se inyectó en los huevos de engorde los materiales control (toxina alfa de Clostridium perfringens + adyuvante de la vacuna) dirigidos al cuerpo del embrión en cada huevo. Además, el día 7 o el día 17 después de la eclosión, algunos grupos de tratamiento en los que se inyectó in ovo y después de la eclosión recibieron una vacunación (Cuadro 3).

Punto de la inyección (PDI): En el momento de la inyección se inyectó colorante en los huevos asignados para la evaluación del PDI. A continuación se procedió a la eutanasia y necropsia de los huevos para la evaluación del PDI (Cuadro 4).

Recolección de sueros: Los días 7.14, 21 y 28 después de la eclosión se recolectó sangre de cada ave individual y se introdujo en tubos de tipo vacutainer individuales. Los días 7, 14 y 21 se recolectó < 0.5 mi de sangre a través del ala o de la yugular. El día 28, se recolectó = 0.5 mi de sangre a través de punción cardíaca. A continuación la sangre se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las muestras de sangre se centrifugaron y se retiró el suero y se almacenó en una placa de almacenamiento de 96 pocilios (2-8°C o -70°C) para la evaluación de la respuesta inmunitaria.

Análisis de transferencia de tipo Western: Se realizó una electroforesis en gel de placa de SDS de acuerdo con el procedimiento de Laemli (Nature 227: 680-685 (1970)) tal y como describe O'Farrell (J. Biol. Chem. 250: 4007-4021 (1975), segunda dimensión) usando una placa de gel de acrilamida al 10% (longitud de 125 mm x anchura de 150 mm x espesor de 0.75 mm) superpuesto con un gel de apilamiento de 25 mm. La electroforesis se llevó a cabo a 12 mAmp durante aproximadamente 3.5 horas o hasta que el frontal de azul de bromofenol había migrado hasta el extremo de las láminas de geles. Tras la electroforesis en placa de gel, el gel para la transferencia se introdujo en tampón de transferencia (12.5 mM de Tris, pH 8.8, glicina 96 mM, MEOH 20%) y se transfirió a una membrana de PVDF durante la noche a 200 mA y a aproximadamente 100 voltios/dos geles. La membrana de PVDF se tiñó después con azul de Coomassie y se secó entre láminas de papel de filtro. La membrana de PVDF se tiñó con azul de Coomassie R-250 y se sometió a barrido de sobremesa antes y después del corte en calles individuales. Cada carril de transferencia se introdujo en un contenedor distinto y se bloqueó durante dos horas en leche desecada sin grasa al 5% en solución salina tamponada con Tween-20 Tris (TTBS) y se aclaró en TTBS. A continuación, los puntos de transferencias se incubaron en anticuerpos primarios (diluidos a 1 : 100 en leche desecada sin grasa al 2% en TTBS) durante la noche y se aclararon 3 veces durante 10 minutos en TTBS. El carril de transferencia 1 (Control positivo) se introdujo entonces en anticuerpos secundarios [IgG-HRP anti-cabra de conejo (Sigma, Cat, n° A-5420 y lote n° 034K4858), se diluyó a 1 :5,000 en LDSG al 2% en TTBS] durante dos horas, se aclaró 3 veces durante 10 minutos en TTBS, se trató con ECL y se expuso a una película de rayos X. Los carriles de transferencia restantes se introdujeron individualmente en anticuerpos secundarios [IgG-HRP anti-pollo de conejo (Bethyl, cat. N° A30-107P y lote n° A30-107P-3), se diluyeron a 1 :2,000 en leche desecada sin grasa al 2% en TTBS] durante dos horas, se aclararon 3 veces durante 10 minutos en TTBS, se trataron con ECL y se expusieron a una película de rayos X. Los resultados de los estudios de transferencia de tipo western se describen en el cuadro 5.

Resultados Se detectó una respuesta de anticuerpos específicos en aves vacunadas in ovo (dirigido al cuerpo del embrión) con una vacuna con toxina alfa recombinante Quil-A e IFA como adyuvante con y sin un refuerzo después de la eclosión. Estos datos demuestran que la vacunación in ovo con una toxina alfa recombinante puede provocar una respuesta inmunitaria contra la toxina alfa de C. períringens en aves de engorde.

EJEMPLO III Una vacuna ¡nactivada de emulsión oleosa comercialmente disponible para la enfermedad de Newcastle se adquirió de Maine Biological Laboratories. La vacuna se administró in ovo el E18 a través de la vía del líquido amniótico o in ovo el E19 a través de la vía del cuerpo del embrión. La administración dirigida al sitio hacia el líquido amniótico y el cuerpo del embrión se confirmó mediante análisis del punto de inyección con colorante el E18 o E19. La administración dirigida al sitio en el líquido amniótico se realizó usando una aguja roma (Grupo 2). La administración dirigida al sitio en el cuerpo del embrión se realizó usando una aguja con extremo en punta de 3.18 cm (Grupo 3). El suero sanguíneo se recolectó a los 14, 21 y 28 días de edad y se analizó la existencia de anticuerpos específicos frente al virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) usando ELISA (Idexx, Inc.). Cada día de recolección de sangre se extrajo sangre de diferentes aves individuales. El análisis del sitio de inyección el E18 indicó que en 22/24 huevos se había inyectado en el líquido amniótico, 22/24 en el líquido alantoideo y 0/24 en el cuerpo del embrión. El análisis del sitio de inyección el E19 indicó que en 7/10 huevos se había inyectado en el cuerpo del embrión y en 3/10 se inyectó en el líquido amniótico. El cuadro 6 muestra la respuesta de anticuerpos frente al virus de la enfermedad de Newcastle después de la vacunación in ovo de pollos. El cuadro 7 muestra los datos del porcentaje de eclosión.

El estudio demuestra que la respuesta inmunitaria del embrión en desarrollo está fuertemente influida por el sitio de la administración in ovo de la vacuna inactivada de emulsión oleosa contra la enfermedad de Newcastle (cuadro 6). Los embriones vacunados en el líquido amniótico que rodea al cuerpo del embrión no respondieron con anticuerpos específicos frente a la enfermedad de Newcastle. Por el contrario, los embriones vacunados directamente en el cuerpo del embrión respondieron con una fuerte respuesta de anticuerpos que aumentó con la edad hasta los 28 días. Durante el curso de este estudio se extrajo sangre de un total de 34 aves y 26/34 dieron resultados positivos para anticuerpos frente al virus la enfermedad de Newcastle (cuadro 6). La cifra de 26/34 es un 76.5%, que es muy similar a la obtenida en el estudio del punto de inyección en el que el 70% de los embriones inmunizados el E19 fue inyectado en el cuerpo del embrión. El porcentaje de eclosión se encontraba dentro de los límites normales para los grupos tratados y no tratados (cuadro 7).

EJEMPLO IV Una vacuna inactivada de emulsión oleosa comercialmente disponible para la enfermedad de Newcastle se adquirió de Maine Biological Laboratories. La vacuna se administró in ovo el E19 a través de la vía del cuerpo del embrión o por vía subcutánea en la eclosión. La administración dirigida al sitio en el cuerpo del embrión se realizó usando una aguja con extremo en punta de 3.18 cm (Grupo 3). El día de la vacunación en la eclosión se realizó inyectando la vacuna por vía subcutánea en la nuca de los polluelos recién eclosionados (Grupo 2). El suero sanguíneo se recolectó a los 21 días de edad y se analizó la existencia de anticuerpos específicos frente NDV usando ELISA (Idexx, Inc.). Los resultados se muestran en el cuadro 8. Los datos presentados en el cuadro 8 muestran que los embriones vacunados en el cuerpo con la vacuna de emulsión oleosa contra la enfermedad de Newcastle respondían tan bien como los polluelos vacunados mediante la vía estándar el d ía de la eclosión. El porcentaje de eclosión se encontraba dentro de los límites normales para los grupos tratados y no tratados (cuadro 9). Los datos presentados en los ejemplos III y IV anteriores muestran que apuntar al cuerpo del embrión es necesario para estimular una respuesta ¡nmunitaha activa contra un antigeno inactivado (en este caso el virus de la enfermedad de Newcastle). Estos datos también indican que los embriones no se ven afectados negativamente por la inyección en el cuerpo del embrión de un antígeno inactivado en un adyuvante de emulsión oleosa. La inyección in ovo (antes de la eclosión) en el cuerpo del embrión se puede realizar manualmente usando una jeringuilla y aguja o mediante un dispositivo de inyección automática también con agujas. En los ejemplos que se proporcionan en la presente memoria descriptiva se usaron manualmente jeringuillas y agujas para aplicar la vacuna en el cuerpo del embrión o en el líquido amniótico (sólo en el ejemplo I II) que rodea al cuerpo del embrión. Para realizar la inyección en el cuerpo del embrión, la aguja se insertó a través de un orificio practicado en la cáscara en el extremo de célula aérea del huevo. La aguja insertada pasó a través de la membrana de la célula aérea, las membranas alantoideas y el líquido alantoideo y, finalmente, llegó a la cavidad amniótica en la que reside el cuerpo del embrión. A continuación, la aguja penetró en el cuerpo del embrión y se depositó la vacuna. Las inyecciones en el cuerpo del embrión se pueden producir en numerosos puntos dentro del cuerpo del embrión e incluye el depósito subcutáneo, intradérmico, intravenoso, intramuscular e intraabdominal de la vacuna, así como cualquier combinación de estos puntos. Además, las inyecciones en el cuerpo del embrión se pueden producir en la cabeza, cuello, hombro, alas, dorso, pecho o pata, incluidas todas las combinaciones. La inyección en el cuerpo del embrión no incluye el depósito exclusivo de la vacuna en la célula aérea, la cavidad alantoidea, el líquido amniótico o la albúmina. La inyección en el cuerpo del embrión in ovo puede realizarse usando una aguja de una longitud variable de 1 .91 cm a 10.2 cm y de diámetros que varían de 1 .83 mm a 0.38 mm. Las puntas de las agujas pueden va ar desde muy afiladas (hipodérmicas) a romas. En los ejemplos III y IV, como modelo de antígeno se usó una vacuna contra el virus de la enfermedad de Newcastle. No obstante, cabría esperar que cualquier vacuna de emulsión oleosa formulada adecuadamente y con suficiente masa antigénica fuera similar a la vacuna contra el virus de la enfermedad de Newcastle analizada. Por tanto, las vacunas inactivadas frente a bursitis infecciosa, gripe aviar, bronquitis infecciosa, infección por el virus de la anemia del pollo, laringotraqueitis aviar, reovirus aviar, adenovirus, rotavirus, astrovirus, hepatitis de cuerpos de inclusión, síndrome de caída de la puesta, Escherichia coli, especies de Mycoplasma, especies de Salmonella, especies de Campylobacter, especies de Clostridium, especies de Haemophilus, especies de Pasteurella se pueden administrar in ovo directamente en el cuerpo del embrión de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva. Las vacunas hechas a partir de estos agentes puede ser de células enteras o de subunidades. Las vacunas hechas a partir de estos agentes pueden producirse convencionalmente en medios de crecimiento, huevos o cultivos tisulares y/o puede producirse por medios recombinantes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Además, también cabría esperar que cualquier agente de enfermedad que se puede producir de modo que posea suficiente masa antigénica para vacunar con eficacia el día de la eclosión de los polluelos cuando está inactivada vacunara de forma eficaz a los embriones in ovo si se administra d irectamente en el cuerpo del embrión. El adyuvante usado en la vacuna analizada en estos ejemplos fue una emulsión oleosa comercial típica. Cabría esperar que las vacunas inactivadas en emulsión no oleosa con adyuvantes distintos a aceite produjeran una respuesta inmunitaria activa si se administran directamente en el cuerpo del embrión antes de la eclosión. Adyuvantes adecuados incluirían, entre otros, geles minerales, polianiones, polioles plurónicos, derivados de saponina, lisolecitina y otras sustancias similares de superficie activa, glicósidos y todos tipos de aceites y combinaciones de los mismos.

EJEMPLO V Aves de raza Leghorn sin patógenos específicos (SPE) se vacunaron in ovo del siguiente modo Grupo 1 : solución salina tamponada con fosfato (PBS); Grupos 2 y 3: 0.3 x 109 de NDV inactivada a DIH50/dosis en PBS; Grupo 4: 0.3 x 109 de NDV inactivada a DIH5o/dosis mezclada con un adyuvante de liberación prolongada de alumbre (Imject, Pierce; hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio); Grupo 5: una vacuna en emulsión oleosa comercial para la NDV. A los 1 1 días de edad, los sujetos del grupo 3 recibieron una segunda dosis de NDV en PBS mediante inyección subcutánea. Las vacunas administradas in ovo se dirigieron al cuerpo del embrión y en un grupo diferente de huevos similares se realizó un análisis del punto de inyección usando colorante para estimar el porcentaje de embriones a los que se había inyectado directamente en el cuerpo del embrión. La vacunación in ovo se realizó el día 19 de la incubación con una aguja de 0.61 mm y 3.17 cm. Catorce aves por grupo se introdujeron en jaulas y se criaron hasta los 21 días de edad. Las muestras de suero se recogieron a los 21 días de edad y mediante ELISA (Idexx, Inc.) se analizó la presencia de anticuerpos IgH frente a NDV. En las muestras de suero de los grupos 2, 4 y 5 también se analizó para determinar la presencia de anticuerpos específicos frente a NDV mediante inhibición de la hemaglutinación (IH) usando cuatro unidades AH. El número de muestras analizadas mediante IH difiere del de las analizadas mediante ELISA porque de varias muestras no se recolectó suficiente suero para realizar la prueba IH. Se consideró que las aves mostraban una respuesta de anticuerpos mensurable (es decir, seroconversión) frente a la vacunación si la muestra de suero presentaba un título en ELISA > 200 o un título en IH > 3.0 log2 (Es decir, título de 1 :8).

Resultados El análisis del punto de inyección indica que las inyecciones en el cuerpo del embrión representaban el 78% de todas las inyecciones (cuadro 1 0). El porcentaje de eclosiones y el índice de seroconversión frente a NDV medidos mediante ELISA se muestran en el cuadro 1 1 . En el cuadro 1 2 se expone el número de aves seroconvertidas usando la prueba de IH. A partir de estos estudios se observaron los siguientes puntos clave. 1 ) El antígeno de NDV en PBS no estimulaba una respuesta de anticuerpos mensurable mediante ELISA de NDV, incluso cuando el antígeno de NDV inactivado se administró dos veces como en el grupo 3 (una vez in ovo y de nuevo a los 1 1 días de edad); 2) La NDV-alumbre (grupo 4) estimulaba seroconversión en 8/14 aves cuando se midió mediante ELISA, mientras que la vacuna comercial de emulsión oleosa (grupo 5) estimulaba seroconversión en 10/13 aves cuando se midió mediante ELISA; 3) La NDV-alumbre (grupo 4) estimulaba seroconversión en 12/14 aves cuando se midió mediante IH, mientras que la vacuna de emulsión oleosa estimulaba seroconversión en 1 1/1 1 aves cuando se midió mediante IH; y 5) la vacuna comercial de emulsión oleosa para la enfermedad de Newcastle (grupo 5) estimulaba una respuesta de anticuerpos más fuerte que la vacuna de NDV-alumbre (grupo 4). El Ejemplo III muestra que la administración in ovo de un antígeno presentado en una emulsión oleosa con adyuvante de liberación prolongada requería que la vacuna se administrara en el cuerpo del embrión para estimular una respuesta de anticuerpos mensurable mediante ELISA. En el presente ejemplo, el análisis del punto de inyección in ovo indicó que el 78% de los huevos recibieron la vacuna directamente en el cuerpo del embrión.

EJEMPLO VI Se condujo un estudio utilizando leghorn SPE para determinar si el adyuvante de liberación prolongada de alumbre estimuló una respuesta inmunitaria cuando se administró in ovo. Los grupos analizados fueron los siguientes: Grupo 1 : solución salina tamponada con fosfato (PBS) in ovo; Grupos 2 y 3: 1 .2 x 109 de NDV inactivada a DIH50 ß-propiolactona/dosis en PBS in ovo; Grupo 4: administración in ovo de 1.2 x 109 de NDV inactivada a DI H5o ß-propiolactona/dosis mezclada con un alumbre en una relación de 30%:70% de alumbre a antígeno NDV. El alumbre utilizado fue una solución comercial de hidróxido de aluminio e hidróxido de magnesio (Imject, Pierce). El Grupo 3 recibió una dosis adicional del antígeno NDV en PBS en el día 1 1 de edad por medio de una inyección subcutánea. La administración in ovo se realizó el día 1 9 de la incubación utilizando una aguja de calibre de 31 .75 mm. Las vacunas se aplicaron in ovo al cuerpo del embrión y se condujo un análisis de punto de inyección en un conjunto separado de huevos similares para calcular el porcentaje de embriones inyectados directamente en el cuerpo del embrión. Las muestras de suero se tomaron en el día 21 de edad y se analizaron para anticuerpos a NDV mediante ELISA (Indexx, Inc.). Se consideró que las aves mostraron una respuesta a anticuerpos mensurable (es decir, seroconvertída) si ELISA presentaba un título > de 200.

Resultados El análisis de punto de inyección indica que el 81 % de los embriones fueron inyectados directamente en el cuerpo del embrión (Cuadro 1 3). La eclosión por ciento y el índice y magnitud de la seroconversión frente al virus de enfermedades de Newcastle se muestran en el Cuadro 14. Estos estudios proporcionaron los siguientes puntos clave: 1 ) Los embriones fueron inyectados el E 9 y los datos del punto de inyección indicaron que el 81 % de los embriones fueron inyectados en el cuerpo del embrión; y 2) En este estudio, el alumbre se mezcló con NDV inactívada de ß- propiolactona en una relación de 30% a 70% y ésta difirió del estudio aquí descrito en el Ejemplo V, en el cual la NDV inactivada en calor se mezcló en una relación de 50% de alumbre a 50% de antígeno NDV. La diferencia en las respuestas inmunitarias en los dos estudios puede deberse a las diferencias en el antígeno NDV utilizado y/o la diferencia en las relaciones de alumbre a antígeno analizadas, así como las diferencias en ELISA utilizada para medir los anticuerpos. En el ejemplo III, se mostró que el antígeno presentado en la emulsión oleosa de adyuvante de liberación prolongada requiere que se suministre la vacuna in ovo en el cuerpo del embrión para estimular una respuesta de anticuerpos mensurable mediante ELISA. En este estudio, el análisis de punto de inyección indicó que el 81 % de los embriones fueron inyectados en el cuerpo del embrión y a partir de estos datos podría esperarse que aproximadamente 1 1 de 14 huevos vacunados in ovo tendrían una respuesta de anticuerpos. El número real que respondió fue nueve de 14.

EJEMPLO VII Se aplicó a las aves de engorde una vacuna comercial contra la enfermedad de Newcastle en emulsión oleosa vía in ovo. Este estudio determinó la capacidad de las aves de engorde a responder a los antígenos virales de la enfermedad de Newcastle inactivada cuando se suministraba in ovo mediante el líquido amniótico y vía intraembrionaria. Se extrajo sangre de las aves en los días de edad 13, 21 , 26 y 35 y el título de anticuerpos a NDV se determinó utilizando ELISA (Idexx. Inc.). El análisis de punto de inyección se condujo en el E18 y E19 utilizando colorante. Los datos de eclosión se muestran en el Cuadro 16. La eclosión por ciento fue normal cuando se suministró la vacuna de emulsión oleosa en el cuerpo del embrión. El punto de inyección (cuadro 15) fue muy preciso, con más del 90% de los embriones inyectados por la vía indicada para el tratamiento (cuadro 16). Los datos de la respuesta de anticuerpos específica frente al virus de la enfermedad de Newcastle se muestran en el cuadro 17. Se puede ver que las aves respondían al antígeno de Newcastle cuando la vacuna se administraba in ovo en el cuerpo del embrión o por vía subcutánea tras la eclosión. Cuando la vacuna frente a NDV se administró in ovo en el líquido amniótico no se produjo respuesta de anticuerpos, lo que indicaba que la vacuna debía administrarse en el cuerpo del embrión para estimular una respuesta ¡nmunitaria adecuada. Lo anterior es ilustrativo de la presente invención y no debe interpretarse como limitante de la misma. La invención está definida por las reivindicaciones siguientes, con equivalentes de las reivindicaciones que se han de incluir aqui.

CUADRO 1 Porcentaje de eclosión y punto de inyección Los huevos que recibieron Vision CD o Siteguard G mostraron índices de eclosión ligeramente menores que los huevos que recibieron material control (82.5% y 75.0% frente a 95.0%, respectivamente).

CUADRO 2 Resultados del ensayo de neutralización de toxina en suero: Todos los sueros se combinaron (~ 5 aves/grupo) • Se detectó una respuesta positiva específica en aves vacunadas in ovo (dirigida la vacuna al cuerpo del embrión) con la vacuna vacuna bacteriana-toxoide de C. perfringens (Vision CD) seguida por un refuerzo tras la eclosión. Los resultados sugirieron una baja respuesta de anticuerpos (protección parcial) en aves vacunadas in ovo solo (sin refuerzo tras la eclosión). • No se observó protección en los sueros de aves vacunados con una vacuna de toroide de C. perfríngens (Siteguard).

CUADRO 3 Resumen del estudio Ave De engorde Día de la E18, D7 y D 17 inyección Tipo de Embrión ± refuerzo post eclosión inyecciones (D7), sólo refuerzo post eclosión (D7) sin refuerzo (D7) Control No inyectados (perforados) Materiales de Toxina alfa recombinante inactivada ensayo (SEC ID N° 6), adyuvante Quil A + adyuvante incompleto de Freund Dosis de la toxina 55.2-60 Lig/0.2 mi CUADRO 4 Porcentaje de eclosiones y punto de inyección Se alcanzó un porcentaje de eclosión del 96% tras la vacunación in ovo con la toxina alfa recombinante. Se alcanzó una diana del 72.16% usando la aguja de 0.91 mm 3.81 cm.

CUADRO 5 Detección de la respuesta de anticuerpos específica mediante análisis de transferencia tipo western.

• Los controles positivos y negativos funcionaron como estaba previsto, lo que demostró la validez de la prueba. • Se detectó una respuesta positiva específica en aves vacunadas in ovo (dirigida la vacuna al cuerpo del embrión) con la formulación de la toxina alfa recombinante con y sin un refuerzo después de la eclosión.

CUADRO 6 Respuesta de anticuerpos en pollos al virus de la enfermedad de Newcastle tras la administración in ovo dirigida por sitio de una vacuna inactivada en emulsión oleosa frente a la enfermedad de Newcastle número de aves positivos para anticuerpos frente a la enfermedad de Newcastle/número de aves analizadas CUADRO 7 Porcentaje de eclosiones tras la administración in ovo dirigida por sitio de una vacuna inactivada en emulsión oleosa frente a la enfermedad de Newcastle Grupo Vía de la vacuna Datos de porcentaje de eclosiones N° eclosionados Porcentaje N° transferidos eclosionados 1 No vacunado 48/50 96% 2 Vacuna de NDV in 51 /60 85% ovo en líquido amniótico 3 Vacuna de NDV in 48/60 80% ovo en cuerpo del embrión CUADRO 8 Respuesta de anticuerpos en pollos al virus de la enfermedad de Newcastle tras la administración in ovo intraembrionaria o la administración subcutánea el día de la eclosión de una vacuna inactivada en emulsión oleosa frente a la enfermedad de Newcastle CUADRO 9 Porcentaje de eclosiones tras la administración in ovo intraembrionaria de una vacuna inactivada en emulsión oleosa frente a la enfermedad de Newcastle Grupo Vía de la vacuna Datos de porcentaje de eclosiones N° eclosionados Porcentaje N° transferidos eclosionados 1 Tampón in ovo en 7/21 81 % cuerpo del embrión 2 No vacunados 80/101 79.2% 3 Vacuna de NDV in 18/20 90% ovo en cuerpo del embrión CUADRO 10 Punto de inyección usando colorante CUADRO 11 Porcentaje de eclosiones y resultados del ELISA del NDV de aves vacunadas in ovo con antígeno de NDV, antígeno de NDV-alumbre o una vacuna de NDV de emulsión oleosa ** NDV-OE= vacuna comercial en emulsión oleosa para la NDV(LAHI) NA= no aplicable CUADRO 12 Resultados de la inhibición de hemaglutinación de NDV de aves de engorde vacunadas in ovo con antígeno NDV-alumbre o una vacuna en emulsión oleosa de NDV ** NDV-OE= vacuna comercial en emulsión oleosa para la NDV(LAHI) CUADRO 13 Resultados del punto de inyección Tratamiento Célula Saco Líquido Cuerpo Saco I aérea alantoides amniótico del vitelino embrión 0.61 mm x 0% 2, 1 % 16.7% 81 .3% 0% A 31 .7 cm CUADRO 14 Porcentaje de eclosiones y resultados del ELISA de pollos de engorde vacunados in ovo con antígeno de NDV o NDV-alumbre *Ambos tratamientos con NDV procedían del mismo grupo de aves eclosionadas; NA= no aplicable CUADRO 15 Sitio de inyección para la administración in ovo dirigida por sitio de una vacuna inactivada en emulsión oleosa frente al virus de la enfermedad de Newcastle Edad del Punto de la inyección embrión al inyectar Día 18,0 Cuerpo del Líquido Líquido embrión amniótico alantoides 1/34 33/34 0 % 2,9 97, 1 0 Día 19 Cuerpo del Liquido Liquido embrión amniótico alantoides 57/63 6/63 0 % 90.5 9.5 0,0 CUADRI 16 Grupos de tratamiento y porcentaje de eclosiones para grupos de aves de engorde a las que se ha administrado in ovo una vacuna en emulsión oleosa de NDV 1 Emulsión oleosa de NDV- formulada para el día de edad de los polluelos, 1 dosis en 0.1 mi CUADRO 17 Respuesta de anticuerpos al NDV en aves de engorde inmunizadas con una vacuna de emulsión oleosa de NDV in ovo.

Emulsión oleosa de NDV- formulada para el día de edad de los polluelos, 1 dosis en 0.1 mi

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 . El uso de una composición inmunogénica que comprende al menos un toxoide de Clostridium perfringens, una vacuna bacteriana de Clostridium perfringens o una toxina de Clostridium perfringens, para la elaboración de una vacuna útil para inmunizar un sujeto aviar contra infecciones por Clostridium, en donde dicha vacuna está adaptada para ser administrable in ovo durante el último cuarto de incubación.

2. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna está adaptada para ser administrable en el amnios.

3. El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable axialmente a través del extremo grande del huevo en el liquido amniótico.

4. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna está adaptada para ser administrable directamente en el cuerpo del embrión.

5. El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable al embrión parenteralmente.

6. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto aviar es un pollo.

7. El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable desde el día 15 al día 20 de la incubación.

8. El uso como se reclama en la reivindicación 6, en donde la vacuna está adaptada para ser administrable el día 18 o el día 19 de la incubación.

9. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto aviar es un pavo.

10. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición inmunogénica comprende un toxoide de Clostridium períringens.

1 1 . El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición inmunogénica comprende una vacuna bacteriana de Clostridium períringens.

12. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición inmunogénica comprende un toxoide de Clostridium períringens y una vacuna bacteriana de Clostridium períringens.

13. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la composición inmunogénica comprende una toxina de Clostridium períringens.

14. El uso como se reclama en la reivindicación 1 3, en donde la toxina de Clostridium perfringens es una toxina alfa de Clostridium perfringens.

1 5. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la 5 composición inmunogénica comprende un Clostridium perfringens atenuado.

16. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna comprende una emulsión de agua en aceite en agua.

17. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna comprende un adyuvante.

I 0 18. El uso como se reclama en la reivindicación 17, en donde el adyuvante comprende un adyuvante derivado de aluminio, una saponina, un aceite, o cualquier combinación de los anteriores.

19. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está adaptado adicionalmente para ser administrable in ovo con 15 un estimulante inmunitario en cualquier momento durante la incubación.

20. El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna está adaptada adicionalmente para ser administrable in ovo con una vacuna contra la coccidiosis, una vacuna contra la enfermedad de Marek, una vacuna contra la bursitis infecciosa, una vacuna contra la enfermedad de 20 Newcastle, una vacuna contra la viruela aviar o cualquier combinación de las anteriores.

21 . El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde la vacuna está adaptada para ser administrable in ovo con una formulación nutriente, un modulador entérico o una combinación de los mismos.