JP2020533338A - ワクチン分子 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、ターゲティングユニットおよび変異型抗原性ユニットを含むモノマーから形成された、ヘテロ二量体化ユニットによって連結されたヘテロ二量体ワクチン分子のワクチン、これらに限定されないが特に、組成物、方法、および使用に関する技術が提供される。
Description
本明細書では、ターゲティングユニットおよび変異型抗原性ユニットを含むモノマーから形成された、ヘテロ二量体化ユニットによって連結されたヘテロ二量体ワクチン分子のワクチン、これらに限定されないが特に、組成物、方法、および使用に関する技術が提供される。
Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒト集団の間を循環し、重大な罹患率および死亡率を引き起こす。季節性及び新型インフルエンザに対する不活化及び弱毒化生ワクチンのほとんどは株特異的であり、年１回の多価ワクチン製剤に用いられる株の絶え間ない更新が必要である。また、ヒト集団において免疫がない人畜共通感染症では、２００９年の豚インフルエンザのように、ときにパンデミック株が出現することがある［１］［２］。鳥Ｈ５Ｎ１およびＨ７Ｎ９ウイルスによるヒト感染は、Ａ型インフルエンザウイルスの動物リザーバによってもたらされる潜在的リスクをさらに強調する。従って、インフルエンザの全血清型に至るまでの広範な中和抗体を誘導するインフルエンザワクチンが緊急に必要とされている。
サブユニットワクチンにおけるタンパク質抗原の免疫原性を増大させる公知の方法は、化学的［３〜５］または遺伝的に［６〜９］、抗原提示細胞を標的とする抗体または抗体断片に抗原を組み込むことである。この原理は、ＡＰＣ特異的融合タンパク質をコードするＤＮＡプラスミドを構築することによって、ＤＮＡワクチン接種にまで拡大された。このように、ＤＮＡワクチン接種によってin vivoでトランスフェクトされた細胞は、ＡＰＣへの抗原の送達を促進する融合タンパク質を分泌し、その結果、免疫反応が改善される［１０〜１４］。ＤＮＡワクチンの注射部位をエレクトロポレーションすることで、効率的な取り込みとワクチンタンパク質への翻訳が確実に行われる［１２］。さらに免疫原性を高めるために、ボジェンと共同研究者らは、二量体標的ＤＮＡワクチンを開発した［１２，１３］。２つのターゲティングユニットおよび２つの抗原性ユニットを含む二量体型は、結合活性を増加させた。このホモ二量体ワクチンにおいて見出される異種配列が組み合わさったこの二価性は、短期アッセイにおける単量体のワクチンよりも抗体反応を増加させた［１５］。
本明細書では、ターゲティングユニットおよび変異型抗原性ユニットを含むモノマーから形成された、ヘテロ二量体化ユニットによって連結されたヘテロ二量体ワクチン分子のワクチン、これらに限定されないが特に、組成物、方法、および使用に関する技術が提供される。
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、
第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含むＤＮＡワクチンであって、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードし、
上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質であり、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞へ導入される場合、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が発現され、上記ヘテロ二量体化ユニットの会合を介して、第１のヘテロ二量体タンパク質が形成される、ＤＮＡワクチンを提供する。
第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含むＤＮＡワクチンであって、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードし、
上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質であり、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞へ導入される場合、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が発現され、上記ヘテロ二量体化ユニットの会合を介して、第１のヘテロ二量体タンパク質が形成される、ＤＮＡワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、ＡＣＩＤヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化ドメインを形成するＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニットである。いくつかの実施形態において、 上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、バルスターヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインを形成するバルナーゼヘテロ二量体化ユニットである。
いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは同一である。いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは異なっている。いくつかの実施形態において、上記ターゲティングユニットは、抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、上記ターゲティングユニットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ターゲティングユニットである。いくつかの実施形態において、上記ＡＰＣターゲティングユニットは、ＭＨＣ−ＩＩ分子、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＰ、Ｔｏｌｌ様受容体およびケモカイン受容体からなる群より選択される標的に結合する。
いくつかの実施形態において、上記変異型抗原標的タンパク質は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有するか、または約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有する上記変異型抗原標的タンパク質中、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０アミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００アミノ酸である保存領域を有する。いくつかの実施形態において、異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、生物の異なる菌株または血清型由来である。いくつかの実施形態において、上記生物は、病原性生物である。いくつかの実施形態において、上記生物は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）の変異体である。いくつかの実施形態において、ワクチンは、インフルエンザウイルスの少なくとも３、４、５または６および最大１２または１８の菌株または血清型由来のＨＡの変異体を含む。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスは、グループ１のインフルエンザウイルスおよびグループ２のインフルエンザウイルスからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記グループ１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群より選択され、上記グループ２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、ガン抗原（例えば、ｎｅｏ−エピトープ）の変異体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも第３の核酸構築物および第４の核酸構築物をさらに含むＤＮＡワクチンであって、上記第３の核酸構築物および上記第４の核酸構築物は、第３の融合タンパク質および第４の融合タンパク質をコードし、上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、各上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質である。いくつかの実施形態では、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質を用いた細胞内での上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質の発現によって、ヘテロ二量体タンパク質の混合物が産生される。いくつかの実施形態において、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞内で発現される場合、上記ヘテロ二量体タンパク質の産生は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質の産生が実質的に存在しないことを特徴とする。いくつかの実施形態において、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物ならびに上記少なくとも第３の核酸構築物および第４の核酸構築物が細胞内で発現される場合、上記ヘテロ二量体タンパク質の産生は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質の産生が実質的に存在しないことを特徴とする。
いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質をコードする配列は、プロモータ、好ましくは外因性プロモータに動作可能に連結されている。
いくつかの実施形態において，本発明は、
ヘテロ二量体タンパク質分子を含むワクチン組成物であって、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、第１の融合タンパク質モノマーおよび第２の融合タンパク質モノマーを含み、
上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニット、および抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーのにおける上記抗原性ユニットは、異なる変異型抗原標的タンパク質をコードすることによって異なり、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、上記二量体化ドメインの会合によって連結された２つの上記モノマーを含む、ワクチン組成物を提供する。
ヘテロ二量体タンパク質分子を含むワクチン組成物であって、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、第１の融合タンパク質モノマーおよび第２の融合タンパク質モノマーを含み、
上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニット、および抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーのにおける上記抗原性ユニットは、異なる変異型抗原標的タンパク質をコードすることによって異なり、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、上記二量体化ドメインの会合によって連結された２つの上記モノマーを含む、ワクチン組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの一方における上記ヘテロ二量体化ユニットが、ＡＣＩＤヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化ドメインを形成するＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニットである。いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、バルスターヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインを形成するバルナーゼヘテロ二量体化ユニットである。
いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは同一である。いくつかの実施形態において、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは異なっている。いくつかの実施形態において、上記ターゲティングユニットは、抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、上記ターゲティングユニットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ターゲティングユニットである。いくつかの実施形態において、上記ＡＰＣターゲティングユニットは、ＭＨＣ−ＩＩ分子、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、およびケモカイン受容体からなる群より選択される標的に結合する。
いくつかの実施形態において、上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有するか、または約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有する上記変異型抗原標的タンパク質中、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０アミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００アミノ酸である保存領域を有する。いくつかの実施形態において、上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、生物の異なる菌株または血清型由来である。いくつかの実施形態では、記生物は、病原性生物である。いくつかの実施形態において、上記生物は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）の変異体である。いくつかの実施形態において、ワクチンは、インフルエンザウイルスの少なくとも３、４、５または６および最大１２または１８の菌株または血清型由来のＨＡの変異体を含む。いくつかの実施形態において、上記インフルエンザウイルスは、グループ１のインフルエンザウイルスおよびグループ２のインフルエンザウイルスからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記グループ１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群より選択され、上記グループ２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、ガン抗原の変異体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも第３の融合タンパク質モノマーおよび第４の融合タンパク質モノマーをさらに含むワクチン組成物であって、上記第３の融合タンパク質モノマーおよび上記第４の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、各上記第３の融合タンパク質モノマーおよび上記第４の融合タンパク質モノマーにおける上記抗原性ユニットは、上記変異型抗原標的タンパク質の異なる型をコードすることで異なる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、上記第１のモノマーおよび上記第２のモノマーならびに少なくとも第３のモノマーおよび第４のモノマーの全ての考えられる組み合わせを有することを特徴とするヘテロ二量体タンパク質の混合物を含む。いくつかの実施形態において、上記ワクチン組成物は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質が実質的に存在しないことを特徴とする。いくつかの実施形態において、上記ワクチン組成物は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質が実質的に存在しないことを特徴とする。
いくつかの実施形態において，本発明は、上述のＤＮＡワクチンまたはワクチン組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬製剤を提供する。
いくつかの実施形態，本発明は、上述のワクチン組成物と、アジュバントとを含む、ワクチン製剤を提供する。
いくつかの実施形態において，本発明は、被対象に、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を投与することを含む、対象において変異型抗原標的タンパク質に対する免疫性を与える、または免疫反応を誘導する方法を提供する。いくつかの実施形態において、該方法は、上記対象への、上述のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の第２の投与をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法は、上記対象に、１つ以上の標的でない変異型抗原標的タンパク質サブユニットを含む第２のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態において，本発明は、上述のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を必要とする対象において、免疫性を与えるまたは免疫反応を誘導するための、上述のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用を提供する。
いくつかの実施形態において，本発明は、病原体による感染を予防または治療するためのワクチンとしての、上述のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用を提供する。
いくつかの実施形態において，本発明は、癌を予防または治療するためのワクチンとしての、上述のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用を提供する。
さらなる実施形態は、当業者にとって、本明細書に含まれる教示に基づき明らかであろう。
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の図面を参照することにより、より良く理解されるであろう：
図１Ａ〜Ｅは、本発明のヘテロ二量体ワクチン分子に関する模式図およびデータを示す。Ａ．ＡＰＣに特異的に結合するターゲティングユニット、標的である抗原に結合する二量体化ユニット、そして抗原性ユニットからなる２つの同一鎖によって形成される、ホモ二量体ターゲッティングワクチン分子。二量体化ユニットは、２つの鎖間のジスルフィド架橋および非共有結合性の相互作用を誘導するヒトＩｇＧ３由来の短いヒンジおよびＣＨ３からなる。Ｂ．ヘテロ二量体の形成を誘導する、ターゲティングユニットのＮ端末および抗原のＣ端末でサブクローニングされた修飾ロイシンジッパー由来のＡＣＩＤ（Ａ）／ＢＡＳＥ（Ｂ）モチーフ。Ｃ．ターゲティングユニットのＮ端末および抗原のＣ端末でサブクローニングされたバルナーゼ（Ｂｎ）およびバルスター（Ｂｓ）。また、バルナーゼ−バルスターヘテロタンパク質対間の安定したジスルフィド架橋および相互作用を誘導する、ヒトＩｇＧ３におけるヒンジ由来のｈ１が、バルナーゼおよびバルスターの両方のＮ末端に付加される。Ｄ．遺伝子構築物の模式図。Ｅ．ＥＬＩＳＡの結果。
図１Ａ〜Ｅは、本発明のヘテロ二量体ワクチン分子に関する模式図およびデータを示す。Ａ．ＡＰＣに特異的に結合するターゲティングユニット、標的である抗原に結合する二量体化ユニット、そして抗原性ユニットからなる２つの同一鎖によって形成される、ホモ二量体ターゲッティングワクチン分子。二量体化ユニットは、短いヒンジおよび２つの鎖間のジスルフィド架橋および非共有結合性の相互作用を誘導するヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３からなる。Ｂ．ヘテロ二量体の形成を誘導する、ターゲティングユニットのＮ端末および抗原のＣ端末でサブクローニングされた修飾ロイシンジッパー由来のＡＣＩＤ（Ａ）／ＢＡＳＥ（Ｂ）モチーフ。Ｃ．ターゲティングユニットのＮ端末および抗原のＣ端末でサブクローニングされたバルナーゼ（Ｂｎ）およびバルスター（Ｂｓ）。また、バルナーゼ−バルスターヘテロタンパク質対間の安定したジスルフィド架橋および相互作用を誘導する、ヒトＩｇＧ３におけるヒンジ由来のｈ１が、バルナーゼおよびバルスターの両方のＮ末端に付加される。Ｄ．遺伝子構築物の模式図。Ｅ．ＥＬＩＳＡの結果。
図２Ａ〜Ｄは、本発明のヘテロ二量体ワクチン分子の発現に関するデータを示す。Ａ．すべてのＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体は、ホモ二量体と同様のレベルで分泌される。Ｂ．バルナーゼ−バルスターヘテロ二量体もまた発現されるが、おそらくホモ二量体ワクチン分子と比較していくらか低下したレベルである。ＣおよびＤ．同じ上清を、ＥＬＩＳＡで分析して、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥおよびバルナーゼ−バルスターヘテロ二量体対由来のヘテロ二量体分子を測定した。ＭＩＰ１α−ｓｃＦｖ３１５は、ＥＬＩＳＡの陽性対照である。
図３Ａ〜Ｂは、本発明のヘテロ二量体ワクチン分子の形成に関する模式図およびデータを示す。Ａ．ＯＶＡおよびｍＣｈｅｒｒｙの両方を抗原として発現し、２つのＸＣＬ−１、２つのｓｃＦｖ抗ＮＩＰまたは各々１つをターゲティングユニットとして発現するヘテロ二量体を示す模式図。Ｂ．ＥＬＩＳＡは、ＸＣＬ−１およびｍＣｈｅｒｒｙの両方を含む融合タンパク質のみを検出する。結果：ＡＣＩＤまたはＢＡＳＥのみの融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞によって、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥのヘテロ二量体と等しく発現される。ＯＶＡならびにｍＣｈｅｒｒｙは、ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥの両方の抗原であり得、そして同様に、ＸＣＬ−１およびｓｃＦｖの抗ＮＩＰは、ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥの両方のターゲティングユニットとして発現され得る。
図４Ａ〜Ｄは、異なる抗原性ユニットを有する本発明のワクチン分子に関するデータを示す。Ａ．ＥＳＡＴ（Ｅ）、８５ｂ（結核抗原）、ｓｃＦｖ抗Ｍ３１５および赤血球凝集素（ＨＡ）のような種々の抗原を発現する、ＭＩＰ−１αおよびｓｃＦｖ抗ＮＩＰの両方の一価の標的を有するようにサブクローニングされたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体。分泌タンパク質を、抗ＮＩＰとＭＩＰ−１αの両方を発現するヘテロ二量体のみが検出される、ヘテロ二量体に特異的なＥＬＩＳＡで検出した。Ｂ．同じ上清を、ＨＡに対する特異的抗体を用いて分析した。Ｃ．ＥＳＡＴ（Ｅ）、８５ｂ（結核抗原）、ｓｃＦｖ抗Ｍ３１５および血球凝集素（ＨＡ）のような種々の抗原を発現する、ＭＩＰ−１αまたはＸＣＬ−１およびｓｃＦｖ抗ＮＩＰの両方の一価の標的を有するようにサブクローニングされたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体。Ｄ．ＯＶＡ、ｍＣｈｅｒｒｙまたはｓｃＦｖ抗Ｍ３１５（Ｆ）。被覆がＡＣＩＤ／ＢＡＳＥ二量体に対してｍＡｂを有するので、分泌されたタンパク質を、ヘテロ二量体に特異的なＥＬＩＳＡで検出した。
図４Ａ〜Ｄは、異なる抗原性ユニットを有する本発明のワクチン分子に関するデータを示す。Ａ．ＥＳＡＴ（Ｅ）、８５ｂ（結核抗原）、ｓｃＦｖ抗Ｍ３１５および赤血球凝集素（ＨＡ）のような種々の抗原を発現する、ＭＩＰ−１αおよびｓｃＦｖ抗ＮＩＰの両方の一価の標的を有するようにサブクローニングされたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体。分泌タンパク質を、抗ＮＩＰとＭＩＰ−１αの両方を発現するヘテロ二量体のみが検出される、ヘテロ二量体に特異的なＥＬＩＳＡで検出した。Ｂ．同じ上清を、ＨＡに対する特異的抗体を用いて分析した。Ｃ．ＥＳＡＴ（Ｅ）、８５ｂ（結核抗原）、ｓｃＦｖ抗Ｍ３１５および血球凝集素（ＨＡ）のような種々の抗原を発現する、ＭＩＰ−１αまたはＸＣＬ−１およびｓｃＦｖ抗ＮＩＰの両方の一価の標的を有するようにサブクローニングされたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体。Ｄ．ＯＶＡ、ｍＣｈｅｒｒｙまたはｓｃＦｖ抗Ｍ３１５（Ｆ）。被覆がＡＣＩＤ／ＢＡＳＥ二量体に対してｍＡｂを有するので、分泌されたタンパク質を、ヘテロ二量体に特異的なＥＬＩＳＡで検出した。
図５Ａ〜Ｂは、ＭＩＰ１ａターゲティングユニットの化学走性活性の保持に関するデータを示す。
図６Ａ〜Ｂは、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるワクチン接種後のin vivoで抗原特異的反応を誘導することを示すデータを示す。
図７は、本発明のＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体が、１回のワクチン接種後にＭＯＰＣ３１５腫瘍細胞に対する防御を誘導したことを示すデータを示す。
図８Ａ〜Ｅは、ヘテロ二量体ワクチン分子の設計および特徴に関するデータを示す。Ａ．ヘテロ二量体ワクチンタンパク質の模式図。Ｂ．本発明のワクチン分子のためのＤＮＡカセットの模式図。Ｃ．ヘテロ二量体分子のＥＬＩＳＡ分析。Ｄ．ヘテロ二量体ワクチン分子のウェスタンブロット。Ｅ．線維芽細胞によって発現される標的受容体（Ｉ−Ｅｄ／ＭＨＣＩＩ）に特異的に結合するヘテロ二量体タンパク質分子のフローサイトメトリー。
図９Ａ〜Ｉは、ヘテロ二量体ワクチン分子の二価性が、マウスにおけるＩｇＧ力価を増加させることを示すデータを示す。Ａ〜Ｉ．本発明のワクチン構築物でワクチン接種されたマウスについてのＥＬＩＳＡの結果。
図１０Ａ〜Ｅは、ヘテロ二量体抗腫瘍ワクチンでのワクチン接種後の抗体力価を示すデータを示す。Ａ．抗腫瘍抗原を用いたヘテロ二量体ＤＮＡワクチンの模式図。Ｂ〜Ｅ．マウスにおけるワクチン接種後の免疫反応のＥＬＩＳＡの結果。
図１１Ａ〜Ｆは、二価ＤＮＡワクチンが、相同Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染からマウスを完全に保護することを示すデータを示す。データは、平均体重減少（図１１Ａ、ＣおよびＥ）および感染後の生存率（図１１Ｂ、ＤおよびＦ）について示す。
図１２Ａ〜Ｃは、ヘテロ二量体ワクチン分子の二価性が、骨髄における抗原特異的胚中心およびＢ細胞集団を増加させることを示すデータを示す。Ａ．非線形回帰に適合させた、ｒＨＡプローブの希釈曲線。Ｂ．２００ｎＭ ｒＨＡプローブを用いた個々のマウスの代表例。Ｃ．骨髄由来の細胞懸濁液をＢ細胞ＥＬＩＳＰＯＴで分析し、ＰＲ８またはＣａｌ０７特異的Ｂ細胞を検出した。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１（不対両側スチューデントT検定）。
図１３Ａ〜Ｄは、本発明のワクチン分子に関するさらなるデータを提供する。Ａ．ヘテロ二量体ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥターゲティングワクチン。Ｂ．ｂａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種は、一価分子よりも二価分子において、より高いＰＲ８特異的ＩｇＧ１を与えた。Ｃ．二価ヘテロ二量体のみが、ＰＲ８攻撃における完全な防御を誘導した。Ｄ．競合ＥＬＩＳＡ。ＰＲ８を被覆として使用し、ワクチン接種されたマウス由来の血清は、Ｃａｌ０７（Ｃａｌ０７／ＰＲ８はＣａｌ０７／Ｃａｌ０７より阻害された）またはＰＲ８（Ｃａｌ０７／ＰＲ８はＰＲ８／ＰＲ８より阻害されなかった）と競合する。
図１４Ａ〜Ｄは、標的ＤＮＡワクチンおよび二価ＤＮＡワクチンによる抗体の誘導についての模式図モデルを提供する。
図１５は、Ｈ１の同一性が８１．５％である赤血球凝集素（ＨＡ）由来のＣａｌ０７（配列番号１２）およびＰＲ８（配列番号１３）の配列の比較を示す。
図１６は、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ＤＮＡワクチンが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける１回のワクチン接種後に骨髄腫（ＭＯＰＣ．３１５．ＢＭ）の腫瘍に対する防御を誘導することを示す。種々のワクチンにおける生存曲線を、抗原対照および塩化ナトリウムをワクチン接種されたマウスと比較した。腫瘍特異的抗原Ｍ３１５を血清中で測定し、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥをワクチン接種されたマウスは、対照のワクチン接種マウスよりも血清中のＭ３１５が有意に少ない。
図１７は、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ワクチンにおける１つのターゲティングユニットが、in vivoでの抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ反応にとって充分であることを示す。
図１８は、抗原としてＨＡを有するＤＮＡワクチンが、in vitroおよびin vivoで、機能的に発現されることを示す。（Ａ）ワクチンタンパク質の代表例。（Ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１８のサブタイプのうちの１つのサブタイプ由来の、ＨＡを運ぶαＭＨＣＩＩ−Ｈｘ二価二量体を皮内接種した。
図１９は、ＨＡ混合物ワクチンを用いたワクチン接種が、異種ＨＡ株に対する抗体を誘導することを示す（ＨＡ１は、混合物に含まれない）。
図２０は、ＨＡ混合物（Ｈ１を欠く）を用いたワクチン接種が、Ｈ１攻撃に対する部分的防御を与えることを示す。
図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、図面中の物体は必ずしも互いに対して一定の縮尺で描かれているわけでもないことを理解されたい。図面は、本明細書で開示される装置、システム、および方法の種々の実施形態を明確にし、理解することを意図した描写である。同一の参照番号は、可能な限り、図面の全体を通して同一又は類似の構成を表すように使用される。さらに、図面は、本教示の範囲を限定することを決して意図していないことを理解されたい。
本明細書では、ターゲティングユニットおよび変異型抗原性ユニットを含むモノマーから形成された、ヘテロ二量体化ユニットによって連結されたヘテロ二量体ワクチン分子のワクチン、これらに限定されないが特に、組成物、方法、および使用に関する技術が提供される。
本明細書で使用される節の見出しは、編成目的のためだけのものであり、決して説明される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
種々の実施形態のこの詳細な説明において、説明の目的のために、多数の具体的な詳細を記載し、開示される実施形態の完全な理解を提供する。しかしながら、当業者は、これらの種々の実施形態が、これらの具体的な詳細を伴って、または伴わずに実施され得ることを理解するだろう。他の例では、構造および装置がロック図形式で示される。さらに、当業者は、示され、実行される方法における具体的な配列が例示的であることを容易に理解するだろう。そして、配列が変更され得、依然として本明細書中に開示される種々の実施形態の趣旨および範囲内にあることが意図される。
これらに限定されないが、特許、特許出願、論説、本、論文、およびインターネットウェブページを含む、本出願において引用される全ての文献および類似の資料は、任意の目的のために、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書に記載される種々の実施形態が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。組み込まれる参考文献における用語の定義が、本教示において提供される定義と異なるのが明らかな場合、本教示において提供される定義に準拠するものとする。
〔定義〕
本技術の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。詳細な説明の全体にわたって、さらなる定義を記載する。
本技術の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。詳細な説明の全体にわたって、さらなる定義を記載する。
明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、以下の用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、本明細書に明示的に関連付けられた意味をとる。本明細書で使用される「一実施形態において」という語句は、必ずしも同じ実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。さらに、本明細書で使用される「別の実施形態において」という語句は、必ずしも異なる実施形態を指すわけではないが、そうであってもよい。従って、以下に記載するように、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明の種々の実施形態を容易に組み合わせることができる。
また、本明細書で使用される「または」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、包括的な「または」であり、「および／または」という用語と同等である。「に基づく」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、限定的なものではなく、記載されていない追加的要因に基づくことを認めるものである。また、明細書全体を通して、「a」、「an」および「the」の意味には、複数が含まれる。「in」の意味には、「in」および「on」が含まれる。
本出願で使用される「対象」および「患者」という用語は、イヌ、ネコ、トリ、家畜および好ましくはヒト等の哺乳類を含む任意の動物を指す。
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、活性剤と、組成物をとりわけ治療用途に適したものにする不活性または活性の担体との組合せを指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という用語は、対象に投与された場合に、有害反応、例えば、毒性反応、アレルギー反応、または免疫学的反応を実質的に生じない組成物を指す。
本明細書中で使用される「治療する」という用語は、本技術の治療組成物を任意の方法で対象の体内または体上に導入することによって、疾患または障害の少なくとも１つの有害な効果または症状を低減または軽減することを含む。「処置」は、治療処置および予防的または予防手段の両方を指し、ここで、目的は、標的とされる病的状態または障害を予防または遅延させる（例えば、最小限にするか、または軽減する）ことである。処置を必要とするものには、既に障害を有するもの、ならびに障害を有する傾向があるものまたは障害を予防すべきものが含まれる。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、および抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体）を指す、その最も広い意味で使用され、これらが所望の生物学的活性を示す限り、上述の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本明細書中で使用される「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057−1062 (1995)）；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
別の分子「に特異的に結合する」か、または別の分子「に特異的」である分子は、任意の他の分子に実質的に結合することなく、その特定の分子に結合する分子である。
本明細書で使用する「in vitro」という用語は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。In vitro環境には、試験管および細胞培地が含まれるが、これらに限定されない。「in vivo」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
本明細書中で使用される「投与」という用語は、薬物、プロドラッグ、抗体、ワクチン、または他の薬剤を、生理学的システム（例えば、対象またはin vivo、in vitro、もしくはex vivoの細胞、組織、および器官）に与える行為、または治療処置を指す。例示的なヒトの身体への投与経路は、眼（経眼）、口（経口）、皮膚（経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入剤）、口腔粘膜（舌下錠）、耳、注射（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内等）等を通したものであり得る。「併用」は、生理学的システム（例えば、対象またはin vivo、in vitro、もしくはex vivoの細胞、組織、および器官）への複数の化学薬剤の投与または治療処置（例えば、放射線療法）を指す。本明細書中で使用される、１つ以上のさらなる治療剤「と併用しての」投与は、任意の順序での同時（並行）投与および連続投与を含む。治療処置の「併用」は、同時であってもよく、または任意の時間的順序であってもよく、または物理的組み合わせであってもよい。
本明細書中で使用される「担体」は、採用される投与量および濃度において、曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含む。しばしば、生理学的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容可能な担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；および／または非イオン性界面活性剤が含まれる。
本明細書で使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸を含む分子を指す。一般に、「ペプチド」は、２０以下のアミノ酸の配列を指すために使用され、「ポリペプチド」は、２０を超えるアミノ酸の配列を指すために使用される。
本明細書中で使用される「合成ポリペプチド」、「合成ペプチド」、および「合成タンパク質」という用語は、組換え処理（すなわち、生物、宿主細胞、または無細胞系におけるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする外因性核酸の発現）によってまたは化学合成によって産生されるペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。
本明細書中で使用される「目的のタンパク質」という用語は、目的の核酸によってコードされるタンパク質を指す。
本明細書中で使用される「天然」（または野生型）という用語は、タンパク質に関して使用される場合、合成タンパク質を産生するように操作されたゲノム以外の、細胞、組織、または生物のゲノムによってコードされるタンパク質を指す。
本明細書中で使用される「ドメイン」（典型的には、３つ以上、一般的には５つ以上または７つ以上のアミノ酸の配列）は、分子の他の部分と構造的および／または機能的に異なり、そして同定可能である、タンパク質またはコードする核酸等の分子の部分をいう。例えば、ドメインは、１つ以上の構造モチーフから構成されるタンパク質内で独立して折り畳まれた構造を形成することができるポリペプチド鎖、および／またはタンパク質分解活性等の機能的活性によって認識されるポリペプチド鎖の部分を含む。以上のように、ドメインは、残りのタンパク質の三次構造を独立して保持する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能的特性に関与し、多くの場合、タンパク質の残部および／またはドメインの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、除去または転移され得る。
タンパク質は、１つまたは２つ以上の異なるドメインを有することができる。例えば、ドメインは、関連するファミリーメンバーに対するそのドメイン中の配列の相同性（プロテアーゼドメインまたはｇｌａドメインを規定するモチーフに対する相同性等）によって、同定、規定または区別され得る。別の実施例において、ドメインは、その機能（タンパク質分解活性等）、または生体分子と相互作用する能力（ＤＮＡ結合、配位子結合、および二量体化等）によって、区別することができる。ドメインは、独立して、生物学的機能または活性を示し得、その結果、ドメインは独立して、または別の分子に融合されて、例えば、タンパク質分解活動またはリガンド結合等の活性を示す。ドメインは、アミノ酸の線形状配列またはアミノ酸の非線形状配列であり得る。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含む。いくつかのドメインは公知であり、当業者によって同定され得る。名前によって特定のドメインを認識することは、十分に当業者の知識の範囲内であることを理解されたい。必要に応じて、ドメインを特定するために、適切なソフトウェアを用いることができる。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、in vitroまたはin vivo（例えば、トランスジェニック生物）中に位置するかどうかに関わらず、任意の真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、酵母細胞）および細菌細胞等を指す。「宿主細胞」という用語は、異種遺伝子を複製および／または転写および／または翻訳することができる任意の細胞を指す。従って、「宿主細胞」は、in vitroまたはin vivoに位置するかどうかに関わらず、任意の真核細胞または原核細胞を指す。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に位置し得る。
本明細書に用いられる「細胞培養物」という用語は、細胞の任意のin vitroの培養物を指す。この用語には、連続細胞株（例えば、不死化表現型を有する）、初代細胞培養物、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、および卵母細胞および胚を含むin vitroで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
「単離された」という用語は、核酸またはポリペプチドまたはタンパク質に関して使用される場合、その天然の供給源において通常関連する少なくとも１つの汚染された核酸またはポリペプチドまたはタンパク質から同定され、分離された核酸またはポリペプチドまたはタンパク質配列を指す。単離された核酸またはポリペプチドまたはタンパク質は、それらが天然に見出されるものとは異なる形態または構成で存在する分子である。対照的に、単離されていない核酸またはポリペプチドまたはタンパク質は、それらが天然に存在する状態で見出される。
「抗原」という用語は、分子の一部に特異的な抗体と反応する分子（例えば、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、核酸、または他の物質）を指す。
「抗原決定基」という用語は、特定の抗体（例えば、エピトープ）と接触する抗原の部分を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を、宿主動物を免疫化するために用いる場合、タンパク質の多数の領域が、タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導することがあり、これらの領域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体へ結合する際に、インタクト抗原（例えば、免疫反応を誘発するために用いられる「免疫原」）と競合することがある。いくつかの実施形態において、「抗原決定基」または「エピトープ」は、「ネオエピトープ」または新規のエピトープである。
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸を含む化合物を指し、互換的に使用される。遺伝子によってコードされる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に限定されず、タンパク質の翻訳後の修飾を含む。
本明細書で記載される「アミノ酸配列」という用語が、タンパク質分子のアミノ酸配列を指す場合、「アミノ酸配列」および「ポリペプチド」または「タンパク質」等の同様の用語は、アミノ酸配列を、記載されるタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味するものではない。さらに、「アミノ酸配列」は、タンパク質をコードする核酸配列から推定することができる。
「部分」という用語は、タンパク質に関して使用される場合（「所与のタンパク質の一部分」におけるように）、そのタンパク質の断片を指す。断片のサイズは、４個のアミノ酸残基からアミノ酸配列全体から１個のアミノ酸を引いたものまでの範囲であってもよい（例えば、サイズは、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸からアミノ酸配列全体からアミノ酸１個を引いたものまでを含む）。
本明細書中で使用される「ワクチン」は、レシピエント（例えば、対象）において獲得免疫を誘導するために意図的に投与される１つ以上の免疫原性抗原を含む。
本明細書の記載は特定の例示された実施形態に言及するが、これらの実施形態は実施例として提示され、限定として提示されるものではないことを理解されたい。
いくつかの実施形態において、本発明は、
第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含むＤＮＡワクチンであって、第１の核酸構築物および第２の核酸構築物は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードし、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含む、ＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、各上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞へ導入される場合、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が発現され、上記ヘテロ二量体化ユニットの会合を介して、第１のヘテロ二量体タンパク質が形成される。これは、例えば、図１および図８に概略的に示される。これらの図に見られるように、ワクチン核酸構築物の宿主細胞への導入は、ターゲティングユニット（抗ＭＨＣＩＩおよび抗ＮＩＰのようなｓｃＦｖによって例示される）、ヘテロ二量体化ユニット（ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥドメインおよびバルスター／バルナーゼドメインによって例示される）、および異なる抗原性ユニット（Ｆｖ３１５ならびにＰＲ８およびＣａｌ０７由来のＨＡによって例示される）を含む単量体ユニットの産生をもたらす。発現に際して、ＡＣＩＤドメインを有する単量体はＢＡＳＥドメインを有する単量体と対合し、そして同様に、バルスタードメインを有する単量体はバルナーゼドメインを有する単量体と対合して、ヘテロ二量体タンパク質分子を形成する。本明細書中、本発明の融合タンパク質の例示的な配列が提供される。例えば、配列番号１および２は、ヒンジ領域とＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ領域によって分離されるＭＩＰ１αターゲティングユニットおよびＭ３１５抗原性ユニットを有する融合タンパク質をコードする構築物の核酸配列を提供する。配列番号３は、融合タンパク質の対応するアミノ酸配列を提供する。配列番号４および５は、ヒンジ領域およびＢＡＳＥ−ＢＡＳＥドメインによって分離されるＭＩＰ１αターゲティングユニットおよびＭ３１５抗原性ユニットを有する融合タンパク質をコードする構築物の核酸配列を提供する。配列番号６は、融合タンパク質の対応するアミノ酸配列を提供する。例示された構築物および融合タンパク質はモジュラーであり、例えば、例示されたターゲティングユニットは、本明細書により詳細に記載されるように異なる標的化ユニットで置換されてもよく、例示された抗原性ユニットは、本明細書により詳細に記載されるように異なる抗原性ユニットで置換されてもよく、ヘテロ二量体化ドメインは、本明細書により詳細に記載されるように異なるヘテロ二量体化ドメインで置換されてもよいことが理解されるだろう。さらなる抗原性ユニットは、配列番号７〜１３として提供されるものによって例示される。
第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含むＤＮＡワクチンであって、第１の核酸構築物および第２の核酸構築物は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードし、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含む、ＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、各上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質である。いくつかの実施形態において、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞へ導入される場合、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が発現され、上記ヘテロ二量体化ユニットの会合を介して、第１のヘテロ二量体タンパク質が形成される。これは、例えば、図１および図８に概略的に示される。これらの図に見られるように、ワクチン核酸構築物の宿主細胞への導入は、ターゲティングユニット（抗ＭＨＣＩＩおよび抗ＮＩＰのようなｓｃＦｖによって例示される）、ヘテロ二量体化ユニット（ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥドメインおよびバルスター／バルナーゼドメインによって例示される）、および異なる抗原性ユニット（Ｆｖ３１５ならびにＰＲ８およびＣａｌ０７由来のＨＡによって例示される）を含む単量体ユニットの産生をもたらす。発現に際して、ＡＣＩＤドメインを有する単量体はＢＡＳＥドメインを有する単量体と対合し、そして同様に、バルスタードメインを有する単量体はバルナーゼドメインを有する単量体と対合して、ヘテロ二量体タンパク質分子を形成する。本明細書中、本発明の融合タンパク質の例示的な配列が提供される。例えば、配列番号１および２は、ヒンジ領域とＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ領域によって分離されるＭＩＰ１αターゲティングユニットおよびＭ３１５抗原性ユニットを有する融合タンパク質をコードする構築物の核酸配列を提供する。配列番号３は、融合タンパク質の対応するアミノ酸配列を提供する。配列番号４および５は、ヒンジ領域およびＢＡＳＥ−ＢＡＳＥドメインによって分離されるＭＩＰ１αターゲティングユニットおよびＭ３１５抗原性ユニットを有する融合タンパク質をコードする構築物の核酸配列を提供する。配列番号６は、融合タンパク質の対応するアミノ酸配列を提供する。例示された構築物および融合タンパク質はモジュラーであり、例えば、例示されたターゲティングユニットは、本明細書により詳細に記載されるように異なる標的化ユニットで置換されてもよく、例示された抗原性ユニットは、本明細書により詳細に記載されるように異なる抗原性ユニットで置換されてもよく、ヘテロ二量体化ドメインは、本明細書により詳細に記載されるように異なるヘテロ二量体化ドメインで置換されてもよいことが理解されるだろう。さらなる抗原性ユニットは、配列番号７〜１３として提供されるものによって例示される。
構築物はまた、構築物を含む好適な発現ベクターを宿主細胞中で発現させることによって、ポリペプチドワクチン組成物を産生するために使用され得ることが認識される。従って、本発明はまた、ヘテロ二量体タンパク質分子を含むワクチン組成物であって、ヘテロ二量体タンパク質分子は、第１の融合タンパク質モノマーおよび第２の融合タンパク質モノマーを含み、第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニット、および抗原性ユニットを含み、各第１の融合タンパク質モノマーおよび第２の融合タンパク質モノマーにおける抗原性ユニットは、異なる変異型抗原標的タンパク質をコードすることによって異なり、ヘテロ二量体タンパク質分子は、二量体化ドメインの会合によって連結された２つの上記モノマーを含む、ワクチン組成物を提供する。
好ましい実施形態において、異なる抗原性ユニットは、標的抗原タンパク質、例えば病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物）または標的ガン抗原由来の抗原タンパク質の変異体である。いくつかの実施形態において、ガン抗原は、新規のエピトープまたはネオエピトープを生じさせる腫瘍内の体細胞突然変異またはパッセンジャー突然変異から生じるネオエピトープである。ネオエピトープは、適応免疫系によって「変異した自己」として認識され、免疫系が正常細胞から癌を区別する手段として働く。そのため、ネオエピトープは、個別化癌免疫療法ワクチンの有力な候補となり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原タンパク質の変異体は、標的病原体の異なる株（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物の異なる株等）由来の標的抗原タンパク質の変異体である。いくつかの実施形態において、標的抗原タンパク質の変異体は、標的病原体の異なる種または属（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物の異なる種または属等）由来の標的抗原タンパク質の変異体である。いくつかの実施形態において、変異体は、標的抗原タンパク質の変異体によって共有される配列の同一性の程度によって定義され得る。例えば同じ病原性生物の異なる株由来の変異型抗原標的タンパク質は、配列において非常に多様であるため、高度の配列同一性は必要とされない。いくつかの実施形態において、変異体は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列同一性を有し得る。従って、本発明のＤＮＡワクチンおよびワクチン組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０種の変異型抗原標的タンパク質、または２〜１０、２〜２０、２〜３０、２〜５０、３〜１０、３〜２０、３〜３０、３〜５０、４〜１０、４〜２０、４〜３０、４〜５０、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜５０、６〜１０、６〜２０、６〜３０、もしくは６〜５０種の変異型抗原標的タンパク質、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０種の変異型抗原標的タンパク質をコードする配列を含み得る。
本発明は、特定の作用メカニズムに限定されない。実際、作用メカニズムを理解することは、本発明を実施するために必須ではない。しかしながら、図１４は、本発明のワクチンを用いた免疫反応の誘導についてのモデルを提供する。図１４を参照すると、ＤＮＡワクチン接種後にエレクトロポレーションを行った後、宿主細胞は、ＤＮＡを取り込み、ワクチンタンパク質を転写することができる。図１４Ａを参照のこと。ワクチン上のターゲティングユニットは、ＡＰＣと効果的に結合して活性化し、細胞内に取り込まれ、ＭＨＣＩＩに対する抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞へ提示するためにプロセシングされる。抗原特異的ＢＣＲは、抗原性ユニット上のエピトープを認識し、これによりワクチンタンパク質がＢ細胞に取り込まれ、プロセシングされる。Ｂ細胞表面のＭＨＣＩＩに対する抗原を提示することにより、Ｂ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞からの補助を受け、Ｂ細胞を活性化して形質細胞に分化させ、抗体を産生させることができる。さらに、標的化されたワクチン二量体は、Ｂ細胞とＡＰＣとの間でシナプスを形成し得る。二価の標的化されたワクチンは、一つのＢＣＲがワクチン二量体の二つのアームに結合することを可能にする。図１４Ｄに示すように、複数のＡＰＣが結合したワクチン二量体とＢＣＲとが直列に結合すると、シナプスが形成され、ＢＣＲは、Ｂ細胞膜中で互いに固定化される。これにより、ＢＣＲは膜中で互いに接近したままになる。これによりＢＣＲシグナルが増幅され、Ｂ細胞の活性化が亢進し、最終的には抗原特異的抗体の分泌が増加すると考えられる。図１４Ｃに示すように、一価の標的化されたワクチンは、シナプスの形成を促進することができるが、同様のＢＣＲとの強固な結合形態を形成することはできない。ＢＣＲは、互いに膜中を移動することができ（矢印で示される）、拘束性の低いＢＣＲの近接を引き起こす。非標的ワクチンは、Ｂ細胞−ＡＰＣシナプスを安定化せず（図１４Ｂ）、そのうえ、Ｂ細胞膜中にＢＣＲを拘束することができない。
構築物、構築物のワクチン、ワクチンおよびワクチンの使用について、以下により詳細に記載する。
〔抗原性ユニット〕
本発明のワクチン分子は、好ましくは、標的抗原タンパク質（例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物等の病原体由来の抗原タンパク質）または標的癌抗原の変異体である、異なる抗原性ユニットを含む。上述のように、変異体は、標的抗原タンパク質の変異体または標的抗原タンパク質の保存領域によって共有される配列の同一性の程度によって定義され得る。いくつかの実施形態において、変異体は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列同一性を有し得る。さらに他の実施形態において、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０個のアミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００個のアミノ酸である変異型標的タンパク質内の保存領域は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有し得る。本発明によれば、抗原性ユニットは、対象のような生物において１つ以上の抗体の産生を引き起こす物質である抗原を含む。それぞれの抗体は、特定の抗原に結合する。いくつかの文脈において、抗原性ユニットという用語は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合し、Ｔ細胞受容体に提示され得る任意の分子または分子断片を指す。
本発明のワクチン分子は、好ましくは、標的抗原タンパク質（例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物等の病原体由来の抗原タンパク質）または標的癌抗原の変異体である、異なる抗原性ユニットを含む。上述のように、変異体は、標的抗原タンパク質の変異体または標的抗原タンパク質の保存領域によって共有される配列の同一性の程度によって定義され得る。いくつかの実施形態において、変異体は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える配列同一性を有し得る。さらに他の実施形態において、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０個のアミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００個のアミノ酸である変異型標的タンパク質内の保存領域は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有し得る。本発明によれば、抗原性ユニットは、対象のような生物において１つ以上の抗体の産生を引き起こす物質である抗原を含む。それぞれの抗体は、特定の抗原に結合する。いくつかの文脈において、抗原性ユニットという用語は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に結合し、Ｔ細胞受容体に提示され得る任意の分子または分子断片を指す。
いくつかの文脈において、免疫原は、特定のタイプの抗原である。免疫原は、単独で（または例えば、二量体ワクチン分子の抗原性ユニットの一部分として）注射される場合、適応免疫反応を誘導する物質である。そのため、免疫原は、免疫反応を誘導し、一方で、抗原は、一度作られると、免疫反応の産物（例えば、抗体）と結合する。当該技術の一態様として、「抗原」は、免疫原および／または抗原として特徴付けることができるかどうかにかかわらず、その最も広い意味で使用され、例えば、予防的手段として、または処置として、対象において免疫反応を誘導する分子、物質、化学物質、またはタンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチド等の高分子を指す。
分子レベルでは、時には、抗原は、抗体の抗原結合部位に「結合」することができる能力によって特徴付けることができる。抗体は、抗原の表面上に存在する特異的な分子構造を識別する。抗原は通常、細菌、ウイルス、および他の微生物の部分（例えば、外殻、皮膜、細胞壁、べん毛、線毛、および毒素）として存在するタンパク質（例えば、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質）または多糖類である。脂質および核酸は、それらをタンパク質および多糖類と組み合わせることによって抗原性にすることができる。
細胞は、組織適合性分子を介して、免疫系に免疫原性抗原を提示する。提示された抗原および組織適合性分子のタイプによっては、いくつかのタイプの免疫細胞が活性化され得る。エンドサイトーシスまたは食作用により、外因性抗原は抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれ、断片にプロセシングされる。次にＡＰＣは、その表面上のクラスＩＩ組織適合性分子を用いることによって、断片をヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）に提示する。一部のＴ細胞はペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的である。それらは活性化され、サイトカインを分泌し始める。サイトカインは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、抗体を分泌するＢ細胞、マクロファージ、その他の粒子を活性化できる物質である。
当該技術の実施形態によれば、二量体ワクチン分子は、任意の起源の任意のポリペプチドに対する免疫反応を誘導することで、全般的な医療処置に施され得る。抗原性配列がポリペプチドの適切な折り畳みを可能にするのに十分な長さであるならば、任意の抗原性配列を組み込むことが可能である。この配列は、例えば、癌の病原体タンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態において、標的抗原タンパク質は、疾患の進行（例えば、ウイルス感染、自己免疫疾患、または癌）を救援または治療する免疫反応を誘導するために治療的に使用されるタンパク質（またはタンパク質をコードする核酸）である。
いくつかの実施形態において、目的の分子は、病原体由来の抗原（例えば、病原体由来の抗原または抗原をコードする核酸もしくはポリぺプチド）である。例示的な病原性生物には、細菌、ウイルス、真菌および原生動物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、病原体由来の抗原は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）である。いくつかの特に好ましい実施形態において、ＨＡは、グループ１のインフルエンザウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、グループ１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８のうちの２種以上（すなわち、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、または１２種全て）からなる群より選択される。さらに他の実施形態において、ＨＡは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５の２種以上（すなわち、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、または６種すべて）からなる群より選択されるグループ２のインフルエンザウイルスに由来する。
他の病原性生物由来の抗原もまた、本発明の融合において使用され得る。抗原が得られ得る例示的な病原体は、限定されないが、いくつかの実施形態において、微生物として、Bacillus（Bacillus anthracisを含む）；Vibrio（例えばV. cholera）；Escherichia（例えば腸内毒素原生E. coli；Shigella（例えばS. dysenteriae）; Salmonella（例えばS. typhi）；Mycobacterium（例えばM. tuberculosis、M. leprae）；Clostridium（例えばC. botulinum、C. tetani、C. difficile、C. perfringens）；Cornyebacterium（例えばC. diphtheria）；Streptococcus、S. pyogenes、S. pneumonia）; Staphylococcus（例えばS. aureus）；Haemophilus（例えばH. influenza）；Neisseria（例えばN. meningitidis、N. gonorrhoeae）；Yersinia（例えばY. lamblia、Y. pestis）；Pseudomonas（例えばP. aeruginosa、P. putida）；Chlamydia（例えばC. trachomatis）；Bordetella（例えばB. pertussis）；Treponema（例えばT. palladium）；B. anthracis、Y. pestis、Brucella spp.、F. tularensis、B. mallei、B. pseudomallei、B. mallei、B. pseudomallei、C. botulinum、Salmonella spp.、SEB V.コレラ毒素B、E. coli O157:H7、Listeria spp.、Trichosporon beigelii、Rhodotorula species、Hansenula anomala、Enterobacter sp.、Klebsiella sp.、Listeria sp.、Mycoplasma ssp.、Francisella spp.、Bartonella spp.、Borrelia spp.、Campylobacter spp.、Chlamydia spp.、Simkania spp.、Ehrlichia spp.、Enterococcus spp.、Coccidioides spp.、Bordetella spp.、Coxiella spp.、Ureaplasma spp.、Trichomatis spp.、Helicobacter spp.、Legionella spp.、Mycobacterium spp.、Corynebacterium spp.、Rhodococcus spp.、Rickettsia spp.、Arcanobacterium spp.、Listeria spp.、Treponema spp.、Brucella spp.、Campylobacter spp.、Pasteurella spp.、Pseudomonas ssp.、Burkholderii spp.等、オルソミクソウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス）、アデノウイルス、ライノウイルス（ヒトおよび豚）、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス（例えば風疹ウイルス）、パルボウイルス、ポックスウイルス（例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）、エンテロウイルス（例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＥ型を含む）、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス、ＨＶ−ＩおよびＨＶ−ＩＩ、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス）、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）、レトロウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＬＴＶ−ＩＩ）、パポバウイルス（例えばパピローマウイルス）、ポリオーマウイルス、ピコルナウイルス、デングウイルス、フィロウイルス（例えばマールブルグウイルスおよびエボラウイルス）、ハンタウイルス、リフトバレーウイルス、ＨＨＶ−８、ヒトパピローマウイルス、ウシ白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱ウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水痘（水痘ウイルス）、サル痘、エプスタイン・バーウイルス、パルボウイルスＢ１９、ハンターンウイルス、Sin Nombre virus、ベネズエラウマ脳炎、サビアウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス等、伝染性海綿状脳症の原因因子、クロイツフェルト−ヤコブ病原体、変異型クロイツフェルト−ヤコブ病原体、Candida株（C. glabrata、C. albicans、C. krusei、C. lusitaniaeおよびC. maltosaを含む）、ならびにAspergillus属、 Cryptococcus、 Histoplasma、Coccidioides、BlastomycesおよびPenicillium、Cryptcooccus、Cryptosporidium、Giardia lamblia、Microsporidia、Plasmodium vivax、Plasmodium falciparum、Pneumocystis carinii、Toxoplasma gondii、Trichophyton mentagrophytes、Enterocytozoon bieneusi、Cyclospora cayetanensis、Encephalitozoon hellem、Encephalitozoon cuniculi、Ancylostama、Strongylus、Trichostrongylus、Haemonchus、Ostertagia、Ascaris、Toxascaris、Uncinaria、Trichuris、Dirofilaria、Toxocara、Necator、Enterobius、StrongyloidesおよびWuchereria；Acanthamoebaおよび他のアメーバ、Cryptosporidium、Fasciola、Hartmanella、Acanthamoeba、Giardia lamblia、Isospora belli、Leishmania、Naegleria、Plasmodium spp.、Pneumocystis carinii、Schistosoma spp.、Toxoplasma gondii、およびTrypanosoma spp.、他のウイルス、細菌、古細菌、原生動物、真菌等が挙げられる。
本明細書中に記載される融合分子は、以下の標的抗原のリストに属するタンパク質、サブユニット、モチーフ、および／またはエピトープを含むがこれらに限定されない、哺乳動物由来の抗原をさらに含む（ここで、以下のリストは、膜貫通受容体を含み、サイトカインおよび膜結合因子等の両方の可溶性因子を含む）：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ｋｅｔｏ−ＰＧＦ１ａ、８−ｉｓｏ−ＰＧＦ２ａ、８−ｏｘｏ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、ａｌｐｈａ−１−抗トリプシン、ａｌｐｈａ−Ｖ／ｂｅｔａ−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂ−リンパ球分裂促進因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３ オステオゲニン、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰｓ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児生抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３ （ｐ６７ タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、腐敗促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、ＤＮアーゼ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ （ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−ａｌｐｈａ１、ＧＦＲ−ａｌｐｈａ２、ＧＦＲ−ａｌｐｈａ３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐまたはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢ外被糖タンパク質、ＨＣＭＶ ｇＨ外被糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血性成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ （ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４ （ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子悪性黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ １２０ Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−ａｌｐｈａ、ＩＮＦ−ｂｅｔａ、ＩＮＦ−ｇａｍｍａ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリン鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様成長因子１、インテグリンａｌｐｈａ２、インテグリンａｌｐｈａ３、インテグリンａｌｐｈａ４、インテグリンａｌｐｈａ４／ｂｅｔａ７、インテグリンａｌｐｈａ４／ｂｅｔａ７、インテグリンａｌｐｈａ５（ａｌｐｈａＶ）、インテグリンａｌｐｈａ５／ｂｅｔａ１、インテグリンａｌｐｈａ５／ｂｅｔａ３、インテグリンａｌｐｈａ６、インテグリンｂｅｔａ１、インテグリンｂｅｔａ２、インターフェロンｇａｍｍａ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在性ＴＧＦ−１、潜在性ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、Ｌｅｆｔｙ、ルーイス−Ｙ抗原、ルーイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺界面活性物質、黄体形成ホルモン、リンフォトキシンＢｅｔａ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、メタロプロテアーゼ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−ａｌｐｈａ、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー阻害物質、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリリシン、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、またはニューロトロフィン−６、Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ、ニューロン成長因子（ＮＧＦ））、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−ｂｅｔａ、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰＩＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロリラキシン、タンパク質Ｃ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマチ因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、セリン、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ細胞受容体（例えばＴ細胞受容体ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、Ｐａｎ特異的ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ Ｒ１（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ ＲＩＩ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ ＲＩＩｂ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ ＲＩＩＩ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ１、ＴＧＦ−ｂｅｔａ２、ＴＧＦ−ｂｅｔａ３、ＴＧＦ−ｂｅｔａ４、ＴＧＦ−ｂｅｔａ５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ｂｅｔａ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３Ａｐｏ−２， ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、Ｔ
ＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ Ｒ１ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１））、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９ （４−１ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ １２５、腫瘍関連抗原発現ルーイスＹ 関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｉｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォンビルブラント因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、およびホルモンおよび成長因子の受容体。
ＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ Ｒ１ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１））、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンドｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンドＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓリガンドＡｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンドＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンドＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９ （４−１ＢＢリガンドＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原ＣＡ １２５、腫瘍関連抗原発現ルーイスＹ 関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｉｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォンビルブラント因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、およびホルモンおよび成長因子の受容体。
当業者は、上述の標的抗原のリストが特定のタンパク質および生体分子だけでなく、それらを含む生化学的経路を指すことを理解するだろう。例えば、標的抗原としてのＣＴＬＡ−４への言及は、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、およびこれらのタンパク質と結合する他の未発見のリガンドまたは受容体を含む、Ｔ細胞共刺激経路を構成するリガンドおよび受容体もまた標的であることを意味する。そのため、本明細書で使用される標的は、特定の生体分子だけでなく、上記標的と相互作用するタンパク質のセット、および上記標的が属する生化学的経路のメンバーも指す。当業者は、上述の標的抗原、それらに結合するリガンドもしくは受容体、またはそれらの対応する生化学的経路の他のメンバーのいずれかが、Ｆｃ融合を生成するために、本発明のＦｃ変異体に動作可能に連結され得ることをさらに理解する。そのため、例えば、Ｆｃ変異体をＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、またはＥＧＦＲを結合する既知のまたは未発見の他のリガンドと動作可能に連結することによって、ＥＧＦＲを標的とするＦｃ融合を構築することができる。従って、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ｂ、またはＥＧＦＲを結合する既知のまたは未発見の他のリガンドを結合するＦｃ融合を生成するために、本発明のＦｃ変異体をＥＧＦＲに動作可能に連結することができる。そのため、実質的には、上述の標的に限定されないが、これらを含む任意のポリペプチド（リガンド、受容体、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメイン）およびこれらに対応する生化学的経路を構成するタンパク質は、Ｆｃ融合を発達させるために、本発明のＦｃ変異体に動作可能に連結され得る。
好適な抗原の選択肢は、所望の用途に依存する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される構築物は、病原体抗原を標的とする。抗癌治療のためには、その発現が癌細胞に限定される標的を有することが望ましい。特に抗体療法が適していることが証明されている標的の中には、シグナル伝達機能を有するものがある。他の治療用抗体は、受容体とその同族リガンドとの結合を阻害することによって、受容体のシグナル伝達を遮断することで、その効果を発揮する。治療用抗体の作用の別のメカニズムは、受容体のダウンレギュレーションを引き起こすことである。他の抗体は、それらの標的抗原を介したシグナル伝達によっては作用しない。場合によっては、感染症剤に対する抗体が用いられる。
１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、自己免疫、炎症、または移植適応症の処置のために使用される。このような疾患に関連する標的抗原および臨床製品および候補には、ＬＤＰ−０２等の抗α４β７インテグリン抗体、ＬＤＰ−０１等の抗β２インテグリン抗体、５Ｇ１．１等の抗補体（Ｃ５）抗体、ＢＴＩ−３２２等の抗ＣＤ２抗体、ＭＥＤＩ−５０７、ＯＫＴ３等の抗ＣＤ３抗体、ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３抗体、ＩＤＥＣ−１５１等の抗ＣＤ４抗体、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ、抗ＣＤ１１ａ抗体、ＩＣ１４等の抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１８抗体、ＩＤＥＣ１５２等の抗ＣＤ２３抗体、Ｚｅｎａｐａｘ等の抗ＣＤ２５抗体、５ｃ８等の抗ＣＤ４０Ｌ抗体、Ａｎｔｏｖａ、ＩＤＥＣ−１３１、ＭＤＸ−３３等の抗ＣＤ６４抗体、ＩＤＥＣ−１１４等の抗ＣＤ８０抗体、ＡＢＸ−ＣＢＬ等の抗ＣＤ１４７抗体、ＣＤＰ８５０等の抗Ｅ−セレクチン抗体、ＲｅｏＰｒｏ／Ａｂｃｉｘｉｍａ等の抗ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、ＩＣＭ３等の抗ＩＣＡＭ−３抗体、ＶＸ−７４０等の抗ＩＣＥ抗体、ＭＤＸ−３３等の抗ＦｃＲ１抗体、ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５等の抗ＩｇＥ抗体、ＳＢ−２４０６８３等の抗ＩＬ−４抗体、ＳＢ−２４０５６３、ＳＣＨ５５７００等の抗ＩＬ−５抗体、ＡＢＸ−ＩＬ８等の抗ＩＬ−８抗体、抗インターフェロンγ抗体、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、インフリキシマブ、ＭＡＫ−１９５Ｆ等の抗ＴＮＦ（ＴＮＦ、ＴＮＦａ、ＴＮＦａ、ＴＮＦ−α）抗体、アンテグレン（Antegren）等の抗ＶＬＡ−４抗体が含まれるが、これらに限定されない。
〔ターゲティングユニット〕
タンパク質抗原の免疫原性を増大させるための一方法は、免疫系細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とする抗体または抗体断片に、抗原を組み込むことである。ＡＰＣは、抗原のプロセシングを行い、それらを抗原に対する抗体を産生させるためにＴ細胞に提示する。このように、ＡＰＣに抗原を送達することは、抗原に対する免疫反応を誘導する効率的な経路を提供する。
タンパク質抗原の免疫原性を増大させるための一方法は、免疫系細胞、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とする抗体または抗体断片に、抗原を組み込むことである。ＡＰＣは、抗原のプロセシングを行い、それらを抗原に対する抗体を産生させるためにＴ細胞に提示する。このように、ＡＰＣに抗原を送達することは、抗原に対する免疫反応を誘導する効率的な経路を提供する。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面に、主要組織適合性複合体（major histocompatibility comples：ＭＨＣ）との抗原複合体を提示する細胞である。ＡＰＣは、抗原を取り込み、抗原プロセシングを行い、そして抗原（例えば、エピトープ）の全てまたは一部を、抗原を提示するＭＨＣクラスＩＩ分子中でＡＰＣの表面に戻す。ナイーブヘルパーＴ細胞に担持されるＣＤ４受容体は、ＭＨＣクラスＩＩを連結する。（ＭＨＣクラスＩＩ分子内の）エピトープは、ナイーブヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をインプリントし、そのエピトープを記憶する。
Ｔ細胞は、単離された抗原を認識することができず、従って単離された抗原と反応することができない。Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子を介して、細胞によってプロセシングされ提示された抗原にのみ反応することができる。体内のほとんどの細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を介して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を提示することができるため、それらはＡＰＣである。いくつかの文脈において、ＡＰＣという用語は、Ｔ細胞をプライミングできる（例えば、「ナイーブ」Ｔ細胞と称される、抗原に曝露されていないＴ細胞を活性化する）特殊化した細胞を指す。これらの細胞は一般的に、ＭＨＣクラスＩＩならびにＭＨＣクラスＩ分子を発現し、ＣＤ４＋（「ヘルパー」）細胞ならびにＣＤ８＋（「細胞傷害性」）Ｔ細胞をそれぞれ刺激し得る。
ＡＰＣは、非常に効率的に、貪食作用または受容体を介したエンドサイトーシスのいずれかにより抗原を取り込み、次いでその膜上に、クラスＩＩＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を提示する。Ｔ細胞は、ＡＰＣの膜上で、抗原−クラスＩＩＭＨＣ分子複合体を認識し、抗原−クラスＩＩＭＨＣ分子複合体と相互作用する。次いで、さらなる共刺激シグナルがＡＰＣによって生成され、Ｔ細胞の活性化が引き起こされる。ＡＰＣには、最も広い範囲で抗原提示する樹状細胞が含まれる。活性化ＤＣは、それらの組成物の一部として、Ｂ７等の共刺激分子を発現するので、特に強力なＴｈ細胞活性化因子である。さらに、ＡＰＣには、マクロファージ、Ｂ細胞、およびいくつかの活性化上皮細胞が含まれる。特定のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）によって刺激されたときにＡＰＣとして作用し得る細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞（脳）、膵β細胞、および血管内皮細胞が含まれる。
例えば、いくつかの実施形態において、ターゲッティングユニットは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的な一本鎖可変領域断片ターゲッティングユニットを含む。一本鎖可変領域断片（single chain variable fragment：ｓｃＦｖ）は、短いリンカーペプチド（例えば、約１０〜約２５個のアミノ酸）に接続した免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリンまたはトレオニンが豊富である。リンカーは、重鎖のＮ末端を軽鎖のＣ末端に接続させること、またはその逆に接続させることができる。ｓｃＦｖは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングされた重鎖および軽鎖から直接作製され得る（例えば、哺乳動物細胞培養由来、またはＥ．ｃｏｌｉの培養等の細菌細胞培養において）。
ターゲティング機能を有するｓｃＦｖは、ＡＰＣ上の表面分子に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現するＢ細胞ハイブリドーマに由来するか、または任意の供給源（例えば、ファージディスプレイライブラリー）に由来し得る。標的化部分としてのＢ細胞ハイブリドーマ由来のｓｃＦｖの使用することで、ＡＰＣ上の異なる表面分子に結合するｍＡｂを産生するＢ細胞ハイブリドーマの広範なコレクションに起因して、広範囲のものが標的となり得る。さらに、アゴニスト性またはアンタゴニスト性ｍＡｂを採用することによって、標的細胞に与えられるシグナルの性質を選択し得る。Ａｂ−Ａｇ相互作用に関する知識を増やすことで、結合部位におけるアミノ酸の置換により、そのようなｍＡｂのＡｇに対する結合親和性を向上させることができるだろう。これは、通常の部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。ワクチンという目的のために、二量体ワクチン分子の標的を、患者自身のＩｄに対して強い特異的免疫反応を開始することができる樹状細胞（ＤＣ）のサブセットにのみ限定的に発現される表面分子とするという魅力的な方法がある。ＡＰＣ上のこのような標的表面分子の例示として、ＭＨＣＩＩ分子、ＣＤ４０、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、およびケモカイン受容体が挙げられる。従って、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、抗ＭＨＣ−ＩＩまたは抗ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ）、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ４０、または抗トール様受容体（抗トール様受容体２）である。いくつかの実施形態において、ターゲティングユニットは、リガンド（例えば、可溶性ＣＤ４０リガンドまたはケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＧＭ−ＳＣＦまたはＸｃｌ１））、細菌抗原（例えば、フラゲリン）である。
ターゲティングｓｃＦｖは、発現ベクターｐＬＮＯＨ２のＶカセットに挿入されるので（Norderhaug, Olafsen et al. 1997）、他のｓｃＦｖｓと容易に交換される。
また、抗原は、種々のタイプのＡＰＣ上の表面分子（例えば、受容体）に対する抗体または他の抗体断片に、抗原を結合させることによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とし得る。他のターゲティングユニットは、抗免疫グロブリン（例えば、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、ＩｇＤ等）、およびＦａｂまたはＦａｂ’断片を含む。
〔ヘテロ二量体化ユニット〕
本技術の二量体ワクチン分子は、ヘテロ二量体化ドメインを含む。特に、二量体ワクチン分子の各ポリペプチドは、他のポリペプチド上のヘテロ二量体化ユニットと特異的に相互作用してヘテロ二量体化ドメインを形成するヘテロ二量体化ユニットを含む。従って、本明細書で使用される「ヘテロ二量体化ドメイン」という用語は、２つのヘテロ二量体化ユニット、例えば、以下により詳細に記載されるようなＡＣＩＤおよびＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニット、またはバルスターおよびバルナーゼヘテロ二量体化ユニットの相互作用によって形成される二量体分子中のドメインを指す。ヘテロ二量体化ドメインの具体的な例示としては、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化ドメインおよびバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
本技術の二量体ワクチン分子は、ヘテロ二量体化ドメインを含む。特に、二量体ワクチン分子の各ポリペプチドは、他のポリペプチド上のヘテロ二量体化ユニットと特異的に相互作用してヘテロ二量体化ドメインを形成するヘテロ二量体化ユニットを含む。従って、本明細書で使用される「ヘテロ二量体化ドメイン」という用語は、２つのヘテロ二量体化ユニット、例えば、以下により詳細に記載されるようなＡＣＩＤおよびＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニット、またはバルスターおよびバルナーゼヘテロ二量体化ユニットの相互作用によって形成される二量体分子中のドメインを指す。ヘテロ二量体化ドメインの具体的な例示としては、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化ドメインおよびバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体化ドメインは、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化システム等で使用されるロイシンジッパーである（Busch, et al. 2002 “Stabilization of soluble, low−affinity HLA−DM/HLA−DR1 complexes by leucine zippers” J Immunol Methods 263: 111、参照）。このシステムにおいて、一方のヘテロ二量体化ユニットは、酸性ロイシンジッパードメイン、例えば、ＡＣＩＤモジュール（例えば、ＡｃｉｄＰ１またはＦｏｓ）を含み、他方のヘテロ二量体化ユニットは、塩基性ロイシンジッパードメイン、例えば、ＢＡＳＥモジュール（例えば、ＢａｓｅＰ１またはＪｕｎ）を含み、これらは、互いに特異的に相互作用して、ヘテロ二量体ワクチン分子のヘテロ二量体化ドメインを形成する。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体化ドメインは、細菌性バルナーゼモジュールおよび細菌性バルスターモジュールを含む。例えば、Spang HCL, Braathen R, Bogen B (2012) Heterodimeric Barnase−Barstar Vaccine Molecules: Influence of One versus Two Targeting Units Specific for 抗gen Presenting Cells. PLoS ONE 7(9): e45393、参照（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Bacillus amyloliquefaciensのタンパク質であるバルナーゼおよびバルスターは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の親和性に匹敵する非常に高い親和性（ＫＤ：〜１０〜１４Ｍ）で互いに結合する。バルナーゼ−バルスターモジュールは、バルナーゼおよびバルスターのｓｃＦｖＮ末端、ならびにバルナーゼのｓｃＦｖ［２９］または第２のバルナーゼＣ末端の融合に適応することができる。
しかし、本技術は、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥまたはバルスター／バルナーゼドメインを含むヘテロ二量体ワクチン分子に限定されない。例えば、互いに特異的な２つの二量体化ドメインを含む、任意の二量体化ドメインを使用することができる。いくつかの実施形態において、「つまみおよび孔（knobs and holes）」システムが使用される（Xie, et al. 2005 “A new format of bispecific 抗body: highly efficient dimerization, expression and tumor cell lysis.” J Immunol Methods 296: 95、参照）。このシステムは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインに基づき、二量体ワクチン分子の二量体化ドメインを提供する相補的なつまみ（knob）および孔（hole）を生成する。一方のポリペプチドは、つまみモジュールを含み、他方のポリペプチドは、孔モジュールを含む。
本発明のワクチンモノマーをコードする少なくとも第１の構築物および第２の構築物のヘテロ二量体化ドメインは異なり、互いに互換性があることが理解されるだろう。例えば、本発明のＤＮＡワクチンが、第１の拡散構築物および第２の核酸構築物（または第３の構築物および第４の構築物．．．等）を含む場合、構築物の一方はＡＣＩＤ（またはバルスター）ユニットを有し、二量体対の他方の構築物は、ＢＡＳＥ（またはバルナーゼ）ユニットを有する。同様に、本発明のヘテロ二量体ワクチンポリペプチド分子は、一対のモノマーを含み、ここで、モノマーの一方はＡＣＩＤ（またはバルスター）ユニットを有し、二量体対の他方のモノマーは、ＢＡＳＥ（またはバルナーゼ）ユニットを有する。
〔ＤＮＡワクチン〕
本明細書中に提供される技術は、二量体ワクチン分子をコードする核酸を含むＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、単一の核酸は、二量体化して二量体を形成する２つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、２つの別個の核酸は、二量体化して二量体を形成する２つのポリペプチドを含む（例えば、一方の核酸は一方のポリペプチドをコードし、他方の核酸は、他方の核酸をコードする）。種々の実施形態において、核酸は、細胞中に導入することができ、in vivoにおいてポリぺプチドを発現することができる任意の核酸である。
本明細書中に提供される技術は、二量体ワクチン分子をコードする核酸を含むＤＮＡワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、単一の核酸は、二量体化して二量体を形成する２つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、２つの別個の核酸は、二量体化して二量体を形成する２つのポリペプチドを含む（例えば、一方の核酸は一方のポリペプチドをコードし、他方の核酸は、他方の核酸をコードする）。種々の実施形態において、核酸は、細胞中に導入することができ、in vivoにおいてポリぺプチドを発現することができる任意の核酸である。
これらの実施形態において、ＤＮＡワクチンは、単独で、または他の所望の配列と共同して、上述の融合構築物（すなわち、二量体化ドメインおよび／または他のリンカーを介して抗原性ユニットに動作可能に連結された標的化ユニット）をコードするＤＮＡ分子を含む。抗原が抗原提示細胞に取り込まれ、主にＭＨＣクラスＩＩとの関連で発現する組換えタンパク質ワクチンとは異なり、核酸ワクチン中のＤＮＡは直接的に抗原提示細胞に取り込まれて発現し、自然にプロセシングされたＭＨＣクラスＩおよびＩＩのエピトープの両方を介した抗原提示が行われる。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡワクチンは、核酸の発現に好適なベクター中に、本明細書に記載の融合構築物をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、発現カセットにおいて発現される。特定の実施形態において、発現カセットは真核生物の発現カセットである。「真核生物の発現カセット」という用語は、真核生物細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。真核生物の発現カセットは、真核細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を制御することができる調節配列、好ましくはプロモータおよびポリアデニル化シグナルを含む。組換えＤＮＡ分子に含まれるプロモータおよびポリアデニル化シグナルは、免疫化される対象の細胞内で機能的であるように選択される。とりわけヒト用のＤＮＡワクチンの産生に好適なプロモータの例示として、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモータ等のＣＭＶ由来のプロモータ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）由来のプロモータ、ＨＩＦ末端反復配列（long terminal repeat：ＬＴＲ）プロモータ等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモータ、モロニーウイルス由来のプロモータ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプロモータ、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモータ、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子由来のプロモータが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、真核生物の発現カセットは、ＣＭＶプロモータを含む。本発明の文脈において、「ＣＭＶプロモータ」という用語は、強力なサイトメガロウイルス前初期プロモータを指す。
とりわけヒト用ＤＮＡワクチンの産生に好適なポリアデニル化シグナルの例示として、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されない。
他の要素もまた、組換えＤＮＡ分子に含まれ得る。そのようなさらなる要素としてエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、およびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来のエンハンサーのようなウイルスエンハンサーであり得る。
調節配列およびコドンは一般に、種依存性であり、従って、タンパク質の産生を最大にするために、調節配列およびコドンは、好ましくは免疫化される種において効率的であるように選択される。当業者は、所与の対象種において機能的である組換えＤＮＡ分子を産生することができる。
本発明は、ワクチン組成物の特定の剤形によって限定されない。ワクチンがＤＮＡワクチンである場合、ワクチンは、好ましくは生理食塩水または他の生理学的に許容可能な溶液もしくはバッファ中で提供され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、１つ以上の組織への針注射によって筋肉内（ｉ．ｍ．）投与される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡワクチン接種はそれぞれの大腿四頭筋へのｉ．ｍ．である。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションは、注射直後に、Liu et al.(2008, J Virol 82: 5643−5649)に公開されるように、エルゲンエレクトロポレータデバイス（Elgen, Inovio Biomedical Co.）によって、注射部位に隣接してｉ．ｍ．挿入された電極からパルスを送達（ニードルＥＰ）して行われ、電気パルスは、５０Ｖ／４００ｍＡ、２００ｍｓの間隔で５×６０ｍｓとして与えられる。他の実施形態において、左側および右側の脇腹における皮内でエレクトロポレーションを行い、続いて、ＤｅｒｍａＶａｘ(Cyto Pulse Sciences, Inc)システムを用いたエレクトロポレーションを行う（パルスは、４５０Ｖ／ｃｍ×２．５μｓで２回、および１１０Ｖ／ｃｍ×８．１ｍｓで８回）。エレクトロポレーションは、ＤＮＡワクチンのワクチンタンパク質への翻訳を増大させるために行われる。いくつかの実施形態において、効率的な経路は、後肢四頭筋または前脛骨筋への筋肉内注射、続いて皮内注射である。これらの経路は通常、強力な抗原特異的なＴｈ１偏向性の体液性および細胞性免疫反応を引き起こす。他の実施形態において、遺伝子銃が利用される。これらの実施形態において、上述のＤＮＡワクチンは、粒子、好ましくは金粒子上に被覆される。
一般的に、送達方法によって、効率的な免疫反応を引き起こすために必要とされる用量が決定される。生理食塩水の注射には、１０μｇ〜１ｍｇの可変量のＤＮＡが必要であり、一方、遺伝子銃による送達には、１００〜１０００倍が必要である。一般的に、０．２μｇ〜２０μｇが必要であるが、１６ｎｇほどの少ない量も報告されている。これらの量は、種によって異なる。例えばマウスは、霊長類よりも約１０倍少ないＤＮＡを必要とする。生理食塩水注射は、ＤＮＡが標的組織（通常、筋肉）の細胞外に運ばれ、細胞に取り込まれる前に物理的な障壁（基底板や大量の結合組織等、詳細は言うまでもない）を克服しなければならないため、より多くのＤＮＡが必要である。一方、遺伝子銃は、ＤＮＡを細胞内に直接打ち込むため、「無駄」が少なくなる。エレクトロポレーションはまた、必要とされるＤＮＡの量を低減する（例えば、プラスミドあたり０．０４μｇ〜１２．５０μｇ）。
〔ワクチン〕
本明細書中に提供される技術によって提供されるような二量体ワクチン分子には、ワクチン、ワクチン成分である組成物、および／または本技術に係る二量体ワクチン分子（例えば、二量体ポリペプチド分子）、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列、または発現ベクターを含む医薬品における使用が見出される。適宜、この医薬品は、薬学的に適合可能な担体をさらに含む。このような医薬品における好適な担体および剤形は、当業者に公知である。好適な担体は、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、湿潤剤、滅菌溶液等である。医薬品は、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与の方法は、局所投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与を含む。好適な用量は、主治医によって決定され、異なる因子（例えば、患者の年齢、性別および体重、投与の種類等）に依存する。
本明細書中に提供される技術によって提供されるような二量体ワクチン分子には、ワクチン、ワクチン成分である組成物、および／または本技術に係る二量体ワクチン分子（例えば、二量体ポリペプチド分子）、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列、または発現ベクターを含む医薬品における使用が見出される。適宜、この医薬品は、薬学的に適合可能な担体をさらに含む。このような医薬品における好適な担体および剤形は、当業者に公知である。好適な担体は、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、湿潤剤、滅菌溶液等である。医薬品は、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与の方法は、局所投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与を含む。好適な用量は、主治医によって決定され、異なる因子（例えば、患者の年齢、性別および体重、投与の種類等）に依存する。
一態様において、ワクチンまたはワクチン成分は、マウスを免疫化して、ハイブリドーマを産生させるために使用される。いくつかの実施形態において、ワクチンは感染性疾患のためのものであり、他の実施形態において、ワクチンは、癌の治療用ワクチンである。ワクチンが構築され得る感染性疾患には、ウイルス疾患（ロタウイルス、ノロウイルス、狂犬病、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等を含む）、細菌疾患（例えば、淋病、レンサ球菌性肺炎、結核、野兎病等）、真菌疾患（例えば、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、およびカンジダ症）および原虫疾患（例えば、クリプトスポリジウム症、リーシュマニア症、フィラリア症等）が含まれるが、これらに限定されない。治療用ワクチン接種に反応し得る癌の例示として、例えば、子宮頸癌、黒色腫、骨髄腫、および乳癌がある。いくつかの実施形態において、ワクチンはヒトへの使用を目的とし、いくつかの実施形態において、動物（例えば、家畜、コンパニオンアニマル、および任意の他のタイプの動物（魚類、野生生物等））のワクチン接種を目的とする。上記ワクチンはまた、対象（例えば、患者）由来の細胞にin vitroにおいて適用され、ＡＰＣ結合および提示を引き起こし得る；次いで、上記細胞は、起源の宿主（対象、患者）に戻され得る。
いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子のポリペプチドを発現する核酸は、二量体ワクチン分子の産生のためにin vitroにおいて宿主細胞中に存在する。細胞培養においてポリペプチドを産生するための組換え方法は、当該分野で周知である。例えば、いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子のポリペプチドは、E. coliの培養等の細菌培養において発現され、二量体ワクチン分子のポリペプチドは、ワクチンを提供するために培養物から精製および単離される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細胞培養中に保持された真核細胞（例えば、ＮＳＯ細胞、２９３Ｅ細胞およびＣｏｓ−７細胞に遺伝子導入された）であり、いくつかの実施形態において、形質転換された細胞であってもなくてもよい。
一実施形態において、二量体ワクチンは非経口投与される。別の実施形態において、二量体ワクチン分子は、鼻腔または他の粘膜等の粘膜表面に投与される。別の特定の実施形態において、二量体ワクチン分子は、口腔粘膜または胃腸粘膜への提示を可能にするように、経口投与される。経口投与のいくつかの形態において、二量体ワクチン分子は、腸溶カプセルまたはゲルカプセルにカプセル化される。さらに他の実施形態において、二量体ワクチン分子は、咀嚼可能な形態に組み合わされる。動物へ送達される場合、二量体ワクチン分子は、餌または食品に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子は、皮膚に局所的に塗布され得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で提供される二量体ワクチンを含むワクチン組成物を提供する。本発明は、二量体ワクチン分子を含む組成物の特定の剤形によって限定されない。実際、本発明のワクチン組成物は、二量体ワクチン分子に加えて、１つ以上の異なる薬剤を含んでいてもよい。これらの薬剤または補因子には、アジュバント、界面活性剤、添加剤、緩衝剤、可溶化剤、キレート剤、油、塩、治療剤、薬物、生物活性剤、抗細菌剤、および抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤等）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含むワクチン組成物は、免疫反応を誘導する抗原性ユニットの能力を増大させる薬剤または補因子（例えば、アジュバント）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、１つ以上の補因子または薬剤が存在することで、免疫反応（例えば、防御免疫反応（例えば、防御免疫化））の誘発に必要とされる抗原性ユニットの量を低減する。いくつかの実施形態において、１つ以上の補因子または薬剤を存在させることで、細胞性（例えば、Ｔ細胞媒介性）または体液性（例えば、抗体媒介性）免疫反応に対する免疫反応を歪める。本発明は、本発明の治療剤において使用される補因子または薬剤のタイプによって限定されない。
アジュバントは、概して、Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995に記載されており、該文献は全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。本発明は、（例えば、組成物（例えば、薬学的組成物）における使用のために）利用されるアジュバントのタイプによって限定されない。例えば、いくつかの実施形態において、好適なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲル（例えば、ミョウバン）等のアルミニウム塩、またはリン酸アルミニウムが含まれる。いくつかの実施形態において、アジュバントは、カルシウム、鉄、または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシンもしくはアシル化糖、カチオン性もしくはアニオン性誘導体化多糖、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
一般的に、免疫反応は、抗原と免疫系の細胞との相互作用を介して、抗原に対して引き起こされる。免疫反応は大きく２つのカテゴリーに分類される：体液性免疫反応と細胞媒介性免疫反応（例えば、伝統的には、それぞれ抗体と効果細胞（cellular effector）による防御メカニズムによって特徴づけらる）。反応のこれらのカテゴリーは、Ｔｈ１タイプ反応（細胞媒介性）およびＴｈ２タイプ免疫反応（体液性反応）と呼ばれる。
免疫反応の刺激は、医学的介入（intervention）に対する免疫系の細胞または成分の直接的または間接的的反応（例えば、抗原性ユニットへの曝露）から生じ得る。免疫反応は、免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＡＰＣ、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等）の活性化、増殖、または分化；マーカーおよびサイトカインのアップレギュレートされたまたはダウンレギュレートされた発現；ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ力価の刺激；脾腫（脾細胞充実性の増大を含む）；種々の器官における過形成および混合細胞浸潤、を含む多くの方法で測定することができる。免疫刺激に関して評価され得る免疫系の他の応答、細胞、および成分は、当該分野で公知である。
メカニズムの理解は本発明を実施するために必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用メカニズムにも限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、（例えば、マクロファージ、樹状細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞による）サイトカインの発現および分泌を誘導する。特定のサイトカインの発現の変調は、局所的または全身的に生じ得る。サイトカインのプロファイルにより、免疫反応におけるＴ細胞調節および効果作用を決定することができることが知られている。いくつかの実施形態において、Ｔｈ１タイプのサイトカインが誘導され得、従って、本発明の免疫刺激組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴｈ１タイプの抗原特異的免疫反応を促進し得る（例えば、これによって、望ましくないＴｈ２タイプの免疫反応（例えば、疾患の重症化（例えば、ＩＬ−１３の粘液形成の誘導）に関与するＴｈ２タイプのサイトカイン（例えば、ＩＬ−１３）の形成）が回避される）。
サイトカインはＴ細胞応答の方向づけに役割を果たしている。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、Ｂ細胞および他のＴ細胞を含む他の免疫系細胞に作用する可溶性因子の産生を介して、哺乳類の免疫反応を調整する。ほとんどの成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、２つのサイトカインプロファイル、すなわちＴｈ１またはＴｈ２のいずれかを発現する。Ｔｈ１タイプのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよび高レベルのＴＮＦ−αを分泌する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、および低レベルのＴＮＦ−αを発現する。Ｔｈ１タイプのサイトカインは、マウスではＩｇＧ２ａへの、またヒトではＩｇＧ１への免疫グロブリンクラススイッチによって特徴付けられる細胞媒介性免疫と体液性免疫の両方を促進する。Ｔｈ１反応は、遅延型過敏症および自己免疫疾患とも関連し得る。Ｔｈ２タイプのサイトカインは、主として体液性免疫を誘導し、ＩｇＧ１およびＩｇＥへのクラススイッチを誘導する。Ｔｈ１反応に関連する抗体のアイソタイプは、一般的に中和およびオプソニン化する能力を有し、一方、Ｔｈ２反応に関連する抗体のアイソタイプは、アレルギー反応により関連する。
いくつかの因子は、Ｔｈ１タイプまたはＴｈ２タイプの反応のいずれかに対する免疫反応の歪みに影響することが示されている。最もよくその特性を示すレギュレータは、サイトカインである。ＩＬ−１２とＩＦＮ−γは、正のＴｈ１レギュレータかつ負のＴｈ２レギュレータである。ＩＬ−１２は、ＩＦＮγ産生を促進し、ＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２に対して正のフィードバックを行う。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、Ｔｈ２サイトカインのプロファイルの確立およびＴｈ１サイトカインの産生をダウンレギュレートすることにおいて重要であると思われる。
従って、好ましい実施形態において、本発明は、対象においてＴｈ１タイプの免疫反応を刺激する方法であって、抗原性ユニット（例えば、記載される本技術によって提供される二量体ワクチン分子）を含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。しかしながら、他の実施形態において、本発明は、（例えば、Ｔ細胞媒介性反応の平衡化が所望される場合、）対象におけるＴｈ２タイプの免疫反応を刺激する方法であって、抗原性ユニット（例えば、記載される本技術によって提供される二量体ワクチン分子）を含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。さらに好ましい実施形態において、Ｔｈ１タイプまたはＴｈ２タイプの免疫反応のいずれかに対する免疫反応を歪めるために、アジュバントが使用され得る（例えば、本発明の組成物と共投与され得る）。例えば、Ｔｈ２反応または弱いＴｈ１反応を誘導するアジュバントとして、ミョウバン、サポニンおよびＳＢ−Ａｓ４が含まれるが、これらに限定されない。Ｔｈ１反応を誘導するアジュバントとして、ＭＰＬ、ＭＤＰ、ＩＳＣＯＭＳ、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、およびＳＢ−ＡＳ２が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の組成物および方法において、いくつかの他のタイプのＴｈ１タイプの免疫原が、（例えば、アジュバントとして）使用され得る。これらには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ（例えば、特に、３−脱Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ））が使用される。３Ｄ−ＭＰＬは、Ribi Immunochem, Montana製の周知のアジュバントである。これは、しばしば、４、５、または６個のアシル化鎖のいずれかを有する３−脱Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物として供給される。いくつかの実施形態において、ジホスホリル脂質Ａおよびその３−Ｏ−脱アシル化変異体が使用される。これらの各免疫原は、ＧＢ２１２２２０４Ｂに記載されている方法によって精製および調製することができ、本明細書にはその全体が参照により組み込まれている。精製および合成される他のリポ多糖類が記載されている（例えば、U.S. Pat. No. 6,005,099およびEP 0 729 473；Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392−6；Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1):141−6;およびEP 0 549 074、参照（これらの各文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される））。いくつかの実施形態において、３Ｄ−ＭＰＬは、粒子剤形の形態で使用される（例えば、EP 0 689 454（その全体が参照として本明細書に援用される）に記載される、０．２μｍ未満の小さな粒径を有する）。
いくつかの実施形態において、サポニンは本発明の組成物中の免疫原（例えば、Ｔｈ１タイプのアジュバント）として使用される。サポニンは周知のアジュバントである（例えば、Lacaille−Dubois and Wagner (1996) Phytomedicine vol 2 pp 363−386、参照）。サポニンの例示として、クイルＡ（南アメリカの樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮由来）およびその画分（例えば、U.S. Pat. No. 5,057,540；Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1−2):1−55；およびEP 0 362 279、参照（これらの各文献は、それぞれその全体が参照として本明細書に援用される））が含まれる。溶血性サポニンＱＳ７、ＱＳ１７、およびＱＳ２１（クイルＡのＨＰＬＣ精製画分；例えば、Kensil et al. (1991). J. Immunology 146,431−437, U.S. Pat. No. 5,057,540；WO 96/33739；WO 96/11711およびEP 0 362 279、参照（これらの各文献は、それぞれその全体が参照として本明細書に援用される））もまた、本発明において有益であると考えられる。ＱＳ２１とポリソルベートまたはサイクロデクストリンとの組合せもまた、有用であると考えられる（例えば、WO 99/10008、参照（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含む免疫原性オリゴヌクレオチドが、アジュバントとして使用される。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの省略形である。ＣｐＧは、全身経路および粘膜経路の両方によって投与される場合のアジュバントとして、当該分野で公知である（例えば、WO 96/02555、EP 468520、Davis et al., J.Immunol, 1998, 160(2):870−876；McCluskie and Davis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463−6；およびU.S. Pat. App. No. 20050238660、参照（これらの各文献は、それぞれその全体が参照として本明細書に援用される））。例えば、いくつかの実施形態において、免疫刺激配列はプリン−プリン−Ｃ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジンであり、ここでＣＧモチーフはメチル化されていない。
本発明を実施するためにメカニズムの理解は必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用メカニズムにも限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上のＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在によって、ナチュラルキラー細胞（ＩＦＮ−γを産生する）およびマクロファージを含む種々の免疫サブセットが活性化される。いくつかの実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫反応を誘導するために、本発明の組成物に製剤化される。いくつかの実施形態において、ＣｐＧの遊離溶液は、抗原と一緒に同時投与される（例えば、水溶液中に存在する（例えば、WO 96/02555、参照（本明細書中に参考として援用される））。いくつかの実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは抗原に共有結合されるか（例えば、WO 98/16247、参照（本明細書中に参考として援用される））、または水酸化アルミニウム等の担体と共に製剤化される（例えば、Brazolot−Millan et al., Proc.Natl.AcadSci., USA, 1998, 95(26), 15553−8、参照）。
いくつかの実施形態において、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子等）、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）またはＥ．大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）等の細菌ＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体、特にＬＴ−Ｋ６３（野生型アミノ酸に対して、６３位でリジンが置換される）、ＬＴ−Ｒ７２（野生型アミノ酸に対して、７２位でアルギニンが置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（野生型アミノ酸にに対して、１０９位でセリンが置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（野生型アミノ酸に対して、９位でリジンが置換され、１２９位でグリシンが置換される）（例えば、WO93/13202およびWO92/19265、参照（これらの各文献は、本明細書に参照として組み込まれる））、他の免疫原性物質（例えば、本発明の組成物の効率性を高める）は、本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物と共に使用される。
本発明において使用されるアジュバントのさらなる例示として、ポリ（ジ（カルボキシラトフェノキシ））ホスファゼン（ＰＣＰＰ高分子；Virus Research Institute, USA）；モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ribi）およびトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ribi）等のリポ多糖類の誘導体；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミン二糖類；OM Pharma SA, Meyrin, Switzerland）；ならびにリーシュマニア伸長因子（精製リーシュマニアタンパク質；Corixa Corporation, Seattle, Wash）が挙げられる。
アジュバントは、二量体ワクチン分子を含む組成物に添加されてもよく、またはアジュバントは、組成物と組み合わせるか、または組成物と共投与する前に、担体、例えばリポソームまたは金属塩（例えば、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム））と共に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含む組成物は、単一のアジュバントを含む。他の実施形態において、組成物は、２つ以上のアジュバントを含む（例えば、WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241；およびWO 94/00153、参照（これらの各文献は、それらの全体が本明細書に参照として援用される））。
いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含む組成物は１つ以上の粘膜付着剤を含む（例えば、U.S. Pat. App. No. 20050281843、参照（その全体が参照として本明細書中に援用される））。本発明は、使用される粘膜付着剤の種類によって限定されない。実際、ポリ（アクリル酸）（例えば、カルボポールおよびポリカルボフィル）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類（例えば、アルギン酸塩およびキトサン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、レクチン、線毛タンパク質、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体を含む種々の粘膜付着剤が本発明において有用であると考えられるが、これらに限定されない。本発明を実施するためにメカニズムを理解することは必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用メカニズムにも限定されない。いくつかの実施形態において、粘膜付着剤を使用する場合、粘膜付着剤を使用しない場合の二量体ワクチン分子への曝露の持続時間および／または量と比較して、対象が経験する抗原性ユニットへの曝露の持続時間および／または量が増大することで、粘膜付着剤の使用（例えば、二量体ワクチン分子を含む組成物における）により、（例えば、本発明の組成物を投与される）対象における免疫反応の誘導が高められる。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、滅菌水調製物を含んでもよい。許容可能なビヒクルおよび溶媒として、水、リンゲル液、リン酸緩衝食塩水、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。さらに、無菌の不揮発性油を、溶媒または懸濁溶媒として常用できる。この目的のために、合成モノordi−グリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性鉱油または非鉱油を使用することができる。さらに、注射可能な調製物において、オレイン酸等の脂肪酸が使用され得る。粘膜、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、または他の経路による投与に適した担体製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paで見つけることができる。
本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物は、治療用（例えば、免疫反応を高めるため）、または予防用（例えば、免疫化のため（例えば、疾病の徴候または症状を予防するため））に使用することができる。本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物は、多くの異なる送達経路および方法を介して対象に投与することができる。
例えば、本発明の組成物は、溶液中に懸濁して表面に塗布すること；溶液中に懸濁して噴霧アプリケーターを使用して表面に噴霧すること；粘膜付着剤と混合して表面（例えば、粘膜表面）に塗布すること（例えば、噴霧またはすりのばす）；鼻用および／または膣用アプリケーター上に配置または浸み込ませて塗布すること；制御放出メカニズムによって塗布すること；リポソームとして塗布すること；または高分子上に塗布することを含むが、これらに限定されない多数の方法によって対象（例えば、粘膜粘膜、膣粘膜等）に投与することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、粘膜的に投与される（例えば、標準的な技術を使用して；例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995（例えば、鼻腔内、肺、膣、および直腸技術を含む粘膜送達技術について）、ならびにEuropean Publication No. 517,565おおびIllum et al., J. Controlled Rel., 1994, 29:133−141（例えば、鼻腔内投与の技術について）、参照（これらの各文献は、その全体が参照として本明細書中に援用される））。あるいは、本発明の組成物は、標準的な技術を用いて経皮（dermallyまたはtransdermally）投与され得る（例えば、Remington: The Science arid Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th edition, 1995、参照）。本発明は、投与経路によって限定されない。
本発明を実施するためにメカニズムを理解することは必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用メカニズムにも限定されない。いくつかの実施形態において、粘膜ワクチン接種は、抗原の粘膜投与が、多くの病原体の侵入経路である粘膜表面で防御免疫反応（例えば、粘膜免疫）を誘導することが示されている投与経路である。さらに、鼻腔内ワクチン接種等の粘膜ワクチン接種は、鼻粘膜のみならず、生殖器粘膜等の離れた粘膜部位においても粘膜免疫を誘導し得る（例えば、Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265−276, 1987、参照）。粘膜免疫反応の誘導に加えて、粘膜ワクチン接種は全身免疫も誘導する。いくつかの実施形態において、非経口投与（例えば、ワクチンの筋肉内投与）は、全身免疫を加速する効率的で、簡便な方法を提供する（例えば、非経口または粘膜ワクチン接種によって誘導される（例えば、活発な全身性免疫を維持するために複数のブースト（boost）を用いる場合））。
いくつかの実施形態において、本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物は、粘膜経路（例えば、経口／消化または経鼻経路）を介して本発明の組成物を投与する手段によって、疾患に罹りやすいか、または疾病に罹患している対象を保護または治療するために使用され得る。代替の粘膜経路には、膣内および直腸内経路がある。本発明のいくつかの実施形態において、経鼻投与経路が使用され、これを、本明細書中で「鼻腔内投与」または「鼻腔内ワクチン接種」と称する。鼻腔内ワクチン接種の方法は、当該分野で周知であり、免疫化される対象の鼻咽頭への液滴または噴霧形態のワクチンの投与が含まれる。いくつかの実施形態において、霧状にされたまたはエアロゾル化された組成物が提供される。経口投与のための胃耐性カプセル、直腸または膣投与のための座薬等の腸溶性製剤もまた、本発明の一部を形成する。本発明の組成物はまた、経口経路を介して投与され得る。これらの条件下では、二量体ワクチン分子を含む組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含み得、および／またはアルカリ性緩衝液または腸溶性カプセルを含み得る。経鼻送達のための製剤は、アジュバントとしてデキストランもしくはシクロデキストランおよびサポニンを有する製剤を含み得る。
本発明の組成物はまた、膣経路を介して投与され得る。このような場合、二量体ワクチン分子を含む組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤および／または乳化剤、高分子（例えば、CARBOPOL）、ならびに膣クリームおよび座薬の他の公知の安定化剤を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、直腸経路を介して投与される。このような場合、組成物は、直腸座薬を形成するための技術分野で公知の賦形剤および／またはワックスおよびポリマーを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、初回ワクチン接種および追加ワクチン接種の両方で、同じ投与経路（例えば、粘膜投与）が選択される。いくつかの実施形態において、免疫反応を刺激するために、複数の投与経路が使用される（例えば、同時に、または代わりに、連続して）。
例えば、いくつかの実施形態において、二量体ワクチンを含む組成物は、初回ワクチン接種または追加ワクチン接種の処方計画のいずれかで対象の粘膜表面に投与される。あるいはいくつかの実施形態において、組成物は、初回ワクチン接種または追加ワクチン接種の処方計画のいずれかで全身投与される。いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含む組成物は、、対象に、初回ワクチン接種の処方計画で粘膜投与を介し、追加の処方計画で全身投与を介して投与される。いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含む組成物は、対象に、初回ワクチン接種の処方計画で全身投与を介し、および追加の処方計画において粘膜投与を介して投与される。全身投与経路の例示としては、経口、筋肉内、皮内、経皮、皮下、腹腔内、または静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。二量体ワクチンを含む組成物は、予防目的および治療目的の両方に使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、肺送達によって投与される。例えば、本発明の組成物は、対象（例えば、ヒト）の肺に、吸入を介して（例えば、それによって、肺上皮を横切って血流に到達する）送達され得る（例えば、Adjei, et al. Pharmaceutical Research 1990; 7:565−569；Adjei, et al. Int. J. Pharmaceutics 1990; 63:135−144；Braquet, et al. J. Cardiovascular Pharmacology 1989 143−146；Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206−212；Smith, et al. J. Clin. Invest. 1989;84:1145−1146；Oswein, et al. “Aerosolization of Proteins”, 1990；Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado；Debs, et al. J. Immunol. 1988; 140:3482−3488；およびU.S. Pat. No. 5,284,656 to Platz, et al、参照（これらの各文献は、その全体が参照として本明細書中に援用される））。全身的効果の薬剤の肺送達のための方法および組成物について、U.S. Pat. No. 5,451,569 to Wong, et al.（参照として本明細書中に援用される）に記載される。またU.S. Pat. No. 6,651,655 to Licalsi et al.（その全体が参照として本明細書中に援用される）を参照のこと。
本発明の実施における使用のため、医薬品の肺および／または鼻粘膜送達のために設計された広範囲の機械的装置がさらに意図され、該機械的装置には、ネブライザー、計量式吸入器、および粉末吸入器が含まれるが、これらに限定されない（これらの全ては当業者によく知られている）。本発明の実施に好適な市販の装置のいくつかの具体的な例示として、ウルトラベント（ultravent）ネブライザー（Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.）；アコルン（Acorn）ＩＩネブライザー（Marquest Medical Products, Englewood, Colo.）；ベントリン（Ventolin）計量式吸入器（Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.）；およびスピンヘイラー（Spinhaler）粉末吸入器（Fisons Corp., Bedford, Mass.）が挙げられる。このような装置は全て、治療剤の調剤に好適な製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、使用される装置のタイプに特異的であり、通常の希釈剤、アジュバント、界面活性剤、担体、および／または治療に有効な他の薬剤に加えて、適切な噴射剤材料の使用を含んでもよい。また、リポソーム、マイクロカプセルまたは微小球、包接複合体、または他の種類の担体の使用が意図される。
従って、いくつかの実施形態において、本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物は、本明細書に記載される粘膜、筋肉内、腹腔内、皮内、経皮、肺、静脈内、皮下または他の投与経路によって組成物を投与する手段によって、疾患に罹りやすいか、または罹患している対象を保護および／または治療するために使用されてもよい。ワクチン調製物の全身投与の方法として、従来のシリンジおよびニードル、または固形ワクチンのバリスティック送達（ballistic delivery）のために設計された装置（例えば、WO 99/27961、参照（本明細書中に参照として援用される））、またはニードルレス加圧液ジェットデバイス（例えば、U.S. Pat. No. 4,596,556；U.S. Pat. No. 5,993,412、参照（これらの各文献は、参照として本明細書中に援用される））、または経皮パッチ（例えば、WO 97/48440；WO 98/28037、参照（これらの各文献は、本明細書中に参照として援用される））を含み得る。本発明はまた、皮膚に塗布される抗原（経皮（transdermalまたはtranscutaneous）送達、例えば、WO 98/20734；WO 98/28037、参照（これらの各文献は、本明細書中に参照として援用される））の免疫性を高めるためにも使用され得る。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のワクチン組成物で予め充填された、全身投与のための送達装置を提供する。
本発明は、（例えば、免疫反応を刺激するために（例えば、防御免疫（例えば、粘膜および／または全身免疫）を引き起こすために））投与される対象のタイプによって限定されない。実際、広範囲の種々の対象が、本発明の組成物の投与から利益を得ることが意図される。好ましい実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、微生物（例えば、E. coli）に曝露されたかまたは曝露される可能性の高い任意の年齢（例えば、成人、小児、乳児等）である。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、病原性微生物への直接曝露を受ける可能性がより高いか、または病原体への曝露後に疾患の徴候および症状を示す可能性がより高い対象（例えば、免疫が抑制された対象）である。いくつかの実施形態において、（例えば、疾患の発生または広がりを予防するために）本発明の組成物を、一般大衆に投与する（例えば、ワクチン接種する）。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、人々のグループ（例えば、地域、都市、州および／または国の集団）に、自身の健康のため（例えば、疾病を予防または治療するため）にワクチン接種するために使用される。いくつかの実施形態において、対象は非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、または他の家畜；またはマウス、ラット、ウサギ、または他の動物）である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、（例えば、研究動物を用いた）研究環境において使用される。
本発明の組成物は、粘膜、経口、経皮、鼻腔内、非経口、または本明細書に記載の他の経路等の任意の経路による投与のために製剤化することができる。組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、トローチ、フォーム、クリームまたは液体調製物を含むが、これらに限定されない、任意の１つ以上の異なる形態であり得る。
本発明の局所製剤は、例えば、軟膏、クリームまたはローション、フォーム、およびエアロゾルとして提供されてもよく、防腐剤、溶媒（例えば、浸透を補助するため）、および軟膏およびクリーム中の皮膚軟化剤等の適切な従来の添加剤を含んでいてもよい。
局所製剤はまた、皮膚を介した活性成分の浸透を高める薬剤を含み得る。例示的な薬剤として、Ｎ−（ヒドロキシエチル）ピロリドンと細胞エンベロープ障害性化合物（cell−enbelope disordering compound）化合物との二成分を組合せたもの、糖エステルとスルホキシドまたはホスフィンオキシドとの組み合わせ、およびスクロースモノオレエート、デシルメチルスルホキシド、およびアルコールが含まれる。
皮膚浸透を高める他の例示的な物質として、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０）；ソルビタンモノオレアート（スパン８０）；ｐ−イソオクチルポリオキシエチレンフェノールポリマー（Ｔｒｉｔｏｎ ＷＲ−１３３０）；ポリオキシエチレンソールビタントリオレアート（Ｔｗｅｅｎ８５）；ジオクチルナトリウムスルホコハク酸；およびサルコシネートナトリウム（Ｓａｒｃｏｓｙｌ ＮＬ−９７）；および他の薬学的に許容可能な界面活性剤を含むが、これらに限定されない界面活性剤または湿潤剤が含まれる。
本発明の特定の実施形態において、組成物は、１つ以上のアルコール、亜鉛含有化合物、皮膚軟化剤、湿潤剤、増粘剤および／またはゲル化剤、中和剤、および界面活性剤をさらに含み得る。製剤に使用される水は、好ましくは中性ｐＨを有するイオン交換水である。局所製剤中のさらなる添加剤としては、シリコーン流体、染料、芳香剤、ｐＨ調整剤、およびビタミンが挙げられるが、これらに限定されない。
局所製剤はまた、クリームまたは軟膏用基剤、およびローション用のエタノールまたはオレイルアルコール等の適合性のある従来の担体を含んでもよい。このような担体は、製剤の約１％から約９８％まで存在し得る。軟膏用基剤は、ワセリン、鉱油、セレシン、ラノリンアルコール、パンテノール、グリセリン、ビサボロール、ココアバター等の１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物を、フォームとして製剤化し、使用され得る。医薬フォームには、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、およびリポソーム等の、これらに限定されない製剤が含まれる。これらの製剤は、基本的には性質は同様であるが、成分および最終生成物の軟度が異なる。
本発明の組成物は、従来より薬学的組成物に見られる他の補助的成分をさらに含んでいてもよい。従って、例えば、組成物は、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、または抗炎症剤等の追加の適合性のある薬学的活物質を含んでいてもよく、または、染料、香料、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤等の本発明の組成物の種々の投薬形態を物理的に製剤化する際に有効な追加の材料を含んでいてもよい。しかし、このような材物質は、添加される場合、好ましくは本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害しない。製剤は滅菌することができ、所望であれば、製剤の抗原性ユニットまたは他の成分と有害に相互作用しないアジュバント（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、着色剤、香料および／または芳香性物質等）と混合することができる。いくつかの実施形態において、本発明の免疫刺激性組成物は、薬学的に許容可能な塩の形態で投与される。塩を使用する場合、塩は薬学的に許容可能であるべきであるが、薬学的に許容不可能な塩を、その薬学的に許容可能な塩を調製するために好都合に使用してもよい。このような塩としては以下の酸から調製される塩を含むが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩等のアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
好適な緩衝剤として、酢酸および塩（１〜２ｗ／ｖ％）；クエン酸および塩（１〜３ｗ／ｖ％）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５ｗ／ｖ％）；およびリン酸および塩（０．８〜２ｗ／ｖ％）を含むが、これらに限定されない。好適な防腐剤として、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３ｗ／ｖ％）；クロロブタノール（０．３〜０．９ｗ／ｖ％）；パラベン（０．０１〜０．２５ｗ／ｖ％）およびチメロサール（０．００４〜０．０２ｗ／ｖ％）を含み得る。
いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、１つ以上の抗生物質と同時投与される。例えば、１つ以上の抗生物質を、組成物の投与と同時、投与前、および／または投与後に投与することができる。本発明は、同時投与される抗生物質のタイプによって限定されない。実際に、β−ラクタム抗生物質、ペニシリン（天然ペニシリン、アミノペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン等）、セファロスポリン（第１世代、第２世代、および第３世代セファロスポリン）、および他のβ−ラクタム（イミペネム、モノバクタム等）、β−ラクタマーゼ阻害剤、バンコマイシン、アミノグリコシドおよびスペクチノマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、メトロニダゾール、ポリミキシン、ドキシサイクリン、キノロン（例えば、シプロフロキサシン）、スルホンアミド、トリメトプリム、およびキノリンを含むが、これらに限定されない種々の抗生物質を同時投与することができる。
細菌感染、真菌感染、およびウイルス感染の処置における使用のための多数の抗菌剤が、現在、入手可能である。一般クラスのこのような薬物およびそれらの作用メカニズムに関する包括的な学術論文について、当業者はGoodman & Gilman’s “The Pharmacological Basis of Therapeutics” Eds. Hardman et al., 9th Edition, Pub. McGraw Hill, chapters 43 through 50, 1996（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照する。一般に、これらの薬剤には、細胞壁合成を阻害する薬剤（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、シクロセリン、バンコマイシン、バシトラシン）；およびイミダゾール抗真菌剤（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール、およびクロトリマゾール）；微生物の細胞膜を破壊するために直接的に影響を与える薬剤（例えば、ポルミキシンおよびコリスチメタート等の洗浄剤、および抗真菌剤の二スタチンおよびアムホテリシンＢ）；リボソームサブユニットに作用してタンパク質合成を阻害する薬剤（例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、およびクリンダマイシン）；タンパク質合成を改変し、細胞死をもたらす薬剤（例えば、アミノグリコシド）；核酸の代謝に影響を与える薬剤（例えば、リファマイシンおよびキノロン）；代謝拮抗剤（例えば、トリメトプリムおよびスルホンアミド）；およびＤＮＡ合成に必須のウイルス酵素を阻害するように作用するジドブジン、ガングシクロビル、ビダラビン、およびアシクロビル等の核酸アナログを含む。抗菌剤の種々の組み合わせを採用することができる。
本発明はまた、二量体ワクチン分子を含むワクチン組成物と、１つ以上のさらなる活性剤および／または免疫刺激剤（例えば、異なる抗原性ユニット、抗生物質、抗酸化剤等を含む組成物）との同時投与を含む方法を含む。実際、本発明の組成物を同時投与することによって、先行技術の免疫刺激方法（例えば、免疫化方法）および／または薬学的組成物を改善するための方法を提供することが、本発明のさらなる態様である。同時投与手順において、薬剤は、同時にまたは連続して投与され得る。一実施形態において、本明細書に記載される組成物は、他の活性剤に先行して投与される。医薬製剤および投与様式は、本明細書に記載されるものいずれであってもよい。さらに、２つ以上の同時投与される薬剤はそれぞれ、異なる様式（例えば、経路）または異なる製剤を使用して投与され得る。同時投与されるさらなる薬剤（例えば、抗生物質、アジュバント等）は、現在臨床的に使用されているものを含むが、これらに限定されない、当該分野で周知の薬剤のいずれであってもよい。
いくつかの実施形態において、二量体ワクチン分子を含む組成物は、２つ以上の経路を介して対象に投与される。例えば、病原性微生物に対する防御免疫反応（例えば、免疫）を有することが有益であろう対象は、粘膜投与（例えば、本明細書に記載される鼻腔投与または他の粘膜経路）を受け、さらに、１つ以上の他の投与経路（例えば、非経口または肺投与（例えば、本明細書に記載されるネブライザー、吸入器、または他の方法を介する））を受けることが有益であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、粘膜経路を介する投与は、抗原性ユニットまたは抗原性ユニットが由来する生物に対する粘膜免疫および全身免疫の両方を誘導するのに充分である。他の実施形態において、複数経路を介する投与が粘膜免疫および全身免疫の両方を提供するために役立つ。従って、メカニズムを理解することは本発明を実施するために必須ではなく、本発明はいかなる特定の作用メカニズムにも限定されない。いくつかの実施形態において、複数の投与経路を介して本発明の組成物を投与（例えば、免疫化（例えば、組成物の粘膜投与ならびに気道または非経口投与））される対象は、ただ１つの経路を介して組成物を投与される対象よりも、抗原性ユニットに対してより強力な免疫反応を有し得ると考えらえる。
他の送達システムは、時間放出型、遅延放出型、または徐放性送達システムを含み得る。このようなシステムは、組成物の反復投与を回避することができ、対象および医師にとっての利便性を増大させる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキザラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物等のポリマー系システムが含まれる。薬剤を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、U.S. Pat. No. 5,075,109に記載されている（本明細書中に参照として援用される）。送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸等のステロール、またはモノ−グリセリド、ジ−グリセリドおよびトリ−グリセリド等の中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム（sylastic system）；ペプチド系システム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用した圧縮タブレット；部分的融合インプラント等である、非ポリマーシステムを含む。具体的な実施例として、（ａ）本発明の薬剤が、U.S. Pat. Nos. 4,452,775、4,675,189、および5,736,152（これらの各文献は、本明細書中に参照として援用される）に記載されるようなマトリクス内に入った形態で含有されている侵食システム、および（ｂ）U.S. Pat. Nos. 3,854,480、5,133,974および5,407,686（これらの文献は、本明細書中に参照として援用される）に記載されるようなポリマーから活性成分が制御された速度で透過する拡散システムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、ポンプ系ハードウェア送達システムを使用することができ、その一部は、移植に適合したものである。
いくつかの実施形態において、本発明のワクチン組成物は、対象への投与に先行して希釈することができる濃縮された投与量で製剤化される。例えば、本明細書に提供される具体的な用量のいずれか１つ以上が対象に投薬されるように、濃縮された組成物の希釈物を対象に投与してもよい。いくつかの実施形態において、濃縮された組成物の希釈物は、濃縮組成物中にナノエマルジョンおよび抗原性ユニットを０．５〜５０％含む組成物が投与されるように（例えば、単回投与で）作製され得る。濃縮された組成物は、多数の対象が本発明の組成物を投与され得る環境（例えば、クリニック、病院、学校等での免疫化）において有用であると考えられる。本発明の二量体ワクチン分子を含む組成物（例えば、濃縮された組成物）は、いくつかの実施形態では室温で１週間以上、いくつかの実施形態では２週間以上、いくつかの実施形態では３週間以上、いくつかの実施形態では４週間以上、いくつかの実施形態では５週間以上、いくつかの実施形態では６週間以上安定である。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物の最初の投与（例えば、最初のワクチン接種）後に、１回目、２回目、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目、８回目、９回目、１０回目、および／または１１回目以降の投与に続き、１回以上の追加免疫投与を（例えば、約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、約６週間後、約７週間後、約８週間後、約１０週間後、約３ヶ月間後、約４ヶ月間後、約６ヶ月間後、約９ヶ月間後、約１年間後、約２年間後、約３年間後、約５年間後、約１０年間後）対象に行ってもよい。メカニズムを理解することは本発明を実施するために必須ではなく、そして本発明は任意の特定の作用メカニズムに限定されない。いくつかの実施形態において、追加免疫投与で抗原性ユニットを再導入することで、対象における強力な全身免疫が可能になる。追加免疫は、初回免疫反応のために与えられる製剤と同じものを用いてもよく、または抗原性ユニットもしくは最小免疫原エピトープを含む異なる製剤を用いてもよい。投与量処置計画はまた、少なくとも部分的に、対象の必要性によって決定され、そして医師の判断に依存する。
投与量の単位は、対象の体重、年齢、および健康状態を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて、比例して増減し得る。さらに、投与量の単位は、その後の投与（例えば、追加免疫投与）において増減し得る。
本発明の組成物および方法は、研究環境を含む種々の環境において使用され得るだろう。例えば、本発明の組成物および方法はまた、免疫系の研究（例えば、適応免疫反応（例えば、防御免疫反応（例えば、粘膜免疫または全身免疫）））において使用され得る。本発明によって提供される組成物および方法の使用は、ヒトおよび非ヒト対象ならびにこれらの対象からのサンプルを包含し、また、これらの対象を使用する研究適用を包含する。本発明の組成物および方法はまた、アルブミン変異体、抗原性ユニット、および他の成分を研究および最適化すること、ならびに新規成分をスクリーニングすることに有用である。従って、本発明は、いずれの特定の主題および／または適用環境に限定されるものではない。
本発明はさらに、本明細書に含まれるワクチン組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ワクチンを投与するために必要、充分、または有用な成分のすべてを含む。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、ワクチンを投与するための装置（例えば、針または他の注入装置）、温度制御部材（例えば、冷蔵または他の冷却部材）、衛生部材（例えば、注入部位を衛生にするためのアルコールスワブ）、およびワクチンを投与するための説明書を含む。
〔実施例１．新規ヘテロ二量体ＤＮＡワクチンのＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＯＰＣ３１５骨髄腫に対する防御〕
抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の標的とする融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、免疫反応を誘導する高い能力を有する。この技術を、ＡＰＣ上のいくつかの異なる表面分子を同時に標的化して、いくつかの異なる抗原を送達することができるワクチン分子に拡張することは有用であろう。この実施例では、それぞれが４つの異なる融合部分を発現することができるヘテロ二量体ワクチン分子の産生について記載する。
抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）の標的とする融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、免疫反応を誘導する高い能力を有する。この技術を、ＡＰＣ上のいくつかの異なる表面分子を同時に標的化して、いくつかの異なる抗原を送達することができるワクチン分子に拡張することは有用であろう。この実施例では、それぞれが４つの異なる融合部分を発現することができるヘテロ二量体ワクチン分子の産生について記載する。
２つの異なるタイプのヘテロ二量体を合成した。１つ目は、バルナーゼ−バルスタータンパク質対を利用し、２つ目は、修飾ロイシン−ジッパーα−へリックス（ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥモチーフと称する）を利用した。図１Ｂ〜Ｄを参照のこと。ヘテロ二量体は、Ｎ末端に融合したターゲティングモチーフおよびＣ末端に融合した抗原を有する。これらを、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ３ Ｉｇドメインを二量体化モチーフとして使用するワクチン体（vaccibody）ワクチン分子と、比較することができる。図１Ａを参照のこと。
本発明の構築物および抗原性ユニットの例示的な配列を、以下に提供する。
多数の異なる実験を行い、両方のヘテロ二量体形成を分析し、ヘテロ二量体が免疫反応を引き起こす能力を比較した。ヘテロ二量体を、ホモ二量体形式であるワクチン体と具体的に比較した。in vitroで産生されるワクチンタンパク質のレベルは、in vitroでのＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥおよびワクチン体構築物において同様である。図２を参照のこと。簡単に述べると、種々のヘテロ二量体およびホモ二量体プラスミドを、Ｈｅｋ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトし、上清を回収し、ＥＬＩＳＡで分析した。細胞から分泌されるタンパク質のレベルを、抗ＮＩＰおよびｓｃＦｖＭ３１５の両方に存在する、λ１およびλ２の両方を認識するｓｃＦｖＭ３１５（Ｆ）および９Ａ８、ｍＡｂによって結合される抗原であるＤＮＰ−ＢＳＡによって測定する。結果を図２に示す。ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥ二量体化ドメインのヘテロ二量体を形成する能力を分析した。図３を参照のこと。再び、種々のＡＣＩＤ／ＢＡＳＥプラスミド対および単一プラスミドをＨｅｋ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトし、上清を回収し、ＥＬＩＳＡで分析した。結果は、抗原およびターゲティングユニットがＡＣＩＤまたはＢＡＳＥモノマー上で等しく発現され得ることを示す。さらに、単量体であるＡＣＩＤおよびＢＡＳＥ融合タンパク質は、in vitroで分泌され得る。ワクチン分子を製造するために、多数の異なる抗原を使用することができる。in vitroでの種々のＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体の分析の結果を示す図４を参照のこと。結核（Ｅおよび８５ｂ）、インフルエンザ（ＨＡ）の抗原、骨髄腫抗原（Ｆ＝Ｍ３１５）、ならびにＯＶＡおよびｍＣｈｅｒｒｙのようなモデル抗原を含むヘテロ二量体をコードするプラスミドを、Ｈｅｋ２９３Ｅ細胞に一過的にトランスフェクトし、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分析した。ヘテロ二量体のターゲティングユニットとして使用した場合のＭＩＰ１αの化学走性活性を保持する能力を分析した。図５ａおよび５ｂに示すように、種々のワクチン分子を一過的にトランスフェクトしたＨｅｋ２９３Ｅ細胞由来上清は、トランスウェルフィルター（transwell filter）を介してＣＣＲ１＋およびＣＣＲ５＋ＥＳｂ−ＭＰ細胞を誘引する。
ワクチン分子を、in vivoでの実験にも使用した。ＤＮＡワクチンをマウスの筋肉に投与し、続いてエレクトロポレーションを行って、ＤＮＡの取り込みおよび血清に分泌されるワクチンタンパク質の産生を増大させる。図６は、５０μｇのＭ３１５を用いて、ｉ．ｍ．で１度免疫化され、６２日目にタンパク質追加免疫を行われたマウスにおける、Ｍ３１５特異的免疫反応の結果を示す。通常のワクチン体と比較した場合、ＩｇＧ１反応は、ワクチン体よりもわずかに遅いが、ＩｇＧ２ａは、ワクチン体ワクチンと比較してわずかに改善される。図７に示すように、免疫反応は、ＭＯＰＣ３１５腫瘍細胞に対して引き起こされ得る。グループあたり１０匹のマウスに、プラスミドあたり５０μｇのＤＮＡを接種し、１４日後に１００，０００のＭＯＰＣ３１５腫瘍細胞を抗原投与した。
上記のデータからわかるように、バルナーゼ−バルスターヘテロ二量体およびＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体は、Ｎ端末およびＣ端末に結合した融合タンパク質を用いて、in vitroおよびin vivoで効率的に発現される。種々のターゲティングユニットおよび抗原性ユニットが、in vitroでヘテロ二量体中の融合タンパク質として発現されたため、両方のヘテロ二量体は、柔軟であった。最後に、ＭＩＰ−１αターゲッティングは、ホモ二量体ワクチン体よりもさらに良好に、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体を伴う抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ反応を誘導した。さらに、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体は、ＭＯＰＣ３１５骨髄腫腫瘍からマウスを保護し、２つのＭＩＰ−１αターゲティングユニットが保護に不可欠であった。
これらの結果は、ヘテロ二量体ワクチン分子が、高い有効性を有する新規のＤＮＡワクチンを開発するための柔軟な基盤を提供することを示す。
〔例示的な構築物の配列〕
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：１）］
ヌクレオチド由来のＭＩＰ１α：050〜256
ヒンジ：666〜716
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：717〜1022
リンカー：1023〜1037
Ｍ３１５抗原：1038〜1766
001 GGGTGACAAT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTGCATTCCG
051 CGCCATATGG AGCTGACACC CCGACTGCCT GCTGCTTCTC CTACAGCCGG
101 AAGATTCCAC GCCAATTCAT CGTTGACTAT TTTGAAACCA GCAGCCTTTG
151 CTCCCAGCCA GGTGTCATTT TCCTGACTAA GAGAAACCGG CAGATCTGCG
201 CTGACTCCAA AGAGACCTGG GTCCAAGAAT ACATCACTGA CCTGGAACTG
251 AACGCTGGTG AGTCGTACGC TAGCAAGCTT GGCCAGCGCA GGGAGGGAGG
301 GTGTCTGCTG GAAGCCAGGC TCAGCCCTCC TGCCTGGACG CATCCCGGCT
351 GTGCAGTCCC AGCCCAGGGC ACCAAGGCAG GCCCCGTCTG ACTCCTCACC
401 CGGAGGCCTC TGCCCGCCCC ACTCATGCTC AGGGAGAGGG TCTTCTGGCT
451 TTTTCCACCA GGCTCCGGGC AGGCACAGGC TGGATGCCCC TACCCCAGGC
501 CCTTCACACA CAGGGGCAGG TGCTGCGCTC AGAGCTGCCA AAAGCCATAT
551 CCAGGAGGAC CCTGCCCCTG ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC
601 TACTCACTCA GCTCAGACAC CTTCTCTCTT CCCAGATCTG AGTAACTCCC
651 AATCTTCTCT CTGCAGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACA CAACTCACAC
701 ATGCCCACGG TGCCCAGGAG GTAGCAGCGG TGGAAAATTC GGCGGTTCCA
751 CTACAGCTCC ATCAGCTCAG CTCGAAAAAG AGCTCCAGGC CCTGGAGAAG
801 GAAAATGCAC AGCTGGAATG GGAGTTGCAA GCACTGGAAA AGGAACTGGC
851 TCAGGGAGGT GGTAGCGGAG GGTTAACCAA ATTCGGCGGT TCCACTACAG
901 CTCCATCAGC TCAGCTCGAA AAAGAGCTCC AGGCCCTGGA GAAGGAAAAT
951 GCACAGCTGG AATGGGAGTT GCAAGCACTG GAAAAGGAAC TGGCTCAGGG
1001 AGGTGGTAGC GGAGGGTTAA CCGGCCTCAG CGGCCTGGAT GTACAGCTTC
1051 AGGAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGAAACCTT CTCAGTCTCT GTCTCTCACC
1101 TGCTCTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT GGGTATTTCT GGAACTGGAT
1151 ACGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG GTTGGGCTTC ATAAAGTACG
1201 ACGGTAGCAA TGGCTACAAT CCATCTCTCA AAAATCGAGT TTCCATCACT
1251 CGTGACACAT CTGAGAACCA GTTTTTCCTG AAGTTGAATT CTGTGACTAC
1301 TGAGGACACA GCTACATATT ACTGTGCCGG AGATAATGAT CACCTCTACT
1351 ACTTTGACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGGTGGA
1401 GGCGGATCTG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGCTGTTGT
1451 GACTCAGGAA TCTGCACTCA CCACATCACC TGGTGGAACA GTCATACTCA
1501 CTTGTCGCTC AAGTACTGGG GCTGTTACAA CTAGTAACTA TGCCAACTGG
1551 ATACAAGAAA AACCAGATCA TTTATTCACT GGTCTAATCG GTGGTACCAG
1601 CAACCGAGCT CCAGGTGTTC CTGTCAGATT CTCAGGCTCC CTGATTGGAG
1651 ACAAGGCTGC CCTCACCATC ACAGGGGCAC AGACTGAGGA TGATGCAATG
1701 TATTTCTGTG CTCTATGGTT CAGAAACCAT TTTGTTTTCG GCGGTGGAAC
1751 CAAGGTCACT GTCCTATGAG GCCTGCAGGG CCGGTCCGTC GACTCTAGAG
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：２）］
CTCCACAGGTGTGCATTCCGCGCCATATGGAGCTGACACCCCGACTGCCTGCTGCTTCTCCTACAGCCGGAAGATTCCACGCCAATTCATCGTTGACTATTTTGAAACCAGCAGCCTTTGCTCCCAGCCAGGTGTCATTTTCCTGACTAAGAGAAACCGGCAGATCTGCGCTGACTCCAAAGAGACCTGGGTCCAAGAATACATCACTGACCTGGAACTGAACGCTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTAGCAGCGGTGGAAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGCTCGAAAAAGAGCTCCAGGCCCTGGAGAAGGAAAATGCACAGCTGGAATGGGAGTTGCAAGCACTGGAAAAGGAACTGGCTCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGCTCGAAAAAGAGCTCCAGGCCCTGGAGAAGGAAAATGCACAGCTGGAATGGGAGTTGCAAGCACTGGAAAAGGAACTGGCTCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCGGCCTCAGCGGCCTGGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAGTACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTG CTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５アミノ酸配列（配列番号：３）］
アミノ酸由来のＭＩＰ１α：7〜75
ヒンジ；76〜92
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：93〜194
リンカー：195〜199
Ｍ３１５抗原：200〜442
1 STGVHSAPYG ADTPTACCFS YSRKIPRQFI VDYFETSSLC SQPGVIFLTK RNRQICADSK
61 ETWVQEYITD LELNAELKTP LGDTTHTCPR CPGGSSGGKF GGSTTAPSAQ LEKELQALEK
121 ENAQLEWELQ ALEKELAQGG GSGGLTKFGG STTAPSAQLE KELQALEKEN AQLEWELQAL
181 EKELAQGGGS GGLTGLSGLD VQLQESGPGL VKPSQSLSLT CSVTGYSITS GYFWNWIRQF
241 PGNKLEWLGF IKYDGSNGYN PSLKNRVSIT RDTSENQFFL KLNSVTTEDT ATYYCAGDND
301 HLYYFDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSQAVVTQE SALTTSPGGT VILTCRSSTG
361 AVTTSNYANW IQEKPDHLFT GLIGGTSNRA PGVPVRFSGS LIGDKAALTI TGAQTEDDAM
421 YFCALWFRNH FVFGGGTKVT VL*
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：４）］
ヌクレオチド由来のＭＩＰ１α：050〜256
ヒンジ：666〜716
リンカーを有するＢＡＳＥ−ＢＡＳＥ：717〜1022
リンカー：1023〜1037
Ｍ３１５抗原：1038〜1766
001 GGGTGACAAT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTGCATTCCG
051 CGCCATATGG AGCTGACACC CCGACTGCCT GCTGCTTCTC CTACAGCCGG
101 AAGATTCCAC GCCAATTCAT CGTTGACTAT TTTGAAACCA GCAGCCTTTG
151 CTCCCAGCCA GGTGTCATTT TCCTGACTAA GAGAAACCGG CAGATCTGCG
201 CTGACTCCAA AGAGACCTGG GTCCAAGAAT ACATCACTGA CCTGGAACTG
251 AACGCTGGTG AGTCGTACGC TAGCAAGCTT GGCCAGCGCA GGGAGGGAGG
301 GTGTCTGCTG GAAGCCAGGC TCAGCCCTCC TGCCTGGACG CATCCCGGCT
351 GTGCAGTCCC AGCCCAGGGC ACCAAGGCAG GCCCCGTCTG ACTCCTCACC
401 CGGAGGCCTC TGCCCGCCCC ACTCATGCTC AGGGAGAGGG TCTTCTGGCT
451 TTTTCCACCA GGCTCCGGGC AGGCACAGGC TGGATGCCCC TACCCCAGGC
501 CCTTCACACA CAGGGGCAGG TGCTGCGCTC AGAGCTGCCA AAAGCCATAT
551 CCAGGAGGAC CCTGCCCCTG ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC
601 TACTCACTCA GCTCAGACAC CTTCTCTCTT CCCAGATCTG AGTAACTCCC
651 AATCTTCTCT CTGCAGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACA CAACTCACAC
701 ATGCCCACGG TGCCCAGGAG GTAGCAGCGG TGGAAAATTC GGCGGTTCCA
751 CTACAGCTCC ATCAGCTCAG TTGAAAAAGA AATTGCAAGC ACTGAAGAAA
801 AAGAACGCTC AGCTGAAGTG GAAACTTCAA GCCCTCAAGA AGAAACTCGC
851 CCAGGGAGGT GGTAGCGGAG GGTTAACCAA ATTCGGCGGT TCCACTACAG
901 CTCCATCAGC TCAGTTGAAA AAGAAATTGC AAGCACTGAA GAAAAAGAAC
951 GCTCAGCTGA AGTGGAAACT TCAAGCCCTC AAGAAGAAAC TCGCCCAGGG
1001 AGGTGGTAGC GGAGGGTTAA CCGGCCTCAG CGGCCTGGAT GTACAGCTTC
1051 AGGAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGAAACCTT CTCAGTCTCT GTCTCTCACC
1101 TGCTCTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT GGGTATTTCT GGAACTGGAT
1151 ACGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG GTTGGGCTTC ATAAAGTACG
1201 ACGGTAGCAA TGGCTACAAT CCATCTCTCA AAAATCGAGT TTCCATCACT
1251 CGTGACACAT CTGAGAACCA GTTTTTCCTG AAGTTGAATT CTGTGACTAC
1301 TGAGGACACA GCTACATATT ACTGTGCCGG AGATAATGAT CACCTCTACT
1351 ACTTTGACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGGTGGA
1401 GGCGGATCTG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGCTGTTGT
1451 GACTCAGGAA TCTGCACTCA CCACATCACC TGGTGGAACA GTCATACTCA
1501 CTTGTCGCTC AAGTACTGGG GCTGTTACAA CTAGTAACTA TGCCAACTGG
1551 ATACAAGAAA AACCAGATCA TTTATTCACT GGTCTAATCG GTGGTACCAG
1601 CAACCGAGCT CCAGGTGTTC CTGTCAGATT CTCAGGCTCC CTGATTGGAG
1651 ACAAGGCTGC CCTCACCATC ACAGGGGCAC AGACTGAGGA TGATGCAATG
1701 TATTTCTGTG CTCTATGGTT CAGAAACCAT TTTGTTTTCG GCGGTGGAAC
1751 CAAGGTCACT GTCCTATGAG GCCTGCAGGG CCGGTCCGTC GACTCTAGAG
［イントロンを有さないＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：５）］
GTGCATTCCGCGCCATATGGAGCTGACACCCCGACTGCCTGCTGCTTCTCCTACAGCCGGAAGATTCCACGCCAATTCATCGTTGACTATTTTGAAACCAGCAGCCTTTGCTCCCAGCCAGGTGTCATTTTCCTGACTAAGAGAAACCGGCAGATCTGCGCTGACTCCAAAGAGACCTGGGTCCAAGAATACATCACTGACCTGGAACTGAACGCTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTAGCAGCGGTGGAAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGTTGAAAAAGAAATTGCAAGCACTGAAGAAAAAGAACGCTCAGCTGAAGTGGAAACTTCAAGCCCTCAAGAAGAAACTCGCCCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGTTGAAAAAGAAATTGCAAGCACTGAAGAAAAAGAACGCTCAGCTGAAGTGGAAACTTCAAGCCCTCAAGAAGAAACTCGCCCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCGGCCTCAGCGGCCTGGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAGTACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５アミノ酸配列（配列番号：６）］
アミノ酸由来のＭＩＰ１α：4〜72
ヒンジ：73〜89
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：90〜191
リンカー：192〜196
Ｍ３１５抗原：197〜439
1 VHSAPYGADT PTACCFSYSR KIPRQFIVDY FETSSLCSQP GVIFLTKRNR
61 QICADSKETW
121 VQEYITDLEL NAELKTPLGD TTHTCPRCPG GSSGGKFGGS TTAPSAQLKK
181 KLQALKKKNA
241 QLKWKLQALK KKLAQGGGSG GLTKFGGSTT APSAQLKKKL QALKKKNAQL
301 KWKLQALKKK
361 LAQGGGSGGL TGLSGLDVQL QESGPGLVKP SQSLSLTCSV TGYSITSGYF
421 WNWIRQFPGN
KLEWLGFIKY DGSNGYNPSL KNRVSITRDT SENQFFLKLN SVTTEDTATY YCAGDNDHLY
YFDYWGQGTT LTVSSGGGGS GGGGSGGGGS QAVVTQESAL TTSPGGTVIL TCRSSTGAVT
TSNYANWIQE KPDHLFTGLI GGTSNRAPGV PVRFSGSLIG DKAALTITGA QTEDDAMYFC
ALWFRNHFVF GGGTKVTVL*
［ヘテロ二量体に使用される複数の骨髄腫抗原ｓｃＦｖ３１５の配列］
配列番号：７。アミノ酸配列：ＶＨ−リンカー−ＶＬ
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWLGFIKYDGSNGYNPSLKNRVSITRDTSENQFFLKLNVTTEDTATYYCAGDNDHLYYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGGTVILTCRSSTGAVTTSNYANWIQEKPDHLFTGLIGGTSNRAPGVPVRFSGSLIGDKAALTITGAQTEDDAMYFCALWFRNHFVFGGGTKVTVL
配列番号：８。ＤＮＡ：ＶＨ−リンカー−ＶＬ
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAATACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ヘテロ二量体に使用されるリンパ腫抗原ｓｃＦｖＡ２０の配列］
ＶＨ以前のリンカーに下線を付し、ＶＨとＶＬとの間のリンカーを太字で表記する。
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：１）］
ヌクレオチド由来のＭＩＰ１α：050〜256
ヒンジ：666〜716
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：717〜1022
リンカー：1023〜1037
Ｍ３１５抗原：1038〜1766
001 GGGTGACAAT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTGCATTCCG
051 CGCCATATGG AGCTGACACC CCGACTGCCT GCTGCTTCTC CTACAGCCGG
101 AAGATTCCAC GCCAATTCAT CGTTGACTAT TTTGAAACCA GCAGCCTTTG
151 CTCCCAGCCA GGTGTCATTT TCCTGACTAA GAGAAACCGG CAGATCTGCG
201 CTGACTCCAA AGAGACCTGG GTCCAAGAAT ACATCACTGA CCTGGAACTG
251 AACGCTGGTG AGTCGTACGC TAGCAAGCTT GGCCAGCGCA GGGAGGGAGG
301 GTGTCTGCTG GAAGCCAGGC TCAGCCCTCC TGCCTGGACG CATCCCGGCT
351 GTGCAGTCCC AGCCCAGGGC ACCAAGGCAG GCCCCGTCTG ACTCCTCACC
401 CGGAGGCCTC TGCCCGCCCC ACTCATGCTC AGGGAGAGGG TCTTCTGGCT
451 TTTTCCACCA GGCTCCGGGC AGGCACAGGC TGGATGCCCC TACCCCAGGC
501 CCTTCACACA CAGGGGCAGG TGCTGCGCTC AGAGCTGCCA AAAGCCATAT
551 CCAGGAGGAC CCTGCCCCTG ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC
601 TACTCACTCA GCTCAGACAC CTTCTCTCTT CCCAGATCTG AGTAACTCCC
651 AATCTTCTCT CTGCAGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACA CAACTCACAC
701 ATGCCCACGG TGCCCAGGAG GTAGCAGCGG TGGAAAATTC GGCGGTTCCA
751 CTACAGCTCC ATCAGCTCAG CTCGAAAAAG AGCTCCAGGC CCTGGAGAAG
801 GAAAATGCAC AGCTGGAATG GGAGTTGCAA GCACTGGAAA AGGAACTGGC
851 TCAGGGAGGT GGTAGCGGAG GGTTAACCAA ATTCGGCGGT TCCACTACAG
901 CTCCATCAGC TCAGCTCGAA AAAGAGCTCC AGGCCCTGGA GAAGGAAAAT
951 GCACAGCTGG AATGGGAGTT GCAAGCACTG GAAAAGGAAC TGGCTCAGGG
1001 AGGTGGTAGC GGAGGGTTAA CCGGCCTCAG CGGCCTGGAT GTACAGCTTC
1051 AGGAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGAAACCTT CTCAGTCTCT GTCTCTCACC
1101 TGCTCTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT GGGTATTTCT GGAACTGGAT
1151 ACGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG GTTGGGCTTC ATAAAGTACG
1201 ACGGTAGCAA TGGCTACAAT CCATCTCTCA AAAATCGAGT TTCCATCACT
1251 CGTGACACAT CTGAGAACCA GTTTTTCCTG AAGTTGAATT CTGTGACTAC
1301 TGAGGACACA GCTACATATT ACTGTGCCGG AGATAATGAT CACCTCTACT
1351 ACTTTGACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGGTGGA
1401 GGCGGATCTG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGCTGTTGT
1451 GACTCAGGAA TCTGCACTCA CCACATCACC TGGTGGAACA GTCATACTCA
1501 CTTGTCGCTC AAGTACTGGG GCTGTTACAA CTAGTAACTA TGCCAACTGG
1551 ATACAAGAAA AACCAGATCA TTTATTCACT GGTCTAATCG GTGGTACCAG
1601 CAACCGAGCT CCAGGTGTTC CTGTCAGATT CTCAGGCTCC CTGATTGGAG
1651 ACAAGGCTGC CCTCACCATC ACAGGGGCAC AGACTGAGGA TGATGCAATG
1701 TATTTCTGTG CTCTATGGTT CAGAAACCAT TTTGTTTTCG GCGGTGGAAC
1751 CAAGGTCACT GTCCTATGAG GCCTGCAGGG CCGGTCCGTC GACTCTAGAG
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：２）］
CTCCACAGGTGTGCATTCCGCGCCATATGGAGCTGACACCCCGACTGCCTGCTGCTTCTCCTACAGCCGGAAGATTCCACGCCAATTCATCGTTGACTATTTTGAAACCAGCAGCCTTTGCTCCCAGCCAGGTGTCATTTTCCTGACTAAGAGAAACCGGCAGATCTGCGCTGACTCCAAAGAGACCTGGGTCCAAGAATACATCACTGACCTGGAACTGAACGCTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTAGCAGCGGTGGAAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGCTCGAAAAAGAGCTCCAGGCCCTGGAGAAGGAAAATGCACAGCTGGAATGGGAGTTGCAAGCACTGGAAAAGGAACTGGCTCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGCTCGAAAAAGAGCTCCAGGCCCTGGAGAAGGAAAATGCACAGCTGGAATGGGAGTTGCAAGCACTGGAAAAGGAACTGGCTCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCGGCCTCAGCGGCCTGGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAGTACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTG CTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ＭＩＰ１α−２ＡＣＩＤ−Ｍ３１５アミノ酸配列（配列番号：３）］
アミノ酸由来のＭＩＰ１α：7〜75
ヒンジ；76〜92
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：93〜194
リンカー：195〜199
Ｍ３１５抗原：200〜442
1 STGVHSAPYG ADTPTACCFS YSRKIPRQFI VDYFETSSLC SQPGVIFLTK RNRQICADSK
61 ETWVQEYITD LELNAELKTP LGDTTHTCPR CPGGSSGGKF GGSTTAPSAQ LEKELQALEK
121 ENAQLEWELQ ALEKELAQGG GSGGLTKFGG STTAPSAQLE KELQALEKEN AQLEWELQAL
181 EKELAQGGGS GGLTGLSGLD VQLQESGPGL VKPSQSLSLT CSVTGYSITS GYFWNWIRQF
241 PGNKLEWLGF IKYDGSNGYN PSLKNRVSIT RDTSENQFFL KLNSVTTEDT ATYYCAGDND
301 HLYYFDYWGQ GTTLTVSSGG GGSGGGGSGG GGSQAVVTQE SALTTSPGGT VILTCRSSTG
361 AVTTSNYANW IQEKPDHLFT GLIGGTSNRA PGVPVRFSGS LIGDKAALTI TGAQTEDDAM
421 YFCALWFRNH FVFGGGTKVT VL*
［イントロンを有するＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：４）］
ヌクレオチド由来のＭＩＰ１α：050〜256
ヒンジ：666〜716
リンカーを有するＢＡＳＥ−ＢＡＳＥ：717〜1022
リンカー：1023〜1037
Ｍ３１５抗原：1038〜1766
001 GGGTGACAAT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT GTGCATTCCG
051 CGCCATATGG AGCTGACACC CCGACTGCCT GCTGCTTCTC CTACAGCCGG
101 AAGATTCCAC GCCAATTCAT CGTTGACTAT TTTGAAACCA GCAGCCTTTG
151 CTCCCAGCCA GGTGTCATTT TCCTGACTAA GAGAAACCGG CAGATCTGCG
201 CTGACTCCAA AGAGACCTGG GTCCAAGAAT ACATCACTGA CCTGGAACTG
251 AACGCTGGTG AGTCGTACGC TAGCAAGCTT GGCCAGCGCA GGGAGGGAGG
301 GTGTCTGCTG GAAGCCAGGC TCAGCCCTCC TGCCTGGACG CATCCCGGCT
351 GTGCAGTCCC AGCCCAGGGC ACCAAGGCAG GCCCCGTCTG ACTCCTCACC
401 CGGAGGCCTC TGCCCGCCCC ACTCATGCTC AGGGAGAGGG TCTTCTGGCT
451 TTTTCCACCA GGCTCCGGGC AGGCACAGGC TGGATGCCCC TACCCCAGGC
501 CCTTCACACA CAGGGGCAGG TGCTGCGCTC AGAGCTGCCA AAAGCCATAT
551 CCAGGAGGAC CCTGCCCCTG ACCTAAGCCC ACCCCAAAGG CCAAACTCTC
601 TACTCACTCA GCTCAGACAC CTTCTCTCTT CCCAGATCTG AGTAACTCCC
651 AATCTTCTCT CTGCAGAGCT CAAAACCCCA CTTGGTGACA CAACTCACAC
701 ATGCCCACGG TGCCCAGGAG GTAGCAGCGG TGGAAAATTC GGCGGTTCCA
751 CTACAGCTCC ATCAGCTCAG TTGAAAAAGA AATTGCAAGC ACTGAAGAAA
801 AAGAACGCTC AGCTGAAGTG GAAACTTCAA GCCCTCAAGA AGAAACTCGC
851 CCAGGGAGGT GGTAGCGGAG GGTTAACCAA ATTCGGCGGT TCCACTACAG
901 CTCCATCAGC TCAGTTGAAA AAGAAATTGC AAGCACTGAA GAAAAAGAAC
951 GCTCAGCTGA AGTGGAAACT TCAAGCCCTC AAGAAGAAAC TCGCCCAGGG
1001 AGGTGGTAGC GGAGGGTTAA CCGGCCTCAG CGGCCTGGAT GTACAGCTTC
1051 AGGAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGAAACCTT CTCAGTCTCT GTCTCTCACC
1101 TGCTCTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT GGGTATTTCT GGAACTGGAT
1151 ACGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG GTTGGGCTTC ATAAAGTACG
1201 ACGGTAGCAA TGGCTACAAT CCATCTCTCA AAAATCGAGT TTCCATCACT
1251 CGTGACACAT CTGAGAACCA GTTTTTCCTG AAGTTGAATT CTGTGACTAC
1301 TGAGGACACA GCTACATATT ACTGTGCCGG AGATAATGAT CACCTCTACT
1351 ACTTTGACTA CTGGGGCCAA GGCACCACTC TCACAGTCTC CTCAGGTGGA
1401 GGCGGATCTG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT GGCGGATCGC AGGCTGTTGT
1451 GACTCAGGAA TCTGCACTCA CCACATCACC TGGTGGAACA GTCATACTCA
1501 CTTGTCGCTC AAGTACTGGG GCTGTTACAA CTAGTAACTA TGCCAACTGG
1551 ATACAAGAAA AACCAGATCA TTTATTCACT GGTCTAATCG GTGGTACCAG
1601 CAACCGAGCT CCAGGTGTTC CTGTCAGATT CTCAGGCTCC CTGATTGGAG
1651 ACAAGGCTGC CCTCACCATC ACAGGGGCAC AGACTGAGGA TGATGCAATG
1701 TATTTCTGTG CTCTATGGTT CAGAAACCAT TTTGTTTTCG GCGGTGGAAC
1751 CAAGGTCACT GTCCTATGAG GCCTGCAGGG CCGGTCCGTC GACTCTAGAG
［イントロンを有さないＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５ＤＮＡ配列（配列番号：５）］
GTGCATTCCGCGCCATATGGAGCTGACACCCCGACTGCCTGCTGCTTCTCCTACAGCCGGAAGATTCCACGCCAATTCATCGTTGACTATTTTGAAACCAGCAGCCTTTGCTCCCAGCCAGGTGTCATTTTCCTGACTAAGAGAAACCGGCAGATCTGCGCTGACTCCAAAGAGACCTGGGTCCAAGAATACATCACTGACCTGGAACTGAACGCTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTAGCAGCGGTGGAAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGTTGAAAAAGAAATTGCAAGCACTGAAGAAAAAGAACGCTCAGCTGAAGTGGAAACTTCAAGCCCTCAAGAAGAAACTCGCCCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCAAATTCGGCGGTTCCACTACAGCTCCATCAGCTCAGTTGAAAAAGAAATTGCAAGCACTGAAGAAAAAGAACGCTCAGCTGAAGTGGAAACTTCAAGCCCTCAAGAAGAAACTCGCCCAGGGAGGTGGTAGCGGAGGGTTAACCGGCCTCAGCGGCCTGGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAGTACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ＭＩＰ１α−２ＢＡＳＥ−Ｍ３１５アミノ酸配列（配列番号：６）］
アミノ酸由来のＭＩＰ１α：4〜72
ヒンジ：73〜89
リンカーを有するＡＣＩＤ−ＡＣＩＤ：90〜191
リンカー：192〜196
Ｍ３１５抗原：197〜439
1 VHSAPYGADT PTACCFSYSR KIPRQFIVDY FETSSLCSQP GVIFLTKRNR
61 QICADSKETW
121 VQEYITDLEL NAELKTPLGD TTHTCPRCPG GSSGGKFGGS TTAPSAQLKK
181 KLQALKKKNA
241 QLKWKLQALK KKLAQGGGSG GLTKFGGSTT APSAQLKKKL QALKKKNAQL
301 KWKLQALKKK
361 LAQGGGSGGL TGLSGLDVQL QESGPGLVKP SQSLSLTCSV TGYSITSGYF
421 WNWIRQFPGN
KLEWLGFIKY DGSNGYNPSL KNRVSITRDT SENQFFLKLN SVTTEDTATY YCAGDNDHLY
YFDYWGQGTT LTVSSGGGGS GGGGSGGGGS QAVVTQESAL TTSPGGTVIL TCRSSTGAVT
TSNYANWIQE KPDHLFTGLI GGTSNRAPGV PVRFSGSLIG DKAALTITGA QTEDDAMYFC
ALWFRNHFVF GGGTKVTVL*
［ヘテロ二量体に使用される複数の骨髄腫抗原ｓｃＦｖ３１５の配列］
配列番号：７。アミノ酸配列：ＶＨ−リンカー−ＶＬ
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWLGFIKYDGSNGYNPSLKNRVSITRDTSENQFFLKLNVTTEDTATYYCAGDNDHLYYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGGTVILTCRSSTGAVTTSNYANWIQEKPDHLFTGLIGGTSNRAPGVPVRFSGSLIGDKAALTITGAQTEDDAMYFCALWFRNHFVFGGGTKVTVL
配列番号：８。ＤＮＡ：ＶＨ−リンカー−ＶＬ
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGGTATTTCTGGAACTGGATACGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGTTGGGCTTCATAAAATACGACGGTAGCAATGGCTACAATCCATCTCTCAAAAATCGAGTTTCCATCACTCGTGACACATCTGAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTGCCGGAGATAATGATCACCTCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGATACAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATCGGTGGTACCAGCAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGTCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCTATGGTTCAGAAACCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCCTATGAG
［ヘテロ二量体に使用されるリンパ腫抗原ｓｃＦｖＡ２０の配列］
ＶＨ以前のリンカーに下線を付し、ＶＨとＶＬとの間のリンカーを太字で表記する。
ＤＮＡ配列の配列番号：９。アミノ酸配列の配列番号：１０。
［Ａ２０抗原のアミノ酸配列：ＶＨＡ２０−ＶＬＡ２０］
配列番号：１１．ＶＨ−リンカー−ＶＬ
MVQLQQSGPDLVKPGMSVKLSCKTLGYNFSDKWIHWIKQKPGRGLEWVGRIDPSNGDTDYNADFKTPATLTVDRPSNTAYLELNNLTSGDSAVYYCSISGDYSACDYWGQGTELTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLAVSLGDHVKMSCRCNQSLVNSHGDSFLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSSRFFGVPERFSGSGSGTDFTLEISRVEAEDLGIYFCSQGAHVPWTFGGGTKLEVK
〔実施例２．標的ＤＮＡワクチンの二価性によるＢ細胞媒介性反応の増加〕
多価抗原は、Ｂ細胞膜上のＢＣＲ間の架橋を誘導することができ、これはＢ細胞活性化に必須であると考えられる。初期のＢ細胞活性化モデルは、これらの架橋がＢ細胞を活性化するために必要であることを示した（１６、１７）。効率的なＢ細胞活性化のための他のモデルは、最近示されており、それらの各々は、重要な因子として価数を組み込んでいる（１７〜２０）。in vitroおよびin vivoモデルの両方で、多価抗原は、より効力のあるＢ細胞シグナル伝達および抗体反応を誘導するが、単価抗原は、同様にＢ細胞反応を活性化することができることが示されている（２１〜２８）。
配列番号：１１．ＶＨ−リンカー−ＶＬ
MVQLQQSGPDLVKPGMSVKLSCKTLGYNFSDKWIHWIKQKPGRGLEWVGRIDPSNGDTDYNADFKTPATLTVDRPSNTAYLELNNLTSGDSAVYYCSISGDYSACDYWGQGTELTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLAVSLGDHVKMSCRCNQSLVNSHGDSFLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSSRFFGVPERFSGSGSGTDFTLEISRVEAEDLGIYFCSQGAHVPWTFGGGTKLEVK
〔実施例２．標的ＤＮＡワクチンの二価性によるＢ細胞媒介性反応の増加〕
多価抗原は、Ｂ細胞膜上のＢＣＲ間の架橋を誘導することができ、これはＢ細胞活性化に必須であると考えられる。初期のＢ細胞活性化モデルは、これらの架橋がＢ細胞を活性化するために必要であることを示した（１６、１７）。効率的なＢ細胞活性化のための他のモデルは、最近示されており、それらの各々は、重要な因子として価数を組み込んでいる（１７〜２０）。in vitroおよびin vivoモデルの両方で、多価抗原は、より効力のあるＢ細胞シグナル伝達および抗体反応を誘導するが、単価抗原は、同様にＢ細胞反応を活性化することができることが示されている（２１〜２８）。
ＤＮＡワクチンは、従来のワクチンよりも多くの利点があるが、大型動物での免疫原性は乏しい（２９、３０）。ＤＮＡワクチン接種時の免疫反応を改善するための１つの効率的な方法は、抗原をサイトカインまたはＡＰＣ表面上の分子に特異的な一本鎖可変領域断片に遺伝子融合させることにより、直接的に抗原をＡＰＣの標的とすることである（３１〜４０）。
この実施例では、異なる抗原を有する標的ワクチンの環境における抗原価数の値を実証する。抗原提示細胞上のＭＨＣＩＩの標的である一価および二価のＤＮＡワクチンを合成した。これらのワクチンは、二価ワクチンに２つの同一抗原をもつ非対称ヘテロ二量体、または一価ワクチンに２つの異なった抗原をもつヘテロ二量体をコードしている。本実施例において使用される例示的な抗原は、２つの異なるインフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４およびＡ／カリフォルニア／０７／０９由来のＨＡ、ならびにマウスＢ細胞リンパ腫ＭＯＰＣ３１５およびＡ２０によって分泌される腫瘍特異的免疫グロブリン由来の一本鎖Ｆｖである。結果は、抗原の二価性が効率的なＢ細胞応答の誘導における重要なワクチン特性であることを示している。
データを図８〜１２に示す。図８Ａ〜Ｅは、ヘテロ二量体ワクチン分子の設計および特徴に関するデータを提供する。ヘテロ二量体分子および構築物の模式図を提供する。図８Ａ。ＰＲ８およびＣａｌ０７ ＨＡ配列の配列整合を図１５に示す。これらの例示的なワクチン構築物において、インフルエンザＨ１Ｎ１ウイルスＰＲ８またはＣａｌ０７由来の赤血球凝集素（ＨＡ）は、非結合制御として、マウスＭＨＣクラスＩＩまたはハプテンＮＩＰに特異的な一本鎖ＦＶを有する抗原提示細胞の標的である。ヘテロ二量体は、酸性または塩基性アミノ酸のいずれかが豊富なロイシンジッパーモチーフの２つのアルファヘリックス間の酸／塩基相互作用を介して形成される。ターゲティングユニットおよび抗原性ユニットは、ＡＣＩＤ二量体化ユニットまたはＢＡＳＥ二量体化ユニットのいずれかの末端に配置される。ＤＮＡカセットはＣＭＶプロモータ下で発現され、Ｌで示される、ｐＬＮＯＨ２ベクトルのリーダー配列を含む。ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥ構築物を有するベクターを、同時にトランスフェクトし、ヘテロ二量体ワクチンタンパク質を発現する。図８Ｂ。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を、ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥ構築物で同時にトランスフェクトし、上清を、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。抗原アームおよび二量体化ユニットを、抗ＨＡ（ＰＲ８）および抗ＨＡ（Ｃａｌ０７）ｍＡｂ、ならびにＡＣＩＤ／ＢＡＳＥモチーフ（２Ｈ１１）に特異的なｍＡｂで検出した（２６）。図８Ｃ。上清中のワクチンヘテロ二量体を、ビオチン化２Ｈ１１を用いたウェスタンブロットで検出した。図８Ｄ。分子サイズを示す。マウスＭＨＣＩＩ（Ｉ−ＥκおよびＩ−Ｅｄ）でトランスフェクトした線維芽細胞を、ＰＲ８の２つのＨＡを含む非標的ヘテロ二量体ワクチンタンパク質とともに、またはＭＨＣＩＩ標的ヘテロ二量体ワクチンタンパク質とともに、未希釈、または細胞培地中で１〜３および１〜９の希釈でインキュベートした。図８Ｅ。結合したワクチンタンパク質をビオチン化αＨＡ（ＰＲ８）で染色し、フローサイトメトリーでストレプトアビジン−ＰＥによって検出する。
図９Ａ〜Ｉは、ヘテロ二量体ワクチン分子の二価性が、マウスにおけるＩｇＧ力価を増加させることを実証するデータを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１０μｇのＤＮＡプラスミド（ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥプラスミドを各５μｇ）を筋肉内注射でワクチン接種し、続いてエレクトロポレーションを行った（ｎ＝６／グループ）。図９Ａ〜Ｆを参照のこと。ＨＡ（ＰＲ８）（Ａ〜Ｃ）およびＨＡ（Ｃａｌ０７）（Ｄ〜Ｆ）に特異的なＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ反応を、ＥＬＩＳＡによって分析した。（Ｇ〜Ｈ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５０μｇのＤＮＡ（ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥプラスミドを各２５μｇ）を腰に皮内注射でワクチン接種し、続いて直ちにエレクトロポレーションを行った（ｎ＝６／グループ）。ＨＡ（ＰＲ８）（図９Ｇ）およびＨＡ（Ｃａｌ０７）（図９Ｈ）に対する総ＩｇＧ反応を分析した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＨＡ（ＰＲ８）抗原を有する二価または一価ワクチンの種々のＤＮＡ投与を、ｉ．ｍ．注入でワクチン接種した。図９Ｉを参照のこと。６週目に、ＨＡ（ＰＲ８）に特異的な総ＩｇＧを分析した。力価は、バックグランドを超える吸光度を生じる最大血清希釈として定義される。バックグラウンド吸光度を、ＮａＣｌをワクチン接種したマウスの血清からのシグナルの平均吸光度の２倍として決定した。平均力価±標準誤差を示す。二価ワクチンが一価ワクチンを上回る有意性を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。マンホイットニー。
図１０Ａ〜Ｅは、本発明のヘテロ二量体抗腫瘍ワクチン分子でのワクチン接種後の抗体力価を示すデータを提供する。抗腫瘍抗原を有するようにヘテロ二量体ＤＮＡワクチンを設計した。図１０Ａ。腫瘍抗原は、マウスＢ細胞リンパ腫ＭＯＰＣ３１５（注釈付きＭ３１５）およびＡ２０によって分泌される腫瘍特異的免疫グロブリンであった。あるワクチンは、終止コドンを有するように生成され、Ｍ３１５と一価のワクチンを形成する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ヘテロ二量体抗腫瘍ワクチンをワクチン接種した。マウスに、１００μｇのＤＮＡプラスミド（ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥプラスミドを各５０μｇ）を筋肉内注射でワクチン接種し（ｎ＝６／グループ）、続いて、エレクトロポレーションを行った。Ａ２０（図１０Ｂ〜Ｃ）およびＭ３１５（図１０Ｄ〜Ｅ）腫瘍抗原に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ反応を、ＥＬＩＳＡによって分析した。力価は、バックグランドを超える吸光度を生じる最大血清希釈として定義される。バックグラウンド吸光度を、ＮａＣｌをワクチン接種したマウスの血清からのシグナルの平均吸光度の２倍として決定した。平均力価±標準誤差を示す。二価対一価のワクチンを比較するために、有意性を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；マンホイットニー。
図１１Ａ〜Ｆは、二価ＤＮＡワクチンが、相同性Ｈ１Ｎ１インフルエンザ感染からマウスを完全に保護することを示すデータを提供する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１００μｇのＤＮＡプラスミド（ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥプラスミドを各５０μｇ）を筋肉内注射でワクチン接種し、続いて、エレクトロポレーションを行った（ｎ＝６／グループ）。１４日後、マウスに、５×ＬＤ５０（図１１ＡおよびＢ）または５０×ＬＤ５０（図１１ＣおよびＤ）を用いてＰＲ８株由来のインフルエンザウイルスを抗原投与した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、上述のようにワクチン接種した（ｎ＝６／グループ）。１２日目から、αＣＤ４およびαＣＤ８ｍＡｂを、２日ごとに腹腔内注射した。対照グループに、αＭＨＣＩＩ−Ｃａｌ０７／Ｃａｌ０７でのワクチン接種後に、アイソタイプに一致したｍＡｂを投与した（青色の白抜き円で示す）。ワクチン接種の１４日後に、マウスに、ＰＲ８インフルエンザウイルス（５×ＬＤ５０）を抗原投与した。各実験について、感染後の平均重量減少±標準誤差および生存率を示す。図１１Ａ〜Ｅ。二価ワクチンと一価ワクチンとを比較するために、有意性を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１ マンホイットニーおよびマントルコックス（Mantel Cox）。
図１２Ａ〜Ｃは、ヘテロ二量体ワクチン分子の二価性が、骨髄において、抗原特異的胚中心およびＢ細胞集団を増加させることを示すデータを提供する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、５０μｇのＤＮＡプラスミド（ＡＣＩＤおよびＢＡＳＥプラスミドを各２５μｇ）を皮内注射でワクチン接種し、続いて、直ちにエレクトロポレーションを行った（ｎ＝３）。３週間後、流入領域リンパ節（腸骨または鼠径部）および脛骨由来の骨髄を採取した。（図Ａ〜Ｂ）リンパ節由来の単細胞懸濁液を、連続希釈ＨＡプローブで染色し、ＧＣ Ｂ細胞（ＧＬ７＋ＣＤ３８ｌｏ）上にゲートし、フローサイトメトリーで結合を分析した。（図Ａ）非線形回帰に適合したｒＨＡプローブの希釈曲線。（図Ｂ）２００ｎＭ ｒＨＡプローブを有する個々のマウスの代表例。（図Ｃ）骨髄由来の細胞懸濁液を、Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴで分析して、ＰＲ８またはＣａｌ０７特異的Ｂ細胞を検出した。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、独立両側スチューデントｔ検定。
図１３Ａ〜Ｄは、赤血球凝集素であるＨＡの２つの変異体を有する（例えばＰＲ８およびＣａｌ０７（混合））ヘテロ二量体が、体液性反応ならびにＰＲ８の抗原投与モデルにおけるＢＡＬＢ／ｃマウスの保護の両方に関して、二価性の明確な影響を示したことを示すさらなるデータを提供する。いずれの抗原も、マウスにおいて抗原特異的抗体の誘導を示す。ヘテロ二量体ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥターゲティングワクチンを図１３Ａに概略的に示す。ｂａｌｂ／ｃマウスのワクチン接種は、二価分子に対して、一価分子より高いＰＲ８特異的ＩｇＧ１を与えた。図１３Ｂを参照のこと。二価ヘテロ二量体のみが、ＰＲ８抗原投与において完全な防御を誘導した。図１３Ｃを参照のこと。さらに、阻害ＥＬＩＳＡにおける競合の増加傾向は、混合ワクチンがより多くの交差結合抗体を誘導することを示唆した（図１３Ｄ）。図１３Ｄは、ＰＲ８を被覆として使用し、ワクチン接種されたマウス由来の血清は、Ｃａｌ０７（Ｃａｌ０７／ＰＲ８は、Ｃａｌ０７／Ｃａｌ０７よりも多く阻害される）またはＰＲ８（Ｃａｌ０７／ＰＲ８がＰＲ８／ＰＲ８よりも少なく阻害される）と競合する、競合ＥＬＩＳＡの結果を提供する。
〔実施例３．骨髄における腫瘍形成に対する防御〕
本実施例では、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ワクチンが、マウスにおける骨髄ホーミングＭＯＰＣ．３１５腫瘍モデル（ＭＯＰＣ．３１５ＢＭ）からマウスを保護することを示す実験について記載する（Hofgaard, P. O., et al., 2012. PLoS One 7: e51892）。
本実施例では、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ワクチンが、マウスにおける骨髄ホーミングＭＯＰＣ．３１５腫瘍モデル（ＭＯＰＣ．３１５ＢＭ）からマウスを保護することを示す実験について記載する（Hofgaard, P. O., et al., 2012. PLoS One 7: e51892）。
図１６は、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ＤＮＡワクチンが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、単回ワクチン接種後に、骨髄ＭＯＰＣ．３１５．ＢＭ腫瘍に対する防御を誘導することを示す。マウスに、５０μｇのＤＮＡを各四頭筋へｉ．ｍ．でワクチン接種し、続いて注射部位にエレクトロポレーションを行った。１４日後（ｎ＝１０／グループ、ＮａＣｌグループについてはｎ＝５）、マウスに、１０４個のＭＯＰＣ．３１５．ＢＭ（骨髄）細胞を、静脈内へ抗原投与した。採取段階の対麻痺に到達したマウスを安楽死させた。抗原対照（ＭＩＰ１α−ＣＨ３−ｓｃＦｖＡ２０）およびＮａＣｌワクチン接種したマウスと比較した、種々のワクチンの生存曲線（＊＊ｐ＜０．０１、マントルコックス分析、非標的ｓｃＦｖαＮＩＰ−Ａ／Ｂ−ｓｃＦｖ３１５と比較したＭＩＰ１α標的グループ）を、図１６Ａに示す。抗原投与の３６日後に血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡで腫瘍特異的抗原Ｍ３１５について分析した（検出不能＝ＮＤ、平均をバーで示す、＊＊＊ｐ＜０．００１、マンホイットニー、両側）（図１６Ｂ）。
図１７は、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体ワクチンにおける１つの標的化ユニットが、in vivoでの抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ反応において充分であることを示す。図１７に示されるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ａ／Ｂヘテロ二量体ワクチンを用いて、５０μｇのＤＮＡをｉ．ｍ．でワクチン接種した。ワクチン接種の３６日後（Ａ、ｎ＝４／グループ）または１４日後（Ｂ、ｎ＝３／グループ）に、マウスから採血し、血清中のＭ３１５特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを分析した（検出不能＝ＮＤ、平均±標準誤差、有意性なし＝ｎｓ、マンホイットニー）。
まとめると、結果を図１６および１７に示す。結果は、骨髄腫瘍が骨髄にホーミングするヒト患者において示されるのと同様に、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体が、骨髄にホーミングするマウスモデルに対して防御できること（図１６）、および抗原特異的抗体応答（図１７）を誘導するのに、ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体において１つの標的化で充分であること（図１７）を実証する。
〔実施例４．混合ワクチン〕
本実施例では、１８個の赤血球凝集素（ＨＡ）のサブタイプを含む混合ワクチンとして試験されたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体について記載した。
本実施例では、１８個の赤血球凝集素（ＨＡ）のサブタイプを含む混合ワクチンとして試験されたＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体について記載した。
図１８は、抗原としてのＨＡを有するＤＮＡワクチンが、in vitroおよびin vivoで機能的に発現されることを示す。図１８Ａは、ワクチンタンパク質の代表例を示す。ＤＮＡワクチンは、抗原として１８個の異なるサブタイプ由来の全長ＨＡを発現し、マウスＡＰＣまたはマウスＭＨＣＩＩもしくはＮＩＰに対するｍＡｂのｓｃＦｖを有するハプテン（ネガティブ対照）を標的とする。ヘテロ二量体化は、酸性アミノ酸（ＡＣＩＤ）または塩基性アミノ酸（ＢＡＳＥ）のいずれかが豊富なロイシンジッパーαヘリックス間の酸−塩基相互作用を介して達成された。二量体化ユニットは、ターゲティングユニットと抗原との間に配置される。短いヒトＩｇヒンジは、二量体化ユニットとターゲティングユニットとの間に配置され、ＢＡＳＥに対するＡＣＩＤの正しい配向を安定化する２つのシステイン（２つの黒線として示される）の間にジスルフィド架橋を形成することを可能にする。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１８個のサブタイプのうちの１つ由来のＨＡを有するαＭＨＣＩＩ−Ｈｘ二価二量体を皮内でワクチン接種した。ワクチン接種の６週後の血清を、各ＨＡサブタイプ由来の組換えＨＡに対する反応性について分析した。図１８Ｂには、グループ１のＨＡを有するワクチンによって誘導された、グループ１の組換えＨＡタンパク質に対する血清抗体力価（左図）、およびグループ２のＨＡによって誘導された、グループ２の組換えＨＡタンパク質に対する力価（右図）を示す。
図１９は、ＨＡ混合ワクチンによるワクチン接種が、非相同性ＨＡ株に対する抗体を誘導することを示す。１６個のＨＡのサブタイプまたは混合ワクチンに含まれていないＨ１およびＨ７に対する単一ＨＡサブタイプ対照を含むＨＡ混合ワクチンを用いて、筋肉内に２回（０日目および３５日目）マウスを免疫化した。ワクチンは、混合物中に１μｇ／プラスミドを含み、Ｈ１およびＨ７ワクチン中に５μｇ／プラスミドを含んでいた。Ｈ１およびＨ７に対する抗体力価を、９週間後に測定した（図１９Ｂ）。
図２０は、ＨＡ混合物（Ｈ１を欠く）によるワクチン接種が、Ｈ１抗原投与に対する部分的防御を与えることを示す。マウスに、ＨＡ混合ワクチンを３回ワクチン接種した。３回目の免疫化の２週間後に、マウスに、Ｈ１Ｎ１のインフルエンザウイルスを抗原投与した。図２０に、平均重量損失±標準誤差（左図）および生存率（右図）を示す。
まとめると、図１８は、個々のワクチンが、産生され、サブタイプ特異的抗体反応を誘導し、単一ワクチンとして交差反応しないことを示す。ＨＡ変異体（グループ１および２由来のＨＡを含むが、Ｈ１およびＨ７を欠く）の１８個のサブタイプのうち１６個を含む混合ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥワクチンは、Ｈ１およびＨ７に対する抗原特異的抗体を示した（図１９）。さらに、１２個のＨＡ変異体のサブタイプのうち１１個を含み、Ｈ１サブタイプを欠く混合ＡＣＩＤ／ＢＡＳＥワクチンは、Ｈ１含有インフルエンザウイルスに対する防御を示した（図２０）。
上述の明細書において言及された全ての刊行物および特許は、全ての目的のために、それらの全体が参照として本明細書中に援用される。記載された技術の範囲および精神から逸脱することのない、記載された本技術の組成物、方法、および使用における種々の改変および変更は、当業者にとって明らかである。本技術を特定の例示的な実施形態に関連付けて説明しているが、特許請求の範囲に記載された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、薬理学、生化学、医学、または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載される様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
〔参照〕
本明細書中に引用される以下の参考文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照として援用される。
本明細書中に引用される以下の参考文献は、全ての目的のためにそれらの全体が参照として援用される。
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Claims (53)
- 第１の核酸構築物および第２の核酸構築物を含むＤＮＡワクチンであって、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードし、
上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質であり、
上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞へ導入される場合、上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質が発現され、上記ヘテロ二量体化ユニットの会合を介して、第１のヘテロ二量体タンパク質が形成される、ＤＮＡワクチン。 - 上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、ＡＣＩＤヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化ドメインを形成するＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニットである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、バルスターヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物の他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインを形成するバルナーゼヘテロ二量体化ユニットである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは同一である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは異なっている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記ターゲティングユニットは、抗原結合タンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖである、請求項４に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記ターゲティングユニットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ターゲティングユニットである、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記ＡＰＣターゲティングユニットは、ＭＨＣ−ＩＩ分子、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＰ、Ｔｏｌｌ様受容体およびケモカイン受容体からなる群より選択される標的に結合する、請求項８に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記変異型抗原標的タンパク質は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有するか、または約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有する上記変異型抗原標的タンパク質中、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０アミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００アミノ酸である保存ドメインを有する、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、生物の異なる菌株または血清型由来である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記生物は、病原性生物である、請求項１１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記生物は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される、請求項１１に記載のＤＮＡワクチン。
- 異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）の変異体である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記ワクチンは、インフルエンザウイルスの少なくとも３、４、５または６および最大１２または１８の菌株または血清型由来のＨＡの変異体を含む、請求項１４に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記インフルエンザウイルスは、グループ１のインフルエンザウイルスおよびグループ２のインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項１５記載のＤＮＡワクチン。
- 上記グループ１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群より選択され、上記グループ２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５からなる群より選択される、請求項１６に記載のＤＮＡワクチン。
- 異なる上記変異型抗原標的タンパク質は、ガン抗原またはネオエピトープの変異体である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 少なくとも第３の核酸構築物および第４の核酸構築物をさらに含むＤＮＡワクチンであって、
上記第３の核酸構築物および上記第４の核酸構築物は、第３の融合タンパク質および第４の融合タンパク質をコードし、
上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質は、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、
各上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質における上記抗原性ユニットは、変異型抗原標的タンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。 - 上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質を用いた細胞内での上記第３の融合タンパク質および上記第４の融合タンパク質の発現によって、ヘテロ二量体タンパク質の混合物が産生される、請求項１９に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物が細胞内で発現される場合、上記ヘテロ二量体タンパク質の産生は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質の産生が実質的に存在しないことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記第１の核酸構築物および上記第２の核酸構築物ならびに上記少なくとも第３の核酸構築物および第４の核酸構築物が細胞内で発現される場合、上記ヘテロ二量体タンパク質の産生は、同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質の産生が実質的に存在しないことを特徴とする、請求項２０に記載のＤＮＡワクチン。
- 上記融合タンパク質をコードする配列は、プロモータに動作可能に連結されている、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
- ヘテロ二量体タンパク質分子を含むワクチン組成物であって、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、第１の融合タンパク質モノマーおよび第２の融合タンパク質モノマーを含み、
上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニット、および抗原性ユニットを含み、
各上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーにおける上記抗原性ユニットは、異なる変異型抗原標的タンパク質をコードすることによって異なり、
上記ヘテロ二量体タンパク質分子は、上記二量体化ドメインの会合によって連結された２つの上記モノマーを含む、ワクチン組成物。 - 上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの一方における上記ヘテロ二量体化ユニットが、ＡＣＩＤヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるＡＣＩＤ／ＢＡＳＥヘテロ二量体化領域を形成するＢＡＳＥヘテロ二量体化ユニットである、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの一方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、バルスターヘテロ二量体化ユニットであり、上記第１の融合タンパク質モノマーおよび上記第２の融合タンパク質モノマーの他方における上記ヘテロ二量体化ユニットは、相互作用して、上記第１のヘテロ二量体タンパク質であるバルスター／バルナーゼヘテロ二量体化ドメインを形成するバルナーゼヘテロ二量体化ユニットである、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは同一である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記第１の融合タンパク質および上記第２の融合タンパク質の上記ターゲティングユニットは異なっている、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記ターゲティングユニットは、抗原結合タンパク質である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖである、請求項２９に記載のワクチン組成物。
- 上記ターゲティングユニットは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ターゲティングユニットである、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記ＡＰＣターゲティングユニットは、ＭＨＣ−ＩＩ分子、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、およびケモカイン受容体からなる群より選択される標的に結合する、請求項３１に記載のワクチン組成物。
- 上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有するか、または約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える配列同一性を有する上記変異型抗原標的タンパク質中、長さが８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０または６０アミノ酸を超え、長さが最大１００〜２００アミノ酸である保存領域を有する、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、生物の異なる菌株または血清型由来である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記生物は、病原性生物である、請求項３４に記載のワクチン組成物。
- 上記生物は、ウイルス、細菌、真菌および原生動物からなる群より選択される、請求項３４に記載のワクチン組成物。
- 上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、赤血球凝集素（ＨＡ）の変異体である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 上記ワクチンは、インフルエンザウイルスの少なくとも３、４、５または６および最大１２または１８の菌株または血清型由来のＨＡの変異体を含む、請求項３７に記載のワクチン組成物。
- 上記インフルエンザウイルスは、グループ１のインフルエンザウイルスおよびグループ２のインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
- 上記グループ１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群より選択され、上記グループ２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５からなる群より選択される、請求項３９に記載のワクチン構成。
- 上記異なる変異型抗原標的タンパク質は、ガン抗原またはネオエピトープの変異体である、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 少なくとも第３の融合タンパク質モノマーおよび第４の融合タンパク質モノマーをさらに含むワクチン組成物であって、
上記第３の融合タンパク質モノマーおよび上記第４の融合タンパク質モノマーは、動作可能に繋がった、ターゲティングユニット、ヘテロ二量体化ユニットおよび抗原性ユニットを含み、
各上記第３の融合タンパク質モノマーおよび上記第４の融合タンパク質モノマーにおける上記抗原性ユニットは、上記変異型抗原標的タンパク質の異なる型をコードすることで異なる、請求項２４に記載のワクチン組成物。 - 上記ワクチンは、上記第１のモノマーおよび上記第２のモノマーならびに少なくとも第３のモノマーおよび第４のモノマーの全ての考えられる組み合わせを有することを特徴とするヘテロ二量体タンパク質の混合物を含む、請求項４２に記載のワクチン組成物。
- 同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質が実質的に存在しないことを特徴とする、請求項２４に記載のワクチン組成物。
- 同じ抗原標的タンパク質を含むホモ二量体タンパク質が実質的に存在しないことを特徴とする、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
- 請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチンまたはワクチン組成物と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬製剤。
- 請求項２０〜４５のいずれか１項に記載のワクチン組成物と、アジュバントとを含む、ワクチン製剤。
- 対象に、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を投与することを含む、対象において変異型抗原標的タンパク質に対する免疫性を与える、または免疫反応を誘導する方法。
- 上記対象への、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の第２の投与をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
- 上記対象に、１つ以上の標的でない変異型抗原標的タンパク質サブユニットを含む第２のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を投与することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
- 請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤を必要とする対象において、免疫性を与えるまたは免疫反応を誘導するための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用。
- 病原体による感染を予防または治療するためのワクチンとしての、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用。
- 癌を予防または治療するためのワクチンとしての、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン，ワクチン組成物、医薬製剤またはワクチン製剤の使用。
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