ES2140076T5

ES2140076T5 - Vacunas que contienen una saponina y un esterol.

Info

Publication number: ES2140076T5
Application number: ES96910019T
Authority: ES
Inventors: Nathalie Marie-Josephe Claude Garcon; Martin Friede
Original assignee: SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1995-04-25
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2016-04-01
Also published as: ES2140076T3; AR001686A1; ATE186842T1; SI0822831T2; SI0955059T1; EP0955059A3; DK0822831T3; TR199701252T1; KR19990008003A; BG101995A; MA23850A1; KR100463372B1; DK0822831T4; AP771A; CY2588B2; EA199700272A1; EP0822831B1; CN1111071C; MX9708226A; DE69605296D1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION DE VACUNA QUE COMPRENDE UN ANTIGENO, UNA FRACCION DE SAPONINA INMUNOLOGICAMENTE ACTIVA Y UN ESTEROL

Description

Vacunas que contienen una saponina y un esterol.

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, a procedimientos para su producción y a su uso en medicina. En particular, la presente invención se refiere a vacunas que contienen un antígeno, una fracción activa inmunológicamente derivada a partir de la corteza del Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un
esterol.

Las fracciones de saponina inmunológicamente activas que tienen actividad adyuvante derivadas a partir de la corteza del árbol de América del Sur Quillaja Saponaria Molina, son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la QS21, también conocida como QA21, una fracción purificada mediante HPLC, procedente del árbol Quillaja Saponaria Molina y su procedimiento para su producción, se describen (como QA21) en la Patente de EE.UU. No. 5.057.540. Igualmente, la saponina de Quillaja ha sido descrita como un adyuvante por Scott y otros, en Int. Archs. Allergy Appl. Immun., vol. 77, pág. 409, (1985). Sin embargo el uso de la QS21 como un adyuvante está asociada con ciertos inconvenientes. Por ejemplo, cuando la QS21 se inyecta en un mamífero como una molécula libre, se ha observado que se produce necrosis, es decir, muerte de tejido localizado, en el sitio de inyección.

De manera sorprendente, se ha encontrado ahora que la necrosis en el sitio de inyección puede evitarse mediante el uso de formulaciones que contienen una combinación de QS21 y un esterol. Los esteroles preferidos incluyen \beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el colesterol se describe en el Merck Index, 11ª Ed., pág. 341, como un esterol que se produce de manera natural que se encuentra en la grasa animal.

Por lo tanto, de acuerdo con ello, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende un antígeno, QS21 y un esterol, caracterizada porque la relación de QS21: esterol está entre 1:1 y 1:100 (p/p) y porque la QS21 es al menos 90% puro. Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen la fracción de saponina activa inmunológicamente en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen QS21, es decir, al menos 95% pura y lo más preferiblemente al menos 98% pura. Las composiciones de la invención que comprenden QS21 y colesterol, muestran una reactogenicidad disminuida cuando se comparan con composiciones en las que el colesterol se encuentra ausente, mientras que se mantiene el efecto adyuvante. Además, es conocido que el QS21 se degrada bajo condiciones básicas en las que el pH es de aproximadamente 7 o superior. Una ventaja adicional de las presentes composiciones, es que la estabilidad de la QS21 a la hidrólisis mediada por bases está potenciada en las formulaciones que contienen colesterol.

Las composiciones preferidas de la invención son aquellas que forman una estructura de liposoma.

La relación de QS21: esterol estará entre 1:100 y 1:1, peso con respecto a peso. Preferiblemente, se encuentra presente un exceso de esterol siendo la relación de QS21: esterol de al menos 1:2, p/p. Típicamente, para administración humana, la QS21 y el esterol se encuentran presentes en una vacuna dentro de intervalo comprendido desde aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 100 \mug, preferiblemente aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente 50 \mug por dosis.

Preferiblemente, los liposomas contienen un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, el cual es, preferiblemente, no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de la yema del huevo, dioleil fosfatidilcolina o dilauril fosfatidilcolina. Igualmente, los liposomas pueden contener un lípido cargado, el cual incrementa la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para los liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es, preferiblemente, de 1-20%, p/p, lo más preferiblemente 5-10%. La relación de esterol a fosfolípido es de 1-50% (mol/mol), lo más preferiblemente 20-25%.

Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen MPL (monofosforil lípido A 3-desacetilado, también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL se conoce a partir de la Patente GB 2.220.211 (Ribi) en forma de una mezcla de 3 tipos de monofosforil lípido A Da-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y se fabrica por la Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida es la descrita en la Solicitud de Patente Internacional 92/116556.

Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MPL, y a continuación se agrega el MPL, preferiblemente como partículas de 100 nm. De acuerdo con ello, el MPL no está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL fuera). Las composiciones en las que el MPL está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocidas como MPL dentro) forman, igualmente, un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Preferiblemente, los antígenos solubles están fuera y los antígenos hidrófobos o lipidados están contenidos o bien dentro o bien fuera de la membrana.

Frecuentemente, las vacunas de la invención no requieren ningún vehículo específico y se formulan en un medio acuoso u otro tampón aceptable farmacéuticamente. En algunos casos, puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además alumbre o se presenten en una emulsión de aceite en agua, u otro vehículo adecuado, tal como, por ejemplo, liposomas, microesferas o partículas de antígeno encapsulado.

Preferiblemente, las formulaciones de vacuna contienen un antígeno o una composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmune contra un patógeno humano o animal. Las composiciones de antígeno o antigénicas conocidas en la técnica pueden usarse en las composiciones de la invención, incluyendo antígenos polisacáridos, composiciones antígenas o antigénicas derivadas a partir del VIH-1 (tal como gp120 o gp160), cualquier virus de inmunodeficiencia felina, virus del herpes humano o animal, tal como gD o derivados de la misma o proteína temprana inmediata tal como ICP27 procedente del HSV1 o HSV2, citomegalovirus (especialmente humano) (tal como gB o derivados del mismo), virus Zoster de la varicela (tal como gpI, II ó III), o procedentes de un virus de la hepatitis tal como el virus de la hepatitis B, por ejemplo antígeno de superficie de la hepatitis B o un derivado del mismo, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o procedente de otros patógenos víricos, tal como el virus sincitial respiratorio (por ejemplo las proteínas F y G del HSRV o fragmentos inmunógenos de las mismas descritos en la Patente de EE.UU. 5.149.650 o polipéptidos quiméricos que contienen fragmentos inmunógenos procedentes de las proteínas F y G del HSRV, p. ej., la glucoproteína FG descrita en la Patente de EE.UU. 5.194.595), antígenos derivados a partir de cepas de la meningitis tal como la meningitis A, B y C, Streptoccoccus pneumonia, virus del papiloma humano, virus Influenza, Haemophilus influenza B (Hib), virus de Epstein Barr (EBV), derivados procedentes de patógenos bacterianos tal como Salmonella, Neisseria, Borrelia (por ejemplo OspA o OspB o derivados de los mismos), o Chlamydia, o Bordetella, por ejemplo P.69, PT y FHA, o derivados procedentes de parásitos tales como Plasmodium o Toxoplasma.

La glucoproteína D (gD) del HSV o derivados de la misma, es un antígeno de vacuna preferido. Está localizado sobre la membrana vírica, e igualmente se encuentra en el citoplasma de células infectadas (Eisenberg, R. J. y otros, J. of Virol., vol. 35, págs. 428-435, (1980)). Comprende 393 aminoácidos incluyendo un péptido de señal y tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kD. De todas las glucoproteínas de envoltura del HSV, esta es probablemente la mejor caracterizada (Cohen y otros, J. Virology, vol. 60, pág. 157-166). Se sabe que in vivo juega un papel central en la unión vírica a las membranas de la célula. Más aún, se ha mostrado que la glucoproteína D es capaz de provocar la neutralización de anticuerpos in vivo y de proteger animales de una infección letal. Una forma truncada de la molécula gD está exenta de la región de anclaje C-terminal y puede se producida en células de mamíferos en forma de una proteína soluble que es exportada dentro del sobrenadante de cultivo de la célula. Dichas formas solubles de gD son las preferidas. La producción de formas truncadas de gD se describe en la Patente EP 0 139 417. Preferiblemente, la gD deriva a partir del HSV-2. Una realización de la invención es una glucoproteína D truncada del HSV-2 de 308 aminoácidos que comprende desde el aminoácido 1 hasta el 306 de la glucoproteína que se produce de manera natural, con la adición de asparagina y glutamina en el extremo C-terminal de la proteína truncada exenta de su región de anclaje a la membrana. Esta forma de la proteína incluye el péptido de señal que se ha escindido para permitir que la proteína de 283 aminoácidos soluble madura sea secretada a parir de la célula huésped.

En otro aspecto de la invención, el antígeno de superficie de la hepatitis B es un antígeno de vacuna preferido.

Tal como aquí se usa, la expresión "antígeno de superficie de la hepatitis B" o "HBsAg", incluye cualquier antígeno de HBsAg o fragmento del mismo que muestre la antigenicidad del antígeno de superficie del HBV. Se entiende que además de la secuencia de 226 aminoácidos del antígeno de HBsAg (véase Tiollais y otros, Nature, vol. 317, pág. 489, (1985) y referencias allí citadas) en HBsAg tal como aquí se describe, puede, si se desea, contener la totalidad o parte de una secuencia pre-S tal como se describe en las referencias anteriores y en el Documento EP-A-0 278 940. En particular, el HBsAg puede contener un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los restos 12-52, seguido de los restos 133-145, seguido de los restos 175-400 de la proteína L del HBsAg con relación al marco de lectura abierto sobre un virus de la hepatitis B del serotipo ad (a este polipéptido se hace referencia como L*, véase, la Patente EP 0 414 374). El HBsAg, dentro del alcance de la invención, puede incluir, igualmente, el polipéptido pre-S1-pre-S2-S descrito en la Patente EP 0 198 474 (Endotronics) o sus análogos próximos tales como los descritos en la Patente EP 0 304 578 (Mc Cormick y Jones). El HBsAg, tal como aquí se describe, puede referirse igualmente a mutantes, por ejemplo, el "mutante de escape" descrito en la Patente WO 91/14703 o en la Solicitud de Patente Europea Número 0 511 855A1, especialmente el HBsAg en el que la sustitución de aminoácido en la posición 145 es a arginina a partir de glicina.

Normalmente, el HBsAg está en forma de partícula. Las partículas pueden comprender, por ejemplo, proteína S sola o pueden ser partículas compuestas, por ejemplo (L*,S) en la que L* es tal como se ha definido anteriormente y S indica la proteína S del HBsAg. Dicha partícula se encuentra ventajosamente en la forma en la cual está expresada en levadura.

La preparación de proteína S de antígeno de superficie de la hepatitis B está bien documentado.

Véase, por ejemplo, Harford y otros, en Develop. Biol. Standard, vol. 45, pág. 125, (1983); Gregg y otros, en Biotechnology, vol. 5, pág. 479, (1987); Patentes EP 0 226 846 y EP 0 299 108 y referencias en ellas citadas.

Las formulaciones incluidas dentro del alcance de la invención, pueden contener, igualmente, un antígeno anti-tumor y ser útiles para el tratamiento inmunoterapéuticamente de cánceres. La preparación de la vacuna se describe de manera general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y otros, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., (1978). La Encapsulación con liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, en la Patente de EE.UU. 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite, en la Patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y otros, en la Patente de EE.UU. 4.474.757.

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos, en vacunas típicas. Dicha cantidad varía, dependiendo del inmunógeno específico usado y de como se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-1000 mcg de proteína, preferiblemente 2-100 mcg, lo más preferiblemente 4-40 mcg. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede deducirse mediante estudios estándar que implican la observación de las respuestas inmune apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.

Las formulaciones de la presente invención pueden usarse tanto para fines profilácticos como terapéuticos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona, de acuerdo con ello, el uso de una vacuna de la invención para el tratamiento de pacientes humanos. La invención proporciona un procedimiento de tratamiento que comprende la administración de una cantidad eficaz de una vacuna de la presente invención a un paciente. En particular, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de infecciones víricas, bacterianas o parasíticas o de cáncer, el cual comprende la administración de una cantidad eficaz de una vacuna de la presente invención a un paciente.

Los ejemplos y datos siguientes ilustran la invención.

Ejemplos 1.1 Procedimiento de preparación de liposomas

Una mezcla de lípido (tal como fosfatidilcolina, bien procedente de yema de huevo o bien sintética) y colesterol en disolvente orgánico, se secó bajo vacío (o como alternativa, bajo una corriente de gas inerte). A continuación, se agregó una solución acuosa (tal como solución salina tamponada con fosfato), y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido se encontraba en suspensión. A continuación, esta suspensión se microfluidizó hasta que el tamaño del liposoma se redujo a 100 nm y, a continuación, se filtró de manera estéril a través de un filtro de 0,2 \mum. Esta etapa puede reemplazarse por extrusión o tratamiento con ultrasonidos. Típicamente, la relación de colesterol: fosfatidilcolina es de 1:4 (p/p), y la solución acuosa se agregó con el fin de obtener una concentración de colesterol final de 5 a 50 mg/ml. Si se agrega MPL en solución orgánica al lípido en solución orgánica, los liposomas finales contienen MPL en la membrana (denominado como MPL dentro).

Los liposomas tienen un tamaño definido de 100 nm y se denominan como SUV (para pequeñas vesículas unilamelares). Si esta solución se congela y descongela de manera repetida, las vesículas funden, formando estructuras multilamelares grandes (MLV) de un tamaño que varía desde 500 nm hasta 15 \mum. Los liposomas, por sí mismos, son estables a lo largo del tiempo y no tienen capacidad fusogénica.

1.2 Procedimiento de formulación

El QS21 en solución acuosa se agregó a los liposomas. A continuación, esta mezcla se agregó a la solución de antígeno, la cual, puede, si se desea, contener MPL en la forma de partículas de 100 nm.

1.3 La actividad lítica de la QS21 se inhibe mediante liposomas que contienen colesterol

Cuando la QS21 se agregó a eritrocitos, los lisó liberando hemoglobina. Esta actividad lítica puede medirse, igualmente, usando liposomas que contengan colesterol en su membrana y un colorante fluorescente retenido, la carboxifluoresceína. Puesto que los liposomas son lisados, el colorante es liberado, el cual puede monitorizarse mediante espectroscopía de fluorescencia. Si los liposomas fluorescentes no contienen colesterol en su membrana, no se observa lisis de los liposomas.

Si la QS21 se incuba con liposomas que contienen colesterol antes de agregarla a los eritrocitos, la lisis de los eritrocitos se disminuye, dependiendo de la relación de colesterol a QS21. Si se usa una relación 1:1, no se detecta actividad lítica. Si los liposomas no contienen colesterol, la inhibición de la lisis requiere un exceso de 1000 veces de fosfolípido sobre la QS21.

Lo mismo sigue siendo cierto usando liposomas fluorescentes para medir la actividad lítica. En el gráfico que figura a continuación, la actividad lítica de 4 \mug de QS21 tratada con liposomas que carecen de colesterol (1 mg de lecitina de yema de huevo por ml) o que contienen colesterol (1 mg de lecitina, 500 \mug de colesterol por ml), se midieron mediante fluorescencia.

1

Los datos muestran que la QS21 se asocia de una manera específica con el colesterol en una membrana, causando, de esta forma, la lisis (de células o de liposomas fluorescentes).

Si la QS21 se asocia en primer lugar con colesterol en liposomas, ya no es lítica frente a células u otros liposomas. Esto requiere una relación mínima de 0,5:1 de colesterol:QS21 (p/p).

El colesterol es insoluble en soluciones acuosas y no forma una suspensión estable. En presencia de fosfolípidos, el colesterol reside dentro de la bicapa fosfolípida que puede formar una suspensión estable de vesículas denominadas liposomas. Para evitar la necesidad de agregar fosfolípidos, se ensayó un derivado soluble. El sebacato de polioxietanilcolesterol es soluble en agua a una concentración de 60 mg/ml; sin embargo, incluso con un exceso de 2000 veces (p/p) sobre la QS21, no se detectó reducción en la actividad lítica de la QS21.

1.4 Estabilidad incrementada de la QS21 mediante liposomas que contienen colesterol

La QS21 es muy susceptible a la hidrólisis a pH superior a 7. Esta hidrólisis puede monitorizarse midiendo la disminución del pico correspondiente a QS21 sobre HPLC de fase inversa. Por ejemplo, el gráfico que figura más adelante muestra que a pH 9 y a una temperatura de 37ºC, el 90% de QS21 se hidroliza dentro de las 16 horas. Si se agregan liposomas que contienen colesterol a la QS21 a una relación de 2:1 (colesterol: QS21, p/p), no se detecta hidrólisis de la QS21 bajo las mismas condiciones.

Si la relación es de 1:1, se degrada el 10% de la QS21.

Incubación de 20 \mug de QS21 en presencia de SUV que contiene colesterol a pH 9 durante 16 horas a 37ºC

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Se deduce que, cuando la QS21 se asocia con liposomas que contienen colesterol, se vuelve mucho menos susceptible a la hidrólisis mediada por bases. El producto de hidrólisis se describe como uno que no tiene actividad adyuvante cuando se administra parenteralmente; por tanto, las vacunas que contienen QS21 han de formularse a pH ácido y mantenerse a 4ºC con el fin de mantener la composición adyuvante.

El uso de liposomas puede evitar esta exigencia.

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1.5 Estudios de reactogenicidad

Se inyectaron ratones en el músculo tibialis con 5 \mug de QS21 (o digitonina) agregada para incrementar las cantidades de liposomas (expresadas en términos de \mug de colesterol). La actividad lítica se expresó como \mug de QS21 equivalente, lo cual significa la cantidad de QS21 requerida para lograr la misma hemólisis que la muestra.

Después de sacrificar los ratones, se puntuaron visualmente en el sitio de inyección la rojez, necrosis y toxicidad en el músculo.

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Los datos muestran que, cuando la actividad lítica se suprimió mediante la acción de liposomas que contenían colesterol, igualmente se suprimió la toxicidad debida a QS21.

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1.6 Reactogenicidad intramuscularmente en conejos

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Los datos muestran que la adición de liposomas que contienen colesterol a la formulación, reduce significativamente la elevación en CPK (creatina fosfo quinasa) producida por la QS21. Puesto que el incremento de CPK es una medida del daño muscular, esto indica un daño muscular disminuido y se confirmó mediante histopatología.

1.7 Unión del complejo liposoma-QS21 a alumbre

La QS21 se incubó con liposomas neutros que contenían colesterol en exceso así como colesterol radioactivo y, a continuación, se incubaron con alumbre (Al(OH)3) en PBS. Por separado, ni los liposomas neutros ni la QS21 se unieron al alumbre en PBS, cargando negativamente a los liposomas. Sin embargo, juntos, la QS21 y los liposomas neutros se unieron al alumbre. El sobrenadante no contenía ni QS21 (ensayado mediante el ensayo de orcinol) ni colesterol radioactivo.

Esto indica que la QS21 se había unido a los liposomas y permite que la combinación liposoma-QS21 se una al alumbre. Esto puede originarse por haber sido impuesto una carga negativa sobre los liposomas por la QS21, o por una exposición de regiones hidrófobas sobre los liposomas. Igualmente, los resultados implican que la QS21 no extrae el colesterol procedente de la membrana.

Esto indica que las composiciones de la invención pueden usarse en vacunas a base de alumbre.

1.8 Comparación de QS21/MPL liposomial y QS21+MPL libre para anticuerpos e inducción mediante CMI

Se prepararon SUV mediante extrusión (EYPC:colesterol:MPL, 20:5:1).

Para el MPL fuera, los liposomas se prepararon sin MPL y el MPL se agregó en forma de partículas de 100 nm.

La QS21 se agregó antes del antígeno. Colesterol:QS21, 5:1 (p/p).

Los MLV se obtuvieron mediante congelación-descongelación de 3x SUV antes de la adición del antígeno.

Con el fin de retener el antígeno, el antígeno se agregó al SUV antes de la congelación-descongelación y la QS21 se agregó después de la congelación-descongelación. Encapsulación de antígeno = 5% dentro, 95% fuera.

Los ratones (balb/c para gD, B10BR para RTS) se inyectaron dos veces en la planta de la pata.

La gD es la glucoproteína D procedente del virus Herpes Simplex. El RTS es el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) genéticamente modificado para contener un epítopo procedente del esporozoito del Plasmodium falciparum.

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Los datos muestran que SUV/QS + MPL (fuera) induce altos títulos de anticuerpos al menos tan buenos como QS21 + MPL, así como la inducción de IL2 un marcador de inmunidad mediado por células, a la vez que interrumpen la reactogenicidad de la QS21.

En la Tabla que figura a continuación, se muestran resultados adicionales procedentes de un segundo experimento comparando QS21 y QS21 en presencia de colesterol (SUV) en ratones balb/c con gD del HSV como antígeno:

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1.9 Comparación de gp120 más MPL/QS21 liposomial con MPL/QS21 libre

Liposomas = SUV conteniendo MPL en la membrana.

Colesterol:QS21 = 6:1.

La respuesta se ensayó dos semanas después de una inmunización.

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Después de una segunda inmunización:

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Los datos muestran que la QS21 asociada con liposomas que contienen colesterol y MPL inducen una respuesta Th1/Th0 igual a MPL + QS21.

A esta relación de colesterol a QS21, la QS21 es no tóxica en conejos (mediante CPK).

En un segundo experimento, se inmunizaron ratones balb/c intra-planta del pie con gp120 en presencia de QS21 o QS21 + SUV conteniendo colesterol. Se midió la actividad del linfocito T citotóxico en células de bazo.

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Esto demuestra que la QS21 sola induce actividad CTL, y que la QS21 en presencia de liposomas que contienen colesterol induce actividad CTL al menos tan buena, o mejor, que la QS21 sola.

2. Vacunas 2.1 formulación de partículas L*, S de HBsAg

Las partículas L*, S de HBsAg pueden formularse tal como se indica a continuación.

10 \mug de partículas/dosis de L*, S de HBsAg se incubaron 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación. El volumen se ajustó usando agua para inyección y una solución de PBS y se completo hasta un volumen final de 70 \mul/dosis con una solución acuosa de QS21 (10 \mug/dosis). El pH se mantuvo a 7 \pm 0,5.

Se prepararon formulaciones similares usando 1 y 50 \mug de L*,S de HBsAg y usando, igualmente, el antígeno S de HBsAg.

Estas formulaciones pueden ensayarse en el modelo terapéutico subrogado de marmota usando antígenos de HBV de marmota como modelo.

Modelo de marmota

La DQ QS21 (es decir, QS21/colesterol o QS21 interrumpida) puede ensayarse en el modelo terapéutico de marmota en el que los animales son infectados crónicamente con el virus. La vacuna de virus de la hepatitis de marmota específico puede agregarse mezclado con la QS21 tal cual o DQ y con o sin MPL, y administrarse a los animales cada mes durante 6 meses. La eficacia de la vacuna puede comprobarse a través del aclaramiento del DNA
vírico.

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2.2 Modelo de cobayo (HSV) 2.2.1 Modelo profiláctico

Grupos de 12 cobayos Hartley hembras se inyectaron todos ellos intramuscularmente el día 0 y el día 28 con las formulaciones siguientes:

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Primer experimento

: 5 \mug de gD + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 50 \mug de colesterol,

: 5 \mug de gD + 100 \mug de QS21 + SUV conteniendo 100 \mug de colesterol,

: 5 \mug de gD + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug de colesterol,

: 5 \mug de gD + 50 \mug de QS21.

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Segundo experimento

: 5 \mug de gD + 12,5 \mug de MPL + 12,5 \mug de QS21 + SUV conteniendo 62,5 \mug de colesterol, o se dejaron sin tratar.

Los animales se sangraron a los 14 y 28 días después de la segunda inmunización, y los sueros se ensayaron para determinar sus títulos de anticuerpo mediante ELISA específico de gD.

A continuación, los animales se expusieron intravaginalmente con 10^{5} pfu de cepa MS de HSV-2. Se evaluaron directamente desde el día 4 hasta el 12 para evaluar las lesiones herpéticas primarias. Las puntuaciones fueron las siguientes:

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Lesiones vaginales

-: hemorragia = 0,5

-: rojez durante 1 ó 2 días sin hemorragia = 0,5

-: rojez y hemorragia durante un día = 1

-: rojez sin hemorragia permanente al menos 3 Días = 1.

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Vesículas herpéticas externas

-: <4 vesículas pequeñas = 2

-: >= 4 vesículas pequeñas o una vesícula grade 4 > = 4 grandes lesiones 8 grandes lesiones de fusión = 16

-: grandes lesiones de fusión sobre la totalidad del área genital externa = 32.

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En la tabla que figura a continuación, se muestran los resultados.

Modelo profiláctico

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Experimento 1 (col. se refiere a SUV conteniendo colesterol)

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Experimento 2

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  {}\hskip0,1cm   \begin{minipage}[t]{155mm}  Suma de las
puntuaciones de lesiones para los días 4 a 12
post-infección (no se consideraron los animales sin
lesiones). \end{minipage} \cr    {}\hskip0,35cm 
 \begin{minipage}[t]{155mm} Puntuación de lesiones: sin lesión
(0), lesiones vaginales (0,5 ó 1), vesículas en la piel externa (2,
4, 8 ó 16). \end{minipage} \cr  **
 \begin{minipage}[t]{155mm} Índice de infección primaria = SUM
(puntuación máxima i) x (% incidencia); siendo i = 0, 0,5, 1, 2, 4,
8 ó 16.
\end{minipage} \cr}

La Tabla y la gráfica muestran que en el modelo profiláctico se indujo un nivel muy alto de protección contra la enfermedad primaria mediante inmunización con gD/MPL/QS21/SUV. Tanto la incidencia de lesiones externas como la severidad de las lesiones, parecieron reducirse altamente en el grupo de animales inmunizados con gD/MPL/QS21/SUV.

2.2.2. Modelo terapéutico

En el modelo terapéutico, se expusieron primeramente cobayos Hartly hembras con 10^{5} de cepa HSV-2. A continuación, los animales con lesiones herpéticas se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 16.

El día 21 y el día 42, se inmunizaron todos ellos con una de las siguientes formulaciones:

gD + 50 \mug de MPL + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug de colesterol,

gD + Al(OH)3 + 50 \mug de MPL + 50 \mug de QS21 + SUV conteniendo 250 \mug de colesterol o se dejaron sin tratar.

Se monitorizaron diariamente desde el Día 22 hasta el 75 con el fin de evaluar la enfermedad recurrente. La puntuación fue tal como se ha descrito para el modelo profiláctico. Los resultados se muestran en la Tabla y gráfica que figura a continuación:

Modelo terapéutico

18

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  {}\hskip0,25cm   \begin{minipage}[t]{140mm} Suma de las
puntuaciones de lesiones para los días 22 a 75
post-infección. \end{minipage} \cr  ** 
 {}\hskip0,1cm   \begin{minipage}[t]{140mm} Lesiones recurrentes
experimentadas en animales en el total de días para los días 22 a 75
post-infección. \end{minipage} \cr  ***
 \begin{minipage}[t]{140mm} Número de episodios de recurrencia
para los días 22 a 75 post-infección. Un episodio
está precedido y seguido por un día sin lesión y caracterizado por
al menos dos días sin eritema (puntuación = 0,5) o un día con
vesícula externa (puntuación >=2).
\end{minipage} \cr}

Tratamiento inmunoterapéutico realizado los días 21 y 42

Los resultados muestran que se indujeron igualmente buenos niveles de protección en el modelo terapéutico de infección con HSV-2. La inmunización con gD/MPL/QS21/SUV con o sin alumbre tuvo un marcado efecto sobre la media de severidad de enfermedad recurrente. Igualmente, redujo ligeramente el Número y duración de episodios (véase Tabla).

Claims

1. Una composición de vacuna que comprende un antígeno, QS21, y un esterol, caracterizada porque la relación de QS21: esterol está entre 1:1 y 1:100 (p/p) y en la que la QS21 es al menos 90% pura.

2. Una composición de vacuna de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que la relación de QS21: esterol es 1:2 (p/p).

3. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2, en la que el esterol es colesterol.

4. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que contiene además 3D-MPL.

5. Una composición de vacuna de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un vehículo.

6. Una composición de vacuna tal como se reivindica en la Reivindicación 5, en la que el vehículo está seleccionado entre el grupo formado por: emulsiones de aceite en agua, alumbre, microesferas y partículas de antígeno encapsulado.

7. Una composición de vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un antígeno o una composición antigénica derivada a partir de cualquiera de entre el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia felina, virus Zoster de la varicela, virus del Herpes Simplex tipo 1, virus del Herpes Simplex tipo 2, citomegalovirus humano, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus sincitial respiratorio, virus del papiloma humano, virus Influenza, Hib, virus de la meningitis, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium o Toxoplasma.

8. Una vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un antígeno derivado de un tumor.

9. Una composición tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso como un medicamento.

10. Uso de la composición tal como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de una vacuna para el tratamiento profiláctico de infecciones víricas, bacterianas o de parásitos.

11. Uso de la composición tal como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, para la fabricación de una vacuna para el tratamiento inmunoterapéutico de infecciones víricas, bacterianas, de parásitos o cáncer.

12. Un procedimiento para la obtención de una composición de vacuna tal como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 8, que comprende la mezcla de QS21 y colesterol con un antígeno o una composición antigénica.