CN101563090B - 包含南美皂皮树皂苷的含脂质颗粒用于治疗癌症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含脂质颗粒用于制备治疗癌症之药物的用途，所述含脂质颗粒为例如脂质体、免疫刺激复合物(iscom)和/或免疫刺激复合物基质和posintro，包含至少一种脂质和至少一种皂苷。所述皂苷优选来自南美皂皮树(Quillaja Saponaria Molin)。另外，所述颗粒也是用于递送一种或多种用于使用补偿机制治疗癌症之化合物的系统。本发明还公开了包含至少两个部分的药盒，其中一个部分包含至少一种具有癌细胞杀伤作用的疏水性皂苷级分；另一个部分包含至少一种刺激并调节免疫应答的相对亲水的皂苷级分。

Description

包含南美皂皮树皂苷的含脂质颗粒用于治疗癌症的用途

本发明涉及包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒(例如脂质体、免疫刺激复合物(iscom)和/或免疫刺激复合物基质(iscommatrix)和posintro)在制备用于治疗癌症的药物中的用途。所述颗粒也是用于一种或多种使用补偿机制治疗癌症之化合物的递送系统。

本发明还涉及用于治疗癌症的方法，其中将包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒施用给需要癌症治疗的个体。

另外，本发明涉及包含至少两个部分的药盒，其中一个部分包含含脂质颗粒，其包含至少一种具有癌细胞杀伤作用的疏水性皂苷级分；另一个部分包含含脂质颗粒，其包含至少一种刺激并调节免疫应答(例如抗体产生和细胞介导的免疫)的相对亲水的皂苷级分。

本发明涉及颗粒化制剂中选定的南美皂皮树(Quillaja)组分杀伤并抑制肿瘤细胞生长(下文称作KGI)这一发现。由于所述颗粒化制剂具有高的生物利用度，因此它们是优选的。它们可与靶向分子配制在一起，它们可配置成被人或动物良好接受，而没有由游离形式的溶胞效应(lytic effect)所造成的副作用。

现有技术

已经描述了含脂质的颗粒例如脂质体和免疫刺激复合物作为抗原和佐剂的载体。

南美皂皮树皂苷(quillaja saponin)的免疫刺激特性早已为人所知(Ramon 1926)，并且自二十世纪五十年代以来已经在商品疫苗中使用了游离形式的南美皂皮树皂苷，其有时与Al(OH)₃组合(Dalsgaard1978)，Ma等(Ma，Bulger等1994)，(Espinet 1951)。相比于传统的游离形式，Morein等(Morein，Sundquist等，1984)描述了南美皂皮树皂苷显著更有效的应用--免疫刺激复合物技术(EP 0 109 942 B1，EP 0 242 380 B1和EP 0 180 564 B1)以及数年后的免疫刺激复合物-基质技术(Lovgren和Morein，1988)、(EP 0 436 620 B1)。使用iscom技术，疫苗抗原被掺入由南美皂皮树皂苷、胆固醇和磷脂组成的40nm复合物中。

已知南美皂皮树皂苷具有抗癌活性。但是，粗制或分级形式的皂苷本身由于疏水性溶胞效应(hydrophobic-lytic effect)在施用部位导致部分驻留(partial trapping)而具有普遍的副作用。因此，在癌症治疗中使用游离形式的皂苷是不现实的。于是，皂苷本身尚未开发成为有用的癌症药物。

另外，免疫刺激复合物技术已经被开发为包含整合进该免疫刺激复合物中的癌抗原的癌症疫苗。尽管在这些疫苗中的抗原引发抗体和细胞介导的应答，但免疫刺激复合物本身发生降解，并且如果个体在以后受到癌细胞的影响，它将不存在。

现在发现，包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质)可用于制备治疗癌症的药物。

对于本发明含有脂质和皂苷的颗粒，癌细胞比正常细胞敏感30-40倍。所述含有脂质和皂苷的颗粒诱导杀伤癌细胞的凋亡。

杀伤作用是由于主要的凋亡诱导物产生的。高浓度诱导更早地发生凋亡。在用本发明的含脂质颗粒治疗之后，所述细胞脱离了细胞周期，即它们不继续进行下一个周期。因此，对癌细胞的杀伤是不可逆的。产生阶段由产生IL-8后发生凋亡这一事实来展示。

在长时间培养癌细胞后，细胞在处理之后不恢复复制，更重要的是，甚至在接触间断的低生理剂量之后也是如此。

通过多种方法分析癌细胞死亡，所述方法包括台盼兰染色、AlamarBlue方法的酶代谢抑制、碘化丙锭染色所显现出的坏死改变，以及Annexin V染色显示的凋亡，如材料和方法中所述。

发明概述

本发明涉及包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒(例如脂质体、免疫刺激复合物和/或免疫刺激复合物基质和posintro)在制备于治疗癌症的药物中的用途。

本发明还涉及用于治疗癌症的方法，其中将包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒施用给需要癌症治疗的个体。

另外，本发明涉及包含至少两个部分的药盒，其中一个部分包含含脂质颗粒，其包含至少一种具有癌细胞杀伤作用的疏水性皂苷级分；另一个部分包含含脂质颗粒，其包含至少一种刺激并调节免疫应答(例如抗体产生和细胞介导的免疫)的相对亲水的皂苷级分。

本发明涉及颗粒化含脂质制剂中选定的皂苷(例如南美皂皮树组分)具有杀伤并抑制肿瘤细胞生长的作用(下文称作KGI和BBE)这一发现。在皂苷或皂苷级分中选择杀伤肿瘤细胞或抑制其生长的能力。由于具有高生物利用度以及所述颗粒可配制成被个体(例如人或动物)良好接受并且没有游离形式粗制皂苷或游离形式皂苷的副作用，因此选择所述颗粒化制剂。

可选择其它皂苷或皂苷级分(包括来自南美皂皮树(Quillaja SaponariaMolina)的级分QHA)，因为它们可以显示或不显示这种KGI作用，但是它们显示出对KGI的强的中和、阻断和平衡作用。这些级分还可以以颗粒形式作为KGI颗粒的一部分，或者作为独立的BBE颗粒，与颗粒化或非颗粒化QHC协同杀伤某些癌细胞。下文中，阻断和平衡作用简称BBE。KGI和BBE颗粒刺激并调节对肿瘤抗原的免疫保护应答，所述抗原是从用KGI颗粒处理并杀伤的细胞中释放的，其可通过交叉呈递来呈递抗原，或者所述应答利用BBE可直接刺激抗原呈递细胞(APC)产生抗肿瘤效应这一事实。

还通过以下附图描述本发明。

附图说明

图1.1、南美皂皮树皂苷的三萜类化合物结构。

图1.2、南美皂皮树皂苷的反相特征谱。级分C是KGI 1的主要成分和活性成分，级分A是BBE的主要成分和活性成分。

图1.3、KGI 1的电子显微镜图。

图2.1、QHC和QHA之间的结构差异。QHC对细胞膜的高溶胞效应与标记点3右侧的脂肪酰基链相关。QHA缺乏脂肪酰基链，使得其更为亲水得多，于是溶胞效应较低。QHC和QHA都是未分级南美皂皮树皂苷的天然组分(参见图1.2的HPLC分离特征谱)。

图3.1、低浓度的KGI 1杀伤癌细胞U937，由AlamarBlue法测得。

图3.2、需要高剂量的KGI 1才能杀伤正常的人树突细胞(dendritic cell，DC)。

图4.1、BBE对U937肿瘤细胞无毒性。

图4.2、BBE对正常的人树突细胞(DC)无毒性。

图5.1、BBE与KGI 1之比为10∶1时，BBE阻断KGI 1的杀伤作用。此测试使用固定的KGI 1浓度(即77μg/ml)和递增的BBE浓度(如X轴所示)进行。

图6.1、KGI 2在同一颗粒中含有两种皂苷组分(不同比例的QHA和QHC，即：9.5∶0.5；7.5∶2.5和7.0∶3.0)。KGI 2对U937细胞的癌症杀伤能力随着QHC比例的增加而增加。

图6.2、KGI 2在同一颗粒中含有7∶3比例的两种皂苷组分(QHA和QHC)，相比于KGI 1(参见实施例3中的图3.1)，其需要更高的活性物质QHC浓度来杀伤U937癌细胞。

图6.3、KGI 2在同一颗粒中含有7∶3比例的两种皂苷组分(QHA和QHC)，相比于KGI 1(参见实施例3中的图3.2)，其需要比杀伤U937癌细胞更高浓度的活性物质QHC来杀伤正常人DC。

图6.4、多种KGI和BBE制剂活化单核细胞来源的未成熟DC成为成熟细胞，并表达DC标志物CD86，CD86是为活化DC与淋巴细胞交流以分化和活化成为效应细胞的分子。

图7.1、KGI 1颗粒抑制U937癌细胞的复制。将所述细胞接种于微滴定板，然后在9天的实验培养期内接触2μg/ml(M2)KGI 1，每天用台盼兰染色后通过显微镜对活细胞数进行计数。

图7.2、甚至在中断KGI 1接触之后，KGI 1颗粒也抑制U937癌细胞复制。如图7.1中所述培养所述细胞并与2μg/ml(M2)KGI 1接触9天。在孵育3天后，移去KGI 1。在箭头所指的时间点更换培养基。对照细胞在没有KGI 1的情况下培养。

图7.3、使如图7.1中所述培养的U937癌细胞接触25μg/ml高剂量的游离形式KGI1(即Quill A的QHC级分)(F)或25μg/ml颗粒形式KGI1(M)，如图中所示取样。用台盼兰对细胞染色(参见材料和方法)。细胞生存力以活对照细胞的百分比来表示。在此高剂量下，游离形式KGI 1(即Quill A的QHC级分)迅速(即3小时内)杀伤所述细胞，而KGI 1颗粒需要更长的时间(即24小时)来杀伤高比例的癌细胞。

图7.4、如图中所示使U937癌细胞接触低生理剂量的2μg/ml游离形式KGI1(即Quill A的QHC级分)(F)或2μg/ml颗粒形式KGI 1(M)。用台盼兰对细胞染色(参见材料和方法)。细胞生存力以活对照细胞的百分比来表示。在此低剂量下，游离形式KGI 1(即Quill A的QHC级分)在60小时的培养中不杀伤所述细胞，而KGI 1颗粒在24小时后开始杀伤癌细胞。

图7.5、极低剂量的KGI 1颗粒抑制U937癌细胞的生长。如图中所示使所述细胞与0.5μg/ml低剂量(M0.5)或2μg/ml(M2)的KGI 1接触12天。用台盼兰方法染色后对细胞数进行计数(参见材料和方法)。相比于未处理细胞，0.5μg/ml低剂量的KGI减少细胞数，而2μg/ml剂量的KGI 1颗粒在12天的培养中杀伤所有癌细胞。

图7.6、KGI 1在U937癌细胞中诱导凋亡。使所述细胞与培养基中2μg/ml(M2)或25μg/ml(M25)浓度的KGI 1接触120小时。通过FACS(参见材料和方法)确定Annexin V阳性细胞数。2μg/ml浓度引发凋亡细胞群增加，在接触24小时后达到峰值水平。更高浓度即25μg/ml的KGI 1进一步增加凋亡细胞的比例，在接触后12和24小时达到峰值水平。

图7.7、KGI 1不引发坏死U937癌细胞数的增加。如图中所列，使所述细胞与培养基中2μg/ml(M2)至50μg/ml(M50)浓度的KGI 1接触120小时。如图7.1中所述培养细胞并取样，用碘化丙锭染色，通过FACS确定坏死细胞数(参见材料和方法)。用多种剂量的KGI 1处理的细胞或未接触KGI 1的对照细胞之间不存在坏死细胞比例的差异。

图7.8、KGI 1随着时间经过而引发U937癌细胞被Annexin V(凋亡)和碘化丙锭(坏死)同时染色。如图7.1中所述培养所述细胞，将其与培养基中2μg/ml(M2)至50μg/ml(M50)浓度的KGI 1接触120小时。对所述细胞取样，并且如图中所示用碘化丙锭和Annexin V染色。通过FACS确定受影响细胞的比例。浓度的增加诱导就坏死和凋亡作用同时染色的细胞群增加。

图8.1、KGI 1抑制癌细胞U937的增殖，并且细胞在12天的培养期之后也未恢复增殖。将所述细胞与培养基中0.5μg/ml(M0.5)和2μg/ml(M2)的KGI 1接触12天，如图中所示收集样品。在所述细胞与KGI 1接触1至3天后，观察到向细胞生长降低的拐点。在用台盼兰染色后对活细胞进行计数。

图8.2KGI 1抑制癌细胞U937的增殖，并且所述细胞在移去KGI 1之后未恢复增殖。首先，使所述细胞饥饿22小时以使细胞在细胞周期中同步(参见正文)。之后，将所述细胞与培养基中2μg/ml的KGI 1接触多达12天，收集样品，每3天更换一次培养基。在第3天从所述细胞中除去KGI 1。在用台盼兰染色后对活细胞进行计数。

图9.1、细胞周期的说明。胸苷激酶(TK)活性发生在S期(即DNA复制期)之前。KGI 1对细胞生长的抑制作用似乎发生于细胞生长周期晚期，至少在低剂量下是这样。

图9.2、在用2μg/ml(M2)或25μg/ml(M25)的KGI 1处理10⁶个/ml U937细胞后的5天中每天测量细胞裂解物中的TK活性。在此实验期间细胞培养基未更换，这解释了未处理细胞活性的降低。在5天的培养过程中，将经处理细胞中TK活性的降低与未处理对照进行比较。与25μg/ml高剂量的KGI 1接触24小时后以及与2μg/ml低剂量的KGI 1接触2天后TK活性降低明显。

图9.3、在用2μg/ml(M2)或25μg/ml(M25)的KGI 1处理10⁶个/ml U937细胞后在5天中测量细胞裂解物中的TK活性。TK活性表示为未处理细胞的百分比(亦参见图9.2)。

图9.4、用2μg/ml(M2)、10μg/ml(M10)、25μg/ml(M25)和50μg/ml(M50)浓度的颗粒化KGI 1处理10⁶个/ml U937细胞120后，在120小时中每天测量细胞裂解物中的TK活性。将用颗粒化KGI 1处理后TK活性的降低与以相同浓度测试的游离(即非颗粒化，以F表示)KGI 1进行比较。在低生理剂量下，在接触所述细胞48小时后(M2)降低变得明显，但是对游离的KGI 1(F2)来说较不明显。在用高剂量25μg/ml或更高浓度KGI 1处理后，在接触24小时后TK活性的降低明显。用高剂量游离KGI即25μg/ml和50μg/ml细胞培养液处理的细胞未显示可检出的TK活性(亦参见图9.5)。

图9.5、在用2μg/ml(M2)、10μg/ml(M10)、25μg/ml(M25)和50μg/ml(M50)浓度的颗粒化KGI 1处理10⁶个/ml U937细胞的5天中，每天测量细胞裂解物中的TK活性。用颗粒化KGI 1处理细胞的培养基中未检测到TK活性。以25μg/ml和50μg/ml浓度的游离(即非颗粒化，以F表示)KGI 1处理的细胞向培养液中释放TK(亦参见图9.4)。只在细胞培养基中有TK活性(而细胞中没有)表明发生了泄漏和细胞膜破损。

图9.6、在将细胞饥饿22小时以同步化细胞周期后(参见正文)，分析U937癌细胞中的胸苷激酶(TK)活性。之后，将细胞与2μg/ml的KGI 1接触0、2、8、18和24小时。在第0、8和24小时对未处理对照取样(参见正文)。KGI 1(2μg/ml，即M2)降低了处理18和24小时的细胞样品中记录的U937癌细胞胸苷激酶活性。该结果表明，在低剂量下TK活性抑制不在最初8小时中出现，而是在18小时后出现。

图9.7、KGI 1(2μg/ml)在接触18小时后抑制U937癌细胞的增殖。首先，使细胞饥饿22小时以同步化细胞周期(参见正文)。如图9.6所示，处理18小时后降低的细胞生长与TK活性降低一致。在用台盼兰染色后对活细胞进行计数。

图9.8、在细胞饥饿22小时以同步化细胞周期后(参见正文)测量细胞代谢抑制(Alamar Blue)和细胞杀伤(台盼蓝)。之后，将细胞与2μg/ml或0.5μg/ml的KGI 1接触24小时。在第24小时对未处理对照取样。KGI1(2μg/ml，即M2)和游离KGI(2μg/ml，即F2)在处理24小时后降低了细胞生存力。0.5μg/ml浓度的KGI 1或游离KGI 1在处理24小时后降低了细胞生存力。代谢抑制在用KGI 1处理后比用游离形式处理后更加明显。

图10.1、KGI 1以3μg/ml的LC50浓度诱导U937癌细胞产生781pg/ml的IL-8。

图10.2、KGI 2以19μg/ml的LC50浓度诱导U937癌细胞产生880pg/ml的IL-8。

图10.3、KGI 3以14μg/ml的LC50浓度诱导U937癌细胞产生917pg/ml的IL-8。

发明详述

本发明涉及包含至少一种脂质和至少一种皂苷的含脂质颗粒在制备用于治疗癌症的药物中的用途。因此，本发明涉及包含至少一种脂质和至少一种皂苷的用于治疗癌症的药物。

根据本发明，产生癌症杀伤作用的是脂质颗粒本身和皂苷。发现尽管游离皂苷本身可杀伤癌细胞，但是它们对正常细胞也具有不良作用。与脂质一起或者整合进脂质颗粒中后，在比游离皂苷对正常细胞有毒的浓度低30倍的浓度下获得了针对癌细胞的作用。

含脂质颗粒可选自脂质体、免疫刺激复合物和/或免疫刺激复合物基质和posintro。

脂质体

脂质体一般是两亲性化合物的球形或类球形的簇或聚集体，包括亲脂部分，通常是一个或多个同心层的形式，例如单层、双层或多层。在本文中它们也被称为脂质囊。脂质体可由例如离子型脂质和/或非离子型脂质制成。由非离子型脂质制成的脂质体可称为囊泡(niosome)。至少部分由阳离子型脂质或阴离子型脂质配制成的脂质体可被称为脂质卷(cochleate)。

可根据例如Lipford和Wagner(Lipford，Wagner等1994)和Gregoriadis，G.(Gregoriadis，McCormack等1999)，O’Hagan，DT(2001)所述制备脂质体。

可适用于制备本发明脂质体组合物的一般性脂质体制备技术描述于例如美国专利No.4728578、4728575、4737323、4533254、4162282、4310505和4921706；英国专利申请GB2193095A；国际专利申请No.PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；Mayer等(Mayer，Hope等1986)；(Hope等，1985)；Mayhew等(Mayhew，Conroy等1987)；Mayhew等(Mayhew，Lazo等1984)；Cheng等(Cheng，Seltzer等1987)；和Liposome Technology，Gregoriadis，G.(Gregoriadis，G.等1984)，其各个公开内容以援引的形式并入本文。因此，脂质体组合物可使用本领域技术人员公知的多种常规脂质体制备技术中的任一种来制备，包括如溶剂透析、法式挤压(French press)、挤出(有或没有冻融)、反相蒸发、简单的冻融、超声、螯合透析、匀浆、溶剂灌输、微乳化、自发形成、溶剂蒸发、溶剂透析、法式压力细胞技术、受控去污剂透析等，其中每种均包括制备多种形式的组合物。参见，例如Madden等，(Madden，Harrigan等，1990)，其公开内容以援引的形式并入本文。

合适的冻融技术描述于例如1989年11月8日提交的WO申请No.PCT/US89/05040，其公开内容以援引的形式整体并入本文。涉及冻融技术的方法是脂质体制备中优选的。可以在溶液(例如盐水溶液、磷酸盐缓冲水溶液)中或无菌水中进行脂质体的制备。还可通过包括振摇或涡旋混合的多种方法来制备脂质体，所述振摇或涡旋例如可通过使用机械振摇设备来实现，例如：Wig-L-Bug.TM.(Crescent Dental，Lyons，III.)、Mixomat(Degussa AG Frankfurt，Gemany)、Capmix(Espe FabrikPharmazeutischer Praeparate GMBH&Co.，Seefeld，OberayGermany)、Silamat Plus(Vivadent，Lechtenstein)或Vibros(QuayleDental，Sussex，England)。还可使用常规微乳化设备例如Microfluidizer.TM.(Microfluidics，Woburn，Mass)。

免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质

免疫刺激复合物包含至少一种皂苷(例如至少一种糖苷)、至少一种脂质和至少一类抗原物质。所述脂质至少有固醇，例如胆固醇，任选地还有磷脂酰胆碱。此复合物还可含有一种或多种其它免疫调节(佐剂活性)物质，并可如EP 0 109 942 B1、EP 0 242 380 B1和EP 0 180 564B1所述产生。

本发明组合物中的免疫刺激复合物基质复合物包含至少一种糖苷和至少一种脂质。所述脂质至少有固醇，例如胆固醇，任选地还有磷脂酰胆碱。基质对共施用的抗原性物质有免疫增强作用。所述免疫刺激复合物还可含有一种或多种其它免疫调节(佐剂活性)物质，不一定是皂苷，可根据EP 0 436 620 B1所述产生，并且可根据本发明所述产生。

可使用一种或多种免疫刺激复合物颗粒、一种或多种免疫刺激复合物基质颗粒或其6纳米环的任何亚片段。可使用这些免疫刺激复合物基质、颗粒或亚片段的任何混合物。

Posintro

Posintro是包含下列的复合物：i)至少一种第一固醇和/或至少一种第二固醇，其中所述至少一种第二固醇能够通过选自静电相互作用和疏水相互作用的相互作用接触外源抗原(优选核酸)，其中所述至少一种第一固醇和/或所述至少一种第二固醇能够与至少一种第一皂苷和/或至少一种第二皂苷形成复合物，和ii)至少一种第一皂苷和/或至少一种第二皂苷，其中所述至少一种第二皂苷能够通过选自静电相互作用和疏水相互作用的相互作用接触遗传决定因子，其中所述至少一种第一皂苷和/或所述至少一种第二皂苷能够与至少一种第一固醇和/或至少一种第二固醇形成复合物，以及任选地iii)至少一种用于通过选自静电相互作用和疏水相互作用的相互作用接触遗传决定因子的接触基团，其前提为所述复合物中不存在第二固醇时则存在所述至少一种接触基团，另外任选地i)至少一种亲脂部分。

Posintro可以采取类似于已知免疫刺激复合物(iscom)的笼样基质形式的微颗粒结构。除了免疫刺激复合物结构之外，已报道了固醇与皂苷之间的相互作用得到多种不同的结构实体，包括例如点阵、蜂窝、棒状和无定形颗粒的实体，本发明涵盖所有这些结构实体。

Posintro描述于WO专利申请No.WO 2002/080981和WO2004/030696。

脂质

特别地，所用的脂质为本申请人的专利EP 0 109 942 B1(特别是第3页)以及专利EP 0 436 620 B1第7页7-24行所述的那些。尤其是使用固醇(例如胆固醇)和磷脂(例如磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)。可使用与细胞结合组分相结合的含脂质受体，所述细胞结合组分例如为糖脂，包括霍乱毒素受体(其为神经节苷脂GM1)以及岩藻糖血型抗原。然后所述细胞结合组分可行使粘膜靶向分子的功能，并通过简单地将其与含有它们的复合物混合而与含脂质的物质结合。包含这些受体的免疫刺激复合物描述于WO 97/30728。

皂苷

所述皂苷可以是任何皂苷。根据本发明的一个方面，所述皂苷是获得自植物的糖苷。所述植物糖苷可选自具有一个或多个糖部分的皂苷配基和前皂苷配基。所述糖苷可以是来自南美皂皮树的粗制皂苷级分或者其亚级分。

自从上世纪50年代以来，南美皂皮树皂苷及其多种级分已用作佐剂并用于多种佐剂制剂中，其中疏水性最强的级分(例如QS21)已用于动物疫苗和多种人临床试验中(Kersten，Spiekstra等，1991)；(Kensil，Patel等1991)。已经用多种南美皂皮树级分或者级分的多种组合或者更粗制的南美皂皮树皂苷制成了免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质。在所有情况下，免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质制剂都比游离形式引起更少的局部反应。最近已开发出具有更好的免疫增强能力的制剂，并且比用作佐剂的任何其它南美皂皮树皂苷制剂更具耐受性(Morein，Sundquist等1984)。本发明使用这些良好耐受的南美皂皮树皂苷制剂组分来杀伤癌细胞(KGI)和平衡所述作用(BBI)。

皂苷是由连接有一个或多个糖链的糖苷配基组成的分子复合物。皂苷可被有机酸(例如乙酸、丙二酸)酰基化作为其结构的一部分(Hostettmann K和Marston A.1995；Rouhi A.M.1995；Leung A Y.和Foster S.1996)。这些复合物具有600至超过2000kd的分子量。疏水性糖苷配基和亲水性糖部分导致了两亲性特性。特别关注的是三萜类化合物糖苷。以其糖苷配基表征的其它皂苷有甾体糖苷和甾体生物碱糖苷。

粗制南美皂皮树皂苷最先由Kobert，R.(Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.23：233-272，1887)在1887年分离。后来，Dalsgaard纯化了南美皂皮树皂苷(Dalsgaard 1974)。Higuchi，R.(Higuchi，R.1988)报道了南美皂皮树皂苷的完整结构，识别出在两个不同位置连接有两个糖部分的糖苷配基(三萜系化合物皂皮酸)。可用糖苷描述于EP 0 109924 B1。皂苷和三萜皂苷是优选的。它们可以是来自南美皂皮树的粗提物的形式(Dalsgaard 1974)，或者是其任何亚级分，如Kensil等的PCT/US/88101842中所述(Kensil，Patel等1991)，(Kersten，Spiekstra等1991)。“Aspects of iscoms.Analytical，Pharmaceutical and AdjuvantProperties；Thesis，University of Utrecht，EP 0 362 279 B2和EP 0 555276 B1。

本说明书中和权利要求书中的术语“来自南美皂皮树的一种皂苷级分”用作对南美皂皮树的半纯化或确定的皂苷级分或者基本纯化级分的通用描述。重要的是，当使用包含基本上一种级分的免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质的混合物时，所述级分不含有多到对所获得的良好结果有不利影响的任何其它级分。如果需要，所述皂苷制备物可以包含少量的，例如最多40％(重量)、最多30％(重量)、最多25％(重量)、最多20％(重量)、最多15％(重量)、最多10％(重量)、最多7％(重量)、最多5％(重量)、最多2％(重量)、最多1％(重量)、最多0.5％(重量)、最多0.1％(重量)的其它化合物，例如其它皂苷或其它佐剂物质。

本发明的皂苷级分可以是WO 96/11711所述的A、B和C级分，EP0 436 620所述的B3、B4和B4b级分，EP 0 3632 279 B2所述的QA1-22级分，Q-VAC(Nor-Feed，AS Denmark)，南美皂皮树Spikoside(IsconovaAB，Ultunaallén 2B，756 51 Uppsala，Sweden)。

也可使用EP 0 3632 279 B2的级分QA-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-19-20-21和22，尤其是QA-7、17-18和21。它们如EP 0 3632 279 B2尤其是第6页以及第8和9页的实施例1所述获得。WO 96/11711所述的A、B和C级分从粗制南美皂皮树水提取物的色谱分离中获得的亲脂性级分中制得，并用70％乙腈水溶液洗脱以回收亲脂级分。然后通过半制备型HPLC用25％至60％梯度乙腈酸性水溶液洗脱来分离此亲脂级分。本文中称为“级分A”或“QH-A”的级分是(或对应于)以约39％乙腈洗脱的级分。本文中称为“级分B”或“QH-B”的级分是(或对应于)以约47％乙腈洗脱的级分。本文中称为“级分C”或“QH-C”的级分是(或对应于)以约49％乙腈洗脱的级分。

来自南美皂皮树的皂苷可分为两个不同的类别：

(I)较为疏水的级分在4位具有脂肪酸酰基链。这些皂苷级分通过在细胞膜上产生约12nm的小孔而显示出强溶胞效应。游离形式的这些皂苷级分不可逆地杀伤细胞，但是在中等浓度的(Ronnberg，Fekadu等1997)以及如本发明所述的带有整合抗原的颗粒化形式免疫刺激复合物(ISCOM)中或者不带整合抗原的类似颗粒(即ISCOM MATRIX)中则未必如此。

(II)较为亲水的南美皂皮树皂苷可以十倍或更高的浓度给予而不产生细胞溶胞效应。在颗粒化形式中，这些皂苷级分基本上没有细胞毒性作用或者基本上没有体内毒性作用。

较疏水形式和较亲水形式的颗粒化形式如ISCOM MATRIX所述，其为由亚片段形成的6nm环构建成的40nm球(Ronnberg，Fekadu等1995)，(Lovgren和Morein 1991)。

包含疏水皂苷(例如包含脂肪酸)的脂质颗粒(例如免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质)在本发明中被称为KGI颗粒(killing andgrowth inhibiting tumour cell，杀伤并抑制肿瘤细胞生长)。这些皂苷可以是例如在来自南美皂皮树之皂苷的三萜类化合物糖苷配基的4位含有脂肪酰基的级分，例如Quil A的级分C和B，或来自级分A和B之间部分的级分以及EP 03632 279 B2中所述的级分15-21，级分16、17、18在此尤其合适。

由含有亲水皂苷的皂苷构成(例如由脂肪酸构成)的脂质颗粒(例如免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质)被称为BBE颗粒(具有阻断平衡作用(blocking balancing effect)，以及癌细胞杀伤作用)。Quil A的级分4-15，尤其EP 03632 279 B2中所述的级分7-14和级分A(QHA)在此是合适的。

所述脂质颗粒可包含至少一种疏水皂苷。它还可包含至少一种亲水皂苷。所述至少一种亲水皂苷和所述至少一种疏水皂苷可以在同一含脂质颗粒中或不同的含脂质颗粒中。

选择来自南美皂皮树的QHA级分是因为它不显示细胞杀伤作用，但是对KGI制剂显示强的中和、阻断或更重要地平衡作用，例如细胞杀伤和向分化进行调节之间的平衡。下文中，所述阻断和平衡作用简称BBE。KGI和BBE颗粒刺激和调节对抗原的免疫保护应答。因此，预计这些颗粒可刺激对KGI颗粒所杀伤的细胞中释放出的肿瘤抗原(其可通过交叉呈递来呈递抗原)的免疫应答。或者，BBE可直接增强刺激抗原呈递细胞(APC)产生抗肿瘤作用以及诱导获得性抗肿瘤免疫应答。

因此，如在本发明中根据其功能所命名地，KGI和BBE颗粒具有不同的性质。KGI可以在相对低浓度下(即与原代人或鼠细胞相比低30至40倍的浓度)不可逆地阻断细胞生长并杀伤癌细胞。此外，同BBE相似，KGI对所包含抗原或从细胞中释放到环境中的抗原或共施用抗原具有免疫增强作用。BBE颗粒可以与整合有肿瘤抗原的KGI颗粒共施用，或从癌细胞(例如被KGI或共施用的抗原性物质所破坏的癌细胞)自发获得肿瘤抗原，参见EP 0 436 620 B1。

KGI和BBE都包含至少一种皂苷(例如糖苷)和至少一种脂质，如果它们是免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质的话，它们还包含如WO/1990/003184中所述的脂质胆固醇。

包含对癌细胞具有杀伤作用的疏水皂苷的含脂质颗粒还可另外包含亲水皂苷。

所述含脂质颗粒可在同一含脂质颗粒中含有至少两种不同的皂苷级分。

所述含脂质颗粒还可含有至少两种不同的皂苷级分，其中所述至少两种不同皂苷级分之一是结合在一种含脂质颗粒中的复合物，所述至少两种不同皂苷级分中的另一种(或另一些)是结合在另一种(或另一些)物理上不同的含脂质颗粒中的复合物。

所述不同的皂苷可以分别是亲水和疏水的皂苷。所述颗粒可含有至少级分C或至少级分B或者至少Quil A的级分C和B之间的任何级分，以及Quil A的至少另一种级分。因此，一种颗粒可包含仅级分C；级分C和Quil A的至少另一种级分；级分C和Quil A的一种或多种级分；级分C和Quil A的级分A；粗制Quil A。所述颗粒还可包含仅级分B；级分B和Quil A的至少另一种级分；级分B和Quil A的一种或多种级分；级分B和Quil A的级分A。上述级分组合还可在不同的脂质颗粒中或在同一脂质颗粒中。实施例1中的KGI 1、KGI 2和KGI 3颗粒是这些脂质颗粒的实例。

根据本发明的一个方面，所述KGI颗粒可包含Quil A的粗制或粗提物，其包含皂苷混合物或其半纯化形式，例如Quillaja Powder Extract(Berghausen，USA)、Quillaja Ultra Powder QP UF 300、Quillaja UltraPowder QP UF 1000或Vax-Sap(所有这三种均来自Natural Responses，Chile)。根据本发明，纯化的皂苷级分C和B单独或与A组合后用于KGI颗粒中，而A用于BBE颗粒中。所述B和C级分描述于WO96/11711，B3、B4和B4b级分描述于EP 0 436 620。级分QA1-22描述于EP 0 3632 279 B2，Q-VAC(Nor-Feed，AS Denmark)，QuillajaSaponaria Molina Spikoside(Isconova AB，Uppsala Science Park，75183，Uppsala，Sweden)。这些KGI颗粒在实施例中被称为KGI 3。

在KGI颗粒中可用的皂苷的实例有Quil A的QHC级分以及上述Quil A中QHC与QHA级分的不同组合。在实施例中，KGI 1颗粒仅含有级分QHC。KGI 2颗粒含有30％的QHC和70％的QHA。也可使用上述Quil A(quillaja saponin，南美皂皮树皂苷)级分的所有其它组合。

肿瘤细胞是快速生长的未分化细胞。因此，肿瘤细胞(也)对某些细胞毒性物质敏感。本发明的构思是使用基于南美皂皮树的级分或级分组合的颗粒化形式的物质(工作名为KGI 1、KGI 2和KGI 3以及BBE)，其对快速生长的细胞例如恶性肿瘤(不排除良性肿瘤)中的细胞具有毒性和/或调节作用。可以在细胞水平测量所述毒性或调节作用。所述细胞毒性-细胞调节物质(即所述皂苷)被构建成一种或多种递送颗粒。除了毒性或细胞调节作用之外，另一种颗粒还可用于阻断所述毒性(工作名：BBE)。即：可建立针对肿瘤细胞的平衡杀伤系统。在递送系统中，可加入刺激细胞存活并激活其分化的免疫调节物。其它的刺激可包括诱导细胞毒T细胞，其为清除癌症的主要免疫防御细胞类型。淋巴系统的死亡细胞也可通过所谓的交叉呈递促成对活DC的刺激。这里，单核细胞来源的成单核细胞样(monoblastoid)细胞代表淋巴肿瘤细胞，正常细胞是单核细胞来源的树突细胞。

通过将从南美皂皮树制备的KGI和BBE复合物相组合，有可能制得具有不同和互补性质的制备物，所述性质例如比KGI颗粒更低的细胞毒性、互补的细胞活化和分化以及显著的免疫调节作用。KGI和BBE颗粒的作用是受体介导的，如BBE对KGI导致癌细胞细胞毒性的阻断作用所强调的。因此，没有在BBE颗粒上鉴定出KGI对本发明中用作模型的U937细胞的癌细胞杀伤作用。但是，BBE显示了对其它一些癌细胞的杀伤作用。共同的受体引发癌细胞的活化和分化，其在正常细胞上其与佐剂活性相容或部分相容，导致产生和表达细胞因子，例如通信分子如CD86。CD86在树突细胞(DC)和淋巴细胞群之间传递信息，导致抗原特异性应答，缺少它(例如在新生儿或老年人中)阻碍了免疫应答。应注意的是，本发明人发现，级分QHA(BBE和KGI 2中的组分)和QHC(KGI 1和KGI 2中的组分)活化并分化具有固有和获得性未发育或不完全分化之免疫系统的新生儿的免疫应答(Hu等2004，Morein&Hu 2007)。通过凋亡引起癌细胞杀伤的受体存在于KGI颗粒上，但未在BBE颗粒上观察到。但是，不能排除BBE引起其它癌细胞的凋亡。不能排除，癌细胞杀伤受体本身或与另一受体组合后可能导致副作用。特别地，必须考虑到，存在物种差异使得受体活性或受体活性组合导致副作用。期望产生具有解决这些问题能力的系统，KGI和BBE的组合带来了这种可能性。

因此，KGI对细胞的杀伤是受体介导的，因为此作用可被BBE阻断。KGI和BBE的共同(阻断)受体被认为与介导仅含有皂苷级分QHC的KGI 1杀伤U937细胞的受体不同。否则，BBE也应为在这些实验中所用的U937癌细胞杀伤剂。BBE中的活性物质是QHA。当与QHC存在于同一颗粒中时(命名为KGI 2)，它通过稀释“QHC中的杀伤受体”来降低细胞杀伤作用，或者改变结构，导致细胞杀伤中起作用的配体与受体之间的亲和力更低。相反，在不同颗粒中，存在该共同受体的阻断。

本发明皂苷制备物的使用导致产物具有提高的耐受性、提高的生物利用度免疫原性。所述制备物可用于方法中以调整免疫原性，包括提高对炎性反应、超敏反应和变态反应的控制。此调整可以是物种依赖性的，并且可影响毒性、耐受性和免疫原性。

已经发现，当将包含至少一种亲水皂苷(例如来自Quil A的级分A)的含脂质颗粒(例如BBE颗粒)混合物与包含至少一种疏水皂苷(例如来自Quil A的级分C)的含脂质颗粒(例如KGI 1、KGI 2和KGI 3)一起使用时，获得了协同抗癌作用。

所述至少一种亲水皂苷可以是Quil A的级分4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15中的一种或多种，尤其是EP 0 3632 279 B2中所述的级分7、8、9、10、11、12、13和14以及Quil A的级分A或粗制Quil A。

所述至少一种疏水皂苷可以是一种或多种在例如来自南美皂皮树之皂苷的三萜类化合物糖苷配基的4位含有脂肪酰基链的皂苷，例如Quil A的级分C和B或来自级分A和B之间区域的级分，以及EP 0 3632279 B2中所述的级分15、16、17、18、19、10和21，级分17和18在此尤其适用。

所述用于此协同作用的含脂质颗粒可选自免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质颗粒、脂质体和posintro。

可使用任何比例的亲水和疏水皂苷，例如南美皂皮树皂苷的亚片段。同样，可使用南美皂皮树不同亲水和疏水皂苷亚片段的任何组合。因此，一种、两种或更多种亲水和疏水皂苷(例如南美皂皮树皂苷的亚片段)可各自整合进物理上的同一含脂质颗粒或物理上分离的含脂质颗粒。

可使用不同含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物、免疫刺激复合物基质复合物、脂质体或posintro)之间基于其亲水皂苷(例如级分A)和疏水皂苷(例如南美皂皮树级分C)含量的任何重量百分比组合。所述混合物可包含0.1比99.9％(重量)、5比95％(重量)、10比90％(重量)、15比85％(重量)、20比80％(重量)、25比75％(重量)、30比70％(重量)、35比65％(重量)、40比60％(重量)、45比55％(重量)、40比60％(重量)、50比50％(重量)、55比45％(重量)、60比40％(重量)、65比35％(重量)、70比30％(重量)、75比25％(重量)、80比20％(重量)、85比15％(重量)、90比10％(重量)、95比5％(重量)的包含亲水皂苷(例如南美皂皮树的级分A)的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物)，以及在每个区间中补足至100％的包含疏水皂苷(例如南美皂皮树的级分C)的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物)，根据免疫刺激复合物中总亲水和疏水皂苷(例如南美皂皮树的级分A和C)含量来计算。这适用于同时包含亲水和疏水皂苷的含脂质颗粒或者仅仅包含亲水或疏水皂苷的含脂质颗粒的混合物。

因此，含脂质颗粒可包含75％至99.5％(重量)的亲水皂苷(例如Quil A的级分A)和0.5％至25％(重量)的疏水皂苷(例如Quil A的级分C)；80％至95％(重量)的亲水皂苷和5％至20％(重量)的疏水皂苷；85％至90％的亲水皂苷和10-15％的疏水皂苷，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、96％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％(重量)的亲水皂苷(例如级分A)和0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％(重量)的疏水皂苷(例如级分C)。

上述所有区间可用于施用给任何类型的人或动物物种的制备物中南美皂皮树任何级分的任何组合。可向其施用本发明制备物的动物物种的实例有陪伴动物例如猫、狗、马、鸟类(如鹦鹉)、有经济意义的物种例如牛(如牛科物种)、猪、绵羊、山羊。优选将高于50％(重量)的级分C与任何其它级分组合使用，尤其与级分A组合使用。因此，可使用50.5-99.5％(重量)的级分C和0.5-49.5％(重量)的级分A。

当如本文所述制备时，南美皂皮树的级分A、B和C各自代表具有可定义性质的化学上紧密相关的分子类别或家族。获得它们的色谱条件是使得批次之间在洗脱谱和生物活性方面的再现性高度一致。

含脂质颗粒中的抗原

含脂质颗粒(例如脂质体、posintro、免疫刺激复合物、免疫刺激复合物基质、BBE和/或KGI)可包含整合进所述颗粒的、与所述颗粒相偶联的或者与所述含脂质颗粒相混合的癌抗原。这些癌抗原可用于引起抗癌免疫反应。

所述肿瘤抗原可以是进行治疗的肿瘤类型，或者所述含脂质颗粒(例如KGI)在杀伤肿瘤细胞后可导致肿瘤抗原的释放，并通过交叉呈递到旁观者抗原呈递细胞(APC)而导致或增强抗肿瘤免疫应答的起始。BBE还可含有所选择的肿瘤抗原并起始对所整合的、共施用的或自发存在(例如通过KGI颗粒杀伤肿瘤细胞释放出的)的肿瘤抗原的免疫应答。

含有抗原的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物)和不含抗原的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物基质)都可根据本发明使用。同时包含抗原的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物)主要用于针对已形成癌细胞的活性。根据一个实施方案，含抗原的含脂质颗粒(例如免疫刺激复合物基质)可含有至少一种癌抗原。根据另一个实施方案，它们不含有癌抗原。

掺入免疫刺激复合物中的免疫原还可以与免疫刺激复合物基质相关联，并可以是任何可在个体中(例如但不限于人或其他动物)诱导免疫反应的化学实体，所述反应包括但不限于针对细菌、病毒、支原体或其它微生物的体液和/或细胞介导的免疫反应。所述特异性免疫原可以是蛋白质或肽、碳水化合物、多糖、脂多糖或脂肽；或者可以是它们任意组合。

特别地，所述特异性免疫原可包括天然蛋白质或蛋白片段，或者合成蛋白或蛋白片段或肽；它还可包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、核蛋白、核肽；它可包括肽-肽缀合物；它可包括重组核酸表达产物。

这些免疫原的实例描述于EP 0 109 942 B1，包括但不限于能够引发针对病毒或细菌性肝炎、流感、白喉、破伤风、百日咳、麻疹、腮腺炎、风疹、脊髓灰质炎、肺炎球菌、疱疹、呼吸道合胞病毒、血友病流感、衣原体、水痘-带状疱疹病毒、狂犬病或人免疫缺陷病毒的免疫应答的那些。

所述抗原可掺入免疫刺激复合物中或者偶联到免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质或者与免疫刺激复合物和/或免疫刺激复合物基质混合。可使用这些免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质的任何混合物。如EP 9600647-3(PCT/SE97/00289)所述，可使用一种或多种抗原，并可使用运输抗原(transporter antigen)和乘客抗原(passengerantigen)。

佐剂

所述含脂质颗粒可用作其它组分的递送系统。可在所述含脂质颗粒中递送或与之混合的一类这种成分是佐剂。因此，除皂苷之外的其它佐剂可被整合到所述含脂质颗粒中、偶联到所述颗粒或者与其混合。佐剂效应考虑用在肿瘤治疗中，并且正在开发作为治疗剂，例如佛波醇酯、维生素A2和维生素D3。

本发明的颗粒可含有除皂苷之外的其它免疫刺激和增强组分，例如脂多糖(LPS)、脂质A、CTB、CTA或CTA1-DD。BBE和KGI还可含有其它癌细胞杀伤剂或细胞毒性物质例如霍乱毒素(CT)或其级分、热不稳定大肠杆菌毒素(LT)或其亚级分。

另外，上述所有类型的皂苷均可用作这种其他佐剂。

溶液或悬液还可包含至少一种下述佐剂：无菌稀释剂例如注射用水、盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂，抗菌剂例如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如乙二胺四乙酸，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的物质例如氯化钠或葡萄糖。胃肠外制备物可封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量容器中。

其它可掺入免疫刺激复合物或免疫刺激复合物基质中的佐剂实例是任何具有所需免疫调节作用的天然或合成的佐剂，例如胞壁酰基二肽(MDP)衍生物，例如脂肪酸取代的MDP、MDP的苏氨酰类似物；DDA、聚阴离子例如硫酸葡聚糖、脂多糖例如皂苷(除了Quil A之外的)。Future prospects for vaccine adjuvants(Warren和Chedid 1988)；“Characterisation of a non-toxic monophosphoryl lipid A”(Johnson，Tomai等1987)；“Developmental status of syntheticimmunomodulators”(Berendt和Ives 1985)；“Immunopotentiatingconjugates”，(Stewart-Tull 1985)，(Morein等2007)。

抗癌剂

含脂质颗粒还可用作抗癌剂的递送系统。它们可在所述含脂质颗粒中递送或与其混合。

KGI和BBE也可用作其它癌症药物(特别是通过其它机制进行杀伤的)的递送系统。KGI和BBE有助于针对活化-分化进行沉默杀伤，导致凋亡。其它治疗剂具有其它癌细胞杀伤作用。所述组合会确定地避免使得癌细胞发生回复而对治疗产生抗性。

其它的抗癌剂优选选自所谓的铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合物、抗肿瘤长春碱类、抗肿瘤核苷衍生物、氮芥或亚硝基脲烷化剂、抗肿瘤蒽环类衍生物、曲妥珠单抗和抗肿瘤鬼臼毒素衍生物。

在本文中术语“铂配位化合物”用来指任何肿瘤细胞生长抑制性铂配位化合物，其提供离子形式的铂。优选的铂配位化合物包括顺铂、卡铂、氯(二亚乙基三胺)-铂(II)氯化物；二氯(亚乙基二胺)-铂(II)；二胺(1，1-环丁烷二羧酸)-铂(II)(卡铂)；螺铂；异丙铂；二胺(2-乙基丙二酸)-铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)丙二酸铂(II)；(4-偏苯三酸(carboxyphthalo))(1，2-二氨基环己烷)铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸)铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)-顺式-(丙酮酸)铂(II)；和(1，2-二氨基环己烷)-草酸-铂(II)；奥马铂和四铂。

顺铂是市售的，例如作为以水、无菌盐水或其它合适载体重建的粉末形式的来自Bristol Myers Squibb Corporation的商品名Platinol。其它铂配位化合物及其药物组合物是市售的和/或可通过常规技术制备的。

紫杉烷化合物可以是来自Bristol Myers Squibb的以商品名Taxol销售的化合物，多西紫杉醇可以商品名Taxotere从Rhone-PoulencRorer购得。化合物和其它紫杉烷化合物可以常规方式(例如EP 253738、EP 253739和WO 92/09589中所述)或通过其类似方法制得。

喜树碱化合物包括伊立替康和拓扑替康。伊立替康可以例如商品名Campto从Rhone-Poulenc Rorer购得，并且可以例如根据欧洲专利说明书No.137145所述或其类似方法制得。拓扑替康可以例如商品名Hycamtin从SmithKline Beecham购得，并且可以例如根据欧洲专利说明书No.321122所述或其类似方法制得。其它喜树碱化合物可通过常规方式制得，例如通过上文针对伊立替康和拓扑替康所述方法的类似方法。

抗肿瘤长春碱类包括上文提及的长春碱、长春新碱和长春瑞滨。长春碱是市售的，例如Eli Lilly and Co产的商品名为Velban的注射用硫酸盐形式，并且可以根据例如德国专利说明书No.2124023中所述或其相似方法制备。长春新碱是市售的，例如Eli Lilly and Co产的商品名为Oncovin的注射用硫酸盐形式，并且可以根据例如德国专利说明书No.2124023中所述或其相似方法制备。长春瑞滨是市售的，例如GlaxoWellcome产的商品名为Navelbine的注射用酒石酸盐形式，并且可以根据美国专利说明书No.4307100中所述或其相似方法制备。其它抗肿瘤长春碱类可通过常规方式制备，例如通过上文针对长春碱、长春新碱和长春瑞滨所述方法的类似方法。

抗肿瘤核苷衍生物包括上文提及的5-氟尿嘧啶、吉西他滨和卡培他滨。5-氟尿嘧啶是广泛市售的，其可根据例如美国专利No.2802005中所述制备。吉西他滨是市售的，例如Eli Lilly产商品名为Gemzar，并且可根据例如欧洲专利说明书No.122707中所述或其相似方法制备。

卡培他滨是市售的，例如Hoffman-La Roche产商品名为Xeloda的，并且其可根据例如欧洲专利说明书No.698611所述或其相似方法制备。其它抗肿瘤核苷衍生物可用常规方式制备，例如通过与上文针对卡培他滨和吉西他滨所述方法相似的方法。

氮芥化合物包括环磷酰胺和苯丁酸氮芥。环磷酰胺是市售的，例如Bristol-Myers Squibb产商品名为Cytoxan，并且可根据例如英国专利说明书No.1235022中所述或其类似方法制备。苯丁酸氮芥是市售的，例如Glaxo Welcome产商品名为Leukeran，并且可根据例如美国专利说明书No.3046301中所述或其类似方法制备。本发明使用的优选亚硝基脲化合物包括上文提及的卡莫司汀和洛莫司汀。卡莫司汀是市售的，例如Bristol-Myers Squibb产商品名为BiCNU，并且可根据例如欧洲专利说明书No.902015中所述或其类似方法制备。洛莫司汀是市售的，例如Bristol-Myers Squibb产商品名为CeeNU，并且可根据例如美国专利说明书No.4377687中所述或其类似方法制备。

抗肿瘤蒽环类衍生物包括上文提及的柔红霉素、多柔比星和伊达比星。柔红霉素是市售的，例如Bedford Laboratories产商品名为Cerubidine的盐酸盐形式，并且可根据例如美国专利说明书No.4020270所述或其类似方法制备。

多柔比星是市售的，例如Astra产的盐酸盐形式，并且可根据例如美国专利说明书No.3803124所述或其类似方法制备。伊达比星是市售的，例如Pharmacia&Upjohn产商品名为Idamycin的盐酸盐形式，并且可根据例如美国专利说明书No.4046878中所述或其类似方法制备。其它抗肿瘤蒽环类衍生物可以常规方式制备，例如通过上述针对柔红霉素、多柔比星和伊达比星所述方法的类似方法。

曲妥珠单抗可以商品名Herceptin从Genentech购得，并且可根据美国专利说明书No.5821337或PCT专利说明书WO 94/04679和WO92/22653中所述获得。

抗肿瘤鬼臼毒素衍生物包括依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷是市售的，例如Bristol-Myers Squibb产以商品名VePesid的，并且可根据例如欧洲专利说明书No.111058所述或其类似方法制备。替尼泊苷是市售的，例如Bristol-Myers Squibb产以商品名Vumon的，并且可根据例如PCT专利说明书No.WO 93/02094所述或其类似方法制备。其它抗肿瘤鬼臼毒素衍生物可用常规方式制备，例如通过上述针对依托泊苷和替尼泊苷所述方法的类似方法。

粗制形式的皂苷或其级分(例如上文所述那些)也可以游离形式(即不整合进含脂质颗粒)用作抗癌剂。这些抗癌化合物可以与含脂质颗粒(例如脂质体、免疫刺激复合物和/或免疫刺激复合物基质和posintro)混合、偶联或整合进其中。

在整合时，如果它们是疏水的，则是合适的。如果不是，那么可以如EP 242380所述将疏水基团偶联到它们上。

非疏水化合物尤其是蛋白质或肽可通过将疏水基团偶联于其上而获得疏水性。

可偶联到非疏水化合物的疏水基团是直链、支链、饱和或不饱和的脂肪链(优选含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碳原子)，或者疏水氨基酸或肽或其它疏水结构例如类固醇。疏水结构的长度适应于所述蛋白质的尺寸和性质。例如，可以适当地使具有10-15个氨基酸的肽(手足口病病毒)在氨基或羧基端带有两个酪氨酸。分子量为70000道尔顿的蛋白质需要约20个疏水氨基酸。根据经验进行测试。因此，使用尤其1至20个氨基酸的肽，优选1、2、3、4、5个氨基酸，尤其是选自Trp、Ile、Phe、Pro、Tyr、Leu、Val，尤其是Tyr；胆固醇衍生物例如胆酸、熊去氧胆酸(ursodesoxycholine acid)。

这些疏水基团必须和可与非疏水蛋白质或化合物偶联的基团(例如羧基、氨基、二硫基、羟基、巯基(sulohydryl)和羰基例如醛基)连接。

可偶联的疏水基团优选选自甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、己烷、庚烷、辛烷的羧基、醛基、氨基、羟基和二硫基衍生物，以及含Cys、Asp、Glu、Lys的肽，优选辛醛和Tyr.Tyr.Tyr-Cys，-Asp或-GIu。取决于待溶解的物质，带有可偶联基团的疏水基团必须在例如上文所述增溶剂和去污剂或盐酸、67％(体积)乙酸、苛性液、氨水的帮助下溶解于水中。然后，在不使所述物质沉淀的情况下调节pH到中性，这是确保不获得使疏水基团所偶联蛋白质变性的pH值。脂质可增强溶解性。

可将疏水分子以10∶1至0.1∶1(优选1∶1)的摩尔比加入非疏水化合物中。

带有作为偶联分子之羧基的疏水基团可通过水溶性碳二亚胺或复合酸酐偶联于蛋白质。在第一种情况下，以碳二亚胺在pH 5下活化羧基，并与溶解于高磷酸盐含量的pH 8缓冲液中的蛋白质混合。在后一情况下，在二噁烷或乙腈中的三乙胺存在下使羧基化合物与氯甲酸异丁酯反应，在pH 8至9条件下将所得酸酐加至所述蛋白质中。还可以用肼将羧基转化成酰肼，其与蛋白质中高碘酸盐氧化糖单元中的醛和酮一起产生腙键。

亚硝酸中的氨基可以在低温下转变成重氮盐，其与Tyr、His和Lys产生偶氮键。

琥珀酸酐中的羟基可转变成半琥珀酸衍生物，其可作为羧基被偶联。

醛基可与蛋白质中的氨基反应产生希夫碱

一些偶联基团和方法描述于Journal of Immunological Methods(Blair和Ghose 1983)，(Conradie，Govender等1983)，Methods inEnzymology(Ghose，Blair等1983)，和Analytical Biochemistry(Davis和Preston 1981)，其通过引用并入本文。

这样产生的已含有疏水基团的蛋白质、肽或化合物接着与糖苷络合(complex bound)，如a)中所述，但是可省略用于除去细胞碎片的纯化步骤。

包含了疏水基团的亲水蛋白质可通过使该蛋白质温和变性(即约2.5的低pH，3M尿素或高于70摄氏度的高温)而使疏水基团可接近，从而变得疏水。此蛋白质可以是免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。所述免疫球蛋白可用作抗独特型抗体。如(b)中所述纯化获得所述蛋白质，然后如(a)中所述与糖苷络合，可省略用于除去细胞碎片的纯化步骤。

用于含脂质颗粒的靶向分子

含脂质颗粒可另外包含癌症靶向分子，例如来自癌细胞的表面抗原、病毒表面抗原和流感抗原。

本专利申请证明，含脂质颗粒例如KGI和BBE颗粒在生理低剂量下杀伤多种不同癌细胞或抑制其生长。在免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质制剂中用作佐剂的这些颗粒类型还表现出良好的生物利用度以及针对淋巴系统特别是树突细胞的靶向能力(参见Morein等2007)。为了进一步提高体内靶向作用，可通过多种方法掺入靶向分子。可通过疏水相互作用掺入来自微生物膜的表面分子，如Morein等(1984)和EP 242380中最先描述的。可以掺入其他分子，例如通过rDNA技术产生的合成产生的分子，如WO 2002/080981和WO2004/030696所述。

这些靶向分子包括例如靶向肺癌类型的病毒(例如与呼吸道有亲和力的流感和呼吸道合胞病毒)包膜蛋白，或者CTA1DD，其为霍乱毒素A亚基的A1部分，其掺入KGI或BBE制剂中，如Lycke N.(2004)和Mowat等(2001)所述。CTA1DD是对三个主要组分推理性设计出的，每个组分促成互补的作用。CTA1是霍乱毒素的酶活性亚基，其通过与A2和B亚基分离而转变为非毒性。与来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的DD相融合，其靶向B细胞。因此，它尤其适于B细胞淋巴瘤。它已经被掺入到免疫刺激复合物中，用于靶向B细胞以得到增强的免疫刺激。在此免疫刺激复合物中，除了靶向作用之外，它还具有活化和分化作用，补充了免疫刺激复合物或KGI或BBE颗粒的作用。纯靶向作用从来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的DD亚基分子获得，是作为有可能与其它治疗剂互补的BBE或KGI靶向部分之CTA1的替代物。更一般地说，如EP 0 109942 B1、EP 0 242 380 B1和EP 0 180 564 B1所述，可将单克隆抗体和多克隆抗体掺入含脂质颗粒例如KGI和BBE颗粒中。

其它添加剂

本发明的组合物还可包含可药用载体、稀释剂、赋形剂或添加剂。

合适的可药用载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂等等。这些介质和试剂用于药物活性物质中的应用是本领域公知的，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA中有描述。除了任何与所述活性成分不相容的常规介质或试剂之外，其在本发明药物组合物中的用途均考虑在内。所述组合物中还可掺入补充性的活性成分。

药物形式

所述含脂质颗粒可通过任何途径施用给人和动物。可使用胃肠外途径。本文使用的术语“胃肠外”包括皮下注射、静脉内、肌内、真皮内的注射或输注技术，无针注射-喷射注射以及经口、气雾剂施用。

各自基本上包含至少一种类型皂苷的本发明含脂质颗粒可在相同施用部位或在不同施用部位在相同或不同时间在混合形式的一种组合物中施用或者在不同组合物中分开施用。可在不同免疫刺激复合物和基质复合物中以及在不同组合物中使用南美皂皮树的不同级分。

一般而言，本发明的含脂质颗粒以药学有效量施用。实际施用的颗粒量一般由医生根据相关情况来确定，所述情况包括待治疗的病症、所选施用途径、所施用的实际化合物以及个体患者的年龄、体重和反应、患者症状严重程度等等。

用于人的剂量可根据所包含的其它化合物有所不同。考虑到治疗的持续时间，剂量可以是每天从＜50μg至1mg或更多。为了最佳耐受，含有20％KGI和80％BBE的混合物的制剂在以50μg剂量施用给18g小鼠时不引起副作用，因此如果需要可使用非常高的剂量。

药盒

因此，本发明还涉及包含至少两部分的药盒，其中一部分包含含有至少一种具有癌细胞杀伤作用的疏水皂苷级分的含脂质颗粒；另一部分包含含有至少一种刺激并调节免疫应答(例如抗体产生和细胞介导的免疫)的亲水皂苷级分的含脂质颗粒。

所述包含含有至少一种疏水皂苷级分的含脂质颗粒的部分还可另外包含含有至少一种亲水皂苷级分的颗粒。

本发明的组合物和药盒还可包含除南美皂皮树级分之外的至少一种其它佐剂。这些佐剂可与免疫刺激复合物和/或免疫刺激复合物基质相混合，或者整合到所述复合物中，或者本身以游离形式施用。

治疗方法

在此说明书通篇及权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或其变化例如“含有”或“包括”应理解为暗示包含所指的成分或成分组，但是不排除任何其它成分或成分组。

本文所提及的所有出版物以援引的形式并入本文。现在通过下述非限制性实施例描述本发明。

实施例1

KGI 1(QHC)、KGI 2(703-基质ISCOM)、KGI 3(所有QuilA级分，包括QHA至QHC)和BBE(QHA)的制剂

图1.1中显示南美皂皮树皂苷结构，其显示QHA级分缺少QHC中存在的酰基链。KGI 1颗粒基于图1.2右侧区域显示的QHC。此皂苷级分比QHA更疏水并且更具溶胞效应，QHA是图1.2中反向色谱右侧区域中BBE中的碱性皂苷。

KGI可以由确定的南美皂皮树皂苷级分或者若干南美皂皮树皂苷级分的混合物配制而成。因此，KGI 1由QHC级分制得，KGI 2由QHA(7个部分)和QHC(3个部分)的混合物制得，KGI 3是未分离的南美皂皮树级分混合物。同样，QHB可转变为KGI癌症杀伤颗粒。BBE由QHA制得。比例可以改变，以适应期望的杀伤特性或更低的细胞毒性特性，以增强分化特性。

结果

KGI和BBE颗粒的配方描述于上文材料和方法，其基于配制ISCOM的工作(Morein，Sundquist等1984)以及之后ISCOMMATRIX(Morein等2007)。30-40nm直径的常规笼样ISCOM结构在电子显微镜(electron microscopy，EM)下可见(图1.3)。超速离心之后，通过EM观察到含有笼样ISCOM结构的级分，其具有约20S的沉降系数(参见材料和方法)。

结论

形成了具有不同药物作用但形态相同的颗粒，其易于通过EM观察并通过梯度离心来确定，所述梯度离心的使用如下述实施例的描述。这些颗粒可用于改变免疫应答/癌症杀伤特性，以及作为癌症治疗领域中多种分子的递送颗粒。

实施例2

对红细胞(RBC)和有核细胞的溶胞效应

众所周知，皂苷具有细胞溶胞效应，因此，已经将其作为癌症治疗的候选而进行了测试(Wang，Z.P.2005)。HPLC分级后的南美皂皮树皂苷特征谱显示于图1.1。在本发明中，用于制剂KGI 1、2和3颗粒中的QHC由于脂肪酰基链而具有高溶胞效应(图2.1)。相反，用于制剂BBE、KGI 2和3颗粒中的QHA缺少脂肪酰基链，因此基本上没有溶胞效应。RBC用于测量物质对其细胞膜的溶胞效应，该作用造成的损害导致血红蛋白泄漏进悬液，其易于由分光光度法所测定(参见材料和方法)。所述方法是灵敏且可再现的。物质对有核细胞细胞膜的溶胞效应必须用不同的方法进行测试。我们使用了台盼兰染色。游离的KGI具有皂苷的特性，其通过与细胞膜中的胆固醇发生相互作用产生6nm的六角形孔而具有溶胞效应。染料通过细胞膜上的这些孔进入受损的细胞。这些孔会立刻造成细胞溶解并杀伤该有核细胞。因此，使用了在数分钟(例如10分钟)内造成细胞立即死亡的溶解性游离皂苷浓度来将该溶胞效应与需要数小时或数天的其它细胞杀伤机制(例如凋亡)区分开来。在颗粒化的KGI中，皂苷与胆固醇强力结合，这阻止了KGI中的皂苷与细胞膜中的胆固醇发生相互作用，从而阻止了孔的形成和溶胞效应。

将有核癌细胞U937和来自人血液的正常嗜中性粒细胞接触游离的和颗粒化形式的KGI和BBE。

结果

溶血分析的结果综述于表2.1中。作为BBE颗粒原材料的游离BBE在高达50μg/ml的剂量下不产生溶胞效应，所述剂量类似于

等所报告的QHA剂量(Ronnberg，Fekadu等1995)。所述BBE颗粒在高达100μg/ml的剂量下不使RBC发生溶胞。

作为游离KGI 1原材料并且存在于颗粒化KGI 1中的QHC在5μg/ml的浓度下使RBC发生溶胞。含皂苷级分(QHA、B和C)的游离KGI 3在20μg/ml的浓度下使RBC发生溶胞。KGI 3颗粒在100μg/ml的浓度下不导致RBC发生溶胞(参见表2.1)。

表2.1、多种游离形式南美皂皮树皂苷以及颗粒化形式(即KGI和BBE颗粒)的细胞毒性和溶血活性

^＊BBE的原材料；^＊＊KGI 1的原材料；^＊＊＊KGI 3的原材料

在表2.2中显示了对接触KGI制剂10分钟并且随后用台盼兰染色之细胞的溶胞效应。用于处理癌细胞的最高浓度是50μg/ml，在此处理时间内有核细胞不溶胞也不被杀伤。相反，游离形式溶解了有核细胞，对于嗜中性粒细胞来说是在17μg/ml下，对于U937癌细胞来说是在27μg/ml下。在接触颗粒化KGI 1的10分钟内所述有核细胞均未被杀伤，甚至一小时后亦如此(未显示)。

表2.2、通过台盼兰染色检测的游离KGI 1和颗粒化KGI 1对U937癌细胞及嗜中性粒细胞的溶胞效应。所述细胞与KGI制剂一起孵育10分钟。

讨论和结论

重要的是，用于癌症治疗的化合物相对于正常细胞而选择性杀伤癌细胞，并且考虑到在体内靶位点获得高浓度的困难，所述癌细胞杀伤在低剂量下有效。溶胞效应是游离形式皂苷的特征，并且不是用于癌症杀伤的优选细胞毒性作用。另外，游离形式是亲脂性的，并在施用部位与细胞膜相互作用，造成局部细胞破坏以及一部分所述皂苷滞留在该部位。KGI和BBE颗粒在“生理”剂量下不溶解RBC或有核细胞的细胞膜。事实上，所测试的最高剂量(即50μg/ml)不导致溶胞或立即毒性作用，而非颗粒化(游离)形式的南美皂皮树皂苷在相当低的浓度下即导致溶胞的细胞毒效应。

游离形式的KGI在相当低的剂量下在10分钟内溶解RBC并杀伤有核细胞。如实施例7中所示，KGI 1在2μg/ml或更低(甚至低于游离皂苷形式的溶胞或膜破坏浓度)的低生理剂量下杀伤癌细胞。甚至50μg/ml高剂量的KGI 1也需要数小时才能杀伤癌细胞，强烈地表明溶解膜破坏作用之外的另一种机制参与了癌细胞杀伤。应注意，癌细胞和正常嗜中性粒细胞的细胞溶胞效应是类似的。因此，一个极大的优点是，颗粒化形式避免了快速溶解性无差别地杀伤正常细胞和癌细胞。另外，溶胞效应通过使注射的大量化合物滞留在注射部位而造成局部副作用和较低的生物利用度。因此，这是使得南美皂皮树皂苷颗粒用于癌症治疗的创新性特征。因此，颗粒化形式还是一种药物递送系统。

实施例3

KGI 1选择性杀伤癌细胞

通过Alamar blue方法进行测量，此实施例证明了KGI 1颗粒相对于正常细胞而言选择性杀伤癌细胞。选择恶性成单核细胞细胞系(U937)作为肿瘤细胞与正常细胞(即单核细胞来源的树突细胞，DC)进行比较(参见材料和方法)。KGI 1中的活性皂苷成分是从来源于南美皂皮树的市售Quill A中分离的QHC(游离KGI 1)。游离KGI(即级分QHC)相比于级分QHA(即游离BBE)是高度疏水的，如图3.1所示(Quill A的HPLC色谱)。QHC不同于QHA的是QHA中缺乏酰基链，这解释了QHC的较高疏水性及其溶胞效应(图3.2)。

肿瘤细胞：使得自Academic hospital Uppsala的成单核细胞细胞系(THP-1、U937和U-937-1)和骨髓瘤细胞系(LP-1和Jurkat)接触KGI 1。

结果

如材料和方法中所述制备的KGI 1杀伤上文列出的和表3.1中的肿瘤。五种列出的肿瘤细胞系被KGI 1所杀伤，LC50浓度为0.8-10μg/ml(表3.1和图3.1)，而正常DC的LC50是24.3(图3.2)。因此杀伤正常细胞需要浓度高30倍的KGI 1。

表3.1

皂苷制剂对癌细胞或正常细胞生长的抑制

讨论和结论

本发明人鉴定了在颗粒化形式中(KGI 1)选择性杀伤肿瘤细胞的南美皂皮树级分。在这种情况下，成单核细胞U937在比杀伤正常细胞所需浓度低30倍的浓度下被杀伤。可以将高杀伤作用定位在南美皂皮树皂苷反相谱的疏水级分中。相反，更亲水的级分QHA(图1.1和1.2)在相关剂量下不杀伤癌细胞或正常细胞。

因此，KGI 1是癌症治疗的候选物，在下述实施例中进一步证明。

实施例4

BBE对有核细胞无毒性

将反相谱(图1.1和1.2)中相对亲水的级分QHA(游离BBE)掺入BBE颗粒中，测试其对癌细胞或正常细胞的杀伤作用，发现没有细胞毒性(图4.1和4.2)。

结果

在相关剂量下(即所测试的高达1920μg/ml的浓度下)BBE颗粒不杀伤癌细胞(图4.1)或正常细胞(图4.2)。

讨论和结论

此实施例证明BBE颗粒基本上不具有细胞毒性，即被正常细胞和肿瘤细胞良好地接受。BBE颗粒在高至1920μg/ml的任何测试浓度下都不杀伤肿瘤细胞或正常细胞(图4.1和4.2)。一个区别是BBE中的皂苷缺少脂肪链，这也解释了游离形式的活性物质QHA的低溶胞效应(参见实施例2，表2.1和2.2)。考虑到其调节作用(例如通过细胞因子的产生进行调节)，BBE颗粒可用于缓和或调节KGI颗粒的活性。

实施例5

BBE阻断KGI的细胞杀伤作用

此实施例显示BBE阻断KGI 1的杀伤作用。最显著的区别是KGI1的皂苷具有酰基链，而BBE的皂苷缺乏该链(详细信息参见实施例1、2和4)。

结果

将77μg/ml恒定浓度的KGI 1与递增浓度的BBE一起孵育，并施加给U937癌细胞。在10∶1(KGI 1∶BBE)的比例下，KGI 1的细胞毒性作用被阻断。图5.1中曲线揭示，阻断作用很可能是通过受体介导的。

考虑到针对U937细胞的LC50仅为0.8μg/ml，由于我们所使用的恒定高KGI 1浓度为77μg/ml，因此阻断作用是有效的。

讨论和结论

本发明人鉴定了KGI 1颗粒形式中选择性杀伤肿瘤细胞的物质。他们已经鉴定出阻断KGI 1对肿瘤细胞和正常细胞杀伤作用的另一种配制成BBE颗粒的物质(未显示)。即，建立了一种肿瘤杀伤系统，如果需要其可有效地缓和毒性。应注意，此实施例中的活性物质QHC和QHA存在于被称为KGI 1和BBE的不同颗粒中。促进癌细胞死亡的阻断受体很可能不同于促进正常细胞和癌细胞活化和分化的受体。

实施例6

KGI和BBE是递送系统，在正常细胞和癌细胞中分析了一种或两种不同颗粒中活性物质的作用。

实施例5显示，独立的BBE颗粒中的活性物质QHA阻断了含另一种活性皂苷(即QHC)的KGI 1的细胞毒性作用。此阻断作用有可能是由于了阻断一种或多种受体。

KGI 2含有两种活性皂苷物质：KGI 1的活性物质QHC和BBE的活性皂苷QHA。此实施例展示了同一颗粒中的这两种成分组合并缓和了每种成分的作用。此实施例还显示，在分开的颗粒中共施用的相同成分缓和并调节所接触细胞的应答。KGI 2样颗粒具有比例为7∶3、7.5∶2.5或9.5∶0.5的不同QHA/QHC比，如针对KGI 2(703)所述用不同起始材料比制备的。通过AlamarBlue测量细胞存活(参见材料和方法)。

在图6.2所示的实验中，KGI 2(703)与U937癌细胞一起孵育48小时，并类似地与人未成熟DC一起孵育(图6.3)。

正常哺乳动物细胞有多项维持动物或人生命的任务。一种DC细胞群来源于单核细胞。在此实施例中，用IL-4和GMC-SF处理了人外周血细胞以获得单核细胞来源的未成熟DC细胞群，其得自3Hbiomedical(Uppsala，Sweden)。此实施例所使用的详细信息参见材料和方法。此实施例证明，多种KGI和BBE制剂将未成熟人DC活化至成熟，并表达DC标志物CD86，其为活化DC与淋巴细胞传递信息以使其分化并活化成为效应细胞的分子。

不同的KGI和BBE制剂有：仅含有KGI 1的KGI 1，在同一颗粒中从70％QHA(BBE的原材料)和30％QHC(KGI 1的原材料)制备的KGI 2，含有Quill A形式的南美皂皮树皂苷级分混合物的KGI3，仅BBE以及由80％BBE颗粒和20％KGI 1颗粒组成(即每种化合物各自在独立的颗粒中)的BBE+KGI 1制剂。初步研究显示，治疗浓度应为对KGI 1、KGI 2和KGI 3而言是1μg/ml细胞培养液，对BBE和BBE+KGI 1而言浓度应为10μg/ml。详细信息参见材料和方法。

结果

将具有7∶3、7.5∶2.5的不同QHA∶QHC级分比的KGI 2样制剂孵育2天，在20至100μg/ml的浓度下杀伤U937癌细胞。用QHA级分稀释活性QHC级分到0.5至9.5在48小时孵育时间内完全消除了细胞毒活性(图6.1)。这些结果应与实施例5中的结果相比较。

另一实验证明，QHA∶QHC比为7∶3的KGI 2(在同一颗粒中组合QHA和QHC皂苷级分)杀伤U937肿瘤细胞，LC50为18.7μg/ml(图6.2)，这是KGI 1的LC50的23倍。正常人DC的细胞死亡需要比U937癌细胞高44倍的KGI 2浓度，即LC 50是826μg/ml(图6.3)。

在表3.1中总结了通过Alamar Blue法测定的不同KGI颗粒对多种癌细胞的癌细胞杀伤作用，或者台盼兰测定的对人正常嗜中性粒细胞的杀伤作用。总体而言，可得到结论，若干不同癌细胞对KGI制剂敏感，甚至比U937细胞更敏感。本申请中的U937细胞更多地用作基础研究中的模型。

图6.4中显示了活化和分化活性。在1μg/ml低生理剂量的KGI 2显示最高比例的CD86阳性细胞(67.3％)，表明同一颗粒(即KGI 2颗粒)中KGI 1和BBE成分的协同作用。还显示了KGI和BBE颗粒是载体-递送颗粒，即KGI 2递送两种成分。

BBE与LPS诱导相同比例的CD86阳性细胞，而BBE+KGI 1制剂诱导65.8％。后两种制剂需要高于KGI 210倍的剂量，即10μg/ml。

讨论和结论

KGI 1、KGI 2和KGI 3样制剂是将不同特性的两种或可能更多种不同的成分相结合的递送系统。在此实施例中，结合了两种不同的特性，得到完全不同的癌杀伤作用。简单的说，如实施例4中所述的，将限制于不同实体(颗粒)的两种不同化合物(即KGI 1和BBE)混合后通过阻断缓和了活性。因为在同一颗粒中的不同成分无法实现阻断，所以将两种物质组合在同一KGI颗粒(KGI 2)中以稀释的形式降低了毒性，即降低了KGI 1配体的浓度。所述作用在癌细胞和正常细胞中均被记录到。尽管KGI 2对癌细胞的毒性作用相比于KGI 1颗粒降低许多倍，但是对正常人细胞(DC)的毒性与癌细胞(U937)的差值从30倍(KGI 1)增加到40倍(KGI 2)。可以想象，稀释作用是由较低亲和力造成的，因为配体-受体相互作用诱导的细胞杀伤数降低。细胞毒性作用很可能是由与介导阻断作用不同的配体-受体组合引起的。在KGI 2颗粒或其它类似颗粒中，有可能将BBE的调节能力与KGI 1的杀伤能力相结合，将LC50从KGI 1的0.8μg/m增加到KGI 2的18.7μg/ml，而仍保持或提高对癌细胞和正常细胞毒性之间的高差值，例如40倍差值。这很可能在体内具有临床意义。BBE的阻断作用使得KGI1的癌细胞杀伤作用线性降低，但是两种颗粒所引起的分化能力基本没有变化，如可从目前为止进行的实验中看出。这些发现的灵活性使得有可能将对癌细胞的毒性和活化-分化定制成具有程序性凋亡结局的正常化细胞行为。需要注意的是，两种制剂(即同一颗粒中两种物质或者两种物质在分开的颗粒中)都有可能具有临床价值。例如，KGI 1在过低的浓度下杀伤癌细胞，以至于可能阻碍其它特性(例如分化、活化癌细胞，以程序性细胞死亡(凋亡)为结局)，其可能对旁观者效应(bystandereffect，即对非直接接触的邻近细胞的效应)具有意义(参见实施例7)。例如，已经非常了解，在免疫系统中被杀伤的DC释放出交叉刺激邻近DC的成分。

与坏死引起的细胞死亡相比，凋亡(参见实施例7)对个体来说不那么剧烈，由此避免了在所治疗个体中导致疾病的细胞毒性作用。因此，癌细胞的凋亡在癌症治疗中十分有吸引力。在此背景下，可预计被杀伤的癌细胞在活性免疫增强成分(例如在含KGI和BBE颗粒中所包含的那些)的影响下释放可引发免疫保护的免疫原性组分。因此，KGI颗粒是一种提供了定制细胞死亡或整合其它具有多种抗癌活性之物质的可能性的递送系统。这些物质应优选地以其他原理发挥作用，例如紫杉醇靠破坏细胞骨架来杀伤细胞，或者维生素A或D依靠不同于KGI或BBE颗粒的机制促进分化。KGI颗粒显示出不限于此实施例中所用成分的递送能力。总之，游离形式或颗粒化形式的多种KGI或与其它化合物(例如BBE)组合的KGI相对于正常细胞而选择性地杀伤癌细胞(表3.1)。

KGI 1制剂活化-刺激癌细胞U937产生IL8并凋亡，而不是以坏死为特征的细胞死亡(参见实施例7)。其它KGI制剂(如KGI 2和3)需要高得多的浓度来杀伤正常和癌细胞，对正常细胞来说仍然有30至40倍的安全差值(参见实施例5和6)。在此实施例中，显示出高比例的正常未成熟DC被刺激成为表达CD86的成熟DC。更有趣的是，发现通过将活性化合物QHA或BBE与QHC(KGI 1中的皂苷成分)组合在同一颗粒中，记录到了协同作用，即1μg/ml低剂量的KGI 2诱导最高比例的CD86阳性细胞。单独使用时需要10μg/ml的BBE现以在KGI 2制剂中与0.2μg/ml活性KGI 1化合物相组合的0.8μg/ml细胞培养液的活性化合物浓度使用。这些活性成分都比每种化合物单独使用时所需的低得多。也就是说，在效果提高的KGI 2颗粒中，BBE化合物的浓度降低超过10倍，活性KGI化合物降低5倍。含多种南美皂皮树皂苷级分的KGI 3在此实施例中不诱导CD86表达，而是对其进行抑制。需要更多的实验来确认KGI 3是否对CD86表达有抑制作用。

总之，当KGI 2颗粒中的两种成分与细胞相互作用时，显示出通过人DC的成熟测得的意想不到的协同作用，强调了KGI和BBE颗粒作为通过受体靶向细胞之载体系统的有价值前景。因为提出KGI和/或BBE的癌症杀伤作用通过活化和分化来起作用，所以应该有可能对正常细胞进行分析。应注意，癌细胞之间的差异很大，因此提供靶向特性可以改变的癌细胞杀伤系统为癌症治疗提供了新的可能性。

实施例7

通过应用不同检测系统对KGI 1癌症杀伤作用进行分析

颗粒化形式KGI中的南美皂皮树皂苷以与正常细胞相比低30至40倍的浓度杀伤癌细胞(实施例3)。在此实施例中，通过多种方法分析癌细胞死亡，包括台盼兰染色、利用AlamarBlue法的酶代谢抑制、碘化丙锭染色显现的坏死性改变，以及通过Annexin V染色的凋亡，如材料和方法中的详细描述。所处理细胞的台盼兰染色提供了得以确定细胞数的信息，在多至9天中确定生存力(图7.1，7.2)。低剂量的KGI 1(2μg/ml)在较长时间后造成癌细胞死亡，而高剂量(25μg/ml)在较短时间内杀伤(图7.3)并引发更快的凋亡(图7.6)。在此实施例中，台盼兰方法测得的细胞死亡与细胞脱离细胞周期之后的程序性细胞死亡(即凋亡)相关。细胞周期是细胞复制的基础，其对保持在连续复制的细胞周期中的癌细胞来说至关重要。脱离细胞周期意味着细胞可能开始朝着生产(在此例中为产生细胞因子)(实施例10)方向活化，最终发展成如本实施例中所示的程序性细胞死亡。我们使用了胸苷激酶(TK)测试来表明所处理细胞是处于复制期(即细胞周期)中还是脱离了此周期(实施例9)并进入导致生产能力和最终凋亡的途径。

在下述实验中通过台盼兰染色法(参见材料和方法)分析KGI 1杀伤癌细胞U937的能力：

将U937细胞接种于含2μg/ml KGI 1的微滴定板中。在一组培养中，将所述细胞与KGI 1连续接触9天(图7.1)。每三天在含有相同浓度KGI 1的新鲜培养基中调节细胞数至1×10⁶个/ml，每一次都计算累计细胞数。

在第二组培养中，三天之后提供更换无KGI 1培养基而终止KGI处理(图7.2)。每次更换培养基时调节细胞数至1×10⁶/ml。计算累计的细胞数。将U937癌细胞接触25μg/ml高剂量的游离或颗粒化形式的KGI 1并如图7.3所示取样。用台盼兰对细胞染色，通过显微镜计算生存力。细胞生存力表示为活细胞相对于细胞对照的百分比。

为了比较细胞毒性，如图7.4中所示，使U937癌细胞接触2μg/ml低生理剂量的游离或颗粒化形式KGI 1。通过台盼兰对细胞染色。生存力表示为活细胞相对于细胞对照的百分比。

如图7.5中所示，使U937癌细胞与0.5μg/ml或至2μg/ml低剂量的KGI 1接触12天。通过台盼兰法染色对细胞数进行计数。

在U937癌细胞中分析颗粒化KGI 1诱导凋亡的能力。使细胞与2μg/ml或至25μg/ml浓度的KGI 1接触120小时(图7.6)。通过FACS同时确定Annexin V阳性细胞数(图7.6)和坏死的(即碘化丙锭(PI)染色的)细胞数(图7.7)(参见材料和方法)。使U937癌细胞与2μg/ml(M2)至50μg/ml(M50)浓度的KGI 1接触120小时。

在图7.8中，U937细胞与2μg/ml至50μg/ml浓度的KGI 1接触120小时。如图中所示，对所述细胞取样，用碘化丙锭和Annexin V染色。通过FACS确定受影响细胞的比例。详细信息见材料和方法。

结果

图7.1和7.2显示了用KGI 1长时间处理后U937癌细胞的生存力。用2μg/ml低生理剂量KGI 1间断处理癌细胞在抑制癌细胞增殖和杀伤癌细胞方面与连续处理一样有效。孵育9天后细胞数降低到基本上没有活细胞。在3天的孵育过程中，未处理细胞的数量从1百万/ml增加到3百万/ml。经处理细胞的数量在培养3天后降低到低于0.5×10⁶个/ml，在9天的培养过程中进一步降低(图7.1和7.2)。

25μg/ml高剂量的游离形式KGI 1(即Quill A的QHC级分)快速(即3小时内)杀伤细胞，而该浓度的KGI 1颗粒需要更长的时间(即24小时)来杀伤高比例的癌细胞。

2μg/ml低生理性剂量的游离形式KGI 1(即Quill A的QHC级分)在60小时内不杀伤细胞，而该浓度的KGI 1颗粒在培养24小时后开始杀伤癌细胞，并且在60小时的实验培养期内持续杀伤，此时细胞生存力降低到20％。在该浓度下，游离的非颗粒形式无法在60小时培养期内减少癌细胞数量。此浓度没有细胞溶胞效应。

相比于未处理细胞，0.5μg/ml极低剂量的KGI 1颗粒使细胞数量降低，而2μg/ml生理剂量的KGI 1颗粒在12天的培养期间杀伤所有癌细胞(图7.5)。

在图7.6中显示对程序性细胞死亡(凋亡)的诱导。2μg/ml浓度的KGI引起凋亡U937细胞群的增加，接触24小时后达到峰值。更高浓度(即25μg/ml)的KGI进一步提高凋亡细胞的比例，接触12和24小时后达到峰值。

对坏死细胞的诱导(图7.7)。与KGI 1颗粒对凋亡的诱导作用不同，其对坏死性细胞死亡没有影响。也就是说，坏死细胞比例在用多种剂量的颗粒化KGI 1处理的细胞与未接触KGI 1的对照细胞之间没有差异。

图7.8显示，在从2μg/ml到高至50μg/ml的浓度下120小时的实验期间用KGI 1处理的U937癌细胞随时间的碘化丙锭(PI)和Annexin V染色。浓度和时间的增加引起坏死和凋亡作用的细胞染色群均出现增加。对照显示同时对凋亡和坏死染色的细胞比例最低。开始，KGI 1处理的细胞主要并且仅被Annexin V染色，但是随着时间的增加，细胞开始坏死并且被双重染色。

讨论和结论

对U937细胞的低剂量(2μg/ml)KGI 1处理在3至6天后大大减少了细胞数。12天后，基本上没有活的癌细胞剩余。高剂量KGI(25μg/ml)在36小时内杀伤所有癌细胞。在实施例3中，我们显示U937癌细胞比正常细胞敏感30至40倍。一旦诱导了对癌细胞的杀伤(参见图7.2和8.1)，就无法逆转，因为从培养基中除去KGI 1并不停止向细胞死亡发展(也参见实施例4)。正常细胞具有不造成有害症状的程序性死亡(凋亡)结局。在此实施例中，我们可显示，KGI 1诱导了显著的凋亡。凋亡细胞的比例直至接触24小时时仍增加。2μg/ml低剂量的KGI1在孵育24小时后引起最显著的凋亡。

Annexin V阳性细胞的比例随时间的增加而降低，Annexin V和PI同时染色的细胞比例增加。KGI 1处理引起比未处理培养物大得多的双阳性细胞群体。双染色的细胞群来源于坏死或凋亡细胞。最初，仅有低比例的PI阳性细胞，在处理和未处理细胞群中相等。因此，KGI处理后高比例的双阳性细胞很可能来自于最初的凋亡群体。

接触KGI 1后终止的TK活性(实施例9)与U937癌细胞开始产生细胞因子IL-8的效果相一致。如实施例10所示，IL-8产生被用作KGI 1引起的癌细胞活化至生产期的指示物。在KGI 1杀伤癌细胞时，刺激作用与浓度密切相关。一个新的有趣设想是刺激作用使得KGI 1处理细胞脱离细胞周期进入生产期，直至正常产生的细胞不可避免的最终程序性凋亡结局。应注意，KGI制剂还从未能够刺激细胞增殖。癌细胞杀伤过程与通过细胞抑制或放射来杀伤癌细胞相比具有极大的优势，即没有症状或者至少使副作用尽可能小。

实施例8

KGI 1造成癌细胞死亡，其不允许细胞返回到失控的复制。癌症治疗所用的药物可能具有良好的初始效果，但是在持续治疗后，癌细胞杀伤作用可能回复，细胞开始不受控地复制。因此，有必要使被治疗的癌细胞不返回到失控的细胞增殖。实施例7显示，KGI 1对癌细胞的杀伤包括凋亡机制。此实施例证明，在长期培养用KGI 1处理的U937癌细胞后，细胞不回复复制，更重要的是，甚至在用低生理剂量间断处理之后也是如此。

将U937细胞与0.5μg/ml或2μg/ml的KGI 1颗粒一起培养12天，通过如材料和方法中所述的台盼兰染色将其与培养于相同条件下的未处理细胞的细胞存活率进行比较。

在下述实验中(图8.2)，在培养72小时后，通过用不含KGI 1的新鲜培养基替换含KGI 1的培养基来中断用2μg/ml浓度的KGI 1对同步化U937细胞的处理。每三天更换培养基以促进细胞生长。在培养12天后，用台盼兰染色后对活细胞数进行计数。

结果

持续接触2μg/ml浓度KGI 1的U937癌细胞之数量首先增加，然后从1至3天之间的时间点开始稳定降低。在12天的实验期结束时，记录到少于10％的活细胞(图8.1)。在用0.5μg/ml的KGI 1处理之后，细胞数最初增加，然后从起始点后第3天开始降低到一半，之后细胞数显著低于未处理的对照细胞。对照细胞达到三倍于起始时的细胞数。因此，用KGI 1处理细胞之后，在初始复制期后在低生理浓度的KGI 1下活细胞数量降低。

图8.2显示KGI 1抑制癌细胞U937增殖并对其进行杀伤，在12天的培养期间(甚至是在第3天撤去KGI 1之后)所述细胞不回复到增殖。

讨论和结论

实施例3展示并讨论了KGI 1的癌症杀伤作用。从此实施例中，我们可以得出结论：用2μg/ml的低生理性剂量KGI 1处理的细胞甚至是在中断处理之后也不回复到细胞增殖。

用0.5μg/ml KGI 1的处理相比于未处理对照细胞显著降低了细胞数。在最初的复制期之后，活细胞数减少。在用较低浓度(0.5μg/ml)的KGI 1处理的培养物中的活细胞计数很可能表明存活的细胞没有复制。

总之，接触低生理浓度KGI 1的U937癌细胞不回复到失控的复制，而细胞数稳定减少。

实施例9

用KGI 1处理的癌细胞脱离细胞周期

实施例7证明KGI 1杀伤癌细胞，其包括凋亡的过程，实施例8显示对癌细胞的杀伤是不可逆的。实施例10显示，在不加入其它药剂所需的细胞活化或分化物质(如12-肉豆蔻酸佛波酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myrestate-13-acetate，PMA))的情况下，KGI 1引导U937细胞进入生产期(Baldridge，Cluff等2002)。细胞周期控制细胞复制(图9.1)。在S期(细胞周期的早期阶段)中，构建子细胞的DNA。DNA构建单元之一是核苷酸胸腺嘧啶。胸腺嘧啶需要胸苷激酶(TK)来使其磷酸化。因此，此酶必须在S期之前可用。这里，我们使用TK活性来研究KGI 1是否影响U937细胞的细胞周期，以及KGI 1处理的细胞是停留在细胞周期中还是脱离细胞周期。在此实施例中，通过随时间检测TK活性，将TK活性与癌细胞代谢抑制(由AlamarBlue测试来记录)、杀伤(由台盼兰排除染色来测量)以及在有关凋亡的论述中相关联，从而分析KGI 1处理的细胞在细胞周期中的持续性。未处理细胞的细胞代谢、复制和TK活性用于记录仍保留在周期中的癌细胞。

将1百万个/ml的U937细胞接种于微滴定板以用于本实施例中的实验。如材料和方法中所述，将细胞培养基中胎牛血清浓度从10％减少到0.5％而使所述细胞饥饿22小时，使得U937细胞的细胞周期同步化。测定TK活性并在用2μg/ml或25μg/ml浓度的颗粒化KGI 1处理的细胞与未处理细胞之间进行比较。如图9.2和9.3中所述，以多至5天的间隔进行测定，效果在结果中详细描述。在图9.4中，将在用颗粒化KGI1处理U937细胞后细胞裂解物中测定的TK活性降低与相同浓度游离(即非颗粒化)KGI 1处理之间进行比较。用2μg/ml(M2)、10μg/ml(M10)、25μg/ml(M25)和50μg/ml(M50)处理10⁶个/ml细胞之后，在120小时中每天测定细胞裂解物中的样品。在图9.5中，在如图9.4所示以相同的游离和颗粒化KGI 1处理之后，测定细胞培养液中的TK活性。

在图9.6中，对与2μg/ml的KGI 1接触0、2、8、18和24小时的同步化U937癌细胞分析TK活性。未处理对照在0、8和24小时时取样。

图9.7，使同步化U937细胞与2μg/ml的KGI 1接触2、8、18和24小时。对照在第8和24小时时取样。用台盼兰染色后对活细胞计数。

图9.8，在用0.5μg/ml或2μg/ml的颗粒化KGI 1或游离KGI处理24小时后对同步化U937细胞的细胞代谢抑制(AlamarBlue)和细胞杀伤(台盼兰)。

结果

在5天培养过程中，相比于未处理对照，经处理细胞的TK活性降低。用25μg/ml高剂量的KGI 1处理后的TK活性降低在24小时后是显著的，对于2μg/ml低剂量的KGI 1而言是在48小时后(图9.2)。经处理细胞的TK活性也以未处理细胞百分比的形式记录(图9.3)。3天后，在以25μg/ml的KGI 1处理的细胞中检测不到TK活性。5天后，以2μg/ml低剂量的KGI 1进行的细胞处理使TK活性降低至10％。

图9.4显示，2μg/ml低生理剂量的KGI 1在接触癌细胞48小时后造成TK活性显著降低，但在接触72小时后最为显著。在游离KGI 1处理后TK活性的降低则不那么显著。用25或50μg/ml高剂量的KGI 1处理后，TK活性的降低在更早时(即接触24小时后)变得显著。用高剂量游离KGI 1(即25和50μg/ml)处理的细胞在6天培养期间的所有时间点均完全消除了可检出的TK活性，但是转而在培养基中检测到TK活性(图9.5)，这表明细胞膜破损。应注意，这些浓度的游离KGI1具有溶胞效应(实施例2，表2.1)。相反，颗粒化KGI 1不向细胞培养液中释放可检测量的TK。

图9.6显示，在处理18和24小时(即进入第二轮细胞周期的复制期之前)的细胞样品中记录到，2μg/ml低生理剂量的KGI 1降低同步化U937癌细胞的TK活性。在最初8个小时中使用低剂量没有发生对TK活性的抑制。

图9.7显示，2μg/ml低生理性剂量的KGI 1在接触18小时后抑制癌细胞的增殖并降低其数量(以培养物中的细胞生存力衡量)，这在时间上与图9.6中所示的TK活性降低一致。

2μg/ml浓度的颗粒化和游离KGI 1在处理U937细胞24小时后降低细胞生存力和代谢，这是在本实验中测定的(图9.8)。0.5μg/ml浓度的颗粒化或游离KGI 1在处理24小时后降低细胞生存力。在以0.5μg/ml进行处理后，KGI 1对细胞代谢的抑制比游离KGI 1更显著。一般来说，通过细胞代谢和生存力测量均得到颗粒化KGI 1是更有效的癌细胞生长抑制剂。活细胞数与细胞代谢活性之间存在良好的相关性。

讨论和结论

在非同步化细胞中测量时，用2μg/ml低剂量KGI 1处理的U937癌细胞在48小时后而不是24小时后降低TK活性，说明KGI 1抑制作用在第一个周期的晚期发生(图9.2-9.5)。在同步化细胞中，TK活性的抑制出现的更早(图9.6)。TK活性在细胞生长周期中的早期。25μg/ml高浓度的KGI 1更早地降低TK活性。很有可能的是，KGI 1处理使得细胞脱离细胞周期。一般来说，TK活性在用生理剂量的KGI 1处理5天后终止。应注意的是，所测量的TK活性包括新产生的胸苷激酶和来自之前周期的预计会持续一定时间的残余胸苷激酶的总和。在孵育24小时后，记录到25μg/ml高剂量的KGI 1将TK活性降至50％，表明高剂量在细胞生长周期中更早时干扰细胞生长。降低的TK活性反映为代谢抑制(AlamarBlue分析)及台盼兰染色所测量的活细胞数减少，并在时间上与它们一致(图9.7和9.8)。在同步化细胞培养物中，KGI 1处理18小时后癌细胞数减少，表明KGI 1在第一细胞周期中的抑制作用。

在24小时时引起凋亡性癌细胞杀伤(实施例7)，凋亡性杀伤与高剂量和低剂量KGI 1对TK活性的早期影响相一致。应注意的是，在KGI 1诱导癌细胞杀伤的早期阶段，坏死细胞数未超过未处理细胞中的坏死细胞数(参见实施例7)。结论是：PI(坏死)和Annexin V(凋亡)均染色的累计细胞数很大程度上来源于KGI 1引起的凋亡细胞。

但是，不能排除较高剂量KGI 1的早期作用对细胞周期S期之前的TK产生有直接影响。

游离KGI 1的癌症杀伤作用在所测试的较高浓度(即25μg/ml和50μg/ml)下特别显著，但是在这些浓度下，TK被释放到培养基中(图9.4)，表明细胞膜发生破损。在较低浓度下，游离形式具有比颗粒化KGI1更低的降低TK活性之能力。

25μg/ml和50μg/ml高剂量的KGI 1的早期癌症杀伤作用(即24小时之前)显示在细胞周期的早期存在与2μg/ml和10μg/ml低浓度不同的机制，后者显然在TK产生之后影响细胞。25μg/ml和50μg/ml较高浓度的颗粒化KGI 1不像游离形式KGI 1(即Quill A的QHC级分)那样具有溶胞效应(实施例2)。

总之，颗粒化KGI 1杀伤癌细胞，同时甚至在高剂量下也不造成大量坏死。TK活性几乎在凋亡的同时中止，这与AlamarBlue所测得的细胞代谢抑制以及台盼兰染色测得的细胞杀伤相一致。KGI 1在所测试的剂量下没有溶胞效应。在长期培养中也没有观察到回复。KGI 1的癌细胞杀伤作用遵循脱离细胞周期导致活化和生产期并导致最终凋亡的理论。相反，游离形式的KGI 1(即Quill A的QHC级分)除凋亡之外还通过坏死进行杀伤，并在高剂量下通过溶胞效应进行杀伤。在以低生理剂量使用时，游离KGI 1的癌细胞杀伤效力较低。高有效浓度的游离KGI 1产生副作用。

实施例10

KGI制剂诱导U937细胞产生IL-8细胞因子

已经显示，使用超过KGI 1的剂量时，脂多糖(LPS)化合物刺激U937细胞产生细胞因子(IL-8)。在另一个实验中，Baldridge等(Baldridge，Cluff等2002)声称氨酰基氨基葡糖苷4-磷酸(APG)对U937细胞具有这种通过细胞因子产生来衡量的刺激作用。但是，为了实现此能力，培养物必须用12-肉豆蔻酸佛波酯-13-乙酸酯(PMA)预处理以促进分化和活化。本实施例显示，KGI 1、2和3不需要另外的活化-分化化合物来进入细胞因子生产期，并且所需的KGI制剂剂量很低。另外，实施例7和9显示，KGI 1使U937癌细胞脱离细胞复制周期，其中如果不用KGI 1处理的话癌细胞会停留在细胞复制周期中。实施例7和9还显示，KGI 1使U937细胞发生凋亡。凋亡是正常细胞完成其使命(例如产生细胞因子)后的最终步骤。在本实施例中，测试了三种KGI制剂(即KGI 1、2和3)诱导U937细胞产生细胞因子IL-8的能力。

如材料和方法中所述配制KGI 1、2和3，并以图10.1、10.2和10.3中所述浓度添加到微滴定板中密度为10⁶个/ml的U937细胞中。在37℃下孵育2天后，在上清液中测定IL-8。如这些图中所示，还计算了LC50时的IL-8产生。

结果

IL-8产生如下：KGI 1在LC50时为781pg/ml(图10.1)，KGI 2为881pg/ml(图10.2)，KGI 3为916pg/ml(图10.3)。如这些图中所示，不同的KGI制剂还造成不同程度的细胞毒性。

讨论和结论

U937细胞不自发产生细胞因子。尽管Baldridge等(Baldridge，Cluff等2002)宣称某些APG在高剂量下可刺激U937细胞产生细胞因子，但其需要用例如高剂量MPA进行预处理。本实施例显示，KGI制剂不需要MPA或类似处理就可进入细胞因子生产期。另外，实施例9显示，KGI 1使U937癌细胞脱离细胞复制周期，其中如果不用KGI 1处理的话癌细胞会停留在细胞复制周期中。实施例4显示KGI 1使U937细胞发生凋亡。凋亡是正常细胞完成其使命(例如产生细胞因子)后的最终步骤。在本实施例中，测试了三种KGI制剂(即KGI 1、2和3)诱导U937细胞产生细胞因子8的能力。总之，不同的KGI制剂都诱导在凋亡前产生细胞因子8。BBE也诱导IL-8产生(未显示)。

实施例11

KGI 1和BBE在小鼠中为急性毒性

用于癌症治疗的药物大多数导致副作用及低生物利用度，这是用于癌症治疗的潜在化合物未进入临床试验或未上市的最常见原因。南美皂皮树皂苷已经以游离形式在动物中使用超过50年。众所周知，可能出现肿胀、发红和压痛甚至坏死形式的局部反应，成为限制其剂量的副作用。在将QHC掺入免疫刺激复合物和免疫刺激复合物基质制剂中之后，使用相似剂量未记录到此类副作用。在小鼠中肌内注射的10μg游离QHC诱发局部反应，但是掺入免疫刺激复合物或KGI制剂中的却没有。同样众所周知的是，游离皂苷与胆固醇相互作用，造成细胞膜的破损，而在免疫刺激复合物和KGI制剂中对所掺入与胆固醇结合之皂苷的阻断作用避免了这样的破损。在本实施例中，测试了BALB/c小鼠中KGI 1和BBE的全身毒性。如材料和方法中所述，在BALB/c小鼠中皮下施用KGI 1和BBE后测试急性毒性。在4天里对小鼠进行记录。测试结果总结于表11.1中，嗜睡程度评分在表11.2中描述。

在本实施例中，研究了KGI 1和BBE的一般毒性，并将其与所整合皂苷的游离形式(即整合进KGI 1的南美皂皮树皂苷的级分C和整合进BBE的级分A)进行比较。将10、30和50μg剂量的KGI 1，50和100μg的BBE皮下注射到BALB/c小鼠中，在4天中对其进行观察。

表11.1游离和颗粒化KGI毒性的比较

表11.2嗜睡程度评分

嗜睡程度	0	1	2	3
					跟着人移动	是，在未睡觉时	否	否	否
(在清洁过程中)将动物转移到其它具有新鲜褥草的箱子时，它们四处跑并探索新环境	立刻	慢	非常慢或者否	否
					当为其提供新食物时，它们闻食物，“检查”食物	立刻	慢或者否	否	否
当用铅笔在小鼠所处的地方敲击箱子外壁时，小鼠逃走	立刻	慢	否	否
					当用铅笔击打小鼠臀部时，小鼠逃走	立刻	立刻	慢	否
当用镊子夹动物尾部导致中等疼痛时，动物试图逃走	不需此检查	不需此检查	立刻	非常慢或否

结果

效果总结于表11.1中。10μg剂量的KGI 1在小鼠中不造成任何可检出的副作用。30μg的剂量造成轻微反应，即在3级尺度中0.13的肝增大、0.75的脾增大、0.65的脾变暗。除了脾增大(2.0)和脾变暗(1.63)之外，50μg剂量的KGI 1也仅造成小的改变。应注意，KGI 1具有佐剂作用，即增强免疫，脾反应是来自正常的反应。相反，50μg剂量的游离形式级分C造成严重的副作用，包括38％的致死率和高分数的嗜睡(1.8)、脾增大(2.1)、脾变暗(2.8)以及腹泻。BBE颗粒已知基本上没有毒性，只有脾增大是可察觉的反应，这很可能是由于佐剂作用所致。

讨论和结论

考虑到60千克的人，与所计算的人剂量(100μg的KGI 1)相近的50μg KGI 1的全身性反应在18g BALB/c小鼠中导致低水平的副作用，并且没有致死。相反，此剂量(50μg)的游离形式Quillaja级分C(KGI 1中的皂苷)造成致死和腹泻。100μg剂量的KGI 1也是致死的，这还应该考虑到KGI 1颗粒的生物利用度高于级分C。BBE颗粒被证明基本上没有副作用。仅有的显著作用是脾增大分数，这是其强免疫调节作用的反映。之前的研究显示，游离形式的南美皂皮树皂苷级分(如QS 21和QHC)导致局部反应，颗粒化形式避免了此反应，这是因为与KGI和BBE颗粒以及所有形式免疫刺激复合物颗粒中的皂苷相结合的胆固醇的阻断作用所致。即，所述颗粒中的皂苷确实不能与细胞膜中的胆固醇相互作用。

实施例12

根据开发用于免疫刺激的已许可的免疫刺激复合物递送系统，Killcan建立了用于癌症治疗的新用途和新思路。传统癌症杀伤系统是猛烈的，并造成严重的副作用，因为其使用同样影响正常细胞的细胞抑制作用、同样影响正常细胞的放射疗法以及有其局限性的手术。癌症治疗的现代观点是如实施例7和9中所述干扰复制的生物机制。不受控复制是大多数癌症类型的癌细胞存活和发病的主要驱动力。Killcan设想使用已批准上市的成熟的免疫刺激复合物系统作为靶向细胞群以及靶向细胞内区室(例如内体和溶酶体)之化合物的递送系统。通过使用免疫刺激复合物系统，Killcan的设想是通过调节、活化、分化来驱动正常的细胞发育，导致确定的且无症状的程序性细胞死亡(凋亡)结局。因此，在此癌症治疗构思中，使用了300篇出版物中记录的免疫刺激复合物技术所获得的经验，其中针对优秀的生物利用度、细胞靶向和细胞内递送、低毒性以及其它生物功能特性进行了详尽测试。文献从最早的出版物Morein等(Morein，1984)到最近的总结性综述(Morein，2007)。

本发明对多种BBE和KGI制剂的分析由Uppsala大学临床药理学的Rolf Lasson教授的小组利用他们的技术进行(Dhar，1996)。事实上，多种组合导致的杀伤、生长抑制乃至协同作用是针对来自骨髓瘤、淋巴瘤和实体瘤之癌细胞的意想不到的综合作用(covering effect)。另外，来自难治或无法治疗之肿瘤的逃逸突变体(escape mutant)和癌细胞对一种或多种KGI或BBE制剂敏感，这确实是无法预料的。

人肿瘤细胞系组

为了评价药物的活性特征谱，使用了4种敏感性亲代细胞系、代表了不同抗性机制的5种药物抗性亚系以及一种具有原发抗性的细胞系的人细胞系组(Dhar，1998)。所包括的细胞系是骨髓瘤细胞系RPMI8226/S及其亚系8226/Dox40和8226/LR-5(W.S.Dalton惠赠，Dept ofMedicine，Arizona C ancer C enter，University of Arizona，Tucson，AZ)、淋巴瘤细胞系U-937 GTB和U-937-Vcr(K.Nilsson惠赠，Dept of Pathology，University of Uppsala，Sweden)、SCLC细胞系NCI-H69及其亚系H69AR、乳腺癌MCF-7和宫颈癌Hela细胞系(美国模式培养物保藏中心；ATCC，Rockville，MD)、肾腺癌细胞系ACHN(ATCC)以及白血病细胞系CCRF-CEM及其亚系CEM/VM-1(W.T.Beck惠赠，Dept of Pharmacology，College of Medicine，University of Tennessee，Memphis，TN)。

选择8226/Dox40用于多柔比星抗性，其显示过表达P-糖蛋白170(Pgp)的经典MDR表型。选择8226/LR-5用于美法仑抗性，其被认为与GSH水平升高相关。选择U-937-Vcr用于长春新碱抗性，其被认为微管蛋白相关。选择用于多柔比星抗性的H69AR表达MDR表型，其被认为由MRP介导。选择用于替尼泊苷抗性的CEM/VM-1表达非典型MDR，其被认为与拓扑异构酶II(topoII)相关。原发抗性ACHN细胞系确切的抗性机制未知，可能是多因素的。

在37℃含有5％CO₂的湿润气氛下在3.2节中所述的完全培养基中培养所述细胞系。用0.24μg/ml的多柔比星每个月处理8226/Dox40一次，用1.53μg/ml的美法仑在每次更换培养基时处理8226/LR-5。U-937-Vcr在10ng/ml长春新碱存在下连续培养，用无药物培养基和含0.46μg/ml多柔比星的培养基交替培养H69AR。CEM/VM-1细胞系在无药物培养基中培养6-8个月而不丧失任何抗性。在对照实验中对细胞系的抗性模式进行常规确认。

表12.1本研究中使用的人肿瘤细胞系

细胞系	来源	选择剂	抗性与......相关
				CCRF-CEM	白血病	-
CEM/VM-1	″	替尼泊苷	拓扑异构酶II
				ACHN	肾癌	-	(原发抗性)
NCI-H69	小细胞肺癌	-
				H69AR	″	多柔比星	MRP
RPMI	骨髓瘤	-
				8226/S
8226/dox40	″	多柔比星	PgP
				8226/LR5	″	美法仑	谷胱甘肽
U-937GTB	淋巴瘤	-
				U-937-vcr	″	长春新碱	微管蛋白
Hela	宫颈癌	-
				MCF-7	乳腺癌	-

试剂和药物

自始至终均使用由碳酸盐缓冲的培养基RPMI-1640(HyClone，Cramlington，UK)加10％失活FCS、2mM谷氨酰胺、50μg/ml链霉素和60μg/ml青霉素组成的完全培养基。将FDA(Sigma，St Louis，MO)溶解于DMSO并避光冷冻保存(-20℃)，作为贮存液。

从DueCom AB得到在DMSO中10mM贮存液形式的测试化合物。用磷酸缓冲盐水(PBS；Sigma Aldrich)将贮存液稀释10倍至透明溶液。使用BIOMEK-2000自动系统将药物进一步稀释(10倍系列稀释)并加样到384孔微滴定板(NUNC)。

荧光微培养细胞毒性测定(fluorometric microculture cytotoxicityassay，FMCA)

将肿瘤细胞以5000个细胞/孔的密度接种于备有药物的384孔微滴定板。荧光微培养细胞毒性测定(FMCA)是基于测量FDA被具有完整质膜的细胞水解成荧光素所产生的荧光，之前已有详细描述[14]。将所述板于37℃下含5％CO₂的潮湿气氛中孵育72小时。孵育期结束时，吸走培养基。用PBS洗一次之后，加入溶解于生理缓冲液(10μg/ml)的50微升/孔FDA。将所述平板孵育45分钟，在384孔扫描荧光计中测定每个孔所产生的荧光。荧光与孔中的完整细胞数成正比。

成功分析的质量标准包括对照孔中荧光信号是平均空白值的5倍以上，对照孔的平均变异系数(CV)低于30％。

FMCA结果的定量

细胞生存力以存活指数(SI)的形式表示，其定义为实验孔中荧光相比于对照孔中的百分比，其中减去空白孔中的值。

结果

不同组合的KGI和BBE制剂杀伤来自三类所测试癌症(即淋巴瘤、骨髓瘤和实体瘤)的癌细胞。如表12.2中所示，所测试的不同制剂覆盖了癌细胞杀伤或生长抑制的不同方面。

●KGI 1对11种测试细胞中的7种具有杀伤或生长抑制作用，包括淋巴瘤、骨髓瘤和小细胞肺癌细胞的逃逸突变体H69AR。

●BBE对所测试正常细胞和上述模型中使用的U937细胞基本上无毒性。出人意料的是，它对两种细胞(即从BBE抗性U937/GTB逃逸出的U937/vcr)有杀伤/生长抑制作用。更值得注意的是，ACHN细胞对KGI 1有抗性，但是对BBE和含有BBE活性成分QHA的KGI2敏感。

●KGI 3对11种测试细胞中的6种具有杀伤或生长抑制作用。白血病细胞对KGI 3制剂最敏感。它与KGI 2一起是仅有的对乳腺癌HELA细胞有作用的制剂，甚至在对其它制剂有抗性时也有强效作用。

●KGI 2对11种测试细胞中的5种具有杀伤或生长抑制作用。它与KGI3一起是仅有的对乳腺癌HELA细胞有作用甚至作用很强的制剂。

●BBE/KGI 1对11种测试细胞中的5种具有杀伤或生长抑制作用。值得注意的是对具有KGI 1抗性的原发抗性ACHN细胞和抗性骨髓瘤细胞8226/dox40具有强力作用，此外，这些细胞也对KGI 2敏感，但不对其它测试制剂敏感。

讨论和结论

基于细胞调节-活化-分化以及凋亡特性的多种制剂表现出出人意料的宽范围癌症杀伤或生长抑制特性。尽管所述成分是皂苷，但由于不具有皂苷溶胞效应，因此它们具有明显的补充作用，导致所有制剂在对所测试的不同癌细胞的作用方面具有明显不同的特征谱。所测试制剂对癌细胞的杀伤或生长抑制的总体特征谱覆盖了11种测试癌细胞类型中的10种，唯一完全不敏感的细胞是小细胞肺癌细胞系H69。尽管程度有限，但逃逸突变体对KGI 1和KGI 3是敏感的。

总之，已充分证实被正常细胞良好接受的成熟系统具有覆盖广泛癌症类型范围的强力癌细胞杀伤或生长抑制性质，这是一个出乎意料的发现。考虑到癌症杀伤颗粒所具有的已充分证明的递送特性，该系统很好的适用于使用皂苷物质和其它癌症药物(优选通过其它机制发挥作用)的组合疗法。支持此预计效果的是，多种测试制剂对逃逸突变体的能力，所述逃逸突变体被该癌细胞最初对其敏感的其它化合物所引发。

表12.2、以IC50(μg/ml)表示的来源于淋巴瘤、骨髓瘤和实体瘤的多种癌细胞(表12.1)的杀伤/生长抑制。在同一颗粒中的单独化合物(即BBE和KGI 1)、同一颗粒中多种南美皂皮树皂苷级分组合(KGI 3)、同一颗粒中两种组分(QHA和QHC，即KGI 2)和在独立的颗粒中以4∶1的BBE/KGI 1比与KGI 1混合的BBE颗粒的不同作用

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Claims (4)

1.由至少一种脂质和来自南美皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的级分C或其亚级分的皂苷组成的免疫刺激复合物基质含脂质颗粒用于制备治疗癌症之药物的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中与所述含脂质颗粒一起使用其它的癌症治疗化合物。

3.根据权利要求2的用途，其中所述癌症治疗化合物选自紫杉烷化合物。

4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中其它佐剂掺入该颗粒中、与该颗粒偶联或者与该含脂质颗粒混合。

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