JP2019092481A - ヘテロタンパク質ケージ - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質分子から形成された、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）に標的タンパク質を取り込ませる技術を提供する。
【解決手段】標的タンパク質を含むタンパク質ケージの製造方法であって、タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質と、を接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含む、製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヘテロタンパク質籠（ケージ）に関する。より詳細には、本発明は、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（以下、「ヘテロタンパク質ケージ」という場合がある。）の製造方法、結晶の製造方法、結晶、標的タンパク質の立体構造解析方法、及び、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キットに関する。

タンパク質分子の表面には、様々な機能性官能基をもつアミノ酸側鎖が存在し、特異な化学的特性を有している。そして、複数のタンパク質分子が規則正しく配列することにより、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）を形成する場合がある。

例えば、多角体病ウイルスは、カイコ等の昆虫の細胞に感染するウイルスである。多角体病ウイルスは、感染後期に感染細胞内に多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパクの約半分に達するほど大量に作り、その中に多数のウイルス粒子を封入する。多角体タンパク質であるポリヘドリンタンパク質は、上述したタンパク質ケージを形成するタンパク質の例である。

近年、タンパク質ケージを、機能性分子を固定する固体材料として利用する研究が行われている。例えば、非特許文献１には、多角体タンパク質であるポリヘドリンタンパク質のＮ末端に存在するＨ１α−へリックスとの融合タンパク質をコードする遺伝子を、ポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子と共に細胞内で共発現させることにより、細胞質多角体病ウイルスの多角体の結晶に融合タンパク質が封入された多角体を調製できることが記載されている。

Ijiri H., et al., Structure-based targeting of bioactive proteins into cypovirus polyhedra and application to immobilized cytokines for mammalian cell culture., Biomaterials, 30 (26), 4297-4308, 2009

しかしながら、非特許文献１の方法により標的タンパク質をタンパク質ケージに封入するためには、宿主として昆虫細胞を用いる必要がある。また、昆虫細胞にウイルスを感染させた後、約１週間インキュベーションさせる必要があり、比較的長時間を必要とするため改良の余地がある。そこで、本発明は、タンパク質分子から形成された、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）に標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］標的タンパク質を含むタンパク質ケージの製造方法であって、タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法。
［２］前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、［１］に記載の製造方法。
［３］結晶の製造方法であって、［１］又は［２］に記載の製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法。
［４］前記結晶化工程を細胞外で行う、［３］に記載の製造方法。
［５］前記形成工程の後且つ前記結晶化工程の前に、前記タグを有する前記タンパク質ケージを精製する精製工程を更に含む、［３］又は［４］に記載の製造方法。
［６］実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成された結晶。
［７］［６］に記載の結晶の結晶構造解析を行う工程を含む、前記標的タンパク質の立体構造解析方法。
［８］タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キット。
［９］前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、［８］に記載のキット。

本発明によれば、タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することができる。

（ａ）は、実験例３におけるアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。（ｂ）は、実験例３におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例３におけるｌｏｗＧＦＰ画分の陰イオン交換カラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例３におけるｈｉｇｈＧＦＰ画分の陰イオン交換カラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ｃ）は、実験例３におけるｌｏｗＧＦＰ画分のゲル濾過カラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ｄ）は、実験例３におけるｈｉｇｈＧＦＰ画分のゲル濾過カラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 （ａ）〜（ｅ）は、実験例３における各タンパク質ケージの代表的な電子顕微鏡写真である。（ａ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージの単量体画分の電子顕微鏡写真である。（ｂ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。（ｃ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージの単量体画分の電子顕微鏡写真である。（ｄ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。（ｅ）は野生型のフェリチン２４量体籠の電子顕微鏡写真である。 （ａ）〜（ｄ）は、実験例４における、ゲル濾過カラムによるクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムである。（ｂ）はｌｏｗＧＦＰ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムである。（ｄ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 （ａ）〜（ｄ）は、実験例５で作製した各結晶を、可視光及び紫外線の存在下で光学顕微鏡観察した結果を示す写真である。（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真である。（ｂ）はｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真である。（ｄ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。 （ａ）は実験例６におけるタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真である。（ｂ）は実験例６におけるタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。

［タンパク質ケージの製造方法］
１実施形態において、本発明は、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）の製造方法であって、タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法を提供する。

実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、１〜２日で標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）を製造することができる。

本明細書において、タンパク質ケージとは、タンパク質で形成された籠（ケージ）状構造体を意味する。タンパク質ケージとしては、例えば、ウイルスのカプシド、生体内鉄貯蔵を担っているフェリチン２４量体、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｖｅｄ ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｓｍａｌｌ ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）等が挙げられる。

また、本明細書において、タンパク質ケージモノマーとは、タンパク質ケージを構成するモノマータンパク質を意味する。例えば、タンパク質ケージがフェリチン２４量体であり、タンパク質ケージモノマーがフェリチンであってもよいが、これに限定されない。

フェリチンは、藻類、細菌、植物、ヒト、非ヒト動物を含むほぼ全ての生物が合成するタンパク質である。本実施形態の製造方法において、フェリチンとしては、これらフェリチンのいずれも用いることができる。

タンパク質ケージモノマーは、互いに接触することにより、自己組織化してタンパク質ケージを形成するものであることが好ましい。

本実施形態の製造方法において、標的タンパク質は、タンパク質ケージに取り込ませる対象である。ここで、標的タンパク質をタンパク質ケージに取り込ませるとは、標的タンパク質をタンパク質ケージの内部に完全に収容することであってもよいし、標的タンパク質をタンパク質ケージの内部に一部収容し、一部が露出した状態とすることであってもよい。

タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませることにより、例えばタンパク質を安定化させることができる。あるいは、標的タンパク質として生理活性を有するタンパク質を使用した場合、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを、薬物送達システムとして用いることができる。

標的タンパク質としては、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質を形成することができるものであれば特に形成されず、あらゆるタンパク質を利用することができる。また、融合タンパク質において、タンパク質ケージモノマーと標的タンパク質との間にはリンカー配列が配置されていてもよい。

また、実施例において後述するように、タンパク質ケージとして結晶化が容易なものを使用することにより、種々の標的タンパク質を取り込ませたタンパク質ケージを容易に結晶化させることができる。

本実施形態の製造方法によれば、昆虫細胞に限られない様々な宿主を用いてタンパク質ケージを製造することができる。宿主としては、大腸菌、酵母等の細菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。

また、宿主を使用せず、無細胞翻訳系を用いてタンパク質ケージを製造することもできる。無細胞翻訳系としては、特に限定されず、例えば、ウサギ網状赤血球を用いた翻訳系、コムギ胚芽を用いた翻訳系、大腸菌を用いた再構成翻訳系等が挙げられる。

また、実施例において後述するように、融合タンパク質がタグを有していることから、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）のみを分離精製することができる。

タグとしては、タグを有するタンパク質ケージの精製が可能なアフィニティータグが好ましく用いられる。具体的なタグとしては、例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質タグ等が挙げられるがこれらに限定されない。

本実施形態の製造方法において、形成工程は、細胞内で実施してもよいし、細胞外で実施してもよい。

例えば、宿主細胞に、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクターとを、それぞれ導入し、細胞内で、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とを発現させてもよい。この結果、タンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とが、細胞内で、又は、細胞外に分泌された後に接触し、細胞内で、又は細胞外でタンパク質ケージが形成される。

同一細胞内でタンパク質ケージモノマーと融合タンパク質とを発現させる場合、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）、及び、融合タンパク質の発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）を適切に選択することにより、各発現ベクターの細胞内におけるコピー数比、ひいては各タンパク質の発現量比を調節することができる。これにより、タンパク質ケージに取り込まれる標的タンパク質の数を調整することが容易になる。

あるいは、タンパク質ケージモノマーと、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを、別々の宿主細胞を用いて別々に調製した後、両者を接触させてタンパク質ケージを形成させてもよい。

この場合、タンパク質ケージモノマーがタンパク質ケージを形成している場合がある。また、融合タンパク質が会合体を形成している場合がある。このような場合、これらのタンパク質ケージ及び融合タンパク質の会合体を一度モノマーにまで解離させた後に適切な割合に調整して接触させ、タンパク質ケージを形成させることが好ましい。

［結晶の製造方法］
１実施形態において、本発明は、結晶の製造方法であって、上述した製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）を結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法を提供する。

現在解明されているタンパク質の立体構造座標の約９割がＸ線結晶構造解析法により決定されたものである。しかしながら、タンパク質が結晶化する条件は個々のタンパク質によって異なっている。

このため、新たなタンパク質の結晶を得るためには、大量の精製タンパク質を調製すること、タンパク質を結晶化するために数百から数千の結晶化条件の検討を行うこと等が必要になる。これらの作業には多大な労力と長期間を要し、タンパク質のＸ線結晶構造解析を行う際のボトルネックとなっている。

これに対し、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、様々な標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を容易に製造することができる。また、製造した、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を用いてＸ線結晶構造解析を行うことにより、標的タンパク質の立体構造座標を決定することができる。

本実施形態の製造方法によれば、タンパク質ケージとして、結晶化しやすいもの、結晶化条件が確立されているもの等を用いることにより、含有する標的タンパク質が異なるタンパク質ケージを、同一の条件で、あるいは、わずかな結晶化条件の検討により、容易に結晶化させることができる。この結果、従来、多大な労力と長期間を要していたタンパク質の結晶を容易に製造することが可能となる。

本実施形態の製造方法では、従来の多角体ウイルスを用いた結晶の製造方法と異なり、結晶化工程を細胞外で行うことができる。この結果、例えば、タンパク質ケージを形成させる形成工程の後、且つ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程の前に、タグを有するタンパク質ケージのみを精製する精製工程を行うことができる。更に、実施例において後述するように、タンパク質ケージ１個あたりの標的タンパク質の分子数が均一なタンパク質ケージを精製して結晶化させることもできる。

この結果、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成された結晶、更には、標的タンパク質を特定の割合で含むタンパク質ケージのみから形成された結晶を製造することができる。このようにして、均一な結晶を得ることにより、標的タンパク質の立体構造座標を決定することが容易になる。

［結晶］
１実施形態において、本発明は、実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）のみから形成された結晶を提供する。本実施形態の結晶は、上述した結晶の製造方法により製造することができる。

本実施形態の結晶は、実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成されている。このため、例えばＸ線結晶構造解析等を実施するのに適している。ここで、標的タンパク質としては特に限定されず、上述したものと同様である。また、タンパク質ケージは、例えばフェリチン２４量体であってもよいし、フェリチン２４量体以外の、上述したものと同様のタンパク質ケージであってもよい。

本実施形態において、実質的にとは、結晶中に、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージがごくわずかに混入することを許容する意味である。あるいは、結晶中に、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージが、検出限界以下混入することを許容する意味である。本実施形態の結晶中に含まれる、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージの割合は、５モル％以下であることが好ましく、１モル％以下であることがより好ましく、０．３モル％以下であることが更に好ましく、０モル％であること、すなわち、標的タンパク質を含まないタンパク質ケージを全く含まないことが特に好ましい。

［標的タンパク質の立体構造解析方法］
１実施形態において、本発明は、上述した結晶の結晶構造解析を行う工程を含む、前記標的タンパク質の立体構造解析方法を提供する。

本実施形態の方法により、様々な標的タンパク質について立体構造解析を容易に行うことができる。結晶構造解析の手法は特に限定されず、例えば、Ｘ線結晶構造解析、電子顕微鏡像再構成法、電子線結晶構造解析等により行うことができる。

［キット］
１実施形態において、本発明は、タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キットを提供する。

本実施形態のキットにより、上述した、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ（ヘテロタンパク質ケージ）、及び、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶（ヘテロタンパク質ケージの結晶）を容易に製造することができる。

本実施形態のキットにおいて、タンパク質ケージモノマーは、例えば、フェリチンであってもよい。また、タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクターとしては、例えば、フェリチン及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター等が挙げられる。

ここで、標的タンパク質としては特に限定されず、上述したものと同様である。また、融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターとは、例えば、フェリチン及び標的タンパク質の融合タンパク質を製造するためのベクターであって、標的タンパク質をコードする遺伝子が連結されていない発現ベクター等が挙げられる。

より具体的には、例えば、プロモーターの下流に、Ｈｉｓタグ、フェリチン遺伝子、マルチクローニングサイトをこの順に有しており、マルチクローニングサイトに標的タンパク質をコードする遺伝子断片を導入することにより、融合タンパク質の発現ベクターを作製することができるベクターが挙げられる。ここで、マルチクローニングサイトとは、１つ以上のユニークな制限酵素認識配列を有し、ベクターへの遺伝子断片の導入を容易にする領域を意味する。

融合タンパク質において、フェリチン遺伝子と標的タンパク質との間にはリンカー配列が配置されていてもよい。また、タンパク質ケージモノマーはフェリチンに限られず、上述したものと同様のタンパク質ケージモノマーを適宜使用することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターの作成）
タンパク質ケージモノマーとして、フェリチンを使用した。フェリチンとしては、ウマ脾臓由来フェリチンＬ鎖を使用した。フェリチンは２４量体の籠（フェリチン２４量体籠）からなるタンパク質ケージを形成することが知られている。また、標的タンパク質として、Ｓｕｐｅｒ ｆｏｌｄｅｒ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用した。

まず、フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターを鋳型に用いて、ＰＣＲ法によりフェリチン遺伝子断片を増幅した。また、ＧＦＰ遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ発現ベクターを鋳型に用いて、ＰＣＲ法によりＧＦＰ遺伝子断片を増幅した。

続いて、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ１発現ベクターにフェリチン遺伝子及びＧＦＰ遺伝子を導入し、フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の発現ベクターである、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターを作製した。フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質のＮ末端には６×Ｈｉｓタグを導入した。

フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）は、ベクターが１細胞あたり数１０コピー維持されることが知られているｐＢＲ３２２ｏｒｉであった。また、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターの複製起点（ｏｒｉ）は、ベクターが１細胞あたり数コピー維持されることが知られているｐ１５ｏｒｉであった。また、フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が組み込まれており、Ｈｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターにはクロラムフェニコール耐性遺伝子が組み込まれていた。

［実験例２］
（フェリチン及びＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の共発現）
フェリチン遺伝子が導入されたｐＥＴＤｕｅｔ１発現ベクター、及び、実験例１で作製したＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ発現ベクターを用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布しコロニーを形成させた。

続いて、形成されたコロニーを、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で６００ｎｍの吸光度が０．６程度となるまで培養した。

続いて、３０℃に温度を下げた後、ＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導し、引き続き３０℃で６時間培養した。続いて、培養液を遠心分離して大腸菌体を沈殿させた。得られた菌体は−８０℃で保存した。

［実験例３］
（ＧＦＰを含むタンパク質ケージの精製）
実験例２で凍結した菌体を０．３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波破砕機を用いて菌体を溶菌させた。

《Ｎｉ−アフィニティカラムによる精製》
続いて、溶菌液を遠心分離して可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＮｉ−アフィニティＨｉｓＴｒａｐＦＦ Ｃｒｕｄｅカラム（５ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加した。続いて、２０ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で未吸着タンパク質を溶出した。

カラムに吸着したタンパク質は、まず、４５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で溶出した。これにより、弱く結合したタンパク質を溶出した。

続いて、４５〜５００ｍＭイミダゾールの直線グラジエントにより、強く結合したタンパク質を溶出した。

続いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各溶出画分に含まれるタンパク質を確認した。

図１（ａ）は、Ｎｉ−アフィニティＨｉｓＴｒａｐＦＦ Ｃｒｕｄｅカラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムであり、図１（ｂ）は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す写真である。図１（ｂ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。

その結果、弱く結合したタンパク質はフェリチンに対しＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の含量が少ない画分（ｌｏｗＧＦＰ画分）であり、強く結合したタンパク質はフェリチンに対しＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質の含量が多い画分（ｈｉｇｈＧＦＰ画分）であることが確認された。そこで、以降の操作では、ｌｏｗＧＦＰ画分及びｈｉｇｈＧＦＰ画分を別々に精製した。

《陰イオン交換カラムによる精製》
続いて、Ｎｉ−アフィニティカラム溶出試料を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化した陰イオン交換ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラム（５ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加した。続いて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で未吸着タンパク質を溶出した。続いて、吸着したタンパク質を、０〜１Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントにより溶出した。

図２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、陰イオン交換ＨｉＴｒａｐＱＨＰカラムによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分を精製した結果であり、図２（ｂ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を精製した結果である。図２（ａ）及び（ｂ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。

続いて、フェリチンとＨｉｓ６−フェリチン−ＧＦＰ融合タンパク質をともに含む画分を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濃縮デバイスを用いて濃縮した。

《ゲル濾過カラムによる精製》
続いて、上記の濃縮した試料を、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０を移動相として分離した。

図２（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラムによるクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図２（ｃ）はｌｏｗＧＦＰ画分を精製した結果であり、図２（ｄ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を精製した結果である。図２（ｃ）及び（ｄ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。

また、溶出した各試料の電子顕微鏡観察も行った。図３（ａ）〜（ｅ）は、代表的な電子顕微鏡写真である。倍率は５万倍である。図３（ａ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体画分の電子顕微鏡写真であり、図３（ｂ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。また、図３（ｃ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体画分の電子顕微鏡写真であり、図３（ｄ）はｌｏｗＧＦＰ画分から精製した会合体画分の電子顕微鏡写真である。また、図３（ｅ）は野生型のフェリチン２４量体籠の電子顕微鏡写真である。

その結果、クロマトグラムのピーク形状と電子顕微鏡観察の結果から、ＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）が複数会合した分子種（会合体）が混在していることが明らかとなった。また、会合体には、オリゴマー及び凝集体が存在すると考えられた。そこで、分離したピーク画分を再度濃縮し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し会合体を除去した。

［実験例４］
（精製したタンパク質ケージの解析）
実験例３で精製した各タンパク質ケージを、超遠心速度法及びゲル濾過により解析した。

《超遠心速度法による解析》
続いて、精製したｌｏｗＧＦＰ画分及びｈｉｇｈＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）、及び野生型のタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）をそれぞれ超遠心速度法により解析し、分子量、沈降係数、分子の形状（ｆ／ｆ_０）を測定した。下記表１に、超遠心速度法による解析結果を示す。なお、アミノ酸配列から推定したフェリチンの分子量は４７９ｋＤａであり、ＧＦＰの分子量は２９ｋＤａであった。

その結果、各タンパク質ケージは分子量、沈降係数が異なっているにもかかわらず、ｆ／ｆ_０がほぼ同じであることが明らかとなった。この結果から、ＧＦＰはフェリチン２４量体籠に内包されており、タンパク質ケージの外側の形状はいずれのタンパク質ケージにおいても同様であると考えられた。

《ゲル濾過による解析》
実験例３で精製したｌｏｗＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体、及び、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のＧＦＰを含むタンパク質ケージ（フェリチン２４量体籠）の単量体を、それぞれ、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラム（２４ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０を移動相として分離し、波長２８０ｎｍにおける吸光度、及び波長４８８ｎｍにおける吸光度を解析した。なお、波長２８０ｎｍにおける吸光はタンパク質全般（主にトリプトファン残基）による吸収を検出するものであり、波長４８８ｎｍにおける吸光はＧＦＰによる吸収を検出するものである。

図４（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＧＬカラムによるクロマトグラム及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図４（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムであり、図４（ｂ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。また、図４（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分を解析した結果を示すクロマトグラムであり、図４（ｄ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図４（ｂ）及び（ｄ）中、上の矢印は融合タンパク質を示し、下の矢印はフェリチンを示す。

その結果、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、波長２８０ｎｍの吸光と波長４８８ｎｍの吸光の比が約６：１であった。一方、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、波長２８０ｎｍの吸光と波長４８８ｎｍの吸光の比が約３：１であった。

この結果から、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージと比較して、約２倍のＧＦＰを含むことが明らかとなった。ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージ１個は１分子のＧＦＰを含み、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージ１個は２分子のＧＦＰを含むと考えられた。

［実験例５］
（ＧＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化）
実験例３で精製した、ＧＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化を行った。まず、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濃縮デバイスを用いて、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージを約２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。また、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージを約１６ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。

続いて、フェリチンの既知の結晶化条件により各タンパク質ケージを結晶化させた。具体的には、１２．５〜２０ｍＭの塩化カドミウムを含む０．５〜１．０Ｍの硫酸アンモニウム溶液０．５ｍｌを母液に用いて、タンパク質ケージ試料１μＬと母液１μＬを混合し、ハンギングドロップ法により結晶化させた。

図５（ａ）〜（ｄ）は、結晶化を開始してから３日後の各結晶を、それぞれ、可視光及び紫外線（波長４３０ｎｍ以下）の存在下で光学顕微鏡観察した結果を示す写真である。倍率は７０倍である。

図５（ａ）はｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図５（ｂ）は、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。また、図５（ｃ）はｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図５（ｄ）は、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージの紫外線の存在下における顕微鏡写真である。

その結果、図５（ａ）に示すように、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージを結晶化させることができた。また、図５（ｂ）に示すように、ｌｏｗＧＦＰ画分のタンパク質ケージの結晶は紫外線の存在下で蛍光を発することから、ＧＦＰを含んでいることが確認された。

一方、図５（ｃ）に示すように、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは、アモルファス状態又は相分離により、上記の条件下では結晶化させることができなかった。また、図５（ｄ）に示すように、ｈｉｇｈＧＦＰ画分のタンパク質ケージは紫外線の存在下で蛍光を発することから、ＧＦＰを含んでいることが確認された。

［実験例６］
（ＧＦＰ以外のタンパク質を含むタンパク質ケージの結晶化）
ＧＦＰ以外のタンパク質を含むタンパク質ケージの結晶化を行った。標的タンパク質として、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を使用した。タンパク質ケージモノマーとして、フェリチンを使用した。フェリチンとしては、ウマ脾臓由来フェリチンＬ鎖を使用した。ＧＦＰの代わりにＹＦＰを使用した点以外は、実験例１〜３と同様にして、ＹＦＰを含むタンパク質ケージを精製した。

続いて、実験例５と同様にしてＹＦＰを含むタンパク質ケージの結晶化を行った。図６（ａ）及び（ｂ）は、結晶化を開始してから３日後の結晶を、可視光及び励起波長（波長５１０ｎｍ）の光の存在下で光学顕微鏡観察した結果を示す写真である。倍率は２５倍である。

図６（ａ）はタンパク質ケージの可視光下における顕微鏡写真であり、図６（ｂ）は、タンパク質ケージの励起波長の光の存在下における顕微鏡写真である。

その結果、図６（ａ）に示すように、ＹＦＰを含むタンパク質ケージを結晶化させることができた。また、図６（ｂ）に示すように、タンパク質ケージの結晶は励起波長の光の存在下で蛍光を発することから、ＹＦＰを含んでいることが確認された。

この結果は、ＧＦＰ以外のタンパク質を標的タンパク質とした場合においても、タンパク質ケージ、及びタンパク質ケージの結晶を作製することができることを示す。

本発明によれば、タンパク質ケージに標的タンパク質を取り込ませる技術を提供することができる。

Claims (9)

1. 標的タンパク質を含むタンパク質ケージの製造方法であって、
   タンパク質ケージモノマーと、前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質とを接触させて、タンパク質ケージを形成させる形成工程を含み、
   前記融合タンパク質はタグを有しており、前記タグは前記タンパク質ケージの表面に露出する、製造方法。
2. 前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、請求項１に記載の製造方法。
3. 結晶の製造方法であって、
   請求項１又は２に記載の製造方法により製造された、標的タンパク質を含むタンパク質ケージを結晶化させ、標的タンパク質を含むタンパク質ケージの結晶を得る結晶化工程を含む、製造方法。
4. 前記結晶化工程を細胞外で行う、請求項３に記載の製造方法。
5. 前記形成工程の後且つ前記結晶化工程の前に、前記タグを有する前記タンパク質ケージを精製する精製工程を更に含む、請求項３又は４に記載の製造方法。
6. 実質的に、標的タンパク質を含むタンパク質ケージのみから形成された結晶。
7. 請求項６に記載の結晶の結晶構造解析を行う工程を含む、前記標的タンパク質の立体構造解析方法。
8. タンパク質ケージモノマーの発現ベクターと、
   前記タンパク質ケージモノマー及び標的タンパク質の融合タンパク質の発現ベクター、又は、前記融合タンパク質の発現ベクター製造用ベクターと、を備え、
   前記融合タンパク質がタグを有している、標的タンパク質を含むタンパク質ケージ製造用キット。
9. 前記タンパク質ケージモノマーがフェリチンである、請求項８に記載のキット。