PL205181B1

PL205181B1 - Stała kompozycja zawierająca nośnik kolagenowy, fibrynogen i trombinę oraz zastosowanie nośnika kolagenowego

Info

Publication number: PL205181B1
Application number: PL363274A
Authority: PL
Inventors: Dagmar Stimmeder
Original assignee: Nycomed Pharma As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2010-03-31
Also published as: HU227987B1; CA2434964C; CA2434964A1; HUP0400768A3; IL157097A; EE200300349A; DE60203364D1; WO2002058749A8; BG66439B1; NO20033297D0; CZ20032198A3; CA2435159A1; NZ527166A; NO332462B1; IL157095A0; IS6885A; DE60203364T2; EE200300341A; JP2004520124A; KR100830294B1

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy stałej kompozycji zawierającej nośnik kolagenowy, fibrynogen i trombinę oraz zastosowania nośnika kolagenowego.

Stan techniki

Dostępne w handlu kleje fibrynowe, naśladujące ostatni etap kaskady krzepnięcia, składające się z bardzo stężonego roztworu fibrynogenu, który należy zmieszać z roztworem trombiny przed nanoszeniem na ranę chirurgiczną. Mieszaniny te zawierają inhibitor fibrynolizy, np. aprotyninę lub kwas ε-aminokapronowy, co zapobiega przedwczesnemu rozpuszczeniu skrzepu fibrynowego przez enzym fibrynolityczny, plazminę. Te dwuskładnikowe kleje fibrynowe są wartościowym elementem w różnych procedurach chirurgicznych, ale w przypadku znacznego krwawienia mogą zostać wypłukane przed osiągnięciem hemostazy. Ponadto dwuskładnikowe kleje fibrynowe wymagają pewnych etapów przygotowawczych, w tym rozmrożenia lub rozpuszczenia. W związku z tym są one raczej niepraktyczne i kłopotliwe w użyciu, a do ich skutecznego stosowania konieczne jest pewne doświadczenie.

Podczas ostatniego dziesięciolecia różne uszczelniacze fibrynowe stały się sposobami z wyboru w chirurgii w szeregu wskazaniach. Jednakże w większości badań z klejami fibrynowymi dodatkowo stosowano runo kolagenowe dla poprawy hemostazy i właściwości adhezyjnych, co wskazuje na ich wady oraz ograniczone stosowanie przez chirurgów.

Kolagen jako środek hemostatyczny stosuje się od końca lat sześćdziesiątych. Kolagen jest najczęstszym białkiem strukturalnym u wszystkich ssaków. Monomeryczne białko o masie około 300 kDa (tropokolagen) jest usieciowane w swoistych miejscach wiązaniami kowalencyjnymi. W związku z tym dojrzałe białko jest nierozpuszczalne i tworzy charakterystyczne fibryle o dużej wytrzymałości na rozciąganie. Opisano szereg podgrup kolagenu, spośród których najpowszechniejszym jest kolagen typu I, główny rodzaj kolagenu znajdujący się w skórze, ścięgnach, kościach i rogówce. Kolagen to włókniste białko złożone z potrójnej helisy o długości około 290 nm. Pięć spośród tych potrójnych helis (cząsteczek tropokolagenu) jest ułożonych schodkowo i tworzy mikrofibrylę o średnicy około 3,6 nm. Te mikrofibryle mają segmenty polarne i niepolarne, łatwo dostępne dla swoistych oddziaływań pomiędzy fibrylami i w obrębie nich. Mikrofibryle upakowane są w tetragonalną sieć i tworzą subfibryle o średnicy około 30 nm. Te subfibryle są zorganizowane w postać fibryli kolagenu, podstawowej jednostki tkanki łącznej, o średnicy kilkuset nm, dzięki czemu jest ona widoczna w mikroskopie świetlnym w postaci cienkiej linii.

Kolagen można stosować jako materiał do uszczelniania ran, ewentualnie z powłoką zawierającą klej fibrynowy. Kleje fibrynowe, tzn. połączenie fibrynogenu, trombiny i aprotyniny od wielu lat stosuje się z powodzeniem w terapii do sklejania tkanek i nerwów oraz do uszczelniania powierzchni w przypadkach drobniejszych krwawień. Niedogodnością klejów fibrynowych jest to, że w przypadku poważniejszego krwawienia klej zostaje zazwyczaj wypłukany przed zajściem wystarczającej polimeryzacji fibryny. Aby przezwyciężyć ten problem chirurdzy ręcznie nanoszą kleje fibrynowe na chłonne nośniki, np. runo kolagenowe.

Pomimo imponującego powodzenia tych połączonych zastosowań sposobu tego nie zastosowano na szerszą skalę ze względu na pewne niedogodności. Jego przygotowanie jest stosunkowo niedogodne, realizacja sposobu wymaga doświadczenia i wykwalifikowanego personelu, a preparat nie jest łatwo dostępny w sytuacjach nagłych, gdyż czas jego przygotowania wynosi 10 -15 minut. Te czynniki sprawiły, że poszukiwano lepszego produktu, co doprowadziło do opracowania stałego połączenia nośnika kolagenowego, pokrytego powłoką złożoną ze stałego fibrynogenu, stałej trombiny i stałej aprotyniny, co ujawniono w EP 0059265.

Kolagen ujawniony w EP 0059265 służy przede wszystkim jako nośnik, który absorbuje i zapewnia stabilność mechaniczną preparatu krzepnięcia, którym jest powleczony.

Opracowano produkt łączący hemostatyczne właściwości kleju fibrynowego z korzyściami płynącymi z zastosowania kolagenu jako nośnika; jest on dostępny na rynku pod nazwą handlową TachoComb®. TachoComb® to gotowe do użycia i łatwe w stosowaniu stałe połączenie plastra kolagenowego z następującymi czynnymi składnikami kleju fibrynowego: ludzkim fibrynogenem, bydlęcą trombiną i bydlęcą aprotyniną.

TachoComb® sprzedawany jest od początku lat dziewięćdziesiątych przez Nycomed Pharma i został zastosowany w badaniach klinicznych w Europie u ponad 2500 pacjentów. Ponadto produkt stosowano u ponad 700 pacjentów w japońskim programie klinicznym w szeregu wskazaniach, w tym resekcjach wątroby i płuca, zabiegach chirurgicznych na przewodzie żółciowym, w chirurgii śledziony,

PL 205 181 B1 nerek i trzustki, chirurgii ENT, chirurgii ginekologicznej i chirurgii naczyniowej. Stwierdzono, że TachoComb® jest skuteczny i bezpieczny.

W przebiegu przeprowadzonych badań klinicznych nie donoszono o klinicznych powikł aniach związanych ze stosowaniem TachoComb®. Niemniej jednak w trzech badaniach japońskich wystąpiły przeciwciała przeciwko aprotyninie.

W ciągu wieloletniego klinicznego stosowania tysię cy plastrów TachoComb® stwierdzono zaledwie 37 spontanicznych reakcji niepożądanych na lek (ADR, adverse drug reaction). Szesnaście spośród tych ADR mogło być teoretycznie związanych z reakcjami przeciwko składnikom TachoComb® (przeziębienie, gorączka, eozynofilia, wydłużony czas protrombinowy, nadwrażliwość, reakcje immunologiczne lub alergiczne). Jedna ADR (odpowiedź immunologiczna) była najwyraźniej związana z zastosowaniem TachoComb®.

W WO97/37694 (Immuno France S.A.) ujawniono w przykł adzie porównawczym 4, ż e gdy stosowano produkt kolagenowy lub TachoComb®, nie obserwowano hemostazy, co doprowadziło do śmierci z wykrwawienia podczas stosowania TachoComb®, podczas gdy hemostazę osiągnięto w czasie 5 minut w przypadku stosowania produktu kolagenowego niezawierającego trombiny, wytworzonego według WO97/37694.

W WO96/40033 podkreś lono wady bydlę cej trombiny stosowanej w TachoComb®, gdyż stosowanie trombiny bydlęcej lub trombiny pochodzącej od innych gatunków może prowadzić do szkodliwego zanieczyszczenia wirusami i ewentualnego przeniesienia chorób bydlęcych, takich jak gąbczasta encefalopatia bydła.

W publikacji WO99/59647 ujawniono hemostatyczny warstwowy („sandwiczowy”) bandaż zawierający (1) warstwę chłonnego materiału, którym może być kolagen, (2) pierwszą warstwę fibrynogenu sąsiadującą z warstwą chłonnego materiału, (3) warstwę trombiny sąsiadującą z pierwszą warstwą fibrynogenu, (4) drugą warstwę fibrynogenu sąsiadującą z warstwą trombiny. Publikacja ta nie podaje żadnych szczegółów dotyczących nośnika kolagenowego. Ponadto ujawniono tu jedynie rozwiązanie, w którym trombinę i fibrynogen umieszczono w różnych warstwach.

W publikacji US 4 453 939 (Zimmermann i in., zgłoszenie złożone 11 lutego 1982 r.) ujawniono kompozycję zawierającą nośnik kolagenowy w postaci pianki powlekany mieszaniną trombiny i fibrynogenu, ewentualnie z aprotyniną. Nie podano w niej szczegółów odnoszących się do nośnika kolagenowego i rozmieszczenia fibrynogenu i trombiny. Nie ujawniono tu również jakichkolwiek danych dotyczących skuteczności produktów w zastosowaniach in vitro lub in vivo.

W publikacji US 4 606 337 (Zimmermann i in., zgł oszenie zł oż one 19 kwietnia 1983 r.) ujawniono materiał do zamykania ran zawierający matrycę glikoproteinową oraz trombinę i fibrynogen, gdzie materiał w postaci arkusza jest suchy i ma strukturę wielowarstwową, przy czym co najmniej jedna warstwa wielowarstwowego arkusza materiału nie zawiera trombiny i zawiera w matrycy glikoproteinowej fibrynogen rozprowadzony zasadniczo jednorodnie. Ponadto, co najmniej jedna inna warstwa wielowarstwowego arkusza materiału nie zawiera fibrynogenu i zawiera w matrycy glikoproteinowej trombinę rozprowadzoną zasadniczo jednorodnie. W publikacji tej nie ujawniono szczegółów dotyczących nośnika kolagenowego. Brak jest tu również jakiejkolwiek informacji o tym, że trombina i fibrynogen mogłyby być równomiernie rozmieszczone w mieszaninie na nośniku kolagenowym.

W publikacji WO99/56797 (np. w zastrz. 31) ujawniono rekombinacyjną fibrynową substancję uszczelniającą zawierającą ludzki rekombinacyjny fibrynogen, ludzki rekombinacyjny czynnik XIII, ludzką rekombinacyjną trombinę oraz źródło wapnia. Nie wskazano tu jednak nośnika kolagenowego.

Wynalazek niniejszy dotyczy gotowej do stosowania kompozycji do klejenia tkanek, uszczelniania tkanek oraz hemostazy, składającej się zasadniczo z nośnika pokrytego trwale związanymi ludzkimi składnikami kleju fibrynowego: ludzkim fibrynogenem i ludzką trombiną. To stałe połączenie można stosować bezpośrednio, np. na powierzchnię rany. W zetknięciu z krwią, płynami ustrojowymi lub fizjologicznym roztworem soli mechanizm tego układu naśladuje ostatni etap kaskady krzepnięcia, w którym trombina katalizuje przemianę fibrynogenu do fibryny oraz aktywację czynnika XIII z wytworzeniem czynnika XIIIa. Po wytworzeniu czynnik XIIIa stabilizuje skrzep fibrynowy poprzez kowalencyjne usieciowanie.

Podobnie jak klej dwuskładnikowy, powierzchnia rany i nośnik zostają ze sobą sklejone poprzez polimeryzację. Podczas tego trwającego około 3-5 minut procesu kompozycję według wynalazku korzystnie dociska się do okolicy rany. Składniki kompozycji według wynalazku ulegają degradacji enzymatycznej w czasie około 4-6 miesięcy po zastosowaniu.

Tak więc wynalazek dotyczy stałej kompozycji zawierającej nośnik kolagenowy, fibrynogen i trombinę, charakteryzującej się tym, że składa się zasadniczo z:

PL 205 181 B1

a) nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych: moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm oraz równomiernie rozmieszczonej na tym nośniku i związanej z nim mieszaniny

b) stałego ludzkiego fibrynogenu i

c) stałej ludzkiej trombiny.

Korzystnie kompozycja według zawiera nośnik kolagenowy, którym jest gąbka kolagenowa zawierająca kolagen typu I pochodzący ze źródeł ssaczych, transgenicznych lub zrekombinowanych.

Korzystny nośnik kolagenowy ma jedną lub większą liczbę aktywnych stron, na których fibrynogen jest obecny w ilości 2 - 10 mg/cm², np. 4,3 - 6,7 mg/cm², korzystnie około 5,5 mg/cm², a trombina jest obecna w ilości 1,5 - 5,5 IU/cm², korzystnie około 2,0 IU/cm².

W korzystnej postaci fibrynogen ten jest oczyszczony ze źródła naturalnego, lub też jest to fibrynogen transgeniczny lub zrekombinowany.

W korzystnej postaci trombina ta jest oczyszczona ze źródła naturalnego, lub też jest to trombina transgeniczna lub zrekombinowana.

Korzystnie kompozycja do hemostazy, uszczelniania i klejenia tkanek zawiera elastyczny nośnik kolagenowy mający co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm, zawierająca ponadto mieszaninę stałego ludzkiego fibrynogenu i stałej ludzkiej trombiny, i niezawierają ca ż adnego ś rodka antyfibrynolitycznego, takiego jak aprotynina, kwas ε -aminokapronowy lub a2-antyplazmina przy czym stały ludzki fibrynogen i stała trombina są związane z nośnikiem w taki sposób, że ścieranie wynosi mniej niż 1,0 mg/cm², gdy próbkę powlekanego nośnika wstrząsa się na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością około 1000 obrotów/minutę przez 2 minuty oraz gdy powleczony nośnik wprowadzi się do przyrządu endoskopowego, a następnie wyjmie z niego, powleczony nośnik pozostaje niezmieniony, a strata powłoki wynosi mniej niż 20%, co wskazuje na giętkość nośnika oraz trwałą adhezję stałego fibrynogenu i stałej fibryny, oraz kompozycja jest szczelna w stosunku do powietrza i cieczy oraz charakteryzuje się wskaźnikiem elastyczności wynoszącym co najmniej 1,25, oznaczonym w teście polegającym na unieruchomieniu powleczonego nośnika na arkuszu lateksowym, trzykrotnym rozciągnięciu lateksu działaniem ciśnienia, oraz wykonaniu za trzecim razem pomiaru powierzchni powleczonego nośnika w najwyższym punkcie rozciągania arkusza lateksowego i porównaniu powierzchni rozciągniętej powleczonego materiału z jego powierzchnią wyjściową.

Wynalazek dotyczy także zastosowania nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

₂ moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm oraz wystarczającej ilości ludzkiego fibrynogenu i wystarczającej ilości ludzkiej trombiny do wytwarzania produktu do uszczelniania tkanek.

Wynalazek dotyczy również zastosowania nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

₂ moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm oraz wystarczającej ilości ludzkiego fibrynogenu i wystarczającej ilości ludzkiej trombiny do wytwarzania produktu do hemostazy.

Wynalazek dotyczy również zastosowania nośnika mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

₂ moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³,

PL 205 181 B1 średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm, oraz wystarczającej ilości ludzkiego fibrynogenu i wystarczającej ilości ludzkiej trombiny do wytwarzania produktu do klejenia tkanek.

Korzystnie wynalazek dotyczy zastosowań w interwencjach chirurgicznych w przewodzie żołądkowo-jelitowym, np. przełyku, żołądku, jelicie cienkim, jelicie grubym, odbytnicy lub narządach miąższowych, takich jak wątroba, śledziona, trzustka, nerki, płuca, nadnercza, tarczyca i węzły chłonne, w chirurgii układu sercowo-naczyniowego, w chirurgii klatki piersiowej, w tym chirurgii tchawicy, oskrzeli lub płuc, chirurgicznych interwencjach w uchu, nosie i gardle (ENT), w tym w stomatologii, w chirurgii ginekologicznej, urologicznej, naczyniowej, chirurgii kości (np. resekcji kości gąbczastej), w interwencjach chirurgicznych w stanach nagłych, neurochirurgii, przetokach limfatycznych, żółciowych i mózgowordzeniowych (CSF) oraz przy ulatnianiu się powietrza podczas chirurgii klatki piersiowej i płuc.

Korzystnie nośnikiem jest gąbka kolagenowa, taka jak gąbka kolagenowa składająca się zasadniczo z włókien kolagenu typu I.

Także korzystnie nośnik ma jedną lub większą liczbę aktywnych stron, na których fibrynogen jest obecny w ilości 2 - 10 mg/cm², np. 4,3 - 6,7 mg/cm², korzystnie około 5,5 mg/cm², a trombina jest obecna w ilości 1,5-2,5 IU/cm², korzystnie 2,0 IU/cm².

Korzystnie stosuje się fibrynogen oczyszczony ze źródła naturalnego.

Korzystnie stosuje się fibrynogen transgeniczny lub zrekombinowany.

Korzystnie stosuje się trombinę oczyszczoną ze źródła naturalnego.

Korzystnie stosuje się trombinę transgeniczną lub zrekombinowaną.

Kompozycja według wynalazku może charakteryzować się dwiema, trzema lub wszystkimi z wymienionych powyż ej właściwości fizycznych. W obecnie korzystnych postaciach materiał nośnikowy wytwarza się w sposób opisany w DK PA 2001 00135, a także w zgłoszeniu zatytułowanym „Sposób wytwarzania gąbki kolagenowej, urządzenie do wydzielania części pianki kolagenowej oraz wydłużona gąbka kolagenowa”, złożonym przez Nycomed Pharma AS 25 stycznia 2002, zastrzegającym pierwszeństwo z tego zgłoszenia. W obecnym kontekście określenie „średnica komórki” należy rozumieć jako najdłuższą linię prostą pomiędzy ścianami komórki, tzn. najwyższy przekątny wymiar w komórce. Komórki mogą mieć kształt wielokątny, np. ośmiokątny. Zatem po przecięciu nośnika komórki są dzielone i rozcinane na jamy. Stały fibrynogen i stała trombina są związane na nośniku, a wię kszość ich znajduje się w jamach, co zapewnia zasadniczo równomierny rozkł ad stałej trombiny i stałego fibrynogenu. Ze względu na to oraz na związanie możliwe jest wprowadzenie znacznych ilości fibrynogenu i trombiny do nośnika, w przeciwieństwie do sytuacji, w której kompozycje trombiny i fibrynogenu są np. zakraplane lub natryskiwane na materiał .

Wytwarzanie powlekanego nośnika

Wytwarzanie powlekanego nośnika obejmuje zasadniczo

- wytworzenie zawiesiny aktywnych sk ładników

- równomierne rozmieszczenie zawiesiny na noś niku

- suszenie powlekanego nośnika w celu otrzymania stałej kompozycji/związania aktywnych składników z nośnikiem.

Wytwarzanie zawiesiny fibrynogenu i trombiny obejmuje:

- dostarczenie mieszaniny fibrynogenu, będącej mieszaniną fibrynogenu z alkoholem, takim jak etanol

- dostarczenie mieszaniny trombiny, będącej mieszaniną trombiny z alkoholem, takim jak etanol

- zmieszanie mieszaniny fibrynogenowej i mieszaniny trombinowej, z wytworzeniem tej zawiesiny.

W etapie dostarczania mieszanin mieszaninę moż na homogenizować lub przesiewać, z wytworzeniem zawiesiny zawierającej cząstki fibrynogenu i trombiny ze średnią średnicą Folka-Warda cząstek w granicach 25 - 100 μm. Temperatura wynosi 0 - 12°C.

Nośnikiem może być nośnik kolagenowy, np. gąbka kolagenowa. Gąbka kolagenowa może spełniać co najmniej jedno, a korzystnie szereg z następujących kryteriów:

- wartość pH 5,0 - 6,0

- zawartość kwasu mlekowego najwyżej 5%,

- zawartość amoniaku najwyżej 0,5%,

- zawartość rozpuszczalnego białka, liczona jako zawartość albuminy, najwyżej 0,5%,

- zawartość popiołu siarczanowego najwyżej 1,0%,

- zawartość metali ciężkich najwyżej 20 ppm,

- czystość mikrobiologiczna, najwyżej 10³ CFU/g,

- zawartość kolagenu 75 - 100%,

PL 205 181 B1

- gę stość 1 - 10 mg/cm³,

- moduł sprężystoś ci w zakresie 5 - 100 N/cm.

W obecnie korzystnej postaci nośnik kolagenowy wytwarza się jak opisano w DK PA 2001 00135. Właściwości fizyczne trzech przykładowych nośników kolagenowych przedstawiono w poniższej tabeli:

Przykład	I	II	III
Wartość pH	5,3	5,1	5,4
Zawartość kwasu mlekowego	2,3%	2,8%	2%
Zawartość amoniaku	0.1%	0,2%	0,1%
Zawartość białka rozpuszczalnego	0,04%	0,05%	0,08%
Zawartość popiołu siarczanowego	0,3%	0,3%	0,3%
Czystość mikrobiologiczna (CFU/g)	<12 - 345	<18 - 124	<11 - 33
Zawartość kolagenu w przeliczeniu na suchą masę	95%	95%	98%
Zawartość wody	14%	15%	16%
Moduł sprężystości	10,4 - 42,1 N/cm	15 - 50 N/cm	12,3 - 41,0 N/cm
Wielkość porów (średnica; wartość średnia)	2,9 mm	2,1 mm	2,9 mm
Gęstość	2,9 - 5,3 mg/cm³	2,9 - 5,9 mg/cm³	2,4 - 5,0 mg/cm³

Równomierne rozmieszczenie zawiesin uzyskuje się poprzez naniesienie zawiesiny na nośnik z zastosowaniem urządzenia nakraplającego, jak ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5942278 i 6177126 lub aplikatora z co najmniej jedną dyszą. Aplikator wtryskowy tłoczy zawiesinę przez dyszę w czasie, gdy nośnik i dysza przesuwają się względem siebie. Aplikator może zawierać lub znajdować się w pobliżu pasa transmisyjnego, jednostki mieszającej połączonej z pompą lub układem pomp lub innym sprzętem podającym oraz przemieszczającą się poprzecznie dyszą lub układem dysz, np. pod kątem prostym w stosunku do pasa transmisyjnego. W zależności od konkretnych właściwości ośrodków, dysza lub układ dysz mogą mieć różne kształty i wielkości. Dyszę lub układ dysz można połączyć ze sprzętem dostarczającym przy pomocy rurek. Urządzenie podające może podawać ośrodek powlekający z jednostki mieszającej do układów dysz. W procesie powlekania układ dysz może poruszać się względem nośnika. W pozycji spoczynkowej może znajdować się po jednej stronie pasa transmisyjnego. Proces powlekania można inicjować barierą świetlną wyczuwającą obecność nośnika na pasie transmisyjnym i podobnie można go przerwać sygnałem bariery świetlnej. Taki aplikator charakteryzuje się stosunkowo niewielką martwą przestrzenią i jest łatwy w obsłudze, w tym łatwy w czyszczeniu. Charakteryzuje się on ponadto możliwością przerwania procesu powlekania w dowolnym momencie, znajduje zastosowanie dla stosunkowo szerokiego zakresu lepkości i zapewnia równomierne powlekanie.

₂

Oba układy nanoszą zawiesinę w objętości 0,08 - 0,12 ml zawiesiny na cm² nośnika.

Ważnym etapem jest suszenie zawiesiny fibrynogenu, trombiny i alkoholu, nanoszonej jako mokra powłoka na powlekaną powierzchnię nośnika. Przykładowy sposób obejmuje etap poddania powlekanego nośnika działaniu ciśnienia poniżej 1000 milibarów, z wytworzeniem wysuszonej powłoki na powierzchni nośnika oraz związaniem wysuszonej powłoki z tą powierzchnią.

Poprzez doprowadzenie próżni i zastosowanie próżni w procesie suszenia utrzymać można niską temperaturę (2 - 10°C) i wysoką wilgotność względną (80 - 95%); w takich warunkach utrzymać można strukturę i właściwości fizyczne nośnika, w szczególności nośnika w postaci kolagenu, np. gąbki kolagenowej, a także fibrynogenu i trombiny.

Określenie „składający się zasadniczo z” oznacza, że te trzy składniki są kluczowe i niezbędne dla wynalazku. W kompozycji mogą jednakże znajdować się również dodatki, które nie są niezbędne, takie jak jony wapnia i marker barwiący, np. ryboflawina. Kompozycja może również zawierać inne użyteczne składniki, np. jedną lub większą liczbę czynnych farmaceutycznie substancji, które mogą np. być wybrane z grupy, na którą składają się antybiotyki, takie jak środki przeciwbakteryjne lub przeciwgrzybicze oraz środki przeciwnowotworowe.

PL 205 181 B1

Chociaż materiałem nośnikowym jest korzystnie gąbka kolagenowa, zawierająca kolagen typu I pochodzący od ssaków lub źródeł transgenicznych lub rekombinowanych, można go otrzymać z innych rodzajów kolagenu, tzn. kolagenu typu I, II, III, IV, VII i X. Można jednakże wyobrazić sobie, że nośnikiem może być ulegający biodegradacji polimer, taki jak polikwas hialuronowy, polihydroksykwas, np. kwas mlekowy, kwas glikonowy, kwas hydroksybutanowy, celuloza lub żelatyna.

W korzystnej postaci wynalazku kompozycja zawiera nośnik, który ma jedną lub większą liczbę aktywnych stron, na których fibrynogen jest obecny w ilości 2 - 10 mg/cm², np. 4,3 - 6,7 mg/cm², korzystnie około 5,5 mg/cm², a trombina jest obecna w ilości 1,0 - 5,5 IU/cm², korzystnie około 2,0 IU/cm². Fibrynogen i/lub trombina są korzystnie ludzkie, np. oczyszczone ze źródła naturalnego sposobami znanymi fachowcom, bądź stanowią transgeniczny lub zrekombinowany ludzki fibrynogenem i/lub trombinę, wytwarzane sposobami znanymi fachowcom.

Wszystkie wcześniejsze produkty, takie jak TachoComb®, Beriplast® i TissueSeal® zawierają aprotyninę lub podobne środki anty-fibrynolityczne. Aprotyninę uzyskać można jedynie ze źródła bydlęcego. Celem wynalazku było opracowanie kompozycji z lepszym materiałem nośnikowym i opartej wyłącznie na składnikach ludzkich, zrekombinowanych lub transgenicznych. W związku z tym opracowano materiał nośnikowy i zbadano, czy możliwe jest zastąpienie bydlęcej trombiny trombiną ludzką oraz uniknięcie stosowania aprotyniny. Starano się osiągnąć ten cel wynalazku w dwóch etapach.

Po pierwsze opracowano TachoComb H jako następcę TachoComb®, w którym np. trombinę bydlęcą zastąpiono trombiną Ludzką. Doświadczenie kliniczne ze stosowaniem TachoComb H zebrano w szeregu potwierdzających (faza IlIa) badań klinicznych we wskazaniach takich jak hemostaza, klejenie tkanek i uszczelnianie tkanek. Niepublikowane jak dotąd wyniki uzyskane w tych badaniach potwierdziły skuteczność i bezpieczeństwo TachoComb H w kontroli przecieku krwi i powietrza, jako leczenie uzupełniające w stosunku do szwów w hemostazie, klejeniu tkanek i uszczelnianiu tkanek podczas zabiegów chirurgicznych. W szczególności zarówno w przypadku zabiegów chirurgicznych na naczyniach, jak i na wątrobie, w przekonywują cy sposób wykazano skuteczność TachoComb H w uzyskiwaniu lokalnej hemostazy, wyrażoną jako istotna redukcja „czasu do hemostazy” w porównaniu z kontrolą.

Stwierdzono również, że TachoComb H może zmniejszać wielkość defektów płucnych, skutkiem czego jest szybsze ustępowanie wycieku powietrza, oraz że może on być użyteczny w uszczelnianiu poważnych przecieków płucnych oraz w płucach z rozedmą.

Niemniej jednak zarówno TachoComb®, jak i TachoComb H zawierają aprotyninę jako integralną część produktu. Aprotyninę uznano za czynnik niezbędny dla hamowania ewentualnej konwersji niewielkich ilości plazminogenu do plazminy w składniku fibrynogenowym oraz dla zapobieżenia przedwczesnej lizie skrzepu fibrynowego, szczególnie w przypadkach stanów przebiegających z nadmierną aktywnością fibrynolityczną.

Zaplanowano nowe doświadczenia w celu zbadania hipotezy o konieczności stosowania aprotyniny. Badania in vitro wykazały anty-fibrynolityczne ochronne działanie aprotyniny w skrzepie, oraz wykazały, że TachoComb® bez aprotyniny (TachoComb S) nie ulegał rozpuszczeniu w bardzo krótkim czasie. W związku z tym opracowano stresujące modele zwierzęce i porównano TachoComb S z TachoComb H, uzyskując podobną skuteczność. We wszystkich modelach stosowano odpowiednio TachoComb H lub S jako jedyny środek do osiągania hemostazy.

Wykonano cztery obszerne serie eksperymentalne dla zbadania skuteczności oraz wzorca histopatologicznego obecnie korzystnej postaci wynalazku, TachoComb S w porównaniu z TachoComb H. TachoComb S lub TachoComb H nanoszono na narządy: wątrobę, śledzionę, trzustkę lub mózg/opony psów, świń lub królików. Eksperymenty opracowano w taki sposób, aby przypominały normalne warunki chirurgiczne, warunki ciężkiego stresu oraz nadmiernej aktywności układu fibrynolitycznego.

Wyniki uzyskane w tych czterech badaniach nie wykazały istnienia znaczącej różnicy pomiędzy TachoComb S a TachoComb H. Oba produkty zachowywały się w podobny sposób pod względem skuteczności hemostazy i uszczelnienia rany, również w warunkach znacznego stresu, np. podwyższonego ciśnienia wewnątrz narządów lub nadmiernej aktywności układu fibrynolitycznego, indukowanej miejscowym nanoszeniem r-tPA.

Można wnioskować, że przedkliniczny program mający na celu ocenę ogólnej konieczności stosowania aprotyniny jako składnika TachoComb H wykazał podobną skuteczność TachoComb H i TachoComb S. Oba produkty stosowano z powodzeniem jako jedyne środki do osiągania hemostazy, sklejenia tkanek i uszczelnienia tkanek we wszystkich warunkach eksperymentalnych. W przebiegu doświadczeń na zwierzętach nie występowały niepożądane reakcje tkankowe. W związku z tym aprotyninę wyeliminowano z kompozycji według wynalazku.

PL 205 181 B1

Oczekuje się, że kompozycja według wynalazku w warunkach klinicznych będzie wywierać takie same działania w zakresie hemostazy, klejenia tkanek i uszczelniania tkanek jak jej poprzednicy i będzie charakteryzować się takim samym lub jeszcze korzystniejszym profilem bezpieczeństwa. Nieobecność aprotyniny, która dostępna jest obecnie wyłącznie ze źródeł bydlęcych, podwyższa bezpieczeństwo w odniesieniu do reakcji nadwrażliwości. W tym kontekście należy zauważyć, że w trzech badaniach japońskich występowały przeciwciała przeciwko aprotyninie. Nie należy spodziewać się występowania odpowiedzi immunologicznych w przypadku kompozycji pozbawionej aprotyniny.

W obecnie korzystnej postaci wynalazek dotyczy kompozycji do osiągania hemostazy, uszczelnienia i klejenia tkanek, zawierającej giętki nośnik, charakteryzujący się co najmniej jedną z następujących właściwości fizycznych:

moduł sprężystości w zakresie 5 - 100 N/cm, np. 10 - 50 N/cm; gęstość 1 - 10 mg/cm³, np. 2 - 7 mg/cm³;

średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm, która zawiera również stały fibrynogen oraz stałą trombinę i nie zawiera żadnego środka anty-fibrynolitycznego, takiego jak aprotynina, kwas ε-aminokapronowy lub a2-antyplazmina, gdzie stały fibrynogen i stała trombina są związane na nośniku w taki sposób, że ścieranie wynosi mniej niż 1,0 mg/cm² gdy próbkę powlekanego materiału wstrząsa się na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością około 1000 obrotów/min przez 2 minuty oraz jeżeli powleczony materiał jest wprowadzony do aparatu endoskopowego, a następnie usunięty, materiał pozostaje zasadniczo niezmieniony, a strata materiału powlekającego wynosi mniej niż 20%, co wskazuje na giętkość nośnika oraz trwałą adhezję stałego fibrynogenu i stałej trombiny oraz ten materiał jest zasadniczo szczelny w stosunku do powietrza i cieczy i charakteryzuje się wskaźnikiem elastyczności wynoszącym co najmniej 1,25, oznaczonym w teście polegającym na unieruchomieniu powleczonego nośnika na arkuszu lateksowym, trzykrotnym rozciągnięciu lateksu pod wpływem ciśnienia, oraz wykonaniu za trzecim razem pomiaru powierzchni powleczonego nośnika w najwyższym punkcie rozciągania arkusza lateksowego i porównaniu rozciągniętej powierzchni powleczonego materiału z jego wyjściową powierzchnią.

Korzystna kompozycja według wynalazku, w której fibrynogen i trombina są ludzkie, np. oczyszczone ze źródła naturalnego bądź są transgeniczną lub zrekombinowaną, trombiną i fibrynogenem, jest jedynym dostępnym nie-bydlęcym uszczelniającym materiałem fibrynowym, z ustalonym połączeniem aktywnych składników, którymi powleczony jest giętki nośnik, charakteryzująca się kilkoma korzystnymi właściwościami:

Łatwość do użycia, bez konieczności czasochłonnego odmrażania ani procedury przygotowania

Łatwość nanoszenia bezpośrednio na większość tkanek i powierzchni narządów

Możliwe stosowanie endoskopowe

Nie ma problemów z wyczerpaniem się hemostazy lub wypłukaniem z docelowej okolicy

Połączenie działania klejącego skrzepu fibrynowego z mechanicznymi właściwościami giętkiego nośnika

Znaczna giętkość i odporność na silne rozciąganie i ucisk

Skuteczna hemostaza i uszczelnienie tkanek w ciągu 3 - 5 minut

Korzystny profil bezpieczeństwa, np. brak składników bydlęcych

Biodegradacja z pozostawieniem jedynie drobnych blizn tkankowych

Możliwość przechowywania w temperaturze od +2 do +8°C, przewidywany dopuszczalny okres przechowywania 36 miesięcy lub w temperaturze pokojowej, przez co najmniej 2 lata.

Powodem opracowania korzystnej kompozycji według wynalazku jest potrzeba pozbycia się składnika bydlęcego dla uniknięcia jakiegokolwiek, nawet teoretycznego, ryzyka przeniesienia chorób z bydła na ludzi, w tym przeniesienia gąbczastych encefalopatii. Zatem aktywne składniki, fibrynogen i trombina, są pochodzenia ludzkiego, a bydlęcą aprotyninę, inhibitor enzymu fibrynolitycznego, plazminy, usunięto z kompozycji. Korzyścią płynącą zatem z korzystnej kompozycji według wynalazku, niezawierającej składników bydlęcych, jest eliminacja ryzyka przeniesienia chorób, w tym gąbczastej encefalopatii bydła (BSE) poprzez materiał bydlęcy.

Podobnie do innych klejów fibrynowych, kompozycja według wynalazku działa poprzez odtworzenie ostatniego etapu kaskady krzepnięcia krwi. Mieszanina fibrynogenu i trombiny tworzy umocowaną

PL 205 181 B1 stałą warstwę na powierzchni giętkiego nośnika. W zetknięciu z płynami, np. krwawiącą powierzchnią, płynami ustrojowymi lub fizjologicznym roztworem soli następuje rozpuszczenie składników warstwy, dyfuzja do rany i początek reakcji.

Proces polimeryzacji prowadzi do silnej adhezji pomiędzy powierzchnią rany a plastrem nośnika. W czasie potrzebnym do sklejenia, tzn. 3 - 5 minut, kompozycję według wynalazku należy korzystnie delikatnie docisnąć do powierzchni rany. Plaster nośnika zapewnia wsparcie mechaniczne, umożliwiające tamponowanie rany. Plaster utrzymuje składniki koagulujące na miejscu wówczas, gdy rana obficie krwawi, i zapobiega potencjalnemu- wznowieniu krwawienia. Mechanizm działania obejmuje konwersję przez trombinę fibrynogenu do fibryny poprzez odszczepienie peptydów. Monomery fibryny spontanicznie ulegają polimeryzacji w pasma fibryny, tworząc lepki i elastyczny skrzep, który przykleja plaster nośnika do powierzchni rany. Matryca fibrynowa służy następnie jako rusztowanie dla migracji fibroblastów (fig. 8).

Podobnie jak w przypadku kleju dwuskładnikowego, powierzchnia rany zostaje sklejona z nośnikiem poprzez polimeryzację. Trwałość mechaniczna plastra nośnikowego wspomaga tamponowanie, uzupełniając działanie skrzepu fibrynowego. Ponadto aktywne substancje znajdują się jedynie na powierzchni nośnika skierowanej w stronę rany, a poprzez tamponowanie i delikatny ucisk nie dochodzi do ich dyfuzji przez nośnik. W konsekwencji, w przeciwieństwie do sytuacji, w której stosuje się większość klejów fibrynowych, nie następuje adhezja pomiędzy uszkodzonym obszarem, pokrytym kompozycją według wynalazku a innymi narządami lub ich fragmentami, na których stosuje się kompozycję według wynalazku.

W przeciwieństwie do klejów cyjanoakrylanowych i żelatynowo-rezorcyno-formaldehydowych (GRF), charakteryzujących się znacznymi działaniami histotoksycznymi w stosunku to tkanki miąższowej, stała kompozycja według wynalazku ulega fizjologicznej degradacji i zastąpieniu tkanką w czasie tygodni lub miesięcy po naniesieniu, głównie według dwóch mechanizmów:

1. Skrzep fibrynowy ulega degradacji częściowo przez fibrynolizę, częściowo przez fagocytozę komórkową.

2. Nośnik ulega degradacji warstwa po warstwie przez absorpcyjną tkankę ziarnistą i przekształcany jest w pseudo-kapsułki, złożone z endogennej tkanki łącznej.

Kompozycja według wynalazku jest użyteczna dla hemostazy, klejenia i uszczelniania tkanek, w szczególności w interwencjach chirurgicznych w przewodzie żołądkowo-jelitowym, np. przełyku, żołądku, jelicie cienkim, jelicie grubym, odbytnicy lub narządach miąższowych, takich jak wątroba, śledziona, trzustka, nerki, płuca, nadnercza, tarczyca i węzły chłonne, w chirurgii układu sercowonaczyniowego, w chirurgii klatki piersiowej, w tym chirurgii tchawicy, oskrzeli lub płuc, chirurgicznych interwencjach w uchu, nosie i gardle (ENT), w tym w stomatologii, chirurgii ginekologicznej, urologicznej, chirurgii kości (np. resekcji kości gąbczastej), w interwencjach chirurgicznych w stanach nagłych, neurochirurgii, przetokach limfatycznych, żółciowych i mózgowo-rdzeniowych (CSF) oraz wyciekach powietrza podczas chirurgii klatki piersiowej i płuc. Wynalazek dotyczy zatem również zastosowania opisanych kompozycji w powyższych celach.

Należy podkreślić, że kompozycja według wynalazku jest zasadniczo szczelna w stosunku do powietrza i cieczy, dzięki czemu produkt jest szczególnie użyteczny w leczeniu przetok limfatycznych, żółciowych i mózgowo-rdzeniowych (CSF) oraz ulatniania się powietrza podczas chirurgii klatki piersiowej i płuc. Ponadto, z uwagi na to, że produkt jest zasadniczo szczelny w stosunku do cieczy, jest on wysoce użyteczny w chirurgii silnie krwawiących narządów, takich jak wątroba i śledziona oraz w chirurgii np. przewodu żołądkowo-jelitowego.

Produkt według wynalazku należy stosować wówczas, gdy za pomocą znanych sposobów nie można zahamować krwawienia lub wycieku limfatycznego, żółciowego, powietrznego lub CSF bądź gdy sposoby te przynoszą niezadowalające wyniki.

Nośnikiem jest korzystnie gąbka kolagenowa, runo lub plaster, które to określenia stosowane są jako synonimy w opisie i zastrzeżeniach. Składniki, kolagen, fibrynogen i trombina, korzystnie pochodzą od ssaków. Korzystne stałe składniki są pochodzenia ludzkiego. Kolagen, fibrynogen i trombina mogą być oczyszczone ze źródła naturalnego lub zrekombinowanymi bądź transgenicznymi ludzkimi fibrynogenem i/lub trombiną.

Obecnie korzystnym źródłem kolagenu są konie. Aby zapobiec przeniesieniu wirusów, wynikającego z zanieczyszczenia plastra kolagenowego końskimi wirusami, patogennymi dla człowieka, ważne znaczenie zapobiegawcze ma odpowiedni wybór materiału źródłowego i inaktywacja potencjalnie patogennych środków.

PL 205 181 B1

Opis figur

Fig. 1

1.1 Opraskin®: nie powlekany/powlekany

1.2 Powlekany Opraskin®: wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

1.3 Powlekany Opraskin®: rozwinięty po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego Fig. 2

2.1 Willospon® forte: niepowlekany/powlekany

2.2 Powlekany Willospon® forte: wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

2.3 Powlekany Willospon® forte: rozwinięty po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

Fig. 3

3.1 Willospon® Spezial: niepowlekany/powlekany

3.2 Powlekany Willospon® Spezial: wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

3.3 Powlekany Willospon® Spezial: rozwinięty po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

Fig. 4

4.1 Plaster Ethisorb®: niepowlekany/powlekany

4.2 Powlekany plaster Ethisorb®: wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

4.3 Powlekany plaster Ethisorb®: rozwinięty po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

Fig. 5

5.1 Tabotamp® NU Knit: niepowlekany/powlekany

5.2 Powlekany Tobotamp® NU Knit: wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

5.3 Powlekany Tobotamp® NU Knit: rozwinięty po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

Fig. 6

6.1 Gąbka Nycomed: niepowlekana/powlekana (próbka laboratoryjna)

6.2 Powlekana gąbka kolagenowa Nycomed (próbka laboratoryjna): wprowadzenie do przyrządu endoskopowego

6.3 Powlekana gąbka kolagenowa Nycomed (próbka laboratoryjna): rozwinięta po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

6.3 Powlekana gąbka Nycomed (próbka produkcyjna = Tacho-Comb®): rozwinięta po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego

Fig. 7

Przyrząd endoskopowy: Endodock®

Fig. 8

Krzepnięcie krwi i degradacja skrzepu i plastra nośnika. Składniki czynne powłoki zaznaczono zacienionymi na szaro okienkami.

P r z y k ł a d y

Poniższe przykłady I-IV obrazują różne procedury wytwarzania powlekanej gąbki kolagenowej z różnymi rodzajami fibrynogenu i trombiny.

Surowce fibrynogenowe

Składnik	% całości preparatu
	Preparat A	Preparat B	Preparat C
Ludzki fibrynogen	36-52	42-47	36 - 52
Ludzka albumina	16-24	20-24	16 - 24
Białko całkowite	52-76	62-71	52 - 76
Chlorek sodu	8-14	0	8 - 14
Cytrynian trisodowy	2-4	1 -3	2 - 4
Arginina (chlorowodorek)	15-26	15-21	15 - 26
Glicyna	0	6-9	1 - 2
Histydyna	0	3-5	0
Sacharoza	0	0	1 - 2
Wilgotność resztkowa	<2	2-4	<1,5

PL 205 181 B1

Surowce trombinowe

Preparat	Aktywność (I.U./mg substancji)	Wilgotność	Dodatki
Ludzka trombina A	360-540	<3%	Ludzka albumina, chlorek sodu, cytrynian sodu
Ludzka trombina B	7-10	<3%	Ludzka albumina, chlorek sodu, cytrynian sodu
Ludzka trombina C	35-60	<3%	Ludzka albumina, chlorek sodu, octan sodu, glicyna

P r z y k ł a d I

W przykładzie tym zawiesina zawierała preparat B ludzkiego fibrynogenu B i preparat B ludzkiej trombiny.

Ostateczną objętość zawiesiny (3500 ml) uzyskano poprzez zastosowanie następujących ilości i parametrów:

Mieszanina fibrynogenu:

- 2800 ml etanolu (94% w temperaturze 2-8°C)

- 492,5 g preparatu B ludzkiego fibrynogenu

- 493,5 mg ryboflawiny

Mieszaninę fibrynogenu przechowywano przez 8-16 godzin w temperaturze 2-8°C, w trakcie mieszania.

Mieszanina trombiny:

- 100 ml etanolu (100% w temperaturze -30°C)

- 12,27 g preparatu B ludzkiej trombiny

Mieszaninę trombiny przechowywano przez 8-16 godzin w temperaturze -30°C.

Zawiesina:

- 157 ml mieszaniny trombiny dodano do mieszaniny fibrynogenu

- 94% etanol w temperaturze 2-8°C dodano uzupełniając objętość do ostatecznej objętości zawiesiny do 3500 ml.

Właściwości zawiesiny:

1. Stężenie etanolu: 94,3%

2. Sedymentacja:

a) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 5 minut po rozpoczęciu: 98% objętości,

b) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 24 godziny od rozpoczęcia: 64% objętości.

3. Wielkość cząstek (średnia średnica Folka-Warda): 56,4 ± 1,3 μm

Nośniki w postaci pasków kolagenu powlekano zawiesiną. Na początek 48 pasków gąbki kolagenowej inkubowano wstępnie w komorze chłodzącej w następujących warunkach:

- Temperatura: 5,2°C

- Wilgotność bezwzględna: 4,8 g wody/kg powietrza

- Czas inkubacji: 18,5 godziny

Powlekane paski gąbki kolagenowej suszono w następujący sposób:

Powlekane paski inkubowano przez 15 minut w temperaturze 5,2°C i wilgotności bezwzględnej 4,8 g wody/kg powietrza.

Następnie powlekane paski suszono pod próżnią w komorze suszącej w następujących warunkach suszenia:

- Powietrze: temperatura 5,2°C, wilgotność bezwzględna 4,8 g wody/kg powietrza

- Przepływ powietrza przez zawór ssący: 23 m³/godzinę

- Próżnia: 59 milibarów

- Czas suszenia: 4 godziny ₂

Ścieranie uzyskanej powłoki z pasków gąbki kolagenowej wynosiło około 0,2 mg/cm² po wstrząsaniu na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością 800 - 1200 obrotów/min przez 2 minuty.

P r z y k ł a d II

W przykładzie tym zawiesina zawierała preparat C ludzkiego fibrynogenu i preparat C ludzkiej trombiny.

PL 205 181 B1

Mieszanina fibrynogenu:

- 2252 ml etanolu (94% w temperaturze 2 - 8°C)

- 370,7 g preparatu C ludzkiego fibrynogenu - 493,5 mg ryboflawiny

Mieszaninę fibrynogenu przechowywano przez 8 - 16 godzin w temperaturze 2 - 8°C, w trakcie mieszania.

Mieszanina trombiny

- 188 ml etanolu (100% w temperaturze -30°C)

- 12 fiolek preparatu C ludzkiej trombiny (10650 I.U./fiolkę)/12 ml wody do iniekcji Mieszaninę trombiny przechowywano przez 8 - 16 godzin w temperaturze -30°C.

Zawiesina:

- 164,5 ml mieszaniny trombiny dodano do mieszaniny fibrynogenu - 94% etanol w temperaturze 2-8°C dodano uzupeł niają c obję tość do ostatecznej obję toś ci zawiesiny, wynoszącej 3500 ml.

Właściwości zawiesiny:

1. Stężenie etanolu: 94,1%

2. Sedymentacja:

a) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 5 minut od rozpoczęcia: 94% objętości

b) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 24 godziny od rozpoczęcia: 71% badanej objętości

3. Wielkość cząstek (średnia średnica Folka-Warda): 49,2 ± 0,93 μοι

- Temperatura: 4,8°C

- Wilgotność względna: 90,3%

- Czas inkubacji: 22,25 godziny

Powlekane paski gąbki kolagenowej suszono w następujący sposób:

Powlekane paski inkubowano przez 13 minut w temperaturze 4,9°C i wilgotności bezwzględnej

4,8 g wody na kg powietrza.

- Powietrze: temperatura 5,2°C, wilgotność bezwzględna 4,9 g wody na kg powietrza

- Przepływ powietrza przez zawór ssący: 25 m³ na godzinę

- Próżnia: 60 milibarów

- Czas suszenia: 4 godziny ₂

Ścieranie uzyskanej powłoki z pasków gąbki kolagenowej wynosiło około 0,3 mg/cm² po wstrząsaniu na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością 800 - 1200 obrotów/minutę przez 2 minuty.

P r z y k ł a d III

W przykładzie tym zawiesina zawiera preparat C ludzkiego fibrynogenu C i preparat C ludzkiej trombiny.

Ostateczną objętość zawiesiny (780 ml) uzyskano poprzez zastosowanie następujących ilości i parametrów:

Mieszanina fibrynogenu

- 700 ml etanolu (94% w temperaturze 2 - 8°C)

- 84,42 g preparatu C ludzkiego fibrynogenu

- 110 mg ryboflawiny

Mieszanina trombiny:

- 35 ml etanolu (100% w temperaturze -30°C)

- 0,54 g preparatu C ludzkiej trombiny

Mieszaninę trombiny przechowywano przez 8 - 16 godzin w temperaturze -30°C.

Zawiesina:

- 23,0 ml mieszaniny trombiny dodano do mieszaniny fibrynogenu

PL 205 181 B1

- 100% etanol w temperaturze 2-8°C dodano uzupełniając objętość do ostatecznej objętości zawiesiny, wynoszącej 780 ml.

Właściwości zawiesiny:

1. Stężenie etanolu: 94%

2. Sedymentacja:

a) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 5 minut od rozpoczęcia: 92% badanej objętości

b) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 24 godziny od rozpoczęcia: 72% badanej objętości

3. Wielkość cząstek (średnia średnica Folka-Warda): 60,5 ± 0,5 μm

Nośniki w postaci pasków kolagenu powlekano zawiesiną. Na początek 8 pasków gąbki kolagenowej inkubowano wstępnie w komorze chłodzącej w następujących warunkach:

- Temperatura: 6,0°C

- Wilgotność względna: 85%

- Czas inkubacji: 18,5 godziny

Powlekane paski gąbki kolagenowej suszono w następujący sposób:

Powlekane paski inkubowano przez 45 minut w temperaturze 5°C i 85% wilgotności względnej. Następnie powlekane paski suszono pod próżnią w komorze suszącej w następujących warunkach suszenia:

- Powietrze: temperatura 5°C, wilgotność względna 85%

- Przepływ powietrza przez zawór ssący: 1,2 m³ na godzinę

- Próżnia: 35 milibarów

- Czas suszenia: 4 godziny ₂

P r z y k ł a d IV

W przykładzie tym zawiesina zawiera preparat A ludzkiego fibrynogenu A i preparat A ludzkiej trombiny A.

Ostateczną objętość zawiesiny (3120 ml) uzyskano poprzez zastosowanie następujących ilości i parametrów:

Mieszanina fibrynogenu

- 2540 ml etanolu (100% w temperaturze 2 - 8°C)

- 311,6 g preparatu A ludzkiego fibrynogenu

- 440 mg ryboflawiny

Mieszaninę fibrynogenu przechowywano przez 8-16 godzin w temperaturze 2 - 8°C, w trakcie mieszania.

Mieszanina trombiny:

- 210 ml etanolu (100% w temperaturze -30°C)

- 229 mg preparatu A ludzkiej trombiny Zawiesina:

- 87,3 ml wody do iniekcji dodano do mieszaniny fibrynogenu. Mieszaninę trombiny dodano do mieszaniny fibrynogenu.

100% etanol w temperaturze 2-8°C dodano uzupełniając objętość do ostatecznej objętości zawiesiny.

Właściwości zawiesiny:

1. Stężenie etanolu: 97%

2. Sedymentacja:

a) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 5 minut od rozpoczęcia: 95,6% badanej objętości

b) objętość zawiesiny, która uległa sedymentacji, 24 godziny od rozpoczęcia: 63,5% badanej objętości

3. Wielkość cząstek (średnia średnica Folka-Warda): 51,8 ± 0,8 μm

- Temperatura: 6,5°C

- Wilgotność względna: 90%

- Czas inkubacji: 22,5 godziny

Powlekane paski gąbki kolagenowej suszono w następujący sposób:

Powlekane paski inkubowano przez 10 minut w temperaturze 6,5°C i 90% wilgotności względnej.

PL 205 181 B1

- Powietrze: temperatura 6,5°C, wilgotność względna 90%

- Przepływ powietrza przez zawór ssący: 21 m³ na godzinę

- Próżnia: 58 milibarów

- Czas suszenia: 4 godziny ₂

Ścieranie uzyskanej powłoki z pasków gąbki kolagenowej wynosiło poniżej 0,1 mg/cm² po wstrząsaniu na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością 800 - 1200 obrotów/minutę przez 2 minuty.

P r z y k ł a d 1

Aprotynina jako składnik TachoComb®

Badanie in vitro aktywności anty-fibrynolitycznej w warunkach wypłukiwania zbliżonych do sytuacji in vivo

Celem badania było wykazanie skuteczności aprotyniny jako składnika TachoComb H w warunkach nadmiernej aktywności fibrynolitycznej z użyciem modeli badawczych in vitro.

TachoComb S to białawy, powlekany, gąbko-podobny plaster. Plaster spienionego suchego kolagenu stosuje się jako nośnik aktywnych stałych składników. Wymiary plastra wynoszą 9,5 x 4,8 x 0,5 cm. Strona aktywna ma barwę żółtą. 1 cm² plastra TachoComb S (grubości 0,5 cm) zawiera:

Kolagen pochodzenia końskiego 2,1 mg

Powleczony:

Ludzkim fibrynogenem 5,5 mg

Ludzką trombiną 2,0 I.U.

Ryboflawiną (żółty kolor jako marker powleczonej okolicy) 16,5 μg

Eksperymentalne badania in vitro, ustalające dawkę, potwierdziły, że powyższe stężenia trombiny i fibrynogenu powodują najwyższą wytrzymałość klejową (patrz przykład 3).

TachoComb H zawierający ludzką trombinę, ludzki fibrynogen i aprotyninę porównano z TachoComb S, zawierającym - jako aktywne składniki - jedynie ludzką trombinę i ludzki fibrynogen.

Opracowano dwa modele badawcze dla ilościowego ustalenia skuteczności w warunkach nadmiernej aktywności fibrynolitycznej, które można uznać za odpowiadające warunkom chirurgicznym i które umożliwiały przeprowadzenie szeregu testów koniecznych do wykazania istotnego efektu.

W modelu badawczym 1 badaną próbkę naniesiono na syntetyczny materiał, będący powierzchnią adhezyjną. W materiale wycięto określony otwór, aby naśladować np. perforację naczynia krwionośnego. Uszczelnienie eksponowano na działanie dwóch różnych roztworów fibrynolitycznych (roztwory do inkubacji) poprzez otwór. Jeden z tych roztworów dodatkowo zawierał składnik o działaniu anty-fibrynolitycznym, a₂-antyplazminę.

Skład roztworów do inkubacji:

Wszystkie badane substancje rozcieńczono w buforze 1: 50 mM Trometamol, 100 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mg/ml BSA (bez proteazy), 0,5 mg/ml azydku Na/ml).

Roztwór do inkubacji I (1 μM plazminogen, 1 nM tkankowy aktywator plazminogenu (tPA), 1 μM a₂-antyplazmina).

μl buforu 1, pH 7,4 μl roztworu plazminogenu (stęż. 4,9 μM, aktywność ludzkiego plazminogenu Coachrom) μl roztworu tPA (50 nM)

100 μl roztworu a₂-antyplazminy (2,5 μM)

Roztwór do inkubacji II (1 μM plazminogen, 1 nM tkankowy aktywator plazminogenu)

149 μl buforu 1, pH 7,4 μl roztworu plazminogenu (stęż. 4,9 μM, aktywność ludzkiego plazminogenu Coachrom) μl roztworu tPA (50 nM)

Roztwór do inkubacji wymieniano w dwugodzinnych odstępach czasu, naśladując wypłukiwanie. Przy tej okazji kontrolowano adhezję. Do próbki przykładano ciśnienie 50 mbarów. Rejestrowano czas, w jakim następowało odklejenie próbki przy ciśnieniu < 50 mbarów.

Model badawczy 2 służył do wykazania fibrynolitycznego działania uszkodzonej tkanki jelitowej. Badaną próbkę naniesiono na jelito świni (ex vivo), służące jako powierzchnia adhezyjna. W jelicie wycięto otwór dla umożliwienia kontaktu roztworu do inkubacji ze skrzepem fibrynowym i naśladując efekt wypłukiwania. W określonych momentach zmieniano roztwór do inkubacji; wówczas do próbki przykładano ciśnienie 50 mbarów. Rejestrowano czas, w jakim następowało odklejenie próbki przy ciśnieniu < 50 mbarów.

PL 205 181 B1

Wyniki wykazały występowanie znacznych różnic pomiędzy TachoComb H zawierającym aprotyninę a TachoComb S bez aprotyniny.

W modelu badawczym 1 z zastosowaniem roztworu do inkubacji, zawierającym tkankowy aktywator plazminogenu, plazminogen i a₂-antyplazminę, czas fibrynolizy dla TachoComb H wynosił 41,2 ± 7,3 godziny w porównaniu z 12,8 ± 2,8 godzin dla TachoComb S.

W modelu badawczym 1 z zastosowaniem roztworu do inkubacji, zawierającym jedynie tkankowy aktywator plazminogenu i plazminogen, czas fibrynolizy dla TachoComb H wynosił 31,6 ± 5,3 godziny w porównaniu z 8,3 ± 1,8 godziny dla TachoComb S.

W modelu badawczym 2 czas odklejenia TachoComb H wynosił 78,4 ± 16,3 godziny w porównaniu z czasem 6,5 ± 1,8 godziny dla TachoComb S.

W badanej próbce wciąż znajdowało się wiele fibryny. Niemniej jednak próbka odklejała się od powierzchni jelita, gdyż adhezja pomiędzy skrzepem fibrynowym a powierzchnią jelita słabła.

W obu modelach można było bardzo wyraźnie wykazać anty-fibrynolityczne działanie aprotyniny jako aktywnego składnika TachoComb H.

W modelu badawczym 1 wydłużenie fibrynolizy, osiągnięte dzięki aprotyninie, stanowiącej aktywny składnik TachoComb H wynosiło 320% dla roztworu do inkubacji I, zawierającego α2antyplazminę oraz 380% dla roztworu do inkubacji II, nie zawierającego a₂-antyplazminy.

Model badawczy 1 wykazał również dodatkowe anty-fibrynolityczne działanie a₂-antyplazminy poprzez wydłużenie czasu fibrynolizy dla TachoComb H z 31,6 do 41,2 godzin (130%) oraz dla TachoComb S z 8,3 do 12,8 godzin (154%).

P r z y k ł a d 2

Porównanie powlekanej gąbki Nycomed (TachoComb S) z innymi nośnikami, powlekanymi tak samo jak TachoComb S

Adhezja warstwy

Procedura

1. Powlekanie różnych nośników

Nazwa firmowa	Materiał	Producent/dystrybutor
Opraskin®	Gąbka kolagenowa	Lohmann, Postfach 2343, D-56513 Neuwied
Willospon® forte	Gąbka kolagenowa (cielęta)	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Willospon® Special	Gąbka żelatynowa	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Plaster Ethisorb®	Polyglactin910/Polydioxanon	Johnson/Johnson (producent) Ethicon, Robert-Koch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Tabotamp® NU Knit	Utleniona regenerowana celuloza	Johnson/Johnson (producent) Ethicon, Robert-Koch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Gąbka kolagenowa Nycomed	Końska gąbka kolagenowa	Nycomed Austria, Sankt-Peter-Str. 25 A4021 Linz

Powierzchnię 2 x 4,5 cm² każdego z nośników powlekano zawiesiną powlekającą TachoComb S. Ilość zawiesiny powlekającej odpowiadała charakterystyce TachoComb (5,5 mg fibrynogenu/cm²). Próbki suszono.

₂

2. Z każdego poleczonego nośnika wytworzono próbkę 1 x 4 cm².

3. Adhezję warstwy badano w następujący sposób

Opis sposobu

Aparatura

Waga analityczna (pomiar z dokładnością ± 0,5 mg)

Wstrząsarka Vibrofix w połączeniu z urządzeniem mocującym

Linijka z podziałką milimetrową

Sekundomierz, skalpel, probówki o wewnętrznej średnicy 2 cm z korkiem

Procedura ₂

Przy pomocy skalpela z powlekanego nośnika wycinano powleczoną powierzchnię 4 x 1 cm².

PL 205 181 B1

Próbkę umieszczano w zważonej probówce z korkiem. Następnie wstrząsano ją na wstrząsarce Vibrofix (częstotliwość około 1000 obrotów/minutę) przez 2 minuty.

Arkusz usuwano i ponownie ważono pozostałość materiału powlekającego (ścieranie: mg/cm²). Obliczenie:

Ścieranie (mg/cm²) = [masa pozostałości (mg) - tara (mg)]/4 cm²Wyniki

Nośnik	Substancja	Ścieranie (mg/cm²)
Opraskin®	Liofilizowany kolagen	2,1
Willospon® forte (3 mm)	Liofilizowany kolagen	1,2
Willospon® Spezial (1 mm)	Żelatyna	2,1
Plaster Ethisorb® (ZVP609)	Polyglactin/dioksanon	14,3
Tabotamp® NU Knit	Utleniona celuloza	9,2
Gąbka kolagenowa Nycomed	Kolagen, spieniony	0,15

Komentarz

Z wyją tkiem gą bki kolagenowej Nycomed, ż aden z noś ników nie był elastyczny po powleczeniu.

Próbkę należy wycinać bardzo ostrożnie. Jeżeli wycina się ją przy pomocy nożyczek, dużo materiału powlekającego odpadnie, gdyż sama warstwa jest sztywna. Plaster Ethisorb® wykazywał niemal całkowity brak przyczepności z materiałem powlekającym. Po niewielkim wstrząśnięciu całość powłoki opada jak „dywan”.

Dość wyraźnie widać różnicę pomiędzy gąbką kolagenową Nycomed a innymi materiałami nośnikowymi.

Elastyczność zwilżonego powleczonego nośnika

Procedura

1. Powlekanie różnych nośników.

₂

2. Z każdego powleczonego nośnika przygotowano próbkę około 5 - 7 cm². Ustalono dokładną wyjściową powierzchnię suchej próbki.

3. Próbkę zwilżono i umieszczono na elastycznym arkuszu lateksowym, umocowanym w specjalnym aparacie, jak szczegółowo opisano w rozdziale „procedura”. Arkusz lateksowy poddano działaniu ciśnienia, w wyniku czego rozciągnął się. Po dwukrotnym rozciągnięciu arkusz rozciągnięto trzeci raz. W momencie największego rozciągnięcia zmierzono powierzchnię nośnika.

Opis sposobu

Aparatura/odczynniki

Pompa perystaltyczna (IKA PA-SF)

Butla buforująca ciśnienie (3 otwory wylotowe)

Manometr VDO (0-250 mbar)

Szklany lejek (średnica otworu 1: 30 mm; średnica otworu 2: 15 mm)

Rurki silikonowe i zaciski, rękawiczki lateksowe (Semper med), skalpel, linijka z podziałką milimetrową, nożyczki

Fizjologiczny roztwór soli

Procedura

Z trzema otworami butli buforującej ciśnienie przy pomocy rurek silikonowych w sposób szczelny dla powietrza połączono następujący sprzęt:

a) pompę perystaltyczną

b) manometr

c) szklany lejek - otwór 2 ₂

Z rękawiczki lateksowej wycięto podwójny arkusz o powierzchni około 8 x 8 cm². Arkusz ten umocowano w sposób szczelny dla powietrza na otworze 1 szklanego lejka.

Przy pomocy skalpela z powlekanego nośnika wycięto około 5 - 7 cm² powierzchni powleczonej.

PL 205 181 B1

Zmierzono powierzchnię próbki (powierzchnia wyjściowa). Powłokę próbki zwilżono fizjologicznym roztworem soli i umieszczono na arkuszu lateksowym. Następnie ręcznie przyciśnięto ją do tego arkusza przez czas około 1 minuty.

Przy pomocy pompy perystaltycznej rozciągano arkusz lateksowy poprzez wywarcie ciśnienia około 70 mbarów. Czynność tę powtórzono dwukrotnie, za każdym razem rozluźniając następnie arkusz lateksowy. Podczas trzeciego rozciągania w momencie największego rozciągnięcia arkusza lateksowego zmierzono powierzchnię (długość i szerokość) powlekanego nośnika.

Obliczenie:

Współczynnik „elastyczności” = powierzchnia nośnika podczas trzeciego rozciągnięcia/wyjściowa powierzchnia próbki

Wyniki

Nośnik	Substancja	Współczynnik elastyczności
Opraskin®	Liofilizowany kolagen	1,78
Willospon® forte (3 mm)	Liofilizowany kolagen	1,53
Willospon® Spezial (1 mm)	Żelatyna	1,79
Plaster Ethisorb® (ZVP609)	Polyglactin/dioksanon	1,0
Tabotamp® NU Knit	Utleniona celuloza	1,15
Gąbka kolagenowa Nycomed	Kolagen, spieniony	1,55

Komentarz

Elastyczność zwilżonej gąbki kolagenowej Nycomed (TachoComb S) stanowi jedną z ważnych właściwości produktu. Elastyczność ma kluczowe znaczenie w chirurgii klatki piersiowej i brzucha. Po sklejeniu nośnik powinien poddawać się przykładowo ruchom rozciągającym i relaksacyjnym płuc lub jelit. Zwłaszcza Ethisorb® nie wykazał jakiejkolwiek elastyczności. Ulegał on natychmiastowemu odklejeniu od powłoki. Powlekany Willospon® Spezial i Opraskin® w badaniu wykazały defekty strukturalne.

Stosowanie powlekanego nośnika w chirurgii endoskopowej

Procedura

1. Powlekanie różnych nośników.

Powierzchnię 2 x 4 cm² każdego z nośników powlekano zawiesiną powlekającą TachoComb S. Ilość zawiesiny powlekającej odpowiadała charakterystyce TachoComb (5,5 mg fibrynogenu/cm²). Próbki suszono.

2. Manipulację powlekanymi próbkami nośników do stosowania w chirurgii endoskopowej oraz utratę powłoki w wyniku takiej manipulacji dokumentowano przy pomocy cyfrowego aparatu fotograficznego.

Opis sposobu

Aparat

Endodock: Przyrząd endoskopowy przeznaczone do stosowania TachoComb® w chirurgii endoskopowej (patrz fig. 7). Cyfrowy aparat fotograficzny.

Lista badanych nośników

Nośnik	Materiał nośnikowy
Opraskin®	Liofilizowany kolagen
Willospon® forte (3 mm)	Liofilizowany kolagen
Willospon® Spezial (1 mm)	Żelatyna
Plaster Ethisorb® (ZVP609)	Polyglactin/dioksanon
Tabotamp® NU Knit	Utleniona celuloza
Gąbka kolagenowa Nycomed	Kolagen, spieniony

Procedura

Seria zdjęć wykonanych każdemu z nośników:

1. zdjęcie: dokumentacja niepowlekanych i powlekanych próbek nośnika

PL 205 181 B1

2. zdjęcie: powlekane próbki wprowadzono do przyrządu endoskopowego (Endodock). Próbkę należy ręcznie rozpłaszczyć, aby można było ją zawinąć wokół „sworznia” wiodącego. Następnie próbkę ostrożnie wprowadza się do stalowej rurki o średnicy 10 mm.

Dokumentacja próbki częściowo wprowadzonej do rurki Endodock.

3. Zdjęcie: próbkę ostrożnie wyjmuje się. Następnie próbkę należy rozwinąć. Powłokę, która odpadła od nośnika w wyniku tej manipulacji zbiera się poza nośnikiem. Udokumentowano rozwiniętą próbkę po wprowadzeniu do przyrządu endoskopowego oraz utratę powłoki w wyniku tej manipulacji.

Komentarz

Stosowanie TachoComb S (powlekana gąbka kolagenu końskiego/Nycomed) w chirurgii endoskopowej stanowi najbardziej wymagające zastosowanie produktu. TachoComb S wprowadza się do przyrządu endoskopowego. Rurka tego sprzętu ma zazwyczaj średnicę 10 - 13 mm. Aby TachoComb S mógł zostać wprowadzony do rurki, konieczne jest jego spłaszczenie, a następnie zawinięcie wokół „sworznia” wiodącego i ostrożne wprowadzenie do rurki. W związku z tym połączenie powłoki z nośnikiem oraz sobą samą musi być mocne, ale produkt musi być zarazem wystarczająco elastyczny na sucho, aby można go było zginać i zwijać. Po wprowadzeniu do miejsca wykonywania zabiegu chirurgicznego TachoComb S należy ostrożnie wyciągnąć z rurki. Następnie należy go odwinąć i umieścić na powierzchni rany. Wymaga to często pewnego dopasowania. Dlatego adhezja warstwy do nośnika powinna być wystarczająco silna, aby wytrzymać te manipulacje.

Wyniki

Wyniki przedstawiają załączone fig. 1 - 6.

Szacunkowa utrata materiału powlekającego jest następująca:

Opraskin® 30 - 40%

Willospon® forte 60 - 70%

Willospon® Spezial 50%

Tacotamp® NU knit 60 - 70%

Plaster Ethisorb® 95%

Gąbka kolagenowa Nycomed < 5%

Ponieważ Ethisorb® jest bardzo sztywnym nośnikiem, adhezja powłoki jest bardzo słaba. Dlatego powlekany Ethisorb® utracił niemal całą powłokę w tym badaniu. W porównaniu z powlekaną gąbką kolagenową Nycomed wszystkie pozostałe badane nośniki miały pokrywaną płaską powierzchnię. W takim przypadku powłoka leży jak „płaski dywan” na nośniku. Prowadzi to do uzyskania mało elastycznej struktury suchych powlekanych nośników. Zginanie lub zwijanie często łamie samą powłokę.

Po wprowadzeniu powlekanych nośników do rurki przyrządu endoskopowego oraz następnie rozwinięciu próbki wszystkie nośniki z wyjątkiem gąbki kolagenowej Nycomed utraciły znaczną część powłoki, w związku z czym ich duże powierzchnie były pozbawione materiału powlekającego.

Struktura i tekstura gąbki kolagenowej Nycomed jest podstawą znacznej elastyczności TachoComb S w warunkach suchych lub wilgotnych. Gąbka kolagenowa Nycomed jest spieniona i ma w sobie wielokątne komórki. Na powierzchni te komórki są przecięte i powstają jamy. Podczas powlekania zawiesina powlekająca zostaje równo naniesiona na strukturę powierzchni. Podczas suszenia roztwór zawierający zarówno fibrynogen, jak i trombinę ulega umocowaniu jako ciało stałe w jamach. W związku z tym TachoComb S można przycinać do pożądanych kształtów i wprowadzać do przyrządu endoskopowego z jedynie niewielką utratą (bądź w ogóle bez strat) materiału powlekającego.

Znaczna elastyczność suchego TachoComb S stanowi istotną korzyść w porównaniu z badanymi powlekanymi nośnikami.

P r z y k ł a d 3

Badania aktywnych składników - ustalenie dawki

Dawkę aktywnych składników ustalono w dwóch różnych modelach doświadczalnych, w których mierzono siłę adhezji: wytrzymałość na rozciąganie na wątrobie szczura, siłę adhezji względem podwyższonego ciśnienia tkankowego w nerce szczura.

A. Wytrzymałość na rozciąganie na wątrobie szczura.

Na lewym płacie wątroby znieczulonego szczura wykonano ranę 1 x 1 cm i około 1 mm głębokości dla wytworzenia sączącego krwawienia. Ranę uszczelniono fragmentem 1 x 1 cm TachoComb S, połączonym z wagą sprężynową. Mierzono rozciągnięcie, przy którym następowało oderwanie TachoComb S.

B. Siła adhezji względem podwyższonego ciśnienia tkankowego w nerce szczura

PL 205 181 B1

W lewej nerce znieczulonych szczurów wykonano gładką, równą, silnie krwawiącą ranę poprzez odcięcie około jednej czwartej masy narządu. Ranę uszczelniono badanymi arkuszami TachoComb S. Ciśnienie tkankowe podwyższono poprzez zamknięcie drenażu żylnego oraz pompowanie izotonicznego roztworu soli cytrynianowej (pH 7,2) do nerki. Mierzono ciśnienie, przy którym rozpoczynało się odklejanie TachoComb S.

T a b e l a 1

Adhezja TachoComb S, zawierającego różną ilość fibrynogenu

Skład warstwy	Adhezja (średnia ± SD)
Fibrynogen, mg/cm²	Trombina, IU/cm²	Wytrzymałość na rozciąganie na wątrobie szczura, N/cm² n = 5	Adhezja przy podwyższonym ciśnieniu tkankowym w nerce szczura, mbar n = 5
0	0	0,20 ± 0,02	47 ± 9
0	2,40	0,20 ± 0,03	63 ± 16
1,30	1,73	0,30 ± 0,06	81 ± 12
2,92	1,85	0,39 ± 0,05	101 ± 13
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	110 ± 13
7,22	1,82	0,38 ± 0,02	97 ± 13
10,02	1,75	0,40 ± 0,07	87 ± 10

T a b e l a 2

Adhezja TachoComb S, zawierającego różną ilość trombiny

Skład warstwy	Adhezja (średnia ± SD)
Fibrynogen, mg/cm²	Trombina, IU/cm²	Wytrzymałość na rozciąganie na wątrobie szczura, N/cm² n = 5	Adhezja przy podwyższonym ciśnieniu tkankowym w nerce szczura, mbar n = 5
0	0	0,20 ± 0,02	47 ± 9
6,15	0	0,27 ± 0,01	57 ± 10
4,72	0,92	0,39 ± 0.02	84 ± 9
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	110 ± 13
4,78	4,95	0,35 ± 0,02	97 ± 9
4,70	9,63	0,30 ± 0.02	109 ± 13
4,75	19,83	0,27 ± 0,03	91 ± 20

Uzyskane wyniki ujawniają istotne różnice pomiędzy kilkoma wariantami. Optymalny zakres dla ludzkiej trombiny to 0,9 - 10 I.U./cm² przy stałej zawartości ludzkiego fibrynogenu, wynoszącej około 5 mg/cm². Optymalny zakres dla ludzkiego fibrynogenu to 2,9 - 7,2 mg/cm² przy stałej zawartości ludzkiej trombiny, wynoszącej około 2 I.U./cm².

Te prowadzone w warunkach in vivo badania potwierdziły, że zarówno stężenie fibrynogenu (4,3-6,7 mg/cm²), jak i trombiny (1,5-2,5 I.U./cm²), stosowane w preparatach TachoComb (TachoComb® i TachoComb H) również powodują maksymalną adhezję w TachoComb S.

P r z y k ł a d 4

Skuteczność TachoComb S w uszczelnianiu uszkodzeń na śledzionie i wątrobie u psów

Celem tego badania było porównanie skuteczności hemostazy TachoComb H (zawierającego aprotyninę) z TachoComb S (bez aprotyniny) w psim modelu uszkodzeń na śledzionie i wątrobie. Aby

PL 205 181 B1 naśladować krwawienie sączące zastosowano nacięcie i nakłucie (głębokości 0,5 cm) śledziony. Aby naśladować silne krwawienie powierzchniowe wykonano resekcję koniuszka czołowego płata wątroby (2 - 3 cm²). Plaster TachoComb H lub TachoComb S stosowano jako jedyny środek do uzyskania hemostazy ran (ta sama seria stosowana dla uszkodzeń na śledzionie i wątrobie u tego samego psa). Sekcję zwłok przeprowadzono 48 godzin po zabiegu chirurgicznym, gdyż okres ten związany jest z najwyższym ryzykiem ponownego krwawienia w praktyce klinicznej.

Całkowitą hemostazę osiągnięto w przypadku obu produktów. Ani w pobieżnej obserwacji, ani w badaniu histologicznym nie stwierdzono wtórnego krwotoku podczas sekcji zwłok wykonanej po 48 godzinach.

Histologicznie nie stwierdzono także różnic pomiędzy psami, u których stosowano TachoComb H lub TachoComb S podczas oceny uszkodzeń na śledzionie i wątrobie, pokrytych odpowiednimi plastrami, pod względem hemostazy i gojenia się rany. Nie obserwowano występowania wtórnego krwotoku po zabiegu chirurgicznym.

Dane pochodzące z badania morfologii ujawniły podobne wyniki w obu leczonych grupach, z niewielkim wzrostem liczby białych krwinek 48 godzin po zabiegu chirurgicznym. Nie było różnic pomiędzy grupami pod względem jakichkolwiek innych badanych parametrów. Również badania krzepnięcia nie ujawniły różnic związanych z obecnością lub brakiem aprotyniny. Podwyższenie zawartości fibrynogenu we krwi było ewidentne w obu leczonych grupach 48 godzin po zabiegu chirurgicznym. Podwyższenie liczby krwinek białych i poziomu fibrynogenu we krwi można przypisać odpowiedzi zapalnej na uraz chirurgiczny, a zmian tych nie traktuje się jako toksycznego działania ubocznego TachoComb H lub S.

Wniosek: TachoComb S (bez aprotyniny) charakteryzuje się taką samą skutecznością, co TachoComb H (zawierający aprotyninę) w leczeniu sączących i silnie krwawiących ran narządów miąższowych u psów. Na stabilność skrzepu w wybranych warunkach nie wpływała obecność ani brak aprotyniny.

P r z y k ł a d 5

Porównanie hemostazy, działania uszczelniającego ranę oraz oporu chłonnego TachoComb S z TachoComb H: badanie doświadczalne u świni

Cel badania

Test opracowano dla oceny natychmiastowej skuteczności i krótkotrwałego oporu runa hemostatycznego na wywołanym u świni uszkodzeniu na śledzionie.

Materiał i metody

W badaniu wykorzystano 24 samice świń. W losowy sposób zbadano 2 grupy runa hemostatycznego: TachoComb H z aprotyniną i TachoComb S bez aprotyniny.

W dniu zabiegu chirurgicznego zwierzę otrzymywało runo, bezpośrednio tamując standardowe uszkodzenie o wielkości 2 x 3 cm, wywołane chirurgicznie na brzusznej części śledziony.

Oceniano natychmiastowe i hemostatyczne działanie runa poprzez liczenie liczby pęcherzyków i pomiar czasu koniecznego do zatrzymania krwawienia. Notowano przyleganie TachoComb H i S.

Po 72 godzinach badano krótkoterminowe zachowanie i opór obu materiałów poprzez podwyższanie ciśnienia wewnątrz śledziony (zaciśnięcie naczyń żylnych).

Gdy ciśnienie osiągnęło niemal stan równowagi dożylnie podawano dużą dawkę adrenaliny (0,02 mg lub 0,04 mg) dla podwyższenia ciśnienia tętniczego, związanego lub nie z infuzją chlorowodorku dobutaminy.

Przy pomocy tych substancji farmakologicznych dla każdego zwierzęcia ustalono przerwanie ciśnienia krwawienia dla uszkodzeń opatrzonych przy pomocy TachoComb H i S.

Wyniki

Nie stwierdzono różnic pomiędzy sposobami leczenia pod względem działania hemostatycznego w czasie zabiegu chirurgicznego na śledzionie.

Podczas ponownej kontroli po 72 godzinach wygląd makroskopowy obu rodzajów runa był identyczny.

Pomiary przy wysokim ciśnieniu i oporności na rozerwanie nie różniły się istotnie pomiędzy oboma grupami eksperymentalnymi.

Nie wystąpiło rozerwanie materiału. Krwawienie z miejsca uszkodzenia obserwowano u 4 zwierząt z TachoComb S i 2 zwierząt z TachoComb H (z jednym dodatkowym pęcherzykiem w grupie 4).

PL 205 181 B1

Badanie histologiczne sugerowało, że aprotynina może wywierać działanie ochronne na strukturę runa; aprotynina wydawała się modyfikować wzór mikroskopowy, zmniejszając degradację runa. Nie obserwowano swoistych wzorców komórkowych.

Wniosek

W standaryzowanym modelu uszkodzeń na śledzionie u 24 świń badano natychmiastową aktywność hemostatyczną 2 preparatów TachoComb, S i H.

Oba materiały wykazywały podobne właściwości pod względem skuteczności, przylegania do miejsca uszkodzenia i podatności w stosunku do miąższu. Ich skuteczność była imponująca.

Ich oporność na biodegradację i proteolizę badano w 72. godzinie po zabiegu chirurgicznym poprzez podwyższenie ciśnienia w śledzionie (sposobami mechanicznymi i farmakologicznymi) oraz rejestrowanie miejscowego oporu runa TachoComb H i S. Nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy tymi dwoma materiałami.

Badania histopatologiczne wykazały jednakże, że degradacja proteolityczna TachoComb S była nieco bardziej zaznaczona niż TachoComb H.

TachoComb S lub TachoComb H stosowano jako jedyne środki hemostatyczne do uszczelnienia silnie krwawiących miejsc uszkodzeń na śledzionie u świń (uszkodzenie powierzchniowe 2 cm x 3 cm, głębokość 3 - 5 mm; n = 12 na grupę). Po 72 godzinach podwyższano ciśnienie wewnątrz śledziony poprzez podwiązanie żył(y) śledzionowych(ej). Następnie ciśnienie wewnątrz śledziony dodatkowo podwyższano poprzez iniekcję adrenaliny. Świnie obserwowano pod kątem objawów nawrotu krwawienia lub występowania pęcherzyków krwi pod plastrem. Po sekcji zwłok wykonano histopatologiczne badania próbek (miejsce uszkodzenia uszczelnione TachoComb H i S).

TachoComb S i TachoComb H charakteryzują się podobną skutecznością, przyleganiem do uszkodzeń i podatnością w stosunku do miąższu.

P r z y k ł a d 6

Porównanie hemostatyczne działania uszczelniającego ranę oraz oporu chłonnego TachoComb S z TachoComb H: badanie doświadczalne na modelu ostrego zapalenia trzustki u świni

Cel badania

Test opracowano dla oceny natychmiastowej skuteczności i krótkotrwałego oporu runa hemostatycznego na wywołanym u świni uszkodzeniu na śledzionie w modelu ostrego zapalenia trzustki.

Materiały i metody

W badaniu wykorzystano 20 samic świń. W losowy sposób zbadano 2 grupy runa hemostatycznego: TachoComb H z aprotyniną i TachoComb S bez aprotyniny.

W dniu zabiegu chirurgicznego zwierzę otrzymywało runo, bezpośrednio tamujące standaryzowane uszkodzenie o wielkości 2 x 3 cm, wywołane chirurgicznie na brzusznej części śledziony.

Oceniano natychmiastowe hemostatyczne działanie runa poprzez liczenie liczby pęcherzyków i pomiar czasu koniecznego do zatrzymania krwawienia. Notowano przyleganie TachoComb H i S.

Następnie przy pomocy strzykawki nakłuwano pęcherzyk żółciowy, pobierano żółć i 10 ml żółci wstrzykiwano przez przewód Wirsunga, aby wywołać zapalenie trzustki. Przed zabiegiem chirurgicznym oraz codziennie po nim monitorowano poziom enzymów we krwi (poziom lipazy i amylazy).

Niewielkie fragmenty TachoComb H i S umieszczono na miąższu trzustki w miejscu jego połączenia z jelitem.

Po 72 godzinach badano krótkoterminowe zachowanie i oporność obu materiałów na enzymatyczną degradację. TachoComb H i S badano poprzez podwyższanie ciśnienia wewnątrz śledziony (zaciśnięcie naczyń żylnych oraz środki farmakologiczne).

Gdy ciśnienie osiągnęło niemal stan równowagi, dla podwyższenia ciśnienia tętniczego dożylnie podawano dużą dawkę adrenaliny (0,02 mg lub 0,04 mg), a następnie stosowano infuzję noradrenaliny w dawce 0,02 - 0,04 mg/min, związane lub nie z infuzją chlorowodorku dobutaminy w dawce 0,3 - 0,6 mg/min.

Wyniki

Na śledzionie oba materiały zachowywały się podobnie pod względem natychmiastowej skuteczności hemostatycznej, przylegania do uszkodzeń i podatności w stosunku do miąższu. Ich skuteczność była doskonała.

W badaniu makroskopowym oba runa były niezmienione w 3 dniu, aczkolwiek warunki enzymatyczne były ciężkie, szczególnie w 2 dniu we krwi i wciąż w 4 dniu w płynie otrzewnowym.

PL 205 181 B1

Po 72 godzinach nie stwierdzono istotnych różnic oporu obu materiałów po podwyższeniu ciśnienia w śledzionie.

W grupie TachoComb S wystąpiło jedno przerwanie materiału. Krwawienie z miejsca uszkodzenia obserwowano u 1 zwierzęcia z TachoComb S i u 2 zwierząt z TachoComb H (z jednym pęcherzykiem w grupie TachoComb H).

Badanie histopatologiczne nie wykazało istotnej różnicy w degradacji TachoComb S w porównaniu z TachoComb H. Nie obserwowano swoistych wzorców komórkowych w śledzionie. Nawet w próbkach trzustkowych fragmenty TachoComb H i S znajdujące się w bliskim kontakcie z wysokim stężeniem enzymów trzustkowych nie wykazały większych zmian.

Wniosek

Nie stwierdzono wyraźnej różnicy pomiędzy TachoComb S a TachoComb H pod względem ich oporności na przerwanie w warunkach podwyższonego stężenia enzymów trzustkowych.

Nie wykryto swoistych makro- ani mikroskopowych cech wskazujących na modyfikację runa TachoComb H i S.

Aktywność hemostatyczną TachoComb S i TachoComb H badano w standaryzowanym modelu uszkodzeń śledziony (uszkodzenie powierzchniowe 2 cm x 3 cm, głębokość ok. 3 mm; n = 10 na grupę) u świń z ostrym zapaleniem trzustki indukowanym wsteczną iniekcją żółci do przewodu Wirsunga i następującym zamknięciem przewodu trzustkowego. Niewielkie fragmenty TachoComb H i S naniesiono również na trzustkę w miejscu niedrożności przewodu trzustkowego. Po 72 godzinach po zabiegu chirurgicznym podwyższano ciśnienie wewnątrz śledziony poprzez zamknięcie żyły śledzionowej i dożylną iniekcję adrenaliny.

Na śledzionie TachoComb S i TachoComb H zachowywały się podobnie pod względem natychmiastowej skuteczności hemostazy, przylegania do miejsca uszkodzenia oraz oporności na podwyższone ciśnienie wewnątrz śledziony pomimo znacznego wzrostu poziomów enzymów trzustkowych (20 - 100-krotny wzrost amylazy i lipazy we krwi oraz 10 - 100-krotny wzrost poziomu enzymów trzustkowych w płynie otrzewnowym w porównaniu z poziomami wyjściowymi). Badania histopatologiczne nie wykazały istotnych różnic w degradacji TachoComb S i TachoComb H. Nie obserwowano swoistego wzorca komórkowego na śledzionie. Nawet w próbkach trzustkowych po bliskim kontakcie TachoComb H i S z wysokimi stężeniami enzymów trzustkowych adhezja TachoComb H i S i badania histopatologiczne nie wykazywały większych różnic.

W tym wysoce stresującym modelu ostrego zapalenia trzustki u świń nie obserwowano zatem swoistych makro- ani mikroskopowych różnic pomiędzy TachoComb S a TachoComb H.

P r z y k ł a d 7

Porównawcza reakcja tkanki mózgowej i skuteczność wchłanialnych TachoComb H i TachoComb S: Badanie eksperymentalne w modelu króliczym w warunkach prawidłowego krzepnięcia oraz podczas miejscowej nadmiernej aktywności fibrynolitycznej.

Celem tego badania było porównanie skuteczności TachoComb S i TachoComb H po aplikacji neurochirurgicznej. Uszkodzenia mózgu wywołano u królików w warunkach krzepnięcia prawidłowego (reakcja tkanki mózgowej = BTR, n = 12 królików, nadających się do oceny n = 10) oraz w warunkach nadmiernej aktywności fibrynolitycznej (HF) na skutek miejscowego zastosowania r-tPA (n = 10 królików). W każdej półkuli wywołano trzy uszkodzenia w korze mózgowej (łącznie 6 uszkodzeń u jednego zwierzęcia; wywiercone uszkodzenie mózgu o głębokości 3 mm i średnicy 4 mm).

Seria BTR

Dwa z trzech uszkodzeń w jednej półkuli traktowano odpowiednio TachoComb H lub TachoComb S, a jedno miejsce uszkodzenia pozostawiano puste jako kontrolę. Po uszczelnieniu uszkodzeń przy pomocy TachoComb H lub S pod dużym powiększeniem mierzono czas krwawienia z ciągłą irygacją fizjologicznym roztworem soli w warunkach niskiego przepływu. Po uzyskaniu hemostazy we wszystkich miejscach uszkodzeń wywoływano nadciśnienie tętnicze poprzez dożylną iniekcję adrenaliny (0,01 mg/kg), zwiększając średnie ciśnienie tętnicze (MAP), do co najmniej 120 mmHg. Podczas tej procedury kontynuowano obserwację pod kątem nawrotu krwawienia. Po ponownym obniżeniu MAP do wartości prawidłowych zamykano skórę. Czas do wykonania sekcji wynosił 3 i 7 dni (n = 5 królików w każdej grupie). U trzech zwierząt przed sekcją zwłok w dniu 3 wykonano rezonans magnetyczny. Podczas sekcji prowadzono makroskopową obserwację uszkodzeń oraz pobrano próbki do badania histopatologicznego.

Seria HF

PL 205 181 B1

Po ustaleniu warunków jak opisano w serii BTR, uszkodzenie zakraplano r-tPA (0,3 mg r-tPA w 0,5 ml fizjologicznym roztworze soli na uszkodzenie), a następnie wszystkie uszkodzenia zaklejono TachoComb S bądź TachoComb H. Pod dużym powiększeniem mierzono czas krwawienia z ciągłą irygacją fizjologicznym roztworem soli w warunkach niskiego przepływu. Sekcję zwłok z obserwacją makroskopową przeprowadzono w dniu 1 (n = 7) i dniu 3 (n = 3). Badanie histopatologiczne wykonano na próbkach pobranych w dniu 3 w celach porównawczych.

W przebiegu całego badania nie stwierdzono wyraźnych różnic pomiędzy TachoComb S a TachoComb H pod względem skuteczności uszczelnienia, tolerancji podwyższonego MAP, czasu krwawienia ani pod względem wyników histopatologicznych. Znaczne krwawienie występowało u wszystkich zwierząt w serii HF nie tylko w miejscu uszkodzenia, ale także pod skórą na całym pysku. Pomimo tych ciężkich warunków TachoComb S również w tym przypadku charakteryzował się podobną skutecznością jak TachoComb H.

P r z y k ł a d 8

Neurochirurgiczne stosowanie TachoComb H i TachoComb S:

Reakcja tkanki mózgowej i skuteczność hemostazy

Płynne uszczelniacze fibrynowe stosowane są na szeroką skalę do uzyskania hemostazy w neurochirurgii. Brak jest obszernych opublikowanych danych dotyczących reakcji tkanki mózgowej na TachoComb®, a stosowanie środków anty-fibrynolitycznych (tzn. aprotyniny) jest w dalszym ciągu kontrowersyjne.

Cele

Badanie skupiło się na dwóch głównych zagadnieniach: ocenie krótkoterminowej miejscowej reakcji tkanki mózgowej po nanoszeniu TachoComb H (TCH) i TachoComb S (TCS) na uszkodzenia w korze mózgowej w porównaniu z pustymi uszkodzeniami kontrolnymi (CL) z wykorzystaniem sposobów histologicznych i nowoczesnych technik obrazowych.

Drugim celem było zbadanie skuteczności hemostazy TachoComb H i S w warunkach prawidłowego krzepnięcia (grupa BTR) i po miejscowej indukcji istotnej nadmiernej aktywności fibrynolitycznej (grupa HF) oraz ocena, czy aprotynina wywiera wpływ na jakość hemostazy i siłę adhezji preparatu.

Materiał i metoda

W grupie 22 młodych królików na każdej półkuli wykonano po trzy uszkodzenia w korze mózgowej. Dwanaście zwierząt przypisano do grupy z oceną reakcji tkanki mózgowej (BTR), a 10 zwierząt do grupy z nadmierną fibrynolizą (HF).

W grupie zwierząt BTR dwa uszkodzenia wypełniono odpowiednio TachoComb H i TachoComb S, natomiast trzecie pozostawiono puste jako kontrolę. Mierzono czas krwawienia i monitorowano występowanie ponownego krwawienia w wyniku indukcji nadciśnienia tętniczego. Zwierzęta uśmiercono w dniach 3 i 7 po zabiegu chirurgicznym i przeprowadzono badanie histologiczne. U trzech zwierząt BTR w dniu 3 bezpośrednio przed eutanazją wykonano rezonans magnetyczny dla oceny obrzęku mózgu.

U zwierząt HF, u których uprzednio indukowano stan ostrej miejscowej nadaktywności fibrynolitycznej przy pomocy rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (r-tPA) wszystkie trzy uszkodzenia w jednej półkuli leczono TachoComb H, a w drugiej półkuli TachoComb S. Mierzono czas krwawienia, a u trzech zwierząt w dniu 3 wykonano badanie histologiczne.

Wyniki

W warunkach prawidłowego krzepnięcia (zwierzęta BTR) hemostaza przy pomocy TCH i TCS była znacznie szybsza (p < 0,001) niż przy braku środka hemostatycznego. Wykazano brak różnic w czasie krwawienia dla obu produktów (p = 0,294), ale czasy te były w każdym przypadku krótsze niż w przypadku uszkodzeń kontrolnych (p < 0,001).

Podczas indukowanego nadciśnienia tętniczego ponowne krwawienie wystąpiło w 1 z 24 uszkodzeń TCH, 3 z 24 TCS oraz 19 z 24 uszkodzeń kontrolnych. Obecność środka hemostatycznego zapobiegała ponownemu krwawieniu podczas znacznego wzrostu ciśnienia tętniczego (x² = 16,3; p < 0,001). Z kolei nieobecność TCH lub TCS podczas wzrostu ciśnienia tętniczego wskazywała na 80% ryzyko wystąpienia ponownego krwawienia.

Analiza statystyczna czasów krwawienia w grupie z nadmierną fibrynolizą (zwierzęta HF) wykazała brak różnic w zakresie czasów krwawienia dla obu produktów (test dla par obserwacji: p = 0,927 i test T: p = 0,4102).

PL 205 181 B1

Na koniec w przedziale ufności 99,73% (D < 3sdD = ns) wykluczono występowanie istotnej różnicy w zakresie skuteczności hemostatycznej tego samego produktu w obu sytuacjach krzepnięcia.

Wniosek

TachoComb H i TachoComb S nie indukowały swoistych zmian histologicznych w tkance mózgowej. Oba produkty charakteryzują się wysoką zgodnością z miąższem tkanki mózgowej, jako że nie indukowały większych reakcji tkankowych niż samo uszkodzenie. Nie było morfologicznych cech działań niepożądanych związanych z produktami łączonymi. Badanie histologiczne nie ujawniło różnic pomiędzy oboma produktami ani w warunkach prawidłowego, ani znacznie zaburzonego krzepnięcia. TachoComb H i S cechowały się taką samą skutecznością hemostazy i siłą adhezji zarówno w warunkach prawidłowego krzepnięcia, jak i nadaktywności fibrynolizy. Istnieją silne dowody wskazujące, że aprotynina nie wywiera wpływu na jakość hemostazy i siłę adhezji, nawet w warunkach znacznie zaburzonego krzepnięcia.

W porównaniu z danymi literaturowymi TachoComb H i S prowadzą do osiągnię cia znacznie szybszej hemostazy niż utleniona celuloza i runo kolagenowe.

Claims

1. Stała kompozycja zawierająca nośnik kolagenowy, fibrynogen i trombinę, znamienna tym, że składa się zasadniczo z

a) nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych: moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm oraz równomiernie rozmieszczonej na tym nośniku i związanej z nim mieszaniny

b) stałego ludzkiego fibrynogenu i

c) stałej ludzkiej trombiny.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera nośnik kolagenowy którym jest gąbka kolagenowa zawierająca kolagen typu I pochodzący ze źródeł ssaczych, transgenicznych lub zrekombinowanych.

3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że zawiera nośnik kolagenowy mający jedną lub większą liczbę aktywnych stron, na których fibrynogen jest obecny w ilości 2 - 10 mg/cm², np. 4,3 - 6,7 mg/cm², korzystnie około 5,5 mg/cm², a trombina jest obecna w ilości 1,5 - 5,5 IU/cm², korzystnie około 2,0 IU/cm².

4. Kompozycja według zastrz. 1 - 3, znamienna tym, że zawiera fibrynogen oczyszczony ze źródła naturalnego.

5. Kompozycja według zastrz. 1 - 3, znamienna tym, że zawiera fibrynogen transgeniczny lub zrekombinowany.

6. Kompozycja według zastrz. 1 - 5, znamienna tym, że zawiera trombinę oczyszczoną ze źródła naturalnego.

7. Kompozycja według zastrz. 1 - 5, znamienna tym, że zawiera trombinę transgeniczną lub zrekombinowaną.

8. Kompozycja według zastrz. 1 - 7 do hemostazy, uszczelniania i klejenia tkanek, znamienna tym, że zawiera elastyczny nośnik kolagenowy mający co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

₂ moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm, zawierająca ponadto mieszaninę stałego ludzkiego fibrynogenu i stał ej ludzkiej trombiny, i nie zawierająca żadnego środka antyfibrynolitycznego, takiego jak aprotynina, kwas ε-aminokapronowy lub a2-antyplazmina przy czym stały ludzki fibrynogen i stała trombina są związane z nośnikiem w taki sposób, że ścieranie wynosi mniej niż 1,0 mg/cm², gdy próbkę powlekanego nośnika wstrząsa się na wstrząsarce Vibrofix z częstotliwością około 1000 obrotów/minutę przez 2 minuty oraz

PL 205 181 B1 gdy powleczony nośnik wprowadzi się do przyrządu endoskopowego, a następnie wyjmie z niego, powleczony nośnik pozostaje niezmieniony, a strata powłoki wynosi mniej niż 20%, co wskazuje na giętkość nośnika oraz trwałą adhezję stałego fibrynogenu i stałej fibryny, oraz kompozycja jest szczelna w stosunku do powietrza i cieczy oraz charakteryzuje się wskaźnikiem elastyczności wynoszącym co najmniej 1,25, oznaczonym w teście polegającym na unieruchomieniu powleczonego nośnika na arkuszu lateksowym, trzykrotnym rozciągnięciu lateksu działaniem ciśnienia, oraz wykonaniu za trzecim razem pomiaru powierzchni powleczonego nośnika w najwyższym punkcie rozciągania arkusza lateksowego i porównaniu powierzchni rozciągniętej powleczonego materiału z jego powierzchnią wyjściową.

9. Zastosowanie nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

₂ moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm oraz wystarczającej ilości ludzkiego fibrynogenu i wystarczającej ilości ludzkiej trombiny do wytwarzania produktu do uszczelniania tkanek.

10. Zastosowanie nośnika kolagenowego mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych:

11. Zastosowanie nośnika mającego co najmniej dwie z następujących właściwości fizycznych: moduł sprężystości w zakresie 10 - 50 N/cm², ₃ gęstość 1 - 10 mg/cm³, średnicę komórek powyżej 0,75 mm i poniżej 4 mm i/lub średnią średnicę komórek poniżej 3 mm, oraz wystarczającej ilości ludzkiego fibrynogenu i wystarczającej ilości ludzkiej trombiny do wytwarzania produktu do klejenia tkanek.

12. Zastosowanie według zastrz. 9 - 11, w interwencjach chirurgicznych w przewodzie żołądkowo-jelitowym, np. przełyku, żołądku, jelicie cienkim, jelicie grubym, odbytnicy lub narządach miąższowych, takich jak wątroba, śledziona, trzustka, nerki, płuca, nadnercza, tarczyca i węzły chłonne, w chirurgii ukł adu sercowo-naczyniowego, w chirurgii klatki piersiowej, w tym chirurgii tchawicy, oskrzeli lub płuc, chirurgicznych interwencjach w uchu, nosie i gardle (ENT), w tym w stomatologii, w chirurgii ginekologicznej, urologicznej, naczyniowej, chirurgii koś ci (np. resekcji kości gąbczastej), w interwencjach chirurgicznych w stanach nagłych, neurochirurgii, przetokach limfatycznych, ż ółciowych i mózgowo-rdzeniowych (CSF) oraz przy ulatnianiu się powietrza podczas chirurgii klatki piersiowej i płuc.

13. Zastosowanie według zastrz. 9 - 12, w którym nośnikiem jest gąbka kolagenowa, taka jak gąbka kolagenowa składająca się zasadniczo z włókien kolagenu typu I.

14. Zastosowanie według zastrz. 9 - 13, w którym nośnik ma jedną lub większą liczbę aktywnych stron, na których fibrynogen jest obecny w ilości 2 - 10 mg/cm², np. 4,3 - 6,7 mg/cm², korzystnie około 5,5 mg/cm², a trombina jest obecna w ilości 1,5 - 2,5 IU/cm², korzystnie 2,0 IU/cm².

15. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 9 - 14, w którym fibrynogen jest oczyszczony ze źródła naturalnego.

16. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 9 - 15, w którym fibrynogen jest transgeniczny lub zrekombinowany.

17. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 9 - 16, w którym trombina jest oczyszczona ze źródła naturalnego.

18. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 9 - 17, w którym trombina jest transgeniczna lub zrekombinowana.