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CN1264578C - 具有固体纤维蛋白原和固体凝血酶的载体 - Google Patents

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CN1264578C
CN1264578C CNB028040961A CN02804096A CN1264578C CN 1264578 C CN1264578 C CN 1264578C CN B028040961 A CNB028040961 A CN B028040961A CN 02804096 A CN02804096 A CN 02804096A CN 1264578 C CN1264578 C CN 1264578C
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Abstract

本发明涉及一种固体组合物，主要由a)一种载体，所述载体具有至少下述一种物理性质：弹性模量范围为5-100N/cm2，如10-50N/cm2；密度为1-10mg/cm3，腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，和均匀分散并固定在所述载体上的b)固体纤维蛋白原、和c)固体凝血酶组成。所述载体是一种生物可降解聚合物如聚透明质酸、多羟基酸例如乳酸、葡糖酸、羟基丁酸、一种纤维素、胶质或胶原如胶原海绵例如主要由胶原I型纤维组成的胶原海绵。所述纤维蛋白原和凝血酶优选是人体的、从一种天然来源纯化得到的、或转基因的或重组的人体纤维蛋白原和/或凝血酶。在一个优选实施方式中，所述组合物不含有任何抗纤维蛋白溶解试剂如抑肽酶、ε-氨基正己酸或α2-抗血纤维蛋白溶酶。

Description

具有固体纤维蛋白原和固体凝血酶的载体
发明领域
本发明涉及一种易于使用的可吸收组合物，用于组织粘合、组织封口和止血，主要由一种涂敷有固体固定的人体组合成分纤维蛋白胶：人体纤维蛋白原和人体凝血酶的载体组成。这种固定组合物可以直接涂敷到例如伤口表面。在与血液、体液或生理盐水接触时，这种系统机制就会模仿阶式凝结的最后阶段，其中，凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并催化XIII因子的活化从而生成XIIIa。XIIIa因子一经形成，就可以通过共价交联稳定所述纤维蛋白凝块。
象一种两组分粘合剂一样，伤口表面和载体通过聚合作用被粘合在一起。在此过程中，它持续大约3-5分钟，本发明所述组合物优选是压在所述伤口区域之上。本发明所述组合物的成分应用约4-6个月之后，因酶促而退化。
现有技术
商用纤维蛋白胶水，它们模仿所述阶式凝结的最后步骤，含有一种高度浓缩的纤维蛋白原溶液，在应用到所述存在的外科伤口之前与一种凝血酶溶液进行混合。这些混合物含有一种纤维蛋白溶解抑制剂，例如，抑酞酶或ε-氨基正己酸，以防止所述纤维蛋白凝块被纤维蛋白溶酶血纤维蛋白酶过早地溶解。这些两组分纤维蛋白胶水在许多外科手术中是有用的，但是，如果所述流血是严重情形时，在实现止血之前，它们就可能会被冲走。这种两组分纤维蛋白胶水还需要一些包括融化或溶解的预备步骤。因此，它们是相当不实用的且是难以起作用的，还需要经验才能成功地使用这些纤维蛋白胶水。
在最近十年来，大量的纤维蛋白密封剂正成为大量适应症中外科手术中的备选方法。但是，在采用纤维蛋白胶水的大部分试验中，需要另外采用一种胶原棉网，以提高止血性能和粘合性能，说明它们存在着不足和被外科医生使用时存在着限制。
胶原自从上世纪六十年代就已经被用作止血试剂。胶原是所有哺乳动物中最为常见的结构蛋白。大约300kDa(原胶原)的单体蛋白质在特定位置进行共价交联。所述成熟蛋白质因而是不溶的，它形成具有高抗拉强度的特征原纤维。大量的胶原子类已经被分开，其中最为常见为胶原I类，它是皮肤、腱、骨和角膜中主要胶原。胶原是一种纤维状蛋白质，由一种长度大约为290nm的三螺旋组成。这些三螺旋中的五个(原胶原分子)进行交错排列，形成一种直径大约为3.6nm的微纤维。这些微纤维具有极性和非极性片断，它们容易地进行纤维间和纤维内的相互作用。微纤维可以被包装到一个四角网格中，以形成具有直径约30nm的亚原纤维。这些亚原纤维接着可装配成胶原纤维，它是结缔组织的基本单位，它具有数百nm的直径，因而在光学显微镜下可以看到一个细线。
胶原可以用作一种用于密封伤口的材料，可能地与一种含有纤维蛋白胶水的涂料一起使用。纤维蛋白胶水，即纤维蛋白原、凝血酶和抑肽酶的组合物，许多年来已经成功地用于治疗粘合组织和神经和用于密封存在少量流血的表面。所述纤维蛋白胶水的一种缺点是，对于大量流血情形，所述胶水在纤维蛋白有效聚合发生之前，就常常被冲走。为了克服这个问题，外科医生开始用手涂敷所述液体纤维蛋白胶水到可吸收载体如胶原棉网之上。
尽管这些结合应用具有给人印象深刻的成功，但是，这种方法不能广泛地应用，这是由于它存在着一些缺点。其制备是相对麻烦的，所述方法需要经验和熟练技术人员，且所述制备方法对于紧急情况不是很有效，制备时间在10-15分钟之间。这些因素刺激着一种改进产品的开发，从而导致开发出一种覆盖有一种固体纤维蛋白原、固体凝血酶和固体抑肽酶涂层的固定组合物，如EP 0 059 265中所述。
在EP 0 059 265中所公开的胶原载体的作用，主要是载体作用，它可吸收所涂敷的凝结液并赋予机械稳定性。
已经开发生产出一种产品，其商标为TachoComb，它结合了纤维蛋白胶水的止血作用和作为载体胶原的优点。TachoComb是一种易于使用且易于适用固定的胶原药膏组合物，它涂敷有下述活性纤维蛋白胶水成分：人体纤维蛋白原、牛凝血酶和牛抑肽酶。
TachoComb自1990年早期就已经由Nycomed Pharma出售，并已经在欧洲的多于2500病人中用于临床实验。所述产品还在日本临床日程大量各种适应症如肝和肺切除术、胆道外科、脾脏、肾脏和胰的外科、ENT外科、妇科外科和血管外科，用于700多病人中。TachoComb已经发现是有效且安全的。
在进行的临床过程中，还没有与应用TachoComb有关的临床并发症的报导。但是，反抑肽酶的抗体发生在三例日本研究中。
临床使用数千个TachoComb药膏这么多年中，已经报导总数仅为37件自发性不良药物反应(ADR)。这些ADR中的16例，理论上可能与对TachoComb成分起反应有关(发热、热病、嗜曙红细胞增多、延长的原凝血酶时间、超敏反应、免疫反应或过敏反应)。一例ADR(免疫反应)明显与采用TachoComb治疗有关。
在WO97/37694(Immuno France S.A.)的对比例4中，描述了采用一种胶原产品或TachoComb，当采用TachoComb时没有止血作用导致流血至死，与之形成对比，当使用一种WO97/37694制备的不含有凝血酶的胶原产品时，在5分钟内止血。
在WO96/40033中，用于TachoComb中的牛凝血酶的缺点着重在于，使用牛或其它种类凝血酶可能会引起有害的病毒污染和可能的牛疾病传播，如牛海绵状脑炎。
详细说明
本发明涉及一种固体组合物，主要由一种载体组成，所述载体具有至少下述一种物理性质：弹性模量范围为5-100N/cm2，如10-50N/cm2；密度为1-10mg/cm3，如2-7mg/cm3；腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，和均匀分散并固定在所述载体上的b)固体纤维蛋白原、和c)固体凝血酶。
所述组合物可以具有上述提及物理性质中的二种、三种或全部。在本发明优选实施方式中，所述载体物质是按照DK PA 2001 00135以及Nycomed Pharma AS于2002年1月25日申请的要求所述申请优选权的申请名称为“一种制备胶原海绵的方法、一种用于提取部分胶原泡沫的装置和一种延长的胶原海绵”中所述方法制备的。在本文中，术语“腔直径”应该理解为在一个腔中最大的直线壁与壁间距离，即一个腔的最大对角直线距离。所述腔可为多边形状，如八角形。因此，当所述载体在被切割时，所述腔可以被分开并可被切成洞穴。所述固体纤维蛋白原和所述固体凝血酶被固定到所述载体上，其大部分是存在于所述洞穴中，从而实现所述固体凝血酶和所述固体纤维蛋白原的充分均匀分散。由于这种固定作用，就可以将显著数量的纤维蛋白原和凝血酶引入到所述载体之上，与那些凝血酶和纤维蛋白原的液体组合物例如是滴加或喷射到所述物质上的情形形成对比。
涂层载体的制备
一种涂敷载体的制备主要有下列过程组成：
-制备一种所述活性成分的悬浮液
-均匀分散所述悬浮液到所述载体上
-干燥所述涂敷载体为一种固体组合物/固定所述活性成分到所述载体上。
一种具有纤维蛋白原和凝血酶的悬浮液的制备，包括：
-提供一种纤维蛋白原和一种醇如乙醇的混合物，
-提供一种凝血酶和一种醇如乙醇的凝血酶混合物，
-混合所述纤维蛋白原混合物和所述凝血酶混合物，从而得到所述悬浮液。
在提供所述混合物步骤，所述混合物可以进行均化或筛分，以得到一种含有纤维蛋白原和凝血酶颗粒的混合物，所述颗粒的FolkWard平均直径为25-100μm。所述温度在0-12℃之间。
所述载体可为一种胶原载体，如一种胶原海绵。所述胶原海绵可以满足至少一个和优选多数的下述标准：
-pH值在5.0-6.0之间，
-乳酸含量至多为5％，
-铵含量至多为0.5％，
-可溶蛋白含量至多为0.5％，白蛋白计，
-硫酸盐灰分含量至多为1.0％，
-重金属含量至多为20ppm，
-微生物纯度至多为103CFU/g，
-胶原含量为75-100％，
-密度为1-10mg/cm3，
-弹性模量范围为5-100N/cm2。
在本发明优选实施方式中，所述胶原载体是按照DK PA 200100135所述方法制备的。三个实施例中的胶原载体的物理性质如下：
  实施例   I   II   III
  pH值   5.3   5.1   5.4
  乳酸含量   2.3％   2.8％   2％
  铵含量   0.1％   0.2％   0.1％
  可溶蛋白含量   0.04％   0.05％   0.08％
  硫酸盐灰分含量   0.3％   0.3％   0.3％
  微生物纯度(CFU/g)   <12-345   <18-124   <11-33
  水含量   14％   15％   16％
  胶原含量(干重)   95％   95％   98％
  弹性模量   10.4-42.1N/cm2   15-50N/cm2   12.3-41.0N/cm2
  孔径尺寸(直径，平均值)   2.9mm   2.1mm   2.9mm
  密度   2.9-5.3mg/cm3   2.9-5.9mg/cm3   2.4-5.0mg/cm3
所述悬浮液的均匀分散，既可以采用如US5942278和US6177126所述的下滴装置，也可以采用一种含有至少一个可用来涂敷所述悬浮液到所述载体上的喷嘴的涂药器来实现。在当所述载体与所述喷嘴相互作相对运动时，所述喷嘴涂药器迫使所述悬浮液流过所述喷嘴。所述涂药器可以包括或设置一个传送带、一个搅拌装置连接到一个泵或一个泵系统或其它供给装置上、和一种喷嘴或喷嘴系统(它能横断地例如以直角移动到所述传送带。
根据所述介质的具体性质，所述喷嘴和喷嘴系统可以具有不同形状和尺寸。所述喷嘴或喷嘴系统，可以经由管道连接到所述供给装置上。所述供给装置可以提升所述涂敷介质从所述搅拌装置到所述喷嘴系统中。在所述涂敷过程中，所述喷嘴系统可以横移过所述载体。在其待料位置，它可固定在所述传送带的一侧。所述涂敷过程可以通过一个挡光板感觉载体在所述传送带上的存在而起动，类似地，它可被一个挡光板信号所停止。这类涂药器具有一个相对小的死体积，而且它易于控制，包括易于清洁。而且，它具有在任意时间中断所述涂敷过程的能力，所以，它可适用于相对宽范围的粘度，而且它能得到均匀的涂层。
这两种系统都能涂敷0.08-0.12ml悬浮液体积/cm2载体。
一个重要步骤是一种纤维蛋白原、凝血酶和醇的悬浮液的干燥步骤，应用作载体涂层表面的湿涂层。一种方法的一个实施例，包括使所述涂敷载体经受低于1000mbar压力的步骤，从而在所述载体上得到一种干燥的涂层表面，并固定所述干燥涂层到所述涂层表面上。通过在所述干燥步骤中施加真空和采用所述真空，可以保持低温(2-10℃)和高的相对湿度(80-95％)，同时可以保持所述载体的结构和物理性质，特别是胶原如胶原海绵以及纤维蛋白原和凝血酶形式的载体。
所述术语“主要由......组成”是表示所述三种成分对于本发明都是重要和必需的。但是，无关紧要的添加剂如钙离子和颜色标记如核黄素也可存在于所述组合物之中。所述组合物还可以含有其它有用的成分，如一种或多种药物活性物质，例如，它们可选自由抗菌的或抗真菌的抗生素、和抗肿瘤试剂组成的组。
尽管所述载体物质优选为胶原海绵，它含有源自哺乳动物、转基因或重组体来源的胶原I物质，它可以通过其它类型的胶原，即胶原I、II、III、IV、VII和X制备得到。但是，所述载体可为一种生物可降解聚合物如聚透明质酸、多羟基酸如乳酸、葡糖酸、羟基丁酸、纤维素或胶质，也是可以正视的。
在本发明一个优选实施方式中，所述组合物含有一种载体，它具有一个或多个活性侧面，其中纤维蛋白原存在数量为2-10mg/cm2如4.3-6.7mg/cm2，优选约为5.5mg/cm2，凝血酶存在数量为1.0-5.5IU/cm2，优选约为2.0IU/cm2。所述纤维蛋白原和/或凝血酶优选为人体的，例如通过本领域技术人员已知的方法自一种天然来源经纯化得到的，或者转基因的或重组的人体纤维蛋白原和/或凝血酶，它们可通过本领域技术人员公知的方法制备得到。
现有技术产品如TachoComb、Beriplast和TissueSeal都含有抑肽酶或相似的抗纤维蛋白溶解试剂。抑肽酶仅可由一种牛来源提供。本发明人的一个目的就是，开发一种具有改进载体物质和仅有人体的、重组的或转基因起源成分的组合物。因此，开发是针对所述载体物质进行的，并研究是否可以用人体凝血酶替代牛的凝血酶从而避免所述抑肽酶。本发明人通过一个两步骤方法努力达到这个目的。
首先，TachoComb H已经开发出来，作为TachoComb与例如被人体凝血酶替代的所述牛凝血酶的后续产物。采用TachoComb H的临床实验，已经在适应症止血、组织粘合和组织封口范围内针对大量的治疗证实的(阶段IIIa)临床试验进行。在这些研究中得到的未公开结果证实了TachoComb H在控制血液和漏气的功效和安全性，从而可以在外科的止血、组织粘合和组织封口中用作辅助治疗以实现缝合。特别地，TachoComb H在达到局部止血的功效，以得到控制的止血时间的明显减少表示，已经在血管和相似的肝外科中得到令人信服的说明。
而且，已经发现，TachoComb H可以减少肺部缺陷的大小，从而可以更快速地解决漏气，它对于密封严重肺部渗漏和肺气肿都是有用的。
但是，TachoComb和TachoComb H两者都含有抑肽酶作为所述产品的一个成分部分。抑肽酶已经被认为是抑制所述纤维蛋白原成分中少量血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶和防止所述纤维蛋白凝块特别是在高纤维蛋白溶解条件下的过早溶解所必需的。
本发明为了测试抑肽酶是必需的这种假设，设计了新的实验。生物体外实验表明了在所述凝块中抑肽酶的抗纤维蛋白溶解保护作用，没有抑肽酶的TachoComb(TachoComb S)在非常短时间内没有溶解。因此，设计了受迫动物样式，TachoComb S与TachoComb H相比，证明具有相似的功效。在所有样式中，TachoComb H或S，都是分别地用作止血手段。
为了研究本发明TachoComb S相对于TachoComb H优选实施方式的功效和组织病理学方案，进行四组广泛的实验系列。TachoCombS或TachoComb H是应用到狗、猪或兔的器官肝、脾、胰腺或脑/脑膜上。所述实验是以一种类似正常外科条件、严重受迫条件和高纤维蛋白溶解条件的方式进行设计的。
在这四组研究中得到的结果，没有给出任何有关TachoComb S和TachoComb H之间的不同。两种产品对于止血和伤口密封功效表现相似，包括严重受迫条件象由局部r-tPA应用所引发的提高的器官内部压力或高纤维蛋白溶解情形。
可以得出结论，设计用来评价抑肽酶作为TachoComb H一个成分的整体必要性的前临床程序，已经证明TachoComb H和TachoComb S具有相似的功效。两种产品都已经成功地在所有实验条件下用作止血、组织粘合和组织封口的手段。在动物实验过程中，没有不希望的组织反应。因此，抑肽酶可以从本发明所述组合物中除去。
本发明所述组合物预期可以临床发挥与其前体相似的止血、组织粘合和组织封口性能，预期具有相同或更令人满意的安全分布。抑肽酶(它目前仅能自牛来源中得到)的缺少，增加了对抗超敏反应的安全性。在这点上，需要提及的是，对抗抑肽酶的抗体发生在三例日本研究之中。对于没有抑肽酶的组合物没有预期到这类免疫反应。
在本发明优选实施方式中，本发明涉及一种用于止血、组织封口和组织粘合的组合物，它含有一种具有至少一种下述发生的弹性载体：弹性模量范围为5-100N/cm2，如10-50N/cm2；密度为1-10mg/cm3，如2-7mg/cm3；腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，它还含有固体纤维蛋白原和固体凝血酶且不含有任何抗纤维蛋白溶解试剂如抑肽酶、ε-氨基正己酸、或α2-抗纤维蛋白溶酶，所述固体纤维蛋白原和固体凝血酶以这样方式被固定在所述载体上，使得所述涂层物质在Vibrofix混合器中以约1000rpm频率摇晃2分钟时，所述磨损低于1.0mg/cm2，而且，当所述涂层载体物质被插入到一种内窥镜检查设置和随后移去时，所述物质基本没有变化，并且具有低于20％的涂层物质脱落物，表明所述载体的弹性和所述固体纤维蛋白原和固体凝血酶的固体粘合性，而且所述物质是充分空气密封和液体密封的，并具有至少1.25的弹性系数，它由一个包括固定所述涂层载体到一个橡胶片上、通过三次施加压力使所述橡胶伸展、和在第三次测量所述涂层载体在橡胶片伸展最高点的面积和将所述涂层载体的膨胀面积与所述涂层面积的起始面积进行比实验测量得到的。
本发明优选组合物，其中所述纤维蛋白原和凝血酶是人体例如自一种天然来源经纯化得到的或转基因的或重组的人体纤维蛋白原和凝血酶，是唯一有效的非牛纤维蛋白密封剂，它具有一种固定组成的活性成分涂敷在一种弹性载体之上，并具有多种优点：
易于使用，不需要消耗时间用于融化或制备手续
易于直接应用到大部分组织和器官表面上
可用于内窥镜检查应用
对于止血不存在溢出或被冲出所述目标区域的问题
结合了纤维蛋白凝结的粘合作用和所述弹性载体机械支撑作用
高度弹性和承受巨大拉伸和压缩作用
在3-5分钟内有效的止血和组织封口
有利的安全分布即没有牛成分
生物可降解性仅遗留很小的组织伤痕
可在+2～+8℃之间贮存，它将具有预期的保存期36个月，或者在室温保存期间可多达至少2年。
开发本发明所述优选组合物的原因，是源自希望能够除去最后的牛成分，从而防止所有至少理论上的疾病从牛传播到人体的危险，包括可传播的海绵状脑病(TSEs)。所述活性成分纤维蛋白原和凝血酶是人体起源的，而牛抑肽酶，所述纤维蛋白溶解酶血纤维蛋白溶酶，已经被除去。这样，本发明所述不含有牛成分的优选组合物的优点在于经由牛物质传播疾病包括牛海绵状脑病(BSE)的危险，就被排除。
与其它纤维蛋白胶水相似，本发明所述组合物通过再制造所述阶式血液凝结的最后步骤而起作用。一种纤维蛋白原和凝血酶的混合物，在所述弹性载体上形成一种固定的固体层。在与流体接触时，例如，流血表面、体液或生理盐水，所述层中的成分溶解并扩散到所述伤口的空腔中，并开始进行反应。
所述聚合反应在伤口表面和载体药膏之间形成一种强烈的粘合作用。在用于粘合所需要的时间即3-5分钟内，本发明所述组合物优选地应该轻轻地加压到所述伤口表面之上。所述载体药膏提供了机械支撑作用，它能够允许所述伤口压塞。当伤口大量地流血时所述药膏能够适当地保持所述凝结成分，并防止可能的再流血。作用机理包括通过脱离缩氨酸由凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。纤维蛋白单体白发地聚合为纤维蛋白股，形成一种粘性的弹性凝块，它粘合所述载体药膏到所述伤口表面之上。所述纤维蛋白间质随后充当纤维蛋白破裂(fibrinoblast)迁移的脚手架(图8)。
象两组分粘合剂一样，伤口表面和载体通过聚合作用粘合在一起。所述载体药膏的机械稳定性为纤维蛋白凝块的止血作用增加一个压塞作用。而且，所述活性物质仅存在于所述载体面向伤口区域的表面，由于所述压塞作用和轻微压力，它们将不会扩散流过所述载体。因此，与使用大多数纤维蛋白胶水的情形比，在使用本发明所述组合物时，被本发明所述组合物覆盖的伤口区域与其它器官或其部分之间，不存在粘合作用。
与氰基丙烯酸盐粘合剂和胶质-间苯二酚-甲醛(GRF)胶水不同，它们对于软组织是高度组织有毒的，本发明所述固体组合物是生理退化的，在应用之后的数周或数月内，它可被组织所替代，主要是经由两种机理：
1.所述纤维蛋白凝块部分被纤维蛋白溶解作用所退化，部分被细胞的吞噬作用所退化。
2.所述载体是一层一层地由吸收的肉芽组织所退化，并转化为一种由内生的结缔组织组成的假包膜(pseudocapsule)。
本发明所述组合物可用于止血、组织粘合和组织封口，，特别地，可用于肠胃系统如食管、胃、小肠、大肠、直肠中、在软组织器官如肝、脾、胰腺、肾、肺、肾上腺、甲状腺和淋巴结上的外科干涉、心血管外科、包括在气管、支气管或肺上的胸外科、在耳朵、鼻和包括牙外科的咽喉(ENT)区域的外科干涉、妇科、泌尿道、骨科(例如松质切除术)、和紧急外科、神经外科、淋巴腺的、胆汁的、和脑脊髓(CSF)管状器官、和在胸和肺外科过程中的漏气。因此，本发明还涉及所述组合物用于上述目的的用途。
应该强调的是，本发明所述组合物是充分空气密封和流体密封的，这是所述产品对于治疗淋巴腺的、胆汁的、和脑脊髓(CSF)管状器官和在胸和肺外科过程中的漏气特别有效的原因。而且，由于所述产品是充分流体密封的，所以，它对于高度流血器官如肝和脾的外科和例如肠胃管道中的外科是非常有用的。
当流血时，或者淋巴腺的、胆汁的、空气或渗漏采用常规方法不能得到控制时，或者这些方法产生不利结果时，可以应用本发明所述产品。
所述载体优选为一种胶原海绵、棉网或药膏，这些术语是在本发明说明书和权利要求书是以相同含义进行使用。所述成分胶原、纤维蛋白原和凝血酶优选是哺乳动物起源。优选地，所述固体成分是人体起源的。所述胶原、纤维蛋白原和凝血酶可以从一种天然来源或重组的或转基基因的人体纤维蛋白原和/或凝血酶纯化而得到。
本发明优选的胶原来源是马。为了防止由于马病毒污染而引起的病毒传播，这些马病毒可借助于所述胶原药膏使人体致病，合适选择来源材料和采用制备方法灭活可能的致病试剂，作为预防措施是非常重要的。
附图说明
 图1
 1.1Opraskin：未涂层的/涂层的
 1.2涂层的Opraskin：插入到内窥镜检查设备中
 1.3涂层的Opraskin：在前插入到内窥镜检查设备中展开。
 图2
 2.1Willosponforte：未涂层的/涂层的
 2.2涂层的Willosponforte：插入到内窥镜检查设备中
 2.3涂层的Willosponforte在插入到内窥镜检查设备中前展开。
 图3
 3.1WillosponSpezial：未涂层的/涂层的
 3.2涂层的WillosponSpezial：插入到内窥镜检查设备中
 3.3涂层的WillosponSpezial在插入到内窥镜检查设备中前展开。
 图4
 4.1Ethisorb药膏：未涂层的/涂层的
 4.2涂层的Ethisorb药膏：插入到内窥镜检查设备中
 4.3涂层的Ethisorb药膏在插入到内窥镜检查设备中前展开。
 图5
 5.1TabotampNU Knit：未涂层的/涂层的
  5.2涂层的TabotampNU Knit：插入到内窥镜检查设备中
  5.3涂层的TabotampNU Knit：在插入到内窥镜检查设备中前展开。
  图6
  6.1海绵Nycomed：未涂层的/涂层的[实验室样品]
  6.2涂层的海绵Nycomed[实验室样品]：插入到内窥镜检查设备中
  6.3涂层的胶原海绵Nycomed[实验室样品]：在插入到内窥镜检查设备中前展开。
  图7
  内窥镜检查工具：Endodock
  内窥镜检查工具：Endodock
  内窥镜检查工具：Endodock
  图8
  血液凝结物和凝块和载体药膏。所述载体涂层的活性成分如阴影框所示。
实施例
实施例I-IV下面将举例说明用于制备具有不同纤维蛋白原和凝血酶原料的涂层胶原海绵的不同步骤。
纤维蛋白原原料
  成分                                    总物质％
  配方A   配方B   配方C
  人体纤维蛋白原   36-52   42-47   36-52
  人体白蛋白   16-24   20-24   16-24
  总蛋白质   52-76   62-71   52-76
  氯化钠   8-14   0   8-14
  柠檬酸三钠   2-4   1-3   2-4
  精氨酸(盐酸)   15-26   15-21   15-26
  氨基乙酸   0   6-9   1-2
  组氨酸   0   3-5   0
  蔗糖   0   0   1-2
  残留水分   ≤2   2-4   ≤1.5
                          凝血酶原料
  配方   活性(I.U./mg物质)   残余水分   附加物质添加剂
 人体凝血酶A   360-540   ≤3％   人体白蛋白，氯化钠，柠檬酸钠
 人体凝血酶B   7-10   ≤3％   人体白蛋白，氯化钠，柠檬酸钠
 人体凝血酶C   35-60   ≤3％   人体白蛋白，氯化钠，乙酸钠，氨基乙酸
实施例I
在本实施例，所述悬浮液含有人体纤维蛋白原配方B和人体凝血酶配方B。
通过适用下述数量和参数，得到最终悬浮液体积为3500ml：
纤维蛋白原混合物：
-2800ml乙醇(在2-8℃时为94％)
-492.5g人体纤维蛋白原配方B
-493.5mg核黄素
所述纤维蛋白原混合物2-8℃贮存8-16小时，同时进行搅拌。
凝血酶混合物：
-100ml乙醇(在-30℃时为100％)
-12.27g人体凝血酶配方B
所述凝血酶混合物在-30℃贮存8-16小时。
悬浮液：
-157ml凝血酶混合物添加到所述纤维蛋白原混合物中。
-将在2-8℃时为94％的乙醇加入到其中，使所述最终悬浮液体积为3500ml。
悬浮液特征：
1.乙醇浓度：94.3％
2.沉降性能：
a)在开始5分钟后沉降体积：98％的测试体积，
b)在开始24小时后沉降体积：64％的测试体积。
3.颗粒尺寸(Folk Ward平均直径)：56.4+/-1.3μm
呈胶原条带形式的载体，采用所述悬浮液进行涂敷。首先，将48个胶原海绵条带在一个冷却室中于下述条件下进行预培养：
-温度：5.2℃
-绝对湿度：4.8g水/kg空气
-培养时间：18.5小时
所述涂层胶原海绵条带按下述方法进行干燥：
所述涂层条带在温度为5.2℃和绝对湿度为4.8g水/kg空气的条件下培养15分钟。
所述涂层条带接着在一个真空干燥室中于下述干燥条件下进行干燥：
-空气条件：温度为5.2℃，绝对湿度为4.8g水/kg空气
-空气流过吸气阀的流量：23m3/小时
-真空：59mbar
-干燥时间：4小时
当其在Vibrofix混合器上以800-1200rpm频率摇晃2分钟时，在所述胶原海绵条带上所得到的涂层的磨损大约为0.2mg/cm2。
实施例II
在本实施例，所述悬浮液含有人体纤维蛋白原配方C和人体凝血酶配方C。
通过适用下述数量和参数，得到最终悬浮液体积为3500ml：纤维蛋白原混合物：
-2252ml乙醇(在2-8℃时为94％)
-370.7g人体纤维蛋白原配方C
-493.5mg核黄素
所述纤维蛋白原混合物2-8℃贮存8-16小时，同时进行搅拌。凝血酶混合物：
-188ml乙醇(在-30℃时为100％)
-12小瓶人体凝血酶配方C(10650I.U/瓶)/12ml水，用于注射
所述凝血酶混合物在-30℃贮存8-16小时。
悬浮液：
-164.5ml凝血酶混合物添加到所述纤维蛋白原混合物中。
-将在2-8℃时为94％的乙醇加入到其中，使所述最终悬浮液体积为3500ml。
悬浮液特征：
1.乙醇浓度：94.1％
2.沉降性能：
a)在开始5分钟后沉降体积：94％的测试体积，
b)在开始24小时后沉降体积：71％的测试体积。
3.颗粒尺寸(Folk Ward平均直径)：49.2+/-0.93μm
呈胶原条带形式的载体，采用所述悬浮液进行涂敷。首先，将48个胶原海绵条带在一个冷却室中于下述条件下进行预培养：
-温度：4.8℃
-相对湿度：90.3％
-培养时间：22.25小时
所述涂层胶原海绵条带按下述方法进行干燥：
所述涂层条带在温度为4.9℃和绝对湿度为4.8g水/kg空气的条件下培养13分钟。
所述涂层条带接着在一个真空干燥室中于下述干燥条件下进行干燥：
-空气条件：温度为5.2℃，绝对湿度为4.9g水/kg空气
-空气流过吸气阀的流量：25m3/小时
-真空：60mbar
-干燥时间：4小时
当其在Vibrofix混合器上以800-1200rpm频率摇晃2分钟时，在所述胶原海绵条带上所得到的涂层的磨损大约为0.2mg/cm2。
实施例III
在本实施例，所述悬浮液含有人体纤维蛋白原配方C和人体凝血酶配方C。
通过适用下述数量和参数，得到最终悬浮液体积为780ml：纤维蛋白原混合物：
-700ml乙醇(在2-8℃时为94％)
-84.42g人体纤维蛋白原配方C
-110mg核黄素
所述纤维蛋白原混合物2-8℃贮存8-16小时，同时进行搅拌。
凝血酶混合物：
-35ml乙醇(在-30℃时为100％)
-0.54g人体凝血酶配方C
所述凝血酶混合物在-30℃贮存8-16小时。
悬浮液：
-23.0ml凝血酶混合物添加到所述纤维蛋白原混合物中。
-将在2-8℃时为100％的乙醇加入到其中，使所述最终悬浮液体积为780ml。
悬浮液特征：
1.乙醇浓度：94％
2.沉降性能：
a)在开始5分钟后沉降体积：92％的测试体积，
b)在开始24小时后沉降体积：72％的测试体积。
3.颗粒尺寸(Folk Ward平均直径)：60.5+/-0.5μm。
呈胶原条带形式的载体，采用所述悬浮液进行涂敷。首先，将48个胶原海绵条带在一个冷却室中于下述条件下进行预培养：
-温度：6.0℃
-相对湿度：85％
-培养时间：18.5小时
所述涂层胶原海绵条带按下述方法进行干燥：
所述涂层条带在温度为5℃和相对湿度为85％的条件下培养45分钟。
所述涂层条带接着在一个真空干燥室中于下述干燥条件下进行干燥：
-空气条件：温度为5℃，相对湿度为85％
-空气流过吸气阀的流量：1.2m3/小时
-真空：35mbar
-干燥时间：4小时
当其在Vibrofix混合器上以800-1200rpm频率摇晃2分钟时，在所述胶原海绵条带上所得到的涂层的磨损大约为0.3mg/cm2。
实施例IV
在本实施例，所述悬浮液含有人体纤维蛋白原配方A和人体凝血酶配方A。
通过适用下述数量和参数，得到最终悬浮液体积为3120ml：纤维蛋白原混合物：
-2540ml乙醇(在2-8℃时为l00％)
-311.6g人体纤维蛋白原配方A
-440mg核黄素
所述纤维蛋白原混合物2-8℃贮存8-16小时，同时进行搅拌。
凝血酶混合物：
-210ml乙醇(在-30℃时为100％)
-229g人体凝血酶配方A
悬浮液：
-将用于注射的87.3ml水添加到所述纤维蛋白原混合物中。
-将在2-8℃时为94％的乙醇加入到其中，达到最终的悬浮液体积。
悬浮液特征：
1.乙醇浓度：97％
2.沉降性能：
a)在开始5分钟后沉降体积：95.6％的测试体积，
b)在开始24小时后沉降体积：63.5％的测试体积。
3.颗粒尺寸(Folk Ward平均直径)：51.8+/-0.8μm。
呈胶原条带形式的载体，采用所述悬浮液进行涂敷。首先，将48个胶原海绵条带在一个冷却室中于下述条件下进行预培养：
-温度：6.5℃
-相对湿度：90％
-培养时间：22.5小时
所述涂层胶原海绵条带按下述方法进行干燥：
所述涂层条带在温度为6.5℃和相对湿度为90％的条件下培养10分钟。
所述涂层条带接着在一个真空干燥室中于下述干燥条件下进行干燥：
-空气条件：温度为6.5℃，相对湿度为90％
-空气流过吸气阀的流量：21m3/小时
-真空：58mbar
-干燥时间：4小时
当其在Vibrofix混合器上以800-1200rpm频率摇晃2分钟时，在所述胶原海绵条带上所得到的涂层的磨损大约为0.1mg/cm2。
实施例1
抑肽酶作为TachoComb的一种成分
在与生物体内状况相似的冲洗条件下进行所述抗纤维蛋白溶解活性的生物体外研究。
本研究的目的是通过采用生物体外测试模型说明抑肽酶作为TachoComb H的一种成分在高纤维蛋白溶解条件下的功效。
TachoComb S是一种白色涂层海绵状药膏。泡沫干燥胶原药膏用来作为所述活性固体成分的载体。所述药膏的尺寸为9.5×4.8×0.5cm。所述活性侧面是黄色的。1cm2的TachoComb S药膏(厚度为0.5cm)由下述物质组成：
马源的胶原2.1mg
涂敷有：
人体纤维蛋白原5.5mg
人体凝血酶2.0I.U.
核黄素(黄色，作为涂层区域的标记)16.5μm
在生物体内的寻找剂量试验，已经证实上述的凝血酶和纤维蛋白原浓度，可以导致最大的粘合强度(参见实施例3)。
含有人体凝血酶、人体纤维蛋白原和抑肽酶的TachoComb H，与含有人体凝血酶和人体纤维蛋白原作为活性成分的TachoComb S进行比较。
两种测试模型用开发用来定量确定在高纤维蛋白溶解条件下的功效，它们可以认为对应于外科条件，而且它们可允许进行说明显著效果所需要的大量试验。
在测试模型1中，所述测试样品应用到一种合成织物上用作粘合表面。在所述织物上切割一个规定的小孔，以模拟例如血管的穿孔。所述密封通过所述小孔朝向两种不同的纤维蛋白溶解溶液(培养溶液)。这些溶液中的一种另外含有所述抗纤维蛋白溶解成分α2-抗血纤维蛋白溶酶成分。
培养溶液组合物：
所有物质稀释在缓冲液1中：50mM Trometamol，100mM NaCl，2.5mM CaCl2，2mg/ml BSA(不含蛋白酸)，0.5mg/ml Na-叠氮化物/ml)
培养溶液I(1μmol血纤维蛋白溶酶原，1nmol组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)，1μmolar α2-抗血纤维蛋白溶酶)
49μl缓冲液1，pH7.4
51μl血纤维蛋白溶酶原溶液(浓度4.9μmol Coachrom人体血纤维蛋白溶酶原活性)
50μl tPA溶液(50nmol)
100μl α2-抗血纤维蛋白溶酶溶液(2.5μmol)
培养溶液II(1μmol血纤维蛋白溶酶原，1nmol组织血纤维蛋白溶酶原活化剂)
149μl缓冲液1，pH7.4，51μl血纤维蛋白溶酶原溶液(浓度4.9μmol Coachrom人体血纤维蛋白溶酶原活性)
50μl tPA溶液(50nmol)
所述培养溶液在2小时期间内放回原处，以模拟冲洗效果。在这种场合粘合得到控制。在所述样品上施加50mbar的压力。记录在压力≤50mbar所述样品脱离的时间。
测试模型2是用来说明受伤的肠组织的所述纤维蛋白溶解效果。测试样品应用到作为粘合表面的猪肠(体外)。在所述肠上切割一个规定的穿孔，以保证所述培养溶液能与所述纤维蛋白凝块进行接触，并模拟冲洗效果。所述培养溶液在记录时间内变化，在此期间在所述样品上施加50mbar的压力。记录在压力≤50mbar所述样品脱离的时间。
结果表明在含有抑肽酶的TachoComb H和不含抑肽酶的TachoComb S之间具有相当大的差别。
在采用含有组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、血纤维蛋白溶酶原和α2-抗血纤维蛋白溶酶的培养溶液的测试模型1中，所述纤维蛋白溶解时间，对于TachoComb H来说为41.2±7.3小时，而对于TachoCombS来说为12.8±2.8小时。
在采用仅含有组织血纤维蛋白溶酶原活化剂和血纤维蛋白溶酶原的培养溶液的测试模型1中，所述纤维蛋白溶解时间，对于TachoComb H来说为31.6±5.3小时，而对于TachoComb S来说为8.3±1.8小时。
在测试模型2中，脱离时间对于TachoComb H来说为78.4±16.3小时，而对于TachoComb S来说为6.5±1.8小时。
在所述测试样品中仍能观察到一些纤维蛋白。但是，在压力下所述样品从所述肠表面脱离下来，因为在纤维蛋白凝块和肠表面之间的粘合强度已经变差。
在两种模型中，抑肽酶作为一种TachoComb H活性成分的抗纤维蛋白溶解效果，已经得到非常清楚的说明。
在测试模型1中，由于抑肽酶作为一种TachoComb H活性成分的抗纤维蛋白溶解时间延长，是含有α2-抗血纤维蛋白溶酶的培养溶液I的320％，是不含有α2-抗血纤维蛋白溶酶的培养溶液II的380％。
测试模型1还表明了添加的α2-抗血纤维蛋白溶酶的抗纤维蛋白溶解效果，纤维蛋白溶解时间的延长，对于TachoComb H来说从31.6小时延长到41.2小时(130％)，而对于TachoComb S来说，则从8.3小时延长到12.8小时(154％)。
实施例2
涂层Nycomed海绵(TachoComb S)与其它如TachoComb S同样涂层的载体产品的比较
所述层的粘合
步骤
1.不同载体的涂敷
  商标   材料   由...制造/分布
  Opraskin   胶原海绵   Lohmann，Postfach 2343，D-56513Neuwied
  Willosponforte   胶原海绵(小牛)   Will-Pharma，Postbus 30，NL1160AA Zwanenburg
  WillosponSpezial   胶质海绵   Will-Pharma，Postbus 30，NL 1160AA Zwanenburg
  Ethisorb药膏   Polyglactin910/Polydioxanon   Johnson/Johnson(manufacturer)Ethicon，Robert-Koch-Str.1D-22851Norderstedt
  TabotampNUKnit   氧化再生纤维素   Johnson/Johnson(manufacturer)Ethicon，Robert-Koch-Str.1D-22851Norderstedt
  胶原海绵Nycomed   马的胶原海绵   Nycomed AustriaSankt-Peter-Str.25A-4021LINZ
每个面积为2×4.5cm2的载体，用TachoComb S涂层悬浮液进行涂敷。涂层悬浮液的数量对应于TachoComb规格(5.5mg纤维蛋白原/cm2).对所述样品进行干燥。
2.对于每个涂层载体，制备一个1×4cm2的样品。
3.所述层的粘合作用是按下述方法进行测试的：
方法说明
装置
分析天平(测量精度0.5mg)
带有固定装置的Vibrofix混合器
具有毫米刻度的标尺
秒表、解剖刀、带有塞子的内径为2cm试管
步骤
使用解剖刀从所述涂层载体上切割下4×1cm2的涂层面积。
所述样品放入带有塞子的平稳试管中。接着，在Vibrofix混合器上摇晃(频率约为1000rpm)2分钟。
移去所述薄片，称量涂层材料的残余质量。
计算：
磨损(mg/cm2)＝(残余重量(mg)-皮重(mg))/4cm2
                               结果
  载体   物质   磨损(mg/cm2)
  Opraskin   冻干胶原   2,1
  Willosponforte(3mm)   冻干胶原   1,2
  WillosponSpezial(1mm)   胶质   2,1
  Ethisorb药膏(ZVP609)   Polyglactin/dioxanon   14,3
  TabotampNU Knit   氧化纤维素   9,2
  胶原海绵Nycomed   胶原，泡沫状   0,15
评价
除Nycomed胶原海绵之外的所有载体在涂敷之后不是弹性的。
所述样品必须非常细心地进行切割。如果使用剪刀进行切割，则会有一些所述涂层植物可能会剥落，这是因为所述层自身是刚性的。Ethisorb药膏显示几乎根据与所述涂层材料没有关系。当摇晃一会之后，所有涂层都剥落得象一块“地毯”一样。
Nycomed胶原海绵与其它载体材料之间的差别，已经清楚地得到说明。
潮湿涂层载体的弹性
1.不同载体的涂敷
每个面积为2×4.5cm2的载体，用TachoComb S涂层悬浮液进行涂敷。涂层悬浮液的数量对应于TachoComb规格(5.5mg纤维蛋白原/cm2)。对所述样品进行干燥。
2.对于每个涂层载体，制备一个约5-7cm2的样品。
3.所述样品进行湿润，并放到一种固定在一种如下述标题“步骤”中详细描述的特定装置上的弹性橡胶薄片上。接着施加压力到所述橡胶薄片上，使之扩展。在经过二次扩展和放松之后，所述薄片进行第三次扩展。在其最高扩展点时测量其所述载体的面积。
方法说明
装置/化学品
蠕动泵(IKA PA-SF)
压力缓冲瓶(3个出口)
VDO压力计(0-250mbar)
玻璃漏斗(孔道1∶30mm，孔道2∶15mm)
硅树脂管道和夹子、橡胶手套(Semper med)、解剖刀、具有毫米刻度的标尺、剪刀
生理盐水
步骤
下述装置经由硅树脂管道空气密封地连接到所述压力缓冲瓶的三个出口之上：
a)蠕动泵
b)压力计
c)玻璃漏斗/孔道2
从橡胶手套上切割下一个约8×8cm2的双重薄片。该薄片空气密封地固定到所述玻璃漏斗/孔道1上。
使用解剖刀从所述涂层载体上切割下约5-7cm2的涂层面积。
测量所述样品的面积(起始面积)。所述样品的涂层用盐水进行湿润，并放在所述橡胶薄片之上。接着用手将它压放在所述橡胶薄片上约1分钟。
使用所述蠕动泵，所述橡胶薄片在约70mbar的压力下进行扩展。在放松所述橡胶薄片之后，重量进行二次。在第三次扩展时，在橡胶薄片扩展的最大处测量所述涂层载体的面积(长度和宽度)。
计算：
“弹性”系数＝载体在第三扩展时的面积/样品的起始面积
                           结果
  载体   物质   弹性系数
  Opraskin   冻干胶原   1,78
  Willosponforte(3mm)   冻干胶原   1,53
  WillosponSpezial(1mm)   胶质   1,79
  Ethisorb药膏(ZVP609)   Polyglactin/dioxanon   1,0
  TabotampNU Knit   氧化纤维素   1,15
  胶原海绵Nycomed   胶原，泡沫状   1,55
评价：
所述湿润胶原海绵Nycomed(TachoComb S)的弹性，是所述产品的一个重要特征。弹性对于胸和腹部外科是非常重要的。在粘合之后，所述载体应该能够允许进行例如肺或肠的扩展和放松运动。特别地，Ethisorb表现出根本没有弹性。它立即从所述涂层上脱离下来。涂层WillosponSpezial和Opraskin在测试过程中表现出结构缺陷。
涂层载体在内窥镜检查外科中的使用
步骤：
1.不同载体的涂敷
采用TachoComb S涂层悬浮液，对每种载体涂敷2×4cm2的面积。
所述涂层悬浮液的数量对应于TachoComb规格(5.5mg纤维蛋白原/cm2)。干燥所述样品。
2.所述涂层载体样品用于内窥镜外科的处理和由于这种处理引起的涂层损失，采用一种数字光电装置记录下来。
方法说明
装置
内窥平台(Endodock)：内窥镜检查工具，设计用于在内窥镜检查外科中使用TachoComb(参见图7)。数字光电装置。
                             研究载体列表
  载体   物质
  Opraskin   冻干胶原
  Willosponforte(3mm)   冻干胶原
  WillosponSpezial(1mm)   胶质
  Ethisorb药膏(ZVP609)   Polyglactin/dioxanon
  TabotampNU Knit   氧化纤维素
  胶原海绵Nycomed   胶原，泡沫状
步骤
自每种载体取得的图片系列：
1.图片：未涂层的和涂层的载体样品的记录
2.图片：所述涂层样品插入到所述内窥镜装置中(Endodock)。
所述样品必须用手压平才能使之围绕一个导向“栓”进行缠绕。接着所述样品细心地插入到直径为10mm的不锈钢管中。
所述样品记录部分地插入到所述Endodock管中。
3.图片：仔细地推出所述样品。之后，展开所述样品。
由于这种处理而从从所述载体上脱离的涂层，聚集在所述载体周围。记录在插入所述内窥镜装置之后的展开样品和由于这种处理引起的涂层损失。
评价：
在内窥镜外科中的TachoComb S(涂层的马胶原海绵/Nycomed)是所述产品最为苛求的应用。TachoComb S被插入到一种内窥镜装置中。这种装置的管道其直径通常为10-13mm。为了被插入到所述管道中，TachoComb S要被压平并接着围绕一个导向“栓”进行缠绕，然后仔细地插入到所述管道中。因此，所述涂层与所述载体和在其自身内的连接，必须是很强的，而且，所述产品必须保持足够的弹性，使之在干燥条件下能够弯曲和被卷起。当运到所述外科位置时，TachoComb S被仔细地从所述管道中推出来。接着，它必须展开并放置在所述伤口表面。这经常需要进行一些调节。因此，所述层与所述载体的粘合作用应该足够地强大以承受这种处理。
结果
结果可从附图1-6看出。涂层材料脱落物的评价如下所示：
  Opraskin   30-40％
  Willosponforte(3mm)   60-70％
  WillosponSpezial(1mm)   50％
  TabotampNU Knit   60-70％
  Ethisorb药膏   95％
  胶原海绵Nycomed   <5％
由于Ethisorb是一种非常刚性的载体，所述涂层的粘合作用是非常差的。因此，涂层的Ethisorb在这种研究过程中会损失几乎全部的涂层。对涂层的胶原海绵Nycomed相比，所有其它研究的载体具有一个有待涂敷的平坦表面。这样，所述涂层就象一张“平坦地毯”躺在所述载体上。这将会导致所述干燥涂层载体具有相当多的非弹性结构。弯曲或卷起经常会使所述涂层自身断裂。
在所述涂层载体插入到所述内窥镜装置和所述样品随后的展开之后，除了胶原海绵Nycomed之外，所有载体损失了相当数量的涂层，这样，留下有很大面积没有涂层材料。
Nycomed胶原海绵的结构和质地是TachoComb S在干燥或湿润条件时弹性的基础。Nycomed胶原海绵是泡沫状的，在其内具有多边腔室。在所述表面上，这些腔室被切割成洞穴。这些洞穴使所述涂层表面变大。在涂敷过程中，所述涂层悬浮液均匀地分散到所述结构表面上。在干燥过程中，所述含有纤维蛋白原和凝血酶的溶液被固定到所述洞穴中。这样，TachoComb S就可被切割为希望的尺寸，它可被插入到内窥镜装置中且仅有少量的涂层材料损失或者根本没有损失。
干燥TachoComb S的高弹性，相对于所有其它研究的涂层载体来说，是一个很大的优点。
实施例3
活性成分的寻找剂量试验
活性成分的剂量已经被两种不同的实验模型所发现，在其中，对粘合强度进行了测量：在鼠肝上的抗张强度、在鼠肾中对抗提高组织压力的粘合强度。
A.在鼠肝上的抗张强度
为了制备一种渗漏出血，在麻醉鼠肝的左圆形突出部位制造一个1×1cm和约1mm深的伤口。所述伤口用1×1cm的TachoComb S碎片进行密封，它与一个弹簧秤相连。测量在它被扯开时的张力。
B.在鼠肾中对抗提高组织压力的粘合强度
通过切割约其质量的1/4，在麻醉鼠的左肾上制造一个平滑水平的强烈流血的伤口。所述伤口用TachoComb测试薄片进行密封。通过封闭静脉排放和泵入一种等压柠檬酸盐溶液(pH7.2)到所述肾中，提高组织压力。测量在TachoComb S开始脱离时的压力。
                     表1
含有不同数量纤维蛋白原的TachoComb S的粘合强度
  所述层组合物   粘合强度(平均值±SD)
  纤维蛋白原mg/cm2   凝血酶，IU/cm2   在鼠肝上的抗张强度，N/cm2n＝5   在鼠肾中对抗提高组织压力的粘合强度，mbarn＝5
  0   0   0.20±0.02   47±9
  0   2.40   0.20±0.03   63±16
  1.30   1.73   0.30±0.06   81±12
  2.92   1.85   0.39±0.05   101±13
  5.10   1.87   0.39±0.03   110±13
  7.22   1.82   0.38±0.02   97±13
  10.02   1.75   0.40±0.07   87±10
                   表2
含有不同数量凝血酶的TachoComb S的粘合强度
  所述层组合物   粘合强度(平均值±SD)
  纤维蛋白原mg/cm2   凝血酶，IU/cm2   在鼠肝上的抗张强度，N/cm2n＝5   在鼠肾中对抗提高组织压力的粘合强度，mbar  n＝5
  0   0   0.20±0.02   47±9
  6.15   0   0.27±0.01   57±10
  4.72   0.92   0.39±0.02   84±9
  5.10   1.87   0.39±0.03   110±13
  4.78   4.95   0.35±0.02   97±9
  4.70   9.63   0.30±0.02   109±13
  4.75   19.83   0.27±0.03   91±20
所得结果表明，在几种变化间存在相当大的差别。对于人体凝血酶来说，最佳范围为0.9-10I.U./cm2，具有恒定的人体纤维蛋白原含量约为5mg/cm2。对于人体纤维蛋白原来说，最佳范围为2.9-7.2mg/cm2，具有恒定的人体凝血酶含量约为2I.U./cm2。
这些生物体内试验证实，纤维蛋白原浓度(4.3-6.7mg/cm2)和凝血酶浓度(1.5-2.5IU/cm2)，它们用于其它TachoComb配方(TachoComb和TachoComb H)中，对于TachoComb S来说，两者都会导致最大的粘合强度。
实施例4
TachoComb S在密封狗的脾和肝损伤的功效
本研究的目的是比较TachoComb H(含有抑肽酶)与TachoCombS(不含抑肽酶)在犬模型的脾和肝损伤的止血功效。选用切口和穿刺(0.5cm深)的脾，来模拟渗漏出血。对前部肝圆形突出部的尖端进行切除术，以模拟一种强烈流血伤口(2-3cm2)。将一种TachoComb H或TachoComb S药膏作为仅有的止血手段涂敷到所述伤口上(在同一条狗的脾和肝上使用同一批)。在外科手术之后48小时，进行验尸，因为在临床实践中这是非常可能重流血的期间。
两种产品都能实现实例止血。在48小时验尸时，没有观察到第二次出血，无论是粗略观察还是组织检查。
也是组织学上的，当在评价覆盖有各自药膏的脾和肝的切口对于止血和治疗伤口时，在涂敷TachoComb H或TachoComb S的狗之间不存在差别。在外科手术之后也没有观察到第二次出血。
血球计数的数据表明，对于两个治疗组在外科手术后48小时具有温和提高的白血球计数，具有相似的结果。在各组之间或与任意其它评价参数有关的时间之间，也不存在差别。而且，凝结试验表明，对于存在或缺乏抑肽酶也不存在差别。血液纤维蛋白原含量的上升，在两种治疗组于外科手术后48小时是明显的。白血球计数和血液纤维蛋白原含量的上升，可以归因于一种对于所述外科损伤的炎症反应，它们不可认为是TachoComb H或S的毒副作用。
可以得出结论，TachoComb S(不含抑肽酶)在治疗狗的渗漏出血和强烈流血的软组织伤口时，具有与TachoComb H(含有抑肽酶)相同的功效。在所选用条件下，所述凝块的稳定性不受抑肽酶存在或缺乏与否的影响。
实施例5
再吸收的TachoComb S和TachoComb H的对比止血、伤口密封效果和抵抗力：在猪身上的试验研究
研究目的
本试验是设计用来评估止血棉网在猪身上引起的脾损伤的即时功效和短期抵抗力。
材料和方法
在本研究中使用24条母猪。2组止血棉网随机地进行测试：含有抑肽酶的TachoComb H和不含抑肽酶的TachoComb S。
在外科手术期间，所述动物接受到一个棉网，直接封闭一个标准化的2×3cm损伤(它是通过外科在所述脾的腹部形成的)。
所述棉网的即时和止血效果，是通过计数水泡的数目并测量停止出血所需要的时间来进行评价的。TachoComb H和S的粘合作用是明显的。
在72小时之后，通过提高脾内压力(夹住静脉管道)，研究两种材料的短期表现和抵抗力。
当所述压力达到基本稳定状态时，使用一种肾上腺IV丸药(0.02mg或0.04mg)，以提高动脉压力，与盐酸多巴酚丁胺浸液联合，或者不联合。
借助于这些药理学物质，所述TachoComb H和S修补的损伤，的出血压力破裂，可以引证用于每个动物。
结果
在治疗脾损伤外科手术期间，对于止血效果，没有检测到差别。
在72小时后，在第二次观察时，两种棉网的肉眼外观是相同的。
在两组试验组间，剧烈压力数值和破裂抵抗力没有明显的不同。
所述材料没有发生破裂。在使用TachoComb S的4个动物中观察到损伤流血，而在使用TachoComb H观察到2个动物(在组4中具有一个附加的水泡)。
组织检查表明，抑肽酶可以对所述棉网结构发挥保护作用，抑肽酶似乎通过降低所述棉网的退化而改进了微观式样。没有观察到特定的细胞的式样。
结论
在24条猪的标准化脾损伤，对TachoComb的2种配方S和H进行研究。
两种材料对于功效、对所述损伤的粘合和对所述软组织柔顺性表现相似。它们的功效是令人难忘的。
在外科手术的第72小时，对它们的耐生物降低性和蛋白质水解性，进行研究，是通过提高脾内压力(通过机械方法和药理方法)和记录所述TachoComb H和S棉网的局部抵抗力而进行的。所述2种材料的抵抗力，没有观察到明显不同。
但是，组织病理学研究表明，TachoCombS的蛋白质水解退化较TachoComb H是略微更显著的。
使用TachoComb S或TachoComb H作为唯一的止血手段，以密封剧烈流血的猪脾损伤(表面损伤2cm×3cm，3-5mm深；n＝12/组)。在72小时后，通过结扎脾内压力脾静脉提高脾内压力。此后，通过注射肾上腺素再提高所述脾内压力。观察所述猪在所述药膏下的再流血或血液水泡的发生。在验尸之后，进行样品(用TachoComb H和S密封的损伤位置)的组织病理学研究。
TachoComb S和TachoComb H发挥出相似的功效、对损伤的粘合性和对软组织的柔顺性。
实施例6
再吸收的TachoComb S和TachoComb H的对比止血、伤口密封效果和抵抗力：在猪身上急性胰腺炎模型的试验研究
研究目的
本试验是设计用来评估止血棉网在猪身上急性胰腺炎引起的脾损伤的即时功效和短期抵抗力。
材料和方法
在本研究中使用20条母猪。2组止血棉网随机地进行测试：含有抑肽酶的TachoComb H和不含抑肽酶的TachoComb S。
在外科手术期间，所述动物接受到一个棉网，直接封闭一个标准化的2×3cm损伤(它是通过外科在所述脾的腹部形成的)。
所述棉网的即时和止血效果，是通过计数水泡的数目并测量停止出血所需要的时间来进行评价的。TachoComb H和S的粘合作用是明显的。
然后，使用一个消毒注射器，将胆囊刺破，收集胆汁，并将10ml胆汁注射流过所述Wirsung’s导管，以引发胰腺炎。在外科手术之前和之后每天对血液酶水平(脂肪酶和淀粉酶水平)进行监测。
将小片的Tachocomb H和S，放置在所述胰腺软组织的其内脏连接处。
在72小时之后，通过提高脾内压力(夹住静脉管道和药理学方法)，研究Tachocomb H和S的短期表现和酶退化抵抗力。
当所述压力达到基本稳定状态时，使用一种IV肾上腺素丸药(0.02mg或0.04mg)，接着进行去甲肾上腺素注入0.02-0.04mg/min，以提高动脉压力，与0.3-0.6mg/min的盐酸多巴酚丁胺浸液联合，或者不联合。
借助于这些药理学物质，所述TachoComb H和S修补的损伤的出血压力破裂，可以引证用于每个动物。
结果
两种材料对于功效、对所述损伤的粘合和对所述软组织柔顺性表现相似。它们的功效是令人难忘的。
两种材料在第3天于肉眼观察下是未变化的，尽管所述酶条件是苛刻的，尤其是在第2天的血液中，在第4天在腹膜流体中仍是这样。
在72小时时，在提高脾压力后，两种材料的抵抗力没有观察到不同。
在所述TachoComb S组中发生一个材料破裂。在使用TachoCombS的1个动物中观察到损伤流血，而在使用TachoComb H观察到2个动物(在所述TachoComb H组中具有一个水泡)。
组织病理学数据表明，TachoComb S与TachoComb H相比，在退化方面没有明显的不同。在所述脾脏上没有观察到特定细胞的式样。即使在胰腺样品上，与高浓度胰腺酶密切接触的TachoComb H和S，也没有表现出任何很大变化。
结论
总之，关于它们对于提高胰腺酶环境的条件下破裂的抵抗力，在TachoComb S和TachoComb H之间没有明显的不同。
两种TachoComb S和H棉网改性，也没有检测到具体的宏观或微观的证据。
在一个标准化脾损伤模型中(表面损伤2cm×3cm，约3mm深；n＝10/组)，对于由在猪的Wirsung管道逆向注射胆汗和随后结扎所述胰腺管道所引起的急性胰腺炎，研究TachoComb S和TachoComb H的止血功效。也将一小片TachoComb H和S涂敷到所述胰腺的胰腺管道结扎位置。在外科手术72小时后，通过结扎所述脾静脉和增值肾上腺注射，提高脾内压力。
在所述脾上，TachoComb S和TachoComb H具有即时止血效果、对损伤的粘合性和抵抗提高的脾内压力，表现出相似的性能，而与胰腺酶水平的标记提高没有关系(与基准水平相比，血液中淀粉酶和脂肪酸提高了20-100倍，腹膜流体中胰腺酶提高了10-100倍)。组织病理学数据表明，在TachoComb S和TachoComb H的退化方面没有明显的不同。在所述脾上也没有观察到特定的细胞样式。即使是在经过与高浓度胰腺酶的TachoComb H和S进行密切接触的样品上，TachoComb H和S的粘合性和组织病理学也没有表现出任何重要不同。
因此，在这种猪的高度受迫模型的急性胰腺炎中，TachoComb Sand TachoComb H之间，没有表现出具体的宏观或微观差别。
实施例7
再吸收的TachoComb H和TachoComb S的对比脑组织反应和效力：在正常凝结下和局部高纤维蛋白溶解过程中的兔模型的试验研究
本研究的目的是比较神经外科应用之后TachoComb S和TachoComb H的功效。脑损伤的引发，是在兔身上于正常凝结条件下(脑组织反应＝BTR，n＝12兔，合格的n＝10)和在高纤维蛋白溶解条件(HF)下，采用局部r-tPA应用进行的(n＝10兔)。对于每个半球制作三个脑皮层损伤(每个动物共有6处损伤；钻孔脑损伤深为3mm，直径为4mm)。
BTR系列
从每个半球的三个损伤中取出二个，分别采用TachoComb H或TachoComb S进行治疗，留下半球中的一个损伤作为空白对照。在采用TachoComb H或S密封所述损伤之后，在高度放大下采用盐水连续低流速冲洗下测量流血时间。在所有损伤中都达到止血后，通过增值肾上腺素注射(0.01mg/kg肾上腺素)，引发动脉高血压，从而提高平均动脉压力(MPA)到至少120mmHg。在此过程中，观察到流血连续进行。在降低所述MAP到正常值后，所述皮肤再次闭合。验尸时间为3和7天(每组n＝5个兔)。在第3天验尸之前，在三个动物中进行磁共振成象。在验尸时，对所述损伤位置进行粗略观察，并取样用于组织病理学研究。
HF系列
在如所述BTR系列确定所述损伤之后，在所有损伤择一地用TachoComb S或TachoComb H进行密封之前，将r-tPA滴加到所述损伤之上(存在于0.5ml盐水中的0.3mg r-tPA/每个损伤)。在高度放大和连续低盐水冲洗下，测量流血时间。在第1天(n＝7)和第3天(n＝3)粗略观察验尸。对在第3天取得的样本进行组织病理学研究，以进行比较。
在整个研究过程中，在TachoComb S和TachoComb H之间没有发明明显的不同，无论是对于密封功效、忍耐提高的MAP和流血时间期间，还是对于组织病理学。在所有HF系列的动物中，严重出血是明显的，不仅是在所述损伤位置，而且在整个表面的皮肤之下位置。尽管是在这些苛刻条件下，但TachoComb S还是发挥出与TachoCombH相似的功效。
实施例8
TachoComb H和TachoComb S的神经外科应用：脑组织反应和止血效力
流体纤维蛋白密封剂大规模地用于神经外科的止血。关于脑组织对于TachoComb反应，还不存在全面的出版数据，而且，抗纤维蛋白溶解试剂(即抑肽酶)仍存在着争议。
目的
本研究设计集中于两个主要问题：采用组织学方法和现代成象技术，对在TachoComb H(TCH)和TachoComb S(TCS)应用到脑皮层损伤后的短期局部脑组织反应进行评价，与空白对照损伤(CL)进行比较。
第二个目的是研究在正常凝结(BTR组)下和局部引发严重高纤维蛋白溶解(HF组)之后TachoComb H和S产品的止血功效，和评价抑肽酶是否会对制剂的止血质量和粘合作用力存在影响。
材料和方法
在一组22只小兔中，对每个半球制作三个皮层损伤。12个动物归为所述脑组织反应(BTR)组，10个归为所述纤维蛋白溶解(HF)组。
在所述BTR动物中，所述损伤中的二个分另用TachoComb H和TachoComb S填充，而第三个则是空白作为对照。测量流血时间，并监测由于引发的动脉高血压而引起的流血的发生。所述动物在外科手术后第3天和第7杀死，并进行组织学检查。在第3天，就在安乐死之前，在三只BTR动物中进行磁共振成象。
在所述HF动物中，其中，预先用一种重组组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(rt-PA)引发一种严重的局部高纤维蛋白溶解状态，一个半球的所有三个损伤，都采用TachoComb H进行治疗，另一半球的都用TachoComb S治疗。测量流血时间，并在第3天在三个动物中进行组织学检查。
结果
在正常凝结下(BTR动物)，具有TCH和TCS的止血作用明显快于不含止血试剂(p＜0.001)。已经得到证实，两种产品的流血时间没有差别(p＝0.294)，但是，这些时间较空白损伤的时间(p＜0.001)始终都是更短的。
在引发的动脉高血压过程中，在24TCH损伤中有1例发生流血，在24TCS损伤中有3例发生流血，在24对照损伤中有19例发生流血。在严重提高的动脉血压(Chi square＝16.3；p＞0.001)过程中，所述止血试剂的存在始终都能防止再流血。相反，在动脉血压提高过程中，缺乏TCH或TCS则存在发生80％再流血的危险。
在所述高纤维蛋白溶解组(HF动物)的流血时间的统计分析证实，两种产品的流血时间之间没有差别(符号等级试验：p＝0.927和T试验：p＝0.4102)。
最后，在99.73％(D＜3sdD＝ns)的安全期限内，消除在两种凝结状态下相同产品的止血功效明显的不同。
结论
TachoComb H和TachoComb S没有在所述脑组织中引发任何特殊的组织变化。两种产品具有良好的脑软组织生物适应性，这是由于它们没有引发较单独的损伤更大的组织反应。与所述组合物物产品相关的不利作用，在形态学上也是不明显的。组织检查也没有发现两种产品之间的任何不同，无论是在正常情形下还是在严重扰乱凝结情形下。TachoComb H和S在正常凝结和高纤维蛋白溶解两种情形之下，具有相同的止血效力。这是非常明显的，即抑肽酶对于止血质量和粘合作用力没有影响，即使是在严重扰乱的凝结情形下。
与文献相比，TachoComb H和S能够建立较氧化纤维素和胶原棉网更快的止血作用。

Claims (56)

1、一种固体组合物，主要由下述物质组成：
a)一种胶原载体，它具有至少下述二种物理性质：
弹性模量范围为5-100N/cm2，
密度为1-10mg/cm3，
腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，
和均匀分散并固定在所述载体之上的由以下成分组成的混合物
b)固体纤维蛋白原，和
c)固体凝血酶。
2、权利要求1所述组合物，其中所述胶原载体是一种胶原海绵，它包括源自哺乳动物、转基因或重组来源的胶原I型材料。
3、权利要求1或2所述组合物，其中所述胶原载体具有一个或多个活性侧面，其中，纤维蛋白原存在的数量为2-10mg/cm2，和凝血酶存在数量为1.5-5.5IU/cm2。
4、权利要求3所述组合物，其中所述纤维蛋白原存在的数量为4.3-6.7mg/cm2。
5、权利要求3所述组合物，其中所述纤维蛋白原存在的数量为5.5mg/cm2。
6、权利要求3所述组合物，其中凝血酶存在数量为2.0IU/cm2。
7、权利要求3所述组合物，其中，所述纤维蛋白原是人体的。
8、权利要求7所述组合物，其中所述人体纤维蛋白原是从一种天然来源纯化得到的。
9、权利要求1或2所述组合物，其中，所述纤维蛋白原是人体的。
10、权利要求9所述组合物，其中所述人体纤维蛋白原是从一种天然来源纯化得到的。
11、权利要求7所述组合物，其中所述纤维蛋白原是转基因的或重组的。
12、权利要求9所述组合物，其中所述纤维蛋白原是转基因的或重组的。
13、权利要求1或2所述组合物，其中所述凝血酶是人体的。
14、权利要求13所述组合物，其中所述人体凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
15、权利要求13所述组合物，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
16、权利要求3所述组合物，其中所述凝血酶是人体的。
17、权利要求16所述组合物，其中所述人体凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
18、权利要求16所述组合物，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
19、权利要求7所述组合物，其中所述凝血酶是人体的。
20、权利要求19所述组合物，其中所述人体凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
21、权利要求19所述组合物，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
22、权利要求8所述组合物，其中所述凝血酶是人体的。
23、权利要求22所述组合物，其中所述人体凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
24、权利要求22所述组合物，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
25、权利要求11所述组合物，其中所述凝血酶是人体的。
26、权利要求25所述组合物，其中所述人体凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
27、权利要求25所述组合物，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
28、权利要求1所述组合物，但它不含有任何抗血纤维蛋白溶解试剂，
所述固体纤维蛋白原和固体凝血酶以这样一种方式固定到所述载体上，使得所述涂层物质在Vibrofix混合器中以1000rpm频率摇晃2分钟时，所述磨损低于1.0mg/cm2，而且，
当所述涂层载体物质被插入到一种内窥镜检查设置和随后移去时，所述物质基本没有变化，并且具有低于20％的涂层物质脱落物，作为所述载体弹性和所述固体纤维蛋白原和固体凝血酶的固体粘合性的标记，
而且所述物质是充分空气密封和液体密封的，并具有至少1.25的弹性系数，它由一个包括固定所述涂层载体到一个橡胶片上、通过三次施加压力使所述橡胶伸展、和在第三次测量所述涂层载体在橡胶片伸展最大处的面积和将所述涂层载体的膨胀面积与所述涂层面积的起始面积进行比较的实验测量得到的。
29、权利要求28所述组合物，其中所述抗血纤维蛋白溶解试剂选自抑肽酶、ε-氨基正己酸和α2-抗血纤维蛋白溶酶。
30、一种具有至少下述二种物理性质的载体，
弹性模量范围为5-100N/cm2，
密度为1-10mg/cm3，
腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，
和充足数量的纤维蛋白原和充足数量的固体凝血酶的用途，用于制备用于组织封口的产品。
31、一种具有至少下述二种物理性质的载体，
弹性模量范围为5-100N/cm2，
密度为1-10mg/cm3，
腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，
和充足数量的纤维蛋白原和充足数量的固体凝血酶的用途，用于制备用于止血的产品。
32、一种具有至少下述二种物理性质的载体，
弹性模量范围为5-100N/cm2，
密度为1-10mg/cm3，
腔直径大于0.75mm且小于4mm和/或具有腔平均直径小于3mm，
和充足数量的纤维蛋白原和充足数量的固体凝血酶的用途，用于制备用于组织粘合的产品。
33、权利要求30-32任一所述用途，用于在肠胃系统、在软组织器官、心血管外科、包括在气管、支气管或肺上的胸外科、在耳朵、鼻和包括牙外科的咽喉区域的外科干涉、妇科、泌尿道、骨科、和紧急外科、神经外科、淋巴腺的、胆汁的、和脑脊髓管状器官、和在胸和肺外科过程中的漏气的外科干涉。
34、权利要求33所述用途，其中所述肠胃系统选自食管、胃、小肠、大肠和直肠。
35、权利要求33所述用途，其中所述软组织器官选自肝、脾、胰腺、肾、肺、肾上腺、甲状腺和淋巴结。
36、权利要求33所述用途，其中所述骨科是松质切除术。
37、权利要求30-32任一所述用途，其中所述载体是一种生物可降解聚合物。
38、权利要求37所述用途，其中所述生物可降解聚合物选自聚透明质酸、多羟基酸、纤维素、胶质和胶原。
39、权利要求38所述用途，其中多羟基酸选自乳酸、葡糖酸和羟基丁酸。
40、权利要求38所述用途，其中所述胶原是胶原海绵。
41、权利要求40所述用途，其中胶原海绵主要由胶原I型纤维组成。
42、权利要求33所述用途，其中所述载体是一种生物可降解聚合物。
43、权利要求42所述用途，其中所述生物可降解聚合物选自聚透明质酸、多羟基酸、纤维素、胶质和胶原。
44、权利要求43所述用途，其中多羟基酸选自乳酸、葡糖酸和羟基丁酸。
45、权利要求43所述用途，其中所述胶原是胶原海绵。
46、权利要求45所述用途，其中胶原海绵主要由胶原I型纤维组成。
47、权利要求42所述用途，其中所述载体具有一个或多个活性侧面，其中，纤维蛋白原存在的数量为2-10mg/cm2，和凝血酶存在数量为1.5-2.5IU/cm2。
48、权利要求47所述组合物，其中所述纤维蛋白原存在的数量为4.3-6.7mg/cm2。
49、权利要求47所述组合物，其中所述纤维蛋白原存在的数量为5.5mg/cm2。
50、权利要求47所述组合物，其中凝血酶存在数量为2.0IU/cm2。
51、权利要求47所述用途，其中，所述纤维蛋白原是人体的、从一种天然来源纯化得到、或转基因或重组的人体纤维蛋白原。
52、权利要求51所述用途，其中所述纤维蛋白原是从一种天然来源纯化得到的。
53、权利要求51所述用途，其中所述纤维蛋白原是转基因的或重组的。
54、权利要求51所述用途，其中所述凝血酶是人体的、从一种天然来源纯化得到的、或转基因或重组的人体凝血酶。
55、权利要求54所述用途，其中所述凝血酶是从一种天然来源纯化得到的。
56、权利要求54所述用途，其中所述凝血酶是转基因的或重组的。
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