HUP0303896A2

HUP0303896A2 - Szilárd fibrinogént és szilárd trombint tartalmazó hordozó

Info

Publication number: HUP0303896A2
Application number: HU0303896A
Authority: HU
Inventors: Dagmar Stimmeder
Original assignee: Nycomed Pharma As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2004-03-01
Also published as: HU227987B1; CA2434964C; CA2434964A1; HUP0400768A3; IL157097A; EE200300349A; DE60203364D1; WO2002058749A8; BG66439B1; NO20033297D0; CZ20032198A3; CA2435159A1; NZ527166A; NO332462B1; IL157095A0; IS6885A; DE60203364T2; EE200300341A; JP2004520124A; KR100830294B1

Abstract

A találmány szövetragasztás, szövetzárás és vérzéscsillapítás céljáraazonnal felhasználható, felszívódó készítményre vonatkozik, amelylényegében áll a) egy hordozóból, amely az alábbi fizikaitulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik: rugalmasságimodulusa az 5-100 N/cm közötti tartományban van, sűrűsége 1 és 10mg/cm3 közötti, üregátmérője 0,75 mm-nél nagyobb, de 4 mm-nél kisebbés/vagy átlagosan 3 mm alatti, és az említett hordozón egyenleteseneloszlatva és rögzítve b) szilárd fibrinogénből, és c) szilárdtrombinból. A hordozó egy biológiailag lebomló polimer, például egypolihialuronsav, polihidroxisav, pl. tejsav, glukolsav, hidroxi-butánsav, egy cellulóz, zselatin vagy kollagén, például egykollagénszivacs, mint például egy lényegében I típusúkollagénszálakból álló kollagénszivacs. A fibrinogén és a trombinelőnyösen humán eredetű, természetes forrásból tisztított, vagytranszgenikus vagy rekombináns humán fibrinogén és/vagy trombin. Akészítmény előnyösen nem tartalmaz antifibrinolitikus szert, példáulaprotinint, e-aminokapronsavat vagy a2-antiplazmint. Ó

Description

SZILÁRD FIBRINOGÉNT ÉS SZILÁRD TROMBINT

TARTALMAZÓ HORDOZÓ

A találmány szövetragasztás, szövetzárás és vérzéscsillapítás céljára azonnal felhasználható, felszívódó készítményre vonatkozik, amely lényegében fibrinragasztó szilárdan rögzített komponenseivel: humán fibrinogénnel és humán trombinnal bevont hordozóból áll. Ez a rögzített kombináció közvetlenül alkalmazható, például egy sebfelületre. Vérrel, testnedvekkel vagy fiziológiás sóoldattal történő érintkezés hatására ennek a rendszernek a mechanizmusa utánozza az alvadási kaszkádot, melynek során trombin katalizálja a fibrinogén fibrinné alakulását és a XIII faktor aktiválását, amikor is XHIa faktor keletkezik. A létrejövő XHIa faktor kovalens keresztkötések létesítésével stabilizálja a fibrin-alvadékot.

Hasonlóan egy kétkomponensű ragasztóhoz, a sebfelület és a hordozó is összeragad polimerizáció révén. E folyamat közben, amely hozzávetőleg 3-5 percig tart, a találmány szerinti készítményt előnyösen a seb területére nyomjuk. A találmány szerinti készítmény komponensei az alkalmazás után kb. 4-6 hónappal enzimatikus úton lebomlanak.

A kereskedelemben kapható fibrinragasztók, amelyek a koagulációs kaszkád utolsó lépését utánozzák, egy igen tömény fibrinogén-oldatból állnak, amit műtéti seb nyílására történő alkalmazás előtt trombin-oldattal kell összekeverni. Ezek a keverékek fibrinolízis-inhibitort, például aprotinint vagy ε-aminokapronsavat tartalmaznak, ami megakadályozza, hogy a fibrinolítikus enzim, a plazmin a fibrin-a1vadékot idő előtt feloldja. Ezek a kétkomponensű fibrinragasztók számos sebészeti eljárás során hasznosnak bizonyulnak. Ha azonban a vérzés erős, kimosódhatnak, még mielőtt a véralvadás létrejönne. A kétkomponensű fibrinragasztók továbbá bizonyos előkészítő lépéseket, olvasztást vagy oldást igényelnek. Ezért nem praktikusak, használatuk nehézkes, és sikeres alkalmazásukhoz gyakorlat szükséges.

Az elmúlt évtized során számos fibrinragasztót alkalmaztak sebészeti eljárásokhoz, számos indikációban. Ezeknek a - fibrinragasztokkal végzett próbálkozásoknak többségében azonban kollagén gyapjút is alkalmaztak a vérzéscsillapítási és a ragasztási jellemzők javítására, ami jelzi hátrányukat és azt, hogy a sebészek ezeket a ragasztókat csak korlátozottan alkalmazhatják.

Kollagént vérzéscsillapító szerként a hatvanas évek végétől alkalmaznak. A kollagén minden emlős ben a leggyakoribb strukturális fehérje. A hozzávetőleg 300 kDa tömegű monomer fehérje (tropokollagén) kovalens módon térhálósodik specifikus helyeken. Az érett fehérje tehát oldhatatlan és jellegzetes, nagy húzószilárdságú szálakat képez. A kollagének számos alosztályát írták le, melyek közül az I típusú kollagén a leggyakoribb, a legfontosabb kollagén-típus a bőrben, az inakban, a csontokban és a szaruhártyában. A kollagén egy szálas fehérje, amely három egymás köré csavarodott, kb. 290 nm hosszúságú láncból áll. Öt ilyen tripla csavarlánc (tropokollagén molekula) lépcsőzetesen elhelyezkedve alkot egy mikroszálacskát, melynek átmérője hozzávetőleg 3,6 nm. Ezeknek a mikroszálacskáknak poláros és nem-poláros szegmensei vannak, amelyek igen hajlamosak specifikus inter- és intrafibrilláris kölcsönhatásokra. A mikroszálacskák négyzetrácsba tömörülve kb. 30 nm átmérőjű szubfibri1Iákat alkotnak. Ezek a szubfibrillák állnak aztán össze kollagén szállá, ami a kötőszövet alapegysége, és amelynek átmérője több száz nm, tehát fénymikroszkóppal vékony vonalként észlelhető.

A kollagén - esetleg egy fibrinragasztót tartalmazó bevonattal ellátva - sebek lezárásához használható. Fibrinragasztókat, vagyis fibrinogén, trombin és aprotinin kombinációit, már évek óta sikeresen alkalmaznak szövetek és idegek ősszetapasztásához és felületek összezárásához, ha a vérzés csekély. A fibrinragasztók hátránya, hogy erős vérzés esetén a ragasztó altatában kimosódik, még mielőtt a fibrin megfelelő polimerizációja végbement volna. Ennek a problémának leküzdése céljából a sebészek kézzel visznek fel folyékony fibrinragasztókat felszívódó hordozókra, például kollagén gyapjúra.

Bár ezek a kombinált alkalmazások igen sikeresek, ezt a módszert nem alkalmazzák elterjedten, mivel van néhány hátránya. Az elkészítés viszonylag nehézkes, az eljárás gyakorlatot és gyakorlott személyzetet igényel, és veszélyhelyzetben a készítmény nem áll azonnal rendelkezésre, mivel elkészítési ideje 10-15 perc. Ezek a tényezők tették szükségessé egy javított termék kifejlesztését, aminek eredménye egy stabil kombináció, azaz sgy szilárd fibrinogént, szilárd trombint és szilárd aprotinint tartalmazó bevonattal ellátott kollagén hordozó, amelyet az 59 265 sz. európai szabadalmi bejelentés ismertet.

Az 59 265 sz. európai szabadalmi bejelentésben szereplő kollagén hordozónak főként az a szerepe, hogy magába szívja azt a koagulációs készítményt, amellyel bevonták, és mechanikai stabilitást biztosítson számára.

Kifejlesztettek már egy olyan készítményt, amely a fibrinragasztó vérzésesi 1lapító tulajdonságait és a kollagén, mint hordozó előnyét egyesíti. A terméket TachoComb® védjegyzett néven forgalmazzák. A TachoComb® egy azonnal felhasználható és könnyen alkalmazható rögzített kombináció, egy kollagén tapasz, amely az alábbi fibrinragasztó hatóanyagokkal van bevonva: humán fibrinogén, szarvasmarha trombin és szarvasmarha aprotinin.

A TachoComb® készítményt az 1990-es évek elejétől forgalmazza a Nycomed Pharma cég. Klinikai kísérletekben több mint 2500 betegen alkalmazták Európában, továbbá több mint 700 betegen Japánban egy klinikai program keretében sokféle indikációval kapcsolatban, például máj- és tüdő-eltávolításnál, epeműtéteknél, lép-, vese- és hasnyálmirigy-műtétek, nőgyógyászati műtétek és érműtétek során. A tapasztalatok szerint a TachoComb® hatékony és biztonságos.

Semmiféle komplikációról nem számoltak be a TachoComb® alkalmazásával kapcsolatban az elvégzett klinikai kipróbálások során. Három japán tanulmány azonban aprotinin elleni antitestek megjelenését említi.

TachoComb® tapaszok ezreinek klinikai alkalmazását végzik hosszú évek óta, ám eddig mindössze 37 spontán kedvezőtlen gyógyszer-reakcióról (ADR) számoltak be. Ezek közül tizenhatot lehetett elméletileg a TachoComb® komponensek elleni reakciókkal összefüggésbe hozni (láz, lázas' állapot, eozinofilia, nyújtott protrombin-idő, hiperérzékenység, immunológiai vagy allergiás reakciók) . Egyetlen ADR függött nyilvánvaló módon össze a TachoComb® termékkel.

A WO97/37694 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentés (Immuno France S.A.) 4. összehasonlító példájában azt írják, hogy ha egy kollagén terméket vagy TachoComb® készítményt alkalmaztak, nem történt véralvadás, ami elvérzéshez vezetett TachoComb® használatakor, ezzel szemben a WO97/37694 sz. nemzetközi szabadalom szerint készített, trombint nem tartalmazó kollagén termék 5 percen belül csillapította a vérzést.

A WO96/40033 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentésben a TachoComb® készítményben alkalmazott szarvasmarha trombin hátrányait hangsúlyozzák, azt állítva, hogy a szarvasmarha eredetű vagy egyéb fajta trombin alkalmazása ártalmas vírusos szennyeződéseket juttathat a szervezetbe, és szarvasmarhabetegségeket, például szivacsos agyvelőgyulladást vihet át a betegekre.

A találmány egy szilárd készítményre vonatkozik, amely lényegében áll

a) egy hordozóból, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkezik:

rugalmassági modulusa az 5 - 100 N/cm közötti tartományban van, például 10 - 50 N/cm között;

sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, például 2-7 mg/cm³ ;

üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb, de 4 mm-nél kisebb, és/vagy átlagosan 3 mm alatti, és az említett hordozón egyenletesen eloszlatva és rögzítve

b) szilárd fibrinogénből, és c) szilárd trombinból.

A készítmény a fent említett fizikai tulajdonságok közül kettővel, hárommal vagy mindegyikkel rendelkezhet. A most előnyösnek tartott megvalósítási módoknál a hordozó anyagot a 2001 00135 számú dán szabadalmi leírásban, valamint az „Eljárás kollagén szivacs előállítására, eszköz a kollagén szivacs egy részének kivonására és nyújtott kollagén szivacs című, a Nycomed Pharma AS cég által 2002. január 25-én benyújtott, az említett bejelentés elsőbbségét igénylő szabadalmi bejelentésben leírtak szerint állítjuk elő. A leírásban alkalmazott szóhasználat szerint az „üreg-átmérő kifejezés a legnagyobb egyenes vonalú, faltól-falig távolság egy üregen belül, például átlós irányban, egyenes vonalban a legnagyabb távolság. Az üregek sokszög alakúak lehetnek, például nyolcszög alakúak. így, ha a hordozót elvágjuk, az üregek szétválnak és mélyedések alakulnak ki. A szilárd fibrinogén és a szilárd trombin a hordozóhoz van rögzítve, és legnagyobb részük a mélyedésekben van, igy a szilárd trombin és a szilárd fibrinogén eloszlása lényegében egyenletes. Ennek, valamint a rögzítésnek köszönhetően a hordozón lévő fibrinogénből és trombinból jelentős mennyiségeket lehet bejuttatni, ellentétben azzal, amikor trombint és fibrinogént tartalmazó folyékony készítményeket csepegtetünk vagy permetezünk az anyagra.

Bevonattal ellátott hordozó előállítása

A bevonattal ellátott hordozó előállítása lényegében az alábbi lépésekből áll:

- a hatóanyagok szuszpenziójának előállítása

- a szuszpenzió egyenletes eloszlatása a hordozón

- a bevont hordozó szilárd készítménnyé történő szárítása/a hatóanyagok rögzítése a hordozóhoz.

A fibrinogént és trombin tartalmazó szuszpenzió előállítása az alábbi lépésekből áll:

- fibrinogénből és valamely alkoholból, például etanolból fibrinogén elegy előállítása

- trombinból és valamely alkoholból, például etanolból trombin elegy előállítása

- a fibrinogén elegy és a trombin elegy összekeverése az említett szuszpenzió előállítása célj ából.

Abban a lépésben, amelyben az elegyeket állítjuk elő, az elegyet homogenizálhatjuk vagy szitálhatjuk, hogy olyan szuszpenziót kapjunk, amelyben a fibrinogén és trombin részecskék Folk Ward átlagos átmérője 25 - 100 pm. A hőmérséklet 0 °C és 12 °C között lehet.

A hordozó lehet valamely kollagén hordozó, például egy kollagén szivacs. A kollagén szivacs az alábbi kritériumok közül legalább egynek, előnyösen pedig többnek feleljen meg:

- 5,0 és 6,0 közötti pH-érték, - legfeljebb 5%-os tejsavtartalom, - legfeljebb 0,5%-os ammonium-tartalom, - legfeljebb 0,5%-os oldható fehérje-tartalom, melyet albumin-tartalomként számítunk,

- legfeljebb 1,0%-os szulfáthamu-tartalom,

- legfeljebb 20 ppm mennyiségű nehézfém-tartalom, - legfeljebb 10³ CFU/g-nek megfelelő mikrobiológiai tisztaság,

- 75 - 100%-os kollagén-tartálom, - 1 és 10 mg/cm³ közötti sűrűség,

- rugalmassági modulus az 5 és 100 N/cm közötti tartományban.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a kollagén hordozót a 2001 00135 sz . dán szabadalmi bejelentésben leírtak szerint állítjuk elő. Az alábbi táblázatban három példát mutatunk be kollagén hordozók fizikai tulajdonságaira:

Példa	I	11	III
pH érték	5,3	5,1	5,4
Tej savtartalom	2,3%	2,8%	2%
Ammóniumtartálom	0,1%	0,2%	0,1%
Oldható fehérje-tartalom	0,04%	0,05%	0,08%
Szulfáthamutartálom	0,3%	0,3%	0,3%
Mikrobiológiai ti s z taság (CFU/g)	< 12-345	< 18-124	< 11-33
Kollagén-tartalom a száraz tömeghez viszony! tva	95%	95%	98%
Víz tartalom	14%	15%	16%
RugaImassági modulus	10,4-42,1 N/cm	15-50 N/cm	12,3-41,0 N/cm
Pórusméret (átlagos átmérő)	2,9 mm	2,1 mm	2,9 mm
Sűrűség	2,9-5,3 mg/cm³	2,9-5,9 mg/cm³	2,4-5,0 mg/cm³

A szuszpenzió egyenletes eloszlatását úgy hajtjuk végre, hogy a szuszpenziónak a hordozóra történő felhordásához vagy egy, az 5 942 278 és 6 111 126 Isz. USA-beli szabadalmakban ismertetett csepegtető eszközt használunk, vagy egy applikátort, amely legalább egy fúvókát tartalmaz. A fúvókás applikátor átnyomatja a szuszpenziót a fúvókán, miközben a hordozó és a fúvóka egymáshoz képest elmozdul. Az applikátor tartalmazhat egy szállítószalagot, vagy egy szállítószalag közelében helyezkedhet el. Tartalmazhat továbbá egy pumpához, pumparendszerhez vagy egyéb ellátó berendezéshez csatlakoztatott keverőegységet, és egy fúvókát vagy fúvóka-rendszert, amely átlósan mozog, például a szállítószalagra merőlegesen. A közegek specifikus jellemzőitől függően a fúvóka vagy a fúvóka-rendszer különböző alakú és méretű lehet. A fúvóka vagy a fúvóka-rendszer csöveken keresztül kapcsolódhat az ellátó berendezéshez. Az ellátó berendezés segítheti a bevonó közeg eljutását a keverőegységből a fúvóka-rendszerekhez . A bevonási folyamat idején a fúvóka-rendszer mozoghat a hordozón. Várakozó helyzetben a szállítószalag egyik oldalán maradhat. A bevonási folyamatot fénysorompóval indíthatjuk be, amely érzékeli egy hordozó jelenlétét a szál1ítószalagon, és a fénysorompó jelére meg is állíthatjuk. Az ilyen applikátor alkalmazásával viszonylag kis térfogatrész marad hasznavehetetlen, a készülék könnyen kezelhető és könnyen tisztítható. Lehetőséget biztosít arra is, hogy bármikor megszakítsuk a bevonási folyamatot, viszonylag széles viszkozitás! tartományban alkalmazható és homogén bevonást tesz lehetővé.

, n no ml - 0 12 ml szuszpenziót

Mindkét rendszer 0,08 ml u,iz visz fel egy négyzetcentiméternyi hordozóra.

Fontos lépés a fibrinogénből, trombrnból és alkoholból álló, egy hordozó bevonati felületén nedves bevonatként alkalmazott szuszpenzió szárítása. Egy ilyen eljárás például az alábbi lépésekből áll: a bevonattal ellátott hordozó 1000 mbar alatti nyomásnak történő kitétele abból a célból, hogy a hordozón szárított bevonati felületet kapjunk, és a száraz bevonat rögzítése a bevonati felülethez. Vákuum alkalmazásával és a szárítási eljárás során vákuumot használva alacsony hőmérséklet (2 - 10 °C) és magas relatív páratartalom (80 - 95%) tartható fenn, és ezáltal a hordozó - főként ha az egy kollagén szivacs -, valamint a fibrinogén és a trombin szerkezete és fizikai tulajdonságai fenntarthatok .

Az a kifejezés, hogy a készítmény „lényegében all (az adott komponensekből) azt jelenti, hogy a három komponens mindegyike lényeges és szükséges a találmány megvalósításához. Lényegtelen adalékok azonban, például kálcium-ronok és egy színező marker, például riboflavin ugyancsak jelen lehetnek a készítményben. A készítmény egyéb hasznos alkotórészeket is tartalmazhat, például egy vagy több baktériumellenes, gombaellenes vagy daganatellenes gyógyászati hatóanyagot.

Bár a hordozó anyag előnyösen egy kollagén szivacs, amely emlősökből, traszgenikus vagy rekombináns forrásokból származó, I típusú kollagén anyagot tartalmaz, előállítható más, például I, II, III, IV, VII és X típusú kollagén alkalmazásával is. Az is elképzelhető azonban, hogy a hordozó egy biológiailag lebomló polimer, mint például egy polihialuronsav, polihidroxisav, pl· tejsav, glikolsav, hidroxi-butánsav, egy cellulóz vagy zselatin.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a készítmény egy olyan hordozóból áll, melynek egy vagy több aktív oldala van, amelyeken fibrinogén van jelen 2-10 mg/cm², például 4,3-6,7 mg/cm² , előnyösen kb. 5,5 mg/cm² mennyiségben, és trombin van jelen 1,0 — 5,5 IU/cm², előnyösen kb. 2,0 IU/cm² mennyiségben. A fibrinogén és/vagy a trombin előnyösen humán eredetű, például egy természetes forrásból származó és szakember számára ismert módszerekkel tisztított fibrinogén, vagy transzgenikus vagy rekombináns humán fibrinogén és/vagy trombin, melyeket szakember számára ismert módszerek szerint állíthatunk elő.

Az irodalomból ismert TachoComb®, Beriplast® és TissueSeal® aprotinint vagy ahhoz hasonló antifibrinolitikus szereket tartalmaz. Az aprotinin csak szarvasmarha eredetű forrásból nyerhető. A találmány célkitűzése az volt, hogy olyan készítményt fejlesszünk ki, amelynek hordozó anyaga jobb, mint az ismert készítményeké, és csupán humán, rekombináns vagy transzgenikus eredetű komponenseket tartalmaz. Ezért fejlesztettük a hordozó anyagot, és azt vizsgáltuk, helyettesíthető-e a szarvasmarha· trombin humán trombinnal, és mellőzhető-e az aprotinin alkalmazása. Ez volt az a cél, amely felé munkánk irányult egy kétlépéses eljáráson keresztül.

Először is a TachoComb® H készítményt, -a TachoComb® termék követőjét fejlesztettük ki, amelyben a szarvasmarha trombint humán trombinra cseréltük. Klinikai tapasztalatokat szereztünk a TachoComb® H készítménnyel számos terápiás megerősítő (Illa fázisú) klinikai kipróbálás során vérzéscsillapítás, szövetragasztás és szövetzárás indikációjában. Azok az - eddig még nem publikált - eredmények, amelyeket ezeknek a vizsgálatoknak során szereztünk, megerősítik, hogy a TachoComb® H hatásos és biztonságos vérzéscsillapításra és levegő-elszivárgás csökkentésére, és így kisegítő gyógymódként szolgálhat műtéti varratok készítésénél vérzéscsillapítás, szövetragasztás és szövet zárás esetén. Különösen hatásosnak bizonyult a TachoComb® H helyi vérzéscsillapításnál: a vérzés elállításához szükséges idő jelentősen lerövidült a kontrolihoz viszonyítva. Ezt ér- és májműtéteknél egyaránt meggyőzően kimutattuk.

Azt is tapasztaltuk, hogy a TachoComb® H csökkentheti a tüdőelégtelenség mértékét, ami a levegő-elszivárgás gyorsabb leküzdését eredményezi, és hasznos lehet súlyos pulmonáris levegőgyülem és emfizémiás tüdő kezeléséhez .

Azonban mind a TachoComb®, mind pedig a TachoComb® H tartalmaz aprotinint, ami e termékek nélkülözhetetlen alkotórésze. Eddig úgy vélték, hogy az aprotinin azért szükséges, hogy a fibrinogén komponensben meggátolja plazminogén kis mennyiségeinek esetleges plazminná alakulását, és megakadályozza a fibrinalvadék idő előtti feloldódását, különösen hiperfibrinolitikus körülmények között.

Abból a célból, hogy ezt a hipotézist próbára tegyük, új kísérleteket gondoltunk ki. Az in vitro kísérletek azt mutatták, hogy az aprotinin védelmet nyújt az alvadók f ibrinoli zise ellen, és azt is, hogy az aprotinint nem tartalmazó TachoComb® (TachoComb® S) nagyon rövid idő alatt nem oldódik fel. Ezért nehezített körülményeket alkalmazó („stressful) állatkísérleti modelleket terveztünk, és a TachoComb® S tér méket összehasonlítottuk a TachoComb® H-val, hogy hasonló hatékonyságukat bebizonyítsuk. Valamennyi kísérletben a TachoComb® H, illetve S volt a vérzéscsillapítás egyetlen eszköze.

Négy kiterjedt kísérletsorozatot végeztünk abból a célból, hogy tanulmányozzuk a találmány jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módja szerinti megoldást. TachoComb® S és TachoComb® H összehasonlítását végeztük. A TachoComb® S vagy TachoComb® H terméket kutya, disznó vagy nyúl alábbi szervein alkalmaztuk: máj, lép, hasnyálmirigy vagy agy/agyhártya. A kísérleteket úgy terveztük, hogy hasonlítsanak a normál műtéti körülményekre, súlyosan nehezített és hiperfibrinolitíkus körülményeket alkalmaztunk.

A négy kísérlet során kapott eredmények nem mutattak releváns különbséget a TachoComb® S és a TachoComb® H között. A vérzéscsillapítás és a sebzárás hatékonyságát tekintve mindkét termék hasonlóan viselkedett, még súlyosan nehezített körülmények - például szerven belüli fokozott nyomás vagy lokális r-tPA alkalmazásával kiváltott hiperfibrinolízis - esetén is.

Azt a következtetést lehet levonni, hogy az a preklinikai program, amelyet az aprotinin, mint TachoComb® H komponens feltétlen szükségességének vizsgálatára terveztünk, a TachoComb® H és a TachoComb® S hasonló hatékonyságát bizonyította.

Mindkét terméket sikeresen alkalmaztuk a vérzéscsillapitás, szövetragasztás és szövetzárás egyetlen eszközeként mindenféle kísérleti körülmények között. Az állatkísérletek során nem léptek fel nemkívánatos szövetreakciók. Ebből következik, hogy az aprotinin kihagyható a találmány szerinti készítményből.

A találmány szerinti készítmény várhatóan klinikailag ugyanolyan vérzéscsillapító, szövetragasztó és szövetzáró tulajdonságokkal rendelkezik, mint elődjei, és biztonsági profilja is ugyanolyan, vagy még kielégítőbb, mint amazoké. A jelenleg csupán szarvasmarha-forrásból hozzáférhető aprotinin hiánya nagyobb biztonságot jelent a hiperérzékenységi reakciókkal szemben. Ebben a tekintetben meg kell jegyeznünk, hogy három japán tanulmányban aprotinin elleni antitestekről számoltak be. Aprotinint nem tartalmazó készítmény alkalmazása esetén ilyen immunológiai válaszra nem kell számítani.

A találmány egy jelenleg előnyös megvalósítási módja szerint egy vérzéscsillapításra, szövetragasztásra és szövetzárásra alkalmazható készítményre vonatkozik, amely áll egy rugalmas hordozóból, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább eggyel rendelkezik:

rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti tartományban van, például 10 - 50 N/cm, sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti , például 2-7 mg/cm³, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb és 4 mm-nél kisebb és/vagy átlagosan 3 mm alatti, továbbá szilárd fibrinogénből, és szilárd trombinból, és nem tartalmaz antifibrinolitikus szert, például aprotinint, ε-aminokapronsavat vagy «2-antiplazmint, és a szilárd fibrinogén és a szilárd trombin úgy rögződik a hordozóhoz, hogy a ledörzsölődés kevesebb, mint 1,0 mg/cm² amikor a bevonattal ellátott anyag egy mintáját Vibrofix rázóberendezésben, kb. 1000 rpm frekvencián 2 percig rázzuk, és ha a bevonattal ellátott anyagot endoszkópos berendezésbe helyezzük, majd abból kivesszük, az anyag lényegében nem változik, és a bevonatnak kevesebb mint 20%-a pereg le, ami a hordozó rugalmasságának valamint a szilárd fibrinogén és a szilárd trombin stabil tapadásának a jele, és az említett anyag lényegében légzáró és folyadékzáró, és rugalmassági faktora legalább 1,25 egy olyan kísérlettel meghatározva, amely az alábbi lépésekből áll: a bevonattal ellátott hordozó

Latex laphoz rögzítése, a Latex nyomás által háromszor történő megnyújtása, a harmadik alkalommal a bevonattal ellátott hordozó területének a Latex lap legmagasabb nyújtási pontjánál történő megmérése, valamint a bevonattal ellátott hordozó megnyújtott területének a bevont terület kiindulási területével történő összehasonlítása.

Az a találmány szerinti előnyös készítmény, amelyben a fibrinogén és a trombin humán eredetű, pl. természetes forrásból történő tisztítással nyert vagy transzgenikus vagy rekombináns humán fibrinogén és trombin, az egyetlen olyan, nem szarvasmarha-eredetű fibrinragasztó, amely rugalmas hordozóra felvitt aktív komponensek rögzített kombinációját tartalmazza. Több előnye is van:

- Azonnal felhasználható, nincs szükség időigényes olvasztásra vagy előállítási eljárásra

- A legtöbb szövet és szerv felületére könnyen és közvetlenül alkalmazható

- Lehetőség van endoszkópos alkalmazásra

- Nincs probléma azzal, hogy kifolyik vagy kimosódik a célterületről

- A fibrin-alvadék ragasztó hatása és a rugalmas hordozó által nyújtott mechanikai támasz összeadódik

- Igen rugalmas, és ellenáll az erős nyújtásnak és összenyomásnak — Hatékony vérzésesi 11api tás és szövetzárás érhető el 3-5 percen belül

- Biztonsági profilja kedvező, ugyanis nem tartalmaz szarvasmarha-eredetű komponenseket — Biológiailag lebomlik, csupán kis szövethegek maradnak utána

- Tárolható +2 °C és +8 °C között, tárolási ideje várhatóan 36 hónap lesz, vagy szobahőmérsékleten legalább 2 évig eltartható

Azért fejlesztettük ki a találmány szerinti előnyös készítményt, hogy kiküszöböljük az utolsó szarvasmarha komponenst, és így megelőzzük minden — akár csak elméleti — kockázatát annak, hogy a szarvasmarháról betegséget, például fertőző szivacsos agyvelőgyulladást (TSE) vigyünk át emberekre. Az aktív komponensek, vagyis a fibrinogén és a trombin így humán eredetűek, vagyis nincs a készítményben szarvasmarha aprotinin, a plazmin nevű fibrinolitikus enzim inhibitora. A találmány szerinti, szarvasmarha eredetű komponenst nem tartalmazó készítmény előnye tehát az, hogy kiküszöböltük annak kockázatát, hogy szarvasmarhából származó anyaggal betegséget, például szarvasmarha szivacsos agyvelőgyulladást (BSE) viszünk át emberre.

Egyéb fibrinragasztokhoz hasonlóan a találmány szerinti készítmény is úgy működik, hogy reprodukálja a koagulációs kaszkád utolsó lépését. A fibrinogén és trombin elegye rögzített, szilárd réteget képez a rugalmas hordozó felületén. Folyadékokkal, pl. egy vérző felülettel, testnedvekkel vagy fiziológiás sóoldattal történő érintkezés hatására a réteg komponensei kioldódnak, bediffundálnak a seb üregeibe, és hatni kezdenek.

A po1imerizációs folyamat erős tapadást létesít a sebfelület és a hordozó tapasz között. A ragasztáshoz szükséges idő, például 3-5 perc alatt, a találmány szerinti készítményt előnyösen gyengéden a sebfelületre kell nyomni. A hordozó tapasz mechanikai támaszt biztosít, ami lehetővé teszi a seb tamponálását. A tapasz a koagulációs komponenseket a helyükön tartja, amikor a sebek erősen véreznek, és megakadályozza az esetleges újbóli vérzést. A hatásmechanizmus magában foglalja a fibrinogén trombin által történő fibrinné alakítását peptidek lehasífásával . Fibrin monomerek spontán módon polimerizálódnak fibrinszálakká viszkózus és rugalmas alvadékot képezve, amely a hordozó tapaszt a sebfelülethez ragasztja. Ezt követően a fibrin-mátrix vázként szolgál a fibrinoblaszt migrációhoz (8. ábra).

Hasonlóan egy kétkomponensű ragasztóhoz, a sebfelület és a hordozó is összeragad polimerizáció révén. A hordozó tapasz mechanikai stabilitása tamponáló hatásként hozzáadódik a fibrinaivadás vérzéscsillapító hatásához. Továbbá, a hatóanyagok csak a hordozónak a sebesült terület felé eső felületén vannak jelen, és a tamponáló hatásnak és a gyenge nyomásnak köszönhetően nem diffundálnak át a hordozón. Ennek következtében - és ellentétben a legtöbb fibrinragasztó használatakor tapasztalható helyzettel -, ha a találmány szerinti készítményt alkalmazzuk, nincs tapadás a készítménnyel befedett sebesült terület és egyéb szervek, vagy azok részei között.

A ciano-akrilát- és a zselatin-rezorcinformaldehid (GRF) ragasztóktól eltérően, amelyek erősen hisztotoxikusak a parenchimás szövetre nézve, a találmány szerinti szilárd készítmény fiziológiásán lebomlik, és az alkalmazás utáni néhány héten vagy hónapon belül szövetre cserélődik. Ez főképp kétféle mechanizmus szerint megy végbe:

1. A fibrinalvadék részben fibrinolízis , részben sejt-fagocitózis révén lebomlik.

2. A hordozót felszívásra képes granulációs szövet bontja le rétegről rétegre endogén kötőszövetből álló pszeudo-kapszulává.

A találmány szerinti készítmény hasznosan alkal mazható vérzéscsillapításhoz, szövetragasztáshoz és szövetzáráshoz, különösen gyomor-bél rendszeri műtéti beavatkozások, például nyelőcső-, gyomor-, vékonybél-, vastagbél-, végbél-műtétek során, vagy a parenchimális szerveken, például máj-, lép-, hasnyálmirigy-, vese-, tüdő-, mellékvese-, pajzsmirigy- és nyirokcsomó-műtétek, szív- és érrendszeri műtétek, mellkasi műtétek, például a légcső, a hörgők vagy a tüdők műtéti beavatkozásai, a fülben, orrban és a torokban végzett sebészeti beavatkozások, fogsebészeti, nőgyógyászati, urológiai, csont-műtétek (pl. szivacsos csontállomány eltávolítása), baleseti sebészeti, idegsebészeti, nyirok-, epe-, cerebro-spinális fisztula- (CSF) és levegőelszivárgás gyógyítására szolgáló mellkasi és pulmonáris műtétek során. A találmány így az említett készítmény fenti célokra történő alkalmazására is vonatkozik.

Hangsúlyoznunk kell, hogy a találmány szerinti készítmény lényegében légzáró és folyadékzáró, ezért van az, hogy a termék különösen hasznos nyirok-, epe- és cerebrospinális fisztulák (CSF), valamint pulmonáris és mellkasi műtétek során történő levegő-elszivárgás kezelésére. Továbbá, a légzárás és folyadékzárás következtében a termék nagyon hasznos erősen vérző szervek, például a máj és a lép műtéti beavatkozásai, valamint pl· a

4 gasztrointesztinális csatorna sebészeti beavatkozásai során történő alkalmazás céljára.

A találmány szerinti készítményt akkor kell alkalmazni, ha vérzést vagy a nyirok-, epe-, levegővágy CSF-szivárgást hagyományos módszerekkel nem lehet csökkenteni, vagy ha ezek a módszerek kedvezőtlen következményekkel járnának.

A hordozó előnyösen egy kollagén szivacs, gyapjú vagy tapasz. Ezeket a kifejezéseket a leírásban és az igénypontokban rokon értelmű szavakként használjuk. A kollagén, fibrinogén és trombin komponensek előnyösen emlősökből származnak. A szilárd komponens előnyösen humán eredetű. A kollagént, fibrinogént és a trombint vagy természetes forrásból tisztítjuk, vagy rekombináns vagy transzgenikus humán fibrinogént és/vagy trombint alkalmazunk .

A jelenleg előnyösnek tartott kollagén-forrás a ló. Annak megakadályozása céljából, hogy lóvírusokkal szennyezett kollagén tapaszokról emberekben betegséget okozó vírusok jussanak a szervezetbe, fontos elővigyázatossági intézkedés a források megfelelő megválasztása és az esetleg betegséget okozó szerek inaktiválása a gyártási eljárás során.

AZ ÁBRÁK LEÍRÁSA

1. ábra

1.1 Opraskin®: bevonat nélkül/bevonattal

1.2 Bevonattal ellátott Opraskin®: behelyezés endoszkópos műszerbe

1.3 Bevonattal ellátott Opraskin®: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után 2. ábra

2.1 Willospon® forte: bevonat nélkül/bevonattál

2.2 Bevonattal ellátott Willospon® forte: behelyezés endoszkópos műszerbe

2.3 Bevonattal ellátott Willospon® forte: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után

3. ábra

3.1 Willospon® Spezial: bevonat nélkül/bevonattal

3.2 Bevonattal ellátott Willospon® Spezial: behelyezés endoszkópos műszerbe

3.3 Bevonattal ellátott Willospon® Spezial: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után 4. ábra

4.1 Ethisorb® tapasz: bevonat nélkül/bevonattal

4.2 Bevonattal ellátott Ethisorb® tapasz: behelyezés endoszkópos műszerbe

4.3 Bevonattal ellátott Ethisorb® tapasz: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után 5. ábra

5.1 Tabotamp® NU kötés: bevonat nélkül/bevonattal

5.2 Bevonattal ellátott Tabotamp® NU kötés: behelyezés endoszkópos műszerbe

5.3 Bevonattal ellátott Tabotamp® NU kötés: ki terítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után

6. ábra

6.1 Nycomed szivacs: bevonat nélkül/bevonattal [laborminta]

6.2 Bevonattal ellátott Nycomed szivacs [laborminta] : behelyezés endoszkópos műszerbe

6.3 Bevonattal ellátott kollagén Nycomed szivacs [laborminta]: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után

6.3 Bevonattal ellátott Nycomed kollagén szivacs [gyártási minta = TachoComb®]: kiterítve az endoszkópos műszerbe való behelyezés után ábra endoszkópos eszköz: Endodock® endoszkópos eszköz: Endodock® endoszkópos eszköz: Endodock® 8. ábra

Véralvadás, az alvadék és a hordozó tapasz lebomlása. A hordozó bevonatának aktív komponensei a besatírozott szürke téglalapokban láthatók.

PÉLDÁK

Az alábbi I-IV. példák a bevonattal ellátott kollagén szivacs különböző előállítási eljárásait mutatják be, különböző fibrinogén és trombin nyers27 anyagokból .

Fibrinogen nyersanyagok :

Komponens	A teljes anyagmennyiség	%-ában
A készítmény	B készítmény	C	készí tmény
Humán fibrinogen	36-52	42-47	36-52
Humán albumin	16-24	20-24	16-24
Összes fehérje	52-76	62-71	52-76
Nátrium-kiorid	8-14	0	8-14
Trinátrium-citrát	2-4	1-3	2-4
Arginin (hidroklorid)	15-26	15-21	15-26
G1i ci n	0	6-9	1 -2
Hi s z tidi n	0	3-5	0
Szacharóz	0	0	1-2
Maradék nedvesség	<= 2	2-4	<= 1,5

Trombin nyersanyagok:

Készítmény	Ak tivi tás (I.U/mg anyag)	Maradék nedvesség	További adalék- anyagok
Humán trombin A	360-540	< = 3%	Humán albumin, nátrium-klórid, nátrium-ci trát
Humán trombin B	7-10	< = 3%	Humán albumin, nátrium-kiorid , nátrium-ci trát
Humán trombin C	36-60	<=3%	Humán albumin, nátrium-klorid, nátrium-acetát, gli ci n

I . Példa

Ebben a példában a szuszpenzió humán fibrinogén B készítményt és humán trombin B készítményt tartalmaz .

Az alábbi mennyiségek és paraméterek alkalmazásával 3500 ml végső térfogatú szuszpenziót kaptunk: Fibrinogén elegy:

- 2800 ml etanol (94% 2-8 °C-on)

- 492,5 g humán fibrinogén B készítmény

- 493,5 mg riboflavin

A fibrinogén elegyet 8-16 órán át 2-8 °C közötti hőmérsékleten tároltuk, és közben kevertük.

Trombin elegy:

- 100 ml etanol (100% -30 °C-on)

- 12,27 g humán trombin B készítmény

A trombin elegyet 8-16 órán át -30 °C hőmérsékleten tároltuk.

Szuszpenzió:

- a fibrinogén elegyhez 157 ml trombin elegyet adtunk.

- 94%-os, 2 - 8 °C hőmérsékletű etanol hozzáadásával értük el a 3500 ml-es végső térfogatot.

A szuszpenzió jellemzői:

1. Etanol-koncentráció: 94,3%

2. Szedimentációs viselkedés:

a) szedimentációs térfogat indulás után 5 perc cel: a kísérleti térfogat 98%-a

b) szedimentációs térfogat indulás után 24 órával: a kísérleti térfogat 64%-a.

3. Részecske-méret (Folk Ward átlagos átmérő): 56,4 +/- 1,3 pm

Hordozóként kollagén csíkokat vontunk be a szuszpenzióval . Először 48 kollagén szivacs-csíkot pre inkubáltunk hűtőkamrában az alábbi körülmények között: - hőmérséklet: 5,2 °C - abszolút páratartalom: 4,8 g víz / kg levegő - inkubálási idő: 18,5 óra

A bevonattal ellátott kollagén szivacs-csíkokat az alábbiak szerint szárítottuk:

A bevont csíkokat 5,2 °C-on és 4,8 g víz / kg levegő abszolút páratartalom mellett 15 percig inkubáltűk.

A bevont csíkokat ezután vákuumos szárítókamrában szárítottuk az alábbi szárítási feltételek alkalmazásával :

— légkondicionálás: 5,2 °C hőmérséklet, abszolút páratartalom 4,8 g víz / kg levegő

- légáramlás a szívószelepen keresztül: 23 m³/óra - vákuum: 59 mbar

- szárítási idő: 4 óra

A kollagén szivacs-csíkok így kapott bevonatának kopása hozzávetőleg 0,2 mg/cm², ha Vibrofix rázóberendezéssel 800-1200 rpm fordulatszámon 2 percig rázzuk.

II. Példa

Ebben a példában a szuszpenzió humán fibrinogén C készítményt és humán trombin C készítményt tartalmaz .

- 2252 ml etanol (94% 2-8 °C-on)

- 370,7 g humán fibrinogén C készítmény

- 493,5 mg riboflavin

A fibrinogén elegyet 8-16 órán át 2-8 C közötti hőmérsékleten tároltuk, és közben kevertük.

Trombin elegy:

— 188 ml etanol (100% -30 °C-on)

- 12 fiola humán trombin C készítmény (10650 I.U./fiola)/12 ml injekcióhoz való víz

A trombin elegyet 8-16 órán át -30 °C hőmérsékleten tároltuk.

Szuszpenzió:

- a fibrinogén elegyhez 164,5 ml trombin elegyet adtunk.

- 94%-os, 2 - 8 °C hőmérsékletű etanol hozzáadásával értük el a 3500 ml-es végső szuszpenziótérf ogatot.

A szuszpenzió jellemzői:

1. Etanol-koncéntráció: 94,1%

2. Szedimentációs viselkedés:

a) szedimentációs térfogat indulás után 5 perccel: a kísérleti térfogat 94%-a

b) szedimentációs térfogat indulás után 24 órával: a kísérleti térfogat 71%-a.

3. Részecske-méret (Folk Ward átlagos átmérő):

49,2 +/- 0,93 pm

Hordozóként kollagén csíkokat vontunk be a szuszpenzióval. Először 48 kollagén szivacs-cslkot preinkubáltunk hűtőkamrában az alábbi körülmények között: - hőmérséklet: 4,8 °C - relatív páratartalom: 90,3% - inkubálási idő: 22,25 óra

A bevonattal ellátott kollagén szivacs - esikokat az alábbiak szerint szárítottuk:

A bevont csíkokat 4,9 °C-on és 4,8 g víz / kg levegő abszolút páratartalom mellett 13 percig inkubáltűk.

— légkondicionálás: 5,2 °C hőmérséklet, abszolút páratartalom 4,9 g víz / kg levegő

- légáramlás a szívószelepen keresztül: 25 m³/óra - vákuum: 60 mbar

- szárítási idő: 4 óra

A kollagén szivacs-csíkok így kapott bevonatának kopása hozzávetőleg 0,3 mg/cm², ha Vibrofix rázóberendezéssel 800-1200 rpm fordulatszámon 2 percig rázzuk.

III. Példa

Az alábbi mennyiségek és paraméterek alkalmazásával 780 ml végső térfogatú szuszpenziót kaptunk: Fibrinogén elegy:

- 700 ml etanol (94% 2-8 °C-on)

- 84,42 g humán fibrinogén C készítmény

- 110 mg riboflavin.

Trombin elegy:

- 35 ml etanol (100% -30 °C-on)

- 0,54 g humán trombin C készítmény

A trombin elegyet 8-16 órán át -30 °C hőmérsékleten tárol tűk.

Szuszpenzió:

- a fibrinogén elegyhez 23,0 ml trombin elegyet adtunk.

- 100%-os, 2 - 8 °C hőmérsékletű etanol hozzáadásával értük el a 780 ml-es végső szuszpenziótérfogatot.

A szuszpenzió jellemzői:

1. Etanol-koncéntráció: 94%

2. Szedimentációs tulajdonság:

a) szedimentációs térfogat indulás után 5 perccel: a kísérleti térfogat 92%-a

b) szedimentációs térfogat indulás után 24 órával: a kísérleti térfogat 72%-a.

3. Részecske-méret (Folk Ward átlagos átmérő): 60,5 +/- 0,5 pm

Hordozóként kollagén csíkokat vontunk be a szuszpenzióval. Először 8 kollagén szivacs-esikot preinkubáltunk hűtőkamrában az alábbi körülmények között:

- hőmérséklet: 6,0 °C

- relatív páratartalom: 85%

- inkubálási idő: 18,5 óra

A bevonattal ellátott kollagén szivacs-cs1 kokat az alábbiak szerint szárítottuk:

A bevont csíkokat 5 °C-on és 85% relatív páratartalom mellett 45 percig inkubáltuk.

- légkondicionálás: 5 °C hőmérséklet, relatív páratartalom 85%

- légáramlás a szívószelepen keresztül: 1,2 m³/óra - vákuum: 35 mbar

- szárítási idő: 4 óra

IV. Példa

Ebben a példában a szuszpenzió humán fibrinogén A készítményt és humán trombin A készítményt tartalmaz .

Az alábbi mennyiségek és paraméterek alkalmazásával 3120 ml térfogatú szuszpenziót kaptunk: Fibrinogén elegy:

- 2540 ml etanol (100% 2-8 °C-on)

- 311,6 g humán fibrinogén A készítmény

- 440 mg riboflavin

Trombin elegy:

- 210 ml etanol (100% -30 °C-on)

- 229 g humán trombin A készítmény

Szuszpenzió:

- a fibrinogén elegyhez 87,3 ml befecskendezésre szánt vizet adtunk

- a trombin elegyet hozzáadtuk a fibrinogén elegyhez.

- 100%-os, 2 - 8 °C hőmérsékletű etanol hozzáadásával értük el a végső térfogatot.

A szuszpenzió jellemzői:

1. Etanol-koncéntráció: 97%

2. Szedimentációs viselkedés:

a) szedimentációs térfogat indulás után 5 perccel: a kísérleti térfogat 95,6%-a

b) szedimentációs térfogat indulás után 24 órával: a kísérleti térfogat 63,5%-a.

3. Részecske-méret (Folk Ward átlagos átmérő):

51,8 +/- 0,8 gm

Hordozóként kollagén csíkokat vontunk be a szuszpenzióval . Először 48 kollagén szivacs-csíkot preinkubáltunk hűtőkamrában az alábbi körülmények kö36

zött:

- hőmérséklet: 6,5 °C

- relatív páratartalom: 90%

- inkubálási idő: 22,5 óra

A bevont csíkokat 6,5 °C-on és 90% relatív páratartalom mellett 10 percig inkubáltuk.

- légkondicionálás: 6,5 °C hőmérséklet, relatív páratartalom 90%

- légáramlás a szívószelepen keresztül: 21 m³/óra - vákuum: 58 mbar

- szárítási idő: 4 óra

A kollagén szivacs-csíkok így kapott bevonatának kopása kevesebb, mint 0,1 mg/cm², ha Vibrofix rázóberendezéssel 800-1200 rpm fordulatszámon 2 percig rázzuk.

1. Példa

Aprotinin, mint TachoComb® komponens

Az antifibrinolitikus hatás in vitro vizsgálata egy in vivo helyzethez hasonló kimosódási („washout) szituációban

Ennek a kísérletnek az volt a célja, hogy kimutassuk az aprotinin, mint TachoComb® H komponens hatékonyságát hiperfibrinolitikus körülmények között, in vitro kísérleti modell alkalmazásával.

A TachoComb® S egy szürkésfehér, bevonattal ellátott, szivacsszerű tapasz. Az aktív, szilárd komponensek hordozójaként habos, száraz kollagén tapasz szolgál. A tapasz 9,5 x 4,8 x 0,5 cm méretű. Az aktív oldal sárga színű. 1 cm² TachoComb® S tapasz (vastagsága 0,5 cm) az alábbi összetevőkből áll :

Lóból származó kollagén 2,1 mg bevonata: humán fibrinogén 5,5 mg humán trombin 2,0 I.U.

riboflavin (sárga színű, a bevont terület jelzésére) 16,5 pg

A dózis megállapítására szolgáló in vivo kísérletek megerősítették, hogy a trombin és a fibrinogén fenti koncentrációi maximális tapadóerőt eredményeznek (lásd a 3. példát).

A humán trombint, humán fibrinogént és aprotinint tartalmazó TachoComb® H terméket hatóanyagként csupán humán trombint és humán fibrinogént tártál mazó TachoComb® S termékkel hasonlítottuk össze.

Két kísérleti modellt fejlesztettünk ki a hatékonyság meghatározására hiperfibrinolitikus körülmények között. Az ilyen körülmények a műtéti körülmények megfelelőinek tekinthetők, és lehetővé tették, hogy számos, szignifikáns hatás bizonyításához szükséges kísérletet végezzünk.

Az 1. kísérleti modellben a mintát tapadási felületként egy szintetikus anyagra vittük fel. Az anyagba előzőleg egy lyukat vágtunk, hogy szimuláljuk például egy vérér perforációját. A tapaszt két különböző fibrinolitikus oldat (inkubáló oldat) hatásának tettük ki a lyukon keresztül. Az egyik ilyen oldat antifibrinolitikus komponensként a₂-antiplazmint is tartalmazott.

Az inkubáló oldatok összetétele:

Minden anyagot puffer 1-ben hígítottunk: 50 mM Trometamol, 100 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, 2 mg/ml BSA (proteázmentes), 0,5 mg/ml Na-azid/ml).

I. inkubáló oldat (1 μmólos plazminogén, 1 nmólos szövet-plazminogén aktivátor (tPA), 1 pmmólos a₂antiplazmin).

μΐ puffer 1, pH 7,4 μΐ plazminogén oldat (konc. 4,9 μιπάΐοε Coachrom humán plazminogén aktivitás) μΐ tPA oldat (50 nmólos)

100 μΐ a₂-antiplazmin-oldat (2,5 μmólos)

II inkubáló oldat (1 μmólos plazminogén, 1 nmólos szövet-plazminogén aktivátor), 149 μΐ puffer 1, pH 7,4, 51 μΐ plazminogén oldat (konc. 4,9 μmólos

Coachrom humán plazminogén aktivitás) 50 μΐ tPA oldat (50 nmólos)

Az inkubáló oldatot 2 óránként cseréltük, hogy kimosó („wash-out) hatást szimuláljunk. Ilyenkor ellenőriztük a tapadást. A mintát 50 mbar nyomás alá helyeztük. Feljegyeztük azt az időt, amikor 50 mbar nyomásnál, vagy az alatt a minta elvált.

A 2. kísérleti modell sérült bélszövet fibrinolitikus hatásának bemutatására szolgál. A kísérleti mintát disznóbélre (ex vivo), mint tapadófelületre alkalmaztuk. Egy meghatározott lyukat vágtunk a bélbe, hogy lehetővé tegyük az inkubáló oldat érintkezését a fibrinalvadékkal és „wash-out hatást szimuláljunk. Az inkubáló oldatot időnként cseréltük, ilyenkor a mintát 50 mbar nyomás alá helyeztünk. Feljegyeztük azt az időt, amikor 50 mbar nyomásnál vagy az alatt a minta elvált .

Az eredmények azt mutatták, hogy számottevő különbség van az aprotinint tartalmazó TachoComb® H és az aprotinin nélküli TachoComb® S között.

Abban az 1. kísérleti modellben, melyben szövet plazminogén aktivátort, plazminogént és ct2 antiplazmint tartalmazó inkubáló oldatot használtunk, a TachoComb® H fibrinolízis-ideje 41,2 ± 7,3 óra, a TachoComb® S fibrinolízis-ideje pedig 12,8 ± 2,8 óra.

Abban az 1. kísérleti modellben, melyben csupán szövet — p1 azminogén aktivátort es plazminogént tar talmazó inkubáló oldatot használtunk, a TachoComb® H fibrinolízis-ideje 31,6 ± 5,3 óra, a TachoComb® S fibrinolízis-ideje pedig 8,3 ± 1,8 óra.

2. kísérleti modellben a TachoComb® H leválási ideje 78,4 ± 16,3 óra, szemben a TachoComb® S 6,5 ± 1,8 órás leválási idejével.

Sok fibrin maradt még a teszt-mintán. De a minta nyomás alatt elvált a bél felületétől, mert gyen gült a tapadási erő a fibrinalvadék és a bél felülete között.

Mindkét modellben a TachoComb® H aktív komponensé nek , az aprotininnek antifibrinolitikus hatása bi

1 zonyosodott be nagyon világosan.

Az 1. kísérleti modellben a fibrinolízis-idő 320%kal hosszabbodott meg az aprotinin, mint aktív TachoComb® H-komponens hatására az a₂-antiplazmint tartalmazó I inkubáló oldat alkalmazása esetén, és 380%-kal az a₂-antiplazmint nem tartalmazó II inkubáló oldat alkalmazása esetén.'

Az 1. kísérleti modell azt is megmutatta, hogy az a₂-antiplazmin a fibrinolízis-idő megnövelése útján kiegészítő antifibrinolitikus hatását fejt ki. A fibrinolízis-idő TachoComb® H esetén 31,6 óráról 41,2 órára (130%), TachoComb® S esetén pedig 8,3 óráról 12,8 órára (154%) növekedett.

2. Példa

Bevonattal ellátott Nycomed szivacs (TachoComb S) összehasonlítása más, a TachoComb S-sel azonosan bevont hordozó termékekkel.

A réteg tapadása

Eljárás

1. Különböző hordozók bevonása

Márkanév	Anyag	Gyártó/forgalmazó
Opraskin®	Kollagén szivacs	Lohmann, postafiók 2343, D-56513 Neuwied
Willospon® forte	kollagén szivacs (borjú)	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Willospon® Special	zselatin szivacs	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
E thi sorb® tapasz	Poliglactin910 /Polidioxanon	Johnson/Johnson (gyártó) Ethicon, RobertKoch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Tabotamp® NU kötés	oxidált regenerált cellulóz	Johnson/Johnson (gyártó) Ethicon, RobertKoch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Nycomed kollagén szivacs	ló-kollagén szivacs	Nycomed Austria SanktPeter-Str. 25 A-4021 LINZ

Minden hordozó 2x4,5 cm²-es területét bevontuk TachoComb S bevonó szuszpenzióval . A bevonó szuszpenzió mennyisége megfelelt a TachoComb specifikációjának (5,5 mg fibrinogén/cm² ) . A mintákat megszári tottuk.

2. Minden bevont hordozóból egy 1x4 cm²-es mintát állítottunk elő.

3. A réteg tapadását a következőképpen teszteltük:

Az eljárás leírása

Berendezés

Analitikai mérleg (mérési pontosság ±0,5 mg)

Vibrofix rázóberendezés rögzítő eszközzel kombinálva

Vonalzó milliméter-beosztással

Stopperóra, szike, 2 cm belső átmérőjű csövek s topperrel

Eljárás

Szikével egy 4x1 cm² méretű bevonattal ellátott területet vágunk ki a bevont hordozóból.

A mintát egy stopperrel ellátott kiegyensúlyozott csőbe helyezzük, majd Vibrofix rázóberendezéssel 2 percig rázzuk (frekvencia: kb. 1000 rpm).

A lapot eltávolítjuk, és a bevonó anyag visszamaradó mennyiségét (kopás: mg/cm²) újra megmérjük.

Számi tás:

„ , ₂ maradék tömeg (mg) - tára (mg)

Kopás (mg/cm ) = --------------------------4 cm

Eredmények:

Hordozó	Anyag	Kopás (mg/cm²)
Opraskin®	liofilizált kollagén	2,1
Willospon® forte (3mm)	liofilizált kollagén	1,2
Willospon® Spezial (lmm)	Zselatin	2,1
Ethisorb® tapasz (ZVP609)	Poliglactin/dioxanon	14,3
Tabotamp® NU kötés	oxidált cellulóz	9,2
Nycomed kollagén s z ivacs	kollagén, habos	0,15

Megjegyzés

A hordozók a Nycomed kollagén szivacs kivételével nem rugalmasak bevonás után.

A mintát nagyon óvatosan kell kivágni. Ha ollóval vágjuk ki, a bevonó anyag jelentős része leválik, mert a réteg önmagában merev. Az Ethisorb® tapasz szinte semmi kötődést nem mutatott a bevonó anyaggal. Ha egy kicsit megrázzuk, a teljes bevonat leválik, mint egy „szőnyeg.

A Nycomed kollagén szivacs és a többi hordozóanyag közti különbség világosan látszik.

A benedvesített, bevonattal ellátott hordozó ruga Imassága

Eljárás

1. Különböző hordozók bevonása

Minden hordozó 2*4,5 cm²-es területét bevontuk TachoComb S bevonó szuszpenzióval. A bevonó szuszpenzió mennyisége megfelelt a TachoComb specifikációjának (5,5 mg fibrinogén/cm²) . A mintákat megszárítottuk .

2. Egy kb. 5-7 cm²-es mintát állítottunk elő minden bevont hordozóból. Meghatároztuk a száraz minta pontos kezdeti területét.

3. A mintát benedvesítettük, és ráhelyeztük egy rugalmas Latex lapra, amit hozzárögzítettünk egy speciális, részletesen az „eljárás címszó alatt ismertetett készülékhez. Ekkor nyomást gyakoroltunk a Latex lapra, ami kitágult. 2-szeri kitágulás és összehúzódás után a lapot harmadszor is kitágítottuk. A hordozó területét a legmagasabb tágulási pontnál mértük.

A módszer leírása

Eszközök/vegyszerek

Perisztaltikus pumpa (IKA PA-SF)

Nyomásálló üveg (3 nyílás)

VDO manométer (0-250 mbar)

Üvegtölcsér (0 1. nyílás: 30mm, 2. nyílás: 15mm) Szilikon csövek és fogók, Latex kesztyűk (Semper

6 med) , szike, milliméter-beosztású vonalzó, olló

Fiziológiás sóoldat

Eljárás

A következő felszereléseket légmentesen, szilikon csövekkel csatlakoztatjuk a nYomásálló üveg három nyi1ására:

a) perisztaltikus pumpa

b) manométer c) üvegtölcsér / 2. nyílás

Egy Latex kesztyűből egy kb. 8x8 cm²-es dupla lapot vágunk ki. Ezt a lapot légmentesen rögzítjük az üvegtől csérhez / 1. nyílás.

Szikével egy kb. 5-7 cm²-es, bevont területet vágunk ki a bevonattal ellátott hordozóból.

Megmérjük a minta területét (kezdeti terület). A minta bevonatát sóoldattal megnedvesítjük és ráhelyezzük a Latex lapra. Ezután kézzel nekinyomjuk a Latex lapnak kb. 1 percig.

A Latex lapot perisztaltikus pumpával, kb. 70 mbar nyomás alkalmazásával kitágítjuk. Ezt a Latex lap visszahúzódása után kétszer megismételjük. A harmadik kitáguláskor megmérjük a bevonattal ellátott hordozó területét (hosszúság és szélesség) a Latex lap kitágulásának legmagasabb pontján.

Számi tás:

„Rugalmas sági faktor = a hordozó területe a harmadik kitáguláskor a minta kezdeti területe

Eredmények

Hordozó	Anyag	Rugalmassági faktor
Opraskin®	liofilizált kollagén	1,78
Willospon® forte (3mm)	liofilizált kollagén	1,53
Willospon® Spezial (Imm)	Zselatin	1,79
Ethisorb® tapasz (ZVP609)	Poliglactin/dioxanon	1 , o
Tabotamp® NU kötés	oxidált cellulóz	1 , 15
Nycomed kollagén szivacs	kollagén, habos	1,55

Megjegyzés:

A benedvesített Nycomed kollagén szivacs (TachoComb) rugalmassága a termék egyik fontos jellemzője. A rugalmasság létfontosságú mellkasi és hasi sebészetnél. A ragasztás után a hordozónak képesnek kell lennie arra, hogy kövesse például a tüdő vagy a belek táguló és összehúzódó mozgását. Különösen az Ethisorb® nem mutatott semmiféle rugalmasságot. Azonnal levált a bevonatról. A bevonattal ellátott Willospon® Spezial és Opraskin® szerkezeti hibákat mutatott a kísérlet során.

Bevonattal ellátott hordozó használata az endoszkópos sebészetben

Eljárás

1. Különböző hordozók bevonása

Minden hordozóból egy 2x4,5 cm²-nyi területet bevontuk TachoComb S bevonó szuszpenzióval. A bevonó szuszpenzió mennyisége megfelelt a TachoComb specifikációjának (5,5 mg fibrinogén/cm²) . A mintákat megszárítottuk.

2. Az endoszkópos sebészetben használandó, bevonattal ellátott hordozó minták kezelését, és a bevonat abból adódó veszteségét digitális fényképező felszereléssel dokumentáltuk.

A módszer leírása

Berendezés

Endodock: Endoszkópos eszköz, melyet a TachoComb® endoszkópos sebészetben történő használatára fejlesztettek ki (Id. 7. ábra). Digitális fényképező felszerelés.

A vizsgált hordozók listája

9

Hordozó	A hordozó anyaga
Opraskin®	liofilizált kollagén
Willospon® forte (3mm)	liofilizált kollagén
Willospon® Spezial (lmm)	zselatin
Ethisorb® tapasz (ZVP609)	Poliglactin/dioxanon
Tabotamp® NU kötés	oxidált cellulóz
Nycomed kollagén szivacs	kollagén, habos ----—

Eljárás

A hordozókról készült képsorozatok:

1. kép: Bevonat nélküli és bevonattal ellátott hordozóminták bemutatása

2. kép: A bevonattal ellátott hordozómintát beillesztjük az endoszkópos eszközbe (Endodock). A mintát kézzel kell elsimítani, hogy a vezető „tű köré tudjuk tekerni. Azután a mintát óvatosan behelyezzük a 10 mm átmérőjű acélcsőbe.

Az Endodock csőbe részben beillesztett minta bemutatása.

3. kép: A mintát óvatosan kinyomjuk. Ezután a mintát ki kell teríteni. A hordozó mellett összegyűjtjük a hordozóról a kezelés miatt levált bevonatot. Bemutatjuk a kiterített mintát az endoszkópos műszerbe történő behelyezés után, és a kezelés miatt elveszett bevonatot.

Me gj e gy z é s

A TachoComb (bevonattal ellátott ló-kollagén szi vacs/Nycomed) az endoszkópos sebészetben a termék legnagyobb igénybevételt jelentő alkalmazása. A TachoComb terméket behelyezzük egy endoszkópos berendezésbe. A készülék csöve általában 10-13 mm átmérőjű. Hogy a csőbe behelyezhessük, a Tachocomb terméket kisimítjuk, egy vezető „tű köré tekerjük, majd óvatosan behelyezzük a csőbe. így a bevonatnak erősen kell tapadnia a hordozóhoz, de a terméknek elég rugalmasnak kell maradnia ahhoz, hogy száraz állapotban hajlítható és feltekerhető legyen. A műtét helyére juttatva a TachoComb terméket óvatosan kihúzzuk a csőből. Akkor ki kell teríteni, és a sérült felületre helyezni. Gyakran igazítgatni is kell. Tehát a rétegnek elég erősen kell tapadnia a hordozóhoz, hogy ellenálljon az ilyen kezelésnek.

Eredmények

Az eredmények a mellékelt 1-6. ábrákon láthatók. A lepergett bevonó anyag becsült mennyiségét az alábbiakban adjuk meg:

Opraskin® 30-40%

Willospon® forte 60-70%

Willospon® Spezial 50%

Tacotamp® NU kötés 60-70%

Ethisorb® tapasz 95%

Nycomed kollagén szivacs <5%

Mivel az Ethisorb® egy nagyon merev hordozó, a bevonat tapadása nagyon rossz. Ezért a bevonattal ellátott Ethisorb® a vizsgálat során szinte a teljes bevonatát elvesztette. A Nycomed bevonattal ellátott kollagén szivaccsal összehasonlítva minden más vizsgált hordozó bevonandó felülete sima. Ezért a bevonat „sima szőnyegként fekszik a hordozón. Ez ahhoz vezet, hogy a száraz, bevonattal ellátott hordozók meglehetősen rugalmatlan szerkezetűek. A hajlítás vagy a feltekerés gyakran összetöri a bevonatot.

Miután behelyeztük a bevonattal ellátott hordozókat az endoszkópos készülék csövébe, és kiterítettük a mintát, a Nycomed kollagén szivacs kivételével az összes hordozó meglehetősen sokat elveszített a bevonatából, így nagy területek maradtak bevonó anyag nélkül.

A Nycomed kollagén szivacs szerkezete és textúrája az alapja annak, hogy a TachoComb mind száraz, mind benedvesített állapotban igen rugalmas. A Nycomed kollagén szivacs habos, és belsejében sokszög alakú üregek találhatók. Ezek az üregek a felszínen mélyedésekként vannak kivágva. Ezek a mélyedések megnövelik a bevonó felület területét. A bevonás során a bevonó szuszpenzió egyenletesen oszlik el a felületen. Szárításkor a fibrinogént és trombint tartalmazó oldat szilárdan rögződik a —: :

• · ♦ · · mélyedésekben. Ennek következtében a TachoComb tetszőleges méretűre vágható, és úgy helyezhető be az endoszkópos műszerbe, hogy közben a bevonó anyagból csak kevés vagy egyáltalán semmi nem vész el .

A száraz TachoComb nagy rugalmassága komoly előny a többi vizsgált, bevonattal ellátott hordozóval s zemben.

3. Példa

Kísérletek az aktív komponensek dózisának maghatározására

Az aktív komponensek dózisát két különböző kísérleti modell segítségével határoztuk meg, melyekben a tapadás erősségét mértük: a húzószilárdságot patkánymájon, a megnövelt szövetnyomással szemben tanúsított tapadási erőt patkányvesén.

A. Szakítószilárdság patkánymájon

Egy 1x1 cm méretű és kb. 1 cm mély sebet ejtettünk altatott patkány májának bal lebenyén abból a célból, hogy szivárgó vérzést produkáljunk. A sebet egy lxl cm-es TachoComb® S darabbal tapasztottuk be, amelyet egy rugós mérleghez csatlakoztattunk. Mértük azt a nyomást, amelynél a

TachoComb® S leszakadt.

B. Megnövelt szövetnyomással szemben tanúsított tapadási erő patkányvesén

Altatott patkány bal veséjén erősen vérző, sima felületű sebet produkáltunk oly módon, hogy tömegének kb. negyedét kivágtuk. A sebet TachoComb® S kísérleti lapokkal betapasztottűk. Megnöveltük a szövetnyomást oly módon, hogy elzártuk a vénás kivezetést, és a vesébe izotóniás citrátsó-oldatot (pH = 7,2) pumpáltunk. Azt a nyomást mértük, amelynél a TachoComb® S elkezdett leválni.

. Táblázat

Különböző mennyiségű fibrinogént tartalmazó TachoComb® S tapadási ereje.

A réteg összetétele	Tapadási erő (átlag ± SD)
Fibrinogén, mg/cm²	Trombin IU/cm²	Szaki tószilárdság patkánymájon N / cm² n=5	Tapadási erő megnövelt szövetnyomással szemben patkányvesén mbar n = 5
0	0	0,20 ± 0,02	47 ± 9
0	2,40	0,20 ± 0,03	63 ± 16
1,30	1 , 73	0,30 ± 0,06	81 ± 12
2,92	1,85	0,39 ± 0,05	101 ± 13
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	110 ± 13
7,22	1,82	0,38 ± 0,02	97 + 13
10,02	1,75	0,40 ± 0,07	87 ± 10

. Táblázat

Különböző mennyiségű trombint tartalmazó

TachoComb® S tapadási ereje.

A réteg összetétele	Tapadási erő (átlag ± SD)
Fibrinogén mg/cm²	Trombin IU/cm²	Szaki tószilárdság patkánymáj on N/cm² n = 5	Tapadási erő megnövelt szövetnyomással szemben patkányve sén mbar n=5
0	0	0,20 ± 0,02	47 ± 9
6,15	0	0,20 ± 0,01	57 ± 10
4,72	0,92	0,39 ± 0,02	84 ± 9
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	110 ± 13
4,78	4,95	0,35 ± 0,02	97 ± 9
4,70	9,63	0,30 ± 0,02	109 ± 13
4,75	19,83	0,27 ± 0,03	91 ± 20

A kapott eredmények azt mutatták, hogy számottevő különbség van a különböző változatok között. A humán trombin optimális mennyisége a 0,9 - 10

I.U./cm² tartományban van kb. 5 mg/cm² állandó fibrinogén-tartalom mellett. A humán fibrinogén optimális mennyisége 2,9 - 7,2 mg/cm² kb. 2 I.U./cm²állandó humán trombin-tartalom mellett.

Ezek az in vivo kísérletek megerősítették, hogy az egyéb TachoComb készítményekben (TachoComb® és •‘Ι Ζ .... c-..*..

TachoComb® H) alkalmazott fibrinogén- koncentráció (4,3 - 6,7 mg/cm²) és trombin-koncentráció (1,5 - 2,5 I.U./cm²) a TachoComb® S-nél is maximális tapadóerőt eredményez.

4. Példa

TachoComb® S hatékonysága lép- és máj sérülések lezárásánál kutyákon

A vizsgálat célja az volt, hogy összehasonlítsuk az aprotinint tartalmazó TachoComb® H hatását az aprotinint nem tartalmazó TachoComb® S hatásával kutyakísérletben lép- és májsérülések esetén. A lép bemetszésével, illetve 0,5 cm mély szúrásával utánoztuk a szivárgó vérzést. A kraniális májlebeny csúcsának kimetszésével jutottunk erősen vérző sebfelülethez (2 -3 cm²) . A vérzés csillapítására csupán TachoComb® H vagy TachoComb® S tapaszt alkalmaztunk a sebre (azonos tételt használtunk az ugyanabból a kutyából származó lép- és májsérülésre) . A műtét után 48 órával boncolást végeztünk, mivel ez az az idő, amikor a klinikai gyakorlatban az újravérzés kockázata a legnagyobb.

Mindkét termékkel teljes vérzéscsillapítást értünk el. A boncolás után 48 órával sem szabad szemmel történő megfigyeléssel, sem pedig hisztológiai vizsgálattal nem észleltünk másodlagos vérzést.

•'4

Hisztológiailag nem volt különbség a kutyák között TachoComb® H vagy TachoComb® S alkalmazásakor akkor sem, amikor a megfelelő tapasszal lezárt lépvagy májsérülést a vérzéscsillapítás vagy a sebgyógyulás szempontjából értékeltük. Műtét után nem lépett fel másodlagos vérzés.

A vérsejtszámlálás adatai hasonló eredményeket mutattak mindkét kezelt csoportnál. Műtét után 48 órával a vérsejtszám egy kicsit emelkedett. Egyik értékelt paraméter tekintetében sem volt különbség a csoportok vagy az idők között. A véralvadási teszt sem mutatott olyan különbséget, ami az aprotinin jelenlétével vagy távollétével állna összefüggésben. A vér fibrinogén-tartalmának növekedése műtét után 48 órával nyilvánvaló volt mindkét kezelt csoportban. A fejérvérsejtszám és a vér fibrinogén-tartalmának emelkedése egy, a műtéti traumára adott gyulladási válasznak tulajdonítható, és nem tekinthető a TachoComb® H vagy S toxikus mellékhatásának.

Az a következtetés vonható le, hogy az aprotinint nem tartalmazó TachoComb® S ugyanolyan hatékony, mint az aprotinint tartalmazó TachoComb® H szivárgó és erősen vérző parenchimális sebek kezelésére kutyáknál. Az alvadék stabilitását a megválasztott körülmények között nem befolyásolta az aprotinin jelenléte vagy távolléte.

5. Példa

Felszívódó TachoComb® S és TachoComb® H vérzéscsillapító, sebgyógyító hatásának és ellenállóképességének összehasonlítása; kísérleti tanulmány disznókon

A kísérlet célja

A kísérlettet arra a célra terveztük, hogy megállapítsuk egy vérzéscsillapító gyapjú azonnali hatékonyságát és rövidtávon tanúsított ellenállóképességét disznóban, lép-sérülésen.

Anyagok és módszerek:

nőstény disznót használtunk a kísérlethez. Két csoport vérzéscsillapító gyapjút teszteltük véletlenszerűen: aprotinint tartalmazó TachoComb® H-t és aprotinin nélküli TachoComb® S-et.

A műtét napján az állatok lépének hasi részén egy standard 2x3 cm-es sebet ejtettünk, és azt egy közvetlenül a sebre alkalmazott - gyapjúval eltömtük.

Értékeltük a gyapjú azonnali vérzéscsillapító hatását oly módon, hogy számoltuk a hólyagokat, és mértük a vérzés elállításához szükséges időt. Feljegyeztük a TachoComb® H és S tapadását.

órával később megvizsgáltuk mindkét anyag rövidtávú viselkedését és ellenállóképességét oly módon, hogy növeltük a lépen belüli nyomást (elzártuk a vénás ereket).

Amikor a nyomás egy csaknem állandó állapotot ért el, egy adrenalin IV bóluszt (0,02 mg vagy 0,04 mg) adtunk be az artériás nyomás növelése céljából dobutamin-klorohidrát infúzióval együtt, vagy anélkül.

Ezeket a farmakológiai anyagokat alkalmazva minden állatnál megállapítottuk a TachoComb® H és S termékkel gyógyított sebek vérzési nyomásás hatására történő felszakadását.

Eredmények:

Nem észleltünk különbséget a lépműtét idején a kezelések között a vérzéscsillapító hatás tekintetében.

A második észleléskor, 72 órával később, mindkét gyapjú makroszkopikus külseje azonos volt.

Az akut nyomásmérés és a szakítással szembeni ellenállóképesség sem különbözött szignifikáns módon a két kísérleti csoportnál.

Az anyag nem szakadt el. A seb vérzését 4 állatnál figyeltük meg TachoComb® S, és 2 állatnál TachoComb® H alkalmazása esetén (egy további hólyagot észleltünk a 4. csoportban).

A hisztológiai leletek arra engedtek következtetni, hogy az aprotinin protektív hatást fejthet ki a gyapjúszerkezetre. Úgy tűnt, hogy az aprotinin módosítja a mikroszkopikus mintát, csökkentve a gyapjú lebomlását. Specifikus sejtmintát nem figyeltünk meg.

Következtetések:

A két TachoComb® készítmény, az S és H közvetlen vérzéscsillapító aktivitását vizsgáltuk standard lépmodellen, 24 disznón.

Hatékonyság, a sebhez tapadás és a működő szövethez történő alkalmazkodás tekintetében mindkét anyag hasonlóan viselkedett. Hatékonyságuk igen számottevő.

A biológiai lebomlással és a fehérjebontással szembeni ellenállást a műtét után 72 órával vizsgáltuk a lépen belüli nyomás (mechanikai és farmakológiai eszközökkel történő) növelésével. A TachoComb® H és S gyapjú lokális ellenállóképességét feljegyeztük. A két anyag ellenállóképessége nem mutatott szignifikáns eltérést.

Hisztopatológiai leletek azonban azt jelezték, hogy a TachoComb® S proteolitikus lebomlása egy kicsit erősebb, mint a TachoComb® H-é.

A TachoComb® S-t és TachoComb® H-t a vérzéscsi1lapí tás egyetlen eszközeként használtuk erősen vérző lépsebek lezárására disznókban (a sebek felülete 2 cm x 3 cm, mélysége 3-5 mm; n= 12 csoportonként). 72 óra múlva a lép vénájának/vénáinak elkötésével növeltük a lépen belüli nyomást. Ezután a lépen belüli nyomást adrenalin befecskendezésével tovább növeltük. Az állatokat figyeltük, nem mutatkoznak-e rajtuk újbóli vérzés jelei, vagy nem jelennek-e meg vérhólyagok a tapaszok alatt. A minták hisztopatológiai vizsgálatát (TachoComb® H-val és S-sel gyógyított sebhely) boncolás után végeztük.

A TachoComb® S és a TachoComb® hatékonysága, sebhez és működő szövethez tapadása hasonlónak bizonyult.

6. Példa

Felszívódó TachoComb® S és TachoComb® H vérzéscsillapító, sebgyógyító hatásának és ellenállóképességének összehasonlítása; kísérleti tanulmány disznókon, akut hasnyálmirigy-gyulladásos modellen

A kísérlet célja

A kísérlettet arra a célra terveztük, hogy megállapítsuk egy vérzéscsillapító gyapjú azonnali hatékonyságát és rövidtávú ellenállóképességét disznóban, akut hasnyálmirigy-gyulladássos modellen kiváltott lép-sérülésen.

Anyagok és módszerek:

nőstény disznót használtunk a kísérlethez. Két csoport vérzéscsillapító gyapjút teszteltük véletlenszerűen: aprotinint tartalmazó TachoComb® H-t és aprotinin nélküli TachoComb® S gyapjúkat.

Értékeltük a gyapjú azonnali vérzéscsillapító hatását oly módon, hogy számoltuk a hólyagokat, és mértük azt az időt, ami a vérzés elállításához szükséges. Feljegyeztük a TachoComb® H és S tapadását.

Steril fecskendő alkalmazásával az epehólyagot felszúrtuk, az epét összegyűjtöttük, és 10 ml epét a Wirsung-féle csatornába fecskendezve hasnyálmirigygyulladást idéztünk elő. A műtét előtt és után naponta figyeltük a vér enzim-szintjét (lipáz és amilázszint).

TachoComb® H-ból és S-ből kis darabkákat helyeztünk a hasnyálmirigy parenchimára a bélhez történő csatlakozásánál .

órával később megvizsgáltuk a TachoComb® H és S rövidtávú viselkedését és enzimatikus lebomlással szembeni ellenállóképességét oly módon, hogy növeltük a lépen belüli nyomást (a vénás erek elzárásával és farmakológiai módszerekkel) .

Amikor a nyomás egy csaknem állandó állapotot ért el, 0,02 - 0,04 mg/perces noradrenalin infúziót alkalmaztunk, majd egy adrenalin IV bóluszt (0,02 mg vagy 0,04 mg) adtunk be az artériás nyomás növelése céljából, 0,3 - 0,6 mg/perces dobutamin-klórhidrát perfúzióval együtt, vagy anélkül.

Eredmények:

A lépen mindkét anyag hasonlóan viselkedett az azonnali vérzéscsillapító hatékonyság, a sebhez tapadás és a működő szövethez történő alkalmazkodás tekintetében. Hatékonyságuk igen számottevő volt.

Makroszkopikus vizsgálat szerint egyik gyapjú sem változott a 3. napon, bár az enzimatikus körülmények súlyosak voltak, különösen a 2. napon a vérben, és míg a 4. napon is a hashártya-folyadékban.

A 72.-ik órában nem mutatkozott szignifikáns különbség a két anyag ellenállóképességében a lép nyomásának növelése után.

Egy anyag szakadt el a TachoComb® S csoportban. A seb vérzését egy állatnál figyeltük meg TachoComb® S, és 2 állatnál TachoComb® H alkalmazása esetén (egy hólyagot észleltünk a TachoComb® H csoportban).

A hisztológiai leletek nem jeleztek szignifikáns különbséget a TachoComb® S és a TachoComb® H lebomlása között. Specifikus sejtmintát nem figyeltünk meg a lépen. Még a hasnyálmirigy-mintákon, a nagy koncentrációban jelen lévő hasnyálmirigy-enzimmel szorosan érintkező TachoComb® H és S darabok sem mutattak nagyobb elváltozásokat.

Következtetések:

Nem mutatkozott nyilvánvaló különbség a TachoComb® S és a TachoComb® H között szakadással szembeni ellenállóképességük tekintetében növelt hasnyálmirigy-enzimes környezetben.

Nincs semmiféle specifikus makroszkopikus vagy mikroszkopikus bizonyíték arra, hogy akár a TachoComb® H, akár a TachoComb® S gyapjúk módosulnának .

A TachoComb® S és TachoComb® vérzéscsi11api tó hatékonyságát standardizált lépsérülési modellen (kb. 3 mm mély, 2 cm x 3 cm-es sebfelület, n=l0/csoport), akut hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő disznókon vizsgáltuk. A hasnyálmirigy gyulladást úgy váltottuk ki, hogy a Wirsung-féle csatornába epét fecskendeztünk, és azt követően elkötöttük a hasnyálmirigy kivezetését. A hasnyálmirigyre kis TachoComb® H és S darabokat helyeztünk a hasnyálmirigy-vezeték lekötési helyénél. A műtét után 72 órával a lép vénájának elkötésével és i.v. adrenalin befecskendezésével növeltük a lépen belüli nyomást.

A lépen a TachoComb® S és a TachoComb® H hasonlóan viselkedett az azonnali vérzéscsillapító hatékonyság, a sebhez tapadás és a megnövelt lépen belüli nyomással szembeni ellenállás tekintetében, annak ellenére, hogy a hasnyálmirigy enzim-szintjét jelentősen megnöveltük (a vérben lévő amiláz- és lipáz 20-100szorosára, a hasnyálmirigy-folyadékban a hasnyálmirigyenzim-szint 10-100-szorosára növekedett az alapszinthez képest). Hisztopatológiai leletek azt mutatták, hogy nincs számottevő különbség a TachoComb® S és a TachoComb® H lebomlása között. A lépen nem mutatkozott specifikus sejtminta. Még a hasnyálmirigyenzimeket magas koncentrációban tartalmazó TachoComb® H és S mintákkal közeli kapcsolatban álló hasnyálmirigy-mintákon sem mutatkoztak nagyobb különbségek a TachoComb® H és S tapadása tekintetében.

Ezen az igen nehezített, disznókon végzett akut hasnyálmirigy-gyulladásos modellen sem jelentkeztek specifikus makroszkópos vagy mikroszkópos különbségek a TachoComb® S és a TachoComb® H között.

7. Példa

Összehasonlító agyszövet-reakció és felszívódó TachoComb® H és TachoComb® S hatékonysága: kísérleti tanulmány nyúl-modellen normál alvadási körülmények között és lokális híperfibrinolízis esetén

Ennek a kísérletnek az volt a célja, hogy a TachoComb® S és a TachoComb® H hatékonyságát idegsebészeti alkalmazás után hasonlítsuk össze. Nyulakban agyi sérüléseket indukáltunk normális koagulációs körülmények között (agyszövet-reakció = BTR, n=12 nyúl, választható n=10) és hiperfibrinolitikus (HF) körülmények között helyi r-tPA alkalmazásával (n=10 nyúl). Féltekénként három kortikális sebet ejtettünk (minden állatban összesen 6 sebet; 3 mm mély és 4 mm átmérőjű fúrt agysebet).

A BTR sorozatok

Féltekénként három sebből kettőt kezeltünk TachoComb® H, illetve TachoComb® S készítménnyel, és féltekénként egy sebet üresen hagytunk kontroll céljára. Miután a sebeket TachoComb® H-val vagy S-sel betapasztottuk, mértük a vérzési időt erős nagyítást és sóoldattal történő folyamatos, enyhe öblítést alkalmazva. Miután minden seben csillapítottuk a vérzést, artériás magas vérnyomást váltottunk ki i.v. adrenalin injekcióval (0,01 mg/kg adrenalin), így az átlagos artériás nyomást (MAP) legalább 120 Hgmm-re növeltük. Ezalatt tovább figyeltük az újbóli vérzést. Miután az átlagos artériás nyomást ismét a normál szintre csökkentettük, a bőrt összezártuk. Boncolást 3 és 7 nappal később végeztünk (mindkét napon 5 nyúlon). Három állatnál a boncolás előtt a 3. napon mágneses rezonancia-vizsgálatot végeztünk. Boncolásnál a sebhelyeket szabad szemmel vizsgáltuk, és hisztopatológiához mintákat vettünk.

A HF sorozatok

Miután a sebeket a BTR-sorozatoknál ismertetett módon létrehoztuk, r-tPA-t csöppentettünk a sebre (sebenként 0,3 mg r-tPA 0,5 ml sóoldatban), mielőtt minden sebet betapasztottunk TachoComb® S-sel vagy TachoComb® H-val. Mértük a vérzés időtartamát erős nagyítás mellett és sóoldattal történő folyamatos, enyhe öblítést alkalmazva. Boncolást és szabad szemmel történő megfigyelést az első (n=7) és a hetedik napon (n=3) végeztünk. Hisztopatológiás vizsgálatot a harmadik napon vett mintákon végeztünk összehasonlítás célj ából.

Az egész kísérlet során nem mutatkozott nyilvánvaló különbség a TachoComb® S és a TachoComb® H között sem a sebzárás hatékonyságát, sem a megnövelt MAP tolerálását, sem a vérzési időt tekintve, sem pedig a hisztopatológia vonatkozásában. Súlyos vérzés mutatkozott minden állatnál a HF sorozatban, nem csak a seb helyén, hanem az egész arcrészt borító bőr alatt. Azonban még ilyen súlyos körülmények között is hason ló hatékonyságot tanúsított a TachoComb® S és a

TachoComb® H.

8. Példa

TachoComb® H és TachoComb® S idegsebészeti alkalmazása : agyszövet-reakció és vérzéscsillapító hatékonyság

Folyékony fibrinragasztókat elterjedten alkalmaznak vérzéscsillapításra az idegsebészetben. Nincsenek publikált összehasonlító adatok a TachoComb® agyszöveti reakciójára vonatkozóan, és még vitatott az antifibrinolitikus szerek (pl. az aprotinin) alkalmazása i s .

Célkitűzések

A kísérletet két fő kérdés megválaszolására terveztük. Vizsgáltuk a rövidtávú lokális agyszövetreakciót TachoComb® H (TCH) és TachoComb® S (TCS) kortikális sebekre történő alkalmazása után, és összehasonlítás céljából - lefedetlen kontroll sebeken (CL), hisztológiai és modern képábrázoló módszerek segítségével.

A másik feladat az volt, hogy tanulmányozzuk a TachoComb® H és S termékek vérzéscsillapító hatékonyságát normál véralvadási (BTR csoport) körülmények között, és lokálisan kiváltott súlyos hiperfibrinolízist (HF csoport) követően. Azt is tudni akartuk, befolyásolja-e az aprotinin a készítmény vérzéscsil lapító tulajdonságait és tapadási erejét.

Anyag és módszer

Egy sorozatban 22 fiatal nyúlon három kortikális sebet ejtettünk mindkét féltekén. 12 állatot jelöltünk ki az agyszövet-reakcióhoz (BTR) és 10 állatot a hiperfibrinolízis (HF) csoportba soroltunk.

A BTR csoport állatainál a sebek közül kettőt TachoComb® H, illetve TachoComb® S készítménnyel tapasztottuk be, a harmadikat kontroll céljából fedetlenül hagytuk. Mértük a vérzés időtartamát, és figyelemmel kísértük a kiváltott artériás magas vérnyomás következtében jelentkező újbóli vérzést. Az állatokat a műtét utáni 3. és 7. napon leöltük, és hisztológiai vizsgálatot végeztünk. A BTR csoport állatai közül háromnál mágneses rezonancia-vizsgálatot végeztünk az agyi ödéma kiértékelése céljából a 3. napon, közvetlenül az eutanázia előtt.

A HF csoportba tartozó állatoknál, amelyekben súlyos lokális hiperfibrinolitikus állapotot idéztünk elő egy rekombináns szövet-plazminogén aktivátorral (rtPA) , egy féltekén mind a három sebet TachoComb® Hval, a másik féltekén TachoComb® S-sel kezeltük. Mértük a vérzés időtartamát, és három állatnál hisztoló giai vizsgálatot végeztünk a 3. napon.

Eredmények

Normál alvadás (BTR állatok) esetén a vérzés TCH és TCS alkalmazásával szignifikánsan gyorsabban (p<0,001) csillapodott, mint vérzéscsillapító alkalmazása nélkül. Kimutattuk, hogy nincs különbség a két termék között a vérzés időtartamát tekintve (p=0,294), de ezek az időtartamok lényegesen rövidebbek, mint a lefedetlen sebek esetén (p<0,001).

Artériás magas vérnyomás kiváltása esetén újbóli vérzés történt a 24 TCH borítású seb közül egynél, a 24 TCS borítású seb közül háromnál, és a 29 kontroll seb közül 19-nél. A vérzéscsillapító szer jelenléte következetesen megakadályozta az újravérzést súlyosan fokozott artériás nyomás (Chi négyzet=l6,3, p>0,001) esetén. TCH vagy TCS alkalmazása nélkül azonban megnövelt artériás nyomást alkalmazva az újbóli vérzés jelentkezésének kockázata 80%-os.

Az újbóli vérzési idők statisztikai elemzése a hiperfibrinolizis-csoportban (HF állatok) azt mutatta, hogy nincs különbség a két termék között a vérzési idők tekintetében (kijelölt beosztású teszt: p=0,927 és T teszt: p=0,4102).

Végül, egy 99,73%-os biztonsági intervallumon belül (D<3sdD=ns) kizártuk, hogy szignifikáns különbség van ugyanazon termék vérzéscsillapító hatékonysága között a két alvadási helyzetben.

0 ,· ·· ···:··♦:···:

Következtetések:

A TachoComb® H és a TachoComb® S nem váltott ki specifikus hisztológiai elváltozásokat az agyszövetben. Mindkét terméknek jó az agyi parenchimás biokompatibilitása, mivel nem váltanak ki további szövetreakciókat. Nincs olyan hátrányos hatás, amelyet morfológiailag nyilvánvaló módon a kombinációs termék alkalmazása idézne elő. Hisztológiai vizsgálatok nem tártak fel a két termék között különbséget sem normál, sem pedig súlyosan megzavart véralvadás esetén. A TachoComb® H és S ugyanolyan vérzéscsillapító hatékonysággal és tapadóerővel rendelkezik mind normál véralvadás, mind pedig hiperfibrinolízis esetén. Erős bizonyíték van arra, hogy az aprotinin nem befolyásolja a vérzéscsillapító tulajdonságokat és a tapadási erőt, még súlyosan megzavart véralvadás esetén sem.

Az irodalomból ismert termékekhez viszonyítva a TachoComb® H és S sokkal gyorsabban csillapítja a vérzést, mint az oxidált cellulóz és a kollagén gyapjú.

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Szilárd készítmény, amely lényegében áll

a) egy kollagén hordozóból, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik : rugalmassági modulusa az 5 - 100 N/cm közötti tartományban van , sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb, de 4 mm-nél kisebb, és/vagy átlagosan 3 mm alatti, és az említett hordozón egyenletesen eloszlatva és rögzítve

b) szilárd fibrinogénből, és c) szilárd trombinból.
2. Az 1. igénypont szerinti hordozó, azzal jellemezve, hogy a kollagén hordozó egy kollagén szivacs, amely emlősből, transzgenikus vagy rekombináns forrásból származó I típusú kollagén anyagból áll.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a kollagén hordozónak egy vagy több aktív oldala van, amelyeken fibrinogén van jelen 2-10 mg/cm², például 4,3-6,7 mg/cm², előnyösen kb. 5,5 mg/cm² mennyiségben, és trombin van jelen 1,5-5,5 IU/cm², előnyösen kb. 2,0 IU/cm² mennyiségben .
4. Az 1. - 3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén humán eredetű.
5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fibrinogént egy természetes forrásból tisztítottuk.
6. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén transzgenikus vagy rekombináns.
7. Az 1. - 6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a trombin humán eredetű.
8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a trombint egy természetes forrásból tisztítottuk.
9. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén transzgenikus vagy rekombináns.
10. Vérzéscsillapításra, szövetragasztásra és szövetzárásra alkalmazható anyag, amely egy rugalmas hordozót tartalmaz, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik: rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti tartományban van, sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb és 4 mm-nél kisebb, és/vagy átlagosan 3 mm alatti, továbbá tartalmazza szilárd fibrinogén és szilárd trombin keverékét, és nem tartalmaz antifibrinolitikus szert, például aprotinint, e-aminokapronsavat vagy «2-antiplazmint, és a szilárd fibrinogén és a szilárd trombin úgy rögződik a hordozóhoz, hogy a kopás kevesebb, mint 1,0 mg/cm² amikor a bevonattal ellátott anyag egy mintáját Vibrofix rázóberendezésben, kb. 1000 rpm frekvencián 2 percig rázzuk, és ha a bevonattal ellátott anyagot endoszkópos berendezésbe helyezzük, majd abból kivesszük, az anyag lényegében nem változik, és a bevonatnak kevesebb mint 20%-a pereg le, ami a hordozó rugalmasságának valamint a szilárd fibrinogén és a szilárd trombin stabil tapadásának a jele, és az említett anyag lényegében légzáró és folyadékzáró, és rugalmassági faktora legalább 1,25 egy olyan kísérlettel meghatározva, amely az alábbi lépésekből áll: a bevonattal ellátott hordozó Latex laphoz rögzítése, a Latex nyomás által háromszor történő megnyújtása, a harmadik alkalommal a bevonattal ellátott hordozó területének a Latex lap legmagasabb nyújtási pontjánál történő megmérése, valamint a bevonattal ellátott hordozó megnyújtott területének a bevont terület kiindulási területével történő összehasonlítása.
11. Egy olyan hordozó alkalmazása szövetzárásra használható termék előállításához, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik :

rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti tartományban van, sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb és 4 mm-nél kisebb és/vagy átlagosan 3 mm alatti, és tartalmaz elegendő mennyiségű fibrinogént és elegendő mennyiségű trombint.
12. Egy olyan hordozó alkalmazása vérzéscsillapításra használható termék előállításához, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik: rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti tartományban van, sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb és 4 mm-nél kisebb és/vagy átlagosan 3 mm alatti, és tartalmaz elegendő mennyiségű fibrinogént és elegendő mennyiségű trombint.
13. Egy olyan hordozó alkalmazása szövetragasztásra használható termék előállításához, amely az alábbi fizikai tulajdonságok közül legalább kettővel rendelkezik: rugalmassági modulusa az 5 és 100 N/cm közötti tartományban van, sűrűsége 1 és 10 mg/cm³ közötti, üreg-átmérője 0,75 mm-nél nagyobb és 4 mm-nél kisebb és/vagy átlagosan 3 mm alatti, és tartalmaz elegendő mennyiségű fibrinogént és elegendő mennyiségű trombint.
14. A 11. - 13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás a gyomor-bélrendszerben, például a nyelőcsőben, gyomorban, vékonybélben, vastagbélben, végbélben, vagy parenchimális szerveken, például májon, lépen, hasnyálmirigyen, vesén, tüdőn, mellékvesén, pajzsmirigyen és nyirokcsomókon végzett műtéti beavatkozások, szív- és érrendszeri műtétek, mellkasi műtétek, például a légcső, a hörgők vagy a tüdők műtéti beavatkozásai, a fülben, orrban és a torokban (ÉNT) végzett sebészeti beavatkozások, fogsebészeti, nőgyógyászati, urológiai, vaszkuláris műtétek, csontműtétek (pl. szivacsos csontállomány eltávolítása), baleseti sebészeti, idegsebészeti, nyirok-, epe-, cerebro-spinális fisztula- (CSF) és levegőelszivárgás gyógyítására szolgáló mellkasi és pulmonáris műtétek céljára.
15. A 11. - 14. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a hordozó ©gy biológiailag lebomló polimer, mint például egy polihialuronsav, polihidroxisav, pl. tejsav, glikolsav, hidroxi-butánsav, egy cellulóz, zselatin vagy kollagén, például egy kollagén szivacs, például egy lényegében I típusú kollagén szálakból álló kollagén szivacs.
16. A 11. - 15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a hordozónak sgy vagy több aktív oldala van, amelyeken fibrino— gén van jelen 2-10 mg/cm², például 4,3-6,7 mg/cm², előnyösen kb. 5,5 mg/cm² mennyiségben, és trombin van jelen 1,5 - 2,5 IU/cm², előnyösen kb. 2,0 IU/cm² mennyiségben.
17 . A 11.

16. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén humán eredetű, egy természetes forrásból tisztított, transzgenikus vagy rekombináns humán fibrinogén.
18. A 11. - 17. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén egy természetes forrásból tisztítással nyert fibrinogén.
19. A 11. - 18. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fibrinogén transzgenikus vagy rekombináns .
20. A 11. - 19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a trombin egy természetes forrásból tisztított, transzgenikus vagy rekombináns humán trombin.
21. A 11. - 20. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a trombin egy természetes forrásból tisztítással nyert trombin.
22. A 11. - 21. igénypontok kalmazás, azzal jellemezve, genikus vagy rekombináns.

bármelyike szerinti alhogy a trombin transz-

ADVOPATENT

SZ>áiADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA KOVÁíTXjYÖBlGY »»pa|lalnii ügjn/vő

ItJip'UaP»*’ 9* ¹⁹· \ Λ AvS