JP7481008B2 - ２反応剤型のシート状組織接着補強材 - Google Patents

Description

本発明は、生体組織に接着されて、接着された部位を補強または被覆することが可能で、止血材、気漏防止材、癒着防止材、縫合補強材、接着剤シートなどとして利用しうる生体分解性のシート状の接着補強材に関する。特には、生体分解性の多孔質基材に、２反応剤型の接着剤粉末が固着されたシート状組織接着補強材に関する。

市販されている代表的なシート状組織接着補強材としては、フィブリノゲン製剤、多糖類を用いた製剤、脂肪族ポリマーを用いた製剤が存在する。フィブリノゲン製剤としての「タコシール」(登録商標、CSLベーリング株式会社)は、シート状のコラーゲンスポンジに、血液由来のフィブリノゲン及びトロンビンなどを付着させたものである。この付着のためには、フィブリノゲン及びトロンビンなどの溶液をコラーゲンスポンジに噴霧してから乾燥を行うといった処理を行っているようである（特許文献２～３）。一方、接着剤成分を含まない、多糖類または脂肪族ポリマーの多孔質シートを用いた市販製剤として、「サージセル」(登録商標、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社:酸化セルロースの布地)、及び、「ネオベール」（登録商標、グンゼ株式会社:ポリグリコール酸の不織布）が知られている。また、仔牛真皮由来のアテロコラーゲンを綿線維状に紡糸加工し、ポリエポキシ化合物で化学架橋処理した吸収性局所止血材（商品名「インテグラン」株式会社高研製、販売元日本臓器製薬株式会社）が市販されている。

生体原料を使用しない組織接着剤ないし組織補強材として、本出願人の提案に係る、アルデヒド化グルカン及び変性ポリ-L-リジンの混合粉末からなる２反応剤型のものが存在する（特許文献１）。この組織接着補強材は、粉末のまま適用部に噴霧後、生理食塩液を噴霧することによりゲル化し、シート状に適用部に接着する。既に、動物試験により止血効果及び肺切除面での気漏防止効果が確認されている（例えば、非特許文献１）。

国際公開WO2008/066182（特許4571693） 特公昭61-034830 国際公開WO2012/029971 特開2017-192560

Development of new biodegradable hydrogel glue for preventing alveolar air leakage, J. Thoracic and Cardiovascular Surgery, 134(5):1241-8 (2007 Nov).

しかしながら、「タコシール」を始めとするフィブリノゲン製剤は血液成分を原料とした製剤であるため、血液由来の感染症等の危険性が生じる。血液成分を原料としない「サージセル」は適用患者本来の凝血能を利用するものであり、サージセルの多孔質シートに血液を吸い込んで凝血塊を形成することにより組織補強効果を実現するため、止血部位に貼付した後、凝血塊が形成されるまで、数分間押さえている必要がある。また、脂肪族ポリマーの多孔質シートである「ネオベール」は、不足する生体組織への接着性を補強するために、フィブリノゲン製剤の併用が推奨されている。それゆえ、従来のシート状組織補強材は、安全性と簡便性の両方を有しているとは言い難い。

本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、シート状組織接着補強材において、フィブリノゲン及び患者生体由来の凝血能のいずれも用いることなく、組織への接着及び補強の効果を実現することを目的とする。

WO2008/066182（特許文献１）に記載の医療用２反応剤型接着剤は、粉末の状態で生体組織の切開部や傷口などに塗布された後、生理食塩液を添加した際などに、２種の反応成分が互いに反応することで、架橋または重合し、性状が紛体から含水ゲルに変化する。該含水ゲルは生体組織への接着性を有し、該含水ゲル単体で液体及び気体の透過を妨げる特徴を有しており、既に、動物試験により、組織接着補強の効果として止血効果及び肺切除面での気漏防止効果が確認されている。なお、この医療用２反応剤型接着剤の粉末は、水溶液から、凍結乾燥などによる乾燥の後に粉砕することで得られる、ランダムな形状の多孔体であって、平均粒径が１０～１５０μｍである。

本件発明者らは、粉末の形態の上記医療用２反応剤型接着剤を用いて、シート状の組織接着補強材を得ることを種々試みた。ところが、この医療用２反応剤型接着剤は、水以外の溶剤に溶解しない。また、水に溶解させると、アルデヒド化グルカンのアルデヒド基と、変性ポリ-L-リジンのアミノ基との反応が進んでしまい、反応がほぼ完了した状態の含水ゲルは、生体組織への接着性が低下してしまう。したがって、フィブリノゲン及びトロンビンなどを付着させるのと同様の方法では、多孔質の基材シートに付着させることができない。

アルデヒド化グルカンの粉末と、変性ポリ-L-リジンの粉末とを、それぞれ別個に水に溶解させたとしても、例えば、アルデヒド化グルカンの水溶液を基材シートに噴霧してから乾燥させ、この後に、変性ポリ-L-リジンの水溶液を噴霧したならば、やはり、アルデヒド化グルカンのアルデヒド基と、変性ポリ-L-リジンのアミノ基との反応が進んでしまう。微細なドット状またはストライプ状に塗り分けることも考えられるが、工程が非常に複雑であり、現実的でない。

一方、上記医療用２反応剤型接着剤の粉末を、カプセルに封入するか、バインダーを用いることによって、多孔質基材に付着させることも考えられる。しかし、カプセルやバインダーを用いると、反応材成分が迅速に水と接触することを妨げ、硬化（ゲル化）を遅延させたり不完全なものとしたりするおそれがある。また、多孔質基材に付着させるための処理が煩雑になるおそれがある。

本件発明者らは、上記医療用２反応剤型接着剤を用いて、シート状の組織接着補強材を得るべく、鋭意検討する中で、無水エタノールなどを用いる簡単な方法で実現できることを知るに至った。すなわち、医療用２反応剤型接着剤の粉末を、無水エタノールなどの中に分散させてから、コラーゲンスポンジシートなどの生体分解性の多孔質シートに、噴霧または浸漬によって加えた後、乾燥させてエタノールを除去した。すると、意外にも、医療用２反応剤型接着剤の粉末が、生体分解性の多孔質シートに固着されており、多孔質シートに振動や多少の衝撃を加えても、医療用２反応剤型接着剤の粉末が外れて落ちることがなかった。

また、このようにして得られたシート状の組織接着補強材は、医療用２反応剤型接着剤の粉末と同様に、反応性及び接着性を保持していた。すなわち、生体組織の切開部や創傷部位にあてがって、適宜に生理食塩液の吹き付けなどを行った際、速やかに水を吸うとともに硬化（ゲル化）して、生体組織に強固に接着された。

この硬化後の含水ゲルは、表面に親水基を有する生体分解性の多孔質シート（以降、適宜に「基材シート」と呼ぶ）に対しても接着性を有しており、生体組織に組織接着補強材をあてがった場合、生体組織と基材シートとを接着する作用をも有する。そのため、シート状の組織接着補強材により、生体組織同士を接着することができるだけでなく、生体組織の創傷部位などに貼り付けられて、この部位を保護し補強する役割を行うこともできる。例えば、生体臓器の創傷部位に貼り付けるならば、治癒が完了するまで、創傷部位を強固に被覆・閉鎖するとともに、外力などによる変形や裂け目の生成などを防止する補強作用を行うことができる。

すなわち、本発明のシート状組織接着補強材は、硬化した含水ゲルそのものによる組織補強作用及び被覆・閉鎖の作用に加えて、基材シートによる組織補強作用が足し合わされることにより、更なる組織補強効果を実現するとともに、液体及び気体の通過を物理的に妨げる強力な封止作用を実現することが可能となる。特には、噴出性・滲出性の出血部位に対する圧迫止血が可能になり、利便性が拡がる。なお、本願において、「組織接着補強」は、止血、気漏防止、組織癒着防止、縫合補強、及び外傷面の保護を含む意味で用い、得られる効果には、生体組織の内外双方からの気体及び液体通過を遮断する効果、生体組織と他の生体組織或いは固形物との接触を妨げる効果、並びに、生体組織面を保持する効果が含まれる。

本発明のシート状組織接着補強材において、接着を実現するための２反応剤型接着剤粉末のゲル化は、水分の添加により開始する。ゲル化を開始させる水分は、形態・種類を問わない。ゲル化開始剤としての水分には、体液や血液をなす生体組織上の水分、生理食塩液或はブドウ糖液が挙げられる。

感染の危険性を排除或いは低減することができ、取扱性及び組織補強効果に優れる。

種々の含水率のエタノール中に、２反応剤型接着剤粉末（LYDEX(登録商標)）を投入して攪拌した際（実施例２）の様子を示す一連の写真である。 ウサギの肺を用いた空気漏れ試験（実施例３）の手順を示すための一組の図である。 ポリ-L-乳酸（PLLA）を紡糸及び編成して得られた2種類のメッシュシート（2.5×5cm）を、二つ折りにした状態で示す、垂直斜め方向からの写真である。 図３のメッシュシートのうち、編目（網目）が細かい方（「PLLAメッシュ密」）に、接着剤樹脂層を形成する際（実施例４－１）の様子を示す一組の写真である。 図３のメッシュシートのうち、編目（網目）が粗い方（「PLLAメッシュ粗」）に、接着剤樹脂層を形成する際（実施例４－２）の様子を示す一組の写真である。 実施例４－１の接着シートについてのin vitroでの接着力評価試験（実施例６）の要点を示す模式図である。 接着力評価試験（実施例６）の様子を示す写真である。 接着力評価試験（実施例６）の結果を示すグラフである。 ２反応剤型接着剤（LYDEX）を塗布するのに用いた粉体スプレー装置（スプレーガン；特願2017-222915）についての、右側ハウジング部を取り外した状態での右側面図である。 綿線維状コラーゲンシートを基材シートとした場合の接着シート（実施例７）、および、同じ基材シートにて、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を塗布する樹脂粉末の２０％となるように添加した場合の接着シート（実施例８）をまとめて示す写真である。 実施例７の接着シートを一旦巻物状に巻いてから、開いて伸ばした際の様子を示す写真である。 実施例８の接着シートについての、図１１と同様の写真である。 無水エタノールを用いた参考例１についての、接着シートを形成する各段階での様子を示す一組の写真である。 図１３の中段（「４」）に示された、EtOH浸透物及びEtOH部分乾燥品、並びに、図１３の下段に示された乾燥後の表面を、２つの倍率（×１００及び×４００）にて示す拡大写真である。 図１３の下段に示された乾燥後のシートについての切断面の拡大写真である。 非含水アセトンを用いた参考例２についての、各段階での様子を示す、図１３と同様の一組の写真である。 図１６の中段（「４」）に示された、アセトン浸透物及びアセト部分乾燥品、並びに、図１３の下段に示された乾燥後の表面を、２つの倍率（×１００及び×４００）にて示す拡大写真である。 非含水アセトン中に分散させた後で完全に乾燥させた後の、２反応剤型接着剤の粉末（左）、及び、元の２反応剤型接着剤の粉末（右）を並べて示す左右一組の写真である。 ２％含水アセトンを用いた参考例３についての、各段階での様子を示す一組の写真である。左から、シャーレ（ペトリ皿）中の分散液、この分散液を基材シートに塗布した直後の様子、乾燥した後の接着シート、及び、この接着シートをピンセットでつまんで持ち上げた様子を示す。 図１９に示す乾燥後の接着シートの表面についての顕微鏡写真である。 非反応性の類似混合粉末を用いた参考例４についての、各段階での様子を示す、一組の写真である。 ２反応剤型接着剤に代えて、変性ポリリジン（第２反応剤；ＳＡＰＬ）のみを用いた参考例５についての、各段階での様子を示す、一組の写真である。

本発明のシート状組織接着補強材（以降、適宜「接着シート」ともいう）は、生体分解性の連通多孔質シート（基材シート）に、医療用の２反応剤型接着剤の粉末を固定させたものであり、この固定の際に、接着剤やバインダー、被覆材といった第３の材料を介在させていないものである。ここでの固定は、シート状組織接着補強材を湾曲させた場合にも、２反応剤型接着剤の粉末の全部または大部分が、少なくとも脱落しない程度に接着されている状態をいうこととする。好ましい実施形態において、この固定は、後で詳しく説明するように、２反応剤型接着剤の粉末の一部、特には変性ポリ-L-リジンの粉末の表層部が部分的に溶解することで生じていると考えられる。

ここでの２反応剤型接着剤は、特にはWO2008/066182（特許文献１）に記載されたような混合粉末の形態の２反応剤型接着剤であって、水の存在下に反応をして含水ゲルを形成するものである。すなわち、重量平均分子量が１０００～２０万であるアルデヒド化グリカン（アルデヒド化多糖類、特には水溶性のアルデヒド化多糖類）の粉末からなる第１反応剤と、重量平均分子量が１０００～２万であるポリ-L-リジン（A）にカルボン酸無水物を添加することで得られる酸無水物添加（部分カルボキシル化）ポリ-L-リジンの粉末（B1）からなる第２反応剤とを、アルデヒド基／アミノ基のモル比が０．９～３．５となるように混合した混合粉末よりなり、前記アルデヒド化グリカンは、水溶性または水分散性である、グルカン（D-グルコースのポリマー）などの多糖類を過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩で酸化して、無水グルコース・ユニットあたり０．１～１．０個のアルデヒド基を導入したものである。ここでのグリカンは、好ましい一実施形態においてα－グルカンであり、例えば、デキストランまたはデキストリンである。グリカン（多糖類）は、ヒアルロン酸などのグルコサミノグリカン、グアーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルローなどであっても良い。

基材シートに固定する前の、アルデヒド化グリカンの粉末及び酸無水物添加ポリ-L-リジンの粉末（B1）は、いずれも、ランダムな形状（球体に程遠い形状）の多孔体であって、平均粒径が１０～１５０μｍである。このランダムな形状の多孔体は、アルデヒド化グリカン及び酸無水物添加ポリ-L-リジンの水溶液から、それぞれ、凍結乾燥などによって乾燥した後に、高速回転刃式の粉砕機などで粉砕して得られるもの、または、それと同等の粉末である。このように得られたアルデヒド化グリカンの粉末及び酸無水物添加ポリ-L-リジンの粉末（B1）を、所定の比率で混合することで２反応剤型接着剤としての混合粉末が得られる。この混合粉末は、好ましくは、含水率を２．０％以下、特には１．０％以下に維持するように、密閉容器などに保存される。

２反応剤型接着剤は、好ましくは、重量平均分子量が１０００～２０万であるアルデヒド化グリカンの粉末からなる第１反応剤と、重量平均分子量が１０００～２万であるポリ-Ｌ-リジンに、コハク酸無水物またはグルタル酸無水物を反応させて残存アミノ基率が７０～９３％となるようにした部分カルボキシル化ポリ-Ｌ-リジンの粉末からなる第２反応剤とをアルデヒド基／アミノ基のモル比が０．９～２．０となるように混合した混合粉末よりなり、前記アルデヒド化グリカンは、デキストランまたはデキストリンを過ヨウ素酸または過ヨウ素酸塩で酸化して、無水グルコース・ユニット（単糖ユニット）あたり０．２～０．５個のアルデヒド基を導入したものである。また、好ましくは、含水率が２．０％以下である。医療用２成分反応型接着剤は、前記アルデヒド化グリカンにおけるアルデヒド基の導入量を、無水グルコース・ユニット（単糖ユニット）あたり０．２～０．４個の範囲で変化させることにより、含水ゲルが崩壊するまでの期間を、２～３日から、４週間以上の範囲で調整して設定することができる。

好ましい実施形態において、アルデヒド化グリカンの粉末及び酸無水物添加ポリ-L-リジンの粉末の平均粒径は、下記範囲の(1)から(7)へと進むにつれて順次、より好ましい範囲となる。(1) 1～500μｍ、(2) ５～350μｍ、(3) 10～250μｍ、(4) 10～150μｍ、(5) 15～120μｍ、(6) 20～100μｍ、(7) 20～80μｍ。すなわち、10～150μｍを特に好ましい範囲と言えるが、15～120μｍ等であるとさらに好ましい。ここで、平均粒径は、実体顕微鏡により得られた映像より、画像解析プログラム（例えば株式会社マウンテックの画像解析式粒度分布測定ソフトウェア「マックビュー」を用いることができる)等により、各粒子の２軸平均径（長軸長と短軸長との単純平均ｘ）を求めて長さ平均(Σｘ²/Σｘ)することで得られる。粉末の平均アスペクト比（長軸長／短軸長）は、例えば１．３～３．０、特には１．５～２．０である。なお、平均粒径は、例えば、島津製作所製のレーザ回折式粒度分布測定装置 SALD-2200(レーザ回折・散乱法，回分セル使用)および解析プログラム（WingSALD II-2200 for Japanese ソフトウェア）を使用して、より簡便に測定することができ、上記の画像解析と、概ね同様の結果が得られる。

２反応剤型接着剤をなす、アルデヒド化グリカンの粉末及び酸無水物添加ポリ-L-リジンの粉末は、典型的には、２軸平均径の分布において、10～150μｍの範囲内に９０％以上が含まれ、20～100μｍの範囲内に８０％以上が含まれる。また、アルデヒド化グルカンの粉末の平均粒径は、酸無水物添加ポリ-L-リジンの粉末の平均粒径の１．１～２．０倍でありうる。

基材シートは、上記の２反応剤型接着剤の粉末の全部または大部分が通り抜けられない程度に、厚み方向に貫通する孔のサイズが小さいものである。また、好ましくは、上記の医療用２反応剤型接着剤と同程度の期間内、例えば0.3倍～3倍、特には0.5倍～2倍の期間内に生体内にて崩壊し、吸収または排出されるものである。但し、用途などによっては、上記の医療用２反応剤型接着剤よりも、かなり早期に分解されるものであってもよい。例えば、創傷部位での生体組織の再生などにより、接着されている必要があるものの、繊維材による補強がそれほど必要でなくなることも考えられる。一方、基材シートを構成する繊維などが、比較的長期にわたって生体組織内に残留しても、生体組織の機能などに悪影響を及ぼさないこともありうる。

基材シートは、不織布、織物、編物、メッシュシートなどの繊維製品のシート(textile sheet)であってもよく、また、連続気孔のスポンジ（発泡体）状、スエード（微細繊維の複合体）状、目の細かい格子状ないし網状、ハニカム状などの、繊維製品でない連通多孔質シート(non-textile open-cell porous sheet)であってもよい。

基材シートの厚みは、例えば10μm～1000μm（1mm）、15μm～500μm（0.5mm）、特には20μm～300μmとすることができる。特には、基材シートが比較的強度の大きい繊維からなる繊維製品のシートである場合、10μm～150μm、特には20μm～100μmまたは20μm～50μmとすることができる。

基材シートは、好ましい一実施形態において、生体分解性のフィラメント（長繊維）から編成されたメッシュシートまたは編物であり、特には、伸縮性を抑えるべく、経編（たてあみ；トリコット、ラッセルなど）によって編成されたメッシュシートまたは編物である。メッシュシートまたは編物は、単一の層のシートであってもよく、また、複数の編地を重ねたものであってもよく、場合によっては、二重編、立体編などによる編物であっても良い。

メッシュシートとする場合、構成する糸条の径は、結節部以外にて、例えば20～300μmとすることができる。また、所要の形状安定性や柔軟性などを考慮して、適宜、マルチフィラメントまたはモノフィラメントとすることができる。このようなメッシュシートの目開き（開口の径）は、例えば、0.1mm～3mm、特には0.2mm～2mmとすることができる。また、メッシュシートの開口率（開口の総面積を全体の面積で割った値）は、例えば50～95％、特には60～90％とすることができる。このようなメッシュシートであると、厚み及び重量を最小限としつつ、接着剤樹脂層を支持するとともに、補強効果を大きくすることができる。

編物のシートとする場合、開口率（編み目による開口の総面積を全体の面積で割った値）を、例えば20～50％とすることができる。また、編物を構成する糸条（編み糸）は、マルチフィラメント糸またはステープル糸により、空隙率を、例えば30～80％とすることができる。

基材シートは、好ましい一実施形態において、生体分解性の繊維からなる不織布または紙である。特には、生体分解性のポリマーからなるフィラメント（長繊維）またはステープル（短繊維）からなり、ニードルパンチ法、スパンレース法、スパンボンド法、紙すき法などにより製造したものである。

基材シートは、好ましい一実施形態において、繊維製品シートまたは細かい網目を有する網状シートであって、医療用２反応剤型接着剤の粉末の保持、及びこの粉末との接着に有利なように、微細な繊維の束や起毛部、パイル部など、または微細な凹凸構造などを少なくとも表面の近傍に有する。

好ましい実施形態において、基材シートをなす、繊維製品または非繊維製品による多孔質シートは、表面及び／または切断面（すなわち、これらの少なくとも一方）を光学顕微鏡で観察した場合、比較的大きい空孔の径が、５００μm以下、４００μm以下、または３００μm以下である。具体的な実施形態において、光学顕微鏡で観察される１μm以上の径の空孔に関して、平均孔径（メディアン径；D50）が、例えば２０～１５０μmである。基材シートの空隙率（％；porosity;空孔の体積割合）は、例えば５０～９７％または６０～９５％である。

基材シートを構成する生体内分解性のポリマーとしては、コラーゲンなどのタンパク質、またはその他のアミノ酸ポリマー、多糖類またはその誘導体、脂肪族ヒドロキシ酸ポリマーなどの脂肪族ポリエステル、またはその誘導体、ポリビニルアルコール(PVA)またはその誘導体などを挙げることができる。ここで、「誘導体」とは、官能基の導入、酸化、還元、原子の置き換えなどにより、生体分解性などの特性の付与または調整を行ったものである。このような生分解性ポリマーは、いずれも、親水性を有しており、上記の２反応剤型接着剤との接着性が良好である。

好ましい生分解性ポリマーとしては、コラーゲン、デキストラン、デキストリン、及び脂肪族ポリエステル、並びにポリジオキサノン（PDS）が挙げられる。好ましい脂肪族ポリエステルとしては、ポリグリコール酸(PGA)、グリコール酸/乳酸共重合体（PLGA）、ポリ乳酸(PLLA, PDLLA)、及び乳酸/カプロラクトン共重合体が挙げられる。ここに挙げた生分解性ポリマーは、加水分解などにより、内部からも崩壊することで、全体が所定期間経過後に分解するように設定しやすいことから、好ましい。上記以外にも、その他の乳酸系ポリマーやポリデプシペプチドなども好適に使用可能であり、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリグリコネート（トリメチレンカーボネートとグリコリドの共重合体）、酸化セルロース、キチンやその誘導体なども使用可能である。

生分解性ポリマーの具体例としては、(株)ビーエムジーによる下記の市販製品を挙げることができる。
(1) ポリグリコール酸（PGA）：240℃，10kg荷重でのメルトフローレート(MFR)が3.0～9.0g/10min。
(2) ポリ-L-乳酸（PLLA）：GPC-光散乱法による重量平均分子量M_Wが200,000～280,000、DSC法による融点が180～195℃。
(3) グリコール酸/DL-乳酸共重合体（PGDLLA）：グリコール酸と乳酸とのモル比が20:80～30:70、GPC-光散乱法による重量平均分子量M_Wが220,000～280,000、DSC法による融点が50～60℃。
(4) L-乳酸/ε-カプロラクトン共重合体（LCL）
・LCL(75:25)：L-乳酸とε-カプロラクトンとのモル比が70:30～80:20、GPC-光散乱法による重量平均分子量M_Wが400,000～800,000、DSC法による融点が150～175℃。
・LCL(50:50)：L-乳酸とε-カプロラクトンとのモル比が45:55～55:45、GPC-光散乱法による重量平均分子量M_Wが200,000～600,000、DSC法による融点が80～130℃。
(5) ポリ-p-ジオキサノン（PDO）：DSC法による融点が100～110℃。240℃，10kg荷重でのメルトフローレート(MFR)が3.0～9.0g/10min。

基材シートは、一の好ましい実施形態において、ポリ乳酸や脂肪族ポリエステルなどの生体分解性樹脂からなる、連通孔構造を有する発泡シート、または、細かいハニカム構造による多数の上下連通孔を有する網状シートである。

基材シートの具体例としては、コラーゲンスポンジシート（グンゼ株式会社の「ペルナックGプラス（登録商標）」の「単層タイプ」、株式会社高研の「インテグラン」のプレスシート）、コラーゲン繊維シート（株式会社ニッピの「コラーゲン繊維シート」）、ポリグリコール酸の不織布（「ネオベール」：登録商標、グンゼ株式会社）、酸化セルロースや酸化再生セルロースの布地（「サージセル」及び「インターシード」：登録商標、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社)、キチンの不織布（「ベスキチン」：登録商標、ニプロ株式会社）などを挙げることができる。

コラーゲンスポンジシートは、例えば、特許4681214の実施例３の記載に準拠して、コラーゲン溶液を酸性に調整した後、グルタルアルデヒドで架橋を行ってから、凍結乾燥及び加熱乾燥を施すことで得ることができる。

好ましい実施形態において、基材シートの少なくとも一方の面に、上記の２反応剤型接着剤の粉末が固定されることで、２反応剤型接着剤からなる多孔質の層を形成している。この多孔質の層の厚みは、２反応剤型接着剤の粉末を基材シート上に塗布する量を適宜増減することによって調整することができる。なお、本願において、「固定」とは基材シートの表面に付着または積層されている形態だけではなく、基材シートの内部に存在している形態をも含む。

２反応剤型接着剤を基材シートに固定して乾燥させた後における、基材シート上の２反応剤型接着剤による樹脂層（接着剤樹脂層）の厚みは、例えば、50μm～1000μm（1mm）、100μm～800μm（0.8mm）、150μm～600μm（0.5mm）、特には200μm～500μmとすることができる。また、基材シートの厚みが、例えば15μm～500μm（0.5mm）または20μm～300μmである場合に、接着剤樹脂層の厚みは、基材シートの厚みの0.5～20倍、0.8～１０倍、１～５倍などとすることができる。このような接着剤樹脂層の厚みは、基材シートに２反応剤型接着剤を固定する際の、２反応剤型接着剤の粉末の塗布量に対応する。

このようなシート状組織接着補強材（接着シート）の製造時における、２反応剤型接着剤の塗布量（乾燥重量基準）は、例えば30～500ｍｇ/ｃｍ²、40～400ｍｇ/ｃｍ²、50～300ｍｇ/ｃｍ²または60～250ｍｇ/ｃｍ²とすることができ、特には、70～200ｍｇ/ｃｍ²、80～200ｍｇ/ｃｍ²または約100～150ｍｇ/ｃｍ²とすることができる。２反応剤型接着剤による多孔質層の厚み、または単位面積あたりの質量は、過度に大きいと、シート状組織接着補強材の柔軟性が低下し、過度に小さいと、接着力や、漏れ防止のための封止が不十分となるおそれがある。なお、基材シート上の２反応剤型接着剤による多孔質層は、薄い方が柔軟性に優れるため創傷部位との密着性がよい。しかしながら、上記の接着力や封止性の他にも、２反応剤型接着剤を基材シートに塗布する操作性が、２反応剤型接着剤の塗布量、並びに、基材シートの性状や物性によって変化する。そのため、これらを総合的に勘案して、好適に２反応剤型接着剤の塗布量を調整することができる。

好ましい実施形態において、シート状組織接着補強材（接着シート）及びこのための基材シートは、一平面に沿って延びる平坦な形状をなし、所定のサイズのシートを重ねた形態、または、ロール状に巻いた形態の製品としうる。しかし、予め、適用する創傷部位や患部の形状に合わせて、湾曲した形状に形成することもできる。すなわち、一方向にのみ湾曲して断面が円弧状をなす形状とすることも、球面の一部をなすような湾曲カップ状とすることもできる。また、場合によっては、糸状、ロッド状、袋状、パイプ状などの形状とすることができる。

エタノールを用いて、基材シートに２反応剤型接着剤の粉末を固定するためには、好ましくは、エタノールの含水率を、3％以下、2.5％以下、2％以下、2％未満、1.5％以下、1.5％未満、1％以下または１％未満、特には、0.9％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下または0.5％以下とする。また、エタノールの含水率を、例えば、0.1％以上、0.2％以上、0.3％以上または0.4％以上とする。このように、エタノールの含水率を、0.2～2％、0.3～1.5％または0.3～1％、特には0.3～0.8％とすることができる。エタノールの含水率が上記の上限値よりも高くなるにつれて、２反応剤型接着剤の混合粉末（アルデヒド化デキストランの粉末、及び無水コハク酸ポリリジンの粉末）を、基材シートに均一に固定するのが難しくなっていく。特には、２反応剤型接着剤の混合粉末が分散されにくくなり、一部或いは全体が塊を形成することがある。

２反応剤型接着剤の粉末を基材シートに固定するための溶媒（分散媒）として、エタノールを使用するのが特に好ましい。0.1％～2.0％または0.2％～1.5％、特には0.2％～1.0％といった含水率を有する低含水率エタノールを使用するのが、２反応剤型接着剤の混合粉末を基材シートに良好に固定することができるからである。また、エタノールを使用すると、シート状組織補強材を人体に使用するにあたり、溶媒の回収・除去や乾燥の後にわずかに残留する溶媒に起因する毒性などの問題が、なくなるか、または、大幅に低減されるからである。

しかし、エタノール以外にも、親水性の有機溶媒であって、揮発性で低毒性であるならば使用可能である。特には、水に自由に混和（任意の割合で均一な溶液を形成）することができ、沸点が１００℃以下であるものを用いることができる。このような有機溶媒としては、アセトン、1-プロパノール、及び、2-プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができる。これらの、エタノール以外の親水性有機溶媒を用いる場合、含水率は、上記のエタノールの含水率の好ましい範囲に準じて設定することができる。但し、有機溶媒の親水性の度合いに合わせて調整し、特には、後で説明するように、部分カルボキシル化ポリ-Ｌ-リジンを可塑化または部分的に溶解させる度合いが、エタノールを用いる場合と同程度となるように、含水率の上限値及び下限値などを調整することができる。例えば、アセトンを用いる場合、含水率を１～３％または１～２％とすることができる。

また、例えば、エタノール、アセトン、1-プロパノール、2-プロパノール、及び、その他の親水性有機溶媒との混合溶媒を用いることもできる。例えば、エタノールに、2-プロパノールを２～３５体積％となるように添加したものを、エタノールについての上述した含水率範囲内として用いることができる。

シート状の組織接着補強材（接着シート）を作成する際に、薬学的に許容される添加剤を添加してもよい。特には、２反応剤型接着剤の粉末を基材シートに固定するにあたり、エタノールなどの親水性有機溶媒に、予め添加剤を溶解または分散させておいたものを用いることができる。添加剤としては、アミノ酸、糖類、脂肪酸、塩類、糖アルコール及び界面活性剤などが挙げられる。これらの添加剤の一つ以上を適宜に２反応剤型接着剤に組み合わせることで、シート状の組織接着補強材を使用する際における、水分を吸い込んで生成する含水ゲル或いは基材シートの溶解性や柔軟性、ゲル化の速度、組織接着補強材と生体組織との接着力を変化させることが可能となる。

添加剤は、エタノールなどに溶解または分散した状態から、エタノールなどの蒸発に伴い、基材シートの表面、及び、２反応剤型接着剤による多孔質層の表面などに付着することとなる。また、２反応剤型接着剤の固定が、２反応剤型接着剤の粉末の一部、特には変性ポリ-L-リジンの粉末の表層部が部分的に溶解することで生じていると考えられることから、添加剤は、このように一旦溶解してから固まった部分の中にも取り込まれると考えられる。シート状組織接着補強材の使用時には、水分を取り込んで形成された含水ゲルの内部に、添加剤の大部分がトラップされると考えられる。

上記の添加剤に代えて、または上記の添加剤とともに、薬理成分を添加してもよい。薬理成分としては、抗生剤、抗炎症剤、血行改善剤、ステロイド剤、酵素阻害剤、サイトカイン、ビタミン、酵素などが挙げられる。組織接着補強材が薬理成分を含有することによって、薬理成分の徐放を目的とするドラッグデリバリーシステムの一種として利用することもできる。すなわち、含水ゲルから、薬理成分が徐々に放出されるようにして用いることができる。

シート状組織接着補強材（接着シート）を製造するための、基材シートへの２反応剤型接着剤の塗布・固定は、例えば、次の(i)～(iv)のいずれかによって行うことができる。

(i)基材シートへの分散液の吐出
２反応剤型接着剤の粉末を、上記の低含水率エタノール中に強制的に分散させる。そして、得られた比較的不安定な分散液（懸濁液）を、基材シートへと、特にはその上方から、噴霧、滴下または落下させるか、または、他の方法により吐出することで、塗布する。

この際、例えば、平均粒径20～80μｍの２反応剤型接着剤の粉末１重量部を、低含水率エタノール８～１５重量部中に加えて、小型の攪拌機構により攪拌させることで均一に分散させつつ、基材シート上へと吐出させて塗布することができる。例えば、液溜り部に攪拌機構を備えたスリットコーターやカーテンコーター、または、スプレーコーターを用いることができる。スプレーコーターには、圧縮気体により噴霧を行うエアスプレー方式のものを使用でき、例えば、塗料攪拌装置付スプレーガン（例えば、アネスト岩田(株）の「アジテータースプレーガン」)を用いることもできる。静電スプレー方式や超音波方式のスプレーコーターを用いることもできる。また、場合によっては、シリンジ式のディスペンサーを用いることもできる。

簡易な実験のためには、分注ピペットなどのディスペンサーを用いて、適宜、振動モータや超音波などで攪拌しつつ、塗布を行うことができる。なお、ここでの攪拌機構には、携帯電話用などに用いられているコイン型の振動モータ（例えば、日本電産コパル電子(株)のφ11mmのDC振動モータ）や、スティック型（ペン型）の超音波ウォッシャー（例えば、シャープ(株)のUW-A1シリーズと同等のもの）などを用いることができる。

なお、後述のようにエタノールに生分解性ポリマーを添加するならば、エタノールからなる分散媒の粘度を増大させることで、２反応剤型接着剤の粉末を安定に保持するための、増粘安定化を行うことも可能である。

(ii)分散液の層への基材シートの突き当て
上記(i)と同様の分散液を、面上にひろげておき、このようにして形成された分散液の層に、基材シートを突き当てることで塗布を行うことができる。分散液を広げておく面は、平坦な面、または、ローラー面などの曲面でありうる。また、適宜、シリコーン樹脂やフッ素樹脂で、金属面をライニングすることで、非接着性の面としておくことができる。

面上に分散液を均一に広げておくためには、上記(i)と同様のコーターやディスペンサーを用いることができる。すなわち、液溜り部に攪拌機構を備えたスリットコーター、カーテンコーター、スプレーコーター、ディスペンサーなどを用いることができる。また、ローラー面に塗布した後で基材シートに転写するようにする、ダイレクトグラビアコータなどのロールコーターを用いることもできる。

一の実施形態において、上記(i)と同様の分散液を、非接着性の平坦な面に載せて、均一な厚みとなるように広げておき、この上に基材シートを被せる。例えば、シリコーン樹脂やフッ素樹脂でライニングした、水平で平坦な金属板、またはバットやトレーの底面上に、上記(i)の分散液を、攪拌機構を備えたカーテンコーターやディスペンサーなどにより均一に塗り広げる。そして、この後、分散液の層の上に、基材シートを被せるようにして載せ置く。そして、このまま、エタノールの除去の工程を行ってから、基材シート及びこの一面側に形成された接着剤樹脂層を、ライニングなどによる非接着性の表面から引き剥がすことができる。この際、乾燥が完了する前に、接着剤樹脂層が形成された基材シートを、引き剥がすこともできる。また、例えば、シリコーン樹脂などでライニングしたドラムの表面に、基材シートを固定しておき、上記(i)の分散液を塗布した面に、順次、突き当てるようにすることもできる。この際、例えば、ゴムローラーを塗布ローラーとして、基材シートを取り付けたドラムと接触させることも考えられる。

(iii)基材シートへの粉末塗布後に分散媒を供給
２反応剤型接着剤の混合粉末のみを、基材シートに噴霧などにより塗布しておき、その後、この上にエタノールを、噴霧や滴下などにより供給する。

この際、エタノールの噴霧のためには、例えば、通常のスプレーボトルを用いることもできる。また、定量吐出バルブ機構とスプレーガンを一体化したニードルスプレーガン（トミタエンジニアリング(株)）を用いることもできる。また、基材シートにエタノールを塗布するか、もしくは染み込ますためには、噴霧や滴下に限らず、例えば、エタノールを染みこませたスポンジ面やスポンジローラーを、基材シートに突き当てるという方式でも可能である。さらには、塗布後の基材シートを、エタノールを入れて薄く広げた層の上に載せ置くことで、基材シート中にエタノールを染み込ませるという方式でも可能である。

(iv)分散媒の供給後に粉末塗布
エタノールを浸み込ませておいた基材シートに、２反応剤型接着剤の粉末のみを噴霧する。

エタノールを浸み込ませておくためには、例えば、基材シートをエタノールに浸漬するか、または、上記のニードルスプレーガンやスプレーコーターなどで、エタノールを基材シート上に均一に染み込ましておくことができる。

上記(i)～(iv)のようにして基材シートに２反応剤型接着剤を塗布・固定する際、特には、上記(i)のように２反応剤型接着剤の粉末を、エタノール中に分散させて噴霧する際、エタノール中に、予め、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)といったエタノールに可溶の生分解性ポリマーを添加しておくこともできる。このような生分解性ポリマーを、２反応剤型接着剤の重量を基準として、例えば５～３０％添加することにより、乾燥後のシート状組織接着補強材における２反応剤型接着剤の層に、柔軟性や強靭さを付与することができる。

ここで用いる生分解性ポリマーは、分散媒に完全に溶解せずとも、均一に分散するのであれば使用することができる。また、分散媒に溶解または均一に分散させておいてから、混合粉末と引き合わせる方式に限らず、混合粉末中に、粉末の形態で混合させておくこともできる。

接着シートを止血のために使用する場合などに、上述した生分解性ポリマーの添加と同様の種々の方式にて、血液凝固促進剤を添加して、接着剤樹脂層などの中に含有されるようにすることができる。具体的には、トロンボプラスチン様作用によって止血作用をもたらすトロンビンや、ヘビ毒から作られた酵素止血薬であるヘモコアグラーゼなどの凝固誘発剤の乾燥調製物を添加することができる。トロンビンなどの凝固誘発剤の添加量は、例えば、100mm × 50mmの基材シートに200～5000単位（ＩＵ）または500～3000単位（ＩＵ）、すなわち、１平方センチメートルあたりに４～１００単位（ＩＵ）または１０～６０単位（ＩＵ）とすることができる。血液凝固促進剤には、場合により、トラネキサム酸やアドレナリン、またはその誘導体を用いることもできる。

上記(i)～(iv)のようにして基材シートに２反応剤型接着剤を塗布・固定する際に添加する生体分解性ポリマーとしては、各種の生体由来のポリマーを他の好ましい類型として挙げることができる。このような生体由来のポリマーとしては、コラーゲン、及び、ゼラチンなどのコラーゲン誘導体が、接着剤樹脂層の亀裂などを防止する上で、特に好ましい。しかし、場合により、セリシン，カゼイン，フィブリンなどの生体由来ペプチドを用いることでき、また、上述の基材シートの形成に使用可能な生体分解性ポリマーを単独で、または、れらの組み合わせ、または、コラーゲンなどとの組み合わせで用いることができる。これらは、上述した生分解性ポリマーの添加と同様の種々の方式にて添加可能であるが、特には、２反応剤型接着剤の混合粉末に、これら粉末と同程度の平均粒径を有する粉末の形態で添加して混合しておくことができる。

上記(i)～(iv)のようにして基材シートに２反応剤型接着剤を塗布・固定する際に、グリセリンなどの保湿成分（もしくは可塑剤）を添加することで、得られる接着剤樹脂層に柔軟性を付与し、湾曲時の亀裂の発生を抑えることができる。保湿成分の添加量は、２反応剤型接着剤の重量を基準として、例えば０．５～３０％または１～２５％、特には２～１５％または２～１０％とすることができる。添加可能な保湿成分としては、グリセリン以外にも、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、１，２－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、ｄｌ－ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ポリグリセリン、ヒアルロン酸ナトリウム及びトリメチルグリシンを挙げることができる。これらの保湿成分は、例えば、２反応剤型接着剤の混合粉末に混ぜ合わせることにより添加することができる。

上記(i)～(ii)のように、エタノールなどに分散させた状態で、２反応剤型接着剤の粉末を、基材シート上、または、バットやトレーの底面上などに塗布するためには、液溜め部などに攪拌機構が備えられた、スリットコーターまたはスプレーガンを用いることができる。また、この際、液の吐出部と、基材シートとの間の相対移動のために、移動ステージやベルトコンベアーを用いることもできる。

上記(iii)～(iv)の方法で固定を行うにあたり、２反応剤型接着剤の粉末を基材シート上に塗布するには、篩（ふるい）状の網目や複数の小孔から粉末を均一に落下させる粉掛け機、または、スプレーガン式やディスペンサー式の粉末吐出装置などを用いることができ、この際、適宜、粉体塗装に用いられているような静電塗装法や流動浸漬法を用いることができる。例えば、粉末の貯留槽の底部に、多数の小孔が細長い領域に配列された粉末吐出部を設けておき、粉末を落下させつつ、基材シートを、この細長い粉末吐出部を横切る方向に移動させて行くことで、塗装を行うことができる。この際、スクリーン部と、基材シートが載せられた基台面との間に高電圧を掛けて、一種の静電塗装法により、均一に散布することができる。例えばベルク工業有限会社の「静電スクリーン粉掛機」のような機構の装置を用いることができる。また、例えば、乾燥圧縮空気により粉末を流動状態とさせた中に、基材シートを入れること（流動浸漬法）によって、粉末の塗布を行うこともできる。さらには、上記(iii)の場合などに、基材シート上に粉末の塊を置いてから、ゴムローラーやゴムブレード（ゴムワイパー）などを用い、均一に押し広げることで塗布することも可能である。

一の好ましい実施形態において、サーボモーターなどによる左右方向の水平駆動機構（Ｘ軸駆動機構）と、サーボモーターなどによる前後方向の水平駆動機構（Ｙ軸駆動機構）とにより、粉末吐出部と、基材シートとの間で、前後左右に、連続的にまたは順次に相対移動させつつ塗布を行うことができる。すなわち、Ｘ軸駆動機構と、Ｙ軸駆動機構とによるＸＹ軸駆動機構の駆動端に、粉末吐出部を取り付けた、ＸＹ軸-吐出部駆動装置（例えば、NCC株式会社の「卓上塗板塗装機」のもの）を用いることができる。また、ＸＹ軸駆動機構を備えたＸＹテーブルに基材シートを置いて、位置が固定された粉末吐出部により塗布することもできる。

一の好ましい実施形態において、特開2016-063919の医療用粉体スプレー装置、または、特願2017-222915に記載の粉体スプレー装置を用いることができる。これらの粉体スプレー装置は、圧縮空気を用いて噴霧するピストル状のスプレーガンであり、施術者が片手で、持ち上げて噴霧のオンオフ操作ができるようになっている。これらの粉体スプレー装置を用いて２反応剤型接着剤の粉末を基材シート上に塗布するには、上記のＸＹ軸-吐出部駆動装置、ＸＹテーブル、または、ロボットアームや、その他の移動ステージまたはベルトコンベアーなどを用いることができる。また、この際に、静電塗装法などを用いることもできる。

特願2017-222915に記載の粉体スプレー装置は、図９に示すように、(i)粉体容器７を上部に取り付け可能か、または粉体容器７と一体に設けられる漏斗（ろうと）部材１と、(ii)漏斗部材１の下端の排出口１１Ｂに第1の開口３１が接続される第１の三方継ぎ手３と、第１の三方継ぎ手３の第2及び第3の開口３２，３３にそれぞれ接続される気流供給管４１及び送出管４２と、これらの部材を収納するハウジング５と、(iii)漏斗部材１に備え付けられる振動モータ２と、(iv)気流供給管４１から分岐して、第１の三方継ぎ手３を介さずに送出管４２に合流するように接続するバイパス気流管８と、(v)圧縮気体が、気流供給管４１、第１の三方継ぎ手３の内部、及び送出管４２を通る塗布用の流路４Ａを通って送られるとともに、バイパス気流管８をも通って送られる塗布状態（オン状態）と、圧縮気体がバイパス気流管８のみを通って送られる待機状態（オフ状態）との間で、切り換えを行うためのオンオフ機構６と、を備えており、漏斗部材（１）及び第１の三方継ぎ手（３）は、ハウジング（５）に対して揺動及び振れ動きが可能に取り付けられている。

より一般的には、粉体スプレー装置は、粉末を貯留することができる貯留部と、噴霧塗布の開始前から貯留部に振動を加えることができる振動機構と、塗布状態（オン状態）にて、貯留部から落下する粉末を圧縮気体とともにノズルへと送出する送出経路と、待機状態（オフ状態）にて、貯留部から粉末が落下する箇所を通らずに、圧縮気体をノズルへと送出するバイパス経路とを備える。このような粉体スプレー装置は、本願で特に用いる２反応剤型接着剤のように、上述のようにランダムな形状を有する粉末であって、吸湿して送出経路を閉塞しやすいものを塗布するのに適している。

上記(i)～(iv)のようにして基材シートに２反応剤型接着剤を塗布した後、例えば、静置した状態にて、窒素雰囲気下に適宜加熱しつつ、エタノールの回収、及び、乾燥を行うことができる。例えば、「棚型粉体乾燥システム SDP-500」（(株)創造化学研究所）を用いることができる。また、定温加熱機構を備えた減圧乾燥機（真空乾燥機）を用いることもできる。

乾燥後、得られたシート状組織接着補強材（接着シート）について、紫外線（UV）、電子線、エチレンオキシドガス（EOG）またはγ線により滅菌を行うことができる。また、吸湿などを避けるために、デシケーター中に保存するか、または、アルミ層を有するラミネートフィルムなどからなる袋中に、密封して保存することができる。

以上に説明した、塗布・固定の方法では、２反応剤型接着剤の混合粉末を用いるとして説明したが、例えば、上記の粉体スプレー装置を用いて、基材シートの上に、変性ポリ-L-リジン（SAPL）の粉末を噴霧塗布してから、無水エタノールをまんべんなく噴霧し、この上にアルデヒド化デキストラン（AD）の粉末を噴霧塗布し、さらに、無水エタノールを噴霧するといったことも可能である。

以上のようにして得られるシート状組織接着補強材（接着シート）は、生体分解性及び連通多孔構造を有する基材シートと、この上に固定されて形成された接着剤樹脂層とを含む。この接着剤樹脂層は、アルデヒド化グリカンを含む第１反応剤と、部分カルボキシル化ポリリジンを含む第２反応剤とを含むものであり、第１反応剤の粉末に由来する粒状構造（グレーン）と、第２反応剤に由来する連結層とを含む。この連結層は、第１反応剤の粒状構造（グレーン）を相互に連結するとともに基材シートに固定している。

参考例１についての図１４の上段の写真に示すように、接着シートを製造する際、第２反応剤（部分カルボキシル化ポリリジン）が、無水エタノールなどの分散媒中にて、分散媒を吸って膨潤することで、粘着性で多少の流動性を有するペースト状となり、第１反応剤（アルデヒド化グリカン）の粉末を連結するものと考えられる。また、同時に基材シートに粘着し、部分的に、基材シートの多数の連通孔の中に入り込むものと考えられる。この後に、分散媒を除去する乾燥の操作により、基材シート上に形成される接着際樹脂層は、主として、連通孔の中に入り込んだ部分によるアンカー効果（機械的結合）でもって基材シートに接着されていると推測される。一方、第１反応剤（アルデヒド化グリカン）の粉末は、分散媒中でも、ほぼ形状を維持することで、接着際樹脂層中の粒状構造（グレーン）を形成すると考えられる。

以下、実施例により本発明の実施の形態を説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

＜実施例１＞綿線維状コラーゲンシートへの分散液塗布による接着シートの作製
ガラス容器（10mLバイアル瓶）に入れた「無水」エタノール(エタノール99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.9ｇ）に対して、２反応剤型接着剤の混合粉末0.5gを加え、栓をして、超音波撹拌により均一に分散させた。基材シートには、コラーゲンスポンジシートを用いた。具体的には、株式会社高研の「インテグラン」「プレスシート」（100mm × 50mm、0.2ｇの綿線維状コラーゲンシート）をそのまま用いた。

株式会社高研の「インテグラン」のウェブページには次のように記載されている。「インテグランは高純度に精製された仔牛真皮由来のアテロコラーゲン（蛋白質分解酵素により可溶化し、主要な抗原性発現部位を除去したコラーゲン）を綿線維状に紡糸加工し、ポリエポキシ化合物で化学架橋処理した吸収性局所止血材です。」

上記のように均一に分散させた後、ガラス容器の栓を開けた。そして、超音波撹拌を適宜続けつつ、ガラス容器中の分散液を、分注ピペット（エムエス機器(株)のピペットマンP000、１ｍＬチップ装着）により、順次吸いだして、基材シートの全面に塗布した。塗布は、上記の5cmx5cmの基材シート上に、まんべんなく滴下するようにして行った。この後、室温下で大気中に一晩放置することで乾燥させてから、真空乾燥機中に入れて、室温で減圧排気することで、エタノールを完全に除去するとともに、全体の含水率が0.2％以下になるようにした。このようにして、凹凸を有する接着剤樹脂層の厚みが、約300～350μm（0.3～0.35mm）になるようにした。なお、この場合、基材シートの周縁部を除き、1平方センチあたりの接着剤樹脂の量は、15～20mgと考えられた。この量は、２反応剤型接着剤の粉末をそのまま用いる場合の最適な１回の塗布量20～30ｍｇ/ｃｍ²の下限値にほぼ等しいか、これより少し少ないものであった。

上記のようにして得られた接着シート（「LYDEXシート・コラーゲン基材」）は、多少ゴワゴワしたが、ロール状に巻くことで、径が約２ｃｍの巻物状にすることができた。また、この際、接着剤樹脂が脱落することや、接着剤樹脂層に亀裂が生じることもなかった。接着シートの表面及び切断面を、高性能の実体顕微鏡（(株)KEYENCE製「デジタルマイクロスコープVHX-5000」システム）で観察したところ、２反応剤型接着剤の混合粉末、特には、アルデヒド化デキストランの粉末に由来すると考えられる微小な突起構造が、全面にわたって、びっしりと形成されていた。

なお、２反応剤型接着剤の混合粉末は、グルコース・ユニットあたりのアルデヒド基の導入量が0.28であるアルデヒド化デキストランの粉末と、遊離アミノ基の残存率が89.5％の無水コハク酸添加ポリリジンの粉末とを４／１の重量比率で混合した混合接着剤粉末（平均粒径が８０μｍ）である。これらの製造方法は、国際公開WO2008/066182（特許文献１）に記載したとおりである。すなわち、次の１）～３）ようにして得られたものである。

１）粉末状アルデヒド化デキストラン（第１反応剤；ＡＤ）の調製
分子量70,000のデキストラン（名糖産業株式会社Meito Sangyo Co.,Ltd.、「デキストラン７０」）４００ｇをイオン交換水１６００ｍｌに溶解させ、５０ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（分子量２１３．８９）をイオン交換水８００ｍｌに溶解させた後添加し、５０℃水浴中で３時間撹拌させながら反応させた。そして、反応後の溶液を透析した後、０．４５μｍフィルターでろ過後、乾燥させた。さらに、小型粉砕器（ワンダークラッシュミルＤ３Ｖ-１０、大阪ケミカル株式会社）を用いて粉砕処理を行い、粉末状のアルデヒド化デキストラン（２．５／２０）を得た。なお、（２．５／２０）は、アルデヒド化デキストランを構成する（過ヨウ素酸ナトリウム／デキストラン７０）の仕込み比率を示す。得られたアルデヒド化デキストランにおける、糖残基量（モル）あたりのアルデヒド基の導入量は０．２８であった。なお、アルデヒド基の導入量の測定は酸化還元滴定法により行った。具体的には、０．０５ｍｏｌ／ｌのヨウ素水溶液２０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌのアルデヒド化デキストラン水溶液１０ｍｌ及び１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを、１００ｍｌマイヤーフラスコに入れ２５℃で１５分間撹拌した。そして、６ｖ／ｖ％硫酸水溶液１５ｍｌを添加し、０．１ｍｏｌ／ｌのチオ硫酸ナトリウム水溶液にて滴定した。終点は反応系が無色透明化した時点とし、指示薬はでんぷん水溶液とした。粉末の粒度を、実体顕微鏡を用いて評価したところ、平均粒径が９０μｍであった。さらに、電子顕微鏡により表面性状を観察した結果、多孔体をなしていた。平均アスペクト比（短軸に対する長軸の比）は約１．６であった。

得られたアルデヒド化デキストランにおける、糖残基量（モル）あたりのアルデヒド基の導入量は０．２８であった。なお、アルデヒド基の導入量の測定は酸化還元滴定法により行った。具体的には、０．０５ｍｏｌ／ｌのヨウ素水溶液２０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌのアルデヒド化デキストラン水溶液１０ｍｌ及び１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを、１００ｍｌマイヤーフラスコに入れ２５℃で１５分間撹拌した。そして、６ｖ／ｖ％硫酸水溶液１５ｍｌを添加し、０．１ｍｏｌ／ｌのチオ硫酸ナトリウム水溶液にて滴定した。終点は反応系が無色透明化した時点とし、指示薬はでんぷん水溶液とした。

２）無水コハク酸処理ポリリジン（第２反応剤；ＳＡＰＬ）の調製
２５重量％のε-ポリリジン水溶液（分子量4,000、チッソ株式会社）４００ｇに無水コハク酸（ナカライテスク）１０ｇを加え、５０℃で１時間反応させた。反応後の溶液を０．４５μｍフィルターでろ過後、乾燥させた。さらに、小型粉砕器（ワンダークラッシュミルＤ３Ｖ-１０、大阪ケミカル株式会社）を用いて粉砕処理を行い、粉末状の無水コハク酸処理ポリリジンを得た。得られた無水コハク酸処理ポリリジンについて、遊離アミノ基（ペプチド結合の形成に関与しない側鎖及び末端のアミノ基）の残存率を求めたところ、89.5％であった。この測定のためには、水に溶かした後、ニンヒドリン溶液およびｐＨ５．５の酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加え、３分間沸騰水浴中で加熱した後、急冷し試料溶液とした。そして、日本薬局方の紫外可視吸光度測定法により試験を行い、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料溶液中のアミノ基含量を求めた。得られた粉末状の無水コハク酸処理ポリリジンは、上記のアルデヒド化デキストランの場合と同様に実体顕微鏡を用いて評価したところ、ほぼ同様のランダムな形状の多孔体であった。また、平均粒径が８０μｍであった。平均アスペクト比は約１．７であった。

得られた無水コハク酸処理ポリリジンについて、残存アミノ基率を定量したところ、84.7％であった。なお、残存アミノ基率の定量は、次のようにして行った。まず、粉末状の無水コハク酸処理ポリリジンを乾燥し、水に溶かした。この後、ニンヒドリン溶液およびｐＨ５．５の酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加え、３分間沸騰水浴中で加熱した後、急冷し試料溶液とした。そして、日本薬局方 紫外可視吸光度測定法により試験を行い、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料溶液中のアミノ基含量を求めた。

３）混合接着剤粉末
上記の粉末状のアルデヒド化デキストランと粉末状の無水コハク酸処理ポリリジンを４／１の重量比率で混合することで、混合接着剤粉末（平均粒径が８０μｍ）は、アルデヒド基とアミノ基とのモル比がほぼ１になるようにした。得られた混合接着剤粉末を示す。混合接着剤粉末のかさ密度は、４２０ｍｇ／ｃｍ^３であった。なお、この混合接着剤粉末は、含水率を０．５～１．０％に保持するように密閉保存した。本願において、この混合接着剤粉末を、適宜「ライデックス（登録商標）」とも呼ぶこととする。なお、特に記載しない限り、上記の反応仕込み比及び混合比のものを用いた。すなわち、ε-ポリリジン１００ｇに無水コハク酸１０ｇを反応させた無水コハク酸処理ポリリジンを用いるとともに、デキストランをアルデヒド化する際の過ヨウ素酸ナトリウム／デキストラン７０の仕込み重量比率を２．５／２０とし、アルデヒド化デキストラン（ＡＤ）と無水コハク酸処理ポリリジン（ＳＡＰＬ）とを４／１の重量比率で混合した、２反応剤型接着剤の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）を用いた。

＜実施例２＞分散媒の含水率の影響
上記の２反応剤型接着剤の混合粉末を、含水率の異なるエタノール中に分散させて、分散の様子を観察した。すなわち、分散媒のエタノールとして、含水率が、それぞれ、0.5％以下、１％、２％、５％、及び１０％に調整されたもの（すなわち、５段階の含水率の分散媒）を、6mLずつ準備した。そして、上記のガラス容器（10mLバイアル瓶）中で、上記実施例１で用いたのと同一の２反応剤型接着剤の混合粉末末0.5gを加え、同様に超音波で攪拌した後、蓋付きガラスシャーレ（φ32×20mm）に入れて観察した。この様子を、図１の一組の写真により、まとめて示す。

なお、「0.5％以下」は、市販の無水エタノール（エタノール99.5vol%以上）を、そのまま用いたものである。この実験の後に、同種の無水エタノール製品における含水率が、約0.3～0.5％であることを確かめた。また、１％～１０％の含水率の含水エタノールは、市販の無水エタノールの含水率を0.4％と仮定して、計算量の水を足したものである。

図１に示すように、含水率が５％以上では、２反応剤型接着剤の粉末を含む相が凝集してしまうため、２反応剤型接着剤を、分散媒（含水エタノール）中の全体にわたって広がるように分散させることができなかった。また、含水率２％では、分散媒中の全体にわたって広がるようにすることができたが、すぐに細かく相分離してしまい、均一に分散させることが困難であった。一方、含水率１％では、ほぼ均一に分散させることができたが、図１中に示す、約１０秒放置した後の状態では、部分的に相分離が見られた。これに対し、含水率が0.3～0.5％と考えられる「無水エタノール」を用いた場合、攪拌後に放置しても、約１０秒までは、肉眼観察で相分離が見られなかった。

図１の結果から、エタノールの含水率は、少なくとも２％以下または１％以下とする必要があり、好ましくは１％以下であり、さらに好ましくは、0.5％前後であろうことが知られた。含水率が大きく影響する機構及び原因について、後述のように、実験によりさらに検討を行った。

＜実施例３＞止血効果の評価
綿線維状コラーゲンシート（株式会社高研の「インテグラン」「プレスシート」100mm × 50mm）を基材シートとする接着シート（「LYDEXシート・コラーゲン基材」）を用いて、切開した組織に対する止血効果を評価した。

＜実施例３－１＞実施例１の接着シート
実施例１で得られた接着シートを用いて、下記のようにして、止血効果を評価した。

日本白色種雄ウサギの上腹部を正中切開して肝臓を露出する。肝臓の外側左葉を長さ約4cm程度、部分切除し、予め重量を測定したガーゼで軽く圧迫止血した。このようにして、適用前の出血量を求めて、記録しておくとともに、湧出性出血を確認した。この後、実施例１で得た止血シート（「LYDEXシート・コラーゲン基材」）と、市販の止血シートである「タコシール」(登録商標、CSLベーリング株式会社)とを、それぞれ用いて止血処置を行った。

止血処置は、圧迫止血の要領で、止血シートを切開部に軽く圧迫して接着させることにより行った。但し、実施例１の止血シートによる止血処置の際には、必要に応じて、少量の生理食塩液を吹き付けた。すなわち、一部に含水ゲルとならずに粉末のままに残っている２反応剤型接着剤が認められた場合、生理食塩液を噴霧してゲル化を完成させた。

出血量については、漏出した血液をガーゼで吸い取り、適用前後の重量の差から、下記の式のとおりに算出した。結果を下記の表１～２に示す。
止血率(％)=(適用前-適用後)/適用前×100

＜表１＞実施例１の接着シート

＜表２＞市販の止血シート（「タコシール」）

上記の表１～２の結果から知られるように、本願実施例１の接着シート（「LYDEXシート・コラーゲン基材」）を用いた場合と、市販の典型的な止血シートを用いた場合とで、止血率の平均値に、有意な差が見られなかった。但し、本願実施例１の「試行回数５」で、止血率が極端に低い値となった。これは、手作業で止血シートを作成する際に、接着剤樹脂層に極端に薄い箇所があったためであろうと考えられた。すなわち、攪拌機能付きスリットコーターを用いるなどの方法により止血シートを作成する工程について改良するか、または、検査工程により、樹脂層が薄い箇所などの欠陥を有するものを排除するならば、非常に良好な止血性能が得られるものと推測された。また、止血操作の際のエラーなどの要因をも考えて、最も低い値のものを除外した場合、本願実施例１の接着シートは、市販の止血シートより優れているのではないかと思われた。

＜実施例３－２＞粉末のディスペンサー塗布による接着シート
実施例１で用いたと同一の基材シート（株式会社高研の「インテグラン」「プレスシート」100mm×50mm）に、「無水」エタノール(エタノール99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.9ｇ）を、噴霧式のディスペンサーを用いて、全体に均一に塗布した。この直後に、実施例１で用いたと同一の２反応剤型接着剤の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）0.5gを、基材シートの全面に均一に塗布した。そして、この後、実施例１と同様に乾燥操作を行うことで、接着シートを得た。

エタノール及び混合粉末の塗布には、ＸＹ軸駆動機構の駆動端に、噴霧式のディスペンサーが取り付けられた塗布装置（NCC株式会社の「卓上塗板塗装機」）を用いた。すなわち、噴霧式のディスペンサーを、左右方向に振りながら順次前後方向に移動させるスキャン（走査）動作により、全面に均一に塗布した。

上記実施例３－１と同一の方法・手順により、止血率を評価したところ、90％以上の止血率を得た。

＜実施例３－３＞トロンビン含有接着シート
実施例１で用いたと同一の２反応剤型接着剤の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）0.5gに、２０００ＩＵのトロンビンを含有する乾燥トロンビン粉末を加えて均一に混合しておいた。そして、このトロンビン添加混合粉末を用いた他は、上記実施例３－２と全く同様にして、接着シートを作製した。

上記実施例３－１～３－２と同一の方法・手順により、止血率を評価したところ、95％以上の止血率が得られた。

＜実施例４＞メッシュシートを基材シートとする接着シート
株式会社ビーエムジーのポリ-L-乳酸（PLLA）（GPC-光散乱法による重量平均分子量M_Wが200,000～280,000、DSC法による融点が180～195℃）を用いて、グンゼ株式会社により製造（紡糸及び編成）された２種類のメッシュシートを、基材シートとした。

＜実施例４－１＞
第１の種類のメッシュシート（「PLLAメッシュ密」）は、マルチフィラメント糸（167dtx×24）を、トリコット編（経編、デンビー編み）により、編目による各開口（網目）の径が、約0.8ｍｍになるようにした一重編地である。第２の種類のメッシュシート（「PLLAメッシュ粗」）は、マルチフィラメント糸（280dtx×12）を、トリコット編（経編、デンビー編み）により、編目による各開口の径が、約1.5～2ｍｍになるようにした一重編地である。

上記の第１の種類のメッシュシート（「PLLAメッシュ密」）を用い、図４の一組の写真に示す手順にて、接着シート（「LYDEXシート・PLLAメッシュ密」）を作製した。まず、上記の２種類のメッシュシートを2.5×5cmに切り出してから、二つ折りにし、左右の縁部にて、超音波シーラーにより、表側の部分と裏側の部分とを互いに融着した。一方、実施例１で用いたと同一の２反応剤型接着剤の分散液（「LYDEX２．５／２０」0.5g＋無水エタノール6mL）を調製した。そして、分散液を調整した直後に、10mLバイアル瓶から、水平に置いたフッ素樹脂のシャーレ（PTFEシャーレ；内径50mm）の底面上に載せ置くようにして移した。この際、均一な厚みで広がるように、まんべんなく塗布するようにして移した。この後、シャーレの底面上に載せられた分散液の層の上に、二つ折りのメッシュシートを、被せるようにした。そして、実施例１と全く同様に、室温で真空乾燥を行い、全体の含水率が0.2％以下になるようにした。

その結果、図４の右半の２つの写真に示すような、接着シート（「LYDEXシート・PLLAメッシュ密」）を得た。図４の右端の写真には、接着樹脂形成面（浸漬・乾燥時の上側）を示し、図４の右から２番目の写真には、基材側の面（浸漬・乾燥時の下側）を示す。これらの写真に示されるように、分散液を広げた層に基材シートを被せる方法（上述の「(ii)分散液の層への基材シートの突き当て」）によっても、一方の面に接着剤樹脂層を形成することができた。接着剤樹脂層の厚みは、実施例１と同様、約300～350μm（0.3～0.35mm）とすることができた。

但し、基材側の面（裏面）も、水分存在下では粘着性を有することとなった。これらは、図４の右端の写真から知られるように、メッシュシートの各糸条部分の全周にわたって、接着剤樹脂がコーティングされているためと考えられた。

＜実施例４－２＞
同様にして、目が粗い方のメッシュシート（「PLLAメッシュ粗」）を用いて、全く同様に、シート状組織接着補強材を製造してみた。この様子を、図４と同様の一組の写真である図５に示した。図５に示されるように、上記の図４の場合と同様に、メッシュシートの一方の面（浸漬・乾燥時の下側）に接着剤樹脂層を形成することができた。但し、接着剤樹脂層の厚みが、比較的不均一であり、ドット状に薄い部分ができてしまった。塗布方法などを改善すれば、上記実施例４－１と同様に使用可能なものが得られるだろうと考えられた。

＜実施例４－３＞
一方、(株)ビーエムジーのポリグリコール酸（PGA）（240℃，10kg荷重でのメルトフローレート(MFR)が3.0～9.0g/10min）を用いて、グンゼ株式会社により、上記の「第１の種類のメッシュシート（「PLLAメッシュ密」）と全く同様にして製造（紡糸及び編成）された第３の種類のメッシュシート（「PGAメッシュシート」）を入手した。そして、上記の「PLLAメッシュ密」と全く同様にして、接着シート（「LYDEXシート・PGAメッシュ」）を作製した。メッシュシートとしての性状は、ポリグリコール酸（PGA）を用いた場合と、ポリ-L-乳酸（PLLA）を用いた場合とで、全く同様であると考えられた。

＜実施例５＞シーラント効果
実施例１及び４－３で得た接着シートを用い、下記(1)～(4)の手順で、空気漏れに対するシーラント効果を評価した。この際、比較例として、下記表３及び「(3) シーラントの適用」の項に示した4種のものを用いた。

(1) 実験動物の用意
ウサギ（日本白色種雄ウサギ）を全身麻酔して開胸し、専用のマウスピースにより気道を確保するとともに、人工呼吸装置により呼吸を維持し、呼吸回数：15回/分、吸気圧：10cmH₂Oに設定した。

(2) 気漏モデルの作製
左肺後葉を部分切除後、デクランプし吸気圧を30cmH₂Oまで上昇させ、肺切断面に生理食塩液を滴下して気漏があることを確認した。気漏発生箇所の数が4箇所に満たない場合は、切断面に注射針(18G)を穿刺し気漏箇所が合計で4箇所となるようにして、気漏モデルを作製した。

(3) シーラントの適用
空気漏れを止めるシーラントして、本願実施例１の接着シート（「LYDEXシート・コラーゲンスポンジ」）、及び、本願実施例４－３の接着シート（「LYDEXシート・PGAメッシュ」）、並びに、各比較例のシーラントを用い、下記の手順で、切断面（患部）に適用した。

・本願実施例１及び４－３の接着シート（表３のＡ-1及びＡ-2）
3mm四方となるように細切し気漏箇所に適用して軽く圧迫して接着させた。この際、上記止血効果の確認と同様に、一部に含水ゲルとならずに粉末のままに残っている２反応剤型接着剤が認められた場合、生理食塩液を噴霧して含水ゲル化を促進させた。

・２反応剤型接着剤（LYDEX）の粉末（表３のＢ-1及びＢ-2）
２反応剤型接着剤（LYDEX）の粉末を切断面に噴霧塗布し、生理食塩液を適宜滴下することで、粉末が残らないように完全にゲル化させた。この噴霧塗布には、特願2017-222915に記載の粉体スプレー装置（本願図９）を用いた。また、接着剤樹脂の塗布量（面積あたりの質量）が、上記の実施例１及び４－３の接着シートの場合より、やや多い、25mg／cm²となるようにした。

ここで、反応剤型接着剤（LYDEX）として、試験No.Ｂ-1では、本願の他の全ての実施例で用いた上述の「LYDEX２．５／２０」を用い、試験No.Ｂ-2では、「LYDEX４．０／２０」を用いた。これは、アルデヒド化デキストランを構成する（過ヨウ素酸ナトリウム／デキストラン７０）の仕込み比率について、「２．５／２０」に代えて、「４．０／２０」とし、アルデヒド化デキストランと無水コハク酸処理ポリリジンとの重量比について、アルデヒド基とアミノ基とのモル比がほぼ１になるように調整したものである。

・フィブリン糊（表３のＢ-3）
ＫＭバイオロジクス(株)の「ボルヒール組織接着用」を、添付文書のとおりに、付属のデュアルシリンジ（「ボルヒールスプレーセット タイプ：エンドスプレー」）を用いてA液・B液の混液を切断面（患部）に塗布した。
・PGAメッシュシート＋フィブリン糊併用（表３のＢ-4）
上記実施例４－３で用いたポリグリコール酸（PGA）のメッシュシート（「PGAメッシュ」）を5ｍｍ四方に細切しておいた。そして、「ボルヒール調製器セット 擦り込みスプレー用シリンジセット」を用い、A液を切断面に塗布後、細切したPGAメッシュシートを気漏箇所に貼付してから、A液・B液の混液を切断面に塗布した。

(4) 加圧による空気漏れ試験
最大50cmH₂Oまで圧力を段階的に上昇させ、気漏の有無を確認した。気漏が認められた場合はそれ以上加圧せず、その吸気圧を気漏発生吸気圧とした。

シーラント効果の試験結果を、下記の表３にまとめて示す。

＜表３＞空気漏れに対するシーラント効果

上記表３の結果から知られるように、本願のシート状組織接着補強材（「シート状LYDEX」）は、基材シートの種類が異なっても、ほぼ同等のシーラント効果を発揮したのであり、以前に実施していた比較例の試験結果と比較するならば、２反応剤型接着剤を粉末の形態のまま用いた場合（「LYDEX（粉末）」）、並びに、フィブリン糊をそのまま用いた場合、及びメッシュシートとともに用いた場合に比べて、高いシーラント効果が認められた。

＜実施例６＞接着力評価試験
実施例４－１の接着シート（「LYDEXシート・PLLAメッシュ密」）を用い、in vitroにて接着強さを評価した。試験は、JIS K 6850接着剤－剛性被着材の引張せん断接着強さ試験方法を参考にして、試験片や試験条件を適当に変更して行った。

接着シートを貼り合わせる対象には、臓器等を想定した代替物として、株式会社ニッピの「コラーゲンケーシング」（厚み28μm、直径20mmの筒状）を縦に切り開いたものを用いた。図４の模式図に示すように、実施例４－１の接着シート、及び、「コラーゲンケーシング」を、５×２ｃｍの小片に切り出し、それらの一方の面における一端から1.25cmまでの箇所を接着部に設定し、マジックペンでマーキングしておいた。接着シートの小片と、「コラーゲンケーシング」の小片とを、接着部同士で接着させた。この際、「コラーゲンケーシング」の小片の接着部に、生理食塩液0.2～0.5mLを噴霧した後、実施例４－１の接着シートの小片の接着部に重ね合わせて押さえつけることで、貼り付けた。そして、ゲル化時間3min(圧迫時間30秒を含む)の経過後、接着シートの小片と、「コラーゲンケーシング」の小片とにおける、接着部以外のほぼ全体が、試験機の上下のチャックにより、それぞれ掴み込まれるようにした。また、引っ張り試験の際には、試験速度 （クロスヘッドの上昇速度）50 mm/min、荷重レンジ10N 1%、記録速度 200 mm/minとした。

具体的な引っ張り強さ試験手順は、以下のとおりである。

1. 「コラーゲンケーシング」の小片(2.5×5cm)の接着部分及びその近傍を、エタノールを滲み込ました科学実験用の紙ワイパー（Kimberly-Clark Corporationの「キムワイプS-200」）で拭き、30秒間放置することで乾燥させた。この後、接着部分とその他の部分との境界にマーキングを行った。
2. 「コラーゲンケーシング」の小片の接着部に、噴霧により生理食塩水をかけた。
3. 接着シート（LYDEXシート）を接着部に被せ、生理食塩水を噴霧した後、錘（おもり）を載せて圧迫した。この際の錘には、PTFEシャーレ(内径50mm）の上に水入りのバイアル瓶を重ねたもの（重さが約200g）を用いた。

4. 錘（おもり）による圧迫を開始してから30秒後に、錘を取り除いた。そして、さらに2分30秒の間、静置した。したがって、トータルのゲル化時間は、3分間である。
5. 3分間のゲル化時間経過後、マーキング位置の近傍までを、万能試験機のチャックで掴みこむようにして、万能試験機（引張・圧縮試験機）に取り付けた。この際、接着シートを上方のチャックで掴み、コラーゲンケーシングの小片を下方のチャックで掴むようにした。
6. 試験を開始する(クロスヘッドを50mm/minで上昇させる)。

また、比較例として、「コラーゲンケーシング」の小片と、実施例４－１で用いたメッシュシート（「PLLAメッシュ密」）の小片とを、フィブリン糊（ＫＭバイオロジクス(株)の「ボルヒール組織接着用」）により、接着させたものを用いた。貼り合わせる各小片の寸法及び接着部の寸法は、上記の接着シートを用いた実施例と同一とした。また、この際の具体的な引っ張り強さ試験手順は、上記の実施例の引っ張り強さ試験手順1.～6.のうち、2.～3.のみ、下記のように変更したものである。

2. 「コラーゲンケーシング」の小片の接着部に、フィブリン糊（「ボルヒール組織接着用」）約0.3mlを付属のデュアルシリンジにより塗布した。
3. 手早く、塗布後の接着部に、メッシュシート（「PLLAメッシュ密」）の小片の接着部を貼り合わせて、上記の錘（おもり；重さが約200g）載せて圧迫した。

接着強さ評価試験により得られた結果を、下記の表４～５及び図８にまとめて示す。

＜表４＞実施例４－１の接着シート（「LYDEXシート・PLLAメッシュ密」）

＜表５＞フィブリン糊＋「PLLAメッシュ密」

実施例４－１の接着シート（「LYDEXシート・PLLAメッシュ密」）と、コラーゲンケーシングとの間の接着強さは、かなり大きく、生体組織の接着や補強の目的で充分であると考えられた。引っ張りにより剥離した後、接着層としての含水ゲルは、コラーゲンケーシングにも、付着(残存)していた。すなわち、接着層破壊が行われたと考えられた。

一方、フィブリン糊及びポリ-L-乳酸（PLLA）のメッシュシートを用いた場合、引っ張りにより剥離した後、接着層としての含水ゲルは、メッシュシートの側にのみ存在し、コラーゲンケーシングの表面での付着(残存)は見られなかった。すなわち、接着層破壊が行われず、コラーゲンケーシングとの間の界面破壊のみが行われた。フィブリン糊を、単純に生体分解性のメッシュシートと組み合わせて用いても、生体組織を接着する接着シートとしては、それほど適していないのかも知れないと考えられた。

＜実施例７＞綿線維状コラーゲンシートへの粉末の噴霧塗布による接着シートの作製
基材シートとして、実施例１と同様に、株式会社高研の「インテグラン」「プレスシート」（100mm × 50mmで0.2ｇの綿線維状コラーゲン）をそのまま用いた。

実施例１及び４などで用いたと同一の２反応剤型接着剤の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）を用いた。この２反応剤型接着剤の混合粉末1.0gを、図９に示す粉体スプレー装置（スプレーガン）を用いて、上記の基材シート（5×10cm）の全体に、まんべんなく噴霧した。なお、噴霧した混合粉末のうち少量の部分（約５％）は、散逸して、基材シート上に載らなかった。混合樹脂粉末の塗布の後、薬剤投与用の小型スプレーを用いて、ミスト状にした無水エタノールを、混合粉末の上からスプレーした。この後、一晩室温下で乾燥させてから、室温にて真空乾燥機に6時間かけ、取り出した。

乾燥器に入れる前および、乾燥機内にて、得られた接着シートは、ある程度平坦であったが、 真空状態から取り出したときに、急激に吸湿することにより、激しい反りが生じた。この状態を、図１０の写真の上部に示す。反りが生じた接着シートを、ドライボックスに入れておいたところ、平坦に戻っていた。この接着シートを、約１ｃｍの径となるように、巻物状に、長辺の方向に巻いてみたところ、メキメキと音はするが、巻くことができた。このように巻いてから開いて伸ばした際の様子を、図１１の写真に示す。図１１中に示すように、２反応剤型接着剤の混合粉末が、少し、剥がれて落ちていた。

＜実施例８＞ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）の添加
実施例７と同様の実験により、２反応剤型接着剤からなる接着剤樹脂層を形成する際に、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）を添加することで、接着剤樹脂層に柔軟性または靭性（じんせい）を付与することについて調べた。

このために、２反応剤型接着剤の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）1.0gに代えて、この混合粉末0.8gと、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）0.2ｇとを、超音波攪拌装置を用いて均一に混合した混合樹脂粉末を用いた。この混合樹脂粉末を上記の基材シート（5×10cm）に塗布した。接着シートを作製するための他の条件及び操作は、実施例７と全く同じである。ここで用いたヒドロキシプロピルセルロースは、日本曹達(株)のNISSO HPC SSL(D₅₀20μm，2%水溶液粘度2～2.9mPa・s)であり、薬局方に準拠し、換算した乾燥物に対し、ヒドロキシプロポキシ基(‐OC₃H₆OH：75.09) 53.4～80.5％を含むものである。

得られた接着シートを図１０の写真の下部に示す。また、実施例７－１と全く同様に、一旦巻物状に巻いてから開いて伸ばした際の様子を、図１２の写真に示す。図１２から知られるように、２反応剤型接着剤の混合粉末が、ほんのわずかに、剥がれて落ちていた。図１１に示す実施例７－１の結果と比較した場合、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）の添加により、２反応剤型接着剤の混合粉末の脱落は、大幅に減少したと考えられる。すなわち、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）の添加により、接着剤樹脂層に柔軟性または靭性を付与することができたと考えられる。

実施例７及び８で得られた接着シートをハサミで切断して断面を高性能の実体顕微鏡（(株)KEYENCE製「デジタルマイクロスコープVHX-5000」システム）で観察することにより、接着剤樹脂層の厚みを測定した。すなわち、顕微鏡装置の画面上から、ランダムに6箇所を選定して厚みを測定し、平均を求めた。この結果を表６に示す。

＜表６＞接着剤樹脂層の厚さ

表６に示されるように、ほぼ、0.30～0.35mm（約300～350μｍ）の厚みとなるように接着剤樹脂層を形成することができた。ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）が20％となるように添加した塗布液を用いた場合、厚みの小さい箇所が少なくなり、全体的に厚みがわずかに大きくなるのではないかと思われた。

＜参考例＞接着樹脂層形成の条件及び機構の検討
下記の一連の実験（参考例１～８）にて、実験を簡便に行うべく、生体分解性の基材シートに代えて、科学実験用の紙ワイパー（日本製紙クレシア(株)の「キムワイプS-200」）を、5×5cmまたは2.5×5cm（参考例３のみ）に切り出したものを、そのまま用いた。この紙ワイパーシートの厚みを、複数の箇所についてマイクロメーター（micrometer screw gauge）で測定したところ、約３０～７０μｍであった。また、この紙ワイパーシート（「キムワイプS-200」）は、木材（針葉樹及び広葉樹）由来の漂白した化学パルプのみからなり、ケバ立ちや紙粉が少ない丈夫なシートであり、クレープ加工（シボ加工）が施されている。ここでのパルプは、針葉樹由来の長さ３～５ｍｍで幅が約20μｍのセルロース繊維と、広葉樹由来の長さ１～２ｍｍで幅約５０μｍのセルロース繊維とが、所定の比率で配合されたものである。

＜参考例１＞無水エタノール
実施例１などで用いた２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）0.5ｇ、実施例１と全く同様の手順で、「無水」エタノール(エタノール99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.9ｇ）中に分散させた。そして、この分散液を、紙ワイパーのシート（「キムワイプS-200」の5×5cm）に、全く同様にして塗布し、乾燥させた。

２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末が樹脂層に変化していく様子を、高性能の実体顕微鏡（(株)KEYENCE製「デジタルマイクロスコープVHX-5000」システム）で観察した。図１３の一組の写真には、分散液の調製から、樹脂層形成後のシートまでの一連の段階での様子を示す。すなわち、(1)シャーレ（ペトリ皿）中の分散液、(2)シリコーン樹脂でライニングした平坦な面上にてシートに分散液を塗布した直後の塗布シート、(3)局部的に乾燥が開始した時点の塗布層（拡大写真）、(4)基材シートの傍（かたわ）らに零（こぼ）れ落ちた塗布層についての、上記(2)の時点のもの、及び、上記(3)の時点の乾燥開始部分を、別のシャーレに移した際の様子、(5)大気中に室温で約１時間放置後の塗布シート、及び、(6)完全乾燥時の塗布シートを示す。なお、約１時間放置して乾燥させた後には、塗布シートを、茶褐色の紙ウェス（日本製紙クレシア(株)の「キムタオル ４つ折り」）の上に移したのであり、これら(5)及び(6)の写真は、紙ウェス上に置かれた、乾燥後の塗布シートを示す。

また、図１４の一組の写真には、これらうちの、３つの段階での顕微鏡による平面画像を異なる倍率（100倍、及び400倍）にて示す。さらに、図１５には、完全乾燥後の塗布シートの断面（100倍）を示す。

すなわち、図１４には、上から順に、下記〔１〕～〔３〕を示し、図１５には下記〔４〕を示す。
〔１〕２反応剤型接着剤（LYDEX）に無水エタノールが浸透したエタノール浸透物。すなわち、上記(2)の、乾燥前の塗布層であり、上記(4)のように、ガラス製のシャーレ（ペトリ皿）にとって観察した。
〔２〕塗布時に、シートから零（こぼ）れ落ちた分散液が部分的に乾燥した部分乾燥品。すなわち、上記(3)上記塗布時にシートを載せていた平坦な面から、剥ぎ取って観察した。
〔３〕上記(5)の、約１時間乾燥させた接着剤樹脂層形成シートの表面。
〔４〕上記(6)の、完全に乾燥させた接着剤樹脂層形成シートをハサミで切断した断面。

図１４の〔１〕、特には右側の拡大写真（×400）の楕円囲み部分に示されるように、無水コハク酸変性ポリリジン（SAPL）が溶けてできたと考えられる部分が観察された。そして、図１４の〔２〕、特には右側の拡大写真（×400）に示されるように、局部的に乾燥した箇所で、粉末同士が結合されていた。また、図１４の〔３〕及び図１５（〔４〕）から知られるように、乾燥後には、２反応剤型接着剤の粉末が互いに結合しあうことで、一つの接着剤樹脂層を形成していた。この接着剤樹脂層は、アルデヒド化デキストラン（AD）のランダムな形状の各粉末が凸部をなして、基材シートである紙ワイパーシートの上に接着されていた。なお、紙ワイパーシートの厚みは、図１５の断面写真によると、最も薄い箇所で３９μｍ、最も厚い箇所で５３μｍであった。

＜参考例２＞非含水アセトン
実施例１などで用いた２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）0.5ｇ、実施例１及び上記参考例１と全く同様の手順で、アセトン(アセトン99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.7ｇ）中に分散させた。そして、この分散液を、紙ワイパーのシート（「キムワイプS-200」の5×5cm）に、全く同様にして塗布し、乾燥させた。なお、アセトンは、試薬ビンの封を解いてすぐに用いたものであり、カールフィッシャー滴定法（ケトン類用の薬液）によって、水分量は約0.2～0.3％であることが確かめられている。

上記参考例１と全く同様の操作を行った。この各段階での様子を、上記参考例１についての図１３の一組の写真と同様の、図１６の一組の写真に示す。また、上記参考例１についての図１４と全く同様にして得られた一連の顕微鏡写真を、図１７に示す。但し、接着剤樹脂層が形成されなかったので、切断面の観察は行わなかった。そして、図１８の左右一組の写真には、茶褐色の紙ウェス（日本製紙クレシア(株)の「キムタオル ４つ折り」）の上に置いて上記と同様に実体顕微鏡で観察した際の、図１７の一連の操作の後に得られた乾燥粉末（左の写真）、及び、元の２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末（右の写真；「LYDEX２．５／２０」）を示す。

図１７から明らかなように、２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末は、アセトン中に分散させることはできるが、アセトン中では無水エタノールの場合のように部分的に溶融する現象は全く観察されず、局部的に乾燥が行われた時点でも、流動性を保ったままであった。すなわち、粉末同士の結合による樹脂層の形成は、起こらなかった。また、図１８から明らかなように、アセトンに分散させてから乾燥させた後も、２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末の形状には、明確な変化が見られなかった。

＜参考例３＞２％含水アセトン
蒸留水を上記のアセトン（和光1級)に添加することで、含水率が２％である、含水アセトンを準備した。そして、この２％含水アセトンを分散媒として、上記実施例１、及び上記参考例１～２と同様に、分散媒中への接着剤粉末の分散、基材シート上への塗布（「固定」）、及び乾燥の操作を行った。但し、紙ワイパーシートのサイズを半分の2.5×5cmとし、２反応剤型接着剤の量、及び分散媒の量も半分とした。すなわち、実施例１などで用いた２反応剤型接着剤（LYDEX）の混合粉末（「LYDEX２．５／２０」）0.25ｇ、実施例１と全く同様の手順で、２％含水アセトン3mL（2.4ｇ）中に分散させた。そして、塗布及び乾燥の後に得られた接着シートを、ピンセットでつまんで持ち上げて見た。

この様子を、図１９の一連の写真に、それぞれ示す。また、図２０には、図１４の下端部、及び、図１７の下端部と同様に、乾燥後の接着シートの表面を観察した、左右一組の写真を示す。右の写真が、左の写真の部分拡大となっている。図１９の一連の写真、特には右端の写真に示すように、２％含水アセトンであると、非含水のアセトンを用いた場合（参考例２）と異なり、接着剤樹脂を基材シート上に固定することができた。すなわち、基材シート上に、一つの連続した接着剤樹脂層を形成することができた。また、図２０の表面の写真を、図１７の下端部と比較すると明らかなように、粒子（グレーン）同士が、相互に密着したものとなっていた。

＜参考例４＞非反応性の類似混合粉末
アルデヒド化デキストラン（第１反応剤；ＡＤ）に代えて、この原料に用いた上述のデキストラン（名糖産業株式会社の「デキストラン７０（Dex-70）」）の粉末を用いた。そして、このデキストランの粉末と、上記実施例１で用いたと同一の無水コハク酸処理ポリリジン（第２反応剤；ＳＡＰＬ）の粉末とを、同様に４／１の重量比率で、混合した。このようにして得られた非反応性の類似混合粉末（「Dex-70+ＳＡＰＬ」）を用いて、上記参考例１～２と全く同一の操作により、接着シートを作製した。

すなわち、まず、実施例１などと同様の手順にて、「無水」エタノール(エタノール99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.9ｇ）に対して、類似混合粉末（「Dex-70+ＳＡＰＬ」）0.5gを加え、超音波撹拌により均一に分散させた。そして、この分散液を、紙ワイパーのシート（「キムワイプS-200」の5×5cm）に、全く同様にして塗布し、乾燥させた。図２１の右上の写真に示すように、紙ワイパーのシートの片面に、樹脂層を固定させて形成することができた。

乾燥後の樹脂層形成シートを、三等分するように切断してから、腕に巻きつけることで湾曲させると、図２１の中段の右の写真に示すように、樹脂層に亀裂が生じた。しかし、樹脂層や接着剤粉末（グレーン）に、脱落や剥離は見られなかった。この状態で、生理食塩液をスプレーすることで、樹脂層形成シートの全体を濡らした。すると、図２１の下段の左半部に示すように、腕の皮膚表面に貼り付いた。しかし、当然ながら、ゲル化は生じていなかった。

一方、図２１の下段の右半部に示すように、上記の非反応性の類似混合粉末（「Dex-70+ＳＡＰＬ」）をシャーレ（ペトリ皿）に入れて、水を加えると、全体が、粘り気のある、均一で透明な液となった。

＜参考例５＞変性ポリリジン（第２反応剤；ＳＡＰＬ）のみ
変性ポリリジン（無水コハク酸処理ポリリジン）の粉末のみを用い、参考例１～２などと全く同様の操作により、樹脂形成シートを作製した。すなわち、上記の各実施例及び各参考例で用いたと同一の変性ポリリジン（残存アミノ基率84.7％）の粉末を用いて、樹脂形成シートを作製した。詳しくは、実施例１などと同様の手順にて、「無水」エタノール(エタノール99.5vol%以上、和光1級)6mL（4.9ｇ）に対して、変性ポリリジン（ＳＡＰＬ）の粉末0.5gを加え、超音波撹拌により均一に分散させた。そして、この分散液を、紙ワイパーのシート（「キムワイプS-200」の5×5cm）に、全く同様にして塗布し、乾燥させた。

図２２の上段の一連の写真に示すように、紙ワイパーのシートに塗布された分散液から、分散媒であるエタノールが蒸発して行くにつれて、無色透明の樹脂層が形成された。完全に乾燥した後、形成された樹脂層形成シートは、紙ワイパーのシートに、透明樹脂フィルムをラミネートさせたような外観を有していた。このように得られた樹脂層形成シートを、ハサミで三分の１足らずの大きさに切り出して、メラミン化粧板からなる、実験台の天板に載せた。そして、生理食塩液をスプレーすることで、樹脂層形成シートの全体を濡らした。すると、樹脂層形成シートが、実験台の天板に貼り付いた。しかし、数時間後、乾燥が進むと、実験台の天板から、自然に剥がれた。

以上の参考例により得られた結果（図１３～２２）から、次のように考えられた。
(i) 多孔性の基材シート上での接着剤樹脂層の形成は、無水エタノールまたはこれと同等の分散媒中にて、変性ポリリジン（ＳＡＰＬ）の粉末が、部分的に溶融することに起因する。
(ii) そのため、基材シート上での接着剤樹脂層の形成には、アルデヒド基と、アミン基との反応、すなわち、含水ゲル化のための反応を、全く必要としない。
(iii) アルデヒド化デキストラン（ＡＤ）の粉末そのものは、無水エタノールまたはこれと同等の分散媒中にて、ほとんど形状が変化しない。
(iv) 基材シート上の接着剤樹脂層は、アルデヒド化デキストラン（ＡＤ）の粉末に由来するグレーン（粒状部分）が、変性ポリリジン（ＳＡＰＬ）由来の連続層により、互いに連結され、また、基材シートに固定されたものと考えられる。このような接着剤樹脂層の構造に鑑み、アルデヒド基と、アミン基との反応は、生じているとしても、アルデヒド化デキストラン（ＡＤ）の粉末に由来するグレーン（粒状部分）の表面のみに限られると考えられる。
(v) 基材シートは、厚みが約３０～７０μｍの繊維製品シートで充分である。この繊維製品シートは、木材パルプのみからなる紙ワイパーと同等程度の多孔性構造を有するもので充分である。すなわち、この程度の厚み及び多孔性構造を有する繊維製品シートにより、所要の程度の接着剤樹脂層の固定及び補強を行うことができる。

本発明のシート状組織補強材は高い組織補強効果を有しており、外科手術や外傷の止血材及び肺切除面の気漏防止として使用できるので、例えば医療品製造業で利用される。

Claims (11)

1. 生体分解性を有する基材シートと、
   この上に固定されて形成された接着剤樹脂層とを含み、
   この接着剤樹脂層は、
   アルデヒド化グリカンを含む第１反応剤と、
   部分カルボキシル化ポリリジンを含む第２反応剤とを含み、
   第１反応剤の粉末に由来する粒状構造と、
   第２反応剤に由来し、この粒状構造を、相互に連結するとともに基材シートに固定している連結層とを有するシート状組織接着補強材。
2. 基材シートは、不織布、織物、編物、メッシュシート、スポンジシート、または、その他の連通多孔質シートであって、厚みが15μm～500μmであり、
   接着剤樹脂層は、厚みが100μm～800μmである、請求項１に記載のシート状組織接着補強材。
3. 第１反応剤の粉末に由来する粒状構造は、平均粒径が20～100μｍである、請求項１または２に記載のシート状組織接着補強材。
4. 第１反応剤をなすアルデヒド化グリカンは、アルデヒド基の導入量が、単糖ユニットあたり０．２～０．５個のアルデヒド基を導入したものであり、
   第２反応剤をなす部分カルボキシル化ポリリジンは、残存アミノ基率が７０～９３％である、請求項１～３のいずれかに記載のシート状組織接着補強材。
5. 接着剤樹脂層には、トロンビン、ヘモコアグラーゼ、またはその他の血液凝固促進剤が含有されている、請求項１～４のいずれかに記載のシート状組織接着補強材。
6. 接着剤樹脂層には、第１反応剤と第２反応剤との合計重量を基準として、５～３０％の重量の、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、コラーゲンもしくはその誘導体、または、その他の生分解性ポリマー、及び／または、１～２５％の重量のグリセリンまたはその他の保湿成分が含有されている、請求項１～５のいずれかに記載のシート状組織接着補強材。
7. 生体分解性を有する基材シートと、
   アルデヒド化グリカンを含む第１反応剤の粉末と、
   部分カルボキシル化ポリリジンを含む第２反応剤の粉末と、
   含水率が２％未満であるエタノールからなる分散媒とを、用意し、
   基材シート上で、少なくとも第２反応剤の粉末に、この分散媒が染み込むようにすることで、第１反応剤及び第２反応剤並びに分散媒を含む層を基材シート上に形成し、
   この後、分散媒を除去することで、基材シート上に固定された、第１反応剤及び第２反応剤を含む接着剤樹脂層を形成する、シート状組織接着補強材の製造方法。
8. 第１反応剤及び第２反応剤の混合粉末を用意し、
   下記(i)～(iv)のいずれか、または、これらからの任意の組み合わせにより、基材シート上に混合粉末及び分散液を含む層を形成した後、分散媒を除去する、請求項６に記載のシート状組織接着補強材の製造方法。
   (i) 混合粉末を前記分散媒中に分散させた分散液を用意し、この分散液を、基材シートへと吐出することで塗布する。
   (ii) 混合粉末を前記分散媒中に分散させた分散液を用意し、この分散液を面上に広げた層に、基材シートを突き当てることで塗布する。
   (iii) 基材シートに、混合粉末を塗布してから、分散媒を塗布するか、または、塗布された基材シートに分散媒を染み込ませる。
   (iv) 基材シートに分散媒を染み込ませておいてから、混合粉末を塗布する。
9. 前記(iii)または(iv)により、前記混合粉末の塗布を行うにあたり、
   網目や複数の小孔から粉末を落下させる方式、または、スプレーガン式もしくはディスペンサー式の粉末吐出部と、
   粉末吐出部に対する基材シートの相対的な位置を、連続的に、または順次に移動させる駆動機構と
   を備えた粉末塗布装置を用いることを特徴とする請求項７または８に記載のシート状組織接着補強材の製造方法。
10. ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、コラーゲンもしくはその誘導体または、その他の、分散媒中に溶解または分散が可能な生分解性ポリマー、及び／または、グリセリンまたはその他の保湿成分を、分散媒または第１反応剤及び第２反応剤の混合粉末、または第１反応剤もしくは第２反応剤の粉末に添加することを含む、請求項７～９のいずれかに記載のシート状組織接着補強材の製造方法。
11. トロンビン、ヘモコアグラーゼ、またはその他の血液凝固促進剤を、分散媒または第１反応剤及び第２反応剤の混合粉末、または第１反応剤もしくは第２反応剤の粉末に添加することを含む、請求項７～１０のいずれかに記載のシート状組織接着補強材の製造方法。