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MX2015003903A - Conjugado de anticuerpo-farmaco. - Google Patents

Conjugado de anticuerpo-farmaco.

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MX2015003903A
MX2015003903A MX2015003903A MX2015003903A MX2015003903A MX 2015003903 A MX2015003903 A MX 2015003903A MX 2015003903 A MX2015003903 A MX 2015003903A MX 2015003903 A MX2015003903 A MX 2015003903A MX 2015003903 A MX2015003903 A MX 2015003903A
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MX
Mexico
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antibody
ch2ch2
ggfg
maleimid
ch2ch2ch2
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MX2015003903A
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Takeshi Masuda
Hiroyuki Naito
Takashi Nakada
Daiichi Sankyo
Hideki Miyazaki
Yuji Kasuya
Koji Morita
Yuki Abe
Yusuke Ogitani
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Publication date
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Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

La presente invención se refiere a un fármaco antitumoral el cual es excelente en términos del efecto antitumoral y seguridad, se proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco en el cual un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH- (CH2) n1-La-Lb-Lc- en donde el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, y el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como una posición de conexión.

Description

CONJUGADO DE ANTICUERPO-FÁRMACO Campo de la Invención La presente invención se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene un conjugado de fármaco antitumoral a un anticuerpo capaz de dirigir células de tumor mediante una porción de estructura de enlazador, el conjugado es útil como un fármaco antitumoral.
Antecedentes de la Invención Un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) que tiene un fármaco con citotoxicidad conjugada a un anticuerpo, cuyo antígeno es expresado en una superficie de células de cáncer y el cual también se une a un antígeno capaz de internalización celular, y por lo tanto puede suministrar el fármaco selectivamente a células de cáncer y de esta forma se espera que provoque acumulación del fármaco dentro de las células de cáncer y elimine las células de cáncer (véase, Literaturas que no son patente 1 a 3). Como un ADC, Mylotarg (Gemtuzumab ozogamicina) en el cual la calicamicina es conjugada a un anticuerpo anti-CD30 es aprobada como un agente terapéutico para leucemia mieloide aguda. Además, Adcetris (Brentuximab vedotina), en el cual la auriestatina E es conjugada a un anticuerpo anti-CD30, ha sido recientemente aprobada como un agente terapéutico para linfoma de Hodgkin y linfoma anaplásico de células grandes Ref . 253088 (véase, Literatura que no es patente 4) . Los fármacos contenidos en los ADCs los cuales han sido aprobados hasta ahora se dirigen al ADN o tubulina.
Con respecto a compuestos anti-tumorales, de bajo peso molecular, se conocen derivados de camptotecina, compuestos que inhiben la topoisomerasa I para presentar un efecto antitumoral. Entre estos, un compuesto antitumoral es representado por la fórmula siguiente.
Fórmula 1 (exatecano, nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil- 5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo [de]pirano[31,4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona) es un derivado soluble en agua de camptotecina (Literatura de Patente 1 y 2). A diferencia de irinotecano actualmente usado en instalaciones clínicas, no es necesaria una activación por una enzima. Además, la actividad inhibidora en topoisomerasa I es superior que SN-38 la cual es una sustancia farmacéuticamente activa principal de irinotecano y topotecano también usada en instalaciones clínicas, y se obtiene actividad superior citocida in vitro contra varias celulas cancerosas las cuales tienen resistencia a SN-38 o similar debido a expresión de P-glicoproteína. Además, en un modelo de ratón subsecuentemente trasplantado de tumor humano, presenta un efecto antitumoral potente, y de esta forma ha experimentado los estudios clínicos, pero no ha sido puesto aún en el mercado (véase Literaturas no patente 5 a 10). No queda claro si o no el exatecano funciona efectivamente como un ADC.
El DE-310 es un complejo en el cual el exatecano es conjugado a un polímero de polialcohol carboximetildextrano biodegradable mediante un espaciador de péptido GGFG (Literatura de Patente 3). Convirtiendo el exatecano en una forma de un profármaco de polímero, de manera que se puede mantener una propiedad de retención de sangre alta y también una alta propiedad dirigible a un área de tumor es pasivamente incrementada utilizando la permeabilidad incrementada de los bazos sanguíneos recientemente formados dentro del tumor y la propiedad de retención en tejidos del tumor. Con DE-310, a través de un desdoblamiento del espaciador de péptido por la enzima, exatecano y exatecano con glicina conectado a un grupo amino son comúnmente liberados como una sustancia activa principal. Como un resultado, las farmacocinéticas son mejoradas y se encontró el DE-310 por tener efectividad superior que el exatecano administrado solo aún a pesar que la dosificación del exatecano sea inferior que el caso de administración del exatecano solo de conformidad con varios modelos de evaluación de tumor en estudios no clínicos. Se condujo un estudio clínico para DE-310, y se confirmaron casos efectivos en humanos, en los cuales se presentó un reporte que sugiere que la sustancia activa principal que se acumula en un tumor que en tejidos normales está presente, sin embargo, existe también un reporte que indica que la acumulación de DE-310 y la sustancia activa principal en un tumor no es muy diferente de la acumulación en tejidos normales en humanos, y de esta forma no se observa objetivo pasivo en humanos (véase, Literaturas no patente 11 a 14). Como un resultado, el DE-310 tampoco fue comercializado, y no permanece claro si o no el exatecano funciona efectivamente como un fármaco orientado para tal objetivo.
Como un compuesto relacionado a DE-310, también se conoce un complejo en el cual una porción de estructura representada por -NH(CH2)4C(=0)- es insertada entre el espaciador GGFG y exatecano para formar -GGFG-NH(CH2)4C(=0)-usado como una estructura espaciadora (Literatura de Patente 4). Sin embargo, el efecto antitumoral del complejo no se conoce del todo.
Lista de Citas Literatura de Patente Literatura de Patente 1 Patente Japonesa Abierta al público No.5-59061 Literatura de Patente 2 - Patente Japonesa Abierta al público No.8-337584 Literatura de Patente 3 - Solicitud Internacional No. WO 1997/46260 Literatura de Patente 4 - Solicitud Internacional No. WO 2000/25825 Literatura que no es patente Literatura que no es patente 1 - Ducry, L., et al. Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.; Antibody-Drug Conjugates: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.
Literatura que no es patente 2 - Allcy, S. C., et al. Current Opinión in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.; Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cáncer.
Literatura que no es patente 3 - Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.; Tumour-targeted chemotherapy with immunoconjugates of calicheamicin.
Literatura que no es patente 4 - Senter P. D., et al. Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.; The discovery and development of brentuxi ab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma.
Literatura que no es patente 5 - Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.; Antitumour activity of DX-8951f: a new camptothecin derivative.
Literatura que no es patente 6 - Mitsui, I., Kumazawa, E., Hirota, Y., et al. Jpn J. Cáncer Res. (1995) 86, 776-786.; A new water-soluble camptothecin derivative, DX-8951f, exhibits potent antitumoral activity against human tumors in vitro and in vivo.
Literatura que no es patente 7 - Takiguchi, S., Tohgo, A., et al. Jpn J. Cáncer Res. (1997) 88, 760-769.; Antitumoral effect of DX-8951, a novel camptothecin analog, on human pancreatic tumor cells and their CPT-ll-resistant variants cultured in vitro and xenografted into nude mice.
Literatura que no es patente 8 - Joto, N. et al. Int J Cáncer (1997) 72, 680-686.; DX-8951f, a water-soluble camptothecin analog, exhibits potent antitumoral activity against a human lung cáncer cell line and its SN-38-resistant variant.
Literatura que no es patente 9 - Kumazawa, E. et al. Cáncer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.; Potent and broad antitumoral effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.
Literatura que no es patente 10 - De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.; DX-8951Í: summary of phase I clinical triáis.
Literatura que no es patente 11 Inoue, K. et al.
Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003), 145-153.; CM-dextran-polyalcohol-camptothecin conjúgate, DE-310 with a novel carrier system and its preclinical data.
Literatura que no es patente 12 - Kumazawa, E. et al. Cáncer Sci (2004) 95, 168-175.; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumoral activities in various murine tumor models.
Literatura que no es patente 13 - Soepenberg, O. et al. Clinical Cáncer Research, (2005) 11, 703-711.; Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in Patients con Advanced Solid Tumors.
Literatura que no es patente 14 - Wente M. N. et al. Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.; DE-310, a macromolecular prodrug of the topoisomerase-I-inhibitor exatecan (DX-8951), in patients con operable solid tumors.
Breve Descripción de la Invención Problema Téenico Con respecto al tratamiento de tumor por un anticuerpo, se puede observar un efecto antitumoral insuficiente aún cuando el anticuerpo reconoce un antígeno y se une a células de tumor, y existe un caso en el cual se necesita un anticuerpo antitumoral más efectivo. Además, muchos compuestos de bajo peso molecular, antitumorales, tienen un problema de seguridad como efectos secundarios y toxicidad, aún los compuestos que tienen un excelente efecto antitumoral, permanecen como un sujeto para lograr el efecto terapéutico superior mejorando adicionalmente la seguridad. Así, un objeto de la presente invención es obtener para proporcionar un fármaco antitumoral que tiene un excelente efecto terapéutico, el cual es excelente en términos de efecto antitumoral y seguridad.
Medios para Resolver el Problema Los inventores piensan que, cuando un compuesto antitumoral como exatecano es convertido en un conjugado de anticuerpo-fármaco, mediante una porción de estructura enlazadora, por conjugación al anticuerpo, el cual es capaz de dirigir las células de tumor, que tienen una propiedad de reconocer las células de tumor, una propiedad de unión a células de tumor, una propiedad de internalización dentro de las células de tumor, una actividad citocidal contra células de tumor o similares, el compuesto antitumoral puede ser más seguramente suministrado a células de tumor para presentar específicamente el efecto antitumoral del compuesto en las células de tumor, y de este modo el efecto antitumoral puede ser presentado de manera segura y también se espera un efecto citocidal mejorado del anticuerpo, y una dosis del compuesto antitumoral puede ser reducida comparada con un caso de administración del compuesto solo, y de este modo se puede aliviar una influencia del compuesto antitumoral en células normales de manera que se puede lograr una mayor seguridad.
En este respecto, los inventores crearon un enlazador con una estructura específica y exitosa obteniendo un conjugado de anticuerpo-fármaco en el cual el anticuerpo y exatecano son conjugados entre sí mediante el enlazador, y se confirmó un excelente efecto antitumoral presentado por el conjugado para de este modo completar la presente invención.
Específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente, [1] Un conjugado de anticuerpo-fármaco en donde un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula: Fórmula 2 es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-Lp-NH-(CH2)h1-^-^-^-.
Aquí, el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como posición de conexión, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-, - CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-, -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta 8, n3 representa un número entero de 1 hasta 8, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, -S- (CH2)n6-C(=0)-, o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, n6 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9-0H, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -0-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 3 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 4 la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=0)-, L1 es -C(=O)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-.
La presente invención además se refiere a cada uno de lo siguiente. [2] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [1], en donde Lc es -C(=0)-. [3] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [1] o [2], en donde el enlace entre el anticuerpo y L1 es un enlace de tioéster el cual está formado en un sitio de enlace de disulfuro presente en una parte de articulación del anticuerpo, un enlace de disulfuro el cual está formado en un sitio de enlace de disulfuro presente en una parte de articulación del anticuerpo, o un enlace de amida el cual está formado en un grupo amino presente en una cadena lateral de un aminoácido que constituye el anticuerpo o en el grupo amino terminal. [4] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [3], en donde el residuo de péptido de Lp es un residuo de aminoácido que comprende un aminoácido seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico. [5] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [3], en donde Lp es un residuo de péptido que consiste de 4 aminoácidos. [6] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [3], en donde Lp es -GGFG-. [7] Un conjugado de anticuerpo-fármaco en donde un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula: Fórmula 5 es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.
Aquí, el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como una posición de conexión, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-, -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)-, o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta | 8, n3 representa un número entero de 1 hasta 8, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, -S- (CH2)n6-C(=0)-, o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, n6 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo tetrapéptido de GGFG, La representa -O- o un enlace simple, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno representa un átomo de hidrógeno, Lc representa -C(=0)-, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 6 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 7 la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=0)-, L1 es -C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. [8] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [7], en donde L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- o -CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-. [9] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [7], en donde L1 es - (Succinimid-3-il-N)-(CH)n2-C(=0)-. [10] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [7], en donde L1 es -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-. [11] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [9], en donde n2 es un número entero de 2 hasta 5, y L2 es un enlace simple. [12] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [9], en donde n2 es un número entero de 2 hasta 5, L2 es -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=0) y n5 es 2 o 4. [13] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [12], en donde -NH- (CH2)n1-La-Lb-Lc- es una estructura parcial que tiene una longitud de cadena de 4 hasta 7 átomos. [14] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [12], en donde -NH- (CH2)n1-La-Lb-Lc- es una estructura parcial que tiene una longitud de cadena de 5 o 6 átomos. [15] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [14], en donde -NH- (CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-(CH2)3-C(=0)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=0)-, o -NH-(CH2)2-0-CH2-C(=0)-. [16] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [15], en donde la porción de estructura de fármaco-enlazador es una estructura de fármaco-enlazador seleccionada del grupo que consiste de las siguientes estructuras de fármaco-enlazador: , -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2- ' C(=0)-(NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH- ! CH2-O-CH2-C(=0)-(NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) ' - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (NH-DX) -C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) -C(=0) -cic.Hex(l,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) En donde, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 8 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 9 la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 10 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en la posición de conexión, y -GGFG- representa un residuo de péptido de -Gly-Gly-Phe-Gly-. [17] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [9] y [11] hasta [14], en donde la porción de estructura de fármaco-enlazador que tiene un fármaco conectado a -I^-I^-I^-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-es una estructura de fármaco-enlazador seleccionada del siguiente grupo: - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX).
En lo anterior, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 11 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y conectado a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, y -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 12 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [18] Un conjugado de anticuerpo-fármaco en donde un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula: Formula 13 es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que t Lene una estructura representada por la siguiente fórmula: - - - - Aquí, el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- y está conectado al anticuerpo mediante un enlace tioéter el cual está formado en un sitio de enlace de disulfuro presente en una parte de articulación del anticuerpo, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo tetrapéptido de GGFG, La representa -O- o un enlace simple, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno representa un átomo de hidrógeno, Lc representa -C(=0)-, y -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 14 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1. [19] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [18], en donde n2 es 2, L2 es -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, n5 es 2, n1 es 3, y tanto La como Lb son enlaces únicos, n2 es 5, L2 es un enlace simple, n1 es 1, La es -O-, y Lb es -CR2(-R3)-, o n2 es 5, L2 es un enlace simple, n1 es 2, La es -0-, y Lb es -CR2(-R3)-. [20] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [18] o [19], en donde n2 es un número entero de 2 hasta 5, y L2 es un enlace simple. [21] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [18] o [19], en donde n2 es un número entero de 2 hasta 5, L2 es -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH-C(=0)-, y n5 es 2 o 4. [22] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [18] hasta [21], en donde -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-(CH2)3-C(=0)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=0)-, o -NH-(CH2)2-0-CH-C(=0)-. [23] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [18] hasta [22], en donde la porción de estructura de fármaco-enlazador es una estructura de fármaco-enlazador seleccionada del grupo que consiste de las siguientes estructuras de fármaco-enlazador: - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 -C (=0) - (NH-DX) - ( Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) En lo anterior, - (Succinimid-3 - il-N) - tiene una estructura representada por la siguiente fórmula : Fórmula 15 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, y -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 16 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [24] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [23], en donde la porción de estructura de fármaco-enlazador que tiene un fármaco conectado a -L1-L2-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es una estructura de fármaco-enlazador seleccionada del siguiente grupo: - (Succinimid-3 - il -N) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2O - CH2CH20 -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) .
En lo anterior, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 17 L la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, y -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 18 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [25] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [24], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco- enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 1 hasta 10. [26] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [24], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco- enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 2 hasta 8. [27] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [24], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 3 hasta 8. [28] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [27], en donde el anticuerpo es un anticuerpo que tiene una o más de una propiedad de reconocimiento de una célula objetivo, una propiedad de unión a una célula objetivo, una propiedad de internalización en una célula objetivo, y una propiedad de daño a una célula objetivo. [29] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [27], en donde una célula la cual está dirigida por el conjugado de anticuerpo-fármaco es una célula de tumor. [30] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [27], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti- tenascina-C, un anticuerpo anti-SLC44A4, o un anticuerpo anti-mesotelina. [31] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [27], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, o un anticuerpo anti-CD70. [32] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [27], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3. [33] Un fármaco que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [32], una sal del mismo o un hidrato del mismo. [34] Un fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [32], una sal del mismo o un hidrato del mismo. [35] El fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno de conformidad con [34], el cual se aplica a cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, o cáncer esofágico. [36] Una composición farmacéutica que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [32], una sal del mismo o un hidrato del mismo como un componente activo, y un componente de formulación farmacéuticamente aceptable. [37] La composición farmacéutica de conformidad con [36], la cual se aplica a cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, o cáncer esofágico . [38] Un método para el tratamiento de tumor y/o cáncer que comprende administrar el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [1] hasta [32], una sal del mismo o un hidrato del mismo. [39] Un compuesto intermediario fármaco-enlazador representado por la siguiente fórmula: Q-(CH2)nQ-C(=0)-L2a-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX).
En la fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=0)-NH-, o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C (=0)-, X representa un átomo de bromo o un átomo de yodo, nQ representa un número entero de 2 hasta 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico, n1 representa un número entero de 0 hasta 6, j La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9- OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, I ¡ Lc representa -CH2- o -C(=0)-, (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 19 (Pirrolidin 2,5 dionaN ilo) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 20 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 21 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [40] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con [39], en donde Lc es -C(=0)-. [41] El compuesto intermediario fármaco-enlazador i j de conformidad con [39] o [40], en donde Lp es un residuo de péptido que consiste de 4 aminoácidos. | [42] El compuesto intermediario fármaco-enlazador i de conformidad con cualquiera de [39] hasta [41], en donde Lp es -GGFG-. [43] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de [39] hasta [42], en donde - NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2- , - NH - CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 - , -NH-CH2-O-CH2-, O -NH-CH2CH2-O-CH2-. [44] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de [39] hasta [42], en donde - NH- (CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-0-CH2-, O -NH-(CH2)2-0-CH2-. [45] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de [39] hasta [44], en donde n es un número entero de 2 hasta 6. [46] El compuesto intermediario fármaco-enlazador ¡ de conformidad con [43], en donde Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 hasta 5, y j L2a es un enlace simple. [47] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con [44], en donde Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 hasta 5, y L2a es un enlace simple. [48] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de [39] hasta [42], en donde Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 hasta 5, L2a es -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, n5 es un número entero de 2 hasta 4, y j -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2- , -NH-CH2 -O-CH2 - , O -NH-CH2CH2-O-CH2-. [49] El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con [48], en donde n5 es un número entero de 2 o 4, y - - - | I - - [50] Un compuesto de lo siguiente : (maleimid-N - il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) - CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - GGFG - NH - CH2 CH2 - I I ! aleimid-N- il ) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - GGFG - NH - CH2 CH2 - (maleimid-N - il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) , (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- ¡ C (=0) - (NH-DX) ! (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) I (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH -C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-j CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - (NH-DX) j (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- ! CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) ! (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-, C ( =0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2- , C ( =0) - (NH-DX) (maleimid-N-il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C ( =0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- i j CH2-C (=0) - (NH-DX) j (maleimid-N-il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - ) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-; CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH -C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- ' CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH 0-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH 0-CH2CH20- | 1 - ! I X-CH2-C(=0)-NH-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) (NH-DX) X-CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- c(=o)- - (NH-DX) X-CHs-C (=0) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=0)- (NH-DX) X-CH2-C (=0) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- c(=0) (NH-DX) X-CH2-C (=0) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2· C(=0)- (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2- CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) X-CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH- DX) HS-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH- DX) HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) j HS-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH- DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-, NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) I ! HS-CH2CH2-C(=0) -NH- CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2 - C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS - CH2CH2 - C ( = 0 ) -NH - CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG- i ¡ NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) j HS-CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- ! C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) | - - - - j CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH CH2-C (=0) - GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2-C (=0) GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2 C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2, 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2- C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C (=0)- CH2CH2CH2CH2CH2CH -C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=O) -CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2- C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2- C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C (=0)- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - H2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) H2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) ( Pi r rol idin - 2 , 5 -diona-N- il) -O-C(=0) - CH2CH2CH2CH2 - C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) - CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -I j (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) - J CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -¡ GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) - CH2 CH2 CH2 CH2 - C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) - ! CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) I (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2, 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH- DX) i ¡ (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- -DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=0)-CH2CH2-C(=0)-NH CH2CH20 - CH2CH2O - CH2CH2O - CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH- DX) j (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH20 - CH2CH20 - CH2CH20 - CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2 CH2 - C ( = O ) - GGFG - NH - CH2 - 0 - CH2 - ; C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2, 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) , o (Pirrolidin-2, 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2-C (=0) -NH ( ) Fórmula 22 O 1 ' en donde el átomo de nitrógeno está en una posición I de conexión, ¡ X representa un átomo de halógeno, | (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo I representado por la siguiente fórmula: I Fórmula 23 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y 1 -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 24 la posición 1 está en una posición de conexión. [51] Un compuesto de lo siguiente: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C (=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C (=0)- I (NH-DX) | (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH CH -C (=0) -j (NH-DX) (maleimid-N-il) - CH2 CH2 CH2 CH2 - C ( =0 ) - GGFG - H - CH2 CH2 -j C (=0) - (NH-DX) i (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - , C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - 1 C(=0) - (NH-DX) i (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2 C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C ( =0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20 CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20 CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- H2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20 =0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH -C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- I CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) | (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- ¡ CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-| ¡ (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) ! (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) , o (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- ¡ CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) .
! En lo anterior, (maleimid-N- il ) - es un grupo i representado por la siguiente fórmula: Fórmula 25 nde el átomo de nitrógeno está en una posición DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 26 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 1 [52] Un compuesto de lo siguiente: I I (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- 5 CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) , (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-I (NH-DX) o (maleimid-N-il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- (NH-DX) .
En lo anterior, (maleimid-N- il) - es un grupo ! representado por la siguiente fórmula : Fórmula 27 O en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y ¡ -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 28 o del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [53] Un compuesto seleccionado del siguiente grupo: NH2-CH2CH2-C(=0)-(NH-DX), NH2 - CH2CH2CH2 - C ( =0) - (NH-DX) , NH2-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) , NH2-CHCH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) , y H0-CH2-C (=0) - (NH-DX) en donde -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 29 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [54] Un compuesto representado por la siguiente fórmula Formula 30 Fórmula 31 representado por la siguiente fórmula Fórmula 32 anticuerpo-fármaco que comprende hacer reaccionar un compuesto representado por la siguiente fórmula: - con un anticuerpo o un derivado reactivo del mismo y conjugar una porción de fármaco-enlazador al anticuerpo por un método para formar un enlace de tioéster en un sitio de enlace de disulfuro presente en una parte de articulación del anticuerpo, o por un método para formar un enlace de amida en un grupo amino presente en una cadena lateral de un aminoácido que constituye el anticuerpo o en el grupo amino terminal.
En la fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=0)-NH-, o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=0)-, J X representa un átomo de bromo o un átomo de yodo, 1 nQ representa un número entero de 2 hasta 8, 1 L2a representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un I enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, J Lp representa un residuo de péptido que consiste de |2 hasta 7 aminoácidos seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico, n1 representa un número entero de 0 hasta 6, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -0-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, o -(CH2)n9- OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 hasta , nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)- (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula Fórmula 33 nde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, (Pirrolidin-2,5-diona-N-ilo) es un grupo representado por la siguiente fórmula la 34 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula H35 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [58] El método de producción de conformidad con [57], en donde el método para conjugar una porción de fármaco-enlazador a un anticuerpo es un método para reducir el anticuerpo y después de esto formar un enlace de tioéster por la reacción con el compuesto en el cual Q es un grupo maleimidilo o X-CH2-C(=0)- NH-, un método para formar un enlace de amida por la reacción con el compuesto en el cual Q es (Pirrolidin-2,5- diona-N-il)-O-C (=0)-, o un método para hacer reaccionar el anticuerpo con un compuesto representado por la fórmula Q1-Lla-Q2 en donde Q1 representa (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- 0-C(=0)-, (3-Sulfo-Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C(=0)-, RQ-0- =N-, representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, un grupo alquileno que tiene 1 hasta 10 átomos de carbono, un grupo fenileno, - (CH2)n4-C(=0)-, -(CH2)n4a-NH-C(=0)-(CH2)n4b-, o - (CH2)n4a-NH-C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-, Q2 representa (maleimid-N-ilo), un átomo de halógeno, o -S-S-(2-Piridilo), RQ representa un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, n4a representa un número entero de 0 hasta 6, n4b representa un número entero de 1 hasta 6, (3-Sulfo-Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 36 de conexión, y este ácido sulfónico es capaz de formar una sal de litio, sal de sodio, o sal de potasio, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y (2-Piridilo) representa un grupo 2-piridilo] y después de esto se hace reaccionar con el compuesto en el cual Q es SH para formar una estructura de fármaco-enlazador por un enlace amida. [59] El método de producción de conformidad con [57] o [58], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 1 hasta 10. [60] El método de producción de conformidad con [57] o [58], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 2 hasta 8. [61] El método de producción de conformidad con [57] o [58], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 3 hasta 8. [62] El método de producción de conformidad con cualquiera de [57] hasta [61], en donde una célula la cual está dirigida por el conjugado de anticuerpo-fármaco es una célula de tumor. [63] El método de producción de conformidad con cualquiera de [57] hasta [61], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, I un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un I j anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo | anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti- EphA2 , un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-tenascin-C, un anticuerpo anti-SLC44A4, o un anticuerpo anti-mesotelina. [64] El método de producción de conformidad con cualquiera de [57] hasta [61], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, o un anticuerpo anti-CD70. [65] El método de producción de conformidad con cualquiera de [57] hasta [61], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3. [66] Un conjugado de anticuerpo-fármaco obtenido i por el método de producción de conformidad con cualquiera de ¡[57] hasta [65]. [67] Un conjugado de anticuerpo-fármaco obtenido por formar un enlace de tioéster en un sitio de enlace sulfuro en una parte de articulación de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es tratado en una condición de reducción y después de esto se hace reaccionar con un compuesto seleccionado del grupo de compuesto mostrado abajo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C (=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C (=0)- (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) (NH-DX) aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH -CH2CH2- aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH -CH2CH2- aleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) ¡ j aleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - H - CH2CH2CH2- | aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 0) - (NH-DX) aleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- ! aleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- S H2-C (=0) - (NH-DX) aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH - H2-C (=0) - (NH-DX) aleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG-NH - H -C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH - C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- =0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- =0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- H2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- - H2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- =0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2O-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20 CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-| - - - - - - - (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2 O - CH2 CH20 - CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) , o (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- 1 CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) .
I En lo anterior, (maleimid-N- il) - es un grupo ¡ representado por la siguiente fórmula : Fórmula 37 nde el átomo de nitrógeno está en una posición DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula : Fórmula 38 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [68] Un conjugado de anticuerpo-fármaco obtenido por formar un enlace de tioéster en un sitio de enlace sulfuro presente en una parte de articulación de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es tratado en una condición de reducción y después de esto se hace reaccionar con un compuesto seleccionado del grupo de compuesto mostrado abajo: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=0)-NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) , (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O- (NH-DX) , o (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - )-(NH-DX).
En lo anterior, (maleimid-N-il)- es un grupo ado por la siguiente fórmula: , y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 40 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. [69] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [67] o [68], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 1 hasta 10. [70] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [67] o [68], en donde un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 2 hasta 8. [71] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con [67] o [68], en donde un número promedio de i unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada ¡ conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 3 hasta 8. | [72] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [67] hasta [71], en donde una celula la cual está dirigida por el conjugado de anticuerpo- fármaco es una célula de tumor. [73] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [67] hasta [71], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7- H3 , un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, I !un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un |anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti- ? integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti- tenascin-C, un anticuerpo anti-SLC44A4, o un anticuerpo anti- Jmesotelina. 5 [74] El conjugado de anticuerpo-fármaco de jconformidad con cualquiera de [67] hasta [71], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti- CD30, un anticuerpo anti-CD33, o un anticuerpo anti-CD70. [75] El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de [67] hasta [71], en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3. [76] A enlazador representada por la siguiente fórmula : -LÍ-^ -LP-NH-(CH2)n1-La-Ib-le para obtener un conjugado de anticuerpo-fármaco en el cual un fármaco es conjugado a un anticuerpo mediante el enlazador .
En lo anterior, L1 está en una posición de conexión para el anticuerpo, Lc está en una posición de conexión por un compuesto antitumoral, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-, - CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-, -C(=0)-cic.Hex(l,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)- , o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta 8, n3 representa un número entero de 1 hasta 8, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, -S- , o un enlace simple, donde n5 representa un número entero de 1 hasta nta un número entero de 1 hasta 6, representa un residuo de péptido que consiste de noácidos, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, o -(CH2)n9- OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple , en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo I alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un jnúmero entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 1hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre i que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, - (Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Formula 41 I i l 3 del mismo y está conectada a un grupo metíleño en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=0)-, L1 es -C(=0)- cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. [77] El enlazador de conformidad con [76], el cual es seleccionado del siguiente grupo, siempre que la terminal izquierda está en una posición de conexión con el anticuerpo y la terminal derecha está en una posición de conexión con el compuesto antitumoral: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=0)- - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH CH CH CH -C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C (=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2-C ( = 0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2- C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH CH CH CH CH -C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C (=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH -C (=0) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C(=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C(=0) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2 (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- - (Succinimid-3 - il -N) - CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - GGFG - NH - CH2 - 0-CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C(=0) - -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C (=0)-GGFG-NH-CH2CH2- 0-CH2-C(=0)- - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-j CH2CH2-O-CH2-C (=0) - J - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- i CH2CH2-0-CH2-C(=0) - ' - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O) -1 - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O) - 1 - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O- j -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - I (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH20 - CH2 CH20 - H2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) - NH -CH2CH2O-CH2CH2O- H20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH20 - CH2 CH2 O - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=O) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH 0-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O) - -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0 ) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C(=0) -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=0) -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C (=0) -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- C(=0) -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-1 c(=o) -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=0) -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O) - -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C (=0) -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C (=0) -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O) - -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=O) -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O CH2CH2O-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O) - -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C(=O) -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- CH2CH2O-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - -CH2-C(=0) -NH-CH2CH2-C(=0) -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- - - - - - - - - - -C(=0) -CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - -C(=0) -CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O) - C( 0) CH CH CH CH CH C( 0) -GGFG-NH-CH -O C - ( ) I ¡ ¡ | j CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - -C (=0) -cic . Hex (1,4) -CH2- (N-li -3 -diminiccuS ) -S- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - -C(=0) -cic.Hex(l,4) - CH2 - (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - -C (=0) -cic .Hex (1,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-CH2 C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -C (=0) -cic .Hex (1,4) - CH2 - (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -C(=0) -cic . Hex ( 1 , 4 ) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - -C(=0) -cic . Hex ( 1 , 4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -C(=0) -cic . Hex ( 1 , 4 ) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S-j CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - ¡ -C(=0)-cic.Hex(l,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- !CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0)-. [78] El enlazador de conformidad con [76], el cual es seleccionado del siguiente grupo, siempre que la terminal izquierda está en una posición de conexión con el anticuerpo y la terminal derecha está en una posición de conexión con el compuesto antitumoral: - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - c(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) - CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH- CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH -C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) -1 - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- ¡ CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-i CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C(=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C (=0) - I 1 (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- - (Succinimid-3 - il-N) - CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH-CH2- O-CHz-C (=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH CH2CH CH2-C (=0) -GGFG-NH CH2-O-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2 - 0 - CH2 - C ( =0 ) - - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH CH2CH2-0-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20-! CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- ! CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C ( =0) - ¡ - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- ' CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) [79] El enlazador de conformidad con [76] , el cual J es seleccionado del siguiente grupo, siempre que la terminal izquierda está en una posición de conexión con el anticuerpo y la terminal derecha está en una posición de conexión con el compuesto antitumoral : - (Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2- C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- - ( Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- =0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2 - C ( =0 ) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- -C (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - ( Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- H20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -c (=o) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2 - c (=0) - . [80] El enlazador de conformidad con [76], el cual es seleccionado del siguiente grupo, siempre que la terminal izquierda está en una posición de conexión con el anticuerpo y la terminal derecha está en una posición de conexión con el compuesto antitumoral: - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH -C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2 -O-CH2 - C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) Efectos Ventajosos de la Invención Con un conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene un conjugado exatecano del compuesto antitumoral mediante un enlazador con una estructura especifica, se puede lograr un excelente efecto antitumoral y seguridad.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 - La Figura 1 muestra una secuencia de aminoácido de variante 1 de B7-H3 (SEQ ID NO: 1).
Figura 2 - La Figura 2 muestra una secuencia de aminoácido de variante 2 de B7-H3 (SEQ ID NO: 2).
Figura 3 - La Figura 3 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena pesada tipo M30-H1 (SEQ ID NO: 9).
Figura 4 - La Figura 4 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena pesada tipo M30-H2 (SEQ ID NO: 10).
Figura 5 - La Figura 5 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena pesada tipo M30-H3 (SEQ ID NO: 11).
Figura 6 - Figura 6 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena pesada tipo M30-H4 (SEQ ID NO: 12).
Figura 7 - La Figura 7 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L1- (SEQ ID NO: 13).
Figura 8 - La Figura 8 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L2 (SEQ ID NO: 14).
Figura 9 - La Figura 9 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L3 (SEQ ID NO: 15).
Figura 10 - La Figura 10 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L4 (SEQ ID NO: 16).
Figura 11 - La Figura 11 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L5 (SEQ ID NO: 17).
Figura 12 - La Figura 12 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L6 (SEQ ID NO: 18).
Figura 13 - La Figura 13 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera tipo M30-L7 (SEQ ID NO: 19).
Figura 14 - La Figura 14 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena pesada del anticuerpo M30 (SEQ ID NO: 20).
Figura 15 - La Figura 15 muestra una secuencia de aminoácido de una cadena ligera del anticuerpo M30 (SEQ ID NO: 21).
Figura 16 - La Figura 16 muestra una secuencia de nucleótido de variante 1 de B7-H3 (SEQ ID NO: 26).
Figura 17 La Figura 17 muestra el efecto de un conjugado de anticuerpo-fármaco (2) en la línea de células A375 de melanoma humano subcutáneamente trasplantadas. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos describe el efecto de un anticuerpo M30-H1-L4P, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2).
Figura 18 - La Figura 18 muestra el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) en la línea de células A375 de melanoma humano subcutáneamente trasplantadas. La línea con rombos abiertos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con cuadrados rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 0.1 mg/kg, la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 0.3 mg/kg, la línea con triángulos rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 1 mg/kg, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 3 mg/kg.
Figura 19 - La Figura 19 muestra el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) en la línea de células Calu-6 de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas subcutáneamente trasplantadas. La línea con rombos abiertos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos describe el efecto de un anticuerpo M30- H1-L4P, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2).
Figura 20 - La Figura 20 muestra los efectos de los conjugados de anticuerpo-fármaco (1), (13), (41), y (55) en la línea de células A375 de melanoma humano subcutáneamente trasplantadas. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (1), la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (13), la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (41), y la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (55).
I Figura 21 - La Figura 21 muestra los efectos de los ¡conjugados de anticuerpo-fármaco (13), (41), y (55) en la línea de células Calu-6 de cáncer de pulmón de células no I Ipequeñas humanas subcutáneamente trasplantadas. La línea con rombos abiertos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos describe el efecto de DE-310, la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (13), la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo- fármaco (41), y la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (55).
Figura 22 - La Figura 22 muestra los efectos de los conjugados de anticuerpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), y (61) en la línea de células A375 de melanoma humano subcutáneamente trasplantadas. En el dibujo, la línea con rombos rellenos describe resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con cuadrados rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (17), la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (18), la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (19), la línea con triángulos rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (59), la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (60), y la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (61).
Descripción Detallada de la Invención El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención es un fármaco antitumoral en el cual un anticuerpo antitumoral es conjugado a un compuesto antitumoral mediante una porción de estructura enlazadora y explicada en detalle a continuación.
Anticuerpo El anticuerpo usado en el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se refiere a una inmunoglobulina y es una molécula que contiene un sitio de unión al antígeno inmunoespecíficamente unido a un antígeno. La clase del anticuerpo de la presente invención puede ser cualquiera de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, y IgY y es de manera preferente IgG. La subclase del anticuerpo de la presente invención puede ser cualquiera de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, y IgA2 y es de manera preferente IgGl o IgG2. El anticuerpo puede ser derivado de cualquiera de las especies, y ejemplos preferidos de las especies pueden incluir humanos, ratas, ratones, y conejos. En casos cuando se derive de otras especies diferentes a la humana, es de manera preferente quimerizado o humanizado usando una téenica bien conocida. El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal y es de manera preferente un anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo de la presente invención puede ser aquel el cual es capaz de dirigir células de tumor. Puesto que el anticuerpo de la presente invención es conjugado con un fármaco que tiene actividad antitumoral mediante un enlazador, el anticuerpo de manera preferente posee una o más de una propiedad de reconocimiento de una célula de tumor, una propiedad de unión a una célula de tumor, una propiedad de internalización en una célula de tumor, y una propiedad de daño una célula de tumor.
La actividad de unión del anticuerpo contra células de tumor puede ser confirmada usando citometría de flujo. La internalización del anticuerpo en células de tumor puede ser confirmada usando (1) un ensayo para visualizar un anticuerpo incorporado en células bajo un microscopio fluorescente usando un anticuerpo secundario (fluorescentemente etiquetado) unido al anticuerpo terapéutico (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) un ensayo para medir la cantidad de fluorescencia incorporada en las células usando un anticuerpo secundario (fluorescentemente etiquetado) unido al anticuerpo terapéutico (Molecular Biology of the Cell, Vol.15, 5268-5282, Diciembre 2004), o (3) un ensayo Mab-ZAP usando una inmunotoxina unida al anticuerpo terapéutico en donde la toxina es liberada después de incorporación en las células para inhibir el crecimiento celular (Bio Techniques 28: 162-165, Enero 2000).
La actividad antitumoral del anticuerpo se refiere a una actividad citotóxica o efecto citocida contra células de tumor y puede ser confirmada in vitro determinando la actividad inhibidora contra el crecimiento celular. Por ejemplo, una línea de células de cáncer que sobreexpresa una proteína objetivo por el anticuerpo es cultivada, y el anticuerpo es agregado a concentraciones variadas en el sistema de cultivo para determinar una actividad inhibidora contra la formación de focos, formación de colonia, y crecimiento esferoide. La actividad antitumoral puede ser confirmada in vivo, por ejemplo, administrando el anticuerpo a un ratón desnudo con una línea de células de tumor trasplantado que expresa altamente la proteína objetivo, y determinar el cambio en la célula de cáncer. Puesto que el conjugado de fármaco en el conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto antitumoral, es más preferido pero no esencial que el anticuerpo mismo deba tener un efecto antitumoral. Para ejercer el efecto antitumoral y también para específicamente y selectivamente dañar las células de tumor por el fármaco, es importante y también preferido que el anticuerpo deba tener la propiedad de internalización para migrar en las células de tumor.
Ejemplos de este anticuerpo pueden incluir, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CEA, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-tenascin-C, un anticuerpo anti-SLC44A4, y un anticuerpo anti-mesotelina.
El anticuerpo de la presente invención es preferiblemente un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti- CD33, un anticuerpo anti-CD70, o un anticuerpo anti-B7-H3, y más preferiblemente un anticuerpo anti-B7-H3.
El anticuerpo de la presente invención se puede obtener usando un método usualmente llevado a cabo en la téenica, el cual involucra inmunizar animales con un polipéptido antigénico y recolectar y purificar anticuerpos producidos in vivo. El origen del antígeno no se limita a humanos, y los animales pueden ser inmunizados con un antígeno derivado de un animal no humano tal como un ratón, una rata y similares. En este caso, la reactividad cruzada de anticuerpos unidos a los antígenos heterólogos obtenidos con antígenos humanos se puede probar por selección para un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.
| Alternativamente, la células que producen , anticuerpo las cuales producen anticuerpos contra el antígeno se fusionan con células de mieloma de conformidad con un método conocido en la técnica (por ejemplo, Kohler and j Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; y Kennet, R. ed., iMonoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para establecer hibridomas, de los cuales los anticuerpos |monoclonales pueden a su vez ser obtenidos.
I i El antígeno se puede obtener por células hospederas j diseñadas por ingeniería genética para producir un gen que codifica la proteína antigénica. Específicamente, los vectores que permiten expresión del gen antígeno se preparan y transfirieron a las células hospederas de manera que el gen es expresado. El antígeno de este modo expresado puede ser purificado.
El anticuerpo anti-CD30, el anticuerpo anti-CD33, y el anticuerpo anti-CD70 pueden obtenerse por un procedimiento conocido en la téenica con referencia al documento W02002/043661, Patente Estadounidense No. 5,773,001, y W02006/113909, respectivamente.
El anticuerpo B7-H3 usado en la presente invención es preferiblemente aquel que tiene propiedades como se describe posteriormente: (1) Un anticuerpo que tiene las siguientes propiedades: (a) se une específicamente a B7-H3, (b) tiene actividad de fagocitosis mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés), y (c) tiene actividad antitumoral in vivo. (2) El anticuerpo de conformidad con (1), en donde B7-H3 es una molécula que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 1 o 2. (3) El anticuerpo de conformidad con (1) o (2), en donde el anticuerpo tiene la CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 3, la CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 4, y la CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 5 como regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada, y la CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 6, la CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 7, y la CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 8 como regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera. (4) El anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) hasta (3), en donde la región constante del mismo es una región constante derivada de humano. (5) El anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) hasta (4), en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. (6) El anticuerpo de conformidad con (5), en donde el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de (a) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9, (b) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 10, (c) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 11, (d) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 12, (e) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% o superior homología con cualquiera de las secuencias (a) hasta (d), y (f) una secuencia de aminoácido derivado de cualquiera de las secuencias (a) hasta (d) por las supresiones, reemplazos, o adiciones de al menos un aminoácido, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de (g) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 13, (h) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 14, (i) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 15, (j) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 16, (k) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 17, (1) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 18, (m) una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 19, (n) una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% o superior homología con cualquiera de las secuencias (g) hasta (m), y (o) una secuencia de aminoácido derivado de cualquiera de las secuencias (g) hasta (m) por las supresiones, reemplazos, o adiciones de al menos un aminoácido. (7) El anticuerpo de conformidad con (6), en donde el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 13, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 14, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 15, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 16, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta ' 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera I ' que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las j posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 17, una región variable de cadena pesada que comprende una ! secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 18, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de i aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 19, una región ! variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena Iligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 13, una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta L28 en la SEQ ID NO: 14, una región variable de cadena pesada 2ue comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 141 en la SEQ ID NO: 12 y ina región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: 15, y una región /ariable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta L41 en la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena Ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en Las posiciones de aminoácido 21 hasta 128 en la SEQ ID NO: L6. (8) El anticuerpo de conformidad con (6) o (7), en londe el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena Ligera seleccionada del grupo que consiste de una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en Las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 / una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la 3EQ ID NO: 13, una cadena pesada que comprende una secuencia ie aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las iciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 14, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 15, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 16, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 17, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 18, una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la ID NO: 19, una cadena pesada que comprende una secuencia aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 13, ¡ una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido 1 descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia j de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 | hasta 233 en la SEQ ID NO: 14, una cadena pesada que , comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 15, y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 12 y una cadena I ¡ ligera que comprende una secuencia de aminoácido descrita en ! las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 16. (9) El anticuerpo de conformidad con cualquiera de (6) hasta (8), en donde el anticuerpo comprende una cadena jpesada y una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 13, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 14, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 15, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 16, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 17, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 18, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 19, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 13, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 14, una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 15, y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 16. (10) El anticuerpo de conformidad con (8) o (9), en donde el anticuerpo carece de un aminoácido en el terminal carboxi de la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 9 o 12 en la cadena pesada. (11) Un anticuerpo obtenido por un método para producir el anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) hasta (10), el método comprende las etapas de: cultivar una célula hospedera transformada con un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo; y recolectar el anticuerpo de interés a partir de los cultivos obtenidos en la etapa precedente. (12) El anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) hasta (11), en donde la modificación de un glicano es regulada con el fin de mejorar la actividad citotóxica dependiente del anticuerpo.
Posteriormente, se describe el anticuerpo B7-H3 usado en la invención.
Los términos "cáncer" y "tumor" como se usan en la presente son usados con el mismo significado.
El término "gen" como se usan en la presente incluye no solamente ADN, sino también mARN del mismo, cADN del mismo y cARN del mismo.
El término "polinucleótido" como se usa en la presente se usa con el mismo significado como un ácido nucleico, y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos, y cebadores.
Los términos "polipéptido" y "proteína" como se usan en la presente son usados sin distinción.
El término "célula" como se usan en la presente también incluye células en un animal individual y células cultivadas.
El término "B7-H3" como se usa en la presente es usado con el mismo significado como la proteína B7-H3, y también se refiere a una variante 1 de B7-H3 y/o variante 2 de B7-H3.
El término "CDR" como se usa en la presente se refiere a una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), y se conoce que cada cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs). La CDR también es llamada la región hipervariable, y está presente en una región variable de cada cadena ligera y pesada de un anticuerpo. Es un sitio el cual tiene inusualmente alta variabilidad en su estructura primaria, y aquí existen tres CDRs separadas en la estructura primaria de cada cadena de polipéptido ligera y pesada. En esta descripción, como para las CDRs de un anticuerpo, las CDRs de la cadena pesada son representadas por la CDRH1, CDRH2, y CDRH3 a partir del lado amino-terminal de la secuencia de aminoácido de la cadena pesada, y las CDRs de la cadena ligera son representadas por la CDRL1, CDRL2, y CDRL3 a partir del lado amino-terminal de la secuencia de aminoácido de la cadena ligera. Estos sitios son próximos entre sí en la estructura terciaria y determinan la especificidad por un antígeno al cual el anticuerpo se une.
La frase "hibridización se realiza bajo condiciones rigurosas" como se usa en la presente se refiere a un proceso en el cual la hibridización se realiza bajo condiciones bajo las cuales se puede lograr la identificación realizando hibridización a 68°C en una solución de hibridización comercialmente disponible, solución de Hibridización ExpressHyb (manufacturada por Clontech, Inc.) o realizando hibridización a 68°C en la presencia de NaCl 0.7 a 1.0 M usando un filtro que tiene ADN inmovilizado en este, seguido realizando un lavado a 68°C usando solución de SSC 0.1 a 2 x (la solución de SSC 1 x está compuesta de NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM) o bajo condiciones equivalentes a esta. 1. B7-H3 B7-H3 es un miembro de la familia B7 expresado en células que presentan antígeno como una molécula co estimuladora, y se considera por actuar en un receptor en las células T para mejorar o suprimir la actividad inmune.
B7-H3 es una proteína que tiene una estructura de transmembrana de paso único, y el dominio extracelular N-terminal de B7-H3 contiene dos variantes. La variante 1 de B7-H3 (4Ig-B7-H3) contiene un dominio Ig similar a V o similar a C en dos sitios, respectivamente, y la variante 2 de B7-H3 (2Ig-B7-H3) contiene un dominio Ig similar a V o similar a C en un sitio, respectivamente.
En cuanto al B7-H3 que será usado en la invención, B7-H3 puede ser directamente purificado a partir de células que expresan B7-H3 de un mamífero humano o no humano (tal como una rata o un ratón) y usada, o una fracción de membrana celular de las células descritas anteriormente puede ser preparada y usada. Además, B7-H3 se puede obtener por síntesis in vitro del mismo o producción del mismo en una célula hospedera a través de ingeniería genética. En la ingeniería genética, específicamente, después que el cADNc de B7-H3 es integrado en un vector capaz de expresar el cADN de B7-H3, B7-H3 se puede obtener por síntesis en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia de energía requerida para transcripción y traducción, o expresando B7-H3 en otra célula hospedera transformada procariótica o eucariótica.
La secuencia de aminoácido de un marco lector abierto (ORF, por sus siglas en inglés) de un gen variante 1 de B7-H3 humano es representada por la SEQ ID NO: 1 en el Listado de Secuencias. Además, la secuencia de la SEQ ID NO: 1 se muestra en la Fig.1.
La secuencia de aminoácido de un ORF de un gen variante 2 de B7-H3 humano es representada por la SEQ ID NO: 2 en el Listado de Secuencias. Además, la secuencia de la SEQ ID NO: 2 se muestra en la Fig.2.
Además, una proteína la cual consiste de una secuencia de aminoácido en donde uno o varios aminoácidos son sustituidos, suprimidos y/o agregados en cualquiera de las secuencias de aminoácido descritas anteriormente de B7-H3 y también tiene una actividad biológica equivalente a aquella de la proteína también está incluida en B7-H3.
La variante 1 de B7-H3 humano madura a partir de la cual la secuencia señal ha sido removida corresponde a una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 27 a 534 de la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 1. Además, la variante 2 de B7-H3 humana madura a partir de la cual la secuencia señal ha sido removida corresponde a una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 27 a 316 de la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2. 2. Producción de anticuerpo anti-B7-H3 El anticuerpo contra B7-H3 de la invención se puede obtener inmunizando un animal con B7-H3 o un polipéptido arbitrario seleccionado de la secuencia de aminoácido de B7-H3, y recolectando y purificando el anticuerpo producido in vivo de conformidad con un procedimiento común. Las especies biológicas de B7-H3 a ser usadas como un antígeno no se limitan un ser humano, y un animal puede ser inmunizado con B7-H3 derivado de otro animal distinto de humanos tal como un ratón o una rata. En este caso, examinando la reactividad cruzada entre un anticuerpo unido a B7-H3 heterólogo y B7-H3 humano, se puede seleccionar un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana.
Además, un anticuerpo monoclonal se puede obtener a partir de un hibridoma establecido fusionando células que producen anticuerpo las cuales producen un anticuerpo contra B7-H3 con células de mieloma de conformidad con un método conocido (por ejemplo, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp.495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
El B7-H3 a ser usado como un antígeno se puede obtener expresando el gen de B7-H3 en una célula hospedera usando ingeniería genética.
Específicamente, se produce un vector capaz de expresar el gen de B7-H3, y el vector resultante es transfectado en una célula hospedera para expresar el gen, y después, el B7-H3 expresado es purificado. Posteriormente, se describe específicamente un método para obtener un anticuerpo contra B7-H3. (1) Preparación de antígeno Ejemplos de antígenos a ser usados para producir el anticuerpo anti-B7-H3 incluyen B7-H3, un polipéptido que consiste de una secuencia de aminoácido parcial que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos de B7-H3, y un derivado obtenido agregando una secuencia de aminoácido dada o un portador a esta.
El B7-H3 puede ser purificado y usado directamente a partir de tejidos de tumor o células de tumor humanas. Además, el B7-H3 se puede obtener sintetizándolo in vitro produciéndolo en una célula hospedera por ingeniería genética.
Con respecto a la ingeniería genética, específicamente, después de que el cADN de B7-H3 es integrado en un vector capaz de expresar el cADN de B7-H3, el B7-H3 se puede obtener sintetizándolo en una solución que contiene una enzima, un sustrato y una sustancia de energía requerida para transcripción y traducción, o expresando el B7-H3 en otra célula hospedera transformada procariótica o eucariótica.
Además, el antígeno también se puede obtener como una proteína secretora expresando una proteína de fusión obtenida por ligación del dominio extracelular de B7-H3, el cual es una proteína de membrana, a la región constante de un anticuerpo en un sistema de hospedero-vector apropiado.
El cADN de B7-H3 se puede obtener mediante, por ejemplo, un método así llamado PCR en el cual una reacción en cadena de la polimerasa (posteriormente referido como "PCR") se realiza usando una biblioteca de cADN expresando el cADN de B7-H3 como una plantilla y cebadores los cuales específicamente amplían el cADN de B7-H3 (véase Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp.487-489).
Como la síntesis in vitro del polipéptido, por ejemplo, Sistema de Traducción Rápido (RTS, por sus siglas en inglés) manufacturado por Roche Diagnostics, Inc. puede ser ejemplificado, pero no se limita a esta.
Ejemplos de células hospederas procarióticas incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis . Con el fin de transformar las células hospederas con un gen objetivo, las células hospederas son transformadas por un vector plásmido que comprende un replicón, es decir, un origen de replicación derivado de una especie compatible con el hospedero, y una secuencia reguladora. Además, el vector preferiblemente tiene una secuencia capaz de imponer la selectividad fenotípica en la célula transformada.
Ejemplos de las células hospederas eucarióticas incluyen células de vertebrado, células de insecto, y células de levadura. Como las células de vertebrado, por ejemplo, las células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp.175-182, ATCC CRL-1650), N1H3T3 de fibroblasto murino (ATCC No. CRL-1658), y cepas deficientes de dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp.4126-4220) de células de ovario de hámster Chino (células CHO; ATCC: CCL-61); y similares son a menudo usadas, sin embargo, las células no se limitan a estas.
El transformante de este modo obtenido puede ser cultivado de conformidad con un procedimiento común, y por el cultivo del transformante, un polipéptido objetivo se produce intracelularmente o extracelularmente.
Un medio adecuado para ser usado para el cultivo puede ser seleccionado de varios medios de cultivo comúnmente usados dependiendo de las células hospederas empleadas. Si se emplea Escherichia coli, por ejemplo, un medio de LB suplementado con una célula de antibiótico como ampicilina o IMPG como se necesite, puede ser usado.
Una proteína recombinante producida intracelularmente o extracelularmente por el transformante a través de tal cultivo puede ser separada y purificada por cualquiera de los varios métodos de separación conocidos utilizando la propiedad física o química de la proteína.
Ejemplos específicos de los métodos incluyen tratamiento con un precipitante de proteína común, ultrafiltración, varios tipos de cromatografía líquida tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía por adsorción, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad, diálisis, y una combinación de los mismos.
Además, uniendo una etiqueta de seis residuos de histidina a una proteína recombinante a ser expresada, la proteína puede ser eficientemente purificada con una columna de afinidad de níquel. Alternativamente, uniendo la región Fe de IgG a una proteína recombinante a ser expresada, la proteína puede ser eficientemente purificada con una columna de proteína A.
Combinando los métodos descritos anteriormente, una gran cantidad de un polipéptido objetivo puede ser fácilmente producida en alto rendimiento y alta pureza. (2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 Ejemplos del anticuerpo específico que se une a B7-H3 incluyen un anticuerpo monoclonal específico que se une a B7-H3, y un método de obtención del anticuerpo es como se describe posteriormente.
La producción de un anticuerpo monoclonal en general requiere las siguientes etapas de operación de: (a) purificar un biopolímero para ser usado como un antígeno; (b) preparar células que producen anticuerpo inmunizando un animal por inyección del antígeno, recolectar la sangre, ensayando su titulador de anticuerpo para determinar cuándo es escindido el bazo; (c) preparar células de mieloma (posteriormente referido como "mieloma"); (d) fusionar las células que producen anticuerpo con el mieloma; (e) seleccionar un grupo de hibridomas que producen un anticuerpo deseado; (f) dividir los hibridomas en clones de células únicas (clonación); (g) opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar un animal implantado con el hibridoma para producir una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal; (h) examinar el anticuerpo monoclonal así producido para determinar la actividad biológica y especificidad de enlace, o ensayar el mismo para propiedades como un reactivo etiquetado; y similares.
Posteriormente, el método para producir un anticuerpo monoclonal será descrito en detalle siguiendo las etapas anteriores, sin embargo, el método no está limitado a estas y, por ejemplo, las células que producen anticuerpo distinto de las células del bazo y mieloma pueden ser usadas. (a) Purificación de antígeno Como el antígeno, el B7-H3 preparado por el método como se describe anteriormente o un péptido parcial del mismo, puede ser usado.
Además, una fracción de membrana preparada a partir de células recombinantes que expresan B7-H3 o las células recombinantes que expresan B7-H3 las mismas, y también un péptido parcial de la proteína de la invención químicamente sintetizado por un método conocido por aquellos expertos en la téenica también puede ser usado como el antígeno. (b) Preparación de células que producen anticuerpo El antígeno obtenido en la etapa (a) es mezclado con un adyuvante tal como adyuvante incompleto o completo de Freund o sulfato de potasio y la mezcla resultante es usada como un inmunógeno para inmunizar un animal experimental. Como el animal experimental, cualquier animal usado en un método de producción de hibridoma conocido puede ser usado sin algún problema. Específicamente, por ejemplo, un ratón, una rata, una cabra, una oveja, vaca, un caballo, o similares pueden ser usados. Sin embargo, a partir del punto de vista de facilidad de disponibilidad de células de mieloma a ser fusionadas con las células que producen anticuerpo extraídas, se usa preferiblemente un ratón o una rata como el animal a ser inmunizado.
Además, la cepa de un ratón o una rata a ser usada no está particularmente limitada, y en el caso de un ratón, por ejemplo, varias cepas tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, y 129 y similares pueden ser usadas, y en el caso de una rata, por ejemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawlcy, ACI, BN, Fischer y similares pueden ser usadas.
Estos ratones y ratas con comercialmente disponibles de reproductores/distribuidores de animales experimentales, por ejemplo, CLEA Japón, Inc. y Charles River Laboratories Japón, Inc.
Entre estos, en consideración de la compatibilidad de fusión con células de mieloma descritas abajo, en el caso de un ratón, la cepa BALB/c, y en el caso de una rata, las cepas Wistar y Low son particularmente preferidas como el animal a ser inmunizado.
Además, en consideración de homología antigénica entre humanos y ratones, también es preferido usar un ratón que tiene función biológica disminuida para remover auto-anticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmune.
La edad de tal ratón o rata al tiempo de la inmunización es preferiblemente 5 a 12 semanas de edad, más preferiblemente 6 a 8 semanas de edad.
Para inmunizar un animal con B7-H3 o un recombinante del mismo, por ejemplo, un método conocido descrito en detalle en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook de Experimental Immunology Vol . I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) o similares puede ser usado.
Entre estos métodos de inmunización, un método específico preferido en la invención es, por ejemplo, como sigue.
Es decir, primero, una fracción de proteína de membrana que sirve como el antígeno o células causadas por expresar el antígeno es/son intradermalmente o intraperitonealmente administrados a un animal.
Sin embargo, la combinación de ambas rutas de administración es preferida para incrementar la eficiencia de inmunización, y cuando la administración intradermal se realiza en la primera mitad y la administración intraperitoneal se realiza en la última mitad o solamente en la última dosificación, la eficiencia de inmunización puede ser particularmente incrementada.
El esquema de administración del antígeno varía dependiendo del tipo de animal a ser inmunizado, diferencia individual o similares. Sin embargo, en general, un esquema de administración en el cual la frecuencia de administración del antígeno es 3 hasta 6 veces y el intervalo de dosificación es 2 hasta 6 semanas, es preferido, y un esquema de administración en el cual la frecuencia de administración del antígeno es 3 hasta 4 semanas y el intervalo de dosificación es 2 hasta 4 semanas es más preferido.
Además, la dosis del antígeno varía dependiendo del tipo de animal, diferencias individuales o similares, sin embargo, la dosis en general se ajusta a 0.05 hasta 5 mg, preferiblemente aproximadamente 0.1 hasta 0.5 mg.
Una inmunización de refuerzo se realiza 1 hasta 6 semanas, preferiblemente 2 hasta 4 semanas, más preferiblemente 2 hasta 3 semanas después de la administración del antígeno como se describe anteriormente.
La dosis del antígeno al tiempo de realizar la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal o similares, sin embargo, en el caso de, por ejemplo, un ratón, la dosis es en general establecida a 0.05 hasta 5 mg, preferiblemente 0.1 hasta 0.5 mg, más preferiblemente aproximadamente 0.1 hasta 0.2 mg.
Las células del bazo o linfocitos que incluyen células que producen anticuerpo son asépticamente removidas del animal inmunizado 1 hasta 10 días, preferiblemente 2 hasta 5 días, más preferiblemente 2 hasta 3 días después de la inmunización de refuerzo. En este tiempo, el titulador de anticuerpo es medido, y si un animal que tiene un titulador de anticuerpo suficientemente incrementado se usa como una fuente de suministro de las células que producen anticuerpo, el procedimiento subsecuente puede llevarse a cabo más eficientemente.
Ejemplos del método para medir el titulador de anticuerpo a ser usado aquí incluyen un método de RIA y un método de ELISA, pero el método no está limitado a estos.
Por ejemplo, si se emplea un método de ELISA, la medición del titulador de anticuerpo en la invención puede llevarse a cabo de conformidad con los procedimientos cómo se describe abajo.
Primero, un antígeno purificado o parcialmente purificado es adsorbido en la superficie de una fase sólida tal como una placa de 96 pozos para ELISA, y la superficie de la fase sólida que no tiene antígeno adsorbido en esta es cubierta con una proteína no relacionada con el antígeno tal como albúmina de suero bovino (posteriormente referido como "BSA"). Después de lavar la superficie, la superficie es llevada en contacto con una muestra diluida serialmente (por ejemplo, suero de ratón) como un anticuerpo primerio para permitir al anticuerpo en la muestra unirse al antígeno.
Además, como un anticuerpo secundario, un anticuerpo etiquetado con una enzima contra un anticuerpo de ratón se agrega y se deja unirse al anticuerpo de ratón. Después del lavado, un sustrato para la enzima es degradado y un cambio en la absorbancia el cual ocurre debido al desarrollo de color inducido por degradación del sustrato o similar, se mide y se calcula el titulador de anticuerpo con base en la medición.
La separación de las células que producen anticuerpo a partir de las células del bazo o linfocitos del animal inmunizado se puede llevar a cabo de conformidad con un método conocido (por ejemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p.495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por ejemplo, en el caso de células del bazo, puede ser empleado un método general en el cual las células que producen anticuerpo son separadas homogenizando el bazo para obtener las células a través de la filtración con una malla de acero inoxidable y suspender las células Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM). (c) Preparación de células de mieloma (posteriormente referido como "mieloma") Las células de mieloma a ser usadas para fusión celular no son particularmente limitadas y las células adecuadas pueden ser seleccionadas a partir de líneas de células conocidas. Sin embargo, en consideración de la conveniencia cuando un hibridoma es seleccionado de células fusionados, se prefiere usar una cepa deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa) cuyo procedimiento de selección ha sido establecido.
Más específicamente, ejemplos de la cepa deficiente de HGPRT incluyen X63 -Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Agl4(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, y BU.l derivado de ratones; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivado de ratas; y U266AR (SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1(NP41) derivado de humanos. Estas cepas deficientes de HGPRT están disponibles de, por ejemplo, la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC) o similares.
Estas cepas de células son subcultivadas en un medio apropiado tal como un medio de 8-azaguanina [un medio obtenido agregando 8-azaguanina a un medio de RPMI 1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, y suero de ternero fetal (posteriormente referido como "FCS")], Medio Dulbecco Modificado de Iscove (posteriormente referido como "IMDM"), o Medio Eagle Modificado de Dulbecco (posteriormente referido como "DMEM"). En este caso, 3 hasta 4 días antes de realizar la fusión celular, las células son subcultivadas en un medio normal [por ejemplo, un medio ASF104 (manufacturado por Ajinomoto Co., Ltd.) que contiene 10% de FCS] para asegurar no menos de 2 x 107 células al día de la fusión celular. (d) Fusión celular La fusión entre las células que producen anticuerpo y las células de mieloma puede ser realizada apropiadamente de conformidad con un método conocido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), bajo condiciones de manera que la velocidad de supervivencia de las células no se reduce excesivamente.
Como tal método, por ejemplo, un método químico en el cual las células que producen anticuerpo y las células de ielo a se mezclan en una solución que contiene un polímero tal como polietilenglicol a una alta concentración, un método físico que usa estimulación eléctrica, o similar, puede ser usado. Entre estos métodos, un ejemplo específico del método químico es como se describe posteriormente.
Es decir, en el caso donde el polietilenglicol es usado en la solución que contiene un polímero a una alta concentración, las células que producen anticuerpo y las células de mieloma son mezcladas en una solución de polietilenglicoles que tiene un peso molecular de 1500 hasta 6000, más preferiblemente 2000 hasta 4000 a una temperatura desde 30 hasta 40°C, preferiblemente desde 35 hasta 38°C por 1 hasta 10 minutos, preferiblemente 5 hasta 8 minutos. (e) Selección de un grupo de hibridomas El método para seleccionar hibridomas obtenido por la fusión de células descrito anteriormente no está particularmente limitado. Usualmente, se usa un método de selección HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550).
Este método es efectivo cuando los hibridomas se obtienen usando las células de mieloma de una cepa deficiente de HGPRT en la cual no pueden sobrevivir en la presencia de aminopterina.
Es decir, cultivando células e hibridomas no fusionados en un medio HAT, solamente los hibridomas resistentes a aminopterina son selectivamente dejados sobrevivir y proliferar. (f) División en clon de células únicas (clonación) Como un método de clonación para hibridomas, puede ser usado un método conocido tal como un método de metilcelulosa, un método de agarosa suave, o un método de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. and Stanlcy, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos métodos, particularmente, un método de cultivo tridimensional tal como un método de metilcelulosa, es preferido. Por ejemplo, los grupos de hibridomas producidos por fusión celular son suspendidos en un medio de metilcelulosa tal como Medio de Selección D de ClonaCell-HY (manufacturado por StemCell Technologies, inc., #03804) y cultivado. Entonces, las colonias de hibridoma formadas son recolectadas, de este modo se pueden obtener hibridomas monoclonales. Las colonias de hibridoma respectivas recolectadas son cultivadas, y un hibridoma el cual ha sido confirmado por tener un titulador de anticuerpo estable en un sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido es seleccionado como una cepa de hibridoma que produce anticuerpo monoclonal B7-H3.
Ejemplos de la cepa de hibridoma de este modo establecida incluyen el hibridoma M30 de B7-H3. En esta descripción, un anticuerpo producido por el hibridoma M30 de B7-H3 es referido como el "anticuerpo M30" o simplemente "M30".
La cadena pesada del anticuerpo M30 tiene una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 20 en el Listado de Secuencias. Además, la cadena ligera del anticuerpo M30 tiene una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 21 en el Listado de Secuencias. En la secuencia de aminoácido de cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 20 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 1 hasta 19 es una secuencia de señal, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 es una región variable, y una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 142 hasta 471 es una región constante. Además, en la secuencia de aminoácido de cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 21 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 1 hasta 22 es una secuencia de señal, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 23 hasta 130 es una región variable, y una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 131 hasta 235 es una región constante. (g) Preparación del anticuerpo monoclonal por cultivo de hibridoma Cultivando el hibridoma así seleccionado, un anticuerpo monoclonal se puede obtener eficientemente. Sin embargo, previo al cultivo, se prefiere realizar la selección de un hibridoma el cual produce un anticuerpo monoclonal objetivo.
En tal selección, un método conocido puede ser empleado.
La medición del titulador de anticuerpo en la invención se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, un método de ELISA explicado en el punto (b) descrito anteriormente.
El hibridoma obtenido por el método descrito anteriormente puede ser almacenado en un estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80°C o por debajo.
Después de la terminación de la clonación, el medio es cambiado de un medio HT a un medio normal, y el hibridoma es cultivado.
El cultivo a gran es cala se realiza por cultivo de rotación usando una botella de cultivo grande o por cultivo giratorio. A partir del sobrenadante obtenido por el cultivo a gran escala, un anticuerpo monoclonal el cual se une específicamente a la proteína de la invención se puede obtener por purificación usando un método conocido por aquellos expertos en la téenica tal como filtración en gel.
Además, el hibridoma se inyecta en la pozo abdominal de un ratón de la misma cepa como el hibridoma (por ejemplo, el BALB/c descrito anteriormente) o un ratón Nu/Nu para proliferar el hibridoma, de este modo se pueden obtener ascitos que contienen una gran cantidad de anticuerpo monoclonal de la invención se puede obtener.
En el caso donde el hibridoma es administrado en la pozo abdominal, si un aceite mineral tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano) es administrado 3 hasta 7 días previo a este, se puede obtener una gran cantidad de ascitos.
Por ejemplo, un inmunosupresor es previamente inyectado en la pozo abdominal de un ratón de la misma cepa como el hibridoma para inactivar las células T. 20 días después de esto, 106 a 107 células de clon de hibridoma son suspendidas en un medio libre de suero (0.5 mi), y la suspensión es administrada en la pozo abdominal del ratón. En general, cuando el abdomen es expandido y llenado con los ascitos, los ascitos son recolectados del ratón. Por este método, el anticuerpo monoclonal se puede obtener a una concentración la cual es cercana a 100 veces o mucho más que en la solución de cultivo.
El anticuerpo monoclonal obtenido por el método descrito anteriormente puede ser purificado por un método descrito en, por ejemplo, Weir, D. M. : Handbook de Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
El anticuerpo monoclonal obtenido de este modo tiene alta especificidad del antígeno para B7-H3. (h) Ensayo de anticuerpo monoclonal El isotipo y subclases del anticuerpo monoclonal de este modo obtenido pueden ser determinados como sigue.
Primero, ejemplos del método de identificación incluyen un método de Ouchterlony, un método de ELISA, y un método de RIA.
Un método de Ouchterlony es simple, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, se requiere una operación de condensación.
Por otro lado, cuando se usa un método de ELISA o un método de RIA, haciendo reaccionar directamente el sobrenadante de cultivo con una fase sólida adsorbida por el antígeno y usando anticuerpos que corresponden a varios tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulina como anticuerpos secundarios, se puede identificar el isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal.
Además, como un método más simple, un kit de identificación comercialmente disponible (por ejemplo, Mouse Tiper Kit manufacturado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similares también puede ser usado.
Además, la determinación cuantitativa de una proteína puede ser realizada por el método Folin Lowcy y un método de cálculo con base en la absorbancia a 280 nm [1.4 (OD 280) = Inmunoglobulina 1 mg/ml].
Además, aún cuando el anticuerpo monoclonal es obtenido de manera separada e independientemente para realizar nuevamente las etapas de (a) hasta (h) en (2), es posible obtener un anticuerpo que tiene una actividad citotóxica equivalente a aquella del anticuerpo M30. Como un ejemplo de este anticuerpo, un anticuerpo el cual se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30 puede ser ejemplificado. El M30 reconoce un epítopo en el dominio IgCl o IgC2, el cual es un dominio en el dominio extracelular de B7-H3, y se une al dominio IgCl o el dominio IgC2 o ambos. Por lo tanto, como el epítopo para el anticuerpo de la invención, particularmente, un epítopo presente en el dominio IgC2 o IgC2 de B7-H3 puede ser ejemplificado. Si un anticuerpo monoclonal recientemente producido se une a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial a la cual el anticuerpo M30 se une, se puede determinar que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30. Además, confirmando que el anticuerpo monoclonal compite con el anticuerpo M30 para la unión a B7-H3 (es decir, el anticuerpo monoclonal inhibe la unión entre el anticuerpo M30 y B7-H3), se puede determinar que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30 aún si la secuencia o estructura del epítopo específica no ha sido determinada. Cuando se confirma que el anticuerpo monoclonal se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30, se espera fuertemente que el anticuerpo monoclonal tenga una actividad citotóxica equivalente a aquella del anticuerpo M30. (3) Otros anticuerpos El anticuerpo de la invención incluye no solamente el anticuerpo monoclonal descrito anteriormente contra el B7-H3 sino también un anticuerpo recombinante obtenido por modificación artificial con el propósito de disminuir la antigenicidad heteróloga a humanos tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos pueden ser producidos usando un método conocido.
Como el anticuerpo quimérico, un anticuerpo en el cual las regiones variable y constante de anticuerpo se derivan de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico en el cual una región variable de anticuerpo derivada de ratón o rata está conectada a una región constante de anticuerpo derivada de humano puede ser ejemplificada (véase Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 6851- 6855, (1984)).
Como el anticuerpo humanizado, un anticuerpo obtenido integrando solamente una región determinante de complementariedad (CDR) en un anticuerpo derivado de humano (véase Nature (1986) 321, pp. 522-525), y un anticuerpo obtenido injertando una parte de los residuos de aminoácido del armazón así como también la secuencia de CDR a un anticuerpo humano por un método de injerto-CDR (WO 90/07861), pueden ser ejemplificados.
Sin embargo, el anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo M30 no se limita a un anticuerpo humanizado específico tan pronto como el anticuerpo humanizado tiene todos los 6 tipos de secuencias de CDR del anticuerpo M30 y tiene un actividad antitumoral. La región variable de cadena pesada del anticuerpo M30 tiene la CDRH1 (NYVMH) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 3 en el Listado de Secuencias, la CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 4 en el Listado de Secuencias, y la CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 5 en el Listado de Secuencias. , la región variable de cadena ligera del anticuerpo M30 tiene la CDRL1 (RASSRLIYMH) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 6 en el Listado de Secuencias, la CDRL2 (ATSNLAS) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 7 en el Listado de Secuencias, y la CDRL3 (QQWNSNPPT) que consiste de una secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 8 en el Listado de Secuencias.
Como un ejemplo del anticuerpo humanizado de un ratón anticuerpo M30, una combinación arbitraria de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de cualquiera de (1) una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9, 10, 11, o 12 en el Listado de Secuencias, (2) una secuencia de aminoácido que tiene una homología de al menos 95% o más con la secuencia de aminoácido (1) descrita anteriormente, y (3) una secuencia de aminoácido en donde uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácido (1) descrita anteriormente son suprimidos, sustituidos o agregados y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de cualquiera de (4) una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19 en el Listado de Secuencias, (5) una secuencia de aminoácido que tiene una homología de al menos 95% o más con la secuencia de aminoácido (4) descrita anteriormente, y (6) una secuencia de aminoácido en donde uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácido (4) descrita anteriormente son suprimidos, sustituidos o agregados puede ser ejemplificada.
El término "varios" como se usan en la presente se refiere de 1 hasta 10, 1 hasta 9, 1 hasta 8, 1 hasta 7, 1 hasta 6, 1 hasta 5, 1 hasta 4, 1 hasta 3, o 1 o 2.
Como la sustitución de aminoácido en esta descripción, una sustitución de aminoácido conservadora es preferida. La sustitución de aminoácido conservadora se refiere a una sustitución que ocurre dentro de un grupo de aminoácidos relacionados con cadenas secundarias de aminoácidos. Grupos de aminoácido preferidos son como sigue: un grupo acídico (ácido aspártico y ácido glutámico); un grupo básico (lisina, arginina, e histidina); un grupo no polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, y triptofano); y una familia polar no cargada (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, y tirosina). Grupos de aminoácido más preferido son como sigue: un grupo hidroxi alifático (serina y treonina); un grupo que contiene amida (asparagina y glutamina); un grupo alifático (alanina, valina, leucina, e isoleucina); y un grupo aromático (fenilalanina, triptofano, y tirosina). Esta sustitución de aminoácido es preferiblemente realizada dentro de un intervalo el cual no deteriora las propiedades de una sustancia que tiene la secuencia de aminoácido original.
Como un anticuerpo el cual tiene una combinación preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrita anteriormente, un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 de la SEQ ID NO: 16, puede ser ejemplificada.
Además, como un anticuerpo el cual tiene una combinación más preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrita anteriormente, un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 471 de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 233 de la SEQ ID NO: 16, puede ser ejemplificada.
Además, como un anticuerpo el cual tiene otra combinación más preferida de una cadena pesada y una cadena ligera descrita anteriormente, un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 15; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 16; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 17; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 18; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 19; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 13; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 14; un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 15; y un anticuerpo que consiste de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 16, puede ser ejemplificada.
Combinando una secuencia que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácido de cadena pesada descrita anteriormente con una secuencia que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácido de cadena ligera descrita anteriormente, es posible seleccionar un anticuerpo que tiene una actividad citotóxica equivalente a aquella de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente. Tal homología es en general una homología de 80% o más, preferiblemente una homología de 90% o más, más preferiblemente una homología de 95% o más, muy preferiblemente una homología de 99% o más. Además, combinando una secuencia de aminoácido en donde uno a varios residuos de aminoácido son sustituidos, suprimidos o agregados en la cadena pesada o secuencia de aminoácido de cadena ligera, también es posible seleccionar un anticuerpo que tiene una actividad citotóxica equivalente a aquella de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente.
La homología entre dos secuencias de aminoácido puede ser determinada usando parámetros de falta del algoritmo Blast versión 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Scháffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.25: 3389-3402). El algoritmo Blast puede también ser usado a través de la Internet accesando el sitio www.ebí .nlm.nih.gov/blast.
En la secuencia de aminoácido de cadena pesada representada por la SEQ ID NO: 9, 10, 11 o 12 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 1 hasta 19 es una secuencia de señal, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 20 hasta 141 es una región variable, y una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 142 hasta 471 es una región constante. Las secuencias de las SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12 se muestran en la Figura 3, 4, 5 y 6 respectivamente. Además, en la secuencia de aminoácido de cadena ligera representada por la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 en el Listado de Secuencias, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 1 hasta 20 es una secuencia de señal, una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 21 hasta 128 es una región variable, y una secuencia de aminoácido que consiste de los residuos de aminoácido 129 a 233 es una región constante. Las secuencias de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 se muestran en la Figura 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 respectivamente.
Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano el cual se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30. Un anticuerpo humano anti-B7-H3 se refiere a un anticuerpo humano que tiene solamente una secuencia de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano. El anticuerpo humano anti-B7-H3 se puede obtener por un método usando un ratón que produce anticuerpo humano que tiene un fragmento de cromosoma humano que comprende genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp.133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp.722-727, etc.).
Tal ratón que produce anticuerpo humano puede ser creado específicamente como sigue. Un animal genéticamente modificado en el cual los loci del gen de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina endógena han sido alterados, y preferiblemente, los loci del gen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana han sido introducidos mediante un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC, por sus siglas en inglés) o similares, son creados produciendo un animal agénico y un animal transgénico y apareando esto animales .
Además, de conformidad con una téenica de ADN recombinante, usando cADNs que codifican cada una de tales cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano, y preferiblemente un vector que comprende tales cADNs, las células eucarióticas son transformadas, y una célula transformante la cual produce un anticuerpo monoclonal humano recombinante es cultivada, de este modo el anticuerpo también se puede obtener a partir del sobrenadante de cultivo.
Aquí, como el hospedero, por ejemplo, pueden ser usadas células eucarióticas, preferiblemente células de mamífero tales como células CHO, linfocitos, o células de mieloma .
Además, también se conoce un método para obtener un anticuerpo humano derivado del despliegue de fago seleccionado de una biblioteca humana de anticuerpo (véase Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp.427-431, etc.).
Por ejemplo, puede ser usado un método de despliegue de fago en el cual una región variable de un anticuerpo humano es expresada en la superficie de un fago como un anticuerpo de cadena única (scFv), y se selecciona un fago el cual se une a un antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp.1105-1116).
Analizando el gen del fago seleccionado con base en la unión a un antígeno, se puede determinar una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano el cual se une a un antígeno.
Si se determina la secuencia de ADN del scFv el cual se une a un antígeno, un anticuerpo humano se puede obtener preparando un vector de expresión que comprende la secuencia e introduciendo el vector en un hospedero apropiado para expresarlo (documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol . (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp.1105-1116).
Si un anticuerpo humano recientemente producido se une a un péptido parcial o estructura terciaria parcial a la cual el anticuerpo M30 se une, se puede determinar que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30. Además, confirmando que el anticuerpo humano compite con el anticuerpo M30 para la unión a B7-H3 (es decir, el anticuerpo humano inhibe la unión entre el anticuerpo M30 y B7-H3), se puede determinar que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30 aún si la secuencia o estructura de epítopo específica no ha sido determinada. Cuando se confirma que el anticuerpo humano se une al mismo epítopo como el anticuerpo M30, el anticuerpo humano es fuertemente esperado por tener una actividad citotóxica equivalente a aquella del anticuerpo M30.
Los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos humanos obtenidos por el método descrito anteriormente son evaluados por las propiedades de unión a un antígeno por un método conocido o similares, y un anticuerpo preferido puede ser seleccionado.
Como un ejemplo de otros índices para uso en la comparación de las propiedades de los anticuerpos, la estabilidad de los anticuerpos puede ser ejemplificada. La calorimetría de barrido diferencial (DSC) es un dispositivo capaz de medir rápidamente y exactamente una temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) para ser usada como un índice favorable de la estabilidad conformacional relativa de las proteínas. Midiendo los valores de Tm usando DSC y comparando los valores, una diferencia en la estabilidad térmica puede ser comparada. Se conoce que la estabilidad de almacenamiento de los anticuerpos muestra alguna correlación con la estabilidad térmica de los anticuerpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), y un anticuerpo preferido puede ser seleccionado usando estabilidad térmica como un índice. Ejemplos de otros índices para seleccionar anticuerpos incluyen las siguientes características: el rendimiento en una célula hospedera apropiada es alto; y la agregabilidad en una solución acuosa es baja. Por ejemplo, un anticuerpo el cual muestra el rendimiento más alto no siempre muestra la estabilidad térmica más alta, y por lo tanto, es necesario seleccionar un anticuerpo más adecuado para la administración a humanos haciendo una evaluación comprehensiva con base en los índices descritos anteriormente.
En la invención, una variante modificada del anticuerpo también se incluye. La variante modificada se refiere a una variante obtenida sometiendo el anticuerpo de la invención a modificación química o biológica. Ejemplos de la variante químicamente modificada incluyen variantes químicamente modificadas enlazando una porción química a un esqueleto de aminoácido, variantes químicamente modificadas con una cadena de carbohidrato N-ligada u O-ligada, etc. Ejemplos de la variante biológicamente modificada incluyen variantes obtenidas por modificación post-traduccional (tal como glicosilación N-ligada u 0-ligada, procesamiento N- o C-terminal, desamidación, isomerización de ácido aspártico, u oxidación de metionina), y variantes en las cuales un residuo de metionina ha sido agregado al N-término siendo expresado en una célula hospedera procariótica.
Además, un anticuerpo etiquetado para así permitir la detección o aislamiento del anticuerpo o un antígeno de la invención, por ejemplo, un anticuerpo etiquetado con la enzima, un anticuerpo etiquetado con fluorescencia, y un anticuerpo etiquetado de afinidad también son incluidos en el significado de la variante modificada. Tal variante modificada del anticuerpo de la invención es útil para mejorar la estabilidad y retención de sangre del original anticuerpo de la invención, reduciendo la antigenicidad del mismo, detectando o aislando este anticuerpo o un antígeno, y así sucesivamente.
Además, regulando la modificación de un glicano el cual está ligado al anticuerpo de la invención (glicosilación, desfucosilación, etc.), es posible mejorar la actividad citotóxica celular dependiente del anticuerpo. Como la téenica para regular la modificación de un glicano de anticuerpos, se conocen los documentos WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140. Sin embargo, la técnica no está limitada a esta. En el anticuerpo de la invención, un anticuerpo en el cual la modificación de un glicano es regulada, también está incluido.
En el caso donde un anticuerpo es producido aislando primero un gen de anticuerpo y después introduciendo el gen en un hospedero apropiado, puede ser usada una combinación de un hospedero apropiado y un vector de expresión apropiado. Ejemplos específicos del gen de anticuerpo incluyen una combinación de un gen que codifica una secuencia de cadena pesada de un anticuerpo descrito en esta descripción y un gen que codifica una secuencia de cadena ligera del mismo. Cuando una célula hospedera es transformada, es posible insertar el gen de la secuencia de cadena pesada y el gen de la secuencia de cadena ligera en el mismo vector de expresión, y también diferentes vectores de expresión de manera separada.
En el caso donde las células eucarióticas son usadas como el hospedero, pueden ser usadas células animales, células vegetales, y microorganismos eucarióticos. Como las células animales, las células de mamífero, por ejemplo, células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp.175- 182, ATCC CRL-1650), N1H3T3 de fibroblasto murino (ATCC No.
CRL-1658), y cepas deficientes de dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp.4126-4220) de células de ovario de hámster Chino (células CHO; ATCC: CCL-61) pueden ser ejemplificadas.
En el caso donde se usan células procarióticas, por ejemplo, Escherichia coli y Bacillus subtilis pueden ser ejemplificadas.
Introduciendo un gen de anticuerpo deseado en estas células a través de la transformación, y cultivando las células in vitro de este modo transformadas, se puede obtener el anticuerpo. En el método de cultivo descrito anteriormente, el rendimiento puede algunas veces variar dependiendo de la secuencia del anticuerpo, y por lo tanto, es posible seleccionar un anticuerpo el cual es fácilmente producido como un farmacéutico usando el rendimiento como un índice entre los anticuerpos que tienen una actividad de unión equivalente. Por lo tanto, en el anticuerpo de la invención, un anticuerpo obtenido por un método para producir un anticuerpo, caracterizado por incluir una etapa de cultivar la célula hospedera transformada y una etapa para recolectar un anticuerpo deseado a partir de un producto cultivado en la etapa de cultivo también se incluye.
Se conoce que un residuo de lisina en el término carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en una célula de mamífero cultivada es suprimido (Journal de Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), y también se conoce que dos residuos de aminoácido (glicina y lisina) en el término carboxilo de la cadena pesada de un anticuerpo producido en una célula de mamífero cultivada son suprimidos y un residuo de prolina recientemente localizado en el término carboxilo es amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Sin embargo, tal supresión y modificación de la secuencia de cadena pesada no afecta la afinidad de unión al antígeno, y la función efectora (la activación de un complemento, la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, etc.) del anticuerpo. Por lo tanto, en la invención, un anticuerpo sometido a tal modificación también está incluido, y una variante de supresión en la cual uno o dos aminoácidos han sido suprimidos en el término carboxilo de la cadena pesada, una variante obtenida por amidación de la variante de supresión (por ejemplo, una cadena pesada en la cual el residuo de prolina carboxilo terminal ha sido amidada), y similares pueden ser ejemplificados. El tipo de variante de supresión que tiene una supresión en el término carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo de conformidad con la invención no se limita a las variantes anteriores en la medida en que la afinidad de unión al antígeno y la función efectora son conservadas. Las dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo de conformidad con la invención pueden ser de un tipo seleccionado del grupo que consiste de una cadena pesada de longitud completa y la variante de supresión descrita anteriormente, o pueden ser de dos tipos en combinación seleccionados a partir de estos. La relación de la cantidad de cada uno de las variantes de supresión puede ser afectada por el tipo de células de mamífero cultivadas las cuales producen el anticuerpo de conformidad con la invención y las condiciones de cultivo, sin embargo, un caso donde un residuo de aminoácido en el término carboxilo ha sido suprimido en tanto las dos cadenas pesadas contenidas como componentes principales en el anticuerpo de conformidad con la invención pueden ser ejemplificado.
Como isotipo del anticuerpo de la invención, por ejemplo, puede ser ejemplificado el IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), e IgGl o IgG2 pueden ser ejemplificados preferiblemente.
Como la función del anticuerpo, en general una actividad de unión al antígeno, una actividad de neutralización de la actividad de un antígeno, una actividad de mejoramiento de la actividad de un antígeno, una actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) pueden ser ejemplificadas. La función del anticuerpo de la invención es una actividad de unión a B7-H3, preferiblemente una actividad de fagocitosis mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCP), más preferiblemente una actividad de citotoxicidad (actividad antitumoral) a una célula de tumor mediada por una actividad de ADCP. Además, el anticuerpo de la invención puede tener una actividad de ADCC y/o una actividad de CDC además de una actividad de ADCP.
El anticuerpo obtenido puede ser purificado a homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo puede ser realizada empleando un método convencional de separación y purificación de proteína. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser separado y purificado seleccionando y combinando apropiadamente la cromatografía en columna, filtración de filtro, ultraprecipitación, precipitación de sal, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida preparativa, electroforesis de enfoque isoeléctrico, y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lañe, Coid Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el método no está limitado a estos.
Ejemplos de tal cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, y cromatografía de adsorción.
Tal cromatografía puede ser realizada empleando cromatografía líquida tal como HPLC o FPLC.
Como una columna a ser usada en cromatografía de afinidad, una columna de Proteína A y una columna de Proteína G pueden ser ejemplificadas. Por ejemplo, como una columna usando una columna de Proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) y similares pueden ser ejemplificadas Además, usando un portador que tiene un antígeno inmovilizado en este, el anticuerpo también puede ser purificado utilizando la propiedad de unión del anticuerpo al antígeno.
Compuesto Antitumoral Se explica el compuesto antitumoral a ser conjugado con el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención. El compuesto antitumoral no está particularmente limitado si es un compuesto que tiene un efecto antitumoral y un grupo sustituyente o una estructura parcial que permite la conexión a una estructura enlazadora. Cuando una parte o todo el enlazador son desdoblados en las células de tumor, la porción del compuesto antitumoral es liberada para presentar el efecto antitumoral del compuesto antitumoral. Como el enlazador es desdoblado en una posición de conexión al fármaco, el compuesto antitumoral es liberado en su estructura intrínseca para presentar su efecto antitumoral intrínseco.
Ejemplos del compuesto antitumoral pueden incluir doxorubicina, daunorubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agente antitumoral a base de platino (cisplatino o derivados de los mismos), taxol o derivados de los mismos, y camptotecina o derivados de los mismos (el agente antitumoral se describe en la Patente Japonesa Abierta al público No. 6-87746). En el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, el exatecano como un derivado de camptotecina (((1S,9S)-1-amino- 9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 10,13(9H,15H)-diona; mostrado en la siguiente fórmula) puede ser preferiblemente usado.
Fórmula 43 Aunque tiene un excelente efecto antitumoral, el exatecano no ha sido comercializado como un fármaco antitumoral. El compuesto puede ser fácilmente obtenido por un método conocido y el grupo amino en la posición 1 puede ser preferiblemente usado como una posición de conexión a la estructura enlazadora. Además, aunque el exatecano también puede ser liberado en células tumorales mientras parte del enlazador está todavía unida a estas, es un excelente compuesto que presenta un excelente efecto antitumoral aún en tal caso.
Con respecto al conjugado de anticuerpo-fármaco, el número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo es un factor clave que tiene una influencia en la eficiencia y seguridad. Se realiza la producción del conjugado de anticuerpo-fármaco definiendo la condición de reacción incluyendo las cantidades de uso de materias primas y reactivos para la reacción para así tener un número constante de moléculas de fármaco, una mezcla que contiene diferentes números de moléculas de fármaco en general se obtiene distinto de la reacción química de un compuesto de bajo peso molecular. El número de fármacos conjugados en una molécula de anticuerpo es expresado o especificado por el valor promedio, es decir, el número promedio de moléculas de fármaco conjugado. A menos que se describa específicamente de otro modo como un principio, el número de moléculas de fármaco conjugado se refiere a un valor promedio excepto en un caso en el cual representa un conjugado de anticuerpo- fármaco que tiene un número específico de moléculas de fármaco conjugado que son incluidas una mezcla del conjugado de anticuerpo-fármaco que tiene diferentes números de moléculas de fármaco conjugado. El número de moléculas de exatecano conjugadas a una molécula de anticuerpo es controlable, y como un número promedio de moléculas de fármaco conjugado por anticuerpo, alrededor de 1 hasta 10 exatecanos se pueden unir. Preferiblemente, es 2 hasta 8, y más preferiblemente 3 hasta 8. No obstante, una persona experta en la téenica puede diseñar una reacción para conjugar un número requerido de moléculas de fármaco a un molécula de anticuerpo con base en la descripción de los Ejemplos de la presente solicitud y puede obtener un anticuerpo conjugado con un número controlado de moléculas de exatecano.
Debido a que el exatecano tiene una estructura de camptotecina, se conoce que el equilibrio se ajusta a una estructura con un anillo de lactona cerrado (anillo cerrado) en un medio acídico acuoso (por ejemplo, pH 3 o menos) pero se ajusta a una estructura con un anillo de lactona abierto (anillo de lactona) en un medio básico acuoso (por ejemplo, pH 10 o menos). Un fármaco conjugado se introduce con un residuo de exatecano que corresponde a la estructura de anillo cerrado y la estructura de anillo abierto también se espera tenga el mismo efecto antitumoral y es innecesario decir que cualquiera de ellos está dentro del alcance de la presente invención.
Estructura enlazadora Con respecto al conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, se explica la estructura enlazadora para conjugar un fármaco antitumoral al anticuerpo. El enlazador tiene una estructura de la siguiente estructura: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.
El anticuerpo está conectado a la terminal de L1 (terminal opuesta a la conexión a L2), y el fármaco antitumoral está conectado a la terminal de Lc (terminal opuesta a la conexión a Lb). n1 representa un número entero de 0 hasta 6 y es preferiblemente un número entero de 1 hasta 5, y más preferiblemente 1 hasta 3. 1. L1 L1 es una porción en el enlazador representada por la siguiente estructura: -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-, -CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0) -C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS) o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)- En lo anterior, n2 es un número entero de 2 hasta 8, n3 es un número entero de 1 hasta 8, y n4 es un número entero de 1 hasta 8.
En el enlazador que tiene una estructura representada por -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- de L1, (Succinimid-3-il-N) tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 44 La posición 3 de la estructura parcial anterior está en una posición de conexión al anticuerpo. El enlace al anticuerpo en la posición 3 es caracterizado por la unión con la formación de tioéter. Por otro lado, el átomo de nitrógeno en la posición 1 de la porción de estructura está conectado al átomo de carbono de metileno el cual está presente dentro del enlazador que incluye la estructura. Específicamente, (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-L2- es una estructura representada por la siguiente fórmula (aquí, "anticuerpo-S-" se origina a partir de un anticuerpo).
Fórmula 45 - - En la fórmula, n2 es un número entero de 2 hasta 8, y preferiblemente 2 hasta 5.
En el enlazador que tiene una estructura representada por -CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)- de L1, n3 es un número entero de 1 hasta 8, preferiblemente 2 hasta 6. Este enlazador está conectado al anticuerpo en su átomo de carbono de terminal metileno y tiene la siguiente estructura para conexión mediante la formación de tioéter, como con el enlazador precedente (aquí, "anticuerpo-S- " se origina a partir de un anticuerpo).
Anticuerpo-S-CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-L2-.
En el enlazador que tiene una estructura representada por -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L·1, (N-li-3-diminiccuS)-" tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 46 En esta porción de estructura, el átomo de nitrógeno en la posición 1 está conectado al átomo de carbono de metileno presente en la estructura enlazadora que contiene esta estructura. El átomo de carbono en la posición 3 está conectado al átomo de azufre terminal de -S-(CH2)n6-C(=0)- de L2 en el enlazador. Esta porción -S-(CH2)n6-C(=0)- de L2 en el enlazador forma una estructura de enlazador combinada solamente con -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1 en el enlazador. En lo anterior, "-cic.Hex (1,4)-" contenido en el enlazador representa un grupo 1,4-ciclohexileno. En el enlazador, -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- está conectado al anticuerpo con formación de enlace amida en su carbono carbonilo terminal (aquí, "anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo).
Fórmula 47 A El grupo amino del anticuerpo para esta formación de enlace amida es el grupo amino terminal de una cadena lateral de un residuo de lisina en el anticuerpo o un grupo amino en el N-terminal del anticuerpo. Tal enlazador de una estructura puede conectarse por la formación de enlace áster con el grupo hidroxi de un aminoácido en el anticuerpo distinto de tal enlace amida.
La porción de estructura "-cic.Hex (1,4)-" contenida en tal enlazador puede ser un grupo alquileno cíclico saturado divalente distinto del grupo 1,4-ciclohexileno, es decir, un grupo hidrocarburo saturado cíclico divalente tal como un grupo ciclobutileno, un grupo ciclopentileno, un grupo cicloheptaleno, o un grupo ciclooctaleno, un grupo hidrocarburo aromático divalente tal como un grupo fenileno o un grupo naftileno, o un grupo heterocíclico divalente de 5 o 6 elementos saturado, parcialmente saturado, o aromático que contiene 1 o 2 heteroátomos. Alternativamente, esta porción puede ser un grupo alquileno divalente que tiene 1 hasta 4 átomos de carbono. La conexión al grupo divalente puede ocurrir adyacente a las posiciones o en las posiciones distantes.
En el enlazador que tiene una estructura representada por -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)- como L1, n4 es un número entero de 1 hasta 8, y preferiblemente 2 hasta 6. Este enlazador es también conectado por la formación de enlace amida en su grupo carbonilo terminal con un grupo amino del anticuerpo, como con los enlazadores mencionados anteriormente (véase la siguiente fórmula; en la estructura de la misma, "anticuerpo-NH-" se origina a partir de un anticuerpo).
Anticuerpo-NH-C (=0)-(C¾ )n4-C (=0)-L2-.
Ejemplos específicos de L1 en el enlazador pueden incluir -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C (=0)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C (=0)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C (=0)- - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - -CH2C (=0) NH-CH2-C (=0) - , -CH2C(=0)NH-CH2CH2-C(=0) - -CH2C(=0)NH-CH2CH2CH2-C(=0) - -CH2C(=0)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=0) - -CH2C (=0) NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - -C (=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(=0)-Aril-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C (=0)-cic.Het-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(=0) -CH2CH2-C(=0) - -C (=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - -C (=0) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - -C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) - -C (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - .
(Arilo representa un grupo hidrocarburo aromático divalente, y cic.Het representa un grupo heterocíclico cíclico divalente). 2. L2 L2 es un enlazador representado por la siguiente estructura: -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=0)-, o -S-(CH2)n6-C(=0)-, L2 puede no estar presente, y en tal caso, L2 es un enlace simple. En lo anterior, n5 es un número entero de 1 hasta 6, y n6 es un número entero de 1 hasta 6.
En el enlazador que tiene una estructura de -NH- (CH2CH20)n5-CH2-CH2-C(=0)- como L2, n5 es un número entero de 1 hasta 6, y preferiblemente 2 hasta 4. Esta porción en el enlazador está conectada a L1 en su grupo amino terminal y está conectada a Lp en su grupo carbonilo en el otro terminal.
En el enlazador que tiene una estructura de -S- (CH2)n6-C(=0)- como L2, n6 es un número entero de 1 hasta 6, y preferiblemente 2 hasta 4.
Ejemplos específicos de L2 pueden incluir -NH-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-, -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-, -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-, -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-, -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2- - NH - CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2CH20 - CH2 CH20 - CH2CH20 - CH2CH2-C(=0)-.
Cuando L2 es -S-(CH2)ns-C (=0)-, L1 a ser combinado con este es -C (=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. Ejemplos específicos de -L1-L2- puede incluir -C (=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2- C(=0)- -C (=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2-C(=0)- -C (=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2CH2-C(=0)- -C (=0) -cic .Hex (1,4) -CH2- (N-li-3 -diminiccuS) -S- CH CH CH CH -C (=0) - -C(=0) -cic.Hex(l,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2CH CH2CH2-C(=0) - -C (=0) -cic .Hex (1 , 4) -CH2- (N-li-3 -diminiccuS) -S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - . 3. Lp El enlazador Lp es un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos. Específicamente, consiste de un residuo de oligopéptido en el cual 2 hasta 6 aminoácidos están ligados por un enlace peptídico. El enlazador Lp está conectado a L2 en su N-terminal y está conectado al grupo amino de la porción -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- del enlazador en su C-terminal. El amino ácido que constituye Lp en el enlazador no está particularmente limitado, sin embargo, ejemplos del mismo incluyen un L o D-aminoácido, preferiblemente un L-aminoácido. Y, puede ser un aminoácido que tiene una estructura tal como b-alanina, ácido e-aminocapropico, o ácido g-aminobutírico además de un a-aminoácido, además, puede ser un aminoácido de tipo no natural tal como aminoácido N-metilado.
La secuencia de aminoácido de Lp no está particularmente limitada, pero ejemplos del aminoácido constituyente incluyen fenilalanina (Phe; F), tirosina (Tyr,-Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutámico (Glu; E), y ácido aspártico (Asp; D). Entre ellos, ejemplos preferidos incluyen fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico. Dependiendo del tipo de aminoácido, el patrón de liberación de fármaco puede ser controlado. El número del aminoácido puede ser entre 2 hasta 7.
Ejemplos específicos de Lp pueden incluir -GGF- -DGGF- -(D-)D-GGF- -EGGF- -GGFG- -SGGF- -KGGF- -DGGFG- -GGFGG- -DDGGFG- -KDGGFG- -GGFGGGF- [en lo anterior, "(D-)D" representa un ácido D- aspártico].
Particularmente ejemplos preferidos de Lp para el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención pueden incluir -GGFG-.
En la estructura representada por -NH-ÍCH^n1- dentro del enlazador, n1 es un número entero de 0 hasta 6 y es preferiblemente un número entero de 1 hasta 5, y más preferiblemente 1 hasta 3. El grupo amino de esta porción está conectada al C-terminal de Lp en el enlazador. 4. La El enlazador La es representada por cualquiera de las estructuras -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, y -O- o es un enlace simple. En lo anterior, n7 es un número entero de 1 hasta 6, R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9- OH, n8 es un número entero de 1 hasta 4, y n9 es un número entero de 1 hasta 6.
La estructura amida -C(=0)-NH- dentro del enlazador La está conectada a Lb en su lado del átomo de nitrógeno. En la porción de estructura de -NR1-(CH2)n7- dentro de La, n7 es un número entero de 1 hasta 6, y preferiblemente 1 hasta 3. Esta porción está conectada a Lb en su lado metileno. R1 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono. El grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono puede ser lineal o ramificado. Ejemplos del mismo pueden incluir un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo isopropilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo tere-butilo, un grupo pentilo, un grupo isopentilo, un grupo 2-metilbutilo, un grupo neopentilo, un grupo 1-etilpropilo, un grupo hexilo, un grupo isohexilo, un grupo 4-metilpentilo, un grupo 3- metilpentilo, un grupo 2-metilpentilo, un grupo 1- metilpentilo, un grupo 3,3-dimetilbutilo, un grupo 2,2- dimetilbutilo, un grupo 1,1-dimetilbutilo, un grupo 1,2- dimetilbutilo, un grupo 1,3-dimetilbutilo, un grupo 2,3- dimetilbutilo y un grupo 2-etilbutilo. De ellos, un grupo metilo o un grupo etilo es preferido. Cuando R1 tiene una estructura representada por -(CH2)n8-C00H, n8 es un número entero de 1 hasta 4, y preferiblemente 1 o 2. Cuando R1 tiene una estructura representada por -(CH2)n9-OH, n9 es un número entero de 1 hasta 6, y preferiblemente 1 o 2. R1 es preferiblemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, -CH2C00H, -CH2CH2-COOH, o -CH2CH2-OH, y más preferiblemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o - CH2COOH. Además es preferiblemente un átomo de hidrógeno. La porción La del enlazador puede ser -O- o un enlace simple. 5 . Lb El enlazador Lb es cualquiera de las estructuras - CR2(-R3)-, -O-, y -NR4- o es un enlace simple. En lo anterior, R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o -(CH2)nc-0H, R4 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na es un número entero de 0 hasta 6, nb es un número entero de 1 hasta 4, y nc es un número entero de 0 hasta 4. Cuando na o nc es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí .
Cuando cada uno de R2 y R3 es un grupo alquilo, este grupo alquilo es interpretado como se define en el grupo alquilo de R1. Cuando R2 y R3 tienen una estructura de - (CH2)na-NH2, na es un número entero de 0 hasta 6, y preferiblemente 0, o es 3 hasta 5. Cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí. Cuando R2 y R3 tienen una estructura de -(CH2)nb-C00H, nb es un número entero de 1 hasta 4, y preferiblemente 1 o 2. Cuando R2 y R3 tienen una estructura de -(CH2)nc-OH, nc es un número entero de 0 hasta 4, y preferiblemente 1 o 2.
Cada uno de R2 y R3 es preferiblemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo etilo, -NH2, CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, - CH2CH2-COOH, -CH2OH, O -CH2CH2-OH, y más preferiblemente un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, -NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, - CH2C00H, -CH2CH2-COOH, -CH2OH, o -CH2CH2-0H. Son además preferiblemente átomos de hidrógeno.
Cuando R4 es un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, este grupo alquilo es interpretado como se define en el grupo alquilo de R1. R4 es preferiblemente un átomo de hidrógeno o un grupo metilo, y más preferiblemente un átomo de hidrógeno.
Ejemplos específicos de la estructura representada por -NH-(CH2)n1-!·3-!^- como el enlazador pueden incluir -NH-CH2- -NH-CH(-Me)- -NH-C(-Me)2- -NH-CH2-CHMe- -NH-CH(-CH2OH)- -NH-CH(-CH2C00H)- -NH-CH(-CH2CH2COOH)- -NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- -NH-CH2CH2- -NH-CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2-O- -NH-CH2CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2C(-Me)2- -NH-CH2CH2NH- -NH-CH2CH2NH-CH2- - NH - CH2 CH2NMe - CH2 - - NH - CH2 CH2NH - CH2 CH2 - - NH - CH2CH2NMe - CH2 CH2 - -NH-CH2CH2N(-CH2COOH) -CH2- -NH-CH2CH2N(-CH2CH20H) -CH2- -NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH) -CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2C (=0) -NHCH ( -CH2OH) - -NH-CH2CH2CH2C(=0) -NHCH(-CH2COOH) - -NH-CH2CH2CH2C (=0) -NHCH ( - CH2CH2CH2CH2NH2 ) - -NH-CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2CH2- - NH - CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 - -NH-CH2CH2CH2CH2CH (NH2) - .
De ellos, ejemplos preferidos de los mismos pueden incluir -NH-CH2- -NH-CH2-CH (Me) - -NH-CH(-CH20H) - -NH-CH ( -CH2CH2COOH) - -NH-CH2CH2- -NH-CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2-O- -NH-CH2CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2C ( -Me) 2- -NH-CH2CH2NH- -NH-CH2CH2NH-CH2- - NH - CH2 CH2NMe - CH2 - - NH - CH2 CH2NMe - CH2 CH2 - -NH-CH2CH2N(-CH2COOH) -CH2- -NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH) -CH2- -NH-CH2CH2N(-CH2CH20H) -CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2C(=0) -NHCH(-CH2OH) - -NH-CH2CH2CH2C (=0) -NHCH(-CH2COOH) - -NH-CH2CH2CH2- - NH - CH2 CH2 CH2 CH2 - -NH-CH2CH2CH2CH2CH2- .
Ejemplos más preferidos de los mismos pueden incluir -NH-CH2- -NH-CH2CH2- -NH-CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2-O- -NH-CH2CH2-O-CH2- -NH-CH2CH2NH- -NH-CH2CH2NH-CH2- -NH-CH2CH2N (-CH2COOH)-CH2- -NH-CH2CH2N(-CH2CH20H) -CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2C (=0) -NHCH(-CH2COOH) - - NH - CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2CH2CH2CH2CH2- .
Ejemplos preferidos adicionales de los mismos incluir -NH-(CH2)3-, -NH-CH2-O-CH2-, y -NH-(CH2)2-O-CH2-. 6. Lc El enlazador Lc es -CH2- o -C(=0)-. Tal enlazador está conectado al compuesto antitumoral. Lc del enlazador es más preferiblemente -C(=0)-.
En el enlazador, la longitud de cadena de -NH- (CH2)n1-La-Lb-Lc es preferiblemente una longitud de cadena de 4 hasta 7 átomos, y más preferiblemente una longitud de cadena de 5 o 6 átomos.
Con respecto al conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, cuando es transferido al interior de las células de tumor, la porción enlazadora es desdoblada y el derivado de fármaco que tiene una estructura representada por NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) es liberado para expresar una acción antitumoral. Ejemplos del derivado antitumoral que presenta un efecto antitumoral por liberación del conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención incluyen un derivado antitumoral que tiene una porción de estructura en la cual la estructura representada por -NH-(CH2)n1-La-Lb- del enlazador está unida con Lc y tiene un grupo amino terminal, y los particularmente preferidos incluyen los siguientes.
NH2-CH2CH2 -C (=0) - (NH-DX) NH2-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) NH2-CH2-O-CH2-C ( =0) - (NH-DX) NH2-CHCH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) No obstante, en caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=0)-(NH-DX), se confirmó que, como la estructura aminal en la molécula es inestable, nuevamente sufre una auto-degradación para liberar el siguiente H0-CH2-C(=0)-(NH-DX). Estos compuestos también pueden ser preferiblemente usados como un intermediario de producción del conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención.
Para el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención en el cual el exatecano es usado como un fármaco, es preferible que la porción de estructura de fármaco-enlazador que tiene la siguiente estructura [-L1-!^-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)] esté conectada a un anticuerpo. El número de conjugado promedio de la porción de estructura de fármaco-enlazador por anticuerpo puede ser 1 hasta 10. Preferiblemente, es 2 hasta 8, y más preferiblemente 3 hasta 8.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=0)- (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- - - - - - - - - - - - - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) Entre ellos, los más preferidos son los siguientes - - - - - - - - - - - - - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2 O - CH2 CH20 - CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) .
Con respecto a la estructura enlazadora para conjugar el anticuerpo y un fármaco en el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente solicitud, el enlazador preferido puede ser construido conectando las estructuras preferidas mostradas para cada parte del enlazador explicado anteriormente. Como para la estructura enlazadora, aquellos con la siguiente estructura pueden ser preferiblemente usados. No obstante, la terminal izquierda de la estructura está en una posición de conexión con el anticuerpo y la terminal derecha está en una posición de conexión con el fármaco .
- (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C (=0) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C (=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C (=0) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=0)- - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O- 0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- 0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - - ( Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH O- 2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- 2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - -CH2-C(=O) -NH-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - -C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- -C(=0) -cic .Hex (1, 4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - Entre ellos, los más preferidos son los siguientes.
-(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C (=0)-GGFG- H-CH2CH2CH2- - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- =0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH =0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH -C(=0) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C ( =O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - -c (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - c (=0) - -C (=0) -cic . Hex ( 1 , 4 ) -CH2- (N- li-3 -diminiccuS) -S- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2 - C ( =O) Los particularmente preferidos incluyen los siguientes .
- (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-0-CH2-C (=0) - - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - .
Método de producción Después, se proporcionan explicaciones para el método representativo para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención o un intermediario de producción del mismo. No obstante, los compuestos son una continuación descrita con el número de compuesto mostrado en cada fórmula de reacción. Específicamente, son referidas como un "compuesto de la fórmula (1)", un "compuesto (1)", o similares. Los compuestos con números distintos de aquellos también son descritos de manera similar. 1. Método de producción 1 El conjugado de anticuerpo-fármaco representado por la fórmula (1) en el cual el anticuerpo está unido a la estructura enlazadora mediante tioéter se puede producir por el siguiente método, por ejemplo.
Fórmula 48 AB - - - - - - - 2 1 En la fórmula, AB representa un anticuerpo con un grupo sulfhidrilo, y L1' representa L1 la estructura enlazadora en la cual el enlazador terminal es un grupo maleimidilo (fórmula mostrada abajo) Fórmula 49 (en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión) o el terminal es halógeno, y representa un grupo en el cual la porción -(Succinimidil-3-il-N)- en -(Succinimid-3- il-N)-(CH2)n2-C(=0)- de L1 es un grupo maleimidilo o un grupo halógeno -CH2C(=0)NH-(CH2)n3-C(=0)- en el cual el metileno terminal en -CH2C(=0)NH-(CH2)n3-C(=0)- de L1 es halogenado para formar haloacetamida. Además, el -(NH-DX) representa una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 50 y representa un grupo que es derivado removiendo un átomo de hidrógeno del grupo amino en la posición 1 de exatecano. Además, el compuesto de la fórmula (1) en la fórmula de reacción anterior se describe como una estructura en la cual una porción de estructura del fármaco al enlazador terminal se conecta con un anticuerpo. Sin embargo, es solamente la descripción dada con fines de conveniencia, y existen actualmente muchos casos en los cuales una pluralidad de las porciones de estructura está conectada a una molécula de anticuerpo. Lo mismo aplica a la explicación del método de producción descrito abajo.] Específicamente, el conjugado de anticuerpo-fármaco (1) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (2), el cual es obtenible por el método descrito abajo, con el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo.
El anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo se puede obtener por un método bien conocido en la téenica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Ejemplos incluyen: el reactivo Traut se hace reaccionar con el grupo amino del anticuerpo; N-succinimidil S-acetiltioalcanoatos se hacen reaccionar con el grupo amino del anticuerpo seguido por reacción con hidroxilamina; después de hacer reaccionar con N-succinimidil 3-(piridilditio)propionato, el anticuerpo se hace reaccionar con un agente de reducción; el anticuerpo se hace reaccionar con un agente de reducción tal como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, y clorhidrato de tris(2- carboxietil)fosfina (TCEP) para reducir el enlace de disulfuro en una parte de la articulación en el anticuerpo para formar un grupo sulfhidrilo, pero no está limitado a este.
Específicamente, usando 0.3 hasta 3 equivalentes molares de TCEP como un agente de reducción por disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo y hacer reaccionar con el anticuerpo en una solución amortiguadora que contiene un agente quelante, se puede obtener el anticuerpo con disulfuro parcialmente o completamente reducido en la parte de articulación en el anticuerpo. Ejemplos del agente quelante incluyen ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) y ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA). Puede ser usado a una concentración de 1 mM a 20 mM. Ejemplos de la solución amortiguadora la cual puede ser usada incluyen una solución de fosfato de sodio, borato de sodio, o acetato de sodio. Como un ejemplo específico, hacer reaccionar el anticuerpo con TCEP por 1 hasta 4 horas de 4°C a 37°C, se puede obtener el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo parcialmente o completamente reducido.
No obstante, realizando la reacción agregando un grupo sulfhidrilo a una porción de fármaco-enlazador, la porción de fármaco-enlazador puede ser conjugada por un enlace de tioéster.
Después, usando 2 hasta 20 equivalentes molares del compuesto (2) por el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo, se puede producir el conjugado de anticuerpo- fármaco (1) en el cual 2 hasta 8 moléculas de fármaco son conjugadas por anticuerpo. Específicamente, es suficiente que la solución que contiene el compuesto (2) disuelto en esta sea agregado a una solución amortiguadora que contiene el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo para la reacción. Aquí, ejemplos de la solución amortiguadora los cuales pueden ser usados incluyen solución de acetato de sodio, fosfato de sodio, y borato de sodio. El pH para la reacción es 5 a 9, y más preferiblemente la reacción se realiza cercana a pH 7. Ejemplos del solvente para disolver el compuesto (2) incluyen un solvente orgánico tal como dimetil sulfóxido (DIVISO), dimetil formamida (DMF), dimetil acetamida (DMA), y N-metil-2-piridona (NMP). Es suficiente que la solución de solvente orgánico que contiene el compuesto (2) disuelto en esta sea agregada de 1 hasta 20% en v/v a una solución amortiguadora que contiene el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo para la reacción. La temperatura de reacción es 0 hasta 37°C, más preferiblemente 10 hasta 25°C, y el tiempo de reacción es 0.5 a 2 horas. La reacción puede ser terminada desactivando la reactividad del compuesto sin reaccionar (2) con un reactivo que contiene tiol. Ejemplos del reactivo que contiene tiol incluyen cisteína y N-acetil-L-cisteína (NAC). Más específicamente, 1 hasta 2 equivalentes molares de NAC se agregan al compuesto (2) usado y, mediante incubación a temperatura ambiente por 10 hasta 30 minutos, la reacción puede ser terminada.
El conjugado de anticuerpo-fármaco producido (1) puede ser sometido a, después de la concentración, intercambio de amortiguador, purificación, y medición de la concentración del anticuerpo y número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo de conformidad con procedimiento comunes descritos abajo, identificación del conjugado de anticuerpo-fármaco (1).
Procedimiento común A: Concentración de solución acuosa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco A un contenedor Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation), se agregó una solución de anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco y la solución del anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco se concentró por centrifugación (centrífuga por 5 a 20 minutos de 2000 G a 3800 G) usando una centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.).
Procedimiento común B: Medición de la concentración de anticuerpo Usando un detector UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), la medición de la concentración del anticuerpo se realizó de conformidad con el método definido por el fabricante. En tal tiempo, se usó 280 nm del coeficiente de absorción diferente para cada anticuerpo (1.3 mLmg^enr1hasta 1.8 mLmg^cnr1).
Procedimiento común C-l: Intercambio de amortiguador para el anticuerpo La columna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japón Corporation) usando portador Sephadex G-25 se equilibró con amortiguador de fosfato (10 mM, pH 6.0) (es referido como PBS6.0/EDTA en la descripción) que contiene cloruro de sodio (137 mM) y ácido etilendiamina tetraacético (EDTA, 5 mM) de conformidad con el método definido por el manual de instrucciones del fabricante. La solución acuosa del anticuerpo se aplicó en una cantidad de 2.5 mL a una columna NAP-25 única, y después la fracción (3.5 mL) eluida con 3.5 mL de PBS6 .0/EDTA se recolectó. La fracción resultante se concentró por el Procedimiento común A. Después de medir la concentración del anticuerpo usando el Procedimiento común B, la concentración del anticuerpo se ajustó a 10 mg/mL usando PBS6.0/EDTA.
Procedimiento común C-2: Intercambio de amortiguador para el anticuerpo La columna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japón Corporation) usando portador Sephadex G-25 se equilibró con amortiguador de fosfato (50 mM, pH 6.5) (es referido como PBS6.5/EDTA en la descripción) que contiene cloruro de sodio (50 mM) y EDTA (2 mM) de conformidad con el método definido por el fabricante. La solución acuosa del anticuerpo se aplicó en una cantidad de 2.5 mL a una columna NAP-25 única, y después la fracción (3.5 mL) eluida con 3.5 mL de PBS6.5/EDTA se recolectó. La fracción resultante se concentró por el Procedimiento común A. Después de medir la concentración del anticuerpo usando el Procedimiento común B, la concentración del anticuerpo se ajustó a 20 mg/mL usando PBS6.5/EDTA.
Procedimiento común D-l: Purificación del conjugado de anticuerpo-fármaco La columna NAP-25 se equilibró con cualquier amortiguador seleccionado de amortiguador de fosfato comercialmente disponible (PBS7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), amortiguador de fosfato de sodio (10 mM, pH 6.0; es referido como PBS6.0) que contiene cloruro de sodio (137 mM), y amortiguador de acetato que contiene sorbítol (5%) (10 mM, pH 5.5; es referido como ABX en la descripción). La solución acuosa de la reacción del conjugado de anticuerpo- fármaco se aplicó en una cantidad de aproximadamente 1.5 mL a la columna NAP-25, y después se eluyó con el amortiguador en una cantidad definida por el fabricante para recolectar la fracción de anticuerpo. La fracción recolectada se aplicó nuevamente a la columna NAP-25 y, repitiendo 2 hasta 3 veces en el total del proceso de purificación de filtración en gel para elución con el amortiguador, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco que excluye el enlazador de fármaco no conjugado y un compuesto de bajo peso molecular clorhidrato de (tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L-cisteína (NAC), y dimetil sulfóxido).
Procedimiento común E: Medición de la concentración de anticuerpo en el conjugado de anticuerpo-fármaco y número promedio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo.
La concentración de fármaco conjugado en el conjugado de anticuerpo-fármaco puede ser calculada midiendo la absorbancia UV de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco a dos longitudes de onda de 280 nm y 370 nm, regido por realizar el cálculo mostrado abajo.
Debido a que la absorbancia total en cualquier longitud de onda es igual a la suma de la absorbancia de cada una de las especies químicas que absorben luz que se presentan en un sistema [aditividad de la absorbancia], cuando los coeficientes de absorción molar del anticuerpo y el fármaco permanecen los mismos antes y después de la conjugación entre el anticuerpo y el fármaco, la concentración del anticuerpo y la concentración de fármaco en el conjugado de anticuerpo-fármaco son expresados en las siguientes ecuaciones.
A280 = AD , 28o + AA , 28o = ED, 28OCD + EA, 28OCA Ecuación ( 1 ) A370 = AD, 37O+ AA, 370 = D, 37OCD + EA, 37OCA Ecuación ( 2 ) En lo anterior, A280 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco a 280 nm, A370 representa la absorbancia de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco a 370 nm, AA,2SO representa la absorbancia de un anticuerpo a 280 nm, AA,37O representa la absorbancia de un anticuerpo a 370 nm, AD,2SO representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 280 nm, AD,37O representa la absorbancia de un precursor de conjugado a 370 nm, eA,280 representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 280 nm, eA,37o representa el coeficiente de absorción molar de un anticuerpo a 370 nm, ep,2bo representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 280 nm, eD,37o representa el coeficiente de absorción molar de un precursor de conjugado a 370 nm, CA representa la concentración de anticuerpo en un conjugado de anticuerpo-fármaco, y CD representa la concentración de fármaco en un conjugado de anticuerpo-fármaco.
Como para eA,2bo, eA,370, eh,28o, y eD,37o en lo anterior, se usaron los valores previamente preparados (valor estimado con base en el cálculo o valor de medición obtenido por medición UV del compuesto). Por ejemplo, eA,2bo puede ser estimado a partir de la secuencia de aminoácido de un anticuerpo usando un método de cálculo conocido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). eA,37o es en general cero.
ED,28O y ep,37o se pueden obtener con base en las lcyes de Lambert-Beer (Absorbancia = concentración molar x coeficiente de absorción molar x longitud de la trayectoria celular) midiendo la absorbancia de una solución en la cual el precursor de conjugado a ser usado es disuelto a una cierta concentración molar. Midiendo A2so y A370 de una solución acuosa del conjugado de anticuerpo-fármaco y resolviendo las ecuaciones simultáneas (1) y (2) usando los valores, se pueden obtener CA y CD. Además, dividiendo CD por CA, se puede obtener el número promedio del fármaco del conjugado por anticuerpo.
El compuesto representado por la fórmula (2) en el Método de producción 1 es cualquier compuesto representado por la siguiente fórmula: Fórmula 51 - ---- - Halógeno -CH2C(=0)NH-(CH2)n3-C(=0)-L2-LP-NH-(CH2)ni -La-Lb-Lc- (NH-DX) En la fórmula, n1, n2, n3, L2, Lp, La, Lb, y Lc son como ya se han definido, y Lc es una posición de conexión para el fármaco.
En un intermediario útil para producir este compuesto de la presente invención, preferiblemente, n2 es un número entero de 2 hasta 5, L2 es -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=0)- o un enlace simple, n5 es un número entero de 2 hasta 4, Lp es GGFG, y -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es una estructura parcial de -NH- CH2CH2-C(=0)-, NH-CH2CH2CH2-C(=0)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=0)-, o - NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0)-. Halógeno es preferiblemente bromo o yodo. Ejemplos específicos de estos compuestos pueden incluir los siguientes [aquí, (maleimid-N-ilo) representa un grupo maleimidilo (grupo 2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-ilo)]. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=0)- (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2· DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- DX) (maleimid-N- il ) - CH2 CH2 CH2 CH2 - C ( =0 ) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2· DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N.- il ) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2· DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2 -0-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0- CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2- C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleitnid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N - il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) X-CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH- DX) X-CH2-C ( =0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C ( =0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2 -C ( =0) - (NH-DX) X-CH2-C ( =0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C ( =0) -GGFG-NH-CH2-O- CH2-C (=0) - (NH-DX) X-CH2-C ( =0) -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C ( =0) -GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C (=0) - (NH-DX) En la fórmula, X representa un átomo de bromo o un átomo de yodo. Todos estos compuestos de bromo y yodo pueden ser preferiblemente usados como intermediarios de producción .
Con el fin de asegurar la cantidad del conjugado, una pluralidad de conjugados obtenidos bajo condiciones de producción similares para tener un número de fármacos equivalentes (por ejemplo, aproximadamente + 1) puede ser mezclada para preparar nuevos lotes. En este caso, el número promedio de fármacos cae entre los números promedio de fármacos en los conjugados antes del mezclado. 2. Método de producción 2 El conjugado de anticuerpo-fármaco representado por la fórmula (1) en la cual el anticuerpo está conectado mediante un grupo amida a un enlazador y que tiene un enlace de tioéster dentro del enlazador, específicamente, una estructura en la cual -L1-!,2- es -C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)-S-(CH2)n6-C(=0)-, también se puede producir por el siguiente método.
Fórmula 52 AB-L1 - 2a 1 En la fórmula, AB-L1' representa un grupo en el cual el anticuerpo y enlazador L1 están conectados y, además, el terminal de L1 es convertido a un grupo N-maleimidilo. Este grupo específicamente tiene una estructura en la cual - (N-li-3-diminiccuS)- en AB-C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)- es convertido a un grupo maleimidilo. L2' representa un grupo HS-(CH2)n6-C(=0)- en el cual el terminal es un grupo mercapto, y AB representa el anticuerpo.
Específicamente, el conjugado de anticuerpo-fármaco (1) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (2a), el cual es obtenible por el método descrito abajo, con el anticuerpo (3b) el cual está conectado al enlazador que tiene un grupo maleimidilo.
El anticuerpo (3b) que tiene un grupo maleimidilo también se puede obtener por un método bien conocido en la téenica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Los ejemplos incluyen: un enlazador bifuncional, tal como succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato (SMCC), el cual es capaz de unirse a un grupo amino o un grupo hidroxilo y tiene un grupo maleimidilo que se permite reaccionar en el grupo amino del ligando para introducir un grupo maleimidilo, pero no se limita a este.
Por ejemplo, un compuesto que tiene una porción reactiva de grupo amino y una porción reactiva de grupo tiol unida mediante un enlazador puede ser preferiblemente usado. Aquí, la porción reactiva del grupo amino puede ser áster activo, áster imida, o similares, y la porción reactiva de tiol puede ser maleimida, haluro de acetilo, haluro álcali, ditiopiridilo, o similares.
Como un método para construir el enlazador con un grupo amino o grupo hidroxi de un aminoácido que constituye el anticuerpo, particularmente mediante un enlace de amida con el grupo amino, el compuesto a reaccionar primero con el anticuerpo puede ser un compuesto representado por la siguiente fórmula: Ql_Lla_Q2.
En la fórmula, Q1 representa (Pirrolidin-2,5-diona- N-il)-O-C(=0)-, (3-Sulfo-Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C(=0)-, RQ-O-C(=N)-, o 0=C=N-, Lla- representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, un grupo alquileno que tiene 1 hasta 10 átomos de carbono, un grupo fenileno, - (C¾)n4-C(=0)-, -(CH2)n4a-NH-C(=0)-(CH2)n4b-, o - (CH2)n4a-NH-C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-, Q2 representa (maleitnid-N-ilo), un átomo de halógeno, o -S-S- (2-Piridilo) , R representa un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, n4a representa un número entero de 0 hasta 6, y n4b representa un número entero de 1 hasta 6.
En lo anterior, RQ es un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, y más preferiblemente un grupo metilo o un grupo etilo.
El grupo alquileno de Lla puede ser aquellos que tienen 1 hasta 10 átomos de carbono. El grupo fenileno puede ser cualquiera de las configuraciones orto, meta, y para y es más preferiblemente un grupo para- o met a - f eni leño .
Ejemplos preferidos de Lla pueden incluir cic . Hex (1,4) -CH2- , - (CH2) -NH-C (=0) -cic. Hex (1,4) -CH2- , - (CH2) 2-NH-C (=0) -CH2- , - (CH2) -NH-C (=0) - (CH2) 2- , -CH2-, - (CH2)2-, - (CH2)3-, - (CH2)5-, - ( CH2 ) - , - (para-Ph) -, - (meta-Ph) - , - (para-Ph) -CH ( -CH ) - , - (CH2) - (meta-Ph) - , y - (meta-Ph) -NH-C (=0) -CH2- .
Q1 es preferiblemente (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- 0-C(=0)-, Q2 es preferiblemente (maleimid-N-ilo), o -S-S-(2- Piridilo) puede ser usado cuando un enlace de disulfuro está siendo formado.
En lo anterior, (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 53 en donde el átomo de nitrógeno como una posición de conexión, y (3-Sulfo-Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 54 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y este ácido sulfónico es capaz de formar una sal de litio, sal de sodio, o sal de potasio, y preferiblemente sal de sodio, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, (maleimid-N-ilo) es un grupo representado por la siguiente fórmula: la 55 nde el átomo de nitrógeno está en una posición (2-Piridilo) representa un grupo 2-piridilo, (para-Ph) representa un grupo para-fenileno, y (meta-Ph) representa un grupo meta-fenileno.
Ejemplos de este compuesto incluyen sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidilmetil)ciclohexan-1-carboxilato (sulfo-SMCC), N-succinimidil-4- (N-maleimidilmetil)-ciclohexan-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido K-maleimidil undecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido g-maleimidil butírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido e-maleimidil caproico (EMCS), éster de m-maleimidilbenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidilacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6- (b-maleimidilpropionamida)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidilfenil)-butirato (SMPB), N- (p-maleimidilfenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4- (yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), N-succinimidil 3-(bromoacetamida)propionato (SBAP), N-succinimidil-3- (2-piridoditio)propionato (SPDP), y succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- (2-piridilditio)tolueno (SMPT).
Específicamente, por ejemplo, haciendo reaccionar 2 hasta 6 equivalentes de SMCC con el anticuerpo (3) en un amortiguador de fosfato de pH 6 a 7 por 1 hasta 6 horas a temperatura ambiente, el áster activo de SMCC puede reaccionar con el anticuerpo para proporcionar el anticuerpo (3b) que tiene un grupo maleimidilo. El anticuerpo obtenido (3b) puede ser purificado por el Procedimiento común D-2 descrito abajo, y usado para la siguiente reacción con el compuesto (2a).
Procedimiento común D-2: Purificación de 4-(N- maleimidilmetil)-ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC)-anticuerpo derivatizado La columna NAP-25 se equilibró con PBS6.5/EDTA. La solución de reacción que contiene el 4-(N-maleimidilmetil)- ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (aquí, referido como SMCC)-anticuerpo derivatizado se aplicó en una cantidad de aproximadamente 0.5 mL a la columna NAP-25, y después se eluyó con el amortiguador en una cantidad definida por el fabricante para recolectar la fracción de anticuerpo para purificación.
El grupo amino del anticuerpo para conexión con el enlazador puede ser un grupo amino N-terminal y/o un grupo amino portado por un residuo lisina, pero no se limita a este. Alternativamente, el anticuerpo puede ser conectado al enlazador con la formación del enlace áster por el uso de un grupo hidroxi portado por un residuo serina.
La reacción del compuesto (2a) con el anticuerpo (3b) conectado al enlazador que tiene un grupo maleimidilo puede ser realizada en la misma manera como el método para hacer reaccionar el compuesto (2) con el anticuerpo (3a) que tiene un grupo sulfhidrilo como se menciona en el Método de producción 1.
Para el conjugado de anticuerpo-fármaco (1) preparado, la concentración, intercambio de amortiguador, purificación, e identificación del conjugado de anticuerpo- fármaco (1) por la medición de la concentración de anticuerpo y un número promedio de las moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo pueden ser realizados en la misma manera como el método de Producción 1.
El compuesto representado por la fórmula (3b) en el Método de producción 2 tiene la siguiente estructura (véase la siguiente fórmula; en la estructura de la misma, "anticuerpo -NH-" se origina a partir de un anticuerpo).
Fórmula 56 Un compuesto el cual es un intermediario para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención y tiene la estructura anterior es como se describe posteriormente (en la fórmula, n es un número entero de 1 hasta 10, preferiblemente 2 hasta 8, y más preferiblemente 3 hasta 8 ) .
Fórmula 57 anticuerpo anti-CD30 anticuerpo anti-CD33 Qj n n Además, ee jj eemmppllooss del compuesto de la presente invención en el cual el terminal es un grupo mercapto pueden incluir los siguientes.
HS-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C (=0)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH- HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) S-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) S-CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH- S-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) S-CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) S-CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH- S-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - S-CH2CH2-C(=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG- -C (=0) - (NH-DX) S - CH2CH2 - C ( = 0 ) -NH - CH2CH20 - CH2CH20 - CH2CH20 - CH2CH2 - NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) S-CH2CH2-c(=o)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) . Método de producción 3 l conjugado de anticuerpo- fármaco representado por la fórmula (1) en la cual el anticuerpo es conjugado a la porción enlazadora de fármaco mediante un enlace de amida se puede producir por un método descrito abajo. Por ejemplo, como para -C (=0)- (CH2)n4-C (=0)- de L1, su éster activo L1', por ejemplo , (Pirrolidin-2,5-diona-N-il) -0 -C (=0)- (CH2)n4- puede ser preferiblemente usado. Cuando L2 es un enlace simple, el conjugado de anticuerpo- fármaco (1) se puede producir por el siguiente método, por ejemplo .
Fórmula 58 AB 2b 1 Específicamente, el conjugado de anticuerpo-fármaco (1) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (2b), el cual es obtenible por el método descrito abajo, con el anticuerpo (3).
El compuesto (2b) es capaz de conectarse con el grupo amino o grupo hidroxilo del anticuerpo. El grupo amino y grupo hidroxilo del anticuerpo se refiere a, como se describe en el Método de producción 2, por ejemplo, un grupo amino N-terminal portado por el anticuerpo y/o un grupo amino portado por un residuo de lisina y un grupo hidroxi portado por un residuo serina, respectivamente, pero no se limitan a estos.
El compuesto (2b) es un éster activo compuesto de un grupo de N-hidroxisuccinimidil éster. Alternativamente, otros ásteres activos, por ejemplo, un grupo de sulfosuccinimidil éster, N-hidroxiftalimidil éster, N-hidroxisulfoftalimidil éster, orto-nitrofenil éster, para- nitrofenil éster, 2,4-dinitrofenil éster, 3-sulfonil-4-nitrofenil éster, 3-carboxi-4-nitrofenil éster, y pentafluorofenil éster, pueden ser usados.
Usando 2 hasta 20 equivalentes molares del compuesto (2b) por el anticuerpo (3) en la reacción del compuesto (2b) con el anticuerpo (3), se puede producir el conjugado de anticuerpo-fármaco (1) en el cual 1 hasta 10 moléculas de fármaco son conjugadas por anticuerpos. Específicamente, la solución que contiene el compuesto (2b) disuelto en esta puede ser agregada a una solución amortiguadora que contiene el anticuerpo (3) para la reacción para proporcionar el conjugado de anticuerpo-fármaco (1). Aquí, ejemplos de la solución amortiguadora los cuales pueden ser usados incluyen solución de acetato de sodio, fosfato de sodio, y borato de sodio. El pH para la reacción puede ser 5 a 9, y más preferiblemente la reacción se realiza cercana a pH 7. Ejemplos del solvente para disolver el compuesto (2b) incluyen un solvente orgánico tal como dimetil sulfóxido (DMSO) , dimetil formamida (DMF), dimetil acetamida (DMA), y N-metil-2-piridona (NMP). Es suficiente que la solución de solvente orgánico que contiene el compuesto (2b) disuelto en esta sea agregada de 1 hasta 20% en v/v a una solución amortiguadora que contiene el anticuerpo (3) para la reacción. La temperatura de reacción es 0 hasta 37°C, más preferiblemente 10 hasta 25°C, y el tiempo de reacción es 0.5 a 20 horas.
Para el conjugado de anticuerpo -fármaco producido (1) , la concentración, intercambio de amortiguador, purificación, e identificación del conjugado de anticuerpo- fármaco (1) por la medición de la concentración de anticuerpo y un número promedio de las moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticuerpo pueden ser realizados en la misma manera como el método de Producción 1.
La porción (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=0)-(CH2)n4-C(=0)- en el Método de producción 3 tiene la siguiente estructura.
Fórmula 59 Ejemplos del compuesto de la presente invención que tienen la estructura parcial anterior pueden incluir los siguientes.
(Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C(=0)-CH2CH2-C(=0)- GGFG-NH-CH2CH2-C ( =0) - (NH-DX) ( Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2-C ( =0) - GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N- il ) -O-C (=0) -CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N- il ) -O-C ( =o) -CH2CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5 -diona-N- il ) -O-C (=0) - 2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=C - (NH-DX) ( Pirrolidin- 2 , 5 -diona-N- il ) -O-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - 2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin- 2 , 5 -diona-N- il ) -O-C (=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - 2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) ( Pirrolidin- 2 , 5-diona-N- il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin- 2 , 5 -diona-N- il ) -0-C (=0) - 2 CH2 CH2 - C ( = 0 ) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin -2 , 5-diona-N- il ) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - 2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C (=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - ¡ 2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin- 2 , 5-diona-N- il ) -0-C (=0) - CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C (=0) - CH2CH2CH2CH2CH2 - -NH-CH2-0-CH2-C(=0)-(NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C(=0)- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Fórmula 60 - I En la fórmula, Lc es -C(=0)- y está conectado a - (NH-DX) con formación de enlace amida, L11 representa la estructura L1 en la cual el terminal es convertido a un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, o a (Pirrolidin-2,5- diona-N-il)-O-C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-, y P1, P2, y P3 cada uno representa un grupo protector.
El compuesto (6) se puede producir derivatizando el ácido carboxílico (5) en un éster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con NH2-DX [indicando exatecano; nombre químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona] (4) o una sal del mismo farmacológicamente aceptable.
Se pueden emplear reactivos y condiciones de reacción que son comúnmente usados para la síntesis peptídica para la reacción. Existen varios tipos de áster activo. Por ejemplo, se pueden producir haciendo reaccionar fenoles tales como p-nitrofenol , N-hidroxi benzotriazol, N-hidroxi succinimida, o similares, con el ácido carboxílico (5) usando un agente de condensación tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida o clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Además, el áster activo también se puede producir por una reacción del ácido carboxílico (5) con trifluoroacetato de pentafluorofenilo o similares; una reacción del ácido carboxílico (5) con hexafluorofosfato de 1-benzotriazolil oxitripirrolidinofosfonio; una reacción del ácido carboxílico (5) con cianofosfato dietílico (método de sales); una reacción del ácido carboxílico (5) con trifenilfosfina y disulfuro de 2,2 ' -dipiridilo (método de Mukaiyama); una reacción del ácido carboxílico (5) con un derivado de triazina tal como cloruro de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin- 2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM); o similares. Además, la reacción también se puede realizar mediante, por ejemplo, un método de haluro de ácido por el cual el ácido carboxílico (5) se trata con haluro de ácido tal como cloruro de tionilo y cloruro de oxalilo en la presencia de una base. Haciendo reaccionar el éster activo, anhídrido de ácido mezclado, o haluro del ácido carboxílico (5) obtenido por consiguiente con el compuesto (4) en la presencia de una base adecuada en un solvente inerte de -78°C a 150°C, se puede producir el compuesto (6). (No obstante, "solvente inerte" indica un solvente el cual no inhibe una reacción para la cual se usa el solvente.) Ejemplos específicos de la base usados para cada etapa descrita anteriormente incluyen carbonato de un metal álcali o un metal alcalino térreo, un alcóxido de metal álcali, hidróxido o hidruro de un metal álcali que incluye carbonato de sodio, carbonato de potasio, etóxido de potasio, butóxido de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidruro de sodio, e hidruro de potasio, bases organometálicas representadas por un alquil litio que incluye n-butil litio, dialquilamino litio que incluye diisopropilamida de litio; base organometálica de bissililamina que incluye bis(trimetilsilil)amida de litio; y una base orgánica que incluye piridina, 2,6-lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietilamina, N-metil morfolina, diisopropiletilamina, y diazabiciclo[5.4.0]undec- 7-eno (DBU).
Ejemplos del solvente inerte el cual es usado para la reacción de la presente invención incluyen un solvente hidrocarburo halogenado tal como diclorómetaño, cloroformo, y tetracloruro de carbono; un solvente de éter tal como tetrahidrofurano, 1,2-dimetoxietano, y dioxano; un solvente de hidrocarburo aromático tal como benceno y tolueno; y un solvente de amida tal como N,N-dimetil formamida, N,N-dimetil acetamida, y N-metilpirrolidin-2-ona. Además de estos, un solvente de sulfóxido tal como dimetil sulfóxido y sulfolano; y un solvente de cetona tal como acetona y metil etil cetona, pueden ser usados dependiendo del caso.
El grupo hidroxi, grupo carboxi, grupo amino, o similares de La y Lb en el compuesto (6) puede ser protegido con un grupo protector el cual es comúnmente usado en síntesis de compuesto orgánico, como se menciona después. Específicamente, ejemplos del grupo protector para un grupo hidroxilo incluyen un grupo alcoximetilo tal como un grupo metoximetilo; un grupo arilmetilo tal como un grupo bencilo, grupo 4-metoxibencilo, y grupo trifenilmetilo; un grupo alcanoilo tal como grupo acetilo; un grupo aroilo tal como grupo benzoilo; y un grupo sililo tal como grupo terc-butil difenilsililo. El grupo carboxi puede ser protegido, por ejemplo, como un éster con un grupo alquilo tal como grupo metilo, grupo etilo, y grupo tere-butilo, un grupo alilo, o un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo. El grupo amino puede ser protegido con un grupo protector para un grupo amino el cual es en general usado para la síntesis peptídica, por ejemplo, un grupo alquiloxicarbonilo tal como grupo terc- butiloxi carbonilo, grupo metoxicarbonilo, y grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetilo tal como aliloxicarbonilo, grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo, grupo benciloxi carbonilo, grupo parametoxibenciloxi carbonilo, y para (u orto)nitroibenciloxi carbonilo; un grupo alcanoilo tal como grupo acetilo; un grupo aril metilo tal como grupo bencilo y grupo trifenil metilo; un grupo aroilo tal como grupo benzoilo; y un grupo arilsulfonilo tal como grupo 2,4- dinitrobencen sulfonilo u ortonitrobencen sulfonilo La protección con, y desprotección del grupo protector se puede realizar de conformidad con un método comúnmente llevado a cabo.
Como para el grupo protector P1 por el grupo amino terminal del compuesto (6), un grupo protector para un grupo amino el cual es en general usado para la síntesis peptídica, por ejemplo, grupo terc-butiloxi carbonilo, grupo 9- fluorenilmetiloxi carbonilo, y grupo benciloxicarbonilo, puede ser usado. Ejemplos de otro grupo protector para un grupo amino incluyen un grupo alcanoilo tal como grupo acetilo; un grupo alcoxicarbonilo tal como grupo metoxicarbonilo y grupo etoxicarbonilo; un grupo arilmetoxi carbonilo tal como grupo parametoxi benciloxicarbonilo, y grupo para (u orto)nitroibenciloxicarbonilo; un grupo arilmetilo tal como grupo bencilo y grupo trifenilmetilo; un grupo aroilo tal como grupo benzoilo; y un grupo arilsulfonilo tal como grupo 2,4-dinitrobencen sulfonilo y ortonitrobencen sulfonilo. El grupo protector P1 puede ser seleccionado dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino a ser protegido.
Desprotegiendo el grupo protector P1 por el grupo amino terminal del compuesto (6) obtenido, se puede producir el compuesto (7). Reactivos y condiciones se pueden seleccionar dependiendo del grupo protector.
El compuesto (9) se puede producir derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8) que tiene el N-terminal protegido con P2 en un áster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (7) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8) y el compuesto (7) pueden ser adecuadamente seleccionadas a partir de aquellas descritas para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P2 puede ser adecuadamente seleccionado a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6), y la selección se puede hacer con base en, por ejemplo, las propiedades del compuesto que tiene un grupo amino a ser protegido. Como se usa en general para la síntesis peptídica, repitiendo secuencial ente la reacción y desprotección del aminoácido o péptido que constituye el ácido carboxílico peptídico (8) por elongación, el compuesto (9) también se puede producir.
Desprotegiendo P2 como el grupo protector para el grupo amino del compuesto (9) obtenido, el compuesto (10) se puede producir. Reactivos y condiciones se pueden seleccionar dependiendo del grupo protector.
Es posible producir el compuesto (2) o (2b) derivatizando el ácido carboxílico (11) o (11b) en un áster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (10) obtenido. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico (11) o (11b) y el compuesto (10) pueden ser adecuadamente seleccionadas a partir de aquellas descritas para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (9) también se puede producir por el siguiente método, por ejemplo.
El compuesto (13) se puede producir derivatizando el ácido carboxílico peptídico (8) que tiene el N-terminal protegido con P2 en el éster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto amina (12) que tiene el grupo carboxi protegido con P3 en la presencia de una base. LLaass ccoonnddiicciioonneess ddee reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (8) y el compuesto (12) pueden ser adecuadamente seleccionadas a partir de aquellas descritas para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13) puede ser adecuadamente seleccionado a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6). Como para el grupo protector P3 para un grupo carboxi, un grupo protector comúnmente usado como un grupo protector para un grupo carboxi en química sintética orgánica, en particular, síntesis peptídica puede ser usado. Específicamente, puede ser adecuadamente seleccionado a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6), por ejemplo, esteres con un grupo alquilo tal como un grupo metilo, un grupo etilo, o un tere-butilo, ésteres de alilo, y ésteres de bencilo. En tal caso, es necesario que el grupo protector para un grupo amino y el grupo protector para un grupo carboxi pueda ser removido por un método diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P2 es un grupo terc-butiloxi carbonilo y P3 es un grupo bencilo. Los grupos protectores pueden ser seleccionados de los mencionados anteriormente dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino y un grupo carboxi a ser protegido. Para remoción de los grupos protectores, se pueden seleccionar reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
Desprotegiendo el grupo protector P3 para el grupo carboxi del compuesto (13) obtenido, el compuesto (14) se puede producir. Reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector.
El compuesto (9) se puede producir derivatizando el compuesto (14) obtenido en el éster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacer reaccionar con el compuesto (4) en la presencia de una base. Para la reacción, los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados, y las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para la reacción pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6).
El compuesto (2) o (2b) también se puede producir por el siguiente método, por ejemplo.
Desprotegiendo el grupo protector P2 para el grupo amino del compuesto (13), el compuesto (15) se puede producir. Se pueden seleccionar reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector.
El compuesto (16) o (16b) se puede producir derivatizando el derivado de ácido carboxílico (11) o (11b) en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (15) obtenido en la presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para formar un enlace de amida entre el ácido carboxílico peptídico (11) o (11b) y el compuesto (15) pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (16) o (16b) obtenido, el compuesto (17) o (17b) se puede producir. Se puede llevar a cabo de manera similar para desproteger el grupo carboxi para producir el compuesto (14).
El compuesto (2) o (2b) se puede producir derivatizando el compuesto (17) o (17b) en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (4) en la presencia de una base. Para la reacción, los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados, y las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para la reacción pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6). 5. Método de producción 5 El compuesto representado por la fórmula (2) de un intermediario también se puede producir por el siguiente método.
Fórmula 61 - L1-L2-LP-NH-(CH InV-LV-lNH-DX) 2 En la fórmula, L1' corresponde a L1 que tiene una estructura en la cual el terminal es convertido a un grupo maleimidilo o un grupo haloacetilo, y P4 representa un grupo protector.
El compuesto (19) se puede producir derivatizando el compuesto (11) en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y hacerlo reaccionar con el ácido carboxílico peptídico (18) que tiene el C-terminal protegido con P4 en la presencia de una base. Las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para formar un enlace peptídico entre el ácido carboxílico peptídico (18) y el compuesto (11) pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6). El grupo protector P4 para el grupo carboxi del compuesto (18) puede ser adecuadamente seleccionado a partir de aquellos descritos para el grupo protector del compuesto (6).
Desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (19) obtenido, el compuesto (20) se puede producir. Se puede realizar de manera similar a la desprotección del grupo carboxi para producir el compuesto (14).
El compuesto (2) se puede producir derivatizando el compuesto (20) obtenido en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (7). Para la reacción, los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados, y las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para la reacción pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6). 6·. Método de producción 6 El intermediario de producción (2a) descrito en el Método de producción 2 en el cual L2' corresponde a L2 que tiene una estructura en la cual el terminal es convertido a un grupo mercaptoalcanoilo se puede producir por el siguiente método.
Fórmula 62 - El compuesto (2a) se puede producir derivatizando el ácido carboxílico (21) que tiene un grupo mercapto terminal en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (10). Para la reacción, los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados, y las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para la reacción pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (4).
Además, el compuesto (23) se puede producir derivatizando el compuesto (21) en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares, hacerlo reaccionar con el compuesto (15), y desprotegiendo el grupo protector para el grupo carboxi del compuesto (22) obtenido.
El compuesto (2a) se puede producir derivatizando el compuesto (23) en el áster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (4) en la presencia de una base. Para la reacción, los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados, y las condiciones de reacción, reactivos, bases, y solvente inerte usados para la reacción pueden ser adecuadamente seleccionados a partir de aquellos descritos como para la síntesis del compuesto (6). 7. Método de producción 7 A continuación, el método para producir el compuesto (10c) que tiene n1 = 1, La = 0, y Lb = CR2(-R3) en el intermediario de producción (10) descrito en el Método de producción 4 se describe en detalle. El compuesto representado por la fórmula (10c), una sal o un solvato del mismo se puede producir de conformidad con el siguiente - - - - i - - - - - -- - En la fórmula, Lp, R2, y R3 son como se definen anteriormente, L representa un grupo acetilo, un átomo de hidrógeno, o similares, X y Y cada uno representa un oligopéptido que consiste de 1 hasta 3 aminoácidos, P5 y P7 cada uno representa un grupo protector para un grupo amino, y P6 representa un grupo protector para un grupo carboxi.
Un compuesto representado por la fórmula (24) se puede producir usando o aplicando el método descrito en la Patente Japonesa Abierta al público No. 2002-60351 o la literatura (J. Org. Chem., Vol.51, page 3196, 1986), y si es necesario, removiendo los grupos protectores o modificando los grupos funcionales. Alternativamente, también se puede obtener tratando un aminoácido con un grupo amino terminal protegido o amida de ácido de oligopéptido con un grupo amino protegido con aldehido o cetona.
Haciendo reaccionar el compuesto (24) con el compuesto (25) que tiene un grupo hidroxilo a una temperatura que varía desde bajo enfriamiento hasta temperatura ambiente en un solvente inerte en la presencia de un ácido o base, el compuesto (26) se puede producir. Ejemplos del ácido los cuales pueden ser usados incluyen ácido inorgánico tal como ácido fluorhídrico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y ácido bórico; un ácido orgánico tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido paratoluensulfónico, y ácido metansulfónico; y un ácido Lewis tal como tetrafluoroborato, cloruro de zinc, cloruro de estaño, cloruro de aluminio, y cloruro de fierro. El ácido paratoluensulfónico es particularmente preferible. Como para la base a ser usada, cualquiera de las bases mencionadas anteriormente puede ser adecuadamente seleccionada y usada. Ejemplos preferidos de las mismos incluyen un alcóxido de metal álcali tal como terc-butóxido de potasio, un hidróxido de metal álcali tal como hidróxido de sodio e hidróxido de potasio; hidruro de metal álcali tal como hidruro de sodio e hidruro de potasio; bases organometálicas representadas por dialquilamino litio tal como diisopropilamida de litio; y base organometálica de bissililamina tal como bis (trimetilsilil)amida de litio. Ejemplos del solvente a ser usado para la reacción incluyen un solvente de éter tal como tetrahidrofurano y 1,4-dioxano; y un solvente de hidrocarburo aromático tal como benceno y tolueno. Aquellos solventes pueden ser preparados como una mezcla con agua. Además, el grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P5 no está particularmente limitado si este es un grupo comúnmente usado para protección de un grupo amino. Ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que son descritos en el Método de producción 4. Sin embargo, en la presente reacción, el grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P5 puede ser desdoblado. En tal caso, es necesario realizar una reacción con un reactivo adecuado para la desprotección de un grupo amino como puede ser requerido.
El compuesto (27) se puede producir removiendo el grupo protector P6 del compuesto (26). Aquí, aunque los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ejemplifica por P6 se describen en el Método de producción 4, es deseable en este caso que el grupo protector P5para un grupo amino y el grupo protector P6para un grupo carboxi sean los grupos protectores que pueden ser removidos por un método diferente o condiciones diferentes. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P5 es un grupo 9-fluorenilmetiloxi carbonilo y P6 es un grupo bencilo. Los grupos protectores pueden ser seleccionados dependiendo de, por ejemplo, las propiedades de un compuesto que tiene un grupo amino y un grupo carboxi a ser protegido. Para remoción de los grupos protectores, reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector.
El compuesto (29) se puede producir derivatizando el ácido carboxílico (27) en el éster activo, anhídrido de ácido mezclado, haluro de ácido, o similares y hacerlo reaccionar con el compuesto (4) y una sal del mismo farmacológicamente aceptable para producir el compuesto (28) seguido por remoción el grupo protector P5 del compuesto (28) obtenido. Para la reacción entre el compuesto (4) y el ácido carboxílico (27) y la reacción para remover el grupo protector P6, se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción como aquellos descritos para el Método de producción 4.
El compuesto (10c) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto (29) con un aminoácido con un grupo amino terminal protegido o el oligopéptido (30) con un grupo amino protegido para producir el compuesto (9c) y remover el grupo protector P7 del compuesto (9c) obtenido. El grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P7 no está particularmente limitado si este es en general usado para la protección de un grupo amino. Ejemplos representativos de los mismos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el Método de producción 4. Para remover el grupo protector, reactivos y condiciones se seleccionan dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (29) y el compuesto (30), se pueden emplear reactivos y condiciones de reacción que son comúnmente usados para la síntesis peptídica. El compuesto (10c) producido por el método mencionado anteriormente puede ser derivatizado en el compuesto (1) de la presente invención de conformidad con el método descrito anteriormente. 8. Método de producción 8 A continuación, el método para producir el compuesto (2c) que tiene n1 = 1, La = O, y Lb = CR2(-R3) en el intermediario de producción (2) descrito en el Método de producción 4 se describe en detalle. El compuesto representado por la fórmula (2c), una sal o un solvato del mismo se puede producir de conformidad con el siguiente método, por ejemplo.
Fórmula 64 Reacción de L1'-L2-0H Reacción de desprotección ( 1 1 ) pa.Z-OP desprotección 9 H-Z-OP9 ? ?LZ-OR9 - ? I ILZ-OH (31 ) (32) (33) (34) - En la fórmula, L1', L2, Lp, R2, y R3 son como se definen anteriormente, Z representa un oligopéptido que consiste de 1 hasta 3 aminoácidos, P8 representa un grupo protector para un grupo amino, y P9 representa un grupo protector para un grupo carboxi.
El compuesto (33) se puede producir removiendo el grupo protector P8 del aminoácido u oligopéptido (31) con un grupo amino terminal protegido y un grupo carboxi para producir el compuesto (32) y hacer reaccionar la forma de amina obtenida (32) con el compuesto (11). El grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P8 no está particularmente limitado si este es un grupo comúnmente usado para la protección de un grupo amino. Ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el Método de producción 4. Además, para remover el grupo protector P8, se pueden seleccionar reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Para la reacción entre el compuesto (32) y el ácido carboxílico (11), se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción como aquellos descritos para el Método de producción 4.
El intermediario de producción (2c) se puede producir removiendo el grupo protector P9 del compuesto (33) para producir el compuesto (34) y hacer reaccionar el ácido carboxílico obtenido (34) con el compuesto (29). Los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ejemplifica por P9 se describen en el Método de producción 4. Para la reacción de desprotección del mismo, se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción como aquellos descritos para el Método de producción 4 . Para la reacción entre el compuesto (29) y el ácido carboxílico (34), los reactivos y condiciones de reacción que son en general usados para la síntesis peptídica también pueden ser usados. El compuesto (2c) producido por el método mencionado anteriormente puede ser derivatizado en el compuesto (1) de la presente invención de conformidad con el método descrito anteriormente. 9. Método de producción 9 A continuación, el método para producir el compuesto (17c) que tiene n1 = 1, La = 0, y Lb = CR2(-R3) en el intermediario de producción (17) descrito en el Método de producción 4 se describe en detalle. El compuesto representado por la fórmula (17c), una sal o un solvato del mismo también se puede producir de conformidad con el siguiente método, por ejemplo.
Fórmula 65 Reacción de P7-Y-OH desprotección Ps-X-N H-CH2-O-CR2( -R3)-C(=0)-0P6- H-X-NH-CH2-0-CR3(-R3)-C(=0}-OPe (30) (26) (35) Reacción de IIOH desprotección (11) P7-Lp-NH-CH3-0-CR2(-R3)-C(=0)-0P6- H-Lp-NH-CH,-0-CR2(-R3)-C(=0)-OK. (36) (37) L1,-L2-Lp-NH-CH2-0-CR2(-R3)-C(=O)-0H (17c) En la fórmula, L1', L2, Lp, R2, R3, X, Y, P5, P6, y P7 son como se definen anteriormente.
El compuesto (36) se puede producir desprotegiendo el grupo protector P5 para el grupo amino del compuesto (26) con un grupo amino terminal protegido y un grupo carboxi para producir el compuesto (35) y hacer reaccionar la forma de amina obtenida (35) con el oligopéptido (30) con un grupo amino terminal protegido o grupo amino protegido. El grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P5 no está particularmente limitado si este es un grupo comúnmente usado para la protección de un grupo amino. Ejemplos representativos incluyen los grupos protectores para un grupo amino que se describen en el Método de producción 4. Además, para remover el grupo protector P5, se pueden seleccionar reactivos y condiciones dependiendo del grupo protector. Aquí, aunque los ejemplos representativos del grupo protector para un grupo carboxi como se ejemplifica por P6 y el grupo protector para un grupo amino como se ejemplifica por P7 que incluyen los grupos protectores para un grupo carboxi y un grupo amino que se describen en el Método de producción 4, es deseable que el grupo protector P6 para un grupo carboxi y el grupo protector P7 para un grupo amino sean los grupos protectores que pueden ser removidos por el mismo método o las mismas condiciones. Por ejemplo, un ejemplo representativo incluye una combinación en la cual P6 es un grupo de éster bencílico y P7 es un grupo benciloxicarbonilo.
El compuesto (37) se puede producir removiendo el grupo protector P6 para el grupo carboxi del compuesto (36) y el grupo protector P7 para el grupo amino del compuesto (36). El compuesto (37) también se puede producir removiendo secuencialmente el grupo protector P6 para el grupo carboxi y el grupo protector P7 para el grupo amino, o el compuesto (37) se puede producir removiendo de una vez tanto los grupos protectores P6 y P7 que pueden ser removidos por el mismo método o las mismas condiciones.
El compuesto (17c) se puede producir haciendo reaccionar el compuesto obtenido (37) con el compuesto (11). Para la reacción entre el compuesto (37) y el compuesto (11), se pueden usar los mismos reactivos y condiciones de reacción como aquellos descritos para el Método de producción 4.
En lo anterior, el compuesto representado por la siguiente fórmula: Fórmula 66 se describe como un intermediario de producción útil para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención. Además, un grupo de compuestos representados por la siguiente fórmula: Q-(CH2)nQ-C(=0)-L2a-Lp-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) son también compuestos que sirven como intermediaros de producción útiles para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención.
Específicamente, en lo anterior fórmula, Q es (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=0)-NH-, o (Pirrolidin-2,5- diona-N-il)-O-C(=0)-, X es un átomo de bromo o un átomo de yodo, nQ es un número entero de 2 hasta 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos, n1 representa un número entero de 0 hasta 6, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9- OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -0-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, (maleimid-N-il)- es un grupo que estructura representada por la siguiente fórmula Fórmula 67 (en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión), (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula : Fórmula 68 (en la fórmula, el átomo de nitrógeno es la posición de conexión), -(NH-DX) es un grupo que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 69 amino en la posición 1 es la posición de conexión).
Un compuesto en el cual Lc es -C(=0)- es preferido como un intermediario de producción.
Como para el residuo de péptido de Lp, un compuesto de un residuo de aminoácido que consiste de un aminoácido seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico es preferido como un intermediario de producción. Entre estos residuos peptídicos, un compuesto en el cual Lp es un residuo de péptido que consiste de 4 aminoácidos es preferido como un intermediario de producción. Más específicamente, un compuesto en el cual Lp es -GGFG- es preferido como un intermediario de producción.
Además, como para el -NH-(CH2)n1-La-Lb-, un compuesto de -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2- es preferido como un intermediario de producción. Un compuesto de NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=0)- es más preferido.
Como para nQ, un compuesto en el cual es un número entero de 2 hasta 6 es preferido como un intermediario de producción.
Un compuesto en el cual L2a es un enlace simple o n5 es un número entero de 2 hasta 4 es preferido como un intermediario de producción.
Cuando Q es (maleimid-N-il)-, un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 hasta 5, L2a es un enlace simple, y -NH-(CH2)n1—La—Lb— es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, O -NH- CH2CH2-O-CH2- es preferido como un intermediario de producción. Un compuesto en el cual -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-0-CH2-, o -NH-CH2CH2-0-CH2- es más preferido. Un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 o 5 es además preferido.
También, cuando Q es (maleimid-N-il)-, un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 hasta 5, L2a es -NH- (CH-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, n5 es un número entero de 2 hasta 4, y -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH-, -NH-CH2-0-CH2-, O -NH- CH2CH2-0-CH2- es preferido como un intermediario de producción. Un compuesto en el cual n5 es un número entero de 2 o 4 es más preferido. Un compuesto en el cual -NH-CCH^n1- La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-0-CH2-, o -NH-CH2CH2-0-CH2- es además preferido.
Cuando Q es HS-, un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 hasta 5, L2a es un enlace simple, y -NH- o -NH-CH2CH2-O-CH2- es más preferido.
Cuando Q es X-CH2-C(=0)-NH-, un compuesto en el cual X es un átomo de bromo es preferido como un intermediario de producción. Un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 hasta 8 es preferido, también un compuesto en el cual L2a es un enlace simple es preferido, y un compuesto en el cual -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2- es preferido como un intermediario de producción.
Cuando Q es (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=0)-, un compuesto en el cual nQ es un número entero de 2 hasta 5, L2a es un enlace simple, y -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2- 0-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2- es preferido como un intermediario de producción. Un compuesto en el cual -NH-(CH2)n1-La-Lb- es - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2- es más preferido.
Más específicamente, los siguientes son compuestos preferidos como intermediaros de producción. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=0)- (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- -DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2- 0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2O - CH2 CH20 - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) - NH- CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) Br-CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C (=0)- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0)-(NH-DX) No obstante, el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención, cuando se deja en el aire o recristalizar, puede absorber la humedad para tener adsorción de agua o cambiar en un hidrato, y este compuesto y una sal que contiene agua también están incluidos en la presente invención.
Un compuesto etiquetado con varios isótopos radioactivos o no radioactivos también se incluye en la presente invención. Uno o más átomos que constituyen el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención pueden contener un isótopo atómico a relación no natural. Ejemplos del isótopo atómico incluyen deuterio (2H), tritio (3H), yodo-125 (125I), y carbono-14 (14C). Además, el compuesto de la presente invención puede ser etiquetado radioactivo con un isótopo radioactivo tal como tritio (3H), yodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre-64 (S4Cu), circonio-89 (89Zr), yodo-124 (124I), flúor-18 (18F), indio-111 (1:L1I), carbono-11 (1:LC) y yodo-131 (131I). El compuesto etiquetado con un isótopo radioactivo es útil como un agente terapéutico o profiláctico, un reactivo para búsqueda tal como un reactivo de ensayo y un agente para diagnóstico tal como un agente de imagen de diagnóstico in vivo. Sin estar relacionado con la radioactividad, cualquier tipo de variante de isótopo del conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención está dentro del alcance de la presente invención.
Fármacos El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención presenta una actividad citotóxica contra células de cáncer, y de este modo, se pueden usar como un fármaco, particularmente como un agente terapéutico y/o agente profiláctico para cáncer.
Ejemplos de tipo de cáncer al cual el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se aplica, incluyen cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, o cáncer esofágico, sin embargo, no se limita a estos en la medida en que es una célula de cáncer que expresa, en una célula de cáncer como un sujeto de tratamiento, una proteína en la cual el anticuerpo dentro del anticuerpo-fármaco puede reconocer.
El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención puede ser preferiblemente administrado a un mamífero, pero es más preferiblemente administrado a un humano.
Sustancias usadas en una composición farmacéutica que contiene conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención pueden ser adecuadamente seleccionadas y aplicadas a partir de aditivos de formulación o similares que son en general usados en la téenica, en vista de la dosificación o concentración de administración.
El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención puede ser administrado como una composición farmacéutica que contiene al mmeennooss un ingrediente farmacéuticamente adecuado.
Por ejemplo, la composición farmacéutica anterior contiene típicamente al menos un portador farmacéutico (por ejemplo, líquido estéril), por ejemplo, agua y aceite (aceite de petróleo y aceite de origen animal, origen vegetal, u origen sintético (el aceite puede ser, por ejemplo, aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo o similares)). El agua es un portador más típico cuando la composición farmacéutica anterior es intravenosamente administrada. La solución salina, una solución de dextrosa acuosa, y una solución acuosa de glicerol, también pueden ser usadas como un portador líquido, en particular, para una solución de inyección. Un vehículo farmacéuticamente adecuado se conoce en la téenica. Si se desea, la composición anterior también puede contener una cantidad rastro de un agente humectante, un agente emulsificante, o un agente amortiguador de pH. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W.
Martin. Las formulaciones corresponden a un modo de administración.
Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden usar para administrar el conjugado de anticuerpo- fármaco de la presente invención. Ejemplos de la ruta de administración incluyen rutas intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, y subcutánea, pero no se limitan a estas. La administración se puede hacer por inyección o inyección de bolo, por ejemplo. De conformidad con una modalidad preferida específica, la administración del conjugado de anticuerpo-fármaco se realiza por inyección. La administración parenteral es una ruta de administración preferida.
De conformidad con una modalidad representativa, la composición farmacéutica es prescrita, como una composición farmacéutica adecuada para administración intravenosa a un humano, de conformidad con los procedimientos convencionales. La composición para administración intravenosa es típicamente una solución en una solución amortiguadora acuosa isotónica y estéril. Si es necesario, el fármaco puede contener un agente solubilizante y anestésicos locales para aliviar el dolor en el sitio de inyección (por ejemplo, lignocaína). En general, el ingrediente anterior es dividido individualmente como cualquiera del polvo liofilizado o un concentrado anhidro contenido en un contenedor el cual se obtiene por sellado en una ampolleta o un sobre que tiene una cantidad del agente activo o como una mezcla en una forma de dosificación unitaria. Cuando el fármaco está siendo administrado por inyección, puede ser administrado de una botella de inyección que contiene agua o salina de grado farmacéutico estéril. Cuando el fármaco es administrado por inyección, una ampolleta de agua estéril o salina para inyección puede ser proporcionada de manera que los ingredientes mencionados anteriores son mezclados entre sí antes de la administración.
La composición farmacéutica de la presente invención puede ser una composición farmacéutica que contiene solamente el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención o una composición farmacéutica que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco y al menos un agente de tratamiento de cáncer distinto del conjugado. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención puede ser administrado con otro agente de tratamiento de cáncer. El efecto anti-cancerígeno puede ser mejorado por consiguiente. Otro agente anti-cancerígeno usado para tal propósito puede ser administrado a un individuo simultáneamente con, separadamente de, o subsecuentemente al conjugado de anticuerpo-fármaco, y puede ser administrado mientras varía el intervalo de administración para cada uno. Ejemplos del agente de tratamiento de cáncer incluyen abraxano, carboplatino, cisplatino, gemcitabina, irinotecano (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbina, fármacos descritos en la Solicitud Internacional No. WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorelina, goserelina, o similares), fosfato de estramustina, antagonistas de estrógeno (tamoxifeno, raloxifeno, o similares), y un inhibidor de aromatasa (anastrozol, letrozol, exemestano, o similares), pero no se limita en la medida en que es un fármaco que tiene un actividad antitumoral.
La composición farmacéutica puede ser formulada en una formulación de liofilización o formulación líquida como una formulación que tiene la composición y pureza requerida deseada. Cuando se formula como una formulación de liofilización, puede ser una formulación que contiene aditivos de formulación adecuados que son usados en la téenica. También para una formulación líquida, puede ser formulada como una formulación líquida que contiene varios aditivos de formulación que son usados en la técnica.
La composición y concentración de la composición farmacéutica pueden variar dependiendo del método de administración. Sin embargo, el conjugado de anticuerpo- fármaco contenido en la composición farmacéutica de la presente invención puede presentar el efecto farmacéutico aún a una dosificación menor cuando el conjugado de anticuerpo- fármaco tiene afinidad superior por un antígeno, es decir, afinidad superior (= valor Kd inferior) en términos de la constante de disociación (es decir, valor Kd) para el antígeno. De este modo, para determinar la dosificación del conjugado de anticuerpo-fármaco, la dosificación puede ser determinada en vista de una situación que se refiere a la afinidad entre el conjugado de anticuerpo-fármaco y antígeno. Cuando el conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención se administra a un humano, por ejemplo, aproximadamente 0.001 hasta 100 mg/kg puede ser administrado una vez o administrado varias veces por 1 hasta 180 días.
Ejemplos La presente invención se describe específicamente en vista de los ejemplos mostrados abajo. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos. Además, no significa ser interpretada en un sentido limitado. Además, a menos que se describa específicamente de otro modo, el reactivo, solvente, y material de partida descritos en la descripción se pueden obtener fácilmente a partir de un proveedor comercial.
Ejemplo de Referencia 1 anticuerpo M30-H1-L4 De los anticuerpos humanizados de un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo compuesto de una cadena pesada que consiste de una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 20 hasta 471 en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste de una secuencia de aminoácido descrita en las posiciones de aminoácido 21 hasta 233 en la SEQ ID NO: 16 se produjo de conformidad con un método conocido en la téenica para proporcionar el anticuerpo anti- B7-H4 humanizado designado como un anticuerpo M30-H1-L4 (o simplemente referido como "M30-H1-L4").
Ejemplo de Referencia 2 anticuerpo M30-H1-L4P La modificación de un glicano unido al anticuerpo M30-H1-L4 obtenido anteriormente se reguló por desfucosilación de conformidad con un método conocido en la técnica para proporcionar anticuerpo con la modificación regulada de un glicano designado como un anticuerpo M30-H1- L4P (o simplemente referido como "M30-H1-L4P").
Ejemplo de Referencia 3 Anticuerpo anti-CD30 Un anticuerpo anti-CD30 se produjo con referencia a la Publicación Nacional de la Solicitud de Patente Internacional No.2005-506035. Su secuencia se muestra en las SEQ ID NOs: 27 y 28.
Ejemplo de Referencia 4 Anti-CD33 anticuerpo Un anticuerpo anti-CD33 se produjo con referencia a la Patente Japonesa Abierta al público No. 8-48637. Su secuencia se muestra en las SEQ ID NOs: 29 y 30.
Ejemplo de Referencia 5 Anticuerpo anti-CD70 Un anticuerpo anti-CD70 se produjo con referencia a la Publicación Nacional de la Solicitud de Patente Internacional No.2008-538292. Su secuencia se muestra en las SEQ ID NOs: 31 y 32.
Ejemplo 1 4 -Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]butanamida hidroxi-4 -metil-10,13 -dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahidro- 1H,12H-benzo [de]pirano [31,4 ':6,7]indolizino [1,2- b]quinol in-1-i1]amino }-4-oxobutil)carbamato de tere- butilo Ácido 4-(Tere-butoxicarboni lamino )butanoico (0.237 g, 1.13 mmol) se disolvió en diclorometano (10 mL), N-hidroxisuccinimida (0.130 g, 1.13 mmol) y se agregaron clorhidrato de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil )carbodiimida (0.216 g, 1.13 mmol), y se agitó por 1 hora. La solución de reacción se agregó por goteo a una solución de N,N-dimetilformamida (10 mL) cargada con mesilato del compuesto (4) (0.500 g, 0.94 mmol) y trietilamina (0.157 mL, 1.13 mmol), y se agitó por 1 día a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo cloroformo :metanol = 8:2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título (0.595 g, cuantitativo).
RMN !H (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J=7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7 .2 Hz), 1.82-1.89 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+ Proceso 2: 4-Amino-N- [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano[3',41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]butanamida El compuesto (0.388 g, 0.61 mmol) obtenido en el Proceso 1 se disolvió en diclorometano (9 mL). Ácido tr ifluoroacét ico (9 mL) se agregó y se agitó por 4 horas. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformo :metanol:agua = 7:3:1 (v/v/v)] para proporcionar tr ifluoroacetato del compuesto del título (0.343 g, cuantitativo) . Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibe el conjugado de anticuerpo-fármaco (13) o (14).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-dg) d: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2.17 (2H, m), 2.27 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.80-2.86 (2H, m), 3.15-3.20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.54- 5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.72 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+ Ejemplo 2 Conjugado de anticuerpo-fármaco (1) Fórmula 71 i I _ , - Proceso 1: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L- fenilalanil-N-(4-{[(lS,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[31,41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]amino}-4-oxobutil)glicinamida N-(Terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L- fenilalanilglicina (0.081 g, 0.19 mmol) se disolvió en diclorometano (3 mL), se agregaron N-hidroxisuccinimida (0.021 g, 0.19 mmol) y clorhidrato de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0.036 g, 0.19 mmol) y después se agitó por 3.5 horas. La solución de reacción se agregó por goteo a una solución de N,N-dimetilformamida (1.5 mL) cargada con el compuesto (0.080 g, 0.15 mmol) del Ejemplo 1, y se agitó por 4 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo:metanol = 8:2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título (0.106 g, 73%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12.7, 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, ), 3.16-3.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Proceso 2: Trifluoroacetato de glicilglicil-L- fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]amino}-4-oxobutil)glicinamida El compuesto (1.97 g, 2.10 mmol) obtenido en el Proceso 1 se disolvió en diclorometano (7 mL). Después de agregar ácido trifluoroacético (7 mL), se agitó por 1 hora. El solvente se removió bajo presión reducida, y se cargó con tolueno para destilación azeotrópica. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformo:metanol:agua = 7:3:1 (v/v/v)] para proporcionar el compuesto del título (1.97 g, 99%).
RMN !H (400 MHz, DMSO-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz) , 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H , m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.03-3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m) , 3.64 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8, 5.9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17- 7.27 (5H , m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 (2H, m), 7.95- 7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+ Proceso 3: N- [6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il) hexanoil] glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{ [(1S,9S)-9-etil -5-flúoro- 9-hidroxi -4-metí1-10 ,13-dioxo-2 ,3,9,10,13, 15-hexahidro- 1H,12H-benzo [de]pirano [31,4 ':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il]amino} -4-oxobutil) glic inamida A una solución de N,N-dimetil formamida (1.2 mL) del compuesto (337 mg, 0.353 mmol) obtenido en el Proceso 2, se agregaron trietilamina (44.3 mL, 0.318 mmol) y ácido N-succinimidil 6-maleimida hexanoico (119.7 g, 0.388 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo :metanol = 5:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (278.0 mg, 76%).
RMN !H (400 MHz, DMS0-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 (3H, s), 2.79 (1H, dd, J=14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m), 4.41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18 .9 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.40 (1H, d, J=17 .1 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J=6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+ Proceso 4: Conjugado de anticuerpo-fármaco (1) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30- H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (como coeficiente de absorción a 280 nm, se usó 1.61 mLmg-!cm 1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL).
Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo por incubación por 1 hora a 37°C.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma- Aldrich Co . LLC; 0.109 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 (0.039 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.008 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó a temperatura ambiente para terminar la reacción del enlazador de fármaco por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,370 0 (valor de cálculo estimado ) , £ 5000 (valor promedio medido) , y £D,37O 19000 (valor promedio medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 13.02 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 9.1 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.4.
Ejemplo 3 Conjugado de anticuerpo-fármaco (2) Fórmula 72 I Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (2) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (4.0 mL) se recolectó en un tubo de 15 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.118 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.200 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido (0.236 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.00471 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 17.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), sD,280 = 5000 (valor promedio medido), y eh,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.80 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 26.1 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.9.
Ejemplo 4 Conjugado de anticuerpo-fármaco (3) Fórmula 73 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (3) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^crtr1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 (0.085 mL; 10.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 60 minutos. Después, una solución acuosa (0.013 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), eB,28o = 5000 (valor promedio medido), y ep,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.67 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 10.02 mg (80%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.3.
Ejemplo 5 Conjugado de anticuerpo-fármaco (4) Fórmula 74 , Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (4) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cirr1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma- Aldrich Co. LLC; 0.025 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 (0.127 mL; 15.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 60 minutos. Después, una solución acuosa (0.019 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eE,2bo = 5000 (valor promedio medido), y D,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.19 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 7.14 mg (57%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 7.5.
Ejemplo 6 Conjugado de anticuerpo-fármaco (5) Fórmula 75 Casi todas las cantidades de los conjugados de anticuerpo-fármaco de los Ejemplos 4 y 5 se mezclaron. La solución se concentró por el Procedimiento común A para proporcionar el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 15.37 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.7.
Ejemplo 7 Conjugado de anticuerpo-fármaco (6) Fórmula 76 - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (6) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución a 22°C por 10 minutos, una solución de dimetil sulfóxido (0.0593 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0119 mL; 18.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA28o = 270400 (valor de cálculo estimado) , eA o 0 (valor de cálculo estimado), eD,2so = 5000 (valor promedio medido), y eh,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.99 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.94 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.3.
Ejemplo 8 Conjugado de anticuerpo-fármaco (7) Fórmula 77 - - .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (7) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido (0.0297 mL; 13.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó por 40 minutos a 22°C para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo. Después, una solución acuosa (0.0178 mL; 27.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2o = 270400 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eD,28o = 5000 (valor promedio medido), y eD,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.99 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.94 mg (59%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.8.
Ejemplo 9 Conjugado de anticuerpo-fármaco (8) Fórmula 78 - , Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (8) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido (0.0593 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0119 mL; 18.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 256400 (valor de cálculo estimado), e,37o = 0 (valor de cálculo estimado), e0,28o = 5000 (valor promedio medido), y e?,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.06 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 6.36 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.4.
Ejemplo 10 Conjugado de anticuerpo-fármaco (9) Fórmula 79 . , Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (9) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido (0.0297 mL; 13.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0178 mL; 27.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eD,28o = 5000 (valor promedio medido), y ED,37O = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.95 mg/mL rendimiento de anticuerpo: 5.70 mg (57%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.7.
Ejemplo 11 Conjugado de anticuerpo-fármaco (10) Fórmula 80 i Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (10) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución a 22°C por 10 minutos, una solución de dimetil sulfóxido (0.0593 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0119 mL; 18.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 M de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 262400 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), ep,2bo = 5000 (valor promedio medido), y eh,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.00 mg/mL rendimiento de anticuerpo: 6.00 mg (60%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 12 Conjugado de anticuerpo-fármaco (11) Fórmula 81 1 .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (11) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti- CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69) y el Procedimien o común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 2 mL y se cargó con una solución acuosa de 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc .; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución a 22°C por 10 minutos, una solución de dimetil sulfóxido (0.0297 mL; 13.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 30 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 2 se agregó a esta e incubó por 40 minutos a 22°C para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo. Después, una solución acuosa (0.0178 mL; 27.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldr ich Co . LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimien o común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, EA,28O = 262400 (valor de cálculo estimado), EA,370 = 0 (valor de cálculo estimado) , ED,28O = 5000 (valor promedio medido) , y £D,37O = 19000 (valor promedio medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.96 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.76 mg (58%) , y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.6.
Ejemplo 13 Conjugado de anticuerpo-fármaco (12) Fórmula 82 O - , Proceso 1: N-[3- (2,5-Dioxo -2,5-dihidro-1H- pirrol-1-il) propanoil] glicilglicil-L-fenilalanil-N- (4-{ [(lS,9S)-9-etil-5-fluoro-9 -hidroxi -4-metil-10, 13- dioxo-2 ,3,9,10, 13,15-hexahidro-lH, 12H- benzo [de]pirano [31,41:6,7]indoli zino [1,2-b]quinolin- 1-il]araino}-4- oxobuti 1)glicinamida El compuesto (80 mg, 0.084 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando propionato de N- succinimidi 1 3-maleimida (24.6 mg , 0.0924 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (60.0 mg, 73%).
RMN !H (400 MHz , DMS0-d6) d: 0.89 (3H, t, J=7.3 Hz) , 1.70-1.78 (2H, m) , 1.81-1.94 (2H, m) , 2.12-2.23 (4H , m), 2.42 (3H, s), 2.81 (1H, dd J= 13.7 , 9.8 Hz), 3.01-3.15 (3H, m), 3.16-3.23 (2H, m) , 3.30-3.35 (1H, m), 3.58-3.71 (6H, m), 3.71-3.79 (1H, m), 4.44-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.0 Hz), 5.27 (1H, d, J=1 9.0 Hz), 5.43 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.47 (1H , d, J=17.6 Hz), 5.57-5.63 (1H, m), 6.56 (1H, s), 7.02 (2H, s), 7.17-7.22 (1H, m), 7.22-7.30 (5H, m) , 7.34 (1H, s), 7.73 (1H, t, J=5.6 Hz), 7.83 (1H, d, J=10.7 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.6 Hz), 8.15 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.30 (2H, dt, J=18.7, 5.7 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.8 Hz).
MS (APCI ) m/z: 990 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de ant icuerpo- fármaco (12) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1, se obtuvo el conjugado de anticuerpo- fármaco del título en la misma manera como el Proceso 4 del Ejemplo 2.
Concentración del anticuerpo: 12.16 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.5 mg (68%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.4.
Ejemplo 14 Conjugado de anticuerpo-fármaco (13) , - oxo -2,5- dihidro-1H-pirrol-1- i1)propanoil ]amino }etoxi)etoxi ]propanoi 1 Jglicilglicil -L-fenilalanil-N- (4-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-4-metil-lO, 13-dioxo- 2,3,9, 10,13,15-hexahidro- 1H, 12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7] indolizino [1,2- b]quinol in -1-i1] mino}-4-oxobut i1 )glicinamida El compuesto (100 mg, 0.119 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando dii sopropile ti1amina (20.8 mL, 0.119 mmol) en lugar de triet ilamina y 3-(2- (2-(3- malcinimidapropanamida) etoxi )etoxi )propanoato de N-succ inimidilo (50.7 mg , 0.119 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (66.5 mg , 48%).
RMN H (400 MHz , DMS0-d6) d: 0.85 (3H, t, J=7 .4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m) , 1.77-1.90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H , m), 2.38 (3H , s), 2.76 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3.53-3.76 (10H, m) , 4.43 (1H, td, J=8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz) , 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.2 Hz) , 5.42 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s) , 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m) , 7.18-7.25 (4H , m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=11 .3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J=7 .8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.9 Hz) , 8.44 (1H, d, J=9.0 Hz).
MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo- fármaco (13) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 4 de 1 E j emplo 2 .
Concentración del anticuerpo: 12.76 mg/mL , rendimiento de anticuerpo: 8.9 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.4.
Ejemplo 15 Conjugado de anticuerpo- fármaco (14) Fórmula 84 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo- fármaco (14 ) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14, se obtuvo el conjugado de anticuerpo- fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 4.
Concentración del anticuerpo: 1.60 mg/mL , rendimiento de anticuerpo: 9.60 mg (77% ), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.1.
Ejemplo 16 Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 15 ) Fórmula 85 .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo -fármaco (15) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14, se obtuvo el conjugado de anticuerpo- fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 5.
Concentración del anticuerpo: 1.64 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 9.84 mg (79%) , y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 7.1.
Ejemplo 17 Conjugado de anticuerpo- fármaco (16) Fórmula 86 - - 1 6.5 Casi todas las cantidades de los conjugados de anticuerpo- fármaco de los Ejemplos 15 y 16 se mezclaron. La solución se concentró por el Procedimiento común A para proporcionar el conjugado de anticuerpo- fármaco del título.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 17.30 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.5.
Ejemplo 18 Conjugado de anticuerpo- fármaco (17) Fórmula 87 - - ¦ .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo- fármaco (17) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30- H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm 1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (100 mL, 1 g del anticuerpo) se colocó en un matraz de 250 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; 3.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y además con una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (5 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.4 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (2.14 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 M del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (3.51 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó con un agitador para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 130 minutos. Después, una solución acuosa (0.547 mL) de 100 mM de NAC se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación por ultraf iltración usando un aparato de ultraf iltración compuesto de una membrana de ult rafi1tr acion (Merck Japón, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa) , una bomba de tubo (Bomba Cole-Parmer International, MasterFlex modelo 77521-40, Cabeza de Bomba modelo 7518-00), y un tubo (Tubo Cole-Parmer International, MMaasstteerrFFlleexx LL//SS1166)).. Específicamente, mientras el ABS se agregó por goteo (un total de 800 mL) como una solución amortiguadora para purificación a la solución de reacción, la purificación por ultraf iltración se realizó para remover los enlazadores de fármaco no conjugados y otros reactivos de bajo peso molecular, también reemplazando la solución amortiguadora con ABS, y además concentrando la solución, para proporcionar aproximadamente 70 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo -fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado) , eh,28o = 4964 (valor medido) , y ep,37o = 18982 (valor medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 14.5 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 1.0 g (aproximadamente 100%) , y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.5.
Ejemplo 19 Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 18 ) Fórmul a 88 - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (18) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^crrr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (5 mL, 50 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 15 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.135 mL; 4 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.4 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.064 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.219 mL; 6.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 90 minutos. Después, una solución acuosa (0.033 mL; 9.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 19 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA2bo = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eh,2bo = 4964 (valor medido), y ep,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 2.17 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 41 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.0.
Ejemplo 20 Conjugado de anticuerpo-fármaco (19) Fórmula 89 - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (19) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (4 mL, 40 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 15 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.140 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.4 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.232 mL; 8.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 90 minutos. Después, una solución acuosa (0.035 mL; 12.9 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 13 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,2SO = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O 0 (valor de cálculo estimado) , £D, 28O = 4964 (valor medido) , y £D, 37O = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 2.36 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 31 mg (77%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.9.
Ejemplo 21 Conjugado de anticuerpo-fármaco (20) Fórmula 90 _ --- .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (20) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^crrr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.0267 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0066 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), D,28O = 4964 (valor medido), y £D,37O = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.7 mg (70%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.5.
Ejemplo 22 Conjugado de anticuerpo-fármaco (21) Fórmula 91 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (21) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30- H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm 1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0726 mL; 8.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.011 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), EA,37O = 0 (valor de cálculo estimado) , £D,2SO = 4964 (valor medido), y ED,37O = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.3 mg (66%) , y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.5.
Ejemplo 23 Conjugado de ant icuerpo -fármaco (22) Fórmul a 92 · 25 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (22) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 M de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molécula de anticuerpo). El enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora .
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.0098 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 270400 (valor de cálculo estimado), eA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), ep,28o = 4964 (valor medido), y e0,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.86 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.2 mg (54%), y número promedio de de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0204 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) y propilenglicol (Kanto Chemical Co., Inc., 0.18 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0031 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 270400 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eB,2bo = 4964 (valor medido), y e037o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores . . cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0058 L). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.0101 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 256400 (valor de cálculo estimado), eA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), e0,28o = 4964 (valor medido), y eh,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.25 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 3.1 mg (78%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.7.
Ejemplo 26 Conjugado de anticuerpo-fármaco (25) Fórmula 95 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (25) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0035 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS ? como solución amortiguadora) descrito en el Método de - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (26) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti- CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69 mLmg-!cm·1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0058 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.0101 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co . LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2 .5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar , EA,280 262400 (valor de cálculo estimado) , A,37O = O (valor de cálculo estimado) , D,28O = 4964 (valor medido) , y £D,370 = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concent ación del anticuerpo: 1.14 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.9 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.8.
Ejemplo 28 Conjugado de anticuerpo-fármaco (27) Fórmula 97 .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (27) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 ± 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido (0.0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 14 hasta la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0035 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 262400 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eh,2bo = 4964 (valor medido), y eB,37o = 18982 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.13 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.8 mg (71%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 7.4.
Ejemplo 29 Conjugado de anticuerpo-fármaco (28) Fórmula 98 G - - - Proceso 1: N- [19-(2,5-dioxo- 2 ,5-dihidro -1H-pirrol-1-il) -17-oxo-4 ,7,10,13 -tet raoxo-16 -azanonadecan-l-oil] glicilglicil-L-fenilalanil-N- (4-{ [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4 -met il-10,13-dioxo -2,3, 9,10,13, 15-hexahidro-1H, 12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-i 1]amino }-4-oxobut i1)glicinamida El compuesto (90 mg, 0.107 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando diisopropiletilamina (18.7 mL, 0.107 mmol) en lugar de trietilamina y 1-malcinimida -3-oxo- 7,10 ,13,16-tet raoxa-4 - zanonadecan-1 9-oato de N- succini idilo (55.1 mg, 0.107 mmol) en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (50 mg, 37%).
RMN !H (400 MHz , DMSO-d6) d: 0.85 (3H, t, J=7 .2 Hz), 1.64-1.74 (2H, m) , 1.77-1.90 (2H, m), 2.06-2.19 (4H, m), 2.27-2.32 (2H, m), 2.33-2.37 (2H, m) , 2.38 (3H , s), 2.72-2.80 (3H, m) , 2.96-3.19 (6H, m) , 3.39-3.48 (10H, m), 3.52-3.75 (10H, m), 4.39-4.48 (1H, m), 5.14 (1H , d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz ), 5.38 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.0 Hz ), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (1H, s), 7.13-7.24 (5H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz ), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.10 (1H , d, J=7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.44 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo- fármaco (28) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30 H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL· reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm 1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 _+ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.102 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 M del compuesto obtenido en el Proceso 1 (0.047 mL; 5.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.009 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co . LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, e¾,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), A,370 = 0 (valor de cálculo estimado) , 8D,2SO = 5000 (valor promedio medido), y 8D,37O = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 13.60 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 9.5 mg (76%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.3.
Ejemplo 30 Conjugado de anticuerpo-fármaco (29) Fórmula 99 .
- Proceso 1: N- (terc-butoxicarbonil)-b-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H-benzo[de]pirano [31,41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida El compuesto (0.839 g, 1.00 mol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 1 usando N-(tere -butoxicarbonil ) -b-alanina en lugar de ácido 4-(tere -butoxicarboni lamino )butanoico . El producto crudo obtenido se usó en el siguiente proceso sin realizar purif icación .
Proceso 2: b-Alanilgl icilglici 1-L-feni lalanil- N- (4-{[(1S,9S )-9-etil-5-fluoro-9 -hidroxi -4-metí1-10, 13-dioxo- 2,3,9,10,13,15 -hexahidro- 1H ,12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indol izino [1,2-b]quino1in- 1-i1]amino }-4-oxobut i1)gl icinamida El producto crudo obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.610 g, 67%).
RMN *H (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz) , 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 (2H, m), 2.09-2.22 (4H , m), 2.40 (3H, s), 2.46-2.55 (2H, m), 2.82-2.73 (1H, m) , 2.95-3.13 (5H, m), 3.14-3.21 (2H, m), 3.55- 3.80 (6H, m), 4.44-4.52 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J=35.0, 19.0 Hz) , 5.42 (2H, s), 5.53-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s) , 7.14-7.28 (5H , m), 7.31 (1H, s), 7.67 (2H, brs), 7.72-7.78 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.10-8.17 (2H, m), 8.29 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.42 (1H, t, J=5.7 Hz) , 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz).
Proceso 3: N- (bromoacetil )-b-alani lglici lglici1-L-f enilalanil -N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9 -hidroxi-4 -metil-10, 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H ,12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indol izino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobuti1 )glicinamida A una solución de dicloromet ano (4.5 mL) de ácido 2-bromoacét ico (96.3 mg , 0.693 mmol), se agregaron N-hidroxisuccinimida (79.7 mg, 0.693 mmol) y 1,3 -diisopropilcarbodiimida (0.107 mL, 0.693 mmol) y se agitó a temperatura ambiente. La solución de reacción se agregó a una solución de N,N-dimetil formamida (4.5 mL) del compuesto (473 mg, 0.462 mmol) obtenido en el Proceso 2 y trietilamina (0.154 mL, 1.11 mmol) a 0°C y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. La solución de reacción se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [solvente de elución: cloroformo cloroformo :metanol = 85:15 (v/v)]. El sólido obtenido se lavó con solvente mezclado de cloroformo :metanol:éter dietílico para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (191 mg, 40%).
RMN CH (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz) , 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 (2H, m), 2.08-2.22 (4H , m), 2.33 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.74- 2.83 (1H, m), 2.99-3.12 (3H, m) , 3.14-3.21 (2H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.56-3.77 (6H, m), 3.82 (2H, s), 4.41-4.51 (1H, m), 5.20 (2H, q, J=18.9 Hz), 5.42 (2H, s) , 5.54-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.15-7.27 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.69-7.74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz) , 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.21-8.34 (3H, m), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H)+ Proceso 4: Conjugado de anticuerpo- fármaco (29) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30- H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg- ^-enr1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL).
Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma- Aldrich Co. LLC; 0.09 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 (0.059 mL; 7.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.009 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £D,28O = 5000 (valor promedio medido) , y £D,370 = 19000 (valor promedio medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 13.9 mg/mL , rendimiento de anticuerpo: 9.7 mg (78%), ^ número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 31 Conjugado de anticuerpo -fármaco (30) Fórmul a 100 - i I Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 30, se obtuvo el conjugado de ant icuerpo- fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 4.
Concentración del anticuerpo: 1.94 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 11.64 mg (93%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.6.
Ejemplo 32 Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 31 ) Fórmula 101 | - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 31 ) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 30, se obtuvo el conjugado de ant icuerpo- fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 5.
Concentración del anticuerpo: 1.90 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 11.40 mg (91%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.7.
Ejemplo 33 Conjugado de anticuerpo- fármaco (32) Fórmula 102 6.0 Casi todas las cantidades de los conjugados de anticuerpo- fármaco de los Ejemplos 31 y 32 se mezclaron. La solución se concentró por el Procedimiento común A para proporcionar el conjugado de anticuerpo- fármaco del título.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 21.06 mg , y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.0.
Ejemplo 34 Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 33 ) Fórmula 103 I o ..
H o X O Í Ó . ( . . ^ o _ o r HO O . - - _ .
Proceso 1: 4- ({N6-(terc-butoxicarbonil)-N2-[(9H- fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-lisil}amino)butanoato de tere- butilo A una solución de N,N-dimetil formamida (10.0 mL) NE-(terc-butoxicarbonil)-Na-[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]-L-lisina (1.00 g, 2.14 mmol), se agregaron N-hidroxisuccinimida (0.370 g, 3.20 mmol), y clorhidrato del áster terc-butílico del ácido 4-aminobutanoico (0.830 g, 4.27 mmol), clorhidrato de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0.610 g, 3.20 mmol) y N,N- diisopropiletilamina (0.410 mi, 2.35 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 3 días. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de 10% de ácido cítrico y una solución acuosa saturada de carbonato hidrógeno de sodio, y salmuera saturada, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (1.35 g, cuantitativo).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 1.14-1.42 (4H, m), 1.36 (9H, S), 1.37 (9H, S), 1.48-1.67 (4H, m), 2.18 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.84-2.93 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3.84-3.94 (1H, m), 4.18-4.30 (3H, m), 6.76 (1H, t, J=5.4 Hz), 7.33 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.39-7.45 (3H, m), 7.73 (2H, dd, J=7.3, 2.7 Hz), 7.85- 7.92 (3H, m).
Proceso 2: 4- {[Ns-(terc-butoxicarbonil)-L- lisil]amino}butanoato de tere-butilo A una solución de N,N-dimetil forraamida (8.00 mL) del compuesto (1.35 g, 2.22 mmol) obtenido en el Proceso 1, se agregó piperidina (2.00 mL) y se agitó por 1.5 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin realizar purificación adicional.
Proceso 3: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L- valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-terc-butoxi-4-oxobutil)- L-lisinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (30.0 mL) de la mezcla (2.22 mmol) obtenida en el Proceso 2, se agregaron N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-valina (1.13 g, 3.32 mmol), N-hidroxisuccinimida (0.310 g, 2.66 mmol), y clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0.550 g, 2.88 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 18 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa saturada de carbonato hidrógeno de sodio y salmuera saturada, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo:metanol = 9:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (0.363 g, 23%).
RMN XH (400 MHz, DMS0-ds) d: 0.84 (6H, t, J=6.0 Hz), 1.12-1.64 (8H, m), 1.34 (9H, s), 1.38 (9H, s), 1.90-2.04 (1H, m), 2.17 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.79-2.90 (2H, m), 2.99-3.09 (2H, tn), 3.83-3.91 (1H, m), 4.08-4.44 (4H, m), 6.71 (1H, t, J=5.4 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.42 (3Hf t, J=7.3 Hz), 7.74 (2H, t, J=7.0 Hz), 7.85-7.91 (4H, m).
MS (ESI) m/z: 709 (M+H)+ Proceso 4: formiato de N-[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]-L-valil-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamida Al compuesto (0.363 mg, 0.512 mmol) obtenido en el Proceso 3, se agregó ácido fórmico (10.0 mi) y se agitó a temperatura ambiente por 4 horas. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título. El compuesto se usó para la siguiente reacción sin realizar purificación adicional.
Proceso 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L- valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(3-carboxipropil)-L- lisinamida A una suspensión de 1,4-dioxano (5.00 mL) del compuesto (0.512 mmol) obtenido en el Proceso 4, se agregaron una solución acuosa saturada de carbonato hidrógeno de sodio (20.0 mi) y dicarbonato de di-terc-butilo (0.178 mi, 0.769 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 3 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de 10% de ácido cítrico y salmuera saturada, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (0.295 g, 88%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.84 (6H, t, J=6.7 Hz), 1.13-1.39 (4H, m), 1.35 (9H, s), 1.48-1.62 (4H, m), 1.91-2.04 (1H, m), 2.20 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.80-2.89 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3.87 (1H, dd, J=8.5, 6.7 Hz), 4.06-4.35 (4H, m), 6.71 (1H, t, J=6.0 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.39-7.46 (3H, m), 7.74 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.83-7.94 (4H, m).
MS (ESI) m/z: 653 (M+H)+ Proceso 6: N- [(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L- valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida El mesilato del compuesto (4) (0.240 g, 0.452 mmol) se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 1 usando el compuesto (0.295 g, 0.452 mmol) obtenido en el Proceso 5 en lugar de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para proporcionar el compuesto del título como un sólido anaranjado pálido (0.208 g, 43%).
MS (ESI) m/z: 1071 (M+H)+ Proceso 7: L-Valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano [31,4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-l- il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida El compuesto (0.208 g, 0.194 mmol) obtenido en el Proceso 6 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 hasta proporcionar una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin realizar purificación adicional.
Proceso 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)- 9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [31,4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida La mezcla (0.194 mmol) obtenido en el Proceso 7 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.133 g, 56%).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.77 (6H, t, J=5.7 Hz), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.14-1.71 (10H, m), 1.35 (9H, s), 1.77-1.95 (3H, m), 2.02-2.23 (7H, m), 2.40 (3H, s), 2.84 (3H, q, J=6.4 Hz), 3.05 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.17 (2H, s), 3.26-3.39 (3H, m), 4.01-4.16 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36-5.48 (2H, m), 5.51-5.60 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.72 (1H, t, J=6.0 Hz), 6.99 (2H, s), 7.31 (1H, s), 7.71-7.85 (5H, m), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (ESI) m/Z: 1041 (M+H)+ Proceso 9: trifluoroacetato de N-[6-(2,5-dioxo-2,5- dihidro-lH-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indolizino [1,2- b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)-L-lisinamida A una solución de diclorometano (10.0 mi) del compuesto (0.110 mg, 0.106 mmol) obtenido en el Proceso 8, se agregó ácido trifluoroacético (4.00 mi) y se agitó por 5 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (70.0 mg, 64%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-de) d: 0.76-0.81 (6H, m), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.31 (4H, m), 1.39-1.56 (8H, m), 1.57-1.74 (3H, m), 1.79-1.96 (3H, m), 2.06-2.18 (7H, m), 2.40 (3H, s), 2.70-2.80 (2H, m), 3.01-3.10 (2H, m), 3.13-3.22 (2H, m), 4.04 (1H, t, J=7.6 Hz), 4.10-4.20 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 HZ), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52- 5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.32 (1H, s), 7.61 (3H, brs), 7.75-7.88 (4H, m), 8.43 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (ESI) m/z: 941 (M+H)+ Proceso 10: Conjugado de anticuerpo-fármaco (33) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 9, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 29.
Concentración del anticuerpo: 12.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.4 mg (67%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 35 Conjugado de anticuerpo-fármaco (34) Fórmula 104 , - - - ., Proceso 1: N-(3-sulfanilpropanoil)glicilglicil-L- fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4';6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]amino}-4-oxobutil)glicinamida El compuesto (84.0 mg, 0.100 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando N-succinimidil 3- mercaptopropionato en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6- maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (61.2 mg, 66%).
RMN ¾ (DMSO-De) d : 0 . 87 ( 3H, t , J=7.4 Hz) , 1 . 77- 1.66 (2H, m), 1.79-1.92 (2H, m), 2.07-2.24 (4H, m), 2.31-2.47 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.59-2.69 (2H, m), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.98-3.13 (3H, m), 3.14-3.23 (2H, m), 3.54- 3.79 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J=36.8, 19.2 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.63 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.68-7.74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.03-8.09 (1H, m), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.19-8.29 (2H, m), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 927 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo-fármaco (34) Derivatización de SMCC del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 20 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^ctrr1). La solución (0.25 mL) se colocó en un tubo de 1.5 mL, cargada con solución de DMSO (0.0063 mL; la cual corresponde a aproximadamente 2.55 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 27.6 mM de succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) a temperatura ambiente, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-2 hasta proporcionar 0.7 mL de una solución que contiene aproximadamente 5 mg del SMCC-anticuerpo derivatizado.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar DMSO (0.045 mL) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 (0.015 mL; el cual corresponde a aproximadamente 2.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 3.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, EA,2BO = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), ED,28Ü = 5000 (valor promedio medido), y ED,37O = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 3.85 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 0.8 mg (16%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 2.9.
Ejemplo 36 Conjugado de anticuerpo-fármaco (35) Fórmula 105 - . - - 4.2 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (35) Derivatización de SMCC del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 20 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cirr1). La solución (0.25 mL) se colocó en un tubo de 1.5 mL, cargada con solución de DMSO (0.0125 mL; la cual corresponde a aproximadamente 5.1 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 27.6 mM de succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) a temperatura ambiente, y se hizo reaccionar a temperatura ambiente por 2 horas. Esta solución de reacción se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-2 hasta proporcionar 0.7 mL de una solución que contiene aproximadamente 5 mg del SMCC-anticuerpo derivatizado.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar DMSO (0.03 mL) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 35 (0.03 mL; el cual corresponde a aproximadamente 4.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 3.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), e0,28o = 5000 (valor promedio medido), y eh,370 = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 2.43 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 0.5 mg (10%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 4.2.
Ejemplo 37 Conjugado de anticuerpo-fármaco (36) Fórmula 106 I ' 1 I - - . 3.2 Proceso 1: N-{8-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]-8 oxooctanoil}glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(lS,9S)-9-etil- 5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida El compuesto (84.0 mg, 0.100 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando di(N-succinimidilo) suberato en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (77.1 mg, 71%).
RMN ¾ (DMSO-De) d: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.21- 1.38 (4H, m), 1.43-1.50 (2H, m), 1.55-1.63 (2H, m), 1.68-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.07-2.22 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.60-2.67 (2H, m), 2.76-2.84 (5H, m), 2.97-3.22 (5H, m), 3.56-3.76 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, q, J=18.8 Hz), 5.37-5.48 (2H, m), 5.53-5.62 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.15-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.04 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.09 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.26 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1092 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo-fármaco (36) Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 20 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm 1). La solución (0.25 mL) se colocó en un tubo de 1.5 mL, cargada con solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 (0.025 mL; el cual corresponde a aproximadamente 3.7 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 3.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorc ión molar , £ , 235300 (valor de cálculo estimado), 8A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £ü,280 5000 (valor promedio medido), y ED,37O = 19000 (valor promedio medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 6.25 mg/mL , rendimiento de anticuerpo: 1.3 mg (26%), y numero promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 38 Conjugado de anticuerpo- fármaco (37) Fórmula 107 ,, - .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo- fármaco (37) Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 20 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm 1). La solución (0.5 mL) se colocó en un tubo de 1.5 mL, después de esto se cargó con solución de DMSO que contiene DMSO (0.025 mL) y 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 37 (0.025 mL; el cual corresponde a aproximadamente 7.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 16 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 3.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, EA,2 80 235300 (valor de cálculo est imado ) , E , 0 (valor de cálculo estimado ) , E , 5000 (valor promedio medido), y ED,37O = 19000 (valor promedio medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 4.36 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 0.9 mg (18%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 4.1.
Ejemplo 39 Conjugado de anticuerpo-fármaco (38) Fórmula 108 l Proceso 1: Conjugado de ant icuerpo -fármaco ( 38 ) Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: El anticuerpo anti-CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75 mLmg^cm 1). La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL, después de esto se cargó con DMSO (0.017 mL) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 37 (0.023 mL; el cual corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 4 horas .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo -fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,2SO = 270400 (valor de cálculo estimado) , £A,370 = 0 (valor de cálculo estimado) , £D,2SO 2670 (valor medido), y £ü,370 15820 (valor medido) ), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 0.55 mg/mL , rendimiento de anticuerpo: 1.4 mg (34%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 2.7.
Ejemplo 40 Conjugado de anticuerpo-fármaco (39 Fórmula 109 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo- fármaco (39) Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: El anticuerpo anti-CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66 mLmg^cm 1). La solución (0.4 mL , 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL, después de esto se cargó con DMSO (0.017 mL) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 37 (0.023 mL; el cual corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a temperatura ambiente, y se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 4 horas .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,2SO = 256400 (valor de cálculo estimado), 8A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), 8D,28O = 2670 (valor medido), y 8D,37O = 15820 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 0.93 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.3 mg (58%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 4.0.
Ejemplo 41 Conjugado de anticuerpo-fármaco (40) Fórmula 110 4.1 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (40) Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.5/EDTA usando el Procedimiento común C-2 y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69 mLmg^cirr1). La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL, después de esto se cargó con DMSO (0.017 mL) y una solución de DMSO que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 1 (0.023 mL; el cual corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) del Ejemplo 37 a temperatura ambiente, y se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 4 horas.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) para proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,2SO = 262400 (valor de cálculo estimado) , 8A,370 0 (valor de cálculo estimado) , 8D,2SO = 2670 (valor medido) , y 8D,37o = 15820 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 1.04 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.6 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 4.1.
Ejemplo 42 2- (2-Aminoetoxi)-N- [(1S,9S)-9- etil-5-f luoro- 9-hidroxi-4 -metil-10 ,13-dioxo - 2,3,9,10,13, 15-hexahidro-IH, 12H- benzo [de]pirano [3',4 ':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin- 1-il]acetamida Fórmula 111 HÓ O HO O HO O Proceso 1: [2-(2-{ [(1S,9S)-9 -eti1-5 -fluoro -9- hidroxi-4-metil-10, 13 -dioxo-2 ,3,9,10,13,15- hexahidro - 1H,12H-benzo [de]pirano [31,4':6,7]indol izino [1,2- b]quinolin-1-il] amino} -2-oxoetoxi )et i1]carbamato de tere-butilo El mesilato del compuesto (4) (3.10 g, 5.47 mol) se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 1 usando ácido {2-[(terc- butoxicarbonil )amino]etoxi }acético (J. Med. Chem ., 1992, vol. 35, pp .2928) (1.55 g, 6.01 mmol) en lugar de ácido 4-(tere -butoxicarboni lamino)butanoico para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (2.56 g, 73%).
RMN !H (400 MHz , DMS0-d6) d: 0.87 (3H, t, =7.3 Hz), 1.26 (9H , s), 1.81-1.91 (2H, m), 2.13-2.22 2H, m), 2.40 (3H, s), 3.08-3.26 (4H, m), 3.43-3.53 2H, m), 4.00 (1H, d, J=15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J=15.1 z), 5.14 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.22 (1H, d, J= 18.7 Hz), 5.40 (1H , d, J=16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.59-5.66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J=5.4 Hz ), 7.31 (1H , s), 7.79 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J= 9.1 Hz) .
MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+ Proceso 2: 2- (2-Aminoetoxi)-N- [(1S ,9S)-9- etil-5-fluoro-9- hidroxi -4-metil-10, 13-dioxo - 2,3,9,10,13, 15 -hexahidro-IH, 12H- benzo [de]pirano [3 ' ,4' :6, 7] indo lizino[l,2-b] quino lin- 1-il] acetamida El compuesto (1.50 g, 2.36 mol) obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 1 hasta proporcionar trifluoroc lorhidra to del compuesto del título como un sólido amarillo pálido (1.50 g, cuantitativo). Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibe el conjugado de ¡ o- fármaco (41) .
MN H (400 MHz , DMSO-d6) d: 0.87 ( 3 H , t, 1.81-1.92 (2H, m) , 2.15-2.23 ( 2 H , m) , 2.41 3.05 ( 2 H , t, J= 5.1 Hz ) , 3.15-3.23 (2H, m) , .71 ( 2H , t, J= 5 1 Hz) , 4.10 ( 2H , s) 5.19 (1H, d, = 18.7 Hz) , 5.24 (1H, d, J= 18.7 Hz) , 5.43 ( 2 H , s) , 5 .58-5.66 (1H, m) , 6.55 (1H, s) , 7.33 (1H, s ) , 7.73- v .84 ( 4H , m) , 8.55 (1H, d, J=9.1 Hz) .
MS ( APCI ) m/ z : 537 (M+H ) + Ejemplo 43 Conjugado de anticuerpo- fármaco (41) Fórmula 112 H2N^L O N^. H NgA O Proceso 2 H ° = TFA Proceso 3 HO O I .
- Proceso 1: N- (Terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L- fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1- il]amino}-2-oxoetoxi)etil]glicinamida El compuesto (554 mg, 0.85 mmol) del Ejemplo 42 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (775 mg, 95%).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.85 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H, dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m), 3.40-3.62 (8H, m), 3.73 (1H, dd, J=16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J=5.8 Hz), 7.13-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J=5.2 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+ Proceso 2: Glicilglicil-L-fenilalanil-N- [2-(2- { [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)etil]glicinamida trifluoroacetato El compuesto (630 mg, 0.659 mol) obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (588 mg, 92%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.86 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09- 3.23 (1H, m), 3.24-3.32 (3H, m), 3.41-3.71 (7H, m), 3.86 (1H, dd, J=16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J=9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.5 Hz), 5.45 (1H, d, J=16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46- 8.55 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+ Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(lS,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [31,4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-l-il]amino}-2-oxoetoxi)etil]glicinamida El compuesto (240 mg, 0.247 mmol) obtenido en el Proceso 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (162 mg, 62%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-de) d: 0.86 (3H, t, J=7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 (4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J=13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J=13.6, 4.5 Hz), 3.08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m), 3.72 (1H, dd, J=16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J=8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.7 Hz) , 5.40 (1H, d, J=17.2 Hz) , 5.44 (1H, d, J=17.2 Hz) , 5.57-5.64 (1H, m) , 6.52 (1H, s) , 6.99 (2H, s) , 7.13-7.25 ( 5H, m) , 7.31 (1H, s) , 7.74-7.81 (2H, m) , 7.99 (1H, t, J=5.7 Hz) , 8.03-8.11 (2H, m) , 8.22 (1H, t, J=5.7 Hz) , 8.47 (1H, d, = 9.1 Hz) .
MS (APCI ) m/z: 1048 (M+H) + Proceso 4: Conjugado de anticuerpo-fármaco (41) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 29.
Concentración del anticuerpo: 12.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.4 mg (67%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.5.
Ejemplo 44 Conjugado de anticuerpo-fármaco (42) Fórmula 113 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (42) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 43, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 5.
Concentración del anticuerpo: 0.83 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 4.98 mg (40%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 7.2.
Ejemplo 45 Conjugado de anticuerpo-fármaco (43) Fórmula 114 - - . 6.3 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (43) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 43, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 4.
Concentración del anticuerpo: 1.06 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 6.36 mg (51%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.3.
Ejemplo 46 Conjugado de anticuerpo-fármaco (44) Fórmula 115 i 6.6 Casi todas las cantidades de los conjugados de anticuerpo-fármaco de los Ejemplos 44 y 45 se mezclaron. La solución se concentró por el Procedimiento común A para proporcionar el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 10.21 mg, y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.6.
Ejemplo 47 Conjugado de anticuerpo-fármaco (45) Fórmula 116 H O H 0 H tz ó H o 7 H o ^ ,NK 0 .
Proceso 1 - - - . 3.7 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (45) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (0.0267 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 43 (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0066 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), 8D,2SO = 5193 (valor medido), y 8D,37O = 20347 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. 338 Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 9.3 mg (74%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.7.
Ejemplo 48 Conjugado de anticuerpo-fármaco (46) Fórmula 117 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (46) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm-1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co.f Ltd.) (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido (0.0726 mL; 8.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 3 del Ejemplo 43 hasta la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.011 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eB,28o = 5193 (valor medido), y eO370 = 20347 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 10.0 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 7.8 mg (62%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 5.2.
Ejemplo 49 N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-b- alaninamida Fórmula 118 Proceso 1: (3-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-l- il]amino}-3-oxopropil)carbamato de tere-butilo El mesilato del compuesto (4) (500 mg, 0.941 mmol) se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-b-alanina en lugar de ácido 4 - ( terc-butoxicarbonilamino) butanoico para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo-marrón (616 mg, cuantitativo).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.29 (9H, s), 1.86 (2H, dt, J=15.1, 7.3 Hz), 2.04-2.22 (2H, m), 2.31 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.40 (3H, s), 3.10-3.26 (4H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, dd, J=18.8, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.5, 4.2 Hz), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.30 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+ Proceso 2: N-[(lS,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il]-b-alaninamida El compuesto obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 1 hasta proporcionar trifluoroacetato del compuesto del título como un sólido amarillo (499 mg, 86%).
RMN !H (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.86 (2H, dquin, J=14.6, 7.2, 7.2, 7.2, 7.2 Hz), 2.06-2.27 (1H, m), 2.41 (3H, s), 2.46-2.57 (2H, m), 3.08 (2H, t, J=6.8 Hz), 3.14-3.24 (2H, m), 5.22 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.29 (1H, d, J=18 .8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.58 (1H, dt, J=8.5, 4.5 Hz), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.74 (3H, brs), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+ Ejemplo 50 Conjugado de anticuerpo-fármaco (47) Fórmula 119 , t [ , , | - - - · Proceso 1: N- (terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[31,41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-b-alaninamida El compuesto (484 mg, 0.780 mmol) del Ejemplo 49 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (626 mg, 87%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27-1.42 (9H, m), 1.77-1.93 (2H, m), 2.06-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, d, J=1.6 Hz), 2.44-2.54 (2H, m), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.52 (6H, d, J=6.3 Hz), 4.42-4.54 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.42 (1H, dd, J=18.4, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.7, 4.4 Hz), 6.53 (1H, s), 6.98 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.77-7.84 (1H, m), 7.91 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.16 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.1 Hz), 8.52 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proceso 2: trifluoroacetato de Glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de]pirano[31,4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il]-b-alaninamida El compuesto (624 mg, 0.675 mmol) obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo (626 mg, 92%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.86 (2H, tt, J=14.5, 7.2 Hz), 2.07-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, s), 2.44-2.54 (2H, m), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 4.3 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=4.7 Hz), 3.69 (3H, td, J=11.2, 5.7 Hz), 3.87 (1H, dd, J=17.0, 5.7 Hz), 4.54 (1H, m, J=17.8, 4.5 Hz), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.43 (2H, s) , 5.51-5.60 (1H, m) , 6.55 (1H, s) , 7.14-7.29 (5H, m) , 7.32 ( 1H, s ) , 7.81 (1H, d, J=10.9 Hz) , 7.88 (1H, t, J=5.7 Hz) , 7.97 ( 3H, brs) , 8.29-8.38 (2H, m) , 8.50 (1H, t, J=5.7 Hz) , 8.55 ( 1H, d, J=8.6 Hz) .
MS (ESI) tn/z: 825 (M+H) + Proceso 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [3',41:6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-l-il]-b-alaninamida El compuesto (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtenido en el Proceso 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título como un sólido (14.0 mg, 21%).
RMN ¾ (400 MHz, DMSO-de) d: 0.86 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.39-1.51 (4H, m), 1.79-1.91 (2H, m), 2.02-2.20 (2H, m), 2.07 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.30-2.42 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J=14.1, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.7, 4.9 Hz), 3.12-3.21 (2H, m), 3.26-3.42 (2H, m), 3.50- 3.80 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.6 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.51-5.62 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.84 (2H, m), 8.01 (1H, t, J=5.3 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.14 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.25 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI ) m/z : 1018 (M+H) + Proceso 4: Conjugado de anticuerpo-fármaco (47) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 3, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 4 del Ejemplo 2.
Concentración del anticuerpo: 12.27 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.6 mg (69%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.4.
Ejemplo 51 Conjugado de anticuerpo-fármaco (48) Fórmula 120 I - - - Proceso 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-l il)propanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-b-alaninamida El compuesto (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando N-succinimidil 3-maleimida propionato en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (36.0 mg, 57%).
RMN !H (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.85 (2H, dt, J=14.4, 7.5 Hz), 2.05-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.30-2.44 (5H, m), 2.73-2.84 (1H, m), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.17 (3H, d, J=5.1 Hz), 3.26-3.40 (2H, m), 3.41-3.81 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.52-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.80 (2H, d, J=10.2 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.12 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.20-8.31 (2H, m), 8.52 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo-fármaco (48) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 4 del Ejemplo 2.
Concentración del anticuerpo: 11.59 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.1 mg (65%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.7.
Ejemplo 52 Conjugado de anticuerpo-fármaco (49) Fórmula 121 - _ I - 3.8 Proceso 1: N- {3-[2-(2-{[3- (2,5-dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol-1-il)propanoil] amino})etoxi] propanoil}glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N- [(1S,9S)-9-etil -5-fluoro-9-hidroxi -4-metil -10,13-dioxo-2 ,3,9,10,13,15-hexahidro- 1H,12H-benzo [de]pirano [31,41:6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il]-b-alaninamida El compuesto (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando 3-(2-(2- (3-malcinimidapropanamida) etoxi)etoxi) propanoato de N-succinimidilo en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (23.0 mg, 31%).
RMN XH (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz) , 1.77-1.92 (2H, m), 2.07-2.21 (2H, m), 2.27-2.42 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.74-2.84 (1H, m), 2.97-3.06 (1H, m), 3.09-3.21 (4H, m), 3.25-3.39 (6H, m), 3.45 (4H, s), 3.50- 3.80 (8H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.26 (1H, m, J=18.4 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.51-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.87 (2H, m), 7.93-8.07 (2H, m), 8.09-8.21 (2H , m), 8.26 (1H, brs), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo-fármaco (49) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 29.
Concentración del anticuerpo: 14.50 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 10.2 mg (82%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.8.
Ejemplo 53 Conjugado de anticuerpo-fármaco (50) Fórmula 122 , [_ - - - Proceso 1: N-[19- (2,5-Dioxo-2,5-dihidro- 1H-pirrol -1-il)-17-oxo-4 ,7,10,13 -tetraoxa-16-azanonadecan-1-oil] glicilglicil -L-fenilalanilgl icil-N- [(1S,9S)-9-etil-5-f luoro-9-hidroxi-4-metil-10 ,13-dioxo -2,3,9,10,13,15 -hexahidro- 1H ,12H-benzo [de]pirano [31,4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1-il] -b-alaninamida El compuesto (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 50 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 usando 1- malcinimida- 3-oxo- 7,10,13,16-tetraoxa-4 -az anonadecanoato de N-succinimidilo en lugar de hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida para proporcionar el compuesto del título como un sólido (23.0 mg, 29%).
RMN *H (400 MHz, DMSO-ds) d: 0.86 (3H, t, J=7.0 Hz) , 1.85 (2H, tt, J=14.6, 7.1 Hz), 2.06-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.28-2.43 (6H, m), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 3.9 Hz), 3.09-3.22 (4H, m) , 3.27-3.41 (4H, m), 3.47 (12H, d, J=8.6 Hz), 3.53- 3.81 (1OH , m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz) , 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.53-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.12-7.29 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.85 (2H, m), 8.03 (2H, d, J=6.6 Hz), 8.11-8.21 (2H, m), 8.27 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d, J=8 .6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+ Proceso 2: Conjugado de anticuerpo-fármaco (50) Usando el anticuerpo M30-H1-L-4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 y el compuesto obtenido en el Proceso 1, se obtuvo el conjugado de anticuerpo-fármaco del título en la misma manera como el Proceso 4 del Ejemplo 2.
Concentración del anticuerpo: 13.47 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 9.4 mg (75%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.1.
Ejemplo 54 Conjugado de anticuerpo-fármaco (51) Fórmula 123 MsOH 0>- HO 0 , | · I - - I Proceso 1: (6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de]pirano[3',41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)carbamato de tere-butilo El mesilato del compuesto (4) (0.500 g, 0.882 mmol) se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 1 usando ácido 6-(terc-butoxicarbonilamino)hexanoico en lugar de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para proporcionar el compuesto del título (0.620 g, cuantitativo).
RMN XH (DMSO-de) d: 0.83 (3H, t, J=7.8 Hz), 1.14- 1.28 (2H, m), 1.31 (9H, s), 1.47-1.61 (2H, m), 1.75-1.89 (2Hf m), 2.04-2.17 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.81-2.88 (2H, m), 3.09- 3.16 (2H, m), 5.10 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.16 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.39 (2H, s), 5.48-5.55 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.73-6.78 (1H, m), 7.26 (1H, s), 7.74 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.39 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proceso 2: trifluoroacetato de 6-Amino-N-[(1S,9S)- 9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]hexanamida El compuesto (0.397 g, 0.611 mmol) obtenido en el Proceso 1 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 1 hasta proporcionar el compuesto del título (0.342 g, 84%).
RMN ¾ (DMS0-d6)d: 0.88 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31-1.41 (2H, m), 1.52-1.70 (4H, m), 1.80-1.94 (2H, m), 2.05-2.18 (2H, m), 2.21 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.40 (3H, s), 2.81 (2H, t, J=7.4 Hz), 3.10-3.25 (2H, m), 3.33 (2H, brs), 5.18 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.22 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.41 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.45 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.53-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.2 Hz).
Proceso 3: N- (terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de]pirano[31,4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)glicinamida El compuesto (0.170 g, 0.516 mmol) obtenido en el Proceso 2 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 1 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (0.225 g, 91%).
RMN ¾ (DMSO-de) d: 0.88 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.43- 1.70 (6H, m), 1.87 (2H, td, J=15.0, 7.4 Hz), 2.10-2.22 (3H, m), 2.28-2.37 (1H, m), 2.42 (3H, s), 2.78-2.85 (1H, m), 3.01- 3.10 (3H, m), 3.15-3.22 (2H, m), 3.54-3.61 (5H, m), 3.62-3.69 (1H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.45 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.02 (1H, t, J=6.1 Hz), 7.11-7.28 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.63-7.69 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.90-7.96 (1H, m), 8.17 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.28 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=9.0 Hz).
Proceso 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N- (6- { [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de] irano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)glicinamida El compuesto (0.105 g, 0.108 mmol) obtenido en el Proceso 3 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 2 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (0.068 mg, 65%).
RMN ? (DMSO-ds) 5: 0.89 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.15-1.67 (6H, m), 1.79-1.97 (2H, m), 2.08-2.24 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.76-2.82 (1H, m), 3.00-3.10 (5H, m), 3.19 (1H, s), 3.50- 3.63 (2H, m), 3.64-3.76 (3H, m), 3.84-3.92 (1H, m), 4.51-4.59 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.24 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.44 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, brs), 7.15-7.29 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.72-7.78 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.96-8.08 (2H, m), 8.30-8.38 (2Hf m), 8.46-8.56 (2H, m).
Proceso 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6-oxohexil)glicinamida El compuesto (58 mg, 0.060 mmol) obtenido en el Proceso 4 se hizo reaccionar en la misma manera como el Proceso 3 del Ejemplo 2 hasta proporcionar el compuesto del título (39 mg, 62%).
RMN ¾ (CD3OD) 6: 0.99 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27 (2H, td, J=ll.6, 6.1 Hz), 1.38-1.44 (2H, m), 1.50-1.63 (6H, m), 1.65-1.80 (2H, m), 1.89-1.98 (2H, m), 2.17-2.25 (3H, m), 2.26-2.36 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.95 (1H, dd, J=14.3, 9.2 Hz), 3.12 (1H, dd, J=13.7, 5.7 Hz), 3.15-3.25 (4H, m), 3.44 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.65 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.76 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.79-3.86 (4H, m), 4.43 (1H, dd, J=8.9, 6.0 Hz), 5.10 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.35 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.56 (1H, d, J=16.0 Hz), 5.60-5.64 (1H, m), 6.76 (2H, s), 7.12-7.24 (6H, m), 7.58 (1H, s), 7.60 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.68 (1H, t, J=5.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+ Proceso 6: Conjugado de anticuerpo-fármaco (51) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 mL; 2.3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 ^ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 5 (0.0295 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.00590 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (PBS7.4 se usó como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £D,28O = 5000 (valor promedio medido), y £D,37O = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.97 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.82 mg (58%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 1.7.
Ejemplo 55 Conjugado de anticuerpo-fármaco (52) Fórmula 124 - - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (52) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 M de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 L; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 ± 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 5 del Ejemplo 54 (0.0590 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0118 mL; 18.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (PBS7.4 se usó como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA28o = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eh,2bo = 5000 (valor promedio medido), y eB,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.94 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.64 mg (56%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.1.
Ejemplo 56 Conjugado de anticuerpo-fármaco (53) Fórmula 125 - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (53) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 mL; 2.3 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución a 22°C por 10 minutos, una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 5 del Ejemplo 54 (0.0295 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.00590 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (PBS7.4 se usó como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), e¾,37o = 0 (valor de cálculo estimado), e?,2bo = 5000 (valor promedio medido), y ep,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.22 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 7.32 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 1.5.
Ejemplo 57 Conjugado de anticuerpo-fármaco (54) Fórmula 126 ! - - - , Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (54) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.0 mL) se recolectó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de incubar la solución por 10 minutos a 22°C, una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 5 del Ejemplo 54 (0.0590 mL; 9.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) se agregó a esta e incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a 22°C por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.0118 mL; 18.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a 22°C por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (PBS7.4 se usó como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA28o = 235300 (valor de cálculo estimado) , eA 3 o 0 (valor de cálculo estimado), ED,2SO = 5000 (valor promedio medido), y eh,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.06 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 6.36 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.0.
Ejemplo 58 Conjugado de anticuerpo-fármaco (55) Fórmula 127 . _ · · · ' , · ' - Proceso 1: acetato de ({N-[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metilo A una mezcla que contiene N-9- fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahidrofurano (120 mi), y tolueno (40.0 mi), se agregaron piridina (1.16 mi, 14.7 mmol) y tetraacetato de plata (6.84 g, 14.7 mmol) y se sometió a reflujo bajo calentamiento por 5 horas. Después que la solución de reacción se enfrió a temperatura ambiente, los insolubles se removieron por filtración a través de Celite, y se concentró bajo presión reducida. El residuo obtenido se redisolvió en acetato de etilo y se lavó con agua y salmuera saturada, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después que el solvente se removió bajo presión reducida, el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [hexano:acetato de etilo = 9:1 (v/v) - acetato de etilo] para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (3.00 g, 67%).
RM ¾ (400 MHz, CDCI3) d: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7.0 Hz), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H, brs), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz).
Proceso 2: [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acetato de bencilo A una solución de tetrahidrofurano (40.0 mL) del compuesto (3.68 g, 10.0 mmol) obtenido en el Proceso 1 y glicolato de bencilo (4.99 g, 30.0 mmol), se agregó terc-butóxido de potasio (2.24 g, 20.0 mmol) a 0°C y se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos. La solución de reacción se cargó con acetato de etilo y agua a 0°C y se extrajo con acetato de etilo y cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida. El residuo obtenido se disolvió en dioxano (40.0 mL) y agua (10.0 mL), se cargó con carbonato hidrógeno de sodio (1.01 g, 12.0 mmol) y cloroformiato de 9-fluorenilmetilo (2.59 g, 10.0 mmol), y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. La solución de reacción se cargó con agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [hexano:acetato de etilo = 100:0 (v/v) - 0:100] para proporcionar el compuesto del título en una sustancia aceitosa incolora (1.88 g, 40%).
RMN ¾ (400 MHz, CDCl3) d: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 (2H, d, J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 (1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz).
Proceso 3: ácido [({N-[(9H-Fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acético El compuesto (1.88 g, 3.96 mmol) obtenido en el Proceso 2 se disolvió en etanol (40.0 mL) y acetato de etilo (20.0 mi). Después de agregar catalizador de paladio en carbono (376 mg), se agitó bajo atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente por 2 horas . Los insolubles se removieron por filtración a través de Celite, y el solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (1.52 g, cuantitativo).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.72 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz).
Proceso 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]amino}-2- oxoetil)carbamato Bajo enfriamiento en hielo, a una solución de N,N- dimetil formamida (10.0 mL) de mesilato del compuesto (4) (0.283 g, 0.533 mmol), N-hidroxisuccinimida (61.4 mg, 0.533 mmol), y el compuesto (0.205 g, 0.533 mmol) obtenido en el Proceso 3, se agregaron N,N-diisopropiletilamina (92.9 pL, 0.533 mmol) y N,N1-diciclohexilcarbodiimida (0.143 g, 0.693 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 3 días. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformo:metanol:agua = 7:3:1 (v/v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido marrón pálido (0.352 g. 82%).
RMN ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73 1.87 (2H, m), 2.06-2.20 (2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.98 (2H, s), 4.13-4.25 (3H, m), .60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5.42 (2H, m), ¡.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J=6.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+ Proceso 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin-1- il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (11.0 mL) del compuesto (0.881 g, 1.10 mmol) obtenido en el Proceso 4, se agregó piperidina (1.1 mL) y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin realizar purificación adicional.
Proceso 6: N- [(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamida Bajo enfriamiento en hielo, a una solución de N,N-dimetil formamida (50.0 mL) de la mezcla (0.439 mmol) obtenido en el Proceso 5, N-hidroxisuccinimida (0.101 g, 0.878 mmol), y N- [(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (es decir, el compuesto descrito en la Patente Japonesa Abierta al público No. 2002-60351) (0.440 g, 0.878 mmol), se agregó N,N'-diciclohexilcarbodiimida (0.181 g, 0.878 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 4 días. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo cloroformo¡metanol = 9:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido anaranjado pálido (0.269 g, 58%).
MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+ Proceso 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(2- { [(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano [31,41:6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]amino}-2-oxoetoxi)metil]glicinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (4.00 mL) del compuesto (0.269 g, 0.253 mmol) obtenido en el Proceso 6, se agregó piperidina (0.251 mL, 2.53 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar una mezcla que contiene el compuesto del título. La mezcla se usó para la siguiente reacción sin realizar purificación adicional.
Proceso 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-lH-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(lS,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-IH,12H-benzo [de]pirano [31,4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-1-il]amino}-2-oxoetoxi)metil] licinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (10.0 mL) del compuesto (0.253 mmol) obtenido en el Proceso 7, se agregó hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0.156 g, 0.506 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 3 días. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo:metanol = 9:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.100 g, 38%).
RMN CH (400 MHz, DMSO-d6) d: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 (4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (8H, m), 3.98 (2H, s), 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11- 7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.5 Hz).
MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Proceso 9: Conjugado de anticuerpo-fármaco (55) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm·1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc .; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma- Aldrich Co. LLC; 0.109 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 (0.039 mL; 4.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 40 minutos. Después, una solución acuosa (0.008 mL) de 100 mM de NAC (Sigma- Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A descrito en el Método de producción 1.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2bo = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), ep,2o = 5000 (valor promedio medido), y eD,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 12.57 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 8.8 mg (70%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 59 Conjugado de anticuerpo-fármaco (56) Fórmula 128 -- - · 4.8 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (56) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cirr1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma- Aldrich Co. LLC; 0.067 mL) una solución de dimetil sulfóxido que contiene y 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.085 mL; 10.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 60 minutos. Después, una solución acuosa (0.013 mL) de 100 mM de NAC (Sigma- Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £D,28O = 5000 (valor promedio medido), y £D,37O = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.33 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 7.98 mg (64%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 4.9.
Ejemplo 60 Conjugado de anticuerpo-fármaco (57) Fórmula 129 ' .
- - Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (57) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 2 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL reemplazando el medio con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común C-l y Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm-1) descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL) se colocó en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar dimetil sulfóxido (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 mL) y una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.127 mL; 15.0 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 60 minutos. Después, una solución acuosa (0.019 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y se agitó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A descrito en el Método de producción 1.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, £A,28o = 235300 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £D28o = 5000 (valor promedio medido), y £D,37o = 19000 (valor promedio medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.91 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 5.46 mg (44%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.3.
Ejemplo 61 Conjugado de anticuerpo-fármaco (58) Fórmula 130 Casi todas las cantidades de los conjugados de anticuerpo-fármaco de los Ejemplos 59 y 60 se mezclaron. La solución se concentró por el Procedimiento común A descrito . colocó en un matraz de 250 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; 3.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) y además con una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (5 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.4 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (3.51 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (2.14 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó con un agitador para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 130 minutos. Después, una solución acuosa (0.547 mL) de 100 mM de NAC se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación por ultrafiltración usando un aparato de ultraf iltración compuesto de una membrana de ultraf iltración (Merck Japón, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa) , una bomba de tubo (Bomba Cole-Parmer International, MasterFlex modelo 77521-40, Cabeza de Bomba modelo 7518-00), y un tubo (Tubo Cole-Parmer International, MasterFlex L/S16). Específicamente, mientras el ABS se agregó por goteo (un total de 800 mL) como una solución amortiguadora para purificación a la solución de reacción, la purificación por ultrafiltración se realizó para remover los enlazadores de fármaco no conjugados y otros reactivos de bajo peso molecular, también reemplazando la solución amortiguadora con ABS, y además concentrando la solución, para proporcionar aproximadamente 70 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,28O = 235300 (valor de cálculo estimado), 8A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), 8D,2SO = 5178 (valor medido), y 8D,37O = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos .
Concentración del anticuerpo: 14.2 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 1.0 g (aproximadamente 100%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.2.
Ejemplo 63 Conjugado de anticuerpo-fármaco (60) Fórmula 132 - - 4.7 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (60) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm-1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (5 mL, 50 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 15 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.075 mL; 4 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.0 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.219 mL; 6.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (0.064 mL) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 90 minutos. Después, una solución acuosa (0.033 mL; 9.8 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 19 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA280 = 235300 (valor de cálculo estimado), eA37o = 0 (valor de cálculo estimado), ep,28o = 5178 (valor medido), y e0,3> = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 2.19 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 42 mg (83%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo : 4 .7.
Ejemplo 64 Conjugado de anticuerpo-fármaco (61) Fórmula 133 5.7 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (61) Reducción del anticuerpo : El anticuerpo M30-H1-L4P producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (4 mL, 40 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 15 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.14 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo). Después de confirmar que la solución tiene un pH cercano a 7.0 usando un medidor de pH, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.232 mL; 8.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 60 minutos. Después, una solución acuosa (0.035 mL; 12.9 equivalentes por molécula de anticuerpo) de 100 mM de NAC se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 13 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA b0 = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,37o = 0 (valor de cálculo estimado), eh,28o = 5178 (valor medido), y eh,37o = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 2.03 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 26 mg (66%), y número promedio de moleculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo : 5.7.
Ejemplo 65 Conjugado de anticuerpo- fármaco (62 ) Fórmula 134 - 3.4 Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (62) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo M30-H1-L4 producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^cm1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 ± 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (0.0267 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0066 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, la solución se concentró por el Procedimiento común A.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,o = 235300 (valor de cálculo estimado), eA,3o = 0 (valor de cálculo estimado), eh,28o = 5178 (valor medido), y eD,37o = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. - - . . - producido en el Ejemplo de Referencia 1 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.61 mLmg^crrr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (1.25 mL, 12.5 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 mL; 5.2 equivalentes por molécula de anticuerpo) (0.0287 mL; 3.4 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.4 ± 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0726 mL; 8.6 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se incubó para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo en un baño maría a 15°C por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.011 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta e incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por otros 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 6 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título. Después de esto, llaa solución se concentró por el Procedimiento común A.
C t i ió fi i í i U d l · . usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0058 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (0.0101 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS .
Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (65) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti- CD30 producido en el Ejemplo de Referencia 3 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.75 mLmg^cm 1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc .; 0.006 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0035 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co . LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo- fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, EA,28O = 270400 (valor de cálculo estimado) , £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), £D,2SO = 5178 (valor medido), y eD,37o = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 0.39 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 1.0 mg (24%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 6.8.
Ejemplo 69 Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 66 ) - -CD33 producido en el Ejemplo de Referencia 4 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66 mLmg^enr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co.; Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0058 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (0.0101 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA,2qo = 256400 (valor de cálculo estimado), eA3o = 0 (valor de cálculo estimado), ep,28o = 5178 (valor medido), y eh,3o = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos. . r la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.66 mLmg^cirr1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesgue, Inc.; 0.006 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 + 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0035 mL) de 100 mM de NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, eA 2 o 256400 (valor de cálculo estimado), eA,o = 0 (valor de cálculo ti d ) 5178 ( l did ) 20217 ( l - ¡ _ Proceso 1: Conjugado de anticuerpo-fármaco (68) Reducción del anticuerpo: El anticuerpo anti-CD70 producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69 mLmg^cm-1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co. , Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalentes por molecula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque, Inc . ; 0.0058 mL) . Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 _+ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37°C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador : Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0116 mL; 4.5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y dimetil sulfóxido (0.0101 mL) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0017 mL) de 100 mM de NAC (Sigma- Aldrich Co . LLC ) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos.
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caracterización fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, 8A,28O = 262400 (valor de cálculo estimado), 8A,370 = 0 (valor de cálculo estimado), 8D,2SO = 5178 (valor medido), y 8D,37O = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.10 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.8 mg (69%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 3.8.
Ejemplo 72 Conjugado de anticuerpo-fármaco (69) Fórmula 141 - Proceso 1 : Conjugado de anticuerpo- fármaco ( 69 ) Reducc ión de l ant i cue rpo : El ant i cuerpo ant i CD7 O producido en el Ejemplo de Referencia 5 se preparó para tener la concentración del anticuerpo de 10 mg/mL con PBS6.0/EDTA usando el Procedimiento común B (se usó como coeficiente de absorción a 280 nm, 1.69 mLmg^cm·1) y el Procedimiento común C-l descrito en el Método de producción 1. La solución (0.4 mL, 4 mg del anticuerpo) se colocó en un tubo de 1.5 mL y se cargó con una solución acuosa de 10 mM de TCEP (Tokyo Chemical Industry Co ., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticuerpo) y una solución acuosa de 1 M de fosfato hidrógeno dipotásico (Nacalai Tesque , Inc .; 0.006 mL). Después de confirmar que la solución tiene un pH de 7.0 +_ 0.1, el enlace de disulfuro en la parte de articulación en el anticuerpo se redujo incubando a 37 °C por 1 hora.
Conjugación entre el anticuerpo y el fármaco enlazador: Después de agregar una solución de dimetil sulfóxido que contiene 10 mM del compuesto obtenido en el Proceso 8 del Ejemplo 58 (0.0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticuerpo) a la solución anterior a temperatura ambiente, se agitó usando un tubo rotador (MTR-103, manufacturado por AS ONE Corporation) para conjugar el enlazador de fármaco al anticuerpo a temperatura ambiente por 1 hora. Después, una solución acuosa (0.0035 mL) de 100 mM de NAC (Sigtna-Aldrich Co . LLC) se agregó a esta y además se incubó para terminar la reacción del enlazador de fármaco a temperatura ambiente por 20 minutos .
Purificación: La solución anterior se sometió a purificación usando el Procedimiento común D-l (se usó ABS como solución amortiguadora) descrito en el Método de producción 1 hasta proporcionar 2.5 mL de una solución que contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco del título.
Caract erizac ión fisicoquímica: Usando el Procedimiento común E descrito en el Método de producción 1 (se usaron como coeficiente de absorción molar, 6A,28O = 262400 (valor de cálculo estimado), £A,37O = 0 (valor de cálculo estimado), 8D,28O = 5178 (valor medido), y 8D,37O = 20217 (valor medido)), se obtuvieron los siguientes valores característicos.
Concentración del anticuerpo: 1.16 mg/mL, rendimiento de anticuerpo: 2.9 mg (73%), y número promedio de moléculas de fármaco conjugado (n) por molécula de anticuerpo: 7.0.
Ejemplo 73 (Otro método para sintetizar el compuesto del Proceso 8 del Ejemplo 58) Fórmula 142 , Proceso 1: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-l 1)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalaninato de tere-butilo Bajo enfriamiento en hielo, a una solución de THF (12.0 mi) de tere-butilo N- [(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalaninato (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393) (0.400 g, 0.717 mmol), se agregó 1,8-diazabiciclo [5.4.0]-7-undeceno (0.400 mi) y se agitó a temperatura ambiente por 4 días, y después se agregó además hexanoato de N-succinimidil 6-maleimida (0.221 g, 0.717 mmol) y se agitó por 3 horas. La solución de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución acuosa de 10% de ácido cítrico, una solución acuosa saturada de carbonato hidrógeno de sodio, y salmuera saturada, y después la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después que el solvente se removió bajo presión reducida, el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo cloroformo zmetanol = 9:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.295 g, 78%).
RMN ¾ (400 MHz, CDCl3) d: 1.28-1.36 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.57-1.71 (4H, m), 2.23 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.09 (2H, d, J=6.0 Hz), 3.51 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.85-4.02 (4H, m), 4.69-4.78 (1H, m), 6.15 (1H, t, J=4.6 Hz), 6.33 (1H, d, J=7.3 Hz), 6.60 (1H, t, J=5.0 Hz), 6.68 (2H, s), 7.10-7.16 (2H, m), 7.22-7.31 (3H, m).
MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+ Proceso 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanina A una solución de diclorometano (8.00 mi) del compuesto (0.295 g, 0.558 mmol) obtenido en el Proceso 1, se agregó ácido trifluoroacético (4.00 mL) y se agitó a temperatura ambiente por 18 horas. El solvente se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.240 g, 91%).
RMN H (400 MHz, DMSO-ds) d: 1.15-1.23 (2H, m), 1.40-1.53 (4H, m), 2.10 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.88 (1H, dd, J=13.7, 8.9 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 5.0 Hz), 3.35-3.43 (2H, m), 3.58-3.77 (4H, m), 4.41 (1H, td, J=7.8, 5.0 Hz), 7.00 (2H, s), 7.16-7.31 (5H, m), 8.00 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz).
Proceso 3: N- [6-(2,5 -dioxo-2 ,5-dihidro -1H- pirrol-1-il) hexanoil] glicilglicil-L-fenilalanil-N-[ (2-{[(1S, 9S)-9-etil-5-fluoro-9 -hidroxi -4-metil-10,13 -dioxo -2,3,9, 10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzo [de]pirano [3 ',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-i 1]amino }-2-oxoet oxi)metil] glic inamida El compuesto (0.572 g, 1.21 mmol) obtenido en el Proceso 2 se disolvió en dicloromet ano (12.0 mL), se cargó con N-hidroxisuccinimida (0.152 g, 1.32 mmol) y clorhidrato de 1-(3-dimet ilaminopropil )-3-eti 1carbodi imida (0.253 g, 1.32 mmol), y se agitó por 1 hora. La solución de reacción se agregó a una solución de N,N-dimetil formamida (22.0 mL) de la mezcla (1.10 mmol) obtenida en el Proceso 5 del Ejemplo 58, y se agitó a temperatura ambiente por 3 horas. La solución de reacción se cargó con una solución acuosa de 10% de ácido cítrico y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo :metanol = 8:2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.351 g, 31%) . Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos como aquellos del compuesto del Proceso 8 del Ejemplo 58.
Ejemplo 74 (Otro método para sintetizar el compuesto del Proceso 8 del Ejemplo 58) Fórmula 143 H Proceso 1: [({N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]glicil}amino)metoxi]acetato de bencilo A una solución de tetrahidrofurano (200 mi) del compuesto (7.37 g, 20.0 mmol) obtenido en el Proceso 1 del Ejemplo 58, se agregaron glicolato de bencilo (6.65 g, 40.0 mmol) y monohidrato de ácido p-toluensulfónico (0.381 g, 2.00 mmol) a 0°C y se agitó a temperatura ambiente por 2 horas y 30 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución acuosa saturada de carbonato hidrógeno de sodio y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [hexano:acetato de etilo = 100:0 (v/v) - 0:100] para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (6.75 g, 71%). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos como aquellos del compuesto del Proceso 2 del Ejemplo 58.
Proceso 2: N- [(Benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2-(benciloxi)-2-oxoetoxi]metil}glicinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (140 mL) del compuesto (6.60 g, 13.9 mmol) obtenido en el Proceso 1, se agregó 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (2.22 g, 14.6 mmol) a 0°C y se agitó a temperatura ambiente por 15 minutos. La solución de reacción se cargó con una solución de N,N-dimetil formamida (140 mL) de N- [(benciloxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6.33 g, 15.3 mmol), N-hidroxisuccinimida (1.92 g, 16.7 mmol), y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3.20 g, 16.7 mmol), se agitó en adelante a temperatura ambiente por 1 hora, y se agitó a temperatura ambiente por 4 horas. La solución de reacción se cargó con ácido clorhídrico 0.1 N y se extrajo con cloroformo. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cclloorrooffoorrmmoo::mmeettaannooll = 8:2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (7.10 g, 79%).
RMN ¾ (DMSO-De) d: 2.78 (1H, dd, J=13.9, 9.6 Hz), 3.05 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.56-3.80 (6H, m), 4.15 (2H, s), 4.47-4.55 (1H, ), 4.63 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.16-7.38 (15H, m), 7.52 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.17 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.36 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.61 (1H, t, J=6.6 Hz).
Proceso 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(carboximetoxi)metil]glicinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (216 mL) del compuesto (7.00 g, 10.8 mmol) obtenido en el Proceso 2, se agregó catalizador de paladio en carbono (7.00 g) y se agitó bajo atmósfera de hidrógeno a temperatura ambiente por 24 horas. Los insolubles se removieron por filtración a través de Celite, y el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo obtenido se disolvió en agua, los insolubles se removieron por filtración a través de Celite, y el solvente se removió bajo presión reducida. Este procedimiento se repitió dos veces para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (3.77 g, 82%).
RMN 2H (DMSO-De) d: 2.84 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.08 (1H, dd, J=13.7, 4.7 Hz), 3.50-3.72 (4H, m), 3.77-3.86 (2H, m), 3.87 (2H, s), 4.52-4.43 (1H, m), 4.61 (2H, d, J=6.6 Hz), 7.12-7.30 (5H, m), 8.43 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.70 (1H, t, J=6.3 Hz), 8.79 (1H, t, J=5.5 Hz).
Proceso 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximetoxi)metil]glicinamida A una solución de N,N-dimetil formamida (85.0 mL) del compuesto (3.59 g, 8.48 mmol) obtenido en el Proceso 3, Se agregaron ácido N-succinimidil 6-maleimida hexanoico (2.88 g, 9.33 mmol) y trietilamina (0.858 g, 8.48 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. La solución de reacción se cargó con ácido clorhídrico 0.1 N y se extrajo con cloroformo y un solvente mezclado de cloroformo y metanol [cloroformo¡metanol = 4:1 (v/v)]. La capa orgánica obtenida se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformo:metanol:agua = 7:3: 1 (v/v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (3.70 g, 71%).
RMN *H (DMSO-De) d: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42- 1.53 (4H , m), 2.11 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.80 (1H, dd, J=1 3.7, 9.8 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.37 (2H , t, J=7.2 Hz), 3.56-3.78 (6H, m), 3.97 (2H, s), 4.46-4.53 (1H, m), 4.61 (2H, d, J=6.3 Hz), 7.00 (2H, s), 7.15-7.29 (5H, m), 8.03-8.20 (3H, m), 8.32 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.7 Hz).
Proceso 5: N-[6- (2,5-dioxo -2,5-dihi dro- 1H- pirrol-1-il) hexanoil] glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(2-{ [(1S,9S) -9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil- 10,13-dioxo -2, 3,9,10, 13,15-hexahidro-1H, 12H- benzo [de]pirano [3',4 ':6,7]indolizino [1,2-b]quinolin- 1-il]amino} -2- oxoetoxi )metil] glicinami da A una solución de N,N-dimetil formamida (40.0 mL) de mesilato del compuesto (4) (1.14 g, 2.00 mmol) , se agregaron trietilamina (0.202 g, 2.00 mol) , el compuesto (1.48 g, 2.40 mmol) obtenido en el Proceso 4, y cloruro de 4-(4 ,6-dimetoxi -1,3 ,5- triazin -2-i1) -4-metilmor folinio (0.993 g, 3.00 mmol) que contiene 16.4% agua a 0°C y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo :metanol = 8:2 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (1.69 g, 82%). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos como aquellos del compuesto del Proceso 8 del Ejemplo 58.
Ejemplo 75 N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-lH,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-l-il]-2- hidroxiacet amida Fórmula 144 MsOH Proceso 1: 2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4- metil-10 ,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- il]amino}-2-oxoetilacetato Bajo enfriamiento en hielo, a una suspensión de N,N-dimetil formamida (20.0 mL) de mesilato del compuesto (4) (0.500 g, 0.941 mmol), se agregaron N,N-diisopropiletilamina (0.492 mL, 2.82 mmol) y cloruro de acetoxiacetilo (0.121 mi, 1.13 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformormetanol:agua = 7:3: 1 (v/v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.505 g, cuantitativo).
RMN *H (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.08 (3H, s), 2.08-2.22 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.14-3.21 (2H, m), 4.51 (2H, dd, J=19.4, 14.7 Hz), 5.22 (2H, dd, J=40.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, s), 5.56-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+ Proceso 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4- metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H- benzo [de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2- hidroxiacetamida A una suspensión de metanol (50.0 mL) del compuesto (0.504 g, 0.941 mmol) obtenido en el Proceso 1, se agregaron tetrahidrofurano (20.0 mi) y una solución acuosa de 1 N hidróxido de sodio (4.00 mi, 4.00 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 1 hora. La reacción se terminó por la adición de ácido clorhídrico 1 N (5.00 mi, 5.00 mmol), y el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - capa orgánica dividida de cloroformo:metanol:agua = 7:3: 1 (v/v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.412 g, 89%). Este compuesto se confirmó en el tumor de un ratón portador de cáncer que recibe el conjugado de anticuerpo- fármaco (55) o (56).
RM ¾ (400 MHz, DMS0-d6) d: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.78-1.95 (2H, m), 2.09-2.28 (2H, m), 2.39 (3H, s), 3.07-3.27 (2H, m), 3.96 (2H, d, J=6.0 Hz), 5.11-5.26 (2H, m), 5.42 (2H, s), 5.46-5.54 (1H, m), 5.55-5.63 (1H, m), 6.52 (1H, s), 7.30 (1H, s), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+ Ejemplo 76 (Otro metodo para sintetizar compuesto del Ejemplo 75) -9-hidroxi-4- metil-10 , 13-dioxo-2 , 3 , 9 , 10 , 13 , 15 -hexahidro-IH, 12H- benzo [de] pirano [3 ' , 4 : 6 , 7] indolizino [1 , 2-b] quinolin-l-il] -2- hidroxiacetamida Se disolvió ácido glicólico (0.0201 g, 0.27 mmol) en N,N-dimetil formamida (1.0 mL), cargada con N- hidroxisuccinimida (0.0302 g, 0.27 mmol) y clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0.0508 g, 0.27 mmol), y se agitó por 1 hora. La solución de reacción se agregó a una suspensión de N,N-dimetil formamida (1.0 mL) cargada con mesilato del compuesto (4) (0.1 g, 0.176 mmol) y trietilamina (0.025 mL, 0.18 mmol) y se agitó a temperatura ambiente por 24 horas. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice [cloroformo - cloroformo:metanol = 10:1 (v/v)] para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (0.080 g, 92%). Los datos instrumentales del compuesto fueron los mismos como aquellos del compuesto obtenido en el Proceso 2 del Ejemplo 75.
Ejemplo de Prueba 1 - Producción del vector de expresión de la variante 1 de B7-H3 humano de longitud completan El cADN que codifica la variante 1 de B7-H3 humana se amplificó por reacción de PCR usando cADN sintetizado de ARN total de células LNCaP (Colección de Cultivos Tipo Americano: ATCC) como una plantilla y la siguiente serie de cebadores: cebador 1: 5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3 ' (SEQ ID NO: 22) y cebador 2: 5'-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgct gtcag-3 1 (SEQ ID NO: 23).
Después, el producto de PCR obtenido se purificó usando MagExtractor PCR & Gel de limpieza (Toyobo Co., Ltd.). El producto purificado además se digirió con enzimas de restricción (Nhel/Notl) y después de esto se purificó usando MagExtractor PCR & Gel de limpieza (Toyobo Co., Ltd.). El pcADN3 .1 (+) el ADN plásmido (Life Technologies) se digirió con las mismas enzimas de restricción como anteriormente (Nhel/Notl) y después de esto se purificó usando MagExtractor PCR & Gel de limpieza (Toyobo Co., Ltd.).
Estas soluciones de ADN purificado se mezclaron, además se cargaron con luz de Ligación (Toyobo Co., Ltd.), e incubaron por ligación a 16°C por 8 horas.
Células competentes DH5OÍ de Escherichia coli (Life Technologies) se transformaron por la adición del producto de reacción obtenido.
Las colonias así obtenidas se sometieron a PCR dirigido a la colonia usando cebadores de PCR y cebador inverso de BGH para seleccionar clones candidatas.
Los clones candidatos obtenidos se cultivaron en un medio líquido (LB/Amp), y el ADN plásmido se extrajo con MagExtractor-Plásmido- (Toyobo Co., Ltd.).
Cada uno de los clones obtenidos se comparó con la secuencia CDS proporcionada por el análisis de secuencia entre cebador 3 (cebador promotor de CMV ): 5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) y cebador 4 (cebador inverso de BGH): 51-tagaaggcacagtcgagg-31 (SEQ ID NO: 25) con el plásmido de ADN obtenido como una plantilla.
Después de confirmar la secuencia, el clon obtenido se cultivó en 200 mL de medio LB/Amp, y el plásmido de ADN se extrajo usando un kit VioGene Plásmido Midi V-100.
El vector se designó como pcADN3.1-B7-H3. La secuencia de un sitio ORF de gen de la variante 1 de B7-H3 clonado en el vector se muestra en las posiciones de nucleótidos 1 hasta 1602 de la SEQ ID NO: 26 (Figura 16) en el Listado de Secuencias. También, la secuencia de aminoácido de la variante 1 de B7-H3 se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el Listado de Secuencias.
Ejemplo de Prueba 2 - Preparación de células CCRF-CEM que expresan establemente el gen de la variante 1 de B7-H3 El pcADN3.1-B7-H3 producido en el Ejemplo de Prueba 1 se transfectó en células CCRF-CEM (ATCC) por electroporación usando Nucleofector II (manufacturado por Lonza Group Ltd.). Después, las células se cultivaron además por dos noches en medio RPMI1640 (Life Technologies) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) (posteriormente, referido como 10% de FBS-RPMI1640) bajo condiciones de 37°C y 5% de CO2.
Después del día 2 del cultivo, el cultivo se inició en 10% de FBS-RPMI1640 que contiene 750 mg/mL de G418 (Life Technologies) con el fin de seleccionar células de CCRF-CEM en las cuales el pcADN3.1-B7-H3 fue establemente integrado.
Después de 1 mes de cultivo, la clonación se llevó a cabo limitando el método de dilución con el fin de proporcionar un clon de célula única. Específicamente, las células que tienen resistencia a G418 se diluyeron en 10 células/mL, inoculadas en una placa de 96 pozos a una concentración de 100 mL/pozo, y las células dejadas proliferar se recuperaron de pozos individuales.
Se usó cito etría de flujo para confirmar la expresión de B7-H3 expresión en cada clon recuperado. Específicamente, cada clon recuperado se lavó dos veces con PBS que contiene 5% de FBS, después de esto se suspendió por la adición de PBS que contiene 5% de FBS y 10 mg/mL de M30, y se dejó reposar a 4°C por 30 minutos. El clon se lavó dos veces con PBS que contiene 5% de FBS, después de esto se suspendió por la adición de la fracción de IgG de cabra conjugada a Fluoresceína a IgG de ratón (Whole Molecule) (#55493, manufacturado por ICN Pharmaceuticals, Inc.) se diluyó 1000-veces con PBS que contiene 5% de FBS, y se dejó reposar a 4°C por 30 minutos. El clon se lavó dos veces con PBS que contiene 5% de FBS, después de esto se resuspendió en PBS que contiene 5% de FBS, y se separó usando un citómetro de flujo (FC500: Beckman Coulter, Inc.).
Las células CCRF-CEM que expresan el gen de la variante 1 de B7-H3 así obtenidas por estos procedimientos, se designaron como células CEM_V1_3.1_2. Las células CCRF-CEM de la línea precursora se usaron como una línea celular que carece de la expresión B7-H3.
Ejemplo de Prueba 3 - Prueba de citotoxicidad (1) del conjugado de anticuerpo-fármaco Las células CEM_V1_3.1_2 producidas en el Ejemplo de Prueba 2 o células CCRF-CEM (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células CEM__V1_3.1_2 o células CCRF-CEM se prepararon para tener una concentración de 8 x 104 células/mL usando un medio, se agregaron a una concentración de 25 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para el cultivo celular cargada con 65 pL/pozo de un medio, y se cultivaron durante la noche. Al siguiente día, el anticuerpo M30-H1-L4, anticuerpo M30-H1-L4P, y conjugado de anticuerpo-fármaco cada uno se diluyó en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando un medio agregado a una concentración de 10 pL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de CO2 a 37°C por 3 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución de cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor ICso se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través del 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 10) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52), y (54) presenta una actividad citotóxica de IC50 < 0.1 (nM) contra las células CEM_V1_3.1_2. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49), y (53) presentan una actividad citotóxica de 0.1 < IC50 < 1 (nM) contra las células. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (33), (34), (47), (48), (50), y (51) presentan una actividad citotóxica de 1 < IC50 < 100 (nM) contra las células. Por otro lado, ninguno de estos conjugados de anticuerpo-fármaco presenta una actividad citotóxica contra las células CCRF-CEM (> 100 (nM)). Ninguno de los anticuerpos M30-H1-L4 ni el anticuerpo M30-H1-L4P presentaron una actividad citotóxica contra ambas de las células (> 100 (nM)).
Ejemplo de Prueba 4 - Ensayo de citotocixidad (2) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células SR de células positivas al antígeno SR (ATCC) o células Daudi de células negativas al antígeno (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células SR o células Daudi se prepararon para tener una concentración de 2.8 x 104 células/mL usando un medio y se agregaron a una concentración de 90 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular. Dos horas después, los conjugados de anticuerpo anti-CD30 y de anticuerpo-fármaco (6) y (7) cada uno se diluyó en 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 320 pM, 64 pM, 12.8 pM, y 2.6 pM usando un medio agregado a una concentración de 10 pL/pozo a la microplaca.
Se agregó un medio a una concentración de 10 mL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de CO2 a 37°C por 3 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación : Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 12) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (6) y (7) presentan una pozo citotóxica de IC5o < 0.01 (nM) contra las células SR. Por otro lado, los conjugados de anticuerpo-fármaco (6) y (7) no presentan actividad citotóxica contra las células Daudi (> 4.0 (nM)). El anticuerpo anti-CD30 no presenta actividad citotóxica contra ambas células (> 4.0 (nM)).
Ejemplo de Prueba 5 - Prueba de citotoxicidad (3) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células SR de las células positivas al antígeno (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células SR se prepararon para tener una concentración de 2.8 x 104 células/mL usando un medio y se agregaron a una concentración de 90 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular. Dos horas después, los conjugados de anticuerpo anti-CD30 y de anticuerpo-fármaco (22), (23), (38), (64), y (65) cada uno se diluyó en 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, y 1 pM usando un medio agregado a una concentración de 10 mL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de C0å a 37°C por 6 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC5o se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 12) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (23), (38), (64), y (65) presentan una pozo citotóxica de IC5o < 0.01 (nM) contra las células SR. El conjugado de anticuerpo-fármaco (22) presenta una pozo citotóxica de IC50 < 0.1 (nM) contra las células SR. El anticuerpo anti-CD30 no presenta actividad citotóxica contra las células SR (> 4.0 (nM)).
Ejemplo de Prueba 6 - Prueba de citotoxicidad (4) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células HL-60 de las células positivas al antígeno (ATCC) o células Raji de las células negativas al antígeno (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células HL-60 o células Raji se prepararon para tener una concentración de 8 x 104 células/mL usando un medio y se agregaron a una concentración de 25pL/pozo a una microplaca de 96 pozos para el cultivo celular cargada con 65 pL/pozo de un medio. Los conjugados de anticuerpo anti-CD33 y de anticuerpo-fármaco (8) y (9) cada uno se diluyó en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando un medio agregado a una concentración de 10 mL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron por 3 días bajo 5% de CO2 a 37°C. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: ICso (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 5) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (8) y (9) presentan una pozo citotóxica de IC50 < 0.1 (nM) contra las células HL-60. Por otro lado, los conjugados de anticuerpo- fármaco (8) y (9) no presenta actividad citotóxica contra las células Raji (> 100 (nM)). El anticuerpo anti-CD33 no presenta actividad citotóxica contra ambas células (> 100 (nM)).
Ejemplo de Prueba 7 - Prueba de citotoxicidad (5) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células NOMO-1 de las células positivas al antígeno (HSRRB) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células N0M0-1 se prepararon para tener una concentración de 2.8 x 104 células/mL usando un medio y se agregaron a una concentración de 90 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular. Dos horas después, los conjugados de anticuerpo anti-CD33 y de anticuerpo-fármaco (24), (25), y (67) cada uno se diluyó en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando un medio agregado a una concentración de 10 mL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de CO2 a 37°C por 6 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar por 30 minutos a temperatura ambiente. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 5) El conjugado de anticuerpo-fármaco (25) presenta una pozo citotóxica de IC50 < 0.1 (nM) contra las células NOMO-1. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (24) y (67) presentan una pozo citotóxica de 1 < IC50 < 100 (nM) contra las células. El anticuerpo anti-CD33 no presenta actividad citotóxica contra las células NOMO-1 (> 100 (nM)).
Ejemplo de Prueba 8 - Prueba de citotoxicidad (6) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células U251 de las células positivas al antígeno (ATCC) o células MCF-7 células negativas al antígeno (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células U251 o células MCF-7 se prepararon para tener una concentración de 2.8 x 104 células/mL usando un medio, agregado a una concentración de 90 yL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular, y se cultivaron durante la noche. Al siguiente día, los conjugados de anticuerpo anti-CD70 y de anticuerpo-fármaco (10) y (11) cada uno se diluyó en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando un medio agregado a una concentración de 10 yL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 yL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de CO2 a 37°C por 6 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 12) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (10) y (11) presentan una pozo citotóxica de ICso < 1 (nM) contra las células U251. Por otro lado, los conjugados de anticuerpo- fármaco (10) y (11) no presentan actividad citotóxica contra las células MCF-7 (> 90 (nM)). El anticuerpo anti-CD70 no presenta actividad citotóxica contra ambas células (> 100 (nM)).
Ejemplo de Prueba 9 - Prueba de citotoxicidad (7) del conjugado de anticuerpo-fármaco Células U251 de las células positivas al antígeno (ATCC) se cultivaron en RPMI1640 (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células U251 se prepararon para tener una concentración de 2.8 x 104 células/mL usando un medio y se agregaron a una concentración de 90 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular. Dos horas después, los conjugados de anticuerpo anti-CD70 y de anticuerpo-fármaco (26), (27), (40), (68), y (69) cada uno se diluyó en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando un medio agregado a una concentración de 10 pL/pozo a la microplaca. Se agregó un medio a una concentración de 10 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. Las células se cultivaron bajo 5% de CO2 a 37°C por 6 días. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa (PerkinElmer). El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de las células a cada concentración se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 12) Los conjugados de anticuerpo-fármaco (26), (27), (40), y (69) presentan una pozo citotóxica de 1 < IC50 < 10 (nM) contra las células U251. El conjugado de anticuerpo-fármaco (68) presenta una pozo citotóxica de 10 < IC50 < 100 (nM) contra las células. El anticuerpo anti-CD70 no presenta actividad citotóxica contra las células U251 (> 100 (nM)).
Ejemplo de Prueba 10 - Prueba de citotoxicidad (8) de fármaco liberado Células A375 (ATCC) se cultivaron en DMEM (GIBCO) que contiene 10% de suero bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como un medio). Las células A375 se prepararon para tener una concentración de 4 x 104 células/mL usando un medio, agregado a una concentración de 25 mL/pozo a una microplaca de 96 pozos para cultivo celular (CORNING) cargada con 65 pL/pozo de un medio, y se cultivaron durante la noche. Al siguiente día, cada sustancia de prueba diluida en 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, y 0.064 nM usando DMSO se agregó a una concentración de 0.5 pL/pozo a la microplaca. Se agregó DMSO a una concentración de 0.5 pL/pozo a las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba. El volumen del medio en cada pozo se ajustó a 100 mL por la adición de 10 pL/pozo de un medio, y las células se cultivaron por 6 días bajo 5% de CO2 a 37°C. Después del cultivo, la microplaca se tomó de la incubadora y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30 minutos. La solución se cultivo se cargó con una cantidad igual de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega) y se agitó. Después que la microplaca se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 minutos, la cantidad de emisión de luz se midió usando un lector de placa. El valor IC50 se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: IC50 (nM) = antilog ( (50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d c) + LOGiob) a: Concentración a de la sustancia de prueba b: Concentración b de la sustancia de prueba c: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración a d: Relación de células vivas suplementadas con la sustancia de prueba que tiene la concentración b Las concentraciones a y b establecen la relación a > b a través de 50% de relación de células vivas.
La velocidad de supervivencia de células se calculó de conformidad con la siguiente ecuación: Velocidad de supervivencia de células (%) = a / b x 100 a: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos suplementadas con la sustancia de prueba (n = 2) b: Cantidad promedio de emisión de luz a partir de las pozos no suplementadas con la sustancia de prueba (n = 10) El compuesto del Ejemplo (75) y exatecano presentan una pozo citotóxica de 0.1 < IC50 < 1 (nM) contra las células A375. El compuesto del Ejemplo (42) presenta una pozo citotóxica contra 1 < IC50 < 10 (nM) contra las células. El compuesto del Ejemplo (1) presenta una pozo citotóxica contra 10 < IC50 < 100 (nM) contra las células.
Ejemplo de Prueba 11 Prueba antitumoral (1) Ratón: Ratones sin pelo de BALB/c hembras de 5- a 6 semanas de edad (Charles River Laboratories Japón, Inc.) se aclimatizaron por 4 hasta 7 días bajo condiciones de SPF antes del uso en el experimento. Los ratones se alimentaron con alimento sólido esterilizado (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) y se les dio agua de grifo esterilizada (preparada por la adición de 5 a 15 ppm de solución de hipoclorito de sodio).
Ensayo y expresión del cálculo: En todos los estudios, los ejes mayor y ejes menor del tumor se midieron dos veces por semana usando un calibrador digital electrónico (CD-15C, Mitutoyo Corp.), y el volumen del tumor (mm3) se calculó. La expresión del cálculo es como se muestra abajo.
Volumen del tumor (mm3) = 1/2 x Eje mayor (mm) x [Eje menor (mm)]2 Todos los conjugados de anticuerpo-fármaco se diluyeron con salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) y se usaron a un volumen de 10 mL/kg para administración intravenosa a la cola de cada ratón. Líneas de células de melanoma humano A375 se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano). 8 x 106 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 11. Los conjugados de anticuerpo M30-H1-L4P y de anticuerpo-fármaco (2) fueron cada uno administrados intravenosamente a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón en los Días 11, 18, y 25.
Los resultados se muestran en la Figura 17. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos describe el efecto del anticuerpo M30-H1-L4P, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2).
Como se puede ver a partir de estos resultados, la administración del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) disminuye notablemente el volumen del tumor, y no se observó crecimiento adicional del tumor después de la administración final. Por el contrario, la administración del anticuerpo M30-H1-L4P resultó en el progreso del crecimiento del tumor.
Además, los ratones que reciben el conjugado de anticuerpo-fármaco (2) se alimentaron a partir de signos notables tales como pérdida de peso, sugiriendo que el conjugado de anticuerpo-fármaco (2) es de baja toxicidad y altamente seguro.
Ejemplo de Prueba 12 - Ensayo antitumoral (2) Líneas de células de melanoma humano A375 se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano).6 x 106 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 18. El conjugado de anticuerpo-fármaco (2) fue administrado intravenosamente a cada una de las dosis (0.1, 0.3, y 1,3 mg/kg) a la cola de cada ratón en los Días 18, 25, y 32 en un esquema de qw x 3.
Los resultados se muestran en la Figura 18. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con cuadrados rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 0.1 mg/kg, la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 0.3 mg/kg, la línea con triángulos rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 1 mg/kg, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) administrado a 3 mg/kg. El conjugado de anticuerpo-fármaco (2) fue efectivo para encoger el tumor en una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo de Prueba 13 - Ensayo antitumoral (3) Células Calu-6 Células Calu-6 de la línea de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano).5 x 106 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 11. Los conjugados de anticuerpo M30-H1-L4P y de anticuerpo-fármaco (2) fueron cada uno administrados intravenosamente a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón en los Días 11, 18, y 25 en un esquema de qw x 3.
Los resultados se muestran en la Figura 19. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con triángulos abiertos describe el efecto del anticuerpo M30-H1-L4P, y la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (2). La administración del conjugado de anticuerpo-fármaco (2) disminuye notablemente el volumen del tumor, y no se observa crecimiento adicional del tumor después de la administración final. Por el contrario, la administración del anticuerpo M30-H1-L4P resulta en el progreso del tumor.
Además, los ratones que reciben el conjugado de anticuerpo-fármaco (2) se alimentaron a partir de signos notables tales como pérdida de peso, sugiriendo que el conjugado de anticuerpo-fármaco (2) es de baja toxicidad y altamente seguro.
Ejemplo de Prueba 14 - Ensayo antitumoral (4) Líneas de células de melanoma humano A375 se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano).8 x 106 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 21. Los conjugados de anticuerpo- fármaco (1), (13), (41), y (55) fueron cada uno administrados intravenosamente a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón al Día 21.
Los resultados se muestran en la Figura 20. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (1), la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (13), la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (41), y la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (55). La administración del conjugado de anticuerpo-fármaco (1), (13), (41), o (55) disminuye notablemente el volumen del tumor, y todos estos conjugados del anticuerpo-fármaco ejercen un efecto inhibidor del crecimiento del tumor.
Además, los ratones que reciben el conjugado de anticuerpo-fármaco (1), (13), (41), o (55) se alimentaron a partir de signos notables tales como pérdida de peso, sugiriendo que los conjugados de anticuerpo-fármaco (1), (13), (41), y (55) son de baja toxicidad y altamente seguros.
Ejemplo de Prueba 15 - Ensayo antitumoral (5) Células Calu-6 de la línea de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano).5 x 106 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 12. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (13), (41), y (55) fueron cada uno administrados intravenosamente a una dosis de 10 mg/kg a la cola de cada ratón al Día 12. Como un control comparativo, el DE-310 fue intravenosamente administrado a una dosis de 0.1 mg/kg a la cola de cada ratón al Día 12. Aquí, la dosis mencionada anteriormente del conjugado de anticuerpo-fármaco se basa en la cantidad del anticuerpo en el conjugado y la dosis mencionada anteriormente de DE-310 se basa en la cantidad del fármaco contenido en este. En este sentido, las cantidades de fármacos respectivamente contenidos en el conjugado de anticuerpo-fármaco y DE-310 fueron aproximadamente 1:100. Esto significa que las dosis del conjugado de anticuerpo-fármaco y DE-310 fueron iguales en términos de las cantidades de los fármacos contenidos en estos.
Los resultados se muestran en la Figura 21. En el dibujo, la línea con rombos abiertos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con círculos abiertos describe el efecto de DE-310, la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (13), la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (41), y la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco (55). La administración del conjugado de anticuerpo-fármaco (13), (41), o (55) disminuye notablemente el volumen del tumor, mientras la administración de DE-310 no presenta reducción en el volumen del tumor.
Además, los ratones que reciben el conjugado de anticuerpo-fármaco (13), (41), o (55) se alimentaron a partir de signos notables tales como pérdida de peso, sugiriendo que estos conjugados de anticuerpo-fármaco son de baja toxicidad y altamente seguros.
Ejemplo de Prueba 16 Ensayo antitumoral (6) Líneas de células de melanoma humano A375 se adquirieron de ATCC (Colección de Cultivos Tipo Americano).1 x 107 células suspendidas en salina fisiológica se trasplantaron subcutáneamente al abdomen derecho de cada ratón sin pelo hembra (Día 0), y los ratones se agruparon aleatoriamente al Día 11. Los conjugados de anticuerpo- fármaco (17), (18), (19), (59), (60), y (61) fueron cada uno administrados intravenosamente a una dosis de 3 mg/kg a la cola de cada ratón en los Días 11 y 18 en un esquema de qw x 2.
Los resultados se muestran en la Figura 22. En el dibujo, la línea con rombos rellenos describe los resultados acerca del tumor sin tratar, la línea con cuadrados rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (17), la línea con triángulos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (18), la línea con círculos abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (19), la línea con triángulos rellenos describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (59), la línea con cuadrados abiertos describe el efecto del conjugado de anticuerpo- fármaco administrado (60), y la línea con Marcas en forma de X describe el efecto del conjugado de anticuerpo-fármaco administrado (61).
La administración del conjugado de anticuerpo- fármaco (17), (18), (19), (59), (60), o (61) disminuye notablemente el volumen del tumor, y todos estos conjugados del anticuerpo-fármaco ejercen un efecto inhibidor del crecimiento del tumor.
Además, los ratones que reciben el conjugado de anticuerpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), o (61) se alimentaron a partir de signos notables tales como pérdida de peso, sugiriendo que estos conjugados de anticuerpo-fármaco son de baja toxicidad y altamente seguros.
Breve Descripción del Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1 - Secuencia de aminoácido de la variante 1 de B7-H3 SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácido de la variante 2 de B7-H3 SEQ ID NO: 3 - Secuencia de aminoácido de la CDRH1 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 4 - Secuencia de aminoácido de la CDRH2 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 5 - Secuencia de aminoácido de la CDRH3 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 6 - Secuencia de aminoácido de la CDRL1 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 7 - Secuencia de aminoácido de la CDRL2 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 8 - Secuencia de aminoácido de la CDRL3 del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 9 - Secuencia de aminoácido de la cadena pesada tipo M30-H1 SEQ ID NO: 10 - Secuencia de aminoácido de la cadena pesada tipo M30-H2 SEQ ID NO: 11 - Secuencia de aminoácido de la cadena pesada tipo M30-H3 SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácido de la cadena pesada tipo M30-H4 SEQ ID NO: 13 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L1 SEQ ID NO: 14 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L2 SEQ ID NO: 15 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L3 SEQ ID NO: 16 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L4 SEQ ID NO: 17 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L5 SEQ ID NO: 18 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L6 SEQ ID NO: 19 Secuencia de aminoácido de la cadena ligera tipo M30-L7 SEQ ID NO: 20 - Secuencia de aminoácido de una cadena pesada del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 21 - Secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo M30 SEQ ID NO: 22 - Cebador de PCR 1 SEQ ID NO: 23 - Cebador de PCR 2 SEQ ID NO: 24 Cebador del promotor de CMV: cebador 3 SEQ ID NO: 25 - Cebador inverso de BGH: cebador 4 SEQ ID NO: 26 - Secuencia de nucleótido de la variante 1 de B7-H3 SEQ ID NO: 27 - Secuencia de aminoácido de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD30 SEQ ID NO: 28 - Secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD30 SEQ ID NO: 29 - Secuencia de aminoácido de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD33 SEQ ID NO: 30 - Secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD33 SEQ ID NO: 31 - Secuencia de aminoácido de una cadena pesada del anticuerpo anti-CD70 SEQ ID NO: 32 - Secuencia de aminoácido de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD70.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco, caracterizado porque un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula: Fórmula 1 es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- en donde el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc con el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 como la posición de conexión, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-, -CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-, -C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0) en donde n2 representa un número entero de 2 hasta 8, n3 representa un número entero de 1 hasta 8, n4 representa un número entero de 1 hasta 8, L·2 representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, -S-(CH2)n6-C(=0)-, o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, n6 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9-OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 hasta 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 2 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 3 la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y cuando L2 es -S- (CH2) n6-C (=0) - , L1 es -C(=0)-cic.Hex(l,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. 2. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo de péptido de Lp es un residuo de aminoácido que comprende un aminoácido seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico. 3. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Lp representa un residuo tetrapeptídico, La representa -O- o un enlace simple, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, nb representa un número entero de 1 hasta 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, y Lc representa -C(=0)-. 4. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Lp representa un residuo tetrapéptido de GGFG, La representa -O- o un enlace simple, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno representa un átomo de hidrógeno, y Lc representa -C(=0)-. 5. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- o -CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-. 6. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L1 es -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-. 7. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L1 es -C(=0)-cic.Hex (1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-. 8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque n2 es un número entero de 2 a 5, y L2 es un enlace simple. 9. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque n2 es un número entero de 2 a 5, L2 es - - - C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3-il-N) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2O-CH2 CH20 - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH20 - CH2 CH20 - CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20 CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3-il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) -CH2-C (=0) -NH-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) -C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C (=0) - (NH-DX) -C (=0) -cic.Hex(l,4) -CH2- (N-li-3-diminiccuS) -S- CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) en donde -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula Fórmula 4 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en la posición de conexión, y -GGFG- representa un residuo de péptido de -Gly-Gly-Phe-Gly-. 14. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la estructura del enlazador es una estructura seleccionada del siguiente grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) en donde -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 5 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 es la posición de conexión. 15. Un conjugado de anticuerpo-fármaco, caracterizado porque un compuesto antitumoral representado por la siguiente fórmula: Fórmula 6 es conjugado a un anticuerpo mediante un enlazador que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- en donde el anticuerpo está conectado a la terminal de L1, el compuesto antitumoral está conectado a la terminal de Lc, en donde n1 representa un número entero de 0 hasta 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)- y stá conectado al anticuerpo mediante un enlace tioéter el ual está formado en una porción de enlace de disulfuro resente en una parte de articulación del anticuerpo, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un nlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta Lp representa un residuo tetrapéptido de GGFG, La representa -O- o un enlace simple, Lb representa -CR2(-R3)- o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno representa un átomo de idrógeno, Lc representa -C(=0)-, y -(Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura epresentada por la siguiente fórmula: Fórmula 7 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1. 16. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque n2 es 2, L2 es -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, n5 es 2, n1 es 3, y tanto La y Lb son enlaces únicos, n2 es 5, L2 es un enlace simple, n1 es 1, La es -O-, y Lb es -CR2(-R3)-, o n2 es 5, L2 es un enlace simple, n1 es 2, La es -O-, y Lb es -CR2(-R3)-. 17. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque n2 es un número entero de 2 hasta 5, y L2 es un enlace simple. 18. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque n2 es un número entero de 2 hasta 5, L2 es -NH-(CH2CH2O)n5-CH2- CH2-C(=0)-, y n5 es 2 o 4. 19. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la siguiente fórmula: -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- es -NH-(CH2)3-C(=0)-, -NH-CH2-0-CH2-C(=0)-, o -NH-(CH2)2-0-CH2-C(=0)-. 20. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la estructura del enlazador es una estructura seleccionada del siguiente grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2- C (=0)-(NH-DX) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 -il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 -il-N) -CH CH CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) - (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Succinimid-3 - il -N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20 H20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Succinimid-3 - il-N) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH2O-CH2CH20-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=0)-(NH-DX) en donde -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 8 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 21. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la estructura del enlazador es una estructura seleccionada del siguiente grupo: -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0)-(NH-DX) - (Succinimid- 3 - il -N) -CH2CH2CH2CH2CH2 -C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) - (Succinimid- 3 - il -N) -CH2CH2-C ( =0) -NH- CH2CH20- CH2CH20 - CH2CH2-C ( =0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C ( =0) - (NH-DX) en donde -(NH-DX) representa un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 9 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 22. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 1 hasta 10. 23. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 2 hasta 8. 24. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque un número promedio de unidades de una estructura de fármaco-enlazador seleccionada conjugada por anticuerpo está en un intervalo desde 3 hasta 8. 25. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo que tiene una o más de una propiedad de reconocimiento de una célula objetivo, una propiedad de unión a una célula objetivo, una propiedad de internalización en una célula objetivo, y una propiedad de daño una célula objetivo. 26. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque una célula la cual está dirigida por el conjugado de anticuerpo-fármaco es una célula de tumor. 27. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-A33, un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CanAg, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anti-CEA anticuerpo, un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-G250, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-integrina, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-tenascin-C, un anticuerpo anti-SLC44A4, o un anticuerpo anti-mesotelina. 28. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, o un anticuerpo anti-CD70. 29. El conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-B7-H3. 30. Un fármaco caracterizado porque contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, o una sal del mismo. 31. Un fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno, caracterizado porque contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 o 15, o una sal del mismo. 32. El fármaco antitumoral y/o fármaco anticancerígeno de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque se aplica a cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer urotelial, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, glioblastoma multiforme, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, o cáncer esofágico . 33. Una composición farmacéutica caracterizada porque contiene el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 a 15, o una sal del mismo como un componente activo, y un componente de formulación farmacéuticamente aceptable. 34. Un método para el tratamiento de tumor y/o cáncer, caracterizado porque comprende administrar el conjugado de anticuerpo-fármaco de conformidad con las reivindicaciones 1 a 15, o una sal del mismo. 35. Un compuesto intermediario f rmaco-enlazador, caracterizado porque es representado por la siguiente fórmula: en donde Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=0)-NH-, o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-O-C(=0)-, X representa un átomo de bromo o un átomo de yodo, nQ representa un número entero de 2 hasta 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)- o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 a 7 aminoácidos seleccionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutámico, y ácido aspártico, n1 representa un número entero de 0 hasta 6, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 hasta 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, o -(CH2)n9- OH, n8 representa un número entero de 1 hasta 4, n9 representa un número entero de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o - (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 a 4, nc representa un número entero de 1 hasta 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 10 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, (Pirrolidin-2,5-diona-N-ilo) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 11 O o en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 12 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 36. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque Lc es -C(=0)-. 37. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque Lp es un residuo de péptido que consiste de 4 aminoácidos. 38. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque Lp es -GGFG-. 39. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque la siguiente fórmula: -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2- , -NH-CH2CH2CH2CH2CH2 - , -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2-. 40. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque la siguiente fórmula: -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-(CH2)2-O-CH2-. 41. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque nQ es un número entero de 2 hasta 6. 42. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 a 5, y L2a es un enlace simple. 43. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 a 5, y L2a es un enlace simple. 44. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, caracterizado porque Q es (maleimid-N-il)-, nQ es un número entero de 2 a 5, L2a es -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=0)-, n5 es un número entero de 2 a 4, y -NH-(CH2)n1—La-Lb— es -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2- , -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2-. 45. El compuesto intermediario fármaco-enlazador de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque n5 es un número entero de 2 o 4, -NH-(CH2)n1-La-Lb- es -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, o -NH-CH2CH2-O-CH2- . 46. Un compuesto, caracterizado porque es de los siguientes: (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=0)- (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 - C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH- 467 CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-M- il ) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0 - CH2 C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) - CH2CH2CH2CH2CH2 - C ( =0 ) - GGFG - NH - CH2 CH2 -0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) - NH - CH2 CH2O - CH2 CH20 -CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O) - HS-CH2CH2-C(=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C(=0) -GGFG- H2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) HS-CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- 0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - 2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - 2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N- il ) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2-- -NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2 -NH-CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) - 2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N- il ) -0-C(=0) -CH2CH2-C (=0) - 2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2, 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) 2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) - CH2 CH2 CH2 CH2 - -NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C (=0) - 2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -- 2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - 2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) - 2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 ; 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2-C (=0) - 2CH2-0-CH -C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2-C (=0) - 2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) -CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2-0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2CH2CH2CH2- -NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C (=0) - 2CH2CH2-C(=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-C(=0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -0-C(=0) -CH2CH2-C (=0) -NH- CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C ( =0) - (NH-DX) (Pirrolidin-2 , 5-diona-N-il) -O-C (=0) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2 -C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH- DX), o (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)-0-C(=0)-CH2CH2-C(=0)-NH- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C (=O) -GGFG-NH-CH2CH2CH2- C (=0)-(NH-DX) en donde (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 13 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, X representa un átomo de halógeno, (Pirrolidin-2,5-diona-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 14 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fó l 15 (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-2CH2-C(=0) - (NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-0-CH2-DX) (maleimid-N-il) - CH2CH2CH2CH2 - C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-CH2 DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2-O-(NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-CH2-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0 - CH2 DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2-0-(NH-DX) (maleimid-N-il) -CH2CH2CH2CH2CH2-C (=0) - GGFG - NH - CH2 CH2 - 0-CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) (maleimid-N- il) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) , o (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C (=0) -NH-CH2CH20-CH2CH20- CH2CH20-CH2CH20-CH2CH2-C (=0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) en donde (maleimid-N- il ) - es un grupo representado por la siguiente fórmula : Fórmula 16 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula : Fórmula 17 en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 48. Un compuesto, caracterizado porque es de los siguientes: (maleimid-N- il ) -CH2CH2-C ( =0) -NH-CH2CH2O-CH2CH20- CH2CH2-C ( =0) -GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=0) - (NH-DX) , (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=0)-(NH-DX) o (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=0)-GGFG-NH-CH2CH2-0- CH2-C(=0)-(NH-DX), en donde (maleimid-N-il)- es un grupo representado por la siguiente fórmula: Fórmula 18 en donde el átomo de nitrógeno está en una posición de conexión, y -(NH-DX) es un grupo representado por la siguiente fórmula: [Fórmula 19] en donde el átomo de nitrógeno del grupo amino en la posición 1 está en una posición de conexión. 49. Un enlazador, caracterizado porque es representado por la siguiente fórmula: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- para obtener un conjugado de anticuerpo-fármaco en el cual un fármaco es conjugado a un anticuerpo mediante el enlazador, en donde L1 está en una posición de conexión para el anticuerpo, Lc está en una posición de conexión por un compuesto antitumoral, en donde n1 representa un número entero de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=0)-, - CH2-C(=0)-NH-(CH2)n3-C(=0)-, -C(=0)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3- diminiccuS)-, o -C(=0)-(CH2)n4-C(=0)-, en donde n2 representa un número entero de 2 hasta 8, n3 representa un número entero de 1 a 8, n4 representa un número entero de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-0)n5-CH2-CH2-C(=0)-, -S- (CH2)n6-C(=0)-, o un enlace simple, en donde n5 representa un número entero de 1 hasta 6, n6 representa un número entero de 1 a 6, Lp representa un residuo de péptido que consiste de 2 hasta 7 aminoácidos, La representa -C(=0)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, o un enlace simple, en donde n7 representa un número entero de 1 a 6, R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-C00H, o -(CH2)n9-OH, n8 representa un número entero de 1 a 4, n9 representa un número entero de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, o un enlace simple, en donde R2 y R3 cada uno independientemente representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-C00H, o (CH2)nc-0H, R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene 1 hasta 6 átomos de carbono, na representa un número entero de 0 hasta 6, nb representa un número entero de 1 a 4, nc representa un número entero de 1 a 4, siempre que cuando na es 0, R2 y R3 no son los mismos entre sí, Lc representa -CH2- o -C(=0)-, - (Succinimid-3-il-N)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 20 la cual está conectada al anticuerpo en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, -(N-li-3-diminiccuS)- tiene una estructura representada por la siguiente fórmula: Fórmula 21 la cual está conectada a L2 en la posición 3 del mismo y está conectada a un grupo metileno en la estructura enlazadora que contiene esta estructura en el átomo de nitrógeno en la posición 1, cic.Hex(1,4) representa un grupo 1,4-ciclohexileno, y cuando L2 es -S-(CH2)n6-C(=0) L1 es -C(=0)- cic.Hex(l,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-.
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