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CN114845739B - 艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的应用 - Google Patents

艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的应用 Download PDF

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CN114845739B
CN114845739B CN202180007579.2A CN202180007579A CN114845739B CN 114845739 B CN114845739 B CN 114845739B CN 202180007579 A CN202180007579 A CN 202180007579A CN 114845739 B CN114845739 B CN 114845739B
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Abstract

本公开涉及艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的应用。具体而言，提供一种抗体‑药物偶联物，所述抗体‑药物偶联物包含艾日布林衍生物药物部分。本公开进一步涉及通过施用本文提供的抗体‑药物偶联物用于治疗癌症的方法。

Description

艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的 应用
技术领域
本公开涉及艾日布林衍生物的药物偶联物、其制备方法及其在医药上的应用。
背景技术
抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，ADC)把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的化学接头化合物与具有生物活性的药物相连，充分利用了抗体对正常细胞和肿瘤细胞表面抗原结合的特异性和药物的高效性，同时又避免了前者疗效偏低和后者毒副作用过大等缺陷。这也就意味着，与以往传统的化疗药物相比，抗体药物偶联物能精准地结合肿瘤细胞并降低将对正常细胞的影响(Mullard A，(2013)Nature Reviews Drug Discovery，12：329-332；DiJoseph JF，Armellino DC，(2004)Blood，103：1807-1814)。
2000年第一个抗体药物偶联物Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumabozogamicin)，惠氏制药有限公司)被美国FDA批准上市，用于治疗急性髓细胞白血病(Drugsof the Future(2000)25(7)：686；US4970198；US5079233；US5585089；US5606040；US5693762；US5739116；US5767285；US5773001)。
2011年8月，Adcetris(brentuximab vedotin，西雅图基因遗传公司)通过美国FDA快速审评通道，用于治疗霍奇金淋巴瘤以及复发性间变性大细胞淋巴瘤(Nat.Biotechnol(2003)21(7)：778-784；WO2004010957；WO2005001038；US7090843A；US7659241；WO2008025020)。是一种新型靶向ADC药物，能使药物直接作用于淋巴瘤细胞上的靶点CD30后发生内吞作用从而诱导肿瘤细胞的凋亡。
Mylotarg和Adcetris都是针对血液肿瘤进行靶向治疗，血液肿瘤和实体肿瘤相比组织结构相对简单。2013年2月，Kadcyla(ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)获得美国FDA批准，用于治疗HER2阳性同时对曲妥珠单抗(Tratuzumab，商品名：Herceptin)和紫杉醇有抗药性的晚期或转移性乳腺癌患者(WO2005037992；US8088387)。Kadcyla是美国FDA批准的第一个治疗实体肿瘤的ADC药物。
微管为与包括细胞内迁移和转运、细胞信号传导和维持细胞形状的多种细胞功能相关的有力的细丝状细胞骨架蛋白。微管也在有丝分裂细胞分裂中通过形成染色体分成两个子细胞所需的有丝分裂纺锤体而起到关键作用。所有细胞中微管的生物功能大部分由其聚合动力学调节，这通过α和β微管蛋白二聚物可逆、非共价地加在微管两端进行。这种动力学行为和所产生的对微管长度的控制为有丝分裂纺锤体的适当功能所不可缺少的。甚至微管动力学的微小改变也会牵涉轴检查点，抑制有丝分裂时细胞周期进展，且随后引起细胞死亡(Mukhtar等人(2014)Mol.Cancer Ther.13：275-84)。由于癌细胞的细胞分裂快速，所以与正常细胞相比，其一般对结合于微管蛋白且破坏其正常功能的化合物更加敏感。因此，微管蛋白抑制剂和其它靶向微管剂有望成为一类治疗癌症的药物(Dumontet和Jordan(2010)Nat.Rev.Drug Discov.9：790-803)。
发明内容
本公开提供了一种抗体-药物偶联物(ADC)，其具有式(I)所示结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Ab-(L-D)k
(I)
其中，Ab为抗体或其抗原结合片段，
L为将Ab共价连接于D的连接子，且k为1至20(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两数值之间任意数值)，
-D如下式所示：
其中R1a选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选甲基；
R1b选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选氢；
或者R1a与R1b与其相连接的原子一起形成5至8元杂环烷基，所述杂环烷基任选被烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，且R1a和R1b不同时为氢。
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物中-D中R1a与R1b与其相连接的原子一起形成6至8元杂环烷基。
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物中-D中R1a选自甲基。
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物中-D中R1a、R1b各自独立选自甲基。
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物中-D为
在一些实施方案中，抗体-药物偶联物Ab-(L-D)k中，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数。
另一方面，本公开还提供了一种抗体-药物偶联物(ADC)，其具有式(I)所示结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
Ab-(L-D)k
(I)
其中，-D选自：
在一些实施方案中，连接子在细胞外是稳定的，使得ADC在存在于细胞外环境中时保持完整，但在例如癌细胞的细胞中内化时能够裂解。在一些实施方案中，当ADC进入表达对ADC的抗体部分具有特异性的抗原的细胞时，艾日布林类似物药物部分从抗体部分裂解，且裂解释放艾日布林类似物的未修饰形式。
在一些实施方案中，连接子中的可裂解部分为可裂解肽部分。在一些实施方案中，相对于包含其他可裂解部分的ADC，包含可裂解肽部分的ADC显示较低的聚集水平，改善的抗体与药物比率，增加的癌细胞的靶向杀死，减少的非癌细胞的脱靶杀死，和/或较高的药物负载(p)。在一些实施方案中，相对于不可裂解的连接子，添加可裂解部分增加细胞毒性和/或效力。在一些实施方案中，增加的效力和/或细胞毒性是在表达中等水平的由ADC的抗体部分所靶向的抗原(例如中等FRA表达)的癌症中具有增加的效力和/或细胞毒性。在一些实施方案中，可裂解肽部分能够由酶裂解，且连接子为酶能够裂解的连接子。在一些实施方案中，酶为组织蛋白酶，且连接子为组织蛋白酶能够裂解的连接子。在某些实施方案中，与其它分裂机制相比，酶能够裂解的连接子(例如组织蛋白酶能够裂解的连接子)显示上述改善特性中的一种或多种。
在一些实施方案中，连接子包含氨基酸单元，所述氨基酸单元优选包含由2至7个选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸的氨基酸构成的肽残基，更优选缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(Ala-Ala-Asn)、甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸(Gly-Gly-lys)、缬氨酸-赖氨酸(Val-lys)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)、缬氨酸-苯丙氨酸(Val-Phe)或甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(Gly-Gly-Phe-Gly)。
在一些实施方案中，本公开包括氨基酸单元的连接子选自：
在一些实施方案中，氨基酸单元包含缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)。在一些实施方案中，相对于包含其它氨基酸单元或其它可裂解部分的ADC，包含Val-Cit的ADC显示增加的稳定性，减少的脱靶细胞杀死，增加的靶向细胞杀死，较低的聚集水平，和/或较高的药物负载。
另一方面，一些实施方案提供的连接子包含可裂解磺酰胺部分，所述连接子在还原条件下能够裂解。
在一些实施方案中，所述连接子包含可裂解二硫化物部分，所述连接子在还原条件下能够裂解。
另一方面，本公开抗体偶联物中连接子包含至少一种将艾日布林衍生物D连接于可裂解部分的间隔单元。在一些实施方案中，所述连接子包含连接于D的间隔单元。
在一些实施方案中，所述间隔单元包含对氨基苯甲氧基羰基(PAB)，
在一些实施方案中，所述间隔单元包含对氨基苯甲酰基，
在一些实施方案中，所述间隔单元包含：
其中，Z1～Z5各自独立地选自碳原子或氮原子；R14选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基、烷氧基、卤素、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；R11和R12各自独立选自氢、氘、C1-6烷基、C3-6环烷基，优选氢；或者，R11与R12与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；X选自-O-或-NH-；L选自1-4之间整数；
Q为V-E-，V-E-提供了可被位于胞内的糖苷酶切割的糖苷键，E选自-O-、-S-或-NR13-，R13选自氢或甲基，进一步地，V选自其中R15选自-COOH或CH2OH。在一些实施方案中，V选自-COOH。
在一些实施方案中，所述间隔单元包含：
Z1、Z3、Z4、X、Q、R11、R12、R14如上所述。
在一些实施方案中，所述间隔单元包含选自以下部分：
-(CRaRb)m1-O(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-，
-(CRaRb)m1NH-(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-，
-(CRaRb)m1O-CR8R9(CRaRb)m2-，
-(CRaRb)m1OCR8R9-C(O)-，
-(CRaRb)m1-O-(CRaRb)m2C(O)-或-(CRaRb)m1-S-(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-，
其中Ra和Rb相同或不同，且各自独立地选自氢、氘原子、卤素或烷基；R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基；R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢；或者，R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；m1和m2各自独立选自0、1、2或3。
在一些实施方案中，所述间隔单元包含选自以下部分：
-(CH2)3-C(O)-、-CH2-O-CH2-C(O)-、-(CH2)2-O-CH2-C(O)-、
另一方面，本公开抗体偶联物(ADC)中L-D是由下式表示的化学部分：
-Str-(Pep)-Sp-D
Str是与Ab共价连接的拉伸单元，
Sp为间隔单元，
Pep选自氨基酸单元、二硫化物部分、磺酰胺部分或以下非肽化学部分：
其中，W是-NH-杂环烷基-或杂环烷基；Y是杂芳基、芳基、-C(O)C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C1-6亚烷基或-C1-6亚烷基-NH-；
每个R2独立选自C1-10烷基、C2-10烯基、C1-6亚烷基-NH2、-(C1-10亚烷基)NHC(NH)NH2或-(G1-10亚烷基)NHC(O)NH2；
R3和R4各自独立为H、C1-10烷基、C2-10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基，或R3和R4一起可形成C3-7环烷基；
R5和R6各自独立为C1-10烷基、C2-10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-10亚烷基)OCH2-，或R5和R6一起可形成C3-7环烷基环。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中Y选自以下部分：
另一方面，所述抗体-药物偶联物(ADC)中Str选自下式表示的化学部分：
其中R7选自-W1-C(O)-、-C(O)-W1-C(O)-、-(CH2CH2O)p1C(O)-、-(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-，其中W1选自C1-8亚烷基、C1-8亚烷基-环烷基或1至8个原子的直链杂烷基，所述杂烷基包含1至3个选自N、O或S的杂原子，其中所述的C1-8亚烷基、环烷基和直链杂烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、氘、羟基、氰基、氨基、烷基、卤代烷基、氘代烷基、烷氧基和环烷基的一个或多个取代基所取代；
L1选自-NR10(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR10(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-、-(CH2)p1C(O)-或化学键，优选化学键；其中，p1为1至20的整数，R10选自氢原子、烷基、卤代烷基、氘代烷基和羟烷基。
在一些实施方案中，C1-8亚烷基-环烷基选自亚甲基-环己基亚乙基-环己烷基亚甲基-环戊基
在一些实施方案中，连接子可以包含至少一种聚乙二醇(PEG)部分。PEG部分可以例如包含-(PEG)p1-，其中p1为整数1至20，例如(PEG)2；(PEG)4；(PEG)5。
在一些实施方案中，连接子中的拉伸单元包含(PEG)2。在一些实施方案中，尽管连接子长度较短，但相对于包含较长拉伸单元(例如(PEG)8)的ADC，包含较短拉伸单元(例如(PEG)2)的ADC显示较低的聚集水平和/或较高的药物负载。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物的Str，中R7选自C1-6亚烷基C(O)-、-(CH2-CH2O)2C(O)-、-(CH2-CH2O)2CH2C(O)-、-(CH2-CH2O)2CH2CH2C(O)-、-(CH2-CH2O)3C(O)-和-(CH2-CH2O)4C(O)-。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物的Str，中R7选自-C1-8亚烷基-环烷基-C(O)-、-(CH2-CH2O)4CH2C(O)-和-(CH2-CH2O)6CH2C(O)-。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物中连接子L包含：顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-Val-Cit、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)6-Val-Cit、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)8-Val-Cit、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)4-CH2CH2C(O)-Val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(CH2)5-Val-Cit、顺丁烯二酰亚胺-(CH2)5-Val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(CH2)5-Gly-Gly-Phe-Gly、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-Ala-Ala-Asn、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)6-Ala-Ala-Asn、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)8-Ala-Ala-Asn、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)4-三唑-(PEG)3-磺酰胺、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-CH2CH2C(O)-Val-lys、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)4-三唑-(PEG)3-磺酰胺或Mal-(PEG)4-三唑-(PEG)3-二硫化物。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物中连接子L包含：顺丁烯二酰亚胺-(PEG)4-CH2C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-CH2CH2C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)6-CH2C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly-、顺丁烯二酰亚胺-(CH2)5C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly-、顺丁烯二酰亚胺-C1-8亚烷基-环烷基-C(O)-NH(CH2CH2O)4CH2C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly-、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-CH2C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly-、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-CH2CH2C(O)-Val-Cit-、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-Gly-Gly-Phe-Gly-、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)2-CH2C(O)-Val-Cit-、顺丁烯二酰亚胺-(PEG)4-CH2C(O)-Val-Cit-和顺丁烯二酰亚胺-(PEG)6-CH2C(O)-Val-Cit-。
另一方面，一些实施方案提供所述抗体-药物偶联物中Str选自下式表示的化学部分：
其中R8选自C1-10亚烷基、C2-10亚烯基、(C1-10亚烷基)O-、N(Rd)-(C2-6亚烷基)-N(Rd)和N(Rd)-(C2-6亚烷基)；且每个Rd独立为H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物中L-D由选自以下的式表示：
其中R2是C1-6亚烷基、(C1-6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2；
其中R2是C1-6烷基、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2；
其中R2是C1-6烷基、C2-6亚烯基、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2；
其中R2是C1-6烷基、C2-6亚烯基、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2；
其中R2是C1-6烷基、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2，且R5和R6一起形成C3-7环烷基环；
其中R2是C1-6烷基、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2，且R5和R6一起形成C3-7环烷基环；
W、Str、D如前所述。
在另一些实施方案中，本公开抗体-药物偶联物(ADC)，其由下式表示：
其中R2选自C1-6亚烷基-NH2、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R2选自C1-6亚烷基-NH2、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R2是C1-6亚烷基-NH2、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)NH2，且R5和R6形成C3-7环烷基环，k选自1至1O，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R2是C1-6亚烷基-NH2、(C1-6亚烷基)NHC(NH)NH2或(C1-6亚烷基)NHC(O)N2，且R5和R6形成C3-7环烷基环，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
Y、R3、R4、Ab、D如前所述。
另一方面，一些实施方案提供的抗体-药物偶联物(ADC)，其由下式表示：
其中R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基，优选氢；R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基，优选氢；R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢；或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8；p3选自0、1或2；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2、4、6或8；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；
k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；
其中R8选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R8选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p2选自2-6之间整数；
其中R8选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2；
其中R8选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢，或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基，k选自1至10，可以为整数，也可以为小数，p1选自2、4、6或8，p3选自0、1或2。
在一些所述方案中，所述的抗体-药物偶联物(ADC)，其由下式表示：
其中k选自1至10，可以为整数，也可以为小数；进一步地，D中R1a优选自甲基，R1b优选自氢。
另一方面，本公开抗体-药物偶联物(ADC)中所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中所述抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUGl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体、抗CD79抗体、抗TROP-2抗体、抗CD79B抗体、抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗体为己知抗体，选自但不限于选自曲妥珠单抗(Trastuzumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、恩波妥珠单抗(Enoblituzumab)、依玛妥珠单抗(Emibetuzumab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab)、维布妥昔单抗(Brentuximab)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、比伐珠单抗(Bivatuzumab)、莫洛伐妥单抗(Lorvotuzumab)、cBR96和Glematumamab或其抗原结合片段。
在另一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗体选自抗CD79B抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区，其中：
抗体重链可变区，包含：
1)分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
2)分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或抗体轻链可变区，包含：
1)分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
2)分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，包含选自以下(I)至(II)中的任一项：
1)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
2)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：3所示或与SEQ ID NO：3具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：5所示或与SEQ ID NO：5具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；
和/或轻链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：4所示或与SEQ ID NO：4具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：6所示或与SEQ ID NO：6具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；
优选地，所述抗CD79B抗体或抗原结合片段的重链可变区如序列SEQ ID NO：3所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO：4所示；或重链可变区如序列SEQ ID NO：5所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO：6所示。
＞小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb015重链可变区：
＞小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb015轻链可变区：
＞小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb017的重链可变区：
＞小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb017的轻链可变区：
在另一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：19所示或与SEQ ID NO：19具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：21所示或与SEQ ID NO：21具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的序列；
和/或轻链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：20所示或与SEQ ID NO：20具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：22所示或与SEQ ID NO：22具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；
优选地，所述抗CD79B抗体或抗原结合片段的重链可变区如序列SEQ ID NO：19所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO：20所示；或重链可变区如序列SEQ ID NO：21所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO：22所示。
＞hAb015-10人源化抗体重链序列：
＞hAb017-10人源化抗体重链序列：
＞hAb017-10人源化抗体轻链序列：
另一方面，人CD79B细胞外区域(ECD)和人Fc区域融合蛋白(human CD79B ECD-hFc)的氨基酸序列：
＞人CD79B细胞外区域(ECD)和His标签的融合蛋白(human CD79B ECD-His)的氨基酸序列：
另一方面，在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗体选自抗TROP-2抗体。在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗TROP-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：29序列所示的重链可变区具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：30序列所示的轻链可变区具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗TROP-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示或与其有至少90％同一性。
在另一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗TROP-2抗体包含序列如SEQ ID NO：29所示的重链可变区和序列如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗TROP-2抗体包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体；更优选地，所述抗体包含序列如SEQ ID NO：31所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO：32所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗体-药物偶联物(ADC)中抗TROP-2抗体包含序列如SEQID NO：33所示的重链和序列如SEQ ID NO：34所示的轻链。
TROP-2氨基酸序列(Genbank：NP_002344-2)如下：
TROP-2-His氨基酸序列：
抗TROP-2抗体PD3重链可变区：
抗TROP-2抗体PD3轻链可变区：
抗体 抗TROP-2抗体PD3
重链CDR1 NYGMN(SEQ ID NO：23)
重链CDR2 WINTYTGEPTYTQDFKG(SEQ ID NO：24)
重链CDR3 GGFGSSYWYFDV(SEQ ID NO：25)
轻链CDR1 KASQDVSIAVA(SEQ ID NO：26)
轻链CDR2 SASYRYT(SEQ ID NO：27)
轻链CDR3 QQHYITPLT(SEQ ID NO：28)
抗体(抗TROP-2抗体)的重链恒定区可选自人IgG1、IgG2、IgG4及其变体的恒定区，轻链恒定区可选自人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。示例性的，抗体重链恒定区选自序列如SEQ ID NO：31所示的人IgG1，轻链恒定区选自序列如SEQ ID NO：32所示的人κ链的恒定区。
人IgG1的重链恒定区：
人源κ轻链恒定区：
示例性地，将上述轻链/重链恒定区与前述PD3抗体的可变区组合形成完整的抗体，其轻链/重链序列如下：
抗TROP-2抗体(PD3)重链：
抗TROP-2抗体(PD3)轻链：
进一步地，本公开所述抗体-药物偶联物(ADC)选自：
其中k选自1至10，可以为整数，也可以为小数；进一步地，D中R1a选自甲基，R1b选自氢。
本公开还提供了式D所示化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
其中，
R1a选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选甲基；R1b选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选氢、甲基；或者R1a与R1b与其相连接的原子一起形成5至8元杂环烷基，所述杂环烷基任选被烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，且R1a和R1b不同时为氢。
在一些实施方案中，式D所示化合物中R1a与R1b各自独立选自C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基。在一些实施方案中，式D所示化合物中R1a选自C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基；R1b选自氢。
在一些实施方案中，式D所示化合物中R1a与R1b与其相连接的原子一起形成5至8元杂环烷基。
在一些实施方案中，式D所示化合物为：
在一些实施方案中，式D所示化合物为：
在一些实施方案中，式D所示化合物为：
本公开还提供式DZ所示化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，
其中，R1a选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选甲基；
R1b选自氢、烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、芳基和杂芳基，所述的烷基、环烷基、芳基和杂芳基各自独立地任选被选自烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代，优选氢；
或者R1a与R1b与其相连接的原子一起形成5-8元杂环烷基，所述杂环烷基任选被烷基(如C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基)、烷氧基(如C1-6烷氧基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基)、卤素(如氟、氯、溴)、氘、氨基、氰基、硝基、羟基、羟烷基、环烷基(如C3-8环烷基，包括但不限于环丙基、环戊基或环己基)、杂环烷基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基所取代；且R1a和R1b不同时为氢；
Y选自-O(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-、-NH-(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-、-O-CR8R9(CRaRb)m2-、-OCR8R9-C(O)-、-O(CRaRb)m2C(O)-或-S-(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-，其中Ra和Rb相同或不同，且各自独立地选自氢、氘原子、卤素或烷基；
R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基；
R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢；
或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
m2选自0、1、2或3。
在一些实施方案中，式DZ所示化合物中R1a与R1b各自独立选自C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基。
在一些实施方案中，式DZ所示化合物中R1a选自C1-6烷基，包括但不限于甲基、乙基、异丙基；R1b选自氢。
在一些实施方案中，式DZ所示化合物中R1a与R1b与其相连接的碳原子一起形成5至8元杂环烷基。
在一些实施方案中，式DZ所示的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐，其为式DZ-1所示的化合物，或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体、或其混合物形式，或其可药用的盐：
其中，R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基；R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基，优选氢；或者，R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；m2选自0、1、2或3。
在一些实施方案中，DZ所示化合物选自：
另一方面，一些实施方案提供的DZ所示化合物可以含有一个或多个不对称中心，如可以为
另一方面，本公开还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的前述抗体-药物偶联物，以及药学上可接受的药用载体、稀释剂或赋形剂。
本公开还提供一种前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。在一些实施方案中，所述的肿瘤为与HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。
本公开还提供一种前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症优选乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
本公开还提供一种治疗或预防肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物；其中所述肿瘤优选为与HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。
本公开还提供一种治疗和和/或预防癌症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物；所述癌症优选乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
本公开另外提供一种前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物，其用于治疗或预防肿瘤；其中所述肿瘤优选为与HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。
本公开另外提供一种前述抗体-药物偶联物或前述药物组合物，其用于治疗和和/或预防癌症；所述癌症优选乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
可将活性化合物制成适合于通过任何适当途径给药的形式，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本公开化合物或组合物的单位剂量的表现方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。
本公开治疗方法中所用化合物或组合物的剂量通常将随疾病的严重性、患者的体重和化合物的相对功效而改变。不过，作为一般性指导，合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
本公开的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂(稀释剂)、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。
发明的详细说明
除非另有限定，本公开所用的所有技术和科学术语均与本公开所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本公开所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本公开，但本公开描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本公开时，依据以下定义使用下列术语。
当本公开中使用商品名时，申请人旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
术语“药物”是指细胞毒性药物或免疫调节剂。细胞毒性药物能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，毒性药物，化疗药物，抗生素和核溶酶。免疫调节剂是免疫关卡分子的抑制剂。本公开的一些实施方案中，药物表示为D，属于免疫调节剂，特别是TLR8激动剂。
术语“连接子”、“连接单元”、“接头单元”、“接头”或“连接片段”是指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
接头可以包含一种或多种接头构件。例示性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(MC)、马来酰亚氨基丙酰基(MP)、缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit或vc)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、对氨基苄氧羰基(PAB)，及那些源自与接头试剂的偶联的：N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1羧酸酯(SMCC，在本文中也称作MCC)和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。接头可以包括拉伸单元、间隔单元、氨基酸单元和延伸单元。可以通过本领域已知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
术语“拉伸单元”指一端通过碳原子与抗体共价连接而另一端与氨基酸单元、二硫化物部分、磺酰胺部分或非肽化学部分相连的化学结构片段。
术语“间隔单元”是一种双功能化合结构片段，可用于偶联氨基酸单元和细胞毒性药物最终形成抗体-药物偶联物，这种偶联方式可以将细胞毒性药物选择性的连接到氨基酸单元上。
术语“氨基酸”是指分子结构中含有氨基和羧基，并且氨基和羧基都直接连接在-CH-结构上的有机化合物。通式是H2NCHRCOOH，R为H、取代或未取代烷基等。根据氨基连结在羧酸中碳原子的位置，可分为α、β、γ、6、ε……-氨基酸。在生物界中，构成天然蛋白质的氨基酸具有其特定的结构特点，即其氨基直接连接在α-碳原子上，即α-氨基酸，包括甘氨酸(Glycine)、丙氨酸(Alanine)、缬氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)、异亮氨酸(Isoleucine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)、色氨酸(Tryptophan)、酪氨酸(Tyrosine)、天冬氨酸(Aspartic acid)、组氨酸(Histidine)、天冬酰胺(Asparagine)、谷氨酸(Glutamicacid)、赖氨酸(Lysine)、谷氨酰胺(Glutamine)、甲硫氨酸(Methionine)、精氨酸(Arginine)、丝氨酸(Serine)、苏氨酸(Threonine)、半胱氨酸(Cysteine)、脯氨酸(Proline)等。非天然氨基酸如瓜氨酸。如本领域技术人员所公知的，非天然氨基酸并不构成天然蛋白质，因此也不参与本公开中抗体的合成。本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本公开中间隔单元为PAB，结构如对氨基苯甲氧羰基片段，其结构如式(VI)所示，连接在D上，
接头组件包括但不限于：
MC＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：
Val-Cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的例示二肽)；
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸；
Me-Val-Cit＝N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶B的切割)；
MC(PEG)6-OH＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)；
SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯；
SPDP＝N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯；
SMCC＝琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯；
IT＝亚氨基硫烷；
PBS＝磷酸缓冲盐溶液。
术语“抗体-药物偶联物”，指配体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本公开中“抗体-药物偶联物”(antibody drug conjugate，ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。
术语“载药量”可以表示为药物量和抗体量的比值。载药量的范围可以是每个抗体(Ab)连接1-20个，优选1-10个细胞毒性药物(D)。在本公开的实施方式中，载药量表示为k，示例性的可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两数值之间数值的均值。优选1-10，更优选1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法、质谱、ELISA试验、单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS)和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物平均数量。
本公开单抗分子大小变异体测定法(CE-SDS)可采用十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)紫外检测方法，在还原和非还原条件下，依据分子量大小，按毛电泳法(2015年版《中国药典》0542)，定量测定重组单克隆抗体产品的纯度。
本公开的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在配体的N端氨基和/或赖氨酸残基的ε-氨基上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制抗体-药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。本公开所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUGl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体、抗CD79抗体、抗TROP-2抗体、抗CD79B抗体、抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体选自曲妥珠单抗(Trastuzumab，商品名Herceptin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab，商品名泰欣生)、恩波妥珠单抗(Enoblituzumab)、依玛妥珠单抗(Emibetuzumab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab)、维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab)、维布妥昔单抗(Brentuximab)、吉妥单抗(Gemtuzumab)、比伐珠单抗(Bivatuzumab)、莫洛伐妥单抗(Lorvotuzumab)、cBR96和Glematumamab。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体，优选人源化抗体和全人源抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本公开为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个B细胞抗体制备技术等。
术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc NatlAcad Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50，000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50，000并具有抗原结合活性的抗体片段。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(参见Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.CompImmunol.，27，55-77(2003))等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996))。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7M，例如：大约小于10-8M、10- 9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或GSepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段，如激素、酶类等本质上都是肽。
术语“糖”是指由C、H、O三种元素组成的生物大分子，可分为单糖、二糖和多糖等。
术语“荧光探针”是指在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命和偏振等)可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子，其与核酸(DNA或RNA)、蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变，可用于研究大分子物质的性质和行为。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至10个碳原子的烷基，最优选含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2，2-二乙基戊基、正癸基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“杂烷基”指含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的烷基，其中烷基如上所定义。
“一价基团”是指一个化合物从“形式上”消除一个单价的原子或基团。“亚基”则是指化合物从“形式上”消除两个单价或一个双价形成的原子或原子团。示例“烷基”是指由烷烃分子中去除1个氢原子后余下的部分，包括1至20个碳原子的直链和支链一价基团。含有1至6个碳原子的烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基及其各种支链异构体等。
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1，1-亚乙基(-CH(CH3)-)、1，2-亚乙基(-CH2CH2)-、1，1-亚丙基(-CH(CH2CH3)-)、1，2-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、1，3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1，5-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个。同理，“亚烯基”如前所定义。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至10个碳原子，最优选包含3至8个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“杂环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子。单环杂环烷基的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环烷基包括螺环、稠环和桥环的杂环烷基。
术语“螺杂环烷基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环烷基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环烷基分为单螺杂环烷基、双螺杂环烷基或多螺杂环烷基，优选为单螺杂环烷基和双螺杂环烷基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环烷基。螺杂环烷基的非限制性实例包括：
术语“稠杂环烷基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环烷基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环烷基。稠杂环烷基的非限制性实例包括：
术语“桥杂环烷基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环烷基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环烷基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环烷基的非限制性实例包括：
所述杂环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环烷基，其非限制性实例包括：
等。
杂环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基，优选苯基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环烷基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元，更优选为5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环烷基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含9-芴甲氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。所述氨基保护基优选为9-芴甲氧羰基。
术语“氨基杂环烷基”指杂环烷基被一个或多个氨基取代，优选被一个氨基取代，其中杂环烷基如上所定义，其中“氨基”指-NH2。本公开的代表性实施例如下：
术语“杂环烷基氨基”指氨基被一个或多个杂环烷基取代，优选被一个杂环烷基取代，其中氨基如上所定义，其中杂环烷基如上所定义。本公开的代表性实施例如下：
术语“环烷基氨基”指氨基被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中氨基如上所定义，其中环烷基如上所定义。本公开的代表性实施例如下：
术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH2。
术语“硝基”指-NO2。
化学式中简称“Me”为甲基。
本公开还包括各种氘化形式的式(I)化合物。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式(I)化合物。在制备氘代形式的式(I)化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
另一方面，本公开所述化合物的官能团中氢被氘代，获得相应氘代化合物，氘代化合物保留了与氢衍生物相当的选择性和潜力；氘键更稳定，使得“ADME”即“毒药物动力学”不同，从而提供临床上有益效果。
毒药物动力学，指机体对外源化学物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排泄(excretion)过程。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环烷基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环烷基团被烷基取代的情形和杂环烷基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
术语“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本公开抗体-药物偶联物的盐，或本公开中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。本公开抗体-药物偶联物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，可药用盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂合物”指本公开的配体-药物偶联化合物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂合物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“药物载体”用于本公开的药物，是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”是在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。如片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂。
术语“稀释剂”又称填充剂，其主要用途是增加片剂的重量和体积。稀释剂的加入不仅保证一定的体积大小，而且减少主要成分的剂量偏差，改善药物的压缩成型性等。当片剂的药物含有油性组分时，需加入吸收剂吸收油性物，使保持“干燥”状态，以利于制成片剂。
本公开中化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可以产生对映异构体、非对映异构体，并且其可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或用于氨基酸的(D)-或(L)-的其它立体异构形式。本公开包括所有可能异构体以及其外消旋和光学纯的形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或者可以使用常规方法例如色谱法和分级结晶制备。用于制备/分离各个对映体的常规方法包括从合适的的光学纯前体手性合成或使用例如手性高效液相色谱法(HPLC)的外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)拆分。当本文描述的化合物含有烯双键或其它几何不对称性中心，除非另有说明，否则其意味着所述化合物包括E和Z几何异构体。而且，所有的互变异构形式也意味着包括在内。
本公开所述化合物的化学结构中，键表示未指定构型，即如果化学结构中存在手性异构体，键可以为或或者同时包含和两种构型。
“立体异构体”指通过相同的键键合但具有不同的三维结构的相同原子组成的化合物，其不可互换。本公开中预期各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，其指其分子彼此为不能重叠的镜像的两种立体异构体。
“互变异构体”指质子从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子。本公开中包括任何所述化合物的互变异构体。
附图说明
图1：测试例7中空白溶媒组与不同测试给药组的动物体重变化趋势图(横坐标：天数，纵坐标：体重)。
图2：溶媒与不同测试药给药组的动物肿瘤体积变化趋势图(横坐标：天数，纵坐标：肿瘤体积)。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用Agilent 1200/1290 DAD-6110/6120 Quadrupole MS液质联用仪(生产商：Agilent，MS型号：6110/6120 Quadrupole MS)，waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生产商：waters，MS型号：waters ACQuity Qda Detector/waters SQ Detector)，THERMOUltimate 3000-Q Exactive(生产商：THERMO，MS型号：THERMO Q Exactive)。
高效液相色谱法(HPLC)分析使用Agilent HPLC 1200DAD、Agilent HPLC 1200VWD或Waters HPLC e2695-2489高压液相色谱仪。
手性HPLC分析测定使用Agilent 1260DAD高效液相色谱仪。
高效液相制备使用Waters 2545-2767、Waters 2767-SQ Detecor2、Shimadzu LC-20AP和Gilson GX-281制备型色谱仪。
手性制备使用Shimadzu LC-20AP制备型色谱仪。
CombiFlash快速制备仪使用Combiflash Rf200(TELEDYNE ISCO)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2nm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co KG、Acros Organics、Aldrich Chemical Company、韶远化学科技(AccelaChemBio Inc)、达瑞化学品等公司。
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氩气或氮气气球。
氢气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氢气气球。
加压氢化反应使用Parr 3916EKX型氢化仪和清蓝QL-500型氢气发生器或HC2-SS型氢化仪。
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
微波反应使用CEM Discover-S 908860型微波反应器。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
本公开抗体药物偶联物参见WO2020063676A相关的化合物合成及测试全文引用至本公开。其中的非限制性实施例合成如下：
一、抗体的制备
实施例1-1.蛋白抗原的克隆表达
抗体(包含轻、重链)和抗原用本领域公知的重叠延伸PCR方法构建，将重叠延伸PCR得到的DNA片段用HindIII/BstBI这两个酶切位点插入到表达载体pEE6.4(LonzaBiologics)中，在293F细胞(Invitrogen，Cat#R790-07)中表达得到。所得重组蛋白用于免疫或筛选。人CD79B基因序列来源于NCBI(NP_000617.1)，其细胞外区域(ECD)包含159个氨基酸(Met1-Asp159)。
人CD79B细胞外区域(ECD)和人Fc区域融合蛋白(human CD79B ECD-hFc)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：
人CD79B细胞外区域(ECD)和His标签的融合蛋白(human CD79B ECD-His)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：
实施例1-2.小鼠单克隆抗体的制备
1、小鼠免疫和血清效价检测
以人CD79B细胞外区域(ECD)和人Fc区域融合蛋白(human CD79B ECD-hFc)以及人CD79B细胞外区域(ECD)和His标签的融合蛋白(human CD79B ECD-His)分别作为免疫原，通过腹腔注射法对Balb/c和SJL小鼠进行免疫，刺激小鼠体内产生针对人CD79B细胞外区域(ECD)的抗体。同时，以猴CD79B细胞外区域(ECD)和His标签的融合蛋白(cyno CD79B ECD-His)作为免疫原，通过腹腔注射法对SJL小鼠进行免疫，刺激小鼠体内产生针对猴CD79B细胞外区域(ECD)的抗体。
实验步骤如下：
1)腹腔注射免疫法：根据免疫程序计算出该次免疫所需的抗原量。蛋白抗原按照要求用PBS稀释抗原到相应浓度，随后进行抗原的乳化。将乳化好的抗原和佐剂混合物转移到2.0ml无菌注射器中，注意排空气泡。右手抓住小鼠尾巴，左手的大拇指和食指轻轻抓住小鼠的头颈部皮肤，腹腔向上，用75％酒精棉球擦拭小鼠右侧腹部注射部位。将事先吸好抗原药物的注射器针尖斜面向上，小鼠头部向下，平行刺入皮内后，注射器与腹腔呈45度角刺入小鼠腹腔，缓慢注入抗原和佐剂混合物，免疫完成后进行至少2h观察。
2)小鼠血清的收集：将每只小鼠对应的血清管号做好标记，检查小鼠耳钉号，单手抓取小鼠，通过小鼠面部颌下静脉采取大约100ul全血，将收集的全血样品室温静置大约2h后离心收集离心管上部血清。一周内可将血清存放于4℃冰箱，用于抗体效价等相关实验检测。若长期保存血清可置于-80℃冰箱，避免反复冻融。
3)免疫小鼠ELISA血清效价测定：实验开始前将96孔板做好相应的标记，以1ug/ml抗原浓度，每孔50ul，4℃冰箱过夜包被。次日，将前天包被好的抗原板取出，洗板机清洗一次(清洗液：1x PBST)。清洗后以1X PBST配置的1％BSA封闭液37℃封闭1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入不同稀释浓度的待检血清37℃温箱，孵育1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入100ul 1∶5000稀释的羊抗鼠二抗，37℃温箱孵育0.5小时洗板后，取TMB显色液A液和B液1∶1比例混合后显色。15分钟用1N盐酸终止显色反应。在Spectra Max M5多功能读板机上，检测450nm的荧光值。
4)免疫小鼠FACS血清效价测定：DoHH2细胞或猴外周血单核细胞悬液离心后以含0.1％BSA的PBS重悬细胞后计数，加入各组免疫小鼠的待测血清，室温孵育60分钟后清洗细胞三次后加入Anti-Mouse IgG(Fc specific)-FITC二抗，避光室温孵育30分钟后清洗细胞三次，用含0.1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，上机检测。
通过以上试验使免疫的小鼠中产生了针对CD79B的特异性抗体，以上小鼠可用于细胞融合以产生能够分泌针对CD79B的特异性抗体的杂交瘤细胞系。
2、杂交瘤制备和抗体筛选
细胞融合是在自发或人工诱导下，促使小鼠的淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC，CCL-121TM)融合成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既具有抗体分泌功能又能无限增殖。利用电融合方法对免疫组小鼠的淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合，用于后续抗体筛选。
1)电融合实验：融合前一周将SP2/0细胞于10％DMEM培养基中进行扩大培养。将已处死的小鼠于生物安全柜中摘取脾脏和淋巴结于培养皿中进行冲洗研磨，收集淋巴细胞。将SP2/0和淋巴细胞按比例混合，启动电融合仪，设置程序，进行融合。融合后细胞铺于96孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，融合后5天统计细胞融合率。融合后9-14天对融合的杂交瘤细胞进行筛选，挑选阳性孔细胞于24孔板中扩大培养。
2)有限稀释法进行亚克隆：将需要亚克隆的细胞株自24孔培养孔中重悬起来，进行计数。稀释每株细胞株的细胞浓度至5-10个/ml，将稀释好的细胞悬液加入15cm一次性培养皿中，于96孔培养板中每孔加0.2ml，每孔含细胞为1-2个。将铺好细胞的96孔板放进37℃，5％CO2培养箱中培养。7-10天后根据细胞的生长情况对亚克隆板进行检测筛选，并挑选阳性克隆至24孔进行进一步阳性确认。
3)ELISA筛选：实验开始前将96孔板做好相应的标记，以1ug/ml抗原浓度，每孔50ul，4℃冰箱过夜包被。次日，将前天包被好的抗原板取出，洗板机清洗一次(清洗液：1xPBST)。清洗后以1XPBST配置的1％BSA封闭液37℃封闭1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入50ul待检细胞上清37℃温箱，孵育1小时。1xPBST清洗液洗板3次后，加入100ul 1∶5000稀释的羊抗鼠二抗，37℃温箱孵育0.5小时洗板后，取TMB显色液A液和B液1∶1比例混合后显色。15分钟用1N盐酸终止显色反应。在Spectra Max M5多功能读板机上，检测450nm的荧光值。
4)FACS筛选：DOHH2细胞悬液离心后以含0.1％BSA的PBS重悬细胞后计数，加入待测细胞上清，室温孵育60分钟后清洗细胞三次后加入Anti-Mouse IgG(Fc specific)-FITC二抗，避光室温孵育30分钟后清洗细胞三次，用含0.1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，上机检测。
5)杂交瘤阳性克隆鉴定：通过对小鼠脾细胞的融合和亚克隆筛选后，我们获得多个针对人CD79B抗原的特异性抗体，对其中ELISA和FACS结合力最好的17株杂交瘤进行抗体生产纯化。抗人CD79B杂交瘤阳性克隆细胞培养上清ELISA检测结果见表1。抗人CD79B杂交瘤阳性克隆细胞培养上清FACS检测结果见表2。同时也获得了针对猴CD79B抗原的特异性抗体，对其中ELISA和FACS结合力最好的4株杂交瘤进行抗体生产纯化。均使用mIgG作为阴性对照。
表1.抗人CD79B杂交瘤阳性克隆ELISA检测结果
抗体编号 克隆号 检测结果(OD450)
阴性对照 mIgG 0.05
mAb015 83B2G2 3.41
mAb017 86F11F6 3.80
表2.抗人CD79B杂交瘤阳性克隆FACS检测结果
抗体编号 克隆号 平均荧光值
阴性对照 mIgG 58
mAb015 83B2G2 10036
mAb017 86F11F6 8132
3、小鼠单克隆抗体生产纯化及鉴定
1)小鼠单克隆抗体生产和纯化：显微镜下观察需要抗体生产的杂交瘤细胞，长至≥70％以上且细胞状态良好，收集细胞并用Countstar IC1000型细胞计数仪进行计数。用配制好的培养基将细胞浓度调至1～5×105个/ml，转移至Roller Bottle。将转好细胞的Roller Bottle送到滚瓶培养箱中37℃培养10-15天，每天观察细胞生长状况，待培养液变橙黄且透明，取出待纯化。细胞上清通过Protein A柱子进行抗体纯化，按照常规方法操作。
2)抗人CD79B小鼠单克隆抗体ELISA检测：实验开始前将96孔板做好相应的标记，以1ug/ml抗原浓度，每孔50ul，4℃冰箱过夜包被。次日，将前天包被好的抗原板取出，洗板机清洗一次(清洗液：1x PBST)。清洗后以1X PBST配置的1％BSA封闭液37℃封闭1小时。1xPBST清洗液洗板3次后，加入50ul按照100nM，1∶10稀释过的抗体，放入37℃温箱，孵育1小时。1x PBST清洗液洗板3次后，加入100ul 1∶5000稀释的羊抗鼠二抗，37℃温箱孵育0.5小时。洗板后，取TMB显色液A液和B液1∶1比例混合后显色。15分钟用1N盐酸终止显色反应。在Spectra Max M5多功能读板机上，检测450nm的荧光值。其中有4个抗人CD79B小鼠单克隆抗体的ELISA结合力最强，包括mAb015和mAb017。
3)抗人CD79B小鼠单克隆抗体FACS检测：DOHH2细胞悬液离心后以含0.1％BSA的PBS重悬细胞后计数，加入100ul按照100nM，1∶10稀释过的抗体，室温孵育1小时。清洗细胞三次后加入Anti-Mouse IgG(Fc specific)-FITC二抗，避光室温孵育30分钟后清洗细胞三次，用含0.1％BSA的PBS轻轻重悬细胞，上机检测。其中有4个抗人CD79B小鼠单克隆抗体的FACS结合力最强，包括mAb015和mAb017。
4)抗人CD79B小鼠单克隆抗体SPR检测：采用表面等离子共振技术(surfaceplasmon resonance，SPR)检测抗人CD79B抗体与其抗原人CD79B-His之间的亲和力。将抗原人CD79B-His蛋白固定化至CM5芯片。偶联水平设定在100RU。运行缓冲液为HBS-EP+(10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％surfactant P20)。将稀释好的抗体在30μl/min的流速下流过实验通道和对比通道3分钟，解离5分钟。然后再生缓冲液(10mM Glycine，pH1.5)在30μl/min的流速下运行30秒。数据用Biacore 8K evaluation software软件进行分析。
实施例1-3.小鼠单克隆抗体可变区氨基酸序列测定
将实施例1-2中得到的高亲和力的杂交瘤单克隆细胞株进行可变区氨基酸序列测定，然后重组表达出人鼠嵌合抗体(chimeric antibody，cAb)，再进行进一步的抗体鉴定。用逆转录PCR扩增抗体基因的重链和轻链可变区，连接到载体测序得到单克隆抗体轻重链序列。首先采用RNA纯化试剂盒(Qiagen公司，货号74134，步骤见此说明书)提取实施例2中活性好的单细胞株的细胞总RNA。然后使用Invitrogen公司的货号为18080-051 cDNA合成试剂盒制备cDNA单链，即Oligo-dT primers cDNA反转录。以此为模版，采用PCR方法合成抗体轻重链可变区序列，PCR产物克隆到TA载体pMD-18T，然后送去测序。将得到的抗体轻重链序列分别克隆到表达载体(方法见实施例1-1)，表达重组单克隆抗体，验证活性(方法见实施例1-2)后，进行人源化工作。
抗人CD79B抗体的VH/VL CDR的氨基酸残基由Chothia编号系统确定并注释。
小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb015的序列：
重链可变区：
轻链可变区：
小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体mAb017的序列：
重链可变区：
轻链可变区：
鼠源的CDR序列如表3所示：
表3.鼠源抗人CD79B抗体的CDR序列
实施例1-4.抗人CD79B抗体人源化
将实施例1-3得到的鼠源抗CD79B单克隆抗体轻重链序列在抗体数据库里进行同源性比较后，建立人源化抗体模型，根据模型选择回复突变筛选最优的人源化抗CD79B单克隆抗体为优选分子。该方法从已经发表的小鼠Fab晶体结构模型数据库(比如PDB数据库)中查找与所得鼠源候选分子同源性相似的晶体结构开始，挑取高分辨率(比如)的Fab晶体结构，建立小鼠Fab模型。将鼠源抗体轻重链序列和模型中的序列比对，保留和模型中和鼠源抗体序列一致的序列，得到鼠抗体的结构模型，其中不一致氨基酸为可能的回复突变位点。用Swiss-pdb viewer软件运行鼠抗体结构模型，优化能量(最小化)。将模型中除CDR外的不同氨基酸位点进行回复突变，将所得的突变抗体(人源化)和人源化之前抗体对比进行活性检测。保留活性好的人源化抗体。之后，对CDR区域优化，包括避免糖基化、脱酰胺化、氧化位点等。用基因克隆、重组表达的方法分别克隆、表达、纯化上述抗体，经ELISA、FACS和SPR等检测，最终选出活性保持最好的人源化抗体hAb015-10和hAb017-10。
人源化抗体hAb015-10和hAb017-10的序列见下。
hAb015-10人源化抗体重链：
hAb015-10人源化抗体轻链：
hAb017-10人源化抗体重链：
hAb017-10人源化抗体轻链：
实施例1-5：TROP-2高表达细胞株构建
将pCDH-hTROP-2慢病毒表达载体质粒与pVSV-G，pCMV-dR8.91慢病毒系统包装载体用Lipofectamine 3000转染试剂转染至病毒包装细胞293T中，收集含有病毒的培养基上清，过滤并进行超高速离心，使用浓缩后的病毒感染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1，经puromycin筛选两至三周，再进行FACS单细胞分选。
通过FACS检测慢病毒感染的CHO-K1细胞表面的TROP-2表达量，挑选出TROP-2表达量高的CHO-K1/hTROP-2单克隆细胞株。
TROP-2氨基酸序列(Genbank：NP_002344.2)如下：
TROP-2-His氨基酸序列：
实施例1-6：抗人TROP-2单克隆抗体的制备
本公开中的抗人TROP-2单克隆抗体依照WO03074566专利中公开的方法制备，以hRS7的抗体可变区基因为模板利用计算机软件针对CDR进行点突变改造设计。通过分子克隆插入至蛋白表达载体Phr-IgG(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段))中，在HEK293和Expi-CHO-S细胞中进行表达。按照常规方法进行抗体纯化。利用过表达huTROP-2蛋白的CHO-K 1细胞和huTROP-2蛋白(His27-Thr274 Accession#NP_0023442)进行活性验证，挑选出靶点结合活性较好的抗体，其中PD3可变区序列如下：
PD3重链可变区：
PD3轻链可变区：
注：下划线部分为依照Kabat编号规则确定的CDR区。
表4.PD3抗体的CDR区
抗体 PD3
重链CDR1 NYGMN(SEQ ID NO：23)
重链CDR2 WINTYTGEPTYTQDFKG(SEQ ID NO：24)
重链CDR3 GGFGSSYWYFDV(SEQ ID NO：25)
轻链CDR1 KASQDVSIAVA(SEQ ID NO：26)
轻链CDR2 SASYRYT(SEQ ID NO：27)
轻链CDR3 QQHYITPLT(SEQ ID NO：28)
抗体的重链恒定区可选自人IgG1、IgG2、IgG4及其变体的恒定区，轻链恒定区可选自人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。示例性的，抗体重链恒定区选自序列如SEQ ID NO：11所示的人IgG1，轻链恒定区选自序列如SEQ ID NO：12所示的人κ链的恒定区。
人IgG1的重链恒定区：
人源κ轻链恒定区：
示例性地，将上述轻链/重链恒定区与前述PD3抗体的可变区组合形成完整的抗体，其轻链/重链序列如下：
PD3重链：
PD3轻链：
二、化合物的制备
实施例2-1：化合物L-1的合成
步骤1：化合物2的制备
冰水浴下，将化合物1(50mg，.08mmol，参照WO2017151979中方法制备而得)溶解于1.5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺，18mg，0.14mmol)，接着加入二(对硝基苯)碳酸酯(49mg，0.16mmol)。然后在室温搅拌，加入20mL甲基叔丁基醚，搅拌20分钟，过滤，干燥得到36mg固体化合物2。
LC/MS(ESI)：m/z 784.1[M+H]+。
步骤2：化合物D-1b的制备
冰水浴下，将化合物D-1a(艾日布林，参照ZL201010236637.2方法制备获得)(72.91mg，0.1mmol)溶于10mL的四氢呋喃中，加入Fmoc-OSu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺，41mg，0.12mmol)，然后在室温搅拌至反应完全。减压浓缩得粗品，直接用于下一步反应。
步骤3：化合物D-1c的制备
将上步所得化合物D-1b的粗品溶于10mL无水乙醚中，加入氧化银(34.8mg，0.15mmol)，接着加入碘甲烷(28.4mg，0.2mmol)，然后于室温搅拌至反应完全，过滤，然后减压浓缩得粗品，直接进行下一步反应。
步骤4：化合物D-1的制备
将上步所得化合物D-1c粗品溶于10mL的四氢呋喃中，加入2mL的二乙胺，然后在室温搅拌至反应完全，减压浓缩得粗品，经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯/石油醚)纯化，得3mg目标产物化合物D-1。
LC/MS(ESI)：m/z 7442[M+H]+。
步骤5：化合物L-1的制备
将化合物D-1(13.5mg，0.018mmol)溶于1.5mL的DMF中，加入DIPEA(7mg，0.054mmol)，然后分批加入化合物2(18mg，1.3mmol)，搅拌至反应基本完全，浓缩得粗品。经HPLC制备分离(色谱柱：Welch XTimate C18(5.0μm*30.0*150mm)；流动相：A-水(0.1％formic acid)：B-乙腈，梯度洗脱＝70∶30-5∶95(16min，流速：30.0mL/min)得6.5mg化合物L-1，纯度96.95％。
LC/MS(ESI)：m/z 1388.3[M+H]+。
1HNMR(CDCl3，400M)δ0.85～0.90(m，3H)，0.93～1.00(m，3H)，1.08～1.10(m，3H)，1.20～1.50(m，15H)，1.75～2.04(m，6H)，2.13～2.55(m，16H)，2.70～2.77(m，1H)，2.80～2.96(m，2H)，3.16～3.97(m，20H)，3.99～4.39(m，8H)，4.60～4.80(m，6H)，4.88～5.10(m，5H)，5.24～5.37(m，4H)，6.71(s，2H)，7.03(d，J＝6.8Hz，1H)，7.18～7.30(m，3H)，7.63(d，J＝8.0Hz，2H)，8.92(bs，1H)。
实施例2-2化合物D-2的合成
在反应瓶中加入(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸(4.7mg，0.04mmol，1.5eq)，加入THF搅拌溶解，冰水浴降温。然后加入EDCI HCl(8.0mg，0.04mmol，1.5eq，1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺盐酸盐)、HOBT(5.4mg，0.04mmol，1.50eq，1-羟基苯并三氮唑)，接着加入化合物D-1a(20mg，0.027mmol，1.0eq)，最后加入DIPEA(10.5mg，0.08mmol，3.0eq)。加料完毕后，自然升到室温(20℃)搅拌至反应基本完全，加入2ml水淬灭反应，用乙酸乙酯萃取(2×5ml)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗品经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)纯化得到6.0mg，纯度98％。
MS：827.8[M+H]+。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.82(s，1H)，5.08(s，1H)，4.93(s，1H)，4.89(s，1H)，4.81(s，1H)，4.70(t，J＝4.4Hz，1H)，4.61(t，J＝4.4Hz，1H)，4.42-4.25(m，3H)，4.23-4.16(m，1H)，4.12(s，1H)，4.03(d，J＝9.3Hz，3H)，4.02-3.87(m，3H)，3.82(d，J＝9.4Hz，1H)，3.78-3.70(m，3H)，3.58(dd，J＝50.7，8.9Hz，4H)，3.43(s，3H)，3.32-3.23(m，2H)，2.88(d，J＝9.5Hz，2H)，2.72(dd，J＝16.0，10.0Hz，1H)，2.46(d，J＝13.9Hz，4H)，2.33(d，J＝13.8Hz，3H)，2.19(dd，J＝21.4，14.3Hz，4H)，2.08(s，1H)，1.97(ddd，J＝13.6，9.4，4.7Hz，5H)，1.44(d，J＝11.5Hz，3H)，1.27(d，J＝12.2Hz，4H)，1.10(d，J＝6.2Hz，3H)，0.68-0.45(m，4H)。
实施例2-3化合物D-3的合成
于室温，在氮气氛下，用2mL的DCM溶解化合物D-1(22mg，0.03mmol)和(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸(7.0mg，0.06mmol)，再依次加入Et3N(21uL，0.15mmol)和DMTMM(20.3mg，0.069mmol，4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐)，室温搅拌过夜。反应完后加入H2O(2mL)淬灭，DCM(2mL X 3)萃取，有机相减压浓缩(浴温30℃)。残余物经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物D-3(18mg，纯度95％)。
MS：863.8[M+Na]+。
实施例2-4化合物D-4的合成
用羟基乙酸代替(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸参照实施例2-2方法制得化合物D-4。
MS：787.82[M+H]+。
1HNMR(CDCl3，400M)：0.86～0.90(m，1H)，1.04～1.13(m，4H)，1.22～1.41(m，4H)，1.71～1.74(m，3H)，1.94～2.00(m，5H)，2.15～2.22(m，8H)，2.48(S，3H)，2.71～2.75(m，2H)，2.87～2.89(m，2H)，3.26～3.31(m，2H)，3.43(S，3H)，3.53～3.55(m，1H)，3.64～3.70(m，2H)，3.74(s，1H)，3.80～3.84(m，1H)，3.90～4.05(m，4H)，4.12(s，3H)，4.18～4.20(m，1H)，4.26～4.39(m，3H)，4.61(t，J＝4.8Hz，1H)，4.619(t，J＝4.8Hz，1H)，4.82(s，1H)，4.82(s，1H)，4.88(s，1H)，4.93(s，1H)，5.08(s，1H)，6.89(m，1H)。
实施例2-5化合物D-5的制备
用1-羟基环丙烷-1-羧酸代替(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸参照实施例2-2方法制得化合物D-5。
MS：835.7[M+Na]+。
实施例2-6化合物D-6的合成
利用起始物料(R)-2-环丙基-2-羟基乙酸和E1-30(根据文献Bioorg.Med.Chem.Lett.14(2004)5551-5554.合成得到)参照实施例2-2方法制备式D-6化合物。
MS：850.64[M+Na]+。
实施例2-7化合物D-7的合成
利用起始物料1-羟基环丙烷-1-羧酸和E1-30(根据文献Bioorg.Med.Chem.Lett.14(2004)5551-5554.合成得到)参照实施例2-2方法制备式D-7化合物。
MS：836.73[M+Na]+。
实施例2-8化合物D-8的合成
利用起始物料对羟基乙基苯甲酸和E1-30参照实施例2-2方法制备式D-8化合物。
MS：886.75[M+Na]+。
测试例1：体外细胞毒活性筛选
1.1.实验原理及方法
本实验利用CTG检测ATP含量，反映肿瘤细胞的存活情况。首先通过种植不同密度的细胞并培养3天和5天，根据IC50和最大抑制率确定最终培养条件。然后按照此条件检测毒素分子的杀伤作用。
1.2.细胞株的选择
根据实验目的，选择乳腺癌、NSCLC两种疾病模型，选出SKBR3肿瘤细胞(HER2+，ATCC，货号HTB-30)、MDA-MB-468(HER2-，ATCC，货号HTB-132)和A549(人非小细胞肺癌细胞，ATCC，货号CCL-185)三株细胞用于筛选实验。
1.3.细胞培养条件的确定
1)细胞培养：A549、SK-BR-3和MDA-MB-468细胞分别用含10％FBS(Gibco，10099-141)的Ham’s F-12K(Kaighn’s)培养基(Gibco，21127030)和McCoy′s 5A培养基(ThermoFisher，货号16600108)培养及Leibovitz′s L-15培养基(ThermoFisher，货号11415-114)进行培养。
2)细胞铺板：将A549用胰酶消化后，用上述培养基终止，计数后分别取4.3×105、7.2×105、11.5×105个细胞加培养液使终体积均为26ml。在96孔板(康宁，货号3903)第2列到第11列每孔加180ul细胞悬液，使得细胞密度分别为每孔3K、5K、8K。第12列为200ul培养液，剩余孔用PBS填充。SKBR3和MDA-MB-468细胞重复上述操作。平行两份。
3)药物配制：在圆底96孔板(康宁，货号3788)中，用DMSO配制阳性对照艾日布林和本公开化合物储备液。在配药板1的第1列配制2mM(用DMSO将储液稀释10倍)，此后到第10列梯度10倍稀释于DMSO中，第11列为DMSO。配药板2第2列至第11列每孔加入相应培养液95ul，从配药板1的第2列至第11列吸取5ul溶液至配药板2，混匀后，吸取20ul加入铺好的细胞中，继续培养3天和5天。
4)CTG检测(Cell Titer-GloTM，发光细胞生存能力检测，Promega公司)：分别在第3天和第5天取出细胞板，平衡至室温。每孔加入90ul CTG，避光室温反应10min，酶标仪读取发光值并计算IC50。
1.4.数据结果
表5
结论：化合物D-1在三种肿瘤细胞系中都有很好的杀伤效果，且明显优于阳性药艾日布林。
实施例2-9：化合物D-9的合成
步骤1：化合物D-9a的制备
于室温，取0.3mL的1，4-二氧六环和0.3mL的化合物E-305(31mg，0.042mmol，根据文献Bioorg.Med.Chem.Lett.14(2004)5551-5554.合成得到)，再依次加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)(17mg，0.050mmol)和碳酸钠固体(18mg，0.168mmol)。室温搅拌过夜，检测原料基本转化完全。反应中加入水淬灭，乙酸乙酯萃取，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚)纯化后得15mg产物。
LC/MS(ESI)：m/z 965.64[M+H]+。
步骤2：化合物D-9b的制备
于室温，用二氯甲烷(0.5mL)溶解化合物D-9a(7mg，0.007mmol)，再依次加入4A分子筛(10mg)、三甲基氧鎓四氟硼酸(11mg，0.07mmol)和质子海绵(16mg，0.07mmol)，室温搅拌1小时。检测原料基本转化完全，反应中加入水淬灭，甲基叔丁基醚萃取，再用1N稀盐酸洗涤，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)纯化后得7mg产物。
LC/MS(ESI)：m/z 979.68[M+H]+。
步骤3：化合物D-9的制备
冰水浴下，取1mL四氢呋喃溶解化合物D-9b(10mg，0.01mmol)，再滴加入DBU(6uL，0.04mmol)，搅拌至反应完全。反应中加入水淬灭，二氯甲烷萃取，减压浓缩，残余物经HPLC制备分离(色谱柱：Welch Xtimate C18(10*150mm*5um)；流动相：A-水(20mM NH4HCO3)：B-乙腈，梯度洗脱＝30％B至95％B)得5mg化合物D-9。
LC/MS(ESI)：m/z 757.85[M+H]+。
实施例2-10化合物D-10的合成
步骤1：化合物D-10b的制备
冰水浴下，取2mL的四氢呋喃溶解化合物D-10a(6mg，0.008mmol，根据文献Bioorg.Med.Chem.Lett.21(2011)1639-1643.合成得到)，再滴加入四氢锂铝溶液(80uL，1M在THF中，0.08mmol)，搅拌并将反应温度缓慢升至40℃。LCMS检测原料基本转化完全，反应用十水合硫酸钠淬灭，冰水浴下搅拌半小时，过滤，滤液减压浓缩得粗品，直接用于下一步反应。
LC/MS(ESI)：m/z 758.4[M+H]+。
步骤2：化合物D-10c的制备
于室温，取0.5mL的1，4-二氧六环和0.5mL的水溶解上步所得化合物D-10b，再依次加入芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(6.5mg，0.019mmol)和碳酸钠(6.8mg，0.064mmol)，室温搅拌过夜，检测原料基本转化完全。反应中加入水淬灭，乙酸乙酯萃取，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝3∶2)纯化后得14mg化合物D-10c。
LC/MS(ESI)：m/z 980.4[M+H]+。
步骤3：化合物D-10d的制备
冰水浴下，取1mL的二氯甲烷溶解上步所得化合物D-10c(14mg，0.014mmol)，再加入戴斯-马丁氧化剂(18.2mg，0.042mmol)，搅拌并允许反应缓慢升至室温，搅拌至LCMS检测原料基本转化完全。加入碳酸氢钠水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取，减压浓缩，残余物经硅胶柱层析色谱法(洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝3∶2)纯化后得8mg化合物D-10d。
LC/MS(ESI)：m/z 978.4[M+H]+。
步骤4：化合物D-10的制备
冰水浴下，取1mL的四氢呋喃溶解上步所得化合物D-10d(8mg，0.008mmol)，再滴加入DBU(6uL，0.032mmol)，搅拌1小时，TLC检测原料基本转化完全，反应中加入水淬灭，二氯甲烷萃取，减压浓缩，残余物经HPLC制备分离(色谱柱：Welch Boltimate C18 Core-Shell(4.6*50mm*2.7um)；流动相：A-水(20mM NH4HCO3)得目标产物化合物D-10(1.3mg)。
LC/MS(ESI)：m/z 755.93[M+H]+。
测试例2：体外细胞毒活性筛选
2.1.实验原理及方法
本实验利用CTG检测ATP含量，反映肿瘤细胞的存活情况。
2.2.细胞培养条件的确定
1)细胞培养：A549、SK-BR-3和MDA-MB-468细胞分别用含10％FBS(Gibco，10099-141)的Ham’s F-12K(Kaighn’s)培养基(Gibco，21127030)和McCoy′s 5A培养基(ThermoFisher，货号16600108)培养及Leibovitz′s L-15培养基(ThermoFisher，货号11415-114)进行培养。
将A549、SKBR3和MDA-MB-468用胰酶消化后，各自用培养液重悬计数，将细胞密度调整为2.2×104个/ml，在96孔板的列2至列11每孔加入135μl细胞悬液，列12为空白对照。在5％CO2的37℃培养箱中培养24h。
2)药物配制：
a)储液准备：用DMSO将待测化合物和阳性对照药物溶解，使储液浓度为5mM。
b)配药板1：起始列1将储液稀释40倍，列2至列11依次3倍梯度稀释。列12为DMSO。
c)配药板2：在列2至列11加入196ul相应培养液，从配药板1的列3至列12吸4ul至配药板2的列2到列11。混匀。
2.3.处理细胞
从配药板2吸取15ul加入上述铺好的细胞中。在5％CO2的37℃培养箱中继续培养5天。
2.4.CTG检测(Cell Titer-GloTM，发光细胞生存能力检测)：取出细胞板，平衡至室温。每孔加入75ul CTG，避光室温反应10min，酶标仪读取发光值并计算IC50。
2.5.数据结果
表6
阳性对照药物化合物E-305和化合物E1-30的结构式如下所示，其制备方法参见Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 14(2004)5551-5554中方法制备：
实施例2-11：化合物L-2的合成
冰水浴下，将化合物D-1a(9mg，0.012mmol)溶于0.3mL DMF中，加入DIPEA(3.5mg，0.028mmol)，然后分批加入化合物2(7.8mg，0.011mmol)，搅拌至反应基本完全，减压浓缩得粗品，经HPLC制备分离(色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱)得4.95mg化合物L-2，纯度97％。
LC/MS(ESI)：m/z 1374.3[M+H]+。
实施例2-12：化合物L-3的合成
步骤1：化合物4的制备
将化合物4a(1.3g，采用WO2013106717公开方法制备而得)溶于50ml乙腈中，依次加入碳酸钾(6.2g)、溴化苄(1.35ml)和四丁基碘化铵(415mg)。室温搅拌反应至基本完全，过滤，浓缩，以石油醚/乙酸乙酯为展开剂，用硅胶柱色谱法纯化得化合物4b。
将化合物4b(121mg)和4c(180mg)加入反应瓶中，加入4ml四氢呋喃。氮气氛下，冰水浴降温至0℃左右，加入叔丁醇钾(109mg，0.98mmol)，升至室温搅拌40分钟。加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合并有机相并浓缩。所得残余物溶于4mL二氧六环中，加入2mL水，加入碳酸氢钠(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室温搅拌2小时。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有机相用饱和氯化钠溶液(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。以石油醚/乙酸乙酯为展开剂，用硅胶柱色谱法纯化得到化合物4d，MS m/z(ESI)：515.0[M+1]+。
将化合物4d(20mg，0.038mmol)溶于4.5mL四氢呋喃和乙酸乙酯(V∶V＝2∶1)混合溶剂中，加入钯碳(12mg，含量10％，干型)，氢气置换三次，室温搅拌反应1小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题化合物4(13mg)，产品不经纯化直接进行下一步反应。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
步骤2：化合物DZ-1a的制备
称取化合物4(13.4mg，0.0316mmol，1.7eq)和化合物D-1a的甲磺酸盐(15mg，0.0182mmol，1eq)溶于DMF(0.5ml)中，冰浴冷却下加入三乙胺(10mg，0.0988mmol，5.4eq)、DMTMM(9.8mg，0.0332mmol，1.8eq)，反应液自然升至室温搅拌至基本完成。加入水(2ml)和乙酸乙酯(3ml)稀释分液，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经制备薄层色谱法(乙酸乙酯/石油醚)纯化得到16mg化合物DZ-1a，收率86.7％。
LC/MS(ESI)：m/z 1136.3[M+H]+。
步骤3：化合物DZ-1b的制备
在冰浴冷却下，称取上步所得化合物DZ-1a(16mg，0.0141mmol，1eq)溶于THF中(0.4ml)，加入三乙胺(4.2mg，0.057mmol，4eq)，保持冰浴下搅拌至基本完成。加入二氯甲烷(5ml)稀释，水(2ml X 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品直接用于下一步。
LC/MS(ESI)：m/z 914.3[M+H]+。
步骤4：化合物L-3的制备
称取上步所得化合物DZ-1b粗品(16mg，0.0175mmol，1eq)和化合物6(11.6mg，0.0246mmol，1.4eq，采用EP2907824中方法制备而得)溶于DMF中(0.5ml)，加入HATU(9.9mg，0.026mmol，1.5eq)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(5.5mg，0.0426mmol，2.4eq)，保持冰浴下搅拌至基本完成。加入水(2ml)和乙酸乙酯(3ml)稀释分液，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经制备HPLC(色谱柱：XBridge Prep C18OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱)纯化得到10mg化合物L-3。
LC/MS(ESI)：m/z 1368.3[M+H]+。
实施例2-13：化合物L-4的合成
步骤1：化合物DZ-2a的制备
称取化合物4(11.6mg，0.0273mmol，1.5eq)和化合物D-1(13.5mg，0.0181mmol，1eq)溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中，冰浴冷却下加入DMTMM(10.1mg，0.0343mmol，1.3eq)，搅拌至基本反应完成。加入水(2ml)和乙酸乙酯(3ml)中止和稀释反应，分液，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经制备薄层色谱法(乙酸乙酯/石油醚)纯化得到10mg，收率47.9％。
LC/MS(ESI)：m/z 1150.2[M+H]+。
步骤2：化合物DZ-2b的制备
称取上步产物化合物DZ-2a(10mg，0.0087mmol，1eq)溶于THF(1ml)中，加入DBU(1，8-二氮杂二环十一碳-7-烯)(5.2mg，0.034mmol，4eq)，冰浴下搅拌至基本反应完成。加入二氯甲烷(5ml)稀释，水(2ml X 3)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到粗品直接用于下一步。
LC/MS(ESI)：m/z 928.2[M+H]+。
步骤3：化合物L-4的制备
称取上步产物化合物DZ-2b(16mg，0.0087mmol，1eq)和化合物6(7.8mg，0.0165mmol，1.9eq)溶于DMF中(0.5ml)，加入HATU(6.2mg，0.0163mmol，1.9eq)和DIEA(5.7mg，0.0441mmol，5eq)，冰浴下搅拌至反应基本完成。加入水(2ml)和乙酸乙酯(3ml)稀释分液，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物经制备HPLC(色谱柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流动相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脱)纯化得到3.5mg化合物L-4，两步收率29.1％。
LC/MS(ESI)：m/z 1382.2[M+H]+。
实施例2-14：抗体药物偶联物ADC-1的制备
于37℃，向抗体PD3的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.9mL，60.6nmol)加入配制好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，15.2uL，152nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物L-3(0.83mg，606nmol)溶解于50ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-1的PBS缓冲液(0.76mg/mL，10mL)，于4℃冷冻储存。
十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)紫外检测方法计算平均值：k＝3.87。
实施例2-15：抗体药物偶联物ADC-2的制备
在37℃，向抗体PD3的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.14mL，77.2nmol)加入配制好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，19.3uL，193nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物L-2(0.83mg，772nmol)溶解于50ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-2的PBS缓冲液(0.71mg/mL，12mL)，于4℃冷冻储存。
CE-SDS计算平均值：k＝3.88。
实施例2-16：抗体药物偶联物ADC-3的制备
在37℃，向抗体PD3的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.9mL，60.6nmol)加入配制好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，15.2uL，152nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物L-1(0.84mg，605nmol)溶解于50ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-3的PBS缓冲液(0.77mg/mL，10.2mL)，于4℃冷冻储存。
CE-SDS计算平均值：k＝3.81。
实施例2-17：抗体药物偶联物ADC-4的制备
在37℃，向抗体PD3的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.9mL，60.6nmol)加入配制好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，15.2uL，152nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物L-4(0.84mg，608nmol)溶解于50ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-4的PBS缓冲液(0.64mg/mL，13.5mL)，于4℃冷冻储存。
CE-SDS计算平均值：k＝3.88。
实施例2-18：抗体药物偶联物ADC-5的制备
在37℃，向CD79B抗体hAb015-10的PBS缓冲水溶液(pH＝6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.0mL，67.3nmol)加入配制好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，16.8uL，168nmol)，置于水浴振荡器，于37℃振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
将化合物L-1(0.93mg，673nmol)溶解于50ul DMSO中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用Sephadex G25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：pH为6.5的0.05M的PBS缓冲水溶液，含0.001M的EDTA)，得到标题产物ADC-5的PBS缓冲液(0.68mg/mL，9.6mL)，于4℃冷冻储存。
CE-SDS计算平均值：k＝4.07。
测试例3：评价并比较ADC-5、Polivy对人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2裸小鼠皮下移植瘤的疗效。
3.1药物信息
空白组：hIgG1；
ADC-5：无色澄明液体，浓度0.68mg/mL，纯度98.00％，遮光，2-8℃密闭保存；
Polivy(polatuzumab)：无色澄明液体，浓度5.83mg/mL，纯度97.69％，遮光，2-8℃密闭保存。
3.2药物配制
均用生理盐水稀释至所需浓度。
生理盐水，规格10ml：0.09g，购自中国大冢制药有限公司。
3.3细胞
人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2细胞购自DSMZ。WSU-DLCL2细胞用10-cm培养皿培养，培养条件为RPMI 1640培养基(Gibco)中加10％胎牛血清以及青、链霉素(GIBCO，货号15070-063)，于37℃、含5％的CO2空气的培养箱中培养。一周2-3次传代，当细胞呈指数生长期时，收集细胞，计数，接种。
3.4实验动物
BALB/c-nu裸小鼠，28-35日，雌性，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。生产许可证号：SCXK(京)2019-0008，动物合格证号No.1103221911012510。饲养环境：SPF级。
3.5实验步骤
每只裸小鼠皮下接种2.0×107WSU-DLCL2细胞，待肿瘤生长至～100mm3后，根据肿瘤体积将动物分组(D0)。小鼠静脉注射(IV)给药，给药体积10mL/kg；具体给药剂量和给药方案见表3。每周测2次肿瘤体积，称小鼠体重，记录数据。
本实验动物的使用及福利遵照“国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)”的规定执行。每天监测动物的健康状况及死亡情况，例行检查包括观察受试物和药物对动物日常行为表现的影响如行为活动，体重变化，外观体征等。
3.6实验指标
实验指标为考察药物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。
每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长、宽。
T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。
当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100
如果肿瘤比起始体积缩小，即T＜T0或C＜C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。
实验结束、达到实验终点、或溶剂组平均肿瘤体积达到1500mm3，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。
3.7统计学分析
除非特别说明，两组肿瘤体积之间比较采用双尾学生t检验，P＜0.05定义为有统计学显著性差异。
3.8结果
ADC-5、Polivy(IV；D0，1mg/kg)对人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为53％和37％；荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受，没有明显体重减轻等症状发生。
表7
注：IV静脉注射
结论
抗体-药物偶联物ADC-5和Polivy(阳性对照组)对人弥漫性大B细胞淋巴瘤WSU-DLCL2裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为53％和37％，具有显著抗肿瘤活性；荷瘤小鼠对以上药物均能很好耐受。
测试例4：细胞杀伤实验
4.1实验目的
本实验的目的是为了检测本公开中的抗TROP-2抗体(PD3)-药物偶联物，对不同肿瘤细胞系：Miapaca2肿瘤细胞(人胰腺癌细胞，南京科佰，货号CBP60544)，Fadu肿瘤细胞(人鳞状细胞癌，ATCC，货号HTB-43)、SK-OV-3(人卵巢癌细胞，ATCC，货号HTB-77)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞，ATCC，货号CCL-243)、HCC827(人肺癌细胞，ATCC，货号CRL-2868)和BXPC3(人胰腺癌细胞，ATCC，货号CRL-1687)的增殖抑制活性。以不同浓度的抗体药物偶联物体外处理细胞，经6天培养后，采用CTG(Luminescent Cell ViabilityAssay，Promega，货号：G7573)试剂对细胞的增值进行检测，根据IC50值来评价抗体药物偶联物的体外活性。
4.2实验方法
1)细胞培养：MiaPaCa2、Fadu、SK-OV-3、K562、HCC827和BXPC3细胞分别用含10％FBS(Gibco，10099-141)的DMEM/高葡萄糖培养基(GE，SH30243.01)、MEM培养基(Gibco，11095080)、McCoy’S 5a培养基(Gibco，16600108)、IMDM培养基(ThermoFisher，12440061)、RPIM1640培养基(Gibco，11875119)培养。
2)细胞铺板：实验当天，细胞分别用胰酶(0.25％Trypsin-EDTA(1x)，LifeTechnologies，货号25200-072)消化后，使用相应的培养基分别将MiaPaCa2、Fadu、SK-OV-3、K562、HCC827和BXPC3制成细胞悬液，使密度为3.7×103个/mL，在96孔板(corning，货号3903)中每孔加入135uL悬液，使每孔500个细胞，于37℃，培养24h。
3)药物配制：将待测ADC的母液调整首浓度为4uM加在配药板(corning，货号3599)首列。在配药板的第2列至第9列梯度稀释5倍，第10列为PBS。每孔取15uL加入到细胞培养板中。
4)CTG检测：于37℃培养6天后，取出细胞培养板，平衡至室温。每孔加入75uL CTG，避光室温反应10min，酶标仪(BMG labtech，PHERAstar FS)读取发光值。
4.3数据分析
用Graphpad Prism 5对数据进行处理分析。结果参见下表8。
表8
编号 Miapaca K562 SKOV3 HCC827 BXPC3 Fadu
ADC-1 64.05 73.21 54.14 0.30 0.16 0.96
ADC-2 24.59 27.95 0.27 0.11 0.05 0.11
ADC-3 31.22 44.10 10.42 0.01 0.09 0.60
ADC-4 29.95 39.44 18.73 1.37 1.38 4.04
E1-30 0.45 0.39 0.17 0.31 0.23 0.32
测试例5：旁观杀伤实验
5.1实验目的
检测本公开中的抗体药物偶联物在TROP-2阳性细胞BXPC3(人原位胰腺腺癌细胞，普诺赛)和TROP-2阴性细胞MiaPaCa2(人胰腺腺癌细胞，普诺赛)共培养时，选取抗体药物偶联物在杀伤实验中对TROP-2阳性的BXPC3细胞有杀伤而对TROP-2阴性的细胞MiaPaCa2无杀伤作用的浓度5nM进行实验，考察在两者共培养的体系内抗体药物偶联物是否具有对TROP-2阴性的细胞Miapaca2的旁观杀伤作用。
5.2实验方法
1)细胞培养：MiaPaCa2和BXPC3细胞分别用10％FBS(Gibco，10099-141)的DMEM/高葡萄糖培养基(GE，SH30243.01)、RPIM1640培养基(Gibco，11875119)培养。
2)细胞铺板：实验当天，细胞分别用胰酶(0.25％Trypsin-EDTA(1x)，LifeTechnologies，货号25200-072)消化后，用新鲜RPIM1640(含10％FBS)培养基中和，1000rpm离心3min，弃上清，细胞用RPMI1640+10％FBS重悬。细胞计数后，将BXPC3细胞密度调整为6×104个/mL，将MiaPaCa2细胞密度调整为1.5×104个/mL。12孔板中板1中每孔加入500uL的BXPC3细胞和500uL的MiaPaCa2细胞。12孔板板2中加入500uL的MiaPaCa2细胞和500uL的RPMI1640+10％FBS的培养液。5％二氧化碳，37℃，培养24小时。
3)抗体药物偶联物配制：将抗体药物偶联物ADC-1、ADC-2、ADC-3和ADC-4分别用RPMI1640稀释成浓度为600nM，从中取50uL加培液100uL稀释成200nM(40X，终浓度5nM)。取25uL加入细胞培养板中。另设置PBS溶剂对照组，继续培养6天。
4)流式分析：12孔板(板1和板2)中的细胞用胰酶消化，使用新鲜培养基中和，1000rpm离心3min，弃上清，用1mL的FACS缓冲液(PBS+2.5％FBS)重悬，取20uL的细胞加入20uL的台盼蓝(Sigma，T8154-100ML)，计数。板1中的细胞，1000rpm离心3min，弃上清，用100uL的FACS缓冲液重悬，加入2uL的TROP-2(EGP-1)单克隆抗体(MR54)(ThermoFisher，货号12-6024-42)，冰上孵育30min。然后在4℃，2000rpm离心1min，加入150uL FACS缓冲液重悬细胞，重复上述操作两次。用流式细胞仪(BD，FACSVerse)检测。
5.3数据分析
用Flowjo 10.0对数据进行处理分析。
结论：所有抗体偶联物在试验中都显示旁观者效应。
测试例6：药代动力学测试
1、概述
以的比格犬为受试动物，应用LC/MS/MS法测定了比格犬静脉注射给予化合物D-1和艾日布林后不同时刻血浆中的药物浓度。研究本公开化合物在犬体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。
2、试验方案
2.1试验药品
化合物D-1和艾日布林
2.2试验动物
比格犬6只，雄性，平均分为2组，由美迪西普亚医药科技(上海)有限公司采购并进行动物给药实验。
2.3药物配制
称取化合物D-1，加5％体积的DMSO，20％PG和20％PEG400使其溶解，然后加入55％生理盐水配制成0.25mg/ml无色澄明溶液。
称取艾日布林，加5％体积的DMSO，20％PG和20％PEG400使其溶解，然后加入55％生理盐水配制成0.25mg/ml无色澄明溶液。
2.4给药
一组犬静脉注射给药化合物D-1，给药剂量均为0.5mg/kg，给药体积均为2ml/kg。
另一组犬静脉注射给药艾日布林，给药剂量均为0.5mg/kg，给药体积均为2ml/kg。
3、操作
犬注射给药化合物D-1，于给药前及给药后5分钟、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0小时采血1ml，将收集的血液样本置于EDTA-K2抗凝型采血管中，将收集到的全血放在冰上，1小时内离心分离血浆(离心力2200g，离心10min，2-8℃)。血浆样本在检测前存放于-80℃冰箱内。
犬注射给药艾日布林化合物，于给药前及给药后5分钟、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0小时采血1ml，将收集的血液样本置于EDTA-K2抗凝型采血管中，将收集到的全血放在冰上，1小时内离心分离血浆(离心力2200g，离心10min，2-8℃)。血浆样本在检测前存放于-80℃冰箱内。
测定药物注射给药后犬血浆中的待测化合物含量：取给药后各时刻的犬血浆25μl，加入内标溶液喜树碱(中国生物制品检定所)50μl(100ng/mL)和乙腈200μl，涡旋混合5分钟，离心10分钟(3700转/分钟)，血浆样品取上清液3-4μl进行LC/MS/MS(API4000三重四极杆串联质谱仪(No.2)，美国Applied Biosystems公司；Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱系统，日本Shimadzu公司。)分析。
4、药代动力学参数结果
本公开化合物的药代动力学参数如下表9所示。
表9
测试例7：ADC-2和ADC-3对人咽鳞癌FaDu细胞株BALB/c裸小鼠皮下移植瘤中的药效作用
(1)细胞培养
用于本实验的人咽鳞癌Fadu细胞株(ScienCell实验室，ml-cs-0374)在MEM培养基(添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)(GIBCO，货号10099-141)和0.1％磷酸缓冲液)中于含5％CO2的37℃培养箱中培养。接种前用3-4％异氟烷将小鼠麻醉。细胞连续培养十代之前，将5×106Fadu细胞的培养基100μL和等体积Matrigel(基底胶，solarbio)混匀后，通过皮下注射接种于小鼠背部右边靠近腋下。
(2)动物分组和给药方案
当肿瘤生长到平均约100～150mm3左右时，小鼠根据肿瘤体积和体重被随机分组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如下表10所示：
表10分组和给药方案
给药体积：动物的给药体积按照10μL/g体重进行调整
肿瘤体积：分组后每周测量肿瘤体积两次，连续4周。肿瘤体积(V)的计算方法如下：V＝(长×宽2)/2。每只小鼠相对肿瘤体积(RTV)的计算方法是：RTV＝Vt/V0，其中Vt为每次的测量体积，V0为治疗开始时的体积。
动物体重：分组后每周测量并记录老鼠体重两次。
动物状态观察：本实验中给予溶媒或测试药的动物并未出现异常现象。实验终点，部分动物出现溃疡。
(3)实验停药和恢复给药标准
在实验过程中，小鼠体重下降≥15％时，即停止给药，停药期应足够长让小鼠恢复体重。仅单只小鼠停药，其余小鼠正常给药；停药时小鼠体重恢复参照以下标准将继续实验：体重下降≤10％。
(4)实验终点.
体内实验结束，所有动物将被CO2窒息，然后脱颈椎处死。采集肿瘤，称重并拍照。体内实验结束前，已死亡的荷瘤动物将不进行样品收集。
(5)统计分析
结果将以平均值±S.E.M的方式呈现。两组间比较将用Dunnett’s multi-comparison test进行检验。如果p＜0.05则认为有统计学显著性差异，记为*，p＜0.01记为**，p＜0.001记为***。
(6)结果
体重：溶媒与不同测试药给药组的动物体重变化趋势如图1所示。动物体重随实验进程正常增长。
肿瘤体积：
实验周期内，空白溶媒组别(G1组)的动物接种分组开始给药后，肿瘤缓慢增长；直至第14天，肿瘤体积快速增加。实验第0天，G1组的肿瘤体积均值为：125.05±3.66mm3；第25天，肿瘤体积均值为：1854.48±99.50mm3。由此肿瘤体积和相对肿瘤体积实验数据，说明人咽鳞癌Fadu细胞株在BALB/c nude小鼠皮下移植瘤模型成功建立。
ADC-3高剂量(3mg/kg)组别(G2组)的动物在第0天的肿瘤体积均值为：121.40±3.18mm3；第25天，肿瘤体积均值为：721.56±169.15mm3。实验周期内，与空白溶媒组相比，ADC-3高剂量组能显著地抑制肿瘤的增长。
相对肿瘤增殖率和瘤重抑制率：
相对肿瘤增殖率(T/C％)：用于评价药物抗肿瘤活性的作用，相对肿瘤增殖率T/C(％)＝治疗组(T)RTV平均值/阴性对照组(C)RTV平均值×100％。各个时间点各组相对肿瘤增值率见表11，趋势图见图2。
表11各组各时间点相对肿瘤增值率
结论：
ADC-3组给药后，高剂量组的肿瘤体积相比模型组显著降低，低剂量组的肿瘤体积相比模型组有降低趋势，但没有统计差异。该药显示出了有剂量依赖性的抑制肿瘤生长的作用。同时，3mg/kg剂量给药，ADC-3组在25天时的体内药效优于ADC-2组，二者具有显著性差异。
虽然以上描述了本公开的具体实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方案做出多种变更或修改。因此，本公开的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (30)

1.一种抗体-药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述抗体-药物偶联物由下式表示：
其中，
Ab为抗体或其抗原结合片段，
k为1至10，
-D如下式所示：
其中R1a为C1-6烷基；R1b为氢。
2.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中R1a为甲基。
3.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗B7-H3抗体、抗c-Met抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗HER4(ErbB4)抗体、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD44抗体、抗CD56抗体、抗CD70抗体、抗CD73抗体、抗CD105抗体、抗CEA抗体、抗A33抗体、抗Cripto抗体、抗EphA2抗体、抗G250抗体、抗MUCl抗体、抗Lewis Y抗体、抗VEGFR抗体、抗GPNMB抗体、抗Integrin抗体、抗PSMA抗体、抗Tenascin-C抗体、抗SLC44A4抗体、抗CD79抗体、抗TROP-2抗体、抗CD79B抗体、抗Mesothelin抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述的抗体或其抗原结合片段选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、尼妥珠单抗、恩波妥珠单抗、依玛妥珠单抗、奥英妥珠单抗、维汀-匹那妥珠单抗、维布妥昔单抗、吉妥单抗、比伐珠单抗、莫洛伐妥单抗、cBR96和Glematumamab或其抗原结合片段。
6.根据权利要求1-4任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述的抗体选自抗CD79B抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区，
抗体重链可变区，包含：
1)分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
2)分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或抗体轻链可变区，包含：
1)分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
2)分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
7.根据权利要求6所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，包含选自以下1)至2)中的任一项：
1)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
2)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
8.根据权利要求6或7所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：3所示或与SEQ ID NO：3具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：5所示或与SEQ ID NO：5具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；
和/或轻链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO：4具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO:6所示或与SEQ ID NO：6具有至少90％、95％、98％、99％同一性的序列。
9.根据权利要求8所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗CD79B抗体或抗原结合片段的重链可变区如序列SEQ ID NO：3所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO:4所示；或重链可变区如序列SEQ ID NO：5所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO:6所示。
10.根据权利要求6-8任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗CD79B抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
重链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO：19所示或与SEQ ID NO：19具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO：21所示或与SEQ ID NO：21具有至少90％、95％、98％、或99％同一性的序列；
和/或轻链可变区，包含：
1)如SEQ ID NO:20所示或与SEQ ID NO：20具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列；或
2)如SEQ ID NO:22所示或与SEQ ID NO：22具有至少90％、95％、98％或99％同一性的序列。
11.根据权利要求10所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗CD79B抗体或抗原结合片段的重链可变区如序列SEQ ID NO：19所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO:20所示；或重链可变区如序列SEQ ID NO：21所示，轻链可变区如序列SEQ ID NO:22所示。
12.根据权利要求4所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗TROP-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含与如SEQ ID NO：29序列所示的重链可变区具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含与如SEQ ID NO：30序列所示的轻链可变区具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
13.根据权利要求12所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体选自抗TROP-2抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含序列分别如SEQID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
14.根据权利要求12或13所述的抗体-药物偶联物，其所述抗TROP-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示或与其有至少90％同一性，和所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示或与其有至少90％同一性。
15.根据权利要求12-14任一项所述的抗体-药物偶联物，其所述抗TROP-2抗体包含序列如SEQ ID NO:29所示的重链可变区和序列如SEQ ID NO：30所示的轻链可变区。
16.根据权利要求12-15任一项所述的抗体-药物偶联物，其所述抗TROP-2抗体包含抗体重链恒定区和轻链恒定区；所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体。
17.根据权利要求16所述的抗体-药物偶联物，所述抗TROP-2抗体包含序列如SEQ IDNO:31所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO:32所示的轻链恒定区。
18.根据权利要求12-17任一项所述的抗体-药物偶联物，其所述抗TROP-2抗体包含序列如SEQ ID NO:33所示的重链和序列如SEQ ID NO：34所示的轻链。
19.根据权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其选自以下结构式：
其中：k选自1至10，可以为整数，也可以为小数。
20.根据权利要求19所述的抗体-药物偶联物，其中D中R1a选自甲基，R1b选自氢。
21.式D所示的化合物或其可药用的盐，
其中，R1a选自C1-6烷基；R1b为氢。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中R1a选自甲基。
23.式DZ所示的化合物或其可药用的盐，
其中，R1a选自C1-6烷基；
R1b为氢；
Y为-O(CRaRb)m2-CR8R9-C(O)-，其中Ra和Rb均为氢；
R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基；
R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基；
或者R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
m2选自0、1、2或3。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中R1a选自甲基。
25.根据权利要求23所述的式DZ所示的化合物或其可药用的盐，其为式DZ-1所示的化合物或其可药用的盐：
其中，R8选自氢、C3-6环烷基烷基或C3-6环烷基；R9选自氢、卤代烷基或C3-6环烷基；或者，R8和R9与其相连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；m2选自0、1、2或3。
26.根据权利要求23-25任一项所述的式DZ所示的化合物或其可药用的盐，其选自：
27.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至20任一项所述的抗体-药物偶联物，以及药学上可接受的药用载体、稀释剂或赋形剂。
28.根据权利要求1至20任一项所述的抗体-药物偶联物或权利要求27所述药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述肿瘤为与HER2、HER3、B7H3或EGFR表达相关的癌症。
30.根据权利要求1至20任一项所述的抗体-药物偶联物或权利要求27所述药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、白血病、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
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