KR20240155298A

KR20240155298A - Fc 함유 분자의 제조 방법

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Publication number: KR20240155298A
Application number: KR1020247031892A
Authority: KR
Inventors: 히로시 무토; 미츠히로 이와모토; 시오리 아라카와; 유타 사카이; 가오리 나라; 요시후미 다나카; 유키 나카타니
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2023-03-01
Publication date: 2024-10-28
Also published as: TW202346322A; EP4488378A1; WO2023167238A1; JPWO2023167238A1; CN118804983A; AU2023229142A1; IL315341A

Abstract

(과제) 가능한 한 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조하는 방법으로서, 잔존 가수분해 활성이나 효소종에 관계없이 폭넓은 선택지로부터 사용하는 효소를 자유롭게 선택할 수 있는 방법을 확립하는 것 등.
(해결 수단) 본 명세서에서 상세하게 서술한 공정 1 및 2 를 조합하는 것을 특징으로 하는, 소기의 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 신규 제조 방법을 제공하는 것 등.

Description

Fc 함유 분자의 제조 방법

본 발명은, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 제조 방법, 당해 제조 방법에 있어서 바람직하게 사용되는 신규 당사슬 도너 분자, 및 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법 등에 관한 것이다.

항체는, 중사슬 분자 중의 Fc 영역에 위치하는 297 번째의 Asn 측사슬에 결합한 N 결합형 당사슬 (N297 결합 당사슬) 을 갖는 당단백 분자이다. 항체는, 기초 연구나 의료 분야에 있어서 중요한 분자이며, 특히 항체 의약으로서의 연구 개발이 활발히 진행되고 있어, 당사슬의 다양한 영향이 밝혀지고 있다 (비특허문헌 1). 현재 주로 사용되고 있는 의료용 항체는, IgG 클래스의 분자이며, 이러한 항체는, 일반적으로 CHO 세포나 NS0 세포로 대표되는 배양 동물 세포를 이용하여 산생된다. 이들 동물 세포에서 산생되는 항체의 N297 결합 당사슬은 biantennary 복합형 당사슬이지만, 코어 푸코오스나 말단의 시알기나 갈락토실기, 그리고 bisecting GlcNAc 에 있어서 불균일하다 (비특허문헌 2). 항체의 N297 결합 당사슬이, ADCC 활성 (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) 이나 CDC 활성 (Complement-Dependent Cytotoxicity) 을 포함하는 이펙터 활성에 크게 영향을 주는 것이 밝혀져 있고 (비특허문헌 3, 비특허문헌 4), 혈중 반감기에도 영향을 미칠 가능성이 지적되고 있다 (비특허문헌 5). 또, N297 결합 당사슬의 비환원 말단이 2,6-sialyl 화된 항체가 IVIG (intravenous immunoglobulin) 에 있어서의 주요 약효 성분인 것이 밝혀져 있다 (비특허문헌 6). 또한, 최근, 화학 수식한 당사슬을 링커로 한 항체 약물 복합체나 펩티드-Fc 복합체가 개발되어 있다 (특허문헌 1 ∼ 4, 비특허문헌 7 ∼ 9).

의료용의 항체나 항체 Fc 영역을 포함하는 당단백 분자에 부가하는 당사슬을 균일하게 하는 방법으로는, 효소를 사용한 당사슬 전이 반응이 알려져 있다 (비특허문헌 10 ∼ 12). 당사슬 전이 반응에는, 단독의 ENGase 를 사용하여 환원 말단을 옥사졸린화한 당사슬을 GlcNAc (N-아세틸글루코사민) 억셉터로 전이하는 방법 (특허문헌 5 ∼ 6, 비특허문헌 10 ∼ 11) 과, 2 종류의 ENGase 를 사용하여 당사슬을 GlcNAc 억셉터로 직접 전이하는 원 포트법이 알려져 있다 (비특허문헌 12, 특허문헌 1).

지금까지, 전자의 옥사졸린체 (환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬 도너 분자) 를 이용하는 당사슬 전이 반응이 널리 이용되어 왔다. 그러나, 수용액 중에서 불안정한 옥사졸린체를 당사슬 도너 분자에 사용하는 경우, 그 불안정성으로부터 효소 비개재형의 화학 반응인 항체 Lys 로의 당화 반응 (Glycation) 이 진행되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 7, 9). 이것을 해결하는 하나의 방법으로서, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자를 이용하는 방법인 원 포트법이 제안되었다. 그러나, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 취득하기 위해서는, 대량의 당사슬 도너 분자 사용량, 100 당량 내지 300 당량이 필요해졌다 (특허문헌 1, 비특허문헌 12). 또한, 이 원 포트법에서 사용되는 ENGase 로는, Endo-S 변이 효소와, Endo-M 변이 효소 혹은 Endo-CC 변이주의 2 종류의 효소의 조합이 알려져 있지만, 당사슬 도너 분자 사용량을 삭감하면, 당사슬 전이율이 낮아지는 것도 확인되었다.

균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 의료 용도로 이용하는 경우에는, 그 제조 비용을 억제하기 위해 고액의 원료인 당사슬 도너 분자의 사용량이 저감되어 있는 것이 바람직하다. 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 사용하여 Fc 함유 분자의 당사슬을 균일하게 하는 방법에 있어서, 당사슬 전이 반응의 효율을 개선하고, 보다 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 얻기 위해서는, 가수분해 활성이 억제된 당사슬 전이 효소를 탐색하는 어프로치를 생각할 수 있다. 한편, 원 포트법에 있어서, 이미 가수분해 활성이 억제된 변이 효소가 선택되어 있던 경우, 동일한 어프로치로 당사슬 도너 분자의 사용량을 저감하는 것은 매우 장벽이 높다. 또, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제는, 유래가 된 생물종마다 상이한 기질 특이성을 가지고 있어, 목적에 따라 구분하여 사용할 필요가 있기 때문에, 동 어프로치의 경우, 가수분해 활성의 억제 정도에 따라 사용할 수 있는 효소의 조합이 한정되어 버린다. 이 때문에, 잔존 가수분해 활성이나 효소종에 관계없이, 폭넓은 선택지로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 자유롭게 선택하면서, 보다 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 얻는 방법이 요망되고 있었다.

국제공개 2018/003983호 국제공개 2018/090045호 국제공개 2019/065964호 국제공개 2020/050406호 국제공개 2017/124084호 국제공개 2018/039373호

Arnold JN, et al., Annu Rev Immunol. 2007, 25, 21-50 Jefferis R, Biotechnol Prog. 2005, 21, 11-16 Nimmerjahn F, et al., Nat Rev Immunol. 2008, 8, 34-47 Jefferis R, Nat Rev Drug Discov. 2009, 8, 226-234 Bumbaca D, et al., AAPS J. 2012, 14, 554-558 Anthony RM, et al., Science. 2008, 320, 373-376 Parsons TB,, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016, 55, 2361-2367 Iwamoto M, et al., Bioconjugate Chem. 2018, 29, 2829-2837 Manabe S, et al., Bioconjugate Chem. 2019, 30, 1343-1355 Wang LX, Trends Glycosci Glycotechnol. 2011, 23, 33-52 Huang W, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 12308-12318 Iwamoto M, et al., PLoS ONE 2018, 13, e0193534

본 발명은, 가능한 한 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조하는 방법으로서, 잔존 가수분해 활성이나 효소종에 관계없이 폭넓은 선택지로부터 사용하는 효소를 자유롭게 선택할 수 있는 방법을 확립하는 것이나, 당해 방법에 있어서 바람직하게 사용할 수 있는 신규 당사슬 도너 분자를 제공하는 것, 및 이와 같은 Fc 함유 분자를 선택적으로 단리하는 방법을 확립하는 것 등을 목적으로 한다.

발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 당사슬 전이 반응에서 사용하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (원 포트법에 있어서는, 2 개 이상의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제의 조합) 에 관계없이, 적은 당사슬 도너 분자 사용량이라도 중간 정도 이상의 당사슬 전이율을 갖는 Fc 함유 분자가 얻어지는 반응 조건을 설정할 수 있는 것, 및 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 당사슬 전이 반응 혼합액을 접촉시킴으로써, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자와 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 를 단리할 수 있고, 결과적으로, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 양호한 수율로 회수할 수 있는 것을 알아내었다. 이 지견을 살려, 가능한 한 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 취득하는 제조법을 알아내고, 또한, 이 제조법이면, 원 포트법에 있어서, 폭넓은 선택지로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제의 조합을 선택할 수 있는 것, 또한, 그것들 중 특정한 조합의 효소를 이용한 당사슬 전이 반응에 적합한 신규의 당사슬 도너 분자를 알아내고, 또한, 상기 서술한 산성 조건하에서의 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체를 이용한 단리 공정이, Fc 함유 분자의 제조법뿐만 아니라, 단지, 소기의 Fc 함유 분자의 단리에도 적용할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은, 이하의 발명을 제공한다.

[1]

이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 제조 방법 :

[공정 1] N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와, 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정,

[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는 공정.

[2]

당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는, [1] 에 기재된 방법.

[3]

공정 1 이, 억셉터 분자와 당사슬 도너 분자를, 효소-A 및 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정인, [2] 에 기재된 방법.

[4]

당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 가, 효소-A 의 존재하, 당사슬 도너 분자에 작용함으로써, 효소-A 에 의한 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬의 억셉터 분자로의 당사슬 전이 반응을 촉진하는 성질을 갖는 효소인, [3] 에 기재된 방법.

[5]

효소-B 가, SGP 로부터 GlcNAc 유도체로의 당사슬 전이 활성을 갖는 효소인, [3] 또는 [4] 에 기재된 방법.

[6]

효소-B 가, Endo-M, Endo-Om, Endo-CC, 또는 Endo-Rp 의 변이 효소이며, 당해 변이 효소는 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는, [3] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[7]

효소-B 가, Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172G, Endo-Rp N172I, Endo-Rp N172L, Endo-Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, Endo-Rp N172V, Endo-Rp W278F/S216V, Endo-Rp W278F/N246D, Endo-Rp W278F/D276N, Endo-Rp W278F/A310D, Endo-Rp W278F/N172D/F307Y, Endo-Rp W278F/N172D/F307H, Endo-Rp W278F/N172D/A310D, Endo-Rp W214F/F307Y/L306I, Endo-M N175Q, Endo-M N175Q/Y217F, Endo-CC N180H 및 Endo-Om N194Q 로 이루어지는 군에서 선택되는, [3] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[8]

효소-A 와 효소-B 가 융합되어 있는, [3] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[9]

공정 1 에 있어서, 억셉터 분자 1 당량에 대하여 2 당량 내지 40 당량의 당사슬 도너 분자가 사용되는, [1] ∼ [8] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[10]

공정 1 에 있어서, 당사슬 전이율이 80 ％ 를 초과하는, [1] ∼ [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[11]

당사슬 도너 분자가 갖는 당사슬이, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 N-결합형 당사슬 또는 O-결합형 당사슬인, [1] ∼ [10] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[12]

당사슬 도너 분자가, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 SGP, AG(9)-P, AG(7)-P, SG-Asn, AG(9)-Asn, AG(7)-Asn, SG-OR, AG(9)-OR, AG(7)-OR, (MSG1)-Asn, (MSG2)-Asn, (MSG1)-Asn 과 (MSG2)-Asn 의 혼합물, MSG1-OR, MSG2-OR, 또는 MSG1-OR 과 MSG2-OR 의 혼합물이며, 식 중, R 은, 적어도 하나의 탄소 원자를 개재하여 산소 원자에 연결하는 임의의 치환기인, [11] 에 기재된 방법.

[13]

R 이, C1 ∼ C6 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 아릴기를 나타내는, [12] 에 기재된 방법.

[14]

R 이, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 및 n-헥실기로 이루어지는 군에서 선택되거나, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 또는 할로겐기로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 벤질기, 인데닐기, 나프틸기, 플루오레닐기, 안트라닐기, 및 페난트레닐기로 이루어지는 군에서 선택되는, [13] 에 기재된 방법.

[15]

R 이, PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe 및 A-PEG-N₃ (A 는 글리콜산 유닛 중의 아세틸기, 즉, 아노머 수산기와, Mor 또는 PEG 중의 아미노기 사이에 놓인 부분을 나타낸다) 으로 이루어지는 군에서 선택되는, [12] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[16]

당사슬 도너 분자가, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-P-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃ 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃ 의 혼합물인 [11] 또는 [12] 에 기재된 방법.

[17]

당사슬 도너 분자가, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR 의 혼합물인, [12] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[18]

당사슬 도너 분자가, 이하의 식 :

[화학식 1]

로 이루어지는 군에서 선택되는 식에 의해 나타내는 화합물인, [11] ∼ [17] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[19]

Fc 함유 분자가, 면역 글로불린, CLCH 또는 Fc 함유 단편인, [1] ∼ [18] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[20]

N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 가, Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는, 가수분해 활성이 잔류하고 있어도 되는 효소인, [1] ∼ [19] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[21]

효소-A 가, Endo-S, Endo-S2, Endo-Si, Endo-Se, Endo-Sd, 또는 Endo-Sz 의 변이 효소이며, 당해 변이 효소는 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는, [1] ∼ [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[22]

효소-A 가, Endo-S D233Q, Endo-S D233Q/Q303L, Endo-S D233Q/E350A, Endo-S D233Q/E350Q, Endo-S D233Q/E350D, Endo-S D233Q/E350N, Endo-S D233Q/D405A, Endo-Si D241Q, Endo-Si D241Q/Q311L, Endo-Si D241Q/E360Q, Endo-Si D241M, Endo-Si D241M/Q311L, Endo-Si D241M/E360Q, Endo-Si T190Q, Endo-Si T190/D241Q, Endo-Si T190Q/D241M, Endo-S2 D184M, Endo-S2 T138Q, Endo-S2 D184Q/Q250L, Endo-S2 D184M/Q250L, Endo-Se D233M, Endo-Sz D234M, Endo-Sz D234M/Q304L, Endo-Si D241X₁ (X₁ 은, K, R 및 D 이외의 어느 것의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si T190X₂ (X₂ 는, F, H, K, M, Q, R, W 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si Q311X₃ (X₃ 은, F, N, 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), 또는 Endo-Si E360K 인, [21] 에 기재된 방법.

[23]

공정 1 의 반응계 내 pH 가 6.5 내지 8.0 의 범위인, [1] ∼ [22] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[24]

공정 1 의 반응계 내 최종 억셉터 분자 농도가, 20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하인, [1] ∼ [23] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[25]

양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체의 통과 획분에, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는, [1] ∼ [24] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[26]

공정 2 에 있어서의 산성 조건이 pH 3.5 내지 4.5 의 범위를 의미하는, [1] ∼ [25] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[27]

크로마토그래피 매체가 입자상, 멤브레인상, 또는 모노리스상인, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[28]

크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, [1] ∼ [27] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[29]

당사슬이, 아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기로 화학 수식되어 있는 비환원 말단을 갖고, 당해 방법이, 추가로, 당해 당사슬의 아지드기 (N₃-) 에, 알킨 구조를 갖는 분자를 반응시키는 공정을 포함하는, [1] ∼ [28] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[30]

알킨 구조를 갖는 분자가, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 부활화제, 독소, 광감수성 물질, 항균제, 항바이러스제, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산 분자, 핵산, 항원, 비타민 및 호르몬에서 선택되는, [29] 에 기재된 방법.

[31]

화학 요법제가, 캄토테신, 피롤로벤조디아제핀, 독소루비신, 오리스타틴, 탁산 및 이들의 유도체에서 선택되는, [30] 에 기재된 방법.

[32]

면역 부활화제가, STING 아고니스트, TLR 아고니스트 및 A2AR 안타고니스트에서 선택되는, [30] 에 기재된 방법.

[33]

알킨 구조를 갖는 분자가, (A) ∼ (E) 로 이루어지는 군에서 선택되는, [29] ∼ [32] 중 어느 한 항에 기재된 방법 ;

(A) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드,

(B) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드,

(C) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드,

(D) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드, 그리고

(E) (비스(N,N-디에틸에탄아미늄)N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ⁵,10λ⁵-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드.

[34]

[1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된, Fc 함유 분자.

[35]

N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법으로서, 상기 Fc 함유 분자와 1 개 이상의 불순물을 포함하는 용액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 불순물을 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키는 공정, 또는 상기 Fc 함유 분자를 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키는 공정을 포함하는, 상기 방법.

[36]

N297 결합 당사슬이 복합형 당사슬을 포함하는, [35] 에 기재된 방법.

[37]

N297 결합 당사슬이, 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 가 아니고, 및 상기 1 개 이상의 불순물이, N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 것 이외에는 상기 Fc 함유 분자와 동일한 분자를 포함하는, [35] 또는 [36] 에 기재된 방법.

[38]

크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, [35] ∼ [37] 중 어느 한 항에 기재된 방법.

[39]

이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법 :

[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 단리하는 공정.

[40]

크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, [39] 에 기재된 방법.

[41]

N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자가, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 CDH6 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 ENPP3 항체, 항 CD47 항체, 항 EGFR 항체, 항 GPR20 항체, 및 항 DR5 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 항체에서 유래하는, [1] ∼ [40] 중 어느 한 항에 기재된 방법 또는 Fc 함유 분자.

[42]

이하의 식 :

[화학식 2]

로 이루어지는 군에서 선택되는 식에 의해 나타내는 화합물.

[43]

효소-A 와 효소-B 의 융합 단백으로서,

효소-A 는, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제이며,

효소-B 는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자의 당사슬을 기질로 하지만, 상기 N297 결합 당사슬을 기질로 하지 않거나, 또는, 상기 N297 결합 당사슬에 대한 반응성이 낮은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제인, 융합 단백.

본 발명에 있어서의 제조 방법에서는, 산성 조건하에서의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자와 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 를 분리할 수 있기 때문에, 가능한 한 적은 당사슬 도너 분자 사용량으로 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조하는 것이 가능해진다. 또한, 특히, 본 발명에 있어서의 제조 방법을 원 포트법에 적용하는 경우, 상기의 단리 공정에서, 소기의 Fc 함유 분자의 순도를 높일 수 있기 때문에, 당사슬 전이 반응 그 자체의 효율을 극도로 높일 필요가 없어지고, 결과적으로, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬에 대하여 당사슬 전이 활성을 나타내는 효소-A 와, 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬을 활성화하는 성질을 나타내는 효소-B 를, 폭넓은 선택지로부터 자유롭게 선택하는 것이 가능해진다. 요컨대, 효소의 생산성 및 물성이라는 시점에서, 대량 제조 프로세스에 적합한 효소를 자유롭게 설정하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 제조 방법을 원 포트법에 적용하는 경우, 당사슬 도너 분자로서, 화학적으로 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 N-결합형 당사슬, 또는 O-결합형 당사슬 중에서 자유롭게 선택하는 것이 가능해진다. 즉, 화학적으로 환원 말단이 활성화되어 있는 옥사졸린체를 당사슬 도너 분자로서 설정하는 경우와 달리, 중성 부근의 수용액 중에서 자연 분해되지 않고, Fc 함유 분자 중의 Lys 와 직접 화학 결합을 형성하지 않는, 화학적으로 안정된 구조를 갖는 당사슬 도너 분자를 설정하는 것이 가능해진다.

이상으로부터, 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를, 효율적으로 취득하기 위한 당사슬 도너 분자 필요량의 삭감이 가능해져, 당사슬 리모델링된 Fc 함유 분자의 제조 비용의 저감으로 이어진다.

또한, 본 발명의 일 양태에서는, 원 포트법에 있어서의 당사슬 전이 반응, 특히, 특정한 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제의 조합을 이용한 당사슬 전이 반응에 적합한 신규의 당사슬 도너 분자가 제공되고, 또한, 본 발명의 다른 일 양태에서는, 소기의 Fc 함유 분자를 불순물로부터 단리하는 것을 포함하는, 신규 단리 방법이 제공된다.

도 1 은 억셉터 분자 ((Fucα1,6)GlcNAc-㎃b), 당사슬 도너 분자 (X-SG-Z), 효소-A, 및 효소-B 를 혼합한 원 포트 반응에 있어서의, 당사슬 전이 반응의 모식도이다.
도 2 는 당사슬 도너 분자 대표예의 구조식 일람이다.
도 3 은 당사슬 도너 분자, 및 G-1, G-3 혹은 G-4 중 어느 것을 사용한 경우의 당사슬 전이 반응의 모식도이다.
도 4 는 당사슬 도너 분자, 및 G-1 내지 G-17 중 어느 것을 사용한 경우의 당사슬 전이 반응의 모식도이다.
도 5 는 원 포트 반응의 경합 반응이 되는 가수분해 반응의 모식도이다.
도 6 은 효소-A 를 사용한 mAb2 의 가수분해 활성 반응의 모식도이다.
도 7 은 야생형 Endo-S 의 아미노산 서열 (서열 번호 69) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 8 은 야생형 Endo-S2 의 아미노산 서열 (서열 번호 70) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 9 는 야생형 Endo-Si 의 아미노산 서열 (서열 번호 71) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 10 은 야생형 Endo-M 의 아미노산 서열 (서열 번호 72) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 11 은 야생형 Endo-Rp 의 아미노산 서열 (서열 번호 73) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 12 는 야생형 Endo-CC 의 아미노산 서열 (서열 번호 74) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 13 은 야생형 Endo-Om 의 아미노산 서열 (서열 번호 75) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 14 는 항 CD70 항체 1 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 항 CD70 항체 1 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다.
도 15 는 항 CD70 항체 2 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 항 CD70 항체 2 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 나타낸다.
도 16 은 항 TROP2 항체 1 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 5) 및 항 TROP2 항체 1 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 나타낸다.
도 17 은 항 TROP2 항체 2 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 7) 및 항 TROP2 항체 2 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다.
도 18 은 항 EGFR 항체 1 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 9) 및 항 EGFR 항체 1 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다.
도 19 는 항 EGFR 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 항 EGFR 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타낸다.
도 20 은 항 CD70 항체 1 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 13), 항 CD70 항체 1 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 14), 항 CD70 항체 1 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 15), 항 CD70 항체 1 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 16), 항 CD70 항체 1 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 17), 및 항 CD70 항체 1 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 21 은 항 CD70 항체 2 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 19), 항 CD70 항체 2 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 20), 항 CD70 항체 2 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 21), 항 CD70 항체 2 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 22), 항 CD70 항체 2 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 23), 및 항 CD70 항체 2 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 24) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 22 는 항 TROP2 항체 1 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 25), 항 TROP2 항체 1 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 26), 항 TROP2 항체 1 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 27), 항 TROP2 항체 1 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 28), 항 TROP2 항체 1 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 29), 및 항 TROP2 항체 1 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 23 은 항 TROP2 항체 2 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 31), 항 TROP2 항체 2 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 32), 항 TROP2 항체 2 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 33), 항 TROP2 항체 2 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 34), 항 TROP2 항체 2 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 35), 및 항 TROP2 항체 2 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 36) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 24 는 항 EGFR 항체 1 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 37), 항 EGFR 항체 1 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 38), 항 EGFR 항체 1 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 39), 항 EGFR 항체 1 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 40), 항 EGFR 항체 1 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 41), 및 항 EGFR 항체 1 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 42) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 25 는 항 EGFR 항체 2 의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 43), 항 EGFR 항체 2 의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 44), 항 EGFR 항체 2 의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 45), 항 EGFR 항체 2 의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 46), 항 EGFR 항체 2 의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 47), 및 항 EGFR 항체 2 의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 48) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 26 은 트라스투주맙 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 49) 및 트라스투주맙 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 50) 을 나타낸다.
도 27 은 개변 HER2 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 49) 및 개변 HER2 항체의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 51) 을 나타낸다.
도 28 은 퍼투주맙 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 퍼투주맙 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 53) 을 나타낸다.
도 29 는 개변 HER2 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 개변 HER2 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 54) 을 나타낸다.
도 30 은 항 CDH6 항체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 55) 및 항 CD33 항체의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 56) 을 나타낸다.
도 31 은 퍼투주맙의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 57), 퍼투주맙의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 58), 퍼투주맙의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 59), 퍼투주맙의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 60), 퍼투주맙의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 61), 및 퍼투주맙의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 62) 을 나타낸다. CDR 서열은 IMGT 의 정의에 의해 결정하였다.
도 32 는 항 CDH6 항체의 CDRL1 아미노산 서열 (서열 번호 63), 항 CDH6 항체의 CDRL2 아미노산 서열 (서열 번호 64), 항 CDH6 항체의 CDRL3 아미노산 서열 (서열 번호 65), 항 CDH6 항체의 CDRH1 아미노산 서열 (서열 번호 66), 항 CDH6 항체의 CDRH2 아미노산 서열 (서열 번호 67), 및 항 CDH6 항체의 CDRH3 아미노산 서열 (서열 번호 68) 을 나타낸다. CDR 서열은 Kabat 의 정의에 의해 결정하였다.
도 33 은 야생형 Endo-Sd 의 아미노산 서열 (서열 번호 76) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 34 는 야생형 Endo-Sz 의 아미노산 서열 (서열 번호 77) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 35 는 야생형 Endo-Se 의 아미노산 서열 (서열 번호 78) 이다. 효소의 촉매 활성 중심 부위에 상당하는 아미노산 잔기를 볼드체 밑줄, 실시예에서 사용한 변이 효소에 있어서 치환한 아미노산 잔기, 또는 변이를 가함으로써 효소 활성을 제어할 수 있는 것을 기대할 수 있는 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내었다.
도 36 은 서열 번호 79 의 서열 ([Endo-Si D241Q/Q311L]-[Endo-Rp N172V] 의 융합 단백질) 을 나타내는 도면이다. 실시예에서 기재한 융합 단백질에 있어서 치환된 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내고, 아미노산 링커 서열을 밑줄로 나타내었다.
도 37 은 서열 번호 80 의 서열 ([Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L] 의 융합 단백질) 을 나타내는 도면이다. 실시예에서 사용한 융합 단백질에 있어서 치환된 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내고, 아미노산 링커 서열을 밑줄로 나타내었다.
도 38 은 서열 번호 81 의 서열 ([Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L] 의 융합 단백질) 을 나타내는 도면이다. 실시예에서 사용한 융합 단백질에 있어서 치환된 아미노산 잔기를 볼드체로 나타내고, 아미노산 링커 서열을 밑줄로 나타내었다.

이하에 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서에 있어서, 분자 중에 포함되는 아미노산의 표기법은, 본 분야의 관례에 따라, 변이 개소를 나타내는 경우에는 야생형의 아미노산의 한 글자 표기와 그 번호 (예를 들면, 241 번째의 Asp 이면 「D241」) 에 의해 나타낸다. 또한, 변이에 대해서는, 야생형의 아미노산의 한 글자 표기, 그 번호 및 변이 후의 아미노산의 한 글자 표기 (예를 들면, 241 번째의 Asp 가 Gln 으로 치환된 변이는 「D241Q」) 에 의해 나타낸다. 또한, 변이를 갖는 특정 변이체는, 분자명과 변이 (예를 들어, Endo-Si 의 241 번째 Asp 가 Gln 으로 치환된 변이체는 「Endo-Si D241Q」) 에 의해 나타내고, 복수의 변이를 갖는 경우에는, 변이의 사이를 「/」로 구획하는 형태 (예를 들어, Endo-Si D241Q 에 있어서, 311 번째의 Gln 이 Leu 로 치환된 추가 변이를 갖는 변이체는, 「Endo-Si D241Q/Q311L」) 로 나타낸다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 제조 방법이 제공된다.

[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는 공정.

＜N297 결합 당사슬＞

본 발명에 있어서, 「N297 결합 당사슬」이란, IgG 중사슬의 297 번째의 Asn 의 측사슬에 결합하고 있는 상태의 N 결합형 당사슬을 의미하고, 또한, 임의의 수법으로 IgG 중사슬의 N 결합형 당사슬의 부가 위치를 변경한 경우에도, N 결합형 당사슬이 효소-A 의 작용을 받는 한 N297 결합 당사슬에 포함되는 것으로 한다. 예를 들면, 본 발명의 일 양태에 있어서, IgG 중사슬을 단편화한 경우, 당해 Asn 을 포함하는 펩티드 단편에 있어서, 대응하는 Asn 에 결합하고 있는 상태의 당사슬이어도, N297 결합 당사슬에 포함된다. 통상, 동물 등에서 산생된 IgG 에 있어서의 N297 결합 당사슬은, 하기 식 (I) 또는 (II) 의 구조로 이루어지는 기본 구조를 가지고 있고, 그 비환원 말단은, 추가로 화학 수식되어 있어도 되고, 예를 들면 Gal 이나 시알산이 부가되어 있어도 된다.

[화학식 3]

[화학식 4]

세포가 산생하는 IgG 의 N297 결합 당사슬의 대부분은, 이 기본 구조에 있어서, 그 환원 말단의 GlcNAc (코어 GlcNAc), 비환원 말단, 분기당 등에 있어서 추가로 당사슬이 결합한 것을 포함하는, 당사슬 구조의 다양성을 가지고 있다. N297 결합 당사슬은, 코어 GlcNAc 의 6 위치에 푸코오스 (Fuc) 가 α1,6 결합한 코어 푸코오스를 갖는 구조 ((Fucα1,6)GlcNAc) 를 갖고 있어도 된다. 분기당인 Man 에 있어서는, 그 5 위치에 추가로 GlcNAc 를 포함하는 당사슬이 결합한 3 분기형의 당사슬을 형성하고 있는 경우도 있다. 비환원 말단의 GlcNAc 에 있어서는, 갈락토오스 (Gal) 나 시알산 (Sia) 을 포함하는 당사슬이 추가로 결합되어 있는 경우도 있다.

＜당사슬 도너 분자＞

본 발명에 있어서, 「당사슬 도너 분자」(「당사슬 공여체」라고도 한다) 란, 억셉터 분자에 당사슬을 공여하는 분자를 의미한다.

신약 개발을 목적으로 한 당사슬 리모델링에 이용하는 경우, 인간에게 적용했을 때에 문제가 적은 인간형 당사슬, 또는 인간 적합형 당사슬을 갖는 당사슬 도너 분자를 채용하는 것이 바람직하다. 이러한 당사슬은, 인간의 체내에서 항원성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있는 당사슬이며, N-결합형 당사슬에서는, 하이 만노오스형, 혼성 (하이브리드) 형, 복합 (컴플렉스) 형 등이 알려져 있다. 이들 3 개에는 공통의 기본 구조가 있다. 하이 만노오스형은, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기된 2 개의 분기사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 에, 복수의 만노오스가 연속된 만노오스 리치 구조를 갖는 당사슬이다. 혼성형이란, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기된 2 개의 분기사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 중 일방이 GlcNAc 를 갖는 구조로 된 것이다. 복합형이란, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기된 2 개의 분기사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 에 GlcNAc 를 갖는 구조로 된 것이며, 갈락토오스의 유무, 시알산의 유무, 또한 이들의 결합 이성이나 위치 이성을 포함하는 다채로운 구조를 갖는 것이다. 복합형 당사슬로는 2 분기형, 3 분기형 또는 4 분기형의 것이 알려져 있다.

이하에, 하이 만노오스형, 혼성형 및 복합형의 구조의 예를 나타낸다. 또한, 이들 공통의 기본 구조를, 점선 사각으로 나타낸다 (점선 사각 내에는, β 만노오스의 4 위치에 도입된 GlcNAc (바이섹팅 GlcNAc) 를 포함하는 구조와, 포함하지 않는 구조가 혼재하지만, 본 명세서에 있어서는, 모두 공통의 기본 구조를 가리키는 것으로 한다).

[화학식 5]

본 발명에 있어서, 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬 부분은, 하이 만노오스형 당사슬, 혼성형 당사슬 및 복합형 당사슬 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 하이 만노오스형 당사슬 또는 복합형 당사슬이며, 특히 바람직하게는 복합형 당사슬이다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자는 복합형 당사슬을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 복합형 당사슬은, 2 분기형, 3 분기형 또는 4 분기형 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, 본 발명의 당사슬 도너 분자는, 2 분기형의 복합형 당사슬을 포함한다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명에 있어서의 당사슬 도너 분자는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자, 또는 당사슬의 환원 말단이 활성화된 GlcNAc (예를 들면, 옥사졸린화된 GlcNAc) 를 갖는 당사슬 함유 분자이다. 본 명세서에 있어서, 화학적인 수법으로 합성된 당사슬 도너 분자의 환원 말단의 활성화란, 당사슬 도너 분자의 환원 말단의 아노머 위치의 반응성이 화학적으로 높아진 상태를 가리키고, 전형적으로는, 당해 아노머 위치가 옥사졸린화 또는 할로겐화되어 있는 상태를 가리킨다. 즉, 활성화된 당사슬 도너 분자 단독으로 단리 정제가 가능한 상태를 가리킨다.

한편, 효소-B 가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자에 작용함으로써, 효소-A 가, 당해 당사슬 도너 분자를 소기의 당사슬 전이 반응에 이용 가능한 상태로 하는 활성화란, 당사슬 도너 분자의 환원 말단의 아노머 위치의 반응성이 효소학적으로 높아진 상태를 가리킨다. 즉, 활성화 중간체가 생성되는 것을 의미하고, 활성화된 당사슬 도너 분자 단독으로는 단리 정제가 불가능한 상태를 가리킨다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자이며, 바람직하게는 SGP, (SG-)Asn, (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn 혹은 (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn 의 혼합물을 들 수 있다. 이들 당사슬 부분은, N-결합형 당사슬의 대표이며, 이하의 구조식 및 서열식으로 나타내는 구조로 이루어지는 시알릴 글리칸 (Sialyl Glycan, 이하, 「SG」라 한다) 을 포함한다. 환원 말단측 당사슬의 결합 양식을 N-결합형으로부터 O-결합형으로 변경해도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 특별한 기재가 없는 한, 아미노산의 측사슬에 있어서 당사슬과 연결한 경우의 부분 구조는, 측사슬 부분을 괄호로 표시하고, 상기와 같이, 예를 들면, 「(SG-)Asn」과 같이 표기하는 것으로 한다. 또한 본 명세서에 있어서, SG 의 β-Man 의 분기 사슬의 어느 일방만으로 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG 라고 하고, 분기사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2 로 각각 표기하는 것으로 한다.

[화학식 6]

[화학식 7]

(식 중, 「-(N/O)」는, N 원자 또는 O 원자와 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)

본 발명에서 이용할 수 있는 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬 부분의 구체예로서, SG 를 뉴라미니다아제 처리하고, 2 개의 비환원 말단의 NeuAc 를 결실시킨 AG(9) (이하의 구조식 및 서열식의 AG(9)), AG(9) 를 갈락토시다아제 처리하고, 2 개의 비환원 말단의 Gal 을 결실시킨 AG(7) (이하의 구조식 및서열식의 AG(7)) 등을 예시할 수 있다.

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

본 발명에 있어서, 당사슬 도너 분자는 화학 수식되어 있어도 되고, 예를 들면, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 된다.

본 발명에서 이용할 수 있는 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬 부분의 예로서, 야생형의 시알산 상의 부위가 임의의 치환기에 의해 화학 수식되어 있는 유도체 (SG 형) 를 들 수 있다.

[화학식 12]

[화학식 13]

(식 중, X 는, β-Man 의 분기사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산 상에 도입된 치환기를 나타내고, 유기 합성 화학의 분야에서 공지된 여러 가지 방법을 적용하여 합성할 수 있는 치환기이며, 항체-약물 콘주게이트 합성에 응용되고 있는 결합법에 사용되는 치환기를 참고로 (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215) 하여, 예를 들어, 아세틸렌기, 아지드기 (N₃-), 디벤질시클로옥텐 (DBCO) 기, 비시클로[6.1.0]논 4-엔 (BCN) 기, 1,2,4,5-테트라진 고리를 포함하는 구조, 알데히드기, SH 기, 메틸술포닐트리아졸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 아세틸렌기, 아지드기 (N₃-), 더욱 바람직하게는, 아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 「아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기」로는, 예를 들면, N₃ 을 갖는 폴리에틸렌글리콜 링커, 즉, 링커 구조에 포함되는 에틸렌글리콜 단위 (-CH₂-CH₂-O-) 의 개수의 상한은 약 20 개 이하이고, 바람직하게는 약 11 개 이하이며, 보다 바람직하게는 약 7 개 이하이며, 「아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기」로는, 예를 들어, N₃ 을 갖는 폴리에틸렌글리콜 링커 (예를 들어, 35-아지드-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-운데카옥사펜타트리아콘탄-1-아미노기, 32-아지드-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-데카옥사드트리아콘탄-1-아미노기, 29-아지드-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-아미노기, 26-아지드-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헥사코산-1-아미노기, 23-아지드-3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사트리코산-1-아미노기, 20-아지드-3,6,9,12,15,18-헥사옥사에이코산-1-아미노기, 17-아지드-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데칸-1-아미노기, 14-아지드-3,6,9,12-테트라옥사테트라데칸-1-아미노기, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아미노기, 2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]에틸아미노기, 2-(아지드에톡시)에틸아미노기, 2-아지드에틸아미노기, 2-[2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]-N-[2-[2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]에톡시]에틸]에탄아민기 등, 직사슬형의 치환기, 혹은 1,3-비스[2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]에톡시]프로판-2-아미노기, 3-[2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]에톡시]-2-[2-[2-(2-아지드에톡시)에톡시]에톡시메틸]프로판-1-아미노기 등 분기하고 있는 치환기 등) 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 식 중, 「-(N/O)」는, N 원자 또는 O 원자와 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)

여기에 나타낸 X-SG 형의 구조 중, β-Man 의 분기사슬의 1-6 사슬측의 화학 수식 시알산이 결손된 구조인 X-MSG1 형, 1-3 사슬측의 화학 수식 시알산이 결손된 구조인 X-MSG2 형도, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬 부분의 예로서 들 수 있다.

또한, 화학 수식되어도 되는 부위는, 시알산 이외에도 생각할 수 있고, 이하, AG(9) 형의 유도체, AG(7) 형의 유도체를 들 수 있다.

[화학식 14]

[화학식 15]

(식 중, X 는, β-Man 의 분기사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 갈락토오스 상에 도입된 치환기를 나타내고, 구체적으로는, 상기에 있어서 규정한 것과 동일한 의미를 나타낸다. 식 중, 「-(N/O)」는, N 원자 또는 O 원자와 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)

[화학식 16]

[화학식 17]

(식 중, X 는, β-Man 의 분기사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 GlcNAc 상에 도입된 치환기를 나타내고, 구체적으로는, 상기에 있어서 규정한 것과 동일한 의미를 나타낸다. 식 중, 「-(N/O)」는, N 원자 또는 O 원자와 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)

여기에 나타낸 X-AG(9) 형의 구조 중, β-Man 의 분지사슬의 1-6 사슬측의 화학 수식 갈락토오스가 결손된 구조, 1-3 사슬측의 화학 수식 갈락토오스가 결손된 구조, 혹은 X-AG(7) 형의 구조 중, β-Man 의 분기사슬의 1-6 사슬측의 화학 수식 GlcNAc 가 결손된 구조, 1-3 사슬측의 화학 수식 GlcNAc 가 결손된 구조에 대해서도, 도너 분자에 있어서의 당사슬 부분의 예로서 들 수 있다.

본 발명의 당사슬 도너 분자는, 바람직하게는, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 SGP, AG(9)-P, AG(7)-P, SG-Asn, AG(9)-Asn, AG(7)-Asn, SG-OR, AG(9)-OR, AG(7)-OR, (MSG1)-Asn, (MSG2)-Asn, (MSG1)-Asn 과 (MSG2)-Asn 의 혼합물, MSG1-OR, MSG2-OR, 또는 MSG1-OR 과 MSG2-OR 의 혼합물을 들 수 있고, 또는, 도 2 에 나타낸 구조를 갖는 당사슬 도너 분자를 들 수 있다. 또한, 이상의 구조식 중, 「P」는 SGP 에서 유래하는 펩티드 부분을 나타내고, 도 2 에 있어서의 「X」는, 상기에서 규정한 것과 동일한 의미를 나타낸다. 본 발명의 당사슬 도너 분자로서, 더욱 바람직하게는, N-결합형 당사슬을 포함하는 것으로서, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-P-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃ 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃ 의 혼합물을 들 수 있고, O-결합형 당사슬을 포함하는 것으로서, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR 의 혼합물을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자로서, 바람직하게는, ＜신규 당사슬 도너 분자＞ 의 장에 있어서 구체적으로 개시하는 신규 당사슬 도너 분자를 들 수 있다. 본 발명의 당사슬 도너 분자는, 사용하는 효소-A 와 효소-B 의 조합 등의 여러 조건에 따라 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

상기 화학식에 있어서, 「R」은, 적어도 하나의 탄소 원자를 개재하여 산소 원자에 연결하는 임의의 치환기를 나타내며, 바람직하게는 C1 ∼ C6 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 아릴기를 나타낸다. 「C1 ∼ C6 알킬기」란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬 또는 분기사슬의 알킬기를 의미하고, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸, n-펜틸기, n-헥실 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 「아릴기」로는, 예를 들어 페닐기, 벤질기, 인데닐기, 나프틸기, 플루오레닐기, 안트라닐기, 페난트레닐기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 아릴기의 치환기로는, C1 ∼ C6 알콕시기 (예를 들어, 메톡시기, 에톡시기, 이소프로폭시기 등), C1 ∼ C6 알킬기 (예를 들어, 메틸기, 에틸기 등), 할로겐기를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 치환되어 있는 아릴기로는, 파라메톡시페닐기, 파라메틸페닐기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 「R」은, PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe 및 A-PEG-N₃ (A 는, 글리콜산 유닛 중의 아세틸기, 즉, 아노머 수산기와, Mor 또는 PEG 중의 아미노기 사이에 놓인 부분을 나타낸다) 으로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자는, 하이 만노오스형 당사슬을 포함한다. 이러한 당사슬 도너 분자로는, 이와 같은 당사슬 도너 분자로는, 이하의 구조를 갖는 Man9-GlcNAc₂-Asn (「M9-Asn」) 이나, M9-Asn 으로부터 만노오스가 1 개, 2 개, 혹은 3 개 결손된 구조를 갖는 Man8-GlcNAc₂-Asn (「M8-Asn」), Man7-GlcNAc₂-Asn (「M7-Asn」), Man6-GlcNAc₂-Asn (「M6-Asn」) 을 들 수 있지만, 이들에는 한정되지 않는다.

[화학식 18]

본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자는, 당사슬의 환원 말단이 활성화된 GlcNAc, 바람직하게는 옥사졸린화된 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자이다. 이러한 당사슬 도너 분자로는, 다양한 당사슬 구조의 분자를 사용할 수 있다. 이러한 당사슬 도너 분자의 예로는, SG-Ox (「Ox」는 옥사졸린을 나타낸다), MSG1-Ox, MSG2-Ox 혹은 MSG1-Ox 와 MSG2-Ox 의 혼합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

당사슬의 환원 말단이 활성화된 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자도, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자와 동일하게, 화학 수식되어 있어도 되고, 예를 들면, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 된다. 비환원 말단의 화학 수식으로는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자에 대하여 언급한 것과 동일한 수식을 들 수 있고, 예를 들면, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-Ox, [N₃-PEG(3)]-MSG1-Ox, [N₃-PEG(3)]-MSG2-Ox, 또는 [N₃-PEG(3)]-MSG1-Ox 와 [N₃-PEG(3)]-MSG2-Ox 의 혼합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

당사슬 도너 분자는, 적절히 시판품을 구입하거나, 혹은 이미 알려진 방법을 이용 또는 응용함으로써 제조할 수 있고, 예를 들어, 실시예 7 또는 참고예 23-1 에 나타낸 방법을 이용 또는 응용함으로써 제조할 수 있다.

＜Fc 함유 분자＞

본 발명에 있어서, 「Fc 함유 분자」(「Fc 영역 함유 분자」라고 칭하기도 한다) 란, Fc 영역을 함유하는 분자를 나타내고, 예를 들어 항체 (면역 글로불린), Fc-융합 단백질, Fc 단편 등 (또는 Fc 함유 단편) 을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체 (면역 글로불린) 로는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD 중 어느 것이어도 되고, 또한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 중 어느 것이어도 되고, 또한 천연 유래의 것이어도 되고, 합성한 것이어도 되지만, 바람직하게는 IgG, 특히 IgG 형의 모노클로날 항체를 들 수 있다. 항체 이외의 Fc 함유 단편으로는, CLCH, 예를 들어 IgG (특히, IgG 형의 모노클로날 항체) 의 Fc 단편이나 정상 영역만으로 이루어지는 CLCH (특허문헌 1), Fc 단편을 포함하는 바이스페시픽 항체 (Expert Opin Ther Pat. 2018 28, 251-276) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

＜억셉터 분자란＞

본 발명에 있어서, 「억셉터 분자」란, 당사슬 도너 분자로부터 당사슬을 수령하는 분자를 의미한다. 억셉터 분자로서 전형적인 것은, 모노클로날 항체에서 유래하는, 코어 Fuc 가 결합하고 있어도 되는 코어 GlcNAc 만으로 이루어지는 N297 결합 당사슬을 갖는 IgG 또는 그 Fc 단편이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「코어 Fuc」(또는, 「코어 푸코오스」) 란, 상기 코어 GlnNAc 에 결합하고 있는 푸코오스를 의미하는 것으로 한다. 코어 GlcNAc 에는, 그 유래가 되는 항체 또는 그 산생 방법에 따라, 코어 Fuc 가 결합하고 있어도 되고, 결합하고 있지 않아도 된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 억셉터 분자는, N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자 (예컨대, 항체 또는 그 Fc 함유 단편) 이고, 바람직하게는 GlcNAc 또는 (Fucα1,6)GlcNAc 로 이루어지는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자 (예컨대, 항체 또는 그 Fc 함유 단편) 를 들 수 있다. 억셉터 분자의 유래로는 다양한 모노클로날 항체 또는 당사슬 함유 분자 혹은 Fc 영역 함유 분자 (예를 들어, Fc, 중사슬로부터 가변 영역을 결실시킨 정상 영역만으로 이루어지는 CH 와 경사슬의 정상 영역만으로 이루어지는 CL 과 조합한 CLCH 등) 를 이용할 수 있다. 본 발명의 억셉터 분자는, 바람직하게는 (Fucα1,6)-GlcNAc-IgG (예를 들어, 도 4 의 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1), (Fucα1,6)-GlcNAc-Fc, (Fucα1,6)-GlcNAc-CLCH, GlcNAc-㎃b4 등을 들 수 있다 (특허문헌 1).

발명의 일 양태에 있어서, N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자는, 항체 유래로 할 수 있고, 항체로는, 예를 들어, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 CDH6 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 ENPP3 항체, 항 CD47 항체, 항 EGFR 항체, 항 GPR20 항체 또는 항 DR5 항체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체로서, 바람직하게는 항 HER2 항체 (예를 들어, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙), 항 CDH6 항체, 항 CD33 항체, 항 EphA2 항체, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 또는 항 EGFR 항체이고, 보다 바람직하게는 항 HER2 항체, 항 CDH6 항체, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 또는 항 EGFR 항체이다.

상기 항체는, 이 분야에서 통상적으로 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에게 면역시키고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에게 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.

또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497 ; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라서, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.

또한, 항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 「숙주 세포」는, 동물 세포, 식물 세포, 대장균, 효모 등, 단백질 산생에 통상 이용되는 세포 등을 적절하게 선택할 수 있다.

상기 항체는 인간화 항체여도 되고, 공지된 방법 (예를 들면, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984), Nature (1986) 321, p. 522-525, WO90/07861) 에 따라 취득할 수 있다.

예를 들어, 항 HER2 항체 (US5821337, WO2004/008099, WO2020/050406 등), 항 CD33 항체 (WO2014/057687, WO2020/050406 등), 항 EphA2 항체 (WO2009/028639, WO2020/050406 등), 항 CDH6 항체 (WO2018/212136, WO2020/050406 등), 항 CD70 항체 (WO2004/073656, WO2007/038637, WO2021/177438 등), 항 TROP2 항체 (WO2015/098099, WO2021/177438 등), 항 EGFR 항체 (WO1998/050433, WO2002/092771, WO2021/177438 등) 는, 공지된 수단에 의해 취득할 수 있다.

이하, 항체의 상세를 설명하지만, 항체의 정상 영역에는 복수의 알로타입이 있는 것이 알려져 있고, 예를 들어 IgG1 중사슬에 대해서는 G1m17, G1m3, G1m1, G1m2 를 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 정상 영역으로는, 특별히 한정되지 않지만, G1m17 또는 G1m3 을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체의 아이소타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하고, 일 양태로는, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강 혹은 감약, 항체 의존성 세포 매개 식작용을 증강 혹은 감약, 또는, 보체 의존성 세포 상해 활성을 증강 혹은 감약할 수 있고, 변이체의 일 양태로는, 야생형 인간 IgG1 의 정상 영역의 아미노산 서열 중 EU index (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85) 에 의해 특정되는 234 위치의 류신 및 235 위치의 류신이 각각 알라닌 및 알라닌으로 치환된 것, 또는, EU index 에 의해 특정되는 234 위치의 류신, 235 위치의 류신 및 329 위치의 프롤린이 각각 알라닌, 알라닌, 및 알라닌으로 치환된 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 항체에 대하여 중사슬의 일방 또는 양방의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 것으로 할 수 있다.

상기 항 HER2 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항 HER2 항체 ;

(a) HER2 에 특이적으로 결합한다.

(b) HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다.

(2) HER2 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.

(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.

(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노크로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및 ADCP 활성의 저감을 가져오는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(7) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(8) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU 인덱스에 의해 나타내는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (6) 에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(11) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.

(12) 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (8) 에 기재된 항체.

(13) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(14) 상기 (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.

본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조에 사용되는 항 CD70 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

(1) CD70 에 특이적으로 결합하는 항 CD70 항체.

(2) CD70 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.

(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노크로날 항체, 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(7) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU 인덱스에 의해 나타내는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (6) 에 기재된 항체.

(8) 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.

(11) 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 20 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 22 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 24 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.

(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.

본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조에 사용되는 항 TROP2 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

(1) TROP2 에 특이적으로 결합하는 항 TROP2 항체.

(2) TROP2 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.

(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(7) 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 26 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 27 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 29 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (8) 에 기재된 항체.

(11) 서열 번호 31 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 32 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 34 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (8) 에 기재된 항체.

본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조에 사용되는 항 EGFR 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

(1) EGFR 에 특이적으로 결합하는 항 EGFR 항체.

(2) EGFR 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.

(8) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.

(10) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.

(11) 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.

본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조에 사용되는 항 CDH6 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.

(1) CDH6 에 특이적으로 결합하는 항 CDH6 항체.

(2) CDH6 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.

(8) 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.

(9) 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 에 기재된 항체.

(10) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(11) 상기 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.

억셉터 분자는, 적절히 시판품으로서 구입하거나, 또는 이미 알려진 방법을 이용 또는 응용함으로써 제조할 수 있고, 예를 들어 실시예 1 에 있어서 언급하는 방법을 이용 또는 응용함으로써 제조할 수 있다. 억셉터 분자는, 전형적으로는, 당사슬 개변 (당사슬 리모델링이라고도 한다) 의 대상이 되는 Fc 함유 분자 (전형적으로는, IgG 형의 모노클로날 항체 또는 당해 항체의 Fc 단편이나 정상 영역만으로 이루어지는 CLCH 등의 Fc 함유 분자) 의 N297 결합 당사슬을, N297 결합 당사슬의 코어 키토비오스 구조에 있어서의 GlcNAc 사이의 1,4-글리코시드 결합 (GlcNAcβ1-4GlcNAc) 을 특이적으로 가수분해하는 활성을 유지한 ENGase 로 처리함으로써 조제할 수 있다. 이 경우, ENGase 로는, Endo-Si WT, Endo-A, Endo-D, Endo-E, Endo-F3, Endo-H, Endo-S, Endo-S2, Endo-Si 를 비롯한 다양한 것을 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 억셉터 분자는, 공정 1 에 있어서 사용하는 효소-A (당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬을 억셉터 분자로 전이하는 활성을 갖는 효소) 와 동일 또는 상이한 효소를, 원료가 되는 Fc 함유 분자 (당사슬 개변의 대상이 되는 Fc 함유 분자로서, 전형적으로는, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬, 불균일한 N297 결합 당사슬, 또는 숙주 세포 유래의 불균일한 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 와 반응시키는 등의 수법에 의하여, 공정 1 에 있어서의 당사슬 전이 반응과는 독립된 공정에 있어서 준비할 수 있다. 또한, 공정 1 에서 이용할 수 있는 효소-A 의 특징으로서, 「가수분해 활성이 잔존하고 있어도 된다」가 있다. 이 때문에, 이들 ENGase 로 사전에 처리하는 대신에, 효소-A 가 숙주 세포 유래의 불균일한 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자에 작용함으로써, in situ 로 억셉터 분자를 조제해도 된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 억셉터 분자는, 원료가 되는 Fc 함유 분자 (당사슬 개변의 대상이 되는 Fc 함유 분자로서, 전형적으로는, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬, 불균일한 N297 결합 당사슬, 또는 숙주 세포 유래의 불균일한 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 에, 효소-A를 작용시킴으로써, in situ 및/또는 원 포트로 조제된다. 또, 당사슬 개변 (당사슬 리모델링) 에 이용되는 IgG 또는 Fc 함유 분자는, 바람직하게는 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 IgG 중사슬에서 유래하고, N297 결합 당사슬을 갖는 형태로 산생된 것이면 된다. 그 산생 방법은 한정되는 것은 아니고, 통상적으로 알려진 모노클로날 항체의 생산 방법에 의해 산생된 IgG, IgG 의 CLCH, 또는, 그것을 효소 처리하여 얻어진 Fc 단편 등을 이용할 수 있다. 또한, 이러한 IgG 또는 Fc 단편은, 상이한 생산 방법이나 상이한 로트에서 얻어진 샘플의 혼합물을 채용해도 된다.

＜엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제＞

「엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제」란, ENGase : Endo-β-N-acetylglucosaminidase 로도 알려져 있는 당 가수분해 효소이며, 당사슬 구조 중의 키토비오스 구조의 절단 및 결합 생성을 담당한다. 또한, 그 유래에 따라, 부르는 방법이 상이하다. 본 명세서에 있어서는, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 「효소-A」라고 부르고, 당사슬 도너 분자의 당사슬, 예를 들면, 푸코오스를 갖지 않는 당사슬 원료 (예를 들면, SGP) 의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 「효소-B」라고 부른다. 이하, 본 발명에 있어서의 효소-A 및 효소-B 에 대하여 설명한다.

＜효소-A＞

「효소-A」는, Fc 함유 분자 (예를 들면, 항체) 의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 의미한다. 효소-A 는, 일반적으로, Fc 함유 분자와 친화성이 높은 도메인과, 당사슬과 친화성이 높은 도메인과, 당사슬 전이 반응 촉매 도메인을 포함하고, 전형적으로는, Fc 함유 분자 (예를 들면, 항체) 의 N297 결합 당사슬을 기질로 하여, 가수분해 활성과 당사슬 전이 활성을 겸비하는 것이지만, 본 발명에 있어서 중요한 것은, 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬 (특히, 화학적 수법, 혹은 효소학적 수법으로 활성화된 당사슬) 을, 억셉터 분자로 전이하는 활성이기 때문에, 가수분해 활성에 대해서는, 감약 또는 소실되어 있어도 된다. 오히려, 강한 가수분해 활성을 유지하는 효소는, 당사슬 전이 활성에 의해 억셉터 분자의 코어 GlcNAc 에 전이시킨 당사슬도 기질로서 가수분해할 가능성이 있기 때문에, 본 발명에 있어서의 효소-A 의 가수분해 활성은, 상대적으로 저감되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기한 바와 같이, 효소-A 에 가수분해 활성이 잔존하고 있는 경우, 공정 1 에 있어서의 억셉터 분자를 별도 조제하지 않고, 공정 1 에 있어서의 동일 반응조 내에서 in situ 로 조제할 수 있다는 이점을 향수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-A 는, Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는 활성 (특히, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 당사슬 전이 활성) 을 갖는 것이며, 또한, 본 발명의 다른 일 양태에 있어서는, 효소-A 는, Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는 활성을 갖고 있고, 또한, 가수분해 활성이 잔류하고 있거나, 또는, 가수분해 활성을 소실시키고 있는 것이다.

효소-A 의 가수분해 활성은, 당사슬에 있어서의 공통의 기본 구조 중의 코어 키토비오스에 포함되는 β1,4 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해하는 활성을 의미하고, 특히, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬에 있어서의 공통의 기본 구조 중의 코어 키토비오스에 포함되는 β1,4 글리코시드 결합을 특이적으로 가수분해하는 활성을 의미한다. 효소-A 의 가수분해 활성의 반응 모식도를 도 5, 도 6 에 나타낸다.

효소-A 의 당사슬 전이 활성은, N297 에 코어 GlcNAc (코어 푸코오스가 부가되어 있어도, 부가되어 있지 않아도 된다) 만을 갖는 Fc 부위를 포함하는 억셉터 분자에, 상기 당사슬 도너 분자 (환원 말단이 활성화된 GlcNAc, 혹은 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자) 의 환원 말단을 글리코시드 결합시키는 활성을 의미한다. 당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 경우에 있어서의 효소-A 의 당사슬 전이 활성의 반응 모식도를 도 1 에 나타낸다.

본 발명에 있어서의 효소-A 로는, 예를 들어, Endo-S (Streptococcus pyogenes 유래 효소) (Collin M and Olsen A., EMBO J. 2001, 20, 3046-3055, 및 Goodfellow JJ, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 8030-8033 참조), EndoS2 혹은 EndoS49 (Sjogren J, et al., Biochem J. 2013, 455, 107-118, 및 Shivatare SS, et al., Chem Commun (Camb). 2018, 54, 6161-6164 참조), Endo-F3 (Flavobacterium meningosepticum 유래 효소) (Huang W, et al., Chembiochem. 2011, 12, 932-941, 및 Giddens JP, et al., J Biol Chem. 2016, 291, 9356-9370 참조), 또는 이들의 변이 효소를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 효소-A 로는, Streptococcus iniae (Pier GB and Madin SH., Int J Syst Bacteriol. 1976 26, 545-553 참조) 에서 유래하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (이하, 「Endo-Si」라고 부르고, 그 아미노산 서열 (서열 번호 71) 을 도 9 에 나타낸다), 또는 그 변이 효소를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 효소-A 로는, Storeptococcus 속의 게놈 정보로부터, 그 서열이 특정되는 효소 (Vincent P. Richard, et al., Genome Biol. Evol. 2014, 6, 741-753 참조), 또는 그 변이 효소를 들 수 있다.

본 발명의 효소-A 는, 상기의 특성을 갖는 것이면, 실시예에서 사용한 구체적인 효소에 한정되는 것이 아니고, 천연으로부터 분리된 효소여도 되고, 본 발명의 효소의 서열 정보에 기초하여 인위적으로 제조 또는 개변된 효소여도 된다. 천연으로부터 분리하는 경우, 그 분리원으로 하는 생물종은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 세균이다.

Endo-Si 의 활성 도메인 및 Carbohydrate-binding module (CBM) 은, 결정 구조 해석이 실시되고 있는 EndoS (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No. 18, pp 6714-6719) 와의 서열 비교로부터, 각각 서열 번호 71 의 아미노산 번호 106 ∼ 447 및 아미노산 번호 762 ∼ 897 의 영역이라고 추찰되고, 이 2 개가 가수분해 활성 및/또는 전이 활성과, 항체와의 상호 작용에 중요한 부위라고 생각된다. 따라서, 본 발명의 효소-A 로서, 서열 번호 71 의 아미노산 번호 106 ∼ 447 및/또는 아미노산 번호 762 ∼ 897 에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는, 서열 번호 71 의 아미노산 번호 106 ∼ 897 에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 서열 번호 71 의 아미노산 번호 106 ∼ 928 에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 서열 번호 71 의 아미노산 번호 34 ∼ 928 에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 당사슬 전이 활성을 나타내는 폴리펩티드를 들 수 있다.

상기한 바와 같이, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제는, 통상 가수분해 활성과 당사슬 전이 활성을 겸비하는 바, 강한 가수분해 활성을 유지하는 효소는, 당사슬 전이 활성에 의해 억셉터 분자 (N297 결합 당사슬로서 코어 GlcNAc 를 갖는 항체 혹은 그 Fc 영역 함유 분자) 의 코어 GlcNAc 에 전이시킨 당사슬도 기질로서 가수분해하여, 원하는 당사슬 전이체를 적절하게 취득할 수 없는 경우가 있다. 그 때문에, 당사슬 리모델링 항체 혹은 당사슬 수식 화합물의 합성에 있어서는, 당사슬 전이 활성과의 비교에 있어서 가수분해 활성을 상대적으로 저하시킨 변이 효소가 유용하다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-A 는, Endo-S, EndoS-2, Endo-Si, Endo-Sd, Endo-Se, 또는 Endo-Sz 의 변이 효소이며, 또한 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는 변이 효소이며, 바람직하게는, 도 7 ∼ 도 9 에 있어서 볼드체로 나타낸 아미노산 잔기를 적절히 치환한 변이 효소이며, 특히 바람직하게는, Endo-S D233Q, Endo-S D233Q/Q303L, Endo-S D233Q/E350A, Endo-S D233Q/E350Q, Endo-S D233Q/E350D, Endo-S D233Q/E350N, Endo-S D233Q/D405A, Endo-Si D241Q, Endo-Si D241Q/Q311L, Endo-Si D241Q/E360Q, Endo-Si D241M, Endo-Si D241M/Q311L, Endo-Si D241M/E360Q, Endo-Si T190Q, Endo-Si T190/D241Q, Endo-Si T190Q/D241M, Endo-Si D241X₁ (X₁ 은, K, R 및 D 이외의 어느 것의 아미노산 잔기를 나타내고, 구체적으로는, A, N, C, Q, E, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, 또는 V, 바람직하게는, A, Q, E, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, 또는 V 를 나타낸다), Endo-Si T190X₂ (X₂ 는, F, H, K, M, Q, R, W 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si Q311X₃ (X₃ 은, F, N, 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si E360K, Endo-S2 D184M, Endo-S2 T138Q, Endo-S2 D184Q, Endo-S2 D184Q/Q250L, Endo-S2 D184Q/E289Q, Endo-S2 D184M/Q250L, Endo-S2 D184M/E289Q, Endo-S2 D182Q, Endo-S2 D226Q, Endo-S2 T227Q, Endo-S2 T228Q, Endo-Sd D232Q, Endo-Sd D232M, Endo-Sd D232Q/Q302L, Endo-Sd D232M/Q302L, Endo-Se D233Q, Endo-Se D233M, Endo-Se D233Q/Q303L, Endo-Se D233M/Q303L, Endo-Sz D234Q, Endo-Sz D234M, Endo-Sz D234Q/Q304L, 또는 Endo-Sz D234M/Q304L 을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 효소-A 는, 상기에 있어서 언급한 특정한 변이에 더하여, 추가적인 변이가 가해져 있어도 되고, 예를 들어, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 본 효소 활성에 영향을 미치지 않는 범위에서, 1 ∼ 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 있어도 된다. 또한, 효소-A 의 아미노산 서열로는, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 특정한 변이 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기에 대하여 적어도 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 혹은 99 ％ 이상의 상동성 혹은 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 「수개」란, 30 개 혹은 20 개 이하의 정수를 의미하고, 바람직하게는 10 개 이하의 정수를 의미하고, 더욱 바람직하게는 5 개 이하의 정수를 의미하고, 가장 바람직하게는 4 개, 3 개, 2 개 또는 1 개를 의미한다.

＜효소-B＞

「효소-B」는, 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제, 특히 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하지만 N297 결합 당사슬을 기질로 하지 않는 (바꾸어 말하면, N297 결합 당사슬로의 반응성이 낮은, 바람직하게는 반응성이 매우 낮은) 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 의미하는 것이다. 효소-B 가 기질로 하는 당사슬 도너 분자 상의 당사슬 부분은, 하이 만노오스형 당사슬, 혼성형 당사슬 및 복합형 당사슬 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 하이 만노오스형 당사슬 또는 복합형 당사슬이며, 특히 바람직하게는 복합형 당사슬이다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-B 가 기질로 하는 당사슬 도너 분자 상의 당사슬 부분은, 하이 만노오스형 당사슬 또는 복합형 당사슬이며, 바람직하게는 복합형 당사슬이다. 또한, 본 발명에 있어서, 복합형 당사슬은, 2 분기형, 3 분기형 또는 4 분기형 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 효소-B 가 기질로 하는 당사슬 도너 분자 상의 당사슬 부분은, 2 분기형의 복합형 당사슬이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-B 는, 푸코오스를 갖지 않는 당사슬 원료 (SGP 등의 당펩티드나 당단백질) 를 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제이며, 바람직하게는, 푸코오스를 갖지 않는 2 분기형의 복합형 당사슬을 포함하는 당사슬 원료를 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제이다.

본 발명의 효소-B 로는, 효소-A 의 존재하, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자에 작용함으로써, 당해 환원 말단이 당사슬 전이 반응에 이용 가능한 상태가 된 활성화 중간체를 생성하고, 결과적으로 효소-A 에 의한 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬의 억셉터 분자로의 당사슬 전이 반응을 촉진하는 성질을 갖는 효소인 것이 바람직하다. 여기서, 효소-B 자신의 당사슬 전이 활성이, 당사슬 도너 분자를 활성화하는 능력과 상관이 있다고 생각되는 점에서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-B 는, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 당사슬 도너 분자 (예를 들면, SGP) 의 당사슬을 기질로 하지만, N297 결합 당사슬을 기질로 하지 않는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 중에서, GlcNAc 를 갖는 억셉터 (예를 들면, 1-메틸에틸-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 등의 GlnNAc 유도체) 로의 당사슬 전이 활성을 지표로서 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-B 는, SGP 로부터 GlcNAc 유도체로의 당사슬 전이 활성을 갖는 효소이다.

효소-B 에 의한, 당사슬 도너 분자의 활성화 작용은, 도 1 에 나타내는 바와 같이, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 당사슬 도너 분자에 작용하고, 당해 환원 말단이 당사슬 전이 반응에 이용 가능한 상태가 된 활성화 중간체를 생성한다는 것인 바, 효소-B 에 의한 가수분해 활성이 높은 경우, 활성화 중간체는, 효소-A 를 개재하여, 억셉터 분자와 반응하는 것이 아니라, 반응계에 존재하는 H₂O 분자와 반응하여, 다수의 유리 당사슬이 생성될 우려가 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 효소-B 는, 당사슬 활성화 작용과의 비교에 있어서, 상대적으로 저감된 가수분해 활성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 효소-B 로는, 예를 들어, Endo-M (Mucor hiemalis 유래 효소) (Yamamoto K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994, 203, 244-252, 및 Umekawa M, et al., J. Biol Chem. 2021, 285, 511-521 참조), Endo-CC (Coprinopsis cinerea 유래 효소) (Eshima Y, et al., PLoS One. 2015, 10, e0132859 참조), Endo-Om (Ogataea minuta 유래 효소) (Murakami S, et al., Glycobiology. 2013, 23, 736-744 참조), Endo-Rp (Rhizomucor pusillus 유래 효소) (WO2018101454), 또는 그들의 변이 효소 (바람직하게는, 야생형과 비교하여 가수분해 활성을 저하시킨 변이 효소) 를 들 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-B 는, Endo-M, Endo-Om, Endo-CC, 또는 Endo-Rp 의 변이 효소로서, 또한 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는 변이 효소이며, 바람직하게는, 도 10 ∼ 도 13 에 있어서 볼드체로 나타낸 아미노산 잔기를 적절히 치환한 변이 효소이며, 특히 바람직하게는, Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172G, Endo-Rp N172I, Endo-Rp N172L, Endo-Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, Endo-Rp N172V, Endo-Rp W278F/S216V, Endo-Rp W278F/N246D, Endo-Rp W278F/D276N, Endo-Rp W278F/A310D, Endo-Rp W278F/N172D/F307Y, Endo-Rp W278F/N172D/F307H, Endo-Rp W278F/N172D/A310D, Endo-Rp W214F/F307Y/L306I, Endo-M N175Q, Endo-M N175Q/Y217F, Endo-CC N180H 및 Endo-Om N194Q 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 효소-B 는, 상기에 있어서 언급한 특정한 변이에 더하여, 추가적인 변이가 가해져 있어도 되고, 예를 들어, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 본 효소 활성에 영향을 미치지 않는 범위에서, 1 ∼ 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 있어도 된다. 또한, 효소-B 의 아미노산 서열로는, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 특정한 변이 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기에 대하여 적어도 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 혹은 99 ％ 이상의 상동성 혹은 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있다.

본 발명에 관련된 제조 방법의 전형적인 실시양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 는, 각각 별도 분자로서 공정 1 에 첨가되는데, 효소-A 와 효소-B 는, 각각 원하는 역할을 하는 한, 직접적 또는 간접적으로 결합한 상태에 있어서 반응계에 첨가되어도 된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 는, 직접적 또는 간접적으로 화학적으로 결합한 상태로서 반응계에 첨가되어도 되고, 예를 들어, 양 분자는, 임의의 고상 담체에 고정화된 고정화 효소나, 임의의 아미노산, PEG 등의 폴리머, 올리고머 링커 등으로 결합된 융합 단백질의 상태로 반응계에 첨가되어도 된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 는, 직접적 또는 간접적으로 화학적으로 결합되어 있고 (=효소-A 와 효소-B 는, 융합되어 있고), 예를 들어 임의의 고상 담체에 고정화된 고정화 효소나, 임의의 아미노산, PEG 등의 폴리머, 올리고머 링커 등, 바람직하게는 아미노산 링커로 결합된 융합 단백질로서 반응계에 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 효소-A, 효소-B 가, 결실이 없는 전장 분자가 아니라, 기능 단편이었다고 해도, 당해 기능 단편이 원하는 기능을 갖는 한, 당해 단편도 효소-A, 효소-B 의 일 양태로서 간주한다. 따라서, 본 발명에 있어서의 효소-A 와 효소-B 는, 예를 들어, 「효소-A」와 「효소-B」, 「효소-A 의 기능을 갖는 효소 단편」과 「효소-B 의 기능을 갖는 효소 단편」, 「효소-A」와 「효소-B 의 기능을 갖는 효소 단편」및 「효소-A 의 기능을 갖는 효소 단편」과 「효소-B」가, 직접적 또는 간접적으로 화학 결합한 상태도 포함한다. 「효소-A 의 기능을 갖는 효소 단편」으로는, 상기한 효소-A, 혹은 Endo-BI1 (GenBankAccession number : ACJ53522.1), Endo-BI2 (GenBankAccession number : BAJ71450.1), Endo-BT-3987 (GenBank Accession number : AAO79092.1), Endo-E (GenBankAccession number : AAR20477.1), Endo-F (GenBankAccession number : AAA24922.1), Endo-F2 (GenBankAccession number : AAA24923.1), Endo-F3 (GenBank Accession number : AAA24924.1), Endo-CoM (GenBank Accession number : XP006673222.1), Endo-SB (GenBank Accession number : BBB35949.1) 의 전장 서열로부터 특정한 기능 서열로 단편화한 아미노산 서열이며, 또한 특정한 변이가 가해져 있어도 되는 아미노산 서열을 갖는 단편을 들 수 있다. 또, 「효소-B 의 기능을 갖는 효소 단편」으로는, 상기한 효소-B 의 촉매 활성 도메인 혹은, Endo-A (GenBank Accession number : AAD10851.1), Endo-CE (GenBank Accession number : BAB84821.1), Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number : CCY37287.1), Endo-Tsp1263 (GenBank Accession number : CDD88945.1), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession number : CDD89351.1), Endo-BB (GenBank Accession number : AAN25135.1), Endo-BH (GenBank Accession number : BAB04504.1), Endo-BN (GenBank Accession number : WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession number : XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number : XP_002911817.1), Endo-D (GenBank Accession number : AAK74656.1), Endo-Pm (GenBank Accession number : ADK97032.1) 의 전장 서열로부터 특정한 기능 서열로 단편화한 아미노산 서열이며, 또한 특정한 변이가 가해져 있어도 되는 아미노산 서열을 갖는 단편을 들 수 있다. 예를 들어, 효소-A, 효소-B, 각각의 기능 서열에 관해서, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 상기 기능에 영향을 미치지 않는 범위에서, 1 ∼ 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가되어 있어도 되고, 또, 각각의 아미노산 서열로는, 특허문헌 (국제 공개 2022/050300호) 등을 참고로, 활성에 영향을 미치는 특정한 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기에 대하여 적어도 80 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 혹은 99 ％ 이상의 상동성 혹은 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있다.

효소-A 와 효소-B 의 조합으로는, 각각의 역할을 하는 효소-A 와 효소-B 이면, 임의의 조합을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이하의 표에 기재한 효소-A 와 효소-B 의 임의의 조합을 사용할 수 있다.

또한, 상기와 같이, 효소-A 와 효소-B 가 융합되어 있는 경우, 당해 효소-A 와 효소-B 로는, 각각의 역할을 하는 한, 임의의 조합을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, 효소-A 는 Endo-Si 변이체이고 효소-B 는 Endo-Rp 변이체이며, 예를 들어, 효소-A 는 Endo-Si D241M/Q311L 혹은 Endo-Si D241Q/Q311L 이며, 효소-B 는 Endo-Rp N172H 혹은 Endo-Rp N172V 이다. 또 다른 구체적 양태로는, 융합 효소는 Endo-Rp N172H 와 Endo-Si D241M/Q311L 의 융합 단백질, Endo-Rp N172V 와 Endo-Si D241Q/Q311L 의 융합 단백질, 또는, Endo-Si D241Q/Q311L 과 Endo-Rp N172V 이며, 예를 들어, 이하의 표에 기재한 [효소-A]-[효소-B] 융합 단백 효소, [효소-B]-[효소-A] 융합 단백 효소를 들 수 있다.

효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질은, 비특허문헌 (Joaquim, et al., Processes. 2022, 10, 494.) 등을 참고로, 통상의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 예를 들어 효소-A 와 효소-B 를 임의의 고상 담체에 물리적 또는 화학적 상호 작용을 통하여 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 혹은, 비특허문헌 (F Grueninger-Leitch, et al., Protein Sci. 1996, 12, 2617-22, 및 Emily MK, et al., Protein Eng Des Sel. 2005, 10, 497-501), 및 특허문헌 (WO2017137459) 등을 참고로, 융합 단백질을 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킬 수 있다. 즉, 효소-A 와 효소-B 를 코드하는 유전자를 결합시킨 후, 유전자 조작에 의해 효소-A 와 효소-B 에서 유래하는 기능을 갖는 단일의 효소를 숙주 세포에 산생시킬 수 있다. 이와 같이 유전자 조작에 의해 융합 효소를 숙주 세포에 생산시키는 경우, 효소-A 와 효소-B 를 따로따로 준비할 필요가 없어, 준비해야 할 효소의 수를 줄일 수 있기 때문에, 효소의 제조 비용 그리고 노력을 삭감할 수 있다. 효소-A 와 효소-B 를 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재하여 결합시키는 경우, 링커는, 일 양태에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산으로 구성되고, 비특허문헌 (Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15 ; 65(10) : 1357-1369.) 등을 참고로, 당해 기술 분야에서 알려진 전형적인 성질을 가지고 있는 것을 사용할 수 있으며, 유연 혹은 리지드한 링커, 절단 가능 또는 절단 불가능한 성질의 링커여도 되고, 길거나 혹은 짧은 링커를 사용할 수 있다. 일 양태에 있어서 링커는, 아미노산 서열 단편으로서, (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (EF)n, 또는(GGS)n 혹은 이들의 조합을 포함할 수 있다 (n 은 1 ∼ 30 의 정수이며, 바람직하게는 1 ∼ 20 의 정수이며, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 10 의 정수이며, 보다 바람직하게는 1 ∼ 6 의 정수이다). 또한, 링커에는, 폴리히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그, CBD 태그, Fc 태그, GST 태그 등, 정제 태그로서 상용되는 아미노산 서열을 포함시킬 수 있다. 일 양태에 있어서 정제 태그는 폴리히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그, Fc 태그, GST 태그이며, 바람직하게는 폴리히스티딘 태그, HA 태그, FLAG 태그, CBD 태그이며, 더욱 바람직하게는 폴리히스티딘 태그, FLAG 태그이며, 보다 바람직하게는 폴리히스티딘 태그이다.

＜공정 1＞

본 발명에 관련된 제조 방법에 있어서, 공정 1 은, N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와, 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 1 은, 억셉터 분자와 당사슬 도너 분자를, 효소-A 및 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정이다. 당해 공정 1 의 반응 조건으로는, 환원 말단이 활성화된 GlcNAc (옥사졸린화된 GlcNAc 등) 혹은 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 당사슬 도너 분자로서 이용하는 이미 알려진 당사슬 전이 반응의 반응 조건에 준하거나, 또는 이미 알려진 당사슬 전이 반응의 반응 조건을 이용 또는 응용함으로써 적절히 선택할 수 있다 (예를 들면, 특허문헌 3).

공정 1 의 반응은, 완충액 중에서 실시하는 것이 바람직하고, 환원 말단이 활성화된, 혹은 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 당사슬 도너 분자의 분해를 촉진시키지 않는 조건하에서 실시하는 것이 바람직하다. 이 관점에서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 경우, 공정의 1 의 반응계 내의 pH 는, 5.8 ∼ 9.5 의 사이에서 적당히 선택할 수 있고, 바람직하게는 6.2 ∼ 8.5, 보다 바람직하게는 6.5 ∼ 8.0, 더욱 바람직하게는 6.5 ∼ 7.5 의 범위이다. 또한, 당사슬 도너 분자가 환원 말단이 활성화된 GlcNAc 를 포함하는 경우, 공정의 1 의 반응계 내의 pH 는, 5.5 ∼ 8.0 의 사이에서 적당히 선택할 수 있고, 바람직하게는 6.0 ∼ 7.5, 보다 바람직하게는 6.2 ∼ 7.5, 더욱 바람직하게는 6.5 ∼ 7.5 의 범위이다. 완충액은, 인산 완충액 (pH 6.0 ∼ 7.5), MOPS-NaOH 완충액 (pH 6.5 ∼ 8.0), 트리스염산 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 등에서 적절히 선택하는 것이 가능하며, 바람직하게는 트리스염산 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 이다. 효소를 안정화시킬 목적으로, 반응액 중에 효소 반응을 저해하지 않는 첨가제를 첨가해도 된다.

반응 온도는, 4 ℃ 내지 50 ℃ 의 사이에서 적절히 선택할 수 있지만, 바람직하게는 15 ℃ ∼ 45 ℃ 이며, 보다 바람직하게는 20 ℃ ∼ 40 ℃ 이며, 더욱 바람직하게는 25 ℃ ∼ 40 ℃ 이다.

반응 시간은, 10 분 내지 96 시간의 사이에서 적절히 선택할 수 있지만, 바람직하게는 0.5 시간 ∼ 80 시간이고, 보다 바람직하게는 2 시간 ∼ 70 시간, 더욱 바람직하게는 4 시간 ∼ 60 시간, 특히 바람직하게는 6 ∼ 48 시간이고, 가장 바람직하게는 8 ∼ 30 시간이다. 반응액의 소량을 경시적으로 채취하여, 당사슬 전이 반응의 진행도를 확인하면서 반응의 종료를 판단해도 된다. 일반적으로, 당사슬 전이 반응의 진행도는, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 캐필러리 전기 영동, 마이크로칩 전기 영동, 전자동 전기 영동 시스템, 혹은 액체 크로마토그래피 질량 분석 (LC-MS) 등에 의해 모니터링할 수 있으며, 예를 들면, 당사슬 리모델링 항체를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 후, 전자동 전기 영동 시스템을 사용하여, N297 결합 당사슬이 부가되어 있는 중사슬측만 유지 시간이 변화하는 것을 확인함으로써, 모니터링할 수 있다.

당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 경우, 공정 1 은, 당사슬 도너 분자의 당사슬을, 억셉터 분자인 N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 항체 혹은 그 Fc 영역 함유 분자로 직접 전이하는 원 포트법으로서 실시할 수 있다. 이 양태에 있어서는, 공정 1 은, 효소-A 에 더하여, 상기 서술한 효소-B 도 필요로 한다.

실시예 8 에 있어서 상세하게 서술하는 바와 같이, 환원 말단이 옥사졸린화된 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를 사용하는 당사슬 리모델링에 있어서는, 억셉터 분자 중의 Lys 에 대하여 Endo 효소 비개재형의 화학 반응인 당화 (Glycation) 가 진행되기 쉬워지는 점에서, 반응액 중의 항체 농도를 낮게 설정하는 것이 상용되고 있다. 따라서, 본 발명에 관련된 제조 방법에 있어서, 당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화된 GlcNAc 를 포함하는 경우, 공정 1 에서는, 비교적 낮은 억셉터 분자 농도를 채용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 실시양태에 있어서의 억셉터 분자 농도는, 이미 알려진 방법에 준하여 적절히 설정할 수 있지만, 예를 들어, 공정 1 의 반응계 내 최종 억셉터 분자 농도로서 0.6 mg/mL ∼ 18 mg/mL, 바람직하게는 1.2 mg/mL ∼ 16 mg/mL, 보다 바람직하게는 3 mg/mL ∼ 14 mg/mL, 더욱 바람직하게는 4.2 mg/mL ∼ 13.2 mg/mL, 특히 바람직하게는 6 mg/mL ∼ 12 mg/mL 를 들 수 있다.

한편, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlnNAc 를 포함하는 당사슬 도너 분자를 사용하는 경우, 당화의 원인인, 화학적으로 합성된 옥사졸린체 용액을 첨가하지 않기 때문에, 당화를 염려할 필요가 없고, 따라서 비교적 고농도의 억셉터 분자 농도를 채용할 수 있다. 오히려, 분자간의 접촉 빈도가 높아진다는 관점에서, 고농도의 억셉터 분자를 첨가하는 것이 효과적이다. 따라서, 당사슬 도너 분자가 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는 경우, 공정 1 에 있어서의 억셉터 분자 농도는, 이미 알려진 방법에 준하여 적절히 설정할 수 있는데, 예를 들면, 공정 1 의 반응계 내 최종 억셉터 분자 농도의 상한값으로는 200 mg/mL, 바람직하게는 160 mg/mL, 보다 바람직하게는 120 mg/mL, 더욱 바람직하게는 100 mg/mL, 특히 바람직하게는 80 mg/mL 를 들 수 있고, 하한값으로는 10 mg/mL, 바람직하게는 14 mg/mL, 보다 바람직하게는 18 mg/mL, 더욱 바람직하게는 20 mg/mL 를 들 수 있으며, 농도 범위로는, 상기에 있어서 언급한 상한값 및 하한값의 각각의 임의의 조합, 또는 10 mg/mL ∼ 200 mg/mL, 바람직하게는 14 mg/mL ∼ 160 mg/mL, 보다 바람직하게는 18 mg/mL ∼ 120 mg/mL, 더욱 바람직하게는 20 mg/mL ∼ 100 mg/mL, 특히 바람직하게는 20 mg/mL ∼ 80 mg/mL 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

공정 1 에 있어서의, 당사슬 도너 분자의 첨가량으로는, 이미 알려진 방법을 이용 또는 응용함으로써 적당히 설정할 수 있다. 특히, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlnNAc 를 포함하는 당사슬 도너 분자를 사용하는 당사슬 리모델링 반응에서는, 당사슬 도너 분자의 첨가량은, 당사슬 전이율에 영향을 미치기 때문에, 종래 비교적 다량의 당사슬 도너 분자 (100 ∼ 300 당량, 특허문헌 1, 비특허문헌 12) 를 사용하는 것이 통상적이었다. 한편, 상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서의 제조 방법에서는, 산성 조건하에서의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자와 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 를 분리할 수 있기 때문에, 공정 1 의 당사슬 전이 반응 그 자체의 효율을 극도로 높일 필요는 없고, 따라서, 당사슬 도너 분자의 첨가량을, 비교적 소량으로 할 수 있다. 당사슬 도너 분자는 고가인 것이 많기 때문에, 이 이점은, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 취득하기 위하여, 대량의 당사슬 도너 분자 사용량을 필요로 하는, 원 포트법에 있어서 특히 유용하다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 1 에 있어서 첨가 (사용) 되는 당사슬 도너 분자의 양의 하한값으로는, 억셉터 분자 1 당량에 대하여, 2 당량, 3 당량, 4 당량, 5 당량, 6 당량, 7 당량, 8 당량, 9 당량, 10 당량, 11 당량, 12 당량, 13 당량, 14 당량, 15 당량, 16 당량, 17 당량, 18 당량, 19 당량 또는 20 당량을 들 수 있고, 당사슬 도너 분자의 양의 상한값으로는, 300 당량, 200 당량, 150 당량, 100 당량, 90 당량, 80 당량, 75 당량, 70 당량, 65 당량, 60 당량, 55 당량, 45 당량, 40 당량, 35 당량, 30 당량, 25 당량 또는 20 당량을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 공정 1 에 있어서 첨가 (사용) 되는 당사슬 도너 분자의 양의 범위로는, 상기에 있어서 언급한 상한값 및 하한값의 각각의 임의의 조합, 또는 억셉터 분자 1 당량에 대하여 5 ∼ 80 당량, 바람직하게는 7 ∼ 60 당량, 보다 바람직하게는 8 ∼ 50 당량, 특히 바람직하게는 10 ∼ 40 당량을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서의 제조 방법에서는, 산성 조건하에서의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자와 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 를 분리할 수 있기 때문에, 공정 1 의 당사슬 전이 반응 그 자체의 효율을 극도로 높일 필요는 없다. 따라서, 공정 1 의 당사슬 전이율로는, 임의의 수치를 설정할 수 있고, 예를 들면 50 ％ 이상, 55 ％ 이상, 60 ％ 이상, 65 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상 또는 95 ％ 이상을 설정할 수 있으며, 한편, 당사슬 전이 반응 그 자체의 효율을 극도로 높일 필요는 없다는 관점에서, 95 ％ 이하, 90 ％ 이하, 85 ％ 이하, 80 ％ 이하, 75 ％ 이하, 70 ％ 이하, 65 ％ 이하 또는 60 ％ 이하로 설정할 수도 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 1 의 당사슬 전이율은, 80 ％ 를 초과하는 것이며, 바람직하게는 85 ％ 를 초과하는 것이며, 특히 바람직하게는 90 ％ 를 초과하는 것이다. 또한, 상기 「당사슬 전이율」은, 통상의 방법에 따라 결정할 수 있고, 예를 들어 실시예 8 에 있어서 개시한 전자동 전기 영동 시스템을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 당사슬 전이율의 측정의 타이밍은 사용하는 효소에 따라 상이하지만, 1 분 이상 100 시간 이내, 바람직하게는 1 시간 이상 80 시간 이내, 보다 바람직하게는 2 시간 이상 72 시간 이내이다.

또한, 공정 1 에 있어서 사용하는 억셉터 분자는, 공정 1 과는 독립된 별개의 제조 방법에 있어서 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명의 방법은, 공정 1 에 앞서, 억셉터 분자를 별개로 조제하는 공정을 추가로 포함한다. 이 양태에 있어서, 억셉터 분자는, 예를 들면, 공정 1 에 있어서 사용하는 효소-A (당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬을 억셉터 분자로 전이하는 활성을 갖는 효소) 와 동일 또는 상이한 효소를, 원료가 되는 Fc 함유 분자 (당사슬 개변의 대상이 되는 Fc 함유 분자로서, 전형적으로는, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬, 불균일한 N297 결합 당사슬, 또는 숙주 세포 유래의 불균일한 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 와 반응시키는 등의 수법에 의하여, 공정 1 에 있어서의 당사슬 전이 반응과는 독립된 공정에 있어서 준비할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 억셉터 분자는, 예컨대, 당사슬 개변의 대상이 되는 Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을, N297 결합 당사슬의 코어 키토비오스 구조에 있어서의 GlcNAc 사이의 1,4-글리코시드 결합 (GlcNAcβ1-4GlcNAc) 을 특이적으로 가수분해하는 활성을 유지한 ENGase 로 처리하는 것 등에 의해 조제할 수 있다.

혹은, 공정 1 에서 사용하는 효소-A 에 가수분해 활성이 잔존하고 있을 경우, 공정 1 에 있어서의 억셉터 분자는, 공정 1 과 동일 조 내에 있어서 in situ 로 조제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 공정 1 은, 억셉터 분자가 in situ 로 조제되는 양태를 포함한다. 이 양태에서는, 공정 1 에 앞서, 억셉터 분자를 별개로 조제하는 공정을 생략할 수 있으므로, 제조 공정이 간략화된다. 당해 제조 공정의 간략화는, 당해 별도 공정에 있어서 사용한 ENGase 를 제거하는 공정도 불필요해지고, 또한, 당해 별도 공정에 있어서 발생한 비교적 불안정한 억셉터 분자를 분리·정제하는 처치도 필요가 없어지기 때문에, 매우 유익하다. 또한, 원료가 되는 Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 가수분해하는 효소와, 당사슬 도너 분자에 있어서의 당사슬을 전이하기 위한 효소로서 동일한 효소-A 를 사용하기 때문에, 사용되는 효소의 수·종류를 저감할 수 있다는 제조 공정상의 이점도 향수할 수 있다 (이 점은, 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질을 이용한 경우, 더욱 현저해진다). 이 양태에서는, 공정 1 에 있어서, 당사슬 도너 분자로부터 당사슬을 직접적으로 수령하는 분자인 억셉터 분자 그 자체가 아니라, 당사슬 개변의 대상이 되는 Fc 함유 분자 (전형적으로는, IgG 형의 모노클로날 항체 또는 당해 항체의 Fc 단편이나 정상 영역만으로 이루어지는 CLCH 등의 Fc 함유 분자) 를 반응계에 투입한다. 이러한 원료로서 투입하기 위한 Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬로는, 목적물인 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬과는 상이한 것이면, 특별히 제한은 없지만, 전형적으로는, 당해 Fc 함유 분자를 제조할 때에 사용한 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬, 불균일한 N297 결합 당사슬, 또는 당해 숙주 세포 유래의 불균일한 N297 결합 당사슬을 들 수 있다. 이러한 Fc 함유 분자를 공정 1 의 반응계에 투입하면, 효소-A 의 가수분해 활성에 의해, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬의 코어 키토비오스 구조에 있어서의 GlcNAc 사이의 1,4-글리코시드 결합 (GlcNAcβ1-4GlcNAc) 이 특이적으로 가수분해되어, 억셉터 분자가 in situ 로 생성된다. 계속해서, 효소-A 의 당사슬 전이 활성에 의해, 당해 in situ 로 생성된 억셉터 분자로, 당사슬 도너 분자의 당사슬이 전이됨으로써, 목적물인 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자가 원 포트로 제조된다. 이 양태에서는, 억셉터 분자는 in situ 로 생성되지만, 단리·정제는 되지 않기 때문에, 마치, 원료로서 투입한 Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬이, 원 스텝으로 당사슬 도너 분자 유래의 당사슬로 직접 교환된 것처럼 보인다. 그 때문에, 본 명세서에서는, 이러한 양태를, 적절히 「N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응」이라고 부른다.

N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서는, 특별히 제한없이, 상기 서술한 바와 같은 모든 종류의 당사슬 도너 분자를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자와, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬 도너 분자 모두 사용할 수 있다. 그러나, 환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬 (예를 들면, 환원 말단이 옥사졸린화된 당사슬) 을 당사슬 도너 분자로서 이용하는 경우, 당사슬이 수중에서 신속하게 가수분해되어, 항체에 대한 반응성을 잃기 때문에, 단시간에 반응을 완결시킬 필요가 있다는 제약이 있어, N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서 사용되는 당사슬 도너 분자는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자이다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 1 이, 억셉터 분자가 in situ 로 조제되는 양태를 포함하는 경우, 공정 1 에서 사용하는 당사슬 도너 분자는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자이다. 이러한 당사슬 도너 분자로는, 제한은 없고, 예를 들면, ＜신규 당사슬 도너 분자＞ 의 장에 있어서 구체적으로 개시하는 신규 당사슬 도너 분자를 들 수 있다. 예를 들어, 당사슬 도너 분자에 G-1 을 선택했을 경우, Fc 함유 분자 -[SG]₂ 가 얻어지고, 당사슬 도너 분자에 G-4, G-13, G-14, 혹은 G-16 을 선택했을 경우, Fc 함유 분자 -[X-MSG1]₂ 가 얻어지고, 또한 당사슬 도너 분자에 G-3, G-6, G-7, G-8, G-9, G-10, G-11, G-12, 혹은 G-15 를 선택했을 경우, Fc 함유 분자 -[X-SG]₂ 가 얻어진다.

한편, N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서, 환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬 (예를 들면, 환원 말단이 옥사졸린화되어 있는 당사슬) 을 당사슬 도너 분자로서 이용하는 경우, 상기한 바와 같이, 당사슬이 수중에서 신속하게 가수분해되어, 항체에 대한 반응성을 잃기 때문에, 단시간에 반응을 완결시킬 필요가 있다는 제약이 있다. in situ 로 억셉터 분자를 조제하는 경우, 단시간에 억셉터 분자를 생성시키기 위해서는 원료로서 투입하는 Fc 함유 분자의 농도를 높이는 것이 상기되지만, 이 농도가 지나치게 높으면, 환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬과 원료로서 투입한 Fc 함유 분자의 접촉 빈도가 높아져, 효소 비개재형의 당화 (Glycation) 가 우위로 진행될 가능성이 있다. 따라서, 환원 말단이 활성화되어 있는 당사슬을 이용하여 N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응을 실시하려면, 당화 반응을 억제하기 위하여, 원료로서 투입하는 Fc 함유 분자 농도를 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 혹은, 단시간에 억셉터 분자를 생성시켜, 활성화 당사슬 (예를 들면, 옥사졸린화 당사슬) 의 가수분해를 피하여 단시간에 반응을 완결시키기 위해, N297 결합 당사슬의 가수분해 활성이 보다 강한 효소-A 를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 비특허문헌 (Xiao Zhang, et al., ACS Chem Biol. 2021, 11, 2502-2514), 및 특허문헌 (WO2022226420) 에 있어서는, 숙주 세포 유래의 불균일한 당사슬을 갖는 항체에 대하여 옥사졸린화한 2 당과 야생형 Endo-S2 를 더하여, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 높은 당사슬 전이율로 항체에 부가할 수 있는 것이 보고되어 있다. 당해 보고에 있어서는, 항체에 전이된 2 당 옥사졸린 유래의 당사슬이 Endo-S2 의 가수분해 활성에 내성을 갖기 때문에, 가수분해 활성이 높은 야생형 Endo-S2 를 사용하여 단시간에 반응을 완결시키는 것이 가능하게 되어 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서도, 이러한 이미 알려진 방법을 이용하여, 반응에 사용하는 당사슬 도너 분자나 효소-A 를 적절하게 선택할 수 있다.

또한, N297 결합 당사슬의 직접 교환 반응에 있어서의 반응 온도 등의 여러 조건에 대해서는, 상기한 바와 같지만, 반응 시간에 대해서는, 억셉터 분자를 별개로 조제하는 공정을 포함하는 양태와 비교하여, 긴 시간을 설정하는 것이 바람직하다.

＜공정 2＞

본 발명에 관련된 제조 방법에 있어서, 공정 2 는, 공정 1 에서 얻은 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는 공정이며, 바람직하게는, 공정 1 에서 얻은 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 반응 혼합액에 포함되는 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를, 일부 또는 전부가 미반응인 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 로부터 단리하고, 회수하는 공정이다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 2 는, 공정 1 에서 얻은 반응 혼합액을 그대로 부하액으로 하거나, 또는 반응 혼합액에 적절히 완충액을 추가함으로써, 부하액을 조제하고, 당해 부하액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시킴으로써, 미반응의 억셉터 분자를 당해 매체에 선택적으로 흡착시키고, 한편, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 포함하는 통과액을 회수함으로써, 당해 Fc 함유 분자를 선택적으로 회수하는 공정이다.

상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서의 제조 방법에서는, 공정 2 에 있어서 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자와 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 를 분리할 수 있기 때문에, 공정 1 에서 소량의 당사슬 도너 분자만을 사용한 경우라도 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조할 수 있다. 본 착상에 있어서는, 공정 1 에서 이용하는 당사슬 도너 분자의 사용량을 억제하면서, 높은 당사슬 전이율의 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조하기 위해서는, 공정 2 가 높은 선택성과 회수율을 갖고 있을 필요가 있다. 선택성이 낮은 경우에는, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자를 미반응의 Fc 함유 분자 (억셉터 분자) 로부터 단리할 수 없기 때문에, 당사슬 전이율을 높일 수 없고, 또한 회수율이 낮은 경우에는, Fc 함유 분자의 수량을 늘리기 위해서는 공정 1 에서 억셉터 분자의 주입량을 늘릴 필요가 있기 때문에, 결과적으로 당사슬 도너 분자의 사용량이 증대되어, 목적으로 하는 효과가 얻어지지 않는다. 또, 본 발명을 공업 스케일에서의 의료용 항체의 제조 방법으로서 응용하는 경우에는, 공정 2 에서 목적물인 항체를 원하는 생물학적인 활성을 유지한 채 효율적으로 단리할 수 있을 필요가 있다.

종래의 단리 기술로는, N297 결합 당사슬이 부가된 항체 중에 포함되는 당사슬이 부가되어 있지 않은 (코어 GlcNAc 를 갖지 않는) 항체를 검출하는 분석 수법으로서 캐필러리 겔 전기 영동법 (CE-SDS) 이 알려져 있다 (Richard R. Rustandi 등, Electrophoresis. 2008 Sep ; 29(17) : 3612-20). 본 수법은, 환원 조건하에서 프래그먼트화한 항체의 중사슬을 분자의 유체 역학적 사이즈에 따라 단리할 수 있는 한편, 전처리의 과정에서 항체가 변성되어 생물학적인 활성을 잃는 것 외에, 미세한 캐필러리에 충전한 매체에 의해 항체를 단리하기 때문에, 처리능이 수백 μg 정도로 한정되어 있다. 또, ENGase 를 사용하여 조제한 코어 GlcNAc 를 갖는 항체를, ENGase 를 작용시키기 전의 N297 결합 당사슬을 갖는 항체로부터 단리하는 분석 수법으로서, 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 를 사용한 방법이 알려져 있다 (Matthew A 등, Measuring the Glycan Occupancy of Intact mAbs using HILIC and Detection by Intrinsic Fluorescence). 본 수법은, 항체의 프래그먼트화를 필요로 하지 않고, N297 결합 당사슬을 갖는 항체와 코어 GlcNAc 를 갖는 항체를 분리할 수 있는 한편, 가열과 유기 용매에 대한 폭로에 의해 항체가 변성되어 생물학적인 활성을 잃는 것 외에, 단리에는 고이론 단수의 분석용 칼럼이나 초고속 액체 크로마토그래피 장치 (UHPLC) 를 필요로 하기 때문에, 처리능이 수 μg 정도로 한정되어 있다. 또, ENGase 를 사용하여 조제한 코어 GlcNAc 를 갖는 항체를, ENGase 를 작용시키기 전의 N297 결합 당사슬을 갖는 항체로부터 단리하는 분석 수법으로서, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용한 방법이 알려져 있다 (Masaki Kurogochi 등, PLOS ONE｜DOI : 10.1371/journal. pone. 0132848 July 22, 2015, 및 Shiyi Wang 등, Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 6496-6502). 본 수법은, 항체를 변성시키지 않고 N297 결합 당사슬을 갖는 항체와 코어 GlcNAc 를 갖는 항체를 분리할 수 있는 한편, 고분해능의 분리를 달성하기 위해서는 고이론 단수의 분석용 칼럼을 사용하고, 2 액을 복잡한 프로그램으로 혼합하는 그래디언트 용출 방식을 필요로 하여, 처리능이 수백 μg 정도로 한정되어 있는 것 외에, 만족스러운 수율이 얻어지지 않는 결점이 있었다. 따라서, 본 발명 이전에 있어서는, 공업 스케일에서의 단리·정제 목적에 적용할 수 있는, 당사슬 부가의 유무에 따라 항체를 단리하는 방법은, 일체 보고되어 있지 않았다.

이와 같은 상황하에 있어서, 본 발명자들은, 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시킨다는 매우 심플한 방법으로, 목적물인 당사슬이 부가된 Fc 함유 분자를 변성시키지 않고 선택적으로 고수율로 단리·정제할 수 있는 것을 알아낸 것이다.

공정 2 는, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 멀티 모드 크로마토그래피에 있어서의 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 공정 1 에서 얻은 반응 혼합액을, 산성을 나타내는 완충액과 혼합함으로써 부하액을 얻고, 당해 부하액을, 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체를 충전한 칼럼에 통액함으로써, 칼럼에 흡착된 분자와, 통과한 분자를 분리할 수 있다. 공정 2 에서는, 계속하여, 평형화액 (또는 세정액) 을 통액함으로써, 칼럼에 비특이적으로 흡착된 분자를 씻어낸 후에, 용출액 (또는 재생액) 을 통액함으로써, 칼럼에 특이적으로 흡착된 분자를 용리시킬 수 있다. 공정 2 에서는, 그 후, 적절히 정치 세정 목적으로, 클리닝액을 통액할 수 있다.

공정 2 에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 멀티 모드 크로마토그래피는 산성 조건하에서 실행된다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 2 에 있어서의 부하액 (또는 부하액 및 평형화액) 은 산성의 pH 를 갖는다. 공정 2 에 있어서는, 부하액 (또는 부하액 및 평형화액) 의 pH 가 낮을수록 당사슬 전이율의 향상 효과가 높고, pH 의 증가에 수반하여 당사슬 전이율의 향상 효과가 저하되는 경향이 보인다. 본 발명에 있어서의 「산성 조건」으로는, 소기의 단리를 달성할 수 있는 한, 임의의 산성 pH (＜7.0) 를 사용할 수 있고, 예를 들어, 하한값 (부하액 및 평형화액의 pH 의 하한값) 으로는, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 및 4.0 에서 선택되는 임의의 pH 를 채용할 수 있고, 상한값 (부하액 및 평형화액의 pH 의 상한값) 으로는 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0, 3.9, 3.8, 3.7, 3.6 및 3.5 에서 선택되는 임의의 pH 를 채용할 수 있다. 또한, 「산성 조건」에 있어서의 pH 의 범위 (부하액 및 평형화액의 pH 의 범위) 로는, 상기에 있어서 언급한 상한값 및 하한값의 각각의 임의의 조합, 또는 2.5 ∼ 5.0, 바람직하게는 3.0 ∼ 4.8, 더 바람직하게는 3.3 ∼ 4.7, 특히 바람직하게는 3.4 ∼ 4.6, 가장 바람직하게는 3.5 ∼ 4.5 를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 2 에 있어서의 산성 조건은, pH 2.5 ∼ 5.0, 바람직하게는 pH 3.0 ∼ 4.8, 더욱 바람직하게는 pH 3.3 ∼ 4.7, 특히 바람직하게는 pH 3.4 ∼ 4.6, 가장 바람직하게는 pH 3.5 ∼ 4.5 의 범위를 의미한다.

공정 2 에서는, 공정 1 에서 얻은 반응 혼합액을 그대로 칼럼에 통액하기 위한 부하액으로 하거나, 반응 혼합액에 적절히 완충액을 추가함으로써, 부하액을 조제할 수 있다. 부하액을 조제하기 위한 완충액으로는, 부하액이 산성의 pH 를 갖는 한, 모든 완충액을 사용할 수 있지만, 예를 들어 아세트산 완충액, 시트르산 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 프탈산 완충액을 들 수 있다.

또, 부하액에 적절히 염을 첨가함으로써, 소기의 염 농도를 갖도록 조정할 수도 있다. 부하액을 조제하기 위한 염으로는, 소기의 단리를 달성할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘을 들 수 있다. 또한, 염 농도로는, 예를 들어, 30 ∼ 2000 mM, 바람직하게는 150 ∼ 1000 mM, 보다 바람직하게는 200 ∼ 750 mM, 더욱 바람직하게는 280 ∼ 600 mM, 특히 바람직하게는 310 ∼ 500 mM 을 들 수 있다. 또한, 부하액에 있어서의 염 농도는, 최종적인 목적물의 수율이나 순도에 영향을 미치고, 또한, 그 최적 염 농도는, 목적물이나 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체의 종류에 따라서 변화하기 때문에, 주어진 크로마토그래피 환경에 따라서, 최적의 염 농도를 채용하는 것이 바람직하다.

부하액에 있어서의 Fc 함유 분자의 농도는, 소기의 단리를 달성할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 0.1 ∼ 100 mg/mL, 바람직하게는 0.5 ∼ 50 mg/mL, 보다 바람직하게는 1.5 ∼ 30 mg/mL, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 20 mg/mL, 특히 바람직하게는 3 ∼ 10 mg/mL 를 들 수 있다. 또한, 매체에 통액하는 부하액 자체의 체적으로는, 통상의 방법에 따라, 매체의 체적 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

공정 2 에 있어서의, 평형화액으로는, 단리 전에 매체 내의 pH 및 염 농도를 평형화하고, 또한 매체에 흡착된 분자를 실질적으로 단리하지 않고, 매체에 비특이적으로 흡착된 분자를 씻어낼 수 있는 것이면, 모든 것을 사용할 수 있다. 평형화액으로서 사용할 수 있는 완충액이나, 평형화액 중의 염 농도에 대해서는, 부하액에 대한 언급을 참조하기 바란다. 평형화액의 통액량에 대해서는, 통상의 방법에 따라, 매체의 체적 등에 따라서 적절히 결정할 수 있고, 예를 들어, 1 ∼ 100 칼럼 용량 (CV), 바람직하게는 5 ∼ 50 CV, 보다 바람직하게는 8 ∼ 40 CV, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 30 CV, 특히 바람직하게는 12 ∼ 20 CV 를 들 수 있지만, 이들에는 한정되지 않는다.

공정 2 에 있어서의, 용출액은, 매체에 흡착된 분자를 용리할 수 있는 것이지만, 모든 것을 사용할 수 있고, 클리닝액은, 매체를 정치 세정 (CIP) 할 수 있는 것이면, 모든 것을 사용할 수 있다. 따라서, 용출액이나 클리닝액에 대해서는, 이미 알려진 방법에 준하여, 또는, 이미 알려진 방법을 응용함으로써, 적절히 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서의 제조 방법에서는, 공정 2 의 종료 후의 당사슬 전이율로는, 임의의 수치를 설정할 수 있고, 예를 들면 85 ％ 이상, 90 ％ 이상 또는 95 ％ 이상을 설정할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 2 의 당사슬 전이율은, 90 ％ 를 초과하는 것이며, 바람직하게는 95 ％ 를 초과하는 것이며, 특히 바람직하게는 99 ％ 를 초과하는 것이다. 또한, 공정 2 의 공정 수율로서도 임의의 수치를 설정할 수 있지만, 상기 서술한 바와 같이 공정 2 의 공정 수율을 높일수록 공정 1 의 당사슬 도너 분자 사용량을 삭감할 수 있기 때문에 보다 높은 공정 수율이 바람직하다. 단, 소기의 단리를 달성할 수 있는 한, 공정 수율은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 1 ∼ 99 ％, 바람직하게는 5 ∼ 95 ％, 보다 바람직하게는 20 ∼ 95 ％, 특히 바람직하게는 40 ∼ 90 ％ 를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 매체란, 양이온 교환기를 갖는 매체를 의미한다. 양이온 교환 크로마토그래피 매체는, 그 표면에 술폰산기 (R-SO₃H) 가 결합한 강산형과, 카르복실기 (R-COOH), 페놀성 하이드록실기 (R-OH), 포스폰산기 [R-P(=O)(OH)₂], 혹은 포스핀산기 [R-P(=O)(OH)-R] 가 결합한 약산형으로 분류된다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 매체는, 강산형 혹은 약산형의 매체이며, 및/또는 양이온 교환기로서, 술폰산기, 카르복실기, 페놀성 하이드록실기, 포스폰산기, 또는 포스핀산기를 갖는 매체이다. 구체적인 이온 교환 크로마토그래피 매체의 형태로는, 입자상, 멤브레인상, 모노리스상, 판상, 칩상, 섬유상 등 중 어느 것이어도 되지만, 매체에 흡착시키는 분자의 특성 관점에서, 입자상, 멤브레인상, 모노리스상 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

입자상의 양이온 교환 크로마토그래피 매체로서, SP sepharose FF (Cytiva), SOURCE 15S (Cytiva), Capto S Impact (Cytiva), Eshmuno CP-FT (Merck), Exhmuno CPX (Merck), POROS HS (Thermo), POROS XS (Thermo), Nuvia HR-S (BiO-RAD), Cellufine Max GS (JNC) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

멤브레인상의 양이온 교환 크로마토그래피 매체로서, Sartobind S (Sartorius), Mustang S (Pall) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

모노리스상의 양이온 교환 크로마토그래피 매체로서, CIM monolith SO3 (BIA Separation) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지는 않는다.

공정 2 의 양이온 교환 크로마토그래피는, 이미 알려진 장치를 사용하여 실행할 수 있으며, 이러한 장치로는, AKTA avant 25 (Cytiva) 를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 공정 2 의 양이온 교환 크로마토그래피에 있어서의, 이동상의 유속은, 통상의 방법에 따라 적절히 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 멀티 모드 크로마토그래피 매체란, 양이온 교환기 및 양이온 교환기와는 상이한 작용이 가능한 작용기를 적어도 1 종 포함하고, 일 실시양태에서는 상이한 작용이 가능한 작용기는 소수성 상호 작용이 가능한 작용기이다. 양이온 교환기로는, 양이온 교환 크로마토그래피 매체에서 언급된 것과 동일한 것을 들 수 있다. 또한, 멀티 모드 크로마토그래피 매체의 형태로는, 양이온 교환 크로마토그래피 매체에서 언급된 것과 동일한 것을 들 수 있다. 멀티 모드 크로마토그래피 매체로서, Capto(TM)MMC 나 TOYOPEARL(TM)MX-TRP-650M 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 공정 2 의 멀티 모드 크로마토그래피는, 이미 알려진 장치를 사용하여 실행할 수 있다. 또한, 공정 2 의 멀티 모드 크로마토그래피에 있어서의, 이동상의 유속은, 통상의 방법에 따라 적절히 결정할 수 있다.

＜콘주게이트＞

본 발명의 공정 1 및 공정 2 를 개재하여 얻어진 Fc 함유 분자는, 또한 화학적으로 혹은 생화학적으로 수식할 수 있다. 전술한 당사슬 도너 분자의 구조식 중 X 의 부분에, 아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기, 예를 들어, N₃ 을 갖는 폴리에틸렌글리콜 링커 (L(PEG)) 를 갖는 당사슬 도너 분자를 사용함으로써, 당사슬의 비환원 말단에 아지드기를 갖는 Fc 함유 분자, 예를 들어, 이하의 식으로 나타내는, N297-(Fuc)SG-L(PEG)₂, N297-(Fuc)MSG1-L(PEG) 또는 N297-(Fuc)MSG2-L(PEG) 의 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조할 수 있다.

[화학식 19]

[화학식 20]

(식 중, L(PEG) 는, β-Man 의 분기사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다. L(PEG) 는, 에틸렌글리콜 구조를 포함하고, 다른 결합 구조 및/또는 수식 구조를 포함하고 있어도 되는 링커 구조이다.)

[화학식 21]

[화학식 22]

(식 중, L(PEG) 는, β-Man 의 분기사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다. L(PEG) 는, 에틸렌글리콜 구조를 포함하고, 다른 결합 구조 및/또는 수식 구조를 포함하고 있어도 되는 링커 구조이다.)

[화학식 23]

[화학식 24]

(식 중, L(PEG) 는, β-Man 의 분기사슬 중 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다. L(PEG) 는, 에틸렌글리콜 구조를 포함하고, 다른 결합 구조 및/또는 수식 구조를 포함하고 있어도 되는 링커 구조이다.)

아지드기 (N₃-) 는, (헤테로)시클로알키닐기 (예를 들어, DBCO (Dibenzocyclooctyne)) 등의 알킨 구조와 반응시킴으로써, 1,2,3-트리아졸 고리를 형성한다 (SPAAC (strain-promoted alkyne azide cycloaddition : Agard NJ, et al., J Am Chem Soc. 2004, 126, 46, 15046-15047). 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬이, 아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기로 화학 수식되어 있는 비환원 말단을 갖거나, 혹은 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬 자체는 아지드기를 갖지 않지만, 공정 1 또는 공정 2 후에, 당해 당사슬의 비환원 말단에 아지드기를 갖는 치환기를 도입한 경우, 본 발명에 관련된 제조 방법은, 추가로, 당해 당사슬의 아지드기 (N₃-) 에, 알킨 구조를 갖는 분자를 반응시키는 공정을 포함할 수 있다. 본 명세서에서는, 이와 같이 하여, 알킨 구조를 갖는 분자와 결합한 상태의 Fc 함유 분자를, 「콘주게이트」라고 칭하는 경우가 있다. 또한, 본 발명의 공정 1 및 공정 2 를 개재하여 얻어진 Fc 함유 분자를, SPAAC 이외의 반응에 의해, 다른 분자와 복합체화한 것도, 「콘주게이트」라고 부르는 경우가 있다.

알킨 구조를 갖는 분자로는, 예를 들면, (헤테로)시클로알키닐기를 갖고, 또한 원하는 활성을 갖는 분자를 들 수 있고, 바람직하게는, 약학적으로 활성인 화합물 (예를 들어, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 부활화제 (예를 들어, STING 아고니스트 (WO2020/050406, WO2014/099824, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2014/189806, WO2015/074145, WO2015/185565, WO2016/096714, WO2016/012305, WO2016/145102, WO2017/027646, WO2017/027645, WO2017/075477, WO2017/093933, WO2017/100305, WO2017/123669, WO2017/161349, WO2017/175147, WO2017/175156, WO2018/009466, WO2018/045204, WO2018/060323, WO2018/067423, WO2018/065360, WO2014/093936, WO2018/009648, WO2018/100558), TLR 아고니스트, A2AR 안타고니스트, IDO 저해제, CTLA-4, LAG-3 및 PD-1 경로의 안타고니스트, 체크 포인트 저해제, 혈관 내피 증식 인자 (VEGF) 수용체 저해제, 슴즌 (smoothen) 저해제, 알킬화제, 대사 길항제, 레티노이드 및 항암 백신, 아쥬반트, 지질, 리포솜, 독소, 항균제, 항바이러스제, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 항원, 비타민, 호르몬 등) 을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 화학 요법제 또는 독소로는, 캄토테신 (예를 들어, WO2014/057687), 피로로벤조디아제핀 (예를 들어, WO2013/173496, WO2014/130879, WO2017/004330, WO2017/004025, WO2017/020972, WO2016/036804, WO2015/095124, WO2015/052322, WO2015/052534, WO2016/011519, WO2015/052321, WO2015/031693, WO2011/130613, WO2019/065964), 독소루비신, 오리스타틴, 탁산 혹은 그 유도체를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 면역 부활화제로는, STING 아고니스트, TLR 아고니스트 및 A2AR 안타고니스트를 예시할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 알킨 구조를 갖는 분자로는, 바람직하게는 이하의 (A) ∼ (E) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자를 들 수 있다 :

상기에 있어서 기술해 온 제조 방법에 의해 제조되는 Fc 함유 분자도 또한, 본 발명의 범위 내이다. 따라서, 본 발명은 그 일 양태에 있어서, 상기에 있어서 기술해 온 제조 방법에 의해 제조되는 Fc 함유 분자를 포함한다.

＜단리 방법＞

본 발명자들에 있어서 발견한, 소기의 당사슬을 갖는 당단백질 (특히, N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 과, 당해 당사슬을 갖지 않는 당단백질을, 산성 조건하에서의 양이온 교환 크로마토그래피 또는 멀티 모드 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다는 지견은, 상기에 있어서 서술해 온 바와 같은 제조 방법과는 독립적으로, 단순히 목적 당단백질을 단리하는 용도에도 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 당단백질 (특히, N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 의 단리 방법으로서, 상기 당단백질 (Fc 함유 분자) 과 1 개 이상의 불순물을 포함하는 용액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 불순물을 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키는 공정을 포함하는, 단리 방법이 제공된다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 당해 단리 방법은, 상기 당단백질 (Fc 함유 분자) 과 1 개 이상의 불순물을 포함하는 용액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시킴으로써, 불순물을 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키고, 한편, 당해 매체에 선택적으로는 트랩되지 않는, 소기의 당사슬을 갖는 당단백질 (N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 을 포함하는 통과액을 회수함으로써, 당해 당단백질 (Fc 함유 분자) 을 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 단리 방법이다.

본 발명에 있어서의 단리 방법의 일 양태에 있어서, 당단백질은 Fc 함유 분자이고, 전형적으로는, N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자이다. N297 결합 당사슬은, 하이 만노오스형 당사슬, 혼성형 당사슬 및 복합형 당사슬 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 복합형 당사슬이다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, N297 결합 당사슬은, 복합형 당사슬이다. 또한, 소기의 당사슬을 갖는 당단백질 (예를 들면, N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자) 로부터 분리해야 할 불순물로는, 전형적으로는, 목적물인 당단백질 (Fc 함유 분자) 과는 당사슬 (예를 들면, N297 결합 당사슬) 의 구조가 상이하거나, 혹은 당사슬 (예를 들면, N297 결합 당사슬) 을 결실시키고 있는 것 이외에는, 당단백질 (Fc 함유 분자) 과 동일 구조를 갖는 분자를 들 수 있다. 예를 들면, 목적물인 Fc 함유 분자에 있어서의 N297 결합 당사슬이, 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 가 아닌 경우 (예를 들면, N297 결합 당사슬이, 하이 만노오스형 당사슬, 혼성형 당사슬 및 복합형 당사슬의 어느 것인 경우), 상기 1 개 이상의 불순물은, N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 것 이외에는 상기 Fc 함유 분자와 동일한 분자를 포함한다.

본 발명에 관련된 단리 방법은, 반드시 Fc 함유 분자의 제조 방법의 일 공정으로서 삽입될 필요는 없다는 점을 제외하고는, 기본적으로 본 발명에 관련된 제조 방법의 공정 2 와 동일하다. 따라서, 상기 공정 2 에 관하여 언급해 온 것은, 본 발명에 관련된 단리 방법을 실시할 때에도 그대로 적용된다.

또한, 본 발명에 관련된 단리 방법은, 소기의 당사슬 전이 반응과 조합할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법이 제공된다.

[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 단리, 회수 또는 단리 회수하는 공정.

당해 단리 방법에 있어서의 공정 1 및 2 는, 상기에 있어서 기술해 온 본 발명에 관련된 제조 방법의 공정 1 및 공정 2 와 동일하다. 따라서, 상기 공정 1 및 공정 2 에 관하여 언급해 온 것은, 당해 단리 방법을 실시할 때에도 그대로 적용된다.

＜신규 당사슬 도너 분자＞

본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 이하의 식 :

[화학식 25]

로 이루어지는 군에서 선택되는 식에 의해 나타내는 신규 당사슬 도너 분자가 제공된다. 이하의 실시예에 있어서 구체적으로 기재하는 바와 같이, 이들 신규 당사슬 도너 분자는, 본 발명에 관련된 제조 방법에 있어서 바람직하게 사용할 수 있는 것이 실증되어 있지만, 그 이외의 당사슬 리모델링 반응 (당사슬 전이 반응) 에도 사용할 수 있는 것을 기대할 수 있다. 본 발명에 관련된 제조 방법에 있어서 상기 신규 당사슬 도너 분자를 사용하는 경우, 각 당사슬 도너 분자는, 실시예에 있어서의 시험 결과를 참조하면서, 사용하는 효소-A 와 효소-B 의 조합에 대한 상성 등을 감안하여, 적절히 결정하는 것이 바람직하다.

＜항체-면역 부활화제 콘주게이트 (Rp,Rp-XIII) 의 제조 방법＞

본 발명의 일 양태에 있어서,

[공정 1] N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와, 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 및 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정으로서, 상기 Fc 함유 분자가 항체이고, 상기 당사슬 도너 분자가 식 G-10 에 의해 나타내어지는 화합물인 공정,

[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는 공정, 그리고

[공정 3] 당해 당사슬의 아지드기 (N₃-) 에, 이하의 식 (Rp,Rp-XII) :

[화학식 26]

으로 나타내는 Cyclic dinucleotide (CDN) 콘주게이트 전구체를 고리화 부가 반응에 의해 결합시키는 공정을 포함하는, 항체-면역 부활화제 콘주게이트 (Rp,Rp-XIII) 의 제조 방법이 제공된다. 당해 제조 방법에 있어서, 공정 1 및 공정 2 는, 상기 ＜공정 1＞ 및 ＜공정 2＞ 의 장에 있어서 언급해 온 것이 그대로 적용된다. 따라서, 이하에 있어서 공정 3 및 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트에 대하여 상세하게 서술한다.

공정 3 은, 이하의 모식도에 의해 나타내어진다.

[화학식 27]

(식 중,

(3) 은, 공정 2 에 있어서 얻어진, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 모식적으로 나타낸 것으로,

항체-면역 부활화제 콘주게이트 (Rp,Rp-XIII) 의 좌측의 2 개의 아스테리스크 (*) 는 우측의 아스테리스크로 나타내는 CDN-링커 부분을 나타내고, 및

A1 은,

[화학식 28]

의 어느 것을 나타낸다).

항체-면역 부활화제 콘주게이트 (Rp,Rp-XIII) 는, 공정 2 에 있어서 얻어진 Fc 함유 분자 (3) 와 CDN 콘주게이트 전구체 (Rp,Rp-XII) 를 고리화 부가 반응에 의해 결합시켜 제조할 수 있다. CDN 콘주게이트 전구체 (Rp,Rp-XII) 는, WO2020/050406, WO2021/177438, 또는 WO2022/163846 을 참조하여 제조할 수 있다. 고리화 부가 반응으로는, 예를 들어 Diels-Alder 반응, 및 1,3-쌍극자 고리화 부가 반응을 들 수 있고, 바람직하게는 1,3-쌍극자 고리화 부가 반응을 사용하여 제조한다. 1,3-쌍극자 고리화 부가 반응으로는, 예를 들어, 아지드와 말단 알킨의 고리화 부가 반응, 및 SPAAC (변형 촉진형 아지드-알킨 부가 고리화 반응 strain-promoted azide-alkyne cycloaddition : J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047) 반응을 들 수 있고, 바람직하게는 SPAAC 반응을 사용하여 제조한다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 3 은, 공정 2 에 있어서 얻어진 Fc 함유 분자 (3) 와 CDN 콘주게이트 전구체 (Rp,Rp-XII) 를, SPAAC 반응에 의해 결합시키는 공정을 포함한다.

(E-1 공정)

이하에 있어서, 공정 3 에 있어서의 SPAAC 반응에 대하여 기술한다. 공정 2 에 있어서 얻어진 Fc 함유 분자 (3) 의 완충 용액 (인산 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액등) 과, CDN 콘주게이트 전구체 (Rp,Rp-XII) 를 적당한 용매 (디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 프로필렌글리콜 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응을 실시할 수 있다. CDN 콘주게이트 전구체 (Rp,Rp-XII) 는, Fc 함유 분자 (3) 1 몰에 대하여, 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 4 몰 내지 30 몰이며, 유기 용매의 비율은, Fc 함유 분자 (3) 의 완충 용액에 대하여 1 ％ 내지 200 ％(v/v) 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 15 ℃ 내지 25 ℃ 이고, 반응 시간은 1 시간 내지 150 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 72 시간이다. 반응 용액의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다. 적절히, 반응 용액을 후술하는 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라 단리하여, 항체-면역 부활화제 콘주게이트 (Rp,Rp-XIII) 를 얻을 수 있다.

항체-면역 부활화제 콘주게이트는, 후술하는 공통 조작 D 내지 G 에 의해 버퍼 교환, 단리, 항체 농도의 측정 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수의 측정을 실시하고, 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 동정을 실시할 수 있다.

공통 조작 A : 항체 수용액의 농축

Amicon (등록상표) Ultra 원심식 필터 디바이스 (50,000 NMWL, Merck Millipore Ltd.) 에 항체 또는 항체-면역 부활화제 콘주게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000 G 내지 4000 G 로 5 분간 내지 20 분간 원심) 에 의해, 항체 및 항체-면역 부활화제 콘주게이트 용액을 농축할 수 있다.

공통 조작 B : 항체의 농도 측정

UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라, 항체 농도의 측정을 실시할 수 있다. 그 때에, 항체마다 상이한 280 nm 흡광 계수 (1.3 mLmg^-1cm^-1 내지 1.8 mLmg^-1cm^-1) 를 사용한다.

공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환

항체 수용액에 완충액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고, 공통 조작 A 에 기재된 방법에 따라서 농축한다. 이 조작을 수 회 실시한 후, 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 항체 농도를 측정한다. 이 항체 완충 용액에, 적절히 완충액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하여, 목적으로 하는 농도 (예를 들어, 약 10 ㎎/mL) 의 항체 완충 용액을 조제할 수 있다.

공통 조작 D : 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 단리 (겔 여과 크로마토그래피)

아세트산 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5 ; 본 명세서에서는 ABS 라고 칭한다) 또는 그 이외의 적당한 완충액으로 NAP 칼럼 (NAP-5, NAP-10, NAP-25 (GE 헬스케어 제조)) 을 평형화시킨다. 이 NAP 칼럼에, 항체-면역 부활화제 콘주게이트 반응 용액을 차지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분리 채취한다. 이 획분을 다시 NAP 칼럼에 차지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분리 채취한다. 이 조작을 합계 2 회 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 면역 부활화제 링커나 디메틸술폭시드, 프로필렌글리콜을 제거한 항체-면역 부활화제 콘주게이트를 얻을 수 있다. 필요에 따라, 공통 조작 A 및 C 에 의해 항체-면역 부활화제 콘주게이트 용액의 농도를 조절할 수 있다.

공통 조작 E : 항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수의 측정 (UV 법)

항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 결합 면역 부활화제 농도는, WO2020/050406, WO2021/177438 에 기재된 방법에 준하여, 흡광 광도계 (UV/VIS Spectrometer Lambda 25, PerkinElmer, Inc.) 를 사용하여, 항체-면역 부활화제 콘주게이트 수용액의 280 ㎚ 및 250 ㎚ 의 2 파장에 있어서의 흡광도를 측정함으로써 산출할 수 있다.

공통 조작 F : 항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수의 측정 (역상 고속 액체 크로마토그래피 법 : RP-HPLC)

항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 에 더하여, WO2020/050406, WO2021/177438 에 기재된 방법에 준하여 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.

공통 조작 G : 항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수의 측정 (소수성 상호 작용-고속 액체 크로마토그래피법 : HI-HPLC)

항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당 면역 부활화제 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 및 F 에 더하여, WO2020/050406, WO2021/177438 에 기재된 방법에 준하여 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.

상기에 있어서 기술해 온 제조 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 컨주게이트도 또한, 본 발명의 범위 내이다. 따라서, 본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 상기에 있어서 기술해 온 제조 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 컨주게이트를 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하는 경우도 있는데, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이들의 혼합물 모두 본 발명에 포함된다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 면역 부활화제의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조는, 면역 부활화제의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 면역 부활화제가 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상이다. 그러나, 본 발명의 방법에서는, 공정 1 및 2 에 있어서, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 제조할 수 있기 때문에, 결과적으로, 면역 부활화제의 결합수가 균일한 항체-면역 부활화제 컨주게이트를 고순도로 얻을 수 있다. 항체 1 분자에 대한 면역 부활화제의 결합수는 평균값, 즉, 평균 면역 부활화제 결합수 (DAR : Drug to Antibody Ratio) 로서 특정할 수 있다. 항체 분자에 대한 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당 면역 부활화제 평균 결합수로서, 1 내지 4 의 범위의 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 2 내지 4 개이고, 보다 바람직하게는 3 내지 4 개, 더욱 바람직하게는 3.2 내지 4 개, 특히 바람직하게는 3.5 내지 4 개이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 상기 [공정 1] 의 당사슬 도너 분자를 식 G-10 대신에 G-14 를 사용하는 것 이외에는 상기 방법과 동일하게 하여 1 항체당 면역 부활화제 평균 결합수로서, 1 내지 3 의 범위의 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 결합시킨 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 제조 방법이 제공된다. 이 경우, 공정 2 에 있어서 얻어지는 Fc 함유 분자는, (3) 이 아니라, 이하의 (3') 에 의해 나타내는 구조를 갖는다. 항체 분자에 대한 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당 면역 부활화제 평균 결합수는, 바람직하게는 1.0 내지 2.5 개이며, 보다 바람직하게는 1.2 ∼ 2.2 의 범위이다.

[화학식 29]

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 부착되거나, 수화물이 되는 경우가 있으며, 그러한 물을 포함하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트는, 아미노기 등의 염기성기를 갖고 있기 때문에, 원하는 바에 따라 의약적으로 허용되는 염으로 할 수 있다. 그러한 염으로는, 예를 들어 염산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산, 아세트산, 말산, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트는, 인산기 및/또는 티오인산기를 그 구조에 포함하기 때문에, 일반적으로 염기 부가염을 형성하는 것이 가능하다. 의약적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, tert-부틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트는, 공기 중의 수분을 흡수하거나 함으로써 수화물로서 존재하는 경우도 있다. 본 발명의 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 수화물, 에탄올화물, 2-프로판올화물 등이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트 중에는 질소 원자가 존재하기 때문에, N-옥사이드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드체도 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트에는 황 원자가 존재하기 때문에, 술폭시드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 술폭시드체도 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트에는, 다양한 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트를 구성하는 원자의 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항체-면역 부활화제 콘주게이트는 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 와 같은 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체-면역 부활화제 콘주게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성인지의 여부를 불문하고, 본 발명의 범위에 포함된다.

＜효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질 및 당해 융합 단백질을 사용한 Fc 함유 분자의 제조 방법＞

본 발명의 또 다른 일 양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질이 제공된다. 본 명세서에 있어서, 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질은, 효소-A 와 효소-B 가 직접적 또는 간접적으로 결합되어 있는 상태의 단백질을 의미한다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질은, 효소-A 와 효소-B 의 양방이 임의의 고상 담체에 고정화된 고정화 효소이며, 또, 본 발명의 다른 일 양태에 있어서, 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질은, 효소-A 와 효소-B 가 직접 결합되어 있거나, 혹은 임의의 링커, 예를 들어, 임의의 아미노산, PEG 등의 폴리머, 올리고머 링커 등, 바람직하게는 아미노산 링커를 개재하여 결합되어 있는 융합 단백질이다. 효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질에 있어서 사용되는 효소-A 와 효소-B 로는, 각각의 역할을 하는 한, 임의의 조합을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이하의 표에 기재한 [효소-A]-[효소-B] 융합 단백 효소, [효소-B]-[효소-A] 융합 단백 효소를 들 수 있다.

효소-A 와 효소-B 의 융합 단백질은, Fc 함유 분자의 제조에 있어서 사용되는 경우, 제조 공정에 있어서 조제·준비해야 할 효소의 수를 줄일 수 있는 등과 같은 이점을 초래할 수 있고, 이것은, 본 발명의 공정 2 와는 독립적으로 얻어지는 이점이다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 이하의 공정 1' : N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 와 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 의 융합 단백질의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정을 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 제조 방법이 제공된다. 당해 공정 1' 에 있어서 사용되는 억셉터 분자나 당사슬 도너 분자나 반응 조건 등은, 모두 상기에 있어서 공정 1 에 대하여 설명해 온 것을 그대로 적용할 수 있다. 또한, 공정 1' 에 공정 2 를 후속시킴으로써, 보다 높은 당사슬 전이율을 달성할 수도 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타낸 것은, 본 발명의 실시형태의 일례이며, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재되어 있는 단백질 농도는, 초미량 분광 광도계 NanoDrop8000 (Thermo Fisher Scientific 제조), 혹은 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 를 사용하여 정량하였다.

실시예 중의 SGP (시알릴글리코펩티드) 는, WO2017110984 의 실시예 1 에 기재된 방법, 혹은 WO2014208742 의 실시예 1 에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 실시예 중의 AG(9)-P 는, WO2014115797 의 실시예 1-17 의 공정 1-17A 에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 실시예 중의 AG(7)-P 는, WO2014115797 의 실시예 1-17 의 공정 1-17B 에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.

실시예 중의 ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-Asn-PEG(3)-N₃ 은, WO2018003983 의 실시예 1-12, 공정 1-12A 에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 실시예 중의 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃ 은, WO2019065964 의 실시예 154 의 공정 3 에 기재된 방법으로 제조할 수 있다.

실시예 중의 mAb1 은, Trastuzumab 를 나타낸다. (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 은, WO2017010559 의 실시예 3 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 Trastuzumab 의 당사슬 가수분해체를 나타낸다. 실시예 중의 mAb2 는, WO2019065964 의 실시예 136 에 기재된 방법 및 WO2019065964 내의 서열 번호 36 및 52 로 제조할 수 있는 항체를 나타낸다. (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b2 는, WO2019065964 의 실시예 61 의 공정 1 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 당사슬 가수분해체 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L1) 를 나타낸다. 실시예 중 ㎃b2-[MSG1-N₃]₂ 는, WO2019065964 의 실시예 61 의 공정 2 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 항 CLDN6 항체 (H1L1)-[MSG1-N₃]₂ 를 나타낸다. 실시예 중의 ㎃b3 은, WO2020050406 의 참고예 5 에 기재된 방법 및 WO2020050406 내의 서열 번호 28 및 30 으로 제조할 수 있는 개변 HER2 항체 2 를 나타낸다. (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b3 은, WO2020050406 의 실시예 85 의 공정 1 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 당사슬 가수분해체 (Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 HER2 항체 2 를 나타낸다. 실시예 중 ㎃b3-[SG-N₃]₂ 는, WO2020050406 의 실시예 85 의 공정 2 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 개변 항 HER2 항체-[MSG1-N₃]₂ 를 나타낸다.

당사슬 가수분해, 및 당사슬 전이 반응의 진행 정도를 단백질의 겔 전기 영동법을 사용하여 확인하였다 (WO2013/120066, Huang W, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 12308-12318). 단백질의 전자동 전기 영동 시스템으로서, 장치에는 LabChip GX II (PerkinElmer 제조), 시약은 Protein Express Assay LabChip 및 Protein Express Reagent Kit (PerkinElmer 제조) 를 사용하였다.

＜실시예 1＞ 효소-A 와 효소-B 의 선택 방법

효소-A 와 효소-B 가 협주적으로 작용하면, 화학적으로 활성화되어 있지 않은 당사슬 도너 분자로부터, 그 당사슬 유닛의, Fc 함유 분자의 GlcNAc (억셉터 분자) 로의 직접 전이가 가능해진다. 본 실시예에서는, 효소-A 는, Fc 함유 분자와 친화성이 있는 도메인과, 당사슬과 친화성이 있는 도메인과, 당사슬 전이 반응 촉매 영역을 갖는 효소이며, 또한, 효소-B 는, 푸코오스를 갖지 않는 2 분기 당사슬 도너 분자로부터, 효소-A 가 Fc 함유 분자로의 당사슬 전이 반응에 이용 가능한 상태 (활성화 중간체) 로 활성화하는 효소이다 (이하의 모식도 또는 도 1 참조). 실시예 8 이후에 조합할 수 있는 효소-A 와 효소-B 의 일반적인 성질, 효과적인 반응 조건을 확인하기 위해, 실시예 2 내지 실시예 6 에서 조제하는 효소를, 이하의 표 Y-1 에 디자인하였다.

각각의 역할을 하는 효소-A 와 효소-B 이면, 효소종은 한정되지 않고, 그들을 임의로 조합함으로써, 원하는 당사슬 전이체를 얻을 수 있다.

효소-A 의 대표예로서, 가수분해 활성은 잔존하지만, 대응하는 각각의 야생형 효소보다 가수분해 활성이 억제되고 있는 것을 기대할 수 있는 Endo-S 변이체의 대표예, Endo-S2 변이체의 대표예 및 Endo-Si 변이체의 대표예를 선택하였다. 효소-B 자신의 당사슬 전이 활성은, 당사슬 도너 활성화 능력과 상관이 있다고 생각되는 점에서, 효소-B 의 대표예로서 푸코오스를 갖지 않는 2 분기 당사슬 도너 분자인 SGP 로부터 GlcNAc 유도체로의 당사슬 전이 활성이 알려져 있는 Endo-M 변이체의 대표예, 및 Endo-Rp 변이체의 대표예를 선택하였다.

[화학식 30]

상기 모식도 및 도 1 중, 시알산 상의 X 는, 수소 원자를 포함하는 임의의 치환기를 나타낸다. 예를 들어, X 는 PEG-azide 이다. 도면 중, 당사슬 환원 말단의 Z 는 임의의 치환기이고, 바람직하게는 질소 원자 또는 산소 원자를 개재하여 결합되는 NHR, OR 로 나타낸다. 예를 들어, R 은, PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe 및 A-PEG-N₃ (A 는 글리콜산 유닛 중의 아세틸기, 즉, 아노머 수산기와, Mor 또는 PEG 중의 아미노기 사이에 놓인 부분을 나타낸다) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이다.

＜실시예 2＞ Endo-Si 효소의 조제

(실시예 2-1) Endo-Si 효소의 발현

서열 번호 3 에 대응하는 유전자를 코드한 Endo-Si 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써, Endo-Si 산생주를 얻었다. 계속해서, 진탕 배양 조건하 또는 통기 교반 배양 조건하에서의 메탄올 유도에 의한 Endo-Si 단백질의 발현을 실시하였다. 진탕 배양의 경우, 500 ml 용량 배플 플라스크 (CORNING, 431401) 를 사용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 3 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다. 통기 교반 배양의 경우, 3 L 배양조 (에이블, BMS-03KP3 가압형) 를 이용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 2 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다.

(실시예 2-2) Endo-Si 효소의 정제

실시예 2-1 에서 집균한 균체를, YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) 또는 고압 호모게나이저를 사용하여 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating, Capto DEAE 및 Capto Phenyl ImpRes (Cytiva) 를 조합하여 정제하였다. 마지막에 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 로 PBS(-) (후지 필름 와코 순약) 로 버퍼를 치환하여 효소액을 얻었다.

＜실시예 3＞ Endo-Rp 효소의 조제

(실시예 3-1) Endo-Rp 효소의 발현

서열 번호 5 에 대응하는 유전자를 코드한 Endo-Rp 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써, Endo-Rp 산생주를 얻었다. 계속해서, 진탕 배양 조건하 또는 통기 교반 배양 조건하에서의 메탄올 유도에 의한 Endo-Rp 단백질의 발현을 실시하였다. 진탕 배양의 경우, 1000 ml 용량 배플 플라스크 (CORNING, 431403) 를 사용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 2 일째나 3 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다. 통기 교반 배양의 경우, 3 L 배양조 (에이블, BMS-03KP3 가압형) 를 이용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 4 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다.

(실시예 3-2) Endo-Rp 효소의 정제

실시예 3-1 에서 집균한 균체를 YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) 또는 고압 호모게나이저를 사용하여 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating, POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific) 및 Capto MMC (Cytiva) 중 어느 2 개, 혹은 모두를 사용하여 정제하여, 효소액을 얻었다. 일부에 대해서는, Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 에서의 농축 혹은 버퍼 교환을 실시하여, 효소액을 얻었다.

＜실시예 4＞ Endo-S2 효소의 조제

(실시예 4-1) Endo-S2 효소의 발현

서열 번호 2 에 대응하는 유전자를 코드한 Endo-S2 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써, Endo-S2 산생주를 얻었다. 계속해서, 진탕 배양 조건하에서의 메탄올 유도에 의한 Endo-S2 단백질의 발현을 실시하였다. 진탕 배양에는 1000 ml 용량 배플 플라스크 (CORNING, 431403) 를 사용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 3 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다.

(실시예 4-2) Endo-S2 효소의 정제

실시예 4-1 에서 집균한 균체를, YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) 를 사용하여 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating 을 사용하여 정제하였다. 마지막에 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 로 PBS(-) (후지 필름 와코 순약) 로 버퍼를 치환하여 효소액을 얻었다.

＜실시예 5＞ Endo-S 효소의 조제

(실시예 5-1) Endo-S 효소의 발현

서열 번호 1 에 대응하는 유전자를 코드한 Endo-S 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써, Endo-S 산생주를 얻었다. 계속해서, 통기 교반 배양 조건하에서의 메탄올 유도에 의한 Endo-S 단백질의 발현을 실시하였다. 42 L 배양조 (Infors HT) 를 이용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 4 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다.

(실시예 5-2) Endo-S 효소의 정제

실시예 5-1 에서 집균한 균체를 고압 호모게나이저에 의해 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating, Capto MMC (Cytiva), 및 POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific) 를 사용한 정제를 조합하여 정제하였다. 마지막에 Pellicon 3 cassette, 30 kDa (Merck) 로 PBS(-) (Merck) 로 버퍼를 치환하여 효소액을 얻었다.

＜실시예 6＞ Endo-M 효소의 조제

(실시예 6-1) Endo-M 효소의 발현

서열 번호 4 에 대응하는 유전자를 코드한 Endo-M 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써, Endo-M 산생주를 얻었다. 계속해서, 통기 교반 배양 조건하에서의 메탄올 유도에 의한 Endo-M 단백질의 발현을 실시하였다. 통기 교반 배양에는 3 L 배양조 (에이블, BMS-03KP3 가압형) 를 이용하여, 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 2 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다.

(실시예 6-2) Endo-M 효소의 정제

실시예 6-1 에서 집균한 균체를 YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) 를 사용하여 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating 및 Capto DEAE (Cytiva) 로 정제하였다. 마지막에 버퍼 조성을 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 30 ％ Glycerol, pH 8.0 으로 하여, 효소액을 얻었다.

＜실시예 7＞ 당사슬 공여체의 합성

본 발명의 당사슬 공여체는, 후술하는 방법 (당사슬 원료, 혹은 당사슬 중간체의 효소 변환, 및 화학 변환) 에 따라 제조할 수 있다. 각 반응 종료 후, 각 반응의 목적 화합물은 통상의 방법에 따라, 반응 혼합물로부터 채취된다. 예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화하고, 또, 불용물이 존재하는 경우에는 여과에 의해 제거하고, 용제를 증류 제거함으로써 얻어진다. 얻어진 화합물은, 필요하면, 통상의 방법, 예를 들어 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피나 이온 교환 크로마토그래피로 분리·정제할 수 있다. 혹은, 재침전, 재결정, 한외 여과에 의해 정제할 수 있다.

본 명세서에 기재되어 있는 당사슬 유도체의 질량은, 다음의 방법으로 확인하였다. 장치에는, Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc 제조), Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 CORETECS UPLC C18 (WatersInc 제조) (1.6 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 을 사용하고, 이동상 A 에는 아세토니트릴, 이동상 B 에는 0.1 ％ 포름산 첨가 수용액을 이용하고, 이동상 A 가 4 분 동안에 2 ％ 에서 95 ％ 로 변화하는 그래디언트로 사용하고, 유속 0.4 mL/min, 40 ℃ 에서 분석하였다.

또는, 장치에는, Xevo G2-XS Family mass spectrometer (Waters 제조), ACQUITY BEH C18 (Waters 제조) (1.7 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 을 사용하고, 이동상 A 에는 아세토니트릴, 이동상 B 에는 10 mM 아세트산암모늄 수용액을 이용하고, 이동상 A 가 5 분 동안에 1 ％ 에서 30 ％ 로 변화하는 그래디언트로 사용하고, 유속 0.8 mL/min, 40 ℃ 에서 분석하였다.

(실시예 7-1) 당사슬 공여체 원료 (당사슬 원료 3, 당사슬 원료 3-1) 의 합성

(합성 스킴)

[화학식 31]

(7-1a) [N-아세틸화 및 가수분해 반응]

SGP(G-1) (25.0 g) 를 정제수 (100 mL) 에 용해하고, 아세토니트릴 (50 mL) 에 용해한 N,N-디이소프로필에틸아민 (6.77 g), 아세토니트릴 (50 mL) 에 용해한 N-(아세톡시카르보닐옥시)숙신이미드 (8.22 g) 를 순차 첨가하여, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 종료를 확인한 후, 수산화나트륨 수용액 (5 N, 25 mL) 을 첨가하여, 1 시간 교반하였다.

이 액을 냉각 후, pH 미터로 확인하면서 염산 (5 N, 36.6 g) 을 첨가하여, pH 2.20 으로 조정한 후, 온도를 57-59 ℃ 로 유지하여, 3 시간 반 교반하였다. 실온으로 냉각한 후, pH 미터로 확인하면서 수산화나트륨 수용액 (5 N, 25 mL) 을 첨가하여, pH 5.98 로 조정하였다.

[정제]

pH 5.98 로 조정한 액 중 SGP 14 g 분에 상당하는 분량을, SEPHADEX G-25 Fine (GE 헬스케어 재팬) 을 사용하여 정제하였다 (용출액에는 정제수를 사용하였다). 목적물을 포함하는 프랙션을 회수하고, 감압 농축 및 동결 건조에 의하여, 당사슬 원료 1, 당사슬 원료 2-1, 당사슬 원료 2-2, 당사슬 원료 2-3 의 혼합물인 고형물 (13.5 g) 을 얻었다.

(7-1b) [축합 반응]　

공정 (7-1a) 에서 얻어진 고형물 (11.0 g) 을 DMF (121.0 mL), DMSO (33.0 mL) 에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민 (3.16 g, 24.4 mmol), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (5.33 g, 24.4 mmol) 을 순차 첨가하여, -7 ℃ 로 냉각하였다. 이 혼합액에 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (12.72 g, 24.4 mmol) 의 DMF (22.0 mL) 용액을 15 분에 걸쳐 첨가한 후, -5 ℃ 부근에서 1 시간 교반하였다.

[조 (粗) 정제]

반응 종료 후, 반응액을 실온으로 올리고, 에탄올 (550 mL) 에 적하하였다. 또한 반응 용기를 에탄올 (110 mL) 로 세정하고, 충분히 씻어내었다. 발생한 슬러리를 여과 채취하고, 케이크를 에탄올 (110 mL) 로 세정한 후, 실온에서 감압 건조를 실시하여, 반응 조체 15.7 g 을 얻었다.

이 반응 조체에 정제수 (198 g) 를 첨가하여 용해하였다. 약간 남은 잔류물을 여과하여 제거하고, 얻어진 여과액을 감압 농축한 후, 정제수로 88 g 으로 조정하였다. 이 수용액을 에탄올 (550 mL) 에 적하하고, 또한 수용액을 정제수 (22 mL) 로 세정하였다. 생성된 슬러리를 여과 채취하고, 케이크를 에탄올 (275 mL) 과 정제수 (55 mL) 의 혼합액으로 세정함으로써 습고체 (162.0 g) 를 얻었다. 이것을 정제수 (220 mL) 에 용해한 후, 감압 농축에 의해 반 분량으로 농축하고, 에탄올을 제거하였다. 이것을 동결 건조함으로써, 당사슬 원료 3, 당사슬 원료 3-1, 당사슬 원료 3-2, 당사슬 원료 2-3 의 혼합물인 조체 (8.81 g) 를 얻었다.

(7-1c) [Triart C18 을 이용한, 당사슬 원료 3 과 당사슬 원료 3-1 의 분리 채취]

공정 (7-1b) 에 기재된 방법으로 얻은 스케일이 상이한 2 개의 로트의 혼합품, 즉, 당사슬 원료 3, 당사슬 원료 3-1, 당사슬 원료 3-2, 당사슬 원료 2-3 의 혼합물인 조체 (합계 10.05 g) 를, 아세토니트릴과 정제수를 용리액으로 하고, 장치에는 K-Prep Lab 100G (와이엠씨사 제조), 칼럼에는 Triart C18 (와이엠씨사 제조) 을 사용하여, 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의해 검출된 메인 피크를 회수하여, 감압 농축하였다. 이 농축액을 동결 건조하여, 목적 화합물 당사슬 원료 3 (2.09 g), 목적 화합물 당사슬 원료 3-1 (2.02 g) 을 백색 분말로서 얻었다.

(실시예 7-5) 당사슬 공여체의 합성 (G-10)

G-10 의 합성 방법 1

[화학식 32]

(7-5-1) [당사슬 교환 반응]

공정 (7-1c) 에서 얻은 당사슬 원료 3 (200 mg) 및 1-Methylethyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (733 mg, 50 equiv) 를 인산 완충액 (0.5 mL, pH 6.7, 0.2 mol/L) 에 용해한 후, 50 ℃ 로 가온하였다. 이 혼합 용액에 Endo-Rp N172Q (1.3 mg) 를 첨가하여, 그대로의 온도에서 90 시간 진탕하였다.

[정제]

반응 종료 후, 실온에서 반응액에 정제수 8 mL 를 첨가한 후, 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여과액을, 아세토니트릴과 물을 용리액으로 하고, 칼럼에 YMC-Actus Triart C18 (와이엠씨사 제조) 을 사용하여 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의해 검출된 메인 피크를 회수하여, 감압 농축, 동결 건조에 의해 목적물 G-10 (82 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C103H176N14O66 : [M＋2H]^2＋ 1333.5496 (most abundant mass), Found 1333.5450

G-10 의 합성 방법 2

[화학식 33]

(7-5-2a) [당사슬 교환 반응]

SGP(G-1) (20.0 g) 및 1-Methylethyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (36.8 g, 20 equiv) 를 인산 완충액 (280 mL, pH 5.5, 0.2 mol/L) 에 용해한 후, 50 ℃ 로 가온하였다. 이 혼합 용액에 Endo-Rp N172H (9.1 mg) 를 첨가하여, 그대로의 온도에서 72 시간 교반하였다.

[정제]

반응 종료 후, 실온에서 반응액을 여과하였다. 이 여과액의 일부에 대하여 Sartocon Hydrosart-2 kDa (Sartorius), 이어서 Amberlite (등록상표) IR120 H form (Merck) 로 정제한 후, 동결 건조에 의해 고형물 4 (3.72 g from SGP 5.6 g) 를 얻었다.

(7-5-2b) [축합 반응]

공정 (7-5-2a) 에서 얻은 고형물 4 (3.0 g) 를 DMF (59.1 mL) 와 정제수 (0.9 mL) 를 사용하여 용해한 후, N,N-디이소프로필에틸아민 (1.03 g, 7.94 mmol), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (867 mg, 3.97 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (6.20 g, 11.9 mmol) 를 20 ℃ 에서 3 회로 나누어 첨가 후, 그대로의 온도에서 23 시간 교반하였다.

[정제]

반응 후 반응액을 정제수로 희석한 후, Sartocon Hydrosart-2 kDa (Sartorius) 로 정제하고 농축하였다. 이 농축액을, 아세토니트릴과 물을 용리액으로 하고, 칼럼에는 YMC-Actus Triart Prep C18-S (와이엠씨사 제조) 를 사용하여 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의하여 검출된 메인 피크를 회수하고, 감압 농축하여, 목적 화합물 G-10 (2.77 g) 을 얻었다.

(실시예 7-9) 당사슬 공여체의 합성 (G-14)

C-14 의 합성 방법 1

[화학식 34]

(7-9-1) [당사슬 교환 반응]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 원료 3-1 (400 mg), 1-Methylethyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (679 mg, 20 equiv) 및 Endo-Rp N172Q (4.2 mg) 를 인산 완충액 (13.0 mL, pH 6.8, 0.2 mol/L) 중에서 50 ℃ 로 가온하였다. 그대로의 온도에서 6 일간 진탕하였다.

[정제]

반응 종료 후, 실온에서 반응액을 정제수로 희석하고, 불용물을 여과하여 제거하였다. Vivaspin 15R, 2,000 MWCO Hydrosart (Sartorius) 로 정제하고 농축하였다. 이 농축액을, 아세토니트릴과 물을 용리액으로 하고, 칼럼에는 Sfaer C18 (바이오타지사 제조) 을 사용하여 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의하여 검출된 메인 피크를 회수하고, 감압 농축하여, 목적 화합물 G-14 (174 mg) 를 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C84H143N9O56 : [M＋2H]^2＋ 1087.9382 (most abundant mass), Found 1087.9357

C-14 의 합성 방법 2

[화학식 35]

(7-9-2a) [가수분해 반응]

공정 (7-5-2a) 에서 얻은 고형물 4 (1.0 g) 에 물 (20 mL) 을 첨가하여 용해한 후, 희염산 (1.0 mol/L) 을 사용하여 pH 를 2.5 로 조정하였다. 이 수용액을 60 ℃ 로 가온하고, 그대로의 온도에서 90 분 교반하였다.

[정제]

반응 종료 후, 실온으로 냉각한 후, NaOH 수용액 (1mol/L) 을 이용하여 pH 7.0 으로 조정하였다. Sartocon Hydrosart-2 kDa (Sartorius) 를 이용하여 정제한 후, 동결 건조에 의해 당사슬 원료 5-1, 당사슬 원료 5-2, 당사슬 원료 5-3, 당사슬 원료 5-4 의 혼합물인 고형물 (1.06 g) 을 얻었다.

(7-9-2b) [축합 반응]

공정 (7-9-2a) 에서 얻은 당사슬 원료 5-1, 당사슬 원료 5-2, 당사슬 원료 5-3, 당사슬 원료 5-4 의 혼합물인 고형물 (0.8 g) 에 DMF (8.0 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.13 g, 1.0 mmol) 을 첨가하여, 0 ℃ 로 냉각하였다. 이 슬러리 용액에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.23 g, 1.0 mmol) 과 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (0.55 g, 1.0 mmol) 를 순차 첨가하였다. 0 ℃ 에서 30 분 교반한 후, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 슬러리가 용해되지 않기 때문에, 재차, 0 ℃ 로 냉각하여 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.13 g, 1.0 mmol), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.23 g, 1.0 mmol), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (0.55 mg, 1.0 mmol) 를 순차 첨가하였다. 실온에서 13.5 시간 교반한 후, 0 ℃ 로 냉각하고, 추가로 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (0.41 g, 0.78 mmol), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (57 mg, 0.26 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (33 mg, 0.26 mmol) 을 순차 첨가하였다. 실온에서 1 시간 교반하고, 물 (68 mL) 을 첨가하여 반응을 정지하고, G-14, G-10, 당사슬 원료 6, 당사슬 원료 5-4 를 포함하는 반응액을 얻었다.

[정제]

이 반응액을 정제수로 다시 희석한 후, Sartocon Hydrosart-2 kDa (Sartorius) 로 정제하고 농축하였다. 이 농축액을, 아세토니트릴과 물을 용리액으로 하고, 칼럼에 Triart C18 (와이엠씨사 제조) 을 사용하여, 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의해 검출된 메인 피크를 회수하여, 감압 농축하였다. 이 농축액을 동결 건조하여, 목적 화합물 G-14 (98 mg) 를 백색 분말로서 얻었다.

(실시예 7-2) 당사슬 공여체의 합성 (G-7)

[화학식 36]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 3 (200 mg) 및 Methyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (655 mg, 50 equiv) 를 사용하여, 「G-10 의 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-5-1) 과 동일한 방법으로, G-7 (64.9 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C101H172N14O66 : [M＋2H]^2＋ 1319.5340 (most abundant mass), Found 1319.5292

(실시예 7-3) 당사슬 공여체의 합성 (G-8)

[화학식 37]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 3 (100 mg) 및 2-(Morpholin-4-yl)-2-oxoethyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (194 mg, 20 equiv) 를 사용하여, 「G-10 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-5-1) 과 동일한 방법으로, G-7 (32.0 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C106H179N15O68 : [M＋2H]^2＋ 1376.0578 (most abundant mass), Found 1376.0525

(실시예 7-4) 당사슬 공여체의 합성 (G-9)

[화학식 38]

원료로서 SG-A (30 mg) 를 사용하는 것 이외에는, 「G-10 의 합성 방법 2」에 기재한 공정 (7-5-2b) 와 동일한 방법으로, G-9 (23.8 mg) 를 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C110H188N18O70 : [M＋2H]^2＋ 1441.5925 (most abundant mass), Found 1733.78.

(실시예 7-6) 당사슬 공여체의 합성 (G-11)

[화학식 39]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 3 (200 mg) 및 Propyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (733 mg, 50 equiv) 를 사용하여, 「G-10 의 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-5-1) 과 동일한 방법으로, G-11 (80.9 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C103H176N14O66 : [M＋2H]^2＋ 1333.5496 (most abundant mass), Found 1333.5471

(실시예 7-7) 당사슬 공여체의 합성 (G-12)

[화학식 40]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 3 (200 mg) 및 3-Methoxypropyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (816 mg, 50 equiv) 를 사용하여, 「G-10 의 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-5-1) 과 동일한 방법으로, G-12 (70.0 mg) 를 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C104H178N14O67 : [M＋2H]^2＋ 1348.5549 (most abundant mass), Found 1348.5491

(실시예 7-8) 당사슬 공여체의 합성 (G-13)

[화학식 41]

공정 (7-1c) 에서 합성한 당사슬 3-1 (150 mg) 및 Methyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (569 mg, 50 equiv) 를 사용하여, 「G-14 의 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-9-1) 과 동일한 방법으로, G-13 (50.0 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C82H139N9O56 : [M＋2H]^2＋ 1073.9226 (most abundant mass), Found 1073.9198

(실시예 7-10) [N₃-PEG(3)]₂-SGP-PEG(3)-N₃ (당사슬 공여체 G-15) 의 합성

(7-10a) SGP-tri-Fmoc 체의 합성

[화학식 42]

[아미노기의 Fmoc 보호]

SGP (200 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (2.1 ml)/증류수 (0.7 ml) 혼합 용액에, N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐옥시]숙신이미드 (188 mg, 0.56 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.12 ml, 0.70 mmol) 을 첨가하여, 실온에서 30 분 교반하였다.

[조정제]

반응 종료 후, 반응액을 미리 디에틸에테르 (30 ml) 를 첨가한 원침관 (50 ml) 에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 이용하여, 2 층으로 분리하고, 상청액을 제거하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 계속해서, 메틸알코올 (2 ml) 을 첨가하고, 아세트산에틸 (20 ml) 을 첨가하고, 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 사용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 계속해서, 적량의 디에틸에테르로 고형물을 세정한 후에, 감압하 건조하여, 목적 화합물을 포함하는 고형물 (412 mg) 을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 다음의 반응에 사용하였다.

ESI-MS : Calcd for C157H219N15O76 : [M＋3H]^3＋ 1178.13 (most abundant mass), Found 1178.13.

(7-10b) [N₃-PEG(3)]₂-SGP-PEG(3)-N₃(당사슬 공여체 G-15) 의 합성　

[화학식 43]

[축합 반응]

공정 (7-10a) 에서 얻어진 고형물 (412 mg) 과, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (243 mg, 0.47 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (6.7 ml) 혼합액에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (127 mg, 0.58 mmol) N,N-디메틸포름아미드 (1.6 ml) 용액과, N,N-디이소프로필에틸아민 (0.18 ml, 1.40 mmol) 을 첨가하여, 37 ℃ 에서 1.5 시간 교반 후, 실온에서 19 시간 교반하였다.

[조정제]

반응 종료 후, 반응액 (2.5 mL) 을 미리 디에틸에테르 (30 ml) 를 첨가한 원침관 (35 ml) 에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 이 조작을 반응액이 없어질 때까지 반복하였다. 계속해서, 메틸알코올 (3 ml) 을 첨가하여, 침전물을 스패출러로 분쇄하였다. 그 후, 아세트산에틸 (30 ml) 을 첨가하여, 고형물을 석출시킨 후에, 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 이 조작을 3 회 반복하였다. 계속해서, 적량의 디에틸에테르로 고형물을 세정한 후에, 감압하 건조하여, 고형물을 얻었다.

[Fmoc 기의 탈보호]

상기 고형물에 N,N-디메틸포름아미드 (5.0 ml) 와 피페리딘 (0.35 ml) 을 첨가하여, 37 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 그 후, N,N-디메틸포름아미드 (3.3 ml) 를 첨가하여, 실온에서 16 시간 교반하였다.

[조정제]

반응 종료 후, 반응액 (2.5 mL) 을 미리 디에틸에테르 (30 ml) 를 첨가한 원침관 (35 ml) 에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 이 조작을 반응액이 없어질 때까지 반복하였다. 계속해서, 메틸알코올 (8 ml) 을 첨가하여, 침전물을 스패출러로 분쇄하였다. 그 후, 아세트산에틸 (16 ml) 을 첨가하여, 고형물을 석출시킨 후에, 소형 원심기 (히타치 코키, CF16RX II) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 계속해서, 적량의 디에틸에테르로 고형물을 세정한 후에, 감압하 건조하여, 고형물을 얻었다.

[정제]

얻어진 고형물을 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시켰다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 동결 건조하였다. 다시 한번 증류수에 용해하고, 동결 건조 전에, 적량의 암모니아수를 첨가하여, 산성이 아닌 것을 확인하고 재동결 건조하여, 목적 화합물 G-15 (90 mg) 를 동결 건조 분말로서 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C136H237N27O76 : [M＋2H]^2＋ 1733.78 (most abundant mass), Found 1733.78.

(실시예 7-11) 당사슬 공여체 원료 (당사슬 원료 8-1, 당사슬 원료 8-2, 당사슬 원료 8-3) 의 혼합액의 조제

[화학식 44]

(7-11a) [가수분해 반응 및 N-Boc 화]

SGP(G-1) (10.0 g) 를 정제수 (100 mL) 에 용해하고, pH 미터로 확인하면서 염산 (1 N) 을 첨가하여, pH 2.4 로 조정한 후, 온도를 60 ℃ 로 유지하고, 3 시간 교반하였다. 실온으로 냉각한 후, pH 미터로 확인하면서 수산화나트륨 수용액 (1 N) 을 첨가하여, pH 7.5 로 조정하였다. 이 용액의 5 분의 1 량에 대하여, 2 탄산-tert-부틸 (708 mg) 을 테트라하이드로푸란 (6 mL) 에 용해하여 첨가한 후, 수산화나트륨 수용액 (1 N) 을 첨가하여, pH 12 로 조정하고 2 시간 교반하였다. 또한, 2 탄산-tert-부틸 (359 mg) 을 첨가하고, 수산화나트륨 수용액 (1 N, 2.3 mL) 을 첨가하여, 추가로 3 시간 교반하였다. 염산 (1 N) 을 첨가하여, pH 8 로 조정하고, 당사슬 원료 7-1, 당사슬 원료 7-2, 당사슬 원료 7-3, 당사슬 원료 7-4 를 포함하는 용액을 얻었다.

(7-11b) [축합]

공정 (7-11a) 에서 얻어진 당사슬 원료 7-1, 당사슬 원료 7-2, 당사슬 원료 7-3, 당사슬 원료 7-4 를 포함하는 용액의 2 분의 1 량에 대하여, DMF (10 mL) 를 첨가한 후, 아세토니트릴 (10 mL) 을 첨가하고, 아세토니트릴을 감압 증류 제거하는 조작을 4 회 반복하여, 탈수 조작을 실시하였다. 얻어진 DMF 용액에 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.46 g) 을 첨가하여, 0 ℃ 로 냉각하였다. 계속해서, 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트 (1.09 g) 를 첨가한 후, 실온에서 1 시간 교반하여, 당사슬 원료 8-1, 당사슬 원료 8-2, 당사슬 원료 8-3, 당사슬 원료 7-4 를 포함하는 용액을 얻었다.

(실시예 7-12) 당사슬 공여체의 합성 (G-16)

[화학식 45]

(7-12a) [당사슬 변환 반응]

공정 (7-11b) 에서 얻어진 당사슬 원료 8-2 를 포함하는 혼합물의 용액을 Amicon Ultra-15, 3kDa (Merck) 를 사용하여 인산 완충액 (9.2 mL, pH 6.7, 0.2 mol/L) 으로 치환하였다. 이 용액에 4-Methoxylphenyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (280 mg, 7 equiv), 톨루엔 (1.2 mL), Endo-Rp N172Q (2.6 mg) 를 첨가하여, 온도를 50 ℃ 로 유지하고, 150 시간 교반하였다.

(7-12b) [정제]

공정 (7-12a) 에서 얻어진 이 반응액의 3 분의 1 에 대하여, 아세토니트릴과 물을 용리액으로 하고, 칼럼에 X-Bridge C18 (Waters 사 제조) 을 사용하여, 분리 정제를 실시하였다. UV 검출 (210 nm) 에 의해 검출된 목적물의 피크를 회수하여, 감압 농축하였다. 이 농축액을 동결 건조하여, 목적 화합물 G-16 (16.3 mg) 을 백색 분말로서 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C88H143N9O57 : [M＋2H]^2＋ 1119.94 (most abundant mass), Found 1119.93

(실시예 7-13) 당사슬 공여체의 합성 (G-6)

[화학식 46]

(7-13) [당사슬 교환 반응]

공정 (7-1c) 에서 얻은 당사슬 원료 3 (100 mg) 및 4-Methoxylphenyl 2-(acetylamino)-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (182 mg, 20 equiv) 를 이용하여 「G-10 의 합성 방법 1」에 기재한 공정 (7-5-1) 과 동일한 방법으로, G-6 (35 mg) 을 얻었다.

ESI-MS : Calcd for C107H176N14O67 : [M＋2H]^2＋ 1365.55 (most abundant mass), Found 1365.54

이번에 착상한 도 1 에 나타낸 형태로 직접 당사슬 전이 반응이 진행되는 경우, 효소-B 가 인식하는 2 분기 당사슬 구조이면, 비환원 말단측의 구조를 N 결합형으로 한정할 필요는 없고, 임의의 구조로 목적의 반응이 진행되는 것으로 생각된다. 예를 들면, 이하 또는 도 2 에 나타낸 구조를 당사슬 공여체로서 이용할 수 있다.

[화학식 47]

그래서, 이하의 실시예에서는, 하기 당사슬 유도체를 적절히 사용하였다.

＜실시예 8＞「공정 1」의 반응 조건 : 항체 농도

일반적으로 널리 사용되고 있는 당사슬 공여체, 화학적으로 합성된 옥사졸린체를 사용한 경우에는, 항체 중의 Lys 에 대하여 Endo 효소 비개재형의 화학 반응인 당화 (Glycation) 가 진행되기 쉬워지는 것이 보고되어 있다. 또한, 이 부반응을 억제하기 위해서는, 약산성 (pH 6.50) 에서 반응시키고, 옥사졸린체 용액을 반복 첨가하여 반응시키는, 요컨대 반응액을 희석시키는 것이 추장되었다 (Ref. Bioconjugate Chemistry 2019 30(5), 1343-1355). 이 보고에서는, 반응액 중의 항체 농도는 40 μM 이하로 설정되어 있었다. 또, 화학적으로 합성된 옥사졸린체를 사용한 당사슬 전이 반응의 상세 프로토콜에 관한 보고에 있어서도, 농도에 관해서 「final concentration : Herceptin = 10 mg/ml」라고 기재되어 있다 (Ref. Nature Protocols volume 12, pages 1702-1721(2017)). 이와 같이, 반응 총액량을 줄이는 것, 즉 고농도 항체 용액으로 당사슬 전이 반응을 실시한다는 발상은, 항체에 대한 당사슬 전이 반응에 있어서, 일반적이지 않다.

한편, 이번에 착상한 도 1 에 나타낸 형태로 직접 당사슬 전이 반응이 진행되는 경우, 반응 용액의 총량을 줄이는 것, 즉, 분자간의 접촉 빈도가 높아지는 조건, 고농도로 반응시키는 것은 매우 효과적이다. 표 Z6 에 대표되는 안정적인 당사슬 공여체와 항체를 고농도로 혼합해도, 화학 반응의 1 종인 당화 (Glycation) 는 일어나지 않는다. 도 1 에 있어서의 「공정 1」의 반응 조건에서는, 상기 부반응의 원인이 되고 있는 화학적으로 합성된 옥사졸린체 용액을 첨가하지 않기 때문이다.

본 발명에 있어서의 제조 방법에서 적응 가능한 반응계 중의 억셉터 분자 (예를 들면, 항체) 농도는 한정되지 않지만, 실시예 8 에서는, 반응계 중의 억셉터 분자 (항체) 농도에 관계없이 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인하기 위해서, 계 내의 항체 농도를 20 mg/mL ∼ 80 mg/mL 로 설정하였다.

(실시예 8-1) 반응계 중 항체 농도 20 mg/mL 의 경우

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (20 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 300 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 에 따라 당사슬 전이 반응시켜 샘플링액을 준비하였다. 여기서는, 참고예 1 에서 준비한 억셉터 분자 용액 1-1 을 사용하였다. 실시예 2 에서 준비한 효소-A 용액 (Si-001-2), 혹은 실시예 5 에서 준비한 효소-A 용액 (S-001) 중 어느 것을 사용하였다. 실시예 3 에서 준비한 효소-B 용액 (Rp-001-2) 을 사용하였다. 표 Z6 에 따라 준비한 당사슬 공여체 G-1, G-3, 또는 G-4 중 어느 것을 사용하였다. 각 실험에 사용한 당사슬 공여체의 구조에 따라, 이하의 모식도 또는 도 3 에 나타낸 당사슬 전이 반응이 진행된다.

[화학식 48]

[LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율 측정]

전술한 방법에 따라, 샘플링액을 LabChip 분석하면, 그 일렉트로페로그램으로부터, 미반응물과 당사슬 전이체가 분리된 피크로서 확인된다. 미반응물과 당사슬 전이체의 피크 면적비로부터 당사슬 전이율을 하기 산출식에 의해 산출하였다.

당사슬 전이율 (％) = [[당사슬 전이 항체 유래의 H 사슬의 피크 면적] / {[미반응물 유래의 H 사슬의 피크 면적]＋[당사슬 전이 항체 유래의 H 사슬의 피크 면적]}] × 100

(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 사용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z7).

사용하는 효소-A 의 포텐셜에 따라, 실시예 8-1-4, 실시예 8-1-5, 실시예 8-1-6 과 같이 당사슬 전이율이 28 시간까지 80 ％ 를 초과하지 않는 경우가 있다. 이러한 경우, 사용하는 당사슬 공여체량을 증가시키면, 전이 효율이 개선될 것이 예상된다. 실시예 8-1-7, 실시예 8-1-8, 실시예 8-1-9 에서는, 각각, 실시예 8-1-4, 실시예 8-1-5, 실시예 8-1-6 에서 사용한 [당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1] 에 있어서, 당사슬 공여체를 20 당량에서 40 당량으로 변경하였다. 예상대로 당사슬 전이율이 개선되었다. 이와 같이, 효소의 조합을 바꾸지 않고, 또한 최종 항체 농도를 바꾸지 않고 당사슬 전이율을 개선하고자 하는 경우, 당사슬 공여체량을 배로 하는 것만으로 좋은 것을 알 수 있다.

(실시예 8-2) 반응계 중 항체 농도 40 mg/mL 의 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 2 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 2]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (20 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 150 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

(실시예 8-1) 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z8).

(실시예 8-3) 반응계 중 항체 농도 60 mg/mL 의 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 3 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 3]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (20 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 100 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

실시예 8-1 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z9).

(실시예 8-4) 반응계 중 항체 농도 80 mg/mL 의 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 4 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 4]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (20 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 750 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다. 단, 여기서는, 참고예 1 에서 준비한 억셉터 분자 용액 1-2 를 사용하였다.

(실시예 8-1) 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z10).

실시예 8 에서는, 대표적인 효소와 대표적인 당사슬 공여체의 조합으로, 주로 당사슬 공여체량을 20 당량으로 고정하여, 28 시간까지의 당사슬 전이율을 확인하였다. 어느 효소의 조합의 경우에서도, 반응계 내의 최종 항체 농도가 높을수록, 당사슬 전이율이 높아지는 것을 알 수 있다. 또한, 반응계 중의 항체 농도에 관계없이 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인할 수 있다.

＜실시예 9＞「공정 1」의 반응 조건 : 당사슬 당량

본 발명에 있어서의 제조 방법에 적응 가능한 반응계 중의 항체 농도는 한정되지 않지만, 실시예 9 에서는, 반응계 중에 첨가하는 당사슬 도너 분자의 양에 관계없이 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인하기 위하여, 계 내에 첨가하는 당사슬 당량을 10 당량 ∼ 40 당량으로 설정하였다.

(실시예 9-1) 항체에 대하여, 10 당량의 당사슬을 사용하는 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 5 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 5]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (10 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 100 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

여기서는, 참고예 1 에서 준비한 억셉터 분자 용액 1-1 을 사용하였다. 실시예 2 에서 준비한 효소-A 용액 (Si-001-2), 혹은 실시예 5 에서 준비한 효소-A 용액 (S-001) 중 어느 것을 사용하였다. 실시예 3 에서 준비한 효소-B 용액 (Rp-001-2) 을 사용하였다. 표 Z6 에 따라 준비한 당사슬 공여체 G-1, G-3, 또는 G-4 중 어느 것을 사용하였다. 각 실험에 사용한 당사슬 공여체의 구조에 따라, 전술한 도 3 의 당사슬 전이 반응이 진행된다.

실시예 8-1 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z11).

실시예 9-1-4 와 같이 당사슬 전이율이 28 시간까지 80 ％ 를 초과하지 않는 경우, 최종 항체 농도를 높게 하면, 전이율이 개선될 것으로 예상된다. 따라서, 실시예 9-1-7 에서는, 실시예 8-4 에서 사용한 [당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 4] 에서, 당사슬 공여체 (20 당량) 로부터 당사슬 공여체 (10 당량) 로 변경한 조건에서 반응시켰다. 예상대로 당사슬 전이율이 개선되었다. 이와 같이, 당사슬 당량수를 바꾸지 않고 당사슬 전이율을 개선하고자 하는 경우, 반응계 내의 최종 항체 농도를 높게 하면 된다.

(실시예 9-2) 항체에 대하여, 30 당량의 당사슬을 사용하는 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 6 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 6]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (30 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 100 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

실시예 8-1 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z12).

(실시예 9-3) 항체에 대하여, 40 당량의 당사슬을 사용하는 경우

당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 1 대신에, 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 7 에 따라, 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 당사슬 전이 반응시켜 LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율을 측정하였다.

[당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 7]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg), 당사슬 공여체 (40 당량), 효소-A (1.6 ∼ 1.7 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 100 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

실시예 8-1 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z13).

실시예 9 에서는, 대표적인 효소와 대표적인 당사슬 공여체의 조합으로, 주로 반응계 내의 최종 항체 농도를 60 mg/mL 로 고정하고, 당사슬 공여체량을 변경함으로써, 28 시간까지의 당사슬 전이율을 확인하였다. 어느 효소의 조합의 경우에서도, 당사슬 공여체 사용량이 높을수록, 당사슬 전이율이 높아지는 것을 확인하였다. 또한, 반응계 중에 첨가한 당사슬 당량에 관계없이 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인할 수 있다.

실험예 8 과 실험예 9 로부터, 「공정 1」에서는, 당사슬 공여체 사용량과 반응계 내 최종 항체 농도를 적절히 조절함으로써, 높은 당사슬 전이율을 달성할 수 있다.

계속해서, 이하, 실시예 10 에서는, 주로 당사슬 공여체 사용량 (20 당량) 과 반응계 내 최종 항체 농도 (60 mg/mL) 를 고정하고, 이용 가능한 당사슬 공여체의 구조와 효소의 조합을 확인하였다.

＜실시예 10＞「공정 1」의 반응 조건 : 효소-A 와 효소-B 의 조합

(실시예 8-3) 에서 사용한 당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 3 에 따라, 당사슬 전이 반응시켜, (실시예 8-1) 과 동일하게 하여, LabChip 분석을 이용하여 당사슬 전이율을 측정하였다.

여기서는, 표 Z14 에 기재한 조합으로, 적절히, 억셉터 분자 용액, 효소-A 용액, 효소-B 용액, 및 당사슬 공여체를 구분하여 사용하였다. 구체적으로, 참고예 1 내지 참고예 3 에서 준비한 억셉터 분자 용액 1-1, 2-1, 2-2, 혹은 3-1 중 어느 하나를 사용하였다. 실시예 2, 혹은 실시예 5 에서 준비한 효소-A 용액 중 어느 하나를 사용하였다. 실시예 3, 혹은 실시예 6 에서 준비한 효소-B 용액 중 어느 하나를 사용하였다. 표 Z6 에 따라 준비한 당사슬 공여체 G-1 내지 G-17 중 어느 하나를 사용하였다. 각 실험에 사용한 당사슬 공여체의 구조에 따라, 이하의 모식도 또는 도 4 의 당사슬 전이 반응이 진행된다.

[화학식 49]

(실시예 8-1) 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1, 혹은 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b2, 혹은 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b3 에 사용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z14).

실시예 10 에서는, 이용 가능한 당사슬 공여체의 구조와 효소의 조합을 비교하여, 어느 조합에 있어서도 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인할 수 있다.

(효소-A 의 잔류 가수분해 활성)

이번에 착상한 도 1 에 나타낸 형태로 직접 당사슬 전이 반응이 진행되는 경우, 「공정 1」에서 사용하는 효소-A 에 가수분해 활성이 잔존하고 있으면, 예를 들면, mAb-[X-MSG1]₂가 목적물이 되는 경우에는, 이하의 모식도 또는 도 5 의 가수분해 반응이 경합되는 것으로 생각된다. 즉, 사용하는 효소-A 의 잔존 가수분해 활성이 야생형 효소와 동등하거나 그 이상인 경우, 외관상의 당사슬 전이율은 낮아진다.

[화학식 50]

「공정 1」에서 사용가능한 효소로서, Endo-S 변이체, Endo-S2 변이체 및 Endo-Si 변이체를 임의로 선택할 수 있다. 임의의 변이체로서 바람직한 잔존 가수분해 활성 정도의 지표를 명확히 하기 위해, 실시예 11 의 실험을 실시하였다.

(실시예 11) mAb2-[MSG1-N₃]₂의 가수분해

[화학식 51]

[가수분해 반응 표준 프로토콜 1]

㎃b2-[MSG1-N₃]₂ (0.2 mg) 와 효소-A (2.0 ％w/w), 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 21 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 4 시간과 24 시간에 샘플링하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

여기서는, 가수분해 반응 표준 프로토콜 1 에 따라, 가수분해하여 샘플링액을 준비하였다. 여기서는, 참고예 7 에서 준비한 항체 용액 7-1 을 사용하였다. 실시예 2, 실시예 4, 혹은 실시예 5 에서 준비한 효소-A 용액 중 어느 하나를 사용하였다.

[LabChip 분석을 이용한 당사슬 전이율 측정]

전술한 방법에 따라, 샘플링액을 LabChip 분석하면, 그 일렉트로페로그램으로부터, 미반응물과 가수분해체가 분리된 피크로서 확인된다. 미반응물과 가수분해체의 피크 면적비로부터 가수분해율을, 하기 산출식에 의해 산출하였다.

가수분해율 (％) = [[가수분해체 유래의 H 사슬의 피크 면적] / {[미반응물 유래의 H 사슬의 피크 면적]＋[가수분해체 유래의 H 사슬의 피크 면적]}] × 100

mAb2-[MSG1-N₃]₂에 사용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 가수분해율을 산출하였다 (표 Z15).

「공정 1」에서 높은 당사슬 전이율을 기대할 수 있는 효소는, 반응 개시 4 시간 시점에 있어서, 그 야생형 효소와 비교하여, 가수분해율이 낮은 것이 확인되었다. 또한, 반응 개시 24 시간 시점에 있어서, 그 야생형 효소와 비교하여, 대체로 가수분해율이 낮은 것이 많지만, 그 중에는 동등한 가수분해율을 나타내는 변이체도 포함되어 있었다.

한편, Endo-S2 D184M 이나 Endo-S2 T138Q 는, 옥사졸린체를 당사슬 공여체로 했을 경우, 당사슬 전이율이 높아지는 것이 보고되어 있다. 그러나, 옥사졸린체 비존재하에서, 당사슬 전이 항체와 반응시킨 경우, 반응 개시 4 시간 시점, 및 반응 개시 24 시간 시점에 있어서, 그들 야생형 효소와 거의 동일한 가수분해 활성을 나타내었다.

실시예 10, 실시예 11 및 참고예 8 의 결과로부터, 「공정 1」에서 사용하는 효소는, 「반응 개시 4 시간 시점의 가수분해율이 90 ％ 미만」이고, 「반응 개시 24 시간 시점의 가수분해율이 99.9 ％ 미만」을 지표로 하여, 임의로 선택해도 되는 것을 알 수 있다.

＜실시예 12＞「공정 1」과 「공정 2」의 조합의 효과 확인

실시예 12 에서는, 「공정 1」의 조건에 관계없이 「공정 2」에서 당사슬 전이율을 향상시킬 수 있는지 검증하였다.

본 발명에 있어서의 제조 방법이 적응 가능한 억셉터 분자종 (항체종), 당사슬 공여체종, 효소종은 한정되지 않지만, 몇 개의 패턴으로 「공정 1」과「공정 2」의 조합의 효과를 확인할 목적으로, 표 Z16 에 기재한 조합, 즉, 당사슬 공여체 5 종류, 항체 3 종류, 효소-A3 종류, 효소-B2 종을 대표예로 선택하였다. 또한, 사용하는 당사슬 공여체량을 10 당량, 또는 20 당량으로 하였다.

[부하액 조제의 표준 프로토콜 1 (공정 1)]

＜공정 1＞

억셉터 분자 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b 와 10 당량, 20 당량, 혹은 60 당량의 당사슬 도너 분자와 1.6 ％(w/w) 의 효소-A 와 0.2 ％(w/w) 의 효소-B 의 혼합액에, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 항체의 종농도가 20 mg/mL 혹은 60 mg/mL 가 되도록, 반응액량을 조정하였다. 계속해서, 그 반응액을 30 ℃ 에서 인큐베이트하고, 반응 개시 28 시간 후에 반응을 종료하였다.

＜샘플링＞

반응 종료 후, 당사슬 전이율을 측정할 목적으로, 극미량의 반응액을 샘플링하여, 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석한 후, LabChip 분석 개시까지 동결 보관하였다.

＜부하액의 pH, 염 농도 조정＞

계속해서, 반응액에 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3.9), 1 M 염화나트륨 수용액, 1 M 염산, 정제수를 첨가하여 칼럼 부하액을 조제하였다. 부하액은 항체 농도가 5 mg/mL 가 되고, 또한, 각 실험의 칼럼 평형화액과 동일한 pH 및 염화나트륨의 최종 농도가 되도록 조제하였다. 부하액의 조제 후, 부하액의 당사슬 전이율을 확인하는 것을 목적으로 하여, 0.5 mL 를 샘플링하였다.

여기서는, 표 Z16 에 기재한 조합으로, 적절히, 억셉터 분자 용액, 효소-A 용액 및 당사슬 공여체를 구분하여 사용하였다. 구체적으로는, 참고예 4 에서 준비한 억셉터 분자 용액 4-1, 참고예 5 에서 준비한 억셉터 분자 용액 5-1, 또는 참고예 6 에서 준비한 억셉터 분자 용액 6-1 중 어느 하나를 사용하였다. 실시예 2 에서 준비한 효소-A 용액 (Si-001-2), 혹은 실시예 5 에서 준비한 효소-A 용액 (S-001) 중 어느 하나를 사용하였다. 실시예 3 에서 준비한 효소-B 용액 (Rp-001-3), 혹은 실시예 6 에서 준비한 효소-B 용액 (M-002) 중 어느 하나를 사용하였다. 표 Z6 에 따라 준비한 당사슬 공여체 G-1, G-3, G-4, G-10, 혹은 G-16 중 어느 하나를 사용하였다.

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 1 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼 : POROS XS (1 ml) (Thermo Fisher 제조)

유속 : 0.3 ml/min

부하액 조제의 표준 프로토콜 1 에 따라 준비한 부하액 약 70 mL 를 칼럼에 통액 (샘플 통액) 한 후에, 평형화액 (50 mM 아세트산 버퍼, 445 mM 염화나트륨 수용액, pH 3.8) 을 15 CV (칼럼 세정) 흘렸다. 그 후, 칼럼 재생 목적으로, 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 수용액, pH 4.0) 을 8 CV 흘렸다. 마지막에, 정치 세정 (CIP) 목적으로, 클리닝액 (50 mM 아세트산 버퍼, 0.5 M 수산화나트륨 수용액) 을 3 CV 흘렸다.

목적물은 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 통과액은 50 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 회수하고, 1 M 트리스 용액을 첨가하여 pH 5.0-5.4 로 조정하여, 통과 획분으로 하였다. 또한, 평형화액에 의한 칼럼 세정 공정에 있어서는 5 CV 통액한 세정액을 1 개의 용기에 회수하여, 세정 획분으로 하였다. 이 회수액에 관하여, 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 로 항체 농도, 및 마이크로칩형 캐필러리 전자동 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하였다.

여기서 나타낸 바와 같이, 10 당량 혹은 20 당량의 당사슬 도너 분자를 사용하여 「공정 1」을 실시한 후에 「공정 2」를 실시한 결과, 「공정 1」에서 사용하는 항체, 효소, 당사슬의 종류에 관계없이, 「공정 2」의 통과액 중에 부하액보다 당사슬 전이율이 향상된 항체를 회수할 수 있었다. 이로써, 「공정 1」과 「공정 2」의 조합으로, 가능한 한 적은 당사슬 도너 분자 사용량 (40 당량 이하, 바람직하게는 10 당량 내지 20 당량) 으로, 고순도의 균일한 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자를 취득하는 것이 가능한 것이 나타났다. 또한, 실시예 12-2, 실시예 12-8 과 같이 조건에 따라서는 세정액 중에도 부하액보다 당사슬 전이율이 향상된 항체가 회수되는 것을 확인하였다. 이 때문에, 회수율을 높이는 것을 목적으로 필요에 따라 회수액과 세정액을 혼합할 수 있는 것으로 생각된다.

[당사슬 리모델링 항체, 및 억셉터 분자의 질량 분석]

실시예 12 에서 얻어진 회수액에 포함되는 당사슬 리모델링 항체 분자 중, 대표적인 화합물, 및 각 화합물 조제에 사용한 억셉터 분자를 다음의 방법으로 확인하였다. 당사슬 리모델링 항체 분자를 중사슬과 경사슬의 복합체의 상태, 혹은 중사슬과 경사슬에 프래그먼트화한 상태로 분석 칼럼으로 분리하고, 질량 분석계에 도입하였다. 장치에는, Orbitrap Exploris 240 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조), Vanquish Flex UHPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 MAbPac RP (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) (5 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 를 사용하고, 이동상 A 에는 물/0.1 ％ 포름산/0.02 ％ 트리플루오로아세트산 용액, 이동상 B 에는 아세토니트릴/0.1 ％ 포름산/0.02 ％ 트리플루오로아세트산 용액을 이용하고, 이동상 A 가 10 분 동안에 20 ％ 에서 50 ％ 로 변화하는 그래디언트를 사용하고, 유속 0.4 mL/min, 80 ℃ 에서 분석하였다.

상기에 있어서 「X」는, N₃-PEG(3) 을 나타낸다.

＜실시예 13＞ 양이온 교환 크로마토그래피 매체의 종류 검토

실시예 13 에서는, 실시예 12 에서 나타낸 당사슬 전이율의 향상 효과가 특정 크로마토그래피 매체에 의존하지 않는 것을 확인하였다. 여기서는, 실시예 12 에서 사용한 부하액 조제의 표준 프로토콜 1 에 따라 준비한 부하액을, 항체 제조에 일반적으로 사용되는 양이온 교환 크로마토그래피 매체에 부하하였다. 본 발명에 있어서의 방법이 입자상, 멤브레인상, 모노리스상 등 폭넓은 양이온 교환 크로마토그래피 매체에 적용 가능한 것을 나타내기 때문에, 각종 매체 중 대표적인 제품을 실험에 사용했지만, 본 발명에 있어서의 양이온 교환 크로마토그래피 매체는 이들에 한정되는 것은 아니다.

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 2 (공정 2)]

실시예 12 에서 나타낸 [양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 1 (공정 2)] 중, 「양이온 교환 크로마토그래피 매체」의 종류를, POROS XS (1 ml) (Thermo Fisher 제조) 로부터, CEX 입자 (POROS HS (1 mL, Thermo Fisher 제조), SOURCE 15S (1.66 mL, Cytiva 제조), Eshmuno CP-FT (1 mL, Merck 제조)), CEX 멤브레인 (Sartobind S (1 mL, Sartorius 제조), Mustang S (0.86 mL, Pall 제조)), 혹은 CEX 모노리스 (CIM monolith SO3 (1 mL, BIA Separations 제조)) 로 변경하였다. 또한, 전술한 매체에 적합한 조작 조건으로, 표 Z17 에 나타내는 각 실험을 실시하였다. 즉, 버퍼 혹은 부하액은, CEX 입자에 대해서는 접촉 시간 3 분 (0.3 mL/min 혹은 0.55 mL/min), CEX 멤브레인에 대해서는 5 멤브레인 체적 (MV)/min (5 mL/min 혹은 4.3 mL/min), CEX 모노리스에 대해서는 접촉 시간 1 분 (1 mL/min) 의 유속으로 통액하였다. 평형화액을 5 CV 혹은 5 ∼ 15 MV 송액하여 평형화한 후, CEX 매체에 대하여 전술한 부하액을 부하하였다. 부하액은, POROS HS, Eshmuno CP-FT, Sartobind S, CIM monolish SO3 에 대해서는 약 29 mL, SOURCE 15S 에 대해서는 49 mL, Mustang S 에 대해서는 25 mL 를 부하하였다. 칼럼 부하액 및 평형화액의 pH 는 사용하는 담체에 따라 pH 3.7 혹은 pH 3.8 로 하고, 염 농도는 280 ∼ 445 mM 의 범위에서 설정하였다. 5 ∼ 15 CV 혹은 15 MV 의 평형화액으로 칼럼을 세척한 후, 5 ∼ 8 CV 혹은 8 ∼ 50 MV 의 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 용액, pH 4.0) 으로 CEX 매체를 재생하였다. 목적물은 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 통과액은 50 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 5 mL 씩 분획하여 회수하고, 각 획분을 1 개로 혼합한 후, 1 M 트리스 용액을 첨가하여 pH 5.0-5.4 로 조정하여, 통과 획분으로 하였다. 또한, 평형화액에 의한 칼럼 세정 공정에 있어서는 5 CV 혹은 5 MV 통액한 세정액을 1 개의 용기에 회수하여, 세정 획분으로 하였다.

여기서 나타낸 바와 같이, 실시예 12 에서 사용한 크로마토그래피 매체 이외의 매체를 사용한 경우에도 당사슬 전이율을 향상시킬 수 있는 것이 확인되었다.

＜실시예 14＞ 크로마토그래피 조작 조건의 검토

「공정 2」의 당사슬 전이율 향상 효과를 기대할 수 있는 단리 조건을 명확하게 하기 위해서, 2 종류의 CEX 매체를 사용하여 각종 단리 조건에서 반응액을 처리하였다.

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 3 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼: POROS HS (Thermo Fisher 제조), SOURCE 15S (Cytiva 제조)

단리 조건은, 실시예 13 에서 사용한 [양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 2 (공정 2)] 에 따랐다. 단, pH 및 염 농도는, 표 Z19 에 설정한 조건으로 각 실험을 실시하였다. 즉, 칼럼 부하액 및 평형화액의 pH 를 pH 3.5 ∼ 5.0, 염 농도를 310 ∼ 500 mM 의 범위로 하였다. 또한, 평형화액에 의한 칼럼 세정 공정에 있어서는 5 CV 통액한 것 중 최초의 1 CV 분을 용기에 회수하여, 세정 획분으로 하였다.

여기서 나타낸 바와 같이, 어느 CEX 매체를 사용한 경우에도, 부하액 및 평형화액의 pH 가 당사슬 전이율의 향상 효과와 수율에 영향을 주는 것을 확인하였다. 부하액 및 평형화액의 pH 가 낮을수록 당사슬 전이율의 향상 효과가 높고, pH 의 증가에 수반하여 당사슬 전이율의 향상 효과가 저하되었다. 일반적으로는, 항체의 양이온 교환 크로마토그래피 정제에서는 부하액 및 평형화액의 pH 에는 pH 4.5 ∼ 6.0 의 범위가 선택되지만 (Groenberg A, Optimizing Cation-Exchange Chromatography with High-Throughput Process Development for ㎃b Purification. Biopharm Int. 2015 ; 28 : 44-47, 및 Thermo Fisher Scientific. POROS XS and HS 50 chromatography resins. [Internet]. Thermo Fisher Scientific Inc ; c2016 [cited 2022 Jan 13]. 3 p. Available from : https : /assets. thermofisher. com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/POROS-viral-clearance-CEX-app-note. pdfPOROS XS and HS 50 chromatography resins. Viral clearance capability of cation exchange and reco㎜endations), 본 실험에서는, pH 5.0 에서는 당사슬 전이율의 향상 효과가 전혀 관찰되지 않고, 당사슬 전이율을 향상시키기 위해서는 pH 5.0 보다 낮은 pH (예를 들어, pH 3.5 ∼ 4.5) 의 범위에서 단리를 실시하는 것이 중요하였다.

또한, pH 와 동일하게 염 농도가 당사슬 전이율의 향상 효과와 수율에 영향을 주는 것을 확인하였다.

＜실시예 15＞「공정 1」에 관한 응용예 (효소, 당사슬 도너 분자, 당사슬 억셉터 분자)

(실시예 15a) 실시예 15 에서 사용하는 효소-A 의 조제

실시예 11 과 참고예 8 로부터, 적절한 가수분해 잔존 활성을 갖는 효소를 「공정 1」에 사용하는 효소-A 로서 채용할 수 있는 것이 시사되었다. 그래서, Endo-S 나 Endo-S2 와 동일한 성질을 나타내는 것이 알려져 있는 Endo-Se, Endo-Sd, Endo-Sz 를 공정 1 에 사용할 수 있는지 검증하였다. 효소는, 서열 번호 76 ∼ 78 에 대응하는 유전자를 코드한 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입하여, 실시예 2, 실시예 4, 실시예 5 와 동일하게 조제하였다 (표 Z20).

(실시예 15b) mAb2-[MSG1-N₃]₂ 의 가수분해

「공정 1」에서 사용 가능한 효소로서 바람직한 잔존 가수분해 활성 정도의 지표를 명확히 하기 위해, 표 Z21 에 나타내는 실험을 실시하였다.

실시예 15a 에서 조제한 효소-A 를 이용하고, 실시예 11 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 가수분해율을 산출하였다 (표 Z21). 단, 항체 용액 7-1 대신 7-2 를 사용하였다.

(실시예 15c) 「공정 1」의 반응 조건 : 효소-A 와 효소-B 의 조합

(실시예 8-2) 에 기재한 [당사슬 전이 반응 표준 프로토콜 2] 에 따라, 당사슬 전이 반응을 실행하여, 샘플링액을 준비하였다. 그 후, (실시예 8-1) 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z22). 단, 각 실험에 사용한 당사슬 공여체나 당사슬 당량, 효소는, 적절히 표 Z22 에 표기한 것으로 변경하였다. 또한, 실시예 15-19 내지 실시예 15-21 에서는, 억셉터 분자로서, 참고예 22 에서 조제한 GlcNAc-㎃b4, (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A, (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 를 사용하였다.

여기서 나타낸 바와 같이, 효소-A 에 Endo-S2 T138Q 를 이용한 경우 (실시예 15-10) 를 제외하고, 어느 효소의 조합에 있어서도 당사슬 전이 반응에서 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율의 항체가 얻어지는 것을 확인하였다. 참고예 8 에서 나타내는 바와 같이, Endo-S2 T138Q 를 이용하는 경우도, 당사슬 공여체의 사용량을 늘리는, 잔존 가수분해 활성을 저감하는 변이를 도입함으로써 중간 정도 이상의 당사슬 전이율의 항체를 얻는 것이 가능한 것으로 추찰된다. 본 실시예에 있어서는, 대표적인 효소의 조합을 평가하는 것을 목적으로 하여 효소-A 로서 Endo-S, Endo-Si, Endo-S2, Endo-Se, Endo-Sz 를 사용하였지만, 실시예 11 에 기재된 바와 같이, 본 발명에 있어서의 효소-A 는 이들에 한정되지 않고, 잔존 가수분해 활성을 지표로 목적에 따라 임의로 선택할 수 있다. 또한, 실시예 15-19 내지 실시예 15-21 에 나타낸 바와 같이, 푸코오스레스 항체, Fc 단편, 및 「가변 영역을 결실시킨 정상 영역만으로 이루어지는 CH 와 경사슬의 정상 영역만으로 이루어지는 CL 을 조합한 CLCH」를 사용한 경우에도, 중간 정도 (＞80 ％) 이상의 당사슬 전이율이 얻어졌다. 이 점에서, 본 발명의 「공정 1」은, Fc 함유 분자의 종류는 항체에 한정되지 않고, 폭넓은 Fc 함유 분자에 응용 가능한 것이 실증되었다.

(실시예 15d) 효소-A/효소-B 융합 단백 효소의 조제

화학적, 혹은 유전자 공학적인 수법에 의해 2 개 이상의 단백질 또는 단백질 단편을 결합시켜, 1 개의 융합 단백질로서 기능시키는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 비특허문헌 (F Grueninger-Leitch, et al., Protein Sci. 1996, 12, 2617-22, 및 Emily MK, et al., Protein Eng Des Sel. 2005, 10, 497-501) 에 있어서, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제에 정제 태그로서 탄수화물 결합 모듈 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제를 융합시킨 예가 보고되어 있다. 또, 특허문헌 (WO2017137459) 에 있어서, 기질 선택성이 상이한 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제끼리를 융합한 효소 (Endo-S 와 Endo-H, 혹은 Endo-F3 과 Endo-H 의 융합 단백질 등) 를 이용하고, 하이 만노오스형 당사슬 및 복합형 당사슬 등, 기본 구조가 상이한 당사슬이 부가된 항체로부터 단일의 스텝으로 당사슬이 절단된 항체를 얻는 방법이 보고되어 있다. 한편, 당사슬 도너 분자로부터 억셉터 분자로 당사슬을 전이시키는 반응을 효율화하는 것을 목적으로 융합 단백질을 이용한 예는 지금까지 보고되어 있지 않다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 있어서, 효소-A 와 효소-B 는, 각각 원하는 역할을 하는 한, 직접적 또는 간접적으로 결합한 상태에 있어서 반응계에 첨가되어도 된다. 여기서는, 대표로서 효소-B 와 효소-A 를 연속한 아미노산 잔기를 포함하는 링커에 의해 결합한 융합 단백질을 조제하고, 반응성을 확인하였다. 융합 단백질은, 서열 번호 80 ∼ 81 에 대응하는 유전자를 코드한 발현 플라스미드를 메탄올 자화성 효모 Ogataea minuta 에 도입함으로써 산생주를 얻었다. 메탄올 유도에 의한 단백질의 발현에서는, 진탕 배양의 경우, 배플 플라스크를 사용하여 식균 후 1 일째에 메탄올 유도, 식균 후 3 일째에 배양을 종료하고, 원심 분리로 균체를 집균하였다. 집균한 균체를, YeastBuster (등록상표) Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) 를 사용하여 파쇄하고, 원심 분리를 실시한 상청을 Capto Chelating 을 사용하여 정제하였다. 마지막에 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 로 PBS(-) (후지 필름 와코 순약) 로 버퍼를 치환하여 효소액을 얻었다.

(실시예 15e) mAb2-[MSG1-N₃]₂ 의 가수분해

「공정 1」에서 사용 가능한 효소로서 바람직한 잔존 가수분해 활성 정도의 지표를 명확히 하기 위해, 표 Z24 에 나타내는 실험을 실시하였다.

실시예 15d 에서 조제한 효소를 이용하고, 실시예 11 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 가수분해율을 산출하였다 (표 Z24).

(실시예 15f) 효소-B/효소-A 융합 단백 효소의 반응예

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (1 mg), 당사슬 공여체 (20 당량), 효소-B/효소-A 융합 단백 (3.2 ％w/w) 과, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 16.7 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

그 후, (실시예 8-1) 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z25). 단, 각 실험에 사용한 당사슬 공여체나 당사슬 당량, 효소는, 적절히 표 Z25 에 표기한 것으로 변경하였다.

여기서 나타낸 바와 같이, 효소-B 와 효소-A 를 아미노산으로 결합한 융합 단백질을 이용한 경우도, 2 종류의 효소를 별도 분자로서 공정 1 에 첨가한 경우 (실시예 10) 와 동일하게, 원하는 당사슬이 부가된 항체를 얻을 수 있었다. 또한, 서열 번호 79 에 대해서도, 상기 수순에 따라 서열 번호 80 및 81 의 융합 단백질과 동일하게 융합 단백질을 조제할 수 있다. 본 실시예에 있어서는, 대표적인 융합 단백질의 예로서, 각각의 효소의 전장을 아미노산에 의해 직접 결합한 융합 단백질을 사용하였지만, 본 발명에 있어서의 융합 단백질은 이에 한정되지 않는다.

＜실시예 16＞「공정 2」의 응용예

(실시예 16-1) 양이온-소수 멀티 모드 수지를 이용한 정제

실시예 12 에서 나타낸 당사슬 전이율의 향상 효과가, 양이온-소수 멀티 모드 수지를 사용한 경우에도 얻어지는 것을 확인하였다.

여기서는, 하기의 부하액 조제의 표준 프로토콜 2 에 따라 준비한 부하액을, 항체 제조에 일반적으로 이용되는 양이온-소수 멀티 모드 수지에 부하하였다. 시판되는 대표적인 제품을 실험에 사용하였지만, 본 발명에 있어서의 양이온-소수 멀티 모드 수지는 이에 한정되는 것은 아니다.

[부하액 조제의 표준 프로토콜 2 (공정 1)]

＜공정 1＞

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (억셉터 분자 용액, 2000 mg) 과, 20 당량의 당사슬 도너 분자 (G-1) 와 1.6 ％(w/w) 의 효소-A (S-001) 와, 0.2 ％(w/w) 의 효소-B (M-001) 의 혼합액에, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 항체의 종농도가 60 mg/mL 가 되도록, 반응액량을 조정하였다. 계속해서, 그 반응액을 30 ℃ 에서 인큐베이트하고, 반응 개시 24 시간 후에 반응을 종료하고, 정제 실험을 개시할 때까지 동결 보관하였다.

＜샘플링＞

[양이온-소수 멀티 모드 크로마토그래피의 표준 프로토콜 1 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼 (모두 용량 1 ml) : Capto MMC Impress (Cytiva 제조), Eshmuno CMX (Merck 제조), Nuvia cPrime (BIO-RAD Laboratories 제조)

유속 : 0.3 ml/min

부하액 조제의 표준 프로토콜 2 에 따라 준비한 반응액에 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3.9), 1 M 염화나트륨 수용액, 1 M 염산, 정제수를 첨가하여 칼럼 부하액을 조제하였다. 부하액은 항체 농도가 5 mg/mL 가 되고, 또한, 각 실험의 칼럼 평형화액과 동일한 pH 및 염화나트륨의 최종 농도가 되도록 조제하였다. 부하액의 조제 후, 부하액의 당사슬 전이율을 확인하는 것을 목적으로 하여, 0.5 mL 를 샘플링하였다. 조제한 부하액 약 30 mL 를 칼럼에 통액 (샘플 통액) 한 후에, 평형화액 (50 mM 아세트산 버퍼, 490 mM 염화나트륨 수용액, pH 3.8) 을 5 CV 흘렸다 (칼럼 세정). 그 후, 칼럼 재생 목적으로, 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 수용액, pH 4.0) 을 5 CV 흘렸다. 마지막에, 정치 세정 (CIP) 목적으로, 클리닝액 (0.5 M 수산화나트륨 수용액) 을 3 CV 흘렸다. 샘플 통액시의 칼럼 통과액 중의 목적물은 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 50 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 회수하고, 1 M 트리스 용액을 첨가하여 pH 5.0-5.4 로 조정하여, 회수액으로 하였다. 이 회수액에 관하여, 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 로 항체 농도, 및 마이크로칩형 캐필러리 전자동 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하였다 (표 Z26).

여기서 나타낸 바와 같이, 양이온-소수 멀티 모드 수지를 사용한 경우에도 당사슬 전이율의 향상 효과가 얻어지는 것이 확인되었다.

(실시예 16-2) 결합/용출 모드로 정제한 방법과의 비교

목적물을 양이온 교환 칼럼에 흡착시킨 후, 용출액을 통액하여 용출 획분에 회수한 경우도, 당사슬 전이율의 향상 효과가 얻어지는 것을 확인하였다. 실시예 12 에 기재한 바와 같이 목적물을 양이온 교환 칼럼 통과 획분에 회수하는 방법과 직접 비교하기 위해, 동일한 방법 (부하액 조제의 표준 프로토콜 2 (공정 1)) 으로 조제한 반응액을 사용하여, 양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 4, 혹은 양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 5 로 정제를 실시하였다.

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 4 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼 : MonoS (1 ml) (Cytiva 제조)

유속 : 0.3 ml/min

부하액 조제의 표준 프로토콜 2 에 따라 준비한 반응액에 대하여, 11 배량의 평형화액 (50 mM 아세트산 버퍼, pH 3.8, pH 4.0, 혹은 pH 4.2) 을 첨가하여 칼럼 부하액을 조제하였다. 부하액을 표 Z27 에 따른 부하량이 되도록 칼럼에 통액하고, 목적물을 칼럼에 흡착시켰다. 평형화액을 5 CV 흘려서 칼럼을 세정한 후, 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 수용액, pH 는 평형화액에 맞추었다) 을 사용하여 염화나트륨의 직선적 농도 구배 (20 CV 에서 0 ∼ 100 ％) 에 의해 목적물을 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출액 중의 목적물은 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 20 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 0.5 ml 씩 분획하였다. 이 분획액에 관하여, 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 로 항체 농도, 및 마이크로칩형 캐필러리 전자동 전기 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하고, 부하액과 비교하여 당사슬 전이율이 향상되어 있는 획분만을 혼합하여, 회수액으로 하였다 (표 Z27).

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 5 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼 : MonoS (1 ml) (Cytiva 제조)

유속 : 0.3 ml/min

부하액 조제의 표준 프로토콜 2 에 따라 준비한 반응액에 대하여, 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3.9), 1 M 염화나트륨 수용액, 1 M 염산, 정제수를 첨가하여 칼럼 부하액을 조제하였다. 부하액은 항체 농도가 5 mg/mL 가 되고, 또한, 각 실험의 칼럼 평형화액과 동일한 pH 및 염화나트륨의 최종 농도가 되도록 조제하였다. 부하액 약 30 mL 를 칼럼에 통액 (샘플 통액) 한 후에, 평형화액 (50 mM 아세트산 버퍼, 490 mM 염화나트륨 수용액, pH 3.8) 을 5 CV 흘렸다 (칼럼 세정). 그 후, 칼럼 재생 목적으로, 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 수용액, pH 4.0) 을 5 CV 흘렸다. 마지막에, 정치 세정 (CIP) 목적으로, 클리닝액 (0.5 M 수산화나트륨 수용액) 을 3 CV 흘렸다. 샘플 통액시의 칼럼 통과액 중의 목적물은 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 50 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 회수하고, 1 M 트리스 용액을 첨가하여 pH 5.0-5.4 로 조정하여, 회수액으로 하였다. 이 회수액에 관하여, 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 로 항체 농도, 및 마이크로칩형 캐필러리 전자동 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하였다 (표 Z27).

여기서 나타낸 바와 같이, 목적물을 양이온 교환 칼럼에 흡착시킨 후, 용출액을 통액하여 용출 획분에 회수한 경우도, 당사슬 전이율의 향상 효과가 얻어지는 것을 확인하였다. 또한, 목적물을 통과 획분으로 회수하는 경우 (실시예 14) 와 동일하게, pH 가 낮을수록 당사슬 전이율의 향상 효과가 높고, pH 의 증가에 수반하여 당사슬 전이율의 향상 효과가 저하되는 것을 확인하였다.

(실시예 16-3) 옥사졸린법을 사용하여 반응액을 준비한 경우

실시예 12 에서 나타낸 당사슬 전이율의 향상 효과가, 공정 1 의 당사슬 공여체에 옥사졸린체를 이용한 경우에도 얻어지는 것을 확인하였다. 우선, 공정 1 에 있어서의 당사슬 공여체의 적절한 사용량을 확인하였다.

[부하액 조제의 표준 프로토콜 3 (공정 1)]

＜공정 1＞

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (억셉터 분자 용액, 6 mg) 과, 당사슬 공여체 N₃-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox (이하, 적절히 「N₃-MSG1-Ox」라고 표기하는, 특허문헌 : WO2019065964) (2 당량, 4 당량, 6 당량, 8 당량, 혹은 10 당량), 효소-A (0.5 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총액량 300 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다.

＜샘플링＞

반응 종료 후, 당사슬 전이율을 측정할 목적으로, 극미량의 반응액을 샘플링하여, 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석한 후, 마이크로칩형 캐필러리 전자동 전기 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하였다 (표 Z28).

표 Z28 로 나타낸 결과로부터, 공정 1 에서 4 당량 이상의 당사슬 공여체 N₃-MSG1-Ox 를 사용한 경우에는 당사슬 전이율이 매우 높아지기 때문에, 공정 2 에서 당사슬 전이율의 향상 효과를 평가하는 데에 적합하지 않다고 생각되었다. 이 때문에, 공정 1 에서 2 당량의 당사슬 공여체 N₃-MSG1-Ox 를 이용하여 공정 2 의 부하액을 조제하였다.

[부하액 조제의 표준 프로토콜 4 (공정 1)]

[부하액 조제의 표준 프로토콜 3 (공정 1)] 중, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (억셉터 분자 용액) 의 첨가량을 150 mg 으로, 당사슬 공여체 N₃-MSG1-Ox 의 첨가량을 2 당량으로 변경하였다. 또한, 반응 총액량을 7.5 ml 로 하였다.

＜부하액의 pH, 염 농도 조정＞

[양이온 교환 크로마토그래피의 표준 프로토콜 5 (공정 2)]

장치 : AKTA avant 25 (Cytiva 제조)

칼럼 : POROS HS (1 ml) (Thermo Fisher 제조)

유속 : 0.3 ml/min

부하액 조제의 표준 프로토콜 4 에 따라 준비한 부하액 약 20 mL 를 칼럼에 통액 (샘플 통액) 한 후에, 평형화액 (50 mM 아세트산 버퍼, 490 mM 염화나트륨 수용액, pH 3.8) 을 5 CV 흘렸다 (칼럼 세정). 그 후, 칼럼 재생 목적으로, 용출액 (50 mM 아세트산 버퍼, 1 M 염화나트륨 수용액, pH 4.0) 을 5 CV 흘렸다. 마지막에, 정치 세정 (CIP) 목적으로, 클리닝액 (0.5 M 수산화나트륨 수용액) 을 3 CV 흘렸다. 샘플 통액시의 칼럼 통과액, 및 칼럼 세정시의 세정액에 포함되는 목적물은, 280 nm 에 있어서의 흡광도에 의해 검출하고, 50 mAU/2 mm UV 셀 이상인 경우에 회수하고, 1 M 트리스 용액을 첨가하여 pH 5.0-5.4 로 조정하여, 각각 통과액 및 세정액으로 하였다. 이들 회수액에 관하여, 자외 가시 분광 광도계 시스템 SoloVPE (C Technologies 제조) 로 항체 농도, 및 마이크로칩형 캐필러리 전자동 영동 시스템 LabChip GX (Perkin Elmer 제조) 를 사용하여 당사슬 전이율을 확인하였다 (표 Z29).

여기서 나타낸 바와 같이, 공정 1 의 당사슬 공여체에 옥사졸린체를 이용한 경우라도 공정 2 에서 당사슬 전이율의 향상 효과가 얻어지는 것이 확인되었다.

본 발명에 이용 가능한 효소 A 는, 이미 알려진 효소, 및 그 변이체에 한정되지 않는다. 실시예 1 에 기재한 요건을 만족하면, 임의의 효소를 선택할 수 있다. 이미 알려진 효소 서열 정보를 기초로 하여, 새롭게 변이체를 탐색해도 된다. 그래서, 실시예 17 내지 실시예 19 에, 「공정 1」에 이용 가능한 효소 A 의 아미노산 변이 확인 방법 (이하, 「아미노산 변이 확인법」이라고 부른다) 을 나타낸다.

＜실시예 17＞ Endo-Si 단변이체의 조제

여기서는 망라적 탐색법을 나타내기 위해, Endo-Si 의 촉매 활성 도메인에 착안하였다. 변이 위치 아미노산의 단독 변이에서의 활성을 해석하기 위해, Endo-Si 단변이체 (D241X, T190X, Q311X, E360X) 를 조제하였다.

T190 의 단변이체, 및 실시예 1 에서 디자인한 변이체 이외의 D241, Q311, E360 각 단변이체에 대하여, 실시예 2 에 기재된 방법에 준하여 조제하였다 (표 Z31). 단, 반응 스케일이 상이하기 때문에, 배양시에는 500 mL 혹은 1000 mL 용량 배플 플라스크 대신에, 96 구멍 딥 웰 플레이트를 사용하고, 정제시에는, Capto Chelating 대신에, His 태그 정제 키트 Capturem His-Tagged Purification (Clontech 사) 을 사용하여, 간이 정제하였다.

＜실시예 18＞ mAb2-[MSG1-N₃]₂ 의 가수분해

다음에 Endo-Si WT 와 비교하여 동등 이하의 잔존 가수분해 활성을 갖는 효소를 좁히는 방법을 나타낸다. 여기서 사용하는 항체에는, 당사슬이 부가되어 있는 항체이면, 임의의 항체를 사용해도 된다.

㎃b2-[MSG1-N₃]₂ (50 μg), 실시예 17 에서 준비한 Endo-Si 단변이체 (1 μg) 및 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.25) 를 포함하는 합계 23.2 μL 의 반응액을 조제하여, 30 ℃ 에서 반응시켰다. 반응 개시 후, 1 시간, 4 시간 및 24 시간의 반응액을 샘플링하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다. 실시예 11 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 가수분해율을 산출하였다. 이 시험을 총 2 회 실시하였다 (표 Z32).

이 평가에서는, Endo-Si WT 와 비교하여 동등 이하의 잔존 가수분해 활성을 갖는 효소로 좁히는 것이 가능하다. 「1 시간 시점에서 가수분해율이 ＞99.9 ％ 를 나타낸 효소」는, 실시예 11 에서 측정한 Endo-Si WT 의 가수분해 활성과 비교하여, 동등 이상의 잔존 가수분해 활성을 나타내는 것으로 판정할 수 있다. 그래서, 「1 시간 시점에서 가수분해율이 ＞99.9 ％ 를 나타내지 않은 효소」에 대하여, 실시예 19 의 평가를 실시하였다.

＜실시예 19＞ 당사슬 공여체 G-1(SGP) 을 사용한 당전이 반응 확인

다음으로, 「공정 1」에 채용 가능한 효소의 아미노산 변이를 특정하는 방법을 나타낸다.

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b2 (50 μg), 당사슬 공여체 G-1 (122.72 μg, 50 당량), 실시예 17 에서 준비한 Endo-Si 단변이체 (2 μg), 실시예 3-2 에서 조제한 Endo-Rp N172H (5.7 μg), 및 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.25) 를 포함하는 합계 28 μL 의 반응액을 조제하여, 30 ℃ 에서 반응시켰다.

반응 개시 후, 4 시간, 8 시간 및 24 시간의 반응액을 샘플링하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다. 실시예 8-1 과 동일하게 하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 Z33).

표 Z33 의 결과로부터, 다음의 것이 확인되었다.

「D241 에 단변이를 넣을 경우」

효소 A 로서 이용 가능한 Endo-Si 단변이체는, 반드시 D241X₁ 이, X₁=Q 혹은 X₁=M 에 한정되지 않고, 일 양태로는, X₁=K 와 X₁=R 을 제외한, 임의의 아미노산을 생각할 수 있다.

「D241 에 단변이를 넣지 않을 경우」

여기서는, 대표예로서 T190X₂, Q311X₃, E360X₄의 3 개소에 대하여, 망라적인 해석을 실시하였다. 일 양태로는, T190X₂는, X₂=F, H, K, M, Q, R, W, Y 를 생각할 수 있고, Q311X₃ 은, X₃=F, N, Y 를 생각할 수 있고, E360X₄ 는, X₄=K 를 생각할 수 있다.

실시예 19 의 실험은, 극소 스케일로 실시하기 때문에, 반응 중 항체 농도는, 실시예 8 내지 실시예 10 에서 실시한 반응 중 항체 농도와 비교하여 현저히 낮아, 4.46 mg/mL 였다. 실시예 8 에서 나타낸 바와 같이 반응 중 항체 농도를 높게 하면, 당사슬 전이율이 향상되는 것을 고려하면, 각 효소에 최적인 조건을 사용하면, 일 양태로는, 24 시간 시점에서 당사슬 전이율이 ＜0.1 ％ 인 효소를 제외한 대부분의 효소는, 「공정 1」에 채용 가능하다고 생각된다 (표 Z34).

동일하게 하여, Endo-Si 의 촉매 활성 중심 부근의 모든 아미노산의 단변이 망라적 해석은 가능하다. 따라서, 「공정 1」에 이용 가능한 효소 A 의 촉매 활성 도메인에 임의의 아미노산 변이가 포함되어도 된다.

또한, 이 방법은 Endo-Si, Endo-S, Endo-S2 에 한정되지 않고, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 모두에 대하여 이용 가능하다. 따라서, 공정 1 에 이용 가능한 효소 A 는, 본 발명의 실시예에 기재된 특정한 Endo-Si 변이체, Endo-S 변이체, Endo-S2 변이체, Endo-Se 변이체, Endo-Sd 변이체, Endo-Sz 변이체에 한정되지 않는다. 당업자라면, 본 명세서를 참고로 하여, 본 실시예, 및 명세서 중에 예시 기재가 없는, 실시예 1 에 기재한 요건을 만족하는 효소-A 의 구조를 특정할 수 있다. 따라서, 실시예 1 에 기재한 요건을 만족하면, 「공정 1」에는 임의의 효소를 선택할 수 있다.

＜실시예 20＞ 숙주 세포 유래 N297 당사슬의 직접 교환 반응

전술한 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명에서는, 가수분해 활성이 잔존하고 있는 효소를 효소-A 로서 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에 있어서, 억셉터 분자는, 효소-A 가 숙주 세포 유래의 불균일한 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자에 작용함으로써 in situ 로 조제할 수 있다. 또한, in situ 로 조제된 억셉터 분자에 대하여, 실시예 10 등에서 나타낸 바와 같이 당사슬 도너 분자로부터 당사슬을 전이시켜, 원하는 당사슬이 균일하게 부가된 항체를 얻을 수 있다.

구체적으로는, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬을 갖는 항체에 대하여, 효소-A, 효소-B, 및 당사슬 도너 분자를 첨가함으로써, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 원하는 당사슬이 균일하게 부가된 항체를 얻을 수 있다. 본 착상에 있어서는, 효소-A 는 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬에 대한 가수분해 반응과, 당사슬 도너 분자의 당 전이 반응의 양방의 작용을 동일 반응조 내에서 나타낸다. 즉, 우선, 효소-A 가 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬을 갖는 항체에 작용하여, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬을 가수분해함으로써 억셉터 분자가 in situ 로 발생한다. 이어서, 동일한 반응조 내에서 효소-B 의 작용에 의해 활성화된 당사슬 도너 분자에 대해서도 효소-A가 작용하여, 억셉터 분자로 당사슬을 전이할 수 있다. 본 항에서 기술한 일련의 반응을 이후, 「숙주 세포 유래 N297 당사슬의 직접 교환 반응」이라고 표기한다.

숙주 세포 유래 N297 당사슬의 직접 교환 반응에서는, 도 xx2 에 나타내는 바와 같이, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬을 원하는 당사슬 구조로 치환할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 당사슬 도너 분자에 G-1 을 선택한 경우, mAb-[SG]₂가 얻어지는 것으로 생각된다. 또, 당사슬 도너 분자에 G-4, G-13, G-14, 혹은 G-16 을 선택한 경우에는 ㎃b-[X-MSG1]₂ 가 얻어지는 것으로 생각되고, 또한, 당사슬 도너 분자에 G-3, G-6, G-7, G-8, G-9, G-10, G-11, G-12, 혹은 G-15 를 선택한 경우, ㎃b-[X-SG]₂ 가 얻어지는 것으로 생각된다.

[화학식 52]

[N297 당사슬의 직접 교환 반응 표준 프로토콜 1]

숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬이 불균일하게 부가된 항체 (naked ㎃b1, 12 mg), 당사슬 공여체 G-1, G-10 혹은 G-16 (40 당량), 효소-A (1.6 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 200 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 72 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 24 시간, 48 시간, 72 시간에 샘플링하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1.5 mg/mL 가 되도록 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 으로 희석하여, 분석 개시시까지 동결 보관하였다. 질량 분석, 및/혹은, LabChip 분석을 이용하여, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬이 원하는 당사슬로 교환되어 있는 것을 확인하였다.

[질량 분석]

당사슬 리모델링 항체 분자를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 상태에서 분석 칼럼으로 분리하고, 질량 분석계에 도입하였다. 프래그먼트화를 위한 환원제로서, TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀) 를 사용하였다. 이에 따라, 당사슬 전이 반응으로 항체에 도입된 당사슬 도너 유래의 당사슬 부위 N₃기에 대하여 Staudinger 반응도 진행되고, NH₂기까지 환원된 질량이 메인의 피크로서 관측되었다.

장치에는, Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc 제조), Ultimate3000 UHPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 PLRP-S 1000A (Agilent Technologies 제조) (8 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 를 사용하고, 이동상 A 에는 물/0.1 ％ 포름산/0.02 ％ 트리플루오로아세트산 용액, 이동상 B 에는 아세토니트릴을 이용하고, 이동상 A 가 4 분 동안에 20 ％ 에서 50 ％ 로 변화하는 그래디언트를 사용하고, 유속 0.6 mL/min, 60 ℃ 에서 분석하여, 데콘볼루션된 스펙트럼을 얻었다 (표 Z36).

상기에 있어서 「X」는, N₃-PEG(3) 을 나타낸다. 단, N₃기가 NH₂기까지 환원된 피크로서 검출되는 경우에는, N₃기 1 개당 질소 원자 2 개분과 수소 원자 2 개분의 변화를 가미한 수치 (26 Da 정도) 가 이론값과의 차로서 관측된다.

naked mAb1 은, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬이 불균일하게 부가된 항체이기 때문에, MS 분석에 있어서 H 사슬에 숙주 세포 유래 N297 당사슬이 부가된 구조가, 복수의 MS 피크로서 확인되었다 (표 Z36). 실시예 20-1 에 착목하면, 반응 개시 24 시간 시점에서, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬은 거의 가수분해되고, G-1 유래의 당사슬 구조로 치환되어 있었다. 이것은, 반응액 중의 항체의 주된 구조가 mAb1-[SG]₂인 것을 나타낸다. 한편, 실시예 20-2 에 착목하면, 반응 개시 24 시간 시점에서, 숙주 세포 유래의 N297 결합 당사슬은 거의 가수분해되고, G-1 유래의 당사슬 구조, 및 그 가수분해체의 구조로 치환되어 있었다. 이것은, 반응액 중의 항체의 주된 구조가 mAb1-[SG]₂, 및 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 인 것을 나타낸다.

계속해서, 당사슬 공여체로서 G-16 을 사용한 실시예 20-3 과 실시예 20-4, 혹은 당사슬 공여체로서 G-10 을 사용한 실시예 20-5 와 실시예 20-6 에 착목하면, 각각, G-16 유래의 당사슬 구조, 및 G-10 유래의 당사슬 구조로서의 MS 피크가 검출되었다. 또한, Endo-Si D241Q 보다 더욱 잔존 가수분해 활성이 약한 Endo-Si D241M/Q303L 을 사용했을 경우에 있어서도, 직접 교환 반응 개시 48 시간 시점에서, 이미 숙주 세포 유래 N297 당사슬은 거의 가수분해되었다. 이것은, 반응액 중의 항체의 주된 구조가 mAb1-[X-SG]₂ 및 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1, 혹은 mAb1-[X-MSG1]₂ 및 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 인 것을 나타낸다. 여기서 나타낸 바와 같이, 숙주 세포 유래의 불균일한 당사슬을 갖는 항체에 효소-A 를 작용시킨 경우에도, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬이 균일하게 부가된 항체를 얻을 수 있었다. 또한, 상이한 효소나 당사슬 도너 분자의 조합을 이용한 경우에도 동일한 결과가 얻어지는 것을 확인하였다. 실시예 19 까지 얻어진 결과를 고려하면, 본 실시예에 기재되어 있는 조합의 효소나 당사슬 도너 분자를 사용하는 경우, 숙주 세포 유래 N297 당사슬의 직접 교환 반응도 「공정 1」에 포함되는 것이 실증되었다.

또한, 당업자라면, 본 명세서를 참고하여, 본 실시예, 및 명세서 중에 예시 기재가 없는, 실시예 20 에 기재한 요건을 만족하는 효소-A, 효소-B 나 당사슬 도너 분자의 구조를 특정할 수 있다. 따라서, 숙주 세포 유래 N297 당사슬의 직접 교환 반응을 「공정 1」에 채용하는 경우에는, 임의의 효소, 당사슬 도너 분자를 선택할 수 있다.

＜참고예＞

이하에 있어서, 참고예를 제시한다. 본 명세서에 있어서, 참고예는, 본 발명의 범위 외의 양태를 개시하는 것이 아니고, 어디까지나, 참고로서, 각종 억셉터 분자, 항체, 당사슬 도너 분자 등의 제조예나, 그들을 사용한 시험예, 본 발명의 응용적인 실시양태 등을 개시하는 것이다.

직접 당사슬 전이 반응에 억셉터 분자로서 사용하는 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자 용액 (억셉터 분자 용액), 가수분해 반응에 사용하는 항체-[MSG1-N₃]₂용액 (항체 용액), 및 항체-[SG-N₃]₂용액 (항체 용액) 을, 이하의 방법으로 조제하였다.

(참고예 1) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 용액의 조제 (1)

WO2017010559 의 실시예 3 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 을 함유하는 용액을, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하고, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b 용액 (억셉터 분자 용액 1-1, 억셉터 분자 용액 1-2) 을 준비하였다.

(참고예 2) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 용액의 조제 (1)

WO2019065964 의 실시예 61 의 공정 1 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b2 를 함유하는 용액을, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하고, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b 용액 (억셉터 분자 용액 2-1, 억셉터 분자 용액 2-2) 을 준비하였다.

(참고예 3) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3 용액의 조제 (1)

WO2020050406 의 실시예 85 의 공정 1 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b3 을 함유하는 용액을, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하고, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b 용액 (억셉터 분자 용액 3-1) 을 준비하였다.

(참고예 4) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 용액의 조제 (2)

(참고예 1) 에서 사용한 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 대신에, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 이용하고, (참고예 1) 과 동일하게 하여, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb 용액 (억셉터 분자 용액 4-1) 을 준비하였다.

(참고예 5) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 용액의 조제 (2)

(참고예 2) 에서 사용한 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 대신에, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 이용하고, (참고예 2) 와 동일하게 하여, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb 용액 (억셉터 분자 용액 5-1) 을 준비하였다.

(참고예 6) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3 용액의 조제 (2)

(참고예 3) 에서 사용한 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5) 대신에, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 이용하고, (참고예 3) 과 동일하게 하여, 표 Y-2 에 나타내는 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb 용액 (억셉터 분자 용액 6-1) 을 준비하였다.

(참고예 7) mAb2-[MSG1-N₃]₂용액의 조제　

WO2019065964 의 실시예 61 의 공정 2 에 기재된 방법으로 제조할 수 있는 ㎃b2-[MSG1-N₃]₂ 를 함유하는 용액을, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하고, 표 Y-2 에 나타내는 ㎃b2-[MSG1-N₃]₂ 용액 (항체 용액 7-1 및 항체 용액 7-2) 을 준비하였다.

(참고예 8) Endo-S2 변이체의 반응성 확인

실시예에서 사용한 표준 프로토콜 중 어느 것에 따라, 하기 표 Z38 에 나타낸 바와 같이, 적절히 조건을 설정하였다. (Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (6 mg) 에 대하여, 각종 당사슬 공여체 (10 당량 ∼ 40 당량, 혹은 100 당량), 효소-A (0.8 ％w/w), 효소-B (0.2 ％w/w), 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 100 ∼ 300 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 28 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 24 시간, 28 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다. 실시예와 동일하게 하여, 당사슬 전이율을 측정하였다.

실시예 11 에서 나타낸 바와 같이, 잔존 가수분해 활성이 야생형과 거의 동등한 Endo-S2 D184M 으로, 당사슬 미수식의 G-1 을 당사슬 공여체로 한 경우에는, [공정 1] 에 있어서 적절한 조건을 설정하면, 80 ％ 를 초과하는 당사슬 전이율을 달성할 수 있다.

한편, 화학 수식된 당사슬 공여체를 사용한 경우는, 일단 당사슬이 전이된 항체가, 잔존 가수분해 활성이 야생형과 거의 동등한 Endo-S2 D184M 으로 용이하게 가수분해를 받기 때문에, 40 당량 이하의 당사슬 공여체 사용량으로 당사슬 전이율이 80 ％ 를 초과하지 않았다. 그러나, 참고예 8-16 이나 참고예 8-17 의 결과로부터, 당사슬 공여체의 사용량을 증가시키면, 당사슬 전이율이 개선되는 경향이 확인되었다. 이러한 경우, 잔존 가수분해 활성을 저감하는 변이를 도입함으로써, 「공정 1」에 채용하는 것이 가능한 것으로 기대할 수 있다.

참고예 9 : 항 CD70 항체 1 의 제조

항 CD70 항체 1 은 WO2004/073656 을 참조하여 제조하였다. 당해 항 CD70 항체 1 은, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이 (IgG1-L234A, L235A) 를 갖는다. 당해 항 CD70 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 도 14 에 나타낸다. 서열 번호 1 (도 14) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 112 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 2 (도 14) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 118 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 13), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 14), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 15), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 16), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 17), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 18) 을 도 20 에 나타낸다.

참고예 10 : 항 CD70 항체 2 의 제조

항 CD70 항체 2 는 WO2007/038637 을 참조하여 제조하였다. 당해 항 CD70 항체 2 는, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이를 갖는다. 당해 항 CD70 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 도 15 에 나타낸다. 서열 번호 3 (도 15) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 4 (도 15) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 118 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 19), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 20), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 21), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 22), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 23), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 24) 을 도 21 에 나타낸다.

참고예 11 : 항 TROP2 항체 1 의 제조

항 TROP2 항체 1 은 WO2015/098099 를 참조하여 제조하였다. 당해 항 TROP2 항체 1 은, 아이소타입이 IgG1 이다. 당해 항 TROP2 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 5) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 도 16 에 나타낸다. 서열 번호 5 (도 16) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 6 (도 16) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 121 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 25), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 26), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 27), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 28), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 29), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 30) 을 도 22 에 나타낸다.

참고예 12 : 항 TROP2 항체 2 의 제조

항 TROP2 항체 1 은 WO2015/098099 를 참조하여 제조하였다. 당해 항 TROP2 항체 1 은, 아이소타입이 IgG1 이다. 항 TROP2 항체 2 는, 항 TROP2 항체 1 에 LALA 변이를 도입하였다. 당해 항 TROP2 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 7) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 도 17 에 나타낸다. 서열 번호 7 (도 17) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 8 (도 17) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 121 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 31), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 32), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 33), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 34), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 35), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 36) 을 도 23 에 나타낸다.

참고예 13 : 항 EGFR 항체 1 의 제조

항 EGFR 항체 1 은, 벡티빅스 점적 정맥 주사 100 ㎎ 심사 결과 보고서 (2010년 3월 5일 의약 식품국 심사 관리과) 를 참조하여 제조하였다. 당해 항 EGFR 항체 1 은, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이를 갖는다. 당해 항 EGFR 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 9) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 도 18 에 나타낸다. 서열 번호 9 (도 18) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 10 (도 18) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 119 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 37), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 38), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 39), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 40), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 41), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 42) 을 도 24 에 나타낸다. CDR 서열은 WO1998/050433 을 참조하였다.

참고예 14 : 항 EGFR 항체 2 의 제조

항 EGFR 항체 2 는 WO2002/092771 을 참조하여 제조하였다. 당해 항 EGFR 항체 2 는, 아이소타입이 IgG1 이며, LALA 변이를 갖는다. 당해 항 EGFR 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 도 19 에 나타낸다. 서열 번호 11 (도 19) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 12 (도 19) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 116 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 43), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 44), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 45), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 46), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 47), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 48) 을 도 25 에 나타낸다.

참고예 15 : 항 HER2 항체의 제조

본 명세서에 있어서,「트라스투주맙」은 HERCEPTIN (등록상표), huMAb4D5-8, rhuMAb4D5-8 로 불리는 경우도 있으며, 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 인간화 IgG1 항체이다. 아미노산 서열은 US5821337 을 참조하였다. 트라스투주맙의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 49) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 50) 을 도 26 에 나타낸다.

항 HER2 항체는, 트라스투주맙의 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 234 번째 및 235 번째의 류신 (L) 을 알라닌 (A) 으로 변이 (본 명세서 중, LALA 변이라고도 한다) 시킨, 트라스투주맙의 정상 영역 개변 IgG1 항체 (본 명세서 중, 개변 항 HER2 항체라고도 한다) 를 설계하여, 제조할 수 있다. 개변 항 HER2 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 49) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 51) 을 도 27 에 나타낸다.

참고예 16 : 항 HER2 항체 2 의 제조

「퍼투주맙」은 PERJETA (등록상표) 로 불리는 경우도 있으며, 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 인간화 IgG1 항체이다. 아미노산 서열은 WO2004/008099 를 참조하였다. 본 명세서에서는 항 HER2 항체 2 라고도 한다. 퍼투주맙의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 53) 을 도 28 에 나타낸다. 서열 번호 52 (도 28) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 서열 번호 53 (도 28) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 119 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 당해 가변 영역의 위치는 IMGT 의 정의에 의해 결정하였다.

항 HER2 항체 2 는, LALA 변이에 더하여, 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 214 번째의 리신 (K) 을 아르기닌 (R) 으로 변이시킨 G1m3 알로타입의 정상 영역을 갖는 항 HER2 항체 2 를 설계하여, 제조할 수 있다 (본 명세서 중, 개변 항 HER2 항체 2 라고도 한다). 당해 개변 항 HER2 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 54) 을 도 29 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 57), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 58), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 59), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 60), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 61), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 62) 을 도 31 에 나타낸다. 서열 번호 52 (도 29) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 108 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 서열 번호 54 (도 29) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 119 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 당해 가변 영역의 위치는 IMGT 의 정의에 의해 결정하였다.

참고예 17 : 항 CDH6 항체의 제조

항 CDH6 항체는 WO2018/212136 을 참조하여 제조할 수 있다. 당해 항 CDH6 항체는, 아이소타입이 IgG1 이고, LALA 변이에 더하여, 중사슬 아미노산 서열의 EU 인덱스 329 번째의 프롤린 (P) 을 글리신 (G) 으로 한 변이를 갖는다. 당해 항 CDH6 항체의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 55) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 56) 을 도 30 에 나타낸다. 서열 번호 55 (도 30) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 107 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이고, 서열 번호 56 (도 30) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 122 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 63), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 64), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 65), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 66), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 67), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 68) 을 도 32 에 나타낸다.

참고예 18 : 「공정 1」의 응용법 예시 1

최근, Endo-S2 WT 로 분해되기 어려운 당사슬 구조를, Fc 함유 분자인 항체에 전이시키는 예가 보고되었다 [비특허문헌 : ACS Chem. Biol. 2021, 2502-2514., 비특허문헌 : Acta Pharm. Sin. B 2022, 2417-2428]. 이 점에서, 당사슬 도너 분자의 구조를 적절히 선택함으로써, 야생형 효소를 이용한 경우에도, 억셉터 분자로 당사슬 도너 분자 유래의 당사슬이 전이된 원하는 생성물을 얻을 수 있다. 예를 들어, 이들 보고에 기재되어 있는 당사슬 옥사졸린체의 구조를 참고로 하여, 환원 말단측에 GlcNAc 를 하나 신장한 옥사졸린화되어 있지 않은 O 결합형 당사슬 도너 분자 혹은 N 결합형 당사슬 도너 분자를 준비하고, 추가로 본 명세서의 조건을 참고로 하여, 이들 당사슬 공여체의 O 결합형 당사슬 혹은 N 결합형 당사슬에 작용할 수 있는 적절한 효소-B 의 존재하, 야생형의 효소-A 를 작용시킴으로써 소기의 생성물을 포함하는 반응액을 얻는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 응용예는, 본 발명의 「공정 1」에 포함된다. 또, 당업자라면, 본 명세서를 참고하여, 본 실시예, 및 명세서 중에 예시 기재가 없는, 협주적으로 작용하는 효소-A 와 효소-B 의 구조를 특정할 수 있고, 예를 들어, Endo-S2, Endo-S, Endo-Si 등에서 선택된 야생형의 효소-A, 및 Endo-M, Endo-Rp, Endo-CC (서열 번호 6), Endo-Om (서열 번호 7), Endo-A (GenBank Accession number : AAD10851), Endo-CE (GenBank Accession number : BAB84821), Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number : CCY37287), Endo-Tsp1263 (GenBank Accession number : CDD88945), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession number : CDD89351), Endo-BB (GenBank Accession number : AAN25135), Endo-BH (GenBank Accession number : BAB04504.1), Endo-BN (GenBank Accession number : WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession number : XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number : XP_002911817.1), Endo-D (GenBank Accession number : AAK74656.1), 혹은 Endo-Pm (GenBank Accession number : ADK97032.1) 등에서 선택된 효소-B 를 들 수 있다.

참고예 19 : 「공정 1」의 응용법 예시 2

본 명세서의 실험예에서는, in vitro 반응에서의 예만을 나타냈지만, 항체의 생산 세포에 효소-A 와 효소-B 를 공발현시킨 경우에도, 생산 세포 내에서 도 1 혹은 도 XX2 와 동일한 상황이 재현되는 것이 기대된다. 당업자라면, 본 명세서를 참고하여 공발현의 조건을 적절히 설정함으로써, 소기의 생성물을 포함하는 반응액 (배양액 중에서도 목적의 반응이 진행되는 경우, 반응액에 해당한다) 을 얻는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 응용예는 본 발명의 「공정 1」에 포함된다.

참고예 20 : 「공정 1」의 응용법 예시 3

본 발명의 효소-A 는, Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는 효소이다. 예를 들면,예를 들어, Endo-BI1 (GenBank Accession number : ACJ53522.1), Endo-BI2 (GenBank Accession number : BAJ71450.1), Endo-BT-3987 (GenBank Accession number : AAO79092.1), Endo-E (GenBank Accession number : AAR20477.1), Endo-F (GenBank Accession number : AAA24922.1), Endo-F2 (GenBank Accession number : AAA24923.1), Endo-F3 (GenBank Accession number : AAA24924.1), Endo-CoM (GenBank Accession number : XP006673222), 혹은 Endo-SB (GenBank Accession number : BBB35949) 등의 아미노산 서열을 부분적으로 포함하는 효소 (이하, 효소-A 단편) 에 대하여, 항체의 Fc 단편에 친화성이 있는 구조를 도입했을 경우, 본 발명의 효소-A 로서 작용하는 것이 기대된다.

옥사졸린체를 당사슬 공여체로 하고, Endo-F3 변이체를 사용하는 경우, Endo-S 등과 비교하여, 보다 많은 당사슬량이나 효소량이 필요하다는 점, 즉 대량 제조의 관점에서 효율이 좋지 않는 것이 알려져 있었다 (비특허문헌 : J. Biol. Chem. 2016, 9356-9370). 한편, Endo-F3 변이체에 Fc 결합성 펩티드를 부여함으로써, 항체 Fc 부분에 효율적으로 당사슬을 전이시키는 것이 가능해지는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 : Org. Biomol. Chem. 2022, 3086-3095). 이 점에서, Endo-F3-Fc 결합성 펩티드 복합체는, Endo-S 와 동일한 작용을 하는, 즉 효소-A 단편과 Fc 결합성 구조를 조합함으로써, 인공적으로 Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는 효소를 제조할 수 있는 것이 나타났다. 인공적으로 제조한 효소-A 를 이용하는 경우에도, 당업자라면, 본 명세서를 참고하여, 본 실시예, 및 명세서 중에 예시 기재가 없는, 효소-A 의 구조 그리고 협주적으로 작용하는 효소-A 와 효소-B 의 구조를 특정하고, 소기의 생성물을 포함하는 반응액을 얻는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 응용예는, 본 발명의 「공정 1」에 포함된다. (단, Fc 결합성 구조란, Fc 단편에 친화성을 나타내는 임의의 펩티드, 핵산, 저분자 등이다.)

참고예 21 : 「공정 1」의 응용법 예시 4

본 발명의 당사슬 도너 분자는, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하고, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 N-결합형 당사슬 또는 O-결합형 당사슬이다. 당사슬 도너 분자는 본 명세서의 실시예에서 사용된 당사슬에 한정되지 않고, 3 분기형 당사슬 구조, 4 분기형 당사슬 구조, 페이로드가 탑재된 당사슬 구조 등을 갖는 당사슬 도너 분자에도 응용할 수 있는 것이 합리적으로 기대된다. 즉, 전술한 당사슬 도너 분자에 대하여 작용할 수 있는 효소-B 와, 효소-A 를 적절히 선택함으로써, 목적으로 하는 당사슬 전이 반응이 진행된다.

예를 들어, Endo-S 또는 그 변이체, Endo-S2 또는 그 변이체, 혹은 Endo-F3 또는 그 변이체를, 목적에 따라 적절히 사용하면, 3 분기형 당사슬 옥사졸린, 혹은 4 분기형 당사슬 옥사졸린 혹은, 페이로드가 탑재된 당사슬 옥사졸린체를 당사슬 도너에 사용한 경우, 소기의 화합물을 취득할 수 있는 것이 보고되었다 (비특허문헌 : Bioorg. Med. Chem, 2018, 1347-1355., J. Biol. Chem. 2016, 16508-16518, Acta Pharm. Sin. B 2022, 2417-2428, 특허문헌 : WO2017124084, US2019002542, JP2021-145548). 이 점에서, 본 명세서를 참고하여 조건을 적절히 이용함으로써, Endo-S2 는, GlcNAc 를 포함하는 Fc 함유 분자에 대하여 작용하고, 3 분기형 당사슬, 4 분기형 당사슬, 또는 페이로드가 탑재된 당사슬을 도입하기 위한 효소-A 로서 작용하는 것을 기대할 수 있다. 즉, 3 분기형 당사슬 구조, 4 분기형 당사슬 구조, 페이로드가 탑재된 당사슬 구조 등을 갖는 당사슬 도너 분자를 사용한 경우에도, 당업자라면, 본 명세서를 참고하여, 본 실시예 및 명세서 중에 예시 기재가 없는, 효소-A 의 구조 그리고 협주적으로 작용하는 효소-A 와 효소-B 의 구조를 특정하고, 소기의 생성물을 포함하는 반응액을 얻는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 응용예는 「공정 1」에 포함된다.

참고예 22 실시예 15, 및 실시예 20 에 사용하는 항체 용액의 조제

항체에는 입수 가능한 Trastuzumab, 혹은 Mogamulizumab (포텔리지오 20 mg, 쿄와 기린 주식회사) 을 이용하여, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하여, 표 Y-3 에 나타내는 항체 용액을 준비하였다.

또, WO2017010559 의 실시예 3 에 기재된 방법에 준하여, 항체에는 Mogamulizumab (포텔리지오 20 mg, 쿄와 기린 주식회사) 를 이용하여, 야생형 Endo-S 로 당사슬을 절단하고, 정제 후, 한외 여과막인 Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하여, 억셉터 분자 용액 9-1 을 준비하였다.

또한, WO2018003983 의 실시예 3-9A 에 기재된 방법으로 조제한 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액을 이용하고, 한외 여과막인 Amicon Ultra-500, 10 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하여, 표 Y-3 에 나타내는 억셉터 분자 용액 10-1 을 준비하였다.

WO2018003983 의 실시예 3-3A 에 기재된 방법으로 조제한 (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 용액을 이용하고, 한외 여과막인 Amicon Ultra-500, 10 kDa (Merck) 와, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.25) 을 사용한 농축 투석 (UFDF) 으로 완충액 교환하여, 표 Y-3 에 나타내는 억셉터 분자 용액 11-1 을 준비하였다.

참고예 23 당사슬 공여체 G-18 (M9-Asn, M8-Asn, M7-Asn, M6-Asn 의 혼합물) 의 조제와 [공정 1] 의 확인

참조예 23-1 당사슬 공여체 G-18 의 조제

[화학식 53]

대두 분말에는, [M9-Asn] 의 구조가 포함되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 : Chem. Biol. 2004, 127-134). M8-Asn, M7-Asn, 혹은 M6-Asn 은, 각각 M9-Asn 으로부터 만노오스가 1 개, 2 개, 혹은 3 개 결손된 구조를 갖는다.

[불용성 성분의 제거 (1)]

시판품인 대두 분말 (Soybean Flour TypeI, 1 Kg, Sigma-Aldrich 제조) 을 0.15 N 수산화나트륨 수용액 (5 L) 에 현탁시켜, 120 분간 교반한 후에, 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하여, 상청 1 (3.8 L) 을 회수하였다.

[수용성 성분의 제거]

계속해서, 상청 1 에 황산암모늄 (1.14 kg) 을 첨가하였다. 그 후, 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하고, 상청 2 를 제거하여 침전물 1 을 얻었다.

[불용성 성분의 제거 (2)]

침전물 1 을 0.15 N 수산화나트륨 수용액 (4 L) 에 용해시킨 후에, 적량의 5 N 염산을 첨가하여 pH 5.0 으로 조정하였다. 그 후, 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하고, 상청 3 을 제거하여 침전물 2 를 얻었다.

[효소 반응]

침전물 2 를 0.15 N 수산화나트륨 수용액 (3 L) 에 용해시킨 후에, 적량의 5 N 염산을 첨가하여 pH 5.0 으로 조정하였다. 그 후, Actinase AS (300 g, 카켄 제약 제조) 를 첨가한 후에, 37 ℃ 에서 48 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 적량의 5 N 염산을 첨가하여 pH 5.0 으로 조정하고, 혼합액을 감압하 셀라이트 여과 (프리 코트 : 셀라이트 505, 보디 피드 : 셀라이트 545) 하여, 여과액 A (2.7 L) 를 얻었다.

[불용성 성분의 제거 (3)]

여과액 A (2.7 L) 에 대하여, 3 배량의 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전물 3 을 회수할 목적으로 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하여, 상청 4 와 분리하였다. 계속해서, 분리한 상청 4 에 대하여, 1 회째와 동량의 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전물 4 를 회수할 목적으로 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하여, 상청 5 와 분리하였다. 1 회째의 조작 및 2 회째의 조작으로 얻어진 침전물 3 과 침전물 4 를 하나로 합하여, 증류수 (2 L) 에 용해하였다. 계속해서, 감압하 여과 (여과지 : ADVANTEC No. 2) 하여, 여과액 B 를 얻었다.

[불용성 성분의 제거 (4)]

여과액 B 로부터 감압하 아세톤을 제거한 후에, 적량의 5 N 염산을 첨가하여 pH 3.0 으로 조정한 후에, 감압하 셀라이트 여과 (프리 코트 : 셀라이트 505, 보디 피드 : 셀라이트 545) 하여, 여과액 C (1.5 L) 를 얻었다.

[조정제 (1) : 칼럼 정제]

여과액 C (1.5 L) 를 SEPABEADS SP207 (200 mL, 미츠비시 케미컬 제조) 을 충전한 칼럼에 통액하고, 통과액을 회수하였다. 그 후, 증류수를 첨가하고, 5.0 L 로 메스업하여, 칼럼 처리액 (5.0 L) 을 얻었다

[조정제 (2) : 막 정제]

칼럼 처리액 (5.0 L) 을 한외 여과막 (Hydrosart 2 kDa, 0.1 m², 싸토리우스 제조) 을 사용하여, 증류수 10 L 를 가수하면서 한외 여과하고, 한외 여과 처리액 (3 L) 을 얻었다.

[추출물의 취득]

한외 여과 처리액 (3 L) 에 대하여, 2 배량의 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전물 5 를 회수할 목적으로, 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하여, 상청 6 과 분리하였다. 계속해서, 분리한 상청 6 에 대하여, 1 회째와 동량의 아세톤을 첨가하고, 발생한 침전물 6 을 회수할 목적으로 원심 분리 (8000 rpm, 30 분) 하여, 상청 7 과 분리하였다. 1 회째의 조작 및 2 회째의 조작으로 얻어진 침전물 5 와 침전물 6 을 하나로 합하여, 동결 건조하여 추출물 (78.6 g) 을 얻었다.

[칼럼 정제]

0.1 ％ 의 포름산을 포함하는 증류수와 아세토니트릴을 용리액으로 하고, 장치에는 Agilent 1100 시리즈 LC (Agilent technologies 제조), 칼럼에는 Hypercarb (20 Φ x 150 ㎜, Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 를 사용하고, 상기에서 얻어진 추출물의 일부 (약 20 g) 의 분리 정제를 실시하였다. MS 검출에 의해 검출된 메인 피크를 회수하고, 동결 건조하였다. 얻어진 동결 건조 분말을 증류수에 용해시키고, 적량의 암모니아수를 첨가하여, pH 7.0 으로 조정하였다. 그 후, 다시 동결 건조하여, 당사슬 원료 G-18 (46.7 mg) 을 동결 건조 분말로서 얻었다.

[질량 분석]

장치에는, Agilent 1200 (Agilent technologies 제조), Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 Hypercarb (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) (5 ㎛, 4.6 x 150 ㎜) 를 사용하고, 이동상 A 에는 물, 이동상 B 에는 아세토니트릴을 이용하고, 이동상 B 가 15 분 동안에 5 ％ 에서 15 ％ 로 변화하는 그래디언트를 사용하고, 유속 1.0 mL/min, 40 ℃ 에서 분석하였다. 주로, 4 개의 피크가 확인되었다.

ESI-MS : Calcd for M9-Asn C74H122N4O58 : [M-2H]^2- 997.34 (most abundant mass), Found 997.34.

Man8GlcNAc2-Asn [M8-Asn] 은, M9-Asn 의 비환원 말단측 만노오스가 1 개 결손된 구조이다.

ESI-MS : Calcd for M8-Asn C68H112N4O53 : [M-2H]^2- 916.31 (most abundant mass), Found 916.31.

Man7GlcNAc2-Asn [M7-Asn] 은, M9-Asn 의 비환원 말단측 만노오스가 2 개 결손된 구조이다.

ESI-MS : Calcd for M7-Asn C62H102N4O48 : [M-2H]^2- 835.28 (most abundant mass), Found 835.28.

Man6GlcNAc2-Asn [M6-Asn] 은, M9-Asn 의 비환원 말단측 만노오스가 3 개 결손된 구조이다.

ESI-MS : Calcd for M6-Asn C62H102N4O48 : [M-2H]^2- 754.26 (most abundant mass), Found 754.26.

[HPLC 분석]

장치에는, Agilent 1260 (Agilent technologies 제조), 및 Hypercarb (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) (5 ㎛, 4.6 x 150 ㎜) 를 사용하고, 이동상 A 에는 물, 이동상 B 에는 아세토니트릴을 이용하고, 이동상 B 가 20 분 동안에 5 ％ 에서 15 ％ 로 변화하는 그래디언트를 사용하고, 유속 1.0 mL/min, 40 ℃ 에서 분석하였다. 주로, 4 개의 피크가 확인되었다.

참고예 23-2 당사슬 공여체 G-18 을 이용한 당사슬 전이 반응

[화학식 54]

(Fucα1,6)GlcNAc-㎃b1 (0.6 mg), 당사슬 공여체 (40 당량), 효소-A (0.8 ∼ 1.6 ％w/w), 효소-B (0.02 ％ ∼ 0.2 ％w/w) 와, 적량의 50 mM 트리스-염산 완충 용액 (pH 7.25) 을 첨가하여, 총량 액량 15 μL 로 하고, 30 ℃ 에서 24 시간 반응시켰다. 반응 개시 후, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 22 시간, 24 시간에 샘플링하였다. 반응 종료 후, 반응액의 pH 를 측정하였다. 샘플링시에는 반응액을 일부 빼내고, 함유 항체 농도가 1 mg/mL 가 되도록 정제수로 희석하여, LabChip 분석 개시시까지 동결 보관하였다.

(실시예 8-1) 과 동일하게 하여, (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 에 이용한 각 반응 조건에 대하여, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 ZZ17).

실시예 23-1 내지 실시예 23-6 의 결과로부터, 「효소-B 의 첨가 비율을 바꾸는 것」, 즉 「효소-B 에 의한 당사슬 도너 분자의 활성화의 속도를 바꿈」으로써, 최대 전이율에 영향이 생기는 것을 확인하였다.

「공정 1」에 이용 가능한 효소-B 의 본질은, 푸코오스를 갖지 않는 당사슬 도너 분자로부터, 효소-A 가 Fc 함유 분자로의 당사슬 전이 반응에 이용 가능한 상태 (활성화 중간체) 로 활성화하는 능력이다. 한편, 효소-A 에 의한 당사슬 전이 반응은, 실시예 11 에서 나타낸 바와 같이, 그 생성물인 당사슬 전이체의 가수분해 반응과 반드시 경합한다. 이러한 환경하, 만약, 효소-B 에 의한 당사슬 도너 분자의 활성화의 속도가 충분하지 않은 경우, 기대되는 당사슬 전이율은 낮아지는 것이 예상된다.

이것을 해결하기 위해서는, 당사슬 도너 분자의 당사슬 구조에 따라, 효소-B 를 적절히 구분하여 사용할 필요가 있다. Endo-M 이나 Endo-Rp 의 변이체를 변경하는 것 외에, 예를 들어, Endo-A (GenBank Accession number : AAD10851), Endo-CE (GenBank Accession number : BAB84821), Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number : CCY37287), Endo-Tsp1263 (GenBank Accession number : CDD88945), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession number : CDD89351), Endo-BB (GenBank Accession number : AAN25135), Endo-BH (GenBank Accession number : BAB04504.1), Endo-BN (GenBank Accession number : WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession number : XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number : XP_002911817.1), Endo-D (GenBank Accession number : AAK74656.1), 혹은 Endo-Pm (GenBank Accession number : ADK97032.1) 을 스크리닝하고, G-18 에 적합한 효소-B 의 구조를 특정함으로써, 보다 높은 당사슬 전이율이 얻어지는 것이 합리적으로 예상된다.

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Claims

이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 제조 방법 :
[공정 1] N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와, 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정,
[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는 공정.
제 1 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 포함하는, 방법.
제 2 항에 있어서,
공정 1 이, 억셉터 분자와 당사슬 도너 분자를, 효소-A 및 당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정인, 방법.
제 3 항에 있어서,
당사슬 도너 분자의 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-B) 가, 효소-A 의 존재하, 당사슬 도너 분자에 작용함으로써, 효소-A 에 의한 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬의 억셉터 분자로의 당사슬 전이 반응을 촉진하는 성질을 갖는 효소인, 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
효소-B 가, SGP 로부터 GlcNAc 유도체로의 당사슬 전이 활성을 갖는 효소인, 방법.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
효소-B 가, Endo-M, Endo-Om, Endo-CC, 또는 Endo-Rp 의 변이 효소이며, 당해 변이 효소는 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는, 방법.
제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
효소-B 가, Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172G, Endo-Rp N172I, Endo-Rp N172L, Endo-Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, Endo-Rp N172V, Endo-Rp W278F/S216V, Endo-Rp W278F/N246D, Endo-Rp W278F/D276N, Endo-Rp W278F/A310D, Endo-Rp W278F/N172D/F307Y, Endo-Rp W278F/N172D/F307H, Endo-Rp W278F/N172D/A310D, Endo-Rp W214F/F307Y/L306I, Endo-M N175Q, Endo-M N175Q/Y217F, Endo-CC N180H 및 Endo-Om N194Q 로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
효소-A 와 효소-B 가 융합되어 있는, 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 1 에 있어서, 억셉터 분자 1 당량에 대하여 2 당량 내지 40 당량의 당사슬 도너 분자가 사용되는, 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 1 에 있어서, 당사슬 전이율이 80 ％ 를 초과하는, 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가 갖는 당사슬이, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 N-결합형 당사슬 또는 O-결합형 당사슬인, 방법.
제 11 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가, 비환원 말단이 화학 수식되어 있어도 되는 SGP, AG(9)-P, AG(7)-P, SG-Asn, AG(9)-Asn, AG(7)-Asn, SG-OR, AG(9)-OR, AG(7)-OR, (MSG1)-Asn, (MSG2)-Asn, (MSG1)-Asn 과 (MSG2)-Asn 의 혼합물, MSG1-OR, MSG2-OR, 또는 MSG1-OR 과 MSG2-OR 의 혼합물이며, 식 중, R 은, 적어도 하나의 탄소 원자를 개재하여 산소 원자에 연결하는 임의의 치환기인, 방법.
제 12 항에 있어서,
R 이, C1 ∼ C6 알킬기 또는 치환되어 있어도 되는 아릴기를 나타내는, 방법.
제 13 항에 있어서,
R 이, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸기, n-펜틸기, 및 n-헥실기로 이루어지는 군에서 선택되거나, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 또는 할로겐기로 치환되어 있어도 되는 페닐기, 벤질기, 인데닐기, 나프틸기, 플루오레닐기, 안트라닐기, 및 페난트레닐기로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
R 이, PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe 및 A-PEG-N₃ (A 는 글리콜산 유닛 중의 아세틸기, 즉, 아노머 수산기와, Mor 또는 PEG 중의 아미노기 사이에 놓인 부분을 나타낸다) 으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-P-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N₃ 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N₃ 의 혼합물인, 방법.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가, ([N₃-PEG(3)]₂-SG)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR, ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR, 또는 ([N₃-PEG(3)]-MSG1)-OR 과 ([N₃-PEG(3)]-MSG2)-OR 의 혼합물인, 방법.
제 11 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
당사슬 도너 분자가, 이하의 식 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 식에 의해 나타내는 화합물인, 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
Fc 함유 분자가, 면역 글로불린, CLCH 또는 Fc 함유 단편인, 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 가, Fc 함유 분자의 당사슬에 작용할 수 있는, 가수분해 활성이 잔류하고 있어도 되는 효소인, 방법,
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
효소-A 가, Endo-S, Endo-S2, Endo-Si, Endo-Se, Endo-Sd, 또는 Endo-Sz 의 변이 효소이고, 당해 변이 효소는 그 대응하는 야생형 효소보다 낮은 가수분해 활성을 갖는, 방법.
제 21 항에 있어서,
효소-A 가, Endo-S D233Q, Endo-S D233Q/Q303L, Endo-S D233Q/E350A, Endo-S D233Q/E350Q, Endo-S D233Q/E350D, Endo-S D233Q/E350N, Endo-S D233Q/D405A, Endo-Si D241Q, Endo-Si D241Q/Q311L, Endo-Si D241Q/E360Q, Endo-Si D241M, Endo-Si D241M/Q311L, Endo-Si D241M/E360Q, Endo-Si T190Q, Endo-Si T190/D241Q, Endo-Si T190Q/D241M, Endo-S2 D184M, Endo-S2 T138Q, Endo-S2 D184Q/Q250L, Endo-S2 D184M/Q250L, Endo-Se D233M, Endo-Sz D234M, Endo-Sz D234M/Q304L, Endo-Si D241X₁ (X₁ 은, K, R 및 D 이외의 어느 것의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si T190X₂ (X₂ 는, F, H, K, M, Q, R, W 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), Endo-Si Q311X₃ (X₃ 은, F, N, 또는 Y 의 아미노산 잔기를 나타낸다), 또는 Endo-Si E360K 인, 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 1 의 반응계 내 pH 가 6.5 내지 8.0 의 범위인, 방법.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 1 의 반응계 내 최종 억셉터 분자 농도가, 20 mg/mL 이상 100 mg/mL 이하인, 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체의 통과 획분에, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 회수하는, 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 2 에 있어서의 산성 조건이 pH 3.5 내지 4.5 의 범위를 의미하는, 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
크로마토그래피 매체가 입자상, 멤브레인상, 또는 모노리스상인, 방법.
제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, 방법.
제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
당사슬이, 아지드기 (N₃-) 를 갖는 치환기로 화학 수식되어 있는 비환원 말단을 갖고, 당해 방법이, 추가로, 당해 당사슬의 아지드기 (N₃-) 에, 알킨 구조를 갖는 분자를 반응시키는 공정을 포함하는, 방법.
제 29 항에 있어서,
알킨 구조를 갖는 분자가, 화학 요법제, 분자 표적약, 면역 부활화제, 독소, 광감수성 물질, 항균제, 항바이러스제, 진단용 약제, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산 분자, 핵산, 항원, 비타민 및 호르몬에서 선택되는, 방법.
제 30 항에 있어서,
화학 요법제가, 캄토테신, 피롤로벤조디아제핀, 독소루비신, 오리스타틴, 탁산 및 이들의 유도체에서 선택되는, 방법.
제 30 항에 있어서,
면역 부활화제가, STING 아고니스트, TLR 아고니스트 및 A2AR 안타고니스트에서 선택되는, 방법.
제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
알킨 구조를 갖는 분자가, (A) ∼ (E) 로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법 ;
(A) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드,
(B) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드,
(C) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드,
(D) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드, 그리고,
(E) (비스(N,N-디에틸에탄아미늄)N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ⁵,10λ⁵-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-푸린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된, Fc 함유 분자.
N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법으로서, 상기 Fc 함유 분자와 1 개 이상의 불순물을 포함하는 용액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 불순물을 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키는 공정, 또는 상기 Fc 함유 분자를 선택적으로 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 트랩시키는 공정을 포함하는, 상기 방법.
제 35 항에 있어서,
N297 결합 당사슬이, 복합형 당사슬을 포함하는, 방법.
제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
N297 결합 당사슬이, 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 가 아니고, 및 상기 1 개 이상의 불순물이, N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 것 이외에는 상기 Fc 함유 분자와 동일한 분자를 포함하는, 방법.
제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, 방법.
이하의 공정 1 및 2 를 포함하는, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자의 단리 방법 :
[공정 1] N297 결합 당사슬로서 푸코오스가 부가되어 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 Fc 함유 분자인 억셉터 분자와, 당사슬을 포함하는 당사슬 도너 분자를, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제 (효소-A) 의 존재하에서 반응시켜 반응 혼합액을 얻는 공정,
[공정 2] 상기 반응 혼합액을, 산성 조건하에서 양이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 멀티 모드 크로마토그래피 매체에 접촉시켜, 당사슬 도너 분자에서 유래하는 당사슬을 포함하는 N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자를 단리하는 공정.
제 39 항에 있어서,
크로마토그래피 매체가 양이온 교환 크로마토그래피 매체인, 방법.
N297 결합 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자가, 항 HER2 항체, 항 HER3 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 CDH6 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 ENPP3 항체, 항 CD47 항체, 항 EGFR 항체, 항 GPR20 항체, 및 항 DR5 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 항체에서 유래하는, 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 방법 또는 Fc 함유 분자.
이하의 식 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 식에 의해 나타내는 화합물.
효소-A 와 효소-B 의 융합 단백으로서,
효소-A 는, Fc 함유 분자의 N297 결합 당사슬을 기질로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제이며,
효소-B 는, 당사슬의 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 GlcNAc 를 갖는 당사슬 함유 분자의 당사슬을 기질로 하지만, 상기 N297 결합 당사슬을 기질로 하지 않거나, 또는, 상기 N297 결합 당사슬에 대한 반응성이 낮은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제인, 융합 단백.