[go: up one dir, main page]

TW202346322A - 含Ｆｃ分子之製造方法 - Google Patents

含Ｆｃ分子之製造方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202346322A
TW202346322A TW112107386A TW112107386A TW202346322A TW 202346322 A TW202346322 A TW 202346322A TW 112107386 A TW112107386 A TW 112107386A TW 112107386 A TW112107386 A TW 112107386A TW 202346322 A TW202346322 A TW 202346322A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
endo
sugar chain
enzyme
molecule
antibody
Prior art date
Application number
TW112107386A
Other languages
English (en)
Inventor
武藤洋史
岩本充廣
荒川史織
酒井雄大
奈良佳織
田中芳文
中谷侑紀
Original Assignee
日商第一三共股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商第一三共股份有限公司 filed Critical 日商第一三共股份有限公司
Publication of TW202346322A publication Critical patent/TW202346322A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明之課題為：確立盡可能地以少的糖鏈予體(donor)分子用量來製造高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子的方法等，該方法可與殘留水解活性或酵素種類無關地從廣泛的選項自由地選擇所要使用之酵素。 本發明之解決手段為：提供具有所期待的N297鍵結糖鏈之含Fc分子的新穎製造方法等，該方法的特徵為組合本說明書中詳述之步驟1及2。

Description

含Fc分子之製造方法
本發明有關於：一種具有包含源自糖鏈予體(donor)分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子的製造方法；該製造方法中所適合使用的新穎糖鏈予體分子；及具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子的單離方法等。
抗體係具有與位於重鏈分子中的Fc區之第297位的Asn側鏈鍵結之N連結型糖鏈(N297鍵結糖鏈)的醣蛋白分子。抗體係基礎研究和醫療領域中重要的分子，尤其是作為抗體醫藥之研究開發正蓬勃發展，糖鏈之各式各樣的影響正逐漸被揭曉(非專利文獻1)。現在所主要使用的醫療用抗體為IgG類別的分子，此種抗體一般係使用CHO細胞和NS0細胞所代表的動物培養細胞而產生。此等動物細胞所產生的抗體之N297鍵結糖鏈為雙觸角(biantennary)複合型糖鏈，但於核心岩藻糖(core fucose)、末端的唾液酸基(sialyl)、半乳糖苷基，還有於二等分(bisecting) GlcNAc並不均勻(非專利文獻2)。已清楚明白抗體之N297鍵結糖鏈係大幅影響包含ADCC活性(抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity))和CDC活性(補體依賴性細胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity))的效應活性(effector activity)(非專利文獻3、非專利文獻4)，且被指摘對血中半衰期亦造成影響之可能性(非專利文獻5)。又，已清楚明白N297鍵結糖鏈的非還原末端經2,6-唾液酸基化之抗體為IVIG(靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin))中的主要藥效成分(非專利文獻6)。進而，近年已開發以經化學修飾之糖鏈作為連接子(linker)的抗體藥物複合體和肽-Fc複合體(專利文獻1～4、非專利文獻7～9)。
就使附加在醫療用抗體或包含抗體Fc區的醣蛋白分子之糖鏈均勻的方法而言，已知使用酵素之糖鏈轉移反應(非專利文獻10～12)。於糖鏈轉移反應，已知使用單獨的ENGase而將還原末端經唑啉化之糖鏈轉移至GlcNAc (N-乙醯葡萄糖胺)接受體(acceptor)的方法(專利文獻5～6、非專利文獻10～11)、及使用2種類的ENGase而將糖鏈直接轉移至GlcNAc接受體的一鍋法(one-pot method)(非專利文獻12、專利文獻1)。
迄今，已廣泛使用前者之利用唑啉體(還原末端經活化之糖鏈予體分子)的糖鏈轉移反應。然而，已知將在水溶液中不安定的唑啉體使用於糖鏈予體分子之情形，因其不安定性而為非酵素媒介型化學反應之對抗體Lys的糖化反應(Glycation)會進行(非專利文獻7、9)。作為解決此的一種方法，而提案一鍋法，其係利用還原末端未經活化之糖鏈予體分子的方法。然而，為了取得高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子，係認為需要大量的糖鏈予體分子用量，需要100當量至300當量(專利文獻1、非專利文獻12)。又，就此一鍋法中所使用的ENGase而言，已知Endo-S變異酵素、與Endo-M變異酵素或是Endo-CC變異株之2種類的酵素之組合，但亦已確認若削減糖鏈予體分子用量，則糖鏈轉移率變低。
將具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子用於醫療用途之情形，為了壓低其製造成本而期望減少為昂貴原料之糖鏈予體分子的用量。於使用內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶而使含Fc分子之糖鏈均勻的方法中，為了改善糖鏈轉移反應的效率，以更少的糖鏈予體分子用量來得到高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子，可考慮探索水解活性經抑制之糖鏈轉移酵素的研究方法。在另一方面，於一鍋法中，已選擇水解活性經抑制之變異酵素之情形，要以同樣的研究方法來減少糖鏈予體分子的用量，則門檻非常高。又，內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶在成為來源之每個物種中具有不同的受質特異性，有因應目的來區別使用之必要，因此同研究方法之情形，會因應水解活性的抑制程度而可使用的酵素之組合被限定。所以，期望一種與殘留水解活性或酵素種類無關地從廣泛的選項自由地選擇內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶，並且以更少的糖鏈予體分子用量而得到高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子的方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開2018/003983號 [專利文獻2]國際公開2018/090045號 [專利文獻3]國際公開2019/065964號 [專利文獻4]國際公開2020/050406號 [專利文獻5]國際公開2017/124084號 [專利文獻6]國際公開2018/039373號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Arnold JN, et al., Annu Rev Immunol. 2007, 25, 21-50 [非專利文獻2]Jefferis R, Biotechnol Prog. 2005, 21, 11-16 [非專利文獻3]Nimmerjahn F, et al., Nat Rev Immunol. 2008, 8, 34-47 [非專利文獻4]Jefferis R, Nat Rev Drug Discov. 2009, 8, 226-234 [非專利文獻5]Bumbaca D, et al., AAPS J. 2012, 14, 554-558 [非專利文獻6]Anthony RM, et al., Science. 2008, 320, 373-376 [非專利文獻7]Parsons TB, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016, 55, 2361-2367 [非專利文獻8]Iwamoto M, et al., Bioconjugate Chem. 2018, 29, 2829-2837 [非專利文獻9]Manabe S, et al., Bioconjugate Chem. 2019, 30, 1343-1355 [非專利文獻10]Wang LX, Trends Glycosci Glycotechnol. 2011, 23, 33-52 [非專利文獻11]Huang W, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 12308-12318 [非專利文獻12]Iwamoto M, et al., PLoS ONE 2018, 13, e0193534
[發明欲解決之課題]
本發明之目的為：確立盡可能地以少的糖鏈予體分子用量來製造高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子的方法，該方法可與殘留水解活性或酵素種類無關地從廣泛的選項自由地選擇所要使用之酵素；提供可適合使用於該方法中的新穎糖鏈予體分子；及確立選擇性地單離此種含Fc分子的方法等。 [用以解決課題之手段]
發明人等為了解決上述課題而專心致力反覆研究的結果，發現：可與糖鏈轉移反應中使用的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(於一鍋法中，為2個以上的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之組合)無關地設定即便以少的糖鏈予體分子用量亦可得到具有中程度以上之糖鏈轉移率的含Fc分子之反應條件；及藉由在酸性條件下使糖鏈轉移反應混合液與陽離子交換層析介質或多模(multimode)層析介質接觸，而可將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子與未反應的含Fc分子(接受體分子)單離，結果可產率良好地回收高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子。活用此見解而發現盡可能地以少的糖鏈予體分子用量而取得高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子的製造法；又發現若為此製造法，則可於一鍋法中從廣泛的選項選擇內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之組合，以及適於使用彼等之中的特定之組合的酵素之糖鏈轉移反應的新穎糖鏈予體分子；進而發現上述在酸性條件下之使用陽離子交換層析介質或多模層析介質的單離步驟不僅可適用於含Fc分子之製造法，亦可適用於僅單離所期待的含Fc分子；以至完成本發明。
本發明提供以下發明。 [1] 一種含Fc分子的製造方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2： [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子回收的步驟。 [2] 如[1]所記載之方法，其中糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc。 [3] 如[2]所記載之方法，其中步驟1係使接受體分子與糖鏈予體分子在酵素-A及以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟。 [4] 如[3]所記載之方法，其中以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)，係因在酵素-A存在下作用於糖鏈予體分子，而具有促進由酵素-A所致之源自糖鏈予體分子之糖鏈往接受體分子的糖鏈轉移反應之性質的酵素。 [5] 如[3]或[4]所記載之方法，其中酵素-B為具有從SGP往GlcNAc衍生物之糖鏈轉移活性的酵素。 [6] 如[3]～[5]中任一項所記載之方法，其中酵素-B為Endo-M、Endo-Om、Endo-CC、或Endo-Rp之變異酵素，且該變異酵素具有較其對應之野生型酵素低的水解活性。 [7] 如[3]～[6]中任一項所記載之方法，其中酵素-B選自由Endo-Rp N172Q、Endo-Rp N172H、Endo-Rp N172A、Endo-Rp N172C、Endo-Rp N172D、Endo-Rp N172E、Endo-Rp N172G、Endo-Rp N172I、Endo-Rp N172L、Endo-Rp N172M、Endo-Rp N172P、Endo-Rp N172S、Endo-Rp N172T、Endo-Rp N172V、Endo-Rp W278F/S216V、Endo-Rp W278F/N246D、Endo-Rp W278F/D276N、Endo-Rp W278F/A310D、Endo-Rp W278F/N172D/F307Y、Endo-Rp W278F/N172D/F307H、Endo-Rp W278F/N172D/A310D、Endo-Rp W214F/F307Y/L306I、Endo-M N175Q、Endo-M N175Q/Y217F、Endo-CC N180H及Endo-Om N194Q所組成之群組。 [8] 如[3]～[7]中任一項所記載之方法，其中酵素-A與酵素-B經融合。 [9] 如[1]～[8]中任一項所記載之方法，其中於步驟1中對於接受體分子1當量而使用2當量至40當量之糖鏈予體分子。 [10] 如[1]～[9]中任一項所記載之方法，其中於步驟1中，糖鏈轉移率超過80%。 [11] 如[1]～[10]中任一項所記載之方法，其中糖鏈予體分子所具有的糖鏈為非還原末端可經化學修飾之N-連結型糖鏈或O-連結型糖鏈。 [12] 如[11]所記載之方法，其中糖鏈予體分子為非還原末端可經化學修飾之SGP、AG(9)-P、AG(7)-P、SG-Asn、AG(9)-Asn、AG(7)-Asn、SG-OR、AG(9)-OR、AG(7)-OR、(MSG1)-Asn、(MSG2)-Asn、(MSG1)-Asn與(MSG2)-Asn的混合物、MSG1-OR、MSG2-OR、或MSG1-OR與MSG2-OR的混合物，且式中R為透過至少一個碳原子而與氧原子連結的任意之取代基。 [13] 如[12]所記載之方法，其中R表示C1～C6烷基或可經取代之芳基。 [14] 如[13]所記載之方法，其中R選自由甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、及正己基所組成之群組、或選自由可經C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、或鹵基取代之苯基、苄基、茚基、萘基、茀基、蒽基(anthranyl)、及菲基(phenanthrenyl)所組成之群組。 [15] 如[12]～[14]中任一項所記載之方法，其中R選自由PMP、Me、A-Mor、iPr、nPr、PrOMe及A-PEG-N 3(A表示乙醇酸單元中之乙醯基，即變旋異構羥基與Mor或PEG中之胺基所夾住的部分)所組成之群組。 [16] 如[11]或[12]所記載之方法，其中糖鏈予體分子為([N 3-PEG(3)] 2-SG)-P-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3的混合物。 [17] 如[12]～[15]中任一項所記載之方法，其中糖鏈予體分子為([N 3-PEG(3)] 2-SG)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR的混合物。 [18] 如[11]～[17]中任一項所記載之方法，其中糖鏈予體分子為以選自由以下之式所組成的群組之式所表示的化合物
。 [19] 如[1]～[18]中任一項所記載之方法，其中含Fc分子為免疫球蛋白、CLCH或含Fc片段。 [20] 如[1]～[19]中任一項所記載之方法，其中以N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)，為可作用於含Fc分子的糖鏈之可殘留有水解活性的酵素。 [21] 如[1]～[20]中任一項所記載之方法，其中酵素-A為Endo-S、Endo-S2、Endo-Si、Endo-Se、Endo-Sd、或Endo-Sz之變異酵素，且該變異酵素具有較其對應之野生型酵素低的水解活性。 [22] 如[21]所記載之方法，其中酵素-A為Endo-S D233Q、Endo-S D233Q/Q303L、Endo-S D233Q/E350A、Endo-S D233Q/E350Q、Endo-S D233Q/E350D、Endo-S D233Q/E350N、Endo-S D233Q/D405A、Endo-Si D241Q、Endo-Si D241Q/Q311L、Endo-Si D241Q/E360Q、Endo-Si D241M、Endo-Si D241M/Q311L、Endo-Si D241M/E360Q、Endo-Si T190Q、Endo-Si T190/D241Q、Endo-Si T190Q/D241M、Endo-S2 D184M、Endo-S2 T138Q、Endo-S2 D184Q/Q250L、Endo-S2 D184M/Q250L、Endo-Se D233M、Endo-Sz D234M、Endo-Sz D234M/Q304L、Endo-Si D241X 1(X 1表示K、R及D以外的任一個之胺基酸殘基)、Endo-Si T190X 2(X 2表示F、H、K、M、Q、R、W或Y之胺基酸殘基)、Endo-Si Q311X 3(X 3表示F、N、或Y之胺基酸殘基)、或Endo-Si E360K。 [23] 如[1]～[22]中任一項所記載之方法，其中步驟1之反應系內pH為6.5至8.0之範圍。 [24] 如[1]～[23]中任一項所記載之方法，其中步驟1之反應系內最終接受體分子濃度為20mg/mL以上100mg/mL以下。 [25] 如[1]～[24]中任一項所記載之方法，其中於陽離子交換層析介質或多模層析介質的通過流分(flow-through fraction)中，回收具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子。 [26] 如[1]～[25]中任一項所記載之方法，其中步驟2中的酸性條件意指pH3.5至4.5之範圍。 [27] 如[1]～[26]中任一項所記載之方法，其中層析介質為粒子狀、膜狀、或蜂巢狀(monolithic)。 [28] 如[1]～[27]中任一項所記載之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。 [29] 如[1]～[28]中任一項所記載之方法，其中糖鏈具有經具有疊氮基(N 3-)之取代基所化學修飾的非還原末端，且該方法進一步包含使具有炔結構之分子與該糖鏈之疊氮基(N 3-)進行反應的步驟。 [30] 如[29]所記載之方法，其中具有炔結構之分子選自化學治療劑、分子標靶藥物、免疫增強劑(immunopotentiator)、毒素、光敏感物質、抗菌劑、抗病毒劑、診斷用藥劑、蛋白質、肽、胺基酸、核酸分子、核酸、抗原、維生素、及荷爾蒙。 [31] 如[30]所記載之方法，其中化學治療劑選自喜樹鹼、吡咯并苯并二氮呯、艾黴素(doxorubicin)、阿瑞他汀(auristatin)、紫杉烷及此等之衍生物。 [32] 如[30]所記載之方法，其中免疫增強劑選自STING促效劑、TLR促效劑、及A2AR拮抗劑。 [33] 如[29]～[32]中任一項所記載之方法，其中具有炔結構之分子選自由(A)～(E)所組成之群組： (A) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (B) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺； (C) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (D) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺；以及 (E) (雙(N,N-二乙基乙銨)　N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aR,16R)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧-2,10-二硫-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ 5,10λ 5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四炔-7-基]-6-側氧-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺。 [34] 一種含Fc分子，其係藉由如[1]～[33]中任一項所記載之方法所製造。 [35] 一種具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子之單離方法，前述方法包含：使包含前述含Fc分子與1個以上之雜質的溶液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，使雜質選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉的步驟；或使前述含Fc分子選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉的步驟。 [36] 如[35]所記載之方法，其中N297鍵結糖鏈包含複合型糖鏈。 [37] 如[35]或[36]所記載之方法，其中N297鍵結糖鏈並非可有岩藻糖附加之核心GlcNAc，而且前述1個以上之雜質包含除了具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈以外係與前述含Fc分子相同的分子。 [38] 如[35]～[37]中任一項所記載之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。 [39] 一種含Fc分子的單離方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2： [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子單離的步驟。 [40] 如[39]所記載之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。 [41] 如[1]～[40]中任一項所記載之方法或含Fc分子，其中具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子，係源自選自由抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗CDH6抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整聯蛋白(Integrin)抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C(Tenascin-C)抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗ENPP3抗體、抗CD47抗體、抗EGFR抗體、抗GPR20抗體、及抗DR5抗體所組成之群組的抗體。 [42] 一種以選自由以下之式所組成的群組之式所表示的化合物：
。 [43] 一種融合蛋白，其係酵素-A與酵素-B之融合蛋白，其中 酵素-A係以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶， 酵素-B係以具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子之糖鏈為受質，但不以前述N297鍵結糖鏈為受質或對前述N297鍵結糖鏈之反應性低的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶。 [發明之效果]
本發明中之製造方法，係藉由在酸性條件下的陽離子交換層析，而可將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子與未反應的含Fc分子(接受體分子)分離，所以能夠盡可能地以少的糖鏈予體分子用量來製造高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子。又，尤其是將本發明中之製造方法適用於一鍋法之情形，可在上述之單離步驟中提高所期待的含Fc分子之純度，所以變得無需極度提高糖鏈轉移反應本身的效率，結果能夠從廣泛的選項自由地選擇對於含Fc分子之N297鍵結糖鏈顯示糖鏈轉移活性的酵素-A、與顯示活化糖鏈予體分子的糖鏈之性質的酵素-B。亦即，能夠從所謂酵素的生產性及物性之視點，自由地設定適於大量製造程序的酵素。 又，將本發明之製造方法適用於一鍋法之情形，能夠從化學上還原末端未經活化之N-連結型糖鏈、或O-連結型糖鏈之中自由地選擇作為糖鏈予體分子。亦即，有別於設定化學上還原末端經活化之唑啉體作為糖鏈予體分子之情形，能夠設定在中性附近之水溶液中不會自然分解，且與含Fc分子中的Lys不直接形成化學鍵結之具有化學上安定結構的糖鏈予體分子。 由於上述，而能夠削減用以效率良好地取得具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子的糖鏈予體分子之需要量，且致使經糖鏈重塑之含Fc分子的製造成本減少。
又，本發明之一態樣，係提供一種新穎糖鏈予體分子，其適於一鍋法中的糖鏈轉移反應、尤其是使用特定內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之組合的糖鏈轉移反應，再者，本發明之另一態樣，係提供一種新穎單離方法，其包含從雜質單離所期待的含Fc分子。
[用以實施發明的形態]
於以下，詳細地說明本發明。 於本說明書中，分子中所包含之胺基酸的標記法係依照本領域之慣例，於顯示變異位置之情形，係藉由野生型胺基酸的一字母標記與其編號(例如，若為第241位之Asp則為「D241」)表示。又，關於變異，則藉由野生型胺基酸的一字母標記、其編號及變異後之胺基酸的一字母標記(例如，第241位之Asp被取代為Gln的變異為「D241Q」)表示。又，具有變異之特定變異體，係藉由分子名與變異(例如，Endo-Si之第241位Asp被取代為Gln的變異體為「Endo-Si D241Q」)表示，具有複數個變異之情形，係表示為將變異之間以「/」區隔的形式(例如，於Endo-Si D241 Q中，具有第311位之Gln被取代為Leu的追加變異之變異體為「Endo-Si D241Q/Q311L」)。
於本發明之一態樣中，提供一種含Fc分子的製造方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2。 [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子回收的步驟。
＜N297鍵結糖鏈＞ 於本發明中，所謂「N297鍵結糖鏈」，意指與IgG重鏈之第297位的Asn之側鏈鍵結之狀態的N連結型糖鏈，又，即使以任意之手法變更IgG重鏈之N連結型糖鏈的附加位置之情形，只要N連結型糖鏈會受到酵素-A的作用，則亦視其包含在N297鍵結糖鏈中。例如，於本發明之一態樣中，將IgG重鏈片段化之情形，於包含該Asn之肽片段中與對應之Asn鍵結之狀態的糖鏈，亦包含在N297鍵結糖鏈中。通常，動物等所產生的IgG中的N297鍵結糖鏈，係具有包含下述式(I)或(II)之結構的基本結構，其非還原末端可進一步經化學修飾，例如可有Gal或唾液酸附加。
細胞所產生的IgG之N297鍵結糖鏈，大多具有糖鏈結構的多樣性，即包含於此基本結構中，於其還原末端的GlcNAc(核心GlcNAc)、非還原末端、支鏈糖等進一步有糖鏈鍵結者。N297鍵結糖鏈亦可具有具核心岩藻糖的結構((Fucα1,6)GlcNAc)，此結構係岩藻糖(Fuc)以α1,6鍵結於核心GlcNAc之6位而成。於支鏈糖之Man中，亦有形成進一步有包含GlcNAc之糖鏈鍵結於其5位而成的3分支型糖鏈之情形。於非還原末端的GlcNAc中，亦有進一步有包含半乳糖(Gal)或唾液酸(Sia)的糖鏈鍵結之情形。
＜糖鏈予體分子＞ 於本發明中，所謂「糖鏈予體分子」(亦稱為「糖鏈給予體」)，意指對接受體分子給予糖鏈的分子。
使用於目的為開發藥物的糖鏈重塑之情形，較佳為採用在適用於人類之際問題少的具有人類型糖鏈、或人類相容型糖鏈的糖鏈予體分子。此種糖鏈係已知在人類體內不顯示抗原性之糖鏈，N-連結型糖鏈係已知有高甘露糖型、混成(hybrid)型、複合(complex)型等。此等3個中有共通的基本結構。高甘露糖型，係具有在由靠近還原末端之位置的甘露糖(β甘露糖)所分支的2個支鏈(1-3鏈、1-6鏈)有複數個甘露糖連續而成的富含甘露糖之結構的糖鏈。所謂混成型，係由靠近還原末端之位置的甘露糖(β甘露糖)所分支的2個支鏈(1-3鏈、1-6鏈)之中有一方成為具有GlcNAc之結構者。所謂複合型，係成為在由靠近還原末端之位置的甘露糖(β甘露糖)所分支的2個支鏈(1-3鏈、1-6鏈)具有GlcNAc之結構者，且為具有包含有無半乳糖、有無唾液酸、還有此等之鍵聯異構或位置異構的多種結構者。就複合型糖鏈而言，已知2分支型、3分支型或4分支型者。
於以下，顯示高甘露糖型、混成型及複合型的結構之例。此外，以虛線四角形表示此等之共通的基本結構(於虛線四角形內，係混合存在有包含與不包含被導入至β甘露糖之4位的GlcNAc(二等分GlcNAc)之結構，但於本說明書中，任一者皆指共通的基本結構)。
於本發明中，糖鏈予體分子中的糖鏈部分可為高甘露糖型糖鏈、混成型糖鏈及複合型糖鏈之任一者，但較佳為高甘露糖型糖鏈或複合型糖鏈，特佳為複合型糖鏈。所以，於本發明之一態樣中，糖鏈予體分子包含複合型糖鏈。又，於本發明中，複合型糖鏈可為2分支型、3分支型或4分支型之任一者，但較佳為本發明之糖鏈予體分子包含2分支型的複合型糖鏈。
於本發明之一態樣中，本發明中之糖鏈予體分子為具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子、或具有糖鏈的還原末端經活化之GlcNAc(例如，經唑啉化之GlcNAc)的含糖鏈分子。於本說明書中，所謂以化學性手法所合成之糖鏈予體分子之還原末端的活化，係指糖鏈予體分子的還原末端之變旋異構物位的反應性被化學性地提高之狀態，在典型上係指該變旋異構物位經唑啉化或鹵化之狀態。即，指能夠單獨以經活化之糖鏈予體分子而單離純化之狀態。 另一方面，因酵素-B作用於含包含還原末端未經活化之GlcNAc的糖鏈的糖鏈予體分子，而使該糖鏈予體分子成為酵素-A可於所期待的糖鏈轉移反應利用之狀態的活化，係指糖鏈予體分子的還原末端之變旋異構物位的反應性被酵素學性地提高之狀態。即，意指生成活化中間體，係指單獨以經活化之糖鏈予體分子則不能夠單離純化之狀態。
於本發明之一態樣中，糖鏈予體分子為具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子，較佳可舉出SGP、(SG-)Asn、(MSG1-)Asn、(MSG2-)Asn或是(MSG1-)Asn、(MSG2-)Asn的混合物。此等之糖鏈部分包含唾液酸聚醣(Sialyl Glycan，以下，稱為「SG」)，其為N-連結型糖鏈的代表，且包含由以下之結構式及序列式所示之結構。亦可將還原末端側糖鏈的鍵結樣式由N-連結型變更為O-連結型。此外，於本說明書中，只要無特別之記載，於胺基酸之側鏈上與糖鏈連結之情形的部分結構，係以括弧表示側鏈部分，如上所述，例如係以「(SG-)Asn」的方式標記者。又，於本說明書中，將僅在SG的β-Man之支鏈的任意一方有非還原末端的唾液酸缺失的糖鏈結構稱為MSG，分別將僅於支鏈的1-3糖鏈具有唾液酸者標記為MSG1，將僅於支鏈的1-6糖鏈具有唾液酸者標記為MSG2。
(式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
作為可在本發明中使用的糖鏈予體分子中的糖鏈部分之具體例，可例示：將SG進行神經胺糖酸苷酶處理，使2個非還原末端之NeuAc缺失而成的AG(9)(以下之結構式及序列式之AG(9))；將AG(9)進行半乳糖苷酶處理，使2個非還原末端之Gal缺失而成的AG(7)(以下結構式及序列式之AG(7))等。
(式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
(式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
於本發明中，糖鏈予體分子可經化學修飾，例如非還原末端可經化學修飾。
作為可在本發明中使用的非還原末端可經化學修飾之糖鏈予體分子中的糖鏈部分之例，可舉出野生型唾液酸上的部位藉由任意之取代基而被化學修飾的衍生物(SG型)。
(式中，X表示β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩方之非還原末端的唾液酸上所導入的取代基，為可適用有機合成化學領域中周知之各式各樣的方法而合成之取代基，以應用於抗體-藥物複合物(antibody-drug conjugate)合成的結合法中所使用之取代基作為參考(Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215)，而可舉出例如乙炔基、疊氮基(N 3-)、二苄基環辛烯(DBCO)基、雙環[6.1.0]壬-4-烯(BCN)基、包含1,2,4,5-四環的結構、醛基、SH基、甲磺醯基三唑基等，較佳可舉出具有乙炔基、疊氮基(N 3-)之取代基，進一步較佳可舉出具有疊氮基(N 3-)之取代基，但不限定於此等。又，就「具有疊氮基(N 3-)之取代基」而言，例如，具有N 3之聚乙二醇連接子，亦即連接子結構所包含的聚乙二醇單元(-CH 2-CH 2-O-)之個數的上限為約20個以下，較佳為約11個以下，更佳為約7個以下，就「具有疊氮基(N 3-)之取代基」而言，可舉出例如具有N 3之聚乙二醇連接子(例如，35-疊氮-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧雜三十五烷-1-胺基、32-疊氮-3,6,9,12,15,18,21,24,27, 30-十氧雜三十二烷-1-胺基、29-疊氮-3,6,9,12,15, 18,21,24,27-九氧雜二十九烷-1-胺基、26-疊氮-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十六烷-1-胺基、23-疊氮-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷-1-胺基、20-疊氮-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十烷-1-胺基、17-疊氮-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-胺基、14-疊氮-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-胺基、11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺基、2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]乙基胺基、2-(疊氮乙氧基)乙基胺基、2-疊氮乙基胺基、2-[2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]-N-[2-[2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙基]乙胺基等直鏈狀之取代基、或1,3-雙[2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]乙氧基]丙烷-2-胺基、3-[2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]乙氧基]-2-[2-[2-(2-疊氮乙氧基)乙氧基]乙氧基甲基]丙烷-1-胺基等分支之取代基等)，但不限定於此等。式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
此處所示X-SG型之結構之中，作為非還原末端可經化學修飾之糖鏈予體分子中的糖鏈部分之例，亦可舉出為β-Man之支鏈的1-6鏈側的化學修飾唾液酸缺損之結構的X-MSG1型、為1-3鏈側的化學修飾唾液酸缺損之結構的X-MSG2型。
再者，可經化學修飾之部位也可為唾液酸以外，以下可舉出AG(9)型之衍生物、AG(7)型之衍生物。
(式中，X表示β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩方之非還原末端的半乳糖上所導入的取代基，具體而言，表示與於上述所規定者相同之意義。式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
(式中，X表示β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩方之非還原末端的GlcNAc上所導入的取代基，具體而言，表示與於上述所規定者相同之意義。式中，「-(N/O)」表示與N原子或O原子進行醣苷鍵結。)
作為予體分子中的糖鏈部分之例，亦可舉出此處所示X-AG(9)型之結構之中，β-Man之支鏈的1-6鏈側的化學修飾半乳糖缺損之結構、1-3鏈側的化學修飾半乳糖缺損之結構；或者X-AG(7)型之結構之中，β-Man之支鏈的1-6鏈側的化學修飾GlcNAc缺損之結構、1-3鏈側的化學修飾GlcNAc缺損之結構。
本發明之糖鏈予體分子，較佳可舉出非還原末端可經化學修飾之SGP、AG(9)-P、AG(7)-P、SG-Asn、AG(9)-Asn、AG(7)-Asn、SG-OR、AG(9)-OR、AG(7)-OR、(MSG1)-Asn、(MSG2)-Asn、(MSG1)-Asn與(MSG2)-Asn的混合物、MSG1-OR、MSG2-OR、或MSG1-OR與MSG2-OR的混合物；或可舉出具有圖2所示結構之糖鏈予體分子。此外，以上之結構式中，「P」表示源自SGP之肽部分，圖2中之「X」表示與於上述所規定者相同之意義。就本發明之糖鏈予體分子而言，作為包含N-連結型糖鏈者，進一步較佳可舉出([N 3-PEG(3)] 2-SG)-P-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3的混合物；作為包含O-連結型糖鏈者，進一步較佳可舉出([N 3-PEG(3)] 2-SG)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR的混合物。再者，於本發明之一態樣中，作為糖鏈予體分子，較佳可舉出於＜新穎糖鏈予體分子＞之章節中所具體揭示的新穎糖鏈予體分子。本發明之糖鏈予體分子，較佳為因應使用之酵素-A與酵素-B之組合等的諸條件而適宜選擇。
上述之化學式中，「R」表示透過至少一個碳原子而與氧原子連結的任意之取代基，較佳為表示C1～C6烷基或可經取代之芳基。所謂「C1～C6烷基」，意指碳數1～6之直鏈或支鏈的烷基，可舉出例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、正己基等，但不限定於此等。又，就「芳基」而言，可舉出例如苯基、苄基、茚基、萘基、茀基、蒽基、菲基等，但不限定於此等。就芳基的取代基而言，可舉出C1～C6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、異丙氧基等)、C1～C6烷基(例如甲基、乙基等)、鹵基，但不限定於此等。就經取代之芳基而言，可舉出對甲氧基苯基、對甲基苯基等，但不限定於此等。於本發明之一態樣中，「R」選自由PMP、Me、A-Mor、iPr、nPr、PrOMe及A-PEG-N 3(A表示乙醇酸單元中之乙醯基，即變旋異構羥基與Mor或PEG中之胺基所夾住的部分)所組成之群組。
於本發明之一態樣中，糖鏈予體分子包含高甘露糖型糖鏈。就此種糖鏈予體分子而言，可舉出具有以下之結構的Man9-GlcNAc 2-Asn(「M9-Asn」)、或者具有從M9-Asn有1個、2個、或3個甘露糖缺損之結構的Man8-GlcNAc 2-Asn(「M8-Asn」)、Man7-GlcNAc 2-Asn(「M7-Asn」)、Man6-GlcNAc 2-Asn(「M6-Asn」)，但並不限定於此等。
於本發明之一態樣中，糖鏈予體分子為具有糖鏈的還原末端經活化之GlcNAc的含糖鏈分子，較佳為具有經唑啉化之GlcNAc的含糖鏈分子。就此種糖鏈予體分子而言，可使用多種糖鏈結構的分子。就此種糖鏈予體分子之例而言，可舉出SG-Ox(「Ox」表示唑啉)、MSG1-Ox、MSG2-Ox或是MSG1-Ox與MSG2-Ox的混合物，但不限定於此等。
具有糖鏈的還原末端經活化之GlcNAc的含糖鏈分子，亦與具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子同樣，可經化學修飾，例如非還原末端可經化學修飾。就非還原末端的化學修飾而言，可舉出與針對具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子所提及者同樣之修飾，可舉出例如([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Ox、[N 3-PEG(3)]-MSG1-Ox、[N 3-PEG(3)]-MSG2-Ox、或[N 3-PEG(3)]-MSG1-Ox與[N 3-PEG(3)]-MSG2-Ox的混合物，但不限定於此等。
糖鏈予體分子係適宜地購入市售品，或者可藉由利用或應用已知的方法來製作，例如可藉由利用或應用實施例7或參考例23-1所示方法來製作。
＜含Fc分子＞ 於本發明中，所謂「含Fc分子」(有時亦稱為「含Fc區分子」)，係表示含有Fc區的分子，可例示例如抗體(免疫球蛋白)、Fc-融合蛋白質、Fc片段等(或含Fc片段)。就本發明中之抗體(免疫球蛋白)而言，可為IgG、IgA、IgM、IgE及IgD之任一者，又可為單株抗體或多株抗體之任一者，再者，可為源自天然者或經合成者，但較佳可舉出IgG、尤其是IgG型的單株抗體。就抗體以外之含Fc片段而言，可舉出CLCH，例如，IgG(尤其是IgG型的單株抗體)之Fc片段或僅由恆定區構成的CLCH(專利文獻1)、包含Fc片段的雙特異性(bispecific)抗體(Expert Opin Ther Pat. 2018 28, 251-276)等，但不限定於此等。
＜所謂接受體分子＞ 於本發明中，所謂「接受體分子」，意指從糖鏈予體分子收取糖鏈的分子。作為接受體分子，典型者為源自單株抗體且具有僅由可有核心Fuc鍵結之核心GlcNAc構成的N297鍵結糖鏈之IgG或其Fc片段。此外，於本說明書中，所謂「核心Fuc」(或「核心岩藻糖」)，係設為意指與上述核心GlnNAc鍵結之岩藻糖者。於核心GlcNAc，係因應其來源之抗體或其產生方法而可有核心Fuc鍵結，亦可未鍵結。所以，於本發明之一態樣中，接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子(例如，抗體或含其Fc之片段)，較佳可舉出具有由GlcNAc或是(Fucα1,6)GlcNAc構成的N297鍵結糖鏈之含Fc分子(例如，抗體或含其Fc之片段)。就接受體分子的來源而言，可利用各式各樣的單株抗體或含糖鏈分子或是含Fc區分子(例如，Fc、組合從重鏈使可變區缺失而成的僅由恆定區構成的CH與僅由輕鏈的恆定區構成的CL之CLCH等)。本發明之接受體分子，較佳可舉出(Fucα1,6)-GlcNAc-IgG(例如，圖4之(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1)、(Fucα1,6)-GlcNAc-Fc、(Fucα1,6)-GlcNAc-CLCH、GlcNAc-mAb4等(專利文獻1)。
於發明之一態樣中，具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子可設為源自抗體，就抗體而言，可舉出例如抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗CDH6抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整聯蛋白抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素抗體、抗ENPP3抗體、抗CD47抗體、抗EGFR抗體、抗GPR20抗體或抗DR5抗體，但不限定於此等。作為本發明之抗體，較佳為抗HER2抗體(例如，曲妥珠單抗或帕妥珠單抗)、抗CDH6抗體、抗CD33抗體、抗EphA2抗體、抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體，更佳為抗HER2抗體、抗CDH6抗體、抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體。
上述抗體可藉由使用此領域中通常實施之方法，將成為抗原之多肽對動物進行免疫，並採集、純化活體內所產生的抗體來得到。抗原的來源並不限定於人類，亦可將源自小鼠、大鼠等人類以外之動物的抗原對動物進行免疫。於此情形，藉由對所取得之會與異種抗原結合的抗體和人類抗原之交叉性進行試驗，而可選出能夠適用於人類之疾病的抗體。
又，亦可依照周知方法(例如，Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497、Kennett, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980))，藉由使產生對抗原之抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，得到單株抗體。
此外，抗原可藉由將編碼抗原蛋白質的基因利用基因操作來使宿主細胞產生而得到。於本發明中，「宿主細胞」可適宜選擇動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母等通常用於產生蛋白質的細胞等。
上述抗體可為人源化抗體(humanized antibody)，可依照周知方法(例如，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)、Nature (1986) 321, p.522-525、WO90/07861)而取得。
例如，抗HER2抗體(US5821337、WO2004/008099、WO2020/050406等)、抗CD33抗體(WO2014/057687、WO2020/050406等)、抗EphA2抗體(WO2009/028639、WO2020/050406等)、抗CDH6抗體(WO2018/212136、WO2020/050406等)、抗CD70抗體(WO2004/073656、WO2007/038637、WO2021/177438等)、抗TROP2抗體(WO2015/098099、WO2021/177438等)、抗EGFR抗體(WO1998/050433、WO2002/092771、WO2021/177438等)，可藉由周知手段而取得。
以下，詳細說明抗體，但已知抗體之恆定區有複數個同種異型(allotype)，例如關於IgG1重鏈，可舉出G1m17、G1m3、G1m1、G1m2。就本發明中所使用的抗體之恆定區而言，並不特別限定，但較佳為使用G1m17或G1m3。又，使用IgG1作為本發明之抗體的同型(isotype)之情形，能夠藉由將恆定區之胺基酸殘基的一部分進行取代，而調整效應功能，就一態樣而言，可增強或是減弱抗體依賴性細胞毒殺活性、增強或是減弱抗體依賴性細胞媒介吞噬作用、或增強或是減弱補體依賴性細胞毒殺活性增強或是減弱，就變異體之一態樣而言，可舉出：野生型人類IgG1之恆定區的胺基酸序列之中藉由EU索引(EU index)(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.63, No.1 (May 15,1969), pp.78-85)所特定的234位之白胺酸及235位之白胺酸分別被取代為丙胺酸及丙胺酸者；或藉由EU索引所特定的234位之白胺酸、235位之白胺酸及329位之脯胺酸分別被取代為丙胺酸、丙胺酸、及丙胺酸者。又，針對本發明中所使用的抗體，可設為於重鏈之一方或兩方的羧基末端有1個或2個胺基酸缺失者。
上述抗HER2抗體並無特別限制，但期望為例如具有以下特性者。 (1)一種抗HER2抗體，其特徵為具有以下特性； (a)會與HER2特異性地結合。 (b)具有藉由與HER2結合而內化(internalization)至HER2表現細胞中之活性。 (2)如上述(1)所記載之抗體，其會與HER2的細胞外結構域結合。 (3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)如上述(1)～(3)的任一個所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體或人源化單株抗體。 (6)如上述(1)～(3)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且包含導致ADCC及ADCP活性減少之變異。 (7)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為包含由序列識別號50所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號49所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (8)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且由EU索引所表示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (9)如上述(8)所記載之抗體，其為包含由序列識別號51所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號49所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (10)如上述(1)～(4)所記載之抗體，其為包含由序列識別號53所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號52所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (11)如上述(8)所記載之抗體，其為包含由序列識別號54所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號52所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (12)如上述(1)～(3)、(6)或(8)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號57所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號58所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號59所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號60所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號61所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號62所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (13)如上述(1)～(12)的任一個所記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (14)一種抗體，其係藉由包含下述步驟之該抗體的製造方法而得：培養藉由表現載體所轉形之宿主細胞的步驟，該表現載體含有編碼如上述(1)～(13)的任一個所記載之抗體的多核苷酸；及自該步驟中所得之培養物採集目標抗體的步驟。
本發明之抗體-免疫增強劑複合物的製造中使用的抗CD70抗體並無特別限制，但期望為例如具有以下特性者。 (1)一種抗CD70抗體，其會與CD70特異性地結合。 (2)如上述(1)所記載之抗體，其會與CD70的細胞外結構域結合。 (3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)如上述(1)～(3)的任一個所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、或人源化單株抗體。 (6)如上述(1)～(3)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且包含導致ADCC及ADCP活性減少之變異。 (7)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且由EU索引所表示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (8)如上述(7)所記載之抗體，其為包含由序列識別號2所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號1所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (9)如上述(7)所記載之抗體，其為包含由序列識別號4所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號3所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (10)如上述(1)～(3)、(6)或(7)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號13所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號14所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號15所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號16所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號17所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號18所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (11)如上述(1)～(3)、(6)或(7)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號19所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號20所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號21所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號22所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號23所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號24所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (12)如上述(1)～(11)的任一個所記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (13)一種抗體，其係藉由包含下述步驟之該抗體的製造方法而得：培養藉由表現載體所轉形之宿主細胞的步驟，該表現載體含有編碼如上述(1)～(12)的任一個所記載之抗體的多核苷酸；及自該步驟中所得之培養物採集目標抗體的步驟。
本發明之抗體-免疫增強劑複合物的製造中使用的抗TROP2抗體並無特別限制，但期望為例如具有以下特性者。 (1)一種抗TROP2抗體，其會與TROP2特異性地結合。 (2)如上述(1)所記載之抗體，其會與TROP2的細胞外結構域結合。 (3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)如上述(1)～(3)的任一個所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、或人源化單株抗體。 (6)如上述(1)～(3)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且包含導致ADCC及ADCP活性減少之變異。 (7)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為包含由序列識別號6所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號5所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (8)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且由EU索引所表示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (9)如上述(8)所記載之抗體，其為包含由序列識別號8所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號7所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (10)如上述(1)～(3)、(6)或(8)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號25所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號26所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號27所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號28所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號29所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號30所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (11)如上述(1)～(3)、(6)或(8)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號31所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號32所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號33所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號34所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號35所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號36所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (12)如上述(1)～(11)的任一個所記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (13)一種抗體，其係藉由包含下述步驟之該抗體的製造方法而得：培養藉由表現載體所轉形之宿主細胞的步驟，該表現載體含有編碼如上述(1)～(12)的任一個所記載之抗體的多核苷酸；及自該步驟中所得之培養物採集目標抗體的步驟。
本發明之抗體-免疫增強劑複合物的製造中使用的抗EGFR抗體並無特別限制，但期望為例如具有以下特性者。 (1)一種抗EGFR抗體，其會與EGFR特異性地結合。 (2)如上述(1)所記載之抗體，其會與EGFR的細胞外結構域結合。 (3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)如上述(1)～(3)的任一個所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、或人源化單株抗體。 (6)如上述(1)～(3)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且包含導致ADCC及ADCP活性減少之變異。 (7)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且由EU索引所表示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (8)如上述(7)所記載之抗體，其為包含由序列識別號10所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號9所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (9)如上述(7)所記載之抗體，其為包含由序列識別號12所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號11所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (10)如上述(1)～(3)、(6)或(7)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號37所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號38所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號39所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號40所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號41所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號42所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (11)如上述(1)～(3)、(6)或(7)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號43所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號44所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號45所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號46所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號47所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號48所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (12)如上述(1)～(11)的任一個所記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (13)一種抗體，其係藉由包含下述步驟之該抗體的製造方法而得：培養藉由表現載體所轉形之宿主細胞的步驟，該表現載體含有編碼如上述(1)～(12)的任一個所記載之抗體的多核苷酸；及自該步驟中所得之培養物採集目標抗體的步驟。
本發明之抗體-免疫增強劑複合物的製造中使用的抗CDH6抗體並無特別限制，但期望為例如具有以下特性者。 (1)一種抗CDH6抗體，其會與CDH6特異性地結合。 (2)如上述(1)所記載之抗體，其會與CDH6的細胞外結構域結合。 (3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)如上述(1)～(3)的任一個所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)如上述(1)～(4)的任一個所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、或人源化單株抗體。 (6)如上述(1)～(3)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且包含導致ADCC及ADCP活性減少之變異。 (7)如上述(6)所記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，且由EU索引所表示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (8)如上述(7)所記載之抗體，其為包含由序列識別號56所記載之胺基酸序列構成的重鏈及由序列識別號55所記載之胺基酸序列構成的輕鏈而成之人源化單株抗體。 (9)如上述(1)～(3)、(6)或(7)所記載之抗體，其為包含以下輕鏈以及重鏈而成之人源化單株抗體：包含由序列識別號63所記載之胺基酸序列構成的CDRL1、由序列識別號64所記載之胺基酸序列構成的CDRL2、及由序列識別號65所記載之胺基酸序列構成的CDRL3之輕鏈；包含由序列識別號66所記載之胺基酸序列構成的CDRH1、由序列識別號67所記載之胺基酸序列構成的CDRH2、及由序列識別號68所記載之胺基酸序列構成的CDRH3之重鏈。 (10)如上述(1)～(9)的任一個所記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (11)一種抗體，其係藉由包含下述步驟之該抗體的製造方法而得：培養藉由表現載體所轉形之宿主細胞的步驟，該表現載體含有編碼如上述(1)～(10)的任一個所記載之抗體的多核苷酸；及自該步驟中所得之培養物採集目標抗體的步驟。
接受體分子係適宜地購入市售品，或者可藉由利用或應用已知的方法來製作，例如可藉由利用或應用實施例1中所提及之方法來製作。接受體分子在典型上，可藉由將作為糖鏈改造(亦稱為糖鏈重塑)之對象的含Fc分子(在典型上為IgG型的單株抗體或該抗體之Fc片段或僅由恆定區構成的CLCH等含Fc分子)之N297鍵結糖鏈，以保持著特異性地水解N297鍵結糖鏈的核心幾丁二糖(core chitobiose)結構中之GlcNAc間的1,4-醣苷鍵(GlcNAcβ1-4GlcNAc)之活性的ENGase進行處理而製備。此情形，就ENGase而言，可利用以Endo-Si WT、Endo-A、Endo-D、Endo-E、Endo-F3、Endo-H、Endo-S、Endo-S2、Endo-Si為首的各式各樣者。所以，於本發明之一態樣中，接受體分子可藉由使與步驟1中所使用之酵素-A(具有將糖鏈予體分子中的糖鏈轉移至接受體分子之活性的酵素)相同或不同的酵素和作為原料的含Fc分子(作為糖鏈改造之對象的含Fc分子，在典型上為具有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈、不均勻的N297鍵結糖鏈、或源自宿主細胞之不均勻的N297鍵結糖鏈之含Fc分子)反應等之類的手法，而在與步驟1中之糖鏈轉移反應為獨立之步驟中準備。又，作為步驟1中可利用之酵素-A的特徵，有「可殘留有水解活性」。所以，亦可藉由酵素-A作用於具有源自宿主細胞之不均勻的糖鏈之含Fc分子，來代替以此等之ENGase於事前進行處理，而以原位(in situ)製備接受體分子。所以，於本發明之一態樣中，接受體分子係藉由使酵素-A作用於作為原料的含Fc分子(作為糖鏈改造之對象的含Fc分子，在典型上為具有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈、不均勻的N297鍵結糖鏈、或源自宿主細胞之不均勻的N297鍵結糖鏈之含Fc分子)，而以原位及/或一鍋製備。又，糖鏈改造(糖鏈重塑)所使用的IgG或含Fc分子，較佳只要為源自包含相同胺基酸序列的IgG重鏈，且以具有N297鍵結糖鏈之形式所產生者即可。其產生方法並不被限定，可利用藉由通常所知的單株抗體之生產方法所產生的IgG、IgG之CLCH、或將其進行酵素處理所得之Fc片段等。又，此種IgG或Fc片段亦可採用以不同生產方法或不同批所得之試樣的混合物。
＜內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶＞ 所謂「內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶」，係亦作為ENGase：Endo-β-N-acetylglucosaminidase而為人所知之醣水解酵素，負責糖鏈結構中之幾丁二糖結構的切斷、及鍵結生成。又，依其來源而名稱不同。於本說明書中，係將以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶稱為「酵素-A」，將以糖鏈予體分子之糖鏈、例如不具有岩藻糖之糖鏈原料(例如，SGP)的糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶稱為「酵素-B」。以下，針對本發明中之酵素-A及酵素-B進行說明。
＜酵素-A＞ 「酵素-A」意指以含Fc分子(例如，抗體)之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶。酵素-A一般包含與含Fc分子親和性高的結構域、與糖鏈親和性高的結構域、及糖鏈轉移反應觸媒結構域，在典型上為以含Fc分子(例如，抗體)的N297鍵結糖鏈為受質而兼具水解活性與糖鏈轉移活性者，但於本發明中重要的是將糖鏈予體分子中的糖鏈(尤其是以化學的手法、或酵素學的手法而經活化之糖鏈)轉移至接受體分子之活性，因此關於水解活性，其亦可減弱或消失。反倒是保持著強的水解活性之酵素，有亦將藉由糖鏈轉移活性而被轉移至接受體分子的核心GlcNAc之糖鏈作為受質進行水解之可能性，所以本發明中之酵素-A的水解活性較佳為相對地減少。此外，如上所述，酵素-A殘留有水解活性之情形，可享受所謂可不另行製備步驟1中之接受體分子而在步驟1中之相同反應槽內以原位製備的優點。所以，於本發明之一態樣中，酵素-A為具有可作用於含Fc分子的糖鏈之活性(尤其是以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的糖鏈轉移活性)者，又，於本發明之另一態樣中，酵素-A為具有可作用於含Fc分子的糖鏈之活性，而且殘留有水解活性或水解活性消失者。
酵素-A的水解活性意指特異性地水解糖鏈之共通的基本結構中之核心幾丁二糖所包含的β1,4醣苷鍵之活性，尤其是意指特異性地水解含Fc分子之N297鍵結糖鏈之共通的基本結構中之核心幾丁二糖所包含的β1,4醣苷鍵之活性。於圖5、圖6顯示酵素-A的水解活性之反應示意圖。
酵素-A的糖鏈轉移活性意指使上述糖鏈予體分子(具有還原末端經活化之GlcNAc、或是還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子)的還原末端，與包含於N297僅具有核心GlcNAc(有核心岩藻糖附加或未附加皆可)之Fc部位的接受體分子進行醣苷鍵結之活性。於圖1顯示糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc之情形的酵素-A的糖鏈轉移活性之反應示意圖。
就本發明中之酵素-A而言，可舉出例如Endo-S(源自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)之酵素)(參照Collin M and Olsen A., EMBO J. 2001, 20, 3046-3055、及Goodfellow JJ, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 8030-8033)、EndoS2或是EndoS49(參照Sjogren J, et al., Biochem J. 2013, 455, 107-118、及Shivatare SS, et al., Chem Commun (Camb). 2018, 54, 6161-6164)、Endo-F3(源自腦膜炎黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)之酵素)(參照Huang W, et al., Chembiochem. 2011, 12, 932-941、及Giddens JP, et al., J Biol Chem. 2016, 291, 9356-9370)、或此等之變異酵素。又，就本發明中之酵素-A而言，可舉出源自魚型鏈球菌(Streptococcus iniae)(參照Pier GB and Madin SH., Int J Syst Bacteriol. 1976 26, 545-553)的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(以下，稱為「Endo-Si」，於圖9顯示其胺基酸序列(序列識別號71))、或其變異酵素。再者，就本發明中之酵素-A而言，可舉出由鏈球菌(Storeptococcus)屬的基因體資訊特定出其序列之酵素(參照Vincent P. Richard, et al., Genome Biol. Evol. 2014, 6, 741-753)、或其變異酵素。
本發明之酵素-A，若為具有上述特性者，則不限定於實施例中所使用的具體之酵素，可為從天然所分離之酵素、或基於本發明之酵素的序列資訊而經人為地製作或改造之酵素。從天然分離之情形，作為其分離源的物種並不特別限定，但較佳為細菌。
Endo-Si之活性結構域及碳水化合物結合模組(Carbohydrate-binding module (CBM))，係從與已進行晶體結構分析之EndoS (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No.18, pp6714-6719)的序列比較而推測其分別為序列識別號71之胺基酸編號106～447及胺基酸編號762～897的區域，此2處被認為是對水解活性及/或轉移活性、與抗體之交互作用而言重要的部位。所以，作為本發明之酵素-A，可舉出：包含序列識別號71之胺基酸編號106～447及/或胺基酸編號762～897所記載之胺基酸序列、較佳為包含序列識別號71之胺基酸編號106～897所記載之胺基酸序列、更佳為包含序列識別號71之胺基酸編號106～928所記載之胺基酸序列、進一步較佳為包含序列識別號71之胺基酸編號34～928所記載之胺基酸序列，而且顯示糖鏈轉移活性的多肽。
如上所述，內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶通常兼具水解活性與糖鏈轉移活性，但保持著強的水解活性之酵素亦有將藉由糖鏈轉移活性被轉移至接受體分子(具有核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈之抗體或是含其Fc區之分子)的核心GlcNAc之糖鏈作為受質進行水解，而無法適當地取得所期望之糖鏈轉移體之情形。所以，於糖鏈重塑抗體或是糖鏈修飾化合物之合成中，在與糖鏈轉移活性之比較中使水解活性相對地降低而成的變異酵素為有用的。所以，於本發明之一態樣中，酵素-A為Endo-S、EndoS-2、Endo-Si、Endo-Sd、Endo-Se、或Endo-Sz之變異酵素，且為具有較其對應之野生型酵素低的水解活性之變異酵素，較佳為將圖7～圖9中以粗字所表示的胺基酸殘基適宜取代而成的變異酵素，特佳可舉出Endo-S D233Q、Endo-S D233Q/Q303L、Endo-S D233Q/E350A、Endo-S D233Q/E350Q、Endo-S D233Q/E350D、Endo-S D233Q/E350N、Endo-S D233Q/D405A、Endo-Si D241Q、Endo-Si D241Q/Q311L、Endo-Si D241Q/E360Q、Endo-Si D241M、Endo-Si D241M/Q311L、Endo-Si D241M/E360Q、Endo-Si T190Q、Endo-Si T190/D241Q、Endo-Si T190Q/D241M、Endo-Si D241X 1(X 1表示K、R及D以外的任一個之胺基酸殘基，具體而言，表示A、N、C、Q、E、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、或V，較佳為表示A、Q、E、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y、或V)、Endo-Si T190X 2(X 2表示F、H、K、M、Q、R、W或Y之胺基酸殘基)、Endo-Si Q311X 3(X 3表示F、N、或Y之胺基酸殘基)、Endo-Si E360K、Endo-S2 D184M、E ndo-S2 T138Q、Endo-S2 D184Q、Endo-S2 D184Q/Q250L、Endo-S2 D184Q/E289Q、Endo-S2 D184M/Q250L、Endo-S2 D184M/E289Q、Endo-S2 D182Q、Endo-S2 D226Q、Endo-S2 T227Q、Endo-S2 T228Q、Endo-Sd D232Q、Endo-Sd D232M、Endo-Sd D232Q/Q302L、Endo-Sd D232M/Q302L、Endo-Se D233Q、Endo-Se D233M、Endo-Se D233Q/Q303L、Endo-Se D233M/Q303L、Endo-Sz D234Q、Endo-Sz D234M、Endo-Sz D234Q/Q304L、或Endo-Sz D234M/Q304L，但不限定於此等。又，酵素-A除了在上述所提及之特定變異以外，亦可施加進一步之變異，例如，亦可參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而在不影響本酵素活性之範圍內有1～數個胺基酸殘基取代、缺失、插入、及/或附加。又，就酵素-A之胺基酸序列而言，可舉出參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而相對於特定變異胺基酸殘基以外之胺基酸殘基具有至少80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進一步較佳為95%、96%、97%、98%或是99%以上之同源性或是同一性的胺基酸序列。
此外，於本發明中，所謂「數個」，意指30個或是20個以下的整數，較佳為意指10個以下的整數，進一步較佳為意指5個以下的整數，最佳為意指4個、3個、2個或1個。
＜酵素-B＞ 「酵素-B」係意指以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶，尤其是以糖鏈予體分子之糖鏈為受質但不以N297鍵結糖鏈為受質(換言之，對N297鍵結糖鏈之反應性低，較佳為反應性極低)之內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶。作為酵素-B的受質之糖鏈予體分子上的糖鏈部分，可為高甘露糖型糖鏈、混成型糖鏈及複合型糖鏈之任一者，但較佳為高甘露糖型糖鏈或複合型糖鏈，特佳為複合型糖鏈。所以，於本發明之一態樣中，作為酵素-B的受質之糖鏈予體分子上的糖鏈部分，係高甘露糖型糖鏈或複合型糖鏈，較佳為複合型糖鏈。又，於本發明中，複合型糖鏈可為2分支型、3分支型或4分支型之任一者，但較佳為：作為酵素-B的受質之糖鏈予體分子上的糖鏈部分係2分支型的複合型糖鏈。於本發明之一態樣中，酵素-B係以不具有岩藻糖之糖鏈原料(SGP等醣肽或醣蛋白)為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶，較佳為以包含不具有岩藻糖之2分支型的複合型糖鏈之糖鏈原料為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶。
就本發明之酵素-B而言，較佳為：因在酵素-A存在下作用於含包含還原末端未經活化之GlcNAc的糖鏈的糖鏈予體分子，而生成該還原末端成為可於糖鏈轉移反應利用之狀態的活化中間體，結果具有促進由酵素-A所致之源自糖鏈予體分子之糖鏈往接受體分子的糖鏈轉移反應之性質的酵素。此處，由於酵素-B本身的糖鏈轉移活性被認為與活化糖鏈予體分子之能力有關聯，而於本發明之一態樣中，酵素-B可從以包含還原末端未經活化之GlcNAc的糖鏈予體分子(例如，SGP)的糖鏈為受質，但不以N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之中，將往具有GlcNAc的接受體(例如1-甲基乙基-2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷、2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷等GlnNAc衍生物)之糖鏈轉移活性作為指標來選擇。所以，於本發明之一態樣中，酵素-B為具有從SGP往GlcNAc衍生物之糖鏈轉移活性的酵素。
由酵素-B所致之糖鏈予體分子的活化作用，係如圖1所示，作用於包含還原末端未經活化之GlcNAc的糖鏈予體分子，生成該還原末端成為可於糖鏈轉移反應利用之狀態的活化中間體，但由酵素-B所致之水解活性高的情形，活化中間體並不透過酵素-A而與接受體分子反應，而是與存在於反應系之H 2O分子反應，有生成許多游離糖鏈之虞。所以，本發明中之酵素-B較佳為：於與糖鏈活化作用之比較中，具有相對地減少之水解活性者。
就本發明之酵素-B而言，可舉出例如Endo-M(源自凍土毛黴(Mucor hiemalis)之酵素)(參照Yamamoto K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994, 203, 244-252、及Umekawa M, et al., J. Biol Chem. 2021, 285, 511-521)、Endo-CC(源自灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)之酵素)(參照Eshima Y, et al., PLoS One. 2015, 10, e0132859)、Endo-Om(源自微小歐加鐵酵母(Ogataea minuta)之酵素)(參照Murakami S, et al., Glycobiology. 2013, 23, 736-744)、Endo-Rp(源自小假根毛黴(Rhizomucor pusillus)之酵素)(WO2018101454)、或彼等之變異酵素(較佳為與野生型比較而使水解活性降低而成的變異酵素)。於本發明之一態樣中，酵素-B為Endo-M、Endo-Om、Endo-CC、或Endo-Rp之變異酵素，且為具有較其對應之野生型酵素低的水解活性之變異酵素，較佳為將圖10～圖13中以粗字所表示的胺基酸殘基適宜取代而成的變異酵素，特佳可舉出選自由Endo-Rp N172Q、Endo-Rp N172H、Endo-Rp N172A、Endo-Rp N172C、Endo-Rp N172D、Endo-Rp N172E、Endo-Rp N172G、Endo-Rp N172I、Endo-Rp N172L、Endo-Rp N172M、Endo-Rp N172P、Endo-Rp N172S、Endo-Rp N172T、Endo-Rp N172V、Endo-Rp W278F/S216V、Endo-Rp W278F/N246D、Endo-Rp W278F/D276N、Endo-Rp W278F/A310D、Endo-Rp W278F/N172D/F307Y、Endo-Rp W278F/N172D/F307H、Endo-Rp W278F/N172D/ A310D、Endo-Rp W214F/F307Y/L306I、Endo-M N175Q、Endo-M N175Q/Y217F、Endo-CC N180H及Endo-Om N194Q所組成之群組的酵素，但不限定於此等。又，酵素-B除了在上述所提及之特定變異以外，亦可施加進一步之變異，例如亦可參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而在不影響本酵素活性之範圍內有1～數個胺基酸殘基取代、缺失、插入、及/或附加。又，就酵素-B之胺基酸序列而言，可舉出參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而相對於特定變異胺基酸殘基以外之胺基酸殘基具有至少為80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進一步較佳為95%、96%、97%、98%或是99%以上之同源性或是同一性的胺基酸序列。
於本發明之製造方法的典型的實施態樣中，酵素-A與酵素-B係在步驟1分別作為不同的分子而添加，但酵素-A與酵素-B只要分別會履行所期望之職責，則亦可於直接或間接地結合之狀態下添加在反應系中。所以，於本發明之一態樣中，酵素-A與酵素-B係以直接或間接地化學性地結合之狀態而添加在反應系中，例如兩分子亦能以下述狀態添加在反應系中：經固定化於任意之固相擔體(solid support)的固定化酵素；或藉由任意之胺基酸、PEG等聚合物、寡聚物連接子等鍵結而成的融合蛋白質。換言之，於本發明之一態樣中，酵素-A與酵素-B係直接或間接地化學性地結合(=酵素-A與酵素-B經融合)，例如可作為下述而添加在反應系中：經固定化於任意之固相擔體的固定化酵素；或藉由任意之胺基酸、PEG等聚合物、寡聚物連接子等、較佳為胺基酸連接子鍵結而成的融合蛋白質。此外，於本發明中，即使酵素-A、酵素-B並非沒有缺失的全長分子而為功能片段，只要該功能片段具有所期望之功能，則該片段亦視為酵素-A、酵素-B之一態樣。因此，本發明中之酵素-A與酵素-B亦包含例如「酵素-A」與「酵素-B」、「具有酵素-A的功能之酵素片段」與「具有酵素-B的功能之酵素片段」、「酵素-A」與「具有酵素-B的功能之酵素片段」、及「具有酵素-A的功能之酵素片段」與「酵素-B」直接或間接地化學結合的狀態。就「具有酵素-A的功能之酵素片段」而言，可舉出具有下述胺基酸序列之片段：為從上述之酵素-A、或Endo-BI1 (GenBank登錄號：ACJ53522.1)、Endo-BI2 (GenBank登錄號：BAJ71450.1)、Endo-BT-3987 (GenBank登錄號：AAO79092.1)、Endo-E (GenBank登錄號：AAR20477.1)、Endo-F (GenBank登錄號：AAA24922.1)、Endo-F2 (GenBank登錄號：AAA24923.1)、Endo-F3 (GenBank登錄號：AAA24924.1)、Endo-CoM (GenBank登錄號：XP006673222.1)、Endo-SB (GenBank登錄號：BBB35949.1)的全長序列經片段化為特定之功能序列的胺基酸序列，且可施加特定變異的胺基酸序列。又，就「具有酵素-B的功能之酵素片段」而言，可舉出具有下述胺基酸序列之片段：為上述之酵素-B的觸媒活性結構域、或從Endo-A (GenBank登錄號：AAD10851.1)、Endo-CE (GenBank登錄號：BAB84821.1)、Endo-Tsp1006 (GenBank登錄號：CCY37287.1)、Endo-Tsp1263 (GenBank登錄號：CDD88945.1)、Endo-Tsp1457 (GenBank登錄號：CDD89351.1)、Endo-BB (GenBank登錄號：AAN25135.1)、Endo-BH (GenBank登錄號：BAB04504.1)、Endo-BN (GenBank登錄號：WP_007484749.1)、Endo-CC1 (GenBank登錄號：XP_001839402.1)、Endo-CC2 (GenBank登錄號：XP_002911817.1)、Endo-D (GenBank登錄號：AAK74656.1)、Endo-Pm (GenBank登錄號：ADK97032.1)的全長序列經片段化為特定之功能序列的胺基酸序列，且可施加特定變異的胺基酸序列。例如，關於酵素-A、酵素-B、各個功能序列，亦可參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而在不影響上述功能之範圍內有1～數個胺基酸殘基取代、缺失、插入、及/或附加，又，就各個胺基酸序列而言，可舉出參考專利文獻(國際公開2022/050300號)等，而相對於會影響活性的特定胺基酸殘基以外之胺基酸殘基具有至少80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進一步較佳為95%、96%、97%、98%或是99%以上之同源性或是同一性的胺基酸序列。
就酵素-A與酵素-B之組合而言，若為會履行各自之職責的酵素-A與酵素-B，則可使用任意之組合。例如，可使用下表所記載之酵素-A與酵素-B的任意之組合。
[表1]
   酵素-A    酵素-B
A-1 Endo-Si D241M Q311L B-1 Endo-Rp N172H
A-2 Endo-Si D241Q B-2 Endo-Rp N172Q
A-3 Endo-Si D241Q E360Q B-3 Endo-Rp N172V
A-4 Endo-Si D241M B-4 Endo-M N175Q
A-5 Endo-Si D241Q Q311L B-5 Endo-M N175Q Y217F
A-6 Endo-Si D241M E360Q      
A-7 Endo-Si WT      
A-8 Endo-S D233Q E350Q      
A-9 Endo-S WT      
A-10 Endo-S2 D184M      
A-11 Endo-S2 T138Q      
A-12 Endo-S2 WT      
   酵素-A    酵素-A
A-13 Endo-Si T190F A-26 Endo-Si D241L
A-14 Endo-Si T190H A-27 Endo-Si D241P
A-15 Endo-Si T190K A-28 Endo-Si D241R
A-16 Endo-Si T190M A-29 Endo-Si D241S
A-17 Endo-Si T190Q A-30 Endo-Si D241T
A-18 Endo-Si T190R A-31 Endo-Si D241V
A-19 Endo-Si T190W A-32 Endo-Si D241W
A-20 Endo-Si T190Y A-33 Endo-Si D241Y
A-21 Endo-Si D241A A-34 Endo-Si Q311F
A-22 Endo-Si D241E A-35 Endo-Si Q311K
A-23 Endo-Si D241F A-36 Endo-Si Q311N
A-24 Endo-Si D241H A-37 Endo-Si Q311Y
A-25 Endo-Si D241I A-38 Endo-Si E360K
   酵素-A
A-39 Endo-S2 D184M/Q250L
A-40 Endo-S2 D184Q/Q250L
A-41 Endo-Sd WT
A-42 Endo-Se WT
A-43 Endo-Se D233M
A-44 Endo-Sz WT
A-45 Endo-Sz D234M
A-46 Endo-Sz D234M/Q304L
又，如上所述，酵素-A與酵素-B經融合之情形，就該酵素-A與酵素-B而言，只要會履行各自之職責，則可使用任意之組合。更具體而言，例如酵素-A為Endo-Si變異體而酵素-B為Endo-Rp變異體，例如酵素-A為Endo-Si D241M/Q311L或Endo-Si D241Q/ Q311L，而酵素-B為Endo-Rp N172H或Endo-Rp N172V。就再另外的具體態樣而言，融合酵素為Endo-Rp N172H與Endo-Si D241M/Q311L之融合蛋白質、Endo-Rp N172V與Endo-Si D241Q/Q311L之融合蛋白質、或Endo-Si D241Q/Q311L與Endo-Rp N172V，可舉出例如下表所記載之[酵素-A]-[酵素-B]融合蛋白酵素、[酵素-B]-[酵素-A]融合蛋白酵素。
[表2]
   [酵素-A]-[酵素-B]融合蛋白酵素、或[酵素-B]-[酵素-A]融合蛋白酵素
BA-1 [Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L]
BA-2 [Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L]
酵素-A與酵素-B之融合蛋白質，可參考非專利文獻(Joaquim, et al., Processes. 2022, 10, 494.)等，而依照慣用方法來製造，例如可藉由使酵素-A與酵素-B透過物理性、或化學性交互作用來結合在任意之固相擔體而製造。或者，可參考非專利文獻(F Grueninger-Leitch, et al., Protein Sci. 1996, 12, 2617-22、及Emily MK, et al., Protein Eng Des Sel. 2005, 10, 497-501)、及專利文獻(WO2017137459)等，而藉由基因操作使宿主細胞產生融合蛋白質。即，可使編碼酵素-A與酵素-B的基因結合之後，藉由基因操作而使宿主細胞產生具有源自酵素-A與酵素-B的功能之單一酵素。如此地藉由基因操作而使宿主細胞生產融合酵素之情形，沒有個別準備酵素-A與酵素-B之必要，可減少應準備之酵素的數量，所以可削減酵素的製造成本以及勞力。使酵素-A與酵素-B透過由胺基酸構成的連接子鍵結之情形，連接子係於一態樣中，可使用由一或複數個胺基酸所構成，且參考非專利文獻(Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369.)等而具有該技術領域中已知之典型的性質者，可為柔軟或剛硬的連接子、能夠切斷或不能夠切斷之性質的連接子，能夠使用長的或短的連接子。於一態樣中，連接子就胺基酸序列片段而言可包含(SGGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n、(G)n、(EAAAK)n、(EF)n、或(GGS)n或是此等之組合(n為1～30的整數，較佳為1～20的整數，進一步較佳為1～10的整數，更佳為1～6的整數)。又，於連接子，可包含聚組胺酸標籤、HA標籤、FLAG標籤、CBD標籤、Fc標籤、GST標籤等作為純化標籤所常用的胺基酸序列。於一態樣中，純化標籤為聚組胺酸標籤、HA標籤、FLAG標籤、Fc標籤、GST標籤，較佳為聚組胺酸標籤、HA標籤、FLAG標籤、CBD標籤，進一步較佳為聚組胺酸標籤、FLAG標籤，更佳為聚組胺酸標籤。
＜步驟1＞ 於本發明之製造方法中，步驟1係使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，其中該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子。於本發明之一態樣中，步驟1係使接受體分子與糖鏈予體分子在酵素-A及以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟。就該步驟1之反應條件而言，可根據使用還原末端經活化之GlcNAc(經唑啉化之GlcNAc等)或是未經活化之GlcNAc作為糖鏈予體分子之已知的糖鏈轉移反應之反應條件，或藉由利用或應用已知的糖鏈轉移反應之反應條件來適宜選擇(例如，專利文獻3)。
步驟1之反應較佳為在緩衝液中進行，期望在不促進包含還原末端經活化或是未經活化之GlcNAc的糖鏈予體分子的分解之條件下進行。從此觀點來看，於本發明之一態樣中，糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc之情形，步驟之1的反應系內之pH可在5.8～9.5之間適宜選擇，較佳為6.2～8.5，更佳為6.5～8.0，進一步較佳為6.5～7.5之範圍。又，糖鏈予體分子包含還原末端經活化之GlcNAc之情形，步驟之1的反應系內之pH可在5.5～8.0之間適宜選擇，較佳為6.0～7.5，更佳為6.2～7.5，進一步較佳為6.5～7.5之範圍。緩衝液能夠從磷酸緩衝液(pH6.0～7.5)、MOPS-NaOH緩衝液(pH6.5～8.0)、Tris鹽酸緩衝液(pH7.0～9.0)等來適宜選擇，較佳為Tris鹽酸緩衝液(pH7.0～9.0)。以使酵素安定化為目的，亦可於反應液中加入不會阻礙酵素反應的添加劑。
反應溫度可在4℃至50℃之間適宜選擇，但較佳為15℃～45℃，更佳為20℃～40℃，進一步較佳為25℃～40℃。
反應時間可在10分鐘至96小時之間適宜選擇，但較佳為0.5小時～80小時，更佳為2小時～70小時，進一步較佳為4小時～60小時，特佳為6～48小時，最佳為8～30小時。亦可隨著時間經過地採集少量反應液，一邊確認糖鏈轉移反應的進度，一邊判斷反應的結束。一般，糖鏈轉移反應的進度可藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細管電泳、微晶片電泳、全自動電泳系統、或液相層析質譜分析(LC-MS)等進行監測，例如可藉由將糖鏈重塑抗體片段化為重鏈與輕鏈之後，使用全自動電泳系統來確認滯留時間僅在有N297鍵結糖鏈附加的重鏈側變化，而進行監測。
糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc之情形，步驟1可作為將糖鏈予體分子之糖鏈直接轉移至接受體分子的一鍋法來進行，其中該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的抗體或是含其Fc區之分子。於此態樣中，步驟1除了酵素-A以外，亦需要上述之酵素-B。
如實施例8中所詳述，於使用包含還原末端經唑啉化之糖鏈的糖鏈予體分子的糖鏈重塑中，為非Endo酵素媒介型之化學反應的糖化(Glycation)對於接受體分子中的Lys變得容易進行，因此常用將反應液中的抗體濃度設定為低的。所以，於本發明之製造方法中，糖鏈予體分子包含還原末端經活化之GlcNAc之情形，於步驟1較佳為採用比較低的接受體分子濃度。此種實施態樣中之接受體分子濃度，可根據已知的方法來適宜設定，但例如，作為步驟1之反應系內最終接受體分子濃度，可舉出0.6mg/mL～18mg/mL、較佳為1.2mg/mL～16mg/mL、更佳為3mg/mL～14mg/mL、進一步較佳為4.2mg/mL～13.2mg/mL、特佳為6mg/mL～12mg/mL。
另一方面，使用包含還原末端未經活化之GlnNAc的糖鏈予體分子之情形，由於未添加為糖化之原因的化學性地合成之唑啉體溶液，並無顧慮糖化之必要，因此，可採用比較高濃度的接受體分子濃度。反倒是從所謂分子間的接觸頻率升高之觀點來看，添加高濃度的接受體分子係有效。所以，糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc之情形，步驟1中之接受體分子濃度，可根據已知的方法來適宜設定，但例如，就步驟1之反應系內最終接受體分子濃度的上限值而言，可舉出200mg/mL、較佳為160mg/mL、更佳為120mg/mL、進一步較佳為100mg/mL、特佳為80mg/mL，就下限值而言，可舉出10mg/mL、較佳為14mg/mL、更佳為18mg/mL、進一步較佳為20mg/mL，就濃度範圍而言，可舉出上述所提及之上限值及下限值各別的任意之組合、或10mg/mL～200mg/mL、較佳為14mg/mL～160mg/mL、更佳為18mg/mL～120mg/mL、進一步較佳為20mg/mL～100mg/mL、特佳為20mg/mL～80mg/mL，但不限定於此等。
就步驟1中之糖鏈予體分子的添加量而言，可藉由利用或應用已知的方法來適宜設定。尤其，在使用包含還原末端未經活化之GlnNAc的糖鏈予體分子之糖鏈重塑反應，糖鏈予體分子的添加量會對糖鏈轉移率造成影響，因此以往通常使用較大量的糖鏈予體分子(100～300當量，專利文獻1、非專利文獻12)。另一方面，如上所述，本發明中之製造方法，係藉由在酸性條件下的陽離子交換層析，而可將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子與未反應的含Fc分子(接受體分子)分離，所以並無極度提高步驟1之糖鏈轉移反應本身效率之必要，因此，可將糖鏈予體分子的添加量設為較少量。糖鏈予體分子大多昂貴，所以此優點在為了取得高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子而需要大量的糖鏈予體分子用量之一鍋法中尤其為有用的。所以，於本發明之一態樣中，就步驟1中所添加(使用)的糖鏈予體分子之量的下限值而言，相對於接受體分子1當量，而可舉出2當量、3當量、4當量、5當量、6當量、7當量、8當量、9當量、10當量、11當量、12當量、13當量、14當量、15當量、16當量、17當量、18當量、19當量或20當量，就糖鏈予體分子之量的上限值而言，可舉出300當量、200當量、150當量、100當量、90當量、80當量、75當量、70當量、65當量、60當量、55當量、45當量、40當量、35當量、30當量、25當量或20當量，但不限定於此等。又，就步驟1中所添加(使用)的糖鏈予體分子之量的範圍而言，可舉出上述所提及之上限值及下限值各別的任意之組合、或相對於接受體分子1當量而為5～80當量、較佳為7～60當量、更佳為8～50當量、特佳為10～40當量，但不限定於此等。
如上所述，本發明中之製造方法，係藉由在酸性條件下的陽離子交換層析，而可將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子與未反應的含Fc分子(接受體分子)分離，所以並無極度提高步驟1之糖鏈轉移反應本身效率之必要。所以，就步驟1之糖鏈轉移率而言，可設定任意之數值，可設定為例如50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上或95%以上，另一方面，從所謂並無極度提高糖鏈轉移反應本身效率之必要的觀點來看，亦可設定為95%以下、90%以下、85%以下、80%以下、75%以下、70%以下、65%以下或60%以下。於本發明之一態樣中，步驟1之糖鏈轉移率為超過80%者，較佳為超過85%者，特佳為超過90%者。此外，上述「糖鏈轉移率」可依照慣用方法來決定，例如，可使用實施例8中所揭示之全自動電泳系統來決定。此外，糖鏈轉移率之測定的時機因使用之酵素而有所不同，但為1分鐘以上100小時以內，較佳為1小時以上80小時以內，更佳為2小時以上72小時以內。
此外，步驟1中所使用之接受體分子可在與步驟1為獨立之分開的製備方法中製備。所以，於本發明之一態樣中，本發明之方法係於步驟1之前，進一步包含將接受體分子分開製備之步驟。於此態樣中，接受體分子可藉由例如使與步驟1中所使用之酵素-A(具有將糖鏈予體分子中的糖鏈轉移至接受體分子之活性的酵素)相同或不同的酵素和作為原料的含Fc分子(作為糖鏈改造之對象的含Fc分子，在典型上為具有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈、不均勻的N297鍵結糖鏈、或源自宿主細胞之不均勻的N297鍵結糖鏈之含Fc分子)反應等之類的手法，而在與步驟1中之糖鏈轉移反應為獨立之步驟中準備。於本發明之一態樣中，接受體分子可藉由例如將作為糖鏈改造之對象的含Fc分子之N297鍵結糖鏈，以保持著特異性地水解N297鍵結糖鏈的核心幾丁二糖結構中之GlcNAc間的1,4-醣苷鍵(GlcNAcβ1-4GlcNAc)之活性的ENGase進行處理等而製備。
或者，步驟1中使用的酵素-A殘留有水解活性之情形，步驟1中之接受體分子可在與步驟1相同之槽內以原位製備。所以，本發明之步驟1包含以原位製備接受體分子之態樣。此態樣係在步驟1之前，可省略將接受體分子分開製備之步驟，因此可簡化製造步驟。該製造步驟的簡化，由於也無需將該另外的步驟中所使用的ENGase去除之步驟，進一步也變得不需要將該另外的步驟中所產生之較不安定的接受體分子分離・純化之類的處置，而非常有利。又，由於就將作為原料的含Fc分子之N297鍵結糖鏈水解的酵素、與用以轉移糖鏈予體分子中的糖鏈之酵素而言使用相同之酵素-A，而亦可享受所謂可減少所使用之酵素的數量・種類之製造步驟上的優點(這點於使用酵素-A與酵素-B之融合蛋白質之情形，變得更為顯著)。此態樣於步驟1中，在反應系中並非投入為從糖鏈予體分子直接收取糖鏈的分子之接受體分子本身，而是投入作為糖鏈改造之對象的含Fc分子(在典型上為IgG型的單株抗體或該抗體之Fc片段或僅由恆定區構成的CLCH等含Fc分子)。就此種用以作為原料而投入的含Fc分子之N297鍵結糖鏈而言，若為與為標的物之源自糖鏈予體分子之糖鏈不同者，則無特別限制，但在典型上，可舉出源自製造該含Fc分子之際所使用的宿主細胞之N297鍵結糖鏈、不均勻的N297鍵結糖鏈、或源自該宿主細胞之不均勻的N297鍵結糖鏈。若將此種含Fc分子投入步驟1之反應系，則藉由酵素-A的水解活性，而含Fc分子之N297鍵結糖鏈之核心幾丁二糖結構中的GlcNAc間之1,4-醣苷鍵(GlcNAcβ1-4GlcNAc)被特異性地水解，接受體分子以原位生成。接著，藉由酵素-A的糖鏈轉移活性，而糖鏈予體分子之糖鏈轉移至該以原位生成的接受體分子，藉此而以一鍋製造為標的物之具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子。此態樣中，接受體分子雖以原位生成，但並未被單離・純化，因此看起來就像是作為原料投入的含Fc分子之N297鍵結糖鏈以單一步驟而被直接交換成源自糖鏈予體分子之糖鏈。所以，本說明書中，將此種態樣適宜稱為「N297鍵結糖鏈的直接交換反應」。
於N297鍵結糖鏈的直接交換反應中，係無特別限制，可使用如上述之各種各樣之種類的糖鏈予體分子，例如，糖鏈的還原末端未經活化之糖鏈予體分子與糖鏈的還原末端經活化之糖鏈予體分子的任一者都可使用。然而，使用還原末端經活化之糖鏈(例如，還原末端經唑啉化之糖鏈)作為糖鏈予體分子之情形，由於糖鏈在水中迅速地被水解，失去對抗體之反應性，而有所謂需要使反應在短時間完結的限制，因此於N297鍵結糖鏈的直接交換反應中，較佳為使用糖鏈的還原末端未經活化之糖鏈予體分子。所以，於本發明之一態樣中，N297鍵結糖鏈的直接交換反應中所使用的糖鏈予體分子為糖鏈的還原末端未經活化之糖鏈予體分子。換言之，於本發明之一態樣中，步驟1包含以原位製備接受體分子之態樣之情形，步驟1中使用的糖鏈予體分子為糖鏈的還原末端未經活化之糖鏈予體分子。就此種糖鏈予體分子而言，並無限制，可舉出例如＜新穎糖鏈予體分子＞之章節中所具體揭示的新穎糖鏈予體分子。例如，於糖鏈予體分子選擇G-1之情形，可得到含Fc分子-[SG] 2，於糖鏈予體分子選擇G-4、G-13、G-14、或G-16之情形，可得到含Fc分子-[X-MSG1] 2，再者，於糖鏈予體分子選擇G-3、G-6、G-7、G-8、G-9、G-10、G-11、G-12、或G-15之情形，可得到含Fc分子-[X-SG] 2。
另一方面，於N297鍵結糖鏈的直接交換反應中，使用還原末端經活化之糖鏈(例如，還原末端經唑啉化之糖鏈)作為糖鏈予體分子之情形，如上所述，由於糖鏈在水中迅速地被水解，失去對抗體之反應性，而有所謂需要使反應在短時間完結的限制。以原位製備接受體分子之情形，為了使接受體分子在短時間生成，而思及提高作為原料所投入之含Fc分子的濃度，但若此濃度過高，則還原末端經活化之糖鏈與作為原料所投入之含Fc分子的接觸頻率升高，有非酵素媒介型之糖化(Glycation)優勢地進行之可能性。因此，使用還原末端經活化之糖鏈而進行N297鍵結糖鏈的直接交換反應時，為了抑制糖化反應，較佳為將作為原料所投入之含Fc分子濃度設定為低的。或者，為了使接受體分子在短時間生成，避免活化糖鏈(例如，唑啉化糖鏈)的水解而使反應於短時間完結，較佳為使用N297鍵結糖鏈之水解活性更強的酵素-A。此外，於非專利文獻(Xiao Zhang, et al., ACS Chem Biol. 2021, 11, 2502-2514)、及專利文獻(WO2022226420)中報告：對於具有源自宿主細胞之不均勻的糖鏈之抗體加入經唑啉化之雙醣與野生型Endo-S2，可將源自糖鏈予體分子之糖鏈以高糖鏈轉移率附加在抗體。於該報告中，認為由於被轉移至抗體的源自雙醣唑啉之糖鏈對Endo-S2的水解活性具有抗性，而能夠使用水解活性高的野生型Endo-S2而使反應在短時間完結。所以，於本發明中之N297鍵結糖鏈的直接交換反應中，亦可利用此種已知的方法，而適宜選擇反應中使用的糖鏈予體分子和酵素-A。
此外，關於N297鍵結糖鏈的直接交換反應中之反應溫度等的諸條件，係如上所述，但關於反應時間，較佳為與包含將接受體分子分開製備之步驟的態樣比較而設定較長的時間。
＜步驟2＞ 於本發明之製造方法中，步驟2係使步驟1中所得之反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子回收的步驟，較佳為：使步驟1中所得之反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，而將反應混合液中所包含的具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子，從一部分或全部未反應的含Fc分子(接受體分子)單離、回收的步驟。於本發明之一態樣中，步驟2係將步驟1中所得之反應混合液直接當作負載液、或藉由對反應混合液適宜追加緩衝液而製備負載液，使該負載液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，藉此使未反應的接受體分子選擇性地被吸附於該介質，且另一方面，回收含有具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子的通過液，藉此選擇性地回收該含Fc分子之步驟。
如上所述，本發明中之製造方法，可在步驟2中將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子與未反應的含Fc分子(接受體分子)分離，所以即使在步驟1中僅使用少量糖鏈予體分子之情形亦可製造高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子。於本想法中，為了抑制在步驟1中使用之糖鏈予體分子的用量，並且製造具有高糖鏈轉移率的糖鏈結構之含Fc分子，而需要步驟2具有高選擇性與回收率。選擇性低之情形，由於無法將為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子從未反應的含Fc分子(接受體分子)單離，而無法提高糖鏈轉移率，又，回收率低之情形，為了增加含Fc分子的產量而有在步驟1中增加接受體分子的進料量之必要，所以就結果而言，糖鏈予體分子的用量增大，得不到作為目標之效果。又，應用本發明來作為工業規模之醫療用抗體的製造方法之情形，需要在步驟2中可將為標的物之抗體以保持著所期望之生物學上的活性之狀態而有效率的進行單離。
就以往之單離技術而言，作為檢測附加有N297鍵結糖鏈的抗體中所包含之未有糖鏈附加的(不具有核心GlcNAc之)抗體的分析手法，已知毛細管凝膠電泳法(CE-SDS)(Richard R. Rustandi等人，Electrophoresis. 2008 Sep; 29(17): 3612-20)。本手法可在還原條件下因應分子之流體力學尺寸而單離經片段化之抗體的重鏈，但另一方面，除了抗體在前處理的過程變性，失去生物學上的活性以外，由於藉由填充在微細的毛細管中之介質來單離抗體，而處理能力被限制在數百μg左右。又，作為從具有使ENGase作用前之N297鍵結糖鏈的抗體來單離使用ENGase而製備之具有核心GlcNAc的抗體之分析手法，已知使用親水性交互作用層析(HILIC)的方法(Matthew A等人，使用HILIC及內因性螢光檢測來測量完整mAb的聚醣佔有率(Measuring the Glycan Occupancy of Intact mAbs using HILIC and Detection by Intrinsic Fluorescence))。本手法不需要抗體片段化，而可將具有N297鍵結糖鏈的抗體與具有核心GlcNAc的抗體分離，但在另一方面，除了抗體因加熱與暴露於有機溶媒中而變性，失去生物學上的活性以外，由於單離需要高理論板數的分析用管柱或超高效液相層析裝置(UHPLC)，而處理能力被限制在數μg左右。又，作為從具有使ENGase作用前之N297鍵結糖鏈的抗體來單離使用ENGase而製備之具有核心GlcNAc的抗體之分析手法，已知使用陽離子交換層析的方法(Masaki Kurogochi等人，PLOS ONE|DOI:10.1371/ journal.pone.0132848 July 22, 2015、及Shiyi Wang等人，Journal of Chromatography A, 1217 (2010) 6496-6502)。本手法可不使抗體變性而將具有N297鍵結糖鏈的抗體與具有核心GlcNAc的抗體分離，但另一方面，為了達成高分解能力的分離，需要使用高理論板數的分析用管柱且以複雜的程式混合2液之梯度洗提方式，處理能力被限制在數百μg左右，除此以外，有得不到令人滿足之產率的缺點。所以，於本發明以前，完全沒有報告可適用於工業規模之單離・純化目的之因應有無糖鏈附加來單離抗體的方法。
於此種狀況下，本發明人等發現：以所謂使反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸之極為單純的方法，可不使為標的物之附加有糖鏈的含Fc分子變性而選擇性地以高產率進行單離・純化。
步驟2可依照陽離子交換層析或多模層析中之慣用方法來實施。例如，可藉由將步驟1中所得之反應混合液與顯示酸性的緩衝液混合而得到負載液，將該負載液對填充有陽離子交換層析介質或多模層析介質之管柱進行通液，藉此而分離吸附於管柱之分子、與通過之分子。步驟2中可接著藉由將平衡液(或洗淨液)進行通液，而沖洗掉非特異性地吸附於管柱之分子後，將洗提液(或再生液)進行通液，藉此而使特異性地吸附管柱之分子溶析。步驟2中，可於之後適宜以定位洗淨為目的來將清洗液進行通液。
於步驟2中，在酸性條件下實行陽離子交換層析或多模層析。於本發明之一態樣中，步驟2中的負載液(或負載液及平衡液)具有酸性之pH。於步驟2中，可見到負載液(或負載液及平衡液)之pH越低，糖鏈轉移率的提升效果越高，且伴隨著pH的增加而糖鏈轉移率的提升效果降低之傾向。就本發明中之「酸性條件」而言，只要可達成所期待的單離，則可使用任意之酸性pH(＜7.0)，例如，就下限值(負載液及平衡液之pH的下限值)而言，可採用選自2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9及4.0的任意之pH，就上限值(負載液及平衡液之pH的上限值)而言，可採用選自5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6及3.5的任意之pH。又，就「酸性條件」之pH的範圍(負載液及平衡液之pH的範圍)而言，可舉出上述所提及之上限值及下限值各別的任意之組合、或2.5～5.0、較佳為3.0～4.8、進一步較佳為3.3～4.7、特佳為3.4～4.6、最佳為3.5～4.5，但不限定於此等。所以，於本發明之一態樣中，步驟2中的酸性條件意指為pH2.5～5.0、較佳為pH3.0～4.8、進一步較佳為pH3.3～4.7、特佳為pH3.4～4.6、最佳為pH3.5～4.5之範圍。
步驟2中，可將步驟1中所得之反應混合液直接當作用以對管柱進行通液的負載液、或藉由對反應混合液適宜追加緩衝液而製備負載液。就用以製備負載液之緩衝液而言，只要負載液具有酸性之pH，則可使用各種各樣之緩衝液，但可舉出例如乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、甘胺酸緩衝液、酞酸緩衝液。
又，亦可藉由對負載液適宜加入鹽，而調整成具有所期待的鹽濃度。就用以製備負載液之鹽而言，只要可達成所期待的單離，則並不特別限定，但可舉出例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂。又，就鹽濃度而言，可舉出例如：30～2000mM、較佳為150～1000mM、更佳為200～750mM、進一步較佳為280～600mM、特佳為310～500mM。此外，負載液中之鹽濃度會對最終標的物之產率或純度造成影響，又，其最適鹽濃度由於因應標的物、陽離子交換層析介質或多模層析介質的種類而變化，較佳為因應給定的層析環境而採用最適的鹽濃度。
負載液中之含Fc分子的濃度只要可達成所期待的單離，則並不特別限定，但可舉出例如：0.1～100mg/mL、較佳為0.5～50mg/mL、更佳為1.5～30mg/mL、進一步較佳為2～20mg/mL、特佳為3～10mg/mL。又，就對介質進行通液之負載液自身的體積而言，可依照慣用方法而因應介質的體積等來適宜決定。
就步驟2中的平衡液而言，於單離前將介質內之pH及鹽濃度平衡化，又，若為可實質上不單離吸附於介質之分子而沖洗掉非特異性地吸附於介質之分子者，則可使用各種各樣之物。關於可作為平衡液使用的緩衝液和平衡液中的鹽濃度，請參照關於負載液所提及者。關於平衡液之通液量，可依照慣用方法而因應介質的體積等來適宜決定，可舉出例如1～100管柱容量(CV)、較佳為5～50CV、更佳為8～40CV、進一步較佳為10～30CV、特佳為12～20CV，但並不限定於此等。
步驟2中的洗提液為可將吸附於介質之分子溶析者，但可使用各種各樣之物，清洗液若為可將介質定位洗淨(CIP)者，則可使用各種各樣之物。所以，關於洗提液和清洗液，可根據已知的方法、或應用已知的方法來適宜決定。
本發明中之製造方法，就步驟2結束後的糖鏈轉移率而言，可設定任意之數值，可設定為例如85%以上、90%以上或95%以上。於本發明之一態樣中，步驟2之糖鏈轉移率為超過90%者，較佳為超過95%者，特佳為超過99%者。又，作為步驟2之步驟產率，亦可設定任意之數值，但如上所述，越提高步驟2之步驟產率越可削減步驟1之糖鏈予體分子用量，因此期望更高的步驟產率。但是，只要可達成所期待的單離，則步驟產率並不特別限定，可舉出例如：1～99%、較佳為5～95%、更佳為20～95%、特佳為40～90%。
於本發明中，所謂陽離子交換層析介質，意指具有陽離子交換基之介質。陽離子交換層析介質被分類為：於其表面有磺酸基(R-SO 3H)鍵結的強酸型及有羧基(R-COOH)、酚性羥基(R-OH)、膦酸基[R-P(=O)(OH) 2]或次膦酸(phosphinic acid)基[R-P(=O)(OH)-R]鍵結的弱酸型。所以，於本發明之一態樣中，陽離子交換層析介質係強酸型或是弱酸型之介質，及/或具有磺酸基、羧基、酚性羥基、膦酸基、或次膦酸基作為陽離子交換基之介質。就具體之離子交換層析介質的形態而言，可為粒子狀、膜狀、蜂巢狀、板狀、小片(chip)狀、纖維狀等之任一者，但從介質會吸附之分子的特性之觀點來看，可舉出粒子狀、膜狀、蜂巢狀等，但不限定於此等。
作為粒子狀的陽離子交換層析介質，可舉出SP sepharose FF (Cytiva)、SOURCE 15S (Cytiva)、Capto S Impact (Cytiva)、Eshmuno CP-FT (Merck)、Exhmuno CPX (Merck)、POROS HS (Thermo)、POROS XS (Thermo)、Nuvia HR-S (BiO-RAD)、Cellufine Max GS (JNC)等，但不限定於此等。
作為膜狀的陽離子交換層析介質，可舉出Sartobind S (Sartorius)、Mustang S (Pall)等，但不限定於此等。
作為蜂巢狀的陽離子交換層析介質，可舉出CIM monolith SO3 (BIA Separation)等，但不限定於此等。
步驟2之陽離子交換層析可使用已知的裝置而實行，就此種裝置而言，可舉出AKTA avant 25 (Cytiva)，但並不限定於此。又，步驟2之陽離子交換層析中的移動相之流速可依照慣用方法而適宜決定。
於本發明中，所謂多模層析介質包含陽離子交換基及可進行與陽離子交換基相異之作用的官能基至少1種，且一實施態樣中，可進行相異之作用的官能基為可進行疏水性交互作用的官能基。就陽離子交換基而言，可舉出與在陽離子交換層析介質所提及者同樣者。又，就多模層析介質的形態而言，可舉出與在陽離子交換層析介質所提及者同樣者。作為多模層析介質，可舉出Capto(TM) MMC或TOYOPEARL(TM) MX-TRP-650M等，但不限定於此等。步驟2之多模層析可使用已知的裝置而實行。又，步驟2之多模層析中的移動相之流速可依照慣用方法而適宜決定。
＜複合物＞ 透過本發明之步驟1及步驟2而得到的含Fc分子，可進一步進行化學上或是生化學上的修飾。藉由使用在前述之糖鏈予體分子之結構式中X的部分具有具疊氮基(N 3-)之取代基、例如具N 3之聚乙二醇連接子(L(PEG))的糖鏈予體分子，而可製作於糖鏈的非還原末端具有疊氮基之含Fc分子、例如具有以下之式所表示的N297-(Fuc)SG-L(PEG) 2、N297-(Fuc)MSG1-L(PEG)或N297-(Fuc)MSG2-L(PEG)之結構的含Fc分子。
(式中，L(PEG)表示與鍵結於β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩方之非還原末端的唾液酸之2位的羰基進行鍵結。L(PEG)為包含聚乙二醇結構且可包含其他的鍵結結構及/或修飾結構之連接子結構。)
(式中，L(PEG)表示與鍵結於β-Man之支鏈的1-3鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羰基進行鍵結。L(PEG)為包含聚乙二醇結構且可包含其他的鍵結結構及/或修飾結構之連接子結構。)
(式中，L(PEG)表示與鍵結於β-Man之支鏈之中1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羰基進行鍵結。L(PEG)為包含聚乙二醇結構且可包含其他的鍵結結構及/或修飾結構之連接子結構。)
疊氮基(N 3-)係藉由與(雜)環炔基(例如，DBCO(二苯并環辛炔))等炔結構反應，而形成1,2,3-三唑環(SPAAC(應變促進型炔疊氮化物環加成(strain-promoted alkyne azide cycloaddition)：Agard NJ, et al., J Am Chem Soc. 2004, 126, 46, 15046-15047)。所以，於本發明之一態樣中，源自糖鏈予體分子之糖鏈具有經具有疊氮基(N 3-)之取代基所化學修飾的非還原末端，或者是源自糖鏈予體分子之糖鏈自身不具有疊氮基，但於步驟1或步驟2之後對該糖鏈的非還原末端導入具有疊氮基之取代基之情形，本發明之製造方法可進一步包含使具有炔結構之分子與該糖鏈之疊氮基(N 3-)進行反應的步驟。本說明書中，有時將如此地進行而與具有炔結構之分子鍵結之狀態的含Fc分子稱為「複合物」。此外，將透過本發明之步驟1及步驟2而得到的含Fc分子藉由SPAAC以外的反應而與其他分子進行複合體化者，亦有稱為「複合物」之情形。
就具有炔結構之分子而言，可舉出例如具有(雜)環炔基且具有所期望之活性的分子，較佳可例示藥學上為活性的化合物(例如化學治療劑、分子標靶藥物、免疫增強劑(例如STING促效劑(WO2020/050406、WO2014/099824、WO2014/179335、WO2014/189805、WO2014/189806、WO2015/074145、WO2015/185565、WO2016/096714、WO2016/012305、WO2016/145102、WO2017/027646、WO2017/027645、WO2017/075477、WO2017/093933、WO2017/100305、WO2017/123669、WO2017/161349、WO2017/175147、WO2017/175156、WO2018/009466、WO2018/045204、WO2018/060323、WO2018/067423、WO2018/065360、WO2014/093936、WO2018/009648、WO2018/100558)、TLR促效劑、A2AR拮抗劑)、IDO抑制劑、CTLA-4、LAG-3及PD-1路徑之拮抗劑、檢查點抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)受體抑制劑、smoothen抑制劑、烷化劑、抗代謝物、類視色素及抗癌症疫苗、佐劑、脂質、微脂體、毒素、抗菌劑、抗病毒劑、診斷用藥劑、蛋白質、肽、胺基酸、核酸、抗原、維生素、荷爾蒙等)，但不限定於此等。就化學治療劑或是毒素而言，可舉出喜樹鹼(例如WO2014/057687)、吡咯并苯并二氮呯(例如WO2013/173496、WO2014/130879、WO2017/004330、WO2017/004025、WO2017/020972、WO2016/036804、WO2015/095124、WO2015/052322、WO2015/052534、WO2016/011519、WO2015/052321、WO2015/031693、WO2011/130613、WO2019/065964)、艾黴素、阿瑞他汀、紫杉烷或是其衍生物，但不限定於此等。又，就免疫增強劑而言，可例示STING促效劑、TLR促效劑、及A2AR拮抗劑，但不限定於此等。就具有炔結構之分子而言，較佳可舉出選自由以下之(A)～(E)所組成之群組的分子： (A) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (B) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺； (C) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (D) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺；以及 (E) (雙(N,N-二乙基乙銨)　N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aR,16R)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧-2,10-二硫-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四炔-7-基]-6-側氧-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺。
藉由上述所記述之製造方法所製造的含Fc分子也在本發明之範圍內。所以，本發明係於其一態樣中，包含藉由上述所記述之製造方法所製造的含Fc分子。
＜單離方法＞ 由本發明人等所發現之所謂藉由在酸性條件下的陽離子交換層析或多模層析而可將具有所期待的糖鏈之醣蛋白(尤其是具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子)、與不具有該糖鏈之醣蛋白分離的見解，亦適用於與如上述所述之製造方法為獨立之僅單離目標醣蛋白之用途。所以，於本發明之一態樣中，提供一種單離方法，其係醣蛋白(尤其是具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子)之單離方法，其包含：使包含前述醣蛋白(含Fc分子)與1個以上之雜質的溶液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，使雜質選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉的步驟。於本發明之一態樣中，該單離方法為包含下述步驟的單離方法，該步驟係藉由使包含前述醣蛋白(含Fc分子)與1個以上之雜質的溶液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，而使雜質選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉，且另一方面，回收包含不會被該介質選擇性地捕捉之具有所期待的糖鏈之醣蛋白(具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子)的通過液，藉此而選擇性地回收該醣蛋白(含Fc分子)。
於本發明中之單離方法之一態樣中，醣蛋白為含Fc分子，且在典型上，為具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子。N297鍵結糖鏈可為高甘露糖型糖鏈、混成型糖鏈及複合型糖鏈之任一者，但較佳為複合型糖鏈。所以，於本發明之一態樣中，N297鍵結糖鏈為複合型糖鏈。又，就應由具有所期待的糖鏈之醣蛋白(例如，具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子)分離之雜質而言，在典型上可舉出：除了與為標的物之醣蛋白(含Fc分子)係糖鏈(例如，N297鍵結糖鏈)之結構不同、或缺失糖鏈(例如，N297鍵結糖鏈)以外，具有與醣蛋白(含Fc分子)相同結構的分子。例如，為標的物之含Fc分子中的N297鍵結糖鏈並非可有岩藻糖附加之核心GlcNAc之情形(例如，N297鍵結糖鏈為高甘露糖型糖鏈、混成型糖鏈及複合型糖鏈的任一個之情形)，前述1個以上之雜質包含除了具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈以外係與前述含Fc分子相同的分子。
本發明之單離方法除了所謂未必需要被併入作為含Fc分子之製造方法的一步驟之點以外，基本上與本發明之製造方法的步驟2相同。所以，關於上述步驟2而提及之事，係於實施本發明之單離方法之際亦直接適用。
又，本發明之單離方法亦可與所期待的糖鏈轉移反應組合。所以，於本發明之一態樣中，提供一種含Fc分子的單離方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2。 [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子單離、回收或單離回收的步驟。 該單離方法中之步驟1及2，係與上述所記述之本發明之製造方法的步驟1及步驟2相同。所以，關於上述步驟1及步驟2而提及之事，係於實施該單離方法之際亦直接適用。
＜新穎糖鏈予體分子＞ 於本發明之再另一態樣中，提供一種以選自由以下之式所組成的群組之式所表示的新穎糖鏈予體分子：
。 如以下之實施例中所具體記載地，此等之新穎糖鏈予體分子已證實可適合使用於本發明之製造方法中，但可期待亦可使用於其以外的糖鏈重塑反應(糖鏈轉移反應)。於本發明之製造方法中使用上述新穎糖鏈予體分子之情形，各糖鏈予體分子較佳為一邊參照實施例之試驗結果，一邊酌量對於使用之酵素-A與酵素-B之組合的適合性等而適宜決定。
＜抗體-免疫增強劑複合物(Rp,Rp-XIII)之製造方法＞ 於本發明之一態樣中，提供一種抗體-免疫增強劑複合物(Rp,Rp-XIII)之製造方法，其包含： [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)及以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子，且該步驟中，前述含Fc分子為抗體，前述糖鏈予體分子為以式G-10所表示的化合物； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子回收的步驟；以及 [步驟3]使以下之式(Rp,Rp-XII)所表示的環狀二核苷酸(Cyclic dinucleotide，CDN)複合物前驅物藉由環化加成反應而與該糖鏈之疊氮基(N 3-)鍵結的步驟。
於該製造方法中，步驟1及步驟2可直接適用上述＜步驟1＞及＜步驟2＞之章節中所提及之事。所以，於以下針對步驟3及藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物進行詳述。
步驟3係藉由以下之示意圖表示。
(式中， (3)示意地表示步驟2中所得之具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子， 抗體-免疫增強劑複合物(Rp,Rp-XIII)之左側的2個星號(*)表示以右側的星號表示之CDN-連接子部分，及 A1表示
的任一個。)
抗體-免疫增強劑複合物(Rp,Rp-XIII)可藉由環化加成反應，使步驟2中所得之含Fc分子(3)與CDN複合物前驅物(Rp,Rp-XII)鍵結而製造。CDN複合物前驅物(Rp,Rp-XII)可參照WO2020/050406、WO2021/177438、或WO2022/163846而製造。就環化加成反應而言，可舉出例如狄耳士-阿德爾反應(Diels-Alder reaction)、及1,3-偶極環化加成反應，較佳為使用1,3-偶極環化加成反應來製造。就1,3-偶極環化加成反應而言，可舉出例如疊氮化物與末端炔的環化加成反應、及SPAAC(應變促進型疊氮化物-炔加成環化反應strain-promoted azide-alkyne cycloaddition: J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047)反應，較佳為使用SPAAC反應來製造。所以，於本發明之一態樣中，步驟3包含藉由SPAAC反應而使步驟2中所得之含Fc分子(3)與CDN複合物前驅物(Rp,Rp-XII)鍵結的步驟。
(E-1步驟) 於以下，針對步驟3中的SPAAC反應進行記述。藉由將步驟2中所得之含Fc分子(3)的緩衝溶液(磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液等)、與使CDN複合物前驅物(Rp,Rp-XII)溶解於適當溶媒(二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、丙二醇或彼等之混合溶媒)而成的溶液進行混合，而可實施SPAAC反應。CDN複合物前驅物(Rp,Rp-XII)係相對於含Fc分子(3)1莫耳而為2莫耳至過剩莫耳，較佳為4莫耳至30莫耳，有機溶媒之比率較佳為相對於含Fc分子(3)的緩衝溶液而為1%至200%(v/v)。反應溫度為0℃至37℃，較佳為15℃至25℃，反應時間為1小時至150小時，較佳為6小時至72小時。反應溶液之pH較佳為5至9。可適宜將反應溶液依照後述共通操作D所記載之方法進行單離，而得到抗體-免疫增強劑複合物(Rp,Rp-XIII)。
抗體-免疫增強劑複合物可藉由後述共通操作D至G，而進行緩衝液交換、單離、抗體濃度之測定及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數之測定，且進行抗體-免疫增強劑複合物的鑑定。
共通操作A：抗體水溶液的濃縮 將抗體或抗體-免疫增強劑複合物溶液放入Amicon(註冊商標) Ultra離心式過濾器裝置(50,000 NMWL，Merck Millipore Ltd.)，且藉由使用離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter, Inc.)的離心操作(以2000G至4000G離心5分鐘至20分鐘)，而可濃縮抗體及抗體-免疫增強劑複合物溶液。
共通操作B：抗體的濃度測定 可使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific, Inc.)，而依照製造商規定的方法進行抗體濃度之測定。此時，對每一個抗體使用不同的280nm吸光係數(1.3mLmg -1cm -1至1.8mLmg -1cm -1)。
共通操作C：抗體的緩衝液交換 對抗體水溶液加入緩衝液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)、磷酸緩衝液(pH6.0)等)，依照共通操作A所記載之方法進行濃縮。將此操作進行數次之後，依照共通操作B所記載之方法測定抗體濃度。對此抗體緩衝溶液適宜加入緩衝液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)、磷酸緩衝液(pH6.0)等)，而可製備目標濃度(例如，約10mg/mL)的抗體緩衝溶液。
共通操作D：抗體-免疫增強劑複合物的單離(凝膠過濾層析) 以乙酸緩衝液(10mM乙酸鹽緩衝液、5%山梨糖醇，pH5.5；本說明書中稱為ABS)或其以外的適當緩衝液使NAP管柱(NAP-5、NAP-10、NAP-25 (GE Healthcare製))平衡化。對此NAP管柱裝入抗體-免疫增強劑複合物反應溶液，使製造商規定量的緩衝液自然流下，分取抗體流分(fraction)。再度對NAP管柱裝入此流分，使製造商規定量的緩衝液自然流下，分取抗體流分。可藉由重複此操作合計2次至3次，而得到除去未鍵結的免疫增強劑連接子和二甲基亞碸、丙二醇之抗體-免疫增強劑複合物。因應需要，可藉由共通操作A及C而調節抗體-免疫增強劑複合物溶液的濃度。
共通操作E：抗體-免疫增強劑複合物中之抗體濃度及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數之測定(UV法) 抗體-免疫增強劑複合物中之鍵結免疫增強劑濃度，可根據WO2020/050406、WO2021/177438所記載之方法，使用吸光光度計(UV/VIS Spectrometer Lambda 25，PerkinElmer, Inc.)，藉由測定抗體-免疫增強劑複合物水溶液的280nm及250nm之二波長下的吸光度而算出。
共通操作F：抗體-免疫增強劑複合物中之抗體濃度及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數之測定(逆相高效液相層析法：RP-HPLC) 抗體-免疫增強劑複合物中之抗體濃度及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數，除了前述共通操作E以外，亦可根據WO2020/050406、WO2021/177438所記載之方法而藉由高效液相層析分析來求得。
共通操作G：抗體-免疫增強劑複合物中之抗體濃度及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數之測定(疏水性交互作用-高效液相層析法：HI-HPLC) 抗體-免疫增強劑複合物中之抗體濃度及抗體每一分子的免疫增強劑平均鍵結數，除了前述共通操作E及F以外，亦可根據WO2020/050406、WO2021/177438所記載之方法而藉由高效液相層析分析來求得。
藉由上述所記述之製造方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物也在本發明之範圍內。所以，本發明係於其一態樣中，包含藉由上述所記述之製造方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物。
藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物中，亦有存在立體異構物或源自不對稱碳原子的光學異構物、幾何異構物、互變異構物或d體、l體、阻轉異構物(atropisomer)等光學異構物之情形，但此等之異構物、光學異構物及此等之混合物的任一者都包含在本發明中。
於藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物中，對抗體1分子之免疫增強劑的鍵結數為影響其有效性、安全性的重要因子。抗體-免疫增強劑複合物之製造，係以免疫增強劑之鍵結數成為一定的數量之方式，規定進行反應之原料・試藥的用量等反應條件而實施，但與低分子化合物的化學反應不同，通常可作為鍵結有不同的數量之免疫增強劑而成的混合物而得到。然而，本發明之方法，可在步驟1及2中製造高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子，所以結果能以高純度得到免疫增強劑之鍵結數均勻的抗體-免疫增強劑複合物。對抗體1分子之免疫增強劑的鍵結數，可作為平均值、亦即平均免疫增強劑鍵結數(DAR：藥物與抗體之比(Drug to Antibody Ratio))而特定。對抗體分子之環狀二核苷酸衍生物的鍵結數可控制，作為每1抗體之免疫增強劑平均鍵結數，可使1至4之範圍的環狀二核苷酸衍生物鍵結，但較佳為2至4個，更佳為3至4個，進一步較佳為3.2至4個，特佳為3.5至4個。
於本發明之再另一態樣中，提供一種抗體-免疫增強劑複合物之製造方法，其係將上述[步驟1]之糖鏈予體分子使用式G-14代替式G-10以外，與上述方法同樣地進行，作為每1抗體之免疫增強劑平均鍵結數，使1至3之範圍的環狀二核苷酸衍生物鍵結。此情形，步驟2中得到的含Fc分子具有並非藉由(3)而是藉由以下之(3’)所示之結構。對抗體分子之環狀二核苷酸衍生物的鍵結數可控制，每1抗體之免疫增強劑平均鍵結數較佳為1.0至2.5個，更佳為1.2～2.2之範圍。
藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物，有因放置在大氣中或進行再結晶而吸收水分、附著吸附水，成為水合物之情形，該種含水的化合物及鹽亦包含在本發明中。
藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物，由於具有胺基等鹼性基，可依期望而作成醫藥上可容許之鹽。就該種鹽而言，可舉出例如鹽酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳基磺酸鹽；甲酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；及鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽。
藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物，由於在其結構中包含磷酸基及/或硫代磷酸基，一般能夠形成鹼加成鹽。就醫藥上可容許之鹽而言，可舉出例如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽等無機鹽；二苄胺鹽、啉鹽、苯基甘胺酸烷酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、三級丁胺鹽、環己胺鹽、二環己胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽等。
藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物，亦有因吸收空氣中的水分等而作為水合物存在之情形。就本發明之溶劑合物而言，若為醫藥上可容許者則不特別限定，但具體而言，較佳為水合物、乙醇合物、2-丙醇合物等。又，於本發明之抗體-免疫增強劑複合物中，由於存在氮原子，而亦可成為N-氧化物體，此等溶劑合物及N-氧化物體亦包含在本發明之範圍中。又，本發明之抗體-免疫增強劑複合物中，由於存在硫原子，而亦可成為亞碸體，此等溶劑合物及亞碸體亦包含在本發明之範圍中。
又，藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物中，亦包含以種種的放射性或非放射性同位素所標識的化合物。於構成藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物之原子的1個以上，亦可含有原子同位素的非天然比例。就原子同位素而言，可舉出例如氘(2H)、氚(3H)、碘-125 (125I)或碳-14 (14C)等。又，藉由本發明之方法所製造的抗體-免疫增強劑複合物，例如可藉由如氚(3H)、碘-125 (125I)或碳-14 (14C)的放射性同位素進行放射性標識。經放射性標識的化合物就下述而言為有用的：治療或預防劑；研究試藥，例如分析試藥；及診斷劑，例如，活體影像診斷劑。本發明之抗體-免疫增強劑複合物的所有同位素變異種，無論是否為放射性，皆包含在本發明之範圍中。
＜酵素-A與酵素-B之融合蛋白質及使用該融合蛋白質的含Fc分子之製造方法＞ 於發明之另一態樣中，提供一種酵素-A與酵素-B之融合蛋白質。於本說明書中，所謂酵素-A與酵素-B之融合蛋白質，意指酵素-A與酵素-B直接或間接地結合之狀態的蛋白質。於本發明之一態樣中，酵素-A與酵素-B之融合蛋白質，係酵素-A與酵素-B兩方經固定化於任意之固相擔體的固定化酵素，又，於本發明之另一態樣中，酵素-A與酵素-B之融合蛋白質，係酵素-A與酵素-B直接鍵結或者透過任意之連接子、例如任意之胺基酸、PEG等聚合物、寡聚物連接子等、較佳為胺基酸連接子鍵結而成的融合蛋白質。就酵素-A與酵素-B之融合蛋白質中所使用的酵素-A與酵素-B而言，只要會履行各自之職責，則可使用任意之組合。可舉出例如下表所記載之[酵素-A]-[酵素-B]融合蛋白酵素、[酵素-B]-[酵素-A]融合蛋白酵素。
[表3]
   [酵素-A]-[酵素-B]融合蛋白酵素、或 [酵素-B]-[酵素-A]融合蛋白酵素
BA-1 [Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L]
BA-2 [Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L]
酵素-A與酵素-B之融合蛋白質在使用於含Fc分子的製造之情形，可帶來減少製造步驟中所應製備・準備之酵素的數量等之類的優點，此為與本發明之步驟2獨立而可得到的優點。因此，於本發明之一態樣中，提供一種含Fc分子的製造方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1’：使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)與以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)之融合蛋白質存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，其中該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子。該步驟1’中所使用的接受體分子、糖鏈予體分子、反應條件等，都可直接適用上述中針對步驟1所說明者。又，亦可使步驟2接續在步驟1’後，藉此達成更高的糖鏈轉移率。 [實施例]
以下，使用實施例而具體說明本發明。實施例所示者為本發明之實施形態之一例，本發明並不限定於此。
本說明書中記載之蛋白質濃度係使用超微量分光光度計NanoDrop8000 (Thermo Fisher Scientific製)、或紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)進行定量。 實施例中的SGP(唾液酸醣肽(sialylglycopeptide))可利用WO2017110984的實施例1所記載的方法、或WO2014208742的實施例1所記載的方法來製作。實施例中的AG(9)-P可利用WO2014115797的實施例1-17之步驟1-17A所記載的方法來製作。實施例中的AG(7)-P可利用WO2014115797的實施例1-17之步驟1-17B所記載的方法來製作。 實施例中的([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Asn-PEG(3)-N 3可利用WO2018003983的實施例1-12、步驟1-12A所記載的方法來製作。實施例中的([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3可利用WO2019065964的實施例154之步驟3所記載的方法來製作。 實施例中的mAb1表示曲妥珠單抗。(Fucα1,6) GlcNAc-mAb1表示可利用WO2017010559的實施例3所記載的方法來製作的曲妥珠單抗之糖鏈水解物。實施例中的mAb2表示可利用WO2019065964的實施例136所記載的方法及WO2019065964內的序列識別號36及52來製作的抗體。(Fucα1,6)GlcNAc-mAb2表示可利用WO2019065964的實施例61之步驟1所記載的方法來製作的糖鏈水解物(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L1)。實施例中mAb2-[MSG1-N 3] 2表示可利用WO2019065964的實施例61之步驟2所記載的方法來製作的抗CLDN6抗體(H1L1)-[MSG1-N 3] 2。實施例中的mAb3表示可利用WO2020050406的參考例5所記載的方法及WO2020050406內的序列識別號28及30來製作的改造HER2抗體2。(Fucα1,6)GlcNAc-mAb3表示可利用WO2020050406的實施例85之步驟1所記載的方法來製作的糖鏈水解物(Fucα1,6)GlcNAc-改造抗HER2抗體2。實施例中mAb3-[SG-N 3] 2表示可利用WO2020050406的實施例85之步驟2所記載的方法來製作的改造抗HER2抗體-[MSG1-N 3] 2。 使用蛋白質的凝膠電泳法確認糖鏈水解、及糖鏈轉移反應的進展狀態(WO2013/120066、Huang W, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 12308-12318)。作為蛋白質的全自動電泳系統，裝置係使用LabChip GX II (PerkinElmer製)，試藥係使用Protein Express Assay LabChip及Protein Express Reagent Kit (PerkinElmer製)。
＜實施例1＞酵素-A與酵素-B的選擇方法 若酵素-A與酵素-B協力地作用，則該糖鏈單元從化學上未經活化之糖鏈予體分子往含Fc分子之GlcNAc(接受體分子)的直接轉移成為可能。在本實施例，酵素-A係具有與含Fc分子有親和性的結構域、與糖鏈有親和性的結構域、及糖鏈轉移反應觸媒區域之酵素，又，酵素-B係從不具有岩藻糖之2分支糖鏈予體分子活化成酵素-A可於往含Fc分子的糖鏈轉移反應利用之狀態(活化中間體)的酵素(參照以下之示意圖或圖1)。為了確認可在實施例8以後組合之酵素-A與酵素-B的一般性質、有效的反應條件，於以下之表Y-1中設計實施例2至實施例6中製備之酵素。 若為會履行各自之職責的酵素-A與酵素-B，則酵素種類並不限定，可藉由任意地組合彼等，而得到所期望之糖鏈轉移體。 作為酵素-A的代表例，選擇可期待雖殘留有水解活性但水解活性較對應之各自的野生型酵素受到抑制的Endo-S變異體之代表例、Endo-S2變異體之代表例、及Endo-Si變異體之代表例。酵素-B本身的糖鏈轉移活性被認為與糖鏈予體活化能力有關聯，因此作為酵素-B的代表例，選擇從為不具有岩藻糖之2分支糖鏈予體分子的SGP往GlcNAc衍生物之糖鏈轉移活性已為人所知的Endo-M變異體之代表例、及Endo-Rp變異體之代表例。
上述示意圖及圖1中，唾液酸上的X表示包含氫原子的任意之取代基。例如X為PEG-疊氮化物。圖中，糖鏈還原末端之Z為任意之取代基，較佳為以透過氮原子或氧原子而鍵結之NHR、OR表示。例如，R為選自由PMP、Me、A-Mor、iPr、nPr、PrOMe及A-PEG-N 3(A表示乙醇酸單元中之乙醯基，即變旋異構羥基與Mor或PEG中之胺基所夾住的部分)所組成之群組的取代基。
[表4]
   酵素A    酵素B
A-1 Endo-Si D241M Q311L B-1 Endo-Rp N172H
A-2 Endo-Si D241Q B-2 Endo-Rp N172Q
A-3 Endo-Si D241Q E360Q B-3 Endo-Rp N172V
A-4 Endo-Si D241M B-4 Endo-M N175Q
A-5 Endo-Si D241Q Q311L B-5 Endo-M N175Q Y217F
A-6 Endo-Si D241M E360Q      
A-7 Endo-Si WT      
A-8 Endo-S D233Q E350Q      
A-9 Endo-S WT      
A-10 Endo-S2 D184M      
A-11 Endo-S2 T138Q      
A-12 Endo-S2 WT      
表Y-1.　實施例2至實施例6中製備之酵素
＜實施例2＞Endo-Si酵素的製備 (實施例2-1) Endo-Si酵素的表現 將編碼對應於序列識別號3之基因的Endo-Si表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母(Ogataea minuta)，藉此得到Endo-Si生產菌株。接著，進行在振盪培養條件下或通氣攪拌培養條件下利用甲醇誘導之Endo-Si蛋白質的表現。振盪培養之情形，使用500ml容量擋板燒瓶(CORNING，431401)，於接種後第1天進行甲醇誘導，於接種後第3天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。通氣攪拌培養之情形，使用3L培養槽(ABLE，BMS-03KP3加壓型)，於接種後第一天進行甲醇誘導，於接種後第2天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。
(實施例2-2) Endo-Si酵素的純化 使用YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck，71186)或高壓均質機而將實施例2-1中集菌之菌體予以破碎，組合Capto Chelating、Capto DEAE及Capto Phenyl ImpRes (Cytiva)而將已進行離心分離之上清液予以純化。於最後以Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)將緩衝液取代為PBS(-) (FUJIFILM Wako Pure Chemical)，而得到酵素液。
[表5] 表Z1.　Endo-Si酵素溶液
酵素-A溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
Si-001-1 D241M Q311L 3.98 5.3
Si-001-2 D241M Q311L 4.07 225.5
Si-002 D241Q 3.99 4.8
Si-003 D241Q E360Q 3.95 13.1
Si-004 D241M 3.99 6.1
Si-005 D241Q Q311L 3.98 11.6
Si-006 D241M E360Q 3.96 6.9
Si-007 野生型(WT) 4.02 27.5
＜實施例3＞Endo-Rp酵素的製備 (實施例3-1) Endo-Rp酵素的表現 將編碼對應於序列識別號5之基因的Endo-Rp表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，藉此得到Endo-Rp生產菌株。接著，進行在振盪培養條件下或通氣攪拌培養條件下利用甲醇誘導之Endo-Rp蛋白質的表現。振盪培養之情形，使用1000ml容量擋板燒瓶(CORNING，431403)，於接種後第1天進行甲醇誘導，於接種後第2天或第3天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。通氣攪拌培養之情形，使用3L培養槽(ABLE，BMS-03KP3加壓型)，於接種後第一天進行甲醇誘導，於接種後第4天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。
(實施例3-2) Endo-Rp酵素的純化 使用YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck，71186)或高壓均質機而將實施例3-1中集菌之菌體予以破碎，使用Capto Chelating、POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific)及Capto MMC (Cytiva)之任意2個、或全部而將已進行離心分離之上清液予以純化，得到酵素液。針對一部分進行利用Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)的濃縮或緩衝液交換，得到酵素液。
[表6] 表Z2.　Endo-Rp酵素溶液
酵素-B溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
Rp-001-1 N172H 2.79 2.7
Rp-001-2 N172H 2.80 15.3
Rp-001-3 N172H 4.07 86.1
Rp-002 N172Q 3.84 3.5
Rp-003 N172V 2.89 4.24
＜實施例4＞Endo-S2酵素的製備 (實施例4-1) Endo-S2酵素的表現 將編碼對應於序列識別號2之基因的Endo-S2表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，藉此得到Endo-S2生產菌株。接著，進行在振盪培養條件下利用甲醇誘導之Endo-S2蛋白質的表現。於振盪培養，係使用1000ml容量擋板燒瓶(CORNING，431403)，於接種後第1天進行甲醇誘導，於接種後第3天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。
(實施例4-2) Endo-S2酵素的純化 使用YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck，71186)而將實施例4-1中集菌之菌體予以破碎，使用Capto Chelating而將已進行離心分離之上清液予以純化。於最後以Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)將緩衝液取代為PBS(-) (FUJIFILM Wako Pure Chemical)，而得到酵素液。
[表7] 表Z3.　Endo-S2酵素溶液
酵素-A溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
S2-001 D184M 4.00 1.54
S2-002 T138Q 4.00 0.75
S2-003 野生型(WT) 3.74 1.8
＜實施例5＞Endo-S酵素的製備 (實施例5-1) Endo-S酵素的表現 將編碼對應於序列識別號1之基因的Endo-S表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，藉此得到Endo-S生產菌株。接著，進行在通氣攪拌培養條件下利用甲醇誘導之Endo-S蛋白質的表現。使用42L培養槽(Infors HT)，於接種後第一天進行甲醇誘導，於接種後第4天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。
(實施例5-2) Endo-S酵素的純化 藉由高壓均質機而將實施例5-1中集菌之菌體予以破碎，組合使用Capto Chelating、Capto MMC (Cytiva)、及POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific)之純化而將已進行離心分離之上清液予以純化。於最後以Pellicon 3 cassette, 30kDa (Merck)將緩衝液取代為PBS(-) (Merck)，而得到酵素液。
[表8] 表Z4.　Endo-S酵素溶液
酵素-A溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
S-001 D233Q E350Q 3.9 863.6
S-002 野生型(WT) 4.1 2021.2
＜實施例6＞Endo-M酵素的製備 (實施例6-1) Endo-M酵素的表現 將編碼對應於序列識別號4之基因的Endo-M表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，藉此得到Endo-M生產菌株。接著，進行在通氣攪拌培養條件下利用甲醇誘導之Endo-M蛋白質的表現。於通氣攪拌培養，係使用3L培養槽(ABLE，BMS-03KP3加壓型)，於接種後第1天進行甲醇誘導，於接種後第2天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。
(實施例6-2) Endo-M酵素的純化 使用YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck，71186)而將實施例6-1中集菌之菌體予以破碎，將已進行離心分離之上清液以Capto Chelating及Capto DEAE (Cytiva)進行純化。於最後將緩衝液組成調成50mM Tris、150mM NaCl、30%甘油、pH8.0，得到酵素液。
[表9] 表Z5.　Endo-M酵素溶液
酵素-B溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
M-001 N175Q 4.14 7.0
M-002 N175Q Y217F 4.06 14.8
＜實施例7＞糖鏈給予體的合成 本發明之糖鏈給予體，可依照後述之方法(糖鏈原料或糖鏈中間體之酵素轉換、及化學轉換)來製造。各反應結束後，各反應之標的化合物係依照慣用方法而從反應混合物採集。例如，可藉由將反應混合物適宜進行中和，又，於存在不溶物之情形係利用過濾來去除，並餾除溶劑而得到。所得之化合物若有必要，則可藉由慣用方法、例如矽膠管柱層析或離子交換層析來分離・純化。或者，可藉由再沉澱、再結晶、超過濾來純化。 本說明書中記載之糖鏈衍生物的質量係以下述方法確認。於裝置使用Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc製)、Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc製)及CORETECS UPLC C18 (Waters Inc製)(1.6μm，2.1×50mm)，於移動相A利用乙腈，於移動相B利用0.1%甲酸添加水溶液，以移動相A在4分鐘由2%變化至95%的梯度來使用，以流速0.4mL/min、40℃進行分析。 或是，於裝置使用Xevo G2-XS Family mass spectrometer (Waters製)、ACQUITY BEH C18 (Waters製)(1.7μm，2.1×50mm)，於移動相A利用乙腈，於移動相B利用10mM乙酸銨水溶液，以移動相A在5分鐘由1%變化至30%的梯度來使用，以流速0.8mL/min、40℃進行分析。
(實施例7-1) 糖鏈給予體原料(糖鏈原料3、糖鏈原料3-1)的合成 (合成流程圖)
(7-1a) [N-乙醯化及水解反應] 將SGP (G-1) (25.0g)溶解於純淨水(100mL)中，依序加入溶解於乙腈(50mL)中的N,N-二異丙基乙胺(6.77g)、溶解於乙腈(50mL)中的N-(乙醯氧基羰氧基)琥珀醯亞胺(8.22g)，於室溫攪拌2小時。確認反應結束之後，加入氫氧化鈉水溶液(5N，25mL)，攪拌1小時。 將此液冷卻後，一邊以pH計確認，一邊加入鹽酸(5N，36.6g)，調整為pH2.20之後，將溫度保持在57-59℃，攪拌3個半小時。冷卻至室溫之後，一邊以pH計確認，一邊加入氫氧化鈉水溶液(5N，25mL)，調整為pH5.98。
[純化] 將調整為pH5.98之液之中相當於SGP 14g分量的部分，使用SEPHADEX G-25 Fine (GE Healthcare Japan)予以純化(洗提液使用純淨水)。回收包含標的物之流分，藉由減壓濃縮及冷凍乾燥，而得到為糖鏈原料1、糖鏈原料2-1、糖鏈原料2-2、糖鏈原料2-3之混合物的固態物(13.5g)。
(7-1b) [縮合反應] 將步驟(7-1a)中所得之固態物(11.0g)溶解於DMF (121.0mL)、DMSO (33.0mL)中，依序加入N,N-二異丙基乙胺(3.16g，24.4mmol)、11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(5.33g，24.4mmol)，冷卻至-7℃。於此混合液中費時15分鐘加入六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(12.72g，24.4mmol)的DMF (22.0mL)溶液之後，於-5℃附近攪拌1小時。
[粗純化] 反應結束後，使反應液上升至室溫，滴入乙醇(550mL)。進一步以乙醇(110mL)洗淨反應容器，清洗並將清洗的液體併入。對所產生的漿液進行過濾，以乙醇(110mL)洗淨濾餅之後，於室溫進行減壓乾燥，得到反應粗產物15.7g。 對此反應粗產物加入純淨水(198g)而予以溶解。將些許殘留的殘渣過濾而除去，將所得之濾液減壓濃縮之後，以純淨水調整為88g。將此水溶液滴入乙醇(550mL)，進一步以純淨水(22mL)清洗並將清洗的液體併入。對所產生的漿液進行過濾，以乙醇(275mL)與純淨水(55mL)之混合液洗淨濾餅，藉此得到濕固體(162.0g)。將其溶解於純淨水(220mL)之後，藉由減壓濃縮而濃縮至一半量，去除乙醇。藉由將其冷凍乾燥，而得到為糖鏈原料3、糖鏈原料3-1、糖鏈原料3-2、糖鏈原料2-3之混合物的粗產物(8.81g)。
(7-1c) [使用Triart C18之糖鏈原料3與糖鏈原料3-1的分取] 以乙腈與純淨水為溶析液，且於裝置使用K-Prep Lab 100G (YMC公司製)，於管柱使用Triart C18 (YMC公司製)，而將以步驟(7-1b)所記載的方法所得之規模不同的2批之混合品，亦即為糖鏈原料3、糖鏈原料3-1、糖鏈原料3-2、糖鏈原料2-3之混合物的粗產物(合計10.05g)進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的主要波峰進行回收，並進行減壓濃縮。將此濃縮液冷凍乾燥，得到呈白色粉末之標的化合物 糖鏈原料3 (2.09g)、標的化合物 糖鏈原料3-1 (2.02g)。
(實施例7-5) 糖鏈給予體的合成(G-10) G-10的合成方法1
(7-5-1) [糖鏈交換反應] 將步驟(7-1c)中所得之糖鏈原料3 (200mg)及1-甲基乙基2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(733mg，50當量)溶解於磷酸緩衝液(0.5mL，pH6.7，0.2mol/L)之後，加溫至50℃。對此混合溶液加入Endo-Rp N172Q (1.3mg)，直接在該溫度振盪90小時。
[純化] 反應結束後，在室溫對反應液加入純淨水8mL之後，進行過濾而除去不溶物。以乙腈與水為溶析液，且於管柱使用YMC-Actus Triart C18 (YMC公司製)，而將此濾液進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的主要波峰進行回收，並藉由減壓濃縮、冷凍乾燥而得到標的物G-10 (82mg)。 ESI-MS：C103H176N14O66的計算值：[M+2H] 2+1333.5496(最豐質量(most abundant mass))，實測值1333.5450
G-10的合成方法2
(7-5-2a) [糖鏈交換反應] 將SGP (G-1) (20.0g)及1-甲基乙基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(36.8g，20當量)溶解於磷酸緩衝液(280mL，pH5.5，0.2mol/L)之後，加溫至50℃。對此混合溶液加入Endo-Rp N172H (9.1mg)，直接於該溫度攪拌72小時。
[純化] 反應結束後，在室溫過濾反應液。針對此濾液的一部分，以Sartocon Hydrosart-2kDa (Sartorius)、接著以Amberlite(註冊商標) IR120 H form (Merck)進行純化之後，藉由冷凍乾燥而得到固態物4(3.72g，源自SGP 5.6g)。
(7-5-2b) [縮合反應] 將步驟(7-5-2a)中所得之固態物4 (3.0g)使用DMF (59.1mL)與純淨水(0.9mL)溶解之後，加入N,N-二異丙基乙胺(1.03g，7.94mmol)、11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(867mg，3.97mmol)。在20℃將六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(6.20g，11.9mmol)分為3次添加於此溶液後，直接於該溫度攪拌23小時。
[純化] 反應後，以純淨水稀釋反應液之後，以Sartocon Hydrosart-2kDa (Sartorius)進行純化並濃縮。以乙腈與水為溶析液，且於管柱使用YMC-Actus Triart Prep C18-S (YMC公司製)，而將此濃縮液進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的主要波峰進行回收，並進行減壓濃縮，得到標的化合物G-10 (2.77g)。
(實施例7-9) 糖鏈給予體的合成(G-14) G-14的合成方法1
(7-9-1) [糖鏈交換反應] 將步驟(7-1c)中合成之糖鏈原料3-1 (400mg)、1-甲基乙基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(679mg，20當量)及Endo-Rp N172Q (4.2mg)，在磷酸緩衝液(13.0mL，pH6.8，0.2mol/L)中加溫至50℃。直接在該溫度振盪6天。
[純化] 反應結束後，在室溫以純淨水稀釋反應液，進行過濾而除去不溶物。以Vivaspin 15R, 2,000 MWCO Hydrosart (Sartorius)進行純化並濃縮。以乙腈與水為溶析液，且於管柱使用Sfaer C18 (Biotage公司製)，而將此濃縮液進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的主要波峰進行回收，並進行減壓濃縮，得到標的化合物G-14 (174mg)。 ESI-MS：C84H143N9O56的計算值：[M+2H] 2+1087.9382(最豐質量)，實測值1087.9357
G-14的合成方法2
(7-9-2a) [水解反應] 對步驟(7-5-2a)中所得之固態物4 (1.0g)加入水(20mL)而溶解之後，使用稀鹽酸(1.0mol/L)而將pH調整為2.5。將此水溶液加溫至60℃，直接於該溫度攪拌90分鐘。
[純化] 反應結束後，冷卻至室溫之後，使用NaOH水溶液(1mol/L)而調整為pH7.0。使用Sartocon Hydrosart-2kDa (Sartorius)而予以純化之後，藉由冷凍乾燥而得到為糖鏈原料5-1、糖鏈原料5-2、糖鏈原料5-3、糖鏈原料5-4之混合物的固態物(1.06g)。
(7-9-2b) [縮合反應] 對步驟(7-9-2a)中所得之為糖鏈原料5-1、糖鏈原料5-2、糖鏈原料5-3、糖鏈原料5-4之混合物的固態物(0.8g)加入DMF (8.0mL)、N,N-二異丙基乙胺(0.13g，1.0mmol)，冷卻至0℃。對此漿液溶液，依序加入11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.23g，1.0mmol)與六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(0.55g，1.0mmol)。於0℃攪拌30分鐘之後，在室溫攪拌1.5小時。由於漿液不溶解，而再度冷卻至0℃，依序加入N,N-二異丙基乙胺(0.13g，1.0mmol)、11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.23g，1.0mmol)、六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(0.55mg，1.0mmol)。在室溫攪拌13.5小時之後，冷卻至0℃，進一步依序加入六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(0.41g，0.78mmol)、11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(57mg，0.26mmol)、N,N-二異丙基乙胺(33mg，0.26mmol)。於室溫攪拌1小時，加入水(68mL)使反應停止，得到包含G-14、G-10、糖鏈原料6、糖鏈原料5-4之反應液。
[純化] 以純淨水進一步稀釋此反應液之後，以Sartocon Hydrosart-2kDa (Sartorius)進行純化並濃縮。以乙腈與水為溶析液，且於管柱使用Triart C18 (YMC公司製)，而將此濃縮液進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的主要波峰進行回收，並進行減壓濃縮。將此濃縮液冷凍乾燥，得到呈白色粉末之標的化合物G-14 (98mg)。 (實施例7-2) 糖鏈給予體的合成(G-7)
使用步驟(7-1c)中合成之糖鏈3 (200mg)及甲基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(655mg，50當量)，而以與「G-10的合成方法1」所記載之步驟(7-5-1)同樣的方法，得到G-7 (64.9mg)。 ESI-MS：C101H172N14O66的計算值：[M+2H] 2+1319.5340(最豐質量)，實測值1319.5292
(實施例7-3) 糖鏈給予體的合成(G-8)
使用步驟(7-1c)中合成之糖鏈3 (100mg)及2-(啉-4-基)-2-側氧乙基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(194mg，20當量)，而以與「G-10的合成方法1」所記載之步驟(7-5-1)同樣的方法，得到G-7 (32.0mg)。 ESI-MS：C106H179N15O68的計算值：[M+2H] 2+1376.0578(最豐質量)，實測值1376.0525
(實施例7-4) 糖鏈給予體的合成(G-9)
除了使用SG-A (30mg)作為原料以外，係以與「G-10的合成方法2」所記載之步驟(7-5-2b)同樣的方法，得到G-9 (23.8mg)。 ESI-MS：C110H188N18O70的計算值：[M+2H] 2+1441.5925(最豐質量)，實測值1733.78。
(實施例7-6) 糖鏈給予體的合成(G-11)
使用步驟(7-1c)中合成之糖鏈3 (200mg)及丙基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(733mg，50當量)，而以與「G-10的合成方法1」所記載之步驟(7-5-1)同樣的方法，得到G-11 (80.9mg)。 ESI-MS：C103H176N14O66的計算值：[M+2H] 2+1333.5496(最豐質量)，實測值1333.5471
(實施例7-7) 糖鏈給予體的合成(G-12)
使用步驟(7-1c)中合成之糖鏈3 (200mg)及3-甲氧基丙基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(816mg，50當量)，而以與「G-10的合成方法1」所記載之步驟(7-5-1)同樣的方法，得到G-12 (70.0mg)。 ESI-MS：C104H178N14O67的計算值：[M+2H] 2+1348.5549(最豐質量)，實測值1348.5491
(實施例7-8) 糖鏈給予體的合成(G-13)
使用步驟(7-1c)中合成之糖鏈3-1 (150mg)及甲基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(569mg，50當量)，而以與「G-14的合成方法1」所記載之步驟(7-9-1)同樣的方法，得到G-13 (50.0mg)。 ESI-MS：C82H139N9O56的計算值：[M+2H] 2+1073.9226(最豐質量)，實測值1073.9198
(實施例7-10) [N 3-PEG(3)] 2-SGP-PEG(3)-N 3(糖鏈給予體G-15)的合成 (7-10a) SGP-tri-Fmoc體的合成
[胺基的Fmoc保護] 對SGP (200mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2.1ml)/蒸餾水(0.7ml)混合溶液加入N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰氧基]琥珀醯亞胺(188mg，0.56mmol)、N,N-二異丙基乙胺(0.12ml，0.70mmol)，於室溫攪拌30分鐘。
[粗純化] 反應結束後，將反應液移至預先加入有二乙醚(30ml)的離心管(50ml)。利用小型離心機(日立工機，CF16RX II)而分離為2層，除掉上澄液。重複此操作2次。接著，加入甲醇(2ml)，加入乙酸乙酯(20ml)，使用小型離心機(日立工機，CF16RX II)使固態物沉澱，除掉上澄液。重複此操作2次。接著，於以適量的二乙醚洗淨固態物之後，減壓下進行乾燥，得到包含標的化合物之固態物(412mg)。不再進行純化而用於以下的反應。 ESI-MS：C157H219N15O76的計算值：[M+3H] 3+1178.13(最豐質量)，實測值1178.13。
(7-10b) [N 3-PEG(3)] 2-SGP-PEG(3)-N 3(糖鏈給予體G-15)的合成
[縮合反應] 對步驟(7-10a)中所得之固態物(412mg)、與六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(243mg，0.47mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(6.7ml)混合液加入11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(127mg，0.58mmol)N,N-二甲基甲醯胺(1.6ml)溶液、與N,N-二異丙基乙胺(0.18ml，1.40mmol)，在37℃攪拌1.5小時後，於室溫攪拌19小時。
[粗純化] 反應結束後，將反應液(2.5mL)移至預先加入有二乙醚(35ml)的離心管(50ml)。利用小型離心機(日立工機，CF16RX II)使固態物沉澱，除掉上澄液。重複此操作至沒有反應液為止。接著，加入甲醇(3ml)，以刮勺將沉澱物搗碎。然後，加入乙酸乙酯(30ml)，於使固態物析出之後，利用小型離心機(日立工機，CF16RX II)使固態物沉澱，除掉上澄液。重複此操作3次。接著，於以適量的二乙醚洗淨固態物之後，減壓下進行乾燥，得到固態物。
[Fmoc基的去保護] 對上述固態物加入N,N-二甲基甲醯胺(5.0ml)與哌啶(0.35ml)，於37℃攪拌4小時。然後，加入N,N-二甲基甲醯胺(3.3ml)，於室溫攪拌16小時。
[粗純化] 反應結束後，將反應液(2.5mL)移至預先加入有二乙醚(35ml)的離心管(50ml)。利用小型離心機(日立工機，CF16RX II)使固態物沉澱，除掉上澄液。重複此操作至沒有反應液為止。接著，加入甲醇(8ml)，以刮勺將沉澱物搗碎。然後，加入乙酸乙酯(16ml)，於使固態物析出之後，利用小型離心機(日立工機，CF16RX II)使固態物沉澱，除掉上澄液。重複此操作2次。接著，於以適量的二乙醚洗淨固態物之後，減壓下進行乾燥，得到固態物。
[純化] 使所得之固態物溶解於0.1%三氟乙酸水溶液中。以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液為溶析液，且於裝置使用Purif-Rp2 (Shoko Scientific製)，於管柱使用Inertsil ODS-3 (GL Sciences製)。將包含洗提中被UV檢測(220nm)出的標的物之流分冷凍乾燥。再一次溶解於蒸餾水中，於冷凍乾燥前，加入適量的氨水，確認非酸性，再進行冷凍乾燥，得到呈冷凍乾燥粉末之標的化合物G-15 (90mg)。 ESI-MS：C136H237N27O76的計算值：[M+2H] 2+1733.78(最豐質量)，實測值1733.78。
(實施例7-11) 糖鏈給予體原料(糖鏈原料8-1、糖鏈原料8-2、糖鏈原料8-3)之混合液的製備
(7-11a) [水解反應及N-Boc化] 將SGP (G-1) (10.0g)溶解於純淨水(100mL)中，一邊以pH計確認，一邊加入鹽酸(1N)，調整為pH2.4之後，將溫度保持在60℃，攪拌3小時。冷卻至室溫之後，一邊以pH計確認，一邊加入氫氧化鈉水溶液(1N)，調整為pH7.5。對於此溶液的5分之1量，將二碳酸第三丁酯(708mg)溶解於四氫呋喃(6mL)而加入之後，加入氫氧化鈉水溶液(1N)，調整為pH12，攪拌2小時。進一步加入二碳酸第三丁酯(359mg)，加入氫氧化鈉水溶液(1N，2.3mL)，進一步攪拌3小時。加入鹽酸(1N)，調整為pH8，得到包含糖鏈原料7-1、糖鏈原料7-2、糖鏈原料7-3、糖鏈原料7-4的溶液。
(7-11b) [縮合] 對於步驟(7-11a)中所得之包含糖鏈原料7-1、糖鏈原料7-2、糖鏈原料7-3、糖鏈原料7-4的溶液的2分之1量，加入DMF (10mL)之後，加入乙腈(10mL)，重複將乙腈減壓蒸餾之操作4次，進行脫水操作。對所得之DMF溶液加入11-疊氮-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.46g)，冷卻至0℃。接著，加入六氟磷酸1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯啶基鏻(1.09g)之後，於室溫攪拌1小時，得到包含糖鏈原料8-1、糖鏈原料8-2、糖鏈原料8-3、糖鏈原料7-4的溶液。
(實施例7-12) 糖鏈給予體的合成(G-16)
(7-12a) [糖鏈轉換反應] 將步驟(7-11b)中所得之包含糖鏈原料8-2之混合物的溶液，使用Amicon Ultra-15, 3kDa (Merck)而取代為磷酸緩衝液(9.2mL，pH6.7，0.2mol/L)。對此溶液加入4-甲氧基苯基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(280mg，7當量)、甲苯(1.2mL)、Endo-Rp N172Q (2.6mg)，將溫度保持在50℃，攪拌150小時。
(7-12b) [純化] 針對步驟(7-12a)中所得之此反應液的3分之1，以乙腈與水為溶析液，且於管柱使用X-Bridge C18 (Waters公司製)，而進行分離純化。對藉由UV檢測(210nm)所檢測到的標的物之波峰，進行減壓濃縮。將此濃縮液冷凍乾燥，得到呈白色粉末之標的化合物G-16 (16.3mg)。 ESI-MS：C88H143N9O57的計算值：[M+2H] 2+1119.94(最豐質量)，實測值1119.93
(實施例7-13) 糖鏈給予體的合成(G-6)
(7-13) [糖鏈交換反應] 使用步驟(7-1c)中所得之糖鏈原料3 (100mg)及4-甲氧基苯基 2-(乙醯胺基)-2-去氧-β-D-葡萄哌喃糖苷(182mg，20當量)，而以與「G-10的合成方法1」所記載之步驟(7-5-1)同樣的方法，得到G-6 (35mg)。 ESI-MS：C107H176N14O67的計算值：[M+2H] 2+1365.55(最豐質量)，實測值1365.54
直接糖鏈轉移反應以本次所想到的圖1所示形式進行之情形，認為若是酵素-B會辨識之2分支糖鏈結構，則沒有將非還原末端側的結構限定於N連結型之必要，任意之結構下目標反應皆會進行。例如，可利用以下或圖2所示結構作為糖鏈給予體。
於是，在以下之實施例，適宜使用下述糖鏈衍生物。
[表10] 表Z6.　糖鏈給予體
糖鏈 給予體 結構 製作方法
G-1 SGP WO2017110984的實施例1所記載的方法、或WO2014208742的實施例1
G-2 AG(9)P WO2014115797的實施例1-17之步驟1-17A
G-3 X-SG-Asn WO2018003983的實施例1-12、步驟1-12A
G-4 X-MSG1-Asn WO2019065964的實施例154之步驟3
G-5 X-MSG2-Asn WO2019065964的實施例154之步驟3
G-6 X-SG-OPMP 實施例7-13
G-7 X-SG-OMe 實施例7-2
G-8 X-SG-OA-Mor 實施例7-3
G-9 X-SG-OA-PEG(3)-N 3 實施例7-4
G-10 X-SG-OiPr 實施例7-5
G-11 X-SG-OnPr 實施例7-6
G-12 X-SG-OPrOMe 實施例7-7
G-13 X-MSG1-OMe 實施例7-8
G-14 X-MSG1-OiPr 實施例7-9
G-15 X-SGP 實施例7-10
G-16 X-MSG1-OPMP 實施例7-12
G-17 AG(7)P WO2014115797的實施例1-17之步驟1-17B
(上述表中Ⅹ表示N 3-PEG(3))
＜實施例8＞「步驟1」的反應條件：抗體濃度 於使用一般被廣泛使用的糖鏈給予體、化學性地合成之唑啉體之情形，有報告：為非Endo酵素媒介型之化學反應的糖化(Glycation)對於抗體中的Lys變得容易進行。進而，為了抑制此副反應，而推薦在弱酸性(pH6.50)進行反應，且重複添加唑啉體溶液來進行反應、亦即稀釋反應液(Ref. Bioconjugate Chemistry 2019 30(5), 1343-1355)。此報告中，反應液中的抗體濃度被設定於40μM以下。又，於關於使用化學性地合成之唑啉體的糖鏈轉移反應之詳細程序的報告中，關於濃度亦記載「最終濃度：Herceptin=10mg/ml」(Ref. Nature Protocols volume 12, pages 1702-1721 (2017))。如此地，減少反應總液量、亦即所謂以高濃度抗體溶液實施糖鏈轉移反應的構想，於對抗體的糖鏈轉移反應中並不常見。 另一方面，直接糖鏈轉移反應以本次所想到的圖1所示形式進行之情形，減少反應溶液的總量、亦即以分子間的接觸頻率升高之條件在高濃度下進行反應係非常有效。即使將表Z6所代表之安定的糖鏈給予體與抗體以高濃度混合，為化學反應之一種的糖化(Glycation)亦不會發生。這是因為圖1中之「步驟1」的反應條件，並不添加成為上述副反應之原因的化學性地合成之唑啉體溶液。 可適應於本發明中之製造方法的反應系中的接受體分子(例如，抗體)濃度並不限定，但實施例8中，為了確認與反應系中的接受體分子(抗體)濃度無關地在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體，而將系內的抗體濃度設定為20mg/mL～80mg/mL。
(實施例8-1) 反應系中抗體濃度20mg/mL之情形 [糖鏈轉移反應標準程序(standard protocol) 1] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(20當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為300μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。 依照糖鏈轉移反應標準程序1，進行糖鏈轉移反應，準備採樣液。此處，使用參考例1中準備的接受體分子溶液1-1。使用實施例2中準備的酵素-A溶液(Si-001-2)、或實施例5中準備的酵素-A溶液(S-001)的任一個。使用實施例3中準備的酵素-B溶液(Rp-001-2)。使用依照表Z6而準備的糖鏈給予體G-1、G-3、或G-4的任一個。因應各實驗中所使用的糖鏈給予體之結構，而以下之示意圖或圖3所示糖鏈轉移反應會進行。
[使用LabChip分析的糖鏈轉移率測定] 若依照前述之方法將採樣液進行LabChip分析，則從該電泳圖可確認未反應物與糖鏈轉移體為分離之波峰。藉由下述算式，從未反應物與糖鏈轉移體的波峰面積比算出糖鏈轉移率。 糖鏈轉移率(%)=〔[源自糖鏈轉移抗體之H鏈的波峰面積]/{[源自未反應物之H鏈波峰面積]+[源自糖鏈轉移抗體之H鏈的波峰面積]}〕×100
對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z7.)。
[表11] 表Z7
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
8-1-1 mAb1 (20) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 7.3 12.5 18.0 24.7 80.2 88.4
8-1-2 mAb1 (20) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 7.6 19.5 31.6 44.9 88.3 89.3
8-1-3 mAb1 (20) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 11.1 26.3 45.1 59.9 96.3 96.2
8-1-4 mAb1 (20) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 4.7 12.1 18.8 23.0 68.0 76.8
8-1-5 mAb1 (20) G-3 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 4.5 10.8 18.9 26.0 70.2 73.1
8-1-6 mAb1 (20) G-4 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 7.4 14.4 21.5 29.1 64.1 66.1
8-1-7 mAb1 (20) G-1 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 15.4 32.8 49.4 65.1 ＞99.9 96.5
8-1-8 mAb1 (20) G-3 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 16.8 39.2 59.4 73.7 88.6 87.7
8-1-9 mAb1 (20) G-4 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 24.0 49.4 68.3 80.3 89.0 87.9
因應使用之酵素-A的潛在能力，而有如實施例8-1-4、實施例8-1-5、實施例8-1-6般地糖鏈轉移率至28小時為止不超過80%之情形。此種情形，可預料若增加使用之糖鏈給予體量，則轉移效率會改善。實施例8-1-7、實施例8-1-8、實施例8-1-9中，係各自於實施例8-1-4、實施例8-1-5、實施例8-1-6中所使用的[糖鏈轉移反應標準程序1]中將糖鏈給予體由20當量變更為40當量。如所預料地，糖鏈轉移率改善。如此地，可知欲不改變酵素之組合且不改變最終抗體濃度地改善糖鏈轉移率之情形，只要將糖鏈給予體量加倍即可。
(實施例8-2) 反應系中抗體濃度40mg/mL之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序2來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序2] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(20當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為150μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。
與(實施例8-1)同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z8)。
[表12] 表Z8
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
8-2-1 mAb1 (40) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 17.9 35.4 57.7 74.7 98.7 99.2
8-2-2 mAb1 (40) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 18.2 44.3 66.2 79.8 94.1 93.8
8-2-3 mAb1 (40) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 19.8 48.6 71.4 86.3 97.3 97.0
8-2-4 mAb1 (40) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 11.7 24.0 36.1 49.4 96.0 96.3
8-2-5 mAb1 (40) G-3 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 13.1 33.0 52.4 67.9 88.3 86.6
8-2-6 mAb1 (40) G-4 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 18.6 39.4 58.0 72.0 85.7 83.7
(實施例8-3) 反應系中抗體濃度60mg/mL之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序3來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序3] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(20當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為100μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。
與實施例8-1同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z9)。
[表13] 表Z9
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
8-3-1 mAb1 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 22.2 62.4 75.2 90.5 98.8 99.2
8-3-2 mAb1 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 29.8 64.5 83.7 91.4 95.1 94.4
8-3-3 mAb1 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 36.8 78.6 95.3 98.5 98.1 97.6
8-3-4 mAb1 (60) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 17.7 39.6 60.6 77.5 97.7 97.9
8-3-5 mAb1 (60) G-3 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 25.9 60.3 81.4 89.8 90.3 88.6
8-3-6 mAb1 (60) G-4 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 33.3 67.7 85.7 91.3 89.4 86.4
(實施例8-4) 反應系中抗體濃度80mg/mL之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序4來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序4] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(20當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為75μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。但是，此處，使用參考例1中準備的接受體分子溶液1-2。
與(實施例8-1)同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z10)。
[表14] 表Z10
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
8-4-1 mAb1 (80) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 25.4 57.2 82.9 95.5 98.7 99.0
8-4-2 mAb1 (80) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 49.9 84.7 94.1 96.3 95.7 95.1
8-4-3 mAb1 (80) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 64.6 96.6 99.0 98.8 98.1 ＞99.9
8-4-4 mAb1 (80) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 28.1 62.0 85.5 96.0 98.2 97.3
8-4-5 mAb1 (80) G-3 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 42.9 81.7 92.7 94.2 90.7 88.6
8-4-6 mAb1 (80) G-4 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 48.0 84.9 93.3 94.2 89.8 87.3
實施例8中，係在代表性的酵素與代表性的糖鏈給予體之組合，主要將糖鏈給予體量固定於20當量，而確認至28小時為止的糖鏈轉移率。在所有的酵素之組合之情形皆可知：反應系內的最終抗體濃度越高，則糖鏈轉移率變得越高。又，可確認：與反應系中的抗體濃度無關地在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體。
＜實施例9＞「步驟1」的反應條件：糖鏈當量 可適應於本發明中之製造方法的反應系中的抗體濃度並不限定，但實施例9中，為了確認與加入反應系中的糖鏈予體分子之量無關地在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體，而將加入系內的糖鏈當量設定為10當量～40當量。
(實施例9-1) 對於抗體使用10當量之糖鏈之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序5來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序5] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(10當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為100μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。
此處，使用參考例1中準備的接受體分子溶液1-1。使用實施例2中準備的酵素-A溶液(Si-001-2)、或實施例5中準備的酵素-A溶液(S-001)的任一個。使用實施例3中準備的酵素-B溶液(Rp-001-2)。使用依照表Z6而準備的糖鏈給予體G-1、G-3、或G-4的任一個。因應各實驗中所使用的糖鏈給予體之結構，而前述之圖3的糖鏈轉移反應會進行。
與實施例8-1同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z11)。
[表15] 表Z11
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
9-1-1 mAb1 (60) G-1 (10eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 7.6 16.4 24.4 31.5 84.3 90.5
9-1-2 mAb1 (60) G-3 (10eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 9.8 22.2 35.9 48.4 88.6 89.6
9-1-3 mAb1 (60) G-4 (10eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 13.4 29.0 48.7 61.7 96.2 96.1
9-1-4 mAb1 (60) G-1 (10eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 5.0 13.1 19.3 26.2 72.6 79.7
9-1-5 mAb1 (60) G-3 (10eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 7.8 18.9 31.4 43.5 81.4 82.0
9-1-6 mAb1 (60) G-4 (10eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 9.7 23.2 35.8 48.7 82.1 81.9
9-1-7 mAb1 (80) G-1 (10eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 14.0 26.3 38.4 50.6 93.8 94.3
如實施例9-1-4般地糖鏈轉移率至28小時為止不超過80%之情形，可預料若提高最終抗體濃度，則轉移率會改善。於是，實施例9-1-7中，係在實施例8-4中所使用的[糖鏈轉移反應標準程序4]以由糖鏈給予體(20當量)變更為糖鏈給予體(10當量)之條件進行反應。如所預料地，糖鏈轉移率改善。如此地，欲不改變糖鏈當量數地改善糖鏈轉移率之情形，若提高反應系內的最終抗體濃度即可。
(實施例9-2) 對於抗體使用30當量之糖鏈之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序6來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序6] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(30當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為100μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。
與實施例8-1同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z12)。
[表16] 表Z12
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
9-2-1 mAb1 (60) G-1 (30eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 50.5 89.2 99.0 99.2 99.3 99.3
9-2-2 mAb1 (60) G-3 (30eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 68.1 92.8 96.8 97.3 96.1 95.7
9-2-3 mAb1 (60) G-4 (30eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 78.4 98.7 98.9 98.8 98.3 98.2
9-2-4 mAb1 (60) G-1 (30eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 39.5 79.9 96.6 98.5 98.3 98.3
9-2-5 mAb1 (60) G-3 (30eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 62.0 93.4 96.2 96.0 93.0 92.3
9-2-6 mAb1 (60) G-4 (30eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 62.8 94.9 96.8 96.6 94.2 93.6
(實施例9-3) 對於抗體使用40當量之糖鏈之情形 依照糖鏈轉移反應標準程序7來代替糖鏈轉移反應標準程序1，而與實施例8-1同樣地進行，進行糖鏈轉移反應，使用LabChip分析測定糖鏈轉移率。
[糖鏈轉移反應標準程序7] 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)、糖鏈給予體(40當量)、酵素-A (1.6～1.7%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為100μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。
與實施例8-1同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z13)。
[表17] 表Z13
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
9-3-1 mAb1 (60) G-1 (40eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 78.1 99.4 99.6 99.5 99.5 ＞99.9
9-3-2 mAb1 (60) G-3 (40eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 88.4 97.4 97.9 97.8 96.5 96.1
9-3-3 mAb1 (60) G-4 (40eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 95.0 98.9 98.9 98.8 98.0 98.5
9-3-4 mAb1 (60) G-1 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 65.7 98.0 99.0 99.0 98.6 98.5
9-3-5 mAb1 (60) G-3 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 88.2 97.2 96.9 96.5 93.7 93.0
9-3-6 mAb1 (60) G-4 (40eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 89.5 97.5 97.1 96.8 94.6 94.1
實施例9中，係在代表性的酵素與代表性的糖鏈給予體之組合，主要將反應系內的最終抗體濃度固定於60mg/mL，且變更糖鏈給予體量，藉此確認至28小時為止的糖鏈轉移率。在所有的酵素之組合之情形都確認：糖鏈給予體用量越高，則糖鏈轉移率變得越高。又，可確認：與加入反應系中的糖鏈當量無關地在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體。 從實驗例8與實驗例9來看，在「步驟1」中，藉由適宜調節糖鏈給予體用量與反應系內最終抗體濃度，而可達成高糖鏈轉移率。 接著，於以下，實施例10中，係主要固定糖鏈給予體用量(20當量)與反應系內最終抗體濃度(60mg/mL)，確認可利用之糖鏈給予體之結構與酵素之組合。
＜實施例10＞「步驟1」的反應條件：酵素-A與酵素-B之組合 依照(實施例8-3)中所使用的糖鏈轉移反應標準程序3，進行糖鏈轉移反應，與(實施例8-1)同樣地進行，使用LabChip分析而測定糖鏈轉移率。 此處，係以表Z14所記載之組合，適宜地區別使用接受體分子溶液、酵素-A溶液、酵素-B溶液、及糖鏈給予體。具體而言，使用參考例1至參考例3中準備的接受體分子溶液1-1、2-1、2-2、或3-1之任意一個。使用實施例2、或實施例5中準備的酵素-A溶液之任意一個。使用實施例3、或實施例6中準備的酵素-B溶液之任意一個。使用依照表Z6而準備的糖鏈給予體G-1至G-17之任意一個。因應各實驗中所使用的糖鏈給予體之結構，而以下之示意圖或圖4的糖鏈轉移反應會進行。
與(實施例8-1)同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1、或(Fucα1,6)GlcNAc-mAb2、或(Fucα1,6)GlcNAc-mAb3的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z14)。
[表18] 表Z14
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
10-1 mAb1 (60) G-2 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 65.3 97.0 99.1 98.8 98.6 98.7
10-2 mAb1 (60) G-5 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 60.6 91.2 96.8 97.5 96.4 96.2
10-3 mAb1 (60) G-14 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 22.0 53.1 76.6 91.3 98.3 98.4
10-4 mAb1 (60) G-16 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 44.3 85.4 97.7 98.6 98.4 98.6
10-5 mAb1 (60) G-17 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 92.1 97.1 96.9 96.2 92.3 91.8
10-6 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 39.2 36.6 62.2 81.6 99.3 99.3
10-7 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172V 27.5 60.5 82.3 92.6 98.0 97.7
10-8 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172Q 16.7 38.3 59.5 75.5 97.3 97.3
10-9 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q 80.3 94.6 96.9 97.3 95.8 95.5
10-10 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q Y217F 29.3 65.7 88.8 97.0 99.0 99.4
10-11 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 19.2 44.0 67.7 84.9 97.7 97.5
10-12 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241M Endo-Rp N172H 20.6 47.3 70.7 85.0 94.4 93.7
10-13 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241QE360Q Endo-Rp N172H 19.5 46.1 70.8 88.4 98.8 98.6
10-14 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241ME360Q Endo-Rp N172H 20.8 48.2 73.2 89.4 97.7 97.4
10-15 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241QQ311L Endo-Rp N172H 17.0 39.1 60.1 79.8 99.1 99.4
10-16 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 11.9 29.5 48.1 65.1 97.2 97.0
10-17 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172V 24.5 56.8 80.2 91.7 96.5 96.3
10-18 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172Q 14.9 35.7 56.7 72.9 95.7 95.3
10-19 mAb2 (60) G-1 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172V Y214F 24.3 56.5 81.3 93.5 97.8 97.7
10-21 mAb2 (60) G-2 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 60.2 93.0 97.8 97.9 97.4 97.3
10-22 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 32.0 68.5 85.7 91.9 94.0 93.2
10-23 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172V 38.7 66.0 77.2 82.4 83.8 81.7
10-24 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172Q 34.0 61.1 73.1 78.2 81.1 78.8
10-25 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q 65.9 79.1 82.9 84.0 75.8 73.1
10-26 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q Y217F 29.9 64.2 81.8 89.2 92.7 92.0
10-27 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 35.0 72.4 88.7 92.0 88.9 85.7
10-28 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241M Endo-Rp N172H 34.6 66.9 80.8 84.3 77.6 74.2
10-29 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241QE360Q Endo-Rp N172H 37.7 77.7 91.9 94.2 91.1 89.6
10-30 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241ME360Q Endo-Rp N172H 38.3 75.7 87.7 89.5 83.7 81.0
10-31 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241QQ311L Endo-Rp N172H 27.2 56.5 74.7 84.7 94.3 93.6
10-32 mAb2 (60) G-3 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 22.0 52.5 72.7 84.0 89.7 88.5
10-33 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 44.6 83.3 96.6 98.1 97.5 97.1
10-34 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172V 56.0 86.5 93.9 95.2 92.5 91.4
10-35 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172Q 56.9 85.6 92.8 94.2 91.0 89.8
10-36 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q 83.9 91.6 92.6 92.3 83.8 81.2
10-37 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q Y217F 57.8 92.5 98.0 98.3 97.4 96.9
10-38 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 35.4 70.0 84.2 87.7 78.0 76.1
10-39 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241M Endo-Rp N172H 27.0 49.3 59.3 62.3 58.2 54.4
10-40 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241QE360Q Endo-Rp N172H 46.2 83.6 91.9 92.6 88.1 85.7
10-41 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241ME360Q Endo-Rp N172H 32.5 56.4 64.9 68.1 63.8 59.6
10-42 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241QQ311L Endo-Rp N172H 45.0 88.5 98.0 98.7 97.9 97.7
10-43 mAb2 (60) G-4 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 28.1 61.4 81.6 90.2 89.4 88.1
10-44 mAb2 (60) G-5 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 69.4 93.6 97.1 97.6 96.1 95.4
10-45 mAb2 (60) G-6 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 17.7 53.7 79.9 91.7 98.2 98.0
10-46 mAb2 (60) G-6 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-M N175Q Y217F 9.6 23.5 39.1 54.1 94.5 95.1
10-47 mAb2 (60) G-6 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 16.2 41.7 63.6 79.0 93.2 92.4
10-48 mAb2 (60) G-7 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 1.2 3.3 7.1 11.3 65.5 73.8
10-49 mAb2 (60) G-8 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 9.8 35.8 60.9 79.5 97.9 97.6
10-50 mAb2 (60) G-8 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 9.4 23.1 38.0 52.0 89.7 89.9
10-51 mAb2 (60) G-9 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 28.4 71.8 91.1 96.8 98.1 98.0
10-52 mAb2 (60) G-9 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 21.1 51.8 73.9 85.9 92.5 91.8
10-53 mAb2 (60) G-10 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 9.8 32.6 59.8 78.8 98.1 98.0
10-54 mAb2 (60) G-10 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 9.3 23.3 38.4 54.1 90.5 90.5
10-55 mAb2 (60) G-11 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 4.6 12.9 27.1 43.7 95.9 96.8
10-56 mAb2 (60) G-11 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 6.2 15.2 25.1 35.9 85.4 87.3
10-57 mAb2 (60) G-12 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 4.1 13.7 28.8 45.6 96.4 97.0
10-58 mAb2 (60) G-12 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 6.5 16.0 26.7 38.3 86.7 88.1
10-59 mAb2 (60) G-13 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 9.9 10.6 16.3 23.8 70.4 77.7
10-60 mAb2 (60) G-14 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 24.2 50.7 74.5 90.0 97.9 97.7
10-61 mAb2 (60) G-14 (20eq.) Endo-S D233QE350Q Endo-Rp N172H 14.3 35.4 56.2 72.4 93.0 92.5
10-62 mAb2 (60) G-15 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 20.4 46.4 66.9 80.4 93.9 93.9
10-63 mAb2 (60) G-16 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 41.0 77.0 94.1 97.3 97.1 97.0
10-64 mAb2 (60) G-17 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 88.8 94.3 94.1 93.3 87.5 86.4
10-65 mAb3 (60) G-1 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 9.3 24.6 44.8 63.8 99.3 99.5
10-66 mAb3 (60) G-2 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 44.8 80.0 96.0 98.0 97.8 97.6
10-67 mAb3 (60) G-3 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 22.4 56.9 81.1 91.7 96.9 96.5
10-68 mAb3 (60) G-4 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 34.6 76.6 95.9 99.0 98.9 98.7
10-69 mAb3 (60) G-5 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 59.0 90.5 96.9 97.8 96.7 96.4
10-70 mAb3 (60) G-13 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 4.0 8.2 13.3 18.8 67.0 76.3
10-71 mAb3 (60) G-14 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 18.1 44.2 67.6 85.4 98.5 98.3
10-72 mAb3 (60) G-15 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 14.7 35.4 55.1 70.5 94.5 94.5
10-73 mAb3 (60) G-16 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 33.3 69.9 91.2 97.4 97.6 97.4
10-74 mAb3 (60) G-17 (20eq.) Endo-Si D241MQ311L Endo-Rp N172H 86.2 94.9 95.1 94.9 91.2 90.3
實施例10中可確認：比較可利用之糖鏈給予體之結構與酵素之組合，於任一組合中都在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體。
(酵素-A的殘留水解活性) 直接糖鏈轉移反應以本次所想到的圖1所示形式進行之情形，認為若「步驟1」中使用的酵素-A殘留有水解活性，則例如於mAb-[X-MSG1] 2為標的物之情形，以下之示意圖或圖5的水解反應會競爭。亦即，使用之酵素-A的殘留水解活性與野生型酵素為同等或其以上之情形，表觀上的糖鏈轉移率變低。
作為「步驟1」中可使用之酵素，可任意地選擇Endo-S變異體、Endo-S2變異體、及Endo-Si變異體。為了使作為任意之變異體的較佳殘留水解活性之程度的指標明確，而實施實施例11之實驗。
(實施例11) mAb2-[MSG1-N 3] 2的水解
[水解反應標準程序1] 加入mAb2-[MSG1-N 3] 2(0.2mg)、與酵素-A (2.0%w/w)、適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為21μL，且在30℃進行反應24小時。於反應開始後4小時與24小時進行採樣。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。 此處，依照水解反應標準程序1，而進行水解，準備採樣液。此處，使用參考例7中準備的抗體溶液7-1。使用實施例2、實施例4、或實施例5中準備的酵素-A溶液之任意一個。
[使用LabChip分析的糖鏈轉移率測定] 若依照前述之方法將採樣液進行LabChip分析，則從該電泳圖可確認未反應物與水解物為分離之波峰。藉由下述算式，從未反應物與水解物的波峰面積比算出水解率。 水解率(%)=〔[源自水解物之H鏈的波峰面積]/{[源自未反應物之H鏈波峰面積]+[源自水解物之H鏈的波峰面積]}〕×100
對於用於mAb2-[MSG1-N 3] 2的各反應條件，算出各反應時間之水解率(表Z15)。
[表19] 表Z15
實施例 酵素-A 反應液pH、溫度 水解率(%)
4h 24h
11-1 Endo-Si D241MQ311L 7.25、30℃ 10.1 21.2
11-2 Endo-Si D241Q 7.25、30℃ 42.9 96.6
11-3 Endo-Si D241Q E360Q 7.25、30℃ 31.4 71.2
11-4 Endo-Si D241M 7.25、30℃ 87.0 99.3
11-5 Endo-Si D241Q Q311L 7.25、30℃ 8.4 22.6
11-6 Endo-Si D241M E360Q 7.25、30℃ 73.1 ＞99.9
11-7 Endo-S D233Q E350Q 7.25、30℃ 9.0 54.0
11-8 Endo-S2 D184M 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
11-9 Endo-S2 T138Q 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
11-10 Endo-Si WT 7.25、30℃ 98.4 99.7
11-11 Endo-S WT 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
11-12 Endo-S2 WT 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
「步驟1」中可期待高糖鏈轉移率之酵素，係於反應開始4小時之時間點，可確認相較於其野生型酵素而水解率低。又，於反應開始24小時之時間點，相較於其野生型酵素而大致多為水解率低者，但其中亦包含顯示同等之水解率的變異體。 在另一方面，有報告：Endo-S2 D184M和Endo-S2 T138Q於使唑啉體為糖鏈給予體之情形，糖鏈轉移率變高。然而，在唑啉體不存在下，與糖鏈轉移抗體進行反應之情形，於反應開始4小時之時間點、及反應開始24小時之時間點，顯示與彼等之野生型酵素幾乎相同的水解活性。
由實施例10、實施例11、及參考例8的結果可知：「步驟1」中使用的酵素係以「反應開始4小時之時間點的水解率小於90%」且「反應開始24小時之時間點的水解率小於99.9%」為指標，而可任意地選擇。
＜實施例12＞確認「步驟1」與「步驟2」之組合的效果 實施例12中，係驗證與「步驟1」之條件無關地在「步驟2」可提升糖鏈轉移率。 可適應於本發明中之製造方法的接受體分子物種(抗體物種)、糖鏈給予體物種、酵素物種並不限定，但以在幾個樣式確認「步驟1」與「步驟2」之組合的效果為目的，而選擇表Z16所記載之組合、亦即糖鏈給予體5種類、抗體3種類、酵素-A 3種類、酵素-B 2種類為代表例。又，將使用之糖鏈給予體量設為10當量、或20當量。
[負載液製備之標準程序1(步驟1)] ＜步驟1＞ 對接受體分子(Fucα1,6)GlcNAc-mAb、10當量、20當量、或60當量之糖鏈予體分子、1.6%(w/w)之酵素-A、及0.2%(w/w)之酵素-B的混合液加入適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，調整反應液量，使抗體的最終濃度成為20mg/mL或60mg/mL。接著，將該反應液保溫在30℃，於反應開始28小時後結束反應。 ＜採樣＞ 反應結束後，以測定糖鏈轉移率為目的，而採樣極微量的反應液，以純淨水稀釋而使抗體濃度成為1mg/mL之後，冷凍保管至LabChip分析開始為止。 ＜負載液之pH、鹽濃度調整＞ 接著，對反應液加入100mM乙酸緩衝液(pH 3.9)、1M氯化鈉水溶液、1M鹽酸、純淨水，而製備管柱負載液。負載液係以抗體濃度成為5mg/mL，且成為與各實驗之管柱平衡液相同的pH及氯化鈉的最終濃度的方式製備。製備負載液後，以確認負載液之糖鏈轉移率為目的，而採樣0.5mL。
此處，係以表Z16所記載之組合，適宜地區別使用接受體分子溶液、酵素-A溶液、及糖鏈給予體。具體而言，使用參考例4中準備的接受體分子溶液4-1、參考例5中準備的接受體分子溶液5-1、或參考例6中準備的接受體分子溶液6-1之任意一個。使用實施例2中準備的酵素-A溶液(Si-001-2)、或實施例5中準備的酵素-A溶液(S-001)之任意一個。使用實施例3中準備的酵素-B溶液(Rp-001-3)、或實施例6中準備的酵素-B溶液(M-002)之任意一個。使用依照表Z6而準備的糖鏈給予體G-1、G-3、G-4、G-10、或G-16之任意一個。
[陽離子交換層析之標準程序1(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱：POROS XS (1ml) (Thermo Fisher製) 流速：0.3ml/min 於將依照負載液製備之標準程序1而準備的負載液約70mL對管柱進行通液(試樣通液)之後，通入平衡液(50mM乙酸緩衝液，445mM氯化鈉水溶液，pH3.8) 15CV(管柱洗淨)。然後，以管柱再生為目的，通入洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉水溶液，pH4.0)) 8CV。於最後，以定位洗淨(CIP)為目的，通入清洗液(50mM乙酸緩衝液，0.5M氫氧化鈉水溶液) 3CV。 標的物係藉由280nm下的吸光度進行檢測，通過液係於50mAU/2mm UV光析管(cell)以上之情形回收，加入1M Tris溶液而調整為pH5.0-5.4，作為通過流分。又，於利用平衡液的管柱洗淨步驟中，係將5CV經通液的洗淨液回收在1個容器中，作為洗淨流分。關於此回收液，以紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)確認抗體濃度，及使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)確認糖鏈轉移率。
[表20] 表Z16
實施例 反應條件 糖鏈轉移率 (%) 產率 (%)
抗體 (濃度) 糖鏈 (當量) 酵素A 酵素B 負載液 通過液 洗淨液 通過液 洗淨液
12-1 mAb-1 (60mg/mL) G-1 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 98.8 99.8 86.5 75.62 3.91
12-2 mAb-2 (60mg/mL) G-1 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 97.9 99.7 99.1 78.27 2.86
12-3 mAb-2 (60mg/mL) G-1 (10eq.) Endo-S D233Q/E350Q Endo-Rp N172H 89.3 98.1 84.0 68.18 2.00
12-4 mAb-2 (60mg/mL) G-3 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 84.7 94.6 81.8 65.54 1.34
12-5 mAb-2 (60mg/mL) G-4 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 92.2 98.9 85.6 68.51 2.52
12-6 mAb-2 (60mg/mL) G-10 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 88.5 96.4 82.7 67.01 1.88
12-7 mAb-2 (60mg/mL) G-16 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 94.9 99.6 93.1 68.88 2.69
12-8 mAb-3 (60mg/mL) G-1 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 97.8 99.6 98.9 75.09 2.65
12-9 mAb-2 (20mg/mL) G-1 (20eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-Rp N172H 93.6 98.5 89.6 73.30 1.67
12-10 mAb-2 (60mg/mL) G-1 (10eq.) Endo-Si D241M/Q311L Endo-M N175Q/Y217F 95.6 99.3 93.7 73.02 2.52
如此處所示，於使用10當量或20當量之糖鏈予體分子而實施「步驟1」之後實施「步驟2」的結果，與「步驟1」中使用之抗體、酵素、糖鏈的種類無關地，可於「步驟2」之通過液中回收糖鏈轉移率較負載液更提升之抗體。據此而顯示：以「步驟1」與「步驟2」之組合，能夠盡可能地以少的糖鏈予體分子用量(40當量以下，較佳為10當量至20當量)而取得高純度之具有均勻的糖鏈結構之含Fc分子。又，確認：如實施例12-2、實施例12-8般地，依條件而在洗淨液中亦可回收糖鏈轉移率較負載液更提升之抗體。所以，認為以提高回收率為目的，而因應必要可混合回收液與洗淨液。
[糖鏈重塑抗體、及接受體分子的質譜分析] 將實施例12中所得之回收液中所包含的糖鏈重塑抗體分子之中代表性的化合物、及各化合物製備中所使用的接受體分子，以下述方法確認。將糖鏈重塑抗體分子在重鏈與輕鏈的複合體之狀態、或經片段化為重鏈與輕鏈之狀態，以分析管柱分離，導入質譜儀。於裝置使用Orbitrap Exploris 240 (Thermo Fisher Scientific Inc製)、Vanquish Flex UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific Inc製)及MAbPac RP (Thermo Fisher Scientific Inc製)(5μm，2.1×50mm)，於移動相A利用水/0.1%甲酸/0.02%三氟乙酸溶液，於移動相B利用乙腈/0.1%甲酸/0.02%三氟乙酸添加溶液，使用移動相A在10分鐘由20%變化至50%的梯度，以流速0.4mL/min、80℃進行分析。
[表21] 表Z17
化合物 標的化合物 ESI-MS
12-1 mAb1-[SG] 2 化合物12-1 (-Lys)之計算質量，M=149872.15：實測值(m/z)，149872.51 (反摺積數據)。
化合物12-1 (-Lys)重鏈之計算質量，M=51509.27：實測值(m/z)，51508.95 (反摺積數據)。
化合物12-1輕鏈之計算質量，M=23442.93 ：實測值(m/z)，23441.83 (反摺積數據)。
12-2 mAb2-[SG] 2 化合物12-2 (-Lys, pyrGlu)之計算質量，M=150208.18：實測值(m/z)，150210.63 (反摺積數據)。
化合物12-2 (-Lys, pyrGlu)重鏈之計算質量，M=51494.07：實測值(m/z)，51493.06 (反摺積數據)。
化合物12-2輕鏈之計算質量，M=23626.14 ：實測值(m/z)，23625.13 (反摺積數據)。
12-6 mAb2-[X-SG] 2 化合物12-6 (-Lys, pyrGlu)之計算質量，M=151008.28：實測值(m/z)，151009.65 (反摺積數據)。
化合物12-6 (-Lys, pyrGlu)重鏈之計算質量，M=51894.13：實測值(m/z)，51893.73 (反摺積數據)。
化合物12-6輕鏈之計算質量，M=23626.14 ：實測值(m/z)，23625.35 (反摺積數據)。
12-7 mAb2-[X-MSG1] 2 化合物12-7 (-Lys, pyrGlu)之計算質量，M=150025.84：實測值(m/z)，150027.12 (反摺積數據)。
化合物12-7 (-Lys, pyrGlu)重鏈之計算質量，M=51402.90：實測值(m/z)，51402.41 (反摺積數據)。
化合物12-7輕鏈之計算質量，M=23626.14 ：實測值(m/z)，23625.21 (反摺積數據)。
12-8 mAb3-[SG] 2 化合物12-8 (-Lys)之計算質量，M=149789.95：實測值(m/z)，149790.65 (反摺積數據)。
化合物12-8 (-Lys)重鏈之計算質量，M=51385.05：實測值(m/z)，51384.65 (反摺積數據)。
化合物12-8輕鏈之計算質量，M=23526.06 ：實測值(m/z)，23525.04 (反摺積數據)。
12-1之接受體分子 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 接受體化合物12-1 (-Lys)之計算質量，M=145864.57：實測值(m/z)，145867.03 (反摺積數據)。
接受體化合物12-1 (-Lys)重鏈之計算質量，M=49505.48：實測值(m/z)，49506.16 (反摺積數據)。
接受體化合物12-1輕鏈之計算質量，M=23442.93 ：實測值(m/z)，23442.45 (反摺積數據)。
12-2、6、7之接受體分子 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 接受體化合物12-2、6、7 (-Lys, pyroGlu)之計算質量，M=146200.60：實測值(m/z)，146204.52 (反摺積數據)。
接受體化合物12-2、6、7 (-Lys, pyrGlu)重鏈之計算質量，M=49490.28：實測值(m/z)，49490.81 (反摺積數據)。
接受體化合物12-2、6、7輕鏈之計算質量M=23626.14 ：實測值(m/z)，23625.74 (反摺積數據)。
12-8之接受體分子 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3 接受體化合物12-8(-Lys)之計算質量，M=145782.37：實測值(m/z)，145784.64 (反摺積數據)。
接受體化合物12-8(-Lys)重鏈之計算質量，M=49381.25：實測值(m/z)，49381.97 (反摺積數據)。
接受體化合物12-8輕鏈之計算質量，M=23526.06 ：實測值(m/z)，23525.89 (反摺積數據)。
於上述中「X」表示N 3-PEG(3)。
＜實施例13＞陽離子交換層析介質的種類的研討 實施例13中確認：實施例12中所示糖鏈轉移率的提升效果並不依賴特定層析介質。此處，係將依照實施例12中所使用的負載液製備之標準程序1而準備的負載液，負載於一般用於抗體製造的陽離子交換層析介質。為了顯示本發明中之方法可適用於粒子狀、膜狀、蜂巢狀等廣泛的陽離子交換層析介質，將各種的介質之中代表性的製品用於實驗，但本發明中之陽離子交換層析介質並不限定於此等。
[陽離子交換層析之標準程序2(步驟2)] 實施例12中所示[陽離子交換層析之標準程序1(步驟2)]之中，將「陽離子交換層析介質」的種類由POROS XS (1ml) (Thermo Fisher製)變更為CEX粒子(POROS HS (1mL，Thermo Fisher製)、SOURCE 15S (1.66mL，Cytiva製)、Eshmuno CP-FT (1mL，Merck製))、CEX膜(Sartobind S (1mL，Sartorius製)、Mustang S (0.86mL，Pall製))、或CEX蜂巢(monolith) (CIM monolith SO3 (1mL，BIA Separations製))。進而，以適於前述介質的操作條件，實施表Z17所示各實驗。即，緩衝液或負載液係對於CEX粒子以接觸時間3分鐘(0.3mL/min或0.55mL/min)的流速，對於CEX膜以5膜體積(MV)/min (5mL/min或4.3mL/min)的流速，對於CEX蜂巢以接觸時間1分鐘(1mL/min)的流速進行通液。將平衡液送液5CV或5～15MV而進行平衡化之後，對於CEX介質而將前述負載液予以負載。負載液係對於POROS HS、Eshmuno CP-FT、Sartobind S、CIM monolish SO3負載約29mL，對於SOURCE 15S負載49mL，對於Mustang S負載25mL。管柱負載液及平衡液之pH係因應使用之擔體而設為pH3.7或pH3.8，鹽濃度係設定在280～445mM之範圍。以5～15CV或15MV的平衡液洗淨管柱之後，以5～8CV或8～50MV的洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉溶液，pH4.0)將CEX介質再生。標的物係藉由280nm下的吸光度進行檢測，通過液係於50mAU/2mm UV光析管以上之情形以每5mL進行區分而回收，將各流分混合為1個之後，加入1M Tris溶液而調整為pH5.0-5.4，作為通過流分。又，於利用平衡液的管柱洗淨步驟中，係將5CV或5MV經通液的洗淨液回收在1個容器中，作為洗淨流分。
[表22] 表Z18
實施例 反應條件 單離條件 糖轉移率 (%)  產率 (%)
抗體 糖鏈 CEX pH 鹽濃度 負載液 通過液 洗淨液 通過液 洗淨液
(濃度) (當量) 介質 (mM)
13-1 mAb-2 G-1 POROS HS 3.8 445 85 96.6 80.1 59.16 4.9
(20mg/mL) (20eq.) (粒子)
13-2 mAb-2 G-1 SOURCE 15S 3.7 280 87.6 96.9 83.7 62.37 4.43
(20mg/mL) (20eq.) (粒子)
13-3 mAb-2 G-1 Eshmuno CP-FT 3.7 320 89.4 91.7 82.5 77.16 5.15
(20mg/mL) (20eq.) (粒子)
13-4 mAb-2 G-1 Sartobind S 3.8 350 87.5 92.5 88.8 63.82 10.36
(20mg/mL) (20eq.) (膜)
13-5 mAb-2 G-1 Mustang S (膜) 3.7 445 97.6 98.4 97.2 70.08 6.14
(60mg/mL) (10eq.)
13-6 mAb-2 G-1 CIM monolith 3.7 445 98.2 98.9 95.2 76.4 5.28
(60mg/mL) (10eq.)
如此處所示，確認：即使於使用實施例12中所使用的層析介質以外的介質之情形，亦可提升糖鏈轉移率。
＜實施例14＞層析操作條件的研討 為了使可期待「步驟2」的糖鏈轉移率提升效果之單離條件明確，而使用2種類的CEX介質，以各種的單離條件處理反應液。
[陽離子交換層析之標準程序3(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱：POROS HS (Thermo Fisher製)、SOURCE 15S (Cytiva製) 單離條件係依照實施例13中所使用的[陽離子交換層析之標準程序2(步驟2)]。但是，pH、及鹽濃度係以表Z19中設定之條件實施各實驗。即，將管柱負載液及平衡液之pH設為pH3.5～5.0，將鹽濃度設為310～500mM之範圍。又，於利用平衡液的管柱洗淨步驟中，係將5CV經通液者中之最初的1CV分回收在容器中，作為洗淨流分。
[表23] 表Z19
實施例 單離條件 糖轉移率 (%) 產率 (%)
CEX 介質 pH 鹽濃度 (mM) 負載液 通過液 洗淨液 通過液 洗淨液
14-1 POROS HS 3.8 460 96.3 99.6 98.0 64.30 4.07
14-2 POROS HS 3.8 480 96.1 99.2 96.1 66.45 4.87
14-3 POROS HS 3.8 490 96.2 99.0 97.2 72.47 3.25
14-4 POROS HS 3.8 500 96.5 98.4 96.7 75.84 3.44
14-5 POROS HS 3.9 480 97.1 97.8 95.9 81.92 2.95
14-6 POROS HS 4.0 460 92.0 92.6 92.8 83.30 3.45
14-7 POROS HS 4.5 460 91.3 91.8 91.7 88.40 6.70
14-8 SOURCE 15S 3.7 310 96.4 98.4 96.6 76.80 4.20
14-9 SOURCE 15S 3.7 320 96.1 98.5 96.3 72.36 6.03
14-10 SOURCE 15S 3.7 330 96.4 97.7 96.1 75.94 5.05
14-11 POROS HS 5.0 460 91.1 90.2 89.9 86.90 2.51
14-12 POROS HS 3.5 460 92.6 99.4 99.3 43.36 0.97
如此處所示，確認：使用任一CEX介質之情形，負載液及平衡液之pH都對糖鏈轉移率的提升效果與產率產生影響。負載液及平衡液之pH越低，糖鏈轉移率的提升效果越高，且伴隨著pH的增加而糖鏈轉移率的提升效果降低。一般而言，在抗體的陽離子交換層析純化，於負載液及平衡液之pH係選擇pH4.5～6.0之範圍(Groenberg A, Optimizing Cation-Exchange Chromatography with High-Throughput Process Development for mAb Purification. Biopharm Int. 2015; 28: 44-47、及Thermo Fisher Scientific. POROS XS and HS 50 chromatography resins. [Internet]. Thermo Fisher Scientific Inc; c2016 [cited 2022 Jan 13]. 3 p. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ Application-Notes/POROS-viral-clearance-CEX-app-note.pdfPOROS XS and HS 50 chromatography resins. Viral clearance capability of cation exchange and recommendations)，但本實驗中，在pH5.0完全見不到糖鏈轉移率的提升效果，為了提升糖鏈轉移率，在較pH5.0低的pH(例如，pH3.5～4.5)的範圍進行單離為重要的。 又，確認與pH同樣地，鹽濃度係對糖鏈轉移率的提升效果與產率產生影響。
＜實施例15＞關於「步驟1」之應用例(酵素、糖鏈予體分子、糖鏈接受體分子) (實施例15a) 實施例15中使用的酵素-A的製備 由實施例11與參考例8暗示：可採用具有適當的水解殘留活性之酵素作為「步驟1」中使用的酵素-A。於是，驗證是否可將已知顯示與Endo-S和Endo-S2同樣的性質之Endo-Se、Endo-Sd、Endo-Sz使用於步驟1。酵素係將編碼對應於序列識別號76～78之基因的質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，且與實施例2、實施例4、實施例5同樣地製備(表Z20)。
[表24] 表Z20.　Endo-S2酵素、Endo-Sd酵素、Endo-Se酵素、及Endo-Sz酵素溶液
酵素-A溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
S2-004 Endo-S2 D184Q Q250L 6.26 0.80
S2-005 Endo-S2 D184M Q250L 7.52 1.10
Sd-001 Endo-Sd WT 9.50 0.43
Se-001 Endo-Se D233M 7.98 0.27
Se-002 Endo-Se WT 8.82 0.30
Sz-001 Endo-Sz D234M 8.11 0.34
Sz-002 Endo-Sz D234M Q304L 7.98 0.31
Sz-003 Endo-Sz WT 8.06 0.26
(實施例15b) mAb2-[MSG1-N 3] 2的水解 為了使作為「步驟1」中可使用之酵素的較佳殘留水解活性之程度的指標明確，而實施表Z21所示實驗。 使用實施例15a中製備的酵素-A，且與實施例11同樣地進行，算出各反應時間之水解率(表Z21)。但是，使用抗體溶液7-2來代替抗體溶液7-1。
[表25] 表Z21
實施例 酵素-A 反應液pH、溫度 水解率(%)
4h 24h
15-1 Endo-S2 D184Q Q250L 7.25、30℃ 15.7 52.1
15-2 Endo-S2 D184M Q250L 7.25、30℃ 22.3 69.3
15-3 Endo-Sd WT 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
15-4 Endo-Se D233M 7.25、30℃ 34.8 ＞99.9
15-5 Endo-Se WT 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
15-6 Endo-Sz D234M 7.25、30℃ 34.1 98.3
15-7 Endo-Sz D234M Q304L 7.25、30℃ 8.4 28.1
15-8 Endo-Sz WT 7.25、30℃ ＞99.9 ＞99.9
(實施例15c)「步驟1」的反應條件：酵素-A與酵素-B之組合 依照(實施例8-2)所記載之[糖鏈轉移反應標準程序2]而實行糖鏈轉移反應，準備採樣液。然後，與(實施例8-1)同樣地進行，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z22)。但是，各實驗中所使用的糖鏈給予體和糖鏈當量、酵素，係適宜地變更為表Z22中標記者。又，實施例15-19至實施例15-21中，係使用參考例22中製備的GlcNAc-mAb4、(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A、(Fucα1,6) GlcNAc-CLCH-A作為接受體分子。
[表26] 表Z22
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
15-9 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 88.0 86.7 84.1 83.0 64.5 59.4
15-10 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S2 T138Q Endo-M N175Q 72.2 73.7 68.4 63.1 33.6 28.7
15-11 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M/Q250L Endo-M N175Q 98.4 99.7 99.8 99.6 99.2 98.8
15-12 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-M N175Q 98.4 99.8 98.4 99.8 99.5 98.9
15-13 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-Se D233M Endo-Rp N172V 34.3 63.8 83.1 91.8 95.2 94.6
15-14 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-Sz D234M Endo-Rp N172V 52.2 87.4 96.5 97.3 96.4 95.9
15-15 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-Sz D234M/Q304L Endo-Rp N172V 40.8 75.0 93.1 98.0 98.2 98.1
15-16 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-Si D241Q/Q311L Endo-Rp N172V 32.4 68.9 89.7 96.8 99.6 99.7
15-17 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-Si D241M Endo-Rp N172V 75.2 97.0 96.9 97.1 95.2 95.2
15-18 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S D233Q/E350Q Endo-Rp N172V 68.3 98.2 99.4 98.6 99.0 98.7
15-19 mAb4 (40) SG-1 (40eq.) Endo-Si D241Q/Q311L Endo-Rp N172V 63.2 91.1 96.6 97.5 97.6 97.5
15-20 Fc-A (40) SG-1 (40eq.) Endo-Si D241Q/Q311L Endo-Rp N172V N.A. N.A. N.A. N.A. 91.2 N.A.
15-21 CLCH (40) SG-1 (40eq.) Endo-Si D241Q/Q311L Endo-Rp N172V N.A. N.A. N.A. N.A. 90.6 N.A.
但是，實施例15-20、及15-21中，僅在反應開始24小時後評價糖鏈轉移率，所以其他的反應時間標記為N.A.。
如此處所示，確認：除了於酵素-A使用Endo-S2 T138Q之情形(實施例15-10)以外，於任一酵素之組合中都在糖鏈轉移反應可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率的抗體。如參考例8中所示，推測使用Endo-S2 T138Q之情形亦可藉由增加糖鏈給予體的用量、導入減少殘留水解活性之變異，而得到中程度以上之糖鏈轉移率的抗體。於本實施例中，係以評價代表性的酵素之組合為目的，而使用Endo-S、Endo-Si、Endo-S2、Endo-Se、Endo-Sz作為酵素-A，但如實施例11所記載，本發明中之酵素-A並不限定於此等，能以殘留水解活性為指標而因應目的來任意地選擇。又，如實施例15-19至實施例15-21所示，使用無岩藻糖抗體、Fc片段、及「組合使可變區缺失而成的僅由恆定區構成的CH與僅由輕鏈的恆定區構成的CL之CLCH」之情形亦可得到中程度(＞80%)以上之糖鏈轉移率。由此已證實：含Fc分子的種類並不限定於抗體，本發明之「步驟1」能夠應用於廣泛的含Fc分子。
(實施例15d) 酵素-A/酵素-B融合蛋白酵素的製備 已知使2個以上的蛋白質或蛋白質片段藉由化學、或基因工學的手法結合而作為1個融合蛋白質發揮功能的方法。例如，於非專利文獻(F Grueninger-Leitch, et al., Protein Sci. 1996, 12, 2617-22、及Emily MK, et al., Protein Eng Des Sel. 2005, 10, 497-501)中報告：使碳水化合物結合模組(carbohydrate-binding module)或者麩胺基硫S-轉移酶作為純化標籤而融合於內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶之例。又，於專利文獻(WO2017137459)中報告：使用將受質選擇性不同的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶彼此予以融合而成的酵素(Endo-S與Endo-H、或Endo-F3與Endo-H之融合蛋白質等)，而以單一步驟從附加有高甘露糖型糖鏈及複合型糖鏈等基本結構不同的糖鏈之抗體得到糖鏈被切斷之抗體的方法。在另一方面，迄今尚未報告以使將糖鏈自糖鏈予體分子轉移至接受體分子的反應效率化為目的而使用融合蛋白質之例。如本說明書所記載，於本發明中，酵素-A與酵素-B只要分別會履行所期望之職責，則亦可於直接或間接地結合之狀態下添加在反應系中。此處，係製備將酵素-B與酵素-A藉由包含連續的胺基酸殘基之連接子鍵結而成的融合蛋白質作為代表，確認反應性。融合蛋白質，係將編碼對應於序列識別號80～81之基因的表現質體導入甲醇利用性酵母之微小歐加鐵酵母，藉此得到生產菌株。利用甲醇誘導之蛋白質的表現中，振盪培養之情形，使用擋板燒瓶而於接種後第1天進行甲醇誘導，於接種後第3天結束培養，且以離心分離將菌體集菌。使用YeastBuster(註冊商標) Protein Extraction Reagent (Merck，71186)而將所集菌之菌體予以破碎，使用Capto Chelating而將已進行離心分離之上清液予以純化。於最後以Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)將緩衝液取代為PBS(-) (FUJIFILM Wako Pure Chemical)，而得到酵素液。
[表27] 表Z23.　酵素-B/酵素-A融合蛋白酵素溶液
酵素溶液 酵素-B/酵素-A 融合蛋白酵素 濃度(mg/mL) 容量(mL)
F-001 [Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L] 8.08 0.38
F-002 [Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L] 8.00 0.36
(實施例15e) mAb2-[MSG1-N 3] 2的水解 為了使作為「步驟1」中可使用之酵素的較佳殘留水解活性之程度的指標明確，而實施表Z24所示實驗。 使用實施例15d中製備的酵素，且與實施例11同樣地進行，算出各反應時間之水解率(表Z24)。
[表28] 表Z24
實施例 酵素-B/酵素-A 融合蛋白酵素 反應液pH、溫度 水解率(%)
4h 24h
15-22 [Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L] 7.25、30℃ 8.7 33.2
15-23 [Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L] 7.25、30℃ 20.4 68.1
(實施例15f) 酵素-B/酵素-A融合蛋白酵素的反應例 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (1mg)、糖鏈給予體(20當量)、酵素-B/酵素-A融合蛋白(3.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為16.7μL，且在30℃進行反應24小時。於反應開始後16小時、18小時、20小時、22小時、24小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。 然後，與(實施例8-1)同樣地進行，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z25)。但是，各實驗中所使用的糖鏈給予體和糖鏈當量、酵素，係適宜地變更為表Z25中標記者。
[表29] 表Z25
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-B/酵素-A 融合蛋白酵素 糖鏈轉移率(%)
16h 18h 20h 22h 24h
15-24 mAb1 (60) G-1 (20eq.) [Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L] 97.6 97.3 97.3 97.3 97.2
15-25 mAb1 (60) G-1 (20eq.) [Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L] 72.4 73.9 74.1 74.4 76.3
如此處所示，使用將酵素-B與酵素-A以胺基酸鍵結而成的融合蛋白質之情形，亦與將2種類的酵素作為不同的分子而添加在步驟1中之情形(實施例10)同樣地，可得到附加有所期望之糖鏈的抗體。又，針對序列識別號79，亦可依照上述順序而與序列識別號80及81的融合蛋白質同樣地製備融合蛋白質。於本實施例中，使用將各個酵素之全長藉由胺基酸直接鍵結而成的融合蛋白質作為代表性的融合蛋白質之例，但本發明中之融合蛋白質並不限定於此。
＜實施例16＞「步驟2」的應用例 (實施例16-1) 使用陽離子-疏水多模樹脂之純化 確認：實施例12中所示糖鏈轉移率的提升效果，係於使用陽離子-疏水多模樹脂之情形亦可得到。 此處，係將依照下述負載液製備之標準程序2而準備的負載液，負載於一般用於抗體製造的陽離子-疏水多模樹脂。將市售之代表性的製品用於實驗，但本發明中之陽離子-疏水多模樹脂並不限定於此等。
[負載液製備之標準程序2(步驟1)] ＜步驟1＞ 對(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1(接受體分子溶液，2000mg)、20當量之糖鏈予體分子(G-1)、1.6%(w/w)之酵素-A (S-001)、及0.2%(w/w)之酵素-B (M-001)的混合液加入適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，調整反應液量，使抗體的最終濃度成為60mg/mL。接著，將該反應液保溫在30℃，於反應開始24小時後結束反應，冷凍保管至開始純化實驗為止。
＜採樣＞ 反應結束後，以測定糖鏈轉移率為目的，而採樣極微量的反應液，以純淨水稀釋而使抗體濃度成為1mg/mL之後，冷凍保管至LabChip分析開始為止。
[陽離子-疏水多模層析之標準程序1(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱(任一者皆為容量1ml)：Capto MMC Impress (Cytiva製)、Eshmuno CMX (Merck製)、Nuvia cPrime (BIO-RAD Laboratories製) 流速：0.3ml/min 對依照負載液製備之標準程序2而準備的反應液，加入100mM乙酸緩衝液(pH 3.9)、1M氯化鈉水溶液、1M鹽酸、純淨水，而製備管柱負載液。負載液係以抗體濃度成為5mg/mL，且成為與各實驗之管柱平衡液相同的pH及氯化鈉的最終濃度之方式製備。製備負載液後，以確認負載液之糖鏈轉移率為目的，而採樣0.5mL。於將所製備的負載液約30mL對管柱進行通液(試樣通液)之後，通入平衡液(50mM乙酸緩衝液，490mM氯化鈉水溶液，pH3.8) 5CV(管柱洗淨)。然後，以管柱再生為目的，通入洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉水溶液，pH4.0)) 5CV。於最後，以定位洗淨(CIP)為目的，通入清洗液(0.5M氫氧化鈉水溶液) 3CV。試樣通液時之管柱通過液中的標的物係藉由280nm下的吸光度進行檢測，於50mAU/2mm UV光析管以上之情形回收，加入1M Tris溶液而調整為pH5.0-5.4，作為回收液。關於此回收液，以紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)確認抗體濃度，及使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)確認糖鏈轉移率(表Z26)。
[表30] 表Z26
實施例 反應條件 介質 糖轉移率 (%)  產率 (%)
抗體 (濃度) 糖鏈 (當量) 負載液 回收液 回收液
16-1-1 mAb-1 (60mg/mL) G-1 (20eq.) Capto MMC Impress 96.1 98.6 41.26
16-1-2 Eshmuno CMX 96.1 98.2 49.97
16-1-3 Nuvia cPrime 96.1 98.3 48.32
如此處所示，確認：於使用陽離子-疏水多模樹脂之情形亦可得到糖鏈轉移率的提升效果。
(實施例16-2) 與以結合/洗提模式進行純化的方法之比較 確認：使標的物吸附於陽離子交換管柱之後，將洗提液通液而回收為洗提流分之情形，亦可得到糖鏈轉移率的提升效果。為了與如實施例12所記載地於陽離子交換管柱通過流分中回收標的物的方法直接比較，而使用以相同的方法(負載液製備之標準程序2(步驟1))製備的反應液，以陽離子交換層析之標準程序4、或陽離子交換層析之標準程序5進行純化。
[陽離子交換層析之標準程序4(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱：MonoS (1ml) (Cytiva製) 流速：0.3ml/min 對於依照負載液製備之標準程序2而準備的反應液，加入11倍量的平衡液(50mM乙酸緩衝液，pH3.8、pH4.0、或pH4.2)，而製備管柱負載液。將負載液以成為依照表Z27之負載量之方式對管柱進行通液，使標的物吸附於管柱。通入平衡液5CV而洗淨管柱之後，使用洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉水溶液，pH係配合平衡液)而藉由氯化鈉之線性濃度梯度(以20CV，0～100%)，從管柱洗提標的物。洗提液中的標的物係藉由280nm下的吸光度進行檢測，且於20mAU/2mm UV光析管以上之情形以每0.5ml進行區分。關於此區分液，以紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)確認抗體濃度，及使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)確認糖鏈轉移率，僅混合與負載液比較而糖鏈轉移率提升之流分，作為回收液(表Z27)。
[陽離子交換層析之標準程序5(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱：MonoS (1ml) (Cytiva製) 流速：0.3ml/min 對於依照負載液製備之標準程序2而準備的反應液，加入100mM乙酸緩衝液(pH 3.9)、1M氯化鈉水溶液、1M鹽酸、純淨水，而製備管柱負載液。負載液係以抗體濃度成為5mg/mL，且成為與各實驗之管柱平衡液相同的pH及氯化鈉的最終濃度之方式製備。於將負載液約30mL對管柱進行通液(試樣通液)之後，通入平衡液(50mM乙酸緩衝液，490mM氯化鈉水溶液，pH3.8) 5CV(管柱洗淨)。然後，以管柱再生為目的，通入洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉水溶液，pH4.0)) 5CV。於最後，以定位洗淨(CIP)為目的，通入清洗液(0.5M氫氧化鈉水溶液) 3CV。試樣通液時之管柱通過液中的標的物係藉由280nm下的吸光度進行檢測，於50mAU/2mm UV光析管以上之情形回收，加入1M Tris溶液而調整為pH5.0-5.4，作為回收液。關於此回收液，以紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)確認抗體濃度，及使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)確認糖鏈轉移率(表Z27)。
[表31] 表Z27
實施例 純化條件 糖轉移率 (%)  產率 (%)
純化方法 pH 負載液量 (mL) 負載液 回收液
16-2-1 結合/洗提 (程序4) 4.2 1.0 96.1 97.8 36.90
16-2-2 結合/洗提 (程序4) 4.0 1.0 96.1 98.8 18.01
16-2-3 結合/洗提 (程序4) 3.8 1.0 96.1 99.4 5.59
16-2-4 結合/洗提 (程序4) 4.2 4.0 96.1 98.2 29.31
16-2-5 結合/洗提 (程序4) 4.2 6.4 96.1 98.0 25.29
16-2-6 通過 (程序5) 3.8 29.8 96.1 98.4 83.38
如此處所示，確認：使標的物吸附於陽離子交換管柱之後，將洗提液通液而回收為洗提流分之情形，亦可得到糖鏈轉移率的提升效果。又，確認：與於通過流分中回收標的物之情形(實施例14)同樣地，pH越低糖鏈轉移率的提升效果越高，且伴隨著pH的增加而糖鏈轉移率的提升效果降低。
(實施例16-3) 使用唑啉法而準備反應液之情形 確認：實施例12中所示糖鏈轉移率的提升效果，係於在步驟1之糖鏈給予體使用唑啉體之情形亦可得到。首先，確認步驟1中之糖鏈給予體的適當用量。
[負載液製備之標準程序3(步驟1)] ＜步驟1＞ 加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1(接受體分子溶液，6mg)、糖鏈給予體[N 3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox(以下，適宜地標記為「N 3-MSG1-Ox」，專利文獻：WO2019065964) (2當量、4當量、6當量、8當量或10當量)、酵素-A (0.5%w/w)、及適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使總液量為300μL，且在30℃進行反應2小時。
＜採樣＞ 反應結束後，以測定糖鏈轉移率為目的，而採樣極微量的反應液，以純淨水稀釋而使抗體濃度成為1mg/mL之後，使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)而確認糖鏈轉移率(表Z28)。
[表32] 表Z28
實施例 反應條件 糖轉移率 (%) 
糖鏈 糖鏈量
(當量)
16-3-1 N 3-MSG1-Ox 2 77.2
16-3-2 4 99.4
16-3-3 6 ＞99.9
16-3-4 8 ＞99.9
16-3-5 10 ＞99.9
由表Z28中所示結果，認為在步驟1中使用4當量以上的糖鏈給予體N 3-MSG1-Ox之情形，由於糖鏈轉移率變得非常高，而不適合用以在步驟2評價糖鏈轉移率的提升效果。所以，在步驟1中使用2當量之糖鏈給予體N 3-MSG1-Ox而製備步驟2之負載液。
[負載液製備之標準程序4(步驟1)] [負載液製備之標準程序3(步驟1)]之中，將(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1(接受體分子溶液)的添加量變更為150mg，將糖鏈給予體N 3-MSG1-Ox的添加量變更為2當量。進而，使反應總液量為7.5ml。
＜負載液之pH、鹽濃度調整＞ 接著，對反應液加入100mM乙酸緩衝液(pH 3.9)、1M氯化鈉水溶液、1M鹽酸、純淨水，而製備管柱負載液。負載液係以抗體濃度成為5mg/mL，且成為與各實驗之管柱平衡液相同的pH及氯化鈉的最終濃度之方式製備。製備負載液後，以確認負載液之糖鏈轉移率為目的，而採樣0.5mL。
[陽離子交換層析之標準程序5(步驟2)] 裝置：AKTA avant 25 (Cytiva製) 管柱：POROS HS (1ml) (Thermo Fisher製) 流速：0.3ml/min 於將依照負載液製備之標準程序4而準備的負載液約20mL對管柱進行通液(試樣通液)之後，通入平衡液(50mM乙酸緩衝液，490mM氯化鈉水溶液，pH3.8) 5CV(管柱洗淨)。然後，以管柱再生為目的，通入洗提液(50mM乙酸緩衝液，1M氯化鈉水溶液，pH4.0) 5CV。於最後，以定位洗淨(CIP)為目的，通入清洗液(0.5M氫氧化鈉水溶液) 3CV。試樣通液時之管柱通過液、及管柱洗淨時之洗淨液中所包含的標的物，係藉由280nm下的吸光度進行檢測，於50mAU/2mm UV光析管以上之情形回收，加入1M Tris溶液而調整為pH5.0-5.4，各自作為通過液及洗淨液。關於此等之回收液，以紫外光-可見光分光光度計系統SoloVPE (C Technologies製)確認抗體濃度，及使用微晶片型毛細管全自動電泳系統LabChip GX (Perkin Elmer製)確認糖鏈轉移率(表Z29)。
[表33] 表Z29
實施例 反應條件 糖轉移率 (%)  產率 (%)
抗體 糖鏈 負載液 通過液 洗淨液 通過液 洗淨液
(濃度) (當量)
16-3-6 mAb-1 (20mg/mL) N 3-MSG1-Ox (2eq.) 77.5 84.1 82.3 84.78 1.74
如此處所示，確認：即使於步驟1之糖鏈給予體使用唑啉體之情形，亦在步驟2中可得到糖鏈轉移率的提升效果。
可於本發明利用之酵素A並不限定於已知的酵素、及其變異體。若滿足實施例1所記載之要件，則可選擇任意之酵素。亦可將已知的酵素序列資訊作為基礎，來新探索變異體。於是，於實施例17至實施例19，顯示可於「步驟1」利用之酵素A的胺基酸變異確認方法(以下，稱為「胺基酸變異確認法」)。
＜實施例17＞Endo-Si單變異體的製備 此處為了顯示綜合性探索法，而著眼於Endo-Si的觸媒活性結構域。為了解析在變異位置胺基酸之單獨變異的活性，而製備Endo-Si單變異體(D241X、T190X、Q311X、E360X)。 針對T190的單變異體、及實施例1中所設計之變異體以外的D241、Q311、E360各單變異體，係根據實施例2所記載之方法來製備(表Z31)。但是，由於反應規模不同，而於培養時係使用96孔深孔盤來代替500mL或1000mL容量擋板燒瓶，於純化時係使用His標籤純化套組Capturem His-Tagged Purification (Clontech社)來代替Capto Chelating，而進行簡易純化。
[表34] 表Z31
酵素-A溶液 變異體 濃度(mg/mL) 容量(mL)
Si-008 T190A 0.258 0.066
Si-009 T190R 0.328 0.061
Si-010 T190N 0.310 0.061
Si-011 T190C 0.348 0.059
Si-012 T190D 0.268 0.060
Si-013 T190E 0.244 0.058
Si-014 T190G 0.215 0.056
Si-015 T190H 0.504 0.056
Si-016 T190I 0.423 0.058
Si-017 T190K 0.241 0.055
Si-018 T190L 0.285 0.055
Si-019 T190M 0.440 0.057
Si-020 T190F 0.082 0.059
Si-021 T190P 0.142 0.060
Si-022 T190S 0.143 0.055
Si-023 T190W 0.132 0.058
Si-024 T190Y 0.357 0.062
Si-025 T190V 0.138 0.062
Si-026 T190Q 0.349 0.062
Si-027 D241A 0.107 0.052
Si-028 D241R 0.098 0.052
Si-029 D241N 0.053 0.047
Si-030 D241C 0.048 0.050
Si-031 D241E 0.088 0.075
Si-032 D241G 0.085 0.054
Si-033 D241H 0.479 0.054
Si-034 D241I 0.106 0.065
Si-035 D241L 0.455 0.053
Si-036 D241K 0.259 0.048
Si-037 D241F 0.216 0.054
Si-038 D241P 0.119 0.056
Si-039 D241S 0.226 0.058
Si-040 D241T 0.252 0.054
Si-041 D241W 0.288 0.056
Si-042 D241Y 0.113 0.054
Si-043 D241V 0.255 0.062
Si-044 Q311A 0.648 0.065
Si-045 Q311R 0.161 0.076
Si-046 Q311N 0.441 0.066
Si-047 Q311C 0.207 0.063
Si-048 Q311D 0.587 0.064
Si-049 Q311E 0.539 0.069
Si-050 Q311G 0.238 0.060
Si-051 Q311H 0.365 0.060
Si-052 Q311I 0.397 0.055
Si-053 Q311K 0.147 0.058
Si-054 Q311M 0.615 0.063
Si-055 Q311F 0.123 0.058
Si-056 Q311P 0.583 0.067
Si-057 Q311S 0.115 0.058
Si-058 Q311T 1.037 0.057
Si-059 Q311W 0.151 0.060
Si-060 Q311Y 0.239 0.052
Si-061 Q311V 0.305 0.065
Si-062 Q311L 0.491 0.067
Si-063 E360A 0.158 0.062
Si-064 E360R 0.156 0.063
Si-065 E360N 0.430 0.058
Si-066 E360C 0.514 0.062
Si-067 E360D 0.474 0.062
Si-068 E360H 0.203 0.060
Si-069 E360I 0.164 0.065
Si-070 E360K 0.154 0.078
Si-071 E360L 0.349 0.063
Si-072 E360M 0.223 0.074
Si-073 E360P 0.238 0.070
Si-074 E360S 0.098 0.070
Si-075 E360T 0.120 0.071
Si-076 E360W 0.086 0.068
Si-077 E360Y 0.102 0.066
Si-078 E360V 0.215 0.070
＜實施例18＞mAb2-[MSG1-N 3] 2的水解 其次，顯示將相較於Endo-Si WT而具有同等以下的殘留水解活性之酵素的範圍縮小之方法。此處使用之抗體若為附加有糖鏈的抗體，則可使用任意之抗體。 製備包含mAb2-[MSG1-N 3] 2(50μg)、實施例17中準備的Endo-Si單變異體(1μg)及50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.25)之合計23.2μL的反應液，且在30℃進行反應。將反應開始後1小時、4小時及24小時的反應液進行採樣。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。與實施例11同樣地進行，算出各反應時間之水解率。將此試驗合計實施2次(表Z32)。
[表35] 表Z32
實施例 酵素-A 所使用之 酵素A溶液 水解率(%) [第1次/第2次]
1h 4h 24h
18-1 Endo-Si T190A Si-008 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-2 Endo-Si T190C Si-011 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-3 Endo-Si T190D Si-012 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-4 Endo-Si T190E Si-013 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-5 Endo-Si T190F Si-020 6.5 / 16.3 33.9 / 47.8 92.8 / ＞99.9
18-6 Endo-Si T190G Si-014 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-7 Endo-Si T190H Si-015 86.2 / 82.3 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-8 Endo-Si T190I Si-016 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-9 Endo-Si T190K Si-017 2.0 / 4.0 11.2 / 4.4 28.2 / 30.9
18-10 Endo-Si T190L Si-018 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-11 Endo-Si T190M Si-019 91.4 / 91.3 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-12 Endo-Si T190N Si-029 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-13 Endo-Si T190P Si-021 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-14 Endo-Si T190Q Si-026 60.2 / 70.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-15 Endo-Si T190R Si-009 2.1 / 4.1 14.3 / 6.1 36.7 / 34.5
18-16 Endo-Si T190S Si-022 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-17 Endo-Si T190V Si-025 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-18 Endo-Si T190W Si-023 7.8 / 14.0 34.5 / 37.0 85.3 / 82.0
18-19 Endo-Si T190Y Si-024 12.5 / 22.3 54.6 / 56.6 94.1 / 95.2
18-20 Endo-Si D241A Si-027 64.4 / 62.8 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-21 Endo-Si D241C Si-030 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-22 Endo-Si D241E Si-031 37.7 / 48.2 97.0 / 97.0 ＞99.9 / ＞99.9
18-23 Endo-Si D241F Si-037 0.9 / ＜0.1 2.2 / 4.1 15.8 / 8.9
18-24 Endo-Si D241G Si-032 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-25 Endo-Si D241H Si-033 2.3 / ＜0.1 4.1 / 9.0 25.2 / 16.9
18-26 Endo-Si D241I Si-034 8.1 / 11.0 32.6 / 45.2 ＞99.9 / ＞99.9
18-27 Endo-Si D241K Si-036 0.7 / ＜0.1 0.8 / 1.7 ＜0.1 / 0.6
18-28 Endo-Si D241L Si-035 4.5 / 4.4 15.1 / 24.8 74.9 / 77.2
18-29 Endo-Si D241N Si-029 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-30 Endo-Si D241P Si-038 2.4 / ＜0.1 8.1 / 15.6 60.6 / 62.7
18-31 Endo-Si D241R Si-028 0.6 / ＜0.1 0.7 / 2.0 2.2 / 0.8
18-32 Endo-Si D241S Si-039 87.2 / 93.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-33 Endo-Si D241T Si-040 35.0 / 37.3 ＞99.9 / 94.2 ＞99.9 / ＞99.9
18-34 Endo-Si D241V Si-043 30.5 / 36.8 96.0 / 91.9 96.0 / ＞99.9
18-35 Endo-Si D241W Si-041 1.0 / ＜0.1 2.4 / 4.8 34.7 / 15.0
18-36 Endo-Si D241Y Si-042 0.8 / ＜0.1 1.5 / 3.0 10.4 / 9.0
18-37 Endo-Si Q311A Si-044 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-38 Endo-Si Q311C Si-047 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-39 Endo-Si Q311D Si-048 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-40 Endo-Si Q311E Si-049 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-41 Endo-Si Q311F Si-064 5.0 / 3.6 24.4 / 24.4 ＞99.9 / 94.0
18-42 Endo-Si Q311G Si-050 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-43 Endo-Si Q311H Si-051 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-44 Endo-Si Q311I Si-052 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-45 Endo-Si Q311K Si-053 4.7 / 3.9 32.0 / 28.7 ＞99.9 / 93.5
18-46 Endo-Si Q311L Si-062 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-47 Endo-Si Q311M Si-054 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-48 Endo-Si Q311N Si-046 46.8 / 52.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-49 Endo-Si Q311P Si-056 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-50 Endo-Si Q311R Si-045 0.7 / ＜0.1 0.8 / 2.8 2.0 / 3.8
18-51 Endo-Si Q311S Si-057 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-52 Endo-Si Q311T Si-058 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-53 Endo-Si Q311V Si-061 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-54 Endo-Si Q311W Si-059 0.7 / ＜0.1 3.7 / 1.5 9.2 / 4.5
18-55 Endo-Si Q311Y Si-060 1.3 / ＜0.1 5.0 / 4.8 26.0 / 26.6
18-56 Endo-Si E360A Si-063 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-57 Endo-Si E360C Si-066 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-58 Endo-Si E360D Si-067 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-59 Endo-Si E360H Si-068 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-60 Endo-Si E360I Si-069 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-61 Endo-Si E360K Si-070 71.3 / 94.5 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-62 Endo-Si E360L Si-071 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-63 Endo-Si E360M Si-072 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-64 Endo-Si E360N Si-065 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-65 Endo-Si E360P Si-073 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-66 Endo-Si E360R Si-064 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-67 Endo-Si E360S Si-074 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-68 Endo-Si E360T Si-075 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-69 Endo-Si E360V Si-078 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
18-70 Endo-Si E360W Si-076 55.8 / 71.6 88.8 / 97.2 ＞99.9 / ＞99.9
18-71 Endo-Si E360Y Si-077 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9 ＞99.9 / ＞99.9
以此評價，能夠縮小範圍至相較於Endo-Si WT而具有同等以下的殘留水解活性之酵素。「在1小時之時間點顯示水解率＞99.9%的酵素」，可判定為與實施例11中測定之Endo-Si WT的水解活性比較而顯示同等以上的殘留水解活性。於是，針對「在1小時之時間點未顯示水解率＞99.9%的酵素」，實施實施例19的評價。
＜實施例19＞使用糖鏈給予體G-1 (SGP)之糖轉移反應確認 其次，顯示特定於「步驟1」可採用的酵素之胺基酸變異的方法。 製備包含(Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 (50μg)、糖鏈給予體G-1 (122.72μg，50當量)、實施例17中準備的Endo-Si單變異體(2μg)、實施例3-2中製備的Endo-Rp N172H (5.7μg)、及50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.25)之合計28μL的反應液，且在30℃進行反應。 將反應開始後4小時、8小時及24小時的反應液進行採樣。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。與實施例8-1同樣地進行，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表Z33)。
[表36] 表Z33
實施例 酵素-A 所使用之 酵素A溶液 糖鏈轉移率(%)
4h 8h 24h
19-1 Endo-Si T190F Si-020 21.2 47.4 75.4
19-2 Endo-Si T190H Si-015 37.0 61.3 65.5
19-3 Endo-Si T190K Si-017 11.2 30.4 61.5
19-4 Endo-Si T190M Si-019 40.3 64.4 69.6
19-5 Endo-Si T190Q Si-026 32.7 61.9 74.2
19-6 Endo-Si T190R Si-009 9.0 27.6 56.4
19-7 Endo-Si T190W Si-023 27.6 58.3 87.9
19-8 Endo-Si T190Y Si-024 42.1 73.9 88.2
19-9 Endo-Si D241A Si-027 27.9 51.1 70.7
19-10 Endo-Si D241E Si-031 26.7 43.4 48.5
19-11 Endo-Si D241F Si-037 ＜0.1 4.2 19.4
19-12 Endo-Si D241H Si-033 39.4 63.2 87.0
19-13 Endo-Si D241I Si-034 48.1 74.2 50.0
19-14 Endo-Si D241K Si-036 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
19-15 Endo-Si D241L Si-035 57.7 81.9 91.6
19-16 Endo-Si D241P Si-038 34.0 61.8 84.9
19-17 Endo-Si D241R Si-028 ＜0.1 2.5 4.0
19-18 Endo-Si D241S Si-039 34.3 54.4 59.4
19-19 Endo-Si D241T Si-040 50.2 74.8 77.9
19-20 Endo-Si D241V Si-043 59.2 86.4 89.6
19-21 Endo-Si D241W Si-041 10.3 23.6 49.3
19-22 Endo-Si D241Y Si-042 12.8 28.6 52.6
19-23 Endo-Si Q311F Si-064 5.7 15.1 29.2
19-24 Endo-Si Q311K Si-053 ＜0.1 ＜0.1 4.8
19-25 Endo-Si Q311N Si-046 34.4 62.5 81.1
19-26 Endo-Si Q311R Si-045 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
19-27 Endo-Si Q311W Si-059 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
19-28 Endo-Si Q311Y Si-060 ＜0.1 5.7 10.8
19-29 Endo-Si E360K Si-070 2.6 7.5 15.0
19-30 Endo-Si E360W Si-076 ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1
由表Z33的結果，確認以下。 「對D241置入單變異之情形」 可作為酵素A利用之Endo-Si單變異體D241X 1未必被限定於X 1=Q或X 1=M，就一態樣而言，除了X 1=K與X 1=R以外，可為任意之胺基酸。 「對D241不置入單變異之情形」 此處，作為代表例，係針對T190X 2、Q311X 3、E360X 4的3處，實施綜合性的解析。就一態樣而言，T190X 2可為X 2=F、H、K、M、Q、R、W、Y，Q311X 3可為X 3=F、N、Y，E360X 4可為X 4=K。 實施例19之實驗係以極小規模實施，所以反應中抗體濃度相較於實施例8至實施例10中實施的反應中抗體濃度而顯著低，為4.46mg/mL。若如實施例8中所示提高反應中抗體濃度，則糖鏈轉移率提升，考量此情形時，若對各酵素使用最適的條件，則就一態樣而言，認為除了在24小時之時間點糖鏈轉移率＜0.1%的酵素以外之大部分的酵素，於「步驟1」皆可採用(表Z34)。
[表37] 表Z34　藉由胺基酸變異確認法，而認為效果高的胺基酸變異
   酵素A    酵素A
A-13 Endo-Si T190F A-26 Endo-Si D241L
A-14 Endo-Si T190H A-27 Endo-Si D241P
A-15 Endo-Si T190K A-28 Endo-Si D241R
A-16 Endo-Si T190M A-29 Endo-Si D241S
A-17 Endo-Si T190Q A-30 Endo-Si D241T
A-18 Endo-Si T190R A-31 Endo-Si D241V
A-19 Endo-Si T190W A-32 Endo-Si D241W
A-20 Endo-Si T190Y A-33 Endo-Si D241Y
A-21 Endo-Si D241A A-34 Endo-Si Q311F
A-22 Endo-Si D241E A-35 Endo-Si Q311K
A-23 Endo-Si D241F A-36 Endo-Si Q311N
A-24 Endo-Si D241H A-37 Endo-Si Q311Y
A-25 Endo-Si D241I A-38 Endo-Si E360K
同樣地進行，而Endo-Si的觸媒活性中心附近之全部的胺基酸的單變異綜合性解析係有可能。因此，可於「步驟1」利用之酵素A的觸媒活性結構域中，可包含任意之胺基酸變異。 再者，此方法並不限定於Endo-Si、Endo-S、Endo-S2，對於所有以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶皆可利用。因此，可於步驟1利用之酵素A並不限定於本發明之實施例所記載的特定之Endo-Si變異體、Endo-S變異體、Endo-S2變異體、Endo-Se變異體、Endo-Sd變異體、Endo-Sz變異體。若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則參考本說明書，可特定本實施例及說明書中未例示記載之滿足實施例1所記載之要件的酵素-A之結構。因此，若滿足實施例1所記載之要件，則於「步驟1」可選擇任意之酵素。
＜實施例20＞源自宿主細胞之N297糖鏈的直接交換反應 如前述實施例中所示，本發明中可選擇殘留有水解活性的酵素作為酵素-A。所以，於本發明之一態樣中，接受體分子可藉由酵素-A作用於具有源自宿主細胞之不均勻的糖鏈之含Fc分子而以原位製備。又，可對於以原位所製備之接受體分子，如實施例10等中所示自糖鏈予體分子使糖鏈轉移，而得到所期望之糖鏈均勻地附加而成的抗體。
具體而言，可對於具有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈的抗體，加入酵素-A、酵素-B、及糖鏈予體分子，藉此得到均勻地附加有源自糖鏈予體分子的所期望之糖鏈的抗體。於本想法中，酵素-A係於相同反應槽內顯示對於源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈的水解反應、與糖鏈予體分子的糖轉移反應兩方的作用。亦即，首先，酵素-A作用於具有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈的抗體，將源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈水解，藉此而接受體分子以原位產生。接著，在相同之反應槽內，對於藉由酵素-B的作用而經活化之糖鏈予體分子，酵素-A亦進行作用，可將糖鏈轉移至接受體分子。將本項所記述之一連串的反應於以下標記為「源自宿主細胞之N297糖鏈的直接交換反應」。
在源自宿主細胞之N297糖鏈的直接交換反應，係認為如圖xx2所示，可將源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈取代為所期望之糖鏈結構。例如，於糖鏈予體分子選擇G-1之情形，認為可得到mAb-[SG] 2。又，於糖鏈予體分子選擇G-4、G-13、G-14、或G-16之情形，認為可得到mAb-[X-MSG1] 2，再者，於糖鏈予體分子選擇G-3、G-6、G-7、G-8、G-9、G-10、G-11、G-12、或G-15之情形，認為可得到mAb-[X-SG] 2。
圖XX2
[N297糖鏈的直接交換反應標準程序1] 加入不均勻地附加有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈的抗體(裸mAb1，12mg)、糖鏈給予體G-1、G-10或G-16 (40當量)、酵素-A (1.6%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為200μL，且在30℃進行反應72小時。於反應開始後24小時、48小時、72小時進行採樣。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)進行稀釋，使含有抗體濃度成為1.5mg/mL，且冷凍保管至分析開始時為止。使用質譜分析、及/或LabChip分析，而確認源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈被交換成所期望之糖鏈。
[質譜分析] 將糖鏈重塑抗體分子在經片段化為重鏈與輕鏈之狀態下以分析管柱分離，導入質譜儀。使用TCEP(參(2-羧乙基)膦)作為用以片段化之還原劑。藉此，對於以糖鏈轉移反應而被導入抗體的源自糖鏈予體之糖鏈部位N 3基，施陶丁格(Staudinger)反應亦進行，被還原至NH 2基的質量係作為主要波峰而被觀測到。 於裝置使用Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc製)、Ultimate3000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific Inc製)及PLRP-S 1000A (Agilent Technologies製)(8μm，2.1×50mm)，於移動相A利用水/0.1%甲酸/0.02%三氟乙酸溶液，於移動相B利用乙腈，使用移動相A在4分鐘由20%變化至50%的梯度，以流速0.6mL/min、60℃進行分析，得到經反摺積(deconvolution)之光譜(表Z36)。
[表38] 表Z35　源自宿主細胞來源之H鏈的MS波峰(實測值)、及源自反應進行時H鏈的MS波峰(理論值)
標的化合物 重鏈(-Lys)之ESI-MS
裸mAb1 實測值，M=50556.59、50600.70(最豐)、50630.62、50762.43 (反摺積數據)
水解物 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 計算質量，M=49505.48
糖鏈轉移體 mAb1-[SG] 2 計算質量，M=51509.27
糖鏈轉移體 mAb1-[X-MSG1] 2 計算質量，M=51418.25
糖鏈轉移體 mAb1-[X-SG] 2 計算質量，M=51909.75
於上述中「X」表示N 3-PEG(3)。但是，作為N 3基被還原至NH 2基的波峰而被檢測之情形，每1個N 3基係作為與理論值之差而觀測到加算氮原子2個分與氫原子2個分的變化而成的數值(26Da左右)。
[表39] 表Z36　源自宿主細胞之N297糖鏈直接交換反應液中所觀測到之主要源自H鏈之MS波峰、及糖鏈轉移率
實施例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A    酵素-B    時間 重鏈(-Lys)之ESI-MS (反摺積數據) 糖鏈轉移率(%)
20-1 裸mAb1 (60) G-1 (40eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 24h 實測值，M=51507.61 (最豐) 98.0
48h 實測值，M=51507.66 (最豐) 97.1
72h 實測值，M=51507.71 (最豐) 96.0
20-2 裸mAb1 (60) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 24h 實測值，M=49504.86、51507.64(最豐) 67.1
48h 實測值，M=49504.54 (最豐)、 51507.21 46.9
72h 實測值，M=49504.77 (最豐)、 51507.48 32.0
20-3 裸mAb1 (60) G-16 (40eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 24h 實測值，M=49505.05、51390.82 (最豐) 88.3
48h 實測值，M=49504.89、51391.06 (最豐) 84.7
72h 實測值，M=49505.42、51390.54 (最豐) 77.8
20-4 裸mAb1 (60) G-16 (40eq.) Endo-Si D241M/ Q311L Endo-Rp N172H 24h 實測值，M=50600.57、51390.48 (最豐)    77.2
48h 實測值，M=51390.46 (最豐) 97.3
72h 實測值，M=49503.51、51390.68 (最豐) 96.2
20-5 裸mAb1 (60) G-10 (40eq.) Endo-Si D241Q Endo-Rp N172H 24h 實測值，M=49504.88、51856.33 (最豐) 90.8
48h 實測值，M=49504.68、51856.35 (最豐) 88.6
72h 實測值，M=49504.78、51856.78 (最豐) 84.5
20-6 裸mAb1 (60) G-10 (40eq.) Endo-Si D241M/ Q311L Endo-Rp N172H 24h 實測值，M=49504.59、50601.57 51855.76(最豐) 67.3
48h 實測值，M=49504.32、51856.08 (最豐) 93.9
72h 實測值，M=49504.33、51856.11 (最豐) 92.9
裸mAb1為不均勻地附加有源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈的抗體，所以於MS分析中有源自宿主細胞之N297糖鏈附加於H鏈之結構係作為複數個MS波峰被確認到(表Z36)。若著眼於實施例20-1，則在反應開始24小時之時間點，源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈幾乎被水解，且被取代為源自G-1之糖鏈結構。這表示反應液中之抗體的主要結構為mAb1-[SG] 2。另一方面，若著眼於實施例20-2，則在反應開始24小時之時間點，源自宿主細胞之N297鍵結糖鏈幾乎被水解，且被取代為源自G-1之糖鏈結構、及其水解物之結構。這表示反應液中之抗體的主要結構為mAb1-[SG] 2、及(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1。 接著，若著眼於使用G-16作為糖鏈給予體之實施例20-3與實施例20-4、或者使用G-10作為糖鏈給予體之實施例20-5與實施例20-6，則各自檢測到作為源自G-16之糖鏈結構、及源自G-10之糖鏈結構之MS波峰。又，於使用殘留水解活性較Endo-Si D241Q更弱的Endo-Si D241M/Q303L之情形，亦在直接交換反應開始48小時之時間點，源自宿主細胞之N297糖鏈已幾乎被水解。這表示反應液中之抗體的主要結構為mAb1-[X-SG] 2、及(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1、或是mAb1-[X-MSG1] 2、及(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1。如此處所示，即使於使酵素-A對具有源自宿主細胞之不均勻的糖鏈之抗體作用之情形，亦可得到均勻地附加有源自糖鏈予體分子之糖鏈的抗體。又，確認：於使用不同的酵素、糖鏈予體分子之組合之情形，亦可得到同樣的結果。如考量至實施例19為止所得之結果，則已證實：使用本實施例所記載的組合之酵素、糖鏈予體分子之情形，源自宿主細胞之N297糖鏈的直接交換反應亦包含在「步驟1」中。 再者，若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則參考本說明書，可特定本實施例及說明書中未例示記載之滿足實施例20所記載之要件的酵素-A、酵素-B和糖鏈予體分子之結構。因此，於在「步驟1」中採用源自宿主細胞之N297糖鏈的直接交換反應之情形，可選擇任意之酵素、糖鏈予體分子。
＜參考例＞ 於以下提示參考例。於本說明書中，參考例並非揭示本發明之範圍外的態樣者，僅止於揭示各種接受體分子、抗體、糖鏈予體分子等之製造例、或使用彼等的試驗例、本發明之應用性的實施態樣等作為參考者。
以下述方法製備直接糖鏈轉移反應中作為接受體分子使用之(Fucα1,6)GlcNAc-含Fc分子溶液(接受體分子溶液)、水解反應中使用的抗體-[MSG1-N 3] 2溶液(抗體溶液)、及抗體-[SG-N 3] 2溶液(抗體溶液)。
(參考例1) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1溶液的製備(1) 將含有能以WO2017010559的實施例3所記載的方法製作的(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1之溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)與50mM Tris鹽酸(pH7.5)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液1-1、接受體分子溶液1-2)。
(參考例2) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2溶液的製備(1) 將含有能以WO2019065964的實施例61之步驟1所記載的方法製作的(Fucα1,6)GlcNAc-mAb2之溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)與50mM Tris鹽酸(pH7.5)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液2-1、接受體分子溶液2-2)。
(參考例3) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3溶液的製備(1) 將含有能以WO2020050406的實施例85之步驟1所記載的方法製作的(Fucα1,6)GlcNAc-mAb3之溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)與50mM Tris鹽酸(pH7.5)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液3-1)。
(參考例4) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1溶液的製備(2) 使用50mM Tris鹽酸(pH7.25)來代替(參考例1)中使用的50mM Tris鹽酸(pH7.5)，且與(參考例1)同樣地進行，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液4-1)。
(參考例5) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2溶液的製備(2) 使用50mM Tris鹽酸(pH7.25)來代替(參考例2)中使用的50mM Tris鹽酸(pH7.5)，且與(參考例2)同樣地進行，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液5-1)。
(參考例6) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3溶液的製備(2) 使用50mM Tris鹽酸(pH7.25)來代替(參考例3)中使用的50mM Tris鹽酸(pH7.5)，且與(參考例3)同樣地進行，準備表Y-2所示(Fucα1,6)GlcNAc-mAb溶液(接受體分子溶液6-1)。
(參考例7) mAb2-[MSG1-N 3] 2溶液的製備 將含有能以WO2019065964的實施例61之步驟2所記載的方法製作的mAb2-[MSG1-N 3] 2之溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)與50mM Tris鹽酸(pH7.25)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-2所示mAb2-[MSG1-N 3] 2溶液(抗體溶液7-1及抗體溶液7-2)。
[表40] 表Y-2　試液的製備
溶液名 含Fc分子 濃度(mg/mL) 容量(mL)
接受體分子溶液1-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 106.40 26.05
接受體分子溶液1-2 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 156.38 2.50
接受體分子溶液2-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 91.83 7.99
接受體分子溶液2-2 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 103.5 3.51
接受體分子溶液3-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3 92.86 1.85
接受體分子溶液4-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 92.46 7.76
接受體分子溶液4-2 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 98.42 34.30
接受體分子溶液5-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb2 91.27 155.07
接受體分子溶液6-1 (Fucα1,6)GlcNAc-mAb3 90.11 3.79
抗體溶液 7-1 mAb2-[MSG1-N 3] 2 10.00 0.2
抗體溶液 7-2 mAb2-[MSG1-N 3] 2 35.10 0.125
(參考例8) Endo-S2變異體的反應性確認 依照實施例中所使用的標準程序的任一個，如下述表Z38所示，設定適宜條件。對於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (6mg)，加入各種糖鏈給予體(10當量～40當量、或100當量)、酵素-A (0.8%w/w)、酵素-B (0.2%w/w)、適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH7.25)，使液量總量為100～300μL，且在30℃進行反應28小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、24小時、28小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。與實施例同樣地進行，測定糖鏈轉移率。
[表41] 表Z38
參考例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A    酵素-B    糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 24h 28h
8-1 mAb1 (20) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 62.2 77.1 75.2 71.6 52.3 47.1
8-2 mAb1 (40) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 80.1 83.7 81.3 78.1 58.2 54.1
8-3 mAb1 (60) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 64.0 54.9 89.5 88.0 83.8 82.8
8-4 mAb1 (80) G-1 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 88.2 87.8 85.4 83.2 65.6 61.5
8-5 mAb1 (60) G-1 (10eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 24.2 42.0 47.1 47.7 24.4 19.3
8-6 mAb1 (60) G-3 (10eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 5.6 6.0 5.3 4.1 0.8 0.5
8-7 mAb1 (60) G-4 (10eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 7.6 6.7 5.5 4.7 6.3 0.8
8-8 mAb1 (60) G-1 (20eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 54.6 69.6 68.8 66.3 36.7 30.5
8-9 mAb1 (60) G-3 (20eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 18.5 17.0 14.1 10.6 2.0 0.9
8-10 mAb1 (60) G-4 (20eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 20.9 16.9 13.0 12.1 3.7 0.4
8-11 mAb1 (60) G-1 (30eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 78.9 81.3 78.9 76.5 53.2 44.9
8-12 mAb1 (60) G-3 (30eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 31.2 23.3 19.3 26.9 3.2 1.3
8-13 mAb1 (60) G-4 (30eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 26.6 19.1 15.8 12.1 2.0 1.2
8-14 mAb1 (60) G-3 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 4.6 1.6 37.8 26.6 21.5 18.3
8-15 mAb1 (60) G-4 (40eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 32.7 23.3 22.3 15.5 1.8 2.2
8-16 mAb1 (60) G-3 (100eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 63.7 50.8 44.3 35.9 18.0 14.2
8-17 mAb1 (60) G-4 (100eq.) Endo-S2 D184M Endo-M N175Q 71.3 61.7 54.7 46.0 28.2 24.7
如實施例11中所示，對殘留水解活性與野生型幾乎同等的Endo-S2 D184M以糖鏈未修飾的G-1作為糖鏈給予體之情形，若於[步驟1]中設定適當條件，則可達成超過80%之糖鏈轉移率。 另一方面，使用經化學修飾之糖鏈給予體之情形，由於一旦經糖鏈轉移的抗體係因殘留水解活性與野生型幾乎同等的Endo-S2 D184M而容易地受到水解，因此以40當量以下的糖鏈給予體用量，糖鏈轉移率並未超過80%。然而，由參考例8-16和參考例8-17的結果，確認：若增加糖鏈給予體的用量，則有糖鏈轉移率改善之傾向。此種情形，可期待藉由導入使殘留水解活性減少之變異而能夠於「步驟1」中採用。
參考例9：抗CD70抗體1的製作 抗CD70抗體1係參照WO2004/073656而製作。該抗CD70抗體1係同型為IgG1，具有LALA變異(IgG1-L234A、L235A)。將該抗CD70抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列識別號1)及重鏈胺基酸序列(序列識別號2)顯示於圖14。在序列識別號1(圖14)所示輕鏈序列中，由第1～112位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號2(圖14)所示重鏈序列中，由第1～118位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖20顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號13)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號14)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號15)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號16)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號17)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號18)。
參考例10：抗CD70抗體2的製作 抗CD70抗體2係參照WO2007/038637而製作。該抗CD70抗體2係同型為IgG1，具有LALA變異。將該抗CD70抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列識別號3)及重鏈胺基酸序列(序列識別號4)顯示於圖15。在序列識別號3(圖15)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號4(圖15)所示重鏈序列中，由第1～118位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖21顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號19)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號20)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號21)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號22)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號23)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號24)。
參考例11：抗TROP2抗體1的製作 抗TROP2抗體1係參照WO2015/098099而製作。該抗TROP2抗體1係同型為IgG1。將該抗TROP2抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列識別號5)及重鏈胺基酸序列(序列識別號6)顯示於圖16。在序列識別號5(圖16)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號6(圖16)所示重鏈序列中，由第1～121位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖22顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號25)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號26)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號27)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號28)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號29)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號30)。
參考例12：抗TROP2抗體2的製作 抗TROP2抗體1係參照WO2015/098099而製作。該抗TROP2抗體1係同型為IgG1。抗TROP2抗體2係對抗TROP2抗體1導入LALA變異。將該抗TROP2抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列識別號7)及重鏈胺基酸序列(序列識別號8)顯示於圖17。在序列識別號7(圖17)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號8(圖17)所示重鏈序列中，由第1～121位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖23顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號31)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號32)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號33)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號34)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號35)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號36)。
參考例13：抗EGFR抗體1的製作 抗EGFR抗體1係參照維必施(Vectibix)點滴靜脈注射100mg審查結果報告書(平成22年(2010年)3月5日 (日本)醫藥食品局審查管理課)而製作。該抗EGFR抗體1係同型為IgG1，具有LALA變異。將該抗EGFR抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列識別號9)及重鏈胺基酸序列(序列識別號10)顯示於圖18。在序列識別號9(圖18)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號10(圖18)所示重鏈序列中，由第1～119位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖24顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號37)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號38)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號39)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號40)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號41)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號42)。CDR序列參照WO1998/050433。
參考例14：抗EGFR抗體2的製作 抗EGFR抗體2係參照WO2002/092771而製作。該抗EGFR抗體2係同型為IgG1，具有LALA變異。將該抗EGFR抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列識別號11)及重鏈胺基酸序列(序列識別號12)顯示於圖19。在序列識別號11(圖19)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號12(圖19)所示重鏈序列中，由第1～116位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖25顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號43)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號44)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號45)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號46)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號47)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號48)。
參考例15：抗HER2抗體的製作 於本說明書中，「曲妥珠單抗」有時亦被稱為HERCEPTIN(註冊商標)、huMAb4D5-8、rhuMAb4D5-8，係具有由序列識別號49所記載之胺基酸序列構成的輕鏈及由序列識別號50所記載之胺基酸序列構成的重鏈之人源化IgG1抗體。胺基酸序列參照US5821337。將曲妥珠單抗之輕鏈胺基酸序列(序列識別號49)及重鏈胺基酸序列(序列識別號50)顯示於圖26。
抗HER2抗體，可設計並製作使曲妥珠單抗之重鏈胺基酸序列的EU索引第234位及第235位之白胺酸(L)變異為丙胺酸(A)(本說明書中，亦稱為LALA變異)而成的曲妥珠單抗之恆定區改造IgG1抗體(本說明書中，亦稱為改造抗HER2抗體)。將改造抗HER2抗體之輕鏈胺基酸序列(序列識別號49)及重鏈胺基酸序列(序列識別號51)顯示於圖27。
參考例16：抗HER2抗體2的製作 「帕妥珠單抗」有時亦被稱為PERJETA(註冊商標)，係具有由序列識別號52所記載之胺基酸序列構成的輕鏈及由序列識別號53所記載之胺基酸序列構成的重鏈之人源化IgG1抗體。胺基酸序列參照WO2004/008099。本說明書中亦稱為抗HER2抗體2。將帕妥珠單抗之輕鏈胺基酸序列(序列識別號52)及重鏈胺基酸序列(序列識別號53)顯示於圖28。在序列識別號52(圖28)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號53(圖28)所示重鏈序列中，由第1～119位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區，該可變區的位置係藉由IMGT之定義決定。
抗HER2抗體2，可設計並製作除了LALA變異以外，亦使重鏈胺基酸序列的EU索引第214位之離胺酸(K)變異為精胺酸(R)而成的具有G1m3同種異型之恆定區的抗HER2抗體2(本說明書中，亦稱為改造抗HER2抗體2)。將該改造抗HER2抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列識別號52)及重鏈胺基酸序列(序列識別號54)顯示於圖29。於圖31顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號57)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號58)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號59)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號60)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號61)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號62)。在序列識別號52(圖29)所示輕鏈序列中，由第1～108位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號54(圖29)所示重鏈序列中，由第1～119位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區，該可變區的位置係藉由IMGT之定義決定。
參考例17：抗CDH6抗體的製作 抗CDH6抗體可參照WO2018/212136而製作。該抗CDH6抗體係同型為IgG1，除了LALA變異以外，亦具有將重鏈胺基酸序列的EU索引第329位之脯胺酸(P)改為甘胺酸(G)之變異。將該抗CDH6抗體之輕鏈胺基酸序列(序列識別號55)及重鏈胺基酸序列 (序列識別號56)顯示於圖30。在序列識別號55(圖30)所示輕鏈序列中，由第1～107位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為輕鏈可變區，在序列識別號56(圖30)所示重鏈序列中，由第1～122位之胺基酸殘基構成的胺基酸序列為重鏈可變區。於圖32顯示該抗體的CDRL1之胺基酸序列(序列識別號63)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號64)、CDRL3之胺基酸序列(序列識別號65)、CDRH1之胺基酸序列(序列識別號66)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號67)、及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號68)。
參考例18：「步驟1」之應用法例示1 近年有報告使難以被Endo-S2 WT分解的糖鏈結構轉移至為含Fc分子之抗體的例子[非專利文獻：ACS Chem. Biol. 2021, 2502-2514.、非專利文獻：Acta Pharm. Sin. B 2022, 2417-2428]。由此，可藉由適宜選擇糖鏈予體分子之結構，而即使在使用野生型酵素之情形，亦得到源自糖鏈予體分子之糖鏈轉移至接受體分子而成的所期望之生成物。例如，能夠參考此等之報告所記載的糖鏈唑啉體之結構，而準備於還原末端側延伸1個GlcNAc而成的未經唑啉化之O連結型糖鏈予體分子或N連結型糖鏈予體分子，且進一步參考本說明書之條件，於可作用於此等糖鏈給予體的O連結型糖鏈或N連結型糖鏈之適當的酵素-B存在下使野生型酵素-A作用，藉此得到包含所期待的生成物之反應液。所以，此種應用例包含在本發明之「步驟1」中。又，若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則參考本說明書，而可特定本實施例及說明書中未例示記載之協力地作用的酵素-A與酵素-B之結構，可舉出例如：選自Endo-S2、Endo-S、Endo-Si等的野生型酵素-A；及選自Endo-M、Endo-Rp、Endo-CC(序列識別號6)、Endo-Om(序列識別號7)、Endo-A (GenBank登錄號：AAD10851)、Endo-CE (GenBank登錄號：BAB84821)、Endo-Tsp1006 (GenBank登錄號：CCY37287)、Endo-Tsp1263 (GenBank登錄號：CDD88945)、Endo-Tsp1457 (GenBank登錄號：CDD89351)、Endo-BB (GenBank登錄號：AAN25135)、Endo-BH (GenBank登錄號：BAB04504.1)、Endo-BN (GenBank登錄號：WP_007484749.1)、Endo-CC1 (GenBank登錄號：XP_001839402.1)、Endo-CC2 (GenBank登錄號：XP_002911817.1)、Endo-D (GenBank登錄號：AAK74656.1)、或Endo-Pm (GenBank登錄號：ADK97032.1)等的酵素-B。
參考例19：「步驟1」之應用法例示2 本說明書之實驗例中僅顯示在活體外反應之例，但使酵素-A與酵素-B於抗體的生產細胞共表現之情形，亦可期待與圖1或圖XX2同樣的狀況在生產細胞內被再現。若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則能夠參考本說明書而適宜設定共表現之條件，藉此得到包含所期待的生成物之反應液(在培養液中目標反應亦進行之情形，則相當於反應液)。所以，此種應用例包含在本發明之「步驟1」中。
參考例20：「步驟1」之應用法例示3 本發明之酵素-A為可作用於含Fc分子之糖鏈的酵素。例如，對於部分性地包含Endo-BI1 (GenBank登錄號：ACJ53522.1)、Endo-BI2 (GenBank登錄號：BAJ71450.1)、Endo-BT-3987 (GenBank登錄號：AAO79092.1)、Endo-E (GenBank登錄號：AAR20477.1)、Endo-F (GenBank登錄號：AAA24922.1)、Endo-F2 (GenBank登錄號：AAA24923.1)、Endo-F3 (GenBank登錄號：AAA24924.1)、Endo-CoM (GenBank登錄號：XP006673222)、或Endo-SB (GenBank登錄號：BBB35949)等之胺基酸序列的酵素(以下、酵素-A片段)導入對抗體之Fc片段有親和性的結構之情形，可期待作為本發明之酵素-A而作用。 已知以唑啉體為糖鏈給予體，且使用Endo-F3變異體之情形，從所謂相較於Endo-S等而需要更多糖鏈量、酵素量之點、亦即大量製造的觀點來看，效率不佳(非專利文獻：J. Biol. Chem. 2016, 9356-9370)。另一方面，有報告：能夠藉由對Endo-F3變異體賦予Fc結合性肽，而使糖鏈有效率地轉移至抗體Fc部分(非專利文獻：Org. Biomol. Chem. 2022, 3086-3095)。由此顯示：Endo-F3-Fc結合性肽複合體係藉由進行與Endo-S同樣的作用、亦即組合酵素-A片段與Fc結合性結構，而可人工製作可作用於含Fc分子之糖鏈的酵素。即使在使用人工製作的酵素-A之情形，若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則亦能夠參考本說明書而特定本實施例及說明書中未例示記載之酵素-A之結構以及協力地作用的酵素-A與酵素-B之結構，且得到包含所期待的生成物之反應液。所以，此種應用例包含在本發明之「步驟1」中。(惟，所謂Fc結合性結構，係對Fc片段顯示親和性的任意之肽、核酸、低分子等。)
參考例21：「步驟1」之應用法例示4 本發明之糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc，為非還原末端可經化學修飾之N-連結型糖鏈或O-連結型糖鏈。糖鏈予體分子並不限定於本說明書之實施例中所使用的糖鏈，可合理期待亦可應用於具有3分支型糖鏈結構、4分支型糖鏈結構、搭載有效負載(payload)之糖鏈結構等的糖鏈予體分子。即，藉由適宜選擇前述可對糖鏈予體分子作用的酵素-B、與酵素-A，而目標糖鏈轉移反應會進行。 例如，有報告：若因應目的而適宜使用Endo-S或其變異體、Endo-S2或其變異體、或者Endo-F3或其變異體，則於糖鏈予體使用3分支型糖鏈唑啉、或4分支型糖鏈唑啉、或搭載有效負載之糖鏈唑啉體之情形，可取得所期待的化合物(非專利文獻：Bioorg. Med. Chem, 2018, 1347-1355.、 J. Biol. Chem. 2016, 16508-16518、Acta Pharm. Sin. B 2022, 2417-2428；專利文獻：WO2017124084、US2019002542、JP2021-145548)。由此可期待：參考本說明書而適宜利用條件，藉此而Endo-S2係對包含GlcNAc的含Fc分子作用，且作為用以導入3分支型糖鏈、4分支型糖鏈、或者搭載有效負載之糖鏈的酵素-A而作用。即，即使在使用具有3分支型糖鏈結構、4分支型糖鏈結構、搭載有效負載之糖鏈結構等的糖鏈予體分子之情形，若為本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則亦能夠參考本說明書，而特定本實施例及說明書中未例示記載之酵素-A之結構以及協力地作用的酵素-A與酵素-B之結構，且得到包含所期待的生成物之反應液。所以，此種應用例包含在「步驟1」中。
參考例22　實施例15、及實施例20中使用的抗體溶液的製備 於抗體係使用可取得之曲妥珠單抗、或者莫格利珠單抗(Mogamulizumab) (POTELIGEO 20mg，Kyowa Kirin股份有限公司)，且以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)、與50mM Tris鹽酸(pH7.25)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-3所示抗體溶液。 又，根據WO2017010559的實施例3所記載的方法，而於抗體係使用莫格利珠單抗(POTELIGEO 20mg，Kyowa Kirin股份有限公司)，以野生型Endo-S切斷糖鏈，於純化後以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-15, 30kDa (Merck)、與50mM Tris鹽酸(pH7.25)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備接受體分子溶液9-1。 再者，使用以WO2018003983的實施例3-9A所記載的方法製備的(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-500, 10kDa (Merck)、與50mM Tris鹽酸(pH7.25)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-3所示接受體分子溶液10-1。 使用以WO2018003983的實施例3-3A所記載的方法製備的(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A溶液，以使用為超過濾膜之Amicon Ultra-500, 10kDa (Merck)、與50mM Tris鹽酸(pH7.25)的濃縮透析(UFDF)進行緩衝液交換，準備表Y-3所示接受體分子溶液11-1。
[表42] 表Y-3
溶液名 含Fc分子 濃度(mg/mL) 容量(mL)
抗體溶液8-1 (曲妥珠單抗) 裸-mAb1 95.32 3.5
接受體分子溶液9-1 GlcNAc-mAb4 90.75 0.080
接受體分子溶液10-1 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 118.16 0.10
接受體分子溶液11-1 (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 108.89 0.10
參考例23　糖鏈給予體G-18 (M9-Asn、M8-Asn、M7-Asn、M6-Asn的混合物)的製備與[步驟1]的確認 參考例23-1　糖鏈給予體G-18的製備
已知大豆粉末中包含[M9-Asn]之結構(非專利文獻：Chem. Biol. 2004, 127-134)。M8-Asn、M7-Asn、或M6-Asn係各自具有從M9-Asn有1個、2個、或3個甘露糖缺損之結構。
[不溶性成分的去除(1)] 使為市售品之大豆粉末(Soybean Flour TypeI，1Kg，Sigma-Aldrich製)懸浮在0.15N氫氧化鈉水溶液(5L)中，於攪拌120分鐘之後進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，回收上清液1 (3.8L)。
[水溶性成分的去除] 接著，對上清液1加入硫酸銨(1.14Kg)。然後，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，且除掉上清液2，得到沉澱物1。
[不溶性成分的去除(2)] 於使沉澱物1溶解於0.15N氫氧化鈉水溶液(4L)之後，加入適量的5N鹽酸而調整為pH5.0。然後，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，且除掉上清液3，得到沉澱物2。
[酵素反應] 於使沉澱物2溶解於0.15N氫氧化鈉水溶液(3L)之後，加入適量的5N鹽酸而調整為pH5.0。然後，於加入Actinase AS (300g，科研製藥製)之後，於37℃攪拌48小時。反應結束後，加入適量的5N鹽酸而調整為pH5.0，將混合液於減壓下進行矽藻土過濾(預塗(precoat)：Celite 505，主體加料(body feed)：Celite 545)，得到濾液A (2.7L)。
[不溶性成分的去除(3)] 對於濾液A (2.7L)添加3倍量的丙酮，以回收所產生的沉澱物3為目的，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，與上清液4分離。接著，對於所分離之上清液4添加與第1次同量的丙酮，以回收所產生的沉澱物4為目的，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，與上清液5分離。將第1次的操作、及第2次的操作中所得之沉澱物3與沉澱物4合併為一個，溶解於蒸餾水(2L)中。接著，減壓下進行過濾(濾紙：ADVANTEC No.2)，得到濾液B。
[不溶性成分的去除(4)] 於減壓下從濾液B去除丙酮之後，於加入適量的5N鹽酸而調整為pH3.0之後，減壓下進行矽藻土過濾(預塗布：Celite 505，主體加料：Celite 545)，得到濾液C (1.5L)。
[粗純化(1)：管柱純化] 將濾液C (1.5L)對填充有SEPABEADS SP207 (200mL，Mitsubishi Chemical製)之管柱進行通液，回收通過液。然後，加入蒸餾水，於量筒中加至5.0L，得到管柱處理液(5.0L)。
[粗純化(2)：膜純化] 將管柱處理液(5.0L)使用超過濾膜(Hydrosart 2 kDa，0.1 m 2，Sartorius製)一邊加水10L蒸餾水，一邊進行超過濾，得到超過濾處理液(3L)。
[萃取物的取得] 對於超過濾處理液(3L)添加2倍量的丙酮，以回收所產生的沉澱物5為目的，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，與上清液6分離。接著，對於所分離之上清液6添加與第1次同量的丙酮，以回收所產生的沉澱物6為目的，進行離心分離(8000rpm、30分鐘)，與上清液7分離。將第1次的操作、及第2次的操作中所得之沉澱物5與沉澱物6合併為一個，進行冷凍乾燥，得到萃取物(78.6g)。
[管柱純化] 以包含0.1%甲酸的蒸餾水與乙腈為溶析液，且於裝置使用Agilent 1100系列LC (Agilent technologies製)，於管柱使用Hypercarb (20Φ×150mm，Thermo Fisher Scientific Inc製)，進行於上述所得之萃取物的一部分(約20g)的分離純化。對藉由MS檢測所檢測到的主要波峰進行回收，並進行冷凍乾燥。使所得之冷凍乾燥粉末溶解於蒸餾水中，加入適量的氨水，而調整為pH7.0。然後，再次進行冷凍乾燥，得到呈冷凍乾燥粉末之糖鏈原料G-18 (46.7mg)。
[質譜分析] 於裝置使用Agilent 1200 (Agilent technologies製)、Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific Inc製)及Hypercarb (Thermo Fisher Scientific Inc製)(5μm，4.6×150mm)，於移動相A利用水，於移動相B利用乙腈，使用移動相B在15分鐘由5%變化至15%的梯度，以流速1.0mL/min、40℃進行分析。主要確認到4個波峰。
ESI-MS：M9-Asn C74H122N4O58的計算值：[M-2H] 2-997.34(最豐質量)，實測值997.34。
Man8GlcNAc2-Asn [M8-Asn]係M9-Asn的非還原末端側甘露糖缺損1個之結構。 ESI-MS：M8-Asn C68H112N4O53的計算值：[M-2H] 2-916.31(最豐質量)，實測值916.31。
Man7GlcNAc2-Asn [M7-Asn]係M9-Asn的非還原末端側甘露糖缺損2個之結構。 ESI-MS：M7-Asn C62H102N4O48的計算值：[M-2H] 2-835.28(最豐質量)，實測值835.28。
Man6GlcNAc2-Asn [M6-Asn]係M9-Asn的非還原末端側甘露糖缺損3個之結構。 ESI-MS：M6-Asn C62H102N4O48的計算值：[M-2H] 2-754.26(最豐質量)，實測值754.26。
[HPLC分析] 於裝置使用Agilent 1260 (Agilent technologies製)、及Hypercarb (Thermo Fisher Scientific Inc製)(5μm，4.6×150mm)，於移動相A利用水，於移動相B利用乙腈，使用移動相B在20分鐘由5%變化至15%的梯度，以流速1.0mL/min、40℃進行分析。主要確認到4個波峰。
[表43]
參考例23-2　使用糖鏈給予體G-18之糖鏈轉移反應 (圖中M8、M7或M6各自具有從M9缺損1個、2個、或3個甘露糖的結構。)
加入(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1 (0.6mg)、糖鏈給予體(40當量)、酵素-A (0.8～1.6%w/w)、酵素-B (0.02%～0.2%w/w)、與適量的50mM Tris-鹽酸緩衝溶液(pH 7.25)，使液量總量為15μL，且在30℃進行反應24小時。於反應開始後2小時、4小時、6小時、8小時、22小時、24小時進行採樣。反應結束後，測定反應液之pH。於採樣時，係將反應液抽取一部分，以純淨水稀釋，而使含有抗體濃度成為1mg/mL，且冷凍保管至LabChip分析開始時為止。 與(實施例8-1)同樣地進行，對於用於(Fucα1,6)GlcNAc-mAb1的各反應條件，算出各反應時間之糖鏈轉移率(表ZZ17)。
[表44] 表ZZ17
參考例 抗體 (mg/mL) 糖鏈 給予體 酵素-A 酵素-B 糖鏈轉移率(%)
2h 4h 6h 8h 22h 24h
23-1 mAb1 (40) G-18 Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-Rp N172H (0.2%) 30.3 33.8 32.4 28.2 12.3 11.2
23-2 mAb1 (40) G-18    Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-Rp N172H (0.1%) 18.5 29.9 36.6 39.5 36.3 34.9
23-3 mAb1 (40) G-18    Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-Rp N172H (0.02%) 7.1 9.9 12.2 14.8 28.1 28.8
23-4 mAb1 (40) G-18    Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-M N175Q (0.2%) 13.8 15.1 15.0 13.3 7.2 6.9
23-5 mAb1 (40) G-18    Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-M N175Q (0.1%) 17.5 20.5 20.4 19.0 11.2 10.4
23-6 mAb1 (40) G-18    Endo-S2 D184Q/Q250L Endo-M N175Q (0.02%) 10.2 14.2 17.5 19.8 26.1 26.4
由實施例23-1至實施例23-6的結果，確認：藉由「改變酵素-B的添加比率」、亦即「改變由酵素-B所致之糖鏈予體分子的活化之速度」，而對最大轉移率產生影響。
可於「步驟1」利用之酵素-B的本質，係由不具有岩藻糖之糖鏈予體分子活化為酵素-A可於往含Fc分子之糖鏈轉移反應利用之狀態(活化中間體)的能力。另一方面，由酵素-A所致之糖鏈轉移反應，係如實施例11中所示，必定會與為其生成物之糖鏈轉移體的水解反應競爭。此種環境下，若為由酵素-B所致之糖鏈予體分子的活化之速度不充分之情形，則預料所期待之糖鏈轉移率會變低。 為了解決此，而有因應糖鏈予體分子的糖鏈結構來適宜區別使用酵素-B之必要。可合理預料除了變更Endo-M或Endo-Rp之變異體以外，例如，篩選Endo-A (GenBank登錄號：AAD10851)、Endo-CE (GenBank登錄號：BAB84821)、Endo-Tsp1006 (GenBank登錄號：CCY37287)、Endo-Tsp1263 (GenBank登錄號：CDD88945)、Endo-Tsp1457 (GenBank登錄號：CDD89351)、Endo-BB (GenBank登錄號：AAN25135)、Endo-BH (GenBank登錄號：BAB04504.1)、Endo-BN (GenBank登錄號：WP_007484749.1)、Endo-CC1 (GenBank登錄號：XP_001839402.1)、Endo-CC2 (GenBank登錄號：XP_002911817.1)、Endo-D (GenBank登錄號：AAK74656.1)、或Endo-Pm (GenBank登錄號：ADK97032.1)，且特定適於G-18的酵素-B之結構，藉此而亦可得到更高的糖鏈轉移率。
無
圖1係混合接受體分子((Fucα1,6)GlcNAc-mAb)、糖鏈予體分子(X-SG-Z)、酵素-A、及酵素-B之一鍋反應中的糖鏈轉移反應之示意圖。 圖2係糖鏈予體分子代表例之結構式一覽。 圖3係使用糖鏈予體分子、及G-1、G-3或G-4的任一個之情形的糖鏈轉移反應之示意圖。 圖4係使用糖鏈予體分子、及G-1至G-17的任一個之情形的糖鏈轉移反應之示意圖。 圖5係成為一鍋反應之競爭反應的水解反應之示意圖。 圖6係使用酵素-A之mAb2的水解活性反應之示意圖。 圖7係野生型Endo-S之胺基酸序列(序列識別號69)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖8係野生型Endo-S2之胺基酸序列(序列識別號70)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖9係野生型Endo-Si之胺基酸序列(序列識別號71)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖10係野生型Endo-M之胺基酸序列(序列識別號72)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖11係野生型Endo-Rp之胺基酸序列(序列識別號73)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖12係野生型Endo-CC之胺基酸序列(序列識別號74)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖13係野生型Endo-Om之胺基酸序列(序列識別號75)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖14顯示抗CD70抗體1輕鏈之胺基酸序列(序列識別號1)及抗CD70抗體1重鏈之胺基酸序列(序列識別號2)。 圖15顯示抗CD70抗體2輕鏈之胺基酸序列(序列識別號3)及抗CD70抗體2重鏈之胺基酸序列(序列識別號4)。 圖16顯示抗TROP2抗體1輕鏈之胺基酸序列(序列識別號5)及抗TROP2抗體1重鏈之胺基酸序列(序列識別號6)。 圖17顯示抗TROP2抗體2輕鏈之胺基酸序列(序列識別號7)及抗TROP2抗體2重鏈之胺基酸序列(序列識別號8)。 圖18顯示抗EGFR抗體1輕鏈之胺基酸序列(序列識別號9)及抗EGFR抗體1重鏈之胺基酸序列(序列識別號10)。 圖19顯示抗EGFR抗體2的輕鏈之胺基酸序列(序列識別號11)及抗EGFR抗體2的重鏈之胺基酸序列(序列識別號12)。 圖20顯示抗CD70抗體1之CDRL1胺基酸序列(序列識別號13)、抗CD70抗體1之CDRL2胺基酸序列(序列識別號14)、抗CD70抗體1之CDRL3胺基酸序列(序列識別號15)、抗CD70抗體1之CDRH1胺基酸序列(序列識別號16)、抗CD70抗體1之CDRH2胺基酸序列(序列識別號17)、及抗CD70抗體1之CDRH3胺基酸序列(序列識別號18)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖21顯示抗CD70抗體2之CDRL1胺基酸序列(序列識別號19)、抗CD70抗體2之CDRL2胺基酸序列(序列識別號20)、抗CD70抗體2之CDRL3胺基酸序列(序列識別號21)、抗CD70抗體2之CDRH1胺基酸序列(序列識別號22)、抗CD70抗體2之CDRH2胺基酸序列(序列識別號23)、及抗CD70抗體2之CDRH3胺基酸序列(序列識別號24)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖22顯示抗TROP2抗體1之CDRL1胺基酸序列(序列識別號25)、抗TROP2抗體1之CDRL2胺基酸序列(序列識別號26)、抗TROP2抗體1之CDRL3胺基酸序列(序列識別號27)、抗TROP2抗體1之CDRH1胺基酸序列(序列識別號28)、抗TROP2抗體1之CDRH2胺基酸序列(序列識別號29)、及抗TROP2抗體1之CDRH3胺基酸序列(序列識別號30)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖23顯示抗TROP2抗體2之CDRL1胺基酸序列(序列識別號31)、抗TROP2抗體2之CDRL2胺基酸序列(序列識別號32)、抗TROP2抗體2之CDRL3胺基酸序列(序列識別號33)、抗TROP2抗體2之CDRH1胺基酸序列(序列識別號34)、抗TROP2抗體2之CDRH2胺基酸序列(序列識別號35)、及抗TROP2抗體2之CDRH3胺基酸序列(序列識別號36)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖24顯示抗EGFR抗體1之CDRL1胺基酸序列(序列識別號37)、抗EGFR抗體1之CDRL2胺基酸序列(序列識別號38)、抗EGFR抗體1之CDRL3胺基酸序列(序列識別號39)、抗EGFR抗體1之CDRH1胺基酸序列(序列識別號40)、抗EGFR抗體1之CDRH2胺基酸序列(序列識別號41)、及抗EGFR抗體1之CDRH3胺基酸序列(序列識別號42)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖25顯示抗EGFR抗體2之CDRL1胺基酸序列(序列識別號43)、抗EGFR抗體2之CDRL2胺基酸序列(序列識別號44)、抗EGFR抗體2之CDRL3胺基酸序列(序列識別號45)、抗EGFR抗體2之CDRH1胺基酸序列(序列識別號46)、抗EGFR抗體2之CDRH2胺基酸序列(序列識別號47)、及抗EGFR抗體2之CDRH3胺基酸序列(序列識別號48)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖26顯示曲妥珠單抗(Trastuzumab)輕鏈之胺基酸序列(序列識別號49)及曲妥珠單抗重鏈之胺基酸序列(序列識別號50)。 圖27顯示改造(engineered) HER2抗體的輕鏈之胺基酸序列(序列識別號49)及改造HER2抗體的重鏈之胺基酸序列(序列識別號51)。 圖28顯示帕妥珠單抗(Pertuzumab)輕鏈之胺基酸序列(序列識別號52)及帕妥珠單抗重鏈之胺基酸序列(序列識別號53)。 圖29顯示改造HER2抗體2的輕鏈之胺基酸序列(序列識別號52)及改造HER2抗體2的重鏈之胺基酸序列(序列識別號54)。 圖30顯示抗CDH6抗體的輕鏈之胺基酸序列(序列識別號55)及抗CD33抗體的重鏈之胺基酸序列(序列識別號56)。 圖31顯示帕妥珠單抗之CDRL1胺基酸序列(序列識別號57)、帕妥珠單抗之CDRL2胺基酸序列(序列識別號58)、帕妥珠單抗之CDRL3胺基酸序列(序列識別號59)、帕妥珠單抗之CDRH1胺基酸序列(序列識別號60)、帕妥珠單抗之CDRH2胺基酸序列(序列識別號61)、及帕妥珠單抗之CDRH3胺基酸序列(序列識別號62)。CDR序列係藉由IMGT之定義決定。 圖32顯示抗CDH6抗體之CDRL1胺基酸序列(序列識別號63)、抗CDH6抗體之CDRL2胺基酸序列(序列識別號64)、抗CDH6抗體之CDRL3胺基酸序列(序列識別號65)、抗CDH6抗體之CDRH1胺基酸序列(序列識別號66)、抗CDH6抗體之CDRH2胺基酸序列(序列識別號67)、及抗CDH6抗體之CDRH3胺基酸序列(序列識別號68)。CDR序列係藉由Kabat之定義決定。 圖33係野生型Endo-Sd之胺基酸序列(序列識別號76)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖34係野生型Endo-Sz之胺基酸序列(序列識別號77)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖35係野生型Endo-Se之胺基酸序列(序列識別號78)。以粗字底線表示相當於酵素的觸媒活性中心部位之胺基酸殘基，以粗字表示實施例所使用之變異酵素中經取代的胺基酸殘基、或可期待藉由施加變異而可控制酵素活性之胺基酸殘基。 圖36係顯示序列識別號79的序列([Endo-Si D241Q/Q311L]-[Endo-Rp N172V]之融合蛋白質)之圖。以粗字表示實施例所記載的融合蛋白質中經取代之胺基酸殘基，以底線表示胺基酸連接子序列。 圖37係顯示序列識別號80的序列([Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L]之融合蛋白質)之圖。以粗字表示實施例所使用的融合蛋白質中經取代之胺基酸殘基，以底線表示胺基酸連接子序列。 圖38係顯示序列識別號81的序列([Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L]之融合蛋白質)之圖。以粗字表示實施例所使用的融合蛋白質中經取代之胺基酸殘基，以底線表示胺基酸連接子序列。
TW202346322A_112107386_SEQL.xml

Claims (43)

  1. 一種含Fc分子之製造方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體(donor)分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2： [步驟1]使接受體(acceptor)分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模(multimode)層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子回收的步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中糖鏈予體分子包含還原末端未經活化之GlcNAc。
  3. 如請求項2之方法，其中步驟1係使接受體分子與糖鏈予體分子在酵素-A及以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟。
  4. 如請求項3之方法，其中以糖鏈予體分子之糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-B)，係因在酵素-A存在下作用於糖鏈予體分子，而具有促進由酵素-A所致之源自糖鏈予體分子之糖鏈往接受體分子的糖鏈轉移反應之性質的酵素。
  5. 如請求項3或4之方法，其中酵素-B為具有從SGP往GlcNAc衍生物之糖鏈轉移活性的酵素。
  6. 如請求項3至5中任一項之方法，其中酵素-B為Endo-M、Endo-Om、Endo-CC、或Endo-Rp之變異酵素，且該變異酵素具有較其對應之野生型酵素低的水解活性。
  7. 如請求項3至6中任一項之方法，其中酵素-B選自由Endo-Rp N172Q、Endo-Rp N172H、Endo-Rp N172A、Endo-Rp N172C、Endo-Rp N172D、Endo-Rp N172E、Endo-Rp N172G、Endo-Rp N172I、Endo-Rp N172L、Endo-Rp N172M、Endo-Rp N172P、Endo-Rp N172S、Endo-Rp N172T、Endo-Rp N172V、Endo-Rp W278F/S216V、Endo-Rp W278F/N246D、Endo-Rp W278F/D276N、Endo-Rp W278F/A310D、Endo-Rp W278F/N172D/F307Y、Endo-Rp W278F/N172D/F307H、Endo-Rp W278F/N172D/A310D、Endo-Rp W214F/F307Y/L306I、Endo-M N175Q、Endo-M N175Q/Y217F、Endo-CC N180H及Endo-Om N194Q所組成之群組。
  8. 如請求項3至7中任一項之方法，其中酵素-A與酵素-B經融合。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中於步驟1中，對於接受體分子1當量而使用2當量至40當量之糖鏈予體分子。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中於步驟1中，糖鏈轉移率超過80%。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中糖鏈予體分子所具有的糖鏈為非還原末端可經化學修飾之N-連結型糖鏈或O-連結型糖鏈。
  12. 如請求項11之方法，其中糖鏈予體分子為非還原末端可經化學修飾之SGP、AG(9)-P、AG(7)-P、SG-Asn、AG(9)-Asn、AG(7)-Asn、SG-OR、AG(9)-OR、AG(7)-OR、(MSG1)-Asn、(MSG2)-Asn、(MSG1)-Asn與(MSG2)-Asn的混合物、MSG1-OR、MSG2-OR、或MSG1-OR與MSG2-OR的混合物，且式中R為透過至少一個碳原子而與氧原子連結的任意之取代基。
  13. 如請求項12之方法，其中R表示C1～C6烷基或可經取代之芳基。
  14. 如請求項13之方法，其中R選自由甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基、三級丁基、正戊基、及正己基所組成之群組、或選自由可經C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、或鹵基取代之苯基、苄基、茚基、萘基、茀基、蒽基、及菲基所組成之群組。
  15. 如請求項12至14中任一項之方法，其中R選自由PMP、Me、A-Mor、iPr、nPr、PrOMe及A-PEG-N 3(A表示乙醇酸單元中之乙醯基，即變旋異構羥基與Mor或PEG中之胺基所夾住的部分)所組成之群組。
  16. 如請求項11或12之方法，其中糖鏈予體分子為([N 3-PEG(3)] 2-SG)-P-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)] 2-SG)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3的混合物。
  17. 如請求項12至15中任一項之方法，其中糖鏈予體分子為([N 3-PEG(3)] 2-SG)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR、([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR、或([N 3-PEG(3)]-MSG1)-OR與([N 3-PEG(3)]-MSG2)-OR的混合物。
  18. 如請求項11至17中任一項之方法，其中糖鏈予體分子為以選自由以下之式所組成的群組之式所表示的化合物： 。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中含Fc分子為免疫球蛋白、CLCH或含Fc片段。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中以N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)，為可作用於含Fc分子的糖鏈之可殘留有水解活性的酵素。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中酵素-A為Endo-S、Endo-S2、Endo-Si、Endo-Se、Endo-Sd、或Endo-Sz之變異酵素，且該變異酵素具有較其對應之野生型酵素低的水解活性。
  22. 如請求項21之方法，其中酵素-A為Endo-S D233Q、Endo-S D233Q/Q303L、Endo-S D233Q/E350A、Endo-S D233Q/E350Q、Endo-S D233Q/E350D、Endo-S D233Q/E350N、Endo-S D233Q/D405A、Endo-Si D241Q、Endo-Si D241Q/Q311L、Endo-Si D241Q/E360Q、Endo-Si D241M、Endo-Si D241M/Q311L、Endo-Si D241M/E360Q、Endo-Si T190Q、Endo-Si T190/D241Q、Endo-Si T190Q/D241M、Endo-S2 D184M、Endo-S2 T138Q、Endo-S2 D184Q/Q250L、Endo-S2 D184M/Q250L、Endo-Se D233M、Endo-Sz D234M、Endo-Sz D234M/Q304L、Endo-Si D241X 1(X 1表示K、R及D以外的任一個之胺基酸殘基)、Endo-Si T190X 2(X 2表示F、H、K、M、Q、R、W或Y之胺基酸殘基)、Endo-Si Q311X 3(X 3表示F、N、或Y之胺基酸殘基)、或Endo-Si E360K。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中步驟1之反應系內pH為6.5至8.0之範圍。
  24. 如請求項1至23中任一項之方法，其中步驟1之反應系內最終接受體分子濃度為20mg/mL以上100mg/mL以下。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中於陽離子交換層析介質或多模層析介質的通過流分(flow-through fraction)中，回收具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中步驟2中的酸性條件意指pH3.5至4.5之範圍。
  27. 如請求項1至26中任一項之方法，其中層析介質為粒子狀、膜狀、或蜂巢狀(monolithic)。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中糖鏈具有經具有疊氮基(N 3-)之取代基所化學修飾的非還原末端，且該方法進一步包含使具有炔結構之分子與該糖鏈之疊氮基(N 3-)進行反應的步驟。
  30. 如請求項29之方法，其中具有炔結構之分子選自化學治療劑、分子標靶藥物、免疫增強劑(immunopotentiator)、毒素、光敏感物質、抗菌劑、抗病毒劑、診斷用藥劑、蛋白質、肽、胺基酸、核酸分子、核酸、抗原、維生素、及荷爾蒙。
  31. 如請求項30之方法，其中化學治療劑選自喜樹鹼、吡咯并苯并二氮呯、艾黴素(doxorubicin)、阿瑞他汀(auristatin)、紫杉烷及此等之衍生物。
  32. 如請求項30之方法，其中免疫增強劑選自STING促效劑、TLR促效劑、及A2AR拮抗劑。
  33. 如請求項29至32中任一項之方法，其中具有炔結構之分子選自由(A)～(E)所組成之群組： (A) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (B) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺； (C) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺； (D) N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺；以及 (E) (雙(N,N-二乙基乙銨)　N-[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aR,16R)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧-2,10-二硫-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ 5,10λ 5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧二磷環十四炔-7-基]-6-側氧-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺。
  34. 一種含Fc分子，其係藉由如請求項1至33中任一項之方法所製造。
  35. 一種具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子之單離方法，前述方法包含：使包含前述含Fc分子與1個以上之雜質的溶液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，使雜質選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉的步驟；或使前述含Fc分子選擇性地被陽離子交換層析介質或多模層析介質捕捉的步驟。
  36. 如請求項35之方法，其中N297鍵結糖鏈包含複合型糖鏈。
  37. 如請求項35或36之方法，其中N297鍵結糖鏈並非可有岩藻糖附加之核心GlcNAc，而且前述1個以上之雜質包含除了具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈以外係與前述含Fc分子相同的分子。
  38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。
  39. 一種含Fc分子的單離方法，該含Fc分子具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈，該方法包含以下之步驟1及2： [步驟1]使接受體分子、與包含糖鏈的糖鏈予體分子，在以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(酵素-A)存在下進行反應，得到反應混合液的步驟，該接受體分子為具有可有岩藻糖附加之核心GlcNAc作為N297鍵結糖鏈的含Fc分子； [步驟2]使前述反應混合液在酸性條件下與陽離子交換層析介質或多模層析介質接觸，將具有包含源自糖鏈予體分子之糖鏈的N297鍵結糖鏈之含Fc分子單離的步驟。
  40. 如請求項39之方法，其中層析介質為陽離子交換層析介質。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法或含Fc分子，其中具有N297鍵結糖鏈之含Fc分子，係源自選自由抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗CDH6抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整聯蛋白(Integrin)抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C(Tenascin-C)抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗ENPP3抗體、抗CD47抗體、抗EGFR抗體、抗GPR20抗體、及抗DR5抗體所組成之群組的抗體。
  42. 一種以選自由以下之式所組成的群組之式所表示的化合物： 。
  43. 一種融合蛋白，其係酵素-A與酵素-B之融合蛋白，其中 酵素-A係以含Fc分子之N297鍵結糖鏈為受質的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶， 酵素-B係以具有糖鏈的還原末端未經活化之GlcNAc的含糖鏈分子之糖鏈為受質，但不以前述N297鍵結糖鏈為受質或對前述N297鍵結糖鏈之反應性低的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶。
TW112107386A 2022-03-02 2023-03-01 含Ｆｃ分子之製造方法 TW202346322A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022032199 2022-03-02
JP2022-032199 2022-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202346322A true TW202346322A (zh) 2023-12-01

Family

ID=87883860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112107386A TW202346322A (zh) 2022-03-02 2023-03-01 含Ｆｃ分子之製造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20250207169A1 (zh)
EP (1) EP4488378A1 (zh)
JP (1) JPWO2023167238A1 (zh)
KR (1) KR20240155298A (zh)
CN (1) CN118804983A (zh)
AU (1) AU2023229142A1 (zh)
IL (1) IL315341A (zh)
TW (1) TW202346322A (zh)
WO (1) WO2023167238A1 (zh)

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2334494T5 (es) 2001-05-11 2013-05-29 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específicas y usos de las mismas
MXPA05000403A (es) 2002-07-15 2005-07-22 Genentech Inc Metodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra erbb2.
EP2100619B1 (en) 2003-02-20 2014-02-12 Seattle Genetics, Inc. Anti-CD70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of immune disorders
EA016186B1 (ru) 2005-09-26 2012-03-30 Медарекс, Инк. Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
EP2199390B1 (en) 2007-08-30 2016-12-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-epha2 antibody
KR101772354B1 (ko) 2010-04-15 2017-08-28 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
BR112014019825B1 (pt) 2012-02-10 2021-08-24 University Of Maryland, Baltimore Glicoengenharia quimioenzimática de anticorpos e fragmentos fc dos mesmos
US20130309223A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. CD33 Antibodies And Use Of Same To Treat Cancer
WO2014057687A1 (ja) 2012-10-11 2014-04-17 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲート
KR20150095668A (ko) 2012-12-13 2015-08-21 아두로 바이오테크, 인코포레이티드 규정된 입체화학을 갖는 환식 퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 그리고 이의 제조 방법 및 용도
US10336786B2 (en) 2012-12-19 2019-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
TW201442721A (zh) 2013-01-23 2014-11-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 糖鏈修飾心房利尿鈉肽
RU2019109456A (ru) 2013-02-22 2019-04-10 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые конъюгаты антител и их применения
ES2982836T3 (es) 2013-04-29 2024-10-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composiciones y métodos para alterar la señalización de segundos mensajeros
EP2996472B1 (en) 2013-05-18 2019-03-27 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for inhibiting "stimulator of interferon gene" dependent signalling
SMT201900635T1 (it) 2013-05-18 2020-01-14 Univ California Composizioni e metodi di attivazione della segnalazione dipendente dallo "stimolatore di geni interferone"
TW201534613A (zh) 2013-06-28 2015-09-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 寡糖胜肽之純化方法
RU2016111137A (ru) 2013-08-28 2017-10-03 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Сконструированные конъюгаты против dll3 и способы применения
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3071229A4 (en) 2013-11-22 2017-05-10 Brock University Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants
BR112016014126B1 (pt) 2013-12-16 2023-02-14 Medimmune Limited Composto não-peptídico, conjugados de anticorpo-fármaco do mesmo, uso dos ditos conjugados para o tratamento de câncer e composição farmacêutica que compreende os mesmos
KR102351164B1 (ko) 2013-12-25 2022-01-13 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트
JP6750148B2 (ja) * 2014-04-25 2020-09-02 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体
ES2692226T3 (es) 2014-06-04 2018-11-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dinucleótidos cíclicos como moduladores de STING
DE102014214408A1 (de) 2014-07-23 2016-01-28 Wacker Chemie Ag Härtbare Organopolysiloxanzusammensetzungen
BR102014018190B1 (pt) 2014-07-24 2020-10-20 Fabio Eduardo Sabonge Cunha suporte para placa de sinalização vertical
US9381256B2 (en) 2014-09-03 2016-07-05 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
PL3608403T3 (pl) 2014-12-15 2025-06-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Kompozycja detergentowa zawierająca warianty subtylazy
PE20171448A1 (es) 2015-03-10 2017-10-02 Aduro Biotech Inc Composiciones y metodos para activar la senalizacion dependiente del estimulador del gen de interferon
MA42250B1 (fr) 2015-06-29 2020-11-30 Immunogen Inc Conjugués d'anticorps à cystéine modifiée
MX2017017049A (es) 2015-06-30 2018-03-06 Seattle Genetics Inc Anticuerpos anti antigeno de celulas nk y linfocitos t y b (ntb-a) y composiciones y metodos relacionados.
SG10201914047RA (en) 2015-07-16 2020-03-30 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel endos mutant enzyme
JP2017031132A (ja) * 2015-07-29 2017-02-09 公益財団法人野口研究所 コアフコース含有抗体の調製方法
GB201513607D0 (en) 2015-07-31 2015-09-16 Feingold Jay M Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN108137641B (zh) 2015-08-13 2022-04-01 默沙东公司 作为sting激动剂的环状双核苷酸化合物
US10906930B2 (en) 2015-10-28 2021-02-02 Chinook Therapeutics, Inc. Compositions and methods for activating “stimulator of interferon gene”-dependent signalling
RU2020113165A (ru) 2015-12-03 2020-06-09 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Циклические пуриновые динуклеотиды в качестве модуляторов sting
DE212016000029U1 (de) 2015-12-07 2017-07-30 Opi Vi - Ip Holdco Llc Zusammensetzungen von Antikörperkonstrukt-Agonist-Konjugaten
JP6887957B2 (ja) 2015-12-25 2021-06-16 第一三共株式会社 限外ろ過膜を用いたオリゴ糖ペプチドの精製法
WO2017123669A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Gary Glick Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with sting activity such as cancer
JP2019501663A (ja) 2016-01-15 2019-01-24 ユニバーシティー オブ メリーランド，カレッジ パーク グリコシンターゼとしてのＥｎｄｏ−Ｓ２変異体、糖タンパク質の製造方法および糖タンパク質の糖鎖操作のための使用
US10858641B2 (en) * 2016-02-08 2020-12-08 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
CN114751950B (zh) 2016-03-18 2025-04-18 免疫传感器公司 环二核苷酸化合物及使用方法
MX387353B (es) 2016-04-07 2025-03-18 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Amidas heterocíclicas útiles como moduladores de proteínas.
MX2018012266A (es) 2016-04-07 2019-05-30 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Amidas heterociclicas como moduladores de proteinas.
FR3050658B1 (fr) 2016-04-29 2018-04-20 IFP Energies Nouvelles Dispositif de melange et de distribution avec zones de melange et d'echange et deflecteurs.
JP7068167B2 (ja) 2016-07-01 2022-05-16 第一三共株式会社 糖鎖リモデリングされたＦｃ含有分子の製造方法
CN105938917A (zh) 2016-07-01 2016-09-14 深圳市振华新材料股份有限公司 锂离子二次电池钴酸锂正极材料及其制法和应用
WO2018009466A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
AU2017293781B2 (en) 2016-07-06 2022-12-22 Invox Pharma Limited Compounds, compositions, and methods for the treatment of disease
CA3034876C (en) 2016-08-24 2022-10-04 CHO Pharma Inc. Endoglycosidase mutants for glycoprotein remodeling and methods of using it
WO2018045204A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Ifm Therapeutics, Inc Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity
US10537590B2 (en) 2016-09-30 2020-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
MX386187B (es) 2016-10-04 2025-03-18 Merck Sharp & Dohme Llc Compuestos de benzo[b]tiofeno como agonistas de sting.
WO2018065360A1 (de) 2016-10-07 2018-04-12 Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen
KR101867371B1 (ko) 2016-10-10 2018-06-15 한국기계연구원 경량형 중공사 수중 호흡장치
WO2018090045A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Cho Pharma Inc Antibody-drug conjugates
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي
CA3045596C (en) 2016-12-02 2022-08-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Endo-.beta.-n-acetylglucosaminidase
KR101893759B1 (ko) 2017-02-02 2018-08-31 오토데이타 인터내셔날 (주) 출선구 지금제거장치
TW202504643A (zh) 2017-05-15 2025-02-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－藥物結合物之用途
US11459380B2 (en) 2017-06-29 2022-10-04 University Of Maryland, College Park Transglycosylation of endo-S and endo-S mutants for antibody glycosylation remodeling
EP3690038A4 (en) 2017-09-29 2021-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY PYRROLOBENZODIACEPINE DERIVATIVE CONJUGATE
US10594266B2 (en) 2017-12-04 2020-03-17 Nxp Usa, Inc. Multiple-path amplifier with series component along inverter between amplifier outputs
AU2019337051B2 (en) 2018-09-06 2023-11-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof
EP3648159B1 (en) 2018-10-31 2021-12-15 Infineon Technologies Austria AG Semiconductor package and method of fabricating a semiconductor package
KR20220151630A (ko) 2020-03-06 2022-11-15 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트
JP2021145548A (ja) 2020-03-16 2021-09-27 公益財団法人野口研究所 ＥＮＧａｓｅまたはその変異体を用いた４本鎖糖鎖を有するＩｇＧ抗体の調製方法
US20240336907A1 (en) 2020-09-02 2024-10-10 Daiichi Sankyo Company, Limited NOVEL ENDO-ß-N-ACETYLGLUCOSAMINIDASE
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
JP2024514683A (ja) 2021-04-23 2024-04-02 ユニバーシティ オブ メリーランド， カレッジ パーク 部位特異的抗体コンジュゲーションのためのＦｃグリカンリモデリングプラットフォーム法及びその適用

Also Published As

Publication number Publication date
IL315341A (en) 2024-10-01
US20250207169A1 (en) 2025-06-26
KR20240155298A (ko) 2024-10-28
WO2023167238A1 (ja) 2023-09-07
CN118804983A (zh) 2024-10-18
AU2023229142A1 (en) 2024-10-03
JPWO2023167238A1 (zh) 2023-09-07
EP4488378A1 (en) 2025-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113227124B (zh) 具有针对抗体的亲和性物质、切割性部分及反应性基团的化合物或其盐
JP7222347B2 (ja) 可溶性タンパク質に対する親和性物質、切断性部分および反応性基を有する化合物またはその塩
TWI748078B (zh) 抗體藥物偶聯物的製備方法
CN1191093C (zh) Dds化合物及其测定方法
WO2022170971A1 (zh) 生物活性物偶联物及其制备方法和用途
TWI879756B (zh) 抗ｔｒｅｍ２抗體及其使用方法
JP7529654B2 (ja) 抗ｈｅｒ２抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CA3034876C (en) Endoglycosidase mutants for glycoprotein remodeling and methods of using it
JP2023502883A (ja) クローディン１８．２を標的とする抗体－薬物コンジュゲート
EP3645740A2 (en) Anti-pd-1 antibodies and methods of making and using thereof
CN112543770A (zh) 靶向adam9的免疫缀合物及其使用方法
EP3645738A2 (en) Anti-pd-l1 antibodies and methods of making and using thereof
WO2024002330A1 (zh) 固定化的内切糖苷酶融合蛋白及其应用
WO2024158047A1 (ja) 抗ｌｒｒｃ１５抗体
TW202346322A (zh) 含Ｆｃ分子之製造方法
CN114085291B (zh) 一种降低或消除重组蛋白cex酸性峰的方法
KR20250019100A (ko) 친화성 물질, 화합물, 항체 및 그것들의 염
WO2025150556A1 (ja) 環境応答性ペプチドを利用したタンパク質の製造方法
CN119744182A (zh) 包含突变Fc区的抗体药物偶联物
HK40068279A (zh) 抗her2抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物
CN119490559A (zh) 化合物以及含有该化合物的抗体偶联药物
HK1024250A (zh) 與層粘連蛋白的巢蛋白結合域結合的抗體及其制備和用途