KR20220151630A - 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트 - Google Patents
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Abstract
(과제) 전신 투여가 가능하고, 또한, 목적으로 하는 세포나 장기 (예를 들어, 종양 부위) 에 특이적으로 STING 아고니스트를 송달할 수 있는 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 항체 약물 컨쥬게이트를 사용한 STING 아고니스트 활성이 관련되는 질환, 예를 들어, 면역 부활화에 의한 치료가 가능한 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다.
(해결 수단) 본 발명에 의해, 전신 투여할 수 있고, 또한, 항원이 발현되어 있는 종양에서 항종양 효과를 나타내는, 신규 항체 CDN 유도체 컨쥬게이트가 제공된다.
(해결 수단) 본 발명에 의해, 전신 투여할 수 있고, 또한, 항원이 발현되어 있는 종양에서 항종양 효과를 나타내는, 신규 항체 CDN 유도체 컨쥬게이트가 제공된다.
Description
본 발명은, STING 아고니스트 활성을 갖는 신규한 구조를 갖는 고리형 디뉴클레오티드 유도체와 표적 세포에 대한 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 항체 약물 컨쥬게이트, 그 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는 의약 조성물 등에 관한 것이다.
STING (Stimulator of Interferon Genes) 는, 소포체에 국재하는 막 관통형의 어댑터 단백질이다 (비특허문헌 1). STING 은, 포유 동물에 있어서의 자연 면역 활성화의 중추 분자로서 기능하고 있고, 세균이나 바이러스와 같은 병원체의 진입에 대한 방어의 최전선을 담당하고 있다. STING 의 활성화는, 복수의 세포질 DNA 센서가, 외인성 및 내인성의 DNA 를 감지했을 때의 시그널에 의해 야기되는 것이 알려져 있다. 세포질 DNA 센서 중에서는, cGAS (Cyclic GMP-AMP Synthase) 가 중요한 DNA 센서로 생각되고 있다. cGAS 가 DNA 를 감지하면 고리형 디뉴클레오티드 (2',3'-cGAMP) 가 산생되고, 이 2',3'-cGAMP 가 STING 에 직접 결합하여, STING 을 활성화시킨다 (비특허문헌 2). 활성화된 STING 은 골지체로 이동하고, 거기서 TBK1 (Tank-binding kinase 1) 의 자기 인산화를 촉진한다. 자기 인산화하여 활성화된 TBK1 은, IRF3 (Interferon regulatory factor 3) 전사 경로 (비특허문헌 3) 및 NFκB 전사 경로 (비특허문헌 4) 의 양방을 활성화하여, 인터페론이나 사이토카인 (I 형 IFN (Interferon), IL-6 (Interleukin-6), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α)) 으로 불리는 염증성 단백질의 산생을 증가시킨다. 이들 단백질은, 복잡한 캐스케이드를 통해서 병원체나 암 세포를 파괴하는 T 세포를 포함하는 획득 면역계를 시동시킨다.
최근의 연구에 의해, STING 은 미생물에 대한 숙주 방어뿐만 아니라, 항종양 면역을 촉진하는 것이 나타났다. 예를 들어, STING 결손 마우스에 면역원성 종양을 이식했을 경우, 종양은, 야생형 마우스나 TRIF (Toll/Interleukin-1 (IL-1) receptor domain containing adaptor-inducing interferon-β) 결손 마우스보다 급속히 증식한다. 또, STING 결손 마우스에서는, TLR (Toll-like receptor), MyD88 (Myeloid differentiation primary response 88), MAVS (Mitochondrial antiviral-signaling protein) 결손 마우스와는 달리, 종양에 대한 자발적인 CD8＋ T 세포의 프라이밍도 소실되었다. 이것은 세포질 DNA 감지에 의해 시동하는 STING 경로가 종양 증식의 제어에 관여하고 있는 것을 시사하고 있다 (비특허문헌 5). 다른 연구에서는, STING 이 방사선 치료 (비특허문헌 6) 또는 항 CD47 항체 요법 (비특허문헌 7) 의 항종양 효과에 필요한 것도 나타나 있다. 방사선 또는 항 CD47 항체로 처치한 후의, 죽은 종양 세포 유래의 DNA 는, 수지상 세포의 세포질로 이동하여 cGAS-STING 경로를 활성화한 후, IFN 산생을 유도하여 자연 면역과 획득 면역의 중개를 한다. 이 연구는, STING 경로에 의해 활성화된 수지상 세포를 개재하는 크로스 프라이밍이 종양에 대한 획득 면역을 야기하기 위해서 중요한 것을 시사하고 있다.
혈관 파괴제로서 알려져 있는 플라보노이드계 저분자 화합물 DMXAA 는, 매크로파지의 I 형 IFN 을 유도하기 때문에, 마우스 종양 모델에 있어서, 강력한 항종양 활성을 갖는 것이 나타났다 (비특허문헌 8). DMXAA 는 전(前)임상에서의 우수한 항종양 효과로부터, 비소세포폐암의 면역 요법약으로서 기대되고 있었지만, 인간의 임상 시험은 실패하였다 (비특허문헌 9). 최근의 연구에 의해, DMXAA 는 마우스의 STING 에 대한 특이적인 아고니스트이며, 인간의 STING 에 종 교차성이 없기 때문에, 결합할 수 없는 것이 밝혀졌다 (비특허문헌 10). DMXAA 는, 결과적으로 인간에서는 효과가 없었지만, 마우스 모델에서의 연구에 의해, 저분자약이 STING 을 개재하여, 효과적으로 CD8＋ T 세포를 프라이밍하고, 항종양 면역을 증강시킬 수 있는 것이 시사되었다.
다른 저분자 화합물로서 고리형 디뉴클레오티드 (Cyclic dinucleotide, CDN) 는, 담암 마우스에 투여하면 STING 개재에 의한 항종양 면역 응답이 증강되어 종양 증식이 현저하게 저해되어, 마우스의 생존률을 개선하는 것이 나타났다 (비특허문헌 11). CDN 은, 세균 유래의 표준적인 2 개의 3'-5' 인산 결합을 갖는 CDN (cyclic-di-GMP, cyclic-di-AMP, 3',3'-cGAMP) 과, 포유 동물의 cGAS 가 산생하는 비표준적인 2'-5' 인산 결합을 갖는 혼합 결합형의 CDN (2',3'-cGAMP) 으로 분류된다. 최근의 연구에 의해, 표준적인 CDN 보다 혼합 결합형의 CDN 이, 다양한 STING 을 보편적으로 활성화 가능하다는 것이 나타나 있다 (비특허문헌 12).
천연형의 CDN 은, 많은 핵산 분자와 같이 혈액 중의 핵산 분해 효소에 의해 신속하게 분해되기 때문에, 그대로의 형태로 투여할 수는 없다. 그 때문에, 생체 내에서 STING 아고니스트 활성을 갖는 합성 저분자 화합물이 개발되어 있다 (예를 들어, 특허문헌 1 ∼ 26).
현재, 항종양제로서 임상 시험이 진행되고 있는 STING 아고니스트의 MIW-815 (ADU-S100, ML RR-S2 CDA 또는 ML-RR-CDA·2Na＋ 로 불리기도 한다) 는, 종양 내에 직접 투여된다. STING 아고니스트를 종양에 직접 투여하는 방법으로는, 종양 내의 한정된 범위에만 약제를 투여할 수 있고, 또, 복수의 원격 전이 종양 모두에게 직접 투여하는 것은 곤란한 점에서, 치료 가능한 종양이 한정되어 버린다는 문제가 있다. 비특허문헌 13 에는, ML RR-S2 CDA 투여에 의해 항종양 효과가 나타났던 것이 기재되었지만, 종양내 투여뿐이고, 전신 투여 (예를 들어, 정맥내 투여) 에 의한 항종양 효과는 나타나 있지 않다. 비특허문헌 14 에는, STING 아고니스트의 SB11285 를 마우스 종양 모델에 정맥내 투여하면 항종양 효과가 나타난 것이 기재되었지만, SB11285 가 구체적으로 어떠한 구조를 갖는 화합물인지는 밝혀져 있지 않다. 특허문헌 14 에는, 면역 자극 화합물과 항체 구축물과 링커를 함유하는 컨쥬게이트가 기재되어 있지만, 면역 자극 화합물로서 STING 아고니스트를 사용한 컨쥬게이트의 구체예는 기재되어 있지 않다. 특허문헌 26 에는, 특정한 구조를 갖는 CDN 과 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 컨쥬게이트가 기재되어 있지만, 컨쥬게이트를 in vivo 로 투여한 실시예의 기재가 없어, 컨쥬게이트의 항종양 효과는 확인되지 않았다.
Nature 2008, 455, 674-678
Mol. Cell, 2013, 51, 226-235
Science 2015a, 347, aaa2630
J. Virol. 2014, 88, 5328-5341
Immunity 2014, 41, 830-842
Immunity 2014, 41, 843-852
Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215
J. Immunol. 1994, 153, 4684-4693
J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971
J. Immunol. 2013, 190, 5216-5225
Sci. Rep. 2016, 6, 19049
Mol. Cell, 2015, 59, 891-903
Cell Rep. 2015, 11, 1018-1030
AACR Tumor Immunology and Immunotherapy, 2017, Poster＃A25
전신 투여가 가능하고, 또한, 목적으로 하는 세포나 장기 (예를 들어, 종양 부위) 에 특이적으로 STING 아고니스트를 송달할 수 있는 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 항체 약물 컨쥬게이트를 사용한 STING 아고니스트 활성이 관련되는 질환, 예를 들어, 면역 부활화에 의한 치료가 가능한 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제 및/또는 치료법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 축합 3 고리성 치환기를 갖는 것을 특징으로 하는 신규 CDN 유도체와 특정한 항체를 링커를 개재하여 결합시킨 항체 약물 컨쥬게이트를 알아내었고, 그 항체 약물 컨쥬게이트를 전신 투여하면, 항원이 발현되어 있는 종양에서 항종양 효과가 나타나는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉 본원 발명은 이하에 관한 것이지만, 그것들로 한정되는 것은 아니다.
[1] 다음 식 (II) :
[화학식 1]
(식 중, m1 은 1 내지 10 의 범위이고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, 그 항체의 당사슬은 리모델링되어 있어도 되고,
(여기서, 항체는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 및 항 EGFR 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 항체를 나타낸다)
L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고,
Ab 는 그 아미노산 잔기로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고,
D 는, 다음 식 (I) :
[화학식 2]
(여기서,
L 은, L1 에 포함되는 임의의 -NH2 또는 하이드록시기와 결합하고,
L1 은, 이하의 3 식 :
[화학식 3]
(여기서, 파선은 치환 위치를 나타낸다)
중 어느 것의 기를 나타내고,
Q 및 Q' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내고,
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타내고,
W 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다)
로 나타내는 화합물을 나타낸다)
로 나타내는 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[2] D 가, 이하의 2 식 :
[화학식 4]
(여기서, L1, Q, Q' 및 W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[3] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 5]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, Q, Q' 및 W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] 또는 [2] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[4] D 가, 이하의 3 식 :
[화학식 6]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[5] D 가, 이하의 3 식 :
[화학식 7]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[6] D 가, 이하의 4 식 :
[화학식 8]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[7] D 가, 다음 식 :
[화학식 9]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
으로 나타내는, [1] ∼ [4] 또는 [6] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[8] D 가, 이하의 2 식 :
[화학식 10]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[9] D 가, 다음의 4 식 :
[화학식 11]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, [1] ∼ [3] 또는 [8] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[10] 링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 별표는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내거나 또는 존재하지 않고,
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-(CH2)n4-O-C(=O)-, 및,
-(CH2)n9-C(=O)-
(여기서, n2 는 1 ∼ 3 의 정수를 나타내고, n3 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, n4 는 0 ∼ 2 의 정수를 나타내고, n9 는 2 ∼ 7 의 정수를 나타낸다),
Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서 또는 La 와 Ab 의 시스테인 잔기를 결합하는 스페이서를 나타내고, 그리고,
Lc 는, -NH-CH2-, -NH-페닐기-CH2-O(C=O)- 또는 -NH-헤테로아릴기-CH2-O(C=O)- 를 나타내거나 또는 존재하지 않는,
[1] ∼ [9] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[11] Lc 가 -NH-CH2- 인, [10] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[12] Lp 가, -GGFG-, -GGPI-, -GGVA-, -GGFM-, -GGVCit-, -GGFCit-, -GGICit-, -GGPL-, -GGAQ- 또는 -GGPP- 중 어느 하나인, [10] 또는 [11] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[13] Lp 가, -GGFG- 또는 -GGPI- 인, [12] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[14] La 가, 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-, 및
-(CH2)5-C(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내는, [10] ∼ [13] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[15] Lb 가, 다음 식 :
[화학식 12]
또는
[화학식 13]
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 중 어느 것으로 나타내는, [10] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[16] Lb 가, -(숙신이미드-3-일-N)- 이고,
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 은, 이하의 구조식 :
[화학식 14]
을 나타내고,
여기서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 항체의 시스테인 잔기의 측사슬과 티오에테르를 형성하여 결합하고 있는 것을 나타내는, [10] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[17] 링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 별표는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 가, -GGFG-, 또는 -GGPI- 이고,
La 가, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 를 나타내고,
Lb 가, 다음 식 :
[화학식 15]
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 을 나타내고,
Lc 가, -NH-CH2- 를 나타내는, [10] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[18] 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 10 의 범위인, [1] ∼ [17] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[19] 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 5 의 범위인, [18] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[20] 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 3 내지 5 의 범위인, [19] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[21] 항체가, 항체의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 로부터 L 에 결합하고 있는, [1] ∼ [20] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[22] N297 당사슬이 리모델링된 당사슬인, [21] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[23] N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 인, [21] 또는 [22] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 :
[화학식 16]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수이다 ;
[화학식 17]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수이다 ;
[24] 다음 식 :
[화학식 18]
(식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
L 은, Ab 의 N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커로서, 앞에서 정의한 바와 같고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 인 것을 나타내고,
[화학식 19]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
[화학식 20]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
D 는, 이하의 4 식 중 어느 것으로 나타내고,
[화학식 21]
여기서, 식 중, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 로 나타내는, [21] ∼ [23] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[25] 다음 식 :
[화학식 22]
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 23]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
[화학식 24]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내는, [24] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[26] 다음 식 :
[화학식 25]
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 26]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
[화학식 27]
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내는, [25] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[27] 항체가 항 CD70 항체인, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[28] 항체가 항 TROP2 항체인, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[29] 항체가 항 EGFR 항체인, [1] ∼ [26] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[30] 항체가, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [27] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[31] 항체가, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [28] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[32] 항체가, 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, [29] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[33] 항체가, 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [27] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[34] 항체가, 서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [28] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[35] 항체가, 서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [29] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[36] 항체가, 서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [27] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[37] 항체가, 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [28] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[38] 항체가, 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, [29] 에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[39] 다음 식 :
[화학식 28]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 29]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[40] 다음 식 :
[화학식 30]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 31]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[41] 다음 식 :
[화학식 32]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 33]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[42] 다음 식 :
[화학식 34]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 35]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[43] 다음 식 :
[화학식 36]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 37]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[44] 다음 식 :
[화학식 38]
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
[화학식 39]
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[45] [1] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, STING 아고니스트 ;
[46] [1] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, 의약 조성물 ;
[47] [1] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, 항종양제 ;
[48] 종양이, 폐암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암, 췌장암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반융모암, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관간질종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 인두암, 설암, 청각기관암, 흉선암, 소장암, 백혈병, 악성림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종인, [47] 에 기재된 항종양제 ;
[49] [1] ∼ [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트, [45] 에 기재된 STING 아고니스트, [46] 에 기재된 의약 조성물 및 [47] 또는 [48] 에 기재된 항종양제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법 ;
[50] 암이, 폐암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암, 췌장암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반융모암, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관간질종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 인두암, 설암, 청각기관암, 흉선암, 소장암, 백혈병, 악성림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종인, [49] 에 기재된 방법 ;
[51] 인간 신암 세포주 Caki-1 세포를 피하 이식한 BALB/c-nu 마우스에 있어서 항체 표적 의존적인 항종양 효과를 발휘하는, [27], [30], [33] 또는 [36] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트 ;
[52] [42] 내지 [44] 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트로서, 하기 (i) 또는 (ii) 에 기재된 동물에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트에 포함되는 항체보다 강한 항종양 효과를 발휘하는, 항체 약물 컨쥬게이트 :
(i) 그 항체 약물 컨쥬게이트에 포함되는 항체가 결합하는 항원 상의 에피토프 부위가 인간형으로 치환된 인간 마우스 키메라 항원의 유전자를 도입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 가 피하 이식된 BALB/c 마우스 ;
(ii) 인간 신암 세포주 A-498 (HTB-44) 세포가 피하 이식된 BALB/c-nu 마우스,
에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 전신 투여할 수 있고, 또한, 항원이 발현되어 있는 종양에서 항종양 효과를 나타내는, 신규 항체 CDN 유도체 컨쥬게이트가 제공된다.
도 1 은, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 ((II) 의 분자) 인, SG 형 당사슬 리모델링 항체로부터 얻어진 항체 약물 컨쥬게이트 (도 1A 의 (II) 의 분자) 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체로부터 얻어진 항체 약물 컨쥬게이트 (도 1B 의 (II) 의 분자) 를 모식적으로 나타낸 것이다. (a) 는 약물 D, (b) 는 링커 L, (c) 는 PEG 링커 (L(PEG)), (d) 는 N297 당사슬 (여기서, 백색의 원은 NeuAc (Sia), 백색의 육각형은 Man, 흑색의 육각형은 GlcNAc, 백색의 마름모꼴은 Gal, 및 백색의 역삼각형은 Fuc) 를 각각 나타낸다. 백색의 오각형은, 링커 L 유래의 알킨과 PEG 링커 유래의 아지드기가 반응하여 생성된 트리아졸 고리를 나타낸다. Y 자형은, 항체 Ab 를 나타낸다. PEG 링커는, 비환원 말단에 위치하는 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합을 통해 연결되어 있다. 이와 같은 표시 방법은, 특별히 언급이 없는 한, 본 명세서의 전체를 통해서 적용된다.
도 2 는, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 중간체인, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (도 2A 의 (III) 의 분자), SG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2B 의 (IV) 의 분자), 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2C 의 (IV) 의 분자) 의 구조를 나타내는 모식도이다. 모든 도면에 있어서, Y 자형은 도 1 과 동일하게 항체 Ab 를 나타낸다. 도 2A 에 있어서, (e) 는, Fuc 의 1 위치와, GlcNAc 의 6 위치에 있어서 α 글리코시드 결합한 이당으로 이루어지는 N297 당사슬을 나타낸다. 도 2B 및 C 에 있어서, (d) 는 도 1 과 동일한 N297 당사슬을 나타내고, (f) 는 아지드기를 갖는 PEG 링커이며, 말단에 링커 L 과의 결합에 제공되는 아지드기를 나타낸다. 아지드기를 갖는 PEG 링커의 결합 양식은, 도 1 의 PEG 링커와 동일하다.
도 3 은, 동물 세포에서 산생된 항체로부터 SG 형 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정의 모식도이다. 도 중의 분자 (III) 및 (IV) 는, 도 2 와 동일하게, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 및 SG 형 당사슬 리모델링 항체 또는 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 각각 나타낸다. (V) 의 분자는 동물 세포에서 산생된 항체이고, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3A 는, (V) 의 불균일한 N297 당사슬을, EndoS 와 같은 가수분해 효소로 처리함으로써, 균일한 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (III) 이 제작되는 공정을 나타낸다. 도 3B 는, 항체 (III) 의 N297 당사슬의 GlcNAc 에 대해, EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소를 사용하여, SG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써, (IV) 의 SG 형 당사슬 리모델링 항체가 제작되는 공정을 나타낸다. 도 3C 는, 도 3B 와 동일하게, 항체 (III) 에 대해, MSG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써 (IV) 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체가 제작되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 SG 형 당사슬 도너 분자 및 MSG 형 당사슬 도너 분자는, 각각의 비환원 말단의 시알산이 아지드기를 갖는 PEG 링커로 수식된 것으로, 제작되는 SG 형 N297 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 N297 당사슬 리모델링 항체에 있어서도, 도 2B 및 C 에서 나타낸 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다.
도 4 는, 항 CD70 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 CD70 항체 1」은 「개변 항 CD70 항체 1」이라고도 부른다).
도 5 는, 항 CD70 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 CD70 항체 2」는 「개변 항 CD70 항체 2」 라고도 부른다).
도 6 은, 항 TROP2 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 5) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 나타낸다.
도 7 은, 항 TROP2 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 7) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 TROP2 항체 2」는 「개변 항 TROP2 항체」라고도 부른다).
도 8 은, 항 EGFR 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 9) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 EGFR 항체 1」은 「개변 항 EGFR 항체 1」이라고도 부른다).
도 9 는, 항 EGFR 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 EGFR 항체 2」는 「개변 항 EGFR 항체 2」라고도 부른다).
도 10 은, (a) 인간 STING 야생형의 아미노산 서열 (서열 번호 13), (b) 인간 STING REF 변이형 (R232H) 의 아미노산 서열 (서열 번호 15), 및 (c) 인간 STING HAQ 변이체 (R71H, G230A, R293Q) 의 아미노산 서열 (서열 번호 17) 을 나타낸다.
도 11 은, 항 TROP2 항체 2, 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1), 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2), 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (3) 에 의한, TROP2 발현 세포에 있어서의 STING 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 12 는, 화합물 34a, 항 CD70 항체 1, 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1), 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 에 의한, CT26.WT 및 CT26.WT-hCD70 세포주와 마우스 골수 유래 수지상 세포의 공배양 어세이계에 있어서의 활성을 나타낸다.
도 13 은, 항 TROP2 항체 1 및 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 역삼각선은, 참고예 5 에서 제작한 항 TROP2 항체 1 에 실시예 1 의 화합물 6b 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 TROP2 항체 1 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 14 는, 항 TROP2 항체 2 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 역삼각선은, 참고예 6 에서 제작한 항 TROP2 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 TROP2 항체 2 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 15 는, 항 EGFR 항체 1, 항 EGFR 항체 2, 항 EGFR 항체-CDN 컨쥬게이트의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 참고예 7 에서 제작한 항 EGFR 항체 1 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 및 참고예 8 에서 제작한 항 EGFR 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨, 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 EGFR 항체 1 투여군, 흑색 삼각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 EGFR 항체 2 투여군, 흑색 동그라미선은 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 16 은, 항 CD70 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 35), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 36), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 37), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 38), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 39), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 40) 을 나타낸다.
도 17 은, 항 CD70 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 41), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 42), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 43), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 44), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 45), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 46) 을 나타낸다.
도 18 은, 항 TROP2 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 47), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 48), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 49), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 50), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 51), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 을 나타낸다.
도 19 는, 항 TROP2 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 53), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 54), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 55), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 56), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 57), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 58) 을 나타낸다.
도 20 은, 항 EGFR 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 59), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 60), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 61), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 62), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 63), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 64) 을 나타낸다.
도 21 은, 항 EGFR 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 65), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 66), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 67), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 68), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 69), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 70) 을 나타낸다.
도 22 는, 항 CD70 항체 1, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 및 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 1 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 흰색 마름모꼴선은 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 23 은, 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 24 는, 항 EGFR 항체 1, 화합물 34a, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 EGFR 항체 1 투여군, 흰색 마름모꼴선은 화합물 34a 투여군, 흰색 사각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 2 는, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트의 제조 중간체인, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (도 2A 의 (III) 의 분자), SG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2B 의 (IV) 의 분자), 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2C 의 (IV) 의 분자) 의 구조를 나타내는 모식도이다. 모든 도면에 있어서, Y 자형은 도 1 과 동일하게 항체 Ab 를 나타낸다. 도 2A 에 있어서, (e) 는, Fuc 의 1 위치와, GlcNAc 의 6 위치에 있어서 α 글리코시드 결합한 이당으로 이루어지는 N297 당사슬을 나타낸다. 도 2B 및 C 에 있어서, (d) 는 도 1 과 동일한 N297 당사슬을 나타내고, (f) 는 아지드기를 갖는 PEG 링커이며, 말단에 링커 L 과의 결합에 제공되는 아지드기를 나타낸다. 아지드기를 갖는 PEG 링커의 결합 양식은, 도 1 의 PEG 링커와 동일하다.
도 3 은, 동물 세포에서 산생된 항체로부터 SG 형 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정의 모식도이다. 도 중의 분자 (III) 및 (IV) 는, 도 2 와 동일하게, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 및 SG 형 당사슬 리모델링 항체 또는 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 각각 나타낸다. (V) 의 분자는 동물 세포에서 산생된 항체이고, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3A 는, (V) 의 불균일한 N297 당사슬을, EndoS 와 같은 가수분해 효소로 처리함으로써, 균일한 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (III) 이 제작되는 공정을 나타낸다. 도 3B 는, 항체 (III) 의 N297 당사슬의 GlcNAc 에 대해, EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소를 사용하여, SG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써, (IV) 의 SG 형 당사슬 리모델링 항체가 제작되는 공정을 나타낸다. 도 3C 는, 도 3B 와 동일하게, 항체 (III) 에 대해, MSG 형 당사슬 도너 분자를 당사슬 전이시킴으로써 (IV) 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체가 제작되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 SG 형 당사슬 도너 분자 및 MSG 형 당사슬 도너 분자는, 각각의 비환원 말단의 시알산이 아지드기를 갖는 PEG 링커로 수식된 것으로, 제작되는 SG 형 N297 당사슬 리모델링 항체 및 MSG 형 N297 당사슬 리모델링 항체에 있어서도, 도 2B 및 C 에서 나타낸 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다.
도 4 는, 항 CD70 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 CD70 항체 1」은 「개변 항 CD70 항체 1」이라고도 부른다).
도 5 는, 항 CD70 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 CD70 항체 2」는 「개변 항 CD70 항체 2」 라고도 부른다).
도 6 은, 항 TROP2 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 5) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 6) 을 나타낸다.
도 7 은, 항 TROP2 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 7) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 TROP2 항체 2」는 「개변 항 TROP2 항체」라고도 부른다).
도 8 은, 항 EGFR 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 9) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 EGFR 항체 1」은 「개변 항 EGFR 항체 1」이라고도 부른다).
도 9 는, 항 EGFR 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 나타낸다 (본 명세서에 있어서, 「항 EGFR 항체 2」는 「개변 항 EGFR 항체 2」라고도 부른다).
도 10 은, (a) 인간 STING 야생형의 아미노산 서열 (서열 번호 13), (b) 인간 STING REF 변이형 (R232H) 의 아미노산 서열 (서열 번호 15), 및 (c) 인간 STING HAQ 변이체 (R71H, G230A, R293Q) 의 아미노산 서열 (서열 번호 17) 을 나타낸다.
도 11 은, 항 TROP2 항체 2, 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1), 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2), 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (3) 에 의한, TROP2 발현 세포에 있어서의 STING 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 12 는, 화합물 34a, 항 CD70 항체 1, 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1), 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 에 의한, CT26.WT 및 CT26.WT-hCD70 세포주와 마우스 골수 유래 수지상 세포의 공배양 어세이계에 있어서의 활성을 나타낸다.
도 13 은, 항 TROP2 항체 1 및 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 역삼각선은, 참고예 5 에서 제작한 항 TROP2 항체 1 에 실시예 1 의 화합물 6b 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 TROP2 항체 1 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 14 는, 항 TROP2 항체 2 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 역삼각선은, 참고예 6 에서 제작한 항 TROP2 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 TROP2 항체 2 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 15 는, 항 EGFR 항체 1, 항 EGFR 항체 2, 항 EGFR 항체-CDN 컨쥬게이트의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 참고예 7 에서 제작한 항 EGFR 항체 1 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 및 참고예 8 에서 제작한 항 EGFR 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨, 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 EGFR 항체 1 투여군, 흑색 삼각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 EGFR 항체 2 투여군, 흑색 동그라미선은 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 16 은, 항 CD70 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 35), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 36), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 37), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 38), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 39), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 40) 을 나타낸다.
도 17 은, 항 CD70 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 41), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 42), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 43), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 44), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 45), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 46) 을 나타낸다.
도 18 은, 항 TROP2 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 47), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 48), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 49), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 50), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 51), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 을 나타낸다.
도 19 는, 항 TROP2 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 53), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 54), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 55), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 56), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 57), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 58) 을 나타낸다.
도 20 은, 항 EGFR 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 59), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 60), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 61), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 62), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 63), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 64) 을 나타낸다.
도 21 은, 항 EGFR 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 65), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 66), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 67), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 68), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 69), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 70) 을 나타낸다.
도 22 는, 항 CD70 항체 1, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 및 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 1 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 흰색 마름모꼴선은 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 23 은, 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
도 24 는, 항 EGFR 항체 1, 화합물 34a, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 정맥내 투여에 의한 항종양 효과를 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 EGFR 항체 1 투여군, 흰색 마름모꼴선은 화합물 34a 투여군, 흰색 사각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다.
본 발명은, STING 아고니스트 활성을 갖는 신규 CDN 유도체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 사용에 관한 것이다. 그 신규 CDN 유도체는, STING 아고니스트 활성을 갖고, 면역 세포를 부활화하여 인터페론이나 사이토카인의 산생을 유도한다. 또, 그 신규 CDN 유도체는, 당해 면역 세포의 부활화에 의해 항종양 효과를 발휘한다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 그 CDN 유도체와 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 를 인식하고 결합할 수 있는 항체를 임의의 링커를 개재하여 연결시킴으로써 제작되고, 전신 투여할 수 있다. 전신 투여의 구체예로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있다.
STING (Stimulator of Interferon Genes) 이란, 소포체에 국재하는 막 관통형의 어댑터 단백질이다. STING 에는, 선천적인 다형이 높은 빈도로 존재하는 것이 알려져 있다 (PLoS One, 2013 Oct, 21, 8(10), e77846). STING 변이형으로는, 예를 들어, 232 번째의 아미노산이 아르기닌 (R) 에서 히스티딘 (H) 으로 변이한 R232H 변이나, 71 번째의 아르기닌 (R) 이 히스티딘 (H) 으로, 230 번째의 글리신 (G) 이 알라닌 (A) 으로, 293 번째의 아르기닌 (R) 이 글루타민 (Q) 으로 변이한 HAQ 변이가 알려져 있다. 이와 같은 STING 의 다형에서는, STING 아고니스트 자극에 의해 유도되는 사이토카인 산생량 등의 응답의 강도에 차이가 있는 것이 알려져 있다 (Genes and Immunity, 2011, 12, 263-269). 그 때문에, 인간에 있어서 안정적으로 STING 아고니스트가 작용하기 위해서는, 각 STING 의 형태에 대해 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「암」 및 「종양」은 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서, 「면역 부활화」란, 어떠한 형태로, 단구 (單球), 매크로파지, 수지상 세포, T 세포, B 세포, NK 세포, 호중구 등의 항종양 면역에 관여하는 면역 세포의 활성화를 일으키는 것을 말하고, 예를 들어 사이토카인 및 케모카인의 산생, 면역 활성화 마커의 발현 상승, 면역 억제성 마커의 발현 저하, 세포내 시그널 전달계의 인산화 등의 변화, 유전자 발현의 변화 등, 모든 면역 세포의 구조나 기능 상의 변화를 일으키는 것을 말한다. 또, 종양 세포가 항종양 면역을 유도하는 변화를 일으키는 것도 포함하며, 예를 들어 면역 세포를 부활화 또는 유주 (遊走) 를 유도하는 사이토카인 및 케모카인의 산생, 면역 세포에 대한 감수성 항진 등을 유도하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「항종양 효과」란, 약물에 의해 종양 세포에 대해 직접적 또는 간접적으로 영향을 미침으로써, 종양의 감소 또는 퇴축을 유도하는 것을 말한다. 예를 들어, 종양 세포에 대해 약물이 직접적인 상해를 부여하거나, 종양 세포가 약물의 자극에 의해 항종양 면역을 부활화하거나, 종양 세포에 송달된 약물이 세포외로 방출 등 되어 종양 세포 주변의 항종양 면역이 부활화되는 것 등에 의해, 종양 세포수의 감소, 및 상해, 또는 종양의 퇴축을 일으키는 것을 항종양 효과라고 한다.
본 발명에 있어서, 「세포 상해 활성」이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능 상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「세포」에는, 동물 개체내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
＜1. 신규 CDN 유도체＞
신규 CDN 유도체는, 다음 식 (I) :
[화학식 40]
로 나타내는 구조를 갖는다.
L1 은, 이하의 3 식 중 어느 것으로 나타내는 기
[화학식 41]
이다.
Q 및 Q' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타낸다. 바람직하게는, Q 및 Q' 는 모두 티올기이다.
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타낸다. R21 은, 바람직하게는 하이드록시기이다. R22 는, 바람직하게는 불소 원자이다.
W 는, -NH- 또는 황 원자이다. W 는, 바람직하게는 -NH- 이다.
그 신규 CDN 유도체의 제조 방법은, 후술하는 ＜3.제조 방법＞ 에 기재한다.
＜2. 항체 약물 컨쥬게이트＞
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 전술한 신규 CDN 유도체와 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 를 인식하고 결합할 수 있는 항체가 임의의 링커를 개재하여 연결된 항체 약물 컨쥬게이트로서 전신 투여가 가능하다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 다음 식 (II) :
[화학식 42]
로 나타낸다. m1 은 1 내지 10 의 범위이고, 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수를 나타낸다. Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고, D 는 상기 서술한 신규 CDN 유도체 (본 명세서 중, 신규 CDN 유도체가 항체 약물 컨쥬게이트의 일부로서 사용되는 경우, 간단히 「약물」이라고도 부른다) 를 나타낸다.
약물 D 는, 면역 세포를 부활화하는 활성, 구체적으로는, STING 아고니스트 활성을 갖는 화합물이다. 약물 D 는, 링커의 일부 또는 전부가 표적 세포 (예를 들어, 종양 세포 또는 면역 세포) 내에서 절단되면, 본래의 구조에서 유리되어, 면역 부활화 효과가 발휘된다. 면역 세포에 대한 표적 세포의 감수성 항진 또는 표적 세포를 통한 면역 세포의 부활화에 의해, 목적하는 기능이 발휘된다. 목적하는 기능으로는, STING 아고니스트 활성에 관련되는 기능이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항종양 활성이다. 즉, 종양을 표적으로 하는 항체 (예를 들어, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 항 EGFR 항체) 에 임의의 링커를 개재하여 연결된 약물 D 는, 표적의 세포 또는 조직에 송달되고, 링커의 일부 또는 전부가 절단되어, 면역 세포에 대한 표적 세포의 감수성 항진 또는 표적 세포를 통한시킨 면역 세포의 부활화 (예를 들어, 인터페론이나 사이토카인의 산생) 를 통해서 항종양 효과를 발휘한다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 결합되는 약물 D 는, 다음 식 (I) :
[화학식 43]
(여기서, L1, Q, Q', R21, R22 및 W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 2 식 :
[화학식 44]
(여기서, L1, Q, Q',및 W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 4 식 :
[화학식 45]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, Q, Q', 및 W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 3 식 :
[화학식 46]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 3 식 :
[화학식 47]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 4 식 :
[화학식 48]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 보다 바람직하게는 이하의 식 :
[화학식 49]
으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 식 :
[화학식 50]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 2 식 :
[화학식 51]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 식 :
[화학식 52]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 상기 ＜1. 신규 CDN 유도체＞ 에서 규정한 바와 같다) 으로 나타낸다.
또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물 D 는, 바람직하게는 이하의 2 식 :
[화학식 53]
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
＜2.1. 링커 구조＞
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서 약물을 항체에 결합시키는 링커 구조에 대해 설명한다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 링커는, 항체와 약물을 연결시키는 링커로서 당업자가 이해하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 링커로는, 예를 들어, Protein Cell, 2018, 9 (1) : 33-46, Pharm Res, 2015, 32 : 3526-3540, 또는 Int. J. Mol. Sci., 2016, 17, 561 에 기재되는 링커를 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 링커는, 생체 내에서 절단 되는 링커여도 되고, 생체 내에서 절단되지 않는 링커여도 되지만, 바람직하게는 생체 내에서 절단되는 링커이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 링커로는, 예를 들어, 약물을 항체의 Fc 부분의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬에 결합시키는 (본 명세서 중, 「당사슬 컨쥬게이션」이라고 하는 경우가 있다) 링커 (예를 들어, WO2018/003983 에 기재된다), 또는 약물을 항체의 임의의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인 잔기 또는 리신 잔기) 에 결합시키는 링커 (예를 들어, WO2014/057687 에 기재된다) 를 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 약물을 항체의 임의의 아미노산 잔기에 결합시키는 링커로는, 바람직하게는 Ab 의 시스테인의 술프하이드릴기 (SH기) 와 티오에테르 결합하는 경우 (본 명세서 중, 「시스테인 컨쥬게이션」이라고 하는 경우가 있다) 또는 Ab 의 리신의 아미노기 (NH2 기) 와 아미드 결합하는 경우 (본 명세서 중, 「리신 컨쥬게이션」이라고 하는 경우가 있다) 를 들 수 있고, 바람직하게는 시스테인 컨쥬게이션이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 바람직한 링커 L 은, 다음의 식으로 나타낸다.
-Lb-La-Lp-Lc-*
(여기서, 별표는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타낸다)
먼저, Lp 에 대해 설명한다. Lp 는, 생체 내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커 (이하, 본 명세서 중, 펩티드 링커라고도 한다) 를 나타내거나, 또는 존재하지 않는다.
Lp 는, 예를 들어, 펩티다아제나 에스테라아제 등의 효소의 작용에 의해 절단된다. Lp 는, 2 내지 7 개 (바람직하게는 2 내지 4 개) 의 아미노산으로 구성되는 펩티드이다. Lp 는, 그 N 말단에 있어서 후술하는 La 의 우단의 카르보닐기와 아미드 결합을 형성하고, C 말단에 있어서 Lc 의 아미노기 (-NH-) 와 아미드 결합을 형성한다. 상기 펩티다아제 등의 효소에 의해, Lp 의 C 말단측의 아미드 결합이 절단된다.
Lp 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이고, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는, 예를 들어, N-메틸화된 아미노산 등의 비천연형의 아미노산이어도 된다. Lp 의 아미노산 서열은 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe ; F), 글루탐산 (Glu ; E), 이소류신 (Ile ; I), 프롤린 (Pro ; P), 시트룰린 (Cit), 류신 (Leu ; L), 메티오닌 (Met ; M), 세린 (Ser ; S), 리신 (Lys ; K), 및 아스파르트산 (Asp ; D) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 바람직하게는, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe : F), 시트룰린 (Cit), 이소류신 (Ile ; I), 프롤린 (Pro ; P) 이다. 이들 아미노산은 중복되어도 되고, 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 아미노산의 종류에 따라, 약물 유리의 패턴을 컨트롤할 수 있다.
Lp 의 구체예로는, 예를 들어, -GGFG-, -GGPI-, -GGVA-, -GGFM-, -GGVCit-, -GGFCit-, -GGICit-, -GGPL-, -GGAQ-, -GGPP- 를 들 수 있다. 링커 Lp 는, 바람직하게는 -GGFG- 또는 -GGPI- 이고, 보다 바람직하게는 -GGFG- 이다.
다음으로, La 에 대해 설명한다. La 는, 이하 :
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-(CH2)n4-O-C(=O)-, 및,
-(CH2)n9-C(=O)-
(여기서, 식 중, n2 는 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는 1 또는 2) 를 나타내고, n3 은 1 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는 3 또는 4) 를 나타내고, n4 는 0 ∼ 2 의 정수 (바람직하게는 0 또는 1) 를 나타내고, n9 는 2 ∼ 7 의 정수 (바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는, 2, 3 또는 5) 를 나타낸다) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
La 는, 바람직하게는 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)-,
-OC(=O)-, 및
-(CH2)5-C(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
La 는, 보다 바람직하게는,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-, 또는
-(CH2)5-C(=O)-
이다.
La 는, 더욱 바람직하게는 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 이다.
다음으로, Lb 에 대해 설명한다. Lb 는, 당사슬 컨쥬게이션의 링커에 사용되는 스페이서 (본 명세서 중, 「당사슬 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」라고도 한다), 또는 시스테인 컨쥬게이션의 링커에 사용되는 스페이서 (본 명세서 중, 「시스테인 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」라고도 한다) 를 나타낸다.
＜Lb 가 「당사슬 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」인 경우＞
Lb 가 「당사슬 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」인 경우, Lb 는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 스페이서를 들 수 있다.
[화학식 54]
또는
[화학식 55]
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, 별표 (*) 는 La 의 좌단의 -(C=O)-, -CH2- 또는 -OC(=O)- 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
Lb 로 Lb-1 또는 Lb-3 을 선택하는 경우, 트리아졸 고리 부위는, 기하 이성 구조를 갖고, 1 개의 Lb 중에, 2 종류의 구조 중 어느 일방을 포함하거나, 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 항체 1 분자에 복수의 약물을 결합시킬 수 있다. 항체 1 분자에 복수의 약물을 결합시키는 경우, Lb 도 복수 존재하게 된다 (예를 들어, 후술하는 ＜3. 제조 방법＞ 의 E 법에 나타낸 항체 약물 컨쥬게이트의 모식도 (1e) 를 참조). Lb 가 Lb-1 또는 Lb-3 에서 선택되고, 그 Lb 가 항체 1 분자에 대해 복수 존재하는 경우 (예를 들어, 후술하는 m2 가 1 또는 2 의 경우), 각각의 Lb 에 있어서, 트리아졸 고리 부위는 기하 이성 구조를 갖고, 1 개의 Lb 중에, 2 종류의 구조 중 어느 일방을 포함하거나, 또는 그들의 혼합물을 포함한다.
＜Lb 가 「시스테인 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」인 경우＞
Lb 가, 「시스테인 컨쥬게이션의 링커의 스페이서」인 경우, Lb 는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, -(숙신이미드-3-일-N)- 을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 「-(숙신이미드-3-일-N)-」은, 다음 식 :
[화학식 56]
으로 나타내는 구조를 갖는다. 상기에서 나타내는 구조식에 있어서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 항체의 시스테인 잔기의 측사슬과 티오에테르를 형성하여 결합하고 있는 것을 나타낸다.
다음으로, Lc 에 대해 설명한다. Lc 는, -NH-CH2-, -NH-페닐기-CH2-O(C=O)- 또는 -NH-헤테로아릴기-CH2-O(C=O)- 를 나타내거나, 혹은, 존재하지 않는다. 여기서, 페닐기로는, 바람직하게는 1,4-페닐기이고, 헤테로아릴기로서 바람직하게는, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기이다. Lc 는, 바람직하게는 -NH-CH2- 이거나, 또는 존재하지 않는다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 보다 바람직한 링커 L 은, 약물과 항체의 결합 양식이 「당사슬 컨쥬게이션」인 경우,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGICit-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFM-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGLM-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-FG-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, 또는
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-
(여기서, ZL1 은, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 57]
을 나타낸다) 이고, 혹은 약물과 항체의 결합 양식이 「시스테인 컨쥬게이션」인 경우,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGICit-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFM-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGPI-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGLM-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-FG-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-VA-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-,
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, 또는
-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-,
(여기서, ZL2 는, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 58]
으로 나타내는 -(숙신이미드-3-일-N)- 을 나타낸다.)
이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 보다 더 바람직한 링커 L 은, 약물과 항체의 결합 양식이 「당사슬 컨쥬게이션」이고,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
또는
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-CH2-,
(여기서, ZL1 은, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 59]
을 나타낸다) 이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 한층 더 바람직한 링커 L 은, 약물과 항체의 결합 양식이 「당사슬 컨쥬게이션」이고,
-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-,
(여기서, ZL1 은, 상기 Lb 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 60]
을 나타낸다) 이다.
상기 「바람직한 링커 L」, 「보다 바람직한 링커 L」, 「보다 더 바람직한 링커 L」 및 「한층 더 바람직한 링커 L」에 있어서의 우단은, 약물 D 와 결합하고 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 「링커 L-약물 D」는, 바람직하게는 이하의 2 식 :
[화학식 61]
(여기서, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 「링커 L-약물 D」는, 보다 바람직하게는 이하의 2 개의 식 :
[화학식 62]
(여기서, 파선은, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 「링커 L-약물 D」는, 보다 바람직하게는, 이하의 식 :
[화학식 63]
(여기서, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타낸다.
＜2.2. 항체 및 그 당사슬 수식＞
＜2.2.1 항체＞
본 명세서에 있어서, 「유전자」란, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 함유되는 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 서열, 또는 그 상보 사슬을 의미하고, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 함유되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 사슬인 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, RNA 등은 「유전자」의 의미에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 「뉴클레오티드」, 「폴리뉴클레오티드」또는 「뉴클레오티드 서열」과 「핵산」은 동일한 의미이며, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 프라이머 등도 「뉴클레오티드」또는 「뉴클레오티드 서열」의 의미에 포함된다.
본 명세서에 있어서는, 「폴리펩티드」, 「펩티드」, 「단백질」은 구별하지 않고 사용되고 있다.
본 명세서에 있어서, 「항체의 기능성 단편」이란, 「항체의 항원 결합 단편」이라고도 불리며, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전장 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 항체의 기능성 단편은, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 받는 아스파라긴 (Asn297) 및 그 주변의 아미노산을 유지하고, 또한 항원과의 결합능을 갖고 있는 기능성 단편을 포함한다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 항체는, 면역 글로블린을 의미하고, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자이다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 항체로서, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 중 어느 클래스여도 되지만, IgG 가 바람직하다. 또, 서브클래스로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 중 어느 것이어도 되지만, IgG1, IgG2 또는 IgG4 가 바람직하다 (IgG 중사슬의 Fc 영역에 ADCC 및 ADCP 활성에 영향을 미치는 변이를 갖는 항체를 포함한다).
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 항체의 아이소 타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다 (WO88/07089, WO94/28027, WO94/29351 참조). IgG1 의 변이체로는, 예를 들어, IgG1 LALA 변이 (IgG1-L234A, L235A) 를 들 수 있다. 상기 L234A, L235A 는, EU index (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 63, No.1 (May 15, 1969), pp. 78-85) 에 의해 특정되는 234 위치 및 235 위치의 류신의 알라닌에 대한 치환을 나타낸다.
항체의 정상 영역에는 복수의 알로타입이 있는 것이 알려져 있다. 예를 들어 IgG1 중사슬에 대해서는 G1m17, G1m3, G1m1, G1m2 를 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 정상 영역으로는, 특별히 한정되지 않지만, G1m17 또는 G1m3 을 사용하는 것이 바람직하다.
항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 군데의 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity determining region) 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리며, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 일차 구조의 변이성이 특히 높은 부위로, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 일차 구조 상에 있어서, 각각 3 군데로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스 및 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기술을 사용하여 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항체에는, 래트 항체, 마우스 항체, 토끼 항체 등의 비인간 동물 유래의 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 기능성 단편, 또는 그들의 수식체가 포함된다.
항체는, 바람직하게는 종양 세포 또는 면역 세포를 표적으로 하는 항체이지만, 이들에 한정되지 않는다. 항체는, 보다 바람직하게는 종양 세포를 표적으로 하는 항체이다.
종양 세포를 표적으로 하는 항체가 사용되는 경우, 항체로는, 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 종양 세포 내에 도입되어 내재화되는 특성, 나아가서는 종양 세포를 상해하는 특성의 1 또는 그 이상의 특성을 구비하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 약물은, STING 아고니스트 활성을 갖는다. 그 약물은, 인터페론 제어 인자 3 (interferon regulatory factor-3 (IRF3)) 의 시그널을 활성화하여 인터페론을 유도한다. 따라서, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 종양 세포를 표적으로 하는 항체가 사용되는 경우, 항체 약물 컨쥬게이트는 체내에 투여된 후, 종양 부위에 송달되고, 종양 세포 내에 도입된 다음 펩티다아제 등에 의해 링커 부분이 절단되어 약물 부분이 유리된다. 유리된 약물 부분은 STING 아고니스트 활성을 통하여 면역 세포에 대한 종양 세포의 감수성을 항진함과 함께 항종양 면역을 부활화하여, 항종양 효과를 발휘시키는 것으로 생각된다. 혹은, 종양 세포에 집적한 항체 약물 컨쥬게이트가 내재화되지 않아도, 종양 세포 및/또는 항체 약물 컨쥬게이트가 빈식 (貧食) 작용에 의해 면역 세포에 도입되고, STING 아고니스트 활성을 통해서 항종양 면역을 부활화하여, 항종양 효과를 발휘시키는 것도 생각된다.
항체의 종양 세포에 대한 결합성은, 플로사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포 내로의 항체의 도입은, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포 내에 도입되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 을 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리콤비넌트 복합 단백질도 사용 가능하다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 종양 세포를 표적으로 한 항체를 사용하는 경우, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은 바람직하지만, 필수는 아니다.
약물 그리고 항체 약물 컨쥬게이트의 항종양 활성은, 종양 세포에 대한 세포 상해 활성, 항세포 효과, 종양 체적의 퇴축을 말한다. 공지된 in vitro 또는 in vivo 의 평가계를 사용하여, 항종양 활성을 확인할 수 있다.
약물 그리고 항체 약물 컨쥬게이트의 작용 및 면역 부활화 활성은, 면역 세포에 대한 종양 세포의 감수성 항진 또는 종양 세포를 통한 면역 세포의 부활화를 말한다. 공지된 in vitro 또는 in vivo의 평가계를 사용하여, 약물 그리고 항체 약물 컨쥬게이트의 작용 및 면역 부활화 활성을 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 in vitro 또는 in vivo 의 평가계로는, 시험예 4 에 기재된, CT26.WT 및 CT26.WT-hCD70 세포주와 마우스 골수 유래 수지상 세포의 공배양 어세이계, 시험예 5 에 기재된, 마우스 대장암 세포주 CT26.WT 에 인간 TROP2 유전자를 도입한 CT26.WT-hTROP2 세포가 피하 이식된 BALB/c 마우스의 계, 시험예 6 에 기재된, 마우스 대장암 세포주 CT26.WT 에 인간 EGFR 유전자를 도입한 CT26.WT-hEGFR 세포가 피하 이식된 BALB/c 마우스의 계, 시험예 7 에 기재된, 인간 신암 세포주 Caki-1 세포를 피하 이식한 BALB/c-nu 마우스의 계, 시험예 8 에 기재된, 인간 신암 세포주 A-498 (HTB-44) 세포가 피하 이식된 BALB/c-nu 마우스의 계, 시험예 9 에 기재된, 항체 약물 컨쥬게이트에 포함되는 항체가 결합하는 항원 상의 에피토프 부위가 인간형으로 치환된 인간 마우스 키메라 항원의 유전자를 도입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 가 피하 이식된 BALB/c 마우스의 계 등을 예시할 수 있지만, 그것들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 항체로는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 또는 항 EGFR 항체를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체는, 이 분야에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497, Kennett, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라서, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하고, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
또한, 항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 항체는 공지된 방법 (예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984), Nature (1986) 321, p. 522-525, WO90/07861) 에 따라서 취득할 수 있다.
예를 들어, 항 CD70 항체 (WO2004/073656, WO2007/038637 등), 항 TROP2 항체 (WO2015/098099 등), 항 EGFR 항체 (WO1998/050433, WO2002/092771 등) 는, 공지된 수단에 의해 취득할 수 있다.
본 발명에 사용되는 항 CD70 항체는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) CD70 에 특이적으로 결합하는 항 CD70 항체.
(2) 인간 CD70 의 세포외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 인간 모노클로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및 ADCP 활성의 저감을 가져오는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 에 기재된 항체.
(7) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU 인덱스에 의해 나타나는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (5) 에 기재된 항체.
(8) 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
항 CD70 항체로는, 예를 들어, vorsetuzumab, MDX-1115, Cusatuzumab 을 들 수 있고, 바람직하게는 vorsetuzumab, MDX-1115 를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 항 TROP2 항체는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) TROP2 에 특이적으로 결합하는 항 TROP2 항체.
(2) 인간 TROP2 의 세포외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 인간 모노클로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및 ADCP 활성의 저감을 가져오는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 에 기재된 항체.
(7) 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(8) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU 인덱스에 의해 나타나는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (5) 에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체.
(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
본 발명에 사용되는 항 EGFR 항체는 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) EGFR 에 특이적으로 결합하는 항 EGFR 항체.
(2) 인간 EGFR 의 세포외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체, 인간 모노클로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, ADCC 및 ADCP 활성의 저감을 가져오는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 에 기재된 항체.
(7) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이고, EU 인덱스에 의해 나타나는 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (5) 에 기재된 항체.
(8) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(10) 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (7) 에 기재된 항체.
(12) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
항 EGFR 항체로는, 예를 들어, panitumumab, nimotuzumab, cetuximab, ametumumab (SY-101), SYN-004, SCT-200, tomuzotuximab, GC-1118, GR-1401, depatuxizumab (ABT-806) 을 들 수 있고, 바람직하게는 panitumumab, ABT806 을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 항체는, 상기한 항체의 중사슬 및/또는 경사슬과 비교하여 80 ％ 내지 99 ％ 의 아미노산 동일성을 갖는 항체여도 된다. 여기서 「동일성」의 용어는, 당 분야에서 사용되는 일반적인 정의를 갖는 것으로 한다. 동일성의 ％ 는, 2 개의 아미노산 서열을 아미노산의 일치도가 최대가 되도록 정렬 (얼라이먼트) 시켰을 때의 총 아미노산수 (갭을 포함한다.) 당의 동일 아미노산수의 퍼센티지를 가리킨다. 이와 같은 동일성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 동일성이고, 바람직하게는 90, 91, 92, 93 또는 94 ％ 이상의 동일성이고, 보다 바람직하게는 95, 96, 97 또는 98 ％ 이상의 동일성이며, 더욱 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성이다. 또, 중사슬 및/또는 경사슬의 아미노산 서열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 조합하는 것에 의해서도, 상기한 각 항체와 동등한 각종 작용을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 치환, 결실 및/또는 부가되는 아미노산 잔기수는, 일반적으로는 10 아미노산 잔기 이하이고, 바람직하게는 5 내지 6 아미노산 잔기 이하이며, 보다 바람직하게는 2 내지 3 아미노산 잔기 이하이고, 더욱 바람직하게는 1 아미노산 잔기이다.
＜2.2.2 항체의 당사슬 리모델링＞
최근, 불균일한 항체의 당사슬을, 효소 반응에 의해 리모델링하여, 관능기를 갖는 당사슬을 균일하게 도입하는 방법이 보고되어 있다 (ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122, ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7, 1005-1008). 이 당사슬 리모델링 기술을 사용하여, 부위 특이적으로 약물을 도입하고, 균일한 ADC 를 합성하는 시도도 이루어져 있다 (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2233-2242, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US2016361436).
당사슬의 리모델링은, 먼저 가수분해 효소를 이용하여, 단백질 (항체 등) 에 부가되어 있는 불균일한 당사슬을 말단의 GlcNAc 만 남기고 절제하여, GlcNAc 가 부가된 균일한 단백질 부분을 조제한다 (이하, 「억셉터」라고 한다). 다음으로, 별도 조제한 임의의 당사슬을 준비하고 (이하, 「도너」라고 한다), 이 억셉터와 도너를, 당전이 효소를 사용하여 연결한다. 이로써, 임의의 당사슬 구조를 갖는 균일한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「당사슬」이란, 2 개 이상의 단당이 글리코시드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어"GlcNAc-", "SG-" 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 다른 구조 단위와의 글리코시드 결합에 귀속되는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 발명에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고, 또한, 하이드록시기 (또는 글리코시드 결합에 귀속되는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체로서 부여된 것으로, 이 룰은 반드시 적용되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, SG, MSG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를 당해 기호에 포함하는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코시드 결합에 귀속되는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 다음 식 :
[화학식 64]
으로 나타내고, 항체 Ab 또는 그 기능성 단편은, 그 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있다.
본 발명에 있어서의 Ab 의 당사슬은, N 결합형 당사슬이나 O 결합형 당사슬이고, 바람직하게는 N 결합형 당사슬이다.
N 결합형 당사슬은 N 글리코시드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코시드 결합에 의해, 항체의 아미노산 측사슬과 결합하고 있다.
본 발명에 있어서의 Ab 는, IgG 이고, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이다.
IgG 는 그 중사슬의 Fc 영역에 있어서의 297 번째의 아스파라긴 잔기 (이하, 「Asn297 또는 N297」이라고 한다) 에 잘 보존된 N 결합형 당사슬 (이하, 「Asn297 당사슬 또는 N297 당사슬」이라고 한다) 을 가지고 있고, 항체 분자의 활성이나 동태 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (Eon-Duval, A. et al, Biotechnol. Prog. 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem. 2013, 85, 715-736).
IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, Edelman 등의 보고 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63, 78-85, (1969)) 에 있어서, 각각의 아미노산이 EU 번호 (EU INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가되는 Asn297 은, EU 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이고, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해 실제의 아미노산 위치가 변동했을 경우라도 EU 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
하기 도면은 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트가 항체 또는 그 기능성 단편의 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우를 나타낸다.
[화학식 65]
또한, 당해 리모델링된 당사슬을 갖는 항체를 당사슬 리모델링 항체라고 한다.
SGP (α2,6-SGP) 는, Sialylglycopeptide 의 약어로, N 결합형 당 펩티드의 대표적인 것이다. SGP 는, 예를 들어, WO2011/027868 에 기재된 방법에 따라서, 계란의 노른자로부터 단리 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 도쿄 화성 공업 및 후시미 제약소로부터 판매되고 있다. 본 명세서에 있어서, SGP 의 당사슬 부분을 SG 로 표기하고, SG 의 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손된 당사슬을 SG(10) 이라고 표기한다. SG(10) 은, 예를 들어, 우메카와 등의 보고 (Biochim. Biophys. Acta 2010, 1800, 1203-1209) 를 참조하여, SGP 의 효소적인 가수분해에 의해 조제할 수 있다. 또, SG(10) 도 도쿄 화성 공업 및 후시미 제약소로부터 구입할 수 있다.
본 명세서에 있어서, SG(10) 의 β-Man 의 분기 사슬의 어느 일방에서만 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG(9) 로 표기하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2, 로 각각 표기한다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 리모델링된 당사슬은, N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물이고, 바람직하게는 N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 이며, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)SG 또는 N297-(Fuc)MSG1 이다.
N297-(Fuc)SG 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 66]
[화학식 67]
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG1 은 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 68]
[화학식 69]
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 70]
[화학식 71]
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 인 경우, 항체는 이량체이기 때문에, 항체 약물 컨쥬게이트는 4 개의 링커 L 및 4 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 2) 가 된다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 그들의 혼합물인 경우, 항체는 이량체이기 때문에, 항체 약물 컨쥬게이트는 2 개의 링커 L 및 2 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 1) 가 된다 (도 1 참조).
N297 당사슬은, 바람직하게는 N297-(Fuc)SG 혹은 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 이고, 보다 바람직하게는, N297-(Fuc)SG 또는 N297-(Fuc)MSG1 이고, 더욱 바람직하게는 N297-(Fuc)SG 이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 혹은 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 인 경우, 균일성이 높은 ADC 를 취득할 수 있다.
＜3. 제조 방법＞
본 발명의 신규 CDN 유도체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그 제조 중간체의 대표적인 제조 방법을 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해, 각 반응식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉, 「식 (1) 의 화합물」, 「화합물 (1)」등으로 부른다. 또, 이것 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
하기의 A 법 ∼ E 법에 있어서, 치환기 L1 은 상기와 동일한 의미이다. 치환기 L2 는, 하기 (i) 또는 (ii) :
(i) L 과 결합할 때, L2 는, -NHR', 하이드록시 C1-C6 알킬기 또는 아미노 C1-C6 알킬기를 나타내고, 여기서, R' 는, 수소 원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타내고, 그 C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기 또는 C2-C6 알키닐기는, 1 내지 6 개의 할로겐 원자로 치환되어도 된다 ; 또는
(ii) L 과 결합하지 않을 때, L2 는, 수소 원자 또는 할로겐 원자를 나타낸다,
에서 선택되는 기를 나타낸다. 치환기 W1 은, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다. 치환기 W2 는, -CH= 를 나타낸다. 치환기 Z1 ∼ Z3 은, 하나가 되어, -CH2-CH2-CH2- 를 나타낸다. 치환기 R1 ∼ R3 은, 각각 독립적으로, 수소 원자, 할로겐 원자, -OR', -OC(=O)R', -N3, -NHR', -NR'R'' 또는 -NHC(=O)R' (여기서, R' 는, 앞에서 정의한 바와 같고, R'' 는, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C2-C6 알키닐기 또는 C3-C6 시클로알킬기를 나타낸다) 를 나타낸다. 치환기 R4 는, 수소 원자를 나타낸다. 치환기 R5 는, W1 이 질소 원자일 때, R5 는 수소 원자를 나타내고, W1 이 산소 원자일 때, R5 는 존재하지 않는다. 치환기 Ra, Rc, Re 및 Rg 는, 천연형 α-아미노산의 측사슬을 나타낸다. 예를 들어, 메틸기, 이소프로필기, sec-부틸기, 이소부틸기, 벤질기 등이다. PRO1 은, 제 1 급 알코올의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, 4,4'-디메톡시트리틸기, 4-메톡시트리틸기 등이다. PRO2, PRO3, PRO7, PRO8 은, 제 2 급 알코올의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는 tert-부틸디메틸실릴기, 트리이소프로필실릴옥시메틸기, 벤조일기, 2-니트로벤질기, 4-메톡시테트라하이드로피란-4-일기 등이다. PRO6 은 카르복실산의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, tert-부틸기, 벤질기 등이다. PRO5, PRO9 는, 아민의 보호기를 나타낸다. PRO5 는, 바람직하게는 tert-부틸옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기, 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기 등이고, PRO9 는, 바람직하게는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 또는 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기이다. PRO4 는, 알코올 또는 아민의 보호기를 나타낸다. 알코올의 경우, 바람직하게는 tert-부틸디메틸실릴기, 벤조일기 등이고, 아민의 경우, 바람직하게는 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기, tert-부틸옥시카르보닐기 등이다. Qa 는 산소 원자 또는 황 원자를 나타내고, Qb 는 하이드록시기 또는 티올기를 나타낸다. Qa' 및 Qb' 는, 각각 독립적으로, 마이너스로 하전된 산소 원자 (O-) 또는 황 원자 (S-) 를 나타낸다. Rx 및 Ry 는, 각각 독립적으로, 할로겐 원자 또는 -O-PRO2 를 나타낸다. n 은 1 내지 3 의 정수를 나타낸다.
A 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (1) 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 72]
본 제조법은 일반식 (1) 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 본 제조법의 A-1 공정에서부터 A-5 공정까지는 원 포트 합성이 가능한데, 이것은, Gaffney 등의 보고 (Org. Lett. 2010, 12, 3269-3271) 를 참조하여 실시할 수 있다.
[화학식 73]
(A-1 공정)
본 공정은, 식 (1a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 가수분해 반응과 시아노에틸기의 제거를 연속적으로 실시함으로써, 식 (2a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (1a) 를 용매 (아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, N,N-디메틸포름아미드 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -10 ℃ 에서부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 물 및 산 (피리딘트리플루오로아세트산염, 4,5-디시아노이미다졸, 1H-테트라졸 등) 으로 처리함으로써 가수분해 반응을 실시하였다. 화합물 (1a) 1 몰에 대해, 물은 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 10 몰 사용하고, 산은 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 이어서, 이 반응액에 염기 (tert-부틸아민 등) 를 첨가하여 시아노에틸기를 제거하였다. 염기는, 화합물 (1a) 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하였다. 반응 시간은, 5 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 15 분간 내지 1 시간이다. 반응액을 감압하에 농축하여, 화합물 (2a) 의 조체 (粗體) 를 얻었다. 화합물 (2a) 의 조체는, 정제하지 않고 다음의 공정으로 진행시킬 수 있다.
(A-2 공정)
본 공정은, 식 (2a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하여, 식 (3a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정의 반응을 개시하기 전에, 필요에 따라, 아세토니트릴을 사용하여 1 회에서 3 회 공비하여, 식 (2a) 의 조체를 건조시켰다. PRO1 이 4,4'-디메톡시트리틸기인 경우, 화합물 (2a) 를 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등) 중에서, -10 ℃ 에서부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 물과 산 (디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등) 으로 처리함으로써 4,4'-디메톡시트리틸기를 제거하였다. 화합물 (2a) 1 몰에 대해, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 10 몰 내지 20 몰 사용하고, 산은, 반응에 사용하는 용매로 1 ％ 내지 50 ％ (v/v), 바람직하게는 5 ％ 내지 10 ％ (v/v) 까지 희석하고, 그 희석 용액을 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 15 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 반응액에 피리딘을 첨가하여 반응 정지 처리를 하였다. 피리딘은 사용한 산을 충분히 중화할 수 있는 양, 바람직하게는 산 1 몰에 대해 2 몰에서 10 몰 사용하였다. 반응액을 감압하에 농축하여, 화합물 (3a) 의 조체를 얻었다. 화합물 (3a) 의 조체를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회에서 5 회 공비하였다. 마지막 공비시에 아세토니트릴을 남겨, 화합물 (3a) 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액을, 그대로 다음의 공정으로 진행시켰다.
(A-3 공정)
본 공정은, 식 (3a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (4a) 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 황화 반응을 연속적으로 실시함으로써, 식 (5a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정의 반응을 개시하기 전에, 화합물 (4a) 를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회에서 5 회 공비하였다. 마지막 공비시에 아세토니트릴을 남겨, 화합물 (4a) 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 조제하였다. 이 용액에 건조제 (분말상 또는 펠릿상의 몰레큘러시브 3A 혹은 몰레큘러시브 4A) 를 첨가하여, 용액을 사용할 때까지 질소 또는 아르곤 분위기하에서 보존하였다. 화합물 (3a) 의 아세토니트릴 용액에, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 공비에 의해 건조시킨 화합물 (4a) 의 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 커플링 반응을 실시하였다. 반응 시간은, 1 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 6 시간이다. 이어서, 이 반응액에 황화제 (N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드, 3H-1,2-벤조디티올-3-온 등) 를 첨가하여 황화 반응을 실시하였다. 황화제는 화합물 (3a) 1 몰에 대해 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액을 감압하에 농축하여, 화합물 (5a) 의 조체를 얻었다. 얻어진 화합물 (5a) 의 조체는, 그대로 다음의 공정으로 진행시켰다.
(A-4 공정)
본 공정은, 식 (5a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하여, 식 (6a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO1 이 4,4'-디메톡시트리틸기인 경우, 화합물 (5a) 의 화합물을 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등) 중에서, -10 ℃ 에서부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 물과 산 (디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산 등) 으로 처리함으로써 4,4'-디메톡시트리틸기를 제거하였다. 화합물 (5a) 1 몰에 대해, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 10 내지 20 몰을 사용하고, 산은, 반응에 사용하는 용매로 1 ％ 내지 50 ％ (v/v), 바람직하게는 5 ％ 내지 10 ％ (v/v) 까지 희석하고, 그 희석 용액을 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 15 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 3 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 30 분간이다. 반응액에 피리딘을 첨가하여, 반응 정지 처리를 하였다. 피리딘은 사용한 산을 충분히 중화할 수 있는 양, 바람직하게는 산 1 몰에 대해 10 몰 내지 200 몰 사용하였다. 반응액을 감압하에 농축하여, 화합물 (6a) 의 조체를 얻었다. 얻어진 화합물 (6a) 의 조체를, 그대로 다음의 공정으로 진행시켰다.
(A-5 공정)
본 공정은, 식 (6a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 고리화 반응과 황화 반응을 연속적으로 실시하여, 식 (7a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (6a) 를 피리딘에 용해 후, 감압하에 농축하여 0.01 M 내지 0.5 M 의 피리딘 용액을 조제하였다. 이 피리딘 용액에, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 탈수 축합제 (2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 등) 를 첨가함으로써 고리화 반응을 실시하였다. 탈수 축합제는, 화합물 (6a) 1 몰에 대해, 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 1 시간이다. 이어서, 이 반응액에 물과 황화제 (3H-1,2-벤조디티올-3-온, N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드 등) 를 첨가하여 황화 반응을 실시하였다. 화합물 (6a) 1 몰에 대해, 물은 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하고, 황화제는 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 12 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 3 시간이다. 반응액을 탄산수소나트륨 수용액 (0.1 M 내지 1 M 까지) 에 첨가한 후, 15 분간 내지 24 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (아세트산에틸, 디에틸에테르, 톨루엔 또는 그들의 혼합 용매) 로 1 회에서 5 회 추출한 후, 추출액을 합하여 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에 농축하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올, 헥산/아세트산에틸 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (7a) 를 2 종류 이상의 디아스테레오머 혼합물 또는 2 종류 이상의 순수한 디아스테레오머로서 얻었다. 본 공정에서는 많은 경우, 2 종류의 디아스테레오머가 얻어지지만, 원료 (1a) 및 (4a) 에 따라서, 추가로 1 종류 또는 2 종류의 디아스테레오머가 얻어지는 경우도 있다. 얻어진 화합물 (7a) 가 복수의 디아스테레오머 혼합물이어도, 그 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행시킬 수 있다.
(A-6 공정)
본 공정은, 식 (7a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 시아노에틸기 및 모든 아실계 보호기를 동시에 제거하여, 식 (8a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정은, 필요에 따라 오토클레이브 중, 또는 실드 튜브 중에서 실시하였다. PRO4 가 벤조일기인 경우, 화합물 (7a) 의 화합물을 용매 (메탄올, 에탄올, 테트라하이드로푸란 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 5 ℃ 에서부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지에 있어서, 28 ％ (v/v) 암모니아수로 처리함으로써 시아노에틸기와 벤조일기를 제거하였다. 암모니아는, 화합물 (7a) 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 300 몰 내지 3000 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 96 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 48 시간이다. 필요에 따라 반응액을 농축하고, 잔류물을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (8a) 를 얻었다. 얻어진 화합물 (8a) 가 디아스테레오머 혼합물이어도, 그 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행시킬 수 있다. 또, 본 공정에서는 정제를 하지 않고 그대로 다음의 공정으로 진행시킬 수도 있다.
(A-7 공정)
본 공정은, 식 (8a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 모든 실릴계 보호기를 동시에 제거하여, 식 (9a) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO2 및 PRO3 이 tert-부틸디메틸실릴기인 경우, 화합물 (8a) 를, 5 ℃ 에서 100 ℃ 까지, 바람직하게는 35 ℃ 에서 60 ℃ 까지에 있어서, 직접 트리에틸아민삼불화수소산염으로 처리함으로써 tert-부틸디메틸실릴기를 제거하였다. 트리에틸아민삼불화수소산염은, 화합물 (8a) 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 100 내지 200 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 12 시간이다. 반응액을 실온까지 냉각 후, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소 트리에틸암모늄 수용액과 트리에틸아민의 3 : 1 내지 10 : 1 (v/v) 의 혼합 용액을 조금씩 부어 반응 정지 처리를 하였다. 필요에 따라, 반응액을 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액과 트리에틸아민의 혼합 용액에 부어도 된다. 이 경우에는, 반응 용기를 아세토니트릴과 물로 세정하였다. 트리에틸아민은 반응액의 액성을 약염기성으로 변화시킬 수 있는 충분한 양, 바람직하게는 트리에틸아민삼불화수소산염 1 몰에 대해, 트리에틸아민을 약 2 몰 사용한다. 반응액의 유기 용매 성분을 감압하에서 증류 제거한 후, 잔류한 수용액을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (9a) 를 단일 디아스테레오머로서 얻었다.
(A-8 공정)
본 공정은, 식 (9a) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 이온 교환하여, 식 (1) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 양이온 교환 수지 (BT AG (등록상표) 50W-X2 레진, 100-200 메시, 수소형) 를 순수에 현탁시켜, 빈 칼럼 카트리지에 충전하였다. 양이온 교환 수지는, 중량비로 화합물 (9a) 의 10 배에서 50 배량 사용하였다. 과잉의 순수를 자연 유하 (流下) 시킨 후, 1 M 수산화나트륨 수용액을 3 칼럼 체적 자연 유하시키고, 이어서, 6 칼럼 체적의 순수를 자연 유하시켰다. 화합물 (9a) 를 약 3 칼럼 체적의 순수에 용해하고, 칼럼에 챠지하였다. 화합물이 순수에 용해되기 어려운 경우에는, 소량의 유기 용매 (아세토니트릴, 메탄올 등) 와의 혼합액을 사용해도 된다. 자연 유하시킨 용액을 분취 후, 다시 6 칼럼 체적의 순수 등으로 용출하여, 획분을 분취하였다. 목적물을 함유하는 획분을 함께 동결 건조하여, 화합물 (1) 을 단일 디아스테레오머로서 얻었다.
A' 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (1') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 74]
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1') 의 화합물은 A 법 A-5 공정을 이하에 나타내는 A'-5 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 75]
(A'-5 공정)
본 공정은, 식 (6a') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 고리화 반응과 산화 반응을 연속적으로 실시하여, 식 (7a') 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (6a') 를 피리딘에 용해 후, 감압하에 농축하여 0.01 M 내지 0.5 M 의 피리딘 용액을 조제하였다. 이 피리딘 용액에, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 탈수 축합제 (2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 등) 를 첨가하여 고리화 반응을 실시하였다. 탈수 축합제는, 화합물 (6a') 1 몰에 대해, 1 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 분간 내지 6 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 1 시간이다. 이어서, 이 반응액에 물과 산화제 (요오드 등) 를 첨가하여 산화 반응을 실시하였다. 화합물 (6a') 1 몰에 대해, 물은 0 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 30 몰 내지 50 몰 사용하고, 산화제는 2 몰 내지 10 몰, 바람직하게는 3 몰 내지 5 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 12 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 3 시간이다. 반응액을 탄산수소나트륨 수용액 (0.1 M 에서 1 M 까지) 에 첨가하여, 15 분간 내지 24 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (아세트산에틸, 디에틸에테르, 톨루엔 또는 그들의 혼합 용매) 로 1 회에서 5 회 추출한 후, 추출액을 함께 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에 농축하였다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올, 헥산/아세트산에틸 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (7a') 를 얻었다.
A'' 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (1'') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A'' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 76]
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1'') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1'') 의 화합물은, A 법의 A-3 공정을 이하에 나타내는 A''-3 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 77]
(A''-3 공정)
본 공정은, 식 (3a'') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (4a'') 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 산화 반응을 연속적으로 실시함으로써, 식 (5a'') 의 화합물을 제조하는 공정이다. 본 공정의 반응을 개시하기 전에, 화합물 (4a'') 를, 탈수 아세토니트릴을 사용하여 3 회에서 5 회 공비하였다. 마지막 공비시에 아세토니트릴을 남겨, 화합물 (4a'') 의 0.01 M 내지 1 M 의 아세토니트릴 용액을 조제하였다. 이 용액에 건조제 (분말상 또는 펠릿상의 몰레큘러시브 3A 혹은 몰레큘러시브 4A) 를 첨가하고, 용액을 사용할 때까지 질소 또는 아르곤 분위기하에서 보존하였다. 화합물 (3a'') 의 아세토니트릴 용액에, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 공비에 의해 건조시킨 화합물 (4a'') 의 아세토니트릴 용액을 첨가함으로써 커플링 반응을 실시하였다. 반응 시간은, 1 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 5 분간 내지 6 시간이다. 이어서, 이 반응액에 산화제 (tert-부틸하이드로퍼옥사이드 등) 를 첨가하여 산화 반응을 실시하였다. 산화제는 화합물 (3a'') 1 몰에 대해 1 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액에 포화 티오황산나트륨 수용액을 첨가하고, 10 분간 내지 12 시간 교반하여 반응 정지 처리를 하였다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄과 메탄올의 혼합 용매 등) 로 1 회에서 5 회 추출한 후, 추출액을 함께 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에 농축하여, 화합물 (5a'') 의 조체를 얻었다. 얻어진 화합물 (5a'') 의 조체를 그대로 다음의 공정으로 진행시켰다.
A''' 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (1''') 로 나타내는 CDN 유도체는, 이하에 기재하는 A''' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 78]
본 제조법은, A 법의 일부를 변경하여 일반식 (1''') 로 나타내는 화합물을 제조하기 위한 방법이다. 구체적으로는, 일반식 (1''') 의 화합물은, A 법의 A-3 공정을 A''-3 공정으로, A-5 공정을 A'-5 공정으로 변경하여 제조할 수 있다. 또, 치환기 Rx 와 Ry 가 양방 할로겐 원자인 경우에는, A-7 공정을 생략할 수 있다.
[화학식 79]
B 법 : 컨쥬게이션 전구체 (당사슬 컨쥬게이션)
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (2) 로 나타내는 컨쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 B 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 80]
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 -NH2 가 치환되어 있는 경우의 컨쥬게이션 전구체 (2) 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 81]
(B-1 공정)
본 공정은, 식 (1b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 보호기를 제거함으로써, 식 (2b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO5 가 tert-부틸옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (1b) 를 용매 (디클로로메탄, 디옥산, 아세토니트릴, 아세트산에틸, 테트라하이드로푸란, 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -10 ℃ 에서부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 15 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 트리플루오로아세트산으로 처리함으로써 보호기를 제거하였다. 트리플루오로아세트산은, 화합물 (1b) 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 20 몰 내지 50 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분간 내지 6 시간이다. 반응액을 감압하에 농축한 후, 톨루엔에 현탁시켜 재차 감압하에 농축하였다. 이 조작을 2 회에서 5 회 반복하였다. 용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산, 디클로로메탄, 아세트산에틸 또는 그들의 혼합 용매) 를 첨가하여, 슬러리상으로 한 후, 고체를 여과 채취하여, 화합물 (2b) 의 조체를 얻었다. 화합물 (2b) 의 조체는, 더 이상의 정제를 하지 않고 다음의 공정으로 진행시켰다.
(B-2 공정)
본 공정은, 식 (2b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (3b) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (4b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (2b) 를 용매 (N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, N,N-디메틸아세트아미드, 아세토니트릴 등) 중에서, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 염기 (트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등) 및 화합물 (3b) 와 반응시킴으로써 아미드화를 실시하였다. 화합물 (2b) 1 몰에 대해, 염기는 1 몰 내지 5 몰 사용하고, 화합물 (3b) 는 0.5 몰 내지 1.5 몰 사용하였다. 반응 시간은 10 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 24 시간이다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 아세트산에틸, 메탄올 또는 그 혼합 용매) 와 물 또는 산성 수용액 (0.1 내지 1 M 의 염산, 시트르산 수용액 등) 의 2 층에 붓고, 유기 용매로 1 회에서 5 회 추출하였다. 추출액을 함께 포화 식염수로 세정 후, 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압하에 농축하였다. 또한, 상기 분액 조작을 생략하고, 반응액을 그대로 감압하에 농축하여 다음의 실리카겔 칼럼 정제로 진행시킬 수도 있다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올, 아세트산에틸/메탄올 등] 에 의해 정제하여, 화합물 (4b) 를 얻었다. 필요에 따라, 얻어진 화합물 (4b) 를 양용매 (아세트산에틸, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 메탄올 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해한 후, 빈용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산 등) 를 첨가하여 재침전하고, 고체를 여과 채취함으로써 순도를 높일 수 있다.
(B-3 공정)
본 공정은, 식 (4b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (5b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (4b) 를, 용매 (N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴 등) 중에서, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, N-하이드록시숙신이미드 및 축합제 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 등) 와 반응시킴으로써 에스테르화를 실시하였다. N-하이드록시숙신이미드 및 축합제는, 화합물 (4b) 1 몰에 대해, 각각 1 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 24 시간이다. 반응액을 유기 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 아세트산에틸 또는 그 혼합 용매) 로 희석한 후, 빙수로 3 회 내지 5 회 세정하였다. 유기층을 무수 염 (무수 황산나트륨 또는 무수 황산마그네슘) 을 사용하여 건조하였다. 건조제를 여과 제거한 후, 여과액을 감압하에 농축하여 화합물 (5b) 의 조체를 얻었다. 필요에 따라, 얻어진 화합물 (5b) 를 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [아세토니트릴 만] 에 의해 정제해도 된다. 또, 얻어진 화합물 (5b) 를 양용매 (아세트산에틸, 아세토니트릴, 디클로로메탄 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해한 후, 빈용매 (디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 헥산 등) 를 첨가하여 재침전하고, 고체를 여과 채취함으로써 순도를 높일 수 있다.
(B-4 공정)
본 공정은, 식 (5b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여, 식 (6b) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (2) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 화합물 (6b) 를 용매 중 (N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세토니트릴 등) 에서, -10 ℃ 에서 100 ℃ 까지, 바람직하게는 15 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서, 염기 (트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 등) 및 화합물 (5b) 와 반응시킴으로써 축합 반응을 실시하였다. 화합물 (6b) 1 몰에 대해, 염기는 2 몰 내지 5 몰 사용하고, 화합물 (5b) 는 1 몰 내지 2 몰 사용하였다. 반응 시간은 5 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 반응액에 벤질아민을 첨가하여 반응 정지 처리를 하였다. 벤질아민은 화합물 (6b) 1 몰에 대해 4 몰 내지 10 몰 사용하였다. 필요에 따라 반응액을 감압하에서 부분적으로 농축하고, 잔류한 용액을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (2) 를 얻었다.
B' 법 : 컨쥬게이션 전구체 (시스테인 컨쥬게이션)
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (2') 로 나타내는 컨쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 B' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 82]
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 -NH2 가 치환되어 있는 경우의 컨쥬게이션 전구체 (2') 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 83]
(B-5 공정)
본 공정은, 식 (2b') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (7b) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (8b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. 염기를 사용하지 않는 것 이외에는, B 법 B-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8b) 를 얻었다.
(B-6 공정)
본 공정은, 식 (8b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 보호기를 제거함으로써 식 (9b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO6 이 tert-부틸기인 경우, 정제 조작에 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올]을 사용하는 것 이외에는, B 법 B-1 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (9b) 를 얻었다.
(B-7 공정)
본 공정은, 식 (9b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (10b) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (10b) 를 얻었다.
(B-8 공정)
본 공정은, 식 (6b) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여, 식 (10b) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (2') 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (2') 를 얻었다.
C 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (3) 으로 나타내는 컨쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 C 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 84]
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 하이드록시기가 치환되어 있는 경우의 컨쥬게이션 전구체 (3) 을 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 85]
(C-1 공정)
본 공정은, 식 (1c) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (2c) 의 화합물과의 아미드화를 실시함으로써, 식 (3c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3c) 를 얻었다.
(C-2 공정)
본 공정은, 식 (3c) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 에스테르화를 실시함으로써, 식 (4c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (4c) 를 얻었다.
(C-3 공정)
본 공정은, 식 (5c) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (6c) 의 화합물과의 커플링 반응 (아미노메틸렌화) 과 얻어진 커플링체의 탈보호를 연속적으로 실시함으로써, 식 (7c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO9 가 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (5c) 를, 테트라하이드로푸란 중에서, 5 ℃ 에서 35 ℃ 까지에 있어서 화합물 (6c) 및 산 (p-톨루엔술폰산 등) 과 반응시킴으로써 아미노메틸렌화를 실시하였다. 화합물 (5c) 1 몰에 대해, 화합물 (6c) 는 1 몰 내지 20 몰, 바람직하게는 2 몰 내지 10 몰 사용하고, 산은 0.05 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 0.1 몰 내지 3 몰 사용하였다. 반응 시간은 30 분간 내지 72 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 24 시간이다. 이어서, 반응액에 염기 (1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 등) 를 첨가하고, 탈보호를 실시하였다. 반응액이 현탁되어 있는 경우에는, 필요에 따라 용매 (N,N-디메틸포름아미드 등) 를 추가하여 용해시킨 후에 반응시킬 수 있다. 염기는 화합물 (5c) 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 5 몰 내지 20 몰 사용하였다. 반응 시간은 10 분간 내지 24 시간, 바람직하게는 2 시간 내지 12 시간이다. 반응액에 물을 첨가하고, 그대로 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴 등] 에 의해 정제하여, 화합물 (7c) 를 얻었다.
(C-4 공정)
본 공정은, 식 (7c) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 보호기를 제거하여, 식 (8c) 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO7 및 PRO8 이 tert-부틸디메틸실릴기인 경우, A 법 A-7 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8c) 를 얻었다.
(C-5 공정)
본 공정은, 식 (8c) 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여, 식 (4c) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (3) 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3) 을 얻었다.
C' 법
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 (3') 로 나타내는 컨쥬게이션 전구체는, 이하에 기재하는 C' 법에 따라서 제조할 수 있다.
[화학식 86]
본 제조법은, L1 의 임의의 위치에 하이드록시기가 치환되어 있는 경우의 컨쥬게이션 전구체 (3') 를 제조하기 위한 방법이다.
[화학식 87]
(C'-1 공정)
본 공정은, 식 (1c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 가수분해 반응과 시아노에틸기의 제거를 연속적으로 실시함으로써, 식 (2c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-1 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (2c') 를 얻었다.
(C'-2 공정)
본 공정은, 식 (2c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하여, 식 (3c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-2 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3c') 를 얻었다.
(C'-3 공정)
본 공정은, 식 (3c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 식 (4c') 의 화합물과의 커플링 반응 및 얻어진 커플링체의 황화 반응 또는 산화 반응을 연속적으로 실시함으로써, 식 (5c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-3 공정 또는 A'' 법 A''-3 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (5c') 를 얻었다.
(C'-4 공정)
본 공정은, 식 (5c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 하이드록시기의 보호기를 제거하여, 식 (6c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (6c') 를 얻었다.
(C'-5 공정)
본 공정은, 식 (6c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 고리화 반응과 황화 반응 또는 산화 반응을 연속적으로 실시하여, 식 (7c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-5 공정 또는 A' 법 A'-5 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (7c') 를 얻었다.
(C'-6 공정)
본 공정은, 식 (7c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 시아노에틸기 및 모든 아실계 보호기를 동시에 제거하여, 식 (8c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. A 법 A-6 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (8c') 를 얻었다.
(C'-7 공정)
본 공정은, 식 (8c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 모든 실릴계 보호기를 동시에 제거하여, 식 (9c') 의 화합물을 제조하는 공정이다. PRO9 가 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기인 경우, 화합물 (8c') 를, 5 ℃ 에서 100 ℃ 까지, 바람직하게는 35 ℃ 에서 60 ℃ 까지에 있어서, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액으로 처리함으로써, 2-(트리메틸실릴)에톡시카르보닐기를 제거하였다. 불화테트라부틸암모늄은, 화합물 (8c') 1 몰에 대해 과잉 몰, 바람직하게는 10 내지 30 몰 사용하였다. 반응 시간은 1 시간 내지 48 시간, 바람직하게는 4 시간 내지 24 시간이다. 반응액에 완충액을 첨가하여 희석 후, 필요에 따라 유기 용매 성분을 감압하에서 증류 제거하였다. 잔류물을 분취 HPLC [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등], C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [완충액/아세토니트릴, 완충액/메탄올 등] 또는 그것들을 조합함으로써 정제하여, 화합물 (9c') 를 얻었다.
(C'-8 공정)
본 공정은, 식 (9c') 의 화합물에 대해 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여, 식 (4c) 의 화합물과의 축합 반응을 실시함으로써, 식 (3') 의 화합물을 제조하는 공정이다. B 법 B-4 공정에 기재된 수법에 따라서 화합물 (3') 를 얻었다.
D 법 : 당사슬 리모델링 항체의 제조
당사슬 리모델링 항체는, 예를 들어 WO2018/003983 등에 기재된 방법으로 준하여, 다음 식에 나타내는 방법으로 제조할 수 있다.
[화학식 88]
(D-1 공정)
본 공정은, 목적하는 항체에 대해, 공지된 효소 반응을 이용하여 항체의 아미노산 서열 297 번째의 아스파라긴에 결합하는 N 결합형 당사슬 (N297 결합 당사슬) 의 환원 말단 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1-4GlcNAc 간의 글리코시드 결합을 가수분해에 의해 절단하여, 당사슬 절단 항체를 제조하는 공정이다. 목적하는 항체 (1d) (10 mg/mL) 를 완충액 (인산 완충액 등) 중, 0 ℃ 에서 40 ℃ 까지에 있어서, 야생형 EndoS 효소 등의 가수분해 효소를 사용하여 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 간의 글리코시드 결합의 가수분해 반응을 실시하였다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 야생형 EndoS 효소는 항체 (1d) 100 mg 에 대해, 0.1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 mg 내지 3 mg 을 사용하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 (HiTrap rProtein A FF (5 ml) (GE 헬스케어 제조)) 및/또는 하이드록시 아파타이트 칼럼 (Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ml) (BIO-RAD 제조)) 으로 정제하여, (Fucα1,6)GlcNAc 항체 (2d) 를 얻었다.
(D-2 공정)
본 공정은, D-1 공정에서 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc 항체 (2d) 에 대해, 공지된 효소 반응을 사용하여 아지드기를 함유하는 PEG 링커를 갖는 SG 형 또는 MSG (MSG1, MSG2) 형 당사슬 옥사졸린체 (이하, 「아지드 당사슬 옥사졸린체」) 를 결합시켜, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 를 제조하는 공정이다.
항체 (2d) 를 완충액 (인산 완충액 등) 중, 0 ℃ 에서 40 ℃ 까지에 있어서, EndoS (D233Q/Q303L) 등의 당전이 효소 존재하, 아지드 당사슬 옥사졸린체와 반응시킴으로써, 당사슬 전이 반응을 실시하였다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. EndoS 효소 (D233Q/Q303L) 는 항체 100 mg 에 대해, 1 mg 내지 10 mg, 바람직하게는 1 mg 내지 3 mg 을 사용하고, 아지드 당사슬 옥사졸린체는 2 당량 내지 과잉 당량, 바람직하게는 4 당량 내지 20 당량 사용하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 (HiTrap rProtein A FF (5 ml) (GE 헬스케어 제조)) 및 하이드록시 아파타이트 칼럼 (Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ml) (BIO-RAD 제조)) 로 정제하여, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 를 얻었다.
상기의 당사슬 리모델링 항체의 조제에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정, 그리고 버퍼 교환은, 후술하는 공통 조작 A 내지 C 에 따라서 실시할 수 있다.
또한, SG 형의 아지드 당사슬 옥사졸린체는 WO2018/003983 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다. 일례로서 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (WO2018/003983 에 기재된 화합물 1-10) 의 합성 방법을 다음 식에 나타낸다.
[화학식 89]
MSG 형의 아지드 당사슬 옥사졸린체도 WO2018/003983 에 기재된 방법에 준하여 합성하였다. 일례로서 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox (WO2018/003983 에 기재된 화합물 1-11) 의 합성 방법을 다음 식에 나타낸다.
[화학식 90]
E 법 : 항체와 약물의 컨쥬게이션 (당사슬 컨쥬게이션 1)
[화학식 91]
(여기서, 항체 약물 컨쥬게이트 (1e) 의 좌측의 2 개의 별표 (*) 는 우측의 별표로 나타내는 약물 링커 부분을 나타낸다.)
본 제조법은, D 법 D-2 공정에서 얻어진 당사슬 리모델링 항체 (3d) 와 B 법 B-4 공정에서 얻어진 컨쥬게이션 전구체 (2) 를 SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition : J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047) 반응에 의해 결합시켜, 항체 약물 컨쥬게이트 (1e) 를 제조하는 방법이다.
(E-1 공정)
당사슬 리모델링 항체 (3d) 의 완충 용액 (인산 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액 등) 과 컨쥬게이션 전구체 (2) 를 적당한 용매 (디메틸술폭시드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 프로필렌글리콜 또는 그들의 혼합 용매) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응을 실시하였다. 컨쥬게이션 전구체 (2) 는, 당사슬 리모델링 항체 (3d) 1 몰에 대해, 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 4 몰 내지 30 몰이고, 유기 용매의 비율은, 항체의 완충 용액에 대해 1 ％ 내지 200 ％ (v/v) 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 에서 37 ℃, 바람직하게는 15 ℃ 에서 25 ℃ 이며, 반응 시간은 1 시간 내지 150 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 72 시간이다. 반응 용액의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다. 반응 용액을 후술하는 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 항체 약물 컨쥬게이트 (1e) 를 얻었다.
E' 법 : 항체와 약물의 컨쥬게이션 (시스테인 컨쥬게이션)
시스테인 컨쥬게이션을 갖는 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 참고예 3 등에 따라서 조제한 목적의 항체와 B' 법 B-8 공정에서 얻어진 말레이미드기를 갖는 컨쥬게이션 전구체 (2') 를 사용하여, WO2014/057687 등에 기재된 방법에 준하여 제조할 수 있다.
E'' 법 : 항체와 약물의 컨쥬게이션 (당사슬 컨쥬게이션 2)
E 법에 있어서, 컨쥬게이션 전구체 (2) 를 C' 법 C'-8 공정에서 얻어진 컨쥬게이션 전구체 (3') 로 변경함으로써, 다음 식에 나타내는 항체 약물 컨쥬게이트 (1e'') 를 얻었다.
[화학식 92]
(여기서, 항체 약물 컨쥬게이트 (1e'') 의 좌측의 2 개의 별표 (*1) 에는 우측의 별표로 나타내는 약물 링커 부분을 나타낸다.)
항체 약물 컨쥬게이트는, 후술하는 공통 조작 D 내지 G 에 의해 버퍼 교환, 정제, 항체 농도의 측정 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정을 실시하여, 항체 약물 컨쥬게이트의 동정을 실시할 수 있다.
공통 조작 A : 항체 수용액의 농축
Amicon (등록상표) Ultra 원심식 필터 디바이스 (50,000 NMWL, Merck Millipore Ltd.) 에 항체 또는 항체 약물 컨쥬게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000G 내지 4000G로 5 분간 내지 20 분간 원심) 에 의해, 항체 및 항체 약물 컨쥬게이트 용액을 농축하였다.
공통 조작 B : 항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 를 사용하여, 메이커 규정의 방법에 따라서, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그 때에, 항체마다 상이한 280 nm 흡광 계수 (1.3 mLmg-1cm-1 내지 1.8 mLmg-1cm-1) 를 사용하였다.
공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환
항체 수용액에 완충액 (인산 완충 생리식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고, 공통 조작 A 에 기재된 방법에 따라서 농축하였다. 이 조작을 몇 차례 실시한 후, 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 항체 농도를 측정하였다. 이 항체 완충 용액에, 적절히 완충액 (인산 완충 생리식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하여, 목적하는 농도 (예를 들어, 약 10 mg/mL) 의 항체 완충 용액을 조제하였다.
공통 조작 D : 항체 약물 컨쥬게이트의 정제 (겔 여과 크로마토그래피)
아세트산 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5 ; 본 명세서에서는 ABS 라고 부른다) 또는 그 이외의 적당한 완충액으로 NAP 칼럼 (NAP-5, NAP-10, NAP-25 (GE 헬스케어 제조)) 을 평형화시켰다. 이 NAP 칼럼에, 항체 약물 컨쥬게이트 반응 용액을 챠지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분취하였다. 이 획분을 재차 NAP 칼럼에 챠지하고, 메이커 규정량의 완충액을 자연 유하시켜, 항체 획분을 분취하였다. 이 조작을 합계 2 회 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 디메틸술폭시드, 프로필렌글리콜을 제외한 항체 약물 컨쥬게이트를 얻었다. 필요에 따라, 공통 조작 A 및 C 에 의해 항체 약물 컨쥬게이트 용액의 농도를 조절하였다.
공통 조작 E : 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (UV 법)
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 흡광 광도계 (UV/VIS Spectrometer Lambda 25, PerkinElmer, Inc.) 를 사용하여, 항체 약물 컨쥬게이트 수용액의 280 nm 및 250 nm 의 2 파장에 있어서의 흡광도를 측정한 후에, 하기의 계산을 실시함으로써 산출할 수 있다. 어느 파장에 있어서의 전체 흡광도는 계내에 존재하는 모든 흡수 화학종의 흡광도의 합과 동등한 (흡광도의 가성성 (加成性)) 점에서, 항체와 약물의 컨쥬게이션 전후에 있어서, 항체 및 약물의 몰 흡광 계수에 변화가 없다고 가정하면, 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 약물 농도는, 하기의 관계식으로 나타낸다.
A280 = AD,280＋AA,280 = εD,280CD＋εA,280CA 식 (I)
A250 = AD,250＋AA,250 = εD,250CD＋εA,250CA 식 (II)
여기서, A280 은 280 nm 에 있어서의 항체 약물 컨쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, A250 은 250 nm 에 있어서의 항체 약물 컨쥬게이트 수용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 은 280 nm 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,250 은 250 nm 에 있어서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 은 280 nm 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,250 은 250 nm 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 은 280 nm 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,250 은 250 nm 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 은 280 nm 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,250 은 250 nm 에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 약물 농도를 나타낸다. 여기서, εA,280, εA,250, εD,280, εD,250 은, 사전에 준비한 값 (계산 추정치 또는 실측치) 이 사용된다. 예를 들어, εA,280 은, 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. εA,250 은, 항체의 UV 측정에서 얻어진 실측치와 εA,280 의 추정치로부터 계산한 값을 사용하였다. 실시예에 있어서, 항 TROP2 항체 1 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 223400 및 εA,250 = 63482 를 사용하였다. 항 TROP2 항체 2 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 223400 및 εA,250 = 69027 또는 71411 을 사용하였다. 항 CD70 항체 1 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 226380 및 εA,250 = 73432 를 사용하였다. 항 CD70 항체 2 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 212400 및 εA,250 = 72355 를 사용하였다. 항 EGFR 항체 1 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 203460 및 εA,250 = 62692 를 사용하였다. 항 EGFR 항체 2 의 몰 흡광 계수는, εA,280 = 217440 및 εA,250 = 75731 을 사용하였다. εD,280 및 εD,250 은, 사용하는 컨쥬게이트 전구체를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정함으로써, 람베르트ㆍ비어의 법칙 (흡광도 = 몰 농도×몰 흡광 계수×셀 광로 길이) 에 의해 얻을 수 있다. 실시예에 있어서의 컨쥬게이트 전구체의 몰 흡광 계수는, 매번 UV 측정으로 얻었다. 항체 약물 컨쥬게이트 수용액의 A280 및 A250 을 측정하고, 이들 값을 식 (I) 및 (II) 에 대입하여 연립 방정식을 풂으로써, CA 및 CD 를 구할 수 있다. 또한 CD 를 CA 로 나눔으로써, 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수를 구할 수 있다.
공통 조작 F : 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (역상 고속 액체 크로마토그래피법 : RP-HPLC)
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체 약물 컨쥬게이트의 환원)]
항체 약물 컨쥬게이트 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL) 를 디티오트레이톨(DTT) 수용액 (100 mM, 15 μL) 와 혼합하였다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여, 항체 약물 컨쥬게이트의 L 사슬 및 H 사슬간의 디술파이드 결합을 절단하였다. 이 반응 용액을 그대로 HPLC 분석에 사용하였다.
[F-2. HPLC 분석]
대표적인 분석 조건은 하기와 같다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 nm)
칼럼 : Acquity BEH Phenyl (2.1×50 mm, 1.7 ㎛, Waters 제조)
칼럼 온도 : 75 ℃
유속 : 0.8 mL/분
샘플 주입량 : 10 μL
이동상 A : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 이소프로필알코올 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 이소프로필알코올아세토니트릴 용액
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 14 ％-36 ％ (0 분-15 분), 36 ％-80 ％ (15-17 분), 80 ％-14 ％ (17 분-17.1 분), 14 ％-14 ％ (17.1 분-23 분)
[F-3. 데이터 해석]
〔F-3-1〕SPAAC 반응에서의 당사슬 컨쥬게이션의 경우에는, 약물이 결합되어 있지 않은 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 대해, 약물이 결합한 H 사슬 (약물이 하나 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 2 개 결합한 H 사슬 : H2) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 늘어나 유지 시간이 커지는 점에서, 원칙적으로 L0, H0, H1, H2 의 순으로 용출된다. L0 및 H0 의 유지 시간을 비교함으로써 검출 피크를 L0, H0, H1, H2 중 어느 것에 할당할 수 있다. 시스테인 컨쥬게이션의 경우도 마찬가지로, 약물이 결합한 L 사슬 (약물이 하나 결합한 L 사슬 : L1) 와 약물의 결합한 H 사슬 (약물이 하나 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 두 개 결합한 H 사슬 : H2, 약물이 세 개 결합한 H 사슬 : H3) 는, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 늘어나 유지 시간이 커지는 점에서, 원칙적으로 L0, L1, H0, H1, H2, H3 의 순으로 용출된다. L0 및 H0 의 유지 시간을 비교함으로써 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2, H3 중 어느 것에 할당할 수 있다.
〔F-3-2〕약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, SPAAC 반응에서의 당사슬 컨쥬게이션의 경우에는, 약물 링커의 결합수에 따라서, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라서 피크 면적의 보정을 실시하였다. L 사슬에도 약물이 결합하는 시스테인 컨쥬게이션의 경우에는, L 사슬에 대해서도 동일하게 피크 면적의 보정을 실시하였다.
[수학식 1]
여기서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정치를 사용하였다. 항 TROP2 항체 1 및 항 TROP2 항체 2 의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 27702 를, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 83998 을 사용하였다. 항 CD70 항체 1 의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 30222 를, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 82968 을 사용하였다. 항 CD70 항체 2 의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 30222 를, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 75978 을 사용하였다. 항 EGFR 항체 1 의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 23232 를, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 78498 을 사용하였다. 항 EGFR 항체 2 의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 30222 를, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 78498 을 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, SPAAC 반응에서의 당사슬 컨쥬게이션의 경우에는 컨쥬게이션 전구체의 실측치를 사용하고, 시스테인 컨쥬게이션의 경우에는, 컨쥬게이션 전구체를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인과 반응시켜, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측치를 사용하였다.
〔F-3-3〕피크 면적 보정치 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라서 계산하였다.
[수학식 2]
〔F-3-4〕항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (DAR) 를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
[수학식 3]
〔F-3-5〕항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
[수학식 4]
여기서 항체 약물 복합체의 흡광도 (280 nm) 는, 항체 약물 컨쥬게이트 수용액의 실측치를 사용하였다. 희석 배수는, 흡광도를 측정할 때에 항체 약물 컨쥬게이트 수용액을 몇 배로 희석했는지를 나타내고, 통상 4 배 희석이다. 항체의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정치를 사용하였다. 약물 평균 결합수는〔F-3-4〕에서 얻어진 값을 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, SPAAC 반응에서의 당사슬 컨쥬게이션의 경우에는, 컨쥬게이션 전구체의 실측치를 사용하고, 시스테인 컨쥬게이션의 경우에는, 컨쥬게이션 전구체를 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인과 반응시켜, 말레이미드기를 숙신이미드티오에테르로 변환한 화합물의 실측치를 사용하였다.
공통 조작 G : 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정 (소수성 상호 작용-고속 액체 크로마토그래피법 : HI-HPLC)
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수는, 전술한 공통 조작 E 및 F 에 더하여, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 분석에 의해 구할 수 있다.
[G-1. HPLC 분석용 샘플의 조제]
항체 약물 컨쥬게이트 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL) 를 그대로 HPLC 분석에 사용하였다.
[G-2. HPLC 분석]
대표적인 분석 조건은 하기의 2 가지.
HPLC 시스템 : SHIMADZU CBM-20A (시마즈 제작소)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 nm)
칼럼 : TSK-gel Butyl-NPR (4.6×100 mm, 2.5 ㎛, TOSOH 제조)
칼럼 온도 : 25 ℃ 부근의 일정 온도
이동상 A : 1.5 M 황산암모늄 함유 25 mM 인산 완충액 (pH = 7.0)
이동상 B : 25 mM 인산 완충액 (pH = 7.0)/이소프로필알코올 혼합액 (3 : 1)
유속 : 0.8 mL/분
샘플 주입량 : 15 μL
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 10 ％-15 ％ (0 분-5 분), 15 ％-65 ％ (5 분-20 분)
또는
HPLC 시스템 : SHIMADZU CBM-20A (시마즈 제작소)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 nm)
칼럼 : PolyPROPYL A (4.6×100 mm, 3 ㎛, 1500 Å, PolyLC 제조)
칼럼 온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도
이동상 A : 1.5 M 황산암모늄 함유 20 mM 인산 완충액 (pH = 7.4)
이동상 B : 20 mM 인산 완충액 (pH = 7.4)
유속 : 0.8 mL/분
샘플 주입량 : 15 μL
그래디언트 프로그램 (이동상 B) : 40 ％-80 ％ (0 분-20 분)
[G-3. 데이터 해석]
〔G-3-1〕항체에 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 늘어나, 유지 시간이 커지는 점에서, SPAAC 반응에서의 당사슬 컨쥬게이션의 경우에는, 원칙적으로 DAR = 0, DAR = 2, DAR = 4 의 순으로 용출된다. DAR = 0 과의 유지 시간을 비교함으로써, 검출 피크를 DAR = 2 및 DAR = 4 의 어느 것에 할당할 수 있다. 항체나 약물 링커의 종류에 따라서 DAR = 1 및 DAR = 3 의 피크가 검출되기도 한다. 검출 피크의 DAR 은, HI-HPLC 로 당해 피크를 분획 후, 매스 스펙트럼을 측정하여 추정하기도 한다.
〔G-3-2〕약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, 항체 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 이용하여 하기 식에 따라서 피크 면적치의 보정을 실시하였다.
[수학식 5]
여기서, 항체의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 공통 조작 E 에 기재한 이미 알려진 계산 방법으로 산출한 추정치를 사용하였다. 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 컨쥬게이션 전구체의 실측치를 사용하였다.
〔G-3-3〕피크 면적 보정치 합계에 대한 항체 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라서 계산하였다.
[수학식 6]
〔G-3-4〕 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수를, 하기 식에 따라서 계산하였다.
[수학식 7]
〔G-3-5〕항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도는,〔F-3-5〕에 기재된 식에 따라서 계산하였다. 그 때, 약물 평균 결합수는〔G-3-4〕에서 얻어진 값을 사용하였다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하기도 하지만, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이들의 혼합물이 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서, 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 미치는 중요 인자이다. 항체 약물 컨쥬게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 달리, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상적이다. 항체 1 분자에 대한 약물의 결합수는 평균치, 즉, 평균 약물 결합수 (DAR) 로서 특정할 수 있다. 항체 분자에 대한 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당의 약물 평균 결합수로서, 1 내지 10 의 범위의 고리형 디뉴클레오티드 유도체를 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 1 내지 8 개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서, 항체 Ab 가, 항체 Ab 의 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우, 항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 는 1 또는 2 의 정수이다. 당해 당사슬이 N297 당사슬이고, 당사슬이 N297-(Fuc)SG 의 경우, m2 는 2 이고, DAR 은 3 ∼ 5 의 범위 (바람직하게는 3.2 ∼ 4.8 의 범위이고, 보다 바람직하게는 3.5 ∼ 4.2 의 범위) 이다. N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물인 경우, m2 는 1 이고, DAR 은 1 ∼ 3 의 범위 (바람직하게는 1.0 ∼ 2.5 의 범위, 보다 바람직하게는 1.2 ∼ 2.2 의 범위) 이다.
또한, 당업자라면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있고, 고리형 디뉴클레오티드 유도체의 결합수를 컨트롤한 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그 제조 중간체는, 대기 중에 방치하거나 또는 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 붙거나, 수화물이 되는 경우가 있고, 그러한 물을 함유하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 또는 그 제조 중간체가, 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라서 의약적으로 허용되는 염으로 할 수 있다. 그러한 염으로는, 예를 들어 염산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산, 아세트산, 말산, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 인산기 및/또는 티오인산기를 그 구조에 포함하기 때문에, 일반적으로 염기 부가염을 형성하는 것이 가능하다. 또, 그 제조 중간체가, 카르복실기 등의 산성기를 갖는 경우도, 일반적으로 염기 부가염을 형성하는 것이 가능하다. 의약적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염, 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 제조 중간체는, 공기 중의 수분을 흡수하는 것 등에 의해 수화물로서 존재하기도 한다. 본 발명의 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 수화물, 에탄올화물, 2-프로판올화물 등이 바람직하다. 또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 제조 중간체 내에 질소 원자가 존재하는 경우에는 N-옥사이드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드체도 본 발명의 범위에 포함된다. 또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 제조 중간체 내에 황 원자가 존재하는 경우에는 술폭시드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 술폭시드체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또, 본 발명에는, 여러 가지 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 그 제조 중간체를 구성하는 원자의 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명 화합물은, 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 와 같은 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성인지의 여부를 불문하고, 본 발명의 범위에 포함된다.
＜4. 의약＞
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 암세포에 대해 항종양 면역 활성 또는 세포 상해 활성을 나타내기 때문에, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제, 또는 항종양제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암 등), 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암 (표층상피성 종양, 간질성 종양, 배세포 종양 등), 췌장암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반융모암, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관간질종양 (Gastrointestinal Stromal Tumor, GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 인두암, 설암, 청각기관암, 흉선암, 소장암, 유극세포암, 백혈병, 악성림프종, 형질세포종, 골수종, 육종 등을 들 수 있지만, 항체 약물 컨쥬게이트에 대해서는, 치료 대상이 되는 암세포에 있어서 항체 약물 컨쥬게이트 중의 항체를 인식할 수 있는 단백질을 발현하고 있는 암세포이면 이것들에 한정되지는 않는다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 포유 동물에 대해 바람직하게 투여할 수 있지만, 포유 동물은 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상 사용되는 제제 첨가물 기타로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 의약 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 의약 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등)) 을 포함한다)) 을 포함한다. 물은, 상기 의약 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서 특히, 주사용 용액을 위해서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지이다. 상기 조성물은 또한, 원한다면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」에 기재된다. 그 처방은, 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지이며, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체 약물 컨쥬게이트의 투여는 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 항체 약물 컨쥬게이트를 포함하는 의약 조성물은, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 의약 조성물로서, 상습적 순서대로 따라서 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉하여 시일된 용기 중의 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로서, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합한 것 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약 조성물이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다. 상기 의약 조성물은, 용액으로서 제공되는 경우도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 및 다른 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 다른 암 치료제와 함께, 또는 조합하여, 투여할 수도 있으며, 이로써 항종양 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 암 치료제는, 항체 약물 컨쥬게이트와 동시에, 따로따로, 혹은 연속하여 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 변경하여 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, 대사 길항제, 알킬화제, 미소관 저해제 등의 화학 요법제 (abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, docetaxel, pemetrexed, vinblastine 또는 국제 공개 제WO2003/038043호 팜플렛에 기재된 약제 등), 호르몬 조정약 (LH-RH 아날로그인 류프로렐린 등, 고세렐린, 에스트라무스틴, 에스트로겐 길항약인 타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타아제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑스메스탄 등), 키나아제 저해제, PARP 저해제, 골파괴 억제제, 골형성 촉진제, 전이 억제제, 분자 표적약 (항 EGFR 항체, 항 VEGF 항체, 항 VEGFR 항체 등), 면역 체크 포인트 저해약 (항 PD-1 항체인 니볼루맙, 펨브로리주맙 등, 항 PD-L1 항체인 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 등, 항 PD-L2 항체, 항 CTLA4 항체인 이필리무맙 등, 항 A2aR 항체, A2a 수용체 안타고니스트, 항 LAG3 항체, 항 TIM3 항체 등), 항제어성 T 세포약 (항 CTLA4 항체, 항 CD25 항체, 항 GITR 항체, 항 GARP 항체, 항 TIGIT 항체, 항 CCR8 항체 등), 면역 활성화제 (항 4-1BB 항체, 항 OX40 항체, 항 CD40 항체, 항 CD3 항체, 항 CD28 항체, IL-2 아날로그, 사이토카인, TLR 아고니스트 등), 면역 조절제 (항 CD47 항체, 항 SIRPα 항체, 억제성 미엘로이드 조정제 등), ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 활성, ADCP (Antibody Dependent Cellular Phagocytosis) 활성 또는 보체 활성을 갖는 항체 의약, BiTE (Bi-specific T-cell engagers), Antibody-Drug-Conjugate (ADC) (예를 들어, Deruxtecan, DM1, Pyrrolobenzodiazepine, MMAF 등을 포함하는 약제 컨쥬게이트 (항 HER2-ADC, 항 TROP2-ADC, 항 HER3-ADC 등)), 광역학 요법을 조합한 ADC 등, 나아가 항종양 백신, 항종양 세포 치료 (CAR-T, TCR-T, 수지상 세포, NK 세포 등), 항종양 세균 치료, 항종양 바이러스 치료 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지는 않는다. 게다가, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 본 발명의 다른 항체 약물 컨쥬게이트와 함께 투여할 수도 있고, 이로써 항종양 효과를 증강시킬 수 있다. 또, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는 약물뿐만 아니라, 항종양 효과를 가져오는 치료, 예를 들어 방사선, 중량자선, 외과적 수술, 골수 이식 등과의 병용에 의해 항종양 효과를 증강시킬 수 있는데, 항종양 효과를 갖는 치료이면 한정되지는 않는다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때에, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제여도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항체 약물 컨쥬게이트는, 항체 약물 컨쥬게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을수록 (Kd 값이 낮을수록), 소량의 투여량으로도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체 약물 컨쥬게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체 약물 컨쥬게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트를 인간에 대해 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 mg/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일 동안에 1 회의 간격으로 복수 회 투여하면 된다.
이하 본 발명을 실시예에서 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예에 있어서, 실온은 15 ℃ 내지 35 ℃ 를 나타낸다. 탈수 아세토니트릴은, 칸토 화학에서 판매되고 있는 아세토니트릴 (탈수)-Super- 또는 와코 순약 공업에서 판매되고 있는 아세토니트릴 (초탈수) 을 사용하였다. 피리딘은, 칸토 화학에서 판매되고 있는 피리딘 (탈수)-Super- 를 사용하였다. 실리카겔 크로마토그래피는, Biotage SNAP Ultra (Biotage 제조), Chromatorex Q-Pack SI (후지 실리시아 제조) 또는 Purif-Pack-Ex SI (쇼코 사이언스 제조) 를 사용하여 실시하였다. DIOL 실리카겔 칼럼 크로마토그래피는, Chromatorex Q-pack DIOL (후지 실리시아 제조) 를 사용하여 실시하였다. C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피는, Biotage SNAP Ultra C18 (Biotage 제조) 를 사용하여 실시하였다. 칼럼 크로마토그래피의 용출은 박층 크로마토그래피 (TLC) 에 의한 관찰하에 실시하였다. 용출 용매에 사용한 0.1 ％ 트리에틸아민이란, 용출 용매 총용량 중에 0.1 ％ 의 트리에틸아민을 함유하는 것을 의미한다. 분취 HPLC 는, SHIMADZU SPD-M10A HPLC 시스템 (시마즈 제작소) 등을 사용하여 실시하였다. 분취 칼럼은, Kinetex (5 ㎛, C18, 100 Å, 250×30.0 mm, Phenomenex 제조) 또는 Kinetex (5 ㎛, C18, 100 Å, 250×21.2 mm, Phenomenex 제조) 를 사용하였다.
각종 스펙트럼 데이터의 측정에는 이하의 기기를 사용하였다. 1H-NMR 스펙트럼은, JEOL ECS-400 (400 MHz), Varian 400-MR (400 MHz) 또는 Varian Unity Inova 500 (500 MHz) 을 사용하여 측정하였다. 31P-NMR 스펙트럼은, JEOL ECS-400 (160 MHz) 을 사용하여 측정하였다. 매스 스펙트럼은, Agilent 6130 Quadrupole LC/MS 시스템 (Agilent Technologies) 을 사용하여 측정하였다. LC/MS 의 측정은, 이하의 조건으로 실시하였다 [칼럼 : Develosil Combi-RP, 5 ㎛, 50×2.0 mm (노무라 화학 제조), 이동상 : 0.1 ％ 포름산아세토니트릴 용액/0.1 ％ 포름산 수용액, 0.1 ％ 포름산아세토니트릴 용액 : 2 ％-100 ％ (0 분-5 분 또는 0 분-10 분)].
실시예 1 : CDN6 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 93]
[합성 스킴]
[화학식 94]
(공정 1)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보푸라노실}-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
문헌에 이미 알려진 (Tetrahedron 2007, 63, 9850-9861) 의 5-요오드튜베르시딘 (1.0 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 디-tert-부틸실릴비스(트리플루오로메탄술포네이트) (1.24 mL) 를 천천히 적하한 후, 동 온도에서 30 분간 교반하였다. 이미다졸 (868 mg) 을 0 ℃ 에서 첨가한 후, 실온까지 승온하여 30 분간 교반하였다. 실온에서 tert-부틸디메틸클로로실란을 첨가하고, 동 온도에서 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (910 mg) 을 얻었다.
(공정 2)
7-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보푸라노실}-5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (910 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3.0 mL)-테트라하이드로푸란 (9.0 mL) 혼합 용액에 프로파르길알데히드디메틸아세탈 (1.01 mL), 트리에틸아민 (0.392 mL), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (163 mg), 및 요오드화구리 (I) (53.6 mg) 을 순서대로 첨가하여, 40 ℃ 에서 18 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 아세트산에틸을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (878 mg) 을 얻었다.
(공정 3)
2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (878 mg) 의 에탄올 (8.8 mL) 용액에 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (500 mg) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 9 시간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 디클로로메탄으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물의 아세트산 (8.8 mL) 용액에 10 ％ 팔라듐탄소 (M) wet (500 mg) 를 첨가하고, 수소 분위기하, 40 ℃ 에서 2 일간 교반하였다. 촉매를 여과 제거한 후, 디클로로메탄으로 세정하고, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (603 mg) 을 얻었다.
(공정 4)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-O-(디-tert-부틸실릴리덴)-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.17 g) 의 디클로로메탄 (21.7 mL) 용액에 실온에서, 피리딘 (1.56 mL), N,N-디메틸아미노피리딘 (94.5 mg), 및 염화벤조일 (0.898 mL) 를 순서대로 첨가하여, 50 ℃ 에서 15 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (1.91 g) 을 얻었다.
(공정 5)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.91 g) 의 디클로로메탄 (15 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 조제한 불화수소-피리딘 (0.30 mL) 와 피리딘 (1.88 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 0 ℃ 에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출한 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 피리딘 (15 mL) 에 용해하고, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (1.17 g) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 12 시간 교반하였다. 메탄올을 첨가하고, 30 분간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출한 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (1.98 g) 을 얻었다.
(공정 6)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-β-D-리보푸라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.98 g) 의 디클로로메탄 (23.9 mL) 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (1.02 mL) 와 2-시아노에틸N,N-디이소프로필클로로포스포로아미다이트 (1.07 mL) 를 첨가하여, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (2.06 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 7 : 3) 로서 얻었다.
(공정 7)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (935 mg) 의 아세토니트릴 (4.55 mL) 용액에 물 (33 μL) 와 트리플루오로아세트산피리딘염 (229 mg) 을 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 tert-부틸아민 (4.55 mL) 를 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축한 후, 잔류물을 아세토니트릴 (5 mL) 로 2 회 공비하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (11.4 mL) 용액에 물 (0.164 mL) 를 첨가한 후, 디클로로아세트산 (0.651 mL) 의 디클로로메탄 (11.4 mL) 용액을 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반하였다. 피리딘 (1.25 mL) 를 첨가하여 반응을 정지한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 탈수 아세토니트릴 (10 mL) 로 3 회 공비하고, 마지막 1 회는 5 mL 정도의 아세토니트릴을 남겼다. 얻어진 표제 화합물의 아세토니트릴 용액을 그대로 하기 공정 12 에서 사용하였다.
(공정 8)
2',3',5'-트리-O-아세틸-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
시판 (Ark Pharm) 되는 2',3',5'-트리-O-아세틸이노신 (10.0 g) 의 테트라하이드로푸란 (100 mL) 현탁액에, 2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에탄-1-올 (5.37 g) 과 트리페닐포스핀 (7.69 g) 을 첨가한 후, 디프로판-2-일 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트 (6.10 mL) 를 첨가하여, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/디클로로메탄] 로 정제하여, 표제 화합물을 트리페닐포스핀옥사이드와의 혼합물 (10.6 g) 로서 얻었다.
(공정 9)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (10.6 g) 의 테트라하이드로푸란 (30 mL)-메탄올 (30 mL) 혼합 용액에 탄산칼륨 (150 mg) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 아세트산 (125 μL) 를 첨가하고, 감압 농축 후, 잔류물을 피리딘으로 공비하였다. 잔류물의 피리딘 (60 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (6.50 g) 을 첨가하고, 30 분간 교반 후, 냉장고에서 밤새 보관하였다. 반응액에 메탄올 (2 mL) 를 첨가하고, 30 분간 교반 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물을 트리페닐포스핀옥사이드와의 혼합물 (7.21 g) 로서 얻었다.
(공정 10)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (7.21 g) 의 디클로로메탄 (36 mL) 용액에 이미다졸 (1.41 g) 과 tert-부틸(클로로)디메틸실란 (1.49 g) 을 첨가하여, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (2.17 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)이노신 (2.55 g) 을 얻었다.
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
(공정 11)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}이노신
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (2.17 g) 의 디클로로메탄 (25.7 mL) 용액에, 4,5-디시아노이미다졸 (334 mg) 과 2-시아노에틸N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 (0.980 mL) 를 첨가하여, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 추출 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DIOL 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (2.65 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
(공정 12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (950 mg) 을 탈수 아세토니트릴 (5 mL) 로 3 회 공비하고, 마지막 1 회는 3 mL 정도의 아세토니트릴을 남겨, 몰레큘러시브 3A, 1/16 (펠릿상의 것 5 입자) 을 첨가하였다. 이 아세토니트릴 용액을 상기 공정 7 에서 조제한 아세토니트릴 용액에 첨가하여, 질소 분위기하, 실온에서 20 분간 교반하였다. 반응액에 N,N-디메틸-N'-(3-술파닐리덴-3H-1,2,4-디티아졸-5-일)메탄이미드아미드 (206 mg) 을 첨가하여, 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물의 디클로로메탄 (13.0 mL) 용액에 물 (0.164 mL) 를 첨가한 후, 디클로로아세트산 (0.822 mL) 의 디클로로메탄 (13.0 mL) 용액을 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액에 피리딘 (9.01 mL) 를 첨가하여 반응을 정지한 후, 감압 농축하였다. 얻어진 조생성물을 그대로 다음 반응에 사용하였다.
(공정 13)
3-({(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일}옥시)프로판니트릴
상기 공정 12 에서 얻어진 조생성물의 피리딘 (27.1 mL) 용액을 20 mL 정도까지 농축한 후, 2-클로로-5,5-디메틸-1,3,2λ5-디옥사포스피난-2-온 (622 mg) 을 첨가하여, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 물 (0.57 mL) 와 3H-1,2-벤조디티올-3-온 (230 mg) 을 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응액을 탄산수소나트륨 (3.60 g) 의 수용액 (130 mL) 에 붓고, 실온에서 30 분간 교반한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 건조제를 여과 제거하고 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올] 로 정제하여, 표제 화합물 (494 mg) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1274(M＋H)＋.
(공정 14)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (494 mg) 의 메탄올 (5 mL) 용액에 28 ％ 암모니아수 (5 mL) 를 첨가하여, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 농축 후, 잔류물을 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (88.5 mg : 불순물 함유) 와 디아스테레오머 2 (70.7 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1003(M-C6H15Si＋2H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1003(M-C6H15Si＋2H)＋.
(공정 15-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (88.5 mg : 불순물 함유) 에 트리에틸아민삼불화수소산염 (2.0 mL) 를 첨가하여, 45 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 수용액 (10 mL) 와 트리에틸아민 (2 mL) 의 혼합액을 첨가하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％-30 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 을 이하의 수법으로 나트륨염으로 변환하였다.
[나트륨염으로의 변환]
BT AG (등록상표) 50W-X2 Resin (biotechnology grade, 100-200 mesh, hydrogen form) (500 mg) 을 순수에 현탁하고, 빈 칼럼에 충전하였다. 과잉의 순수를 자연 유하시킨 후, 1 M 수산화나트륨 수용액 (5 mL) 와 순수 (10 mL) 를 순서대로 자연 유하시켰다. 상기에서 얻어진 화합물을 순수 (5 mL) 에 용해하여 칼럼에 챠지하였다. 자연 유하시킨 용액을 분취 후, 다시 순수 (10 mL) 로 용출하였다. 목적물을 함유하는 획분을 함께 동결 건조하여, 표제 화합물 (25.7 mg) 을 얻었다.
(공정 15-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (70.7 mg : 불순물 함유) 를 사용하여, 상기 공정 15-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의[정제 조건] 으로 정제를 실시하여, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％-25 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 15 ％-70 ％ (0 분-40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을 상기 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (17.8 mg) 을 얻었다.
실시예 2 : CDN34 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-비스(술파닐)-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 95]
[합성 스킴]
[화학식 96]
(공정 1)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신
시판 (도쿄 화성 공업) 되는 이노신 (10.0 g) 의 피리딘 (50 mL) 와 N,N-디메틸아세트아미드 (50 mL) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (15.2 g) 을 0 ℃ 에서 첨가한 후, 4 ℃ 에서 64 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (2 mL) 를 첨가하고, 10 분 교반 후에 50 mL 정도까지 농축하였다. 잔류물에 2-브로모에틸벤조에이트 (7.02 mL) 와 2,3,4,6,7,8,9,10-옥타하이드로피리미드[1,2-a]아제핀 (13.9 mL) 를 첨가하여, 실온에서 1 일 교반하였다. 반응액에, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (15.2 g) 을 얻었다.
(공정 2)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.01 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 합성을 실시하여, 표제 화합물 (1.20 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신 (1.22 g) 을 얻었다.
(2'-O-TBS 체)
(공정 3)
1-[2-(벤조일옥시)에틸]-5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.20 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 합성을 실시하여, 표제 화합물 (1.41 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 0.55 : 0.45) 로서 얻었다.
(공정 4)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
실시예 1 공정 4 에서 얻어진 화합물 (35.80 g) 의 디클로로메탄 (322 mL)-피리딘 (35 mL) 혼합 용액에, 빙랭하에서 불화수소-피리딘 (6.33 g) 의 디클로로메탄 (36 mL) 용액을 5 분간에 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (268 mL) 와 포화 식염수 (143 mL) 를 순서대로 첨가하여 반응을 정지하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 헥산/아세트산에틸 (1 : 1) (108 mL) 를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 50 ℃ 에서 30 분간 교반하고, 헥산 (161 mL) 를 추가하여 다시 2 시간 교반하였다. 석출된 고체를 여과 채취하고, 헥산/아세트산에틸 (4 : 1) (143 mL) 로 세정하여, 표제 화합물 (26.81 g) 을 얻었다.
(공정 5)
6-벤조일-2-{2-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (19.93 g) 과 3,4-디하이드로-2H-피란 (35 mL) 의 N,N-디메틸포름아미드 (200 mL) 용액에, 빙랭하에서 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (7.25 g) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 빙랭하에서 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 반응을 정지하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물과 포화 식염수로 순서대로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (24.73 g) 을 얻었다.
(공정 6)
6-벤조일-2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보푸라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (24.73 g) 과 아세트산 (3.1 mL) 의 테트라하이드로푸란 (250 mL) 용액에, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 55 mL) 를 첨가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 물과 포화 식염수로 순서대로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (18.74 g) 을 얻었다.
(공정 7)
6-벤조일-2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-아라비노푸라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (18.74 g) 과 피리딘 (13.1 mL) 의 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 빙랭하에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (11 mL) 를 적하하고 10 분간 교반하였다. 반응액에 포화 식염수를 첨가하여 반응을 정지하고, 디클로로메탄으로 추출하여, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (300 mL) 에 용해하고, 빙랭하에서 아질산테트라부틸암모늄 (28.34 g) 의 테트라하이드로푸란 (150 mL) 용액을 적하하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 물과 포화 식염수로 순서대로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (10.46 g) 을 얻었다.
(공정 8)
6-벤조일-2-[2-데옥시-2-플루오로-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보푸라노실]-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (10.46 g) 과 피리딘 (7.3 mL) 의 디클로로메탄 (200 mL) 용액에, 빙랭하에서 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (6.1 mL) 를 적하하고 10 분간 교반하였다. 반응액에 포화 식염수를 첨가하여 반응을 정지하고, 디클로로메탄으로 추출하여, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 테트라하이드로푸란 (200 mL) 에 용해하고, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 150 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (7.65 g) 을 얻었다.
(공정 9)
6-벤조일-2-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (7.65 g) 의 에탄올 (150 mL) 용액에, p-톨루엔술폰산피리디늄 (6.62 g) 을 첨가하고, 50 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하여, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액과 포화 식염수로 순서대로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (3.55 g) 을 얻었다.
(공정 10)
6-벤조일-2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (3.55 g) 의 탈수 피리딘 (50 mL) 용액에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (4.43 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (1 mL) 를 첨가하고, 10 분간 정도 교반 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (5.77 g) 을 얻었다.
(공정 11)
6-벤조일-2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실)-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (5.77 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (5.95 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
(공정 12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (1.02 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 12 와 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 얻어진 조생성물을 그대로 다음 반응에 사용하였다.
(공정 13)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 12 에서 얻어진 조생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 13 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (818 mg : 불순물 함유) 를 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1152(M＋H)＋.
(공정 14)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (818 mg) 을 사용하여, 실시예 1 공정 14 와 동일한 수법을 사용하여 반응을 실시하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (107 mg : 불순물 함유) 와 디아스테레오머 2 (101 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 891(M＋H)＋.
(공정 15-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (107 mg : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 15-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하여, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％-30 ％ (0 분-30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (29.1 mg) 을 얻었다.
(공정 15-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (101 mg : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 15-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하여, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％-20 ％ (0 분-30 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (11.2 mg) 을 얻었다.
실시예 3 : CDN49 의 합성
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-디온
[화학식 97]
[합성 스킴]
[화학식 98]
(공정 1)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
시판 (Aamdis Chemical) 되는 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]이노신 (13.0 g) 의 N,N-디메틸아세트아미드 (60 mL) 현탁액에, N-(2-브로모에틸)프탈이미드 (7.02 g) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (4.1 mL) 를 첨가하여, 실온에서 밤새 교반하였다. N-(2-브로모에틸)프탈이미드 (1.75 g) 과 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (1.1 mL) 를 추가하여, 다시 1 일간 교반하였다. 반응액에 물을 첨가하여 반응을 정지하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [아세트산에틸/메탄올] 로 정제하여, 표제 화합물 (12.4 g) 을 얻었다.
(공정 2)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (12.4 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (4.18 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신 (6.31 g) 을 얻었다.
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
(공정 3)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (8.89 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (9.45 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
(공정 4)
4-클로로-5-요오드-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
시판 (Pharma Block) 되는 4-클로로-5-요오드-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘 (73.8 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 용액에, 빙랭하에서 수소화나트륨 (미네랄 오일을 45 ％ 함유) (13.3 g) 을 첨가하여, 실온까지 승온하면서 40 분간 교반하였다. 재차 빙랭하고, [2-(클로로메톡시)에틸](트리메틸)실란 (51.0 mL) 를 10 분간에 걸쳐 첨가한 후, 동 온도에서 30 분간 교반하였다. 대부분이 고화된 반응액에 물 (260 mL) 를 조금씩 첨가하여 반응을 정지하였다. 고체를 여과 채취하여, 물 (1500 mL) 와 헥산 (600 mL) 으로 세정 후, 감압하 40 ℃ 에서 건조하여, 표제 화합물 (97.63 g) 을 얻었다.
(공정 5)
4-(벤질옥시)-5-요오드-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
벤질알코올 (27 mL) 의 N,N-디메틸포름아미드 (170 mL) 용액에, 빙랭하에서 수소화나트륨 (미네랄 오일을 45 ％ 함유) (12 g) 을 첨가하여, 실온까지 승온하면서 40 분간 교반하였다. 재차 빙랭하고, 상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (97.63 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (360 mL) 현탁액을 40 분간에 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 35 분간 교반하였다. 반응액에 얼음 조각과 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 포화 염화암모늄 수용액과 아세트산에틸의 2 층에 붓고, 아세트산에틸 : 톨루엔 (9 : 1) 로 추출하였다. 유기층을 물과 포화 식염수로 2 회씩 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (107.7 g) 을 얻었다.
(공정 6)
4-(벤질옥시)-5-(3,3-디에톡시프로파-1-인-1-일)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (113.4 g) 의 아세토니트릴 (1000 mL)-트리에틸아민 (98 mL) 혼합 용액에, 질소 분위기하, 실온에서 요오드화구리 (4.49 g), 테트라키스트리페닐포스핀팔라듐(0) (8.17 g), 및 3,3-디에톡시프로파-1-인 (104 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 4.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물에 아세트산에틸과 헥산을 첨가하고, 석출된 고체를 여과 제거하였다. 고체를 아세트산에틸 : 헥산 (1 : 1) 의 혼합액으로 세정 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (145.5 g : 불순물 함유) 를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 482(M＋H)＋.
(공정 7)
5-(3,3-디에톡시프로필)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-올
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (145.5 g) 의 에탄올 (900 mL) 용액에, 10 ％ 팔라듐탄소 촉매 (M) wet (50.2 g) 을 첨가하고, 수소 분위기하, 실온에서 5 시간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (500 mL) 를 첨가하고, 셀라이트로 촉매를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 2 회 정제하여, 표제 화합물 (59.6 g) 을 얻었다.
(공정 8)
5-(3,3-디에톡시프로필)-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-티올
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (59.6 g) 의 탈수 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하, 2,6-루티딘 (42 mL) 를 첨가하였다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (31 mL) 를 -20 ℃ 에서 20 분간에 걸쳐 적하하고, 동 온도에서 20 분간 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드 (500 mL) 와 일황화수소나트륨 n 수화물 (33.5 g) 을 빙랭하에서 첨가하여, 실온까지 승온한 후, 2.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 저비점 성분을 증류 제거하였다. 잔류물을 아세트산에틸과 빙랭한 포화 염화암모늄 수용액의 2 층에 붓고, 아세트산에틸 : 톨루엔 (9 : 1) 의 혼합액으로 추출하였다. 유기층을 포화 염화암모늄 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물과 2,6-루티딘의 혼합물을 얻었다. 얻어진 혼합물을 아세트산에틸과 1 규정 염산의 2 층에 붓고, 아세트산에틸로 2 회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 3 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하여, 표제 화합물 (57.6 g) 을 얻었다.
(공정 9)
3-(4-술파닐-7-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)프로판-1-올
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (31.62 g) 을 80 ％ 아세트산 수용액 (300 mL) 에 용해하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 원료의 소실을 확인 후, 빙랭하여, 수소화붕소나트륨 (1.45 g) 을 소량씩 주의 깊게 첨가하고, 동 온도에서 30 분간 교반하였다. 이어서, 수소화트리아세톡시붕소나트륨 (24.4 g) 을 15 분간에 걸쳐 첨가하고, 동 온도에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 5 분의 1 정도의 양까지 감압 농축하였다. 잔류물에 탄산수소나트륨 (고체) 을 주의 깊게 첨가하여 어느 정도 중화한 후, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 탄산수소나트륨과 포화 식염수로 순서대로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (17.93 g) 을 얻었다.
(공정 10)
2-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (31.31 g) 의 탈수 테트라하이드로푸란 (600 mL) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 트리페닐포스핀 (25.4 g) 과 디이소프로필아조디카르복실레이트 (21.8 g) 을 첨가하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/아세트산에틸] 및 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 순서대로 정제하여, 표제 화합물 (35.93 g : 불순물 함유) 를 얻었다.
(공정 11)
(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)메탄올
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (35.93 g) 의 디클로로메탄 (150 mL) 용액에, 실온에서 트리플루오로아세트산 (150 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 톨루엔으로 4 회 공비하였다. 잔류물에 디클로로메탄 : 헥산 (1 : 2) 의 혼합액을 첨가하고, 석출된 고체를 여과 채취하였다 (고체 1). 여과액을 감압 농축 후, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸→아세트산에틸/메탄올] 로 정제하여, 고체 2 를 얻었다. 고체 1 과 고체 2 를 합하여, 표제 화합물 (20.13 g) 을 얻었다.
(공정 12)
2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (20.13 g) 의 메탄올 (250 mL) 현탁액에, 28 ％ 암모니아 수용액 (150 mL) 를 첨가하여, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응액을 감압하에서 절반 정도의 양까지 농축하였다. 석출된 고체를 여과 채취하여, 에탄올로 세정하고, 고체 1 을 얻었다. 여과액을 감압 농축하고, 동일한 조작으로 고체 2 를 얻었다. 여과액을 실리카겔에 바른 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축하고, 에탄올로 슬러리 세정 후, 고체를 여과 채취하였다 (고체 3). 고체 1, 고체 2, 및 고체 3 을 합하여, 표제 화합물 (12.36 g) 을 얻었다.
(공정 13)
2-(2,3,5-트리-O-벤질-β-D-아라비노푸라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (13.47 g) 의 탈수 아세토니트릴 (350 mL) 현탁액에, 질소 분위기하, 분말상의 수산화칼륨 (10.3 g) 과 트리스[2-(2-메톡시에톡시)에틸]아민 (1.13 mL) 를 첨가하여, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 빙랭하, 문헌에 이미 알려진 (J. Med. Chem. 1976, 19, 6, 814-816) 의 2,3,5-트리-O-벤질-α-D-아라비노푸라노실클로라이드 (40.2 g) 의 아세토니트릴 (100 mL) 용액을 조금씩 첨가한 후, 실온까지 승온하여 4 시간 교반하였다. 불용물을 여과 제거하여, 아세토니트릴로 세정하였다. 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 2 회 정제하여, 표제 화합물 (26.19 g) 을 얻었다.
(공정 14)
2-β-D-아라비노푸라노실-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (26.19 g) 의 탈수 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서 삼염화붕소의 디클로로메탄 용액 (1 M, 200 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 2 시간 교반한 후, 0 ℃ 까지 승온하여 다시 4 시간 교반하였다. 반응액을 재차 -78 ℃ 까지 냉각하고, 메탄올 (80 mL) 의 디클로로메탄 (160 mL) 용액을 첨가하여, 실온까지 승온하면서 30 분간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 에탄올로 2 회 공비하였다. 잔류물에 에탄올 (200 mL) 와 디에틸에테르 (100 mL) 를 첨가하여, 슬러리상으로 하고, 고체를 여과 채취하였다 (고체 1). 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축 후, 에탄올을 첨가하여, 슬러리상으로 하고, 고체를 여과 채취하였다 (고체 2). 고체 1 과 고체 2 를 합하여 표제 화합물 (13.2 g) 을 얻었다.
(공정 15)
2-[3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-아라비노푸라노실]-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (15.35 g) 의 탈수 디메틸술폭시드 (160 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 3,4-디하이드로-2H-피란 (17.2 mL) 와 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (9.02 g) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 3,4-디하이드로-2H-피란 (8.6 mL) 를 추가하여, 45 분간 교반한 후, 즉시 트리에틸아민 (13 mL) 를 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 아세트산에틸과 포화 탄산수소나트륨 수용액의 2 층에 붓고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (10.81 g) 을 4 종류의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
(공정 16)
2-[2-데옥시-2-플루오로-3,5-비스-O-(옥산-2-일)-β-D-리보푸라노실]-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 15 에서 얻어진 화합물 (10.81 g) 의 탈수 디클로로메탄 (150 mL) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서 피리딘 (5.3 mL) 와 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (5.6 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 얼음 조각을 넣어 반응을 정지한 후, 반응액을 아세트산에틸과 포화 탄산수소나트륨 수용액의 2 층에 붓고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 2 회 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하고, 트리플레이트의 조체를 아모르퍼스로서 얻었다. 얻어진 트리플레이트의 조체를 탈수 테트라하이드로푸란 (150 mL) 에 용해하고, 빙랭하에서 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 154 mL) 를 조금씩 첨가하여, 동 온도에서 밤새 교반하였다. 반응액에 포화 염화암모늄 수용액을 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 절반 정도의 양까지 감압 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸과 포화 염화암모늄 수용액의 2 층에 붓고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 염화암모늄 수용액으로 1 회, 포화 식염수로 2 회 세정하였다. 수층을 아세트산에틸로 재차 추출하여, 추출액을 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 합하여 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하고, 여과액을 감압 농축하여, 표제 화합물 (40.37 g) 의 조체를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 494[M＋H]＋.
(공정 17)
2-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 16 에서 얻어진 화합물 (40.37 g) 의 메탄올 (400 mL) 용액에 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (2.09 g) 을 첨가하고, 60 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응액에 트리에틸아민 (16 mL) 를 첨가하여 반응을 정지하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸→아세트산에틸/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 슬러리상이 될 때까지 감압 농축하고, 고체를 여과 채취하였다. 얻어진 고체를 헥산/아세트산에틸 (1 : 1) 로 세정하여, 고체 1 을 얻었다. 여과액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하여, 고체 2 를 얻었다. 고체 1 과 고체 2 를 합하여 표제 화합물 (5.32 g) 얻었다.
(공정 18)
2-{5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 17 에서 얻어진 화합물 (5.32 g) 을 사용하여, 실시예 2 공정 10 과 동일한 수법을 사용하여 반응을 실시하여, 표제 화합물 (10.1 g) 을 얻었다.
(공정 19)
2-(5-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-2-데옥시-2-플루오로-β-D-리보푸라노실)-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌
상기 공정 18 에서 얻어진 화합물 (10.1 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 6 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (12.6 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 1 : 1) 로서 얻었다.
(공정 20)
상기 공정 19 에서 얻어진 화합물 (1.80 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보푸라노실}-2,7,8,9-테트라하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (2.30 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 12 와 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 얻어진 조생성물을 그대로 다음 반응에 사용하였다.
(공정 21)
3-{[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-7-{1-[2-(1,3-디옥소-1,3-디하이드로-2H-이소인돌-2-일)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일}-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-10-일]옥시}프로판니트릴
상기 공정 20 에서 얻어진 조생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 13 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (1.22 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1090(M＋H)＋.
(공정 22)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 21 에서 얻어진 화합물 (1.22 g) 의 에탄올 (10 mL)-테트라하이드로푸란 (10 mL) 혼합 용액에, 하이드라진 1 수화물 (0.544 mL) 를 첨가하여, 실온에서 15 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (108 mg : 불순물 함유) 와 디아스테레오머 2 (111 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 907(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 907(M＋H)＋.
(공정 23-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 22 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (108 mg : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 15-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하여, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％-50 ％ (0 분-40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (44.4 mg) 을 얻었다.
(공정 23-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-아미노에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 22 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (111 mg : 불순물 함유) 를 사용하여, 실시예 1 공정 15-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제하여, 표제 화합물을 트리에틸아민염으로서 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 5 ％-25 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 20 ％-60 ％ (0 분-40 분)].
얻어진 트리에틸아민염을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (40.6 mg) 을 얻었다.
실시예 4 : CDN50 의 합성
N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-비스(술파닐)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에틸)-2-하이드록시아세트아미드
[화학식 99]
[합성 스킴]
[화학식 100]
(공정 1-1)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일}-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
실시예 3 공정 23-1 에서 얻어진 화합물 (20.0 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에, 트리에틸아민 (17 μL) 와 1-[(하이드록시아세틸)옥시]피롤리딘-2,5-디온 (10.3 mg) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액으로 희석하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％-30 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (15.6 mg) 을 얻었다.
(공정 1-2)
디나트륨 (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-7-{1-[2-(2-하이드록시아세트아미드)에틸]-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일}-2,10-디옥소옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
실시예 3 공정 23-2 에서 얻어진 화합물 (10.0 mg) 을 사용하여, 상기 공정 1-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 7 ％-25 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물 (트리에틸아민염) 을, 실시예 1 공정 15-1 에 기재된 [나트륨염으로의 변환] 과 동일한 수법으로 염 교환을 실시하여, 표제 화합물 (6.6 mg) 을 얻었다.
실시예 5 : 약물 링커 2 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 101]
(공정 1)
실시예 1 공정 7 과 동일한 반응을 이하의 스케일로 실시하였다 (원료 : 1.40 g). 얻어진 화합물의 아세토니트릴 용액과 실시예 2 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.41 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 12 와 동일한 수법으로 반응을 실시하였다. 얻어진 조생성물을 그대로 다음 반응에 사용하였다.
(공정 2)
2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에틸 벤조에이트
상기 공정 1 에서 얻어진 조생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 13 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (778 mg) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1264(M＋H)＋.
(공정 3)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-[1-(2-하이드록시에틸)-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (778 mg) 을 사용하여, 실시예 1 공정 14 와 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (255 mg) 과 디아스테레오머 2 (불순물 함유) 를 얻었다. 디아스테레오머 2 를 분취 HPLC [물/0.2 ％ 트리에틸아민 함유 아세토니트릴, 0.2 ％ 트리에틸아민 함유 아세토니트릴 : 5 ％-50 ％ (0 분-40 분)] 로 재차 정제하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 2 (94.6 mg) 을 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
디아스테레오머 2 (고극성)
(공정 4-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-yl)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 1)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (30 mg) 의 테트라하이드로푸란 (0.5 mL) 용액에 [(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}글리실)아미노]메틸 아세테이트 (91.7 mg) 과 p-톨루엔술폰산 1 수화물 (11.8 mg) 을 첨가하여, 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액에 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 와 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (56 μL) 를 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액을 첨가하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하여, 불순물로서 원료를 포함하는 표제 화합물 (25.6 mg) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1089(M＋H)＋.
(공정 4-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-비스{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (84.6 mg) 을 사용하여, 상기 공정 4-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 불순물로서 원료를 포함하는 표제 화합물 (70.9 mg) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1089(M＋H)＋.
(공정 5-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트) 디아스테레오머 1
상기 공정 4-1 에서 얻어진 화합물 (25.6 mg) 에 트리에틸아민삼불화수소산염 (2 mL) 를 첨가하여, 45 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 실온하, 반응액에 빙랭한 1 M 탄산수소트리에틸암모늄 용액 (10 mL) 와 트리에틸아민 (2 mL) 의 혼합액을 첨가하였다. 반응액을 감압 농축 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴) 로 정제하여, 표제 화합물 (16.6 mg : 공정 7-1 의 원료 유래의 불순물을 포함) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 861(M＋H)＋.
(공정 5-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
(디아스테레오머 2)
상기 공정 4-2 에서 얻어진 화합물 (70.9 mg) 을 사용하여, 상기 공정 5-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (51.7 mg : 공정 4-2 의 원료 유래의 불순물을 포함) 을 얻었다.
MS(ESI)m/z : 861(M＋H)＋.
(공정 6-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 2a : 디아스테레오머 1)
상기 공정 5-1 에서 얻어진 화합물 (16.6 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에 트리에틸아민 (6 μL) 와 후술하는 공정 8 에서 얻어진 화합물 (15.5 mg) 을 첨가하여, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응액에 벤질아민 (3 μL) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액과 메탄올을 첨가하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％-45 ％ (0 분-30 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (5.1 mg) 을 얻었다.
(공정 6-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-디하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-yl)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 2b : 디아스테레오머 2)
상기 공정 5-2 에서 얻어진 화합물 (51.7 mg) 을 사용하여, 상기 공정 6-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, 이하의 [정제 조건] 으로 정제를 실시하여, 표제 화합물 (33.7 mg) 을 얻었다.
[정제 조건] C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 10 ％-50 ％ (0 분-30 분)].
(공정 7)
N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닌
시판 (BACHEM) 되는 (2S)-2-[[2-[(2-아미노아세틸)아미노]아세틸]아미노]-3-페닐프로판산 (2.86 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (51.2 mL) 용액에 트리에틸아민 (2.56 mL) 와 시판 (Click Chemistry Tools) 되는 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (3.69 g) 을 첨가하여, 실온에서 24 시간 교반하였다. 반응액에 시트르산 1 수화물 (24.0 g) 의 물 (500 mL) 용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 아세트산에틸/아세토니트릴 혼합 용액에 용해시킨 후, 디이소프로필에테르로 석출시키고 여과 채취하여, 표제 화합물 (4.30 g) 을 얻었다.
(공정 8)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라니네이트
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (2.10 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (75.9 mL) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (961 mg) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (1.60 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석하고, 빙수로 3 회 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물에 톨루엔을 첨가하고, 재차 감압 농축하였다. 잔류물을 아세토니트릴에 용해하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [아세토니트릴 : 100 ％] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축 후, 잔류물에 디이소프로필에테르를 첨가하여 슬러리상으로 하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하여, 표제 화합물 (2.59 g) 을 얻었다.
실시예 6 : 약물 링커 17 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 102]
(공정 1)
[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메틸 아세테이트
시판 (SUNDIA) 되는 N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실글리신 (9.32 g) 의 테트라하이드로푸란 (100 mL)-톨루엔 (33.3 mL) 혼합액에, 실온에서 피리딘 (3.26 mL) 와 사아세트산납 (17.9 g) 을 첨가하고, 65 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 불용물을 여과 제거하여, 테트라하이드로푸란으로 세정 후, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (8.24 g) 을 얻었다.
(공정 2)
2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-하이드록시에틸)이노신
문헌에 이미 알려진 (Chem. Pharm. Bull. 1987, 35 (1), 72-79) 2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]이노신 (31.3 g) 의 테트라하이드로푸란 (75 mL)-N,N-디메틸아세트아미드 (75 mL) 혼합 용액에, 2-브로모에탄올 (4.82 mL) 와 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (7.65 mL) 를 첨가하여, 실온에서 23 시간 교반하였다. 반응액에, 물과 아세트산에틸을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (29.4 g) 을 얻었다.
(공정 3)
2',3',5'-트리스-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (15.6 g) 의 톨루엔 (46.8 mL) 용액에 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.4 g) 과 피리딘 (9.63 mL) 를 첨가하고, 110 ℃ 에서 12 시간 교반하였다. 반응액에 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.46 g) 을 추가하여, 110 ℃ 에서 1 일간 교반하였다. 반응액에 포화 탄산수소나트륨 수용액과 디클로로메탄을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸] 로 정제하여, 표제 화합물 (20.6 g : 불순물 함유) 를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 885(M＋H)＋.
(공정 4)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (20.6 g) 의 테트라하이드로푸란 (50 mL) 용액에 트리에틸아민삼불화수소산염 (10 mL) 를 첨가하여, 실온에서 17 시간 교반하였다. 빙랭하, 반응액에 1 M 탄산수소 트리에틸암모늄 용액 (50 mL) 와 트리에틸아민 (10 mL) 의 혼합액을 천천히 첨가한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 잔류물을 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [물/아세토니트릴] 로 조정제 후, 동결 건조하였다. 얻어진 조체를 피리딘으로 공비하고, 잔류물의 피리딘 (50 mL) 용액에, 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드 (4.73 g) 을 0 ℃ 에서 첨가하여, 4 ℃ 에서 17 시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 (2 mL) 를 첨가하여, 실온에서 15 분간 교반 후, 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산/아세트산에틸/메탄올/0.1 ％ 트리에틸아민] 로 정제하여, 표제 화합물 (9.18 g : 불순물 함유) 를 얻었다.
(공정 5)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5.96 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 10 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (2.33 g) 과 표제 화합물의 위치 이성체인 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-2'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신 (2.45 g) 을 얻었다.
위치 이성체 (2'-O-TBS 체)
(공정 6)
5'-O-[비스(4-메톡시페닐)(페닐)메틸]-3'-O-[tert-부틸(디메틸)실릴]-2'-O-{(2-시아노에톡시)[디(프로판-2-일)아미노]포스파닐}-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)이노신
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.33 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 11 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (2.72 g) 을 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물 (디아스테레오머비 = 6 : 4) 로서 얻었다.
(공정 7)
실시예 2 공정 11 에서 얻어진 화합물 (2.15 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 7 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 6-벤조일-2-{2-데옥시-2-플루오로-3-O-[하이드록시(옥소)-λ5-포스파닐]-β-D-리보푸라노실}-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌의 아세토니트릴 용액을 얻었다. 얻어진 아세토니트릴 용액과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.72 g) 을 사용하여, 실시예 1 공정 12 와 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 얻어진 조생성물을 그대로 다음 반응에 사용하였다.
(공정 8)
2-(트리메틸실릴)에틸 (2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-벤조일-6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-10-(2-시아노에톡시)-15-플루오로-2-옥소-2-술파닐-10-술파닐리덴옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에톡시)메틸]아미노}-2-옥소에틸)카르바메이트
상기 공정 7 에서 얻어진 조생성물을 사용하여, 실시예 1 공정 13 과 동일한 수법으로 반응을 실시하여, 표제 화합물 (1.47 g : 불순물 함유) 를 인 원자 상의 디아스테레오머 혼합물로서 얻었다.
MS(ESI)m/z : 1278(M＋H)＋.
(공정 9)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-15-플루오로-2,10-디옥소-7-[6-옥소-1-(2-{[(N-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}에틸)-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일]-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1.47 g) 의 메탄올 (10 mL)-테트라하이드로푸란 (10 mL) 혼합 용액에, 28 ％ 암모니아수 (10 mL) 를 첨가하고, 50 ℃ 에서 6 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 잔류물을 C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 로 정제하여, 표제 화합물의 디아스테레오머 1 (204 mg : 불순물 함유) 와 디아스테레오머 2 (205 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
디아스테레오머 1 (저극성)
MS(ESI)m/z : 1121(M＋H)＋.
디아스테레오머 2 (고극성)
MS(ESI)m/z : 1121(M＋H)＋.
(공정 10-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 1) (204 mg) 의 테트라하이드로푸란 (6 mL) 용액에, 불화테트라부틸암모늄의 테트라하이드로푸란 용액 (약 1 M, 3 mL) 를 첨가하여, 실온에서 33 시간 교반하였다. 4 ℃ 에서 3 일간 보존한 후, 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액을 첨가하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％-50 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (40.7 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 863(M＋H)＋.
(공정 10-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) (5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-7-(1-{2-[(글리실아미노)메톡시]에틸}-6-옥소-1,6-디하이드로-9H-퓨린-9-일)-16-하이드록시-2,10-디옥소-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-2,10-비스(티올레이트)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (디아스테레오머 2) (205 mg) 을 사용하여, 상기 공정 10-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴] 과 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1), 아세토니트릴-메탄올 용액 (1 : 1) : 10 ％-50 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (50.8 mg : 불순물 함유) 를 얻었다.
MS(ESI)m/z : 863(M＋H)＋.
(공정 11-1)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 17a : 디아스테레오머 1)
상기 공정 10-1 에서 얻어진 화합물 (40.7 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에 트리에틸아민 (11 μL) 와 실시예 5 공정 8 에서 얻어진 화합물 (25.4 mg) 을 첨가하여, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에 벤질아민 (8 μL) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액과 메탄올을 첨가하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 20 ％-45 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％-90 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (25.1 mg) 을 얻었다.
(공정 11-2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드-14-(6,7,8,9-테트라하이드로-2H-2,3,5,6-테트라아자벤조[cd]아줄렌-2-일)옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에톡시)메틸]글리신아미드
(약물 링커 17b : 디아스테레오머 2)
상기 공정 10-2 에서 얻어진 화합물 (50.8 mg) 과 실시예 5 공정 8 에서 얻어진 화합물 (31.7 mg) 을 사용하여, 상기 공정 11-1 과 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％-45 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 45 ％-90 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (23.4 mg) 을 얻었다.
실시예 7 : 약물 링커 20 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 103]
(공정 1)
N-(아자뉴밀아세틸)글리실-L-페닐알라닐글리신트리플루오로아세테이트
시판 (BACHEM) 되는 N-(tert-부톡시카르보닐)글리실글리실-L-페닐알라닐글리신 (3.00 g) 의 디클로로메탄 (30 mL) 용액에 실온에서 트리플루오로아세트산 (15 mL) 를 첨가하고, 동 온도에서 3 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축 후, 톨루엔에 현탁시켜 재차 감압 농축하였다. 이 농축 조작을 추가로 2 회 반복하였다. 잔류물을 디에틸에테르 (100 mL) 로 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하여, 표제 화합물 (3.27 g) 의 조체를 얻었다.
(공정 2)
N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.09 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (46.4 mL) 용액에 트리에틸아민 (0.804 mL) 와 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (1.87 g) 을 첨가하여, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축하고, 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [디클로로메탄/메탄올] 로 정제하였다. 얻어진 화합물의 디클로로메탄 용액에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하여, 표제 화합물 (2.10 g) 을 얻었다.
(공정 3)
2,5-디옥소피롤리딘-1-일N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐글리시네이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.10 g) 의 N,N-디메틸포름아미드 (33.7 mL) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (426 mg) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (710 mg) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 실온에서 16 시간 교반하였다. 반응액을 디클로로메탄으로 희석 후, 빙수로 3 회 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 유상의 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 고체를 석출시켰다. 용매를 감압하에서 증류 제거하고, 얻어진 고체에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 한 후, 여과 채취하여, 표제 화합물 (2.18 g) 을 얻었다.
(공정 4)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에틸)글리신아미드
(약물 링커 20)
실시예 3 공정 23-2 에서 얻어진 화합물 (25.0 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에 트리에틸아민 (8 μL) 와 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (25.8 mg) 을 첨가하여, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액에, 벤질아민 (7 μL) 를 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액과 메탄올을 첨가하고, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 30 ％-50 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 50 ％-90 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (33.1 mg) 을 얻었다.
실시예 8 : 약물 링커 21 의 합성
[합성 스킴]
[화학식 104]
(공정 1)
N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
문헌에 이미 알려진 (WO2014/057687) {[(N-{[(9H-플루오렌-9-일)메톡시]카르보닐}글리실)아미노]메톡시}아세트산 (955 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 mL) 용액에, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (0.74 mL) 를 첨가하여, 실온에서 1 시간 교반하였다 (반응액 A). 실시예 5 공정 7 에서 얻어진 화합물 (938 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 mL) 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (229 mg) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (380 mg) 을 첨가하여, 실온에서 50 분간 교반하였다 (반응액 B). 반응액 A 를 반응액 B 에 첨가하여, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (50 mL) 와 10 ％ 시트르산 수용액 (10 mL) 를 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/(클로로포름/메탄올/물 = 7 : 3 : 1 의 하층)] 로 정제하였다. 얻어진 화합물의 N,N-디메틸포름아미드 (8.0 mL) 용액에, N-하이드록시숙신이미드 (229 mg) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드염산염 (380 mg) 을 첨가하여, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 디클로로메탄 (100 mL) 와 물 (25 mL) 를 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 건조제를 여과 제거하여, 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름/메탄올] 로 정제하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 감압 농축하고, 잔류물에 디에틸에테르를 첨가하여 슬러리상으로 하였다. 얻어진 고체를 여과 채취하여, 표제 화합물 (412 mg) 을 얻었다.
(공정 2)
비스(N,N-디에틸에탄아미늄) N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-디하이드로-6-티아-2,3,5-트리아자벤조[cd]아줄렌-2(7H)-일)-15-플루오로-16-하이드록시-2,10-디옥소-2,10-디술파이드옥타하이드로-2H,10H,12H-5,8-메타노-2λ5,10λ5-푸로[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]펜타옥사디포스파시클로테트라데신-7-일]-6-옥소-6,9-디하이드로-1H-퓨린-1-일}에틸)아미노]-2-옥소에톡시}메틸)글리신아미드
(약물 링커 21)
실시예 3 공정 23-2 에서 얻어진 화합물 (15.0 mg) 과 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (17.4 mg) 을 사용하여, 실시예 7 공정 4 와 동일한 수법으로 반응을 실시한 후, C18 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴], 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/아세토니트릴, 아세토니트릴 : 25 ％-50 ％ (0 분-40 분)], 및 분취 HPLC [10 mM 아세트산트리에틸암모늄 수용액/메탄올, 메탄올 : 40 ％-90 ％ (0 분-40 분)] 로 정제하여, 표제 화합물 (21.8 mg) 을 얻었다.
실시예 9 : 당사슬 리모델링 항체 1 의 합성
항 Trop2 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 105]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체 1 의 조제
참고예 5 에 따라서 조제한 항 Trop2 항체 1 의 인산 완충 생리식염수 용액 (6.0 mL, 16.55 mg/mL, pH 6.0) 에, 야생형 EndoS 의 인산 완충 생리식염수 용액 (0.064 mL, 7.70 mg/mL, pH 6.0) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 진탕하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 으로 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant 25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 mL) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 mL/분 (챠지시에는 1.25 mL/분)
칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 직접 칼럼에 첨가하여, 결합 버퍼 [20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)] 를 1.25 mL/분으로 2 CV (Column Volume) 흘리고, 다시 5 mL/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 [20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액] 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라, 5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 으로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하여, 조정제된 표제 항체 용액 (12.38 mg/mL, 8 mL) 를 얻었다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant 25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 mL) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 mL/분 (챠지시에는 1.25 mL/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 칼럼에 첨가하여, A 액 [5 mM 인산 완충액, 50 mM MES 용액 (pH 6.8)] 을 1.25 mL/분으로 2 CV 흘리고, 다시 5 mL/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 [5 mM 인산 완충액, 50 mM MES 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액] 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (5 CV) 이다. 또한, 세정 용액 [500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)] 를 5 CV 흘렸다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라, 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하여, 표제 항체 용액 (12.30 mg/mL, 8 mL) 를 얻었다.
(공정 2)
항 Trop2 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (12.30 mg/mL, 8 mL, pH 6.0) 에 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (WO2018/003983 의 화합물 1-10) (22.7 mg) 과 EndoS (D233Q/Q303L) 의 인산 완충 생리식염수 용액 (0.339 mL, 5.8 mg/mL, pH 6.0) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 4.5 시간 진탕하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 으로 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 에 기재된 방법에 따라서, 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 으로의 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 완충액의 항체 농도를 공통 조작 B 에 기재된 방법에 따라서 측정하여, 표제 항체 용액 (10.24 mg/mL, 9 mL) 를 얻었다.
실시예 10 : 당사슬 리모델링 항체 2 의 합성
개변 항 Trop2 항체-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 106]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 Trop2 항체의 조제
참고예 6 에 따라서 조제한 개변 항 Trop2 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (10 mL, 16.75 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (18.11 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 Trop2 항체-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (18.11 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (32 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (11.03 mg/mL, 10.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 11 : 당사슬 리모델링 항체 3 의 합성
개변 항 CD70 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 107]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 CD70 항체 1 의 조제
참고예 3 에 따라서 조제한 개변 항 CD70 항체 1 의 인산 완충 생리식염수 용액 (3.0 mL, 16.11 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (6.41 mg/mL, 5.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 CD70 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (6.41 mg/mL, 5.5 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (10 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (9.24 mg/mL, 3.25 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 12 : 당사슬 리모델링 항체 4 의 합성
개변 항 CD70 항체 2-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 108]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 CD70 항체 2 의 조제
참고예 4 에 따라서 조제한 개변 항 CD70 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 용액 (10.0 mL, 14.00 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (18.67 mg/mL, 6 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 CD70 항체 2-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (18.67 mg/mL, 6 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (26 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (11.39 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 13 : 당사슬 리모델링 항체 5 의 합성
개변 항 EGFR 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 109]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 EGFR 항체 1 의 조제
참고예 7 에 따라서 조제한 개변 항 EGFR 항체 1 의 인산 완충 생리식염수 용액 (10.0 mL, 14.00 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (16.70 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 EGFE 항체 1-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (16.70 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (29 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (10.49 mg/mL, 10 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 14 : 당사슬 리모델링 항체 6 의 합성
개변 항 EGFR 항체 2-[SG-(N3)2]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 110]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 EGFR 항체 2 의 조제
참고예 8 에 따라서 조제한 개변 항 EGFR 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 용액 (10.0 mL, 14.10 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (16.88 mg/mL, 6 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 EGFE 항체 2-[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (16.88 mg/mL, 6 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox (23 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (8.34 mg/mL, 6.75 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 15 : 항체 약물 컨쥬게이트 1 의 합성 (항 Trop2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 1 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (10.24 mg/mL, 0.500 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.250 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 2b 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.085 mL, 항체 1 분자에 대해 24 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.165 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (3.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.89 mg/mL
항체 수량 : 3.12 mg (62 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 16 : 항체 약물 컨쥬게이트 2 의 합성 (항 Trop2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (11.03 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.061 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.439 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.26 mg/mL
항체 수량 : 8.16 mg (74 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 17 : 항체 약물 컨쥬게이트 3 의 합성 (항 Trop2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (11.03 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 20 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.061 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.439 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.30 mg/mL
항체 수량 : 8.45 mg (77 ％)
약물 평균 결합수 : 3.5
실시예 18 : 항체 약물 컨쥬게이트 4 의 합성 (항 Trop2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (3) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (11.03 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 21 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.061 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.439 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.33 mg/mL
항체 수량 : 8.62 mg (78 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 19 : 항체 약물 컨쥬게이트 5 의 합성 (항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 3 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (9.24 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.051 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.449 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.08 mg/mL
항체 수량 : 7.02 mg (76 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 20 : 항체 약물 컨쥬게이트 6 의 합성 (항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 4 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (11.39 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.063 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.437 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.33 mg/mL
항체 수량 : 8.65 mg (76 ％)
약물 평균 결합수 : 3.7
실시예 21 : 항체 약물 컨쥬게이트 7 의 합성 (항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 5 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (10.49 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.058 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.442 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.69 mg/mL
항체 수량 : 4.84 mg (48 ％)
약물 평균 결합수 : 3.6
실시예 22 : 항체 약물 컨쥬게이트 8 의 합성 (항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 6 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (8.34 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.055 mL, 항체 1 분자에 대해 9.6 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.445 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (7.0 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 0.52 mg/mL
항체 수량 : 3.62 mg (43 ％)
약물 평균 결합수 : 3.8
실시예 23 : 당사슬 리모델링 항체 7 의 합성
개변 항 Trop2 항체-[MSG1-(N3)]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 111]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 Trop2 항체의 조제
개변 항 Trop2 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (5 mL, 16.75 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (9.81 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 Trop2 항체-[MSG1-(N3)]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (9.81 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox (WO2018/003983 의 화합물 1-11) (12 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (13.22 mg/mL, 5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 24 : 당사슬 리모델링 항체 8 의 합성
개변 항 CD70 항체 2-[MSG1-(N3)]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 112]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 CD70 항체 2 의 조제
개변 항 CD70 항체 2 의 인산 완충 생리식염수 용액 (1.6 mL, 13.44 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (8.96 mg/mL, 2 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 CD70 항체 2-[MSG1-(N3)]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (8.96 mg/mL, 2 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox (4 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (12.20 mg/mL, 1.2 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 25 : 당사슬 리모델링 항체 9 의 합성
개변 항 EGFR 항체 1-[MSG1-(N3)]2 의 조제
[합성 스킴]
[화학식 113]
(공정 1)
(Fucα1,6)GlcNAc-개변 항 EGFR 항체 1 의 조제
개변 항 EGFR 항체 1 의 인산 완충 생리식염수 용액 (10 mL, 14.00 mg/mL, pH 6.0) 을 사용하여, 실시예 9 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 20 mM 인산 완충액 (14.51 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
(공정 2)
개변 항 EGFR 항체 1-[MSG1-(N3)]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 항체의 20 mM 인산 완충액 (14.51 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 과 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox (17.3 mg) 을 사용하여, 실시예 9 공정 2 와 동일한 조작을 실시하여, 표제 항체의 인산 완충 생리식염수 용액 (13.34 mg/mL, 7.5 mL, pH 6.0) 을 얻었다.
실시예 26 : 항체 약물 컨쥬게이트 9 의 합성 (항 Trop2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (4) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 7 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (13.22 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.073 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.427 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.36 mg/mL
항체 수량 : 8.83 mg (67 ％)
약물 평균 결합수 : 1.9
실시예 27 : 항체 약물 컨쥬게이트 10 의 합성 (항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 8 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (12.20 mg/mL, 1.20 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.600 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.081 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.519 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (7 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.46 mg/mL
항체 수량 : 10.25 mg (70 ％)
약물 평균 결합수 : 1.9
실시예 28 : 항체 약물 컨쥬게이트 11 의 합성 (항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 의 합성)
당사슬 리모델링 항체 9 의 인산 완충 생리식염수 (pH 6.0) 용액 (13.34 mg/mL, 1.00 mL) 를 프로필렌글리콜 (0.500 mL) 로 희석하였다. 이 용액에 약물 링커 17a 의 디메틸술폭시드 용액 (10 mM, 0.074 mL, 항체 1 분자에 대해 8 당량) 과 프로필렌글리콜 (0.426 mL) 의 혼합액을 첨가하고, 튜브 로테이터를 사용하여 실온에서 2 일간 반응시켰다. 반응액을 공통 조작 D 에 기재된 방법에 따라서 정제하여, 목적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트의 ABS 용액 (6.5 mL) 를 얻었다.
공통 조작 E 및 G 에 기재된 방법에 따라서 분석하여, 하기의 결과를 얻었다.
항체 농도 : 1.68 mg/mL
항체 수량 : 10.91 mg (82 ％)
약물 평균 결합수 : 1.9
(참고예 1 : ML-RR-CDA·2Na＋ 의 합성)
본 명세서에서, 레퍼런스 화합물로서 사용한 ML-RR-CDA·2Na＋ 는, 특허문헌 3 (WO2014/189805) 에 기재된 방법에 따라서 합성하였다.
(참고예 2 : 2',3'-cGAMP 의 합성)
본 명세서에서, 레퍼런스 화합물로서 사용한 2',3'-cGAMP 는, cGAS 를 사용하여 ATP 와 GTP 로부터 효소적으로 합성하였다. cGAS 의 조제 및 효소 반응은, 문헌에 기재된 방법 (Immunity, 2013, 39, 1019-1031, Cell Rep. 2014, 6, 421-430) 을 적절히 개변하여 실시하였다. 정제는, 약염기성 음이온 교환 수지 (DIAION WA10) 및 합성 흡착제 (SEPABEADS SP207SS) 를 사용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 실시하였다.
(참고예 3 : 항 CD70 항체 1 의 제작)
항 CD70 항체 1 은 WO2004/073656 을 참조하여 제작하였다. 실시예에서 사용한 항 CD70 항체 1 은, 아이소 타입이 IgG1 이고, LALA 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항 CD70 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 2) 을 도 4 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 35), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 36), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 37), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 38), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 39), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 40) 을 도 16 에 나타낸다.
(참고예 4 : 항 CD70 항체 2 의 제작)
항 CD70 항체 2 는 WO2007/038637 을 참조하여 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 항 CD70 항체 2 는, 아이소 타입이 IgG1 이고, LALA 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항 CD70 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 4) 을 도 5 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 41), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 42), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 43), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 44), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 45), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 46) 을 도 17 에 나타낸다.
(참고예 5 : 항 TROP2 항체 1 의 제작)
항 TROP2 항체 1 은 WO2015/098099 를 참조하여 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 항 TROP2 항체 1 은, 아이소 타입이 IgG1 이다. 본 실시예에서 사용한 항 TROP2 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 5) 및 중사슬 아미노산 서열을 (서열 번호 6) 도 6 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 47), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 48), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 49), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 50), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 51), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 을 도 18 에 나타낸다.
(참고예 6 : 항 TROP2 항체 2 의 제작)
항 TROP2 항체 1 은 WO2015/098099 를 참조하여 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 항 TROP2 항체 1 은, 아이소 타입이 IgG1 이다. 항 TROP2 항체 2 는, 항 TROP2 항체 1 에 LALA 변이를 도입하였다. 본 실시예에서 사용한 항 TROP2 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 7) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 도 7 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 53), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 54), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 55), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 56), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 57), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 58) 을 도 19 에 나타낸다.
(참고예 7 : 항 EGFR 항체 1 의 제작)
항 EGFR 항체 1 은, 벡티빅스 점적 정주 (靜注) 100 mg 심사 결과 보고서 (2010년 3월 5일 의약 식품국 심사 관리과) 를 참조하여 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 항 EGFR 항체 1 은, 아이소 타입이 IgG1 이고, LALA 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항 EGFR 항체 1 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 9) 및 중사슬 아미노산 서열을 (서열 번호 10) 을 도 8 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 59), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 60), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 61), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 62), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 63), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 64) 을 도 20 에 나타낸다. CDR 서열은 WO1998/050433 을 참조하였다.
(참고예 8 : 항 EGFR 항체 2 의 제작)
항 EGFR 항체 2 는 WO2002/092771 을 참조하여 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 항 EGFR 항체 2 는, 아이소 타입이 IgG1 이고, LALA 변이를 갖는다. 본 실시예에서 사용한 항 EGFR 항체 2 의 경사슬 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 중사슬 아미노산 서열 (서열 번호 12) 을 도 9 에 나타낸다. 당해 항체의 CDRL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 65), CDRL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 66), CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 67), CDRH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 68), CDRH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 69), 및 CDRH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 70) 을 도 21 에 나타낸다.
(시험예 1) 리포터 세포를 사용한 STING 아고니스트 활성 평가
＜리포터 진 어세이＞
인간 STING 아고니스트 활성은, STING 경로의 하류에 있는 인터페론 제어 인자 3 (interferon regulatory factor-3 (IRF3)) 의 경로의 활성화를 확인할 수 있는 THP1-DualTM 세포 (HAQ 변이형) (InvivoGen, CA, US) 를 사용하여 평가하였다. 마우스 STING 아고니스트 활성은 RAW-DualTM 세포 (InvivoGen) 를 사용하여 평가하였다.
어세이는 이하와 같이 실시하였다. 먼저, 투명 96 웰 플레이트 (Corning, NY, US) 에, PBS 로 희석한 피험 화합물을 20 μL/well 로 분주하였다. 계속해서, 어세이 버퍼 (10 ％ 소 혈청 알부민을 함유하는 RPMI1640 배지 또는 DMEM 배지) 에 현탁한 리포터 세포를 180 μL/well (1×105 cells/well) 로 첨가하여 자극을 개시하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 환경하에서 24 시간 배양한 후의 원심 상청을 회수하였다. 6 μL 의 회수한 상청을 백색 384 웰 플레이트에 첨가하고, 거기에 QUANTI-Luc (InvivoGen) 용액을 15 μL 첨가하였다. 잘 혼화한 후, 플레이트 리더 (Perkin Elmer, MA, US) 를 사용하여 발광을 측정하였다. 1.37 에서 100 μM 의 ML-RR-CDA·2Na＋ (Compound 21 in WO2014/189805) 를 처리한 세포에 있어서의 최대 카운트치를 100 ％, PBS 로 처리한 세포에서의 카운트를 0 ％ 로 하여, 피험 화합물이 50 ％ 의 카운트를 얻는 데 필요한 농도를 EC50 (μM) 치로서 GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, US) 를 사용하여 산출하였다. 표 1 에 인간 STING 아고니스트 활성 시험의 결과를 나타낸다.
이 결과, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 화합물이 인간 STING 에 대한 아고니스트 활성을 갖는 것이 분명해졌다. 또, 마우스 STING 에 대해서도, 기존의 CDN 과 동등 이상의 아고니스트 활성을 확인하였다.
(시험예 2) 리콤비넌트 STING C 단말 결합 도메인 단백질을 사용한 Protein thermal shift assay
(i) 각종 발현 플라스미드의 구축
＜인간 TMEM173 발현 Plasmid 의 구축＞
인간 STING (본 명세서 중, 인간 TMEM173 이라고 부르기도 한다) 의 포유 동물 세포 발현용 플라스미드는, 232 번째의 아르기닌 (R) 이 히스티딘 (H) 으로 변이한 (본 명세서 중, H232 변이 또는 REF 변이라고 한다) 인간 TMEM173 cDNA Clone (Accession NM＿198282.3, H232 (REF) 변이형 STING 발현 플라스미드) (GeneCopoeia, MD, US) 를 구입하였다. 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 15 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 16 에 나타낸다. 또, H232 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, Inverse PCR 법에 기초한 부위 특이적 변이 도입을 실시하여 야생형 STING 및 변이형 STING 의 발현 플라스미드를 제작하였다. 상세하게는, 먼저 2 종류의 Primer (5'-CGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3' (H232R (WT) fwd) (서열 번호 25) 및 5'-GTCACCGGTCTGCTGGGGCAGTTTATC-3' (H232R (WT) rev)) (서열 번호 26) 과 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (SMK-101) (토요보) 를 사용하여 PCR 을 실시하고, DNA 시퀀싱에 의해 목적하는 야생형 (R232) STING 발현 플라스미드의 구축을 확인하였다. 인간 야생형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 13 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 14 에 나타낸다.
다음으로, HAQ (R71H, G230A 및 R293Q) 변이형을, 야생형 STING 발현 플라스미드와 동일한 수법으로 제작하였다. 상세하게는, H232 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 Primer (5'-GCTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3' (H232R/G230A fwd) (서열 번호 27) 및 5'-GGTCTGCTGGGGCAGTTTATCCAGG-3' (H232R/G230A rev) (서열 번호 28)) 과 Mutagenesis Kit 를 사용하여 PCR 을 실시하였다. 2 지점에 동시에 변이를 도입함으로써, G230A 변이형 STING 플라스미드를 취득하였다. 또한, G230A 변이형 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 Primer (5'-CACCACATCCACTCCAGGTACCGG-3' (R71H fwd) (서열 번호 29) 및 5'-CAGCTCCTCAGCCAGGCTGCAGAC-3' (R71H rev) (서열 번호 30)) 과 Mutagenesis Kit 를 사용하여 PCR 을 실시하고, R71H/G230A 변이형 STING 발현 플라스미드를 취득하였다.
계속해서, R71H/G230A 변이형의 STING 발현 플라스미드를 주형으로 하고, 2 종류의 Primer (5'-CAGACACTTGAGGACATCCTGGCAG-3' (R293Q fwd) (서열 번호 31) 및 5'-GCAGAAGAGTTTGGCCTGCTCAA-3' (R293Q rev) (서열 번호 32)) 와 Mutagenesis Kit 를 사용하여 PCR 을 실시하여, HAQ (R71H/G230A/R293Q) 변이형의 발현 플라스미드를 취득하였다. 인간 HAQ 변이형 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 17 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 18 에 나타낸다. 인간의 야생형 STING, REF 변이형 STING, HAQ 변이형 STING 의 아미노산 서열을 도 10 에 나타낸다.
＜리콤비넌트 STING C 말단 결합 도메인 단백질 발현 플라스미드 등의 구축＞
인간 STING C 말단 결합 도메인 (aa139-342) 단백질 (UniProt entry Q86WV6) cDNA 는, 전장의 인간 TMEM173 cDNA clone 발현 플라스미드 (야생형, H232 변이형 및 HAQ 변이형) 로부터 2 종류의 Primer (5'-ACCTGTATTTTCAGGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTG-3' (hST Fw＿v2) (서열 번호 33) 및 5'-CAGAATTCGCAAGCTTTTAAGTAACCTCTTCCTTTTCCTCCTGC-3' (hST Rv＿V3) (서열 번호 34)) 를 사용한 PCR 로 제작하였다. PCR 산물은, N 말단에 히스티딘 6 염기로 이루어지는 6xHis 태그, Avidin 태그 및 TEV 프로테아제 절단 사이트를 갖도록, In-Fusion HD Cloning Kit (다카라 바이오) 를 사용하여 대장균 발현용 벡터인 pET15b 에 삽입하고, pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형, pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 및 pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 HAQ 변이형의 발현 플라스미드를 구축하였다.
마우스 STING C 말단 결합 도메인 (aa138-341) 단백질 (UniProt entry Q3TBT3) 발현용 cDNA 에는, 마우스 TMEM173 cDNA 서열로부터 138 번째에서 341 번째의 아미노산에 해당하는 cDNA 를 eurofins Genomics 로 인공 합성한 것을 사용하였다. 마우스 STING 의 아미노산 서열을 서열 번호 19 에, 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 20 에 나타낸다. 합성한 cDNA 는, N 말단에 히스티딘 6 염기로 이루어지는 6xHis 태그, Avidin 태그 및 TEV 프로테아제 절단 사이트를 갖도록 In-Fusion HD Cloning Kit 를 사용하여 대장균 발현용 벡터인 pET15b 에 삽입하고, pET15b-HisAviTEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형의 발현 플라스미드를 구축하였다.
pCDF＿Duet-1 벡터에 인공 합성한 대장균 BirA (UniProt entry P06709) cDNA 를 삽입하고, pCDF＿Duet-1 BirA (1-321) 발현 플라스미드를 구축하였다.
(ii) STING C 말단 결합 도메인 단백질의 조제법
제작한 각 pET15b-HisAviTEV-hSTING (139-342) (인간 야생형 (Hu-WT), 인간 REF 변이형 (Hu-REF) 및 인간 HAQ 변이형 (Hu-HAQ) 의 STING C 말단 결합 도메인 단백질) 발현 플라스미드 및 pET15b-HisAviTEV-mSTING (138-341) (마우스 야생형 (Ms-WT) 의 STING C 말단 결합 도메인 단백질) 발현 플라스미드는 각각, pCDF＿Duet-1 BirA (1-321) 발현 플라스미드와 동시에 Competent E. coli Rosetta 2 (DE3) (Merck Millipore, MA, US) 로 형질 전환하여, 각 HisAviTEV-STING 발현주를 제작하였다. 이들 발현주를 100 ㎍/mL 암피실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 30 ㎍/mL 카나마이신을 함유하는 TB 배지에 첨가하여, 37 ℃ 에서 배양 후, 100 μM IPTG 로 유도 발현하여 다시 16 ℃ 에서 배양하였다.
배양액을 원심하여, 얻어진 균체를 50 mM HEPES pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1 mM DTT, 5 ％ (w/v) glycerol, Complete EDTA free 에 현탁 후, 동결 융해하였다. Lysozyme, DNase I 을 첨가한 후, 초음파 파쇄에 의해 단백질을 추출하고, 원심을 거쳐 상청을 회수하였다. 얻어진 상청을 AKTAexpress 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare, IL, US) 을 사용하여 HisTrap FF 칼럼 (GE Healthcare) 으로 정제하고, Superdex200 16/60 칼럼 (GE Healthcare) 에 통과시켜 Buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 120 mM NaCl, 20 ％ Glycerol, 0.8 mM DTT) 로 용출 하였다. SEC 에 의해 목적 분자량의 단백질을 함유하는 획분을 회수하여, His-Avi-TEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 HAQ 변이형 단백질 및 His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질로서 회수하였다. 단백질 농도는 Nanodrop2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, US) 를 사용하여 측정하고, 사용하기까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 21, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 22, HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 HAQ 변이형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 23, His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 24 에 나타낸다.
(iii) STING 결합 시험
STING C 말단 결합 도메인 단백질에 대한 화합물의 결합성은, 단백질의 열변성 온도의 상승을 지표로 하는 Protein thermal shift assay 에 의해 실시하였다.
상세하게는, 384 웰의 리얼타임 PCR 플레이트에, 어세이 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 120 mM NaCl) 를 사용하여, 3 μL 의 피험 화합물 (최종 농도 0.5 mM), 3 μL 의 SYPRO Orange Protein Gel Stain (Thermo Fisher Scientific) (최종 농도 20× 농도) 과 6 μL 의 STING 단백질을 혼합하고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 혼화하였다. 리얼타임 PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 에 의해, 온도를 매초 0.03 ℃ 의 속도로 25 ℃ 에서 95 ℃ 까지 상승시켜, 단백질의 열변성 온도를 SYPRO Orange 가 발하는 형광을 지표로 측정하였다. 얻어진 측정치는, 해석 소프트웨어인 Protein Thermal Shift software (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여, 형광 강도의 증가 속도가 최대치를 나타내는 온도로서 Tm (the midpoint of the unfolding transition) (℃) 을 구하였다. 각 화합물의 Tm 치로부터, 화합물 무첨가 웰의 Tm 치를 뺌으로써, 피험 화합물에 의한 Tm 의 시프트를 ΔTm (℃) 로서 산출하였다. STING 단백질에 대한 결합 시험의 결과를 표 2 에 나타낸다.
이 결과, 본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트에 사용되는 화합물이 인간의 야생형 STING 및 변이형 STING, 마우스의 야생형 STING 에 대해 결합 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
(시험예 3) HCC 세포 어세이
TROP2 및 STING 을 항상적으로 고발현하는 주로서, American Type Culture Collection 사로부터 구입한 인간 유방암 세포주 HCC1954 (CRL-2338) 세포를 사용하여, IFIT1 프로모터 리포터 유전자를 안정 발현시킨 HCC1954-IFIT1 리포터 세포를 제작하였다. 상세하게는, 구입한 인간 IFIT1 (ISG-56) promoter reporter 플라스미드 (GeneCopoeia, HPRM40290-PG04) 를, FuGene HD (Promega) 를 사용하여 HCC1954 세포에 트랜스펙션하였다. 세포를 1.0 ㎍/mL Puromycin (LifeTechnologies) 첨가 배지에서 계대하여 안정 발현주를 제작하고, 클로닝을 실시하여 평가용 세포주를 취득하였다. 어세이 버퍼 (10 ％ 소 혈청 알부민을 함유하는 RPMI1640 배지) 에 현탁한 HCC1954-IFIT1 리포터 세포를 90 μL/well (2.5×104 cells/well) 로 384 웰 플레이트에 분주하였다. 다음날, 시험 화합물은 PBS 에 의해 희석하고, 10 μL 를 첨가하여 자극을 개시하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 환경하에서 24 시간 배양한 후의 원심 상청을 회수하였다. 6 μL 의 회수한 상청을 백색 384 웰 플레이트에 첨가하고, 거기에 QUANTI-Luc (InvivoGen) 용액을 15 μL 첨가하였다. 잘 혼화한 후, 플레이트 리더 (Perkin Elmer, MA, US) 를 사용하여 발광을 측정하였다.
결과를 도 11 에 나타낸다. 세로축은 발광 카운트수, 가로축은 각 시험 화합물의 농도를 나타내고 있다. 도 중의 백색 동그라미선은, 참고예 6 에서 제작한 항 TROP2 항체 2, 도 중의 흑색 동그라미선은, 참고예 6 에서 작성한 항 TROP2 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1), 도 중의 흑색 삼각선은, 항 TROP2 항체 2 에 실시예 3 의 화합물 49b 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2), 도 중의 흑색 사각선은, 항 TROP2 항체 2 에 실시예 4 의 화합물 50b 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (3) 를 나타낸다. 항 TROP2 항체 2 는 발광 카운트를 증가시키지 않았음에 대하여, 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1), (2), (3) 은 농도 의존적으로 카운트수를 상승시켰다. 이상으로부터, 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1), (2), (3) 이 인간 STING 경로의 활성화능을 갖는 것이 분명해졌다.
(시험예 4) CT26.WT 및 CT26.WT-hCD70 세포주와 마우스 골수 유래 수지상 세포의 공배양 어세이계
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 인간 CD70 유전자 (NP＿001243) 를 도입한 CT26.WT-hCD70 세포를 작성하였다. 상세하게는, 인간 CD70 유전자를 삽입한 pLVSIN 렌티바이러스 벡터 (다카라 바이오) 를 작성하여, Lenti-X293T 세포주 (다카라 바이오) 에 Lentiviral High Titer Packaging Mix (다카라 바이오) 를 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 10 ㎍/mL puromycin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
5 주령의 암컷 BALB/c 마우스 (BALB/cAnNCrlCrlj) (닛폰 찰스·리버) 의 대퇴골로부터 마우스 골수 세포를 채취하였다. 마우스 골수 세포는 20 ㎍/mL murine GM-CSF (PEPROTECH) 존재하에서 7 일간 배양하여, 마우스 골수 유래 수지상 세포를 얻었다. 96 웰 플레이트 1 웰에 대하여, CT26.WT 혹은 CT26.WT-hCD70 세포주를 1.5×105 세포, 마우스 골수 유래 수지상 세포를 1×105 세포 파종하였다. 시험 화합물은 RPMI 배지 (Invitrogen) 에 의해 희석하고, 200 μL 를 첨가하였다. 20 시간 배양 후, 세포를 FCM 버퍼 (HBSS (Wako), 5 ％ FBS (HyClone), 1 mM EDTA (THERMO FISHER)) 로 세정하고, FCM 항체 (항마우스 CD16/32 (Becton Dickinson), 항마우스 CD45, 항마우스 CD11c, 항마우스 I-A/I-E, 항마우스 CD86 (모두 BIOLEGEND)) 를 사용하여 염색하였다. 재차 FCM 버퍼로 세정 후, Fortessa (BD Biosciences) 로 해석하였다. CD45＋, CD11c＋, I-A/I-E＋ 분획에 있어서 CD86 의 MFI 를 산출 후, 시험 화합물 비첨가군에 대한 비율을 계산하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다. 도 중의 DC 는 마우스 골수 유래 수지상 세포와 각 시험 화합물, 도 중의 DC＋CT26.WT 는 마우스 골수 유래 수지상 세포 및 CT26.WT 와 각 시험 화합물, 도 중의 DC＋CT26.WT-hCD70 은 마우스 골수 유래 수지상 세포 및 CT26.WT-hCD70 과 각 시험 화합물의 배양 결과를 나타낸다. 세로축은 비첨가군에 대한 MFI 의 비율, 가로축은 각 시험 화합물을 나타내고 있다. 도 중의 항 CD70 항체 1-CDN (1) 은, 참고예 3 의 항 CD70 항체 1 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트한 것이고, 도 중의 항 CD70 항체 2-CDN (1) 은, 참고예 4 의 항 CD70 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트한 것이다. 실시예 2 의 화합물 34a 는 모든 조건에서 마우스 수지상 세포 상의 CD86 발현을 상승시키고, 항 CD70 항체 1 및 항 CD70 항체 2 는 어느 조건에서도 CD86 발현을 상승시키지 않았다. 이에 대해 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1), 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 은 마우스 골수 유래 수지상 세포를 CT26.WT-hCD70 과 배양한 경우에만 마우스 수지상 세포 상의 CD86 발현이 증강하였다. 이상으로부터, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1), 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 CD70 의존적인 수지상 세포 활성화가 확인되었다.
(시험예 5) 항종양 시험 (1)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 인간 TROP2 유전자 (NP＿002344.2) 를 도입한 CT26.WT-hTROP2 세포를 작성하였다. 상세하게는, pQCIXN 벡터 (다카라 바이오) 를 BamHI 및 Eco RI 로 절단하고 T4 DNA 폴리머라아제로 절단 후에 절단 말단을 평활화하여, Gateway 리딩 프레임 카세트 A 와 라이게이션하여 제작한 pQCIXN-DEN 벡터에, 인간 TROP2 를 Gateway 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 삽입하였다. 인간 TROP2 삽입 pQCXIN-DEN 레트로바이러스 벡터를 EcoPack2-293 세포주 (다카라 바이오) 에 Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 250 ㎍/mL Geneticin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
항체, 및 항체-CDN 컨쥬게이트는 아세트산염 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5) (나카라이테스크) 에 의해 희석하여 사용하였다.
CT26.WT-hTROP2 세포를 생리식염수에 현탁하고, 2.0×106 세포를 BALB/c 마우스의 오른쪽 액와부에 피하 이식하고 (Day0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항 TROP2 항체 1, 및 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 은 30 ㎍/마리 (1.5 mg/㎏ 상당) 의 용량으로, 항 TROP2 항체 2, 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 은 3.0 mg/㎏ 의 용량으로 Day7 에 합계 1 회 꼬리정맥 내 투여하였다. 또, 비이클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마리수는 8 마리로 하였다.
항 TROP2 항체 1 및 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 결과를 도 13 에 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 동그라미선은, 참고예 5 에서 제작한 항 TROP2 항체 1 투여군, 백색 역삼각선은, 항 TROP2 항체 1 에 실시예 1 의 화합물 6b 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군 및 항 TROP2 항체 1 투여군에서는 종양의 증식이 진행되었다. 이에 대해, 항 TROP2 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
항 TROP2 항체 2 및 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 의 결과를 도 14 에 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 백색 동그라미선은, 참고예 6 에서 제작한 항 TROP2 항체 2 투여군, 백색 역삼각선은, 항 TROP2 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트시킨 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군 및 항 TROP2 항체 투여군에서는 종양의 증식이 진행되었다. 이에 대해, 항 TROP2 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항 TROP2 항체가 효과를 나타내지 않는 약효 모델에 있어서, 항 TROP2 항체-CDN 컨쥬게이트의 정맥내 투여에 의한 항체 표적 의존적인 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 6) 항종양 시험 (2)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 인간 EGFR 유전자 (NP＿005219.2) 를 도입한 CT26.WT-hEGFR세포를 작성하였다. 상세하게는, 인간 EGFR 유전자를 삽입한 pLVSIN 렌티바이러스 벡터 (다카라 바이오) 를 작성하여, Lenti-X293T 세포주 (다카라 바이오) 에 Lentiviral High Titer Packaging Mix (다카라 바이오) 를 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 10 ㎍/mL puromycin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
CT26.WT-hEGFR 세포를 생리식염수에 현탁하고, 3×106 세포를 BALB/c 마우스의 오른쪽 액와부에 피하 이식하고 (Day0), 12 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항 EGFR 항체 1, 항 EGFR 항체 2, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1), 및 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 은 1.5 mg/㎏ 의 용량으로, Day12 에 합계 1 회 꼬리정맥 내 투여하였다. 또 비이클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마리수는 8 마리로 하였다.
결과를 도 15 에 나타낸다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 참고예 7 에서 제작한 항 EGFR 항체 1 투여군, 흑색 삼각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 참고예 8 에서 제작한 항 EGFR 항체 2 투여군, 흑색 동그라미선은 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군은 종양의 증식이 진행되었다. 항 EGFR 항체 1 투여군, 및 항 EGFR 항체 2 투여군은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이에 대해, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 및 항 EGFR 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항 EGFR 항체가 항종양 효과를 나타내지 않는 모델을 사용하여, 항 EGFR 항체-CDN 컨쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 7) 항종양 시험 (3)
항체, 및 항체-CDN 컨쥬게이트는 아세트산염 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5) (나카라이테스크) 에 의해 희석하여 사용하였다.
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 인간 신암 세포주 Caki-1 (HTB-46) 세포를 생리식염수로 50 ％ 희석한 마트리겔 (CORNING) 중에 현탁하고, 2.5×106 세포를 BALB/c-nu 마우스의 오른쪽 액와부에 피하 이식하고 (Day0), 13 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항 CD70 항체 1, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 및 항 CD70 항체 2, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 은 1.5 mg/㎏ 의 용량으로 Day13 에 합계 1 회 꼬리정맥 내 투여하였다. 또, 비이클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마리수는 8 마리로 하였다.
결과를 도 22 에 나타낸다. 도 중의 항 CD70 항체 1-컨쥬게이트 (1) 은, 참고예 3 의 항 CD70 항체 1 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트한 것이고, 도 중의 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 은, 참고예 4 의 항 CD70 항체 2 에 실시예 2 의 화합물 34a 를 컨쥬게이트한 것이다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 1 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 흰색 마름모꼴선은 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군, 백색 동그라미선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군, 항 CD70 항체 1 투여군, 항 CD70 항체 2 투여군에서는 종양의 증식이 진행되었다. 이에 대해, 항 CD70 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (1) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항 CD70 항체가 효과를 나타내지 않는 약효 모델에 있어서, 모든 항 CD70 항체-CDN 컨쥬게이트의 정맥내 투여에서 항체 표적 의존적인 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 8) 항종양 시험 (4)
항체, 및 항체-CDN 컨쥬게이트는 아세트산염 완충액 (10 mM Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5) (나카라이테스크) 에 의해 희석하여 사용하였다.
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 인간 신암 세포주 A-498 (HTB-44) 세포를 생리식염수에 현탁하고, 3.0×106 세포를 BALB/c-nu 마우스의 오른쪽 액와부에 피하 이식하고 (Day0), 20 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 항 CD70 항체 2 및 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 는 1.0 mg/㎏ 의 용량으로 Day20 에 합계 1 회 꼬리정맥 내 투여하였다. 또, 비이클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마리수는 6 마리로 하였다.
결과를 도 23 에 나타낸다. 도 중의 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 는, 약물 평균 결합수가 약 2 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 사용한 항체-CDN 컨쥬게이트이다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 CD70 항체 2 투여군, 백색 역삼각선은 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군에서는 종양의 증식이 진행되었다. 항 CD70 항체 2 투여군은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이에 대해, 항 CD70 항체 2-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항 CD70 항체가 효과를 나타내지 않는 약효 모델에 있어서, 항 CD70 항체-CDN 컨쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
(시험예 9) 항종양 시험 (5)
American Type Culture Collection 사로부터 구입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 에 항 EGFR 항체 1 의 에피토프 부위를 인간형으로 치환한 인간 마우스 키메라 EGFR 유전자 (NP＿005219.2) 를 도입한 CT26.WT-chimeraEGFR 세포를 작성하였다. 상세하게는, 인간 마우스 키메라 EGFR 유전자를 삽입한 pLVSIN 렌티바이러스 벡터 (다카라 바이오) 를 작성하여, Lenti-X293T 세포주 (다카라 바이오) 에 Lentiviral High Titer Packaging Mix (다카라 바이오) 를 사용하여 도입하고, 상청을 회수하여 CT26.WT 에 감염시켰다. 세포는 2 ㎍/mL puromycin (Thermo Fisher Scientific) 첨가 배지에서 유지하였다.
CT26.WT-chimeraEGFR 세포를 생리식염수에 현탁하고, 1×106 세포를 BALB/c 마우스의 오른쪽 액와부에 피하 이식하고 (Day0), 7 일 후에 무작위로 군 분류를 실시하였다. 화합물 34a 는 0.01 mg/㎏, 항 EGFR 항체 1 은 0.98 mg/㎏, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 는 1.0 mg/㎏ 의 용량으로, Day7 에 합계 1 회 꼬리정맥 내 투여하였다. 화합물 번호 34a 및 항 EGFR 항체 1 의 투여량은, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 를 구성하는 각 성분의 당량이다. 또 비이클군으로서 아세트산염 완충액을 투여하는 군을 설정하였다. 각 군의 마우스 마리수는 8 마리로 하였다.
결과를 도 24 에 나타낸다. 도 중의 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 는, 약물 평균 결합수가 약 2 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 사용한 항체-CDN 컨쥬게이트이다. 도 중의 흑색 사각선은 비이클군, 흰색 삼각선은 항 EGFR 항체 1 투여군, 흰색 마름모꼴선은 화합물 34a 투여군, 흰색 사각선은 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군을 나타낸다. 세로축은 종양 체적 (㎣), 가로축은 종양 이식 후의 일수를 나타내고 있다. 비이클군은 종양의 증식이 진행되었다. 화합물 34a 투여군 및 항 EGFR 항체 1 투여군은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 이에 대해, 항 EGFR 항체 1-CDN 컨쥬게이트 (2) 투여군에서는 종양의 증식이 현저하게 억제되었다.
이상으로부터, 항 EGFR 항체가 항종양 효과를 나타내지 않는 모델을 사용하여, 항 EGFR 항체-CDN 컨쥬게이트의 강한 항종양 효과가 확인되었다.
본 발명에 의해, 강한 STING 아고니스트 활성을 갖고, 강한 항종양 효과를 나타내는 신규 CDN 유도체를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트가 제공된다. 그 항체 약물 컨쥬게이트는, STING 아고니스트 활성이 관련되는 질환 (예를 들어, 암) 의 치료제로서 유용하다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 항 CD70 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 2 : 항 CD70 항체 1 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 3 : 항 CD70 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 4 : 항 CD70 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 5 : 항 TROP2 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 6 : 항 TROP2 항체 1 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 7 : 항 TROP2 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 8 : 항 TROP2 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 9 : 항 EGFR 항체 1 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 10 : 항 EGFR 항체 1 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 11 : 항 EGFR 항체 2 의 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 12 : 항 EGFR 항체 2 의 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 13 : 인간 야생형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 14 : 인간 야생형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 15 : 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 16 : 인간 H232 (REF) 변이형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 17 : 인간 HAQ 변이형 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 18 : 인간 HAQ 변이형 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 19 : 마우스 STING 의 아미노산 서열
서열 번호 20 : 마우스 STING 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 21 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 야생형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 22 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 REF 변이형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 23 : HisAviTEV-hSTING (139-342) 인간 HAQ 변이형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 24 : His-Avi-TEV-mSTING (138-341) 마우스 야생형 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 25 ∼ 34 : 프라이머의 서열
서열 번호 35 : 항 CD70 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 36 : 항 CD70 항체 1 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 37 : 항 CD70 항체 1 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 38 : 항 CD70 항체 1 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 39 : 항 CD70 항체 1 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 40 : 항 CD70 항체 1 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 41 : 항 CD70 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 42 : 항 CD70 항체 2 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 43 : 항 CD70 항체 2 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 44 : 항 CD70 항체 2 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 45 : 항 CD70 항체 2 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 46 : 항 CD70 항체 2 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 47 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 48 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 49 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 50 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 51 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 52 : 항 TROP2 항체 1 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 53 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 54 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 55 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 56 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 57 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 58 : 항 TROP2 항체 2 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 59 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 60 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 61 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 62 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 63 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 64 : 항 EGFR 항체 1 의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 65 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 66 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 67 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 68 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 69 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 70 : 항 EGFR 항체 2 의 CDRH3 의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED
<120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATE CONTAINING NOVEL CYCLIC DINUCLEOTIDE DERIVATIVE
<130> SAP-865-PCT
<141> 2021-03-05
<150> JP 202038983
<151> 2020-03-06
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
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65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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<213> Homo sapiens
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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195 200 205
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225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
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290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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<213> Homo sapiens
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
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<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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<213> Homo sapiens
<400> 8
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
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Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
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450
<210> 9
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 10
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
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Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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210
<210> 12
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
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1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
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50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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195 200 205
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 379
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr
20 25 30
Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val
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Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala
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130 135 140
Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala
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Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly
180 185 190
Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val
195 200 205
Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys
210 215 220
Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr
225 230 235 240
Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr
245 250 255
Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser
260 265 270
Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala
275 280 285
Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu
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Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp
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<212> DNA
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<210> 15
<211> 379
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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atgccatact ccaacctgca tccagccatc ccacggccca gaggtcaccg ctccaaatat 60
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<212> PRT
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<210> 22
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser
85 90 95
Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser
165 170 175
Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 23
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly Ala Val Ser
85 90 95
Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Thr Ala Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr Cys Val Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Tyr Ser
165 170 175
Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Gln Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu Ser Gln Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp Ser Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 24
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Gly Leu
1 5 10 15
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Thr Pro Ala Glu Val Ser Ala Val
35 40 45
Cys Glu Glu Lys Lys Leu Asn Val Ala His Gly Leu Ala Trp Ser Tyr
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Gly Leu Gln Ala Arg Ile
65 70 75 80
Arg Met Phe Asn Gln Leu His Asn Asn Met Leu Ser Gly Ala Gly Ser
85 90 95
Arg Arg Leu Tyr Ile Leu Phe Pro Leu Asp Cys Gly Val Pro Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Val Val Asp Pro Asn Ile Arg Phe Arg Asp Met Leu Pro Gln
115 120 125
Gln Asn Ile Asp Arg Ala Gly Ile Lys Asn Arg Val Tyr Ser Asn Ser
130 135 140
Val Tyr Glu Ile Leu Glu Asn Gly Gln Pro Ala Gly Val Cys Ile Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser Gln Asp Ala
165 170 175
Lys Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Cys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Leu Glu Asp Val Pro Glu Ser Arg Asn
195 200 205
Asn Cys Arg Leu Ile Val Tyr Gln Glu Pro Thr Asp Gly Asn Ser Phe
210 215 220
Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Ile Arg Gln Glu Glu Lys Glu
225 230 235 240
Glu Val Thr
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 25
cgtgctggca tcaaggatcg ggtttac 27
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 26
gtcaccggtc tgctggggca gtttatc 27
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 27
gctgaccgtg ctggcatcaa ggatcgggtt tac 33
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
ggtctgctgg ggcagtttat ccagg 25
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
caccacatcc actccaggta ccgg 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
cagctcctca gccaggctgc agac 24
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 31
cagacacttg aggacatcct ggcag 25
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 32
gcagaagagt ttggcctgct caa 23
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
acctgtattt tcagggcctg gccccagctg agatctctg 39
<210> 34
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 34
cagaattcgc aagcttttaa gtaacctctt ccttttcctc ctgc 44
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ser Tyr Ile Met His
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu Ala
1 5
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
His Gly Thr Asn Leu Asp Asp
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 69
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr
1 5
Claims (52)
- 다음 식 (II) :
(식 중, m1 은 1 내지 10 의 범위이고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, 그 항체의 당사슬은 리모델링되어 있어도 되고,
(여기서, 항체는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 및 항 EGFR 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것의 항체를 나타낸다)
L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고,
Ab 는 그 아미노산 잔기로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고,
D 는, 다음 식 (I) :
(여기서,
L 은, L1 에 포함되는 임의의 -NH2 또는 하이드록시기와 결합하고,
L1 은, 이하의 3 식 :
(여기서, 파선은 치환 위치를 나타낸다)
중 어느 것의 기를 나타내고,
Q 및 Q' 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 티올기를 나타내고,
R21 및 R22 는, 각각 독립적으로, 하이드록시기 또는 불소 원자를 나타내고,
W 는, -NH- 또는 황 원자를 나타낸다)
로 나타내는 화합물을 나타낸다)
로 나타내는 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항에 있어서,
D 가, 이하의 2 식 :
(여기서, L1, Q, Q' 및 W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
D 가, 이하의 4 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, Q, Q' 및 W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 이하의 3 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 이하의 3 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 이하의 4 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 다음 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 이하의 2 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, W 는, 앞에서 정의한 바와 같다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
D 가, 다음의 4 식 :
(여기서, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 별표는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내거나 또는 존재하지 않고,
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-(CH2)n4-O-C(=O)-, 및,
-(CH2)n9-C(=O)-
(여기서, n2 는 1 ∼ 3 의 정수를 나타내고, n3 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, n4 는 0 ∼ 2 의 정수를 나타내고, n9 는 2 ∼ 7 의 정수를 나타낸다),
Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서 또는 La 와 Ab 의 시스테인 잔기를 결합하는 스페이서를 나타내고, 그리고,
Lc 는, -NH-CH2-, -NH-페닐기-CH2-O(C=O)- 또는 -NH-헤테로아릴기-CH2-O(C=O)- 를 나타내거나 또는 존재하지 않는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항에 있어서,
Lc 가 -NH-CH2- 인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
Lp 가, -GGFG-, -GGPI-, -GGVA-, -GGFM-, -GGVCit-, -GGFCit-, -GGICit-, -GGPL-, -GGAQ- 또는 -GGPP- 중 어느 하나인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 12 항에 있어서,
Lp 가, -GGFG- 또는 -GGPI- 인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
La 가, 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-, 및
-(CH2)5-C(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
Lb 가, 다음 식 :
또는
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 중 어느 것으로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
Lb 가, -(숙신이미드-3-일-N)- 이고,
여기서, -(숙신이미드-3-일-N)- 은, 이하의 구조식 :
을 나타내고,
여기서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 항체의 시스테인 잔기의 측사슬과 티오에테르를 형성하여 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
링커 L 이, -Lb-La-Lp-Lc-* 로 나타내고,
식 중, 별표는, 약물 D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
Lp 가, -GGFG-, 또는 -GGPI- 이고,
La 가, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- 를 나타내고,
Lb 가, 다음 식 :
(상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 별표는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 을 나타내고,
Lc 가, -NH-CH2- 를 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 10 의 범위인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 18 항에 있어서,
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 내지 5 의 범위인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 19 항에 있어서,
항체 약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 3 내지 5 의 범위인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가, 항체의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 로부터 L 에 결합하고 있는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 21 항에 있어서,
N297 당사슬이 리모델링된 당사슬인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 인, 항체 약물 컨쥬게이트 :
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수이다 ;
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수이다. - 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
다음 식 :
(식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
L 은, Ab 의 N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커로서, 앞에서 정의한 바와 같고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 인 것을 나타내고,
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고,
D 는, 이하의 4 식 중 어느 것으로 나타내고,
여기서, 식 중, 별표는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 24 항에 있어서,
다음 식 :
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 25 항에 있어서,
다음 식 :
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는, 항 CD70 항체, 항 TROP2 항체, 혹은 항 EGFR 항체 또는 그들 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내고 ;
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 5 의 정수를 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 항 CD70 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 항 TROP2 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 항 EGFR 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 27 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 28 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 29 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체, 또는, 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 27 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 28 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 29 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 27 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 28 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 29 항에 있어서,
항체가, 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 2 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 포함하는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 6 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 7 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 8 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 9 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 10 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 119 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 11 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 108 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 12 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 116 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 다음 식 :
으로 나타내고, 식 중, Ab 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
서열 번호 35 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 36 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 39 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 40 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 43 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 44 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 47 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 48 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 52 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 56 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 61 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 66 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 67 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 경사슬, 그리고, 서열 번호 68 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 69 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및 서열 번호 70 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 중사슬을 포함하여 이루어지는 항체 ;
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식 :
(식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH- 를 나타내고, 그 L(PEG) 의 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실기와 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
별표는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
n5 는 3 이고, 및
m2 가 1 이다) 로 나타내는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, STING 아고니스트.
- 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, 의약 조성물.
- 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트를 함유하는, 항종양제.
- 제 47 항에 있어서,
종양이, 폐암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암, 췌장암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반융모암, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관간질종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 인두암, 설암, 청각기관암, 흉선암, 소장암, 백혈병, 악성림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종인, 항종양제. - 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트, 제 45 항에 기재된 STING 아고니스트, 제 46 항에 기재된 의약 조성물 및 제 47 항 또는 제 48 항에 기재된 항종양제로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법.
- 제 49 항에 있어서,
암이, 폐암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암, 췌장암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 자궁체암, 정소암, 자궁경암, 태반융모암, 뇌종양, 두경부암, 갑상선암, 중피종, 소화관간질종양 (GIST), 담낭암, 담관암, 부신암, 유극세포암, 인두암, 설암, 청각기관암, 흉선암, 소장암, 백혈병, 악성림프종, 형질세포종, 골수종 또는 육종인, 암의 치료 방법. - 제 27 항, 제 30 항, 제 33 항 또는 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 신암 세포주 Caki-1 세포를 피하 이식한 BALB/c-nu 마우스에 있어서 항체 표적 의존적인 항종양 효과를 발휘하는, 항체 약물 컨쥬게이트. - 제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 약물 컨쥬게이트로서, 하기 (i) 또는 (ii) 에 기재된 동물에 있어서, 항체 약물 컨쥬게이트에 포함되는 항체보다 강한 항종양 효과를 발휘하는, 항체 약물 컨쥬게이트 :
(i) 그 항체 약물 컨쥬게이트에 포함되는 항체가 결합하는 항원 상의 에피토프 부위가 인간형으로 치환된 인간 마우스 키메라 항원의 유전자를 도입한 마우스 대장암 세포주 CT26.WT (CRL2638) 가 피하 이식된 BALB/c 마우스 ;
(ii) 인간 신암 세포주 A-498 (HTB-44) 세포가 피하 이식된 BALB/c-nu 마우스.
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|---|---|---|---|---|
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| WO2024024935A1 (ja) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | 第一三共株式会社 | 抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法 |
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| CN118873678A (zh) * | 2023-01-18 | 2024-11-01 | 泰励生物科技（上海）有限公司 | 抗体偶联药物及其用途 |
Citations (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014093936A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use |
| WO2014099824A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway |
| WO2014179335A1 (en) | 2013-04-29 | 2014-11-06 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
| WO2014189805A1 (en) | 2013-05-18 | 2014-11-27 | Auro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling |
| WO2014189806A1 (en) | 2013-05-18 | 2014-11-27 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for inhibiting "stimulator of interferon gene" dependent signalling |
| WO2015074145A1 (en) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Brock University | Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants |
| WO2015185565A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cyclic di-nucleotides as modulators of sting |
| WO2016012305A1 (de) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Wacker Chemie Ag | Härtbare organopolysiloxanzusammensetzungen |
| WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
| WO2016145102A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling |
| WO2017027646A1 (en) | 2015-08-13 | 2017-02-16 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists |
| WO2017075477A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling |
| WO2017093933A1 (en) | 2015-12-03 | 2017-06-08 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cyclic purine dinucleotides as modulators of sting |
| WO2017100305A2 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Opi Vi - Ip Holdco Llc | Composition of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof |
| WO2017123669A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Gary Glick | Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with sting activity such as cancer |
| WO2017161349A1 (en) | 2016-03-18 | 2017-09-21 | Immune Sensor, Llc | Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use |
| WO2017175147A1 (en) | 2016-04-07 | 2017-10-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Heterocyclic amides useful as protein modulators |
| WO2017175156A1 (en) | 2016-04-07 | 2017-10-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Heterocyclic amides useful as protein modulators |
| WO2018009466A1 (en) | 2016-07-05 | 2018-01-11 | Aduro Biotech, Inc. | Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof |
| WO2018009648A1 (en) | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Sperovie Biosciences, Inc. | Compounds, compositions, and methods for the treatment of disease |
| WO2018045204A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Ifm Therapeutics, Inc | Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity |
| WO2018060323A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Cyclic dinucleotide compounds |
| WO2018067423A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | BENZO[b]THIOPHENE COMPOUNDS AS STING AGONISTS |
| WO2018065360A1 (de) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh | Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen |
| WO2018100558A2 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Cyclic dinucleotide |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
| IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5885573A (en) | 1993-06-01 | 1999-03-23 | Arch Development Corporation | Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies |
| AU691811B2 (en) | 1993-06-16 | 1998-05-28 | Celltech Therapeutics Limited | Antibodies |
| US6235883B1 (en) * | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
| DK1392359T4 (da) | 2001-05-11 | 2013-06-10 | Ludwig Inst For Cancer Res Ltd | Specifikke bindingsproteiner og deres anvendelser. |
| WO2003038043A2 (en) | 2001-11-01 | 2003-05-08 | Uab Research Foundation | Combinations of dr5 antibody and other therapeutic agents |
| EP2100619B1 (en) * | 2003-02-20 | 2014-02-12 | Seattle Genetics, Inc. | Anti-CD70 antibody-drug conjugates and their use for the treatment of immune disorders |
| KR20080056167A (ko) | 2005-09-26 | 2008-06-20 | 메다렉스, 인코포레이티드 | 씨디70에 대한 인간 모노크로날 항체 |
| EP2474560B1 (en) | 2009-09-03 | 2014-03-19 | The Noguchi Institute | Method for producing 11-sugar sialyloligosaccharide-peptide |
| RU2664465C2 (ru) | 2012-10-11 | 2018-08-17 | Дайити Санкио Компани, Лимитед | Конъюгат антитело-лекарственное средство |
| KR102237803B1 (ko) | 2013-12-25 | 2021-04-09 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 항 trop2 항체-약물 컨쥬게이트 |
| US11559581B2 (en) | 2015-01-09 | 2023-01-24 | Oxford University Innovation Limited | Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates |
| US11008392B2 (en) | 2016-07-01 | 2021-05-18 | Daiichi Sankyo Company, Limited | HANP-Fc-containing molecular conjugate |
| AR113224A1 (es) * | 2017-04-28 | 2020-02-19 | Novartis Ag | Conjugados de anticuerpo que comprenden un agonista de sting |
| CA3065919A1 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Silverback Therapeutics, Inc. | Antibody construct conjugates |
| AU2019337051B2 (en) * | 2018-09-06 | 2023-11-23 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Novel cyclic dinucleotide derivative and antibody-drug conjugate thereof |
| TW202241454A (zh) * | 2021-02-01 | 2022-11-01 | 日商第一三共股份有限公司 | 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法 |
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-
2024
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Patent Citations (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014093936A1 (en) | 2012-12-13 | 2014-06-19 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions comprising cyclic purine dinucleotides having defined stereochemistries and methods for their preparation and use |
| WO2014099824A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway |
| WO2014179335A1 (en) | 2013-04-29 | 2014-11-06 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Compositions and methods for altering second messenger signaling |
| WO2014189805A1 (en) | 2013-05-18 | 2014-11-27 | Auro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling |
| WO2014189806A1 (en) | 2013-05-18 | 2014-11-27 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for inhibiting "stimulator of interferon gene" dependent signalling |
| WO2015074145A1 (en) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | Brock University | Use of fluorinated cyclic dinucleotides as oral vaccine adjuvants |
| WO2015185565A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cyclic di-nucleotides as modulators of sting |
| WO2016012305A1 (de) | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Wacker Chemie Ag | Härtbare organopolysiloxanzusammensetzungen |
| WO2016096714A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Detergent composition comprising subtilase variants |
| WO2016145102A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling |
| WO2017027646A1 (en) | 2015-08-13 | 2017-02-16 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists |
| WO2017027645A1 (en) | 2015-08-13 | 2017-02-16 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists |
| WO2017075477A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Aduro Biotech, Inc. | Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene"-dependent signalling |
| WO2017093933A1 (en) | 2015-12-03 | 2017-06-08 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Cyclic purine dinucleotides as modulators of sting |
| WO2017100305A2 (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | Opi Vi - Ip Holdco Llc | Composition of antibody construct-agonist conjugates and methods of use thereof |
| WO2017123669A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Gary Glick | Cyclic dinucleotides for treating conditions associated with sting activity such as cancer |
| WO2017161349A1 (en) | 2016-03-18 | 2017-09-21 | Immune Sensor, Llc | Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use |
| WO2017175147A1 (en) | 2016-04-07 | 2017-10-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Heterocyclic amides useful as protein modulators |
| WO2017175156A1 (en) | 2016-04-07 | 2017-10-12 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Heterocyclic amides useful as protein modulators |
| WO2018009466A1 (en) | 2016-07-05 | 2018-01-11 | Aduro Biotech, Inc. | Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof |
| WO2018009648A1 (en) | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Sperovie Biosciences, Inc. | Compounds, compositions, and methods for the treatment of disease |
| WO2018045204A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Ifm Therapeutics, Inc | Cyclic dinucleotide analogs for treating conditions associated with sting (stimulator of interferon genes) activity |
| WO2018060323A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Cyclic dinucleotide compounds |
| WO2018067423A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | BENZO[b]THIOPHENE COMPOUNDS AS STING AGONISTS |
| WO2018065360A1 (de) | 2016-10-07 | 2018-04-12 | Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh | Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen |
| WO2018100558A2 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Cyclic dinucleotide |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| AACR Tumor Immunology and Immunotherapy, 2017, Poster＃A25 |
| Cell Rep. 2015, 11, 1018-1030 |
| Immunity 2014, 41, 830-842 |
| Immunity 2014, 41, 843-852 |
| J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971 |
| J. Immunol. 1994, 153, 4684-4693 |
| J. Immunol. 2013, 190, 5216-5225 |
| J. Virol. 2014, 88, 5328-5341 |
| Mol. Cell, 2013, 51, 226-235 |
| Mol. Cell, 2015, 59, 891-903 |
| Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215 |
| Nature 2008, 455, 674-678 |
| Sci. Rep. 2016, 6, 19049 |
| Science 2015a, 347, aaa2630 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20220922 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application |