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WO2024024935A1 - 抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法 - Google Patents

抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法 Download PDF

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WO2024024935A1
WO2024024935A1 PCT/JP2023/027716 JP2023027716W WO2024024935A1 WO 2024024935 A1 WO2024024935 A1 WO 2024024935A1 JP 2023027716 W JP2023027716 W JP 2023027716W WO 2024024935 A1 WO2024024935 A1 WO 2024024935A1
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WO
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antibody
formula
compound
tert
reaction
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/027716
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English (en)
French (fr)
Inventor
友和 小倉
英和 井上
岳志 仲谷
秀輔 藤井
Original Assignee
第一三共株式会社
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Filing date
Publication date
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    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
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    • A61P37/04—Immunostimulants
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    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for highly stereoselective production of cyclic dinucleotide derivatives that can be used for antibody-drug conjugates having antitumor effects, and intermediates for the production.
  • the present invention also relates to a novel method for producing a cyclic dinucleotide-linker and antibody-immunoactivator conjugate, including the production method.
  • the present invention relates to a new method for producing a raw material compound used for producing a cyclic dinucleotide derivative, and an intermediate for producing the same.
  • Cyclic dinucleotides activate STING (Stimulator of Interferon Genes) (Non-Patent Document 1). Due to this activation, administration of CDN to tumor-bearing mice enhanced STING-mediated antitumor immune responses, significantly inhibited tumor growth, and improved the survival rate of mice (Non-patent Document 2). ). Recent research has developed synthetic low-molecular-weight compounds that have STING agonist activity without being degraded by nucleases in vivo (eg, Patent Documents 1 to 5).
  • Antibody drug conjugates (Antibody Drug Conjugates, ADCs), in which CDN and antibodies that exhibit such activity are linked via linkers, are also being studied, and have been shown to have antitumor effects in tumors where the antigen is expressed. (Patent Document 6, Patent Document 7).
  • CDNs that have been studied so far have two sulfur-modified pentavalent phosphate bonds called phosphorothioate bonds when linking two types of nucleotides in a ring, and when asymmetric nucleotides are cyclized together, , an asymmetric point is generated on the phosphorus atom of each phosphorothioate moiety.
  • the synthesis is performed without controlling the asymmetry on phosphorus, and the resulting four types of diastereomers are purified, thereby producing a CDN with the desired absolute configuration.
  • Non-Patent Document 3 Patent Documents 1 to 7 Patent Documents 1 to 7).
  • Non-patent Documents 4 to 5 The method using optically active phosphoric acid as a catalyst also has variations in selectivity and yield depending on the structure of the substrate, and the yield during cyclization is also low (Non-Patent Document 6).
  • cGAS modified cyclic Guanosine-Adenosine Synthase
  • cGAS modified cyclic Guanosine-Adenosine Synthase
  • the present invention provides a novel method for producing a cyclic dinucleotide derivative useful as an intermediate for an antibody-drug conjugate, particularly an antibody-immunoactivator conjugate that has STING agonist activity and activates immune cells. This is what we provide.
  • nucleotides with a strongly acidic functional group called phosphorous acid and nucleotides with optically active amidite moieties that are extremely unstable in acidity are used in practical yields and with high steric properties.
  • a method for selective binding is required.
  • the conventional production method is a stereo-nonselective synthesis method, the yield of the target product is low, which makes purification difficult, and the total yield is extremely low.
  • one of the tasks of the present invention is to create a new industrially superior CDN that increases the production rate of the target product by using stereoselective synthesis, reduces the purification load, and improves the total yield.
  • the purpose is to provide a method.
  • Another object of the present invention is to provide a new method for producing a CDN-linker using the production method.
  • one of the objects of the present invention is to provide a new manufacturing method that further reduces the number of steps and improves the yield for the preparation of raw material compounds used in the synthesis of cyclic dinucleotides.
  • the present inventors conducted intensive studies and found that a highly stereoselective synthesis of cyclic dinucleotide derivatives was achieved by using an optically active phosphitylating agent twice, once during coupling and once during cyclization.
  • a new method for producing diastereomers thereby reducing the burden of diastereomer purification and improving the overall yield.
  • a CDN-linker was constructed using the CDN obtained by the production method, and an antibody-immunoactivator conjugate was constructed using the CDN-linker.
  • a new production method that has a shorter number of steps and improved yield than conventional production methods, and have completed the present invention.
  • Rc-2 An optically active phosphitylating agent (Rc-2) selected from the group consisting of the following formulas (Rc-2-1) and (Rc-2-2): [In the formula, R1 is hydrogen or methyl, R2 is hydrogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or phenyl, wherein said alkyl is unsubstituted or substituted with one or more phenyl, tosyl or diphenylmethylsilyl, and Said phenyl is unsubstituted or substituted with nitro or methoxy.
  • A2, PG1, PG2, PG3 and PG4 are as defined above; B2 is , R1 and R2 are as defined above, and PG7 is a protecting group for the amino group.
  • a step of obtaining a compound represented by (Step a3-1) PG2 of the obtained compound of formula (Rc-5A) is deprotected to form formula (Rc-6A- 01 ): [wherein A2, B2, PG1, PG3 and PG4 are as defined above.
  • a step of obtaining a compound represented by (Step a3-2) The obtained compound of formula (Rc-6A- 01 ) is reacted with an acylating agent or an alkoxycarbonylating agent to form formula (Rc-6A): [wherein A2, B2, PG1, PG3 and PG4 are as defined above, and PG5 is an ester or carbonate protecting group for a hydroxy group.
  • a step of obtaining a compound represented by (Step a4) PG4 of the obtained compound of formula (Rc-6A) is deprotected to form formula (Rc-7A): [wherein A2, B2, PG1, PG3 and PG5 are as defined above.
  • a step of obtaining a compound represented by (Step a5) The obtained compound of formula (Rc-7A) is added to the following formulas (Rc-2-1) and (Rc -2-2) selected from the group consisting of; [wherein R1 and R2 are as defined above. ] PG5 is deprotected by reaction with an optically active phosphitylating agent (Rc-2), followed by cyclization in the presence of an activating agent, further treatment with an acylating agent or an alkoxycarbonylating agent, followed by thiolation.
  • Formula (Rc, Rc-8) [In the formula, A2, B2, PG1 and PG3 are as defined above; B2' is and R1, R2, and PG7 are as defined above.
  • Step a6 B2 and B2', which are protecting groups for the thiophosphoric acid site of the obtained compound of formula (Rc, Rc-8), and PG6, which is a protecting group in A2.
  • the activating agent in step a2 and step a5 is independently 1-phenylimidazolium triflate, 1-methylbenzimidazolium triflate, 1-(cyanomethyl)piperidinium triflate, 1-(cyanomethyl)pyrrolidinium triflate, and 1-(cyanomethyl)imidazolium triflate, the method according to [1].
  • the acylating agent or alkoxycarbonylating agent in step a2 and step a5 is independently acetic anhydride, N-succinimidyl acetate, pentafluorophenyl acetate, ethyl trifluoroacetate, methyl trifluoroacetate, pentafluorophenyl trifluoroacetate.
  • the thiolating agent in step a2 and step a5 is independently xanthan hydride, bis(phenylacetyl) disulfide, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide, 5-phenyl-3H- At least one selected from the group consisting of 1,2,4-dithiazol-3-one and [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione.
  • the method according to any one of [1] to [3].
  • PG1 is tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl
  • PG2 is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl
  • PG4 is formyl, acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl, azidobutyryl, allyloxycarbonyl, chloroazidobenzyl, methoxybenzyl, or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • PG5 is acetyl, chloro The method according to any one of [1] to [4], which is acetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl
  • PG3 is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, or benzyloxycarbonyl
  • PG6 is benzyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, or ethoxycarbonyl
  • PG7 is acetyl, trifluoroacetyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-( The method according to any one
  • Step a9 The obtained compound of formula (Rp, Rp-12) or a salt thereof is combined with an antibody or a functional fragment of the antibody (hereinafter referred to as Ab) to form a compound of formula (Rp, Rp-13).
  • Ab an antibody or a functional fragment of the antibody
  • m ranges from 1 to 10;
  • the sugar chains of Ab are arbitrarily remodeled, Ab can be directly linked to a compound of formula (Rp, Rp-12) from the side chain of an optionally modified amino acid residue, or can be linked to a compound of formula (Rp, Rp-12) from a sugar chain or a remodeled sugar chain of Ab. -12) is bound to the compound, A1 is It is.
  • step a9 the compound of the formula (Rp, Rp-12) or a salt thereof and Ab are bonded by a strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction.
  • step a9 the compound of the formula (Rp, Rp-12) or a salt thereof and Ab are bonded by a strain-promoted azide-alkyne cycloaddition reaction.
  • the antibody is anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 antibody, anti-FAP antibody, anti-CDH11 antibody, anti-CDH6 antibody, anti-A33 antibody, anti-CanAg antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody , anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD98 antibody, anti-TROP2 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti- An antibody selected from the group consisting of PSMA antibody, anti-Tenascin-C antibody, anti-SLC44A4 antibody, anti-Mesothelin antibody, anti-ENPP3 antibody, anti-CD47 antibody, anti-EGFR antibody, anti-GPR20 antibody, and anti-DR5 antibody, [1 ] to [12].
  • Step a0-2 protecting the 2'-position hydroxy group of the obtained compound of formula (4A- 01 ) or its salt using levulinic acid, and further The compound according to any one of [1] to [13], which is produced by the step of obtaining the compound of formula (4A) by reacting with a oxidizing agent or an alkoxycarbonylating agent and then detritylation.
  • PG1 is tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl
  • PG2 is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl
  • PG3 is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxy carbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, or benzyloxycarbonyl
  • PG4 is formyl, acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoy
  • PG1 is tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl
  • PG3 is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, or benzyloxycarbonyl
  • PG5 is Acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl or allyloxycarbonyl.
  • a method for producing a cyclic dinucleotide with high stereoselectivity can be provided.
  • this production method the burden of diastereomer purification is reduced, and CDN having the desired configuration can be produced in large quantities at higher yields.
  • a CDN-linker can be produced in high yield by the method for producing a CDN-linker that includes this stereoselective method for producing a CDN.
  • raw material compounds used in the production of cyclic dinucleotides can be prepared in a shorter number of steps and with a higher yield.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 2) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 5) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 6) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 7) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 8) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 9) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 10) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 11) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 12) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 13) and the amino acid sequence of the heavy chain of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 14) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 17) and the amino acid sequence of the heavy chain of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 18) are shown.
  • amino acid sequence of the light chain variable region of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 19) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 20) are shown.
  • amino acid sequence of the light chain variable region of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 21) and the amino acid sequence of the heavy chain variable region of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 22) are shown.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 23), CDRL2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 24), CDRL3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 25), CDRH1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 26), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 27), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 28). CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 29), CDRL2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 30), CDRL3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 31), CDRH1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 32), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 33), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 34).
  • CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 35), CDRL2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 36), CDRL3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 37), CDRH1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 38), the CDRH2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 39), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 40).
  • CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 41), CDRL2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 42), CDRL3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 43), CDRH1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 44), the CDRH2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 45), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 46).
  • CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 47), CDRL2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 48), CDRL3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 49), CDRH1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 50), the CDRH2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 51), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 52). CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 53), CDRL2 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 54), CDRL3 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 55), CDRH1 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 56), the CDRH2 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 57), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 1 (SEQ ID NO: 58). CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 59), CDRL2 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 60), CDRL3 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 61), CDRH1 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 62), the CDRH2 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 63), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 64).
  • CDR sequences were determined according to the IMGT definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 65), CDRL2 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 66), CDRL3 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 67), CDRH1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 68), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 69), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 1 (SEQ ID NO: 70).
  • CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 71), CDRL2 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 72), CDRL3 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 73), CDRH1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 74), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 75), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody 2 (SEQ ID NO: 76).
  • CDR sequences were determined according to Kabat's definition.
  • FIG. 21A obtained from an SG-type glycan remodeling antibody, which is an antibody-immunostimulator conjugate (molecule of (XXXIV)), and a MSG-type
  • a) is the immunostimulant D
  • (b) is the linker L
  • (c) is the PEG linker (L (PEG))
  • (d) is the N297 sugar chain (here, the white circle is NeuAc (Sia)
  • the white hexagon represents Man
  • the black hexagon represents GlcNAc
  • the white diamond represents Gal
  • the white inverted triangle represents Fuc).
  • the white pentagon represents a triazole ring generated by the reaction of the alkyne derived from linker L and the azide group derived from the PEG linker.
  • the Y shape represents the antibody Ab.
  • the PEG linker is linked to the 2-position carboxyl group of sialic acid located at the non-reducing end via an amide bond. This display method is applied throughout this specification unless otherwise specified.
  • the present invention provides a novel method for producing a CDN derivative that has STING agonist activity and is an intermediate for an antibody-immunoactivator conjugate that activates immune cells.
  • Such an antibody-immunoactivator conjugate is disclosed in WO 2020/050406 (Patent Document 6).
  • One embodiment of the present invention is a method for stereoselectively synthesizing a CDN derivative having the structure of the following formula (Rp, Rp-9).
  • a representative scheme of the present invention is outlined below, focusing on a novel method for producing a CDN derivative of formula (Rp, Rp-9), which is one embodiment.
  • a cyclic dinucleotide of formula (Rp, Rp-9) can be produced according to the following synthetic scheme ⁇ Method A>.
  • PG1 is a hydroxy group protecting group
  • PG2 is a trityl-type protecting group for a hydroxy group
  • PG3 is a protecting group for an amino group
  • PG4 is a hydroxy group protecting group
  • PG5 is an ester or carbonate protecting group for a hydroxy group
  • PG8 is a trityl-type protecting group for a hydroxy group
  • A1 is and A2 is (Here, PG6 is a protecting group for an amino group.)
  • the optically active phosphitylating agent (Rc-2) is (wherein R1 is hydrogen or methyl, R2 is hydrogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or phenyl, and said alkyl is unsubstituted or one or more phenyl, tosyl or diphenyl and the phenyl is unsubstituted or substituted with nitro or methoxy.) and In the synthesis scheme
  • PG1 is, for example, a silyl-type protecting group for a hydroxy group, and examples include tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl. Preferred are tert-butyldimethylsilyl and trimethylsilyl. More preferred is tert-butyldimethylsilyl.
  • PG2 is a trityl-type protecting group for a hydroxy group, and examples include 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl. Preferably it is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl or trityl. More preferred is 4-methoxytrityl or 4,4'-dimethoxytrityl.
  • PG3 is, for example, a carbamate-type protecting group for an amino group, such as 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl , or benzyloxycarbonyl.
  • an amino group such as 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl , or benzyloxycarbonyl.
  • it is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl or allyloxycarbonyl. More preferred is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • PG4 is, for example, formyl, an ester-type protecting group, a carbonate-type protecting group, or a benzyl-type protecting group of a hydroxy group, and includes formyl, acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl, azidobutyryl, allyloxycarbonyl, Mention may be made of chloroazidobenzyl, methoxybenzyl or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl. Preferably it is chloroacetyl, levulinoyl or allyloxycarbonyl. More preferably, it is levulinoyl.
  • PG5 is an ester-type protecting group or a carbonate-type protecting group for a hydroxy group
  • examples of the ester-type protecting group include acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, and levulinoyl
  • examples of the carbonate-type protecting group include , 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, and the like.
  • Preferred are chloroacetyl, levulinoyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, or allyloxycarbonyl. More preferred is 9-fluorenylmethyloxycarbonyl or allyloxycarbonyl.
  • Examples of PG6 include benzyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, Or ethoxycarbonyl can be mentioned.
  • Preferred are benzoyl, 2,2,2-chloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, or 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl. More preferred is benzoyl or 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • Examples of PG7 include acetyl, trifluoroacetyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl) ) Ethoxycarbonyl, methoxycarbonyl or ethoxycarbonyl.
  • Suitable are acetyl, trifluoroacetyl, benzoyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, or 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl. More preferred are acetyl, trifluoroacetyl, allyloxycarbonyl, or 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • Examples of PG8 include 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl. Preferably it is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl or trityl. More preferred is 4-methoxytrityl or 4,4'-dimethoxytrityl.
  • this step is a step of reacting a compound of formula (1A) with an optically active phosphitylating agent (Rc-2) to obtain a compound of formula (Rc-3A).
  • the optically active phosphitylating agent (Rc-2) used in this step has the following formula (Rc-2-1) or formula (Rc-2-2): [In the formula, R1 is hydrogen or methyl, R2 is hydrogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or phenyl, wherein said alkyl is unsubstituted or substituted with one or more phenyl, tosyl or diphenylmethylsilyl, and Said phenyl is unsubstituted or substituted with nitro or methoxy. ] Compounds represented by the following can be mentioned.
  • the optically active phosphitylating agent is a reagent for stereoselectively condensing the compound of formula (1A) and the compound of formula (4A) to produce a compound of formula (Rc-5A), and It reacts stereoselectively with the compound (1A) to produce an intermediate of formula (Rc-3A).
  • optically active phosphitylating agent (Rc-2), (3aR)-1-chlorotetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3aR) -1-chloro-3,3-dimethyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3S,3aR)-1-chloro-3-methyl- 3-phenyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3S,3aR)-1-chloro-3-phenyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[ 1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3R,3aR)-1-chloro-3-[(4-methylbenzene-1-sulfonyl)methyl]tetrahydro-1H,3H-pyrrolo [1,2-c][1,
  • the reaction proceeds stereoselectively, and a compound of formula (Rc-3A) having the desired absolute configuration can be obtained.
  • the absolute configuration of the compound of formula (Rc-3A) is indicated using (Rc) of the absolute configuration on the asymmetric carbon atom contained in the prolinol skeleton, as exemplified below.
  • a desired diastereomer can be obtained with high selectivity of 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably 98% or more. can be obtained.
  • a phosphorothioate bond is formed in a stereononselective manner, and the (Rp) and (Sp) forms are produced in a ratio of approximately 50:50, so the yield of a compound having the desired absolute configuration is low. was less than half.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide may be mentioned;
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferred examples include acetonitrile, dichloromethane, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, and toluene, and
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -78°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 2 minutes to 10 hours, more preferably 5 to 180 minutes.
  • this step comprises reacting the compound of formula (Rc-3A) with the compound of formula (4A) or a salt thereof in the presence of an activating agent, and then reacting the compound of formula (Rc-3A) with the compound of formula (4A) or a salt thereof in the presence of an activating agent,
  • a thiolating agent also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent
  • the reaction proceeds stereoselectively to obtain a compound of formula (Rc-5A) having the desired absolute configuration.
  • the absolute configuration of formula (Rc-5A) is expressed using the absolute configuration on the asymmetric carbon atom contained in the prolinol skeleton in B2, similar to the compound of formula (Rc-3A) above. .
  • the activator used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds without impairing the absolute configuration of the compound represented by formula (Rc-3A), but for example, the base component of the counter anion
  • the acid component of the counter anion include 1-phenylimidazole, benzimidazole, 1-methylbenzimidazole, 1-cyanomethylpiperidine, 1-pyrrolidineacetonitrile, and 1-(cyanomethyl)imidazole.
  • Examples include fluoroboric acid, hexafluorophosphoric acid, perchloric acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, and trifluoromethanesulfonic acid.
  • Suitable examples include 1-phenylimidazolium triflate, 1-methylbenzimidazolium triflate, 1-(cyanomethyl)piperidinium triflate, 1-(cyanomethyl)pyrrolidinium triflate, and 1-(cyanomethyl)imidazolium triflate. More preferred are 1-phenylimidazolium triflate and 1-methylbenzimidazolium triflate.
  • the amount of activator used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 3 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3A).
  • the amount of compound (4A) used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 3 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3A), More preferably, it is 0.8 to 1.2 equivalents.
  • the acylating agent or alkoxycarbonylating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include acetic anhydride, acetyl chloride, N-succinimidyl acetate, pentafluorophenyl acetate, 1-acetyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridine, N-methoxydiacetamide, N-acetylimidazole, trifluoroacetic anhydride, bistrifluoroacetamide, ethyltrifluoroacetate, methyl trifluoroacetamide Fluoroacetate, pentafluorophenyl trifluoroacetate, trifluoroacetylbenzotriazole, S-ethyl trifluorothioacetate, N-methylbistrifluoroacetamide, trifluoroacetyl triflate, 1-trifluoroacetylimidazole, benzoic anhydr
  • the reaction temperature with the acylating agent or alkoxycarbonylating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -20°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 2 minutes to 5 hours, more preferably 5 to 90 minutes.
  • the reaction of the activator, acylating agent or alkoxycarbonylating agent, and thiolating agent in this step can be preferably carried out in the presence of a dehydrating agent.
  • the dehydrating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include molecular sieve 3A, molecular sieve 4A, molecular sieve 5A, molecular sieve 13X, magnesium sulfate, sodium sulfate, and calcium chloride.
  • Preferable examples include Molecular Sieve 3A, Molecular Sieve 4A, Molecular Sieve 5A, Molecular Sieve 13X and sodium sulfate, and more preferably Molecular Sieve 3A and Molecular Sieve 4A.
  • the amount of dehydrating agent used in this step is not limited as long as the reaction progresses, but it is preferably 0.01 to 3 times the mass of the compound represented by formula (Rc-3A). more preferably 0.01 to 1 times the mass.
  • the thiolating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include xanthan hydride, bis(phenylacetyl) disulfide, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1 , 1-dioxide, 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazol-3-one and [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione Xanthan hydride, bis(phenylacetyl) disulfide, [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione is preferably used.
  • xanthan hydride [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione
  • the amount of the thiolating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 5 equivalents, and more preferably 0.5 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3A). Preferably, it is 1 to 2 equivalents.
  • the reaction temperature with the thiolating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 5 hours, more preferably from 5 to 90 minutes.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide may be mentioned; Preferred examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, and N-methylpiperidine, and more preferred examples include triethylamine, diisopropylethylamine, and N-methylmorpholine. can.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 20 equivalents, more preferably 0.5 to 20
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably acetonitrile.
  • step a3 comprises step a3-1 and step a3-2, in step a3-1, PG2 of the compound of formula (Rc-5A) is deprotected, and in step a3-2, the resulting This is a step of protecting the hydroxyl group with PG5 to obtain a compound of formula (Rc-6A).
  • the acid used in the deprotection reaction of PG2 includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, formic acid, oxalic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, monochloroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p- Examples include toluenesulfonic acid and benzenesulfonic acid.
  • Preferred examples include hydrochloric acid, acetic acid, monochloroacetic acid, and dichloroacetic acid, and more preferred examples include hydrochloric acid and dichloroacetic acid.
  • the pH used for deprotection is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 4.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the solvent used in the deprotection reaction of PG2 in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, -Methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1- Methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • the reagent for introducing a protecting group (PG5) into a hydroxyl group used in step a3-2 varies depending on the type of protecting group, but includes, for example, acetic anhydride, acetyl chloride, N-succinimidyl acetate, pentafluorophenyl acetate, 1- Acetyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridine, N-methoxydiacetamide, N-acetylimidazole, chloroacetic anhydride, chloroacetyl chloride, dichloroacetic anhydride, dichloroacetyl chloride, trichloro Acetic anhydride, trichloroacetyl chloride, levulinic anhydride, 9-fluorenylmethylpentafluorophenyl carbonate, 9-fluorenylmethyl chloroformate, 9-fluorenylmethylcarbazate, 9-fluorenylmethylcarbamate
  • acids such as acetic acid, chloroacetic acid, and levulinic acid can be combined with N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide, N,N'-carbonyldiimidazole, or 4-( Combinations with condensing agents such as 4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate may also be mentioned.
  • chloroacetic anhydride chloroacetyl chloride, levulinic anhydride, 9-fluorenylmethyl chloroformate, N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyloxy]succinimide, allyl chloroformate, diallyl dicarbonate
  • Examples include N-(allyloxycarbonyloxy)succinimide, a combination of levulinic acid and 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide, and more preferably chloroacetyl chloride, chloroformic acid 9- Examples include fluorenylmethyl, allyl chloroformate, and a combination of levulinic acid and 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide.
  • the amount of reagent for introducing a protecting group (PG5) into a hydroxyl group is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably
  • the solvent used for introducing the protecting group (PG5) into the hydroxyl group in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane.
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethyl Acetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • this step is a step of deprotecting PG4 of the compound of formula (Rc-6A) to obtain a compound of formula (Rc-7A).
  • the reagents used for deprotection in this step vary depending on the type of PG4, but for example, when PG4 is a levulinoyl group, sodium borohydride, hydrazine monohydrate, hydrazine acetate, hydrazine monohydrochloride, hydrazine dihydrochloride, etc. Mention may be made of hydrochloride. Preferred examples include hydrazine monohydrate, hydrazine acetate, hydrazine monohydrochloride, and hydrazine dihydrochloride, and more preferred examples include hydrazine monohydrate and hydrazine acetate.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • Step a5 In one embodiment, this step involves reacting a compound of formula (Rc-7A) with an optically active phosphitylating agent (Rc-2), followed by deprotection of PG5, and in the presence of an activating agent.
  • Rc-2 optically active phosphitylating agent
  • a thiolating agent also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent
  • the intermediate obtained after reacting with the optically active phosphitylating agent (Rc-2) is of the formula (Rc-8- 01 ), and the intermediate obtained after deprotecting PG5 is of the formula ( Rc- 8-02 ): A compound represented by ) is obtained.
  • the optically active phosphitylating agent (Rc-2) used in this step has the same meaning as the phosphitylating agent (Rc-2) used in the above (step a1), and the base, solvent, reaction temperature and reaction The time is also synonymous with the above (step a1).
  • the reagent used to deprotect PG5 in this step varies depending on the type of PG5, but for example, when PG5 is an allyloxycarbonyl group, reagents such as tetrakis(triphenylphosphine)palladium, tris(dibenzylideneacetone)dipalladium, etc. Examples include zero-valent palladium catalysts.
  • reducing agents triphenylphosphine, tributyltin hydride, formic acid, ammonium formate, triethylsilane It is also possible to reduce it to zero-valent palladium using Furthermore, examples of scavengers for the allyl group to be eliminated include dimedone, piperidine morpholine, dimethylamine-borane complex, and the like. Suitable examples include combinations of reducing agents such as tetrakis(triphenylphosphine)palladium, tris(dibenzylideneacetone)dipalladium, and palladium acetate and triphenylphosphine.
  • More preferred examples include tetrakis(triphenylphosphine)palladium and a combination of palladium acetate and triphenylphosphine.
  • Suitable examples of the allyl group scavenger include dimedone, piperidine morpholine, and more preferably dimedone.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 minute to 48 hours, more preferably 1 minute to 24 hours.
  • the solvent used for the deprotection of PG5 in this step may be the same solvent used for the continuous reaction after the phosphitylation reaction, but is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction.
  • Examples include dichlorome
  • the activating agent that performs the cyclization reaction used in this step is the acylating agent or alkoxycarbonylating agent, and the thiolating agent (also referred to as sulfurizing agent or thiolating agent) are the reagents used in the above (step a2). is synonymous with
  • the reaction temperature with the activator for the cyclization reaction in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -78°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -60°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 2 minutes to 5 hours, more preferably from 5 minutes to 3 hours.
  • the reaction temperature with the acylating agent or alkoxycarbonylating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -20°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 minute to 5 hours, more preferably 5 minutes to 90 minutes.
  • the reaction temperature with the thiolating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 5 hours, more preferably from 5 minutes to 90 minutes.
  • the same solvent may be used for the continuous reaction after the phosphitylation reaction and the PG5 deprotection reaction, but the same solvent may be used for the continuous reaction. There is no particular limitation as long as it does not interfere.
  • Examples include dichloromethane and mixed solvents thereof, and more preferably dichloromethane, acetonitrile, and mixed solvents thereof.
  • the absolute configuration of the compound of formula (8) is (absolute configuration of phosphorus at the 2nd position, absolute configuration of phosphorus at the 10th position) with respect to the absolute configuration on the two phosphorus atoms. Listed in order. They are expressed as (Rp, Rp), (Sp, Rp), (Rp, Sp), (Sp, Sp).
  • the desired diastereomer can be converted to a compound with a concentration of 85% or more while maintaining the asymmetric environment constructed by the formula (Rc- 8-01 ). can be obtained with high selectivity.
  • the desired diastereomer can be converted to a compound with a concentration of 85% or more while maintaining the asymmetric environment constructed by the formula (Rc- 8-01 ).
  • Rc- 8-01 a compound with a concentration of 85% or more while maintaining the asymmetric environment constructed by the formula (Rc- 8-01 ).
  • Rc- 8-01 the desired diastereomer
  • this step includes deprotecting B2 and B2', which are the protecting groups of the thiophosphoric acid moiety of the compound of (Rc, Rc-8), and PG6, which is the protecting group in A2, to deprotect the compound of formula (Rp , Rp-9).
  • This step optionally includes treatment with an organic or inorganic base to convert it into its salt.
  • ammonia used in the deprotection reaction of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably 28% aqueous ammonia can be used.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 30°C to 65°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 96 hours, more preferably 1 to 48 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-propanol, Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N -Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, and pyridine
  • Examples of organic bases used when converting the compound of formula (Rp, Rp-9) into its salt include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2 -Methylpyridine, 2,6-dimethylpyridine, 4-dimethylaminopyridine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, etc. It will be done.
  • inorganic bases include potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide.
  • Preferred examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • triethylamine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate triethylamine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • Step a0-1 This step is a step in which a compound of formula (XXV') or a salt thereof is reacted with a tritylating agent to obtain a compound of formula (4A- 01 ) or a salt thereof.
  • the tritylating agent in this step can include 4,4-dimethoxytrityl chloride, 4-methoxytrityl chloride, 2-chlorotrityl chloride, or trityl chloride, and preferably 4,4-dimethoxytrityl chloride, 4-dimethoxytrityl chloride, -Methoxytrityl chloride may be mentioned.
  • the amount of the tritylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 5 equivalents, more preferably 0.5 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (XXV'). is 1 to 3 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 72 hours, more preferably 1 hour to 36 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include pyridine, 2-methylpyridine, 3-methylpyridine, 4-methylpyridine, 2,6-lutidine, acetonitrile, Dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone , N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof, and preferably pyridine, 2-methylpyridine, 3 Examples include -methylpyridine, 4-methylpyridine, 2,6-luti
  • Step a0-2 the 3'-position hydroxy group of the compound of formula (4A- 01 ) or a salt thereof is protected using levulinic acid, and further reacted with a benzylating agent, an acylating agent, or an alkoxycarbonylating agent, This step is followed by detritylation to obtain the compound of formula (4A).
  • benzylating agent, acylating agent, or alkoxycarbonylating agent in this step examples include benzyl chloride, benzyl bromide, benzoyl chloride, benzoic anhydride, tert-butylphenyl carbonate, N-(tert-butoxycarbonyloxy)phthalimide, 2- (tert-butoxycarbonylthio)-4,6-dimethylpyridine, N-tert-butoxycarbonylimidazole, tert-butylcarbazate, 2-(tert-butoxycarbonyloximino)-2-phenylacetonitrile, 1-tert- Butoxycarbonyl-1,2,4-triazole, di-tert-butyl dicarbonate, 9-fluorenylmethylpentafluorophenyl carbonate, 9-fluorenylmethyl chloroformate, 9-fluorenylmethylcarbazate, 9 -Fluorenylmethyl carbamate, 1-[
  • benzoyl chloride benzoic anhydride, N-(2,2,2-trichloroethoxycarbonyloxy)succinimide, 2,2,2-trichloroethyl chloroformate, benzyl chloroformate, benzyl carbazate, benzyl phenyl carbonate, N-carbobenzyloxysuccinimide, dibenzyl dicarbonate, 4-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy]nitrobenzene, 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-nitro-1H-1,2,4-triazole-1-carboxy N-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy]succinimide, more preferably benzoyl chloride, benzoic anhydride, 4-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy]nitrobenzene, 2-( Mention may be made of trimethylsilyl)ethyl-3-nitro-1H-1,2,4-
  • the amount of the reagent for introducing the protecting group (PG4) into the hydroxyl group is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.7 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (4A- 01 ). The amount is more preferably 1 to 3 equivalents.
  • the amount of the reagent for introducing the protecting group (PG6) into the hydroxyl group is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 1 to 15 equivalents relative to the compound represented by formula (4A- 01 ), More preferably, it is 4 to 10 equivalents.
  • the reaction temperature for protecting the hydroxyl group (PG4) in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C. It is °C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 72 hours, more preferably 1 hour to 36 hours.
  • the reaction temperature for protecting the hydroxyl group (PG6) in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 50°C to 70°C. It is.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 hour to 120 hours, more preferably 30 hours to 60 hours.
  • the solvent used for introducing the protecting group (PG4) into the hydroxyl group in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane.
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethyl Acetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • the solvent used for introducing the protecting group (PG6) into the hydroxyl group in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane.
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethyl Acetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably acetonitrile.
  • a novel intermediate in the above synthetic scheme ⁇ Method A> includes a compound represented by the following formula (4A').
  • PG4 is formyl, acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl, azidobutyryl, allyloxycarbonyl, chloroazidobenzyl, methoxybenzyl, or 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, preferably chloroacetyl, levulinoyl , or allyloxycarbonyl. More preferred is levulinoyl.
  • PG6 is benzyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, or ethoxycarbonyl and is preferably benzoyl or 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, more preferably 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • Rc-5A a compound represented by the following formula (Rc-5A) can be mentioned.
  • A2 is and PG4 and PG6 have the same meanings as the compound of formula (4A') shown above.
  • B2 is preferably , R1 is hydrogen or methyl, and R2 is hydrogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or phenyl, and said alkyl is unsubstituted or one or more phenyl, tosyl or diphenylmethyl. Preferred groups are substituted with silyl and the phenyl is unsubstituted or substituted with nitro or methoxy. More preferably, B2 is More preferably, B2 is It is.
  • PG7 is a protecting group for an amino group, preferably acetyl, trifluoroacetyl, benzoyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, methoxycarbonyl, or ethoxycarbonyl, more preferably acetyl or trifluoroacetyl.
  • PG1 is preferably tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl, more preferably tert-butyldimethylsilyl.
  • PG2 is preferably 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl, more preferably 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, or trityl, Even more preferred is 4-methoxytrityl or 4,4'-dimethoxytrityl.
  • PG3 is preferably 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, or benzyloxycarbonyl, and more Preferably it is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • PG5 is acetyl, chloroacetyl, dichloroacetyl, trichloroacetyl, levulinoyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, or allyloxycarbonyl, preferably chloroacetyl, levulinoyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, or Allyloxycarbonyl. More preferred is 9-fluorenylmethyloxycarbonyl or allyloxycarbonyl.
  • a cyclic dinucleotide of the formula (Rp, Rp-9) can be produced according to the following synthetic scheme ⁇ Method B>.
  • A1, A2, B2, PG1, PG2, PG3, PG4, PG6 and PG7 are A1, A2, B2, PG1, PG2, PG3, PG4, PG6 and PG7 defined in the compounds in the synthesis scheme ⁇ Method A>. are synonymous.
  • B2 is and PG9 is a hydroxy-protecting group, and examples include 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, or trityl. Preferred is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl or trityl. More preferred is 4-methoxytrityl or 4,4'-dimethoxytrityl.
  • this step is a step of reacting a compound of formula (4B) with an optically active phosphitylating agent (Rc-2) to obtain a compound of formula (Rc-3B).
  • the optically active phosphitylating agent (Rc-2) used in this step has the same meaning as (Rc-2) used in the synthetic scheme ⁇ Method A>.
  • the reaction proceeds stereoselectively, and a compound of formula (Rc-3B) having the desired absolute configuration can be obtained.
  • the absolute configuration of the compound of formula (Rc-3B) is indicated using (Rc) of the absolute configuration on the asymmetric carbon atom contained in the prolinol skeleton, as exemplified below.
  • the absolute steric configuration on the phosphorus atom is of the formula (Rc-2) of (Sp) as shown below.
  • Compound 3B) is produced. That is, by using an optically active phosphitylating agent having the absolute configuration (Rc), a desired diastereomer can be obtained with high selectivity.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide may be mentioned;
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferred examples include acetonitrile, dichloromethane, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, and toluene, and
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -78°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 2 minutes to 10 hours, more preferably 5 to 180 minutes.
  • this step is a step of protecting the hydroxyl group of the compound of formula (1A) with a PG4 group and then deprotecting PG2.
  • the reagent for introducing a protecting group (PG4) into a hydroxyl group used in this step varies depending on the type of protecting group, but examples include acetic anhydride, acetyl chloride, N-succinimidyl acetate, pentafluorophenyl acetate, 1-acetyl- 1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridine, N-methoxydiacetamide, N-acetylimidazole, chloroacetic anhydride, chloroacetyl chloride, dichloroacetic anhydride, dichloroacetyl chloride, trichloroacetic anhydride trichloroacetyl chloride, levulinic anhydride, allyl chloroformate, diallyl dicarbonate, N-(allyloxycarbonyloxy)succinimide, allyl phenyl carbonate, 4-methoxybenzyl chloride, 4-methoxybenzyl bromide
  • acids such as acetic acid, chloroacetic acid, and levulinic acid can be combined with N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide, N,N'-carbonyldiimidazole, or 4-( Combinations with condensing agents such as 4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate are also included.
  • chloroacetic anhydride chloroacetyl chloride, levulinic anhydride, allyl chloroformate, diallyl dicarbonate, N-(allyloxycarbonyloxy)succinimide, levulinic acid and 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3 -ethylcarbodiimide, more preferably chloroacetyl chloride, a combination of levulinic acid and 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide, and allyl chloroformate.
  • the amount of the reagent for introducing the protecting group (PG4) into the hydroxyl group is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.7 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (1A), More preferably, it is 1 to 3 equivalents.
  • the solvent used for introducing the protecting group (PG4) into the hydroxyl group in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane.
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethyl Acetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • the deprotection of PG2 in this step is performed under acidic conditions using an acid.
  • the acid used include hydrochloric acid, sulfuric acid, formic acid, oxalic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, monochloroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • Preferred examples include hydrochloric acid, acetic acid, monochloroacetic acid, and dichloroacetic acid, and more preferred examples include hydrochloric acid and dichloroacetic acid.
  • the pH used for deprotection is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 4.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the solvent used in the deprotection reaction of PG2 in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, -Methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1- Methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • this step comprises reacting the compound of formula (Rc-3B) with the compound of formula (1B) or a salt thereof in the presence of an activating agent, and then This step is followed by treatment with a thiolating agent (also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent) to obtain a compound of formula (Rc-5B).
  • a thiolating agent also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent
  • the reaction proceeds stereoselectively to obtain a compound of formula (Rc-5B) having the desired absolute configuration.
  • the reaction proceeds in a stereo-inverted manner with high selectivity while maintaining the asymmetric environment constructed by formula (Rc-3B). Thereby, the desired diastereomer can be obtained with high selectivity.
  • the activator used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds without impairing the absolute configuration of the compound represented by formula (Rc-3B), but for example, the base component of the counter anion
  • the acid component of the counter anion include 1-phenylimidazole, benzimidazole, 1-methylbenzimidazole, 1-cyanomethylpiperidine, 1-pyrrolidineacetonitrile, and 1-(cyanomethyl)imidazole.
  • Examples include tetrafluoroboric acid, hexafluorophosphoric acid, perchloric acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, and trifluoromethanesulfonic acid.
  • Suitable examples include 1-phenylimidazolium triflate, 1-methylbenzimidazolium triflate, 1-(cyanomethyl)piperidinium triflate, 1-(cyanomethyl)pyrrolidinium triflate, and 1-(cyanomethyl)imidazolium triflate. More preferred are 1-phenylimidazolium triflate and 1-methylbenzimidazolium triflate.
  • the amount of activator used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 3 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3B).
  • the amount of compound (1B) used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 3 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3B), More preferably, it is 0.8 to 1.2 equivalents.
  • the acylating agent or alkoxycarbonylating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include acetic anhydride, acetyl chloride, N-succinimidyl acetate, pentafluorophenyl acetate, 1-acetyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridine, N-methoxydiacetamide, N-acetylimidazole, trifluoroacetic anhydride, bistrifluoroacetamide, ethyltrifluoroacetate, methyl trifluoroacetamide Fluoroacetate, pentafluorophenyl trifluoroacetate, trifluoroacetylbenzotriazole, S-ethyl trifluorothioacetate, N-methylbistrifluoroacetamide, trifluoroacetyl triflate, 1-trifluoroacetylimidazole, benzoic anhydr
  • the reaction temperature with the acylating agent or alkoxycarbonylating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -20°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 2 minutes to 5 hours, more preferably 5 to 90 minutes.
  • the reaction of the activator, acylating agent or alkoxycarbonylating agent, and thiolating agent in this step can be preferably carried out in the presence of a dehydrating agent.
  • the dehydrating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include molecular sieve 3A, molecular sieve 4A, molecular sieve 5A, molecular sieve 13X, magnesium sulfate, sodium sulfate, and calcium chloride.
  • Preferable examples include Molecular Sieve 3A, Molecular Sieve 4A, Molecular Sieve 5A, Molecular Sieve 13X and sodium sulfate, and more preferably Molecular Sieve 3A and Molecular Sieve 4A.
  • the amount of dehydrating agent used in this step is not limited as long as the reaction progresses, but it is preferably 0.01 to 3 times the mass of the compound represented by formula (Rc-3B). more preferably 0.01 to 1 times the mass.
  • the thiolating agent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include xanthan hydride, bis(phenylacetyl) disulfide, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1 , 1-dioxide, 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazol-3-one and [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione Xanthan hydride, bis(phenylacetyl) disulfide, [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione is preferably used.
  • xanthan hydride [(N,N-dimethylaminomethylidene)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione
  • the amount of the thiolating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 5 equivalents, and more preferably 0.5 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (Rc-3B). Preferably, it is 1 to 2 equivalents.
  • the reaction temperature with the thiolating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 5 hours, more preferably from 5 to 90 minutes.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide may be mentioned; Preferred examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, and N-methylpiperidine, and more preferred examples include triethylamine, diisopropylethylamine, and N-methylmorpholine. can.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 20 equivalents, more preferably 0.5 to 20
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably acetonitrile.
  • this step is a step of deprotecting PG9 of the compound of formula (Rc-5B) to obtain a compound of formula (Rc-6B).
  • Deprotection in this step is performed under acidic conditions using an acid.
  • the acid used include hydrochloric acid, sulfuric acid, formic acid, oxalic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, monochloroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • Preferred examples include hydrochloric acid, acetic acid, monochloroacetic acid, and dichloroacetic acid, and more preferred examples include hydrochloric acid and dichloroacetic acid.
  • the pH used for deprotection is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 4.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the solvent used in the deprotection reaction of PG9 in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, -Methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1- Methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • this step is a step of deprotecting PG4 of the compound of formula (Rc-6B) to obtain a compound of formula (Rc-7B).
  • the reagents used for deprotection in this step vary depending on the type of PG4, but for example, when PG4 is a levulinoyl group, sodium borohydride, hydrazine monohydrate, hydrazine acetate, hydrazine monohydrochloride, hydrazine dihydrochloride, etc. Mention may be made of hydrochloride. Preferred examples include hydrazine monohydrate, hydrazine acetate, hydrazine monohydrochloride, and hydrazine dihydrochloride, and more preferred examples include hydrazine monohydrate and hydrazine acetate.
  • the reaction temperature for the deprotection reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -30°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this reaction is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1, 4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably acetonitrile and dichloromethane, and more preferably dichloromethane.
  • this step comprises reacting the compound of formula (Rc-7B) with an optically active phosphitylating agent (Sc-2), followed by a cyclization reaction in the presence of an activating agent, and then , an acylating agent or an alkoxycarbonylating agent, and further reacting with a thiolating agent (also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent) to obtain a compound of formula (Rc, Sc-8).
  • a thiolating agent also referred to as a sulfurizing agent or thiolating agent
  • the optically active phosphitylating agent (Sc-2) used in this step has the following formula (Sc-2-1) or formula (Sc-2-2): [In the formula, R1 is hydrogen or methyl, R2 is hydrogen, alkyl having 1 to 3 carbon atoms, or phenyl, wherein said alkyl is unsubstituted or substituted with one or more phenyl, tosyl or diphenylmethylsilyl, and said phenyl is unsubstituted or substituted with nitro or methoxy. ing. ] Compounds represented by the following can be mentioned.
  • optically active phosphitylating agent (Sc-2), (3aS)-1-chlorotetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3aS) -1-chloro-3,3-dimethyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3R,3aS)-1-chloro-3-methyl- 3-phenyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3R,3aS)-1-chloro-3-phenyltetrahydro-1H,3H-pyrrolo[ 1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole, (3S,3aS)-1-chloro-3-[(4-methylbenzene-1-sulfonyl)methyl]tetrahydro-1H,3H-pyrrolo [1,2-c][1,
  • the amount of the optically active phosphitylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably 0.5 to 10 equivalents, based on the compound represented by formula (Rc-7B), More preferably, it is 1 to 3 equivalents.
  • the activating agent that performs the cyclization reaction used in this step is the acylating agent or alkoxycarbonylating agent, and the thiolating agent (also referred to as sulfurizing agent or thiolating agent) are the reagents used in the above (step b2). is synonymous with
  • the reaction temperature with the activator for the cyclization reaction in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -78°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -60°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 2 minutes to 5 hours, more preferably from 5 minutes to 3 hours.
  • the reaction temperature with the acylating agent or alkoxycarbonylating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably -20°C. ⁇ 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 minute to 5 hours, more preferably 5 minutes to 90 minutes.
  • the reaction temperature with the thiolating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 5 hours, more preferably from 5 minutes to 90 minutes.
  • the same solvent may be used for the continuous reaction after the phosphitylation reaction, but as long as it does not inhibit the reaction.
  • the same solvent may be used for the continuous reaction after the phosphitylation reaction, but as long as it does not inhibit the reaction.
  • this step includes deprotecting B2, B2'', which is a protecting group of the thiophosphoric acid site of the compound of (Rc, Sc-8), and PG6, which is a protecting group in A2, of the compound of formula (Rp, This is a step to obtain the compound Rp-9).
  • This step optionally includes a step of converting it into a salt thereof by treatment with an organic or inorganic base.
  • ammonia used in the deprotection reaction of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably 28% aqueous ammonia can be used.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 30°C to 65°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 1 to 96 hours, more preferably 1 to 48 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N -Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, pyridine, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and methanol, ethanol, acetonitrile, dichloromethane, and pyridine are preferably used,
  • Examples of organic bases used when converting the compound of formula (Rp, Rp-9) into its salt include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2 -Methylpyridine, 2,6-dimethylpyridine, 4-dimethylaminopyridine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, etc. It will be done.
  • inorganic bases include potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide.
  • Suitable examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • triethylamine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate triethylamine, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydrogen carbonate.
  • Step a7 This step is a step in which the protecting groups PG1 and PG3 of the compound of formula (Rp, Rp-9) are deprotected to obtain the compound of formula (Rp, Rp-10).
  • Examples of the deprotecting agent used in this step include ammonium fluoride, tetra-n-butylammonium fluoride, pyridine hydrogen fluoride, and triethylamine trihydrofluoride. , tetra-n-butylammonium fluoride, and more preferably tetra-n-butylammonium fluoride.
  • the amount of the deprotecting agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 60 equivalents relative to the compound represented by the formula (Rp, Rp-9). , more preferably 1 to 30 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 10°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 30 minutes to 240 hours, more preferably 1 hour to 120 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N - Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, dichloromethane, and dimethyl sulfoxide
  • Step a8 This step is a step in which a compound of formula (Rp, Rp-10) and a compound of formula (11) are condensed to obtain a compound of formula (Rp, Rp-12) or a salt thereof.
  • the compound represented by formula (11) can be condensed with the compound represented by formula (Rp, Rp-10), preferably by deriving it into an active ester.
  • the amount of the compound represented by formula (11) used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably 0.
  • the amount is 3 to 3 equivalents, more preferably 0.7 to 1.3 equivalents.
  • the induction of active ester in this step is not limited as long as the reaction progresses, but examples include 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (WSCI HCl) or N,N'- Using a condensing agent such as dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), N-hydroxysuccinimide, ethyl cyano(hydroxyimino)acetate, or p - nitrophenol, or 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), 1-[bis( dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxidehexafluorophosphate (HATU), or (1-cyano-2-ethoxy
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • the amount of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably represented by the formula (Rp, Rp-10).
  • the amount is 0.5 to 5 equivalents, more preferably 0.7 to 2 equivalents, based on the compound.
  • the amount of 1-hydroxybenzotriazole or 1-hydroxy-7-azabenzotriazole used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably represented by the formula (Rp, Rp-10).
  • the amount is 0.05 to 4 equivalents, more preferably 0.1 to 2 equivalents, based on the compound.
  • the amount of 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but preferably , 0.3 to 5 equivalents, more preferably 0.7 to 2 equivalents, relative to the compound represented by formula (Rp, Rp-10).
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide can be mentioned;
  • Preferred examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, and sodium acetate.
  • Examples include triethylamine and N-methylmorpholine.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents, and more It is
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -10°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 72 hours, more preferably from 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1, 2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N , N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, and dimethylsulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferably water, tetrahydrofuran, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, and
  • Examples of the base used when converting formula (Rp, Rp-12) into its salt include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, and 2-methylpyridine.
  • 2,6-dimethylpyridine 4-dimethylaminopyridine
  • propylamine iso-propylamine, butylamine, iso-butylamine, tert-butylamine, pentylamine
  • organic bases such as aniline, potassium 2-ethylhexanoate, carbonic acid Potassium, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium 2-ethylhexanoate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium chloride, and inorganic bases such as potassium chloride.
  • Suitable examples include triethylamine, tert-butylamine, potassium 2-ethylhexanoate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, sodium 2-ethylhexanoate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride, and potassium chloride. More preferred examples include triethylamine, potassium 2-ethylhexanoate, and sodium carbonate.
  • Solvents used when converting formula (Rp, Rp-12) into its salt include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane.
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N , N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferably water, 2-propanol, acetonitrile, cyclopentyl methyl ether, and ethyl acetate, and these solvents can be used. More preferably, a mixed solvent of water, 2-propanol, acetonitrile and cyclopentyl methyl ether can be mentioned.
  • PG1 represents a hydroxy group protecting group
  • examples of the protecting group include tert-butyldimethylsilyl, trimethylsilyl, triethylsilyl, triisopropylsilyl, or tert-butyldiphenylsilyl.
  • Preferred are tert-butyldimethylsilyl and trimethylsilyl. More preferred is tert-butyldimethylsilyl.
  • PG2 represents a protecting group for a hydroxy group, and examples of the protecting group include 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl, 2-chlorotrityl, and trityl. Preferably it is 4,4'-dimethoxytrityl, 4-methoxytrityl or trityl. More preferred is 4,4'-dimethoxytrityl.
  • PG3 represents a protecting group for an amino group
  • the protecting group include 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, and 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl. , or benzyloxycarbonyl.
  • it is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl or allyloxycarbonyl. More preferred is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
  • This step is a step in which a compound of formula (XIV) is reacted with a compound of formula (XV) to obtain a compound of formula (XVI).
  • the reaction in this step is carried out in the presence of a base
  • examples of the base include 1,1,3,3-tetramethylguanidine, triethylamine, diisopropylethylamine, or 1,8-diazabicyclo[5.4.0]- 7-undecene can be used, preferably 1,1,3,3-tetramethylguanidine, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene can be used, more preferably Examples include 1,1,3,3-tetramethylguanidine.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XIV), and more preferably, It is 1 to 3 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 10°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 20°C to 50°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 30 minutes to 72 hours, more preferably 5 hours to 36 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N -dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof, preferably N,N-dimethylformamide, N , N-dimethylacet
  • Step x2 the compound of formula (XVI) is reacted with a silylating agent to form a mixture of the compound of formula (1A') and the compound of formula (XVII):
  • the compound of formula (XVI) and the silylating agent are reacted in the presence of a first base to form a mixture of the compound of formula (1A') and the compound of formula (XVII). and then converting the compound of formula (XVII) in the mixture into the compound of formula (1A') in the presence of a second base to obtain the compound of formula (1A'). .
  • the conversion of the compound of formula (XVII) to the compound of formula (1A') involves an equilibrium reaction in the mixture solution and a difference in solubility between the compound of formula (XVII) and the compound of formula (1A'). This is carried out by crystallizing the compound of formula (1A') from a solution of the mixture.
  • the first base 1,1,3,3-tetramethylguanidine, triethylamine, diisopropylethylamine, 2,6-lutidine, or 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene is used.
  • Preferred examples include 1,1,3,3-tetramethylguanidine, 2,6-lutidine, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, and more
  • 1,1,3,3-tetramethylguanidine can be mentioned.
  • the amount of the first base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents, more preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XVI). is 1 to 5 equivalents.
  • the reaction temperature of the reaction using the first base in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 10°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 40°C to 70°C. .
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 30 minutes to 72 hours, more preferably 5 hours to 36 hours.
  • the solvent for the reaction using the first base in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether.
  • silylating agent in this step examples include tert-butyldimethylchlorosilane or tert-butyldimethylsilyl triflate, and preferably tert-butyldimethylchlorosilane.
  • the amount of the silylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents, more preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XIV). is 2 to 4 equivalents.
  • 1,1,3,3-tetramethylguanidine triethylamine, diisopropylethylamine, 2,6-lutidine, or 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene is used.
  • Preferred examples include 1,1,3,3-tetramethylguanidine, 2,6-lutidine, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, and more
  • 1,1,3,3-tetramethylguanidine can be mentioned.
  • the amount of the second base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.01 to 3 equivalents, more preferably 0.01 to 3 equivalents relative to the compound represented by formula (XIV). is 0.05 to 1 equivalent.
  • the reaction temperature of the reaction using the second base in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 10°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 10°C to 40°C. .
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 2 minutes to 10 hours, more preferably 5 minutes to 90 minutes.
  • the first solvent for the reaction using the second base in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, Diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N - Dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferably tetrahydrofuran ,
  • the second solvent for the reaction using the second base in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, Diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N , N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferably ,
  • Step x3 This step is a step in which a compound represented by formula (XVIII) is reacted with 2-haloethanol in the presence of an acid or a base to obtain a compound of formula (XV).
  • Examples of the base in this step include sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, triethylamine, diisopropylethylamine, or 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, preferably , sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, and diisopropylethylamine, and more preferably sodium hydroxide.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 2 equivalents relative to glycylglycine, the starting material for compound (XVIII).
  • the compound (XVIII) can be obtained from glycylglycine by protecting the amino group and converting the carboxy group to an acetyloxy group.
  • Examples of the 2-haloethanol used in this step include 2-chloroethanol, 2-bromoethanol, and 2-iodoethanol, and preferably 2-bromoethanol and 2-iodoethanol. , more preferably 2-bromoethanol.
  • the amount of 2-haloethanol used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents based on the amount of glycylglycine that is the starting material for compound (XVIII). and more preferably 1 to 4 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -10°C to 20°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 36 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N , N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof, preferably 1,2-dimethoxyethane. , 2-methyl
  • Step y1 This step is a step in which a compound of formula (XIX) is reacted with a benzoylating agent to obtain a compound of formula (XX).
  • benzoylating agent used in this step examples include benzoyl chloride, benzoyl bromide, benzoic anhydride, and benzoyl trifluoromethanesulfonate, and preferred examples include benzoyl chloride and benzoyl bromide. More preferred is benzoyl chloride.
  • the amount of benzoylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 5 equivalents, more preferably 0.5 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (XIX). is 1 to 2 equivalents.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide, and mixtures thereof.
  • a mixture thereof can be mentioned, and more preferably a mixture of triethylamine and 4-dimethylaminopyridine can be mentioned.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.1 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XIX), and more preferably, It is 0.2 to 5 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -40°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -10°C to 35°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 0.5 hours to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N , N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof, preferably acetonitrile, N,N- Dimethylform
  • Step y2 This step is a step in which a compound represented by formula (XX) is hydrolyzed to obtain a compound represented by formula (XXI).
  • Examples of the acid used in this step include hydrochloric acid, acetic acid, chloroacetic acid, dichloroacetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and sulfuric acid, and preferably hydrochloric acid , methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and sulfuric acid, and more preferably p-toluenesulfonic acid.
  • the amount of acid used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 20 equivalents relative to the compound represented by formula (XX), and more preferably, It is 1 to 10 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 40°C to 80°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1, 2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N, N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and
  • Step y3 This step is a step in which a compound of formula (XXI) is reacted with a chlorinating agent to obtain a compound of formula (XXII).
  • the chlorinating agents used in this step include trichloroisocyanuric acid, chloroisocyanuric acid, dichloroisocyanuric acid, N-chlorosuccinimide, 1,3-dichloro-5,5-dimethylhydantoin, N-chlorosaccharin, N-N-dichloro- Examples include p-toluenesulfonamide, N-N-dichlorobenzenesulfonamide, or carbon tetrachloride, preferably trichloroisocyanuric acid, chloroisocyanuric acid, and dichloroisocyanuric acid, more preferably , trichloroisocyanuric acid.
  • the amount of the chlorinating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.1 to 6 equivalents, more preferably 0.1 to 6 equivalents relative to the compound represented by formula (XXI). is 0.3 to 3 equivalents.
  • the reaction in this step can be suitably carried out in the presence of a phosphorus reagent.
  • the phosphorus reagent used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but tris(2,4-di-tert-butylphenyl) phosphite, tri-o-tolylphosphite, triphenylphosphite, triethyl Phosphite, tributylphosphine, triphenylphosphine, tris(dimethylamino)phosphine, or tris(diethylamino)phosphine can be mentioned, and preferably tris(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphine, tris(dimethylamino)phosphine, tris(diethylamino)phosphine, Examples include -o-tolylphosphite and triphenylphosphite, and more preferably tris(2,4-
  • the amount of the phosphorus reagent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 6 equivalents, more preferably 0.5 to 6 equivalents relative to the compound represented by formula (XXI). , 1 to 3 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -80°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from -20°C to 30°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N- Dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably dichlor
  • Step y4 This step is a step in which a compound of formula (XXII) is reacted with formula (XXIII) to obtain a compound of formula (XXIV).
  • the reaction in this step can be suitably carried out in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as cesium carbonate, potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide; Examples include mixtures of cesium carbonate, potassium carbonate, and sodium carbonate, and more preferably cesium carbonate.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XXII), and more preferably, It is 1 to 5 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 10°C to 50°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N- Dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferably N
  • Step y5 This step is a step in which the benzoyl group is deprotected from the compound of formula (XXIV) to obtain the compound of formula (XXV) or a salt thereof.
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as cesium carbonate, potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide;
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.001 to 10 equivalents, more preferably 0.001 to
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1, 2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, cyclopentyl methyl ether, ethyl acetate, hexane, pentane, heptane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N, N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and
  • acids used when converting the compound of formula (XXV) into its salt include formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, maleic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, hydrochloric acid, nitric acid, and sulfuric acid. , phosphoric acid and the like. Suitable examples include acetic acid, p-toluenesulfonic acid, and hydrochloric acid. More preferred examples include p-toluenesulfonic acid and hydrochloric acid.
  • the amount of acid used for conversion into a salt is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 5 equivalents, more preferably 0.5 to 5 equivalents relative to the compound represented by formula (XXIV). is 1 to 3 equivalents.
  • Step y9 This step is a step in which a tert-butoxycarbonyl group is deprotected from a compound represented by formula (XXVIII) to obtain a compound represented by formula (XXIX).
  • This step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide can be mentioned; Suitable examples include potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydroxide, and more preferably sodium hydroxide.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 6 equivalents relative to the compound represented by formula (XXVIII), and more preferably, It is 1 to 3 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 24 hours, and from 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N - Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferred examples include methanol, ethanol, 1-propanol, and tetrahydrofuran, and more preferred examples include methanol
  • Step y10 This step is a step in which a compound of formula (XXIX) is subjected to an alkyne reduction reaction and then a reductive amination reaction in the presence of a catalyst to obtain a compound of formula (XXX).
  • a metal catalyst can be used as a catalyst for the alkyne reduction reaction in this step.
  • the metal catalyst used in this step is not particularly limited as long as it catalyzes hydrogenation, but preferred examples include a ruthenium catalyst, rhodium catalyst, palladium catalyst, platinum catalyst, or nickel catalyst, and more preferably Preferably, a palladium catalyst can be mentioned.
  • the amount of the metal catalyst used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.01 to 1 times the mass of the compound represented by formula (XXVIII), More preferably, it is 0.02 to 0.4 times the mass, and even more preferably 0.05 to 0.2 times the mass.
  • the hydrogen gas pressure is usually 100 to 1000 kPa, preferably 100 to 700 kPa, and more preferably 200 to 500 kPa.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 20°C to 80°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 72 hours, more preferably from 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in the alkyne reduction reaction in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, Diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, acetic acid, N , N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof, and preferably N,N-dimethylformamide, N,N Examples include -di
  • a metal catalyst can be used as a catalyst for the reductive amination reaction in this step.
  • the metal catalyst used in this step is not particularly limited as long as it catalyzes hydrogenation, but preferred examples include a ruthenium catalyst, rhodium catalyst, palladium catalyst, platinum catalyst, or nickel catalyst, and more preferably Preferably, a palladium catalyst can be mentioned.
  • the amount of the metal catalyst used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.01 to 1 times the mass of the compound represented by formula (XXVIII), More preferably, it is 0.02 to 0.4 times the mass, and even more preferably 0.05 to 0.2 times the mass.
  • the hydrogen gas pressure is usually 100 to 1000 kPa, preferably 100 to 700 kPa, and more preferably 200 to 500 kPa.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 20°C to 80°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 72 hours, more preferably from 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in the reductive amination reaction in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include water, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform.
  • Step y11 This step is a step in which the compound of formula (XXX) is reacted with a benzoylating agent and then debenzoylated by treatment with a base to obtain the compound of formula (XXIII).
  • benzoylating agent in this step examples include benzoyl chloride, benzoyl bromide, benzoic anhydride, and benzoyl trifluoromethanesulfonate, and preferably benzoyl chloride.
  • the amount of benzoylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents, more preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XXX). is 1 to 5 equivalents.
  • the reaction with the benzoylating agent in this step can be suitably carried out in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, and mixed bases thereof
  • triethylamine, diisopropylethylamine, 4-dimethylaminopyridine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7- Examples include undecene and mixed bases thereof, and more preferably mixed bases of triethylamine, diisopropylethylamine, and 4-dimethylaminopyridine. The amount of base used in this step
  • the reaction temperature with the benzoylating agent in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 5 minutes to 72 hours, more preferably from 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in the reaction with the benzoylating agent in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include pyridine, 2-methylpyridine, 3-methylpyridine, 4-methylpyridine, , 6-lutidine, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, Chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, and dimethylsulfoxide, and mixtures thereof
  • a solvent can be
  • the base used in the base treatment in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, - Organics such as methylpyridine, 2,6-dimethylpyridine, 4-dimethylaminopyridine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene, etc.
  • Bases and bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium bicarbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium bicarbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, and potassium tert-butoxide.
  • Preferred examples include potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, and sodium hydroxide, and more preferred example is triethylamine.
  • the amount of base used in the base treatment in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents, more preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XXX). is 1 to 5 equivalents.
  • the reaction temperature for the base treatment in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 72 hours, more preferably 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in the base treatment in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include pyridine, 2-methylpyridine, 3-methylpyridine, 4-methylpyridine, 2,6-lutidine. , acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, Using 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, and dimethyl sulfoxide, and a mixed solvent thereof Preferred examples include N,N
  • Step y12 This step is a step in which a compound of formula (XXXI) is reacted with a tert-butoxycarbonylating agent in the presence of 1-methylimidazole to obtain a compound of formula (XXXII).
  • the tert-butoxycarbonylation agent used in this step includes di-tert-butyl dicarbonate, N-tert-butoxycarbonylimidazole, N-tert-butoxycarbonyl-1,2,4-triazole, N-(tert-butoxycarbonyl Examples include oxy)phthalimide, and preferably di-tert-butyl dicarbonate.
  • the amount of tert-butoxycarbonylating agent used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 0.5 to 6 equivalents relative to the compound represented by formula (XXXI), More preferably, it is 1 to 3 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from -20°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 0°C to 40°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 24 hours, more preferably 1 hour to 10 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2- Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N -Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, and preferred examples include acetonitrile, tetrahydrofuran, ethyl acetate, benzene,
  • Step y13 This step is a step in which a compound represented by formula (XXXII) is reacted with propargyl aldehyde diethyl acetal to obtain a compound represented by formula (XXVIII).
  • This step can be preferably carried out in the presence of a transition metal catalyst, and preferably in the presence of a palladium catalyst.
  • the palladium catalyst used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include palladium (II) acetate, palladium (II) trifluoroacetate, palladium (II) chloride, palladium (II) bromide. , palladium(II) iodide, bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride and other divalent palladium salts and their complexes, palladium black, palladium carbon, tetrakistriphenylphosphinepalladium(0), bis(dibenzylidene).
  • Zero-valent palladium metals such as acetone) palladium (0) and complexes thereof can be used, and preferably, bis(triphenylphosphine) palladium (II) dichloride can be used.
  • the amount of palladium catalyst used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.0001 to 1 equivalent relative to the compound represented by formula (XXXII), and more preferably , 0.005 to 0.05 equivalent.
  • this step can be suitably carried out in the presence of a copper catalyst in addition to the above palladium catalyst.
  • Copper catalysts that can be used in this step include copper (I) chloride, copper (I) bromide, copper (I) iodide, etc., and copper (I) iodide is preferably used. Can be done.
  • the amount of the copper catalyst used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.0001 to 1 equivalent, more preferably 0.0001 to 1 equivalent relative to the compound represented by formula (XXXII). , 0.005 to 0.05 equivalent.
  • this step can be suitably performed in the presence of a base.
  • the base used in this step is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but examples include triethylamine, tributylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, N-methylpyrrolidine, N-methylpiperidine, pyridine, 2-methylpyridine.
  • Bases such as potassium carbonate, potassium hydroxide, potassium hydrogen carbonate, sodium carbonate, sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, potassium acetate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, and mixed bases thereof
  • Preferred examples include triethylamine, diisopropylethylamine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, and 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene.
  • the amount of base used in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but it is preferably 0.5 to 10 equivalents relative to the compound represented by formula (XXXII), and more preferably, It is 1 to 5 equivalents.
  • the reaction temperature in this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 0°C to the boiling point of the solvent used in the reaction, more preferably from 15°C to 50°C.
  • the reaction time of this step is not limited as long as the reaction proceeds, but is preferably 5 minutes to 72 hours, more preferably 1 hour to 24 hours.
  • the solvent used in this step is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, acetonitrile, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, 1,2-propanol, Dimethoxyethane, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, ethyl acetate, hexane, pentane, cyclohexane, ethylcyclohexane, benzene, toluene, chlorobenzene, acetone, 2-butanone, N,N-dimethylformamide, N,N -Dimethylacetamide, 1-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide, and mixed solvents thereof can be used, preferably N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, 1-methyl-2 -pyrrol
  • antibody functional fragment is also referred to as "antigen-binding fragment of an antibody” and refers to a partial fragment of an antibody that has antigen-binding activity, such as Fab, F(ab'), 2 , Fv, scFv, diabody, linear antibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • Antigen-binding fragments of antibodies also include Fab', which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F(ab') 2 under reducing conditions.
  • the molecules are not limited to these molecules as long as they have the ability to bind to the antigen.
  • these antigen-binding fragments include not only full-length antibody protein molecules treated with appropriate enzymes, but also proteins produced in appropriate host cells using genetically engineered antibody genes. It will be done.
  • a "functional fragment” is a fragment that retains asparagine (Asn297), which is modified with a well-conserved N-linked sugar chain in the Fc region of an IgG heavy chain, and the amino acids surrounding it, and which is capable of binding to an antigen. Contains functional fragments that have the ability to
  • the antibody used in the production of the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention refers to an immunoglobulin, and is a molecule containing an antigen-binding site that immunospecifically binds to an antigen.
  • the antibody of the present invention may be of any class including IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY, but IgG is preferred. Further, the subclass may be any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2, but IgG1, IgG2 or IgG4 is preferable (an antibody having a mutation in the Fc region of the IgG heavy chain that affects ADCC and ADCP activities). including).
  • IgG1 When IgG1 is used as the isotype of the antibody used to produce the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention, the effector function can be adjusted by substituting some of the amino acid residues in the constant region.
  • IgG1 mutants include IgG1 LALA mutations (IgG1-L234A, L235A). The L234A and L235A are listed in the EU index (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America). rica, Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85) This shows the substitution of leucine with alanine at position.
  • CDRs complementarity determining regions
  • CDRs also called hypervariable regions
  • CDRs are located within the variable regions of the heavy and light chains of antibodies, and are regions with particularly high variability in primary structure, and the polypeptide chains of the heavy and light chains. Each is separated into three locations on its primary structure.
  • heavy chain CDRs are expressed as CDRH1, CDRH2, and CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence
  • light chain CDRs are expressed as CDRL1 from the amino terminal side of the light chain amino acid sequence. , CDRL2, and CDRL3. These sites are structurally close to each other and determine the specificity for the antigen to which they bind.
  • the antibodies may be derived from any species, but are preferably human, rat, mouse, and rabbit. When derived from a species other than human, it is preferable to chimerize or humanize using well-known techniques.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable.
  • Monoclonal antibodies include monoclonal antibodies derived from non-human animals such as rat antibodies, mouse antibodies, rabbit antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, functional fragments thereof, or modified bodies thereof.
  • the antibody is preferably an antibody that targets tumor cells or immune cells, but is not limited thereto.
  • the antibody is more preferably an antibody that targets tumor cells.
  • the binding of antibodies to tumor cells can be confirmed using flow cytometry.
  • the uptake of antibodies into tumor cells is determined by (1) an assay in which antibodies taken into cells are visualized using a fluorescence microscope using a secondary antibody (fluorescent label) that binds to the therapeutic antibody (Cell Death and Differentiation (2008)); 15, 751-761), (2) Assay that measures the amount of fluorescence taken into cells using a secondary antibody (fluorescent label) that binds to a therapeutic antibody (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282 , December 2004) or (3) the Mab-ZAP assay (Bio Techniques 28:162-165), in which an immunotoxin that binds to a therapeutic antibody is used to release the toxin and suppress cell proliferation when taken into cells. January 2000).
  • a recombinant complex protein consisting of the catalytic region of diphtheria toxin and protein G can also be used.
  • the antibody itself has an antitumor effect.
  • the antitumor activity of an immunostimulant and an antibody-immunostimulant conjugate refers to cytotoxic activity toward tumor cells, anticellular effect, and regression of tumor volume. Antitumor activity can be confirmed using known in vitro or in vivo evaluation systems.
  • the immunostimulatory activity of an immunostimulant and an antibody-immunostimulant conjugate refers to increased sensitivity of tumor cells to immune cells or activation of immune cells via tumor cells.
  • the immunostimulatory activity can be confirmed using a known in vitro or in vivo evaluation system.
  • antibodies used in the production of the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention include anti-HER2 antibody, anti-HER3 antibody, anti-DLL3 antibody, anti-FAP antibody, anti-CDH11 antibody, anti-CDH6 antibody, and anti-A33 antibody.
  • anti-CanAg antibody anti-CD19 antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD98 antibody, anti-TROP2 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti- EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti-PSMA antibody, anti-Tenascin-C antibody, anti-SLC44A4 antibody, anti-Mesothelin antibody, anti-ENPP3 antibody, anti-CD47 antibody, anti-EGFR antibody, anti- Examples include, but are not limited to, GPR20 antibodies or anti-DR5 antibodies.
  • the antibodies of the present invention are preferably anti-HER2 antibodies (e.g. trastuzumab or pertuzumab), anti-CDH6 antibodies, anti-CD33 antibodies, anti-EphA2 antibodies, anti-CD70 antibodies, anti-TROP2 antibodies, or anti-EGFR antibodies, and more preferably , anti-HER2 antibody, anti-CDH6 antibody, anti-CD70 antibody, anti-TROP2 antibody, or anti-EGFR antibody.
  • anti-HER2 antibodies e.g. trastuzumab or pertuzumab
  • anti-CDH6 antibodies e.g. trastuzumab or pertuzumab
  • anti-CD33 antibodies e.g. trastuzumab or pertuzumab
  • anti-EphA2 antibodies anti-CD70 antibodies
  • anti-TROP2 antibodies anti-EGFR antibodies
  • the antibody used in the production of the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention is produced in vivo by immunizing an animal with a polypeptide as an antigen using a method commonly practiced in this field. It can be obtained by collecting and refining.
  • the origin of the antigen is not limited to humans, and animals can also be immunized with antigens derived from non-human animals such as mice and rats.
  • antibodies applicable to human diseases can be selected by testing the cross-reactivity between antibodies that bind to the obtained foreign antigen and human antigens.
  • hybridomas can be established by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against antigens with myeloma cells, and monoclonal antibodies can also be obtained.
  • the antigen can be obtained by causing a host cell to produce a gene encoding an antigen protein through genetic manipulation.
  • the humanized antibody used in the production of the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention can be produced by known methods (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984 ), Nature (1986) 321, p. 522-525, WO90/07861).
  • anti-HER2 antibodies US5821337, WO2004/008099, WO2020/050406, etc.
  • anti-CD33 antibodies WO2014/057687, WO2020/050406, etc.
  • anti-EphA2 antibodies WO2009/028639, WO2020/050406, etc.
  • Anti-CDH6 antibody WO2018/212136, WO2020/050406, etc.
  • anti-CD70 antibodies WO2004/073656, WO2007/038637, WO2021/177438, etc.
  • anti-TROP2 antibodies WO2015/098099, WO2021/177438, etc.
  • anti-EGF R antibody WO1998/050433, WO2002/092771, WO2021/177438, etc.
  • Glycan remodeling involves first using a hydrolase to excise the heterogeneous sugar chains attached to proteins (antibodies, etc.), leaving only the terminal GlcNAc, and then removing the homogeneous protein portion to which GlcNAc has been attached. (hereinafter referred to as "acceptor”). Next, a separately prepared optional sugar chain is prepared (hereinafter referred to as a "donor"), and the acceptor and donor are linked using a glycosyltransferase. This allows the synthesis of uniform glycoproteins with arbitrary sugar chain structures.
  • sugar chain refers to a structural unit in which two or more monosaccharides are linked via glycosidic bonds.
  • Specific monosaccharides and sugar chains may be designated as abbreviations such as "GlcNAc-" and "SG-”.
  • the oxygen atom or nitrogen atom that belongs to the glycosidic bond with another structural unit at the reducing end is not included in the abbreviation representing the sugar chain, unless there is a special definition. Displayed as not included.
  • a sugar chain is described as a symbol (for example, SG, MSG, GlcNAc, etc.), unless otherwise defined, the symbol includes up to the reducing terminal carbon, and N- or O -N or O belonging to a glycosidic bond shall not be included in the symbol.
  • the antibody-immunoactivator conjugate used in the production of the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention has the following formula (XXXIV):
  • the antibody Ab or a functional fragment thereof is either directly linked to L from the side chain of its amino acid residue (e.g., cysteine, lysine, etc.) or linked to L from the sugar chain of Ab or a remodeled sugar chain. are combined.
  • the side chain of the amino acid residue may be modified with, for example, an azido group.
  • the sugar chain of Ab is an N-linked sugar chain or an O-linked sugar chain, preferably an N-linked sugar chain.
  • N-linked sugar chains are bonded to amino acid side chains of antibodies via N-glycosidic bonds
  • O-linked sugar chains are bonded to amino acid side chains of antibodies via O-glycosidic bonds.
  • Ab is IgG, preferably IgG1, IgG2 or IgG4.
  • IgG has a well-conserved N-linked sugar chain (hereinafter referred to as "Asn297 sugar chain or N297 sugar chain”) at the 297th asparagine residue (hereinafter referred to as "Asn297 or N297”) in the Fc region of its heavy chain. It is known that it contributes to the activity and dynamics of antibody molecules (Eon-Duval, A. et al, Biotechnol. Prog. 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem. 2013, 85, 715-736).
  • each amino acid sequence in the constant region of IgG is well conserved, and in a report by Edelman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63, 78-85, (1969)), each amino acid sequence is It is specified by the EU number (EU INDEX).
  • EU INDEX EU number
  • Asn297 which is added to an N-linked sugar chain in the Fc region, corresponds to position 297 in the EU number, and even if the actual amino acid position changes due to molecular fragmentation or region deletion, the EU number
  • the amino acid is uniquely identified by the symbol.
  • m 2 represents an integer of 1 or 2.
  • the antibody having the remodeled sugar chain is referred to as a sugar chain remodeling antibody.
  • SGP ( ⁇ 2,6-SGP) is an abbreviation for Sialylglycopeptide and is a typical N-linked glycopeptide.
  • SGP can be isolated and purified from chicken egg yolk, for example, according to the method described in WO2011/027868.
  • purified products of SGP are sold by Tokyo Kasei Kogyo and Fushimi Seiyakusho.
  • the sugar chain portion of SGP is referred to as SG, and the sugar chain lacking one GlcNAc at the reducing end of SG is referred to as SG(10).
  • SG (10) can be prepared by enzymatic hydrolysis of SGP, for example, with reference to the report by Umekawa et al. (Biochim. Biophys. Acta 2010, 1800, 1203-1209).
  • SG (10) can also be purchased from Tokyo Kasei Kogyo and Fushimi Pharmaceutical.
  • MSG(9) a sugar chain structure in which sialic acid at the non-reducing end is deleted in only one of the branched chains of ⁇ -Man of SG(10) is referred to as MSG(9), and 1-3 of the branched chains Those having sialic acid only in sugar chains are referred to as MSG1, and those having sialic acid only in branched 1-6 sugar chains are referred to as MSG2.
  • the remodeled sugar chain used in the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention is N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, or N297-(Fuc) It is a mixture of MSG1 and N297-(Fuc)MSG2, preferably N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 or N297-(Fuc)MSG2, more preferably N297-(Fuc)SG or N297 -(Fuc)MSG1.
  • N297-(Fuc)SG is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • L(PEG) represents -(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -NH-
  • amino group at the right end of L(PEG) is a branch of ⁇ -Man of N297 sugar chain.
  • n 5 is an integer from 2 to 10, preferably from 2 to 5.
  • N297-(Fuc)MSG1 is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • L(PEG) represents -(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -NH-
  • amino group at the right end of L(PEG) is a branch of ⁇ -Man of N297 sugar chain.
  • n 5 is an integer from 2 to 10, preferably from 2 to 5.
  • N297-(Fuc)MSG2 is represented by the following structural formula or sequence formula.
  • L(PEG) represents -(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -NH-
  • amino group at the right end of L(PEG) is a branch of ⁇ -Man of N297 sugar chain.
  • n 5 is an integer from 2 to 10, preferably from 2 to 5.
  • the N297 sugar chain of the antibody in the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention is N297-(Fuc)SG
  • the antibody is a dimer
  • the antibody-immunoactivator conjugate has four linkers.
  • the N297 sugar chain of the antibody in the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention is N297-(Fuc)MSG1 or N297-(Fuc)MSG2 or a mixture thereof
  • the antibody since the antibody is a dimer, the antibody -
  • the N297 sugar chain is preferably N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 or N297-(Fuc)MSG2, more preferably N297-(Fuc)SG or N297-(Fuc)MSG1. , more preferably N297-(Fuc)SG.
  • N297 sugar chain of the antibody in the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention is N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 or N297-(Fuc)MSG2, a highly homogeneous ADC is obtained. be able to.
  • the sugar chain remodeling antibody can be produced by the method shown in the following formula, for example, according to the method described in WO2018/003983, WO2020/050406, WO2021/177438, WO2022/050300, PLos ONE 2018, 13, e0193534, etc. can.
  • a hydrolysis reaction of the glycosidic bond between and 4GlcNAc was carried out.
  • the reaction time is 10 minutes to 72 hours, preferably 1 hour to 6 hours.
  • Wild-type EndoS enzyme was used in an amount of 0.1 mg to 10 mg, preferably 0.1 mg to 3 mg, per 100 mg of antibody (1).
  • affinity chromatography HiTrap rProtein A FF (5 ml) (manufactured by GE Healthcare)
  • hydroxyapatite column Bio-Scale Mini CHT Type I cartridge (5 ml) (manufactured by BIO-RAD)
  • (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc antibody (2) was obtained.
  • Step D-2 process the (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc antibody (2) obtained in Step D-1 is subjected to a known enzymatic reaction to form an SG type or MSG (MSG1, MSG2) type having a PEG linker containing an azide group.
  • This is a step of manufacturing a sugar chain remodeling antibody (3) by binding a sugar chain oxazoline body (hereinafter referred to as "azido sugar chain oxazoline body").
  • Antibody (2) is reacted with an azide sugar chain oxazoline form in a buffer solution (phosphate buffer, etc.) at temperatures from 0°C to 40°C in the presence of a glycosyltransferase such as EndoS (D233Q/Q303L).
  • a strand transfer reaction was performed.
  • the reaction time is 10 minutes to 72 hours, preferably 1 hour to 6 hours.
  • the EndoS enzyme (D233Q/Q303L) was used in an amount of 1 mg to 10 mg, preferably 1 mg to 3 mg, and the azido sugar chain oxazoline compound was used in an amount of 2 to excess equivalents, preferably 4 to 20 equivalents, per 100 mg of the antibody.
  • concentration of the aqueous antibody solution, concentration measurement, and buffer exchange can be performed according to common operations A to C described below.
  • SG type azide sugar chain oxazoline body was synthesized according to the method described in WO2018/003983.
  • a method for synthesizing [N 3 -PEG(3)] 2 -SG(10)-Ox is shown in the following formula.
  • MSG type azide sugar chain oxazoline body was also synthesized according to the method described in WO2018/003983.
  • a method for synthesizing [N 3 -PEG(3)]-MSG1(9)-Ox is shown in the following formula.
  • Step D-3 process the (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc antibody (2) obtained in Step D-1 is subjected to a transglycosylation reaction using two types of Endo enzymes to produce a glycan remodeling antibody (3). It is a process.
  • two types of enzymes By using two types of enzymes at the same time, it is possible to directly transfer sugar chains to the N297 sugar chain of an antibody using SGP, (SG)Asn, etc. whose reducing end is not activated as a sugar chain donor.
  • enzyme A EndoM-like enzyme
  • enzyme B EndoS-like enzyme
  • enzyme A examples include EndoM, EndoOm, EndoCC and EndoM mutants with reduced hydrolytic activity, EndoOm mutants, EndoCC mutants, and the like. Preferred enzymes A are EndoM N175Q, EndoCC N180H, and EndoOm N194Q.
  • enzyme B examples include EndoS, EndoS2 (EndoS49), EndoS mutants with reduced hydrolytic activity, and EndoS2 (EndoS49) mutants.
  • Preferred enzymes B include EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350N, and EndoS D233Q/D. 405A, EndoS2 D184M, EndoS2 T138Q, etc.
  • sugar chain donors [N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-Asn-PEG(3)-N 3 , [N 3 -PEG(3)]-MSG1-Asn-PEG(3)- N 3, [N 3 -PEG(3)]-MSG2-Asn-PEG(3)-N 3 , etc. can be used.
  • Antibody (2) was incubated in a buffer solution (Tris buffer, etc.) in the presence of glycosyltransferases enzyme A (EndoM-like enzyme) and enzyme B (EndoS-like enzyme) ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG )-Asn-PEG(3)-N 3 to carry out the transglycosylation reaction.
  • the reaction temperature can be appropriately selected depending on the optimum temperature of the enzyme used, but is usually 15 to 50 degrees, preferably 25 to 40 degrees.
  • the reaction time can be appropriately selected from 2 hours to 48 hours.
  • a purification method affinity chromatography, hydroxyapatite column, etc.
  • ultrafiltration method ultrafiltration membrane
  • concentration of the aqueous antibody solution, concentration measurement, and buffer exchange can be performed according to common operations A to C described below.
  • step 1-2A described in WO2018/003983 Fmoc-(SG-)Asn free form prepared from Fmoc-(SG-)Asn (1S2S-11NC-Asn-Fmoc, manufactured by Glyco Engineering Institute) and 11- By reacting with azide-3,6,9-trioxaundecane-1-amine, ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-Asn-PEG(3)-N 3 (as described in WO2018/003983 Compound 1-13) was obtained.
  • MSG-type sugar chain donors [N 3 -PEG(3)]-MSG1-Asn-PEG(3)-N 3 and [N 3 -PEG(3)]-MSG2-Asn-PEG(3)-N 3 are also available. It can be synthesized according to the method described in Steps 1 to 3 of Example 154 of WO2019065964.
  • the antibody-immunoactivator conjugate of formula (Rp, Rp-13) can be produced according to the following method.
  • the antibody-immunoactivator conjugate (Rp, Rp-13) can be produced by binding the sugar chain remodeling antibody (3) and the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-12) through a cycloaddition reaction.
  • a cycloaddition reaction include the Diels-Alder reaction and the 1,3-dipolar cycloaddition reaction, and the production is preferably performed using the 1,3-dipolar cycloaddition reaction.
  • Examples of the 1,3-dipolar cycloaddition reaction include a cycloaddition reaction between an azide and a terminal alkyne, and SPAAC (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition: J. Am .Chem.Soc.2004, 126, 15046-15047) reaction, and is preferably produced using a SPAAC reaction.
  • the sugar chain remodeling antibody (3) obtained in the above step D-2 or step D-3 and the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-12) are combined by a SPAAC reaction, and the antibody- This is a method for producing an immunostimulant conjugate (Rp, Rp-13).
  • Step E-1) (Step a9) A buffer solution (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, etc.) of the glycan remodeling antibody (3) and the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-12) were mixed in an appropriate solvent (dimethyl sulfoxide, N , N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, propylene glycol, or a mixed solvent thereof) to carry out the SPAAC reaction.
  • an appropriate solvent dimethyl sulfoxide, N , N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, propylene glycol, or a mixed solvent thereof
  • the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-12) is used in an amount of 2 to 30 moles in excess, preferably 4 to 30 moles, per 1 mole of the sugar chain remodeling antibody (3), and the ratio of the organic solvent is as follows: Preferably, it is 1% to 200% (v/v) relative to the antibody buffer solution.
  • the reaction temperature is 0°C to 37°C, preferably 15°C to 25°C, and the reaction time is 1 hour to 150 hours, preferably 6 hours to 72 hours.
  • the pH of the reaction solution is preferably 5 to 9.
  • the reaction solution was purified according to the method described in Common Procedure D below to obtain an antibody-immunoactivator conjugate (Rp, Rp-13).
  • the antibody-immunoactivator conjugate is prepared by performing buffer exchange, purification, measurement of antibody concentration, and measurement of the average number of immunostimulant bound per antibody molecule by common operations D to G described below. Identification of drug conjugates can be performed.
  • Common procedure C Buffer exchange of antibodies A buffer solution (phosphate buffered saline (pH 6.0), phosphate buffer (pH 6.0), etc.) was added to the antibody aqueous solution, and concentrated according to the method described in common procedure A. . After performing this operation several times, the antibody concentration was measured according to the method described in Common Procedure B. Add an appropriate buffer (phosphate buffered saline (pH 6.0), phosphate buffer (pH 6.0), etc.) to this antibody buffer solution to obtain the antibody at the desired concentration (for example, about 10 mg/mL). A buffer solution was prepared.
  • an antibody-immunoactivator conjugate from which unbound immunostimulant linker, dimethyl sulfoxide, and propylene glycol were removed was obtained. If necessary, the concentration of the antibody-immunoactivator conjugate solution was adjusted by common operations A and C.
  • Common operation E Measurement of antibody concentration in antibody-immunoactivator conjugate and average number of immunostimulants bound per antibody molecule (UV method)
  • concentration of the bound immunostimulant in the antibody-immunoactivator conjugate was determined using an absorption photometer (UV/VIS Spectrometer Lambda 25, PerkinElmer, Inc.) according to the method described in WO2020/050406 and WO2021/177438. It can be calculated by measuring the absorbance of the antibody-immunoactivator conjugate aqueous solution at two wavelengths of 280 nm and 250 nm.
  • Common operation F Measurement of antibody concentration and average number of immunostimulant bound per antibody molecule in antibody-immunoactivator conjugate (reversed phase high performance liquid chromatography method: RP-HPLC)
  • the antibody concentration in the antibody-immunoactivator conjugate and the average number of immunostimulants bound per antibody molecule are determined using high-speed liquids according to the methods described in WO2020/050406 and WO2021/177438, in addition to the aforementioned common procedure E. It can be determined by chromatographic analysis.
  • Common operation G Measurement of antibody concentration in antibody-immunoactivator conjugate and average number of immunostimulant bound per antibody molecule (hydrophobic interaction-high performance liquid chromatography method: HI-HPLC)
  • the antibody concentration in the antibody-immunoactivator conjugate and the average number of immunostimulants bound per antibody molecule are determined according to the methods described in WO2020/050406 and WO2021/177438, in addition to the aforementioned common operations E and F. It can be determined by high performance liquid chromatography analysis.
  • the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention or its production intermediate includes stereoisomers, optical isomers derived from asymmetric carbon atoms, geometric isomers, tautomers, and d-isomers. , l-isomer, atropisomer, and other optical isomers may exist, and all of these isomers, optical isomers, and mixtures thereof are included in the present invention.
  • the number of immunostimulants bound to one antibody molecule is an important factor that influences its effectiveness and safety.
  • the production of antibody-immunoactivator conjugates is carried out by specifying reaction conditions such as the amount of raw materials and reagents to be used so that the number of immunostimulants bound is constant. Unlike chemical reactions of compounds, it is usually obtained as a mixture in which different numbers of immunostimulants are combined.
  • the number of immunostimulants bound to one antibody molecule can be specified as an average value, that is, the average number of immunostimulants bound (DAR: Drug to Antibody Ratio).
  • the number of cyclic dinucleotide derivatives bound to an antibody molecule can be controlled, and the average number of cyclic dinucleotide derivatives bound to an immunostimulant per antibody can range from 1 to 10, but preferably The number is 1 to 8, more preferably 1 to 5.
  • the antibody in the antibody-immunoactivator conjugate is The number m 2 of immunostimulant bound per molecule is an integer of 1 or 2.
  • m2 is 2 and DAR is in the range of 3 to 5 (preferably in the range of 3.2 to 4.8). (more preferably in the range of 3.5 to 4.2).
  • N297 sugar chain is N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, or a mixture of N297-(Fuc)MSG1 and N297-(Fuc)MSG2, m2 is 1 and DAR is in the range of 1 to 3. (preferably in the range of 1.0 to 2.5, more preferably in the range of 1.2 to 2.2).
  • the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention or its production intermediate may absorb moisture by leaving it in the air or recrystallizing it, and may have adsorbed water attached to it.
  • the present invention also includes compounds and salts that may become hydrates, and such water-containing compounds and salts.
  • Such salts include, for example, hydrohalides such as hydrochlorides and hydroiodides; inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates, and phosphates; methanesulfonates, trifluoromethanesulfone; lower alkanesulfonates such as acid salts and ethanesulfonates; arylsulfonates such as benzenesulfonates and p-toluenesulfonates; formates, acetates, malates, fumarates, and succinic acids Salts, organic acid salts such as citrate, tartrate, oxalate, maleate; and amino acid salts such as ornitinate, glutamate, aspartate.
  • hydrohalides such as hydrochlorides and hydroiodides
  • inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates, and phosphates
  • the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention or its production intermediate contains a phosphoric acid group and/or a thiophosphoric acid group in its structure, it generally cannot form a base addition salt. It is possible. Furthermore, when the production intermediate has an acidic group such as a carboxy group, it is generally possible to form a base addition salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, and lithium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; inorganic salts such as ammonium salts; dibenzylamine salts.
  • morpholine salt phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, tert-butylamine salt, cyclohexylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, diethanolamine
  • organic amine salts such as salts, N-benzyl-N-(2-phenylethoxy)amine salts, piperazine salts, tetramethylammonium salts, and tris(hydroxymethyl)aminomethane salts.
  • the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention and its production intermediate may exist as a hydrate by absorbing moisture in the air.
  • the solvate of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but specifically preferred are hydrates, ethanolates, 2-propanolates, and the like.
  • a nitrogen atom when present in the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention and its production intermediate, it may be in the form of an N-oxide, and these solvates and N-oxide forms are also present. within the scope of the invention.
  • a sulfur atom when present in the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention and its production intermediate, it may be in the form of a sulfoxide, and these solvates and sulfoxide are also within the scope of the present invention. included.
  • the antibody-immunoactivator conjugate and its production intermediate produced by the method of the present invention also include compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
  • One or more of the atoms constituting the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention and its production intermediate may also contain unnatural proportions of atomic isotopes.
  • atomic isotopes include deuterium (2H), tritium (3H), iodine-125 (125I), and carbon-14 (14C).
  • Compounds of the invention may also be radiolabeled with radioisotopes such as, for example, tritium (3H), iodine-125 (125I) or carbon-14 (14C).
  • Radiolabeled compounds are useful as therapeutic or prophylactic agents, research reagents, such as assay reagents, and diagnostic agents, such as in vivo imaging agents. All isotopic variants of the antibody-immunostimulant conjugates of the invention, whether radioactive or not, are encompassed within the scope of the invention.
  • the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention exhibits antitumor immune activity or cytotoxic activity against cancer cells, it can be used as a medicine, particularly as a therapeutic agent and/or preventive agent for cancer. It can be used as an antitumor agent or an antitumor agent.
  • the types of cancer to which the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention is applicable include lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, etc.), renal cancer, urothelial cancer, Colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer (superficial epithelial tumor, stromal tumor, germ cell tumor, etc.), pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer , gastric cancer, esophageal cancer, endometrial cancer, testicular cancer (seminoma, non-seminoma), cervical cancer, placental choriocarcinoma, brain tumor, head and neck cancer, thyroid cancer, mesothelioma, gastrointestinal cancer Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST), gallbladder cancer, bile duct cancer, adrenal cancer, pharyngeal cancer, tongue cancer, hearing cancer, thymus cancer, small intestine cancer,
  • the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention can be suitably administered to mammals, more preferably humans.
  • the substances used in the pharmaceutical composition containing the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention may be appropriately selected from pharmaceutical additives and others commonly used in this field, depending on the dosage and concentration. Can be selected and applied.
  • the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the invention can be administered as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically compatible ingredients.
  • the pharmaceutical compositions typically include one or more pharmaceutical carriers, such as sterile liquids (e.g., water and oils of petroleum, animal, vegetable, or synthetic origin (e.g., peanut oil, Contains soybean oil, mineral oil, sesame oil, etc.))). Water is a more typical carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solutions, and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, particularly for injectable solutions. Suitable pharmaceutical excipients are known in the art.
  • the composition if desired, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents, or pH buffering agents. Examples of suitable pharmaceutical carriers include E. W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences". The formulation will depend on the mode of administration.
  • a variety of delivery systems are known and can be used to administer the antibody-immunostimulant conjugates of the invention.
  • Methods of introduction include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous routes. Administration can be, for example, by infusion or bolus injection. In certain preferred embodiments, administration of the antibody-immunostimulant conjugate is by injection. Parenteral administration is the preferred route of administration.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody-immunostimulant conjugate is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans.
  • compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer.
  • the medicament may also include a solubilizing agent and a local anesthetic such as lignocaine to ease pain at the site of the injection.
  • the above ingredients may be mixed separately or together in unit dosage form, e.g., as a lyophilized powder or anhydrous concentrate in a hermetically sealed container, such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent.
  • the pharmaceutical composition may be dosed, for example, in an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. If the medicament is administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided, for example, so that the ingredients can be mixed prior to administration.
  • the above pharmaceutical composition may also be provided as a solution.
  • the pharmaceutical composition containing the antibody-immunoactivator conjugate produced by the method of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the antibody-immunostimulator conjugate produced by the method of the present invention. , the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention, and other cancer therapeutic agents.
  • the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention can also be administered together with other cancer therapeutic agents, thereby enhancing the antitumor effect.
  • Other cancer therapeutic agents used for this purpose may be administered to an individual at the same time as the antibody-immunoactivator conjugate, separately, or sequentially, or may be administered at different intervals. You may.
  • Such cancer therapeutic agents include chemotherapeutic agents such as antimetabolites, alkylating agents, and microtubule inhibitors (abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, docetaxel, pemetrexed , vinblastine or international drugs listed in the pamphlet of Publication No.
  • chemotherapeutic agents such as antimetabolites, alkylating agents, and microtubule inhibitors (abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, docetaxel, pemetrexed , vinblastine or international drugs listed in the pamphlet of Publication No.
  • hormone regulators LH-RH analogs such as leuprorelin, goserelin, estramustine, and estrogen antagonists such as tamoxifen and raloxifene
  • aromatase inhibitors anastrozole, letrozole, exemestane, etc.
  • kinase inhibitors PARP inhibitors, bone destruction inhibitors, bone formation promoters, metastasis inhibitors
  • molecular target drugs anti-EGFR antibodies, anti-VEGF antibodies, anti-VEGFR antibodies, etc.
  • immune checkpoint inhibitors anti-PD-1 antibodies such as nivolumab and pembrolizumab
  • anti-PD-L1 antibodies such as atezolizumab, avelumab, durvalumab, etc.
  • anti-PD-L2 antibodies anti-CTLA4 antibodies such as ipilimumab, anti-A2aR antibodies
  • A2a receptor antagonist anti-LAG3 antibody, anti
  • Antibody drugs BiTE (Bi-specific T-cell engagers), Antibody-Drug-Conjugate (ADC) (for example, drug conjugates (anti-HER2-ADC, anti-TROP2-ADC, anti-HER3-ADC, etc.) containing Deruxtecan, DM1, pyrrolobenzodiazepine, MMAF, etc.), ADC combined with photodynamic therapy, etc.
  • Vaccines, anti-tumor cell therapy (CAR-T, TCR-T, dendritic cells, NK cells, etc.), anti-tumor bacterial therapy, anti-tumor viral therapy, etc. can be mentioned, but as long as the drug has anti-tumor activity. It is not limited.
  • the antibody-immunostimulant conjugate of the present invention can be administered together with other antibody-immunostimulant conjugates of the present invention, thereby enhancing the antitumor effect.
  • the antibody-immunoactivator conjugate of the present invention can be used not only as an immunostimulant but also with treatments that bring about antitumor effects, such as radiation, heavy ton beams, surgery, bone marrow transplantation, etc.
  • the treatment is not limited as long as it has an antitumor effect.
  • Such a pharmaceutical composition may be formulated as a lyophilized preparation or a liquid preparation with a selected composition and required purity.
  • the preparation may contain suitable additives used in this field.
  • liquid preparations can be formulated as liquid preparations containing various formulation additives used in this field.
  • the antibody-immunostimulant conjugate contained in the pharmaceutical composition containing the antibody-immunostimulant conjugate produced by the method of the present invention is In terms of the affinity of the antibody-immunostimulant conjugate for the antigen, that is, the dissociation constant (Kd value) for the antigen, the higher the affinity (lower the Kd value), the greater the drug efficacy even at a small dose. It can be demonstrated. Therefore, when determining the dosage of the antibody-immunoactivator conjugate, the dosage can also be set based on the affinity between the antibody-immunostimulant conjugate and the antigen.
  • approximately 0.001 to 100 mg/kg may be administered once or multiple times at intervals of 1 to 180 days. Bye.
  • room temperature refers to 15°C to 35°C.
  • dichloromethane dichloromethane (super dehydrated) sold by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries was used.
  • dehydrated acetonitrile acetonitrile (super dehydrated) sold by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries was used.
  • dehydrated pyridine pyridine (dehydrated) sold by Kanto Kagaku was used.
  • silica gel chromatography use Biotage Sfar HC D (20 ⁇ m, manufactured by Biotage).
  • amino silica gel column chromatography use Biotage Sfar Amino D (50 ⁇ m, manufactured by Biotage).
  • preparative HPLC use Agilent Prepar. Performed using active HPLC System (manufactured by Agilent Technology) .
  • the preparative column used was XBridge Prep OBD (5 ⁇ m, C18, 130 ⁇ , 250 ⁇ 30 mm, manufactured by Waters).
  • Step 1 After cooling a solution of glycylglycine (60 g, 0.45 mol), triethylamine (69 g, 0.68 mol), water (600 mL), and tetrahydrofuran (600 mL) to 0°C, N-[2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyloxy] Succinimide (130 g, 0.50 mol) was added and stirred at 25° C. for 22 hours. After the reaction solution was concentrated to 900 mL under reduced pressure, ethyl acetate (600 mL) was added. After adding triethylamine (69 g, 0.68 mol) and stirring, the organic layer was discarded.
  • Step 2 After heating a solution of lead tetraacetate (302 g, 0.68 mol), acetic acid (360 mL), and tetrahydrofuran (600 mL) to 35°C, an ethyl acetate solution of N- ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ glycylglycine was prepared. A solution of tetrahydrofuran (600 mL) added to (120 mL) was added dropwise. After stirring at 35° C. for 1 hour, the precipitate was collected by filtration and washed with ethyl acetate (600 mL).
  • the filtrate was washed seven times with a 20 wt % trisodium citrate dihydrate aqueous solution (300 mL). After adding 20 wt% brine (180 mL) to the obtained organic layer, a suitable amount of 25 wt% aqueous sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 6.5. The aqueous layer was discarded, and the resulting organic layer was concentrated to about 600 mL under reduced pressure. 1,2-dimethoxyethane (1200 mL) was added and concentrated under reduced pressure to approximately 600 mL. This operation was performed again to obtain a solution of the target compound in 1,2-dimethoxyethane (about 600 mL).
  • Step 3 Add 1,2-dimethoxyethane (300 mL) to a 1,2-dimethoxyethane solution (about 600 mL) of the compound obtained in Reference Example 1, and add 2-bromoethanol (114 g, 0.91 mol) at room temperature. did. After cooling to 0°C, 10 mol/L aqueous sodium hydroxide solution (66 g, 0.50 mol) was added and stirred for 3.5 hours. Acetic acid (41 g, 0.68 mol) was added to the reaction solution. Further water (300 mL) was added, seed crystals of the target compound (60 mg) were added, and water (600 mL) was added.
  • Crystals were collected by filtration from the resulting suspension and washed with 50% water-containing 1,2-dimethoxyethane (360 mL). The crystals were dried at 40° C. overnight to obtain the target compound as white crystals (15 g, yield 80%).
  • Step 4 4,4'-Dimethoxytrityl chloride (7.0 g, 20.5 mmol) was added to a solution of inosine (5.0 g, 18.4 mmol), pyridine (30 mL), and dimethyl sulfoxide (20 mL) at room temperature under a nitrogen atmosphere. . After stirring for 2 hours, 4,4'-dimethoxytrityl chloride (1.3 g, 3.7 mmol) was added. After stirring for 4 hours, 5 wt% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (50 mL), toluene (50 mL), and 20 wt% brine (25 mL) were added to the reaction solution.
  • the aqueous layer was discarded, and a 5 wt% aqueous sodium bicarbonate solution (50 mL) and a 20 wt% saline solution (25 mL) were added to the organic layer. After discarding the aqueous layer, the organic layer was washed with 20 wt% saline (50 mL). The obtained organic layer was concentrated under reduced pressure to about 20 mL, and ethyl acetate (100 mL) was added dropwise to the obtained solution. After stirring at 50° C. for 1 hour, the mixture was cooled to room temperature and stirred overnight. Crystals were collected by filtration from the resulting suspension and washed with ethyl acetate (40 mL). The crystals were dried at 40° C. under reduced pressure to obtain the target compound as white crystals (9.0 g, yield 85%).
  • Step 5 Compound (3.0 g, 5.3 mmol) obtained in Reference Example 3, N-[(2-bromoethoxy)methyl]-N 2 - ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ obtained in Reference Example 2
  • a solution of glycinamide (5.6 g, 15.7 mmol) and 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (30 mL) was heated to 35-40°C.
  • 1,1,3,3-tetramethylguanidine 1.5 mL, 11.8 mmol
  • Reference example 5 5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-3'-O-[tert-butyl(dimethyl)silyl]-1-(2- ⁇ [(N- ⁇ [2-(trimethylsilyl) ) Ethoxy]carbonyl ⁇ glycyl)amino]methoxy ⁇ ethyl)inosine (corresponding to the compound of formula (1A))
  • Step 6 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (15 mL) was added to a 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone solution (about 24 mL) of the compound obtained in Reference Example 4, and 1,1,3, 3-tetramethylguanidine (4.0 mL, 31.5 mmol) and tert-butyldimethylchlorosilane (2.2 g, 14.5 mmol) were added. The mixture was heated to 55-60°C, stirred for 7 hours, and then cooled to room temperature. Toluene (60 mL) and water (30 mL) were added to the reaction solution and stirred.
  • Tetrahydrofuran (30 mL), 1,1,3,3-tetramethylguanidine (0.07 mL, 0.5 mmol), and crystals of the target compound (1.0 mg) were added.
  • n-heptane (30 mL) was added and stirred at 25°C overnight.
  • Crystals were collected by filtration from the resulting suspension and washed with tetrahydrofuran/n-heptane (1/1, 30 mL). The crystals were dried under reduced pressure to obtain the target compound as white crystals (3.7 g, yield 73%).
  • Step 1 Di-tert-butyl dicarbonate (294.1 g, 1.347 mol) was added to a solution of 5-iodo-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine (318.5 g, 1.225 mol) in toluene (1750 mL). ), 1-methylimidazole (50.28 g, 0.612 mol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. Heptane (7000 mL) was added dropwise to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes, then cooled to 0° C. and stirred for 1 hour.
  • the precipitated crystals were filtered, washed with a toluene/heptane (280 mL/1120 mL) mixture, and then dried under reduced pressure at 40°C to obtain the target compound (415.7 g, 1.154 mol, yield 94.2%).
  • Step 2 A solution of the compound obtained in Reference Example 6 (285.4 g, 0.792 mol) in N,N-dimethylformamide (1500 mL) was degassed under reduced pressure, and copper(I) iodide (1. 51 g, 0.0079 mol), bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride (3.89 g, 0.0055 mol), propargyl aldehyde diethyl acetal (182.8 g, 1.426 mol), triethylamine (240.5 g, 2. 377 mol) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 18.5 hours.
  • Step 3 A 4 mol/L sodium hydroxide solution (260.1 mL, 1.040 mol) was added to a solution of the compound obtained in Reference Example 7 (250.0 g, 0.694 mol) in ethanol (1500 mL), and the mixture was heated at room temperature for about 1.5 hours. Stirred. After adding water (1500 mL) to the reaction solution, the pH was adjusted to 7.5 with 2M hydrochloric acid, and the mixture was stirred at room temperature for about 45 minutes. Subsequently, water (3000 mL) was added dropwise, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • the precipitated crystals were filtered and washed with a mixed solution of ethanol/water (250 mL/750 mL) and acetonitrile (1000 mL) cooled to 0°C.
  • the obtained crystals were dried under reduced pressure at 40° C. to obtain the target compound (152.5 g, 0.586 mol, yield 84.4%).
  • Step 4 To a mixture of the compound obtained in Reference Example 8 (63.0 g, 0.242 mol) in 1-methylpyrrolidone (189 mL) was added 5% palladium on carbon (13.4 g, moisture 53.2%), and the mixture was heated under a hydrogen atmosphere ( 300 kPa) and 40° C. for about 2 hours. The inside of the reaction system was purged with nitrogen, acetic acid (630 mL), water (32 mL) and 5% palladium on carbon (13.4 g, moisture 53.2%) were added, and the mixture was stirred at 50°C under a hydrogen atmosphere (300 kPa) for about 21 hours. did.
  • the reaction system was purged with nitrogen, water (300 mL) was added, palladium on carbon was filtered off, palladium on carbon was washed with a mixture of acetic acid (150 mL) and water (150 mL), and the filtrate was concentrated under reduced pressure to 550 mL. .
  • Water (620 mL) and 48% aqueous potassium hydroxide solution (20 mL) were added dropwise at 50°C, and the mixture was cooled to 0 to 5°C and stirred for about 20 hours.
  • the precipitate was filtered, and the filtered crystals were washed with a cooled 1-methylpyrrolidone/water (36 mL/144 mL) mixture, and then with water (320 mL).
  • the obtained crystals were dried at 50° C. under reduced pressure to obtain the target compound (37.0 g, 0.212 mol, yield 87.8%).
  • Step 5 To a mixture of the compound obtained in Reference Example 9 (4.0 g, 23.0 mmol) and 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (40 mL), triethylamine (10.6 mL, 75.9 mol) and 4-dimethyl After adding aminopyridine (280 mg, 2.3 mmol) at room temperature, the mixture was cooled to 0-5° C. and benzoyl chloride (8.3 mL, 72.0 mmol) was added. After stirring for about 21 hours, methanol (20 mL) and triethylamine (12.0 mL) were added to the reaction solution, and the mixture was stirred for about 23 hours.
  • Step 1 Add 2'-deoxy-2'-fluorouridine (70.0 g, 28.4 mmol) and methanol (420 mL) to a 1 L autoclave, add 5% palladium on carbon (13.57 g, moisture 52.2%), and add hydrogen. The mixture was stirred at 50° C. for 7 hours under an atmosphere (300 kPa). After purging the reaction system with nitrogen, palladium on carbon was filtered and washed with a methanol/water (189 mL/21 mL) mixed solution.
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to 210 mL or less, N,N-dimethylacetamide (350 mL) and toluene (350 mL) were added, and the mixture was concentrated under reduced pressure to 350 mL. Thereafter, toluene (350 mL) was added and the mixture was again concentrated under reduced pressure to 350 mL. The same operation was repeated two more times to obtain the target compound.
  • Reference example 12 Synthesis of 3',5'-di-O-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluoro-3,4,5,6-tetrahydrouridine (compound (XIX))
  • Step 2 Pyridine (76.5 g, 96.7 mmol) was added to the N,N-dimethylacetamide solution (340 mL) obtained in Reference Example 11, and benzoyl chloride (85.4 g, 60.5 mmol) was added under ice cooling. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 2.5 hours. After adding water (6.8 mL) and 2-propanol (408 mL) to the reaction mixture, the temperature was raised to 50°C, and water (102 mL) was added dropwise. After stirring at the same temperature for 30 minutes, water (136 mL) was added and stirred for 30 minutes, then cooled to room temperature and stirred for 22 hours.
  • the precipitated crystals were filtered, washed with a 2-propanol/water (204mL/122mL) mixture, and dried under reduced pressure at 40°C to obtain the target compound (117.2g, 25.7mmol). , yield 93.0%) as a white solid.
  • Step 3 To a suspension of the compound obtained in Reference Example 12 (67.0 g, 14.7 mmol) in acetonitrile (402 mL) were added 4-dimethylaminopyridine (18.0 g, 14.7 mmol) and triethylamine (26.8 g, 26.7 mmol). After adding 5 mmol), the mixture was cooled on ice. Benzoyl chloride (33.1 g, 23.5 mmol) was added dropwise, the temperature was raised to room temperature, and the mixture was stirred for 1 hour. The reaction solution was ice-cooled, diluted with cyclopentyl methyl ether (670 mL), 10% brine (670 mL) was added, stirred for 5 minutes, and the layers were separated.
  • the organic layer was washed with 0.5M aqueous tosylic acid solution (670 mL) and then further washed with water (335 mL). Cyclopentyl methyl ether (670 mL) was added to the obtained organic layer, and the mixture was concentrated under reduced pressure to 670 mL to obtain the target compound.
  • Step 4 An aqueous solution (134 mL) of p-toluenesulfonic acid monohydrate (139.8 g, 73.5 mmol) was added to the cyclopentyl methyl ether solution (670 mL) obtained in Reference Example 13, and the mixture was heated at 60°C. Stirred for 6 hours. After the reaction mixture was cooled to room temperature, the layers were separated, and the aqueous layer was extracted with cyclopentyl methyl ether (335 mL). The organic layers were combined and washed twice with 8% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (503 mL) and then with water (335 mL), and then concentrated under reduced pressure to 335 mL to obtain the target compound.
  • Reference example 15 Synthesis of 3,5-di-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluoro- ⁇ -D-ribofuranosyl chloride (compound (XXII))
  • Step 5 Dichloromethane (50 mL) was added to the cyclopentyl methyl ether solution (50 mL) obtained in Reference Example 14, and trichloroisocyanuric acid (1.55 g, 6.66 mmol), tris(2,4-di-tert- Butylphenyl) phosphite (8.64 g, 13.35 mmol) was added. The mixture was stirred at the same temperature for 1 hour, and trichloroisocyanuric acid (1.55 g, 6.66 mmol) and tris(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphite (8.64 g, 13.35 mmol) were added and stirred for 1 hour. .
  • the organic layer was concentrated under reduced pressure to 30 mL or less, heptane (100 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure to 30 mL or less.
  • Heptane (100 mL) and acetonitrile (100 mL) were added to separate the layers, and the acetonitrile layer was further separated and washed with heptane (100 mL).
  • Activated carbon (0.5 g) was added to the acetonitrile layer, stirred for 30 minutes, filtered, and washed with cyclopentyl methyl ether (50 mL).
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to 50 mL, CPME (100 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure to 50 mL.
  • the mixture was heated to 50° C., heptane (50 mL) was added, and the mixture was concentrated under reduced pressure to 50 mL, and then heptane (50 mL) was added dropwise.
  • the mixture was stirred at the same temperature for 30 minutes, then concentrated under reduced pressure to 50 mL, and heptane (50 mL) was added.
  • Reference example 16 6-benzoyl-2-(3,5-di-O-benzoyl-2-deoxy-2-fluoro- ⁇ -D-ribofuranosyl)-6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5, Synthesis of 6-tetraazabenzo[cd]azulene (compound (XXIV))
  • Step 6 Cesium carbonate (3.51 g, 10.77 mmol) was added to a solution of the compound obtained in Reference Example 15 (1.0 g, 3.59 mmol) in dimethyl sulfoxide (8 mL) and stirred for 10 minutes. The compound (2.72 g, 7.18 mmol) was added in three portions, the equipment used for addition was washed with dimethyl sulfoxide (2 mL), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. Acetic acid (1.19 g, 19.75 mmol), acetonitrile (15 mL), and methanol (5 mL) were added. The mixture was heated to 40°C and water (5 mL) was added dropwise.
  • Seed crystals (0.5 mg) of the target compound were added at about 40°C, and water (7 mL) was added dropwise over 1 hour. After the dropwise addition, the mixture was warmed to room temperature and stirred overnight. Crystals were collected by filtration from the resulting suspension and washed with acetonitrile/water (7/3, 25 mL) and then ethanol (5 mL). Ethanol (20 mL) was added to the crystals, and the mixture was stirred at room temperature for about 30 minutes. Crystals were collected by filtration from the suspension and washed with ethanol (5 mL). The crystals were dried at 40° C. overnight to obtain the target compound as white crystals (1.4 g, yield 63%).
  • Reference example 17 2-(2-deoxy-2-fluoro- ⁇ -D-ribofuranosyl)-6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd]azulene/p-toluenesulfone Synthesis of acid salt (compound (XXV ⁇ TsOH))
  • Step 7 An ethanol solution of sodium ethoxide (20%, 0.012 mL, 0.03 mmol) was added to a solution of the compound obtained in Reference Example 16 (300 mg, 0.48 mmol) in ethanol (1.5 mL), and the mixture was heated at 65°C for 6 hours. Stir for hours. After cooling to room temperature, p-toluenesulfonic acid monohydrate (184 mg, 0.97 mmol) and ethanol (0.6 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Then, toluene (6.3 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight, and then cooled to 0°C.
  • the precipitated crystals were filtered and washed with an ethanol/toluene (0.3 mL/0.9 mL) mixture cooled to 0°C.
  • the obtained crystals were dried under reduced pressure at 40°C to obtain the target compound (215.9 mg, 0.45 mmol, yield 93.0%).
  • CDN cyclic dinucleotide
  • A2 is a Teoc-tetraazabenzo [cd] azulene group
  • PG1 is a TBS group
  • PG2 is a DMTr group
  • PG3 is a Teoc group
  • PG4 is a Lev group
  • PG5 is an Alloc group
  • PG7 is a TFAc group.
  • Example 1 5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-3'-O-[tert-butyl(dimethyl)silyl]-2'-O-[(1S,3aR)-tetrahydro-1H, 3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphol-1-yl]-1-(2- ⁇ [(N- ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ glycyl) Synthesis of amino]methoxy ⁇ ethyl)inosine (corresponding to the compound of formula (Rc-3A))
  • Step 1 5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-3'-O-[tert-butyl(dimethyl)silyl]-1-(2- ⁇ [(N- ⁇ [2-(trimethylsilyl) )Ethoxy]carbonyl ⁇ glycyl)amino]methoxy ⁇ ethyl)inosine (10.0 g) was added with dehydrated dichloromethane (150 mL), cooled to -5°C, and triethylamine (1.73 mL) was added.
  • Example 2 2- ⁇ 2-deoxy-2-fluoro-5-O-[(4-methoxyphenyl)(diphenyl)methyl]- ⁇ -D-ribofuranosyl ⁇ -6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3 , 5,6-tetraazabenzo[cd]azulene hydrochloride (corresponding to the compound of formula (4A- 01 )) (Step 2)
  • Step 2 To a solution of p-toluenesulfonate (34.2 g, 71.2 mmol) of the compound obtained in Reference Example 17 in pyridine (171 mL), 4-methoxytrityl chloride (26.4 g, 85.4 mmol) was added at room temperature. did.
  • Example 3 2-(trimethylsilyl)ethyl 2-[2-deoxy-2-fluoro3-O-(4-oxopentanoyl)- ⁇ -D-ribofuranosyl]-2,7,8,9-tetrahydro-6H-2,3 , 5,6-tetraazabenzo[cd]azulene-6-carboxylate (corresponding to the compound of formula (4A)) (Step 3)
  • the hydrochloride salt (4.00 g, 6.48 mmol) of the compound obtained in Example 2 was suspended in dichloromethane (80 mL), and N,N-diisopropylethylamine (1.69 mL, 9.72 mmol) was added to give a homogeneous solution.
  • the obtained organic layers were combined and washed with a 10% aqueous ammonium chloride solution (44 mL), a 10% aqueous potassium carbonate solution (44 mL), and then a 10% aqueous potassium carbonate solution (44 mL), and then the solvent was distilled off under reduced pressure. .
  • the obtained residue was dissolved in dichloromethane (80 mL), MeOH (10.5 mL) and dichloroacetic acid (2.70 mL, 32.9 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Dichloroacetic acid (2.70 mL, 32.9 mmol) was added to the reaction solution, and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours.
  • Step 4 2-(trimethylsilyl)ethyl 2-[2-deoxy-2-fluoro3-O-(4-oxopentanoyl)- ⁇ -D-ribofuranosyl]-2,7,8,9-tetrahydro-6H-2,3 , 5,6-tetraazabenzo[cd]azulene-6-carboxylate (compound obtained in Example 3) (660 mg, 1.20 mmol) in acetonitrile (4.5 mL) was added with Molecular Sieve 3A (198 mg). was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • Molecular Sieve 3A (198 mg) was added to a solution of the compound obtained in Example 1 (1.57 g, 1.44 mmol) in acetonitrile (6.6 mL) and mixed by stirring at room temperature for 1 hour. Molecular Sieve 3A (132 mg) was added, and a 0.92 mol/L acetonitrile solution (2.6 mL, 2.40 mmol) of 1-methylbenzimidazolium triflate, which had been dried overnight, was added.
  • Step 5-1 Ethanol (1.5 mL) and dichloroacetic acid (160 ⁇ L, 1.94 mmol) were added to a solution of the compound obtained in Example 4 (1.145 g, 0.65 mmol) in dichloromethane (20 mL), and the mixture was stirred at room temperature overnight. . Furthermore, dichloroacetic acid (80 ⁇ L, 0.97 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5.5 hours. Next, the mixture was quenched with triethylamine (540 ⁇ L, 3.89 mmol), cooled on ice, 5% sodium bicarbonate water (10 mL) was added, and transferred to a separating funnel to separate organic layer 1 and aqueous layer 1.
  • triethylamine 540 ⁇ L, 3.89 mmol
  • Organic layer 1 was washed with 5% sodium bicarbonate water (10 mL) and separated into organic layer 2 and aqueous layer 2. Next, dichloromethane (10 mL) was added to the aqueous layer 1 for extraction, and the mixture was separated into an organic layer 3 and an aqueous layer 3. Furthermore, the organic layer 3 was added to the aqueous layer 2 for extraction, and the layers were separated into an organic layer 4 and an aqueous layer 4.
  • Organic layer 2 and organic layer 4 were combined and concentrated under reduced pressure, and anhydrous acetonitrile (10 mL) was added to the residue and concentrated under reduced pressure to obtain a compound corresponding to formula (Rc-6A- 01 ), which is a detritylated form of crude. 1.1374g was obtained.
  • Step 5-2 Next, in a dichloromethane (18 mL) solution of the detritylated compound (849 mg, 0.58 mmol), N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (86 ⁇ L, 0.58 mmol), allyl chlorocarbonate (61 ⁇ L, 0.58 mmol) ) and stirred at room temperature for 1 hour and 20 minutes.
  • N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (86 ⁇ L, 0.58mmol) and allyl chlorocarbonate (61 ⁇ L, 0.58mmol) were added, and after stirring for 20 minutes, further N,N,N',N' -Tetramethylethylenediamine (86 ⁇ L, 0.58mmol) and allyl chlorocarbonate (61 ⁇ L, 0.58mmol) were added, and after stirring at room temperature for 10 minutes, N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (21.5 ⁇ L, 0.144 mmol) and allyl chlorocarbonate (15 ⁇ L, 0.142 mmol) were added.
  • Example 6 [(2R,3R,4R,5R)-3- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -5-[1-(2,2-dimethyl-6,9-dioxo-5,12-dioxa- 7,10-diaza-2-silatetradecan-14-yl)-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl]-4- ⁇ [(R)-( ⁇ (2R,3R, 4R,5R)-4-fluoro3-hydroxy-5-(6- ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ -6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetra azabenzo[cd]azulen-2-yl)oxolan-2-yl ⁇ methoxy) ⁇ [(2R)-1-(trifluoroacetyl)pyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ phosphorothioyl
  • Example 7 2-(trimethylsilyl)ethyl [2-( ⁇ [2-(9- ⁇ (2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16- ⁇ [tert-butyl(dimethyl) silyl]oxy ⁇ -15-fluoro-2,10-bis(sulfanylidene)-2,10-bis ⁇ [(2R)-1-(trifluoroacetyl)pyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ -14-(6- ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ -6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H, 12H-5,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphospha
  • the mixed solution was cooled to 0° C., acetonitrile (2.0 mL) and a dehydrated acetonitrile solution (172 ⁇ L) of 1-phenylimidazolium triflate prepared to 0.8 mol/L were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Thereafter, triethylamine (38.4 ⁇ L, 275 ⁇ mol) and 1-(trifluoroacetyl)imidazole (11.8 ⁇ L, 104 ⁇ mol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Furthermore, xanthan hydride (20.7 mg, 138 ⁇ mol) was added and stirred for 2 hours.
  • Example 8 Bis(N,N-diethylethanaminium)(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -15- Fluoro-2,10-dioxo-7-[6-oxo-1-(2- ⁇ [(N- ⁇ [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl ⁇ glycyl)amino]methoxy ⁇ ethyl)-1,6-dihydro -9H-purin-9-yl]-14-(6,7,8,9)-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H, 10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5,10 ⁇ 5-furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphospha
  • Step 8 The residue (170.6 mg) obtained in Example 7 was dissolved in methanol (1.7 mL), a 28% ammonia aqueous solution (838 ⁇ L) was added, the temperature was raised to 45° C., and the mixture was stirred for 20 hours. The reaction solution was filtered to remove insoluble matter and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in methanol, and 5020 mg of the 5057 mg methanol solution was concentrated under reduced pressure. A 50% methanol aqueous solution and triethylamine were added to the residue and filtered to obtain 2473 mg of a mixed solution.
  • CDN A-2 A cyclic dinucleotide (CDN A-2) was synthesized according to the following synthetic scheme A-2.
  • A2 is a Bz-adenine group
  • PG1 is a TBS group
  • PG2 is a DMTr group
  • PG3 is a Teoc group
  • PG4 is a Lev group
  • PG5 is an Alloc group
  • PG7 is a TFAc group.
  • Example 9 Synthesis of N-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluoro-3'-O-(4-oxopentanoyl)adenosine (corresponding to the compound of formula (4A)) (Step 1) A solution of N-benzoyl-5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-2'-deoxy-2'-fluoroadenosine (2.50 g, 3.70 mmol) in dichloromethane (25 mL) was heated with nitrogen.
  • levulinic acid (568 ⁇ L, 5.55 mmol), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (1.06 g, 5.55 mmol), 4-dimethylaminopyridine (4.5 mg, 0.5 mg). 04 mmol) was added.
  • levulinic acid 189 ⁇ L, 1.85 mmol
  • 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (353 mg, 1.84 mmol) were added, and the temperature was raised to 35°C. .
  • Step 2 A solution of the compound obtained in Example 9 (800 mg, 1.70 mmol), Molecular Sieves 4A (160 mg) in acetonitrile (8 mL) and the compound obtained in Example 1 (2.03 g, 1.87 mmol), Molecular Sieves 4A (160 mg) in acetonitrile (8 mL) were mixed under nitrogen after stirring at room temperature for 1 hour, and 1-phenylimidazolium triflate (749 mg, 2.55 mmol) was added.
  • Example 13 ⁇ (2R,3R,4R,5R)-4- ⁇ [(R)- ⁇ [(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-yl)-4-fluoro -3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy ⁇ [(2R)-1-(trifluoroacetyl)pyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ phosphorothioyl]oxy ⁇ -3- ⁇ [tert-butyl(dimethyl )silyl]oxy ⁇ -5-[1-(2,2-dimethyl-6,9-dioxo-5,12-dioxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-yl)-6-oxo- Synthesis of 1,6-dihydro-9H-purin-9-yl]oxolan-2-yl ⁇ methyl prop-2-en-1-yl carbonate (corresponding to the compound of formula (Rc-7A)) (Step
  • Example 14 2-(trimethylsilyl)ethyl (2- ⁇ [(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-benzamide-9H-purine -9-yl)-16- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -15-fluoro-2,10-bis(sulfanylidene)-2,10-bis ⁇ [(2R)-1-(trifluoro acetyl)pyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ octahydro-2H,10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2 ,10]pentaoxadiphosphacyclooctadecyn-7-yl]-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-1-yl ⁇ ethoxy
  • Tetrakistriphenylphosphine palladium (3.0 mg, 2.6 ⁇ mol) and dimedone (7.3 mg, 52 ⁇ mol) were added to the filtrate and stirred for 2 hours.
  • Tetrakistriphenylphosphine palladium (3.0 mg, 2.6 ⁇ mol) was added and stirred for 2 hours.
  • a dehydrated acetonitrile solution (97.5 ⁇ L) of 1-phenylimidazolium triflate adjusted to 0.4 mol/L was added at ⁇ 50° C., heated to room temperature, and stirred for 2 hours.
  • Example 15 2-(trimethylsilyl)ethyl (2- ⁇ [(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-amino-9H-purine -9-yl)-16- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -15-fluoro2,10-dioxo-2,10-bis(sulfanyl)octahydro-2H,10H,12H-5,8- Methanol-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclooctadecyn-7-yl]-6-oxo-6, Synthesis of 9-dihydro-1H-purin-1-yl ⁇ ethoxy)methyl]amino ⁇ -2-oxoethyl)carbamate (corresponding to the compound of formula (Rp,
  • Step 7 The compound obtained in Example 14 (2.0 mg, 1.3 ⁇ mol) was dissolved in methanol (0.1 mL), 25% aqueous ammonia (20 ⁇ L) was added, and the mixture was heated to 50° C. and stirred. After 2 hours, HPLC (210 nm) was measured, and it was confirmed that the target compound was produced with a peak area ratio of 71.7%.
  • CDN B-1 A cyclic dinucleotide (CDN B-1) was synthesized according to the following synthetic scheme B-1.
  • A2 is a Bz-adenine group
  • PG1 is a TBS group
  • PG2 is a DMTr group
  • PG3 is a Teoc group
  • PG4 is a Lev group
  • PG5 is an Alloc group
  • PG7 is a TFAc group.
  • Reference example 18 N-benzoyl-5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-2'-deoxy-2'-fluoro3'-O-[(1S,3aR)-tetrahydro-1H,3H- Synthesis of pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphol-1-yl]adenosine (corresponding to the compound of formula (Rc-3B))
  • Step 1 N-benzoyl-5'-O-[bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methyl]-2'-deoxy-2'-fluoroadenosine (1.50 g, 2.22 mmol) was dissolved in dichloromethane (26 mL). , Molecular Sieves 4A (623 mg), and triethylamine (371 ⁇ L, 2.66 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The mixed solution was cooled to -16°C, and (3aR)-1-chlorotetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxazaphosphole was dissolved in dehydrated dichloromethane (3 mL).
  • Step 2 The compound obtained in Reference Example 5 (2.50 g, 2.61 mmol) was dissolved in dichloromethane (25 mL), and levulinic acid (605 mg, 5.21 mmol), dimethylaminopyridine (31.8 mg, 261 ⁇ L), 1-ethyl -3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (809 mg, 5.21 mmol) was successively added and stirred at room temperature for 4 hours. A 5% aqueous potassium dihydrogen phosphate solution (25 mL) was added to the reaction solution, and after stirring, the aqueous layer was discarded.
  • the obtained organic layer was washed with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (25 mL) and 20% brine (25 mL), and the solvent was distilled off from the obtained organic layer under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in dichloromethane (50 mL), purified water (470 ⁇ L) and dichloroacetic acid (1.50 mL, 18.1 mmol) were added at room temperature, and the mixture was stirred for 3 hours. After cooling on ice and adding methanol (1 mL), the mixture was heated to room temperature, 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (25 mL) was added, and after stirring, the aqueous layer was discarded.
  • the obtained organic layer was washed with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution (25 mL) and 20% brine (25 mL), and the solvent was distilled off from the obtained organic layer under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol/dichloromethane) to obtain the target compound (1.49 g, yield 76%).
  • Reference example 20 (2R,3R,4R,5R)-5-( ⁇ [(R)- ⁇ [(2R)-1-acetylpyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ [(2R,3R,4R,5R)-5- (6-Benzamido-9H-purin-9-yl)-2- ⁇ [bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy]methyl ⁇ -4-fluorooxolan-3-yl]oxy ⁇ phosphorothioyl]oxy ⁇ Methyl)-4- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -2-[1-(2,2-dimethyl-6,9-dioxo-5,12-dioxa-7,10-diaza-2 -silatetradecan-14-yl)-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl]oxolan-3-yl 4-oxopentanoate (corresponds to the
  • Step 3 The compound obtained in Reference Example 19 (1.10 g, 1.46 mmol), a solution of molecular sieves 4A (220 mg) in acetonitrile (5.5 mL), and the compound obtained in Reference Example 18 (1.29 g, 1.60 mmol) A solution of 1-phenylimidazolium triflate in acetonitrile (5.48 mL, 2.19 mmol) was added. After stirring at room temperature for 10 minutes, triethylamine (1.02 mL, 7.28 mmol) and an acetonitrile solution of acetic anhydride adjusted to 1M (1.53 mL, 1.53 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours.
  • Xanthan hydride (230 mg, 1.53 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. After removing the molecular sieves from the reaction solution by filtration, ethyl acetate (22 mL) and 5% aqueous sodium bicarbonate solution (11 mL) were added and stirred, and then the aqueous layer was discarded. The obtained organic layer was washed with 20% brine (11 mL), and the solvent was distilled off from the obtained organic layer under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (methanol/ethyl acetate) to obtain the target compound (1.49 g, yield 63%).
  • Step 4 The compound obtained in Reference Example 20 (400 mg, 245 ⁇ mol) was dissolved in dichloromethane (4 mL), and purified water (44 ⁇ L) and dichloroacetic acid (120 ⁇ L, 1.45 mmol) were added in this order at room temperature. After stirring for 4 hours, 5% sodium hydrogen carbonate (4 mL) was added dropwise and the aqueous layer was discarded after stirring. The obtained organic layer was washed with 20% brine (4 mL), and the solvent was distilled off from the obtained organic layer under reduced pressure. The residue was purified by reverse phase HPLC (acetonitrile/water) to obtain the target compound (103 mg, yield 32%).
  • Reference example 22 2-(trimethylsilyl)ethyl (2- ⁇ [(2- ⁇ 9-[(2R,3R,4S,5R)-5-( ⁇ [(R)- ⁇ [(2R)-1-acetylpyrrolidine-2- yl]methoxy ⁇ [(2R,3R,4R,5R)-5-(6-benzamido-9H-purin-9-yl)-4-fluoro2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxy ⁇ phospho lotioyl]oxy ⁇ methyl)-4- ⁇ [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -3-hydroxyoxolan-2-yl]-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purine-1- Synthesis of yl ⁇ ethoxy)methyl]amino ⁇ -2-oxoethyl)carbamate (corresponding to the compound of formula (Rc-7B))
  • Step 5 The compound obtained in Reference Example 21 (94.6 mg, 71.0 ⁇ mol) was dissolved in dichloromethane (2 mL), hydrazine acetate (6.54 mg, 71.0 ⁇ mol) was added at 0°C, and the mixture was added at room temperature. Stirred for 6 hours. Water (1 mL) was added and the aqueous layer was discarded after stirring. The obtained organic layer was washed with 20% brine (1 mL), and the solvent was distilled off from the obtained organic layer under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (methanol/ethyl acetate) to obtain the target compound (64.8 mg, yield 74%).
  • Reference example 23 2-(trimethylsilyl)ethyl (2- ⁇ [(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-2- ⁇ [(2R)-1- Acetylpyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ -10- ⁇ [(2S)-1-acetylpyrrolidin-2-yl]methoxy ⁇ -14-(6-benzamido-9H-purin-9-yl)-16- ⁇ [ tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy ⁇ -15-fluoro-2,10-bis(sulfanylidene)octahydro-2H,10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l ][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclooctadecyn-7-yl]-6-oxo-6,9
  • Step 6 The compound obtained in Reference Example 22 (32.4 mg, 26.3 ⁇ mol) was dissolved in dichloromethane (0.65 mL), molecular sieves (6.5 mg) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The mixed solution was cooled to -20°C, and triethylamine (4.4 ⁇ L, 31.6 ⁇ mol) and (3aS)-1-chlorotetrahydro-1H,3H-pyrrolo[1,2-c][1,3,2]oxaza were added. A solution of phosphole (4.4 mg, 26.3 ⁇ mol) in dichloromethane (0.32 mL) was added, and the temperature was raised to room temperature.
  • the reaction solution was stirred for 1 hour, and a dehydrated acetonitrile solution (178 ⁇ L) of 1-phenylimidazolium triflate adjusted to 0.4 mol/L was added, followed by stirring at room temperature for 1 hour.
  • Triethylamine 4.4 ⁇ L, 31.6 ⁇ mol
  • an acetonitrile solution of acetic anhydride adjusted to 1M 28.0 ⁇ L, 28 ⁇ mol
  • Xanthan hydride (4.1 mg, 27.6 ⁇ mol) was added to the reaction solution and stirred at room temperature for 2 hours.
  • Step 7 The compound (cyclized product) obtained in Reference Example 23 (1.3 mg, 0.87 ⁇ mol) was dissolved in methanol (50 ⁇ L), 25% aqueous ammonia (10 ⁇ L) was added, and the mixture was heated to 50° C. and stirred. After 6 hours, HPLC (210 nm) was measured, and it was confirmed that the target compound was produced with a peak area ratio of 21.3%.
  • Reference example 25 Synthesis of N-[4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanine (compound (11))
  • Step 1 1- ⁇ [4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]oxy ⁇ pyrrolidine-2,5-dione (5.0 g, 12 Triethylamine (2.3 mL, 16.1 mmol) was added to a suspension of glycylglycyl-L-phenylalanine (4.2 g, 14.9 mmol) in acetonitrile (50 mL) and water (50 mL) at room temperature to give ca. Stirred for 4 hours.
  • Example 16 N-[(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-2,10-dioxo-2,10- Bis(sulfanyl)-14-(6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5, 8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclotetradecin-7-yl]-6-oxo- Synthesis of 6,9-dihydro-1H-purin-1-yl ⁇ ethoxy)methyl]glycinamide (corresponding to the compound of formula (Rp, Rp-10)) 1 (Step 2) Bis(N,N-diethylethana
  • Acetonitrile (12 mL) and calcium chloride (0.59 g, 5.32 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 14 hours.
  • Triethylamine (1 mL) and water (2 mL) were added, and after stirring at room temperature for 2 hours, 5 mol/L hydrochloric acid water (1.2 mL) was added in 6 portions.
  • Triethylamine (60 ⁇ L) was added and insoluble matter was filtered off. The solvent of the obtained filtrate was distilled off under reduced pressure to about 10 mL.
  • Example 17 N-[(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-2,10-dioxo-2,10- Bis(sulfanyl)-14-(6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5, 8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclotetradecin-7-yl]-6-oxo- Synthesis of 6,9-dihydro-1H-purin-1-yl ⁇ ethoxy)methyl]glycinamide (corresponding to the compound of formula (Rp, Rp-10)) 2 (Step 2') Bis(N,N-diethyle
  • Acetonitrile was added to adjust the volume to 8 mL, 5 mol/L hydrochloric acid water (280 ⁇ L) was added to the solution (8 mL), and acetonitrile (9.6 mL) was added, followed by stirring for 1 hour. The solid was collected by filtration from the resulting suspension and washed with acetonitrile (4.0 mL). The solid was dried at room temperature overnight to obtain the target compound as white crystals (0.48 g, yield 91%).
  • Example 18 Bis(N,N-diethylethanaminium) N-[4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]glycylglycyl-L-phenyl Alanyl-N-[(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-2,10-dioxo-2 ,10-disulfide-14-(6,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6,-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5 ,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclo
  • Example 19 Dipotassium N-[4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-2,10-dioxo-2,10-disulfide-14-(6 ,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6,-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclotetradecin-7-yl]
  • Example 20 Disodium N-[4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2- ⁇ 9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-fluoro-16-hydroxy-2,10-dioxo-2,10-disulfide-14-(6 ,7,8,9-tetrahydro-2H-2,3,5,6,-tetraazabenzo[cd]azulen-2-yl)octahydro-2H,10H,12H-5,8-methano-2 ⁇ 5 ,10 ⁇ 5 -furo[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]pentaoxadiphosphacyclotetradecin-7-yl]-6
  • Example 17 The compound obtained in Example 17 (25.0 mg, 0.03 mmol) was added at room temperature and stirred for 2 hours.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and ethyl acetate (0.75 mL) and 5% aqueous sodium carbonate solution (0.25 mL) were added to the resulting residue.
  • the oil component was separated from the two-layer solution, acetonitrile (1 mL) was added to the oil component, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. A supernatant component was removed from the resulting suspension to obtain a solid.
  • the solid was dried under reduced pressure for 5 hours to obtain the target compound as a white solid (38.2 mg, yield 91%).
  • Anti-CD70 antibody 1 can be produced with reference to WO2004/073656.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 1) is the light chain variable region, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (FIG. 1) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 23), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 24), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 25), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 26), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 26) of the antibody. 27) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 28) are shown in FIG.
  • Reference Example 27 Production of anti-CD70 antibody 2
  • Anti-CD70 antibody 2 can be produced with reference to WO2007/038637.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (FIG. 2) is the light chain variable region, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (FIG. 2) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 29), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 30), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 31), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 32), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 32) of the antibody. 33) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 34) are shown in FIG.
  • Anti-TROP2 antibody 1 can be produced with reference to WO2015/098099.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (FIG. 3) is the light chain variable region, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (FIG. 3) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 35), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 36), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 37), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 38), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 38) of the antibody. 39) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 40) are shown in FIG.
  • Anti-EGFR Antibody 1 can be prepared with reference to the Vectibix Intravenous Injection 100mg Examination Results Report (March 5, 2010, Pharmaceutical and Food Safety Administration, Examination Management Division). can.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (FIG. 4) is the light chain variable region
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 (FIG. 4) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 41), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 42), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 43), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 44), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 44) of the antibody. 45) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 46) are shown in FIG.
  • Reference Example 30 Production of anti-EGFR antibody 2
  • Anti-EGFR antibody 2 can be produced with reference to WO2002/092771.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (FIG. 5) is the light chain variable region
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 (FIG. 5) is the heavy chain variable region.
  • Trastuzumab is a humanized IgG1 antibody sometimes referred to as HERCEPTIN (registered trademark), huMAb4D5-8, rhuMAb4D5-8.
  • the amino acid sequence was referred to US5821337.
  • Anti-HER2 antibody 1 is a constant region of trastuzumab in which leucine (L) at positions 234 and 235 of the EU index in the heavy chain amino acid sequence of trastuzumab is mutated to alanine (A) (herein also referred to as LALA mutation).
  • Modified IgG1 antibodies can be designed and produced.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of anti-HER2 antibody 1 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (FIG. 6) is the light chain variable region
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 (FIG. 6) is the heavy chain variable region.
  • CDRL1 SEQ ID NO: 53
  • amino acid sequence of CDRL2 SEQ ID NO: 54
  • amino acid sequence of CDRL3 SEQ ID NO: 55
  • amino acid sequence of CDRH1 SEQ ID NO: 56
  • amino acid sequence of CDRH2 SEQ ID NO: 56
  • amino acid sequence of CDRH3 SEQ ID NO: 58
  • Reference Example 32 Preparation of anti-HER2 antibody 2 "Pertuzumab” is a humanized IgG1 antibody sometimes called PERJETA (registered trademark).
  • Anti-HER2 antibody 2 is a constant region of pertuzumab in which leucine (L) at positions 234 and 235 of the EU index in the heavy chain amino acid sequence of pertuzumab is mutated to alanine (A) (herein also referred to as LALA mutation).
  • Modified IgG1 antibodies can be designed and produced.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) of anti-HER2 antibody 2 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 (FIG. 8) is the light chain variable region
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (FIG. 8) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 59), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 60), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 61), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 62), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 62) of the antibody.
  • 63) and the amino acid sequence of CDRH3 are shown in FIG.
  • Anti-CDH6 antibody 1 can be produced with reference to WO2018/212136.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 (FIG. 10) is the light chain variable region, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 (FIG. 10) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 65), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 66), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 67), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 68), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 68) of the antibody.
  • 69) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 70) are shown in FIG.
  • Anti-CDH6 antibody 2 is an antibody represented by NOV ID: NOV0712 of WO2016/024195, and can be produced with reference to WO2016/024195.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 (FIG. 11) is the light chain variable region, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 (FIG. 11) is the heavy chain variable region.
  • the amino acid sequence of CDRL1 (SEQ ID NO: 71), the amino acid sequence of CDRL2 (SEQ ID NO: 72), the amino acid sequence of CDRL3 (SEQ ID NO: 73), the amino acid sequence of CDRH1 (SEQ ID NO: 74), and the amino acid sequence of CDRH2 (SEQ ID NO: 74) of the antibody. 75) and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 76) are shown in FIG.

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Abstract

本発明の目的は、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートに利用可能な、環状ジヌクレオチド誘導体の高立体選択的な新規製造方法、及びその製造中間体を提供することにある。また、該製造方法を用いた、環状ジヌクレオチド－リンカー及び抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造方法を提供することにある。光学活性なホスフィチル化剤を、カップリング時と環化時に２回用いることによって、所望の立体配置を有する環状ジヌクレオチド誘導体を、より高収率で大量に製造可能な方法を提供する。

Description

抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体の新規製造方法
　本発明は、抗腫瘍効果を有する抗体薬物複合体に利用可能な、環状ジヌクレオチド誘導体の高立体選択的な新規製造方法及びその製造中間体に関する。また、該製造方法を含む、環状ジヌクレオチド－リンカー及び抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの新規製造方法に関する。さらに、環状ジヌクレオチド誘導体の製造に用いる原料化合物の新規製造方法、及びその製造中間体に関する。
　環状ジヌクレオチド（Ｃｙｃｌｉｃ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，以下、ＣＤＮともいう。）はＳＴＩＮＧ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｇｅｎｅｓ）を活性化させる（非特許文献１）。この活性化によりＣＤＮを担がんマウスに投与することでＳＴＩＮＧ介在による抗腫瘍免疫応答が増強して腫瘍増殖が著しく阻害され、マウスの生存率を改善することが示された（非特許文献２）。最近の研究により、生体内で核酸分解酵素による分解を受けずにＳＴＩＮＧアゴニスト活性を有する合成低分子化合物が開発されている（例えば、特許文献１～５）。このような活性を示すＣＤＮと抗体とをリンカーを介して結合させた抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）も研究されており、抗原が発現している腫瘍で抗腫瘍効果が示されている（特許文献６、特許文献７）。
　これまでに研究されているＣＤＮは２種類のヌクレオチドを環状に結ぶ際に２つのホスホロチオエート結合と呼ばれる硫黄修飾された５価のリン酸結合を有しており、非対称なヌクレオチド同士で環状化した場合、それぞれのホスホロチオエート部のリン原子上に不斉点が生成する。これまで報告されてきたＣＤＮの合成法ではリン上の不斉を制御することなく合成を行い、結果として生成する４種類のジアステレオマーを精製することにより、目的の絶対立体配置を有するＣＤＮを取得している（例えば、非特許文献３、特許文献１～７）。このような合成法の場合、４種類のジアステレオマーの生成により低収率となること、またジアステレオマーは物性が類似しているため、その分離精製には低負荷量でのＨＰＬＣによる厳密な分取精製が必要となることから、このような合成法で目的物を大量に合成するには大きな負荷が生じていた。立体選択的なＣＤＮの合成法としてはこれまでに大きく３種類の手法が報告されている。５価リンと不斉補助基を組み合わせた鍵化合物を用いる方法は、その鍵化合物の合成の際に強い悪臭のチオフェノール誘導体の使用及び数工程を必要とし、ＣＤＮへの環化時の収率は低～中程度の収率にとどまっている（非特許文献４～５）。光学活性なリン酸を触媒として用いる手法も基質の構造により選択性や収率にばらつきがあり、環化時の収率も低い（非特許文献６）。ＣＤＮ骨格を構築する酵素であるｃｙｃｌｉｃ　Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ―Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｃＧＡＳ）を改変して用いた手法も収率及び選択性は良好なものの、ｃＧＡＳを基本としているため適用可能な核酸塩基部の構造がグアノシン及びアデノシン誘導体といった構造の範囲に限定されると考えられる（非特許文献７）。また、ＣＤＮ骨格に含まれる特徴的な官能基であるホスホロチオエート部を立体選択的に合成する手法はこれまでに３価のリンと不斉補助基を組み合わせた立体制御型オリゴヌクレオチドに関連していくつかの研究例がある（例えば、非特許文献８～１２、特許文献８～９）。一方で、本手法をベースとした環状ジヌクレオチド合成に応用可能な化合物を用いたジヌクレオチド結合生成の例は無く、実際に高立体選択的にＣＤＮを合成した例も無い。
国際公開第２０１４／１８９８０５号 国際公開第２０１４／１８９８０６号 国際公開第２０１６／１４５１０２号 国際公開第２０１７／０９３９３３号 国際公開第２０１８／０６０３２３号 国際公開第２０２０／０５０４０６号 国際公開第２０２１／１７７４３８号 国際公開第２００５／０９２９０９号 国際公開第２０１６／０１２３０５号
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１３，５１，２２６－２３５ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１６，６，１９０４９ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６．５９．１０２５３－１０２６７ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１８．３６１．１２３４－１２３８ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．　２０２１．８６．８８５１－８８６１ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０２１．３７１．７０２－７０７ Ｎａｔｕｒｅ　２０２２．６０３．４３９－４４７ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．１９９８．３９．２４９１－２４９４ Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９８．８．２５３９－２５４４ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２．１２４．４９６２－４９６３ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３．１２５．８３０７－８３１７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８．１３０．１６０３１－１６０３７
　本発明は一面において、抗体薬物複合体、とりわけ、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性を有し、免疫細胞を賦活化する抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの中間体として有用な、環状ジヌクレオチド誘導体の新規製造方法を提供するものである。
　ホスホロチオエート結合を有する環状ジヌクレオチドの立体選択的な合成には亜リン酸という強い酸性官能基を有するヌクレオチドと酸性に著しく不安定な光学活性なアミダイト部位を有するヌクレオチドを実用的な収率及び高い立体選択性で結合させる方法が必要となる。しかし、従来の製造方法は立体非選択的な合成法のため、目的物の生成割合も低く、それに伴い精製が困難となるため総収率は著しく低かった。
　従って、本発明の課題の１つは、立体選択的合成を用いることにより目的物の生成割合を高め、それに伴い精製負荷を低減し、総収率が向上する工業的に優れたＣＤＮの新規製造方法を提供することである。また、該製造方法を用いたＣＤＮ－リンカーの新規製造方法を提供することである。
　また、本発明の課題の１つは、環状ジヌクレオチドの合成に用いる原料化合物の調製について、より工程数が短縮され、収率が向上した新規製造方法も提供することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意検討した結果、光学活性なホスフィチル化剤をカップリング時と環化時に２回用いることによって、環状ジヌクレオチド誘導体の高立体選択的な合成法を見出し、それによりジアステレオマー精製負荷を低減し、総収率が向上した新規製造方法を完成させた。また、該製造方法によって得られたＣＤＮを用いたＣＤＮ－リンカーの構築、及びそのＣＤＮ－リンカーを用いた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲーションの構築を行った。さらに、環状ジヌクレオチドの製造に用いる原料化合物の調製について、従来の製造方法よりも工程数が短縮され、収率が向上した新規製造方法を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本願発明は、以下に関するものである。
［１］
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 ［式中、
　Ａ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 であり、
　ＰＧ１は、ヒドロキシ基の保護基であり、及び
　ＰＧ３は、アミノ基の保護基である。］
で表される化合物又はその塩の製造方法であって、
（工程ａ１）式（１Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ［式中、
　ＰＧ１及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、及び
　ＰＧ２はヒドロキシ基のトリチル型保護基である。］
で表される化合物を、以下の式（Ｒｃ－２－１）及び（Ｒｃ－２－２）からなる群から選択される光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 ［式中、
　Ｒ１は、水素又はメチルであり、
　Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、
　　ここで、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されており、及び、
　　前記フェニルは、非置換であるか、ニトロ若しくはメトキシで置換されている。］
と反応させて、式（Ｒｃ－３Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 ［式中、
　ＰＧ１、ＰＧ２及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、及び
　Ｂ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 であり、Ｒ１及びＲ２は、上で定義したとおりである。］
で表される化合物を得る工程、
（工程ａ２）得られた式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物を、式（４Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 ［式中、
　Ａ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 であり、ＰＧ６はアミノ基の保護基であり、及び
　ＰＧ４は、ヒドロキシ基の保護基である。］
で表される化合物と、活性化剤の存在下で反応させ、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤と反応させて、式（Ｒｃ－５Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 ［式中、
　Ａ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりであり、
　Ｂ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 であり、Ｒ１及びＲ２は、上で定義したとおりであり、ＰＧ７はアミノ基の保護基である。］
で表される化合物を得る工程、
（工程ａ３－１）得られた式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物のＰＧ２を脱保護して、式（Ｒｃ－６Ａ－０１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりである。］
で表される化合物を得る工程、
（工程ａ３－２）得られた式（Ｒｃ－６Ａ－０１）の化合物を、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤と反応させて、式（Ｒｃ－６Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりであり、ＰＧ５はヒドロキシ基のエステル型又はカーボネート型保護基である。］
で表される化合物を得る工程、
（工程ａ４）得られた式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物のＰＧ４を脱保護して、式（Ｒｃ－７Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ５は、上に定義したとおりである。］
で表される化合物を得る工程、
（工程ａ５）得られた式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物を、工程ａ１の光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と同一の又は異なる、以下の式（Ｒｃ－２－１）及び（Ｒｃ－２－２）からなる群から選択される、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 ［式中、Ｒ１及びＲ２は、上に定義したとおりである。］
光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させ、ＰＧ５を脱保護し、次いで、活性化剤の存在下で環化し、さらにアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、続いてチオ化剤と反応させて、式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 ［式中、
　Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、
　Ｂ２’は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＰＧ７は、上で定義したとおりである。］
で表される化合物を得る工程、並びに
（工程ａ６）得られた式（Ｒｃ、Ｒｃ－８）の化合物のチオリン酸部位の保護基であるＢ２及びＢ２’、及びＡ２中の保護基であるＰＧ６を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物又はその塩を得る工程、
　を含む、方法。
[２]
　工程ａ２及び工程ａ５における活性化剤が、独立して、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピペリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピロリジニウム　トリフレート、及び１－（シアノメチル）イミダゾリウム　トリフレートからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］に記載の方法。
[３]
　工程ａ２及び工程ａ５におけるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤が、独立して、無水酢酸、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、エチルトリフルオロアセテート、メチルトリフルオロアセテート、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート、トリフルオロアセチルベンゾトリアゾール、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、ペンタフルオロフェニルベンゾエート、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニロキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニロキシ］スクシンイミド、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニロキシ）スクシンイミド、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニロキシ］スクシンイミド、Ｎ－エトキシカルボニルフタルイミド、及びメチルイミダゾール－１－カルボキシレートからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］又は［２］に記載の方法。
[４]
　工程ａ２及び工程ａ５におけるチオ化剤が、独立して、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン及び［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
[５]
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルであり、
　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、又はアリルオキシカルボニルである、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
[６]
　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、
　ＰＧ６が、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ７が、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
[７]
　ＰＧ４が、レブリノイルである、［１］～［６］のいずれか１つに記載の方法。
[８]
　ＰＧ５が、アリルオキシカルボニルである、［１］～［７］のいずれか１つに記載の方法。
[９]
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルであり、
　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、又はトリチルであり、
　ＰＧ４が、レブリノイルであり、及び
　ＰＧ５が、アリルオキシカルボニルである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の方法。
[１０]
　さらに
（工程ａ７）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物の保護基であるＰＧ１及びＰＧ３を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 ［式中、
　Ａ１は、［１］に定義したとおりである。］
で表される化合物又はその塩を得る工程、及び、
(工程ａ８）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物又はその塩を、
式（１１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 で表される化合物又はその活性エステル体と縮合して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 ［式中、Ａ１は、上に定義したとおりである。］
で表される化合物又はその塩を得る工程
を含む、［１］～［９］のいずれか１つに記載の方法。
[１１]
　さらに、
（工程ａ９）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩と、抗体又は該抗体の機能性断片（以下、Ａｂという。）と結合させて、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ［式中、
　ｍは１から１０の範囲であり、
　Ａｂの糖鎖は、任意にリモデリングされており、
　Ａｂは、修飾されていてもよいアミノ酸残基の側鎖から直接式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に結合するか、又はＡｂの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖から式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に結合しており、
　Ａ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 である。］
で表される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート、又はそれらの混合物を得る工程
を含む、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
[１２]
　工程ａ９において、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩とＡｂとを、歪み促進型アジド-アルキン付加環化反応（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）反応により結合させることを特徴とする、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
[１３]
　抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＤＲ５抗体からなる群から選択される抗体である、［１］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
[１４]
　前記式（４Ａ）（式中、ＰＧ４がレブリノイルである。）の化合物が、以下の工程：
（工程ａ０－１）式（ＸＸＶ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 の化合物又はその塩の５’位のヒドロキシ基を、トリチル化剤を用いて保護して、式（４Ａ－０１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ［式中、ＰＧ８は、ヒドロキシ基のトリチル型保護基である。］
の化合物又はその塩を得る工程、及び
（工程ａ０－２）得られた式（４Ａ－０１）の化合物又はその塩の２’位のヒドロキシ基を、レブリン酸を用いて保護し、さらに、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤と反応させ、次いで脱トリチル化を行うことによって、前記式（４Ａ）の化合物を得る工程
によって製造される、［１］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
[１５]
　式（４Ａ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ［式中、
　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ６が、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルである。］
で表される化合物。
[１６]
式（Ｒｃ－５Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 ［式中、
　Ａ２及びＢ２は、［１］に定義したとおりであり、
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルであり、及び
　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルである。］
で表される化合物。
[１７]
　式（Ｒｃ－６Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 ［式中、
　Ａ２及びＢ２は、［１］に定義したとおりであり、
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、
　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル又はアリルオキシカルボニルである。］
で表される化合物。
[１８]
　式（Ｒｃ－７Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 ［式中、
　Ａ２及びＢ２は、［１］に定義したとおりであり、
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、及び
　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル又はアリルオキシカルボニルである。］
で表される化合物。
[１９]
　式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 ［式中、
　Ａ２、Ｂ２及びＢ２’は、［１］に定義したとおりであり、
　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、及び
　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルである。］
の化合物。
　本発明により、環状ジヌクレオチドの高立体選択的な製造方法を提供できる。この製造方法によれば、ジアステレオマー精製の負担が軽減され、目的とする立体配置を有するＣＤＮをより高収率で、大量に製造することができる。また、その結果として、この立体選択的なＣＤＮの製造方法を含むＣＤＮ－リンカーの製造方法によって、ＣＤＮ－リンカーを高収率で製造することができる。さらに、本発明により、環状ジヌクレオチドの製造に用いる原料化合物の調製についても、より短い工程数で、かつ高収率で製造することができる。
抗ＣＤ７０抗体１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）及び抗ＣＤ７０抗体１の重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 抗ＣＤ７０抗体２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）及び抗ＣＤ７０抗体２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 抗ＴＲＯＰ２抗体１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）及び抗ＴＲＯＰ２抗体１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。 抗ＥＧＦＲ抗体１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）及び抗ＥＧＦＲ抗体１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 抗ＥＧＦＲ抗体２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）及び抗ＥＧＦＲ抗体２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 抗ＨＥＲ２抗体１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）及び抗ＨＥＲ２抗体１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 抗ＨＥＲ２抗体１の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１３）及び抗ＨＥＲ２抗体１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。 抗ＨＥＲ２抗体２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１５）及び抗ＨＥＲ２抗体２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。 抗ＨＥＲ２抗体２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１７）及び抗ＨＥＲ２抗体２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。 抗ＣＤＨ６抗体１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１９）及び抗ＣＤＨ６抗体１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。 抗ＣＤＨ６抗体２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２１）及び抗ＣＤＨ６抗体２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。 抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号２３）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号２４）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号２５）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号２６）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号２７）、及び抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号２８）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号２９）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号３０）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号３１）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号３２）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号３３）、及び抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号３４）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号３５）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号３６）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号３７）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号３８）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号３９）、及び抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号４０）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号４１）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号４２）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号４３）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号４４）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号４５）、及び抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号４６）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号４７）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号４８）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号４９）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号５０）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号５１）、及び抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号５２）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号５３）、抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号５４）、抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号５５）、抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号５６）、抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号５７）、及び抗ＨＥＲ２抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号５８）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号５９）、抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号６０）、抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号６１）、抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号６２）、抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号６３）、及び抗ＨＥＲ２抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号６４）を示す。ＣＤＲ配列はＩＭＧＴの定義により決定した。 抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号６５）、抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号６６）、抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号６７）、抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号６８）、抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号６９）、及び抗ＣＤＨ６抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号７０）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号７１）、抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号７２）、抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号７３）、抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号７４）、抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号７５）、及び抗ＣＤＨ６抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号７６）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（（ＸＸＸＩＶ）の分子）である、ＳＧ型糖鎖リモデリング抗体から得られた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（図２１Ａの（ＸＸＸＩＶ）の分子）及びＭＳＧ型糖鎖リモデリング抗体から得られた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（図２１Ｂの（ＸＸＸＩＶ）の分子）を模式的に表したものである。（ａ）は免疫賦活化剤Ｄ、（ｂ）はリンカーＬ、（ｃ）はＰＥＧリンカー（Ｌ（ＰＥＧ））、（ｄ）はＮ２９７糖鎖（ここで、白色の円はＮｅｕＡｃ（Ｓｉａ）、白色の六角形はＭａｎ、黒色の六角形はＧｌｃＮＡｃ、白色のひし形はＧａｌ、及び白色の逆三角形はＦｕｃ）をそれぞれ表す。白色の五角形は、リンカーＬ由来のアルキンとＰＥＧリンカー由来のアジド基が反応して生成したトリアゾール環を表す。Ｙ字型は、抗体Ａｂを表す。ＰＥＧリンカーは、非還元末端に位置するシアル酸の２位のカルボキシル基とアミド結合を介して連結している。このような表示方法は、特に言及がない限り、本明細書の全体を通じて適用される。
　本発明は、一態様として、ＳＴＩＮＧアゴニスト活性を有し、免疫細胞を賦活化する抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの中間体であるＣＤＮ誘導体の新規な製造方法を提供する。そのような抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、国際公開第２０２０／０５０４０６号公報（特許文献６）に開示されている。
　本発明の一実施形態は、以下の式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の構造を有するＣＤＮ誘導体を、立体選択的に合成する方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 　一実施形態である、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）のＣＤＮ誘導体の新規な製造方法を中心とした、本発明の代表的なスキームの概要を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これによって本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、本明細書において、化合物を示すために、各反応式中に示される化合物の番号を用いる。すなわち、「式（１Ａ）の化合物」、「化合物（１Ａ）」等と称する。また、これ以外の番号の化合物についても同様に記載する。
＜１．環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）及びＣＤＮ－リンカーの製造＞
＜１－１．環状ジヌクレオチド（化合物（Ｒｐ，Ｒｐ－９））の製造方法及びその中間体＞
　従来の製造方法では、以下に示す４種類の環状ジヌクレオチドが、立体非選択的に合成されていた（特許文献６等参照）。これらの４種類の環状ジヌクレオチドの立体配置は、２つのリン原子上の絶対立体配置について、（２位のリンの絶対立体配置，１０位のリンの絶対立体配置）の順で、（Ｒｐ，Ｒｐ）、（Ｓｐ，Ｒｐ）、（Ｒｐ，Ｓｐ）、（Ｓｐ，Ｓｐ）と表記される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　本発明のＣＤＮの製造では、一実施形態において、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の環状ジヌクレオチドを、以下の合成スキーム＜Ａ法＞に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
上記の合成スキーム＜Ａ法＞中、
　ＰＧ１は、ヒドロキシ基の保護基であり、
　ＰＧ２は、ヒドロキシ基のトリチル型保護基であり、
　ＰＧ３は、アミノ基の保護基であり、
　ＰＧ４は、ヒドロキシ基の保護基であり、
　ＰＧ５は、ヒドロキシ基のエステル型又はカーボネート型保護基であり、
　ＰＧ８は、ヒドロキシ基のトリチル型保護基であり、
　Ａ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 であり、
　Ａ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 　　（ここで、ＰＧ６は、アミノ基の保護基である。）
であり、
　光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 　　（ここで、Ｒ１は、水素又はメチルであり、Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されており、及び、前記フェニルは、非置換であるか、又はニトロ若しくはメトキシで置換されている。）
　であり、
合成スキーム＜Ａ法＞において、Ｂ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 　であり、
　Ｂ２及びＢ２’は、同一または異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 　　（ここで、ＰＧ７は、アミノ基の保護基である。）
である。
　本製造方法において、ＰＧ１は、例えば、ヒドロキシ基のシリル型保護基であり、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルを挙げることができる。好適には、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリルである。より好適には、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルである。
　ＰＧ２は、ヒドロキシ基のトリチル型保護基であり、例えば、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルを挙げることができる。好適には、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル又はトリチルである。より好適には４－メトキシトリチル又は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　ＰＧ３は、例えば、アミノ基のカーバメート型保護基であり、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルを挙げることができる。好適には、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。より好適には、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　ＰＧ４は、例えば、ホルミル、又はヒドロキシ基のエステル型保護基、カーボネート型保護基、若しくはベンジル型保護基であり、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルを挙げることができる。好適には、クロロアセチル、レブリノイル、又はアリルオキシカルボニルである。より好適には、レブリノイルである。
　ＰＧ５は、ヒドロキシ基のエステル型保護基又はカーボネート型保護基であり、エステル型保護基としては、例えば、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル等を、また、カーボネート型保護基としては、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル等を挙げることができる。好適には、クロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。より好適には、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。
　ＰＧ６としては、例えば、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルを挙げることができる。好適にはベンゾイル、２，２，２－クロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、又は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。より好適には、ベンゾイル又は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　ＰＧ７としては、例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、メトキシカルボニル又はエトキシカルボニルを挙げることができる。好適には、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、又は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。より好適には、アセチル、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、又は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　ＰＧ８としては、例えば、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルを挙げることができる。好適には、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル又はトリチルである。より好適には４－メトキシトリチル又は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　以下に、各工程について説明する。
（工程ａ１）
　一実施形態では、本工程は、式（１Ａ）の化合物を、光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させて、式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物を得る工程である。
　一実施形態において、本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）としては、以下の式（Ｒｃ－２－１）又は式（Ｒｃ－２－２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 ［式中、
　Ｒ１は、水素又はメチルであり、
　Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、
　　ここで、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されており、及び、
　　前記フェニルは、非置換であるか、又はニトロ若しくはメトキシで置換されている。］
で表される化合物を挙げることができる。前記光学活性なホスフィチル化剤は、式（１Ａ）の化合物と式（４Ａ）の化合物とを立体選択的に縮合させて、式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物を生成させるための試薬であり、式（１Ａ）の化合物と立体選択的に反応して、式（Ｒｃ－３Ａ）の中間体が生成する。
　光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）としては、（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＲ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－メチル－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＲ）－１－クロロ－３－［（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－［（４－ニトロフェニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＲ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－［（４－メトキシフェニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－（ジフェニルメチル）テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＲ）－１－クロロ－３ａ，４－ジヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－［１，３，２］オキサザホスホロ［３，４－ａ］インドール等を用いることができ、好適には、（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＲ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－メチル－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＲ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホールを用いることができ、より好適には、（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＲ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＲ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＲ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホールを用いることができる。本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（１Ａ）で表される化合物に対して、１～３当量である。
　上記に例示された光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　本工程では立体選択的に反応が進行して、所望の絶対立体配置を有する式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物を得ることが出来る。ここで、式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物の絶対立体配置は、以下に例示するとおり、プロリノール骨格中に含まれる不斉炭素原子上の絶対立体配置の（Ｒｃ）を用いて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　一実施形態において、Ｒ１及びＲ２が水素原子である光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）を用いた場合、以下に示すとおり、リン原子上の絶対立体配置が（Ｓｐ）の式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物が生成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　すなわち、絶対立体配置が（Ｒｃ）の光学活性なホスフィチル化剤を用いることによって、９０％以上の、好ましくは９５％以上の、より好ましくは９８％以上の高い選択性で、所望のジアステレオマーを得ることができる。従来の製造方法では、立体非選択的にホスホロチオエート結合が形成され、おおよそ５０：５０の比率で（Ｒｐ）体と（Ｓｐ）体が生成するため、目的とする絶対立体配置を有する化合物の収率は半分以下であった。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、を挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリンを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（１Ａ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、トルエンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－７８℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～１０時間であり、より好適には、５～１８０分である。
（工程ａ２）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物を、式（４Ａ）の化合物又はその塩と、活性化剤の存在下で反応させ、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）と反応させ、式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物を得る工程である。
　一実施形態としては、本工程では、立体選択的に反応が進行して、目的の絶対立体配置を有する式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物を得ることが出来る。式（Ｒｃ－５Ａ）の絶対立体配置の表記は、上記の式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物と同様に、Ｂ２内プロリノール骨格中に含まれる不斉炭素原子上の絶対立体配置を用いて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　本工程では、式（Ｒｃ－３Ａ）で構築した不斉環境を維持しつつ、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の選択性で、立体反転型に反応が進行する。これにより、所望のジアステレオマーを、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の高い選択性で得ることができる。従来法では、立体非選択的に式（１Ａ）の化合物と式（４Ａ）の化合物が縮合するため、おおよそ５０：５０の比率で、式（５Ａ）の化合物に相当する、分離困難な（Ｒｐ）体と（Ｓｐ）体の混合物が得られていた。従って、所望の化合物である（Ｒｃ－５Ａ）体の収率に関しては、立体選択性の観点から約２倍の改善が見られるだけでなく、分離困難な大量のリン上のジアステレオマーの分離負荷を考慮すると、生産性は３～１０倍程度まで向上すると想定される。
　本工程で用いられる活性化剤としては、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物の絶対立体配置を損なわずに反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、カウンターアニオンの塩基成分としては、１－フェニルイミダゾール、ベンゾイミダゾール、１－メチルベンゾイミダゾール、１－シアノメチルピペリジン、１－ピロリジンアセトニトリル、１－（シアノメチル）イミダゾールなどを挙げることができ、カウンターアニオンの酸成分としては、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などが挙げられる。好適には、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピペリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピロリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）イミダゾリウム　トリフレートを挙げることができ、より好適には、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレートを挙げることができる。本工程に用いられる活性化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物に対して、１～３当量である。
　本工程に用いられる化合物（４Ａ）の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物に対して、０．５～３当量であり、より好適には、０．８～１．２当量である。
　本工程に用いられるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤としては、反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、無水酢酸、アセチルクロリド、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、１－アセチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン、Ｎ－メトキシジアセトアミド、Ｎ－アセチルイミダゾール、トリフルオロ酢酸無水物、ビストリフルオロアセトアミド、エチルトリフルオロアセテート、メチルトリフルオロアセテート、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート、トリフルオロアセチルベンゾトリアゾール、Ｓ－エチルトリフルオロチオアセテート、Ｎ－メチルビストリフルオロアセトアミド、トリフルオロアセチルトリフレート、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、ベンゾイルクロリド、ペンタフルオロフェニルベンゾエート、ベンゾイルトリフルオロメタンスルホネート、３－ベンゾイルチアゾリジンー２－チオン、ｔｅｒｔ－ブチルフェニルカーボネート、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ）フタルイミド、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルチオ）－４，６－ジメチルピリジン、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、ｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシミノ）－２－フェニルアセトニトリル、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、９－フルオレニルメチルカルバゼート、９－フルオレニルメチルカーバメート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、アリルフェニルカーボネート、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、クロロギ酸２，２，２－トリクロロエチル、クロロギ酸ベンジル、ベンジルカルバゼート、ベンジルフェニルカーボネート、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、４－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ニトロベンゼン、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド、Ｎ－エトキシカルボニルフタルイミド、クロロギ酸エチル、ジエチルジカーボネート、エチルイミダゾールー１－カルボキシレート、２－エトキシ－１－（エトキシカルボニル）－１，２－ジヒドロキノリン、クロロギ酸メチル、ジメチルカーボネート、ジメチルジカーボネート、又はメチルイミダゾール－１－カルボキシレートを挙げることができ、好適には、無水酢酸、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができ、より好適には、無水酢酸、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができる。本工程に用いられるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物に対して、０．７～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程のアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～５時間であり、より好適には、５～９０分である。
　本工程の活性化剤、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤、及びチオ化剤の反応は、好適には、脱水剤の存在下で行うことができる。本工程に用いられる脱水剤としては、反応が進行する限り特に限定されないが、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａ、モレキュラーシーブ５Ａ、モレキュラーシーブ１３Ｘ、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、及び塩化カルシウム等を挙げることができ、好適には、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａ、モレキュラーシーブ５Ａ、モレキュラーシーブ１３Ｘ及び硫酸ナトリウムを挙げることができ、より好適には、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａを挙げることができる。本工程に用いられる脱水剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物の質量に対して、０．０１～３倍の質量であり、より好適には、０．０１～１倍の質量である。
　本工程で用いられるチオ化剤としては、反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン及び［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンなどを用いることができ、好適には、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンを用いることができ、より好適には、キサンタンヒドリド、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンを用いることができる。本工程に用いられるチオ化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物に対して、０．５～５当量であり、より好適には、１～２当量である。
　本工程のチオ化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～５時間であり、より好適には、５～９０分である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジンを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリンを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ａ）で表される化合物に対して、０．５～２０当量であり、より好適には、１～１０当量である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、アセトニトリルを挙げることができる。
（工程ａ３）
　一実施形態では、工程ａ３は、工程ａ３－１及び工程ａ３－２を含み、工程ａ３－１において、式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物のＰＧ２を脱保護し、工程ａ３－２において、生じた水酸基をＰＧ５で保護し、式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物を得る工程である。
　工程ａ３－１の脱保護反応によって、式（Ｒｃ－６Ａ－０１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 で表される化合物（ここで、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、合成スキーム＜Ａ法＞で説明した基と同義である。）が得られる。
　工程ａ３－１において、ＰＧ２の脱保護反応に用いられる酸としては、例えば、塩酸、硫酸、ギ酸、シュウ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を挙げることができる。好適には、塩酸、酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸を挙げることができ、より好適には、塩酸、ジクロロ酢酸を挙げることができる。脱保護に用いられるｐＨは、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１～４である。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０．５～４８時間であり、より好適には、１～２４時間である。
　本工程のＰＧ２の脱保護反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
　工程ａ３－２で用いる水酸基への保護基（ＰＧ５）導入の試薬は、保護基の種類によって異なるが、例えば、無水酢酸、アセチルクロリド、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、１－アセチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン、Ｎ－メトキシジアセトアミド、Ｎ－アセチルイミダゾール、クロロ酢酸無水物、クロロアセチルクロリド、ジクロロ酢酸無水物、ジクロロアセチルクロリド、トリクロロ酢酸無水物、トリクロロアセチルクロリド、無水レブリン酸、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、９－フルオレニルメチルカルバゼート、９－フルオレニルメチルカーバメート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、アリルフェニルカーボネートなどを挙げることができる。また、酢酸、クロロ酢酸、レブリン酸などの酸とＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール又は４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム　クロリドｎ水和物などの縮合剤との組み合わせも挙げられる。好適にはクロロ酢酸無水物、クロロアセチルクロリド、無水レブリン酸、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、レブリン酸と１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミドの組み合わせを挙げることができ、より好適には、クロロアセチルクロリド、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、クロロギ酸アリル、レブリン酸と１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミドの組み合わせが挙げられる。水酸基への保護基（ＰＧ５）導入の試薬の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－６Ａ－０１）で表される化合物に対して、０．７～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ５）導入に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
（工程ａ４）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物のＰＧ４を脱保護し、式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物を得る工程である。
　本工程の脱保護に用いられる試薬としては、ＰＧ４の種類によって異なるが、例えばＰＧ４がレブリノイル基の場合は、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、ヒドラジン一塩酸塩、ヒドラジン二塩酸塩を挙げることができる。好適には、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、ヒドラジン一塩酸塩、ヒドラジン二塩酸塩を挙げることができ、より好適には、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩を挙げることができる。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０．５～４８時間であり、より好適には、１～２４時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
（工程ａ５）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物を、光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させた後、ＰＧ５の脱保護を行い、活性化剤の存在下で環化反応を行い、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）と反応させ式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）の化合物を得る工程である。
　本工程において、光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させた後に得られる中間体として、式（Ｒｃ－８－０１）、さらにＰＧ５を脱保護した後に得られる中間体として、式（Ｒｃ－８－０２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 で表される化合物（ここで、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ５は、合成スキーム＜Ａ法＞で説明した基と同義であり、Ｂ１’は前記合成スキーム＜Ａ法＞で説明したＢ１と同義である。）が得られる。
　本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）としては、前記（工程ａ１）で用いられるホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と同義であり、同時に用いる塩基、溶媒、反応温度及び反応時間も前記（工程ａ１）と同義である。
　本工程のＰＧ５の脱保護に用いられる試薬としては、ＰＧ５の種類によって異なるが、例えばＰＧ５がアリルオキシカルボニル基の場合は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウムなどの０価のパラジウム触媒が挙げられる。また、２価のパラジウム触媒（塩化パラジウム、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、酢酸パラジウムなどが挙げられる）を用いて系内で還元剤（トリフェニルホスフィン、水素化トリブチルスズ、ギ酸、ギ酸アンモニウム、トリエチルシランなどが挙げられる）を用いて０価のパラジウムへ還元することによっても可能である。さらに脱離するアリル基のスカベンジャーとして、ジメドン、ピペリジン　モルホリン、ジメチルアミンーボラン錯体などが挙げられる。好適には、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム、酢酸パラジウムとトリフェニルホスフィンなどの還元剤の組み合わせを挙げることができる。より好適には、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、酢酸パラジウムとトリフェニルホスフィンの組み合わせを挙げることができる。アリル基のスカベンジャーとして、好適にはジメドン、ピペリジン　モルホリンがあげられ、より好適には、ジメドンが挙げられる。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１分～４８時間であり、より好適には、１分～２４時間である。
　本工程のＰＧ５の脱保護に用いられる溶媒としては、ホスフィチル化反応後、連続化反応として同一の溶媒を用いてもよいが、反応を阻害するものでなければ特に限定はされない。例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適にはジクロロメタン、アセトニトリル並びにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　本工程に用いられる環化反応を行う活性化剤、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）は、前記（工程ａ２）で用いられる試薬と同義である。
　本工程の環化反応を行う活性化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－７８℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－６０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～５時間であり、より好適には、５分～３時間である。
　本工程のアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１分～５時間であり、より好適には、５分～９０分である。
　本工程のチオ化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～５時間であり、より好適には、５分～９０分である。
　本工程の活性化剤を用いた環化反応からチオ化反応に用いられる溶媒としては、ホスフィチル化反応およびＰＧ５の脱保護反応後、連続化反応として同一の溶媒を用いてもよいが、反応を阻害するものでなければ特に限定はされない。例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適にはジクロロメタン、アセトニトリル並びにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　式（８）の化合物の絶対立体配置は、以下に示すとおり、２つのリン原子上の絶対立体配置に対して、（２位のリンの絶対立体配置，１０位のリンの絶対立体配置）の順で表記する。（Ｒｐ，Ｒｐ），（Ｓｐ，Ｒｐ），（Ｒｐ，Ｓｐ），（Ｓｐ，Ｓｐ）と表記される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
　本工程のＰＧ５の脱保護後の活性化剤を用いた環化反応では、式（Ｒｃ－８－０１）で構築した不斉環境を維持しつつ、所望のジアステレオマーを、８５％以上の高い選択性で得ることができる。例えば、本明細書の実施例８に示した通り、式（Ｒｃ－７）の化合物から式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物への環化反応において、所望の絶対立体配置を有する（Ｒｐ，Ｒｐ－８）体が、（Ｓｐ，Ｒｐ－８）体に対して、８９：１１の選択性で得られた。
　従来法では、環化反応の種類によっても異なるが、立体選択的に環化反応を制御するものではないが、分子自身の立体構造に基づいて、一方のジアステレオマーの生成が優位に進行することがある。しかしながら、立体を特に制御する反応ではないため、選択性は高くても約５０：５０～８５：１５の選択性であると考えられる。例えば、基質は少し異なるが、特許文献１０（国際公開第２０１８／１３８６８５号）の実施例５には、環化後のＲｐ環化体（５ｍ）が４６ｍｇ、Ｓｐ環化体（５ｌ）が５９ｍｇ取得されたことが記載されており、環化時の選択性が低いことは明らかである。
　国際公開第２０１８／１３８６８５号の実施例５より
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
（工程ａ６）
　一実施形態では、本工程は、（Ｒｃ，Ｒｃ－８）の化合物のチオリン酸部位の保護基であるＢ２及びＢ２’、並びにＡ２中の保護基であるＰＧ６を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物を得る工程である。本工程は、任意に、有機又は無機塩基で処理して、その塩に変換する工程を含む。
　本工程の脱保護反応に用いられるアンモニアは、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２８％アンモニア水を用いることができる。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、３０℃～６５℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１～９６時間であり、より好適には、１～４８時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、ピリジン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、ピリジンを挙げることができ、より好適には、メタノール、ピリジンを挙げることができる。
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物をその塩に変換する際に用いる有機塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等が挙げられる。また、無機塩基としては、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等が挙げられる。好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを挙げることができる。
（工程ａ０－１）
　本工程は、式（ＸＸＶ’）の化合物又はその塩を、トリチル化剤と反応させて、式（４Ａ－０１）の化合物又はその塩を得る工程である。
　本工程のトリチル化剤としては、４，４－ジメトキシトリチルクロリド、４－メトキシトリチルクロリド、２－クロロトリチルクロリド、又はトリチルクロリド挙げることができ、好適には、４，４－ジメトキシトリチルクロリド、４－メトキシトリチルクロリドを挙げることができる。本工程に用いられるトリチル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＶ’）で表される化合物に対して、０．５～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～３６時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、ピリジン、２－メチルピリジン、３－メチルピリジン、４－メチルピリジン、２，６－ルチジン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、ピリジン、２－メチルピリジン、３－メチルピリジン、４－メチルピリジン、２，６－ルチジン、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ピリジンを挙げることができる。
（工程ａ０－２）
　本工程は、式（４Ａ－０１）の化合物又はその塩の３’位のヒドロキシ基を、レブリン酸を用いて保護し、さらに、ベンジル化剤又はアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤と反応させ、次いで脱トリチル化を行うことによって、式（４Ａ）の化合物を得る工程である。
　本工程のベンジル化剤又はアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤としては、ベンジルクロリド、ベンジルブロミド、ベンゾイルクロリド、無水安息香酸、ｔｅｒｔ－ブチルフェニルカーボネート、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ）フタルイミド、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルチオ）－４，６－ジメチルピリジン、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、ｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシミノ）－２－フェニルアセトニトリル、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、９－フルオレニルメチルカルバゼート、９－フルオレニルメチルカーバメート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、アリルフェニルカーボネート、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、クロロギ酸２，２，２－トリクロロエチル、クロロギ酸ベンジル、ベンジルカルバゼート、ベンジルフェニルカーボネート、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、４－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ニトロベンゼン、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド、Ｎ－エトキシカルボニルフタルイミド、クロロギ酸エチル、ジエチルジカーボネート、エチルイミダゾールー１－カルボキシレート、２－エトキシ－１－（エトキシカルボニル）－１，２－ジヒドロキノリンなどを挙げることができる。好適にはベンゾイルクロリド、無水安息香酸、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、クロロギ酸２，２，２－トリクロロエチル、クロロギ酸ベンジル、ベンジルカルバゼート、ベンジルフェニルカーボネート、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、４－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ニトロベンゼン、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができ、より好適には、ベンゾイルクロリド、無水安息香酸、４－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ニトロベンゼン、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができる。
　水酸基への保護基（ＰＧ４）導入の試薬の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（４Ａ－０１）で表される化合物に対して、０．７～５当量であり、より好適には、１～３当量である。水酸基への保護基（ＰＧ６）導入の試薬の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（４Ａ－０１）で表される化合物に対して、１～１５当量であり、より好適には、４～１０当量である。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ４）に関する反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～３６時間である。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ６）に関する反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、５０℃～７０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、1時間～１２０時間であり、より好適には、３０時間～６０時間である。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ４）導入に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ６）導入に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、アセトニトリルを挙げることができる。
（新規中間体）
　上記の合成スキーム＜Ａ法＞における新規中間体として、以下の式（４Ａ’）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 ここで、
　ＰＧ４は、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、好ましくは、クロロアセチル、レブリノイル、又はアリルオキシカルボニルである。より好ましくは、レブリノイルである。
　ＰＧ６は、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルであり、好ましくは、ベンゾイル又は２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルであり、より好ましくは、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　また、上記の合成スキーム＜Ａ法＞における新規中間体として、以下の式（Ｒｃ－５Ａ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 ここでＡ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 であり、
　ＰＧ４及びＰＧ６は、前記に示した式（４Ａ’）の化合物と同義である。
　Ｂ２は、好ましくは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 であり、Ｒ１は、水素又はメチルであり、Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されているか、及び、前記フェニルは、非置換であるか、又はニトロ若しくはメトキシで置換されている基が好ましい。
　より好ましくは、Ｂ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 であり、さらに好ましくは、Ｂ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 である。
　ＰＧ７は、アミノ基の保護基であり、好ましくは、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルであり、より好ましくは、アセチル、トリフルオロアセチルである。
　ＰＧ１は、好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、より好ましくは、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルである。
　ＰＧ２は、好ましくは、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルであり、より好ましくは、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル又はトリチルであり、さらにより好ましくは、４－メトキシトリチル又は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　ＰＧ３は、好ましくは、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、より好ましくは、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　また、上記の合成スキーム＜Ａ法＞における新規中間体として、以下の式（Ｒｃ－６Ａ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 ここでＡ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、前記に示した（Ｒｃ－５Ａ）の化合物と同義である。
　ＰＧ５は、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルであり、好ましくは、クロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。より好ましくは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。
　また、上記の合成スキーム＜Ａ法＞における新規中間体として、以下の式（Ｒｃ－７Ａ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 ここでＡ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ５は、前記に示した（Ｒｃ－６Ａ）の化合物と同義である。
　また、上記の合成スキーム＜Ａ法＞における新規中間体として、以下の式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 ここでＡ２、Ｂ２、ＰＧ１及びＰＧ３は、前記に示した（Ｒｃ－７Ａ）の化合物と同義であり、Ｂ２’はＢ２と同義であり、Ｂ２と同一又は異なっていてもよい。
　また、本発明のＣＤＮの製造では、一実施形態において、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の環状ジヌクレオチドを、以下の合成スキーム＜Ｂ法＞に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
　上記の合成スキーム＜Ｂ法＞中、
Ａ１、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ６及びＰＧ７は、前記合成スキーム＜Ａ法＞中の化合物で定義したＡ１、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ６及びＰＧ７と同義である。
　Ｂ２”は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 であり、
　ＰＧ９は、ヒドロキシ基の保護基であり、例えば、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルを挙げることができる。好適には、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル又はトリチルである。より好適には４－メトキシトリチル又は４，４’－ジメトキシトリチルである。
　以下に、各工程について説明する。
（工程ｂ１）
　一実施形態では、本工程は、式（４Ｂ）の化合物を、光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させて、式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物を得る工程である。本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）は、合成スキーム＜Ａ法＞で用いられる（Ｒｃ－２）と同義である。
　本工程では立体選択的に反応が進行して、所望の絶対立体配置を有する式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物を得ることが出来る。ここで、式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物の絶対立体配置は、以下に例示するとおり、プロリノール骨格中に含まれる不斉炭素原子上の絶対立体配置の（Ｒｃ）を用いて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
　一実施形態において、Ｒ１及びＲ２が水素原子である光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）を用いた場合、以下に示すとおり、リン原子上の絶対立体配置が（Ｓｐ）の式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物が生成される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 　すなわち、絶対立体配置が（Ｒｃ）の光学活性なホスフィチル化剤を用いることによって、高い選択性で所望のジアステレオマーを得ることができる。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、を挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリンを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（４Ｂ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、トルエンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－７８℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～１０時間であり、より好適には、５～１８０分である。
（工程ｂ０）
　一実施形態では、本工程は、式（１Ａ）の化合物の水酸基をＰＧ４基で保護した後、ＰＧ２を脱保護する工程である。
　本工程に用いる水酸基への保護基（ＰＧ４）導入の試薬は、保護基の種類によって異なるが、例えば、無水酢酸、アセチルクロリド、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、１－アセチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン、Ｎ－メトキシジアセトアミド、Ｎ－アセチルイミダゾール、クロロ酢酸無水物、クロロアセチルクロリド、ジクロロ酢酸無水物、ジクロロアセチルクロリド、トリクロロ酢酸無水物、トリクロロアセチルクロリド、無水レブリン酸、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、アリルフェニルカーボネート、４－メトキシベンジルクロライド、４－メトキシベンジルブロマイド、４－アジド－３－クロロベンジルブロミドなどを挙げることができる。また、酢酸、クロロ酢酸、レブリン酸などの酸とＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール又は４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物などの縮合剤との組み合わせも挙げられる。好適にはクロロ酢酸無水物、クロロアセチルクロリド、無水レブリン酸、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、レブリン酸と１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミドの組み合わせを挙げることができ、より好適には、クロロアセチルクロリド、レブリン酸と１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミドの組み合わせ、クロロギ酸アリルが挙げられる。水酸基への保護基（ＰＧ４）導入の試薬の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（１Ａ）で表される化合物に対して、０．７～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の水酸基への保護基（ＰＧ４）導入に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
　本工程のＰＧ２の脱保護は、酸を用いた酸性条件で行う。用いる酸は、例えば、塩酸、硫酸、ギ酸、シュウ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を挙げることができる。好適には、塩酸、酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸を挙げることができ、より好適には、塩酸、ジクロロ酢酸を挙げることができる。脱保護に用いられるｐＨは、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１～４である。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０．５～４８時間であり、より好適には、１～２４時間である。
　本工程のＰＧ２の脱保護反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
（工程ｂ２）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物を、式（１Ｂ）の化合物又はその塩と、活性化剤の存在下で反応させ、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）と反応させ、式（Ｒｃ－５Ｂ）の化合物を得る工程である。
　一実施形態としては、本工程では、立体選択的に反応が進行して、目的の絶対立体配置を有する式（Ｒｃ－５Ｂ）の化合物を得ることが出来る。本工程では、式（Ｒｃ－３Ｂ）で構築した不斉環境を維持しつつ、高選択性で、立体反転型に反応が進行する。これにより、所望のジアステレオマーを、高い選択性で得ることができる。
　本工程で用いられる活性化剤としては、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物の絶対立体配置を損なわずに反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、カウンターアニオンの塩基成分としては、１－フェニルイミダゾール、ベンゾイミダゾール、１－メチルベンゾイミダゾール、１－シアノメチルピペリジン、１－ピロリジンアセトニトリル、及び１－（シアノメチル）イミダゾールなどを挙げることができ、カウンターアニオンの酸成分としては、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸などが挙げられる。好適には、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピペリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピロリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）イミダゾリウム　トリフレートを挙げることができ、より好適には、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレートを挙げることができる。本工程に用いられる活性化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物に対して、１～３当量である。
　本工程に用いられる化合物（１Ｂ）の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物に対して、０．５～３当量であり、より好適には、０．８～１．２当量である。
　本工程に用いられるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤としては、反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、無水酢酸、アセチルクロリド、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、１－アセチル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン、Ｎ－メトキシジアセトアミド、Ｎ－アセチルイミダゾール、トリフルオロ酢酸無水物、ビストリフルオロアセトアミド、エチルトリフルオロアセテート、メチルトリフルオロアセテート、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート、トリフルオロアセチルベンゾトリアゾール、Ｓ－エチルトリフルオロチオアセテート、Ｎ－メチルビストリフルオロアセトアミド、トリフルオロアセチルトリフレート、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、ベンゾイルクロリド、ペンタフルオロフェニルベンゾエート、ベンゾイルトリフルオロメタンスルホネート、３－ベンゾイルチアゾリジンー２－チオン、ｔｅｒｔ－ブチルフェニルカーボネート、Ｎ－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ）フタルイミド、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルチオ）－４，６－ジメチルピリジン、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、ｔｅｒｔ－ブチルカルバゼート、２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシミノ）－２－フェニルアセトニトリル、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、クロロギ酸９－フルオレニルメチル、９－フルオレニルメチルカルバゼート、９－フルオレニルメチルカーバメート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、クロロギ酸アリル、ジアリルジカーボネート、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、アリルフェニルカーボネート、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、クロロギ酸２，２，２－トリクロロエチル、クロロギ酸ベンジル、ベンジルカルバゼート、ベンジルフェニルカーボネート、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、４－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ニトロベンゼン、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド、Ｎ－エトキシカルボニルフタルイミド、クロロギ酸エチル、ジエチルジカーボネート、エチルイミダゾールー１－カルボキシレート、２－エトキシ－１－（エトキシカルボニル）－１，２－ジヒドロキノリン、クロロギ酸メチル、ジメチルカーボネート、ジメチルジカーボネート、又はメチルイミダゾール－１－カルボキシレートを挙げることができ、好適には、無水酢酸、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド、Ｎ－（アリロキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができ、より好適には、無水酢酸、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、Ｎ－（アリルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミドを挙げることができる。本工程に用いられるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物に対して、０．７～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程のアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～５時間であり、より好適には、５～９０分である。
　本工程の活性化剤、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤、及びチオ化剤の反応は、好適には、脱水剤の存在下で行うことができる。本工程に用いられる脱水剤としては、反応が進行する限り特に限定されないが、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａ、モレキュラーシーブ５Ａ、モレキュラーシーブ１３Ｘ、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、及び塩化カルシウム等を挙げることができ、好適には、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａ、モレキュラーシーブ５Ａ、モレキュラーシーブ１３Ｘ及び硫酸ナトリウムを挙げることができ、より好適には、モレキュラーシーブ３Ａ、モレキュラーシーブ４Ａを挙げることができる。本工程に用いられる脱水剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物の質量に対して、０．０１～３倍の質量であり、より好適には、０．０１～１倍の質量である。
　本工程で用いられるチオ化剤としては、反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン及び［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンなどを用いることができ、好適には、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンを用いることができ、より好適には、キサンタンヒドリド、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンを用いることができる。本工程に用いられるチオ化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物に対して、０．５～５当量であり、より好適には、１～２当量である。
　本工程のチオ化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～５時間であり、より好適には、５～９０分である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジンを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリンを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－３Ｂ）で表される化合物に対して、０．５～２０当量であり、より好適には、１～１０当量である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、アセトニトリルを挙げることができる。
（工程ｂ３）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－５Ｂ）の化合物のＰＧ９を脱保護し、式（Ｒｃ－６Ｂ）の化合物を得る工程である。
　本工程の脱保護は、酸を用いた酸性条件で行う。用いる酸は、例えば、塩酸、硫酸、ギ酸、シュウ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等を挙げることができる。好適には、塩酸、酢酸、モノクロロ酢酸、ジクロロ酢酸を挙げることができ、より好適には、塩酸、ジクロロ酢酸を挙げることができる。脱保護に用いられるｐＨは、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１～４である。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０．５～４８時間であり、より好適には、１～２４時間である。
　本工程のＰＧ９の脱保護反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
（工程ｂ４）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－６Ｂ）の化合物のＰＧ４を脱保護し、式（Ｒｃ－７Ｂ）の化合物を得る工程である。
　本工程の脱保護に用いられる試薬としては、ＰＧ４の種類によって異なるが、例えばＰＧ４がレブリノイル基の場合は、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、ヒドラジン一塩酸塩、ヒドラジン二塩酸塩を挙げることができる。好適には、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩、ヒドラジン一塩酸塩、ヒドラジン二塩酸塩を挙げることができ、より好適には、ヒドラジン一水和物、ヒドラジン酢酸塩を挙げることができる。脱保護反応の反応温度は、反応が進行する限り、制限されないが、好適には－３０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には－２０℃から３０℃である。本反応の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０．５～４８時間であり、より好適には、１～２４時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、ジクロロメタンを挙げることができ、より好適には、ジクロロメタンを挙げることができる。
(工程ｂ５）
　一実施形態では、本工程は、式（Ｒｃ－７Ｂ）の化合物を、光学活性なホスフィチル化剤（Ｓｃ－２）と反応させた後、活性化剤の存在下で環化反応を行い、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）と反応させ式（Ｒｃ，Ｓｃ－８）の化合物を得る工程である。
　本工程において、光学活性なホスフィチル化剤（Ｓｃ－２）と反応させた後で、環化をする前に得られる中間体として、式（Ｒｃ－８－０１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 で表される化合物（ここで、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１及びＰＧ３は、合成スキーム＜Ａ法＞で説明した基と同義であり、
　Ｂ１”は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 である。）が得られる。
　一実施形態において、本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤（Ｓｃ－２）としては、以下の式（Ｓｃ－２－１）又は式（Ｓｃ－２－２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 ［式中、
　Ｒ１は、水素又はメチルであり、
　Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、
　　ここで、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されており、及び、前記フェニルは、非置換であるか、又はニトロ若しくはメトキシで置換されている。］
で表される化合物を挙げることができる。
　光学活性なホスフィチル化剤（Ｓｃ－２）としては、（３ａＳ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＳ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－メチル－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＳ）－１－クロロ－３－［（４－メチルベンゼン－１－スルホニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－［（４－ニトロフェニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＳ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－［（４－メトキシフェニル）メチル］テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－（ジフェニルメチル）テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＳ）－１－クロロ－３ａ，４－ジヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－［１，３，２］オキサザホスホロ［３，４－ａ］インドール等を用いることができ、好適には、（３ａＳ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＳ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－メチル－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＳ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホールを用いることができ、より好適には、（３ａＳ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３ａＳ）－１－クロロ－３，３－ジメチルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｒ，３ａＳ）－１－クロロ－３－フェニルテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール、（３Ｓ，３ａＳ）－１－クロロ－３－｛［メチル（ジフェニル）シリル］メチル｝テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホールを用いることができる。本工程に用いられる光学活性なホスフィチル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｃ－７Ｂ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量、より好適には、１～３当量である。
　上記に例示された光学活性なホスフィチル化剤（Ｓｃ－２）の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
　本工程に用いられる環化反応を行う活性化剤、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤、さらにチオ化剤（硫化剤又はチオール化剤ともいう）は、前記（工程ｂ２）で用いられる試薬と同義である。
　本工程の環化反応を行う活性化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－７８℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－６０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～５時間であり、より好適には、５分～３時間である。
　本工程のアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１分～５時間であり、より好適には、５分～９０分である。
　本工程のチオ化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～５時間であり、より好適には、５分～９０分である。
　本工程の活性化剤を用いた環化反応からチオ化反応に用いられる溶媒としては、ホスフィチル化反応後、連続化反応として同一の溶媒を用いてもよいが、反応を阻害するものでなければ特に限定はされない。例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適にはジクロロメタン、アセトニトリル並びにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
（工程ｂ６）
　一実施形態では、本工程は、（Ｒｃ，Ｓｃ－８）の化合物のチオリン酸部位の保護基であるＢ２、Ｂ２”及びＡ２中の保護基であるＰＧ６を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物を得る工程である。本工程は、任意に、有機又は無機塩基で処理して、その塩に変換する工程を含む。
　本工程の脱保護反応に用いられるアンモニアは、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２８％アンモニア水を用いることができる。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、３０℃～６５℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１～９６時間であり、より好適には、１～４８時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、ピリジン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、ピリジンを挙げることができ、より好適には、メタノール、ピリジンを挙げることができる。
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物をその塩に変換する際に用いる有機塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等が挙げられる。また、無機塩基としては、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等が挙げられる。好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムを挙げることができる。
＜１－２．ＣＤＮ－リンカー（化合物（Ｒｐ，Ｒｐ－１２））の製造方法＞
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩は、以下の合成スキームに従って製造することができる。式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物は、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造前駆体である。
［合成スキーム＜Ａ２法＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
　上記の［合成スキーム＜Ａ２法＞］中、
　ＰＧ１、ＰＧ３、Ａ１は、上記［合成スキーム＜Ａ法＞］と同義である。
　以下に、各工程について説明する。
　（工程ａ７）
　本工程は、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物の保護基であるＰＧ１及びＰＧ３を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物を得る工程である。
　本工程に用いる脱保護剤としては、フッ化アンモニウム、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム、フッ化水素ピリジン、及びトリエチルアミン三ふっ化水素酸塩などを挙げることができ、好適には、フッ化アンモニウム、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムを挙げることができ、より好適には、フッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウムが挙げることができる。本工程に用いられる脱保護剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）で表される化合物に対して、０．５～６０当量であり、より好適には、１～３０当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、１０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、３０分～２４０時間であり、より好適には、１時間～１２０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、メタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ジメチルスルホキシドを挙げることができ、より好適には、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドを挙げることができる。
　（工程ａ８）
　本工程は、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物と、式（１１）の化合物を縮合して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩を得る工程である。
　式（１１）で表される化合物は、好適には、活性エステルへと誘導することにより、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物と縮合することができる。本工程で用いられる式（１１）で表される化合物の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物に対して、０．３～３当量であり、より好適には、０．７～１．３当量である。
　本工程における活性エステルへの誘導は、反応が進行する限り制限されないが、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ）、又はＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等の縮合剤を用いて、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル、又はｐ－ニトロフェノール等の添加剤を用いて行うことができ、又は、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、又は（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）等の縮合剤を用いて行うことができる。好適には、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、又は１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩と１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、又は４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）を用いて行うことができる。より好適には、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）を用いて行うことができる。本工程に用いられる１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物に対して０．５～５当量であり、より好適には、０．７～２当量である。本工程に用いられる１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、又は１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールの量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物に対して０．０５～４当量であり、より好適には、０．１～２当量である。本工程に用いられる４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム　クロリドの量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物に対して０．３～５当量であり、より好適には、０．７～２当量である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及び酢酸ナトリウムを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリンを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には１～５当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－１０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、水、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシド並びにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）をその塩に変換する際に用いる塩基としては、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、プロピルアミン、ｉｓｏ－プロピルアミン、ブチルアミン、ｉｓｏ－ブチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ペンチルアミン、アニリン等の有機塩基や、２－エチルヘキサン酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、２－エチルヘキサン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド、塩化ナトリウム、及び塩化カリウム等の無機塩基を挙げることができる。好適には、トリエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、２－エチルヘキサン酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、２－エチルヘキサン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを挙げられる。より好適には、トリエチルアミン、２－エチルヘキサン酸カリウム、炭酸ナトリウムを挙げることができる。
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）をその塩に変換する際に用いる溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、水、２－プロパノール、アセトニトリル、シクロペンチルメチルエーテル、及び酢酸エチル並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適には、水、２－プロパノール、アセトニトリル及びシクロペンチルメチルエーテルの混合溶媒を挙げることができる。
＜２．環状ジヌクレオチドの製造に用いる原料化合物（１Ａ）の製造＞
＜２－１．式（１Ａ）の化合物の製造方法＞
　上記の環状ジヌクレオチドの製造に用いる式（１Ａ）の化合物は、以下の合成スキームに従って製造することができる。
［合成スキーム＜Ｘ１＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
　上記の［合成スキーム＜Ｘ１＞］中、
　ＰＧ１、ＰＧ２、及びＰＧ３は、上記［合成スキーム＜Ａ法＞］と同義であり、
　Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。
　本製造方法において、ＰＧ１はヒドロキシ基の保護基を示し、該保護基として、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルを挙げることができる。好適には、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリルである。より好適には、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルである。
　ＰＧ２はヒドロキシ基の保護基を示し、該保護基として、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルを挙げることができる。好適には、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル又はトリチルである。より好適には、４，４’－ジメトキシトリチルである。
　ＰＧ３はアミノ基の保護基を示し、該保護基として、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルを挙げることができる。好適には、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はアリルオキシカルボニルである。より好適には、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルである。
　以下に、各工程について説明する。
　（工程ｘ１）
　本工程は、式（ＸＩＶ）の化合物を、式（ＸＶ）の化合物と反応させて、式（ＸＶＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程の反応は、塩基の存在下で実施され、該塩基としては、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、又は１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを用いることができ、好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを用いることができ、より好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジンが挙げられる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＩＶ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、２０℃～５０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、３０分～７２時間であり、より好適には、５時間～３６時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを用いることができ、より好適には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを挙げることができる。
　（工程ｘ２）
　本工程は、式（ＸＶＩ）の化合物を、シリル化剤と反応させて、式（１Ａ’）の化合物及び式（ＸＶＩＩ）の化合物との混合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 を得、次いで、塩基の存在下で、該混合物中の式（ＸＶＩＩ）の化合物を、式（１Ａ’）の化合物に変換して、式（１Ａ’）の化合物を得る工程である。
　また、本工程は、式（ＸＶＩ）の化合物とシリル化剤との反応を、第一の塩基の存在下で実施して、式（１Ａ’）の化合物と式（ＸＶＩＩ）の化合物との混合物を得、次いで、該混合物中の式（ＸＶＩＩ）の化合物を、第二の塩基の存在下で、式（１Ａ’）の化合物に変換して、式（１Ａ’）の化合物を得る工程を含む。
　式（ＸＶＩＩ）の化合物から式（１Ａ’）の化合物への変換は、該混合物溶液中の平衡反応、及び、式（ＸＶＩＩ）の化合物と式（１Ａ’）の化合物との溶解性の差を利用して、該混合物の溶液から、式（１Ａ’）の化合物を晶析させることによって実施される。
　ここで、第一の塩基としては、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、２，６－ルチジン又は１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを挙げることができ、好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、２，６－ルチジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを挙げることができ、より好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジンを挙げることができる。本工程に用いられる第一の塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＶＩ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程の第一塩基を用いる反応の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、４０℃～７０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、３０分～７２時間であり、より好適には、５時間～３６時間である。
　本工程の第一塩基を用いる反応の溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを用いることができ、より好適には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを挙げることができる。
　本工程のシリル化剤としては、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン、又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルトリフラートを挙げることができ、好適には、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシランを挙げることができる。本工程に用いられるシリル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＩＶ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、２～４当量である。
　また、第二の塩基としては、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、２，６－ルチジン、又は１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンが挙げることができ、好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、２，６－ルチジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを挙げることができ、より好適には、１，１，３，３－テトラメチルグアニジンを挙げることができる。本工程に用いられる第二の塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＩＶ）で表される化合物に対して、０．０１～３当量であり、より好適には、０．０５～１当量である。
　本工程の第二塩基を用いる反応の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、１０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、１０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、２分～１０時間であり、より好適には、５分～９０分である。
　本工程の第二塩基を用いる反応の第一溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを用いることができ、より好適には、テトラヒドロフランを挙げることができる。
　本工程の第二塩基を用いる反応の第二溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、テトラヒドロフラン、ヘプタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを用いることができ、より好適には、ヘプタンを挙げることができる。
＜２－２．式（ＸＶ）の化合物の製造方法及びその中間体＞
　上記の式（１Ａ）の製造に用いる式（ＸＶ）の化合物は、以下の合成スキームに従って製造することができる。
［合成スキーム＜Ｘ２＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
　上記の［合成スキーム＜Ｂ２＞］中、
　ＰＧ３は、上記［合成スキーム＜Ａ１＞］と同義であり、
　Ｘは、上記［合成スキーム＜Ｂ１＞］と同義である。
　以下に、工程ｘ３について説明する。
　（工程ｘ３）
　本工程は、式（ＸＶＩＩＩ）で表される化合物を、酸又は塩基の存在下で、２－ハロエタノールと反応させて、式（ＸＶ）の化合物を得る工程である。
　本工程の塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、又は１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを挙げることができ、好適には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンを挙げることができ、より好適には、水酸化ナトリウムを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、化合物（ＸＶＩＩＩ）の出発原料であるグリシルグリシンに対して、０．５～２当量である。該化合物（ＸＶＩＩＩ）は、グリシルグリシンから、アミノ基の保護及びカルボキシ基のアセチルオキシ基への変換によって得ることができる。
　本工程で用いられる２－ハロエタノールは、２－クロロエタノール、２－ブロモエタノール、及び２－ヨードエタノールを挙げることができ、好適には、２－ブロモエタノール、２－ヨードエタノールを挙げることができ、より好適には、２－ブロモエタノールを挙げることができる。本工程に用いられる２－ハロエタノールの量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、化合物（ＸＶＩＩＩ）の出発原料であるグリシルグリシンの量に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～４当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－１０℃～２０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～３６時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、１，２－ジメトキシエタン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンを用いることができ、より好適には、１，２－ジメトキシエタンを挙げることができる。
＜３．環状ジヌクレオチドの製造に用いる原料化合物（ＸＸＶ）の製造＞
＜３－１．式（ＸＸＶ）の化合物の製造方法＞
　上記の環状ジヌクレオチドの製造に用いる式（ＸＸＶ）の化合物は、以下の合成スキームに従って製造することができる。
［合成スキーム＜Ｙ１＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
　以下に、各工程について説明する。
　（工程ｙ１）
　本工程は、式（ＸＩＸ）の化合物を、ベンゾイル化剤と反応させて、式（ＸＸ）の化合物を得る工程である。
　本工程で用いられるベンゾイル化剤は、塩化ベンゾイル、臭化ベンゾイル、安息香酸無水物又はトリフルオロメタンスルホン酸ベンゾイル等を挙げることができ、好適には、塩化ベンゾイル、臭化ベンゾイルを挙げることができ、より好適には、塩化ベンゾイルを挙げることができる。本工程に用いられるベンゾイル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＩＸ）で表される化合物に対して、０．５～５当量であり、より好適には、１～２当量である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基、並びにこれらの混合物を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、及び酢酸ナトリウム、並びにこれらの混合物を挙げることができ、より好適には、トリエチルアミンと４－ジメチルアミノピリジンの混合物を挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＩＸ）で表される化合物に対して、０．１～１０当量であり、より好適には、０．２～５当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－４０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－１０℃～３５℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、０．５時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを用いることができ、より好適には、アセトニトリルを挙げることができる。
　（工程ｙ２）
　本工程は、式（ＸＸ）で表される化合物を加水分解して、式（ＸＸＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程で用いられる酸としては、塩酸、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、及び硫酸等を挙げることができ、好適には、塩酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、硫酸を挙げることができ、より好適には、ｐ－トルエンスルホン酸を挙げることができる。本工程に用いられる酸の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸ）で表される化合物に対して、０．５～２０当量であり、より好適には、１～１０当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、４０℃～８０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、水、１，２－ジメトキシエタン、２－メチルテトラヒドロフラン、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、より好適には、シクロペンチルメチルエーテルと水の混合溶媒を挙げることができる。
　（工程ｙ３）
　本工程は、式（ＸＸＩ）の化合物を、塩素化剤と反応させて、式（ＸＸＩＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程の塩素化剤としては、トリクロロイソシアヌル酸、クロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸、Ｎ－クロロスクシンイミド、１，３－ジクロロ－５，５－ジメチルヒダントイン、Ｎ－クロロサッカリン、Ｎ－Ｎ－ジクロロ－ｐ－トルエンスルホンアミド、Ｎ－Ｎ－ジクロロベンゼンスルホンアミド、又は四塩化炭素を挙げることができ、好適には、トリクロロイソシアヌル酸、クロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸を挙げることができ、より好適には、トリクロロイソシアヌル酸を挙げることができる。本工程に用いられる塩素化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＩ）で表される化合物に対して、０．１～６当量であり、より好適には、０．３～３当量である。
　また、本工程の反応は、好適には、リン試薬の存在下で行うことができる。本工程に用いられるリン試薬としては、反応が進行する限り特に限定されないが、トリス（２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）ホスファイト、トリ－ｏ－トリルホスファイト、トリフェニルホスファイト、トリエチルホスファイト、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリス（ジメチルアミノ）ホスフィン、又はトリス（ジエチルアミノ）ホスフィンを挙げることができ、好適には、トリス（２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）ホスファイト、トリ－ｏ－トリルホスファイト、トリフェニルホスファイトを挙げることができ、より好適には、トリス（２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）ホスファイトを挙げることができる。本工程に用いられるリン試薬の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＩ）で表される化合物に対して、０．５～６当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－８０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、－２０℃～３０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、ジクロロメタン、１，２－ジメトキシエタン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、より好適には、ジクロロメタン、シクロペンチルメチルエーテル並びにこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　（工程ｙ４）
　本工程は、式（ＸＸＩＩ）の化合物を、式（ＸＸＩＩＩ）と反応させて、式（ＸＸＩＶ）の化合物を得る工程である。
　本工程の反応は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基、並びにこれらの混合物を挙げることができ、好適には、炭酸セシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムを挙げることができ、より好適には、炭酸セシウムを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＩＩ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、１０℃～５０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、ジメチルスルホキシドを用いることができ、より好適には、ジメチルスルホキシドを挙げることができる。
　（工程ｙ５）
　本工程は、式（ＸＸＩＶ）の化合物からベンゾイル基を脱保護して、式（ＸＸＶ）の化合物またはその塩を得る工程である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基、並びにこれらの混合物を挙げることができ、好適には、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができ、より好適には、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＩＶ）で表される化合物に対して、０．００１～１０当量であり、より好適には０．０１～５当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、シクロペンチルメチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、水、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、より好適には、エタノール又は水とテトラヒドロフランの混合溶媒を挙げることができる。
　式（ＸＸＶ）の化合物をその塩に変換する際に用いる酸としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マレイン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。好適には、酢酸、ｐ－トルエンスルホン酸、塩酸を挙げられる。より好適には、ｐ－トルエンスルホン酸、塩酸を挙げることができる。塩に変換するために用いられる酸の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＩＶ）で表される化合物に対して、０．５～５当量であり、より好適には、１～３当量である。
＜３－２．式（ＸＸＩＩＩ）の化合物の製造方法及びその中間体＞
　上記の式（ＸＸＶ）の製造に用いる式（ＸＸＩＩＩ）の化合物は、以下の合成スキームに従って製造することができる。
［合成スキーム＜Ｙ２＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
　以下に、各工程について説明する。
　（工程ｙ９）
　本工程は、式（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物からｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を、脱保護して、式（ＸＸＩＸ）の化合物を得る工程である。
　本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムを挙げることができ、より好適には、水酸化ナトリウムを挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物に対して、０．５～６当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、メタノール、エタノール、１－プロパノール、テトラヒドロフランを挙げることができ、より好適には、エタノールを挙げることができる。
　（工程ｙ１０）
　本工程は、式（ＸＸＩＸ）の化合物を、触媒の存在下で、アルキンの還元反応、次いで還元的アミノ化反応を行って、式（ＸＸＸ）の化合物を得る工程である。
　本工程のアルキンの還元反応の触媒として金属触媒を用いることができる。本工程に用いられる金属触媒は、水素化を触媒するものであれば特に制限はないが、好適には、ルテニウム触媒、ロジウム触媒、パラジウム触媒、白金触媒、又はニッケル触媒を挙げることができ、より好適には、パラジウム触媒を挙げることができる。本工程に用いられる金属触媒の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物の質量に対して、０．０１から１倍の質量であり、より好適には、０．０２～０．４倍の質量であり、より好適には、０．０５～０．２倍の質量である。水素ガス圧力は、通常１００～１０００ｋＰａであり、好適には、１００～７００ｋＰａであり、より好適には、２００～５００ｋＰａである。本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、２０℃～８０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程のアルキンの還元反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、酢酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適には、１－メチル－２－ピロリドンを挙げることができる。
　本工程の還元的アミノ化反応の触媒として金属触媒を用いることができる。本工程に用いられる金属触媒は、水素化を触媒するものであれば特に制限はないが、好適には、ルテニウム触媒、ロジウム触媒、パラジウム触媒、白金触媒、又はニッケル触媒を挙げることができ、より好適には、パラジウム触媒を挙げることができる。本工程に用いられる金属触媒の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＶＩＩＩ）で表される化合物の質量に対して、０．０１から１倍の質量であり、より好適には、０．０２～０．４倍の質量であり、より好適には、０．０５～０．２倍の質量である。水素ガス圧力は、通常１００～１０００ｋＰａであり、好適には、１００～７００ｋＰａであり、より好適には、２００～５００ｋＰａである。本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、２０℃～８０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程の還元的アミノ化反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、酢酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、水、酢酸並びにこれらの混合溶媒を挙げることができ、より好適には、１－メチル－２－ピロリドン、水、酢酸の混合溶媒を挙げることができる。
　（工程ｙ１１）
　本工程は、式（ＸＸＸ）の化合物を、ベンゾイル化剤と反応させた後、塩基処理により脱ベンゾイル化して、式（ＸＸＩＩＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程のベンゾイル化剤としては、ベンゾイルクロリド、ベンゾイルブロミド、無水安息香酸又はトリフルオロメタンスルホン酸ベンゾイル等挙げることができ、好適には、ベンゾイルクロリドを挙げることができる。本工程に用いられるベンゾイル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程のベンゾイル化剤との反応は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド、並びにこれらの混合塩基等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン、並びにこれらの混合塩基を挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジンの混合塩基を挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程のベンゾイル化剤との反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程のベンゾイル化剤との反応に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、ピリジン、２－メチルピリジン、３－メチルピリジン、４－メチルピリジン、２，６－ルチジン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを挙げることができ、より好適には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを挙げることができる。
　本工程の塩基処理に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド等の塩基を挙げることができ、好適には、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミンを挙げることができる。本工程の塩基処理に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程の塩基処理の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程の塩基処理に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、ピリジン、２－メチルピリジン、３－メチルピリジン、４－メチルピリジン、２，６－ルチジン、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンを挙げることができ、より好適には、メタノールと１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンの混合溶媒を挙げることができる。
＜３－３．式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物の製造方法＞
　上記の式（ＸＸＩＩＩ）の製造に用いる式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物は、以下の合成スキームに従って製造することができる。
［合成スキーム＜Ｙ３＞］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
　以下に、各工程について説明する。
　（工程ｙ１２）
　本工程は、式（ＸＸＸＩ）の化合物を、１－メチルイミダゾールの存在下、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル化剤と反応させて、式（ＸＸＸＩＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程のｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル化剤としては、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、Ｎ－(ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルオキシ)フタルイミド等を挙げることができ、好適には、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルを挙げることができる。本工程に用いられるｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル化剤の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸＩ）で表される化合物に対して、０．５～６当量であり、より好適には、１～３当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、－２０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、０℃～４０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～２４時間であり、より好適には、１時間～１０時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエンを挙げることができ、より好適には、トルエンを挙げることができる。
　（工程ｙ１３）
　本工程は、式（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物を、プロパルギルアルデヒドジエチルアセタールと反応させて、式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物を得る工程である。
　本工程は、好適には、遷移金属触媒の存在下で行うことができ、好適には、パラジウム触媒の存在下で行うことができる。本工程に用いられるパラジウム触媒は、反応が進行するものであれば特に限定されないが、例えば、酢酸パラジウム（ＩＩ）、トリフルオロ酢酸パラジウム（ＩＩ）、塩化パラジウム（ＩＩ）、臭化パラジウム（ＩＩ）、よう化パラジウム（ＩＩ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドなどの２価のパラジウム塩及びその錯体や、パラジウムブラック、パラジウムカーボン、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）などの０価パラジウム金属及びその錯体などを用いることができ、好適には、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドを用いることができる。本工程に用いられるパラジウム触媒の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物に対して、０．０００１～１当量であり、より好適には、０．００５～０．０５当量である。
　さらに、本工程は、好適には、上記パラジウム触媒の他に、銅触媒の存在下で行うことができる。本工程に用いることができる銅触媒は、塩化銅（Ｉ），臭化銅（Ｉ）及びヨウ化銅（Ｉ）などを用いることができ、好適には、ヨウ化銅（Ｉ）を用いることができる。本工程に用いられる銅触媒の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物に対して、０．０００１～１当量であり、より好適には、０．００５～０．０５当量である。
　また、本工程は、好適には、塩基の存在下で行うことができる。本工程に用いられる塩基としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルピペリジン、ピリジン、２－メチルピリジン、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の有機塩基や、炭酸カリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、及びカリウム　ｔｅｒｔ－ブトキシド、並びにこれらの混合塩基等の塩基を挙げることができ、好適には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンを挙げることができ、より好適には、トリエチルアミン、を挙げることができる。本工程に用いられる塩基の量は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、式（ＸＸＸＩＩ）で表される化合物に対して、０．５～１０当量であり、より好適には、１～５当量である。
　本工程の反応温度は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、０℃から反応に用いる溶媒の沸点まで、より好適には、１５℃～５０℃である。本工程の反応時間は、反応が進行する限り制限されないが、好適には、５分～７２時間であり、より好適には、１時間～２４時間である。
　本工程に用いられる溶媒としては、反応を阻害するものでなければ特に限定はされないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、アセトン、２－ブタノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドン、及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの混合溶媒を用いることができ、好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、１－メチル－２－ピロリドンを挙げることができ、より好適には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを挙げることができる。
＜４．抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）の製造方法＞
＜４－１．抗体及びその糖鎖リモデリング＞
＜４－１－１．抗体＞
　本明細書において、「抗体の機能性断片」とは、「抗体の抗原結合断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　本明細書において、「機能性断片」は、ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域においてよく保存されたＮ結合型糖鎖による修飾を受けるアスパラギン（Ａｓｎ２９７）及びその周辺のアミノ酸を保持し、且つ抗原との結合能を有している機能性断片を含む。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗体は、免疫グロブリンを意味し、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子である。本発明の抗体として、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹのいずれのクラスでもよいが、ＩｇＧが好ましい。また、サブクラスとして、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のいずれであってもよいがＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４が好ましい（ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域にＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性に影響する変異を持つ抗体を含む）。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／０７０８９、ＷＯ９４／２８０２７、ＷＯ９４／２９３５１参照）。ＩｇＧ１の変異体としては、例えば、ＩｇＧ１　ＬＡＬＡ変異（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）が挙げられる。前記Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡはＥＵ　ｉｎｄｅｘ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１（Ｍａｙ　１５，１９６９），ｐｐ．７８－８５）により特定される２３４位及び２３５位のロイシンのアラニンへの置換を示す。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。ＣＤＲは、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のＣＤＲについて、重鎖のＣＤＲを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖のＣＤＲを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　抗体は、いずれの種に由来してもよいが、好ましくは、ヒト、ラット、マウス及びウサギを例示できる。ヒト以外の種に由来する場合は、周知の技術を用いて、キメラ化又はヒト化することが好ましい。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの機能性断片、又はそれらの修飾体が含まれる。
　抗体は、好ましくは、腫瘍細胞又は免疫細胞を標的にする抗体であるが、これらに限定されない。抗体は、より好ましくは、腫瘍細胞を標的にする抗体である。
　抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内への抗体の取り込みは、（１）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ（Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００８）１５，７５１－７６１）、（２）治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ　Ｖｏｌ．１５，５２６８－５２８２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２００４）又は（３）治療抗体に結合するイムノトキシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというＭａｂ－ＺＡＰアッセイ（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２８：１６２－１６５，Ｊａｎｕａｒｙ　２０００）を用いて確認できる。イムノトキシンとしては、ジフテリア毒素の触媒領域とプロテインＧとのリコンビナント複合蛋白質も使用可能である。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートに腫瘍細胞を標的とした抗体を用いる場合、抗体自体が抗腫瘍効果を有することは、好ましいが、必須ではない。
　免疫賦活化剤ならびに抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの抗腫瘍活性は、腫瘍細胞への細胞傷害活性、抗細胞効果、腫瘍体積の退縮をいう。公知のｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏの評価系を用いて、抗腫瘍活性を確認することができる。
　免疫賦活化剤ならびに抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの免疫賦活化活性は、免疫細胞に対する腫瘍細胞の感受性亢進又は腫瘍細胞を介した免疫細胞の賦活化をいう。公知のｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏの評価系を用いて、免疫賦活化活性を確認することができる。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗体としては、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体又は抗ＤＲ５抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体として、好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ又はペルツズマブ）、抗ＣＤＨ６抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体であり、より好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体である。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
　なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用されるヒト化抗体は公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５、ＷＯ９０／０７８６１）に従って取得することができる。
　例えば、抗ＨＥＲ２抗体（ＵＳ５８２１３３７、ＷＯ２００４／００８０９９、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤ３３抗体（ＷＯ２０１４／０５７６８７、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＥｐｈＡ２抗体（ＷＯ２００９／０２８６３９、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤＨ６抗体（ＷＯ２０１８／２１２１３６、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤ７０抗体（ＷＯ２００４／０７３６５６、ＷＯ２００７／０３８６３７、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）、抗ＴＲＯＰ２抗体（ＷＯ２０１５／０９８０９９、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）、抗ＥＧＦＲ抗体（ＷＯ１９９８／０５０４３３、ＷＯ２００２／０９２７７１、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）は、公知の手段によって取得することができる。
＜４－１－２．抗体の糖鎖リモデリング＞
　近年、不均一な抗体の糖鎖を、酵素反応によってリモデリングし、官能基を有する糖鎖を均一に導入する方法が報告されている（ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，１１０－１２２，ＡＣＳ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１６，７，１００５－１００８）。この糖鎖リモデリング技術を用いて、部位特異的に薬物を導入し、均一なＡＤＣを合成する試みもなされている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３－２２４２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１６，５５，２３６１－２３６７，ＵＳ２０１６３６１４３６）。
　糖鎖のリモデリングは、まず加水分解酵素を利用して、蛋白質（抗体等）に付加されている不均一な糖鎖を末端のＧｌｃＮＡｃのみ残して切除し、ＧｌｃＮＡｃが付加した均一な蛋白質部分を調製する（以下、「アクセプター」という）。次に、別途調製した任意の糖鎖を用意し（以下、「ドナー」と言う）、このアクセプターとドナーとを、糖転移酵素を用いて連結する。これにより、任意の糖鎖構造を持った均一な糖蛋白質を合成できる。
　本明細書において、「糖鎖」とは、２つ以上の単糖がグリコシド結合により結合された構造単位を意味する。具体的な単糖や糖鎖を、例えば“ＧｌｃＮＡｃ－”、“ＳＧ－”のように、略号として標記することがある。構造式中でこれらの略号で記載した場合、還元末端で別の構造単位とのグリコシド結合に帰属する酸素原子又は窒素原子は、特別な定義がある場合を除き、当該糖鎖を表す略号には含まれないものとして表示される。
　本明細書において、糖鎖の基本単位となる単糖の記載は、別に定める場合を除き、便宜上、その環構造において、環を構成する酸素原子に結合し、且つ、ヒドロキシ基（又はグリコシド結合に帰属する酸素原子）と直接結合した炭素原子を１位（シアル酸においてのみ２位）として表記する。実施例化合物の名称は、化学構造全体として付されたものであり、このルールは必ずしも適用されない。
　本明細書において、糖鎖を記号（例えば、ＳＧ、ＭＳＧ、ＧｌｃＮＡｃ等）として記載する場合、別に定義される場合を除き、還元末端の炭素までを、当該記号に含めるものとし、Ｎ－又はＯ－グリコシド結合に帰属するＮ又はＯは、当該記号には含まれないものとする。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、次式（ＸＸＸＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 で示され、抗体Ａｂ又はその機能性断片は、そのアミノ酸残基（例えば、システイン、リシン等）の側鎖から直接Ｌに結合するか、Ａｂの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖からＬに結合している。アミノ酸残基の側鎖は、例えばアジド基等で修飾されていてもよい。
ここで、
Ａｂは、抗体又は該抗体の機能性断片を示し、該抗体の糖鎖はリモデリングされていてもよく、
ｍ１は１から１０の範囲であり、
Ｌは、ＡｂとＤを連結するリンカーを示し、
リンカーＬは、－Ｌｂ－Ｌａ－Ｌｐ－Ｌｃ－＊で示され、
　式中、アステリスクは、免疫賦活化剤Ｄと結合していることを示し、
　Ｌｐが、－ＧＧＦＧ－であり、ここで、Ｇはグリシンを示し、Ｆはフェニルアラニンを示し、
　Ｌａが、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－を示し、
　Ｌｂが、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 （上記で示されるＬｂの構造式において、アステリスクはＬａと結合していることを示し、波線はＡｂの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖と結合していることを示す）を示し、
　Ｌｃが、－ＮＨ－ＣＨ２－を示す。
　Ｄは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 を示す。
　本明細書において、Ａｂの糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖やＯ結合型糖鎖であり、好ましくは、Ｎ結合型糖鎖である。
　Ｎ結合型糖鎖はＮグリコシド結合、Ｏ結合型糖鎖はＯグリコシド結合により、抗体のアミノ酸側鎖と結合している。
　本明細書において、Ａｂは、ＩｇＧであり、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である。
　ＩｇＧはその重鎖のＦｃ領域における２９７番目のアスパラギン残基（以下、「Ａｓｎ２９７又はＮ２９７」という）によく保存されたＮ結合型糖鎖（以下、「Ａｓｎ２９７糖鎖又はＮ２９７糖鎖」という）を有しており、抗体分子の活性や動態等に寄与することが知られている（Ｅｏｎ－Ｄｕｖａｌ，Ａ．ｅｔ　ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０１２，２８，６０８－６２２、Ｓａｎｇｌｉｅｒ－Ｃｉａｎｆｅｒａｎｉ，Ｓ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５，７１５－７３６）。
　ＩｇＧの定常領域におけるアミノ酸配列はよく保存されており、Ｅｄｅｌｍａｎらの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６３，７８－８５，（１９６９））において、それぞれのアミノ酸がＥＵ番号（ＥＵ　ＩＮＤＥＸ）で特定されている。例えば、Ｆｃ領域においてＮ結合型糖鎖が付加するＡｓｎ２９７は、ＥＵ番号において２９７位に相当するものであり、分子の断片化や領域欠損によって実際のアミノ酸位置が変動した場合であってもＥＵ番号で表示することによってアミノ酸が一義的に特定される。
　下図は本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートが抗体又はその機能性断片の前記Ｎ２９７糖鎖からＬに結合している場合を示す。ｍ２は１又は２の整数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 　なお、当該リモデリングされた糖鎖を有する抗体を糖鎖リモデリング抗体という。
　ＳＧＰ（α２，６－ＳＧＰ）は、Ｓｉａｌｙｌｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅの略であり、Ｎ結合型糖ペプチドの代表的なものである。ＳＧＰは、例えば、ＷＯ２０１１／０２７８６８に記載の方法に従って、鶏卵の卵黄より単離、精製することができる。また、ＳＧＰの精製品が東京化成工業及び伏見製薬所から販売されている。本明細書において、ＳＧＰの糖鎖部分をＳＧと表記し、ＳＧの還元末端のＧｌｃＮＡｃが１つ欠損した糖鎖をＳＧ（１０）と表記する。ＳＧ（１０）は、例えば、梅川らの報告（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　２０１０，１８００，１２０３－１２０９）を参照して、ＳＧＰの酵素的な加水分解により調製することができる。また、ＳＧ（１０）も東京化成工業及び伏見製薬所から購入することができる。
　本明細書において、ＳＧ（１０）のβ－Ｍａｎの分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をＭＳＧ（９）と表記し、分岐鎖の１－３糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ１、分岐鎖の１－６糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ２、とそれぞれ表記する。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートに使用されるリモデリングされた糖鎖は、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧ、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２、又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１とＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２の混合物であり、好ましくは、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧ、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２であり、より好ましくはＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧ又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１である。
　Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧは以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
　上記式中、波線は抗体のＡｓｎ２９７に結合していることを示し、
　Ｌ（ＰＥＧ）は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ５－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－を示し、該Ｌ（ＰＥＧ）の右端のアミノ基がＮ２９７糖鎖のβ－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側及び１－６鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の２位のカルボキシル基とアミド結合していることを示し、
　アステリスクは、前記リンカーＬ、特にリンカーＬにおけるＬｂの１，２，３－トリアゾール環上の１位又は３位の窒素原子と結合していることを示し、
　ここで、ｎ５は２～１０の整数であり、好ましくは、２～５の整数である。
　Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１は以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
　上記式中、波線は抗体のＡｓｎ２９７に結合していることを示し、
　Ｌ（ＰＥＧ）は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ５－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－を示し、該Ｌ（ＰＥＧ）の右端のアミノ基がＮ２９７糖鎖のβ－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側の非還元末端のシアル酸の２位のカルボキシル基とアミド結合していることを示し、
　アステリスクは、前記リンカーＬ、特にリンカーＬにおけるＬｂの１，２，３－トリアゾール環上の１位又は３位の窒素原子と結合していることを示し、
　ここで、ｎ５は、２～１０の整数であり、好ましくは、２～５の整数である。
　Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２は以下の構造式又は配列式で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
　上記式中、波線は抗体のＡｓｎ２９７に結合していることを示し、
　Ｌ（ＰＥＧ）は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ５－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－を示し、該Ｌ（ＰＥＧ）の右端のアミノ基がＮ２９７糖鎖のβ－Ｍａｎの分岐鎖の１－６鎖側の非還元末端のシアル酸の２位のカルボキシル基とアミド結合していることを示し、
　アステリスクは、前記リンカーＬ、特にリンカーＬにおけるＬｂの１，２，３－トリアゾール環上の１位又は３位の窒素原子と結合していることを示し、
　ここで、ｎ５は２～１０の整数であり、好ましくは、２～５の整数である。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体のＮ２９７糖鎖が、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧである場合、抗体は二量体であるため、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは４つのリンカーＬ及び４つの免疫賦活化剤Ｄが結合された分子（上記ｍ２＝２）となる。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体のＮ２９７糖鎖が、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１もしくはＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２又はそれらの混合物である場合、抗体は二量体であるため、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは２つのリンカーＬ及び２つの免疫賦活化剤Ｄが結合された分子（上記ｍ２＝１）となる（図１９参照）。
　Ｎ２９７糖鎖は、好ましくは、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧもしくはＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２であり、より好ましくは、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧ又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１であり、さらに好ましくはＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧである。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体のＮ２９７糖鎖がＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧもしくはＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２である場合、均一性の高いＡＤＣを取得することができる。
＜４－２．糖鎖リモデリング抗体の製造＞
　糖鎖リモデリング抗体は、例えばＷＯ２０１８／００３９８３、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８、ＷＯ２０２２／０５０３００、ＰＬｏｓ　ＯＮＥ　２０１８，１３，ｅ０１９３５３４などに記載の方法に準じて、次式に示す方法で製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
　（Ｄ－１工程）
　本工程は、目的の抗体に対して、公知の酵素反応を用いて抗体のアミノ酸配列２９７番目のアスパラギンに結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）の還元末端キトビオース構造のＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ間のグリコシド結合を加水分解により切断し、糖鎖切断抗体を製造する工程である。目的の抗体（１）（１０ｍｇ／ｍＬ）を緩衝液（リン酸緩衝液等）中、０℃から４０℃までにおいて、野生型ＥｎｄｏＳ酵素等の加水分解酵素を用いて還元末端のキトビオース構造のＧｌｃＮＡｃβ１と４ＧｌｃＮＡｃ間のグリコシド結合の加水分解反応を実施した。反応時間は１０分から７２時間、好ましくは１時間から６時間である。野生型ＥｎｄｏＳ酵素は抗体（１）１００ｍｇに対して、０．１ｍｇから１０ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから３ｍｇを用いた。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ　ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＦＦ（５ｍｌ）（ＧＥヘルスケア製））及び／又はハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　Ｍｉｎｉ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ　Ｉカートリッジ（５ｍｌ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ製））で精製し、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ抗体（２）を得た。
　（Ｄ－２工程）
　本工程は、Ｄ－１工程で得られた（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ抗体（２）に対し、公知の酵素反応を用いてアジド基を含むＰＥＧリンカーを有するＳＧ型又はＭＳＧ（ＭＳＧ１、ＭＳＧ２）型糖鎖オキサゾリン体（以下、「アジド糖鎖オキサゾリン体」）を結合させ、糖鎖リモデリング抗体（３）を製造する工程である。
　抗体（２）を緩衝液（リン酸緩衝液等）中、０℃から４０℃までにおいて、ＥｎｄｏＳ（Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ）等の糖転移酵素存在下、アジド糖鎖オキサゾリン体と反応させることで、糖鎖転移反応を実施した。反応時間は１０分から７２時間、好ましくは１時間から６時間である。ＥｎｄｏＳ酵素（Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ）は抗体１００ｍｇに対して、１ｍｇから１０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから３ｍｇを用い、アジド糖鎖オキサゾリン体は２当量から過剰当量、好ましくは４当量から２０当量用いた。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ　ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＦＦ（５ｍｌ）（ＧＥヘルスケア製））及びハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　Ｍｉｎｉ　ＣＨＴ　Ｔｙｐｅ　Ｉカートリッジ（５ｍｌ）（ＢＩＯ－ＲＡＤ製））で精製し、糖鎖リモデリング抗体（３）を得た。
　上記の糖鎖リモデリング抗体の調製において、抗体水溶液の濃縮、濃度測定、並びにバッファー交換は、後述の共通操作ＡからＣに従って行うことができる。
　なお、ＳＧ型のアジド糖鎖オキサゾリン体はＷＯ２０１８／００３９８３に記載の方法に準じて合成した。一例として［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０）－Ｏｘ（ＷＯ２０１８／００３９８３に記載の化合物１－１０）の合成方法を次式に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
　ＭＳＧ型のアジド糖鎖オキサゾリン体もＷＯ２０１８／００３９８３に記載の方法に準じて合成した。一例として［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ（ＷＯ２０１８／００３９８３に記載の化合物１－１１）の合成方法を次式に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
　（Ｄ－３工程）
　本工程は、Ｄ－１工程で得られた（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ抗体（２）に対し、２種類のＥｎｄｏ酵素を使用した糖鎖転移反応により、糖鎖リモデリング抗体（３）を製造する工程である。２種類の酵素を同時に用いることで、還元末端が活性化されていないＳＧＰや（ＳＧ）Ａｓｎなどを糖鎖ドナーとして、抗体のＮ２９７糖鎖へ、直接糖鎖転移させることができる。
使用する２種類のＥｎｄｏ酵素に関して、酵素Ａ（ＥｎｄｏＭ様酵素）及び酵素Ｂ（ＥｎｄｏＳ様酵素）を適切に組合せることができる。
酵素Ａとしては、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＯｍ、ＥｎｄｏＣＣとその加水分解活性を低下させたＥｎｄｏＭ変異体、ＥｎｄｏＯｍ変異体、ＥｎｄｏＣＣ変異体などを例示できる。酵素Ａとして好ましいものは、ＥｎｄｏＭ　Ｎ１７５Ｑ、ＥｎｄｏＣＣ　Ｎ１８０Ｈ、ＥｎｄｏＯｍ　Ｎ１９４Ｑである。
酵素Ｂとしては、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２（ＥｎｄｏＳ４９）及びそれらの加水分解活性を低下させたＥｎｄｏＳ変異体、　ＥｎｄｏＳ２（ＥｎｄｏＳ４９）変異体などを例示できる。酵素Ｂとして好ましいものは、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ　、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ、ＥｎｄｏＳ２　Ｄ１８４Ｍ、ＥｎｄｏＳ２　Ｔ１３８Ｑなどである。
糖鎖ドナーとしては、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３などを用いることができる。
　抗体（２）を緩衝液（トリス緩衝液等）中、酵素Ａ（ＥｎｄｏＭ様酵素）及び酵素Ｂ（ＥｎｄｏＳ様酵素）の糖転移酵素存在下、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と反応させることで、糖鎖転移反応を実施した。反応温度は、用いる酵素の至適温度に応じて適宜選択することができるが、通常１５～５０度であり、好ましくは、２５～４０度である。反応時間は、２時間～４８時間の間で、適宜選択できる。
反応終了後、反応スケールに適した精製方法（アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムなど）や限外ろ過方法（限外ろ過膜）を選択し、糖鎖リモデリング抗体（３）を得た。
　上記の糖鎖リモデリング抗体の調製において、抗体水溶液の濃縮、濃度測定、並びにバッファー交換は、後述の共通操作ＡからＣに従って行うことができる。
　なお、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３は、ＷＯ２０１８／００３９８３に記載の方法に準じて合成した。ＷＯ２０１８／００３９８３に記載の工程１－２Ａにおいて、Ｆｍｏｃ－（ＳＧ－）Ａｓｎ　（１Ｓ２Ｓ－１１ＮＣ－Ａｓｎ－Ｆｍｏｃ、糖鎖工学研究所製)から調製したＦｍｏｃ－（ＳＧ－）Ａｓｎフリー体と１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミンと反応させて（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３（ＷＯ２０１８／００３９８３に記載の化合物１－１３）を得た。
　ＭＳＧ型の糖鎖ドナー［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３もＷＯ２０１９０６５９６４の実施例１５４の工程１から工程３に記載の方法に準じて合成できる。
＜４－３．抗体と免疫賦活化剤のコンジュゲーション＞
　式（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、以下の方法に従って製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
 （ここで、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）の左側の２つのアステリスク（＊）は右側のアステリスクで示されるＣＤＮ－リンカー部分を示す。）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）は、糖鎖リモデリング抗体（３）とＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）を環化付加反応により結合させ、製造することができる。環化付加反応としては、例えばＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応、及び１，３－双極子環化付加反応が挙げられ、好ましくは１，３－双極子環化付加反応を用いて製造する。１，３－双極子環化付加反応としては、例えば、アジドと末端アルキンとの環化付加反応、及びＳＰＡＡＣ（歪み促進型アジド－アルキン付加環化反応　ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１５０４６－１５０４７）反応が挙げられ、好ましくはＳＰＡＡＣ反応を用いて製造する。
　本製造法は、上記のＤ－２工程又はＤ－３工程で得られた糖鎖リモデリング抗体（３）とＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）をＳＰＡＡＣ反応により結合させ、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）を製造する方法である。
　（Ｅ－１工程）（工程ａ９）
　糖鎖リモデリング抗体（３）の緩衝溶液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等）と、ＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）を適当な溶媒（ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、プロピレングリコール又はそれらの混合溶媒）に溶解させた溶液を混合することで、ＳＰＡＡＣ反応を実施した。ＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）は、糖鎖リモデリング抗体（３）１モルに対して、２モルから過剰モル、好ましくは４モルから３０モルであり、有機溶媒の比率は、抗体の緩衝溶液に対し１％から２００％（ｖ／ｖ）が好ましい。反応温度は０℃から３７℃、好ましくは１５℃から２５℃であり、反応時間は１時間から１５０時間、好ましくは６時間から７２時間である。反応溶液のｐＨは５から９が好ましい。反応溶液を後述の共通操作Ｄに記載の方法に従って精製し、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）を得た。
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、後述の共通操作ＤからＧによってバッファー交換、精製、抗体濃度の測定及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定を行い、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの同定を行うことができる。
　共通操作Ａ：抗体水溶液の濃縮
　Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターデバイス（５０，０００　ＮＭＷＬ，Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｌｔｄ．）に抗体又は抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ　Ｘ－１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心操作（２０００Ｇから４０００Ｇで５分間から２０分間遠心）により、抗体及び抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液を濃縮した。
　共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
　ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ　１０００，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１から１．８ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１）を用いた。
　共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
　抗体水溶液に緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等）を加え、共通操作Ａに記載の方法に従って濃縮した。この操作を数回行った後、共通操作Ｂに記載の方法に従って抗体濃度を測定した。この抗体緩衝溶液に、適宜緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等）を加えて、目的の濃度（例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ）の抗体緩衝溶液を調製した。
　共通操作Ｄ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの精製（ゲル濾過クロマトグラフィー）
　酢酸緩衝液（１０ｍＭ　Ａｃｅｔａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ，５％　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，ｐＨ５．５；本明細書ではＡＢＳと称する）又はそれ以外の適当な緩衝液でＮＡＰカラム（ＮＡＰ－５，ＮＡＰ－１０，ＮＡＰ－２５（ＧＥヘルスケア製））を平衡化させた。このＮＡＰカラムに、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート反応溶液をチャージし、メーカー規定量の緩衝液を自然流下させ、抗体画分を分取した。この画分を再度ＮＡＰカラムにチャージし、メーカー規定量の緩衝液を自然流下させ、抗体画分を分取した。この操作を合計２回から３回繰り返すことで、未結合の免疫賦活化剤リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを得た。必要に応じて、共通操作Ａ及びＣにより抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液の濃度を調節した。
　共通操作Ｅ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（ＵＶ法）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける結合免疫賦活化剤濃度は、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて、吸光光度計（ＵＶ／ＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　２５，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍ及び２５０ｎｍの二波長における吸光度を測定することにより算出することができる。
　共通操作Ｆ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（逆相高速液体クロマトグラフィー法：ＲＰ－ＨＰＬＣ）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数は、前述の共通操作Ｅに加え、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて高速液体クロマトグラフィー分析によって求めることができる。
　共通操作Ｇ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（疎水性相互作用－高速液体クロマトグラフィー法：ＨＩ－ＨＰＬＣ）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数は、前述の共通操作Ｅ及びＦに加え、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて高速液体クロマトグラフィー分析によって求めることができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート又はその製造中間体には、立体異性体あるいは不斉炭素原子に由来する光学異性体、幾何異性体、互変異性体又はｄ体、ｌ体、アトロプ異性体等の光学異性体が存在することもあるが、これらの異性体、光学異性体及びこれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおいて、抗体１分子への免疫賦活化剤の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造は、免疫賦活化剤の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の免疫賦活化剤が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体１分子への免疫賦活化剤の結合数は平均値、すなわち、平均免疫賦活化剤結合数（ＤＡＲ：Ｄｒｕｇ　ｔｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒａｔｉｏ）として特定することができる。抗体分子への環状ジヌクレオチド誘導体の結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの免疫賦活化剤平均結合数として、１から１０の範囲の環状ジヌクレオチド誘導体を結合させることができるが、好ましくは１から８個であり、より好ましくは１から５個である。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおいて、抗体Ａｂが、抗体Ａｂのリモデリングされた糖鎖からＬに結合している場合、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体１分子あたりの免疫賦活化剤結合数ｍ２は１または２の整数である。当該糖鎖がＮ２９７糖鎖であり、糖鎖がＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧの場合、ｍ２は２であり、ＤＡＲは３～５の範囲（好ましくは、３．２～４．８の範囲であり、より好ましくは、３．５～４．２の範囲）である。Ｎ２９７糖鎖がＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１とＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２の混合物の場合、ｍ２は１であり、ＤＡＲは１～３の範囲（好ましくは、１．０～２．５の範囲、より好ましくは、１．２～２．２の範囲）である。
　なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の免疫賦活化剤を結合させる反応を設計することができ、環状ジヌクレオチド誘導体の結合数をコントロールした抗体を取得することができる。
　なお、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート又はその製造中間体は、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合が有り、そのような水を含む化合物及び塩も本発明に包含される。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート又はその製造中間体が、アミノ基等の塩基性基を有する場合、所望により医薬的に許容される塩とすることができる。そのような塩としては、例えば塩酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のアリ－ルスルホン酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸塩を挙げることができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート又はその製造中間体が、リン酸基及び／又はチオリン酸基をその構造に含むため、一般的に塩基付加塩を形成することが可能である。また、その製造中間体が、カルボキシ基等の酸性基を有する場合も、一般的に塩基付加塩を形成することが可能である。医薬的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ｔｅｒｔ－ブチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－Ｎ－（２－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機アミン塩、等を挙げることができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及びその製造中間体は、空気中の水分を吸収すること等により水和物として存在することもある。本発明の溶媒和物としては、医薬的に許容し得るものであれば特に限定されないが、具体的には、水和物、エタノール和物、２－プロパノール和物等が好ましい。また、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及びその製造中間体中に窒素原子が存在する場合にはＮ－オキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びＮ－オキシド体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及びその製造中間体中に硫黄原子が存在する場合にはスルホキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びスルホキシド体も本発明の範囲に含まれる。
　また、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及びその製造中間体には、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含される。本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及びその製造中間体を構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）または炭素－１４（１４Ｃ）等を挙げることができる。また、本発明化合物は、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）または炭素－１４（１４Ｃ）のような放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療または予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
＜５．医薬＞
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、がん細胞に対して抗腫瘍免疫活性又は細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特にがんに対する治療剤及び／又は予防剤、又は抗腫瘍剤として使用することができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートが適用されるがんの種類としては、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん等）、腎がん、尿路上皮がん、大腸がん、前立腺がん、多形神経膠芽腫、卵巣がん（表層上皮性腫瘍、間質性腫瘍、胚細胞腫瘍等）、膵がん、乳がん、メラノーマ、肝がん、膀胱がん、胃がん、食道がん、子宮体がん、精巣がん（セミノーマ、非セミノーマ）、子宮頸がん、胎盤絨毛がん、脳腫瘍、頭頚部がん、甲状腺がん、中皮腫、消化管間質腫瘍（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｔｕｍｏｒ、ＧＩＳＴ）、胆のうがん、胆管がん、副腎がん、咽頭がん、舌がん、聴器がん、胸腺がん、小腸がん、有棘細胞がん、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨髄腫、肉腫等を挙げることができるが、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートについては、治療対象となるがん細胞において抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート中の抗体が認識できる蛋白質を発現しているがん細胞であればこれらには限定されることはない。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、１種以上の薬学的に適合性の成分を含む医薬組成物として投与され得る。例えば、上記医薬組成物は、代表的には、１種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水および油（石油、動物、植物、または合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など））を含む））を含む。水は、上記医薬組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
　種々の送達システムが公知であり、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入またはボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
　代表的実施形態において、上記抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを含む医薬組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどに密封してシールされた容器中の凍結乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個に、または単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬組成物が注入によって投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。上記医薬組成物は、溶液として提供される場合もある。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを含む医薬組成物は本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート及び他の癌治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、他の癌治療剤と共に投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の癌治療剤は、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような癌治療剤として、代謝拮抗剤、アルキル化剤、微小管阻害剤等の化学療法剤（ａｂｒａｘａｎｅ、ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ－１１）、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｄｏｃｅｔａｘｅｌ、ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ、ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ又は国際公開第ＷＯ２００３／０３８０４３号パンフレットに記載の薬剤等）、ホルモン調整薬（ＬＨ－ＲＨアナログであるリュープロレリン等、ゴセレリン、エストラムスチン、エストロジェン拮抗薬であるタモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）、キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、骨破壊抑制剤、骨形成促進剤、転移抑制剤、分子標的薬（抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体等）、免疫チェックポイント阻害薬（抗ＰＤ－１抗体であるニボルマブ、ペンブロリズマブ等、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるアテゾリズマブ、アベルマブ、デゥルバルマブ等、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブ等、抗Ａ２ａＲ抗体、Ａ２ａ受容体アンタゴニスト、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体等）、抗制御性Ｔ細胞薬（抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＧＡＲＰ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＣＲ８抗体等）、免疫活性化剤（抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ－２アナログ、サイトカイン、ＴＬＲアゴニスト等）、免疫調節剤（抗ＣＤ４７抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抑制性ミエロイド調整剤等）、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性、ＡＤＣＰ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性または補体活性をもつ抗体医薬、ＢｉＴＥ（Ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｅｎｇａｇｅｒｓ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）（例えば、Ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ、ＤＭ１、Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ、ＭＭＡＦ等を含む薬剤コンジュゲート（抗ＨＥＲ２－ＡＤＣ、抗ＴＲＯＰ２－ＡＤＣ、抗ＨＥＲ３－ＡＤＣ等））、光力学療法を組み合わせたＡＤＣ等、さらに抗腫瘍ワクチン、抗腫瘍細胞治療（ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔ、樹状細胞、ＮＫ細胞等）、抗腫瘍細菌治療、抗腫瘍ウイルス治療等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。さらに、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、本発明の他の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートと共に投与することもでき、これによって抗腫瘍効果を増強させることができる。また、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは免疫賦活化剤だけでなく、抗腫瘍効果をもたらす治療、例えば放射線、重量子線、外科的手術、骨髄移植等との併用によって抗腫瘍効果を増強させることができるが、抗腫瘍効果を有する治療であれば限定されることはない。
　このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
　医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを含む医薬組成物に含まれる抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Ｋｄ値）の点において、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇを１回あるいは１～１８０日間に１回の間隔で複数回投与すればよい。
　以下本発明を実施例にて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下において、「化合物（１Ａ）」又は合成スキーム中の「（１Ａ）」は、「式（１Ａ）の化合物」に対応することを示し、それ以降の化合物番号についても同様である。
　以下の実施例において、別個の規定がある場合を除き、室温は１５℃乃至３５℃を示す。脱水ジクロロメタンは富士フイルム和光純薬から販売されているジクロロメタン（超脱水）を用いた。脱水アセトニトリルは、富士フイルム和光純薬から販売されているアセトニトリル（超脱水）を用いた。脱水ピリジンは、関東化学から販売されているピリジン（脱水）を用いた。シリカゲルクロマトグラフィーはＢｉｏｔａｇｅ　Ｓｆａｒ　ＨＣ　Ｄ（２０μｍ，Ｂｉｏｔａｇｅ製）、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーはＢｉｏｔａｇｅ　Ｓｆａｒ　Ａｍｉｎｏ　Ｄ（５０μｍ，Ｂｉｏｔａｇｅ製）、分取ＨＰＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　ＨＰＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いて実施した。分取カラムは、ＸＢｒｉｄｇｅ　Ｐｒｅｐ　ＯＢＤ（５μｍ，Ｃ１８，１３０Å，２５０×３０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ製）を用いた。
　各種スペクトルデータの測定には以下の機器を用いた。１Ｈ－ＮＭＲ及び３１Ｐ－ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ製ＥＣＺ５００Ｒを用いて測定した。マススペクトルはＳｈｉｍａｄｚｕ　ＬＣＭＳ－２０１０及びＬＣＭＳ－２０２０（島津製作所製）を用いて測定した。
＜１．原料化合物の合成＞
１－１．原料化合物（１Ａ）の合成
　ＣＤＮの合成スキームＡ－１、Ａ－２及びＢ－１に用いる原料化合物（１Ａ）を、以下の合成スキーム１に従って、合成した。
　［合成スキーム１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
参考例１：
［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メチル　アセテート　（化合物（ＸＶＩＩＩ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
（工程１）
　グリシルグリシン（６０ｇ、０．４５ｍｏｌ）、トリエチルアミン（６９ｇ、０．６８ｍｏｌ）、水（６００ｍＬ）、テトラヒドロフラン（６００ｍＬ）の溶液を０℃に冷却後、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］スクシンイミド（１３０ｇ、０．５０ｍｏｌ）を添加し、２５℃で２２時間撹拌した。反応液を減圧下、９００ｍＬまで濃縮後、酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加した。トリエチルアミン（６９ｇ、０．６８ｍｏｌ）を添加、撹拌した後、有機層を廃棄した。得られた水層に酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加し、濃塩酸（１１６ｇ）を添加した。水層を除去したのち、得られた有機層を１０ｗｔ％食塩水（６００ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を減圧下で濃縮し、Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシルグリシンの酢酸エチル溶液（１２０ｍＬ）を得た。
（工程２）
　四酢酸鉛（３０２ｇ、０．６８ｍｏｌ）、酢酸（３６０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（６００ｍＬ）の溶液を３５℃に加温後、Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシルグリシンの酢酸エチル溶液（１２０ｍＬ）にテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）を添加した溶液を滴下した。３５℃で１時間撹拌した後、析出物を濾取して、酢酸エチル（６００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を２０ｗｔ％くえん酸三ナトリウム二水和物水溶液（３００ｍＬ）で７回洗浄した。得られた有機層に２０ｗｔ％食塩水（１８０ｍＬ）を添加後、２５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液を適量添加してｐＨを６．５とした。水層を廃棄し、得られた有機層を減圧下、約６００ｍＬまで濃縮した。１，２－ジメトキシエタン（１２００ｍＬ）を添加し、減圧下で約６００ｍＬまで濃縮した。この操作を再度実施し、目的化合物の１，２－ジメトキシエタン溶液（約６００ｍＬ）を得た。
参考例２：
Ｎ－［（２－ブロモエトキシ）メチル］－Ｎ２－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシンアミド　（化合物（ＸＶ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
（工程３）
　参考例１で得られた化合物の１，２－ジメトキシエタン溶液（約６００ｍＬ）に１，２－ジメトキシエタン（３００ｍＬ）を添加し、室温下で２－ブロモエタノール（１１４ｇ、０．９１ｍｏｌ）を添加した。０℃に冷却した後、１０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（６６ｇ、０．５０ｍｏｌ）を添加し、３．５時間撹拌した。反応液に酢酸（４１ｇ、０．６８ｍｏｌ）を添加した。さらに水（３００ｍＬ）を添加して、目的化合物（６０ｍｇ）の種結晶を加えて、水（６００ｍＬ）を添加した。得られた懸濁液から結晶を濾取し、５０％含水１，２－ジメトキシエタン（３６０ｍＬ）で結晶を洗浄した。結晶を４０℃で終夜乾燥して、目的化合物を白色結晶（１５ｇ、収率８０％）として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ８．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），４．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．０６－４．０１（２Ｈ，ｍ），３．６９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．５８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），０．９５－０．９０（２Ｈ，ｍ），０．０２（９Ｈ，ｓ）．
参考例３：
５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］イノシン　（化合物（ＸＩＶ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
（工程４）
　イノシン（５．０ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）、ピリジン（３０ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）の溶液に窒素気流下、室温で４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（７．０ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を添加した。２時間撹拌後、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１．３ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を追加した。４時間撹拌後、反応液に５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、トルエン（５０ｍＬ）、２０ｗｔ％食塩水（２５ｍＬ）を添加した。水層を廃棄し、有機層に５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、２０ｗｔ％食塩水（２５ｍＬ）を添加した。水層を廃棄後、有機層を２０ｗｔ％食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得られた有機層を減圧下、約２０ｍＬまで濃縮して得られた溶液に酢酸エチル（１００ｍＬ）を滴下した。５０℃で１時間撹拌後、室温に冷却して終夜撹拌した。得られた懸濁液から結晶を濾取し、酢酸エチル（４０ｍＬ）で洗浄した。結晶を減圧下、４０℃で乾燥して目的化合物を白色結晶（９．０ｇ、収率８５％）として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．３９（１Ｈ，ｂｒｓ），８．１９（１Ｈ，ｓ），８．００（１Ｈ，ｓ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２４－７．１８（５Ｈ，ｍ），６．８６－６．８１（４Ｈ，ｍ），５．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），５．６０（１Ｈ，ｂｒｓ），５．２３（１Ｈ，ｂｒｓ），４．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ）４．２４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．０６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７３（６Ｈ，ｓ），３．２３－３．１７（２Ｈ，ｍ）．
参考例４：
５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシンの１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン　（化合物（ＸＶＩ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
（工程５）
　参考例３で得た化合物（３．０ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、参考例２で得られたＮ－［（２－ブロモエトキシ）メチル］－Ｎ２－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシンアミド（５．６ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（３０ｍＬ）の溶液に３５－４０℃に加熱した。１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（１．５ｍＬ、１１．８ｍｍｏｌ）を滴下した。３５－４０℃で１６時間撹拌した後、室温まで冷却した。トルエン（４５ｍＬ）、１０ｗｔ％食塩水（３０ｍＬ）を添加して撹拌した後、水層を廃棄した。１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（１５ｍＬ）、１０ｗｔ％食塩水（１５ｍＬ）を添加して撹拌した後、水層を廃棄した。得られた有機層を１０ｗｔ％食塩水（３０ｍＬ）で２回洗浄し、減圧下、約１５ｍＬまで濃縮した。濃縮液に１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（１５ｍＬ）を添加、減圧下で濃縮して、目的化合物の１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン溶液（約２４ｍＬ）を得た。
参考例５：
５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－３’－Ｏ－［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシン　（式（１Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
（工程６）
　参考例４で得られた化合物の１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン溶液（約２４ｍＬ）に１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（１５ｍＬ）を添加し、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（４．０ｍＬ、３１．５ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルクロロシラン（２．２ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を添加した。５５－６０℃に加温し、７時間撹拌した後、室温まで冷却した。反応液にトルエン（６０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を添加し、撹拌した。水層を廃棄し、得られた有機層を減圧下、約１５ｍＬまで濃縮した。濃縮液にテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を添加し、減圧下、約１５ｍＬまで濃縮した。同様の操作を２回繰り返し、５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－３’－Ｏ－（２，３，３－トリメチルブタン－２－イル）－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシン（目的化合物）と５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－２’－Ｏ－（２，３，３－トリメチルブタン－２－イル）－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシンの混合物（６：４）のテトラヒドロフラン溶液（約１５ｍＬ）を得た。テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（０．０７ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）、目的化合物の結晶（１．０ｍｇ）を添加した。２５℃で３０分撹拌した後、ｎ－ヘプタン（３０ｍＬ）を添加し、２５℃で終夜撹拌した。得られた懸濁液から結晶を濾取し、テトラヒドロフラン／ｎ－ヘプタン（１／１、３０ｍＬ）で結晶を洗浄した。結晶を減圧下で乾燥し、目的化合物を白色結晶（３．７ｇ、収率７３％）として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９９（１Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．４２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．３３－７．２９（４Ｈ，ｍ），７．２９－７．２４（３Ｈ，ｍ），７．２３－７．１９（１Ｈ，ｍ），７．０８－７．０１（１Ｈ，ｍ），６．８３－６．７８（４Ｈ，ｍ），５．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．４６（１Ｈ，ｂｒｓ），４．７０－４．６５（１Ｈ，ｍ），４．６４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，３．７Ｈｚ），４．１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ）４．１８－４．１２（３Ｈ，ｍ），３．８１－３．７６（８Ｈ，ｍ），３．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．４Ｈｚ），３．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．０Ｈｚ），３．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），０．９９－０．９３（２Ｈ，ｍ），０．８９（９Ｈ，ｓ），０．０９（３Ｈ，ｓ），０．０２（９Ｈ，ｓ），０．０１（３Ｈ，ｓ）．
１－２．原料化合物（ＸＸＩＩＩ）の合成
　化合物（ＸＸＶ・ＴｓＯＨ）の合成スキーム３に用いる原料化合物（ＸＸＩＩＩ）を、以下のスキーム２に従って、合成した。
　［合成スキーム２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
参考例６：
ｔｅｒｔ‐ブチル－４－アミノ－５－ヨード－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－７－カルボキシレート　（式（ＸＸＸＩＩ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
（工程１）
　５－ヨード－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－アミン（３１８．５ｇ，１．２２５ｍｏｌ）のトルエン（１７５０ｍＬ）溶液に二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（２９４．１ｇ，１．３４７ｍｏｌ）、１－メチルイミダゾール（５０．２８ｇ，０．６１２ｍｏｌ）を加え、室温で６時間攪拌した。反応液にヘプタン（７０００ｍＬ）を滴下し、室温で１０分間撹拌した後、０℃まで冷却し、１時間撹拌した。析出した結晶をろ過し、トルエン／ヘプタン（２８０ｍＬ／１１２０ｍＬ）混合液で洗浄後、４０℃にて減圧乾燥し目的化合物（４１５．７ｇ，１．１５４ｍｏｌ，収率９４．２％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６１［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４６（１Ｈ，ｓ），７．５５（１Ｈ，ｓ），５．８１（２Ｈ，ｂｒｓ），１．６５（９Ｈ，ｓ）．
参考例７：
ｔｅｒｔ‐ブチル－４－アミノ－５－（３，３－ジエトキシプロパ－１－イン－１－イル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－７－カルボキシレート　（式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
（工程２）
　参考例６で得られた化合物（２８５．４ｇ，０．７９２ｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５００ｍＬ）溶液を減圧下にて脱気操作を行った後、ヨウ化銅（I）（１．５１ｇ，０．００７９ｍｏｌ）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジクロリド（３．８９ｇ，０．００５５ｍｏｌ）、プロパルギルアルデヒドジエチルアセタール（１８２．８ｇ，１．４２６ｍｏｌ）、トリエチルアミン（２４０．５ｇ，２．３７７ｍｏｌ）を加え、室温で１８．５時間攪拌した。反応液にトルエン（６０００ｍＬ）、１０％塩化アンモニウム水溶液（１５００ｍＬ）を加えて撹拌し、分液して水層を取り除いた。得られた有機層を１０％塩化アンモニウム水溶液（１５００ｍＬ）で２回、２０％塩化ナトリウム水溶液（１５００ｍＬ）で１回洗浄した。活性炭（３０ｇ）を加えて室温で約２時間撹拌した後、活性炭をろ別し、活性炭をトルエン（６００ｍＬ）で洗浄してろ液を合致し、１５００ｍＬまで減圧濃縮した。ヘプタン（６０００ｍＬ）を滴下し、室温で約１０分間撹拌した後、０℃まで冷却し、１時間撹拌した。析出した結晶をろ過し、トルエン／ヘプタン（２４０ｍＬ／９６０ｍＬ）混合液で洗浄後、４０℃にて減圧乾燥し目的化合物（２６９．９ｇ，０．７４９ｍｏｌ，収率９４．６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３６１［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４７（１Ｈ，ｓ），７．６０（１Ｈ，ｓ），５．７１（２Ｈ，ｂｒｓ），５．４９（１Ｈ，ｓ），３．８１（２Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．５，７．５Ｈｚ），３．６７（２Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝９．５，７．５Ｈｚ），１．６５（９Ｈ，ｓ），１．２８（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
参考例８：
５－（３，３－ジエトキシプロパ－１－イン－１－イル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－アミン　（式（ＸＸＩＸ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
（工程３）
　参考例７で得られた化合物（２５０．０ｇ，０．６９４ｍｏｌ）のエタノール（１５００ｍＬ）溶液に４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液（２６０．１ｍＬ，１．０４０ｍｏｌ）を加え、室温で約１．５時間撹拌した。反応液に水（１５００ｍＬ）を加えた後、２Ｍ塩酸でｐＨを７．５に調整し、室温で約４５分間撹拌した。続いて、水（３０００ｍＬ）を滴下し、室温で２時間撹拌した。析出した結晶をろ過し、エタノール／水（２５０ｍＬ／７５０ｍＬ）混合液、０℃に冷却したアセトニトリル（１０００ｍＬ）で洗浄した。得られた結晶を４０℃にて減圧乾燥し目的化合物（１５２．５ｇ，０．５８６ｍｏｌ，収率８４．４％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２６１［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．０１（１Ｈ，ｂｒｓ），８．０９（１Ｈ，ｓ），７．５５（１Ｈ，ｓ），６．５０（２Ｈ，ｂｒｓ），５．５８（１Ｈ，ｓ），３．６８（２Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝１０．０，７．５Ｈｚ），３．５８（２Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝１０．０，７．５Ｈｚ），１．１６（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）．
参考例９：
６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン　（式（ＸＸＸ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
（工程４）
　参考例８で得られた化合物（６３．０ｇ，０．２４２ｍｏｌ）の１－メチルピロリドン（１８９ｍＬ）混合物に、５％パラジウム炭素（１３．４ｇ，水分５３．２％）を加え、水素雰囲気下（３００ｋＰａ）、４０℃で約２時間撹拌した。反応系内を窒素置換し、酢酸（６３０ｍＬ）、水（３２ｍＬ）及び５％パラジウム炭素（１３．４ｇ，水分５３．２％）を加え、水素雰囲気下（３００ｋＰａ）、５０℃で約２１時間撹拌した。反応系内を窒素置換し、水（３００ｍＬ）を加えてからパラジウム炭素をろ別し、パラジウム炭素を酢酸（１５０ｍＬ）、水（１５０ｍＬ）の混合液で洗浄後、ろ液を５５０ｍＬまで減圧濃縮した。５０℃で水（６２０ｍＬ）及び４８％水酸化カリウム水溶液２０ｍＬ）を滴下し、０～５℃に冷却して約２０時間撹拌した。析出物をろ過し、ろ別した結晶を冷却した１－メチルピロリドン／水（３６ｍＬ／１４４ｍＬ）混合液で洗浄し、さらに水（３２０ｍＬ）で洗浄した。得られた結晶を減圧下５０℃で乾燥し、目的化合物（３７．０ｇ，０．２１２ｍｏｌ，収率８７．８％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１７５［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．２４（１Ｈ，ｓ），７．３４（１Ｈ，ｓ），６．８６（１Ｈ，ｓ）３．３４－３．３８（２Ｈ，ｍ），２．８０（２Ｈ，ｂｒｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．４９－２．５１（２Ｈ，ｍ），１．８５－１．９１（２Ｈ，ｍ）．
参考例１０：
フェニル（２，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－６－イル）メタノン　（式（ＸＸＩＩＩ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
（工程５）
　参考例９で得られた化合物（４．０ｇ，２３．０ｍｍｏｌ）の１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（４０ｍＬ）の混合物に、トリエチルアミン（１０．６ｍＬ，７５．９ｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（２８０ｍｇ，２．３ｍｍｏｌ）を室温で加えた後、０～５℃に冷却してベンゾイルクロリド（８．３ｍＬ，７２．０ｍｍｏｌ）を加えた。約２１時間撹拌した後、反応液にメタノール（２０ｍＬ）、トリエチルアミン（１２．０ｍＬ）を加え、約２３時間撹拌した。酢酸（６．７ｍＬ）、水（１０２ｍＬ）を添加し、０～５℃で約２時間撹拌した。析出物をろ過し、ろ別した粉末を冷却したアセトニトリル／水（２ｍＬ／１８ｍＬ）混合溶液で洗浄した。得られた粉末をアセトニトリル（４０ｍＬ）に懸濁させ、０～５℃で約１時間撹拌した。析出物をろ過し、ろ別した粉末を冷アセトニトリル（１０ｍＬ）で洗浄した。得られた粉末を減圧下５０℃で乾燥し、目的化合物（５．１３ｇ，１８．４ｍｍｏｌ，収率８０．０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２７９［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．９９（１Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．３２－７．３９（４Ｈ，ｍ），４．１８（２Ｈ，ｍ），２．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．１２－２．１８（２Ｈ，ｍ）．
１－３．原料化合物（ＸＸＶ・ＴｓＯＨ）の合成
　ＣＤＮの合成スキームＡ－１に用いられる原料化合物（ＸＸＶ・ＴｓＯＨ）を、以下のスキーム３に従って、合成した。
［合成スキーム３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
参考例１１：
２’－デオキシ－２’－フルオロ－３，４，５，６－テトラヒドロウリジンの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
（工程１）
　１Ｌオートクレーブに２’－デオキシ－２’－フルオロウリジン（７０．０ｇ，２８．４ｍｍｏｌ）、メタノール（４２０ｍＬ）を加え、５％パラジウム炭素（１３．５７ｇ，水分５２．２％）を添加し、水素雰囲気下（３００ｋＰａ）、５０℃で７時間攪拌した。反応系内を窒素置換後、パラジウム炭素をろ過し、メタノール／水（１８９ｍＬ／２１ｍＬ）混合液で洗浄した。ろ液を２１０ｍＬ以下まで減圧濃縮し、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（３５０ｍＬ）、トルエン（３５０ｍＬ）を加えて３５０ｍＬまで減圧濃縮した。その後トルエン（３５０ｍＬ）を加えて再び３５０ｍＬまで減圧濃縮した。同様の操作をさらに２回繰返し、目的化合物を得た。
参考例１２：
３’，５’－ジ－Ｏ－ベンゾイル－２’－デオキシ－２’－フルオロ－３，４，５，６－テトラヒドロウリジン　（化合物（ＸＩＸ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
（工程２）
　参考例１１で得られたＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液（３４０ｍＬ）に、ピリジン（７６．５ｇ，９６．７ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下にて、塩化ベンゾイル（８５．４ｇ，６０．５ｍｍｏｌ）を滴下後、混合物を室温下にて２．５時間撹拌した。反応混合物に水（６．８ｍＬ）、２－プロパノール（４０８ｍＬ）を添加後、５０℃に昇温し、水（１０２ｍＬ）を滴下した。同温度で３０分攪拌後、水（１３６ｍＬ）を添加し３０分攪拌した後、室温まで冷却して２２時間攪拌した。０℃に冷却し１時間攪拌した後析出した結晶をろ過し、２－プロパノール／水（２０４ｍＬ／１２２ｍＬ）混合液で洗浄後、４０℃にて減圧乾燥し目的化合物（１１７．２ｇ，２５．７ｍｍｏｌ，収率９３．０％）を白色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４５７［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０５（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２３．５，８．０Ｈｚ），７．６２－５．５６（２Ｈ，ｍ），７．４８－７．４１（４Ｈ，ｍ），７．３８－７．３２（１Ｈ，ｍ），５．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２２．３，２．３Ｈｚ），５．５４－５．３７（２Ｈ，ｍ），４．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，２．９Ｈｚ），４．５９－４．４９（２Ｈ，ｍ），３．５３－３．４４（２Ｈ，ｍ），２．６９－２．５８（２Ｈ，ｍ）．
参考例１３：
３－ベンゾイル－３’，５’－ジ－Ｏ－ベンゾイル－２’－デオキシ－２’－フルオロ－３，４，５，６－テトラヒドロウリジン　（化合物（ＸＸ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
（工程３）
　参考例１２で得られた化合物（６７．０ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４０２ｍＬ）懸濁液に、４－ジメチルアミノピリジン（１８．０ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２６．８ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）を添加後、氷冷した。塩化ベンゾイル　（３３．１ｇ，２３．５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温に昇温後、１時間撹拌した。反応液を氷冷し、シクロペンチルメチルエーテル（６７０ｍＬ）を加えて希釈後、１０％食塩水（６７０ｍＬ）を加えて５分間攪拌し、分液した。有機層を０．５Ｍトシル酸水溶液（６７０ｍＬ）で洗浄後、さらに水（３３５ｍＬ）で洗浄した。得られた有機層にシクロペンチルメチルエーテル（６７０ｍＬ）を加えて６７０ｍＬまで減圧濃縮し、目的化合物を得た。
参考例１４：
３，５－ジ－Ｏ－ベンゾイル－２－デオキシ－２－フルオロ－Ｄ－リボフラノース　（化合物（ＸＸＩ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
（工程４）
　参考例１３で得られたシクロペンチルメチルエーテル溶液（６７０ｍＬ）に、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１３９．８ｇ，７３．５ｍｍｏｌ）の水溶液（１３４ｍＬ）を加え、混合物を加熱し６０℃にて６時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却したのち分液し、水層をシクロペンチルメチルエーテル（３３５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて８％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０３ｍＬ）で２回洗浄、水（３３５ｍＬ）で洗浄したのち、有機層を３３５ｍＬまで減圧濃縮し、目的化合物を得た。
参考例１５：
３，５－ジ－Ｏ－ベンゾイル－２－デオキシ－２－フルオロ－α－Ｄ－リボフラノシルクロリド　（化合物（ＸＸＩＩ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
（工程５）
　参考例１４で得られたシクロペンチルメチルエーテル溶液（５０ｍＬ）に、ジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、氷冷下、トリクロロイソシアヌル酸（１．５５ｇ，６．６６ｍｍｏｌ）、トリス（２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）ホスファイト（８．６４ｇ，１３．３５ｍｍｏｌ）を加えた。同温度で１時間攪拌しトリクロロイソシアヌル酸（１．５５ｇ，６．６６ｍｍｏｌ）、トリス（２，４－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）ホスファイト（８．６４ｇ，１３．３５ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。反応液にシクロペンチルメチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて１５０ｍＬ以下まで減圧濃縮したのち２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて２０分間攪拌した。反応混合物を分液し、有機層を２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で２回、６％炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）で２回分液洗浄した。有機層を３０ｍＬ以下まで減圧濃縮し、ヘプタン（１００ｍＬ）を加えて３０ｍＬ以下まで減圧濃縮した。ヘプタン（１００ｍＬ）、アセトニトリル（１００ｍＬ）を加えて分液、アセトニトリル層をヘプタン（１００ｍＬ）でさらに分液洗浄した。アセトニトリル層に活性炭（０．５ｇ）を加えて３０分間攪拌しろ過後、シクロペンチルメチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を５０ｍＬまで減圧濃縮し、ＣＰＭＥ（１００ｍＬ）を加えて５０ｍＬまで減圧濃縮した。５０℃に加温し、ヘプタン（５０ｍＬ）を加えて５０ｍＬまで減圧濃縮後、ヘプタン（５０ｍＬ）を滴下した。同温度で３０分間攪拌し、その後５０ｍＬまで減圧濃縮後、ヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。同じ操作をさらに２回繰り返した後、シクロペンチルメチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、０℃に冷却後、析出した結晶をろ過し、ヘプタン／シクロペンチルメチルエーテル（４５ｍＬ／５ｍＬ）混合液で洗浄後、室温下にて減圧乾燥し目的化合物（６．２ｇ，１６．４ｍｍｏｌ，収率６１．３％）を白色固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３９６［Ｍ＋ＮＨ３＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．６３－７．５８（２Ｈ，ｍ），７．４９－７．４３（４Ｈ，ｍ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），５．６１－５．５９（１Ｈ，ｍ），５．２６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５０．４，６．９，４．６Ｈｚ），４．８６－４．８４（１Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．６，２．９Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，４．０Ｈｚ）．
参考例１６：
６－ベンゾイル－２－（３，５－ジ－Ｏ－ベンゾイル－２－デオキシ－２－フルオロ－β－Ｄ－リボフラノシル）－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン　（化合物（ＸＸＩＶ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
（工程６）
　参考例１５で得られた化合物（１．０ｇ，３．５９ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（８ｍＬ）溶液に炭酸セシウム（３．５１ｇ，１０．７７ｍｍｏｌ）を加え１０分撹拌した後、参考例１０で得られた化合物（２．７２ｇ，７．１８ｍｍｏｌ）を３分割で加え、添加に用いた器具をジメチルスルホキシド（２ｍＬ）で洗いこみ、室温で３時間撹拌した。酢酸（１．１９ｇ，１９．７５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１５ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）を添加した。４０℃に加温し、水（５ｍＬ）を滴下した。約４０℃で目的化合物の種結晶（０．５ｍｇ）を添加し、水（７ｍＬ）を１時間かけて滴下した。滴下後、室温まで戻し、終夜撹拌した。得られた懸濁液から結晶を濾取し、アセトニトリル／水（７／３、２５ｍＬ）、次いでエタノール（５ｍＬ）で洗浄した。結晶にエタノール（２０ｍＬ）を添加して、室温下で約３０分撹拌した。懸濁液から結晶を濾取し、エタノール（５ｍＬ）で洗浄した。結晶を４０℃で終夜乾燥して、目的化合物を白色結晶（１．４ｇ、収率６３％）として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６２１［Ｍ＋Ｈ］＋．
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１１－８．０８（３Ｈ，ｍ），８．０３－８．００（２Ｈ，ｍ），７．６４－７．５５（２Ｈ，ｍ），７．５０－７．４４（２Ｈ，ｍ），７．４２－７．３４（５Ｈ，ｍ），７．２７－７．２３（２Ｈ，ｍ），７．０９（１Ｈ，ｓ），６．４７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１９．５，２．３Ｈｚ），５．９３－５．７４（２Ｈ，ｍ），４．８６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．６，３．４Ｈｚ），４．７５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝７．４，４．０，３．４Ｈｚ），４．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．６，４．０Ｈｚ），４．３１－４．２２（２Ｈ，ｍ），２．８８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．２４－２．１７（２Ｈ，ｍ）．
参考例１７：
２－（２－デオキシ－２－フルオロ－β－Ｄ－リボフラノシル）－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン・ｐ－トルエンスルホン酸塩　（化合物（ＸＸＶ・ＴｓＯＨ））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
（工程７）
　参考例１６で得られた化合物（３００ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール（１．５ｍＬ）溶液にナトリウムエトキシドのエタノール溶液（２０％，０．０１２ｍＬ，０．０３ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃で６時間攪拌した。室温まで冷却後、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１８４ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ）、エタノール（０．６ｍＬ）を加え、室温で３０分間撹拌した。その後、トルエン（６．３ｍＬ）を加え、室温で終夜撹拌した後、０℃まで冷却した。０℃で４時間撹拌した後、析出した結晶をろ過し、０℃に冷却したエタノール／トルエン（０．３ｍＬ／０．９ｍＬ）混合液で洗浄した。得られた結晶を４０℃にて減圧乾燥し目的化合物（２１５．９ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ，収率９３．０％）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ９．０２（１Ｈ，ｂｒｓ），８．３７（１Ｈ，ｓ），７．５６（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．３，１．８Ｈｚ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．１，４．０Ｈｚ），５．２４（１Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３．０，５．２Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），３．６９－３．５８（４Ｈ，ｍ），２．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），２．２９（３Ｈ，ｓ），２．００－１．９８（２Ｈ，ｍ）．
＜２．環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の合成＞
１－１．ＣＤＮ　Ａ－１の合成
　環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ　Ａ－１）を、以下の合成スキームＡ－１に従って合成した。合成スキームＡ－１において、Ａ２がＴｅｏｃ－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン基、ＰＧ１がＴＢＳ基、ＰＧ２がＤＭＴｒ基、ＰＧ３がＴｅｏｃ基、ＰＧ４がＬｅｖ基、ＰＧ５がＡｌｌｏｃ基、ＰＧ７がＴＦＡｃ基である。
　［合成スキームＡ－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
実施例１：
５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－３’－Ｏ－［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］－２’－Ｏ－［（１Ｓ，３ａＲ）－テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール－１－イル］－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシン（式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
（工程１）
　５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－３’－Ｏ－［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシン（１０．０ｇ）に脱水ジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加えて－５℃に冷却し、トリエチルアミン（１．７３ｍＬ）を添加した。上記溶液に文献既知（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ，１９９８，３９，２４９１－２４９４）の（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホールの脱水ジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を滴下し、同温度で３０分間撹拌した。室温に昇温し、３０分間攪拌後、反応液を濃縮した。濃縮した粗生成物をジクロロメタンで希釈溶解し、アミノシリカゲルクロマトグラフィー［ジクロロメタン／酢酸エチル］で精製し、目的化合物を得た（１０．４ｇ、収率９１．７％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０８８（Ｍ＋Ｈ）＋，１０８６（Ｍ－Ｈ）－．
１Ｈ－ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：７．９４（１Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．４４－７．４２（３Ｈ，ｍ），７．３１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），６．８４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），５．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．８３（１Ｈ，ｂｒｍ），４．９４（１Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｍ），４．３３（１Ｈ，ｍ），４．１７－４．０２（６Ｈ，ｍ），３．７４（６Ｈ，ｓ），３．６９（２Ｈ，ｍ），３．６１－３．５７（３Ｈ，ｍ），３．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．２８－３．１９（３Ｈ，ｍ），２．４８－２．４４（１Ｈ，ｍ），１．６５－１．４９（３Ｈ，ｍ）１．２６－１．１７（１Ｈ，ｍ），０．９４－０．９０（２Ｈ，ｍ），０．８７（９Ｈ，ｓ），０．１０（３Ｈ，ｓ），０．０６（３Ｈ，ｓ），０．００（９Ｈ，ｓ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：１５１．９３．
実施例２：
２－｛２－デオキシ－２－フルオロ－５－О－［（４－メトキシフェニル）（ジフェニル）メチル］－β－Ｄ－リボフラノシル｝－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン塩酸塩　（式（４Ａ－０１）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
 （工程２）
　参考例１７で得られた化合物のｐ－トルエンスルホン酸塩（３４．２ｇ、７１．２ｍｍｏｌ）のピリジン（１７１ｍＬ）溶液に、室温で４－メトキシトリチルクロリド（２６．４ｇ、８５．４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で約２４時間撹拌した後、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１７１ｍＬ）を滴下した。トルエン（６８４ｍＬ）を添加して、撹拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を１０％食塩水（１７１ｍＬ）で洗浄し、有機層を得た。ピリジン塩酸塩（８．２ｇ、７１．２ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。さらにピリジン塩酸塩（１２．３ｇ、１０６．８ｍｍｏｌ）を添加して約２３時間撹拌した。得られた懸濁液から結晶を濾取して、トルエン（１０３ｍＬ）で結晶を洗浄して、目的化合物の塩酸塩の湿結晶を取得した。
　得られた湿結晶の一部（参考例１７で得られた化合物のｐ－トルエンスルホン酸塩の６．０ｇ反応相当分）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に懸濁し、室温にて約２時間攪拌した。不溶の結晶をろ過で集め、減圧下４０℃で乾燥することによって、目的化合物を得た。（７．５９ｇ、収率９８．５％）
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６，Ｄ２Ｏ）　δ：８．３５（１Ｈ，ｓ），７．３９－７．１３（１４Ｈ，ｍ），６．９１－６．８５（２Ｈ，ｍ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．８，１．７Ｈｚ），５．３６－５．２２（１Ｈ，ｍ），４．５９－４．４９（１Ｈ，ｍ），４．１４－４．０８（１Ｈ，ｍ），３．６２－３．５５（２Ｈ，ｍ），３．３２－３．２７（２Ｈ，ｍ），２．７４－２．６１（２Ｈ，ｍ），２．０１－１．８８（２Ｈ，ｍ）．
実施例３：
２－（トリメチルシリル）エチル　２－［２－デオキシ－２－フルオロ３－Ｏ－（４－オキソペンタノイル）－β－Ｄ－リボフラノシル］－２，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－６－カルボキレート　（式（４Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
 （工程３）
　実施例２で得られた化合物の塩酸塩（４．００ｇ、６．４８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に懸濁させ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．６９ｍＬ、９．７２ｍｍｏｌ）を添加し均一な溶液にした。混合溶液にレブリン酸（７９６μＬ、７．７８ｍｍｏｌ），ジメチルアミノピリジン（７９．２ｍｇ、６４８μｍｏｌ），１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１．４９ｇ，７．７８ｍｍｏｌ）を順次添加し室温にて３時間攪拌した。反応溶液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液（８０ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を分液した。得られた水層をジクロロメタン（４０ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせて減圧下、溶媒を留去した。
　得られた残渣をアセトニトリル（２０ｍＬ）で溶解させＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．８２ｍＬ、５１．９ｍｍｏｌ）、Ｔｅｏｃ－ＯＮＰ（１１．０ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）を添加し６０℃に昇温し４４時間攪拌した。室温まで冷却した後酢酸イソプロピル（４４ｍＬ）、１０％塩化アンモニウム水溶液（４４ｍＬ）を加えて分液し、水層を酢酸エチル（４４ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を合わせて、１０％塩化アンモニウム水溶液（４４ｍＬ）、１０％炭酸カリウム水溶液（４４ｍＬ）、つづいて１０％炭酸カリウム水溶液（４４ｍＬ）で洗浄した後、減圧下、溶媒を留去した。
　得られた残渣をジクロロメタン（８０ｍＬ）で溶解し、ＭｅＯＨ（１０．５ｍＬ）、ジクロロ酢酸（２．７０ｍＬ、３２．９ｍｍｏｌ）を添加し室温で１時間攪拌した。反応溶液にジクロロ酢酸（２．７０ｍＬ、３２．９ｍｍｏｌ）を添加し室温で１６時間攪拌した。反応溶液にジクロロ酢酸（６８０μＬ、８．２９ｍｍｏｌ）を添加し室温で５時間攪拌した後、０℃に冷却しトリエチルアミン（１１．３ｍＬ、８１．１ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を減圧化濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（２．６９ｇ、収率７５％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５５２（Ｍ＋Ｈ）＋，６１０（Ｍ＋ＡｃＯ）－
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ），７．６２（１Ｈ，ｓ），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．８，４．９Ｈｚ），５．６８（０．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），５．５８（０．５Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．４６－５．４２（１Ｈ，ｍ），５．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），４．２６（２Ｈ，ｔＪ＝８．０Ｈｚ），４．１９（１Ｈ，ｓ），４．０４－３．９１（２Ｈ，ｍ），３．６８－３．５９（２Ｈ，ｍ），２．９０（２Ｈ，ｓ），２．７８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．６４－２．６２（２Ｈ，ｍ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），０．９９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），－０．０１（９Ｈ，ｓ）．
実施例４：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（｛［（Ｒ）－（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－｛［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］メチル｝－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－イル｝オキシ）｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－フルオロ５－（６－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート（式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
（工程４）
　２－（トリメチルシリル）エチル　２－［２－デオキシ－２－フルオロ３－Ｏ－（４－オキソペンタノイル）－β－Ｄ－リボフラノシル］－２，７，８，９－テトラヒドロ－６Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－６－カルボキレート（実施例３で得られた化合物）（６６０ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４，５ｍＬ）溶液にモルキュラーシーブ３Ａ（１９８ｍｇ）を添加して室温で１時間撹拌した。別容器にて実施例１で得られた化合物（１．５７ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（６．６ｍＬ）溶液にモルキュラーシーブ３Ａ（１９８ｍｇ）を添加して室温で１時間攪拌し混合した。モルキュラーシーブ３Ａ（１３２ｍｇ）を添加し、終夜乾燥させた０．９２ｍｏｌ／Ｌの１－メチルベンゾイミダゾリウムトリフラートのアセトニトリル溶液（２．６ｍＬ、２．４０ｍｍｏｌ）を追加した。室温にて１時間攪拌後、トリエチルアミン（６６６μＬ、４．７９ｍｍｏｌ）、１－（トリフルオロアセチル）イミダゾール（２４６μＬ、２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で攪拌した。約１時間撹拌後、キサンタンヒドリド（２３４ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を添加して、室温で１時間撹拌した。反応液を濾過しモレキュラーシーブを除き、アセトニトリル（３ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、目的化合物を得た（１．１５ｇ、収率５４％）。反応時に生成するリン原子上のジアステレオマーはＨＰＬＣ測定の結果、９５．７：４．３であった。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１７６７（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６）　δ：８．６５－８．６０（１Ｈ，ｍ），８．５２（１Ｈ，ｓ），８．２４（２Ｈ，ｓ），７．４４（１Ｈ，ｓ），７．３２－７．１４（９Ｈ，ｍ），６．８５－６．７９（４Ｈ，ｍ），６．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８．３，３．４Ｈｚ），６．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．７１－５．５８（１Ｈ，ｍ），５．５６－５．４６（２Ｈ，ｍ），４．７７－４．７３（１Ｈ，ｍ），４．５４－４．４８（２Ｈ，ｍ），４．３３－３．８３（１３Ｈ，ｍ），３．７４－３．７１（１Ｈ，ｍ），３．７１（６Ｈ，ｓ），３．６５－３．３３（７Ｈ，ｍ），３．１０－３．０５（１Ｈ，ｍ），２．８８－２．８０（２Ｈ，ｍ），２．７６－２．７１（２Ｈ，ｍ），２．６４－２．５８（２Ｈ，ｍ），２．１０（３Ｈ，ｓ），２．０１－１．９１（２Ｈ，ｍ），１．７５（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝９１．１Ｈｚ），１．００－０．８２（６Ｈ，ｍ），０．７３（９Ｈ，ｓ），０．０４－－０．０３（２４Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：６８．８
実施例５：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（｛［（Ｒ）－（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－５－［（｛［（プロペ－２－エン－１－イル）オキシ］カルボニル｝オキシ）メチル］オキソラン－３－イル｝オキシ）｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－フルオロ５－（６－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
（工程５－１）
　実施例４で得られた化合物（１．１４５ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液にエタノール（１．５ｍＬ）、ジクロロ酢酸（１６０μＬ、１．９４ｍｍｏｌ）を添加して室温で１晩撹拌した。さらにジクロロ酢酸（８０μＬ、０．９７ｍｍｏｌ）を加え、室温で５．５時間攪拌した。次にトリエチルアミン（５４０μＬ、３．８９ｍｍｏｌ）でクエンチ後、氷冷し５％炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加えて分液ロートに移し、有機層１と水層１に分液した。有機層１に５％炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加えて洗浄し、有機層２と水層２に分液した。
　次に水層１にジクロロメタン（１０ｍＬ）を加えて抽出し、有機層３と水層３に分液した。さらに水層２に有機層３を加えて抽出し、有機層４と水層４に分液した。有機層２と有機層４を合わせて減圧下濃縮し、残渣に無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加えて減圧下濃縮し、クルードの脱トリチル体である式（Ｒｃ－６Ａ－０１）に相当する化合物を１．１３７４ｇ得た。
（工程５－２）
　次に脱トリチル体（８４９ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１８ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（８６μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）、クロロ炭酸アリル（６１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間２０分攪拌した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（８６μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）、クロロ炭酸アリル（６１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を追加し、２０分攪拌後、さらにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（８６μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）、クロロ炭酸アリル（６１μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を追加し、室温で１０分攪拌後Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（２１．５μＬ、０．１４４ｍｍｏｌ）、クロロ炭酸アリル（１５μＬ、０．１４２ｍｍｏｌ）を追加した。室温で３０分攪拌後、５％炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加え攪拌後、分液した。有機層を減圧下濃縮後し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）にて精製し、目的化合物を得た（７５７ｍｇ、収率８０％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１５４８．９（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６）　δ：８．６５－８．６０（１Ｈ，ｍ），８．５１（１Ｈ，ｓ），８．２６（１Ｈ，ｓ），８．２３（１Ｈ，ｓ），７．４５（１Ｈ，ｓ），７．２１－７．１６（１Ｈ，ｍ），６．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８．９，３．４Ｈｚ），６．１６－６．１４（１Ｈ，ｍ），５．９３－５．８５（１Ｈ，ｍ），５．７０－５．５７（１Ｈ，ｍ），５．５１－５．４２（２Ｈ，ｍ），５．３３－５．２８（１Ｈ，ｍ），５．２５－５．２０（１Ｈ，ｍ），４．７２－４．６７（１Ｈ，ｍ），４．６１－４．５６（２Ｈ，ｍ），４．５４－４．４９（２Ｈ，ｍ），４．４６－４．４１（１Ｈ，ｍ），４．３２－３．９０（１５Ｈ，ｍ），３．６５－３．４１（７Ｈ，ｍ），２．８９－２．８２（２Ｈ，ｍ），２．７８－２．７３（２Ｈ，ｍ），２．６６－２．５７（３Ｈ，ｍ），２．５３－２．３５（１Ｈ，ｍ），２．１２（３Ｈ，ｓ），２．０３－１．９４（２Ｈ，ｍ），１．８６－１．７３（２Ｈ，ｍ），１．００－０．９５（２Ｈ，ｍ），０．９４－０．８９（３Ｈ，ｍ），０．８５（９Ｈ，ｓ），０．１０－０．０７（６Ｈ，ｍ），０．０２－－０．０３（１８Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：６８．７
実施例６：
［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－３－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－５－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－４－｛［（Ｒ）－（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－フルオロ３－ヒドロキシ－５－（６－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オキソラン－２－イル｝メトキシ）｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝オキソラン－２－イル］メチル　プロペ－２－エン－１－イル　カーボネート　（式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000139
 （工程６）
　実施例５で得られた化合物（０．７４６ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液にヒドラジン酢酸塩（５３ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を添加して室温で１晩撹拌した。２％炭酸水素ナトリウム水（１０ｍＬ）を加えて攪拌し、分液した。有機層を減圧下濃縮後し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）にて精製し、目的化合物（５５２ｍｇ、収率７９％）を固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１４４８．６５（Ｍ－Ｈ）－
１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６）　δ：８．６５－８．６０（１Ｈ，ｍ），８．５１（１Ｈ，ｓ），８．２６（１Ｈ，ｓ），８．２４（１Ｈ，ｓ），７．３７（１Ｈ，ｓ），７．２３－７．１６（１Ｈ，ｍ），６．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１９．５，２．３Ｈｚ），６．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．９４－５．８５（２Ｈ，ｍ），５．５０－５．４４（１Ｈ，ｍ），５．３５－５．２０（３Ｈ，ｍ），４．７１－４．６７（１Ｈ，ｍ），４．６１－４．５８（２Ｈ，ｍ），４．５４－４．５１（２Ｈ，ｍ），４．４６－４．３５（２Ｈ，ｍ），４．３１－３．８７（１６Ｈ，ｍ），３．６６－３．４４（６Ｈ，ｍ），２．８７－２．８１（２Ｈ，ｍ），２．０５－１．９２（２Ｈ，ｍ），１．８６－１．６５（４Ｈ，ｍ），１．０２－０．９６（２Ｈ，ｍ），０．９４－０．９０（２Ｈ，ｍ），０．８６（９Ｈ，ｓ），０．１１－０．０９（６Ｈ，ｍ），０．０３－－０．０１（１８Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：６８．６
実施例７：
２－（トリメチルシリル）エチル　［２－（｛［２－（９－｛（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ビス（スルファニリデン）－２，１０－ビス｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝－１４－（６－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝－６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロオクタデシン－７－イル｝－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル）エトキシ］メチル｝アミノ）－２－オキソエチル］カーバメート　（式（Ｒｃ、Ｒｃ－８）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000140
 （工程７）
　実施例６で得られた化合物（１００ｍｇ、６８．９μｍｏｌ）のジクロロメタン（１．０ｍＬ）溶液にモレキュラーシーブ３Ａ（３０．０ｍｇ）を添加して室温で１８時間撹拌した。混合溶液を０℃に冷却し、トリエチルアミン（１４．４μＬ、１０３μｍｏｌ）および（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール（１３．７ｍｇ、８２．８μｍｏｌ）をジクロロメタン（１・０ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、室温に昇温して３０分攪拌した。続いてジメドン（１９．３ｍｇ、１３７μｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（１５．９ｍｇ、１３．８μｍｏｌ）を添加し１時間撹拌した。混合溶液を０℃に冷却し、アセトニトリル（２．０ｍＬ）、０．８ｍｏｌ／Ｌに調製した１―フェニルイミダゾリウムトリフレートの脱水アセトニトリル溶液（１７２μＬ）を添加し室温で１時間攪拌した。その後トリエチルアミン（３８．４μＬ、２７５μｍｏｌ）、１－（トリフルオロアセチル）イミダゾール（１１．８μＬ、１０４μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌した。さらにキサンタンヒドリド（２０．７ｍｇ、１３８μｍｏｌ）を添加し、２時間攪拌した。反応液を濾過してモレキュラーシーブを除いた後、水（１．０ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層３４６７ｍｇのうち３０８４ｍｇを減圧下濃縮し、目的化合物の残渣（１７０．６ｍｇ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１６２３（Ｍ＋Ｈ）＋，１６２１（Ｍ－Ｈ）－
実施例８：
ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ジオキソ－７－［６－オキソ－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－１４－（６，７，８，９）－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ビス（チオラート）　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000141
（工程８）
　実施例７で得られた残渣（１７０．６ｍｇ）をメタノール（１．７ｍＬ）に溶解させ、２８％アンモニア水溶液（８３８μＬ）を添加し、４５℃に昇温して２０時間撹拌した。反応液を濾過して不溶物を除き、減圧下濃縮した。残渣をメタノールに溶解させ、メタノール溶液５０５７ｍｇのうち５０２０ｍｇを減圧下濃縮した。残渣に５０％メタノール水溶液およびトリエチルアミンを添加して濾過し、２４７３ｍｇの混合溶液を得た。そのうち２３８０ｍｇの溶液を逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／１０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液）にて精製し、分画を水で希釈した。この溶液に対し、シリカゲルを用いた固相抽出を行い、０．０６％トリエチルアミン／アセトニトリル溶液で溶出させ、得られた分画を濃縮することで、目的化合物（２０．０ｍｇ、２工程収率２６％）を固体として得た。工程７～８で生成するリン原子上のジアステレオマー比は反応後、精製前のＨＰＬＣ測定の結果、８９：１１であった。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１１２１（Ｍ＋Ｈ）＋，１１１９（Ｍ－Ｈ）－
１Ｈ－ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：８．６１（１Ｈ，ｓ），８．１０（１Ｈ，ｓ），８．０７（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８４－７．８２（１Ｈ，ｍ），７．５０（１Ｈ，ｂｒｓ），７．０３（１Ｈ，ｂｒｓ），６．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．５，３．０Ｈｚ），６．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．０６（１Ｈ，ｂｒｍ），５．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５２．５，４．０Ｈｚ），５．３７（１Ｈ，ｍ），５．３１（１Ｈ，ｍ），４．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｍ），４．１９（３Ｈ，ｍ），４．０７（３Ｈ，ｍ），３．９１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．０，２．０Ｈｚ），３．８４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．０，５．０，２．０Ｈｚ），３．７０（２Ｈ，ｍ），３．６２（２Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｍ），２．９９（６Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．８６（１Ｈ，ｍ），２．７３（１Ｈ，ｍ），１．９５（２Ｈ，ｍ），１．１７（１８Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９５－０．９２（２Ｈ，ｍ），０．９４（９Ｈ，ｓ），０．２３（３Ｈ，ｓ），０．２０（３Ｈ，ｓ），０．００（９Ｈ，ｓ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：５８．３１，５７．２２．
１－２．ＣＤＮ　Ａ－２の合成
　環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ　Ａ－２）を、以下の合成スキームＡ－２に従って合成した。合成スキームＡ－２において、Ａ２がＢｚ－アデニン基、ＰＧ１がＴＢＳ基、ＰＧ２がＤＭＴｒ基、ＰＧ３がＴｅｏｃ基、ＰＧ４がＬｅｖ基、ＰＧ５がＡｌｌｏｃ基、ＰＧ７がＴＦＡｃ基である。
　［合成スキームＡ－２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000142
実施例９：
Ｎ－ベンゾイル－２’－デオキシ－２’－フルオロ－３’－Ｏ－（４－オキソペンタノイル）アデノシン　（式（４Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000143
 （工程１）
　Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－２’－デオキシ－２’－フルオロアデノシン（２．５０ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液に窒素下、レブリン酸（５６８μＬ、５．５５ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．０６ｇ、５．５５ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（４．５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩攪拌後、レブリン酸（１８９μＬ、１．８５ｍｍｏｌ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３５３ｍｇ、１．８４ｍｍｏｌ）を追加し、３５℃に昇温した。１．５時間攪拌後、４－ジメチルアミノピリジン（４．５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を追加し、３５℃で４時間攪拌した。次に室温に戻し、酢酸エチル（２５ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加え分液し、得られた有機層を２０％食塩水（５０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。次に残渣をジクロロメタン（３７．５ｍＬ）、水（０．６６７ｍＬ）を加え溶解し、窒素下、６％ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液を添加した。室温で１５分攪拌後、メタノール（１２．５ｍＬ）で反応をクエンチし、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ｍＬ）を少しずつ添加し、攪拌後に分液した。得られた有機層を２０％食塩水（７５ｍＬ）で洗浄し、有機層を減圧下、溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（１．６４ｇ、収率９４％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　δ：９．０８（１Ｈ，ｓ），８．８０（１Ｈ，ｓ），８．１４（１Ｈ，ｓ），８．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．６３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，６．３Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５０．８，５．７Ｈｚ），５．７６－５．６６（２Ｈ，ｍ），４．４２（１Ｈ，ｓ），４．０２－３．９６（１Ｈ，ｍ），３．８７－３．８０（１Ｈ，ｍ），２．９３－２．８４（１Ｈ，ｍ），２．８３－２．６５（３Ｈ，ｍ），２．２３（３Ｈ，ｓ）．
実施例１０：
２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（｛［（Ｒ）－（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－｛［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］メチル｝－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－ｙｌ｝オキシ）｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－フルオロオキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000144
（工程２）
　実施例９で得られた化合物（８００ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（１６０ｍｇ）のアセトニトリル（８ｍＬ）溶液および実施例１で得られた化合物（２．０３ｇ，１．８７ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（１６０ｍｇ）のアセトニトリル（８ｍＬ）溶液をそれぞれ窒素下、室温で１時間攪拌後混合し、１－フェニルイミダゾリウムトリフレート（７４９ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で約２時間攪拌後、トリエチルアミン（１．１８ｍｌ、８．４８ｍｍｏｌ）、１－（トリフルオロアセチル）イミダゾール（２７１μＬ、２．３８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間攪拌した。キサンタンヒドリド（３８２ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）を添加し、１８時間攪拌後、酢酸エチル（３０ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（１．３４ｇ、収率４７％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１６８８（Ｍ＋Ｈ）＋，１６８６（Ｍ－Ｈ）－
１Ｈ－ＮＭＲ　（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：９．２５（１Ｈ，ｓ），８．７７（１Ｈ，ｓ），８．２５（１Ｈ，ｓ），８．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．９４（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｓ），７．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．２９（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６，１．７Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．８０（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．９，１．４Ｈｚ），６．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８．９，１．７Ｈｚ），６．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），５．８１－５．６１（３Ｈ，ｍ），５．４３－５．３８（１Ｈ，ｍ），４．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），４．３６（１Ｈ，ｍ），４．２８－４．２５（３Ｈ，ｍ），４．２３－４．２０（１Ｈ，ｍ），４．１７－４．０８（６Ｈｍ），４．０３－４．００（１Ｈ，ｍ），３．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．７８－３．７４（８Ｈ，ｍ），３．６２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），３．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．４Ｈｚ），３．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，４．０Ｈｚ），２．８１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．３Ｈｚ），２．６９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．２０（３Ｈ，ｓ），２．０２－１．８９（４Ｈ，ｍ），１．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２），０．９５－０．９１（２Ｈ，ｍ），０．８０（９Ｈ，ｓ），０．００（ｓ，１５Ｈ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７０．０
実施例１１：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（｛［（Ｒ）－｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ｝｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－フルオロオキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－６Ａ－０１）に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000145
 （工程３）
　実施例１０で得られた化合物（１．２４ｇ、７３５μｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解させ精製水（０．１３ｍＬ），ジクロロ酢酸（７５０μＬ、９．０７ｍｍｏｌ）の順に室温にて添加した。３時間攪拌した後、５％炭酸水素ナトリウム（２５ｍＬ）を滴下し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（５６９ｍｇ、収率５６％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１３８５（Ｍ＋Ｈ）＋，１３８３（Ｍ－Ｈ）－
実施例１２：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（｛［（Ｒ）－（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－５－［（｛［（プロペ－２－エン－１－イル）オキシ］カルボニル｝オキシ）メチル］オキソラン－３－イル｝オキシ）｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－フルオロオキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000146
 （工程４）
　実施例１１で得られた化合物（３３９ｍｇ、２４５μｍｏｌ）をジクロロメタン（７ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（２２μＬ，０．１５ｍｍｏｌ），クロロギ酸アリル（２６μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）の順に０℃にて添加した。約３時間攪拌した後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（２２μＬ，０．１５ｍｍｏｌ），クロロギ酸アリル（２６μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）の順に０℃にて添加し、室温に昇温した後約１時間攪拌を４回繰り返した。５％炭酸水素ナトリウム（７ｍＬ）を滴下し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（７ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（２１５ｍｇ、収率６０％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１４６９（Ｍ＋Ｈ）＋，１４６７（Ｍ－Ｈ）－
実施例１３：
｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－｛［（Ｒ）－｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ－３－ヒドロキシオキソラン－２－イル］メトキシ｝｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝－３－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－５－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－２－イル｝メチル　プロペ－２－エン－１－イル　カーボネート　（式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000147
 （工程５）
　実施例１２で得られた化合物（１０７ｍｇ、７２．９μｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン酢酸塩（６．７ｍｇ，７３μｍｏｌ）を室温にて添加し約３時間攪拌した。ヒドラジン酢酸塩（１．３ｍｇ、１５μｍｏｌ）を室温にて添加し約３時間攪拌した後、５％炭酸水素ナトリウム（１ｍＬ）を滴下し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（１ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（７７．７ｍｇ、収率７８％）。
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７０．４
実施例１４：
２－（トリメチルシリル）エチル　（２－｛［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１４－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ビス（スルファニリデン）－２，１０－ビス｛［（２Ｒ）－１－（トリフルオロアセチル）ピロリジン－２－イル］メトキシ｝オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロオクタデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート　（式（Ｒｃ、Ｒｃ－８）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000148
 （工程６）
　実施例１３で得られた化合物（３５．５ｍｇ、２５．９μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解しトリエチルアミン（７．２μＬ）を添加した。（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール（６．４ｍｇ、３８．７μｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１７８μＬ）に溶解した溶液を－２０℃にて滴下し、室温に昇温して３０分攪拌した。析出した固体をシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ　ＬＨ　０．４５μｍ）にて濾過しテトロヒドロフラン（３６０μＬ）にて洗浄した。濾液にテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（３．０ｍｇ、２．６μｍｏｌ）、ジメドン（７．３ｍｇ、５２μｍｏｌ）を添加し２時間攪拌した。テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（３．０ｍｇ、２．６μｍｏｌ）を添加し２時間攪拌した。０．４ｍｏｌ／Ｌに調整した１―フェニルイミダゾリウムトリフレートの脱水アセトニトリル溶液（９７．５μＬ）を－５０℃で添加し室温に昇温した後、２時間攪拌した。続いて、トリエチルアミン（２１．７μＬ、１５５μｍｏｌ）、１－（トリフルオロアセチル）イミダゾール（４．４μＬ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間攪拌した。キサンタンヒドリド（１１．６ｍｇ、７７．６μｍｏｌ）を添加し、１６時間攪拌後、酢酸エチル（１ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（１ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（１０．２ｍｇ、収率２６％、ＨＰＬＣ（２１０ｎｍ）ピーク面積比　９６．２％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１５４５（Ｍ＋Ｈ）＋，１５４３（Ｍ－Ｈ）－
実施例１５：
２－（トリメチルシリル）エチル　（２－｛［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１４－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ２，１０－ジオキソ－２，１０－ビス（スルファニル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロオクタデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000149
（工程７）
　実施例１４で得られた化合物（２．０ｍｇ、１．３μｍｏｌ）をメタノール（０．１ｍＬ）に溶解し２５％アンモニア水（２０μＬ）を添加し５０℃に加温し攪拌した。２時間後ＨＰＬＣ（２１０ｎｍ）を測定し、７１．７％のピーク面積比率で目的化合物が生成したことを確認した。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０８２（Ｍ＋Ｈ）＋，１０８０（Ｍ－Ｈ）－
１－３．ＣＤＮ　Ｂ－１の合成
　環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ　Ｂ－１）を、以下の合成スキームＢ－１に従って合成した。合成スキームＢ－１において、Ａ２がＢｚ－アデニン基、ＰＧ１がＴＢＳ基、ＰＧ２がＤＭＴｒ基、ＰＧ３がＴｅｏｃ基、ＰＧ４がＬｅｖ基、ＰＧ５がＡｌｌｏｃ基、ＰＧ７がＴＦＡｃ基である。
　［合成スキームＢ－１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000150
参考例１８：
Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－２’－デオキシ－２’－フルオロ３’－Ｏ－［（１Ｓ，３ａＲ）－テトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール－１－イル］アデノシン　（式（Ｒｃ－３Ｂ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000151
（工程１）
　Ｎ－ベンゾイル－５’－Ｏ－［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メチル］－２’－デオキシ－２’－フルオロアデノシン（１．５０ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２６ｍＬ）に溶解し、モレキュラーシーブス４Ａ（６２３ｍｇ），トリエチルアミン（３７１μＬ、２．６６ｍｍｏｌ）を添加し室温で１時間攪拌した。混合溶液を－１６℃に冷却し、脱水ジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解した（３ａＲ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール（４４０ｍｇ、２．６６ｍｍｏｌ）を添加した。室温に昇温したのち３０分間攪拌後、反応液を濾過することでモレキュラーシーブを濾去した。濾液を濃縮した後、得られた粗生成物をジクロロメタンで希釈溶解し、アミノシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（１．２５ｇ、収率７０％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　δ：８．９０（１Ｈ，ｂｒｓ），８．７９（１Ｈ，ｓ），８．２９（１Ｈｓ），８．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．６４－７．６０（１Ｈ，ｍ），７．５６－７．５１（２Ｈ，ｍ），７．４１－７．３８（２Ｈ，ｍ），７．３２－７．１８（７Ｈ，ｍ），６．８２－６．７７（４Ｈ，ｍ），６．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．６，２．１Ｈｚ），５．６２（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝５２．１，２．１Ｈｚ），５．１３－５．０４（１Ｈ，ｍ），４．４５－４．４１（１Ｈ，ｍ），４．３６－４．３２（１Ｈ，ｍ），３．９０－３．８４（１Ｈ，ｍ），３．８０－３．６８（７Ｈ，ｍ），３．６１－３．４９（２Ｈ，ｍ），３．４０－３．３５（１Ｈ，ｍ），３．１６－３．０７（１Ｈ，ｍ），１．９３－１．７０（３Ｈ，ｍ），１．４４－１．３６（１Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１５５．６５（ｄ，Ｊ＝５．８）
参考例１９：
３’－Ｏ－［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］－２’－Ｏ－（４－オキソペンタノイル）－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシン）アミノ］メトキシ｝エチル）イノシン　（式（１Ｂ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000152
（工程２）
　参考例５で得られた化合物（２．５０ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解し、レブリン酸（６０５ｍｇ、５．２１ｍｍｏｌ），ジメチルアミノピリジン（３１．８ｍｇ、２６１μＬ），１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（８０９ｍｇ，５．２１ｍｍｏｌ）を順次添加し室温にて４時間攪拌した。反応溶液に５％リン酸２水素カリウム水溶液（２５ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）、２０％食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。
　得られた残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、精製水（４７０μＬ）、ジクロロ酢酸（１．５０ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ）を室温にて添加し３時間攪拌した。氷冷しメタノール（１ｍＬ）を添加した後室温に昇温し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）、２０％食塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン）で精製し、目的化合物を得た（１．４９ｇ、収率７６％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）　δ：８．０５（１Ｈ，ｓ），７．８５（１Ｈ，ｓ），７．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３３．２Ｈｚ），５．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），５．７２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．９，５．２Ｈｚ），５．６３（１Ｈ，ｂｒｓ），５．４２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．７９－４．７４（１Ｈ，ｍ），４．７１－４．６９（１Ｈ，ｍ），４．６７－４．６０（１Ｈ，ｍ），４．２４－４．１１（５Ｈ，ｍ），４．００－３．９５（１Ｈ，ｍ），３．８４－３．６５（５Ｈ，ｍ），２．７０－２．６５（２Ｈ，ｍ），２．５９－２．５３（２Ｈ，ｍ），２．１３（３Ｈ，ｓ），１．００－０．９５（２Ｈ，ｍ），０．９４（９Ｈ，ｓ），０．１３－０．０９（６Ｈ，ｍ），０．０３（９Ｈ，ｓ）．
参考例２０：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（｛［（Ｒ）－｛［（２Ｒ）－１－アセチルピロリジン－２－イル］メトキシ｝｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－｛［ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］メチル｝－４－フルオロオキソラン－３－イル］オキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－５Ｂ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000153
（工程３）
　参考例１９で得られた化合物（１．１０ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２２０ｍｇ）のアセトニトリル（５．５ｍＬ）溶液および参考例１８で得られた化合物（１．２９ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブス４Ａ（２２０ｍｇ）のアセトニトリル（５．５ｍＬ）溶液をそれぞれ窒素下、室温で３０分間攪拌後混合し、０．４Ｍに調整した１－フェニルイミダゾリウムトリフレートのアセトニトリル溶液（５．４８ｍＬ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて１０分間攪拌し、トリエチルアミン（１．０２ｍＬ、７．２８ｍｍｏｌ）、１Ｍに調整した無水酢酸のアセトニトリル溶液（１．５３ｍＬ、１．５３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌した。キサンタンヒドリド（２３０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を添加し、４時間室温で攪拌した。反応液を濾過によりモレキュラーシーブスを除去したのち、酢酸エチル（２２ｍＬ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１１ｍＬ）を添加し攪拌した後、水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（１１ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（１．４９ｇ、収率６３％）。
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：６９．１
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１６３４（Ｍ＋Ｈ）＋，１６３２（Ｍ－Ｈ）－
参考例２１：
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（｛［（Ｒ）－｛［（２Ｒ）－１－アセチルピロリジン－２－イル］メトキシ｝｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ２－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－２－［１－（２，２－ジメチル－６，９－ジオキソ－５，１２－ジオキサ－７，１０－ジアザ－２－シラテトラデカン－１４－イル）－６－オキソ－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］オキソラン－３－イル　４－オキソペンタノエート　（式（Ｒｃ－６Ｂ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000154
（工程４）
　参考例２０で得られた化合物（４００ｍｇ、２４５μｍｏｌ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解させ精製水（４４μＬ），ジクロロ酢酸（１２０μＬ、１．４５ｍｍｏｌ）の順に室温にて添加した。４時間攪拌した後、５％炭酸水素ナトリウム（４ｍＬ）を滴下し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（４ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水）で精製し、目的化合物を得た（１０３ｍｇ、収率３２％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１３３１（Ｍ＋Ｈ）＋，１３２９（Ｍ－Ｈ）－
参考例２２：
２－（トリメチルシリル）エチル　（２－｛［（２－｛９－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－５－（｛［（Ｒ）－｛［（２Ｒ）－１－アセチルピロリジン－２－イル］メトキシ｝｛［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－フルオロ２－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３－イル］オキシ｝ホスホロチオイル］オキシ｝メチル）－４－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－３－ヒドロキシオキソラン－２－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート　（式（Ｒｃ－７Ｂ）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000155
（工程５）
　参考例２１で得られた化合物（９４．６ｍｇ、７１．０μｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン酢酸塩（６．５４ｍｇ，７１．０μｍｏｌ）を０℃にて添加し室温にて添加し６時間攪拌した。水（１ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（１ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル）で精製し、目的化合物を得た（６４．８ｍｇ、収率７４％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１２３３（Ｍ＋Ｈ）＋，１２３１（Ｍ－Ｈ）－
３１Ｐ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＣＮ－ｄ３）δ：６９．６
参考例２３：
２－（トリメチルシリル）エチル　（２－｛［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－２－｛［（２Ｒ）－１－アセチルピロリジン－２－イル］メトキシ｝－１０－｛［（２Ｓ）－１－アセチルピロリジン－２－イル］メトキシ｝－１４－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ビス（スルファニリデン）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロオクタデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート　（式（Ｒ
ｃ，Ｓｃ－８）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000156
（工程６）
　参考例２２で得られた化合物（３２．４ｍｇ、２６．３μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．６５ｍＬ）に溶解しモレキュラーシーブス（６．５ｍｇ）を添加し室温にて３０分間攪拌した。混合溶液を－２０℃に冷却しトリエチルアミン（４．４μＬ、３１．６μｍｏｌ）および（３ａＳ）－１－クロロテトラヒドロ－１Ｈ，３Ｈ－ピロロ［１，２－ｃ］［１，３，２］オキサザホスホール（４．４ｍｇ、２６．３μｍｏｌ）をジクロロメタン（０．３２ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、室温に昇温した。反応溶液を１時間攪拌し、０．４ｍｏｌ／Ｌに調整した１―フェニルイミダゾリウムトリフレートの脱水アセトニトリル溶液（１７８μＬ）を添加し室温で１時間攪拌した。反応溶液にトリエチルアミン（４．４μＬ、３１．６μｍｏｌ）および１Ｍに調整した無水酢酸のアセトニトリル溶液（２８．０μＬ、２８μｍｏｌ）を添加し室温で３時間攪拌した。反応溶液にキサンタンヒドリド（４．１ｍｇ，２７．６μｍｏｌ）を添加し２時間室温で攪拌した。反応溶液を濾過しモレキュラーブスを除去した後、ジクロロメタン（０．４ｍＬ）および５％炭酸水素ナトリウム水溶液（０．５ｍＬ）を添加し、攪拌後に水層を廃棄した。得られた有機層を２０％食塩水（０．５ｍＬ）で洗浄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣を逆相ＨＰＬＣにて分取し（アセトニトリル／水）で精製し、目的化合物を得た（２．５ｍｇ、収率７％、ＨＰＬＣ（２１０ｎｍ）ピーク面積比　６７．６％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１４３６（Ｍ＋Ｈ）＋，１４３４　（Ｍ－Ｈ）－
参考例２４：
２－（トリメチルシリル）エチル　（２－｛［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１４－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ２，１０－ジオキソ－２，１０－ビス（スルファニル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロオクタデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］アミノ｝－２－オキソエチル）カーバメート　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000157
（工程７）
　参考例２３で得られた化合物（環化体）（１．３ｍｇ、０．８７μｍｏｌ）をメタノール（５０μＬ）に溶解し２５％アンモニア水（１０μＬ）を添加し５０℃に加温し攪拌した。６時間後ＨＰＬＣ（２１０ｎｍ）を測定し、２１．３％のピーク面積比で目的化合物が生成したことを確認した。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１０８２（Ｍ＋Ｈ）＋，１０８０（Ｍ－Ｈ）－
＜３．ＣＤＮ－リンカーの合成＞
　ＣＤＮ－リンカーを、以下の合成スキーム４に従って合成した。
　［合成スキーム４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000158
参考例２５：
Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニン　（化合物（１１））の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000159
 （工程１）
　１－｛［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］オキシ｝ピロリジン－２，５－ジオン（５．０ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）、グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニン（４．２ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）懸濁液に室温でトリエチルアミン（２．３ｍＬ、１６．１ｍｍｏｌ）を添加して、約４時間撹拌した。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（１６．２ｍＬ）を添加後、目的化合物の種結晶（４．６ｍｇ）を添加した。室温で終夜撹拌し、得られた懸濁液に水（１００ｍＬ）を２時間かけて滴下した。４０℃で約１．５時間撹拌後、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液（１６．２ｍＬ）を添加した。３０分撹拌後、室温に冷却して、さらに２時間撹拌した。懸濁液から結晶を濾取して、アセトニトリル／水（１／３、５０ｍＬ）で洗浄した。結晶を３０℃で終夜乾燥して、目的化合物を白色結晶（６．７ｇ、収率９５％）として得た。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１２．８（１Ｈ，ｂｒｓ），８．１５－７．９５（３Ｈ，ｍ），７．６８－７．１７（１３Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，Ｊ＝１４．２Ｈｚ），４．４１－４．３７（１Ｈ，ｍ），３．７４－３．５７（５Ｈ，ｍ）３．０５－３．０１（１Ｈ，ｍ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．２，９．３Ｈｚ），２．６８－２．５９（１Ｈ，ｍ）、２．３２－２．２５（１Ｈ，ｍ），２．０９－２．０３（１Ｈ，ｍ），１．８２－１．７６（１Ｈ，ｍ）．
実施例１６：
Ｎ－［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ビス（スルファニル）－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物に相当）の合成１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000160
 （工程２）
　ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ジオキソ－７－［６－オキソ－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－１４－（６，７，８，９）－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ビス（チオラート）（実施例８（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物）（１ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（３ｍＬ）溶液に室温下で７０％テトラブチルアンモニウムフルオリド水溶液（３ｍＬ）を添加し、３０℃で２日間撹拌した。アセトニトリル（１２ｍＬ），塩化カルシウム（０．５９ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を添加して室温で１４時間撹拌した。トリエチルアミン（１ｍＬ）、水（２ｍＬ）を添加して、室温で２時間撹拌後、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水（１．２ｍＬ）を６回に分けて添加した。トリエチルアミン（６０μＬ）を添加し、不溶物を濾別した。得られた濾液を減圧下で約１０ｍＬまで溶媒を留去した。アセトニトリル（２０ｍＬ）を添加して、減圧下で約１０ｍＬまで溶媒を留去する操作を２回繰り返した後、アセトニトリル（５０ｍＬ）を添加して、減圧下で約１０ｍＬまで溶媒を留去する操作を２回繰り返した。得られた溶液に５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水（１６５μＬ）を添加し、アセトニトリル（５０ｍＬ）を添加後、０℃まで冷却して２時間撹拌した。得られた懸濁液から固体を濾取して、アセトニトリル（５ｍＬ）で洗浄した。固体を２５℃で終夜乾燥して、目的化合物を白色結晶（０．４６ｇ、収率７１％）として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：８６３（Ｍ＋Ｈ）＋，８６１（Ｍ－Ｈ）－．
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：９．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），９．０２（１Ｈ，ｂｒｓ），８．６９（１Ｈ，ｓ），８．３７（１Ｈ，ｓ），８．２０（１Ｈ，ｓ），８．０９（２Ｈ，ｂｒｓ），７．４７（１Ｈ，ｓ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．０，２．０Ｈｚ），６．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５２．５Ｈｚ），５．２２（１Ｈ，ｍ），５．０９（１Ｈ，ｍ），４．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，６．５Ｈｚ），４．４３－４．４０（２Ｈ，ｍ），４．３０（２Ｈ，ｍ），４．１９－４．０８（３Ｈ，ｍ），３．９１（２Ｈ，ｍ），３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０，３．５Ｈｚ），３．６６（２Ｈ，ｍ），３．５４（２Ｈ，ｍ），３．４１（２Ｈ，ｍ），２．５８（２Ｈ，ｍ），１．８６（２Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：５５．３６，５１．３１．
実施例１７：
Ｎ－［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ビス（スルファニル）－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物に相当）の合成２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000161
 （工程２’）
　ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１６－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝－１５－フルオロ－２，１０－ジオキソ－７－［６－オキソ－１－（２－｛［（Ｎ－｛［２－（トリメチルシリル）エトキシ］カルボニル｝グリシル）アミノ］メトキシ｝エチル）－１，６－ジヒドロ－９Ｈ－プリン－９－イル］－１４－（６，７，８，９）－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－２，１０－ビス（チオラート）（実施例８（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物）（０．８ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（２．４ｍＬ）溶液に室温下で７０％テトラブチルアンモニウムフルオリド水溶液（２．４ｍＬ）を添加し、室温で４日間撹拌した。アセトニトリル（９．６ｍＬ）、炭酸カルシウム（０．６７ｇ、６．６５ｍｍｏｌ）、ＤＯＷＥＸ　５０Ｗｘ８（２．２４ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を添加して室温で１．５時間撹拌した。反応液の減圧脱気操作を実施した後、トリエチルアミン（０．８ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。不溶物を濾別し、アセトニトリル（８．０ｍＬ）で不溶物を洗浄した。得られた濾液を減圧下で約４ｍＬまで溶媒を留去した。アセトニトリルを添加して８ｍＬに調整し、溶液（８ｍＬ）に５ｍｏｌ／Ｌの塩酸水（２８０μＬ）を添加し、アセトニトリル（９．６ｍＬ）を添加後、１時間撹拌した。得られた懸濁液から固体を濾取して、アセトニトリル（４．０ｍＬ）で洗浄した。固体を室温で終夜乾燥して、目的化合物を白色結晶（０．４８ｇ、収率９１％）として得た。
実施例１８：
ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６，－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000162
 （工程３）
　参考例２５で得られた化合物（１３２．６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．８ｍＬ）、水（０．４４ｍＬ）の懸濁液にトリエチルアミン（５２．６ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加後、実施例１７で得られた化合物（２２２．０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（９３．５ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１８時間撹拌した。反応液にアセトニトリル（２．２ｍＬ）、シクロペンチルメチルエーテル（２．２ｍＬ）、１３．８％硫酸ナトリウム水溶液（３．３ｍＬ）を添加し、撹拌した。水層を廃棄し、得られた有機層を減圧下、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を白色固体として得た（２２２ｍｇ、収率５９％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：８．５８（１Ｈ，ｓ），８．０９（１Ｈ，ｓ），８．０４（１Ｈ，ｓ），７．５７－７．４９（２Ｈ，ｍ），７．４３－７．３４（３Ｈ，ｍ），７．３２－７．０８（９Ｈ，ｍ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），５．５６－５．３７（２Ｈ，ｍ），５．３１－５．１７（１Ｈ，ｍ），５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），４．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），４．６４－４．３８（６Ｈ，ｍ），４．３６－４．２１（４Ｈ，ｍ），４．０５－３．６０（１０Ｈ，ｍ），３．５３－３．４２（３Ｈ，ｍ），３．１８（１２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０１－２．９２（１Ｈ，ｍ），２．８６－２．７３（１Ｈ，ｍ），２．７０－２．５４（２Ｈ，ｍ），２．３７－２．１６（２Ｈ，ｍ），２．０６－１．７７（３Ｈ，ｍ），１．２８（１８Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）．
実施例１９：
二カリウム　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６，－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000163
 （工程３’）
　参考例２５で得られた化合物（１７７．３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．９ｍＬ）、水（０．７８ｍＬ）の懸濁液にトリエチルアミン（７０．８ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を添加後、実施例１７で得られた化合物（３００．０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１２５．１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５．５時間撹拌した。反応液にアセトニトリル（３．９ｍＬ）、シクロペンチルメチルエーテル（２．０ｍＬ）、１３．８％硫酸ナトリウム水溶液（５．８ｍＬ）を添加し、撹拌後に水層を廃棄して有機層を得た。２－エチルヘキサン酸カリウム（３８０．４ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）の２－プロパノール（１９．５ｍＬ）溶液に有機層を室温で滴下後、１時間撹拌した。シクロペンチルメチルエーテル（７．８ｍＬ）を添加し、約１５時間撹拌した。得られた懸濁液から固体を濾取し、２－プロパノール／アセトニトリル／シクロペンチルメチルエーテル（５／２／２、３ｍＬ）で洗浄した。減圧下、室温で約８時間乾燥し、目的化合物を白色固体として得た（３８４．６ｍｇ、収率７４％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：８．６８（ｂｒｓ，１Ｈ），８．６１（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，６．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３５（ｄｔ，Ｊ＝１０．９，５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｂｒｓ，１Ｈ），８．１７（ｄｔ，Ｊ＝１６．６，５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１３－７．９９（ｍ，３Ｈ），７．７０－７．６２（ｍ，１Ｈ），７．６０－７．５５（ｍ，２Ｈ），７．５０－７．４６（ｍ，１Ｈ），７．４６－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．２７（ｍ，３Ｈ），７．２６－７．２０（ｍ，４Ｈ），７．１８－７．１３（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｂｒｓ，１Ｈ），６．３７（ｄｄ，Ｊ＝１４．６，３．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４８（ｄｔ，Ｊ＝５１．０，３．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２２－５．１６（ｍ，１Ｈ），５．１２－５．０４（ｍ，１Ｈ），５．００（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｂｒｓ，１Ｈ），４．６２－４．５７（ｍ，１Ｈ），４．５６－４．５０（ｍ，２Ｈ），４．４９－４．４３（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｂｒｓ，１Ｈ），４．２６－４．１７（ｍ，３Ｈ），４．０６－３．９６（ｍ，３Ｈ），３．８２－３．５１（ｍ，１１Ｈ），３．０４（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，４．６Ｈｚ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，９．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７０－２．５７（ｍ，３Ｈ），２．２９（ｄｔ，Ｊ＝１５．５，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．１２－２．０２（ｍ，１Ｈ），１．９１－１．７４（ｍ，３Ｈ），１．５９－１．５２（ｍ，１Ｈ）．
実施例２０：
二ナトリウム　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（２Ｒ，５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６，－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド　（式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に相当）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000164
 （工程３’’）
　参考例２５で得られた化合物（１８．１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．５ｍＬ）の懸濁液に、トリエチルアミン（１２．１μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（１０．４ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温で添加した。実施例１７で得られた化合物（２５．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を室温で添加し、２時間撹拌した。反応液に減圧下で濃縮し、得られた残渣に酢酸エチル（０．７５ｍＬ）、５％炭酸ナトリウム水溶液（０．２５ｍＬ）を添加した。２層溶液からオイル成分を分離し、オイル成分にアセトニトリル（１ｍＬ）を添加して室温で６時間撹拌した。得られた懸濁液から上澄み成分を除去して、固体を得た。固体を減圧下で５時間乾燥して、目的化合物を白色固体として得た（３８．２ｍｇ、収率９１％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１４１１（Ｍ＋Ｈ）＋，１４０９（Ｍ－Ｈ）－．
参考例２６：抗ＣＤ７０抗体１の作製
　抗ＣＤ７０抗体１はＷＯ２００４／０７３６５６を参照して作製することができる。配列番号１（図１）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２３）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２４）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２５）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２６）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号２７）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号２８）を図１２に示す。
参考例２７：抗ＣＤ７０抗体２の作製
　抗ＣＤ７０抗体２はＷＯ２００７／０３８６３７を参照して作製することができる。配列番号３（図２）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号４（図２）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２９）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号３０）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号３１）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号３２）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号３３）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号３４）を図１３に示す。
参考例２８：抗ＴＲＯＰ２抗体１の作製
　抗ＴＲＯＰ２抗体１はＷＯ２０１５／０９８０９９を参照して作製することができる。配列番号５（図３）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号６（図３）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号３５）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号３６）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号３７）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号３８）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号３９）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４０）を図１４に示す。
参考例２９：抗ＥＧＦＲ抗体１の作製
　抗ＥＧＦＲ抗体１は、ベクティビックス点滴静注１００ｍｇ審査結果報告書（平成２２年３月５日　医薬食品局審査管理課）を参照して作製することができる。配列番号７（図４）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号８（図４）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号４１）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号４２）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号４３）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４４）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４５）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４６）を図１５に示す。
参考例３０：抗ＥＧＦＲ抗体２の作製
　抗ＥＧＦＲ抗体２はＷＯ２００２／０９２７７１を参照して作製することができる。配列番号９（図５）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号１０（図５）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号４７）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号４８）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号４９）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５０）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号５１）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号５２）を図１６に示す。
参考例３１：抗ＨＥＲ２抗体１の作製
　「トラスツズマブ」はＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８、ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８と呼ばれることもあるヒト化ＩｇＧ１抗体である。アミノ酸配列はＵＳ５８２１３３７を参照した。
　抗ＨＥＲ２抗体１は、トラスツズマブの重鎖アミノ酸配列のＥＵインデックス２３４番目及び２３５番目のロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に変異（本明細書中、ＬＡＬＡ変異ともいう）させた、トラスツズマブの定常領域改変ＩｇＧ１抗体を設計し、作製することができる。抗ＨＥＲ２抗体１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１３）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号１４）を図７に示す。配列番号１１（図６）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号１２（図６）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５３）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５４）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５５）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５６）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号５７）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号５８）を図１７に示す。
参考例３２：抗ＨＥＲ２抗体２の作製
　「ペルツズマブ」はＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）と呼ばれることもあるヒト化ＩｇＧ１抗体である。
　抗ＨＥＲ２抗体２は、ペルツズマブの重鎖アミノ酸配列のＥＵインデックス２３４番目及び２３５番目のロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に変異（本明細書中、ＬＡＬＡ変異ともいう）させた、ペルツズマブの定常領域改変ＩｇＧ１抗体を設計し、作製することができる。抗ＨＥＲ２抗体２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１７）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号１８）を図９に示す。配列番号１５（図８）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号１６（図８）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５９）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６０）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６１）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６２）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６３）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６４）を図１８に示す。
参考例３３：抗ＣＤＨ６抗体１の作製
　抗ＣＤＨ６抗体１はＷＯ２０１８／２１２１３６を参照して作製することができる。配列番号１９（図１０）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号２０（図１０）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６５）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６６）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６７）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６８）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６９）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号７０）を図１９に示す。
参考例３４：抗ＣＤＨ６抗体２の作製
　抗ＣＤＨ６抗体２はＷＯ２０１６／０２４１９５のＮＯＶ　ＩＤ：ＮＯＶ０７１２で表される抗体であり、ＷＯ２０１６／０２４１９５を参照して作製することができる。配列番号２１（図１１）に示されるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号２２（図１１）に示されるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号７１）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号７２）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号７３）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号７４）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号７５）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号７６）を図２０に示す。

Claims (19)

  1. 　式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ａ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     であり、
    　ＰＧ１は、ヒドロキシ基の保護基であり、及び
    　ＰＧ３は、アミノ基の保護基である。］
    で表される化合物又はその塩の製造方法であって、
    （工程ａ１）式（１Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、
    　ＰＧ１及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、及び
    　ＰＧ２はヒドロキシ基のトリチル型保護基である。］
    で表される化合物を、以下の式（Ｒｃ－２－１）及び（Ｒｃ－２－２）からなる群から選択される光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、
    　Ｒ１は、水素又はメチルであり、
    　Ｒ２は、水素、炭素数１～３のアルキル又はフェニルであり、
    　　ここで、前記アルキルは、非置換であるか、又は１つ以上のフェニル、トシル若しくはジフェニルメチルシリルで置換されており、及び、
    　　前記フェニルは、非置換であるか、ニトロ若しくはメトキシで置換されている。］
    と反応させて、式（Ｒｃ－３Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、
    　ＰＧ１、ＰＧ２及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、及び
    　Ｂ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     であり、Ｒ１及びＲ２は、上で定義したとおりである。］
    で表される化合物を得る工程、
    （工程ａ２）得られた式（Ｒｃ－３Ａ）の化合物を、式（４Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、
    　Ａ２は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     であり、ＰＧ６はアミノ基の保護基であり、及び
    　ＰＧ４は、ヒドロキシ基の保護基である。］
    で表される化合物と、活性化剤の存在下で反応させ、次いで、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、さらにチオ化剤と反応させて、式（Ｒｃ－５Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、
    　Ａ２、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりであり、
    　Ｂ２は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     であり、Ｒ１及びＲ２は、上で定義したとおりであり、ＰＧ７はアミノ基の保護基である。］
    で表される化合物を得る工程、
    （工程ａ３－１）得られた式（Ｒｃ－５Ａ）の化合物のＰＧ２を脱保護して、式（Ｒｃ－６Ａ－０１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりである。］
    で表される化合物を得る工程、
    （工程ａ３－２）得られた式（Ｒｃ－６Ａ－０１）の化合物を、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤と反応させて、式（Ｒｃ－６Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ４は、上に定義したとおりであり、ＰＧ５はヒドロキシ基のエステル型又はカーボネート型保護基である。］
    で表される化合物を得る工程、
    （工程ａ４）得られた式（Ｒｃ－６Ａ）の化合物のＰＧ４を脱保護して、式（Ｒｃ－７Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     ［式中、Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１、ＰＧ３及びＰＧ５は、上に定義したとおりである。］
    で表される化合物を得る工程、
    （工程ａ５）得られた式（Ｒｃ－７Ａ）の化合物を、工程ａ１の光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と同一の又は異なる、以下の式（Ｒｃ－２－１）及び（Ｒｃ－２－２）からなる群から選択される、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［式中、Ｒ１及びＲ２は、上に定義したとおりである。］
    光学活性なホスフィチル化剤（Ｒｃ－２）と反応させ、ＰＧ５を脱保護し、次いで、活性化剤の存在下で環化し、さらにアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤で処理し、続いてチオ化剤と反応させて、式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     ［式中、
    　Ａ２、Ｂ２、ＰＧ１及びＰＧ３は、上に定義したとおりであり、
    　Ｂ２’は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＰＧ７は、上で定義したとおりである。］
    で表される化合物を得る工程、並びに
    （工程ａ６）得られた式（Ｒｃ、Ｒｃ－８）の化合物のチオリン酸部位の保護基であるＢ２及びＢ２’、及びＡ２中の保護基であるＰＧ６を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物又はその塩を得る工程、
    　を含む、方法。
  2. 　工程ａ２及び工程ａ５における活性化剤が、独立して、１－フェニルイミダゾリウム　トリフレート、１－メチルベンゾイミダゾリウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピペリジニウム　トリフレート、１－（シアノメチル）ピロリジニウム　トリフレート、及び１－（シアノメチル）イミダゾリウム　トリフレートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程ａ２及び工程ａ５におけるアシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤が、独立して、無水酢酸、Ｎ－スクシンイミジルアセテート、ペンタフルオロフェニルアセテート、エチルトリフルオロアセテート、メチルトリフルオロアセテート、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート、トリフルオロアセチルベンゾトリアゾール、１－トリフルオロアセチルイミダゾール、無水安息香酸、ペンタフルオロフェニルベンゾエート、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－１，２，４－トリアゾール、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルイミダゾール、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート、９－フルオレニルメチルペンタフルオロフェニルカーボネート、１－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニロキシ］ベンゾトリアゾール、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニロキシ］スクシンイミド、Ｎ－（２，２，２－トリクロロエトキシカルボニロキシ）スクシンイミド、Ｎ－カルボベンジロキシスクシンイミド、ジベンジルジカーボネート、２－（トリメチルシリル）エチル－３－ニトロ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－カルボキシレート、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニロキシ］スクシンイミド、Ｎ－エトキシカルボニルフタルイミド、及びメチルイミダゾール－１－カルボキシレートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　工程ａ２及び工程ａ５におけるチオ化剤が、独立して、キサンタンヒドリド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン及び［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
    　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルであり、
    　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、又はアリルオキシカルボニルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、
    　ＰＧ６が、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ７が、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　ＰＧ４が、レブリノイルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　ＰＧ５が、アリルオキシカルボニルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルであり、
    　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、又はトリチルであり、
    　ＰＧ４が、レブリノイルであり、及び
    　ＰＧ５が、アリルオキシカルボニルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　さらに
    （工程ａ７）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－９）の化合物の保護基であるＰＧ１及びＰＧ３を脱保護して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     ［式中、
    　Ａ１は、請求項１に定義したとおりである。］
    で表される化合物又はその塩を得る工程、及び、
    (工程ａ８）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－１０）の化合物又はその塩を、
    式（１１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     で表される化合物又はその活性エステル体と縮合して、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     ［式中、Ａ１は、上に定義したとおりである。］
    で表される化合物又はその塩を得る工程
    を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　さらに、
    （工程ａ９）得られた式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩と、抗体又は該抗体の機能性断片（以下、Ａｂという。）と結合させて、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     ［式中、
    　ｍは１から１０の範囲であり、
    　Ａｂの糖鎖は、任意にリモデリングされており、
    　Ａｂは、修飾されていてもよいアミノ酸残基の側鎖から直接式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に結合するか、又はＡｂの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖から式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物に結合しており、
    　Ａ１は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     である。］
    で表される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート、又はそれらの混合物を得る工程
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　工程ａ９において、式（Ｒｐ，Ｒｐ－１２）の化合物又はその塩とＡｂとを、歪み促進型アジド-アルキン付加環化反応（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）反応により結合させることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＤＲ５抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記式（４Ａ）（式中、ＰＧ４がレブリノイルである。）の化合物が、以下の工程：
    （工程ａ０－１）式（ＸＸＶ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     の化合物又はその塩の５’位のヒドロキシ基を、トリチル化剤を用いて保護して、式（４Ａ－０１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     ［式中、ＰＧ８は、ヒドロキシ基のトリチル型保護基である。］
    の化合物又はその塩を得る工程、及び
    （工程ａ０－２）得られた式（４Ａ－０１）の化合物又はその塩の２’位のヒドロキシ基を、レブリン酸を用いて保護し、さらに、アシル化剤又はアルコキシカルボニル化剤と反応させ、次いで脱トリチル化を行うことによって、前記式（４Ａ）の化合物を得る工程
    によって製造される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　式（４Ａ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     ［式中、
    　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ６が、ベンジル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、又はエトキシカルボニルである。］
    で表される化合物。
  16. 　式（Ｒｃ－５Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     ［式中、
    　Ａ２及びＢ２は、請求項１に定義したとおりであり、
    　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
    　ＰＧ２が、４，４’－ジメトキシトリチル、４－メトキシトリチル、２－クロロトリチル、又はトリチルであり、及び
    　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルである。］
    で表される化合物。
  17. 　式（Ｒｃ－６Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     ［式中、
    　Ａ２及びＢ２は、請求項１に定義したとおりであり、
    　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
    　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、
    　ＰＧ４が、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、アジドブチリル、アリルオキシカルボニル、クロロアジドベンジル、メトキシベンジル、又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル又はアリルオキシカルボニルである。］
    で表される化合物。
  18. 　式（Ｒｃ－７Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     ［式中、
    　Ａ２及びＢ２は、請求項１に定義したとおりであり、
    　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、
    　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルであり、及び
    　ＰＧ５が、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、レブリノイル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル又はアリルオキシカルボニルである。］
    で表される化合物。
  19. 　式（Ｒｃ，Ｒｃ－８）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     ［式中、
    　Ａ２、Ｂ２及びＢ２’は、請求項１に定義したとおりであり、
    　ＰＧ１が、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリルであり、及び
    　ＰＧ３が、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル、又はベンジルオキシカルボニルである。］
    の化合物。
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