WO2005092909A1

WO2005092909A1 - 立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデオキシリボヌクレオチド類縁体の製造法

Info

Publication number: WO2005092909A1
Application number: PCT/JP2005/003812
Authority: WO
Inventors: Kazuhiko Saigo; Takeshi Wada; Satoshi Fujiwara; Terutoshi Sato; Naoki Iwamoto
Original assignee: Toudai Tlo, Ltd.
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2005-10-06
Also published as: JP4865544B2; JPWO2005092909A1

Abstract

本発明は、立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体の製造法を提供する。詳しくは、光学活性なヌクレオシド３'−ホスホロアミダイトとヌクレオシドとを、活性化剤を用いて縮合した後、硫化及び脱保護を行うことを特徴とする、式（IV）又は（Ｖ）で表される立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体の製造法である。［各式中、Ｙ+は炭素数１～３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基等、Ｂｓはウラシル等を示し、各式中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］

Description

立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキシリボヌクレオチド類縁体の製造法技術分野

本発明は、立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びォリゴデォキシリボヌクレオチド類縁体の製造法に関するものである。背景技術

リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、近年、重要なアンチセンス薬（アンチセンス法）として注目されており、更 I.こ多くの病気についても臨床試験が行われている。アンチセンス法とは、標的となる mRNAと相補的な塩基配列をもつ核酸を用いて、 mRNAと選択的に結合させ、タンパク質の翻訳を阻害する手法である。アンチセンス分子として必要な性質として、主に、（1)標的となる mRNAの塩基配列を認識し、特異的に結合できること、（2)安定な二重鎖を形成できること、（3)ヌクレア一ゼ耐性が高いこと、（4)細胞膜透過性が高いことなどが挙げられる。

リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、リン原子上に不斉中心を有しており、その絶対立体配置の相違によりアンチセンス効果が異なる。また、近年の i n v i tro研究では、リン酸部位修飾ジヌクレオチドの性質として、例えば DNA、 RNAとの二重鎖形成能ゃヌクレアーゼ耐性、 R N ase H活性などはリン原子上のキラリティ一に影響されることが報告されており（Med. Chem. Lett.

2000, 8, 275-284) 、リン原子上の立体を制御したリン酸部位修飾ォリゴヌクレォチドの効率的な製造法が求められている。

し力、し、従来、リン酸部位修飾ジヌクレオチドは、ホスホロアミダイト法等により製造されており (Beaucage,

S丄.； I yer, R. P. Tetrahedron, 1992, 48, 2223- 2311 ) 、これらの製造法では、リン原子上の立体制御を行うことは困難であったため、製造されたリン酸部位修飾オリゴヌクレオチドは、 R体と S体のジァステレオマーの混合物であった。また、アンチセンス分子として天然型 DNAを用いた場合、ヌクレアーゼによリ加水分解されやすく、また細胞膜透過性が低いというアンチセンス分子としては致命的な問題がある。そこで、天然型 DMA に種々の修飾を施すことにより、これらの問題を克服する試みが行われてきた。その中で、天然型 DMAのインターヌクレオチドの、リン原子上の 2つの非架橋酸素原子を様々に置換した DNA 類縁体、即ちインタ一ヌクレオチド修飾型類縁体は、ヌクレアーゼ耐性、及び細胞膜透過性がともに高まることが知られている (Lev i n, A. A. B i ochem.

B i ophys. Acta. , 1 999, 1489 (1 ) , 69-84. ) 。

しかしながら、導入された置換基がそれぞれ異なる場合、その DNA類縁体はリン原子上にキラリティを有することになる。これらの DNA類縁休はそのキラリティにより、物性や機能が異なることが知られている（Yu, D.； Kanduma l l a, E. R.； Rosky, A.； Zhao, Q.； Chen, J.； Agrawa l , S. B i oorg. Med. Ghem. , 2000, 8, 275-284. ) 。例えば、 2つの非架橋酸素原子のうち 1つを硫黄原子に置換したインターヌクレオチド修飾型 DNA類縁体であるホスホロチォエート DNAは、それと相補的な RNAと形成する二重鎖の構造、ヌクレア一ゼ加水分解に対する耐性などが Sp体のォリゴマーと Rp体のォリゴマ一との間で異なることが知られている（前記文献参照）。このことから、薬としても効能を高めるうえで、リン原子の立体を制御したィンタ一ヌクレオチド修飾型 DNA類縁体を得ることは極めて重要である。

H-ホスホネ一卜 DNAは、天然型 DNAのィンタ一ヌクレオチドのリン原子上の 2つの非架橋酸素原子のうち、 1つの酸素原子を水素原子に置換した DNA類縁体であり、リン原子上にキラリティを有する。また、立体特異的な変換反応により、種々のインタ一ヌクレオチド修飾型 DMA類縁体へと変換可能である。よつて、立体化学的に純粋な H-ホスホネート DNAが得られれば、それを用いてそのまま立体が制御されたィンターヌクレオチド修飾型 DMA類縁体を得ることが可能となる。このように、 H-ホスホネー卜 DNAは、様々な立体の制御されたィンタ一ヌクレオチド修飾型 DNA類縁体へと変換可能な有用な合成中間体である。現在までのところ、立体化学的に純粋な H -ホスホネ一ト DMAを得る方法は、そのジァステレオマ一をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一によリ光学分割する方法以外にない。したがって、立体化学的に純粋な H-ホスホネート DMAは、二量体レベルで得た例の報告があるのみである（（a) See la, F.； Kretschner, U. J. Org. Chem. 1991, 56, 3861-3869. (b) Loshmer, T.； Engels, J. W. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 5143) 。しかも、 H -ホスホネート DNAの二量体を光学分割する場合であっても、 H-ホスホネ一ト DNAはシリカゲルカラムクロマトグラフィ一上で不安定であり、かつその 2つのジァステレオマー間に極性の大きな違いはないため、その光学分割は極めて非効率的なものである。立体化学的に純粋な H-ホスホネ一ト DNAを核酸医薬への応用が可能な合成中間体として考えた場合、オリゴマーレベルで立体の制御された H-ホスホネ一ト DNA が必要となる。その場合、ジァステレオマーの数は指数関数的に増大するため、 H-ホスホネ一ト DMAオリゴマーの光学分割は事実上不可能なものとなる。そこで、 H-ホスホネート DMAの立体選択的合成反応を開発できれば、オリゴマーレベルで立体の制御された H -ホスホネート DMAを得ることが可能となる。

RNAi は 1998年、 Fireと Mel loらにより線虫を用いた研究で初めて報告された (Fire, A.； Xu, S.； Montgomery, Μ. Κ.； Kostas, S. A.； Driver, S. E.； Mel lo, C. G. Nature. 1998, 391, 806- 811. )のをきつかけに、昆虫、植物、 · 菌類などの様々な生物種間に従来備わった遺伝子抑制システムであることが明らかにされている。また、 2001年 Tuschl らによって RNAi は哺乳動物細胞においても適用可能であることが示された (Elbashir, S. M.； Harborth, J.； Lendeckel, .； Yale in, A.； Weber, K.； Tuschl, T. Nature. 2001, 411, 494-498. ) 。これにより、 RNAiは遺伝子抑制効果の高い優れた遺伝子抑制法として、遺伝子治療や遺伝子機能解析などを行なうための有力な手段として注目されるようになった。 RNAiの特徴は、正確に目的の遺伝子をノックアウトできる配列特異性と元来生体に備わった遺伝子抑制機構を用いていることである。このことによって、 RNAi は副作用の少ない新しい遺伝子治療法として期待されている。しかしながら、 s iRNAのような 21塩基程度の RNA鎖は生体内のヌクレァーゼによって徐々に分解されてしまうため、今のところ RNAiの効果は長時間持続させることができない。発明の開示

本発明の課題は、アンチセンス法や RNA干渉に使用することができ、リン原子上の立体を制御した、立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキシリポヌクレオチド類縁体の製造法を提供することにある。

本発明は、課題の解決手段として、一般式（ I )

[式中、 R ¹及び R ' は、同一又は異なっていてもよい、水素原子、炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6 ~ 1 4のァリール基を示し、

R²及び R " は、同一又は異なっていてもよい、水素原子、炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6 〜 1 4のァリール基を示し、

R³は炭素数 1 〜 3のアルキル基を示し、

R⁴は水酸基の保護基、は一 O R ⁵ (ここで R⁵は水酸基の保護基）、水酸基又は水素原子を示し、

B sは、次式

Ο

で表されるゥラシル、アデニン、シトシン、グァニン、チミンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。但し、 R²及び R³は、窒素原子と共にモノシクロ構造又はビシクロ構造を形成していてもよい。 ]

で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイ卜と、

一般式 (II)

[式中、 R^e、及び B sは前記と同じ意味を示す。 ]

で表されるヌクレオシドとを、

一般式 (III)

[式中、 X—は B F₄—、 P F₆—、 T f O— (T f は C F₃S 0₂—を示す。以下同じ）、 T f ₂N\ A s F₆—又は S b F₆—を示す。また、環状構造 Aは窒素原子と共に形成する炭素数 3〜 1 6のモノシクロ又はビシクロ構造を示す。 ]

で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、式（IV) 又は（V) で表される立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体の製造法、及び立体規則性の高いォリゴリボヌクレオチド類縁体及びォリゴデォキシリボヌクレオチド類縁体の製造法を提供する。

[各式中、 Yは炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数 1〜 1 0の'直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基、炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数 6 ~ 1 4のァリール基、炭素数 1 ~ 1 0のアルキルチォ基、炭素数 1〜 1 0のァシル基、アミノ基、炭素数 1〜 1 0のアルキルァミノ基、炭素数 1 ~ 1 0のジアルキルアミノ基、又は Υ=Υ' Ζ+を示す（Υ' は S一、 S e―、 B H ₃—を、 Z+はアンモニゥムイオン、第 1級〜第 4級の低級アルキルアンモニゥムイオン又は 1価の金属イオンを示す）。 B sは、前記と同じ意味を示し、各式中の 2個の B sは、同一でも異なっていてもよい。 D₂及び E₂ は水酸基又は水素原子を示す。 ] 発明の詳細な説明

以下、本発明の製造法を、縮合反応（第 1反応工程）と、求電子試薬との反応及び脱保護反応（第 2反応工程）に分けて説明する。第 1及び第 2の分け方は説明の便宜のためだけのものであり、これに限定されるものではなく、またら必要に応じて精製処理等の公知の処理工程を付加することもできる。

〔第 1反応工程〕

一般式（I) で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイト〔以下「ホスホロアミダイ卜（I) 」という〕と、一般式（II) で表されるヌクレオシド〔以下「ヌクレオシド（II) 」という〕とを、一般式（III) で表される活性化剤〔以下「活性化剤（III) 」という〕の存在下で縮合反応させる。

ホスホロアミダイト（I) は、下記のとおり、適当な 1 , 2—アミノアルコ —ルから公知の方法で製造することができる（例えば Tetrahedron： Asy謹 etry 1995, 6, 1051- 1054参照) 。

即ち、一般式（VI) で表される光学活性な 1 , 2—ァミノアルコール〔以下「アミノアルコール（VI) 」という〕と、三塩化リンを反応させて得られる一般式（VII) で表される光学活性なホスフイチル化剤〔以下「ホスフイチル化剤（VII) J という〕と、一般式（VIII) で表されるヌクレオシドを反応させて得ることができる。

〔式中、 R¹、 R²、 R³、 R D，及び B sは、一般式（1 ) と同じ意味を示す。〕ァミノアルコール（VI) としては、（S) —及ぴ（R) —2—メチルァミノ — 1一フエニルエタノール、（1 R, 2S) —エフェドリン、（1 R, 2 S) 一 2—メチルアミノー 1 , 2—ジフ Xニルエタノール等が挙げられる。

その他にも、プロリノール誘導体、例えば、（Of R, 2S) — 一（ピロリジン一 2—ィル）ベンジルアルコール、（aS， 2 R)— 一（ピロリジン一 2—ィル）ベンジルアルコールが挙げられ、 H-ホスホネートに誘導可能なアミノアルコール類、例えば、（ S) —a, of—ジフエニル（ピロリジン一 2— ィル）メタノール、（2S) — 一メチル（ピロリジン一 2—ィル）ェタノ一ル、（2 R) —び一メチル（ピロリジン一 2—ィル）エタノール、（oiR， 2 S) — 一メチル（ピロリジン一 2—ィル）ベンジルアルコール、（ S, 2 R)— 一メチル（ピロリジン一 2—ィル）ベンジルアルコールが挙げられるヌクレオシド（VIII) において、 Bsはゥラシル、アデニン、シ卜シン、グァニン又はチミンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示すが、誘導体としては、アデニン、シトシン及びグァニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、具体的には、下記式で表される化合物が挙げられる。

〔式中、 R⁷は上記と同じ意味を示し、 R⁸は炭素数 1〜 1 5のアルキル基、ァリール基、ァラルキル基、ァリールォキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フエニル基、ベンジル基、フエノキシメチル基が好ましく、特にフエニル基が好ましい。また、 R⁹及び R^1C)は、それぞれ炭素数 1〜4のァルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。 R"は、グァニン 06位の保護基を示し、 2 -シァノエチル基、 p -ニトロフエニルェチル基、フエニルスルホニルェチル基、ベンジル基、 2-トリメチルシリルェチル基等が好ましい。

ヌクレオシド（VIII) は、ゥラシル、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミン又はそれらの誘導体の 5' 位の水酸基を保護したもので、保護基（R⁴) としては、 tert -ブチルジフエニルシリル基（TBDPS) 、 tert -ブチルジメチルシリル基（TBDMS) 等のアルキルシリル基、 4, 4' ージメトキシトリチル基（DMT r ) 、 4—メトキシトリチル基（MMT r ) 等のトリチル基、次式で表される保護基等が挙げられる。

ヌクレオシド（VIII) のが水素原子のとき、 B sはチミン又はその誘導 -体が好ましい。チミン又はその誘導体以外のヌクレオシドを用いる場合、塩基部への副反応が危惧されるため、塩基部に保護基を導入することが望ましく、アデニンとグァニンにはフエノキシァセチル（Pac)基、シトシンにはイソプチル（iBu)基を用いることができる。

ホスホロアミダイト（ I ) において、 R¹、 R，、 R²、 R" の意味は上記したとおりである。

R¹及び R²としては、 R¹及び R²のいずれか一方が水素原子で他方がフエ二ル基、 R¹及び R²のいずれか一方がメチル基で他方がフエニル基、あるいは R¹ 及び R²が共にフエニル基の組み合わせが好ましく、 R¹がフ: L二ル基、 R²が水素原子の組み合わせが更に好ましい。 R³はメチル基が好ましい。また、 R¹がフエニル基、 R²及び R³が窒素原子と共にピロリジン骨格を形成していることが好ましい。 R⁴及びがー OR⁵のときの R⁵は TBDP S、 T B D M Sが好ましく、 T BD PSが更に好ましい。

R¹及び R²が上記の組み合わせであるとき、 R' 及び R" は、水素原子、炭素数 1〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 1 4のァリール基から選択できる。本発明の一般式（ I ) で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイトにおいては、 R¹と R' は、同一又は異なっていてもよい、炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 14のァリール基である化合物が好ましい。また、 H-ホスホネート（一般式（XII) において Y二 H) を得る場合は、 R¹と R，の両方が水素原子ではなく（即ち、 R¹と R' が結合する炭素原子が第 3 級炭素であり）、かつ前記第 3級炭素の置換基がァリール基を含まない組み合わせにする。

ヌクレオシド (II) は、ゥリジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の 2位と 3位の水酸基を保護したものであり、 B sで示されるゥラシル、アデニン、シトシン、グァニン、チミン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド（VIII) で例示したものが挙げられる。

ヌクレオシド（II) とヌクレオシド（VIリ）の B sは、同一でも異なっていても良い。

R⁶は上記と同じものであり、 E，が一 0 R⁷のときの R⁷で示される水酸基の保護基としては、 TBDPS、 TBDMS、ァセチル基（A c) 、フエノキシァセチル基（PA c) 、ベンジル基 (B z ) 、 DMT r、 MM丁 r等が挙げられ、 R⁶、 R⁷は PA cが好ましい。

活性化剤（III) は、ホスホロアミダイ卜（ I ) の窒素原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。

活性化剤（III) 中、 X—としては、 BF₄-、 P F₆—、 T f O—、 T f ₂N—が好ましい。また、環状構造 Aは、窒素原子と共に形成する炭素数 3〜1 6のモノシクロ又はビシクロ構造を示し、特に式（IU-1) で表されるモノシクロ構造を有するものが好ましい。

(式中、 X—は前記と同じ意味を示す。 nは 3〜 7の数を示し、 4又は 5が好ましい。）

活性化剤 (III) は、式 (IX)

(式中、環状構造 Aは前記と同じ意味を示す。）

で表されるァミンと、次式（X) ：

HX (X) (式中、 Xは前記の意味を示す。）

で表される化合物とを反応させることにより容易に得ることができる。

活性化剤（III) は、特にァセトニトリルに良い溶解性を示すので、ホスホ口アミダイ卜（ I ) とヌクレオシド（M) の反応は、ァセトニトリル等の溶媒中で行うことが好ましい。

ホスホロアミダイト（ I ) とヌクレオシド（||) とは、ホスホロアミダイト ( I ) に対し、ヌクレオシド（II) を◦. 5〜 1. 0当量倍の割合で反応させることが好ましい。活性化剤（III) は、ホスホロアミダイト（ I ) に対し、

1〜 5当量倍の割合で用いることが好ましい。反応温度は 0〜40°Cが好ましく、反応圧力は 1気圧が好ましい。

以上の第 1反応工程により、下記一般式' (XI)

[式中、 R R²、 R³、 R R⁶、 D,, E 及び B sは前記と同じ意味を示す。 ]

で表されるホスフアイ卜〔以下「ホスフアイト (XI) 」という〕を得る。

〔第 2反応工程〕

まず、第 1反応工程で得られたホスフアイ卜（XI) を、無水酢酸、無水トリフルォロ酢酸等でァシル化した後、硫化剤、セレノ化剤、ボラノ化剤等の求電子試薬と反応させ、その後、一般式（XII) の化合物の不斉補助基を 1 , 8— ジァザビシクロ [5. 4. 0] ゥンデカー 7—ェン（DB U) 等で処理して除き、一般式 (XII)

E_1¾ B s及び Yは前記と同じ意味を示す。 ] で表される保護されたジリン酸部位修飾ジヌクレオチドを得る。なお、使用する求電子試薬の種類により（例えば、硫化剤として 1， 2, 4—ジチアゾリジン一 3, 5—ジオン、 3—エトキシ一 1， 2, 4—ジチアゾリンー 5—オン、 3— メチル一1 , 2, 4—ジチアゾリン一 5—オン等を用いた場合）、前段のァシル化工程を省略してもよい。

最後に、水酸基の保護基を、（CH₃CH₂) ₃N ■ 3 H F等で除き、一般式 (IV) 又は（V) で表される立体規則性の高いリポヌクレオチド類縁体を得ることができる。

また、本発明においては、上記した第 1反応工程と第 2反応工程を繰り返すことにより、一般式（XI I I) で表されるオリゴマー〔以下「オリゴマー

(XI I I) 」という〕を製造することができる。

一般式（I) で表されるモノマーの R¹が罈合する炭素が第 3級炭素であり (R¹と R' の両方が水素原子ではない）、かつ前記第 3級炭素の置換基がァリール基を含まない場合、第 1反応工程で得られたホスファイト（XI) を、無水酢酸、無水トリフルォロ酢酸等でァシル化した後、 1 %トリフルォロ酢酸ジクロ口メタン溶液等の酸で処理すると、不斉補助基が脱離して、対応する H-ホスホネート（XIし Y=H) が得られる。前記第 3級炭素の置換基のうち、 1っ以上がァリール基の場合は、第 2反応工程においてァシル化の工程を省略することができるが、生成するカルボカチオンを還元するために、トリェチルシランやボラン■ ピリジン錯体などの還元剤を添加する必要がある。

この方法で 2量体を合成する場合、得られた H -ホスホネート（XIし Y=H) に硫化剤を反応させれば、ホスホロチォェ一卜（XIし Y=S") が得られ、ァミンの四塩化炭素溶液を反応させれば、ホスホロアミデート（XIし Y=NR₂) が得られる。

この方法でオリゴマーを合成する場合、 5' 水酸基の保護基として DMTr基を有するモノマーを用い、上記の方法によって得られたホスフアイト中間体を酸処理することで不斉補助基と 5' 水酸基の保護基である DMTr基を同時に除去し、得られた 5' 位に水酸基を有する 2量体に対してモノマーを縮合し、上記工程を繰り返すことにより、 H -ホスホネート結合を有するオリゴマーを合成できる。

次に、 H-ホスホネ一卜結合を有するオリゴマーを 2量体の場合と同様に変換反応を行い、望みのリン原子修飾 DNAに導いた後に脱保護を行うことで、目的とする核酸類縁体を得ることができる。

—般式（XIII) 中、 nは 1〜 1 50の整数を示し、好ましい範囲は 5〜 50 であり、より好ましい範囲は 1 0〜30、更に好ましい範囲は 1 5〜22である。 D₂及び E ₂は水酸基又は水素原子を示す。

オリゴマー（XII I) は、固相法によるオリゴマー合成法を適用して製造することができ、具体的には市販の自動合成機（Expedite, ABI社製，又は ABI Model 394, DNA/RNA Synthesizer ABI社製）などを用いて合成するか、グラスフィルターのついた固相合成容器を用いた手動法で合成することができる。固相法で用いる固相担体としては、アミノアルキル化され、孔径が制御された多孔性ガラス（control led pore glass: CPG) 、アミノアルキル化された高架橋ポリスチレン（highly cross-l inked polystyrene: HCP) といった公矢!]の高分子担体であって，できるだけ膨潤性がな過剰に用いた試薬を洗浄によつて簡単に除去できるものが好ましい。

固相担体とリボヌクレオシドの 3' 又は 2' 水酸基のいずれかは、コハク酸エステル、シユウ酸エステル、フタル酸エステル等のリンカ一を介して結合しても良い。固相担体が結合していない 2' 又は 3' 水酸基の保護基としては、ァセチル基、ベンゾィル基、 2- (シァノエトキシ）ェチル基、 t-ブチルジメチルシリル基等の RNA合成及び DNA合成で一般的に用いられる保護基を挙げることができる。

本発明の製造法により得られる立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキシリボヌクレオチド誘導体は、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つであるアンチセンス法や RNA干渉に使用することができる。

本発明によれば、アンチセンス分子として有効な立体規則性の高いリボヌクレオチド類縁体及びデォキシリボヌクレオチド類縁体を高い収率で得ることができる。実施例

例中の％は特記しない限リ質量％である。

式および表中、 dr, d.にはジァステレオマ一比を、 rtは室温を、 equiv, eq は当量を、 TFAはトリフルォロ酢酸を、 Pyはピリジンを示す。

<活性化剤（III) の製造例 >

製造例 1-1 ： N—シァノメチルピロリジニゥムテトラフルォロボレイ卜の製造

アルゴン雰囲気下、 N—シァノメチルピロリジン 0. 551 g (5·. 00 mmol) のェチルエーテル（5. OOml) 溶液を一 78 °Cに冷却し、攪拌しつつ 54%四フッ化硼素酸ェチルエーテル溶液 0. 689ml (5. 0 Ommol) を滴下した。溶液を室温に戻した後、減圧下濃縮、乾燥し、残渣にェチルェ一テル

(5ml) を加えて激しく攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を 5回繰り返した後、真空乾燥し、目的物〔一般式（III) において、 _n =4、 X— =B F₄—の活性化剤〕 0. 990 g (5. 00圆 ol) を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性大。

-融点： 1 1 3. 0〜 1 14. 0°C

, I R (KB r ) _x : 2988, 2950, 2825, 2527, 2445, 1451, 1407, 1374, 1298, 1119, 929 cm"¹

^H— NMR (300MHz, CD₃CN) δ ： 7.17(br, 1H), 4.30(s,2H)， 3.51 (br,4H), 2.13〜2.08(m, 4H)

■ ¹³C— NMR (75 MHz, C D₃CN) δ： 112.0, 55.9, 41.8, 23.2。

製造例 1 - 2： Ν—シァノメチルピロリジニゥムへキサフルォロホスフエ一トの製造

6 1 %へキサフルォロリン酸水溶液 1. 20 g (5. O Ommol) に水 5. 0 Oml を加え、攪拌しつつ N—シァノメチルピロリジン 0. 55 1 g (5. 00 画 ol) を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にェチルエーテル（1 Oml) を加え、激し〈攪拌し、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を 3 回繰り返した後、真空乾燥し、目的物〔一般式（III) において、 n = 4、 X一二 P F₆—の活性化剤〕 1. 28 g (5. O Ommol) を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性大。

•融点： 56. 0〜5フ. 0°C

- I R (KB r ) ： 2988, 2828, 2532, 2448, 1626, 1457, 1296, 1082, 987, 834 cm-¹

' ¹Η— NMR (300MHz, CD₃CN) δ ： ,8.27 (br,1H), 4.24(s,2H), 3.48 (br,4H), 2.12〜2.08(m, 4H)

■ ¹³C— NMR (7 5 MHz, CD₃CN) δ： 112.1, 56.0, 42.1, 23.5

■ ³¹ P - N M R ( 1 2 1 MHz, C D₃C N) δ： -146.0 (septet, ¹ J _PF=707Hz) ₀ 製造例 1 - 3： N—シァノメチルピロリジニゥムトリフルォロメタンスルホネ一卜の製造

N—シァノメチルピロリジン 0. 55 1 g (5. 0 Omtnol) のジクロ口メタン（5. 0 Oml) 溶液を 0°Cに冷却し、攪拌しつつトリフルォロメタンスルホン酸 0. 442ml (5. O Ommol) を滴下した後、ェチルエーテル（1 0ml) を加えた。生じた固体を吸引ろ過によって集め、ェチルエーテル（1ml X 3) で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物〔一般式（III) において、 n = 4、 X-=T f O—の活性化剤〕 1. 1 1 _g (4. 27mmol) を得た。収率 85。ノ₀。白色粉末。潮解性小。

-融点： 67. 0〜67. 5°C

■ I R (KB r ) ： 2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm—¹

■ ¹H-NMR (300MHz, C D₃CN) δ ： 8.16(br, 1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2· 09 (m， 4H)

■ ¹³C— NMR (75 MHz, CD₃CN) δ ： 121.2(q, ¹J_CF=320Hz) , 55.9, 42.0, 23.5。

製造例 1 - 4： Ν—シァノメチルビペリジニゥムテトラフルォロボレ一卜の製造

Ν—シァノメチルビペリジン 1. 24 g (1 0. Ommol) のジクロロメタン (1 0. Oml) 溶液に対し、攪拌しつつ 54%四フッ化硼素酸ェチルエーテル溶液 1. 38ml (1 0. Ommol) を滴下した。溶液をェチルエーテル（20 ml) で希釈し、生じた固体を吸引ろ過によって集め、ェチルエーテル（1 0 mi x 2) で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物〔一般式（I I I) において、 n = 5、 X— =B F₄—の活性化剤〕 2. 0 1 g (9. 48mmol) を得た。収率 9 5%。白色粉末。潮解性なし。.

'融点： 1 03. 0〜 1 03. 5°C

■ I R (KB r ) y_mx 3149, 2997, 2952, .2876， 2591, 2570, 2491, 2372, 1457, 1422, 1296, 1074, 980, 935, 850, 641 cm"¹

- ¹H— NMR (300MHz, CD₃CN) δ 6.74(br, 1H), 4.22(s,2H), 3.58(br,2H), 3.15(br,2H), 1.97〜1.51 (m， 6H)

- ¹³C-NMR (75 MHz, CD₃CN) δ ： 111.2, 54.6, 44.0, 23.0, 20.5。製造例 1 - 5： Ν—シァノメチルビペリジニゥムへキサフルォロホスフエ一トの製造

6 1 %へキサフルォロリン酸水溶液 1 · 20 g (5. 0 Ommol) に水 5. 0 Oml を加え、攪袢しつつ N—シァノメチルビペリジン 0. 62 1 g (5. 00 画 ol) を滴下した後、溶液を凍結乾燥した。残渣にジクロロメタン（5mi) 、ェチルエーテル（1 0ml) を加え、一 78°Cに冷却し、激しく攪拌すると固体が生じたので、室温に昇温した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。残渣にェチルエーテル（5ml) を加え、激しく攪拌した後、シリンジを用いて溶媒を除去した。この洗浄操作を 3回繰り返した後、真空乾燥し、目的物〔一般式

(III) において、 n = 5、 X— =P F₆—の活性化剤〕 1. 31 g (4. 85 mmol) を得た。収率 97%。白色粉末。潮解性大。

•爾虫点： 54. 0〜55. 0°C

- I R (KB r ) v_mm： 2997, 2953, 2876, 2589, 2570, 2490, 2372, 1655, 1455, 1422, 1297, 1192. 1142, 1084, 1037, 981, 953, 837, 746 cm^-1

- ¹H-NMR (30 OMHz, CD₃CN) δ ： 7.94 (br, 1H), 4.15(s,2H), 3.31 (br,4H), 1.92〜1.83 (m, 4H) , 1.63(br,2H)

- ¹³C— NMR (75MHz, CD₃CN) δ 111.5, 54.5, 44.2, 23.1, 20.8

■ ³¹ P - N M R (1 21 MHz, CD₃CN) δ ： -145.9 (septet, ¹J_PF=707Hz)。製造例 1 - 6： N—シァノメチルビペリジニゥム卜リフルォロメタンスルホネ

—卜の製造

N—シァノメチルビペリジン 0. 621 g (5. 00圆 ol) のジクロ口メタン（5. 0 Oml) 溶液を 0°Cに冷却し、攪拌しつつトリフルォロメタンスルホン酸 0. 442ml (5. 0 Ommol) を滴下した。溶液を室温に昇温し、ェチルエーテル（1 Oml) を加えた後、固体を吸引ろ過によって集め、ェチルェ一テル（1ml x 3) で洗浄した後、減圧下乾燥して、目的物〔一般式（III) において、 n = 5、 X— =T f O—の活性化剤〕 T. 37 g (5. 0 Ommol) を得た。収率定量的。白色粉末。潮解性小。

-融点： 1 1 0. 0~ 1 1 0. 5°C

■ I R (KB r ) v_mx： 2999, 2723, 1460, 1289, 1226, 1168, 1083, 1027, 978, 936, 762, 641 cm一¹

' ¹Η— NMR (300MHz, C D₃C N) δ 8.12(br, 1H), 4.19(s,2H), 3.58(br,2H), 3.09(br,2H), 2.21(br,4H), 1.50(br, 1H)

, ¹³C— NMR (75 MHz, CD₃CN) 6 ： 120.9 (q, ¹J_CF=319Hz), 111.4, 54.5, 44.2, 23.0, 20.7。

<ホスフイチル化剤（VII) の製造 >

製造例 2 - 1 : (5S) —2—クロロー 3—メチル一5—フエ二ルー 1， 3, 2—ォキサァザホスホリジンの製造

(S) —2—メチルアミノー 1—フエニルエタノール 3. 02 g (1 5. 0 mmol) 、トリェチルァミン 5. 58ml (40. Ommol) のテトラヒドロフラン (TH F) (20. Oml) 溶液を 0°Cに冷却した三塩化リン 1. 75ml (20. Ommol) の T H F (20. Oml) 溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして 30分間攪拌した。生じた塩を、グラスフィルタ一でアルゴン雰囲気下ろ過し、塩を TH F ( 1 Oml X 3) で洗浄した。

ろ液を濃縮し、残渣を減圧下蒸留することにより、目的物〔一般式（VII) において、 R¹-フエニル基、 R²=H、 R³=メチル基である化合物の 5 S体〕 2. 59 g (1 2. Ommol) を得た。収率 60%。 89〜90°CZ0. 2画 H go 無色透明液体。

■ ¹H-NMR (300MHz, CDC I ₃) δ ： 7.54〜7.34 (m, 5Η)， 5.83,

5.44 (br.br, 1H), 3.60〜3,42(m, 1H), 3.22〜3· 12(m, 1H) ,

• ³¹ P - N M R (1 21 MHz, CDC I ₃) δ ■■ 172.4(br), 171.3(br)。

製造例 2 - 2 : (5 R) —2—クロ口一 3—メチル一5—フエニル一 1 , 3, 2—ォキサァザホスホリジンの製造

(R) —2—メチルアミノー 1—フエニルエタノール 2. 27 g (1 5. 0 國 ol) を用い、製造例 2-1 と同様の手法により目的物〔一般式（VII) において、 R¹ フエニル基、 R²=H、 R³=メチル基である化合物の 5 R体〕を製造した。収率 65%。 81〜82°CZ0. 2mmHg。無色透明液体。

' ¹H— NMR (300MHz, CDC I ₃) δ ： 7· 55〜7.35 (m, 5Η)， 5.84,

5.46 (br.br, 1Η),

3.58〜3.43(m, 1Η), 3· 22〜3· 13 (m, 1H) , 2.78 (d, ³J_HP=16.5Hz, 3Η)

■ ³¹ P - N M R (1 21 MHz, CDC I ₃) δ ： 172.4(br), 171.4(br) 製造例 2-3 : (2 R, 4 S, 5 R) —2—クロ口一 3—メチル一4, 5—ジフエ二ルー 1 , 3， 2—ォキサァザホスホリジンの製造

( 1 R, 2 S) —2—メチルアミノー 1 , 2—ジフエニルエタノール 2. 2 7 g (1 0. Ommol) 、卜リエチルァミン 2. 79ml (20. Ommol) の TH F (1 0. Oml) 溶液を、 0°Cに冷却した三塩化リン 0. 872ml (1 0. 0 mmol) の TH F (1 0. Oml) 溶液に対して、攪拌レつつ滴下した後、 1時間加熱環流した。

溶液を室温まで放冷し、生じた塩を、グラスフィルタ一でアルゴン雰囲気下ろ過し、塩を TH F (1 Oml X 2) で洗浄した後、ろ液を減圧下濃縮して、目的物〔一般式（VII) において、 R¹-フエニル基、 R²=フエニル基、 R³=メチル基である化合物の 2 R, 4 S, 5 R体〕 3. 1 7 g (1 0. Ommol) を得た。収率定量的（純度 92%) 。乳白色固体。

■ ¹H-NMR (30 O Hz, CDC I ₃) δ 7.08〜7, 05 (m, 6Η) , 6.91- 6.81 (m, 4H) , 6.15 (d, ³J=8.3Hz, 1H), 4.64 (dd, ³J_HH=8.3Hz， ³J_HP=4.2Hz, 1 H) '

2.64(d,³J_HP=15.3Hz,3H)

■ ³¹ P - N M R (1 21 MHz, CDC I ₃) δ 171.7₀

<ホスホロアミダイ卜 ( I ) の製造 >

製造例 3-1

5' - 0 - 〔ビス（4-メトキシフエ二ル）フエニルメチル〕 -3' - 0 - 〔 (2S, 5S) -3 -メチル -5-フエニル- 1,3, 2-才キサザホスホリジン- 2-ィル〕 - 2' - 0- (tert -プチルジメチルシリル）ゥリジン [(Sp)- 19b]の製造

5' -0- 〔ビス（4 -メトキシフエ二ル）フエニルメチル〕 -2' -0- (tert -プチルジメチルシリル）ゥリジン（4) (0.820 g, 1.5mmol) を、ピリジン、トルェンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF (7.50 ml) 溶液とした。

これにトリェチルァミン (1.05ml, 7.5画 I) を加え、 -78。 G に冷却した後、アルゴン雰囲気下、下記式及び表 1に示す（5S)-18bの 0.22M THF溶液を滴下した。反応混合物を室温で 30分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (75 ml) 及びクロ口ホルム（75 ml) を加えた。有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄（75 mlx2) し、集めた洗液をクロ口ホルム（75 ml 2) で抽出した。

集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5x14cm, シリカゲル 40g, トルェンー酢酸ェチルートリエチルァミン（10:1:0.2, v/v/v) 〕で分離精製した。目的物を含むフラクションを集め、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100 ml) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式及び表 1に示す (Sp)- 19b を収率 70%で得た。無色非晶質。

1H NMR (300 MHz, CDC I ₃) <5 8.80 (br, 1H), 8.20 (d, ³J_HH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 13H), 6.84 (m, 4H), 5.80 (s, 1H), 5.58 (t, ³J_HH = 6.6Hz 1H), 4.60 (m, 1H), 4.18 (br, 2H), 3.80 (s, 6H), 3.40 ( m, 2H), 1.40- 1.00 (m, 6H), 0.91 (t, ³J_HH = 13.5Hz 9H)， 2.22 (d, ³J_HH = 13.5Hz 6H).

製造例 4 - 2

5' -0-〔ビス（4-メチルフエニル）フエニルメチル〕 -3' -0 - 〔 (2R.4S.5R) 一 5—フエ二ル―テトラヒドロー 1H.3H -ピロ口〔1,2-G〕 - 1,3,2 -才キサザホスホリジン- 2-ィル〕 -2' -0- (tert-プチルジメチルシリル）ゥリジン [(Sp)-19d]の製造

5' -0-〔ビス（4-メトキシフエ二ル）フエニルメチル〕 -2' -0- (tert-プチルジメチルシリル）ゥリジン（4) (0.820g, 1.5mmo I ) を、ピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF (7.50ml) 溶液とした。

これにトリェチルァミン（1.05 ml,7.5inmol) を加え、一78° Gに冷却した後、アルゴン雰囲気下、下記式及び表 1に示す（5S)- 18dの 0.22 M THF溶液を滴下した。反応混合物を室温で 30分間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（75ml) 及びク t]口ホルム（75ml) を加えた。

有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄（75ml x2) し、集めた洗液をクロ口ホルム（75ml x2) で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一〔2.5 x14cm, シリカゲル 40g, トルエン一酢酸ェチルートリエチルァミン（10:1:0.2, v/v/v) 〕で分離精製した。

目的物を含むフラクションを集め、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液

(100ml) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式及び表 1に示す（Sp)- 19d を収率 46%で得た。無色非晶質。

1H NMR (300 MHz, C D C \ _ζ) δ 9.82 (br, 1Η), 8.17 (d, ³J_HH = 8.1Hz, 1H), 7.42-7.18 (m, 14H), 6.81 (m, 4H), 5.88 (s, 1H), 5.71 (d, ³J_HH = 6.6Hz, 1H), 5.18 (d, ³J_HH = 8.1Hz, 1H), 2.62 (br, 1H), 4.40 (s, 1H)， 4.28 (d, 1H), 3.83 (br, 1H), 3. 8 (s, 6H), 3.60 (m, 3H), 3.20 (br, 1H), 2.39 (s 1H),' 2.64 (br, 2H), 1.21 (br, 1H),0.97 (s, 9H), 0.24 (s, 6H).

表 1

卜

R³ R⁴ R⁵ 19a-d^a trans： cis

1 18a iPr H P 19a 87 ·· 13

2 18b CH₃ H Ph 19b 94: 6

3 18c (CH2)₃ H 19c

4 18d (CH₂)₃ Ph 19d >99： 1 a ： ³ュ？ NMRで測定されたジァステレオマー比率

実施例 1

下記反応式により、ホスホロアミダイト（I) と、ヌクレオシド（II) とを、活性化剤（III) を用いて縮合した後、硫化反応を行った。 ^Pyridine(1°^eqUiV)

Ac₂0 ( 2 equi )

(Sp .

d.r. > 99:1*

(Sp)-7 (Sp)-9 d.r. > 99:1' d. >99:1* d.r. > 99:1*

* ³¹ P NMRによって測定されたジァステレオマ一比

その後、下記反応式により、脱保護を行い目的とするリボヌクレオチド類縁体を得た。

(Sp)-11 (fip)-11

Sp:flp = >99:1 Sp:Rp = >1:99

逆相 HPLCにより測定。逆相 HPLCにより測定。

(flp)-3cから 37%, 6工程 (Sp)-3cから 32%, 6工程上記反応における詳細な反応操作は、以下のとおりである。なお、縮合反応の反応追跡ならびに生成物のジァステレ'ォマ一比の測定は全て以下の要領で行つた。剛 Rサンプルチューブ中、 trans - 19b (50jumol)と 2' ,·3' -0 -フエノキシァセチルゥリジン (50 mol) を、 P₂0₅上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8 時間乾燥した N - （シァノメチル）ピロロリジニゥムトリフルォロロンメタンスルホネート（27a) (400 1, 100 mol) の 0.25Mァセトニトリル溶液と

CD₃CN(100ju I) をアルゴン雰囲気下加えた。その 3分後、 NMRによる積算を開始し、反応のジァステレオマ一比は NMRシグナルの積分比によって決定した。

(化合物 3→6)

NMRサンプルチューブ中、 trans- 19b (0.0520 g , 50 mo I ) と 2' ，3' - 0-フエノキシァセチルゥリジン（0.0256£,50^υηιοΙ) を Ρ₂0₅上で 12時間真空乾燥し. MS 3Αで 8時間乾燥した Ν— （シァノメチル）ピロロリジニゥムトリフロロ口メタンスルホネート（27a) (400 1, 100 mol) の 0.25Mァセトニトリル溶液と CD₃CN (100 ju I) をアルゴン雰囲気下加えた。

(化合物 6→7)

これを 15分間良くかき混ぜた後に、ピリジン（43 I， 0.5瞧 01 ) と無水酢酸 (10jU I, 0.1國 ol) をマイクロシリンジで加えて、化合物 6を 7ベと変換した。

(化合物 7→8)

更にこの溶液中に Beaucage reagent (0.0120g, 0.06mmo I ) を加え、化合物 7の硫化を行った。

(化合物 8→9)

ここで、 NMRサンプル管から 50ml細口のナスフラスコに反応溶液を移し変え、 3ml のピリジンで洗いこみを行った後、これにアンモニア水一エタノール（3:1, v/v) 混合溶液 20m I を加え、密栓をして 60°Cで 4時閩加熱処理を行った。

加熱後に、溶媒を減圧下留去し、 0.1M TEAAバッファ一 5ml とジクロ口メタン 5ml を加え、化合物 9を有機相へ回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥を行った。

(化合物 9→10)

十分乾燥させた化合物 9に対し、 3HF- ξ1:₃Ι\Ι 1.5ml を neatで加え、 2時間撹拌した後に、 0.1M AAバッファ一 3ml とメタノール 3ml を加え、エーテル 3ml を用いて洗浄したのち、水相を回収し減圧下濃縮乾燥を行い、更に凍結乾燥を繰り返すことにより、脱塩を行った。

(化合物 10→11)

凍結乾燥を行った後の化合物 10に 80%酢酸水溶液 20ml を加え、 30分間室温で撹拌した後、減圧下濃縮乾燥を行った。 80%酢酸を留去した後、ジェチルエーテル 3ml を用いて洗浄した後、蒸留水を用いて抽出を行った。回収した水相を減圧下濃縮乾燥し、更に凍結乾燥を繰り返し、脱塩を行った後、逆相 HPLG 及び UVによる分析を行った。その結果、（Sp)-11 を、縮合からのトータル収率 37%で得た。

実施例 2 下記の各反応工程（1 ) 〜（4) 及び（5) の反応（下記反応式）により、オリゴマー（XIII) を製造した。

( 1 ) 縮合反応

固相担体 [highly cross- linked polystyrene (HCP)] に結合したリボヌクレ才シド〔一般式（ I ) 〕 immol に対して 20当量のモノマ一ユニット〔一般式 (II) 、 (III) のュニット〕（0.2 Ml) 、 50当量の活性化剤（N -シァノメチルアンモニゥ厶塩， 0.5 M) をァセトニトリル中で 90秒間反応させた。反応終了後、ァセトニトリルで洗浄した。

(2) キャップ化反応（ァセチル化反応）

固相担体に結合したリボヌクレオチドを無水酢酸： N -メチルイミダゾ一ル： THF=1 ： 2 ： 7の混合溶液で 60秒間処理し，未反応の 5' 水酸基及び遊離した不斉補助基のアミノ基をァセチル化した。応終了後，ァセトニトリルで洗浄した。

(3) 硫化反応

固相担体に結合したリボヌクレオチドを 50当量の Beaucage試薬（0.5 M) のァセトニトリル溶液で 60秒間処理し，ホスファイト中間体を硫化した。反応終了後，ァセトニトリルで洗浄した。

(4) 脱トリチル化反応

固相担体に結合したリボヌクレオチドを 3 ¾トリクロ口酢酸のジクロロメタ — ン溶液で 60秒間処理し， 5' 末端の DMTr基を除去した。反応終了後、ジクロロメタン、次にァセトニトリルで洗浄した。

(5) 鎖延長反応と、脱保護反応及び精製

上記の（1 ) から（4) の反応操作を繰り返し、オリゴリボヌクレオチド鎖を固相担体上で延長した。

目的とする鎖長のオリゴリボヌクレオチド誘導体が固相担体上に合成できたら、固相担体を 25%アンモニア水：エタノール（3:1, v/v) で 60 ° Cで 15時間反応させて，塩基部及びリン酸部位の保護基を除去した。このとき， 3' 末端の水酸基の保護基と固相担体からのオリゴマーの切り出しも同時に進行した。固相担体を濾過して除き、濾液を減圧下濃縮乾燥後、 Et₃N ' 3HF (100当量）を加え、室温で 2時間反応させて 2' 水酸基の保護基である TBDMS基を除去した。反応終了後、減圧下 Et₃M ' 3HF を留去して乾燥後、水（1ml) に溶解して. エーテル（1 mi x 3回）で洗浄した。水層を減圧下で濃縮乾燥した後に、水

( 1ml) に溶解し、逆相 HPLGによって精製して、収率 20— 70%の範囲で目的物を得た。

実施例 3

〔スキーム 1 ：キラル不斉補助基としての 1,2—ァミノアルコールの合成〕

3a (R = Ph) 88% 4a (R = Ph) 60% 3b (R = Me) 98% 4b (R = Me) 88%

(S) -プロリン- N-ェチルカルバメート（1)の合成

10規定の NaOH水溶液 (50 ml)に S- proline (5.75 g, 49.9 画 ol)を加え、 0 °Cに冷却し、攪拌しつつ 40分間かけて chloroformic acid ethyl esther (5.75 ml, 60.4 剛 o I)を、 pH 9 - 10に保ちつつ、滴下した。室温で 3.5時間攪拌した後、ジクロロメタン（30 ml)を加え、 1規定の HGI水溶液（360 ml)を加えて pH 1にしたのち、ジクロロメタン（300 ml X 10)で抽出し、無水硫酸ナトリウ厶で乾燥し、濾過レ、減圧下濃縮して 1 (9.19 g, 98%)を得た。無色透明液体。

¹H NMR (CDGIg) δ 10.85 - 10.42 (br, 1H), 4.41 - 4.30 (m, 1H), 4.22 - 4.15 (m, 2H), 3.60 - 3.37 (in, 2Η), 2.32一 2.20 (m, 1H), 2.17 - 2.05 (m, 1H), 1.98 - 1.90 (m, 2H), 1.31- 1.19 (m, 3H)； IR (NaCI, cm-¹) 3459 (一 C00H) , 1724 (-C00H) , 1682 (N- C=0)。

(S) -プロリン- N -ェチルカルバメ一トメチルエステル（2)の合成

Ar雰囲気下、 S-prol ine-N-ethyl carbamate 1 (9.19 g, 49.1 瞻 I)にメタノール（150 ml)を加え、 0 °Cに冷却し、攪拌しつつ thionyl chloride (5.40 ml, 74.3 raiol)を加えた。室温で 5時間攪拌したのち、減圧下、メタノールを留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100 ml)を加え、クロ口ホルム（100 ml x3)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮して 2 (9.80 g, 99%)を得た。無色透明液体。

¹H NMR (CDC 1₃) δ 4.29 - 4.20 (m, 1H), 4.08 - 3,98 (m, 2H), 3.65 (s, 3H), 3.56 - 3.35 (m, 2H) , 2.21 - 2.09 (m, 1H), 1.94 - 1.82 (m, 3H), 1.21 - 1.10 (m, 3H)； IR (NaCI, cm"¹) 1751 (COOMe), 1702 (N-C=0) ₀

N-ェチルカルバメート-（2S)- , a-ジフエニル（ピロリジン- 2-ィル）メタノール（3a)の合成

(S) - Pro l ine - N - ethyl carbamate methyl esther 2 (5.03 g, 25.0 瞻1)をトルエンで繰り返し共沸を行い、 THF (50 ml)に溶かし、 0 °Cに冷却した。攪拌しつつ、 THF (96.2 ml)に溶かした PhMgBr (18.0 ml, 100.0 議 ol)を加え、 0 °Cで 3時間攪拌した。飽和塩化アンモニゥム水溶液 (50 ml), 飽和塩化ナトリウム水溶液（50 ml)を加え、クロ口ホルム（50 mi x 3)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮したのち、へキサン 30 ml を加え、激しく攪拌し、吸引濾過し、真空乾燥して 3a (7.22 g, 88%)を得た。無色非晶質。 ^ NMR (CDCI₃) δ 7.40 - 7.12 (m, 10H), 4.94 — 4.87 (m, 1H), 4.19 - 3.98 (m, 2H), 3.45 - 3.35 (m, 2H), 2.17 - 2.02 (m, 1H), 1.99 - 1.88 (m, 1H), 1.55 - 1.42 (m, 1H), 1.25一 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H)； IR (NaCI, cm"¹) 3375 (-OH), 1680 (N-G=0)。

N -ェチルカルバメート-（2S)- -メチル（ピロリジン - 2 -ィル）エタノール (3b) の合成

Ar雰囲気下、マグネシウム（4.80 g， 197.3 mmol)にエーテル（100 ml)を加え、 0 °Cに冷却し、攪拌しつつ、 methyl iodide (12.5 ml, 200.7 園 ol)を溶かしたエーテル（50 ml)を加えた。室温で 45 分攪拌したのち、 0 °Cに冷却し、攪拌しつつ、（S)-Prol ine- N-ethyl carbamate methyl esther 2 (9.80 g, ' 48.7 mmol)を溶かしたエーテル（50 ml)を加えた。 0 °Cで 1.5時間攪拌したのち、飽和塩化アンモニゥム水溶液 (75 ml), 飽和塩化ナトリウム水溶液 (75 ml) を加え、ジクロロメタン（150 ml x3)で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮して 3b (9.60 g， 98%)を得た。黄色透明液体。

1H NMR (CDCI₃) δ 5.72 - 5.66 (br, 1H), 4.09 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.84 (t， J = 7.5 Hz, 1H)， 3.72一 3.62 (m, 1H), 3.20 - 3.11 (m, 1H)， 2.03 - 1.94 (m, 1H), 1.84 - 1.76 (m, 1H), 1.69 - 1.51 (m, 2H), 1.24 - 1.20 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.03 (s, 3H)； IR (NaCI, cm"¹) 3391 (- OH), 1670 (N - G=0)。

(2S)- of, ひ-ジフエニル（ピロリジン- 2 -ィル）メタノール（4a) の合成 N - ethyl carbamate- (2S)- a, a -di phenyl (pyrrol i d i η-2-y I ) methano I 3a (6.51 g, 20.0 raiol)にメタノール（40 ml)を加え、攪拌しつつ、水酸化カリゥム（11.2 g, 200.0 画 ol)を加えた。昇温し、攪拌しつつ 4時間加熱還流したのち、減圧下、メタノールを留去し、水 50 ml を加え、ジクロロメタン（50 ml 2)で抽出し、飽和食塩水（100ml X 2)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。得られた結晶にへキサン（50 ml)を加え、激しく攪拌したのち、吸引濾過を行い、白色粉末を得た。得られた白色粉末を、 ¹H N R (GDGI₃)で測定したところ、ケミカルシフトが文献記載のものと異なること、 ¹³C剛 R (CDGI₃)で測定したところ、炭素数が 14であること、さらに得られた白色粉末（5 mg)をマンデル酸（3 mg)との塩を形成させ、 ¹H NMR (CDGI₃) で測定したところ、シグナルがシフトしなかったことから、得られた白色粉末！ま目的物 4aではなく、ォキサゾリジノン環を形成していると判断した。そこで、全て回収し、同様の条件で 6時間反応をおこなった。精製も同様に行い、 4a (2.99 g, 60%)を得た。無色非晶質。

¹H NMR (CDCI₃) δ 7.57 - 7.11 (m, 10H), 4.26 — 4.21 (m, 1H), 3.06 - 2,89 (m, 2H)， 1.78 - 1.52 (m, 4H)； IR (KBr, cm -¹) 3350 (- OH, NH)。

(2S)—ひ-メチル (ピロリジン- 2 -ィル) エタノール (4b) の合成

N-ethy I carbamate- (2S)- a? -methyl (pyrrol i d i η-2-y I ) ethano I 3b (9.60 g, 48.7 mmol)にメタノール（50 ml)を加え、 0 °Cに冷却し、攪拌しつつ、水酸化カリウム（27.0 g， 481.1 mmol)を加えた。昇温し、攪拌しつつ 4時間加熱還流したのち、減圧下、メタノールを留去し、水 50 ml を加え、 pHlになるまで濃塩酸を加え、エーテル（100 ml x2)で洗浄し、生じた沈殿物もともに水相を回収した。 pH 12になるまで水酸化カリウムを加え、沈殿物を吸引濾過により取リ除いたのち、ジクロロメタン（200 ml X 6)で抽出し、無水硫酸ナトリゥムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮して 4b (5.54 g, 88%)を得た。黄色針状結晶。 ¹H 剛 R (CDCI₃) δ 3.03 - 2.87 (m, 3H)， 2.66 - 2.48 (br, 2H), 1.80 - 1.58 (in, 4Η), 1.16 (s, 3H), 1.13 (s, 3H)； IR (KBr, cm—¹) 3376 (-0H, NH) ₀ 〔スキーム 2 ：ホスフイチル化剤の合成〕

5a (

5b (

(4S) -2-クロロテトラヒドロ- 1H, 3H -ピロ口 [1 , 2 - G]- 5, 5 -ジフェ二ルー 1 , 3, 2- ォキサァザホスホリジン（5a) の合成

(2S) - ， - di phenyl (pyrrol id in - 2 - yl) methanol 4a (1.27 g, 5 mmol) ¾：卜ルェンを用いて共沸乾燥し、トルエン 2.5 ml に溶かした。溶液に N- methylmorphol ine (1.1 ml, 10.0 画 ol)を加え、この混合溶液を Ar 雰囲気下、 phosphorus trichloride (0.44 ml, 5.0 mmol)のトルエン溶液に対し、攪拌しつつ 0 °Cで滴下した。反応混合物を室温で 30分攪袢したのち、生じた塩を Ar 雰囲気下、 - 78°Cで濾別し、 Ar雰囲気下、濾液を減圧濃縮し、 5a (1.79 g, crude)を得た。

¹H NMR (CDGI₃) δ 7.57 - 7.01 (m, 10H), 4.68 — 4.51 (m, 1H), 3.44 -

3.35 (m, 1H), 3.17一 3,07 (m, 1H), 2.06一 1.89 (m, 2H), 1.67一 1.24 (m,

2H) ; ³¹P NMR (121 MHz, CDCI₃) δ 158.2 · (71%) , 173.6 (29%) ₀

(4S)-2 -クロロテトラヒドロ- 1H, 3H -ピロ口 [1, 2-c] - 5, 5-ジメチルー 1, 3, 2-2- ォキサァザホスホリジン (5b) の合成

(2S)-oi -methyl (pyrrol idin-2-yl)ethanol 4b (1.95 g, 15.1 mmol)をトルェンを用いて共沸乾燥し、トルエン 5.0 ml に溶かした。溶液に N - methylmorphol ine (3.3 ml, 29.8 mmol)を加え、この混合溶液を Ar 雰囲気下、 phosphorus trichloride (1.4 ml, 16.0 mmol)のトルエン溶液に対し、攪拌しつつ 0 °Cで滴下した。反応混合物を室温で 30分攪拌したのち、生じた塩を Ar 雰囲気下、 - 78°Cで濾別し、 Ar雰囲気下、濾液を減圧濃縮した。減圧蒸留（bp. 55 。C/ 0.2 mmHg)により精製を試みたが単離にはいたらず、 5b (0.85 g, crude)を得た。無色透明液体。 ·

¹H NMR (CDCIg) δ 3.70 - 3.61 (m, 1H), 3.53 - 3.40 (m, 1H), 3.19 - 3.05 (m, 1H), 2.21 - 2.04 (m, 2H), 1.84 - 1.71 (m, 2H), 1.53 (s, 3H), 1.37 (s, 3H)； ³¹P NMR (121 MHz, CDGI₃) δ 171.0 (35%) , 164.5 (26%), 161.6 (39%)。

〔スキーム 3 ：ォキサァザホスホリジン誘導体の合成〕

表 2 dr

5 temp., time 収率

(Sp)-7： (flP)-7*

7a (R = Ph) 3.3 equiv reflux 15 h >99： 1 70%

7b (R = Wle) 2.4 equiv Π2 h 98： 2 36%

*³¹P MRにより測定

5' - 0- (tert -プチルジフエニルシリル）- 3' - 0- [(2S, 5R)- 5, 5-ジフエ二ル-テトラヒドロ- 1H， 3H-ピロ口 [1,2-c]-1,3, 2- 2-才キサァザホスホリジン- 2 -ィル] チミジン（7a) の合成

5' -0- (tert-Buty I d i pheny I s i I y I ) thym i d i ne 6 (722.3 mg, 1.5 mmol)をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF溶液とした。これに Et₃N (1, 1 ml, 7.9 mmol)を加え、 - 78°Cに冷却したのち、 Ar雰囲気下 (4S) - 2 - ch I orotetrahydro-1 H, 3H-Pyr ro [1 , 2 - c] - 5, 5-d i pheny 1-1 , 3, 2- oxazaphosphol idine 5aの 0.22 THF溶液 22.5 ml (5.0 mmol)を滴下した。反応混合物を室温で 3時間攪拌したところ、反応が完了していなかったので、終夜で加熱還流を行った。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（75 ml)及びクロ口ホルム（75 ml)を加えた。有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄（75 ml x2)し、集めた洗液をクロ口ホルム（75 ml x 2)で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。残渣を酢酸ェチルに溶かし、へキサンに滴下して目的化合物を再沈殿させた。吸引濾過で固体を回収し、へキサンで洗浄して 7a (801.6 mg, crude)を得た。無色非晶質。

¹H R (CDGI₃) δ 7.65 - 7.12 (m, 11H), 6.13 (dd, ³J_HH = 7.8, 7.8 Hz, 1H), 4.65一 4.57 (m, 1H), 4.55 ― 4.49 (m, 1H)， 3.79 (dd, ²J_HH = 11.3 Hz, ³J_HH = 2.4 Hz, 1H), 3.84 (dd, ²J_HH = 11.7 Hz, ³J_HH = 2.4 Hz, 1H), 3.57 一 3.48 (m, 1H), 3.45 ― 3.44 (m, 1H), 3.17 一 3.07 (m, 1H), 2.33 - 2.25 (m 1H), 1.92 - 1.82 (m, 1H), 1.81 - 1.50 (m, 4H), 1.49 (s, 3H), 1.06 (s, 9H)； IR (KBr, cm"¹) 3423, 2930， 1688, 1466, 1448， 1278, 1113, 1066, 958,

5' - 0-(tert -プチルジフエニルシリル） - 3' - 0 - [(2S, 5R)-5, 5-ジメチル-テ卜ラヒドロ- 1H，3H-ピロ口 [1,2- G] - 1,3, 2 - 2 -ォキサァザホスホリジン - 2 -ィル]チミジン（7b) の合成

5' -0- (tert-Buty I d i pheny I s i I y I ) thym i d i ne 6 (1.31 , 2.72 mmol)をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、 THF溶液（7.50 ml) とした。これに Et₃N (1.9 ml, 13.6圆 ol)を加え、 - 78°Cに冷却したのち、 Ar 雰囲気下（4S)- 2- chloro tetrahydro - 1H, 3H-Pyrro[1, 2-c]-5, 5-d i methyl - 1,3, 2-oxazaphosphol idine 5bの 0.38 M THF溶液 (10.0 ml, 3.81 mmol)を滴下した。反応混合物を室温で 30分攪拌したのち、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100 ml)及びクロ口ホルム（100 ml)を加えた。有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄（100 ml X 2)し、集めた洗液をクロ口ホルム (200 mlxl)で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ [4x16 cm, 100 g of silica gel , hexan-ethy I acetate - tri ethyl amine (50:50:5，

v/v/v) → hexan-ethy I acetate- tr i ethyl amine (50:50:2, v/v/v)]で分離精製した。 7bを含むフラクションを集め、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100 ml x 1)で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮して 7b (614.8 mg, 36%)を得た。蕪色非晶質。

¹H MR (CDCI₃) δ 9.83— 9.63 (br, 1Η), フ.68— 7, 34 (m, 11H), 6.42 (dd, ³J_HH = 8.1, 8.1 Hz, 1H), 4.90 - 4.85 (m, 1H)， 4.09 - 4.08 (m, 1H)， 3.99 (dd, ²J_HH = 11.7 Hz, ³J_HH = 2.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, ²J_HH = 11.1 Hz, ³J_HH = 2.1 Hz, 1H), 3.53一 3.47 (m, 2H), 3.09一 2.09 (m, 1H), 2.53一 2,46 (m, 1H), .2.24一 2.15 (m, 1H), 1.85一 1.65 (m, 4H), 1.58 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.11 (s, 9H) ; ³¹P NMR (121 MHz, CDCI₃) δ 152.2 (98%) , 142.9 (2D; IR (KBr, cm—¹) 3423, 2963, 1689, 1467, 1428, 1273, 1113, 1074, 956。 '

〔スキーム 4 ： 7と 9の縮合〕

表 3 dr dr

e

(Sp)-7： tim

(Rp)-7* (Rp)-10： (Sp)-10^:

7a (R= Ph) > 99 : 1 20 min 87： 13

7b {R = Me) 98 :2 < 5 min 97 :3

99： 1 < 5 min 98 :2

*³¹P Rにより測定。

³¹P NMR分光分析法による 8の存在下における 7と 9の縮合のモニタリング。 8の存在下における 7a - bと 9の縮合の代表的モニタリング

刚 Rサンプルチューブ中、 7a (41.9 mg, 55 mol)と 9 (17.8 mg, 50 03812

mol)を P₂0₅上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (ΑΟΟμ I, 100 mo I)の 0.25 Μァセトニトリル溶液と GD₃GN (100 i I)を Ar雰囲気下加えた。その 3分後、關 Rによる積算を開始し、反応のジァステレオマー比を NMR シグナルの積分比によって決定した。

NMRサンプルチューブ中、 7b (35.1 mg, 55 jumol)と 9 (17.8 mg, 50 〃mol)を P₂0₅上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (400 i l, 1O0〃mol)の 0.25 Mァセトニトリル溶液と CD₃CN (100jw I)を Ar雰囲気下加えた。

スキーム 5

(flp)： (Sp) = 97:3

5' - 0-(tert-ブチルジフエニルシリル）チミジン -3' -yl 3' - 0- (tert -プチルジメチルシリル）チミジン - 5' -ィル M -ァセチル -(2S)-び-メチル（ピロリジン- 2-ィル）エタノィルフォスファイト（12b) の合成

NMRサンプルチューブ中、 7b (35.1 mg, 55〃mol)と 9 (17.8 mg, 50 /mol) を P₂0₅上で 12時間真空乾燥し、 MS 3Aで 8時間乾燥した 8 (400〃 I,

100 imol)の 0.25 Mァセ卜二トリル溶液と GD₃GM (100 I)を Ar雰囲気下加えた。 5分後、ピリジン (40.1 1 , 500〃mol)と無水酢酸（9.5 I, 100 ol)を加えた。 3分後、クロ口ホルム（30 ml)を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（15 ml x2)で洗浄し、集めた洗液をクロ口ホルム（30 ml x1)で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し、トルェンと共沸することで 12b (86.9 mg, crude)を得た。

^]W NMR (CDC 1₃) δ 9.73 (br, 2H), 7.63 - 7.61 (m, 4H), 7.46 ― 7.36 (m, 7H), 6,39 (dd, ³J_HH = 6.6, 3 Hz, 1H), 6.23 (t, 6.0 Hz) , 4.89 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.08一 3.80 (m, 6H), 3.58一 3.38 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.34 - 2.23 (m, 3H) , 2.23 - 1.98 (m, 4H), 1.89 (s, 3H), 1.60 (s, 3H) , 1.46 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.10 (s, 9H)， 0.87 (s, 9H), 0.05 (6H)； ³¹P NMR (121 MHz, CDCI₃) δ 137.2 (79%) , 137.0 (7%) , 136.7 (8%) , 135.7 (1%), 135.2 (5%)； IR (KBr, cm—¹) 3430, 2930, 1742, 1694, 1471, 1274, 1112,. 1034, 966， 835。

(Rp) - 5' —0 -（tert-ブチルジフエニルシリル）チミジン- 3' -ィル 3' - 0 - (tert-プチルジメチルシリル）チミジン- 5' -yl H-ホスフォネート [(Rp)- 11] の合成

フォーム状にして 5時間真空乾燥させた 12b (86.9 mg, crude)に、 At'雰囲気下、蒸留した TFA (2 ml)を溶かした CH₂GI₂ (20 ml)を加えた。 0 °Cで 2分攪拌したのち、ジクロロメタン（100 ml)を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（50 ml X 2)で洗浄し、集めた洗液をジクロロメタン（100 ml 1)で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ [4x16 cm, 100 g of si I ica gel , hexan - ethyl acetate (1:1, v/v) → hexan-ethy I acetate (1:2, v/v) -→ hexan-ethy I acetate (1:3, v/v) → hexan-ethy I acetate (1:4, v/v)] で分離精製した。（Rp) - 11を含むフラクションを集め、減圧下濃縮し、クロ口ホルム（50 ml)を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（50 mlxl)で洗浄後、洗液をクロ口ホルム（50 ml XI)で抽出し、集めた有機相を無水硫酸ナ卜リウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮して 11b (43.4 mg, 84% (purity 93%))を得た。無色非晶質。

】H NMR (CDGI3) «59.45 - 9.33 (br, 2H), 7.64― 7.60 (m, 4H), 7.47― 7.37 (m, 8H), 6.90 (d, J_PH = 715.0 Hz, 1H) 6.39 (dd, ³J_HH = 6.0, 6.0 Hz, 1H), 6.14 (t, ³J_HH = 7.2 Hz, 1H), 5.23— 5,22 (m, 1H), 4.46— 4.40 (m, 1H), 4.35 - 4.19 (m, 2H), 4.18 (s, 1H), 3.99一 3.78 (m, 3H), 2.65― 2.55 (m 1H), 2.33— 2.28 (m, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.57 (s, 3H), 1.06 (s, 9H), 0.89 (s, 9H), 0.10 (s, 6H)； ³¹P NMR (121 MHz, GDCI₃) δ 9.3 (3% for (Sp)-11), 7.8 (97% for (Rp)- 11); IR (KBr, cm—¹) 3448, 2930, 1695, 1471, 1276, 1114, 1035, 971, 837。

〔スキーム 6〕

表 4 (Sp)-13： (flp)-13 (Sp)-18： (fip)-18 18の収率

98.1： 1.9 98.6： 1.4

1.9： 98.1 1.9： 98.1 手動固相合成の代表的手順

(1) 3% DCA in CH₂CI₂; 15-20 sx4

(2)洗浄（GH₂CI₂ fol lowed by CH₃CN)

(3)カップリング（0.2 Mモノマー 13 and 1.0 M 8 in CH₃CN; 3 min)

(4)保護 0₂0-1^-11161 1 !1^0|3∑0|6-丁 (1 : 2 : 7, v/v/v)； 30 s]

(5) 1% TFA in CH₂CI₂; 15-20 sx4

(6)硫化 [10% S₈ in CS₂-Py-Et₃N (35 ： 35 ： 1, v/v/v)； 3 h]

(7)洗浄 [GS₂ - Py- Et₃N (35 ： 35 : 1, v/v/v) fol lowed by Py]

(8) 25% NH₃ aq. (5.0 ml; 1h)

(9)吸引濾過，洗浄（H₂0; 1.0 ml x 5)

(10)溶媒の減圧留去

(11)希釈 (H₂0; 5.0 ml)

(12)洗浄（Et₂0; 5.0 ml x 3)

(13)溶媒の減圧留去

(14)凍結乾燥

集めた残渣を水 (0.2 ml)に溶かして逆相 HPLCにより分析した。

〔スキーム 7〕

表 5

(Sp)-13: (flp)-13 (Sp)-19： (fip)-19 19の収率

98.1： 1.9 96.5： 3.5 97,5 1.9： 98.1 4.2： 95.8 97.6 手動固相合成の代表的手順

(1) 1% TFA in CH₂CI₂; 15-20 sx4

(2)洗浄（CH₂CI₂ fol lowed by CH₃CN)

(3)カップリング (0.2 モノマ一 13 and 1.0 M 8 in CH₃CN; 3 min)

(4)保護 [Ac₂0-N- methyl imidazole - THF (1 : 2 : 7, v/v/v)； 30 s]

(5) 1% TFA in CH₂GI₂; 15-20 sx4

(6)酸化的ァミノ化 (飽和 NH₃ in CG 1₄ - dioxane (4 : 1， v/v)； 0°C, 30 min)

(7)吸引濾過，洗浄 (dioxane ;1.0 mi x 2)

(8)溶媒の減圧留去

(9)希釈 (H₂0; 5.0 ml)

(10)溶媒の減圧留去

(11)凍結乾燥

集めた残渣を水（0.2 ml)に溶かして逆相 HPLGにより分析した。

Claims

請求の範囲

又 ^

式

( / \

[式中、 R¹及び R' は、同一又は異なっていてもよい、水素原子、炭素数 1 〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 1 4のァリール基を示し、

R²及び R" は、同一又は Mなっていてもよい、水素原子、炭素数 1〜3のアルキル基又は炭素数 6〜 1 4のァリール基を示し、

R³は炭素数 1〜3のアルキル基を示し、

R⁴は水酸基の保護基、 D，は一 OR⁵ (ここで R⁵は水酸基の保護基）、水酸基又は水素原子を示し、 .

B sは、次式

で表されるゥラシル、アデニン、シ卜シン、グァニン、チミンあるいはそれらの誘導体から誘導される基を示す。但し、 R²及び R³は、窒素原子と共にモノシクロ構造又はビシクロ構造を形成していてもよい。 ]

で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイトと、一般式

(II)

[式中、 R⁶は水酸基の保護基及び E，は一 OR⁷ (ここで R⁵は水酸基の保護基）、水酸基又は水素原子、 B sは前記と同じ意味を示す。 ]

で表されるヌクレオシドとを、

—般式（III)

[式中、 X-は B F₄—、 P F₆—、 T f CT (T f は C F₃S 0₂—を示す。以下同じ）、 T f ₂Ν―、 A s F₆—又は S b F₆—を示す。また、環状構造 Aは窒素原子と共に形成する炭素数 3〜 1 6のモノシクロ又はビシクロ構造を示す。 ]

で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、式（IV) 又は（V) で表される立体規則性の高いリポヌクレオチド類縁体及びデォキシリポヌクレ才チド類縁体の製造法。

[各式中、 Yは炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数 1〜1 0の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基、炭素数 1〜 1 0の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数 6〜 1 4のァリール基、炭素数 1〜1 0のアルキルチ才基、炭素数 1〜 1 0のァシル基、アミノ基、炭素数 1〜 1 0のアルキルァミノ碁、炭素数 1 ~1 0のジアルキルアミノ基、又は Υ=Υ' Ζ⁺を示す（Υ' は S―、 S e―、 BH₃—を、 Z⁺はアンモニゥムイオン、第 1級〜第 4級の低級アルキルアンモニゥムイオン又は 1価の金属イオンを示す）。 B sは、前記と同じ意味を示し、各式中の 2個の B sは、同一でも異なっていてもよい。 D₂及び E₂ は水酸基又は水素原子を示す。 ]

2. —般式（I) で表される光学活性なヌクレオシド 3' —ホスホロアミダイトが、一般式（VI) で表される光学活性な 1， 2—ァミノアルコールと三塩化リンを反応させて得られる一般式（VII) で表される光学活性なホスフィチル化剤と、一般式（VIII) で表されるヌクレオシドを反応させて得られるものである請求項 1記載の製造法。

〔式中、 R¹、 R²、 R³、 R⁴、 D，及び B sは、前記と同じ意味を示す。〕

3. 一般式（ I ) において、 R¹と R' は、同一又は異なっていてもよい炭素数 1〜 3のアルキル基又は炭素数 6〜 1 4のァリール基である、請求項 1 又は 2記載の製造法。

4. 請求項 1〜 3のいずれかに記載の製造法における反応を繰り返すことを特徴とする、一般式（XII I) で表される立体規則性の高いオリゴリボヌクレォチド類縁体及びオリゴデォキシリポヌクレオチド類縁体の製造法。

[式中、丫、 B、 0₂及び已₂はー般式 (IV) 、 (V) と同じ意味を示し nは 1〜 1 50の整数を示す。〕