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TWI851879B - 含有新穎環狀雙核苷酸衍生物之抗體藥物共軛物 - Google Patents

含有新穎環狀雙核苷酸衍生物之抗體藥物共軛物 Download PDF

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TWI851879B
TWI851879B TW110108019A TW110108019A TWI851879B TW I851879 B TWI851879 B TW I851879B TW 110108019 A TW110108019 A TW 110108019A TW 110108019 A TW110108019 A TW 110108019A TW I851879 B TWI851879 B TW I851879B
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鈴木督
久徳真梨子
雪浦弘志
原香生子
千原正尚
大塚貴文
和田悌司
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日商第一三共股份有限公司
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Abstract

業界期待開發一種能夠全身投予、且能夠將STING促效劑特異性地傳遞至目標細胞或器官(例如，腫瘤部位)之抗體藥物共軛物及使用該抗體藥物共軛物之與STING促效劑活性相關之疾病、例如能夠藉由免疫活化治療之疾病(例如，癌症)之治療劑及/或治療法。 根據本發明，可提供一種能夠全身投予、且於表現抗原之腫瘤中表現出抗腫瘤效果之新穎抗體CDN衍生物共軛物。

Description

含有新穎環狀雙核苷酸衍生物之抗體藥物共軛物
本發明係關於一種使包含具有STING促效劑活性之新穎結構之環狀雙核苷酸衍生物與針對標的細胞之抗體經由連接子結合而成之抗體藥物共軛物、含有該抗體藥物共軛物之醫藥組合物等。
STING(Stimulator of Interferon Genes，干擾素基因刺激蛋白)係局部存在於內質網中之跨膜型轉接蛋白(非專利文獻1)。STING作為哺乳動物中之自然免疫活化之中樞分子而發揮功能，負責防禦如細菌或病毒之病原體進入之最前線。已知STING之活化係由複數個細胞質DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)感測器感知到外源性及內源性之DNA時之訊號所引起。於細胞質DNA感測器中，cGAS(Cyclic GMP-AMP Synthase，環狀GMP-AMP合成酶)被認為是重要之DNA感測器。若cGAS感知到DNA，則產生環狀雙核苷酸(2',3'-cGAMP)，該2',3'-cGAMP與STING直接結合，而使STING活化(非專利文獻2)。經活化之STING向高爾基體移動，從而促進TBK1(Tank-binding kinase 1，Tank結合激酶1)之自磷酸化。自磷酸化而活化之TBK1將IRF3(Interferon regulatory factor 3，干擾素調節因子3)轉錄路徑(非專利文獻3)及NFκB(nuclear factor kappa B，核因子κB)轉錄路徑(非專利文獻4)之兩者活化，從而使被稱為干擾素或細胞激素(I型IFN(Interferon)、IL-6(Interleukin-6，介白素-6)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α，腫瘤壞死因子-α))之發炎性蛋白之產生 增加。該等蛋白會啟動包含經由複雜之級聯反應而破壞病原體或癌細胞之T細胞的後天免疫系統。
最近之研究表明，STING不僅會促進針對微生物之宿主防禦，而且會促進抗腫瘤免疫。例如，於對STING缺損小鼠移植免疫原性腫瘤之情形時，與野生型小鼠或TRIF(Toll/Interleukin-1(IL-1)receptor domain containing adaptor-inducing interferon-β，包含Toll/介白素-1受體結構域之轉接蛋白誘導干擾素-β)缺損小鼠相比，腫瘤急速增殖。又，於STING缺損小鼠中，不同於TLR(Toll-like receptor，Toll樣受體)、MyD88(Myeloid differentiation primary response 88，骨髓分化初級反應基因88)、MAVS(Mitochondrial antiviral-signaling protein，線粒體抗病毒訊號蛋白)缺損小鼠，針對腫瘤之自發性之CD8+T細胞之致敏亦消失。由此表明，藉由細胞質DNA感知而啟動之STING路徑參與腫瘤增殖之控制(非專利文獻5)。於其他研究中，亦表明STING對於放射線治療(非專利文獻6)或抗CD47抗體療法(非專利文獻7)之抗腫瘤效果而言為必需。利用放射線或抗CD47抗體處置後的來自殺死之腫瘤細胞之DNA向樹狀細胞之細胞質移動而將cGAS-STING路徑活化後，誘導IFN產生而為自然免疫與後天免疫架橋。該研究表明，利用藉由STING路徑活化之樹狀細胞之交叉致敏對於引起對腫瘤之後天免疫而言較重要。
作為血管破壞劑為人所知之類黃酮系低分子化合物DMXAA(5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，5,6-二甲基
Figure 110108019-A0305-02-0003-150
酮-4-乙酸)會誘導巨噬細胞之I型IFN，因此於小鼠腫瘤模型中表現出具有強力之抗腫瘤活性(非專利文獻8)。DMXAA因臨床前優異之抗腫瘤效果，期待將其作為非小細胞肺癌之免疫療法藥，但人類臨床試驗失敗了(非專利文獻 9)。根據最近之研究可知，DMXAA係針對小鼠之STING之特異性促效劑，由於不具有交叉反應性，故而無法與人類STING結合(非專利文獻10)。就結果而言，DMXAA對人類無效，但小鼠模型中之研究表明，低分子藥可經由STING而有效地使CD8+T細胞致敏，從而增強抗腫瘤免疫。
作為其他低分子化合物，若對荷癌小鼠投予環狀雙核苷酸(Cyclic dinucleotide、CDN)，則表現出STING介導之抗腫瘤免疫應答增強，顯著地阻礙腫瘤增殖，從而改善小鼠之存活率(非專利文獻11)。CDN被分類為來自細菌之具有標準之兩個3'-5'磷酸鍵的CDN(cyclic-di-GMP(cyclic diguanosine monophosphate，環尿苷二磷酸)，cyclic-di-AMP(cyclic diadenosine monophosphate，環腺苷二磷酸)，3',3'-cGAMP)、及哺乳動物之cGAS所產生之具有非標準之2'-5'磷酸鍵的混合結合型之CDN(2',3'-cGAMP)。最近之研究表明，與標準之CDN相比，混合結合型之CDN能夠普遍地活化各種STING(非專利文獻12)。
由於天然型之CDN如多數核酸分子般會被血液中之核酸分解酶迅速地分解，故而無法直接以該形態投予。因此，開發了一種於生物體內具有STING促效劑活性之合成低分子化合物(例如，專利文獻1~26)。
目前，將作為抗腫瘤劑而推進臨床試驗之STING促效劑之MIW-815(有時亦稱為ADU-S100、ML RR-S2 CDA或ML-RR-CDA-2Na+)直接投予至腫瘤內。於將STING促效劑直接投予至腫瘤之方法中，僅可對腫瘤內所限定之範圍投予藥劑，又，難以對複數個遠處轉移腫瘤全部直接投予，因此存在能夠治療之腫瘤有限之問題。非專利文獻13中記載有藉由ML RR-S2 CDA投予表現出抗腫瘤效果，但僅為腫瘤內投予，並未表現出 藉由全身投予(例如，靜脈內投予)所獲得之抗腫瘤效果。非專利文獻14中記載有若將作為STING促效劑之SB11285靜脈內投予至小鼠腫瘤模型，則表現出抗腫瘤效果，但並未明確SB11285具體為具有何種結構之化合物。專利文獻14中記載有含有免疫刺激化合物、抗體構建物及連接子之共軛物，但未記載使用STING促效劑作為免疫刺激化合物的共軛物之具體例。專利文獻26中記載有使具有特定結構之CDN與抗體經由連接子結合而成之共軛物，但未記載活體內(in vivo)投予共軛物之實施例，未確認共軛物之抗腫瘤效果。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2014/099824號
專利文獻2：國際公開第2014/179335號
專利文獻3：國際公開第2014/189805號
專利文獻4：國際公開第2014/189806號
專利文獻5：國際公開第2015/074145號
專利文獻6：國際公開第2015/185565號
專利文獻7：國際公開第2016/096714號
專利文獻8：國際公開第2016/012305號
專利文獻9：國際公開第2016/145102號
專利文獻10：國際公開第2017/027646號
專利文獻11：國際公開第2017/027645號
專利文獻12：國際公開第2017/075477號
專利文獻13：國際公開第2017/093933號
專利文獻14：國際公開第2017/100305號
專利文獻15：國際公開第2017/123669號
專利文獻16：國際公開第2017/161349號
專利文獻17：國際公開第2017/175147號
專利文獻18：國際公開第2017/175156號
專利文獻19：國際公開第2018/009466號
專利文獻20：國際公開第2018/045204號
專利文獻21：國際公開第2018/060323號
專利文獻22：國際公開第2018/067423號
專利文獻23：國際公開第2018/065360號
專利文獻24：國際公開第2014/093936號
專利文獻25：國際公開第2018/009648號
專利文獻26：國際公開第2018/100558號
非專利文獻
非專利文獻1：Nature 2008, 455, 674-678
非專利文獻2：Mol. Cell, 2013, 51, 226-235
非專利文獻3：Science 2015a, 347, aaa2630
非專利文獻4：J. Virol. 2014, 88, 5328-5341
非專利文獻5：Immunity 2014, 41, 830-842
非專利文獻6：Immunity 2014, 41, 843-852
非專利文獻7：Nat. Med. 2015, 21, 1209-1215
非專利文獻8：J. Immunol. 1994, 153, 4684-4693
非專利文獻9：J. Clin. Oncol. 2011, 29, 2965-2971
非專利文獻10：J. Immunol. 2013, 190, 5216-5225
非專利文獻11：Sci. Rep. 2016, 6, 19049
非專利文獻12：Mol. Cell, 2015, 59, 891-903
非專利文獻13：Cell Rep. 2015, 11, 1018-1030
非專利文獻14：AACR Tumor Immunology and Immunotherapy, 2017, Poster#A25
業界期待開發能夠全身投予、且能夠將STING促效劑特異性地傳遞至目標細胞或器官(例如，腫瘤部位)之抗體藥物共軛物及使用該抗體藥物共軛物之與STING促效劑活性相關之疾病、例如能夠藉由免疫活化治療之疾病(例如，癌症)之治療劑及/或治療法。
本發明人等為了解決上述課題，發現了一種使特徵在於具有縮合三環性取代基之新穎CDN衍生物與特定之抗體經由連接子結合而成之抗體藥物共軛物，且發現若全身投予該抗體藥物共軛物，則於表現抗原之腫瘤中表現出抗腫瘤效果，從而完成本發明。
即，本案發明係關於以下，但並不限定於該等。
[1]一種抗體藥物共軛物，其係以下式(II)表示：
Figure 110108019-A0305-02-0007-1
(式中，m1為1至10之範圍，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，該抗體之糖鏈可經重塑， (此處，抗體表示選自由抗CD70(cluster of differentiation 70，分化群70)抗體、抗TROP2(trophoblast cell surface antigen 2，第二型滋胚層細胞表面抗原)抗體、及抗EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮細胞生長因子接受器)抗體所組成之群中之任一抗體)
L表示將Ab與D連結之連接子，Ab可自其胺基酸殘基直接鍵結於L，或可自Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結於L，D表示以下式(I)所表示之化合物：
Figure 110108019-A0305-02-0008-55
(此處，L與L1所含之任意之-NH2或羥基鍵結，L1表示以下3式之任一基：
Figure 110108019-A0305-02-0008-56
(此處，波形線表示取代位置)，Q及Q'分別獨立地表示羥基或硫醇基，R21及R22分別獨立地表示羥基或氟原子，W表示-NH-或硫原子))；
[2]如[1]所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下2式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0009-57
(此處，L1、Q、Q'及W如上文所定義)；
[3]如[1]或[2]所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下4式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0009-58
(此處，星號表示與L鍵結，Q、Q'及W如上文所定義)；
[4]如[1]至[3]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下3式之任一者表示：[化6]
Figure 110108019-A0305-02-0010-59
(此處，星號表示與L鍵結，W如上文所定義)；
[5]如[1]至[4]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下3式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0010-60
(此處，星號表示與L鍵結)；
[6]如[1]至[4]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下4式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0011-61
(此處，星號表示與L鍵結)；
[7]如[1]至[4]或[6]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0011-62
(此處，星號表示與L鍵結)；
[8]如[1]至[3]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由以下2式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0012-63
(此處，星號表示與L鍵結，W如上文所定義)；
[9]如[1]至[3]或[8]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中D由下述4式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0012-64
(此處，星號表示與L鍵結)；
[10]如[1]至[9]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中連接子L由-Lb-La-Lp-Lc-*表示， 式中，星號表示與藥物D鍵結，Lp表示包含可於標的細胞中切斷之胺基酸序列之連接子或不存在，La表示選自以下群中之任一者：-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-、及-(CH2)n9-C(=O)-
(此處，n2表示1~3之整數，n3表示1~5之整數，n4表示0~2之整數，n9表示2~7之整數)，Lb表示將La與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結之間隔子或將La與Ab之半胱胺酸殘基鍵結之間隔子，以及Lc表示-NH-CH2-、-NH-苯基-CH2-O(C=O)-或-NH-雜芳基-CH2-O(C=O)-或不存在；
[11]如[10]所記載之抗體藥物共軛物，其中Lc為-NH-CH2-；
[12]如[10]或[11]所記載之抗體藥物共軛物，其中Lp為-GGFG-、-GGPI-、-GGVA-、-GGFM-、-GGVCit-、-GGFCit-、-GGICit-、-GGPL-、-GGAQ-或-GGPP-之任一者；
[13]如[12]所記載之抗體藥物共軛物，其中Lp為-GGFG-或-GGPI-；
[14]如[10]至[13]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中La表示選自由以下： -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-、及-(CH2)5-C(=O)-
所組成之群中之任一者；
[15]如[10]至[14]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中Lb由下式之任一者表示：
Figure 110108019-A0305-02-0014-65
或者
Figure 110108019-A0305-02-0014-66
(於上述所表示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)；
[16]如[10]至[14]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中Lb為-(丁二醯亞胺-3-基-N)-，此處，-(丁二醯亞胺-3-基-N)-表示以下結構式：[化14]
Figure 110108019-A0305-02-0015-67
 此處，星號表示與La鍵結，波形線表示與抗體之半胱胺酸殘基之側鏈形成硫醚而鍵結；
[17]如[10]至[15]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中連接子L由-Lb-La-Lp-Lc-*表示，式中，星號表示與藥物D鍵結，Lp為-GGFG-、或-GGPI-，La表示-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-，Lb表示下式：
Figure 110108019-A0305-02-0015-68
(於上述所表示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)，Lc表示-NH-CH2-；
[18]如[1]至[17]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為1至10之範圍；
[19]如[18]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為1至5之範圍；
[20]如[19]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為3至5之範圍；
[21]如[1]至[20]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體自抗體之Asn297鍵結之糖鏈(N297糖鏈)鍵結於L；
[22]如[21]所記載之抗體藥物共軛物，其中N297糖鏈為經重塑之糖鏈；
[23]如[21]或[22]所記載之抗體藥物共軛物，其中N297糖鏈為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG：
Figure 110108019-A0305-02-0016-69
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5為2~5之整數；
Figure 110108019-A0305-02-0016-70
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原 子鍵結，及n5為2~5之整數；
[24]如[21]至[23]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0017-71
(式中，m2表示1或2之整數，L為將Ab之N297糖鏈與D連結之連接子，如上文所定義，Ab表示抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG，
Figure 110108019-A0305-02-0017-72
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；[化20]
Figure 110108019-A0305-02-0018-73
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數，D由以下4式之任一者表示，
Figure 110108019-A0305-02-0018-74
此處，式中，星號表示與L鍵結)；
[25]如[24]所記載之抗體藥物共軛物，其係選自下式：[化22]
Figure 110108019-A0305-02-0019-75
於上述所表示之各結構式中，m2表示為1或2之整數，Ab表示抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG之任一者，
Figure 110108019-A0305-02-0019-76
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
Figure 110108019-A0305-02-0020-77
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
[26]如[25]所記載之抗體藥物共軛物，其係選自下式：[化25]
Figure 110108019-A0305-02-0021-78
於上述所表示之各結構式中，m2表示為1或2之整數，Ab表示抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG之任一者，[化26]
Figure 110108019-A0305-02-0022-79
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
Figure 110108019-A0305-02-0022-80
式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
[27]如[1]至[26]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為抗CD70抗體；
[28]如[1]至[26]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為抗TROP2抗體；
[29]如[1]至[26]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為抗 EGFR抗體；
[30]如[27]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為含有包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體、或含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；
[31]如[28]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為含有包含序列編號5所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號6所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體、或含有包含序列編號7所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號8所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；
[32]如[29]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體、或含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；
[33]如[27]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；
[34]如[28]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號5中胺基酸編號1至108所記載之胺 基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號6中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號7中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號8中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；
[35]如[29]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；
[36]如[27]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號 44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3；
[37]如[28]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號47所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號48所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號49所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號50所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號51所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號52所記載之胺基酸序列之CDRH3；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號53所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號54所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號55所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號56所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號57所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號58所記載之胺基酸序列之CDRH3；
[38]如[29]所記載之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含 序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3；
[39]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0026-81
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：含有包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號5所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號6所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號7所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號8所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所 記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0027-82
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為2)；
[40]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化30]
Figure 110108019-A0305-02-0028-83
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號5中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號6中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號7中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號8中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區； 包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0029-84
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為2)；
[41]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化32]
Figure 110108019-A0305-02-0030-85
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號47所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號48所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號49所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號50所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號51所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號52所記載之胺基酸序列之CDRH3； 包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號53所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號54所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號55所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號56所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號57所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號58所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0031-86
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結， 星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為2)；
[42]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0032-87
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：含有包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號5所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號6所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號7所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號8所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體； 含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0033-88
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為1)；
[43]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化36]
Figure 110108019-A0305-02-0034-89
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號5中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號6中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號7中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號8中胺基酸編號1至121所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區； 包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0035-90
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為1)；
[44]一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化38]
Figure 110108019-A0305-02-0036-91
式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號47所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號48所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號49所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號50所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號51所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號52所記載之胺基酸序列之CDRH3； 包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號53所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號54所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號55所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號56所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號57所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號58所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3；Ab之N297糖鏈由下式表示：
Figure 110108019-A0305-02-0037-92
(式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結， 星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為1)；
[45]一種STING促效劑，其含有如[1]至[44]中任一項所記載之抗體藥物共軛物；
[46]一種醫藥組合物，其含有如[1]至[44]中任一項所記載之抗體藥物共軛物；
[47]一種抗腫瘤劑，其含有如[1]至[44]中任一項所記載之抗體藥物共軛物；
[48]如[47]所記載之抗腫瘤劑，其中腫瘤為肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、睾丸癌、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腦瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、間皮瘤、胃腸道間質腫瘤(GIST)、膽囊癌、膽管癌、腎上腺癌、鱗狀細胞癌、咽癌、舌癌、聽覺器官癌、胸腺癌、小腸癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤或肉瘤；
[49]一種癌症之治療方法，其包括投予選自由如[1]至[44]中任一項所記載之抗體藥物共軛物、如[45]所記載之STING促效劑、如[46]所記載之醫藥組合物及如[47]或[48]所記載之抗腫瘤劑所組成之群中之任一者；
[50]如[49]所記載之方法，其中癌症為肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、睾丸癌、子宮頸 癌、胎盤絨毛膜癌、腦瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、間皮瘤、胃腸道間質腫瘤(GIST)、膽囊癌、膽管癌、腎上腺癌、鱗狀細胞癌、咽癌、舌癌、聽覺器官癌、胸腺癌、小腸癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤或肉瘤；
[51]如[27]、[30]、[33]或[36]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其於皮下移植了人類腎癌細胞株Caki-1細胞之BALB/c-nu小鼠中發揮出抗體標的依賴性之抗腫瘤效果；
[52]如[42]至[44]中任一項所記載之抗體藥物共軛物，其於下述(i)或(ii)所記載之動物中發揮出比抗體藥物共軛物所含之抗體更強之抗腫瘤效果：(i)皮下移植有小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)之BALB/c小鼠，該小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入有該抗體藥物共軛物所含之抗體所結合之抗原上之表位部位被置換為人型而成之人鼠嵌合抗原之基因；(ii)皮下移植有人類腎癌細胞株A-498(HTB-44)細胞之BALB/c-nu小鼠。
根據本發明，提供一種能夠全身投予、且於表現抗原之腫瘤中表現出抗腫瘤效果之新穎抗體CDN衍生物共軛物。
圖1係模式性地表示作為本發明之抗體藥物共軛物((II)之分子)之由SG型糖鏈重塑抗體獲得之抗體藥物共軛物(圖1A之(II)之分子)及由MSG型 糖鏈重塑抗體獲得之抗體藥物共軛物(圖1B之(II)之分子)。(a)表示藥物D，(b)表示連接子L，(c)表示PEG連接子(L(PEG))，(d)表示N297糖鏈(此處，白色之圓為NeuAc(Sia)，白色之六邊形為Man，黑色之六邊形為GlcNAc，白色之菱形為Gal，白色之倒三角形為Fuc)。白色之五邊形表示來自連接子L之炔烴與來自PEG連接子之疊氮基進行反應所生成之三唑環。Y字型表示抗體Ab。PEG連接子經由醯胺鍵與位於非還原末端之唾液酸之2位之羧基連結。此種表示方法只要未特別提及，則適用於本說明書之整體。
圖2係表示作為本發明之抗體藥物共軛物之製造中間物的(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(圖2A之(III)之分子)、SG型糖鏈重塑抗體(圖2B之(IV)之分子)、及MSG型糖鏈重塑抗體(圖2C之(IV)之分子)之結構之模式圖。於全部圖中，Y字型與圖1同樣地表示抗體Ab。於圖2A中，(e)表示包含Fuc之1位與GlcNAc之6位中經α糖苷鍵結之二糖之N297糖鏈。於圖2B及C中，(d)表示與圖1相同之N297糖鏈，(f)為具有疊氮基之PEG連接子，末端表示供於與連接子L之鍵結之疊氮基。具有疊氮基之PEG連接子之鍵結形式與圖1之PEG連接子相同。
圖3係由動物細胞中所產生之抗體製造SG型糖鏈重塑抗體及MSG型糖鏈重塑抗體之步驟之模式圖。圖中之分子(III)及(IV)與圖2同樣地分別表示(Fucα1,6)GlcNAc-抗體及SG型糖鏈重塑抗體或MSG型糖鏈重塑抗體。(V)之分子為動物細胞中所產生之抗體，為N297糖鏈不均之分子之混合物。圖3A表示藉由利用如EndoS之水解酶處理(V)之不均之N297糖鏈而製作均勻之(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(III)之步驟。圖3B表示相對於抗體(III)之N297糖鏈之GlcNAc，使用如EndoS D233Q/Q303L變異體之糖基 轉移酶使SG型糖鏈供體分子進行糖鏈轉移，藉此製作(IV)之SG型糖鏈重塑抗體之步驟。圖3C與圖3B同樣地，表示藉由相對於抗體(III)，使MSG型糖鏈供體分子進行糖鏈轉移，而製作(IV)之MSG型糖鏈重塑抗體之步驟。此處所使用之SG型糖鏈供體分子及MSG型糖鏈供體分子係各自之非還原末端之唾液酸被具有疊氮基之PEG連接子修飾而成者，於所製作之SG型N297糖鏈重塑抗體及MSG型N297糖鏈重塑抗體中，亦如圖2B及C所示，非還原末端之唾液酸受到同樣之修飾。
圖4表示抗CD70抗體1之輕鏈之胺基酸序列(序列編號1)及重鏈之胺基酸序列(序列編號2)(於本說明書中，「抗CD70抗體1」亦稱為「改型抗CD70抗體1」)。
圖5表示抗CD70抗體2之輕鏈之胺基酸序列(序列編號3)及重鏈之胺基酸序列(序列編號4)(於本說明書中，「抗CD70抗體2」亦稱為「改型抗CD70抗體2」)。
圖6表示抗TROP2抗體1之輕鏈之胺基酸序列(序列編號5)及重鏈之胺基酸序列(序列編號6)。
圖7表示抗TROP2抗體2之輕鏈之胺基酸序列(序列編號7)及重鏈之胺基酸序列(序列編號8)(於本說明書中，「抗TROP2抗體2」亦稱為「改型抗TROP2抗體」)。
圖8表示抗EGFR抗體1之輕鏈之胺基酸序列(序列編號9)及重鏈之胺基酸序列(序列編號10)(於本說明書中，「抗EGFR抗體1」亦稱為「改型抗EGFR抗體1」)。
圖9表示抗EGFR抗體2之輕鏈之胺基酸序列(序列編號11)及重鏈之胺基酸序列(序列編號12)(於本說明書中，「抗EGFR抗體2」亦稱為「改型抗 EGFR抗體2」)。
圖10表示(a)人STING野生型之胺基酸序列(序列編號13)、(b)人STING REF變異型(R232H)之胺基酸序列(序列編號15)、及(c)人STING HAQ變異體(R71H，G230A，R293Q)之胺基酸序列(序列編號17)。
圖11表示抗TROP2抗體2、抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)、抗TROP2抗體2-CDN共軛物(2)、及抗TROP2抗體2-CDN共軛物(3)於TROP2表現細胞中之STING促效劑活性。
圖12表示化合物34a、抗CD70抗體1、抗CD70抗體2、抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)、及抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)於CT26.WT及CT26.WT-hCD70細胞株與源自小鼠骨髓之樹狀細胞之共培養分析系統中之活性。
圖13表示藉由抗TROP2抗體1及抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白倒三角線表示使實施例1之化合物6b與參考例5中所製作之抗TROP2抗體1共軛而成之抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示抗TROP2抗體1投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
圖14表示藉由抗TROP2抗體2及抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白倒三角線表示使實施例2之化合物34a與參考例6中所製作之抗TROP2抗體2共軛而成之抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示抗TROP2抗體2投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
圖15表示藉由抗EGFR抗體1、抗EGFR抗體2、抗EGFR抗體-CDN共軛物之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。表示藉由使實施例2之化合物34a與 參考例7中所製作之抗EGFR抗體1共軛而成之抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)及使實施例2之化合物34a與參考例8中所製作之抗EGFR抗體2共軛而成之抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗EGFR抗體1投予組，黑三角線表示抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示抗EGFR抗體2投予組，黑圈線表示抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
圖16表示抗CD70抗體1之CDRL1之胺基酸序列(序列編號35)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號36)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號37)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號38)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號39)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號40)。
圖17表示抗CD70抗體2之CDRL1之胺基酸序列(序列編號41)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號42)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號43)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號44)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號45)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號46)。
圖18表示抗TROP2抗體1之CDRL1之胺基酸序列(序列編號47)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號48)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號49)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號50)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號51)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號52)。
圖19表示抗TROP2抗體2之CDRL1之胺基酸序列(序列編號53)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號54)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號55)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號56)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號57)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號58)。
圖20表示抗EGFR抗體1之CDRL1之胺基酸序列(序列編號59)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號60)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號61)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號62)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號63)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號64)。
圖21表示抗EGFR抗體2之CDRL1之胺基酸序列(序列編號65)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號66)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號67)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號68)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號69)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號70)。
圖22表示藉由抗CD70抗體1、抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)及抗CD70抗體2、抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗CD70抗體1投予組，白倒三角線表示抗CD70抗體2投予組，白菱形線表示抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
圖23表示藉由抗CD70抗體2、抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗CD70抗體2投予組，白倒三角線表示抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
圖24表示藉由抗EGFR抗體1、化合物34a、抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)之靜脈內投予獲得之抗腫瘤效果。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗EGFR抗體1投予組，白菱形線表示化合物34a投予組，白四角線表示抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。
本發明係關於一種包含具有STING促效劑活性之新穎CDN衍生物之抗體藥物共軛物及其用途。該新穎CDN衍生物具有STING促效劑活性，將免疫細胞活化而誘導干擾素或細胞激素之產生。又，該新穎CDN衍生物藉由該免疫細胞之活化而發揮出抗腫瘤效果。本發明之抗體藥物共軛物係藉由經由任意之連接子將該CDN衍生物與可識別標的細胞(例如，腫瘤細胞或免疫細胞)並結合之抗體連結而製作，可進行全身投予。作為全身投予之具體例，可列舉：皮內、肌內、腹腔內、靜脈內、及皮下之路徑。
STING(Stimulator of Interferon Genes)係局部存在於內質網中之跨膜型之轉接蛋白。已知STING以較高之頻度存在先天性之多態(PLoS One,2013 Oct,21,8(10),e77846)。作為STING變異型，例如已知有：第232號胺基酸自精胺酸(R)變異為組胺酸(H)之R232H變異；或第71號之精胺酸(R)變異為組胺酸(H)、第230號之甘胺酸(G)變異為丙胺酸(A)、第293號之精胺酸(R)變異為麩胺酸(Q)之HAQ變異。於此種STING之多態中，已知藉由STING促效劑刺激所誘導之細胞激素產生量等應答之強度存在差異(Genes and Immunity,2011,12,263-269)。因此，為了使STING促效劑於人體中穩定地作用，較理想為針對各STING之形態具有活性。
於本說明書中，「癌症」、「癌」及「腫瘤」係以相同之含義使用。
於本發明中，「免疫活化」係指以某種形式引起單核球、巨噬細胞、樹狀細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性球等參與抗腫瘤 免疫之免疫細胞之活化，例如指引起細胞激素及趨化因子之產生、免疫活化標記物之表現上升、免疫抑制性標記物之表現降低、細胞內訊號傳遞系統之磷酸化等變化、基因表現之變化等所有免疫細胞之結構或功能上之變化。又，亦包括引起腫瘤細胞誘導抗腫瘤免疫之變化在內，例如指誘導將免疫細胞活化或誘導其趨化之細胞激素及趨化因子之產生、對免疫細胞之敏感性亢進等。
於本發明中，「抗腫瘤效果」係指藉由利用藥物直接或間接影響腫瘤細胞而誘導腫瘤之減少或消退。例如，將如下情形稱為抗腫瘤效果：藉由藥物對腫瘤細胞造成直接殺傷、腫瘤細胞因藥物之刺激而將抗腫瘤免疫活化、向腫瘤細胞傳遞之藥物向細胞外釋放出等使得腫瘤細胞周邊之抗腫瘤免疫活化等，引起腫瘤細胞數之減少、及殺傷、或腫瘤之消退。
於本發明中，「細胞殺傷活性」係指以某種形式對細胞引起病理性之變化，不限於直接之外傷，亦指引起DNA之切斷或鹼基之二聚物之形成、染色體之切斷、細胞分裂裝置之損傷、各種酶活性之降低等所有細胞之結構或功能上之損傷。
於本發明中，「細胞」亦包括動物個體內之細胞、培養細胞。
<1.新穎CDN衍生物>
新穎CDN衍生物具有下式(I)：[化40]
Figure 110108019-A0305-02-0047-93
所表示之結構。
L1係以下3式中之任一者所表示之基：
Figure 110108019-A0305-02-0047-94
Q及Q'分別獨立地表示羥基或硫醇基。較佳為Q及Q'均為硫醇基。
R21及R22分別獨立地表示羥基或氟原子。R21較佳為羥基。R22較佳為氟原子。
W為-NH-或硫原子。W較佳為-NH-。
該新穎CDN衍生物之製造方法記載於下文所述之<3.製造方法>中。
<2.抗體藥物共軛物>
本發明之抗體藥物共軛物可作為將上文所述之新穎CDN衍生物與可識別標的細胞(例如，腫瘤細胞或免疫細胞)並結合之抗體經由任意之連接子連結而成之抗體藥物共軛物進行全身投予。
本發明之抗體藥物共軛物係以下式(II)：
Figure 110108019-A0305-02-0047-95
表示。m1為1至10之範圍，表示抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之 藥物結合數。Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，L表示將Ab與D連結之連接子，D表示上述新穎CDN衍生物(本說明書中，於將新穎CDN衍生物作為抗體藥物共軛物之一部分使用之情形時，亦簡稱為「藥物」)。
藥物D係具有將免疫細胞活化之活性、具體而言為具有STING促效劑活性之化合物。藥物D若連接子之一部分或全部於標的細胞(例如，腫瘤細胞或免疫細胞)內被切斷，則以原來之結構游離，發揮免疫活化效果。藉由標的細胞對免疫細胞之敏感性亢進或經由標的細胞之免疫細胞之活化，而發揮出目標功能。作為目標功能，只要為與STING促效劑活性相關之功能，則無特別限定，較佳為抗腫瘤活性。即，經由任意之連接子連結於以腫瘤為標的之抗體(例如，抗CD70抗體、抗TROP2抗體、抗EGFR抗體)之藥物D被傳遞至目標之細胞或組織，連接子之一部分或全部被切斷，利用標的細胞對免疫細胞之敏感性亢進或經由標的細胞之免疫細胞之活化(例如，干擾素或細胞激素之產生)發揮出抗腫瘤效果。
結合於本發明之抗體藥物共軛物之藥物D係以下式(I)：
Figure 110108019-A0305-02-0048-96
(此處，L1、Q、Q'、R21、R22及W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之2式：[化44]
Figure 110108019-A0305-02-0049-97
(此處，L1、Q、Q'、及W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之4式：
Figure 110108019-A0305-02-0049-98
(此處，星號表示與L鍵結，Q、Q'、及W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之3式：[化46]
Figure 110108019-A0305-02-0050-99
(此處，星號表示與L鍵結，W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之3式：
Figure 110108019-A0305-02-0050-100
(此處，星號表示與L鍵結)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之4式：
Figure 110108019-A0305-02-0051-101
(此處，星號表示與L鍵結)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D更佳為由以下之式：
Figure 110108019-A0305-02-0051-103
表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之式：
Figure 110108019-A0305-02-0052-104
(此處，星號表示與L鍵結，W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之2式：
Figure 110108019-A0305-02-0052-105
(此處，星號表示與L鍵結)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之式：[化52]
Figure 110108019-A0305-02-0053-106
(此處，星號表示與L鍵結，W如上述<1.新穎CDN衍生物>中所規定)表示。
又，本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物D較佳為由以下之2式：
Figure 110108019-A0305-02-0053-107
(此處，星號表示與L鍵結)表示。
<2.1.連接子結構>
對本發明之抗體藥物共軛物中使藥物鍵結於抗體之連接子結構進行說明。本發明之抗體藥物共軛物所使用之連接子只要為作為使抗體與藥物連結之連接子而為業者所理解者，則無特別限定。作為本發明之抗體藥物共軛物所使用之連接子，例如可列舉Protein Cell,2018,9(1)：33-46、Pharm Res,2015,32：3526-3540、或Int.J.Mol.Sci.,2016,17,561所記載之連接子，但不限定於該等。連接子可為於生物體內被切斷之連接子，亦可為於生物體內不被切斷之連接子，較佳為於生物體內被切斷之連接子。
作為本發明之抗體藥物共軛物所使用之連接子，例如可列舉：使藥物鍵結於抗體之Fc部分之糖鏈或經重塑之糖鏈(本說明書中，有時稱為「糖鏈共軛」)之連接子(例如記載於WO2018/003983)、或使藥物鍵結於抗體之任意胺基酸殘基(例如半胱胺酸殘基或離胺酸殘基)之連接子(例如記載於WO2014/057687)，但不限定於該等。作為使藥物鍵結於抗體之任意之胺基酸殘基之連接子，較佳可列舉與Ab之半胱胺酸之硫氫基(SH基)進行硫醚鍵結之情形(本說明書中，有時稱為「半胱胺酸共軛」)或與Ab之離胺酸之胺基(NH2基)進行醯胺鍵結之情形(本說明書中，有時稱為「離胺酸共軛」)，較佳為半胱胺酸共軛。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之較佳之連接子L係以下式表示。
-Lb-La-Lp-Lc-*
(此處，星號表示與藥物D鍵結)。
首先，對Lp進行說明。Lp表示包含可於生物體內或標的細胞中切斷之胺基酸序列之連接子(以下，於本說明書中，亦稱為肽連接子)或不存在。
Lp例如藉由肽酶或酯酶等酶之作用而被切斷。Lp係包含2至7個(較佳為2至4個)胺基酸之肽。Lp於其N末端與下文所述之La之右端之羰基形成醯胺鍵，於C末端與Lc之胺基(-NH-)形成醯胺鍵。藉由上述肽酶等酶將Lp之C末端側之醯胺鍵切斷。
構成Lp之胺基酸並無特別限定，例如為L-或D-胺基酸，較佳為L-胺基酸。又，亦可為除α-胺基酸以外的β-丙胺酸、ε-胺基己酸、γ-胺基丁酸等結構之胺基酸，進而亦可為例如經N-甲基化之胺基酸等非天然 型之胺基酸。Lp之胺基酸序列並無特別限定，作為構成之胺基酸，可列舉：甘胺酸(Gly；G)、纈胺酸(Val；V)、丙胺酸(Ala；A)、苯丙胺酸(Phe；F)、麩胺酸(Glu；E)、異白胺酸(Ile；I)、脯胺酸(Pro；P)、瓜胺酸(Cit)、白胺酸(Leu；L)、甲硫胺酸(Met；M)、絲胺酸(Ser；S)、離胺酸(Lys；K)、及天冬胺酸(Asp；D)等。該等中，較佳為甘胺酸(Gly；G)、纈胺酸(Val；V)、丙胺酸(Ala；A)、苯丙胺酸(Phe：F)、瓜胺酸(Cit)、異白胺酸(Ile；I)、脯胺酸(Pro；P)。該等胺基酸可重複，具有包含任意選擇之胺基酸之胺基酸序列。又，可根據胺基酸之種類控制藥物游離之方式。
作為Lp之具體例，例如可列舉：-GGFG-、-GGPI-、-GGVA-、-GGFM-、-GGVCit-、-GGFCit-、-GGICit-、-GGPL-、-GGAQ-、-GGPP-。連接子Lp較佳為-GGFG-或-GGPI-，更佳為-GGFG-。
繼而，對La進行說明。La表示選自由以下：-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-、及-(CH2)n9-C(=O)-
(此處，式中，n2表示1~3之整數(較佳為1或2)，n3表示1~5之整數(較佳為2~5之整數，更佳為3或4)，n4表示0~2之整數(較佳為0或1)，n9 表示2~7之整數(較佳為2~5之整數，更佳為2、3或5))所組成之群中之任一者。
La較佳為表示選自由以下：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-、及-(CH2)5-C(=O)-
所組成之群中之任一者。
La更佳為-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-、或-(CH2)5-C(=O)-。
La進而較佳為-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-。
繼而，對Lb進行說明。Lb表示糖鏈共軛之連接子所使用之間隔子(本說明書中，亦稱為「糖鏈共軛之連接子之間隔子」)、或半胱胺酸共軛之連接子所使用之間隔子(本說明書中，亦稱為「半胱胺酸共軛之連接子之間隔子」)。
<Lb為「糖鏈共軛之連接子之間隔子」之情形>
於Lb為「糖鏈共軛之連接子之間隔子」之情形時，Lb並無特別限定，例如可列舉下式所示之間隔子。
Figure 110108019-A0305-02-0057-108
或者
Figure 110108019-A0305-02-0057-109
於上述所表示之各結構式中，星號(*)表示與La之左端之-(C=O)-、-CH2-或-OC(=O)-鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結。
於Lb選擇Lb-1或Lb-3之情形時，三唑環部位具有幾何異構結構，1個Lb中包含2種結構中之任一者、或包含該等之混合物。本發明之抗體藥物共軛物可使複數之藥物結合於1分子抗體。於在1分子抗體結合複數之藥物之情形時，Lb亦存在複數個(例如，參照下文所述之<3.製造方法>之E法所示的抗體藥物共軛物之模式圖(1e))。於Lb選自Lb-1或Lb-3，且該Lb相對於1分子抗體而存在複數個之情形時(例如，於下文所述之m2為1或2之情形時)，於各Lb中，三唑環部位具有幾何異構結構，1個Lb中包含2種結構中之任一者、或包含該等之混合物。
<Lb為「半胱胺酸共軛之連接子之間隔子」之情形>
於Lb為「半胱胺酸共軛之連接子之間隔子」之情形時，Lb並無特別限定，例如可列舉-(丁二醯亞胺-3-基-N)-。於本發明中，「-(丁二醯亞胺-3-基-N)-」具有下式：
Figure 110108019-A0305-02-0058-110
所表示之結構。於上述所表示之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與抗體之半胱胺酸殘基之側鏈形成硫醚而鍵結。
繼而，對Lc進行說明。Lc表示-NH-CH2-、-NH-苯基-CH2-O(C=O)-或-NH-雜芳基-CH2-O(C=O)-、或者不存在。此處，作為苯基，較佳為1,4-苯基，作為雜芳基，較佳為2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基。Lc較佳為-NH-CH2-、或不存在。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之更佳之連接子L於藥物與抗體之鍵結形式為「糖鏈共軛」之情形時，為-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGICit-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFM-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGLM-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-FG-、 -ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-CH2-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-、-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、或-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-
(此處，ZL1表示上述Lb之以下所表示之結構式：
Figure 110108019-A0305-02-0059-111
或者於藥物與抗體之鍵結形式為「半胱胺酸共軛」之情形時，為-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGICit-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFM-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGPI-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGLM-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-FG-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-VA-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFG-NH-CH2-、 -ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-CH2-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGVCit-NH-CH2-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-GGFCit-NH-CH2-、-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、或-ZL2-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-、(此處，ZL2表示上述Lb之以下所表示之結構式：
Figure 110108019-A0305-02-0060-112
所示之-(丁二醯亞胺-3-基-N)-)。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之進而較佳之連接子L係藥物與抗體之鍵結形式為「糖鏈共軛」，且為-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-、或-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-CH2-、(此處，ZL1表示上述Lb之以下所表示之結構式：
Figure 110108019-A0305-02-0060-113
本發明之抗體藥物共軛物所使用之進而更佳之連接子L係藥物與抗體之鍵結形式為「糖鏈共軛」，且為-ZL1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-、(此處，ZL1表示上述Lb之以下所表示之結構式：
Figure 110108019-A0305-02-0061-114
上述「較佳之連接子L」、「更佳之連接子L」、「進而較佳之連接子L」及「進而更佳之連接子L」之右端與藥物D鍵結。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之「連接子L-藥物D」較佳為由以下之2式：[化61]
Figure 110108019-A0305-02-0062-115
(此處，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之「連接子L-藥物D」更佳為由以下之2個式：[化62]
Figure 110108019-A0305-02-0063-116
(此處，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)表示。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之「連接子L-藥物D」進而較佳為由以下之式：[化63]
Figure 110108019-A0305-02-0064-117
(此處，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)表示。
<2.2.抗體及其糖鏈修飾>
<2.2.1 抗體>
於本說明書中，「基因」意指包含編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列的核苷酸或核苷酸序列、或者其互補鏈，例如作為包含編碼蛋白質之胺基酸之核苷酸序列的核苷酸序列或其互補鏈之多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、RNA等包含於「基因」之含義中。
於本說明書中，「核苷酸」、「多核苷酸」或「核苷酸序列」與「核酸」之含義相同，例如DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸、引子等亦包含於「核苷酸」或「核苷酸序列」之含義中。
於本說明書中，「多肽」、「肽」、「蛋白質」係無區別地使用。
於本說明書中，「抗體之功能性片段」亦稱為「抗體之抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性之抗體之部分片段，包括Fab、F(ab')2、Fv、scFv、雙功能抗體(diabody)、線性抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體等。又，於還原條件下對F(ab')2進行處理所獲得之抗體之 可變區之一價片段即Fab'亦包含於抗體之抗原結合片段。但只要具有與抗原之結合能力，則該等分子並無限定。又，該等抗原結合片段不僅包含藉由適當之酶對抗體蛋白質之全長分子進行處理而成者，而且亦包含使用以基因工程方式經改型之抗體基因於適當之宿主細胞中產生之蛋白質。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之抗體之功能性片段包含保持受到利用IgG重鏈之Fc區中良好保存之N結合型糖鏈之修飾之天冬胺酸(Asn297)及其周邊之胺基酸，且具有與抗原之結合能力的功能性片段。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之抗體意指免疫球蛋白，為含有與抗原免疫特異性地結合之抗原結合部位之分子。作為本發明之抗體藥物共軛物所使用之抗體，可為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY之任意類型，較佳為IgG。又，作為亞型，可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2之任意者，較佳為IgG1、IgG2或IgG4(包括IgG重鏈之Fc區具有對ADCC(antibody-dependent cellular cytotoxicity，抗體依賴性細胞殺傷)及ADCP(antibody-dependent cellular phagocytosis，抗體依賴性細胞介導吞噬作用)活性造成影響之變異之抗體)。
於使用IgG1作為本發明之抗體藥物共軛物所使用之抗體之同型之情形時，藉由置換恆定區之胺基酸殘基之一部分，可調整效應功能(參照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。作為IgG1之變異體，例如可列舉IgG1 LALA變異(IgG1-L234A、L235A)。上述L234A、L235A表示由EU index(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,Vol.63,No.1(May 15,1969),pp.78-85)特定出之234位及235位之白胺酸向丙胺酸之置換。
已知抗體之恆定區存在複數個同種異型。例如關於IgG1重 鏈，可列舉：G1m17、G1m3、G1m1、G1m2。作為本發明中所使用之抗體之恆定區，並無特別限定，較佳為使用G1m17或G1m3。
已知抗體分子之重鏈及輕鏈分別存在3處互補決定區(CDR：Complementarity determining region)。CDR亦稱為高變區(hypervariable region)，處於抗體之重鏈及輕鏈之可變區內，為一級結構之變異性尤其高之部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈之一級結構上分別分離為3處。於本說明書中，關於抗體之CDR，自重鏈胺基酸序列之胺基末端側起將重鏈之CDR表述為CDRH1、CDRH2、CDRH3，自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側起將輕鏈之CDR表述為CDRL1、CDRL2、CDRL3。該等部位於立體結構上互相靠近，決定針對所結合之抗原之特異性。
抗體可源自任意物種，較佳可例示人類、大鼠、小鼠及兔子。於源自人類以外之物種之情形時，較佳為使用周知之技術進行嵌合化或人源化。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。單株抗體包括大鼠抗體、小鼠抗體、兔子抗體等源自非人動物之單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、該等之功能性片段、或該等之修飾體。
抗體較佳為以腫瘤細胞或免疫細胞為標的之抗體，但不限定於該等。抗體更佳為以腫瘤細胞為標的之抗體。
於使用以腫瘤細胞為標的之抗體之情形時，作為抗體，較佳為具有可識別腫瘤細胞之特性、可結合於腫瘤細胞之特性、可被吸收至腫瘤細胞內並內化之特性、進而殺傷腫瘤細胞之特性之一種或一種以上特性。本發明之抗體藥物共軛物所使用之藥物具有STING促效劑活性。該藥物將干擾素控制因子3(interferon regulatory factor-3(IRF3))之訊號活化而 誘導干擾素。因此，於本發明之抗體藥物共軛物使用以腫瘤細胞為標的之抗體之情形時，認為於將抗體藥物共軛物投予至體內後，傳遞至腫瘤部位，被吸收至腫瘤細胞內後連接子部分被肽酶等切斷，藥物部分游離。游離之藥物部分利用STING促效劑活性使腫瘤細胞對免疫細胞之敏感性亢進，並且將抗腫瘤免疫活化，從而發揮出抗腫瘤效果。或者亦認為即便集積於腫瘤細胞之抗體藥物共軛物未被內化，腫瘤細胞及/或抗體藥物共軛物亦因吞噬作用而被吸收至免疫細胞中，利用STING促效劑活性將抗腫瘤免疫活化，從而發揮出抗腫瘤效果。
抗體對腫瘤細胞之結合性可使用流式細胞分析進行確認。抗體向腫瘤細胞內之吸收可使用如下分析進行確認：(1)使用結合於治療抗體之二級抗體(螢光標記)，利用螢光顯微鏡使吸收至細胞內之抗體可視化之分析(Cell Death and Differentiation(2008)15,751-761)；(2)使用結合於治療抗體之二級抗體(螢光標記)，對吸收至細胞內之螢光量進行測定之分析(Molecular Biology of the Cell Vol.15,5268-5282,December 2004)；或(3)Mab-ZAP分析，即使用結合於治療抗體之抗毒素，若被吸收至細胞內，則釋放出毒素，而抑制細胞增殖Bio Techniques 28：162-165,January 2000)。作為抗毒素，亦可使用白喉毒素之觸媒區域與蛋白G之重組複合蛋白質。
於本發明之抗體藥物共軛物使用以腫瘤細胞為標的之抗體之情形時，較佳為抗體自身具有抗腫瘤效果，但並非必需。
藥物及抗體藥物共軛物之抗腫瘤活性係指對腫瘤細胞之細胞殺傷活性、抗細胞效果、腫瘤體積之消退。可使用公知之活體外(in vitro)或活體內之評價系統確認抗腫瘤活性。
藥物及抗體藥物共軛物之作用及免疫活化活性係指腫瘤細胞對免疫細胞之敏感性亢進或經由腫瘤細胞之免疫細胞之活化。可使用公知之活體外或活體內之評價系統確認藥物及抗體藥物共軛物之作用及免疫活化活性。
作為本發明可使用之活體外或活體內之評價系統，可例示：試驗例4所記載之CT26.WT及CT26.WT-hCD70細胞株與源自小鼠骨髓之樹狀細胞之共培養分析系統；試驗例5所記載之皮下移植有於小鼠大腸癌細胞株CT26.WT中導入人TROP2基因而成之CT26.WT-hTROP2細胞的BALB/c小鼠之系統；試驗例6所記載之皮下移植有於小鼠大腸癌細胞株CT26.WT中導入人EGFR基因而成之CT26.WT-hEGFR細胞的BALB/c小鼠之系統；試驗例7所記載之皮下移植有人類腎癌細胞株Caki-1細胞之BALB/c-nu小鼠之系統；試驗例8所記載之皮下移植有人類腎癌細胞株A-498(HTB-44)細胞之BALB/c-nu小鼠之系統；試驗例9所記載之皮下移植有導入抗體藥物共軛物所含之抗體所結合之抗原上之表位部位被置換為人型之人鼠嵌合抗原之基因而成之小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)的BALB/c小鼠之系統等，但不限定於該等。
作為本發明所使用之抗體，可列舉：抗CD70抗體、抗TROP2抗體、或抗EGFR抗體。
本發明所使用之抗體可藉由使用該領域通常實施之方法，使動物免疫成為抗原之多肽，採集生物體內所產生之抗體並進行純化而獲得。抗原之來源並不限定於人類，亦可使動物免疫源自小鼠、大鼠等人類以外之動物之抗原。於該情形時，藉由試驗與所獲得之異種抗原結合之抗體與人類抗原之交叉性，可篩選出可適用於人類之疾病之抗體。
又，依照公知之方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennett,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367、Plenum Press,N.Y.(1980))，使產生針對抗原之抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，藉此建立融合瘤，亦可獲得單株抗體。
再者，抗原可藉由利用基因操作使宿主細胞產生編碼抗原蛋白質之基因而獲得。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之抗體可依照公知之方法(例如，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)、Nature(1986)321,p.522-525、WO90/07861)而獲得。
例如，抗CD70抗體(WO2004/073656、WO2007/038637等)、抗TROP2抗體(WO2015/098099等)、抗EGFR抗體(WO1998/050433、WO2002/092771等)可藉由公知之方法獲得。
本發明所使用之抗CD70抗體並無特別限制，例如，較理想為具有以下特性者。
(1)一種抗CD70抗體，其特異性地結合於CD70。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其結合於人CD70之胞外區域。
(3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中上述抗體為單株抗體。
(4)如上述(1)~(3)中任一項所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞殺傷(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞殺傷(CDC)活性。
(5)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、人單株抗體或人源化單株抗體。
(6)如上述(1)~(3)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且包含使ADCC及ADCP活性降低之變異。
(7)如上述(5)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且由EU指數表示之234位及235位之白胺酸被置換為丙胺酸。
(8)如上述(7)所記載之抗體，其係含有包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(9)如上述(7)所記載之抗體，其係含有包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(10)如上述(7)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(11)如上述(7)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(12)如上述(1)~(11)中任一項所記載之抗體，其中於重鏈羧基末端缺失1或2個胺基酸。
(13)一種抗體，其係藉由包括以下步驟之該抗體之製造方法而獲得： 培養藉由含有編碼如上述(1)~(12)中任一項所記載之抗體之多核苷酸之表現載體而轉形之宿主細胞的步驟；及自該步驟中獲得之培養物採集目標抗體之步驟。
作為抗CD70抗體，例如可列舉：沃瑟妥珠單抗(vorsetuzumab)、MDX-1115、Cusatuzumab，可適宜地列舉沃瑟妥珠單抗、MDX-1115。
本發明所使用之抗TROP2抗體並無特別限制，例如較理想為具有以下特性者。
(1)一種抗TROP2抗體，其特異性地結合於TROP2。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其結合於人TROP2之胞外區域。
(3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中上述抗體為單株抗體。
(4)如上述(1)~(3)中任一項所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞殺傷(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞殺傷(CDC)活性。
(5)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、人單株抗體或人源化單株抗體。
(6)如上述(1)~(3)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且包含使ADCC及ADCP活性降低之變異。
(7)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗體，其係含有包含序列編號6所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號5所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(8)如上述(5)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且由EU指數表示之234位及235位之白胺酸被置換為丙胺酸。
(9)如上述(8)所記載之抗體，其係含有包含序列編號8所記載之胺基 酸序列之重鏈及包含序列編號7所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(10)如上述(8)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號47所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號48所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號49所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號50所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號51所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號52所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(11)如上述(8)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號53所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號54所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號55所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號56所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號57所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號58所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(12)如上述(1)~(11)中任一項所記載之抗體，其中於重鏈羧基末端缺失1或2個胺基酸。
(13)一種抗體，其係藉由包括以下步驟之該抗體之製造方法而獲得：培養藉由含有編碼如上述(1)~(12)中任一項所記載之抗體之多核苷酸之表現載體而轉形之宿主細胞的步驟；及自該步驟中獲得之培養物採集目標抗體之步驟。
本發明所使用之抗EGFR抗體並無特別限制，例如較理想為具有以下特性者。
(1)一種抗EGFR抗體，其特異性地結合於EGFR。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其結合於人EGFR之胞外區域。
(3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其中上述抗體為單株抗體。
(4)如上述(1)~(3)中任一項所記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞殺傷(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞殺傷(CDC)活性。
(5)如上述(1)~(4)中任一項所記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體、人單株抗體或人源化單株抗體。
(6)如上述(1)~(3)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且包含使ADCC及ADCP活性降低之變異。
(7)如上述(5)所記載之抗體，其重鏈恆定區為人IgG1之重鏈恆定區，且由EU指數表示之234位及235位之白胺酸被置換為丙胺酸。
(8)如上述(7)所記載之抗體，其係含有包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(9)如上述(7)所記載之抗體，其係含有包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈及包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈而成之人源化單株抗體。
(10)如上述(7)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(11)如上述(7)所記載之抗體，其係包含如下輕鏈及重鏈而成之人源 化單株抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3。
(12)如上述(1)~(11)中任一項所記載之抗體，其中於重鏈羧基末端缺失1或2個胺基酸。
(13)一種抗體，其係藉由包括以下步驟之該抗體之製造方法而獲得：培養藉由含有編碼如上述(1)~(12)中任一項所記載之抗體之多核苷酸之表現載體而轉形之宿主細胞的步驟；及自該步驟中獲得之培養物採集目標抗體之步驟。
作為抗EGFR抗體，例如可列舉：帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、安美木單抗(ametumumab)(SY-101)、SYN-004、SCT-200、托木妥昔單抗(tomuzotuximab)、GC-1118、GR-1401、德帕土西珠單抗(depatuxizumab)(ABT-806)，可適宜地列舉帕尼單抗、ABT806。
本發明所使用之抗體亦可為與上述抗體之重鏈及/或輕鏈相比具有80%至99%之胺基酸同一性之抗體。此處「同一性」之用語設為具有該領域所使用之通常定義。同一性之%係指將2個胺基酸序列以胺基酸之一致度成為最大之方式對齊(對準)時相同胺基酸數相對於總胺基酸數(包括間隙)之百分比。此種同一性通常為80%以上之同一性，較佳為90、91、92、93或94%以上之同一性，更佳為95、96、97或98%以上之同一性，進而較佳為99%以上之同一性。又，藉由將於重鏈及/或輕鏈之胺基 酸序列置換、缺失及/或附加1至數個胺基酸殘基而成之胺基酸序列加以組合，亦可選擇具有與上述各抗體同等之各種作用之抗體。所置換、缺失及/或附加之胺基酸殘基數通常為10個胺基酸殘基以下，較佳為5至6個胺基酸殘基以下，更佳為2至3個胺基酸殘基以下，進而較佳為1個胺基酸殘基。
<2.2.2 抗體之糖鏈重塑>
近年來，報告有藉由酶反應將不均之抗體之糖鏈進行重塑而均勻地導入具有官能基之糖鏈之方法(ACS Chem.Biol.2012,7,110-122、ACS Med.Chem.Lett.2016,7,1005-1008)。亦有嘗試使用該糖鏈重塑技術，部位特異性地導入藥物，而合成均勻之ADC(Bioconjugate Chem.2015,26,2233-2242、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361-2367、US2016361436)。
糖鏈之重塑係首先利用水解酶，切除對蛋白質(抗體等)附加之不均之糖鏈而僅殘留末端之GlcNAc，從而製備附加有GlcNAc之均勻之蛋白質部分(以下稱為「受體」)。繼而，準備另行製備之任意之糖鏈(以下稱為「供體」)，使用糖基轉移酶將該受體與供體連結。藉此，可合成具有任意之糖鏈結構之均勻之糖蛋白質。
於本發明中，「糖鏈」意指藉由糖苷鍵將2個以上單糖鍵結而成之結構單元。存在將具體之單糖或糖鏈以例如“GlcNAc-”、“SG-”般之簡稱之形式標記之情況。於結構式中以該等簡稱記載之情形時，還原末端歸屬於與其他結構單元之糖苷鍵之氧原子或氮原子除了有特別之定義之情形以外，以不包含於表示該糖鏈之簡稱中者之形式表示。
於本發明中，關於成為糖鏈之基本單元之單糖之記載，除 了另行規定之情形以外，為方便起見，將其環結構中與構成環之氧原子鍵結、且與羥基(或歸屬於糖苷鍵之氧原子)直接鍵結之碳原子表述為1位(僅唾液酸中為2位)。實施例化合物之名稱係作為化學結構整體而起，未必適用該規則。
於本發明中，於以符號(例如，SG、MSG、GlcNAc等)記載糖鏈之情形時，除了另行定義之情形以外，將至還原末端之碳為止包含於該符號內，歸屬於N-或O-糖苷鍵之N或O不包含於該符號內。
本發明之抗體藥物共軛物係以下式：
Figure 110108019-A0305-02-0076-118
表示，抗體Ab或其功能性片段可自其胺基酸殘基(例如，半胱胺酸、離胺酸等)之側鏈直接與L鍵結，或者自Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈與L鍵結。
本發明中之Ab之糖鏈係N結合型糖鏈或O結合型糖鏈，較佳為N結合型糖鏈。
N結合型糖鏈係藉由N糖苷鍵與抗體之胺基酸側鏈鍵結，O結合型糖鏈係藉由O糖苷鍵與抗體之胺基酸側鏈鍵結。
本發明中之Ab為IgG，較佳為IgG1、IgG2或IgG4。
已知IgG具有良好保存於其重鏈之Fc區中之第297號之天冬醯胺殘基(以下稱為「Asn297或N297」)之N結合型糖鏈(以下稱為「Asn297糖鏈或N297糖鏈」)，有助於抗體分子之活性或動態等(Eon-Duval,A.et al,Biotechnol.Prog.2012,28,608-622、Sanglier-Cianferani,S.,Anal.Chem.2013,85,715-736)。
IgG之恆定區中之胺基酸序列被良好保存，於Edelman等人之報告(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,63,78-85,(1969))中，各胺基酸由EU編號(EU INDEX)特定。例如，Fc區中N結合型糖鏈附加之Asn297於EU編號中相當於297位，即便於分子之片段化或區域缺損導致實際之胺基酸位置發生變動之情形時，亦可藉由以EU編號表示而將胺基酸單一化地特定出。
下圖表示本發明之抗體藥物共軛物自抗體或其功能性片段之上述N297糖鏈與L鍵結之情形。
Figure 110108019-A0305-02-0077-119
再者，將具有該經重塑之糖鏈之抗體稱為糖鏈重塑抗體。
SGP(α2,6-SGP)係Sialylglycopeptide(唾液酸糖肽)之縮寫，為N結合型糖肽之代表性者。SGP可依照例如WO2011/027868所記載之方法從雞蛋之蛋黃中單離、純化。又，SGP之純化品由東京化成工業及伏見製藥所出售。於本說明書中，將SGP之糖鏈部分表述為SG，將SG之還原末端之GlcNAc缺損一個之糖鏈表述為SG(10)。SG(10)例如可參照梅川等之報告(Biochim.Biophys.Acta 2010,1800,1203-1209)，藉由SGP之酶性水解而製備。又，SG(10)亦可從東京化成工業及伏見製藥所購買。
於本說明書中，將僅於SG(10)之β-Man之任一支鏈缺失非還原末端之唾液酸之糖鏈結構表述為MSG(9)，將僅於支鏈之1-3糖鏈具有唾液酸者表述為MSG1，將僅於支鏈之1-6糖鏈具有唾液酸者表述為MSG2。
本發明之抗體藥物共軛物所使用之經重塑之糖鏈為N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2、或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物，較佳為N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2，更佳為N297-(Fuc)SG或N297-(Fuc)MSG1。
N297-(Fuc)SG係由以下結構式或序列式表示。
Figure 110108019-A0305-02-0078-120
Figure 110108019-A0305-02-0078-121
上述式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L、尤其是連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
N297-(Fuc)MSG1係由以下結構式或序列式表示。
Figure 110108019-A0305-02-0079-122
Figure 110108019-A0305-02-0079-123
上述式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L、尤其是連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
N297-(Fuc)MSG2係由以下結構式或序列式表示。
[化70]
Figure 110108019-A0305-02-0080-192
Figure 110108019-A0305-02-0080-125
上述式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-6鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L、尤其是連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子鍵結，此處，n5為2~10之整數，較佳為2~5之整數。
於本發明之抗體藥物共軛物中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形時，由於抗體為二聚物，故而抗體藥物共軛物成為結合有4個連接子L及4個藥物D之分子(上述m2=2)。
於本發明之抗體藥物共軛物中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或該等之混合物之情形時，由於抗體為二聚物，故而抗體藥物共軛物成為結合有2個連接子L及2個藥物D之分子(上 述m2=1)(參照圖1)。
N297糖鏈較佳為N297-(Fuc)SG或N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2，更佳為N297-(Fuc)SG或N297-(Fuc)MSG1，進而較佳為N297-(Fuc)SG。
於本發明之抗體藥物共軛物中之抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)SG或N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2之情形時，可獲得均勻性較高之ADC。
<3.製造方法>
對包含本發明之新穎CDN衍生物之抗體藥物共軛物或其製造中間物之代表性製造方法進行說明。再者，以下為了表示化合物而使用各反應式中所示之化合物之編號。即，稱為「式(1)之化合物」、「化合物(1)」等。又，除此以外之編號之化合物亦同樣地記載。
於下述A法~E法中，取代基L1與上述含義相同。取代基L2表示選自下述(i)或(ii)中之基：(i)於與L鍵結時，L2表示-NHR'、羥基C1-C6烷基或胺基C1-C6烷基，此處，R'表示氫原子、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C3-C6環烷基，該C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基可經1至6個鹵素原子取代；或(ii)於不與L鍵結時，L2表示氫原子或鹵素原子。
取代基W1表示-NH-或硫原子。取代基W2表示-CH=。取代基Z1~Z3一起表示-CH2-CH2-CH2-。取代基R1~R3分別獨立地表示氫原子、鹵素原子、-OR'、-OC(=O)R'、-N3、-NHR'、-NR'R"或-NHC(=O)R'(此處，R'如上文所定義，R"表示C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C3-C6環 烷基)。取代基R4表示氫原子。關於取代基R5，於W1為氮原子時，R5表示氫原子，於W1為氧原子時，R5不存在。取代基Ra、Rc、Re及Rg表示天然型α-胺基酸之側鏈。例如為甲基、異丙基、第二丁基、異丁基、苄基等。PRO1表示一級醇之保護基。適宜為4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基等。PRO2、PRO3、PRO7、PRO8表示二級醇之保護基。適宜為第三丁基二甲基矽烷基、三異丙基矽烷氧基甲基、苯甲醯基、2-硝基苄基、4-甲氧基四氫哌喃-4-基等。PRO6表示羧酸之保護基。適宜為第三丁基、苄基等。PRO5、PRO9表示胺之保護基。PRO5適宜為第三丁氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基等，PRO9適宜為9-茀基甲氧基羰基或2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基。PRO4表示醇或胺之保護基。於為醇之情形時，適宜為第三丁基二甲基矽烷基、苯甲醯基等，於為胺之情形時，適宜為2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、第三丁氧基羰基等。Qa表示氧原子或硫原子，Qb表示羥基或硫醇基。Qa'及Qb'分別獨立地表示帶負電之氧原子(O-)或硫原子(S-)。Rx及Ry分別獨立地表示鹵素原子或-O-PRO2。n表示1至3之整數。
A法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(1)所表示之CDN衍生物可依照以下所記載之A法製造。
Figure 110108019-A0305-02-0082-126
本製造法係用以製造通式(1)所表示之化合物之方法。本製造法之A-1步驟至A-5步驟可進行單槽合成，其係參照Gaffney等之報告(Org.Lett.2010,12,3269-3271)實施。
Figure 110108019-A0305-02-0083-127
(A-1步驟)
本步驟係藉由使用公知之有機化學方法對式(1a)之化合物連續進行水解反應與氰乙基之去除而製造式(2a)之化合物之步驟。於溶劑(乙腈、四氫呋喃、N,N-二甲基甲醯胺或該等之混合溶劑)中在-10℃至反應所使用之 溶劑之沸點、較佳為15℃至35℃下，利用水及酸(吡啶三氟乙酸鹽、4,5-二氰基咪唑、1H-四唑等)處理化合物(1a)，藉此實施水解反應。相對於化合物(1a)1莫耳，水使用2莫耳至過量莫耳，較佳為使用2莫耳至10莫耳，酸使用1莫耳至過量莫耳，較佳為使用1莫耳至5莫耳。反應時間為1分鐘至3小時，較佳為5分鐘至30分鐘。繼而，於該反應液中添加鹼(第三丁基胺等)而將氰乙基去除。相對於化合物(1a)1莫耳，鹼使用過量莫耳，較佳為使用30莫耳至50莫耳。反應時間為5分鐘至6小時，較佳為15分鐘至1小時。將反應液於減壓下濃縮而獲得化合物(2a)之粗產物。化合物(2a)之粗產物可不進行純化而進入下一步驟。
(A-2步驟)
本步驟係對於式(2a)之化合物，使用公知之有機化學方法去除羥基之保護基，而製造式(3a)之化合物之步驟。於開始本步驟之反應之前，視需要使用乙腈共沸1次至3次，將式(2a)之粗產物加以乾燥。於PRO1為4,4'-二甲氧基三苯甲基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等)中在-10℃至反應所使用之溶劑之沸點、較佳為15℃至35℃下，利用水及酸(二氯乙酸、三氟乙酸等)處理化合物(2a)，藉此將4,4'-二甲氧基三苯甲基去除。相對於化合物(2a)1莫耳，水使用過量莫耳，較佳為使用10莫耳至20莫耳，酸係利用反應所使用之溶劑稀釋至1%至50%(v/v)、較佳為5%至10%(v/v)，使用過量莫耳之該稀釋溶液，較佳為使用5莫耳至15莫耳。反應時間為1分鐘至3小時，較佳為5分鐘至30分鐘。於反應液中添加吡啶進行反應停止處理。吡啶係使用可將所使用之酸充分中和之量，較佳為相對於酸1莫耳而使用2莫耳至10莫耳。將反應液於減壓下濃縮而獲得化合物(3a)之粗產物。將化合物(3a)之粗產物使用脫水乙腈共沸3次至5次。於最 後之共沸時保留乙腈，而獲得化合物(3a)之0.01M至1M之乙腈溶液。將所獲得之乙腈溶液直接送入下一步驟。
(A-3步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(3a)之化合物連續進行與式(4a)之化合物之偶合反應及所獲得之偶合體之硫化反應，藉此製造式(5a)之化合物之步驟。於開始本步驟之反應之前，將化合物(4a)使用脫水乙腈共沸3次至5次。於最後之共沸時保留乙腈，而製備化合物(4a)之0.01M至1M之乙腈溶液。於該溶液中添加乾燥劑(粉末狀或顆粒狀之分子篩3A或分子篩4A)，於使用溶液之前於氮氣或氬氣環境下保存。在5℃之35℃於化合物(3a)之乙腈溶液中添加藉由共沸而乾燥之化合物(4a)之乙腈溶液，藉此實施偶合反應。反應時間為1分鐘至24小時，較佳為5分鐘至6小時。繼而，於該反應液中添加硫化劑(N,N-二甲基-N'-(3-硫酮-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲醯亞胺醯胺、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮等)實施硫化反應。相對於化合物(3a)1莫耳，硫化劑使用1莫耳至5莫耳，較佳為使用1莫耳至2莫耳。反應時間為5分鐘至24小時，較佳為30分鐘至6小時。將反應液於減壓下濃縮，而獲得化合物(5a)之粗產物。所獲得之化合物(5a)之粗產物直接進入下一步驟。
(A-4步驟)
本步驟係對於式(5a)之化合物，使用公知之有機化學方法去除羥基之保護基，而製造式(6a)之化合物之步驟。於PRO1為4,4'-二甲氧基三苯甲基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等)中在-10℃至反應所使用之溶劑之沸點、較佳為15℃至35℃下，利用水及酸(二氯乙酸、三氟乙酸等)處理化合物(5a)之化合物，藉此去除4,4'-二甲氧基三苯甲基。相對 於化合物(5a)1莫耳，水使用過量莫耳，較佳為使用10至20莫耳，酸係利用反應所使用之溶劑稀釋至1%至50%(v/v)、較佳為5%至10%(v/v)，而使用該稀釋溶液過量莫耳，較佳為使用5莫耳至15莫耳。反應時間為1分鐘至3小時，較佳為5分鐘至30分鐘。於反應液中添加吡啶進行反應停止處理。吡啶係使用可充分中和所使用之酸之量，較佳為相對於酸1莫耳而使用10莫耳至200莫耳。將反應液於減壓下濃縮，而獲得化合物(6a)之粗產物。將所獲得之化合物(6a)之粗產物直接送入下一步驟。
(A-5步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(6a)之化合物連續進行環化反應與硫化反應，而製造式(7a)之化合物之步驟。將化合物(6a)溶解於吡啶後，於減壓下進行濃縮，而製備0.01M至0.5M之吡啶溶液。於5℃至35℃向該吡啶溶液添加脫水縮合劑(2-氯-5,5-二甲基-1,3,2λ5-二氧磷雜環己烷-2-酮等)，藉此實施環化反應。相對於化合物(6a)1莫耳，脫水縮合劑使用1莫耳至過量莫耳，較佳為使用3莫耳至5莫耳。反應時間為1分鐘至6小時，較佳為5分鐘至1小時。繼而，於該反應液中添加水及硫化劑(3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、N,N-二甲基-N'-(3-硫酮-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲醯亞胺醯胺等)而實施硫化反應。相對於化合物(6a)1莫耳，水使用過量莫耳，較佳為使用30莫耳至50莫耳，硫化劑使用1莫耳至5莫耳，較佳為使用1莫耳至2莫耳。反應時間為5分鐘至12小時，較佳為30分鐘至3小時。將反應液添加至碳酸氫鈉水溶液(0.1M至1M)中後，攪拌15分鐘至24小時進行反應停止處理。利用有機溶劑(乙酸乙酯、二乙醚、甲苯或該等之混合溶劑)將反應液萃取1次至5次後，合併萃取液，利用無水鹽(無水硫酸鈉或無水硫酸鎂)加以乾燥。將乾燥劑過濾去除，將濾液於減壓下濃縮。藉由矽膠 管柱層析法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇、己烷/乙酸乙酯等]、C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈]或將該等加以組合而將所獲得之殘留物進行純化，從而以2種以上之非鏡像異構物混合物或2種以上之純非鏡像異構物之形式獲得化合物(7a)。於本步驟中，多數情形時獲得2種非鏡像異構物，但依賴於原料(1a)及(4a)，進而亦存在獲得1種或2種非鏡像異構物之情況。即便所獲得之化合物(7a)為複數種非鏡像異構物混合物，亦可不進行進一步純化而直接進入下一步驟。
(A-6步驟)
本步驟係對於式(7a)之化合物，使用公知之有機化學方法將氰乙基及全部醯基系保護基同時去除，而製造式(8a)之化合物之步驟。本步驟視需要於高壓釜中或密封管中實施。於PRO4為苯甲醯基之情形時，於溶劑(甲醇、乙醇、四氫呋喃或該等之混合溶劑)中在5℃至反應所使用之溶劑之沸點下利用28%(v/v)氨水處理化合物(7a)之化合物，藉此將氰乙基與苯甲醯基去除。相對於化合物(7a)1莫耳，氨使用過量莫耳，較佳為使用300莫耳至3000莫耳。反應時間為30分鐘至96小時，較佳為2小時至48小時。視需要將反應液濃縮，藉由分取HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]、C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]或將該等加以組合而將殘留物進行純化，從而獲得化合物(8a)。即便所獲得之化合物(8a)為非鏡像異構物混合物，亦可不進一步純化而進入下一步驟。又，本步驟亦可不進行純化而直接進入下一步驟。
(A-7步驟)
本步驟係對於式(8a)之化合物，使用公知之有機化學方法將全部矽烷 基系保護基同時去除，而製造式(9a)之化合物之步驟。於PRO2及PRO3為第三丁基二甲基矽烷基之情形時，於5℃至100℃、較佳為35℃至60℃直接利用三乙胺三氫氟酸鹽處理化合物(8a)，藉此將第三丁基二甲基矽烷基去除。相對於化合物(8a)1莫耳，三乙胺三氫氟酸鹽使用過量莫耳，較佳為使用100至200莫耳。反應時間為30分鐘至24小時，較佳為2小時至12小時。將反應液冷卻至室溫後，於反應液中逐量注入經冰浴冷卻之1M碳酸氫三乙銨水溶液與三乙胺之3：1至10：1(v/v)之混合溶液，進行反應停止處理。視需要亦可將反應液注入經冰浴冷卻之1M碳酸氫三乙銨水溶液與三乙胺之混合溶液中。於該情形時，利用乙腈與水將反應容器洗淨。三乙胺係使用足夠使反應液之液性變化為弱鹼性之量，較佳為相對於三乙胺三氫氟酸鹽1莫耳，使用三乙胺約2莫耳。將反應液之有機溶劑成分於減壓下蒸餾去除後，藉由分取HPLC[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]、C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]或將該等加以組合而將殘留之水溶液進行純化，從而以單一非鏡像異構物之形式獲得化合物(9a)。
(A-8步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(9a)之化合物進行離子交換，而製造式(1)之化合物之步驟。將陽離子交換樹脂(BT AG(註冊商標)50W-X2樹脂，100-200目，氫型)懸浮於純水中，填充至空柱筒(column cartridge)中。陽離子交換樹脂以重量比計使用化合物(9a)之10倍至50倍量。使過量之純水自然流下後，使3管柱體積之1M氫氧化鈉水溶液自然流下，繼而使6管柱體積之純水自然流下。將化合物(9a)溶解於約3管柱體積之純水中，並填充於管柱中。於化合物難以溶解於純水中之情形時，亦可使用與少量有機溶劑(乙腈、甲醇等)之混合液。將自然流下之溶液分取 後，進一步利用6管柱體積之純水等進行溶出，並分取組分。合併含有目標物之組分並加以冷凍乾燥，而以單一之非鏡像異構物之形式獲得化合物(1)。
A'法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(1')所表示之CDN衍生物可依照以下所記載之A'法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0089-128
本製造法係變更A法之一部分而用以製造通式(1')所表示之化合物之方法。具體而言，通式(1')之化合物可將A法A-5步驟變更為以下所示之A'-5步驟進行製造。又，於取代基Rx與Ry兩者為鹵素原子之情形時，可省略A-7步驟。
[化75]
Figure 110108019-A0305-02-0090-129
(A'-5步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(6a')之化合物連續進行環化反應與氧化反應，而製造式(7a')之化合物之步驟。將化合物(6a')溶解於吡啶中後，於減壓下進行濃縮，製備0.01M至0.5M之吡啶溶液。於5℃至35℃向該吡啶溶液添加脫水縮合劑(2-氯-5,5-二甲基-1,3,2λ5-二氧磷雜環己烷-2-酮等)實施環化反應。相對於化合物(6a')1莫耳，脫水縮合劑使用1莫耳至過量莫耳，較佳為使用3莫耳至5莫耳。反應時間為1分鐘至6小時，較佳為5分鐘至1小時。繼而，於該反應液中添加水與氧化劑(碘等)實施氧化反應。相對於化合物(6a')1莫耳，水使用0莫耳至過量莫耳，較佳為使用30莫耳至50莫耳，氧化劑使用2莫耳至10莫耳，較佳為使用3莫耳至5莫耳。反應時間為5分鐘至12小時，較佳為30分鐘至3小時。將反應液添加至碳酸氫鈉水溶液(0.1M至1M)中、攪拌15分鐘至24小時進行反應停止處理。利用有機溶劑(乙酸乙酯、二乙醚、甲苯或該等之混合溶劑)將反應液萃取1次至5次後，合併萃取液，利用無水鹽(無水硫酸鈉或無水硫酸鎂)加以乾燥。將乾燥劑過濾去除，將濾液於減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇、己烷/乙酸乙酯等]、C18矽膠管柱層析 法[緩衝液/乙腈]或將該等加以組合而將所獲得之殘留物進行純化，從而獲得化合物(7a')。
A"法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(1")所表示之CDN衍生物可依照以下所記載之A"法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0091-130
本製造法係變更A法之一部分而用以製造通式(1")所表示之化合物之方法。具體而言，通式(1")之化合物可將A法之A-3步驟變更為以下所示之A"-3步驟進行製造。又，於取代基Rx與Ry兩者為鹵素原子之情形時，可省略A-7步驟。
[化77]
Figure 110108019-A0305-02-0092-131
(A"-3步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(3a")之化合物連續進行與式(4a")之化合物之偶合反應及所獲得之偶合體之氧化反應，藉此製造式(5a")之化合物之步驟。於開始本步驟之反應之前，將化合物(4a")使用脫水乙腈共沸3次至5次。於最後之共沸時保留乙腈，而製備化合物(4a")之0.01M至1M之乙腈溶液。於該溶液中添加乾燥劑(粉末狀或顆粒狀之分子篩3A或分子篩4A)，於使用溶液之前於氮氣或氬氣環境下保存。於5℃至35℃向化合物(3a")之乙腈溶液添加藉由共沸而乾燥之化合物(4a")之乙腈溶液，藉此實施偶合反應。反應時間為1分鐘至24小時，較佳為5分鐘至6小時。繼而，於該反應液中添加氧化劑(第三丁基過氧化氫等)實施氧化反應。相對於化合物(3a")1莫耳，氧化劑使用1莫耳至5莫耳，較佳為使用2莫耳至3莫耳。反應時間為5分鐘至24小時，較佳為30分鐘至6小時。於反應液中添加飽和硫代硫酸鈉水溶液，攪拌10分鐘至12小時進行反應停止處理。利用有機溶劑(二氯甲烷與甲醇之混合溶劑等)將反應液萃取1次至5次後，合併萃取液，利用無水鹽(無水硫酸鈉或無水硫酸鎂)加以乾燥。將 乾燥劑過濾去除，將濾液於減壓下濃縮，而獲得化合物(5a")之粗產物。將所獲得之化合物(5a")之粗產物直接送入下一步驟。
A'''法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(1''')所表示之CDN衍生物可依照以下所記載之A'''法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0093-132
本製造法係變更A法之一部分而用以製造通式(1''')所表示之化合物之方法。具體而言，通式(1''')之化合物可將A法之A-3步驟變更為A"-3步驟，將A-5步驟變更為A'-5步驟進行製造。又，於取代基Rx與Ry兩者為鹵素原子之情形時，可省略A-7步驟。
[化79]
Figure 110108019-A0305-02-0094-133
B法：共軛前驅物(糖鏈共軛)
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(2)所表示之共軛前驅物可依照以下所記載之B法進行製造。
[化80]
Figure 110108019-A0305-02-0095-134
本製造法係用以製造於L1之任意位置取代有-NH2之情形時之共軛前驅物(2)之方法。
Figure 110108019-A0305-02-0095-135
(B-1步驟)
本步驟係對於式(1b)之化合物，使用公知之有機化學方法將保護基去除，藉此製造式(2b)之化合物之步驟。於PRO5為第三丁氧基羰基之情形時，於溶劑(二氯甲烷、二
Figure 110108019-A0305-02-0095-151
烷、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、或該等之混合溶劑)中，在-10℃至反應所使用之溶劑之沸點、較佳為15℃至35℃下，利用三氟乙酸處理化合物(1b)，藉此將保護基去除。相對於化合物 (1b)1莫耳，三氟乙酸使用過量莫耳，較佳為使用20莫耳至50莫耳。反應時間為5分鐘至24小時，較佳為30分鐘至6小時。將反應液於減壓下濃縮後，懸浮於甲苯中，再次於減壓下進行濃縮。將該操作重複2次至5次。添加溶劑(二乙醚、二異丙醚、己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯或該等之混合溶劑)製成漿料狀後，濾取固體，而獲得化合物(2b)之粗產物。化合物(2b)之粗產物不進一步純化而進入下一步驟。
(B-2步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(2b)之化合物進行與式(3b)之化合物之醯胺化，藉此製造式(4b)之化合物之步驟。於溶劑(N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮、N,N-二甲基乙醯胺、乙腈等)中，在5℃至35℃使化合物(2b)與鹼(三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等)及化合物(3b)進行反應，藉此實施醯胺化。相對於化合物(2b)1莫耳，鹼使用1莫耳至5莫耳，化合物(3b)使用0.5莫耳至1.5莫耳。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至24小時。將反應液注入有機溶劑(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇或其等之混合溶劑)與水或酸性水溶液(0.1至1M之鹽酸、檸檬酸水溶液等)之兩層中，利用有機溶劑萃取1次至5次。合併萃取液，並利用飽和鹽水加以洗淨後，利用無水鹽(無水硫酸鈉或無水硫酸鎂)加以乾燥。將乾燥劑過濾去除，將濾液於減壓下濃縮。再者，亦可省略上述分液操作，將反應液直接於減壓下進行濃縮，而進入其後之矽膠管柱純化。利用矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/甲醇等]將所獲得之殘留物進行純化，而獲得化合物(4b)。視需要將所獲得之化合物(4b)溶解於良溶劑(乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、甲醇或該等之混合溶劑)中後，添加不良溶劑(二乙醚、二異丙醚、己烷等)進行再沈澱，並濾取固體，藉此可提高純 度。
(B-3步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(4b)之化合物進行酯化，藉此製造式(5b)之化合物之步驟。於溶劑(N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、乙腈等)中，在5℃至35℃使化合物(4b)與N-羥基丁二醯亞胺及縮合劑(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽等)進行反應，藉此實施酯化。相對於化合物(4b)1莫耳，N-羥基丁二醯亞胺及縮合劑分別使用1莫耳至3莫耳。反應時間為30分鐘至72小時，較佳為2小時至24小時。利用有機溶劑(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或其等之混合溶劑)稀釋反應液後，利用冰水洗淨3次至5次。使用無水鹽(無水硫酸鈉或無水硫酸鎂)將有機層加以乾燥。將乾燥劑過濾去除後，將濾液於減壓下進行濃縮，而獲得化合物(5b)之粗產物。視需要可利用C18矽膠管柱層析法[僅乙腈]將所獲得之化合物(5b)進行純化。又，將所獲得之化合物(5b)溶解於良溶劑(乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷或該等之混合溶劑)中後，添加不良溶劑(二乙醚、二異丙醚、己烷等)進行再沈澱，並濾取固體，藉此可提高純度。
(B-4步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(5b)之化合物進行與式(6b)之化合物之縮合反應，藉此製造式(2)之化合物之步驟。於溶劑中(N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、乙腈等)，在-10℃至100℃、較佳為15℃至35℃使化合物(6b)與鹼(三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺等)及化合物(5b)進行反應，藉此實施縮合反應。相對於化合物(6b)1莫耳，鹼使用2莫耳至5莫耳，化合物(5b)使用1莫耳至2莫耳。反應時間為5 分鐘至24小時，較佳為1小時至6小時。於反應液中添加苄基胺，進行反應停止處理。相對於化合物(6b)1莫耳，苄基胺使用4莫耳至10莫耳。視需要將反應液於減壓下進行局部濃縮，藉由分取HPLC[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]、C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]或將該等加以組合將殘留之溶液進行純化，而獲得化合物(2)。
B'法：共軛前驅物(半胱胺酸共軛)
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(2')所表示之共軛前驅物可依照以下所記載之B'法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0098-136
本製造法係用以製造於L1之任意位置取代有-NH2之情形時之共軛前驅物(2')之方法。
[化83]
Figure 110108019-A0305-02-0099-137
(B-5步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(2b')之化合物進行與式(7b)之化合物之醯胺化，藉此製造式(8b)之化合物之步驟。除了不使用鹼以外，依照B法B-2步驟所記載之方法獲得化合物(8b)。
(B-6步驟)
本步驟係對於式(8b)之化合物，使用公知之有機化學方法將保護基去除，藉此製造式(9b)之化合物之步驟。於PRO6為第三丁基之情形時，除了純化操作使用矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇]以外，依照B法B-1步驟所記載之方法獲得化合物(9b)。
(B-7步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(9b)之化合物進行酯化，藉此製造式(10b)之化合物之步驟。依照B法B-3步驟所記載之方法獲得化合物(10b)。
(B-8步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(6b)之化合物進行與式(10b) 之化合物之縮合反應，藉此製造式(2')之化合物之步驟。依照B法B-4步驟所記載之方法獲得化合物(2')。
C法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(3)所表示之共軛前驅物可依照以下所記載之C法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0100-138
本製造法係用以製造於L1之任意位置取代有羥基之情形時之共軛前驅物(3)之方法。
[化85]
Figure 110108019-A0305-02-0101-139
(C-1步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(1c)之化合物進行與式(2c)之化合物之醯胺化，藉此製造式(3c)之化合物之步驟。依照B法B-2步驟所記載之方法獲得化合物(3c)。
(C-2步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(3c)之化合物進行酯化，藉此製造式(4c)之化合物之步驟。依照B法B-3步驟所記載之方法獲得化合物(4c)。
(C-3步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(5c)之化合物連續進行與式(6c)之化合物之偶合反應(胺基亞甲基化)及所獲得之偶合體之去保護，藉此製造式(7c)之化合物之步驟。於PRO9為9-茀基甲氧基羰基之情形時，於四氫呋喃中，在5℃至35℃使化合物(5c)與化合物(6c)及酸(對甲苯磺酸等) 進行反應，藉此實施胺基亞甲基化。相對於化合物(5c)1莫耳，化合物(6c)使用1莫耳至20莫耳，較佳為使用2莫耳至10莫耳，酸使用0.05莫耳至過量莫耳，較佳為使用0.1莫耳至3莫耳。反應時間為30分鐘至72小時，較佳為2小時至24小時。繼而，於反應液中添加鹼(1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯等)實施去保護。於反應液懸浮之情形時，可視需要追加溶劑(N,N-二甲基甲醯胺等)使其溶解後進行反應。相對於化合物(5c)1莫耳，鹼使用過量莫耳，較佳為使用5莫耳至20莫耳。反應時間為10分鐘至24小時，較佳為2小時至12小時。於反應液中添加水，直接利用C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈等]進行純化，而獲得化合物(7c)。
(C-4步驟)
本步驟係對於式(7c)之化合物，使用公知之有機化學方法將保護基去除，而製造式(8c)之化合物之步驟。於PRO7及PRO8為第三丁基二甲基矽烷基之情形時，依照A法A-7步驟所記載之方法獲得化合物(8c)。
(C-5步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(8c)之化合物進行與式(4c)之化合物之縮合反應，藉此製造式(3)之化合物之步驟。依照B法B-4步驟所記載之方法獲得化合物(3)。
C'法
本發明之抗體藥物共軛物所使用之(3')所表示之共軛前驅物可依照以下所記載之C'法進行製造。
[化86]
Figure 110108019-A0305-02-0103-140
本製造法係用以製造於L1之任意位置取代有羥基之情形時之共軛前驅物(3'之方法。
[化87]
Figure 110108019-A0305-02-0104-141
(C'-1步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(1c')之化合物連續進行水解反應及氰乙基之去除，藉此製造式(2c')之化合物之步驟。依照A法A-1步驟所記載之方法獲得化合物(2c')。
(C'-2步驟)
本步驟係對於式(2c')之化合物，使用公知之有機化學方法去除羥基 之保護基，而製造式(3c')之化合物之步驟。依照A法A-2步驟所記載之方法獲得化合物(3c')。
(C'-3步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(3c')之化合物連續進行與式(4c')之化合物之偶合反應及所獲得之偶合體之硫化反應或氧化反應，藉此製造式(5c')之化合物之步驟。依照A法A-3步驟或A"法A"-3步驟所記載之方法獲得化合物(5c')。
(C'-4步驟)
本步驟係對於式(5c')之化合物，使用公知之有機化學方法去除羥基之保護基，而製造式(6c')之化合物之步驟。依照A法A-4步驟所記載之方法獲得化合物(6c')。
(C'-5步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(6c')之化合物連續進行環化反應與硫化反應或氧化反應，而製造式(7c')之化合物之步驟。依照A法A-5步驟或A'法A'-5步驟所記載之方法獲得化合物(7c')。
(C'-6步驟)
本步驟係對於式(7c')之化合物，使用公知之有機化學方法將氰乙基及全部醯基系保護基同時去除，而製造式(8c')之化合物之步驟。依照A法A-6步驟所記載之方法獲得化合物(8c')。
(C'-7步驟)
本步驟係對於式(8c')之化合物，使用公知之有機化學方法將全部矽烷基系保護基同時去除，而製造式(9c')之化合物之步驟。於PRO9為2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基之情形時，於5℃至100℃、較佳為35℃至60℃ 下，利用氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液處理化合物(8c')，藉此將2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基去除。相對於化合物(8c')1莫耳，氟化四丁基銨使用過量莫耳，較佳為10至30莫耳。反應時間為1小時至48小時，較佳為4小時至24小時。於反應液中添加緩衝液加以稀釋後，視需要於減壓下將有機溶劑成分蒸餾去除。藉由分取HPLC[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]、C18矽膠管柱層析法[緩衝液/乙腈、緩衝液/甲醇等]或將該等加以組合而將殘留物進行純化，從而獲得化合物(9c')。
(C'-8步驟)
本步驟係使用公知之有機化學方法對式(9c')之化合物進行與式(4c)之化合物之縮合反應，藉此製造式(3')之化合物之步驟。依照B法B-4步驟所記載之方法獲得化合物(3')。
D法：糖鏈重塑抗體之製造
糖鏈重塑抗體例如可依照WO2018/003983等所記載之方法，藉由下式所示之方法進行製造。
Figure 110108019-A0305-02-0106-142
(D-1步驟)
本步驟係對於目標抗體，使用公知之酶反應，藉由水解將與抗體之胺基酸序列第297號之天冬胺酸結合之N結合型糖鏈(N297結合糖鏈)之還原末端幾丁二糖結構之GlcNAcβ1-4GlcNAc間之糖苷鍵切斷，而製造糖鏈 切斷抗體之步驟。對於目標抗體(1d)(10mg/mL)，於緩衝液(磷酸緩衝液等)中，在0℃至40℃使用野生型EndoS酶等水解酶實施還原末端之幾丁二糖結構之GlcNAcβ1與4GlcNAc間之糖苷鍵之水解反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。相對於抗體(1d)100mg，野生型EndoS酶使用0.1mg至10mg，較佳為使用0.1mg至3mg。反應結束後，藉由親和層析法(HiTrap rProtein A FF(5ml)(GE Healthcare製造))及/或羥磷灰石管柱(Bio-Scale Mini CHT Type I筒(5ml)(BIO-RAD製造))進行純化，而獲得(Fucα1,6)GlcNAc抗體(2d)。
(D-2步驟)
本步驟係使用公知之酶反應使對於D-1步驟中所獲得之(Fucα1,6)GlcNAc抗體(2d)與具有含有疊氮基之PEG連接子之SG型或MSG(MSG1、MSG2)型糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0107-152
唑啉體(以下為「疊氮基糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0107-153
唑啉體」)結合，而製造糖鏈重塑抗體(3d)之步驟。
於緩衝液(磷酸緩衝液等)中，於0℃至40℃在EndoS(D233Q/Q303L)等糖基轉移酶存在下，使抗體(2d)與疊氮基糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0107-154
唑啉體進行反應，藉此實施糖鏈轉移反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。相對於抗體100mg，EndoS酶(D233Q/Q303L)使用1mg至10mg，較佳為使用1mg至3mg，疊氮基糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0107-155
唑啉體使用2當量至過量當量，較佳為使用4當量至20當量。反應結束後，藉由親和層析法(HiTrap rProtein A FF(5ml)(GE Healthcare製造))及羥磷灰石管柱(Bio-Scale Mini CHT Type I筒(5ml)(BIO-RAD製造))進行純化，而獲得糖鏈重塑抗體(3d)。
於上述糖鏈重塑抗體之製備中，抗體水溶液之濃縮、濃度 測定、以及緩衝液交換可依照下文所述之共通操作A至C進行。
再者，SG型之疊氮基糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0108-156
唑啉體係依照WO2018/003983所記載之方法而合成。作為一例，將[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox(WO2018/003983所記載之化合物1-10)之合成方法示於下式。
[化89]
Figure 110108019-A0305-02-0109-143
MSG型之疊氮基糖鏈
Figure 110108019-A0305-02-0109-157
唑啉體亦依照WO2018/003983所記 載之方法合成。作為一例，將[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox(WO2018/003983所記載之化合物1-11)之合成方法示於下式。
Figure 110108019-A0305-02-0110-144
E法：抗體與藥物之共軛(糖鏈共軛1)
[化91]
Figure 110108019-A0305-02-0111-145
(此處，抗體藥物共軛物(1e)之左側之2個星號(*)表示右側之星號所表示之藥物連接子部分)
本製造法係藉由SPAAC(應力促進疊氮-炔烴環加成(strain-promoted azide-alkyne cycloaddition)：J.Am.Chem.Soc.2004,126,15046-15047)反應使D法D-2步驟中所獲得之糖鏈重塑抗體(3d)與B法B-4步驟中所獲得之共軛前驅物(2)結合，而製造抗體藥物共軛物(1e)之方法。
(E-1步驟)
將糖鏈重塑抗體(3d)之緩衝溶液(磷酸緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液等)與將共軛前驅物(2)溶解於適當之溶劑(二甲基亞碸、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N-甲基吡咯啶酮、丙二醇或該等之混合溶劑)中而成之溶液加以混合，藉此實施SPAAC反應。相對於糖鏈重塑抗體(3d)1莫耳，共軛前驅物(2)為2莫耳至過量莫耳，較佳為4莫耳至30莫耳， 有機溶劑之比率相對於抗體之緩衝溶液，較佳為1%至200%(v/v)。反應溫度為0℃至37℃，較佳為15℃至25℃，反應時間為1小時至150小時，較佳為6小時至72小時。反應溶液之pH值較佳為5至9。依照下文所述之共通操作D所記載之方法將反應溶液進行純化，而獲得抗體藥物共軛物(1e)。
E'法：抗體與藥物之共軛(半胱胺酸共軛)
具有半胱胺酸共軛之本發明之抗體藥物共軛物可使用依照參考例3等所製備之目標抗體與B'法B-8步驟中所獲得之具有順丁烯二醯亞胺基之共軛前驅物(2')，依照WO2014/057687等所記載之方法進行製造。
E"法：抗體與藥物之共軛(糖鏈共軛2)
於E法中，將共軛前驅物(2)改變為C'法C'-8步驟中所獲得之共軛前驅物(3')，藉此獲得下式所示之抗體藥物共軛物(1e")。
Figure 110108019-A0305-02-0112-146
(此處，抗體藥物共軛物(1e")之左側之2個星號(*1)表示右側之星號所表示之藥物連接子部分)
對於抗體藥物共軛物，藉由下文所述之共通操作D至G進行緩衝液交換、純化、抗體濃度之測定及每一分子抗體之藥物平均結合數之測定，而可進行抗體藥物共軛物之鑑定。
共通操作A：抗體水溶液之濃縮
將抗體或抗體藥物共軛物溶液裝入Amicon(註冊商標)Ultra離心式過濾器設備(50,000NMWL，Merck Millipore Ltd.)中，藉由使用離心機(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc.)之離心操作(以2000G至4000G離心5分鐘至20分鐘)將抗體及抗體藥物共軛物溶液進行濃縮。
共通操作B：抗體之濃度測定
使用UV測定器(Nanodrop 1000，Thermo Fisher Scientific,Inc.)，依照製造商所規定之方法進行抗體濃度之測定。此時，各抗體使用不同之280nm吸光係數(1.3mLmg-1cm-1至1.8mLmg-1cm-1)。
共通操作C：抗體之緩衝液交換
於抗體水溶液中添加緩衝液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)、磷酸緩衝液(pH值為6.0)等)，依照共通操作A所記載之方法進行濃縮。將該操作進行數次後，依照共通操作B所記載之方法測定抗體濃度。於該抗體緩衝溶液中適當添加緩衝液(磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)、磷酸緩衝液(pH值為6.0)等)，而製備目標濃度(例如，約10mg/mL)之抗體緩衝溶液。
共通操作D：抗體藥物共軛物之純化(凝膠過濾層析法)
利用乙酸緩衝液(10mM之乙酸鹽緩衝液(Acetate Buffer)，5%山梨糖醇(Sorbitol)，pH值為5.5；本說明書中稱為ABS)或其以外之適當之緩衝液使NAP管柱(NAP-5、NAP-10、NAP-25(GE Healthcare製造))平衡。於該NAP管柱中填充抗體藥物共軛物反應溶液，使製造商規定量之緩衝液自然流下，分取抗體組分。將該組分再次填充至NAP管柱中，使製造商規定量之緩衝液自然流下，分取抗體組分。將該操作重複進行合計2次至3次，藉此獲得去除未結合之藥物連接子或二甲基亞碸、丙二醇之抗體藥物共軛 物。視需要藉由共通操作A及C調節抗體藥物共軛物溶液之濃度。
共通操作E：抗體藥物共軛物中之抗體濃度及每一分子抗體之藥物平均結合數之測定(UV法)
抗體藥物共軛物中之結合藥物濃度可藉由使用吸光光度計(UV/VIS Spectrometer Lambda 25，PerkinElmer,Inc.)，對抗體藥物共軛物水溶液於280nm及250nm之兩種波長下之吸光度進行測定後，進行下述計算而算出。某一波長下之全吸光度等於系統內所存在之全部吸收化學物種之吸光度之和(吸光度之相加性)，因此若假定抗體與藥物之共軛前後抗體及藥物之莫耳吸光係數無變化，則抗體藥物共軛物中之抗體濃度及藥物濃度係以下述關係式表示。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 式(I)
A250=AD,250+AA,250=εD,250CD+εA,250CA 式(II)
此處，A280表示280nm下之抗體藥物共軛物水溶液之吸光度，A250表示250nm下之抗體藥物共軛物水溶液之吸光度，AA,280表示280nm下之抗體之吸光度，AA,250表示250nm下之抗體之吸光度，AD,280表示280nm下之共軛物前驅物之吸光度，AD,250表示250nm下之共軛物前驅物之吸光度，εA,280表示280nm下之抗體之莫耳吸光係數，εA,250表示250nm下之抗體之莫耳吸光係數，εD,280表示280nm下之共軛物前驅物之莫耳吸光係數，εD,250表示250nm下之共軛物前驅物之莫耳吸光係數，CA表示抗體藥物共軛物中之抗體濃度，CD表示抗體藥物共軛物中之藥物濃度。此處，εA,280、εA,250、εD,280、εD,250使用事先準備之值(計算推定值或實測值)。例如，εA,280可根據抗體之胺基酸序列，藉由已知之計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)進行推定。εA,250係使用由根據抗體之 UV測定所獲得之實測值與εA,280之推定值計算而得之值。於實施例中，抗TROP2抗體1之莫耳吸光係數使用εA,280=223400及εA,250=63482。抗TROP2抗體2之莫耳吸光係數使用εA,280=223400及εA,250=69027或71411。抗CD70抗體1之莫耳吸光係數使用εA,280=226380及εA,250=73432。抗CD70抗體2之莫耳吸光係數使用εA,280=212400及εA,250=72355。抗EGFR抗體1之莫耳吸光係數使用εA,280=203460及εA,250=62692。抗EGFR抗體2之莫耳吸光係數使用εA,280=217440及εA,250=75731。εD,280及εD,250可藉由對將所使用之共軛物前驅物溶解為某一莫耳濃度而成之溶液之吸光度進行測定，並利用朗泊-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度=莫耳濃度×莫耳吸光係數×單元光程長度)而獲得。實施例中之共軛物前驅物之莫耳吸光係數係每次藉由UV測定而獲得。測定抗體藥物共軛物水溶液之A280及A250，將該等值代入式(I)及(II)中，求解聯立方程式，藉此可求出CA及CD。進而，藉由CD除以CA，可求出每一分子抗體之藥物平均結合數。
共通操作F：抗體藥物共軛物中之抗體濃度及每一分子抗體之藥物平均結合數之測定(逆相高效液相層析法：RP-HPLC)
抗體藥物共軛物中之抗體濃度及每一分子抗體之藥物平均結合數除了上文所述之共通操作E以外，可藉由使用以下方法之高效液相層析法分析求出。
[F-1.HPLC分析用樣品之製備(抗體藥物共軛物之還原)]
將抗體藥物共軛物溶液(約1mg/mL，60μL)與二硫代蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)加以混合。將混合物於37℃保溫30分鐘，將抗體藥物共軛物之L鏈及H鏈間之二硫鍵切斷。將該反應溶液直接用於HPLC分 析。
[F-2.HPLC分析]
代表性之分析條件如下所述。
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies)
檢測器：紫外線吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：Acquity BEH Phenyl(2.1×50mm，1.7μm，Waters製造)
管柱溫度：75℃
流速：0.8mL/min
樣品注入量：10μL
流動相A：0.1%三氟乙酸(TFA)，15%異丙醇水溶液
流動相B：0.075%TFA，15%異丙醇乙腈溶液
梯度程式(流動相B)：14%-36%(0分鐘-15分鐘)，36%-80%(15-17分鐘)，80%-14%(17分鐘-17.1分鐘)，14%-14%(17.1分鐘-23分鐘)
[F-3.資料解析]
[F-3-1]於SPAAC反應中之糖鏈共軛之情形時，相對於未結合藥物之抗體之L鏈(L0)及H鏈(H0)，結合有藥物之H鏈(結合有一個藥物之H鏈：H1，結合有兩個藥物之H鏈：H2)與所結合之藥物之數量成正比，疏水性增大，保持時間變大，因此原則上按照L0、H0、H1、H2之順序溶出。藉由將與L0及H0之保持時間進行比較，而可將檢測峰分配至L0、H0、H1、H2之任一者。於半胱胺酸共軛之情形時亦同樣，結合有藥物之L鏈(結合有一個藥物之L鏈：L1)與結合有藥物之H鏈(結合有一個藥物之H鏈：H1，結合有兩個藥物之H鏈：H2，結合有三個藥物之H鏈：H3)與所結合之藥物之數量成正比，疏水性增大，保持時間變大，因此原則上按照 L0、L1、H0、H1、H2、H3之順序溶出。藉由將與L0及H0之保持時間進行比較，而可將檢測峰分配至L0、L1、H0、H1、H2、H3之任一者。
[F-3-2]由於藥物連接子具有UV吸收，故而於SPAAC反應中之糖鏈共軛之情形時，根據藥物連接子之結合數，使用H鏈及藥物連接子之莫耳吸光係數，依照下式進行峰面積之修正。於藥物亦結合L鏈之半胱胺酸共軛之情形時，對於L鏈，亦同樣地進行峰面積之修正。
Figure 110108019-A0305-02-0117-2
此處，各抗體中之L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)使用利用共通操作E中所記載之已知之計算方法所算出之推定值。於抗TROP2抗體1及抗TROP2抗體2之情形時，使用27702作為L鏈之莫耳吸光係數，使用83998作為H鏈之莫耳吸光係數。於抗CD70抗體1之情形時，使用30222作為L鏈之莫耳吸光係數，使用82968作為H鏈之莫耳吸光係數。於抗CD70抗體2之情形時，使用30222作為L鏈之莫耳吸光係數，使用75978作為H鏈之莫耳吸光係數。於抗EGFR抗體1之情形時，使用23232作為L鏈之莫耳吸光係數，使用78498作為H鏈之莫耳吸光係數。於抗EGFR抗體2之情形時，使用30222作為L鏈之莫耳吸光係數，使用78498作為H鏈之莫耳吸光係數。關於藥物連接子之莫耳吸光係數(280nm)，於SPAAC反應中之糖鏈共軛之情形時，使用共軛前驅物之實測值，於半胱胺酸共軛之情形時，使用使共軛前驅物於巰基乙醇或N-乙醯半胱胺酸中進行反應而將順丁烯二醯亞胺基轉換為丁二醯亞胺硫醚而成之化合物之實測值。
[F-3-3]依照下式計算相對於峰面積修正值合計之各鏈峰面積比(%)。
Figure 110108019-A0305-02-0118-3
[F-3-4]依照下式計算抗體-藥物共軛物中之每一分子抗體之藥物平均結合數(DAR)。
Figure 110108019-A0305-02-0118-4
[F-3-5]依照下式計算抗體-藥物共軛物中之抗體濃度。
Figure 110108019-A0305-02-0118-5
此處，抗體藥物複合體之吸光度(280nm)使用抗體藥物共軛物水溶液之實測值。稀釋倍數表示於測定吸光度時將抗體藥物共軛物水溶液稀釋為多少倍，通常稀釋4倍。抗體之莫耳吸光係數(280nm)使用利用共通操作E中所記載之已知之計算方法所算出之推定值。藥物平均結合數使用[F-3-4]中所獲得之值。關於藥物連接子之莫耳吸光係數(280nm)，於SPAAC反應中之糖鏈共軛之情形時，使用共軛前驅物之實測值，於半胱胺酸共軛之情形時，使用使共軛前驅物於巰基乙醇或N-乙醯半胱胺酸中進行反應而將順丁烯二醯亞胺基轉換為丁二醯亞胺硫醚而成之化合物之實測值。
共通操作G：抗體藥物共軛物中之抗體濃度及每一分子抗體之藥物平均結合數之測定(疏水性互相作用-高效液相層析法：HI-HPLC)
抗體藥物共軛物中之抗體濃度及每一分子抗體之藥物平均結合數除了上文所述之共通操作E及F以外，可藉由使用以下方法之高效液相層析 法分析而求出。
[G-1.HPLC分析用樣品之製備]
將抗體藥物共軛物溶液(約1mg/mL，60μL)直接用於HPLC分析。
[G-2.HPLC分析]
代表性之分析條件如下述兩種。
HPLC系統：SHIMADZU CBM-20A(島津製作所)
檢測器：紫外線吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：TSK-gel Butyl-NPR(4.6×100mm，2.5μm，TOSOH製造)
管柱溫度：25℃附近之一定溫度
流動相A：含有1.5M硫酸銨之25mM磷酸緩衝液(pH值=7.0)
流動相B：25mM磷酸緩衝液(pH值=7.0)/異丙醇混合液(3：1)
流速：0.8mL/min
樣品注入量：15μL
梯度程式(流動相B)：10%-15%(0分鐘-5分鐘)，15%-65%(5分鐘-20分鐘)
或HPLC系統：SHIMADZU CBM-20A(島津製作所)
檢測器：紫外線吸光度計(測定波長：280nm)
管柱：PolyPROPYL A(4.6×100mm，3μm，1500Å，PolyLC製造)
管柱溫度：40℃附近之一定溫度
流動相A：含有1.5M硫酸銨之20mM磷酸緩衝液(pH值=7.4)
流動相B：20mM磷酸緩衝液(pH值=7.4)
流速：0.8mL/min
樣品注入量：15μL
梯度程式(流動相B)：40%-80%(0分鐘-20分鐘)
[G-3.資料解析]
[G-3-1]與結合於抗體之藥物之數量成正比，疏水性增大，保持時間變大，因此於SPAAC反應中之糖鏈共軛之情形時，原則上按照DAR=0、DAR=2、DAR=4之順序溶出。藉由將與DAR=0之保持時間進行比較，而可將檢測峰分配至DAR=2及DAR=4之任一者。亦存在依賴於抗體或藥物連接子之種類而檢測DAR=1及DAR=3之峰之情況。檢測峰之DAR亦存在利用HI-HPLC將該峰區分後，測定質譜進行推定之情況。
[G-3-2]由於藥物連接子具有UV吸收，故而根據藥物連接子之結合數，使用抗體及藥物連接子之莫耳吸光係數，依照下式進行峰面積值之修正。
Figure 110108019-A0305-02-0120-6
此處，抗體之莫耳吸光係數(280nm)使用利用共通操作E中所記載之已知之計算方法所算出之推定值。藥物連接子之莫耳吸光係數(280nm)使用共軛前驅物之實測值。
[G-3-3]依照下式計算相對於峰面積修正值合計之抗體峰面積比(%)。
Figure 110108019-A0305-02-0120-7
[G-3-4]依照下式計算抗體-藥物共軛物中之每一分子抗體之藥物平均結合數。
Figure 110108019-A0305-02-0121-8
[G-3-5]抗體-藥物共軛物中之抗體濃度係依照[F-3-5]所記載之式進行計算。此時，藥物平均結合數使用[G-3-4]中所獲得之值。
亦存在本發明之抗體藥物共軛物或其製造中間物存在立體異構物或源自不對稱碳原子之光學異構物、幾何異構物、互變異構物或d體、l體、旋轉對映異構物等光學異構物之情況，該等異構物、光學異構物及該等之混合物均包含於本發明中。
於本發明之抗體藥物共軛物中，藥物於1分子抗體之結合數係影響到其有效性、安全性之重要因子。抗體藥物共軛物之製造係以藥物之結合數成為一定數之方式，規定進行反應之原料、試劑之使用量等反應條件而實施，不同於低分子化合物之化學反應，通常以結合有不同數量之藥物之混合物之形式獲得。藥物於1分子抗體之結合數可以平均值、即平均藥物結合數(DAR)之形式特定出。環狀雙核苷酸衍生物於抗體分子之結合數可控制，作為每一抗體之藥物平均結合數，可結合1至10之範圍之環狀雙核苷酸衍生物，較佳為1至8個，更佳為1至5個。
於本發明之抗體藥物共軛物中，於抗體Ab自抗體Ab之經重塑之糖鏈鍵結於L之情形時，抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之藥物結合數m2為1或2之整數。於該糖鏈為N297糖鏈，糖鏈為N297-(Fuc)SG之情形時，m2為2，DAR為3~5之範圍(較佳為3.2~4.8之範圍，更佳為3.5~4.2之範圍)。於N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物之情形時，m2為1，DAR為1~3之範圍(較佳為1.0~2.5之範圍，更佳為1.2~2.2之範圍)。
再者，若為業者，則可根據本案之實施例之記載設計使抗體與所需數量之藥物結合之反應，而可獲得環狀雙核苷酸衍生物之結合數經控制之抗體。
再者，本發明之抗體藥物共軛物或其製造中間物存在因放置於大氣中、或再結晶而吸收水分，導致附有吸附水等而成為水合物之情形，此種含水之化合物及鹽亦包含於本發明中。
於本發明之抗體藥物共軛物或其製造中間物具有胺基等鹼性基之情形時，可根據所需製成醫藥上容許之鹽。作為此種鹽，例如可列舉：鹽酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳基磺酸鹽；甲酸、乙酸、蘋果酸、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；及鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽。
本發明之抗體藥物共軛物於其結構中包含磷酸基及/或硫代磷酸基，因此通常可形成鹼加成鹽。又，於其製造中間物具有羧基等酸性基之情形時，通常亦可形成鹼加成鹽。作為醫藥上容許之鹽，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；銨鹽等無機鹽；二苄胺鹽、
Figure 110108019-A0305-02-0122-159
啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、環己胺鹽、二環己胺鹽、N,N'-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌
Figure 110108019-A0305-02-0122-158
鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽等。
本發明之抗體藥物共軛物及其製造中間物亦存在因吸收空氣中之水分等而以水合物之形式存在之情況。作為本發明之溶劑合物，只 要為醫藥上可容許者，則無特別限定，具體而言，較佳為水合物、乙醇合物、2-丙醇合物等。又，於本發明之抗體藥物共軛物及其製造中間物中存在氮原子之情形時，亦可成為N-氧化物體，該等溶劑合物及N-氧化物體亦包含於本發明之範圍內。又，於本發明之抗體藥物共軛物及其製造中間物中存在硫原子之情形時，亦可成為亞碸體，該等溶劑合物及亞碸體亦包含於本發明之範圍內。
又，本發明亦包含經各種放射性或非放射性同位素標記之化合物。構成本發明之抗體藥物共軛物及其製造中間物之1個以上原子中亦可含有原子同位素之非天然比例。作為原子同位素，例如可列舉氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)等。又，本發明化合物例如可經如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)之放射性同位素進行放射性標記。經放射性標記之化合物作為治療或預防劑、研究試劑、例如分析試劑、及診斷劑、例如活體內圖像診斷劑而有用。本發明之抗體藥物共軛物之全部同位素變異種不論是否為放射性，均包含於本發明之範圍中。
<4.醫藥>
本發明之抗體藥物共軛物對癌細胞表現出抗腫瘤免疫活性或細胞殺傷活性，因此可作為醫藥、尤其是針對癌症之治療劑及/或預防劑、或抗腫瘤劑使用。
作為應用本發明之抗體藥物共軛物之癌症之種類，可列舉：肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌等)、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌(表面上皮性腫瘤、間質性腫瘤、生殖細胞腫瘤等)、胰臟癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、睾丸癌(精原細胞瘤、非精原細胞瘤)、子宮頸 癌、胎盤絨毛膜癌、腦瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、間皮瘤、胃腸道間質腫瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)、膽囊癌、膽管癌、腎上腺癌、咽癌、舌癌、聽覺器官癌、胸腺癌、小腸癌、鱗狀細胞癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤、肉瘤等，關於抗體藥物共軛物，只要為成為治療對象之癌細胞中表現抗體藥物共軛物中之抗體可識別之蛋白質之癌細胞，則不限定於該等。
本發明之抗體藥物共軛物可對哺乳動物適宜地投予，哺乳動物更佳為入類。
作為包含本發明之抗體藥物共軛物之醫藥組合物中所使用之物質，於投予量或投予濃度方面，可自該領域中通常使用之製劑添加物等中適當選擇而應用。
可將本發明之抗體藥物共軛物以含有1種以上藥學相容性之成分之醫藥組合物之形式投予。例如，上述醫藥組合物代表性地包含1種以上藥學載體(例如，經殺菌之液體(例如包括水及油(石油、動物、植物、或合成來源之油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等))))。於將上述醫藥組合物進行靜脈內投予之情形時，水為更具代表性之載體。食鹽水溶液、以及右旋糖水溶液及甘油水溶液亦可作為液體載體使用，尤其可用於注射用溶液。合適之藥學賦形劑於該領域中為公知。又，若為所需，上述組合物可包含微量之濕潤劑或乳化劑、或pH值緩衝劑。合適之藥學載體之例記載於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。其配方對應於投予之態樣。
各種傳遞系統為公知，可用於投予本發明之抗體藥物共軛物。作為導入方法，可列舉皮內、肌內、腹腔內、靜脈內、及皮下之路 徑，但不限定於該等。投予例如可藉由注入或推注注射進行。於特定之較佳之實施形態中，上述抗體藥物共軛物之投予可藉由注入進行。非經口投予為較佳之投予路徑。
於代表性實施形態中，包含上述抗體藥物共軛物之醫藥組合物係作為適合於對人靜脈內投予之醫藥組合物，依照習慣性順序配製。代表性而言，用於靜脈內投予之組合物係殺菌之等張性之水性緩衝液中之溶液。又，於必要情形時，上述醫藥可包含助溶劑及用以緩和注射部位之疼痛之局部麻醉劑(例如，里格卡因(Lignocaine))。通常上述成分例如以顯示活性劑之量之安瓿或藥囊等經密封而封口之容器中之冷凍乾燥粉末或無水之濃縮物之形式分開供給，或於單位劑形中一起混合供給。於預定藉由注入投予上述醫藥組合物之情形時，其可藉由例如含有殺菌之製藥級之水或食鹽水之注入瓶進行投藥。於藉由注射投予上述醫藥之情形時，注射用殺菌水或食鹽水之安瓿可以例如可於投予前混合上述成分之方式提供。上述醫藥組合物亦存在以溶液之形式提供之情形。
本發明之醫藥組合物可為僅含有本發明之抗體藥物共軛物之醫藥組合物，亦可為含有本發明之抗體藥物共軛物及其他癌治療劑之醫藥組合物。本發明之抗體藥物共軛物亦可與其他癌治療劑一起投予或組合投予，藉此可增強抗腫瘤效果。以此種目的使用之其他癌治療劑可與抗體藥物共軛物同時分開投予或連續以個體投予，亦可改變各自之投予間隔而投予。作為此種癌治療劑，可列舉：代謝拮抗劑、烷化劑、微管抑制劑等化學療法劑(凱素(abraxane)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、長春鹼 (vinblastine)或國際公開第WO2003/038043號說明書所記載之藥劑等)、激素調整劑(作為LH-RH類似物之亮丙瑞林(Leuprorelin)等、戈舍瑞林(Goserelin)、雌莫司汀、作為雌激素拮抗藥之他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)、激酶抑制劑、PARP(poly ADP ribose polymerase，聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶)抑制劑、骨破壞抑制劑、骨形成促進劑、轉移抑制劑、分子標的藥(抗EGFR抗體、抗VEGF抗體、抗VEGFR抗體等)、免疫檢查點抑制劑(作為抗PD-1抗體之納武單抗、帕博利珠單抗(pembrolizumab)等、作為抗PD-L1抗體之阿特珠單抗、阿維魯單抗、度伐魯單抗等、抗PD-L2抗體、作為抗CTLA4抗體之伊匹單抗等、抗A2aR抗體、A2a受體拮抗劑、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體等)、抗控制性T細胞藥(抗CTLA4抗體、抗CD25抗體、抗GITR抗體、抗GARP抗體、抗TIGIT抗體、抗CCR8抗體等)、免疫活化劑(抗4-1BB抗體、抗OX40抗體、抗CD40抗體、抗CD3抗體、抗CD28抗體、IL-2類似物、細胞激素、TLR促效劑等)、免疫調節劑(抗CD47抗體、抗SIRPα抗體、抑制性骨髓調整劑等)、具有ADCC(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity)活性、ADCP(Antibody Dependent Cellular Phagocytosis)活性或補體活性之抗體醫藥、BiTE(Bi-specific T-cell engagers，雙特異性T細胞銜接抗體)、Antibody-Drug-Conjugate(ADC，抗體藥物共軛物)(例如，含有德魯替康(Deruxtecan)、DM1、吡咯并苯二氮呯(Pyrrolobenzodiazepine)、MMAF(Monomethyl auristatin F，單甲基奧利斯他汀F)等之藥劑共軛物(抗HER2-ADC、抗TROP2-ADC、抗HER3-ADC等))、組合光動力療法之ADC等，進而可列舉：抗腫瘤疫苗、抗腫瘤 細胞治療(CAR-T(Chimeric antigen receptor T cells，嵌合抗原受體T細胞)、TCR-T(T cell receptor T cells，T細胞受體T細胞)、樹狀細胞、NK細胞(Natural killer cells，自然殺手細胞)等)、抗腫瘤細菌治療、抗腫瘤病毒治療等，只要為具有抗腫瘤活性之藥劑，則無限定。進而，本發明之抗體藥物共軛物亦可與本發明之其他抗體藥物共軛物一起投予，藉此可增強抗腫瘤效果。又，本發明之抗體藥物共軛物可藉由不僅與藥物，而且與帶來抗腫瘤效果之治療、例如放射線、重子束、外科手術、骨髓移植等之併用而增強抗腫瘤效果，只要為具有抗腫瘤效果之治療，則無限定。
此種醫藥組合物作為具有所選擇之組成與必要之純度之製劑，以冷凍乾燥製劑或液狀製劑之形式進行製劑化即可。於以冷凍乾燥製劑之形式進行製劑化時，可為含有該領域所使用之適當之製劑添加物之製劑。又，液劑方面亦同樣，可以含有該領域所使用之各種製劑添加物之液狀製劑之形式進行製劑化。
醫藥組合物之組成及濃度根據投予方法亦有變化，但本發明之醫藥組合物所含之抗體藥物共軛物就抗體藥物共軛物對抗原之親和性、即相對於抗原之解離常數(Kd值)之方面而言，親和性越高(Kd值越低)，越可以即便少量之投予量發揮出藥效。因此，於決定抗體藥物共軛物之投予量時，亦可基於抗體藥物共軛物與抗原之親和性之狀況設定投予量。於對人類投予本發明之抗體藥物共軛物時，例如將約0.001~100mg/kg以1次投予或以每1~180天1次之間隔投予複數次即可。
以下，藉由實施例對本發明進行說明，但本發明並不限定於該等。
實施例
於以下實施例中，室溫表示15℃至35℃。脫水乙腈使用由關東化學銷售之乙腈(脫水)-Super-或由和光純藥工業銷售之乙腈(超脫水)。吡啶使用由關東化學銷售之吡啶(脫水)-Super-。矽膠層析法係使用Biotage SNAP Ultra(Biotage製造)、Chromatorex Q-Pack SI(Fuji Silysia製造)或Purif-Pack-Ex SI(SHOKO SCIENCE製造)實施。DIOL矽膠管柱層析法係使用ChromatorexQ-pack DIOL(Fuji Silysia製造)實施。C18矽膠管柱層析法係使用Biotage SNAP Ultra C18(Biotage製造)實施。管柱層析法之溶出係於藉由薄層層析法(TLC)之觀察下進行。溶出溶劑所使用之0.1%三乙胺意指溶出溶劑總容量中含有0.1%之三乙胺。分取HPLC係使用SHIMADZU SPD-M10A HPLC系統(島津製作所)等實施。分取管柱使用Kinetex(5μm，C18，100Å，250×30.0mm，Phenomenex製造)或Kinetex(5μm，C18，100Å，250×21.2mm，Phenomenex製造)。
各種圖譜資料之測定使用以下機器。1H-NMR圖譜係使用JEOL ECS-400(400MHz)、Varian 400-MR(400MHz)或Varian Unity Inova 500(500MHz)進行測定。31P-NMR圖譜係使用JEOL ECS-400(160MHz)進行測定。質譜係使用Agilent 6130 Quadrupole LC/MS系統(Agilent Technologies)進行測定。LC/MS(Liquid chromatography/mass spectrometry，液相層析/質譜法)之測定係於以下條件下實施[管柱：Develosil Combi-RP，5μm，50×2.0mm(野村化學製造)，流動相：0.1%甲酸乙腈溶液/0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈溶液：2%-100%(0分鐘-5分或0分鐘-10分鐘)]。
實施例1：CDN6之合成
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-二羥基-7-[1-(2-羥基乙 基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-雙(巰基)-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-二酮
Figure 110108019-A0305-02-0129-147
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0129-148
Figure 110108019-A0305-02-0130-149
(步驟1)
7-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3,5-O-(二第三丁基次矽烷基)-β-D-呋喃核糖基}-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
於0℃向文獻已知(Tetrahedron 2007,63,9850-9861)之5-碘殺結核菌素(1.0g)之N,N-二甲基甲醯胺(10mL)溶液中緩慢滴加雙(三氟甲磺酸)二第三丁基矽烷酯(1.24mL)後，於相同溫度下攪拌30分鐘。於0℃添加咪唑(868mg)後，升溫至室溫並攪拌30分鐘。於室溫下添加第三丁基二甲基氯矽烷，於相同溫度下整夜攪拌。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反 應停止後，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(910mg)。
MS(ESI)m/z：647(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.25(1H,s),7.03(1H,s),6.10(1H,s),5.63(2H,brs),4.49-4.44(2H,m),4.26(1H,dd,J=9.7,4.8Hz),4.17(1H,m),4.00(1H,t,J=9.7Hz),1.09(9H,s),1.04(9H,s),0.91(9H,s),0.13(3H,s),0.11(3H,s).
(步驟2)
7-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3,5-O-(二第三丁基次矽烷基)-β-D-呋喃核糖基}-5-(3,3-二乙氧基丙-1-炔-1-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺
於上述步驟1中所獲得之化合物(910mg)之N,N-二甲基甲醯胺(3.0mL)-四氫呋喃(9.0mL)混合溶液中依序添加炔丙醛二甲基縮醛(1.01mL)、三乙胺(0.392mL)、四(三苯基膦)鈀(0)(163mg)、及碘化銅(I)(53.6mg)，於40℃攪拌18小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液與乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(878mg)。
MS(ESI)m/z：647(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.27(1H,s),7.17(1H,s),6.09(1H,s),5.56(2H,brs),5.50(1H,s),4.48(1H,dd,J=9.1,4.9Hz),4.42(1H,d,J=4.9Hz),4.25(1H,dd,J=9.4,4.6Hz),4.17(1H,m),4.00(1H,t,J= 9.7Hz),3.85-3.77(2H,m),3.66(2H,m),1.28(6H,t,J=7.3Hz),1.08(9H,s),1.04(9H,s),0.91(9H,s),0.13(3H,s),0.11(3H,s).
(步驟3)
2-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3,5-O-(二第三丁基次矽烷基)-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟2中所獲得之化合物(878mg)之乙醇(8.8mL)溶液中添加10%鈀碳(M)濕式(500mg)，於氫氣環境下在室溫下攪拌9小時。將觸媒過濾去除後，利用二氯甲烷洗淨，並將濾液進行減壓濃縮。於殘留物之乙酸(8.8mL)溶液中添加10%鈀碳(M)濕式(500mg)，於氫氣環境下在40℃攪拌2天。將觸媒過濾去除後，利用二氯甲烷洗淨，並將濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(603mg)。
MS(ESI)m/z：561(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.47(1H,brs),8.07(1H,s),6.70(1H,s),6.14(1H,s),4.47-4.43(2H,m),4.29(1H,dd,J=9.1,4.8Hz),4.15(1H,m),3.99(1H,t,J=9.7Hz),3.55(2H,m),2.89(2H,t,J=5.4Hz),2.04(2H,m),1.09(9H,s),1.04(9H,s),0.90(9H,s),0.10(3H,s),0.10(3H,s).
(步驟4)
6-苯甲醯基-2-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3,5-O-(二第三丁基次矽烷基)-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於室溫下向上述步驟3中所獲得之化合物(2.17g)之二氯甲烷(21.7mL)溶液中依序添加吡啶(1.56mL)、N,N-二甲胺基吡啶(94.5mg)、及苯甲醯氯(0.898mL)，於50℃攪拌15小時。於反應液中添加飽和 碳酸氫鈉水溶液使反應停止。利用二氯甲烷進行萃取後，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(1.91g)。
MS(ESI)m/z：665(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.08(1H,s),7.37-7.33(3H,m),7.23(2H,t,J=7.6Hz),6.97(1H,s),6.21(1H,s),4.50-4.46(2H,m),4.37-4.30(2H,m),4.28-4.09(2H,m),4.02(1H,t,J=10.0Hz),3.03(2H,t,J=6.3Hz),2.29-2.17(2H,m),1.10(9H,s),1.05(9H,s),0.90(9H,s),0.10(6H,s).
(步驟5)
6-苯甲醯基-2-{5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於0℃向上述步驟4中所獲得之化合物(1.91g)之二氯甲烷(15mL)溶液中添加所製備之氟化氫-吡啶(0.30mL)與吡啶(1.88mL)之混合液，於0℃攪拌2小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反應停止。利用二氯甲烷對反應液進行萃取後，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。將殘留物溶解於吡啶(15mL)中，添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.17g)，於0℃攪拌12小時。添加甲醇並攪拌30分鐘後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反應停止。利用二氯甲烷對反應液進行萃取後，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(1.98g)。
MS(ESI)m/z：827(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.07(1H,s),7.47(2H,m),7.37-7.19(13H,m),6.84(4H,m),6.37(1H,d,J=5.5Hz),4.75(1H,t,J=5.2Hz),4.38-4.20(4H,m),3.80(6H,s),3.53(1H,dd,J=10.7,2.8Hz),3.40(1H,dd,J=11.0,3.1Hz),2.83(1H,d,J=3.7Hz),2.78(2H,t,J=6.4Hz),2.17(2H,m),0.81(9H,s),-0.03(3H,s),-0.21(3H,s).
(步驟6)
6-苯甲醯基-2-(5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}-β-D-呋喃核糖基)-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟5中所獲得之化合物(1.98g)之二氯甲烷(23.9mL)溶液中添加N,N-二異丙基乙基胺(1.02mL)與2-氰乙基N,N-二異丙基氯亞磷醯胺(1.07mL)，於室溫下攪拌15小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反應停止。利用二氯甲烷對反應液進行萃取後，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物進行純化，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=7：3)之形式獲得標題化合物(2.06g)。
MS(ESI)m/z：1027(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.06(0.3H,s),8.04(0.7H,s),7.50-7.16(15H,m),6.85-6.79(4H,m),6.35(0.7H,d,J=6.7Hz),6.31(0.3H,d,J=6.1Hz),4.84(0.7H,dd,J=7.0,4.6Hz),4.78(0.3H,t,J=5.8Hz),4.43-4.17(4H,m),4.04-3.85(1.3H,m),3.80-3.76(6H,m),3.69-3.43(3H,m),3.50(0.7H,dd,J=10.6,3.3Hz),3.33-3.26(1H,m),2.87-2.76(2H,m),2.74- 2.60(1.4H,m),2.31(0.6H,t,J=6.7Hz),2.23-2.11(2H,m),1.21-1.13(7.8H,m),1.04(4.2H,d,J=6.7Hz),0.73(2.7H,s),0.72(6.3H,s),-0.03(0.9H,s),-0.06(2.1H,s),-0.24(3H,s).
(步驟7)
6-苯甲醯基-2-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3-O-[羥基(側氧基)-λ5-膦基]-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟6中所獲得之化合物(935mg)之乙腈(4.55mL)溶液中添加水(33μL)與三氟乙酸吡啶鹽(229mg)，於室溫下攪拌15分鐘。於反應液中添加第三丁基胺(4.55mL)，於室溫下攪拌15分鐘。對反應液進行減壓濃縮後，利用乙腈(5mL)將殘留物共沸2次。於殘留物之二氯甲烷(11.4mL)溶液中添加水(0.164mL)後，添加二氯乙酸(0.651mL)之二氯甲烷(11.4mL)溶液，於室溫下攪拌15分鐘。添加吡啶(1.25mL)使反應停止後，對反應液進行減壓濃縮。利用脫水乙腈(10mL)將殘留物共沸3次，最後1次保留5mL左右之乙腈。將所獲得之標題化合物之乙腈溶液直接於下述步驟12中使用。
(步驟8)
2',3',5'-三-O-乙醯基-1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)肌苷
於市售(Ark Pharm)之2',3',5'-三-O-乙醯基肌苷(10.0g)之四氫呋喃(100mL)懸浮液中添加2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙烷-1-醇(5.37g)與三苯基膦(7.69g)後，添加(E)-二氮烯-1,2-二羧酸酯(6.10mL)二丙烷-2-基酯，於室溫下攪拌6小時。對反應液進行減壓濃縮後，藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/二氯甲烷]將殘留物進行純化，而以與三苯基氧化 膦之混合物(10.6g)之形式獲得標題化合物。
MS(ESI)m/z：553(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.05(1H,s),7.92(1H,s),6.12(1H,d,J=5.4Hz),5.86(1H,t,J=5.4Hz),5.59(1H,dd,J=5.4,4.2Hz),4.47-4.41(2H,m),4.38-4.31(1H,m),4.22-4.17(2H,m),3.89(2H,t,J=4.8Hz),2.15(3H,s),2.14(3H,s),2.08(3H,s),0.83(9H,s),-0.06(3H,s),-0.06(3H,s).
(步驟9)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)肌苷
於上述步驟8中所獲得之化合物(10.6g)之四氫呋喃(30mL)-甲醇(30mL)混合溶液中添加碳酸鉀(150mg)，於室溫下攪拌3小時。於反應液中添加乙酸(125μL)進行減壓濃縮後，利用吡啶將殘留物進行共沸。於0℃向殘留物之吡啶(60mL)溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(6.50g)，攪拌30分鐘後，於冰箱中整夜保管。於反應液中添加甲醇(2mL)，攪拌30分鐘後，進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1%三乙胺]將殘留物進行純化，而以與三苯基氧化膦之混合物(7.21g)之形式獲得標題化合物。
MS(ESI)m/z：729(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.01(1H,s),7.97(1H,s),7.35-7.30(2H,m),7.25-7.17(7H,m),6.81-6.76(4H,m),5.95(1H,d,J=5.4Hz),5.13(1H,brs),4.68-4.61(1H,m),4.43-4.36(2H,m),4.31-4.23(1H,m),4.15-4.08(1H,m),3.89(2H,t,J=4.5Hz),3.77(6H,s),3.42(1H,dd,J=10.3, 3.6Hz),3.34(1H,dd,J=10.3,3.6Hz),3.10(1H,brs),0.83(9H,s),-0.06(3H,s),-0.07(3H,s).
(步驟10)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)肌苷
於上述步驟9中所獲得之化合物(7.21g)之二氯甲烷(36mL)溶液中添加咪唑(1.41g)與第三丁基(氯)二甲基矽烷(1.49g)，於室溫下攪拌16小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，利用二氯甲烷進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(2.17g)及作為標題化合物之位置異構物之5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)肌苷(2.55g)。
MS(ESI)m/z：843(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.99(1H,s),7.97(1H,s),7.43-7.39(2H,m),7.33-7.19(7H,m),6.83-6.77(4H,m),5.96(1H,d,J=4.2Hz),4.56-4.50(2H,m),4.33-4.25(1H,m),4.19-4.02(2H,m),3.89(2H,t,J=4.8Hz),3.78(6H,s),3.45(1H,dd,J=10.9,4.2Hz),3.27(1H,dd,J=10.9,4.2Hz),3.03(1H,d,J=6.0Hz),0.88(9H,s),0.82(9H,s),0.07(3H,s),-0.01(3H,s),-0.07(3H,s),-0.07(3H,s).
位置異構物(2'-O-TBS體)
MS(ESI)m/z：843(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.98(1H,s),7.94(1H,s),7.46-7.42(2H,m), 7.35-7.20(7H,m),6.85-6.79(4H,m),5.99(1H,d,J=5.4Hz),4.83(1H,t,J=5.1Hz),4.33-4.29(1H,m),4.27-4.24(1H,m),4.24-4.12(2H,m),3.90(2H,t,J=4.5Hz),3.79(3H,s),3.78(3H,s),3.48(1H,dd,J=10.3,3.0Hz),3.40(1H,dd,J=10.3,3.0Hz),2.71(1H,d,J=3.6Hz),0.86(9H,s),0.83(9H,s),0.01(3H,s),-0.07(3H,s),-0.07(3H,s),-0.11(3H,s).
(步驟11)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-2'-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}肌苷
於上述步驟10中所獲得之化合物(2.17g)之二氯甲烷(25.7mL)溶液中添加4,5-二氰基咪唑(334mg)與2-氰乙基N,N,N',N'-四異丙基亞磷醯二胺(0.980mL)，於室溫下攪拌16小時。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反應停止。利用二氯甲烷對反應液進行萃取後，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由DIOL矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物進行純化，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(2.65g)。
MS(ESI)m/z：1043(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.03(0.53H,s),8.01(0.47H,s),7.97(0.53H,s),7.93(0.47H,s),7.45-7.41(2H,m),7.35-7.19(7H,m),6.83-6.78(4H,m),6.17(0.53H,d,J=4.2Hz),6.05(0.47H,d,J=4.2Hz),4.87-4.80(0.47H,m),4.64-4.58(0.53H,m),4.46-4.40(1H,m),4.30-4.05(3H,m),3.92-3.87(2H,m),3.78(6H,s),3.86-3.40(5H,m),3.33-3.24(1H,m),2.54(0.94H,t,J=6.0Hz),2.43(1.06H,t,J=6.7Hz),1.16-1.09(9H, m),1.01-0.97(3H,m),0.83(4.23H,s),0.83(4.77H,s),0.82(9H,s),0.07(1.41H,s),0.04(1.59H,s),-0.02(3H,s),-0.07(1.41H,s),-0.08(1.59H,s),-0.08(3H,s).
(步驟12)
利用脫水乙腈(5mL)將上述步驟11中所獲得之化合物(950mg)共沸3次，最後1次保留3mL左右之乙腈，添加分子篩3A,1/16(顆粒狀者5粒)。將該乙腈溶液添加至上述步驟7中所製備之乙腈溶液，於氮氣環境下在室溫下攪拌20分鐘。於反應液中添加N,N-二甲基-N'-(3-硫酮-3H-1,2,4-二噻唑-5-基)甲醯亞胺醯胺(206mg)，於室溫下攪拌30分鐘後，對反應液進行減壓濃縮。於殘留物之二氯甲烷(13.0mL)溶液中添加水(0.164mL)後，添加二氯乙酸(0.822mL)之二氯甲烷(13.0mL)溶液，於室溫下攪拌15分鐘。於反應液中添加吡啶(9.01mL)使反應停止後，進行減壓濃縮。將所獲得之粗產物直接用於下一反應。
(步驟13)
3-({(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-苯甲醯基-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)-15,16-雙{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-[1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2-側氧基-2-巰基-10-硫酮八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-10-基}氧基)丙腈
將上述步驟12中所獲得之粗產物之吡啶(27.1mL)溶液濃縮至20mL左右後，添加2-氯-5,5-二甲基-1,3,2λ5-二氧磷雜環己烷-2-酮(622mg)，於室溫下攪拌30分鐘。於反應液中添加水(0.57mL)與3H-1,2-苯并 二硫醇-3-酮(230mg)，於室溫下攪拌15分鐘。將反應液注入碳酸氫鈉(3.60g)之水溶液(130mL)中，於室溫下攪拌30分鐘後，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，將乾燥劑過濾去除將濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/甲醇]將殘留物進行純化，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(494mg)。
MS(ESI)m/z：1274(M+H)+.
(步驟14)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-雙{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-[1-(2-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
於上述步驟13中所獲得之化合物(494mg)之甲醇(5mL)溶液中添加28%氨水(5mL)，於室溫下攪拌15小時。將反應液濃縮後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]將殘留物純化而獲得標題化合物之非鏡像異構物1(88.5mg：含有雜質)與非鏡像異構物2(70.7mg：含有雜質)。
非鏡像異構物1(低極性)
MS(ESI)m/z：1003(M-C6H15Si+2H)+.
非鏡像異構物2(高極性)
MS(ESI)m/z：1003(M-C6H15Si+2H)+.
(步驟15-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-二羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物1)
於上述步驟14中所獲得之化合物(非鏡像異構物1)(88.5mg：含有雜質)中添加三乙胺三氫氟酸鹽(2.0mL)，於45℃攪拌3小時。於室溫下向反應液中添加經冰浴冷卻之1M碳酸氫三乙銨水溶液(10mL)與三乙胺(2mL)之混合液。對反應液進行減壓濃縮後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]與分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：5%-30%(0分鐘-40分鐘)]進行純化。藉由以下方法將所獲得之化合物(三乙胺鹽)轉換為鈉鹽。
[向鈉鹽之轉換]
將BT AG(註冊商標)50W-X2樹脂(生物技術級(biotechnology grade)，100-200目，氫型(hydrogen form))(500mg)懸浮於純水中，填充於空管柱中。使過量之純水自然流下後，依序使1M氫氧化鈉水溶液(5mL)與純水(10mL)自然流下。將上述所獲得之化合物溶解於純水(5mL)並填充於管柱中。將自然流下之溶液分取後，進一步利用純水(10mL)進行溶出。合併含有目標物之組分並加以冷凍乾燥，而獲得標題化合物(25.7mg)。
MS(ESI)m/z：775(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.63(1H,s),8.22(1H,s),8.02(1H,s),7.11 (1H,s),6.30-6.24(2H,m),5.46-5.37(1H,m),5.23-5.15(1H,m),4.83-4.79(1H,m),4.78-4.74(1H,m),4.53-4.42(2H,m),4.35-4.16(3H,m),4.16-3.97(3H,m),3.83-3.78(2H,m),3.52-3.47(2H,m),2.88-2.81(2H,m),2.03-1.95(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：57.8(s),54.4(s).
(步驟15-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-15,16-二羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物2)
使用上述步驟14中所獲得之化合物(非鏡像異構物2)(70.7mg：含有雜質)，藉由與上述步驟15-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而以三乙胺鹽之形式獲得標題化合物。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈、乙腈：5%-25%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇、甲醇：15%-70%(0分鐘-40分鐘)]。
藉由與上述步驟15-1中所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法對所獲得之三乙胺鹽進行鹽交換，而獲得標題化合物(17.8mg)。
MS(ESI)m/z：775(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.72(1H,s),8.23(1H,s),8.02(1H,s),7.11(1H,s),6.30(2H,dd,J=13.6,7.6Hz),5.48-5.39(2H,m),4.78(1H,dd, J=6.7,4.2Hz),4.51-4.28(5H,m),4.26-4.13(2H,m),4.06-4.00(1H,m),3.93-3.86(1H,m),3.85-3.80(2H,m),3.52-3.47(2H,m),2.94-2.88(2H,m),2.05-1.97(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：62.9(s),60.0(s).
實施例2：CDN34之合成
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-雙(巰基)-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-二酮
Figure 110108019-A0305-02-0143-150
[合成流程]
[化96]
Figure 110108019-A0305-02-0144-151
(步驟1)
1-[2-(苯甲醯基氧基)乙基]-5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]肌苷
於0℃向市售(東京化成工業)之肌苷(10.0g)之吡啶(50mL)與N,N-二甲基乙醯胺(50mL)溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(15.2g)後，於4℃攪拌64小時。於反應液中添加甲醇(2mL)，攪拌10分鐘後濃縮至50mL左右。於殘留物中添加苯甲酸2-溴乙酯(7.02mL)與2,3,4,6,7,8,9,10-八氫嘧啶并[1,2-a]氮呯(13.9mL)，於室溫下攪拌1天。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液與水，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(15.2g)。
MS(ESI)m/z：719(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.00(1H,s),7.98(1H,s),7.98-7.94(2H,m),7.62-7.15(12H,m),6.80-6.75(4H,m),5.95(1H,d,J=5.4Hz),4.82-4.79(1H,m),4.72-4.64(3H,m),4.55-4.34(5H,m),3.77(6H,s),3.43(1H,dd,J=10.6,3.9Hz),3.34(1H,dd,J=10.6,3.6Hz).
(步驟2)
1-[2-(苯甲醯基氧基)乙基]-5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]肌苷
使用上述步驟1中所獲得之化合物(3.01g)，藉由與實施例1步驟10同樣之方法進行合成，而獲得標題化合物(1.20g)及作為標題化合物之位置異構物之1-[2-(苯甲醯基氧基)乙基]-5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]肌苷(1.22g)。
MS(ESI)m/z：833(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.03(1H,s),7.98-7.96(1H,m),7.96(1H,s),7.96-7.94(1H,m),7.59-7.52(1H,m),7.44-7.38(4H,m),7.32-7.15(7H,m),6.83-6.77(4H,m),5.94(1H,d,J=4.8Hz),4.69-4.63(2H,m),4.59-4.35(4H,m),4.16(1H,dd,J=3.8,1.9Hz),3.77(6H,d,J=1.8Hz),3.47(1H,dd,J=10.9,3.0Hz),3.27(1H,dd,J=10.9,4.2Hz),3.00(1H,d,J=6.7Hz),0.87(9H,s),0.06(3H,s),-0.01(3H,s).
(2'-O-TBS體)
MS(ESI)m/z：833(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.01(1H,s),7.97-7.93(2H,m),7.91(1H,s),7.59-7.53(1H,m),7.45-7.38(4H,m),7.35-7.17(7H,m),6.83-6.77(4H,m),5.97(1H,d,J=6.0Hz),4.84(1H,t,J=5.4Hz),4.71-4.60(2H,m),4.52-4.37(2H,m),4.33-4.28(1H,m),4.28-4.24(1H,m),3.78(3H,s),3.77(3H,s),3.47(1H,dd,J=10.9,3.0Hz),3.38(1H,dd,J=10.9,3.6Hz),2.71(1H,d,J=3.0Hz),0.80(9H,s),-0.03(3H,s),-0.19(3H,s).
(步驟3)
1-[2-(苯甲醯基氧基)乙基]-5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-2'-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}肌苷
使用上述步驟2中所獲得之化合物(1.20g)，藉由與實施例1步驟11同樣之方法進行合成，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=0.55：0.45)之形式獲得標題化合物(1.41g)。
MS(ESI)m/z：1033(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.05(0.45H,s),8.04(0.55H,s),7.99-7.95(2H, m),7.95(0.55H,s),7.92(0.45H,s),7.59-7.53(1H,m),7.45-7.39(4H,m),7.35-7.10(7H,m),6.83-6.78(4H,m),6.15(0.55H,d,J=5.4Hz),6.08(0.45H,d,J=6.0Hz),4.86-4.49(3H,m),4.49-4.35(3H,m),4.25-4.10(1H,m),3.78(6H,s),3.72-3.41(5H,m),3.35-3.25(1H,m),2.47(1H,t,J=6.7Hz),2.32(1H,t,J=6.3Hz),1.33-1.24(6H,m),1.13-1.03(6H,m),0.84(4.05H,s),0.84(4.95H,s),0.08(1.35H,s),0.05(1.65H,s),0.00(1.35H,s),-0.01(1.65H,s).
(步驟4)
6-苯甲醯基-2-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於冰浴冷卻下歷經5分鐘向實施例1步驟4中所獲得之化合物(35.80g)之二氯甲烷(322mL)-吡啶(35mL)混合溶液中添加氟化氫-吡啶(6.33g)之二氯甲烷(36mL)溶液，於相同溫度下攪拌3小時。於反應液中依序添加飽和碳酸氫鈉水溶液(268mL)與飽和鹽水(143mL)使反應停止，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。於殘留物中添加己烷/乙酸乙酯(1：1)(108mL)製成漿料狀後，於50℃攪拌30分鐘，追加己烷(161mL)進一步攪拌2小時。濾取所析出之固體，利用己烷/乙酸乙酯(4：1)(143mL)將其洗淨，而獲得標題化合物(26.81g)。
MS(ESI)m/z：525(M+H)+.
1H-NMR(DMSO-d6)δ：7.98(1H,s),7.65(1H,s),7.39(1H,m),7.26-7.20(4H,m),6.19(1H,d,J=6.5Hz),5.15(1H,t,J=5.6Hz),5.00(1H,d,J=4.8Hz),4.48(1H,t,J=5.6Hz),4.27(1H,m),4.11-4.02(2H,m), 3.97(1H,m),3.67-3.57(2H,m),2.99(2H,m),2.23-2.07(2H,m),0.68(9H,s),-0.11(3H,s),-0.26(3H,s).
(步驟5)
6-苯甲醯基-2-{2-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0148-171
烷-2-基)-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於冰浴冷卻下向上述步驟4中所獲得之化合物(19.93g)與3,4-二氫-2H-哌喃(35mL)之N,N-二甲基甲醯胺(200mL)溶液中添加對甲苯磺酸一水合物(7.25g)，於室溫下攪拌3小時。於冰浴冷卻下於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液使反應停止，利用乙酸乙酯進行萃取。利用水與飽和鹽水依序將有機層洗淨，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(24.73g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.10-8.07(1H,m),7.59-7.35(1H,m),7.35-7.27(3H,m),7.25-7.17(2H,m),6.44-6.36(1H,m),4.90-3.36(13H,m),3.06-2.96(2H,m),2.31-2.15(2H,m),2.01-1.43(12H,m),0.84-0.73(9H,m),0.04-(-0.35)(6H,m).
(步驟6)
6-苯甲醯基-2-[3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0148-172
烷-2-基)-β-D-呋喃核糖基]-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於冰浴冷卻下向上述步驟5中所獲得之化合物(24.73g)與乙酸(3.1mL)之四氫呋喃(250mL)溶液中添加氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(約1M，55mL)，於室溫下整夜攪拌。對反應液進行減壓濃縮，於殘留物中添加乙酸乙酯，利用水與飽和鹽水依序洗淨。利用無水硫酸鈉將有 機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(18.74g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.12-8.09(1H,m),7.49-7.30(4H,m),7.28-7.20(2H,m),6.41-6.30(1H,m),4.83-4.18(7H,m),4.12-3.50(7H,m),3.06-2.97(2H,m),2.31-2.17(2H,m),1.96-1.47(12H,m).
(步驟7)
6-苯甲醯基-2-[3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0149-173
烷-2-基)-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於冰浴冷卻下向上述步驟6中所獲得之化合物(18.74g)與吡啶(13.1mL)之二氯甲烷(300mL)溶液中滴加三氟甲磺酸酐(11mL)，並攪拌10分鐘。於反應液中添加飽和鹽水使反應停止，利用二氯甲烷進行萃取，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。將殘留物溶解於四氫呋喃(300mL)中，於冰浴冷卻下滴加亞硝酸四丁酯銨(28.34g)之四氫呋喃(150mL)溶液，於室溫下整夜攪拌。對反應液進行減壓濃縮，於殘留物中添加乙酸乙酯，利用水與飽和鹽水依序洗淨。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(10.46g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.13-8.06(1H,m),7.63-7.30(4H,m),7.29-7.18(2H,m),6.79-6.55(1H,m),4.93-3.45(14H,m),3.11-2.95(2H,m),2.32-2.14(2H,m),1.98-1.44(12H,m).
(步驟8)
6-苯甲醯基-2-[2-去氧-2-氟-3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0149-174
烷-2-基)-β-D-呋喃核糖基]- 6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於冰浴冷卻下向上述步驟7中所獲得之化合物(10.46g)與吡啶(7.3mL)之二氯甲烷(200mL)溶液中滴加三氟甲磺酸酐(6.1mL)，並攪拌10分鐘。於反應液中添加飽和鹽水使反應停止，利用二氯甲烷進行萃取，利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。將殘留物溶解於四氫呋喃(200mL)中，於冰浴冷卻下添加氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(約1M，150mL)，於相同溫度下攪拌3小時。於反應液中添加飽和氯化銨水溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層，並利用無水硫酸鈉加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(7.65g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.13-8.08(1H,m),7.53-7.31(4H,m),7.26-7.22(2H,m),6.68-6.53(1H,m),5.42-5.08(1H,m),4.93-4.18(6H,m),4.10-3.76(3H,m),3.71-3.47(3H,m),3.06-2.96(2H,m),2.29-2.18(2H,m),1.96-1.47(12H,m).
(步驟9)
6-苯甲醯基-2-(2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基)-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟8中所獲得之化合物(7.65g)之乙醇(150mL)溶液中添加對甲苯磺酸吡啶鎓(6.62g)，於50℃攪拌3小時。對反應液進行減壓濃縮，於殘留物中添加乙酸乙酯，利用飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和鹽水依序洗淨。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標 題化合物(3.55g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.05(1H,s),7.41-7.35(3H,m),7.30-7.24(2H,m),7.06(1H,s),6.07-6.00(2H,m),5.85(1H,ddd,J=52.8,6.7,4.7Hz),4.66(1H,d,J=3.9Hz),4.42-4.31(2H,m),4.20(1H,m),3.93(1H,dd,J=12.9,1.6Hz),3.74(1H,td,J=12.3,1.6Hz),3.12-2.96(2H,m),2.51(1H,s),2.33-2.15(2H,m).
(步驟10)
6-苯甲醯基-2-{5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟9中所獲得之化合物(3.55g)之脫水吡啶(50mL)溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.43g)，於氮氣環境下在室溫下攪拌2小時。於反應液中添加甲醇(1mL)並攪拌10分鐘左右後，進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(5.77g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.09(1H,s),7.45-7.41(2H,m),7.36-7.17(13H,m),6.85-6.79(4H,m),6.53(1H,dd,J=17.2,2.3Hz),5.40(1H,ddd,J=53.2,4.8,2.3Hz),4.83-4.72(1H,m),4.32-4.21(2H,m),4.19-4.14(1H,m),3.79(3H,s),3.79(3H,s),3.59(1H,dd,J=11.0,2.7Hz),3.45(1H,dd,J=11.0,3.5Hz),2.79(2H,t,J=6.3Hz),2.45(1H,s),2.24-2.11(2H,m).
(步驟11)
6-苯甲醯基-2-(5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}-2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基)-6,7,8,9-四 氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁
使用上述步驟10中所獲得之化合物(5.77g)，藉由與實施例1步驟6同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=1：1)之形式獲得標題化合物(5.95g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.10(0.5H,s),8.09(0.5H,s),7.45-7.12(15H,m),6.84-6.75(4H,m),6.57-6.46(1H,m),5.61-5.33(1H,m),5.07-4.83(1H,m),4.34-4.18(3H,m),3.93-3.72(7H,m),3.69-3.49(4H,m),3.38-3.27(1H,m),2.87-2.68(2H,m),2.61(1H,td,J=6.3,1.6Hz),2.40(1H,td,J=6.4,2.1Hz),2.21-2.12(2H,m),1.21-1.13(9H,m),1.03(3H,d,J=6.7Hz).
(步驟12)
使用上述步驟11中所獲得之化合物(1.02g)，藉由與實施例1步驟7同樣之方法進行反應，而獲得6-苯甲醯基-2-{2-去氧-2-氟-3-O-[羥基(側氧基)-λ5-膦基]-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁之乙腈溶液。使用所獲得之乙腈溶液與上述步驟3中所獲得之化合物(1.15g)，藉由與實施例1步驟12同樣之方法進行反應，將所獲得之粗產物直接用於下一反應。
(步驟13)
苯甲酸2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-苯甲醯基-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-10-(2-氰基乙氧基)-15-氟-2-側氧基-2-巰基-10-硫酮八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙酯
使用上述步驟12中所獲得之粗產物，藉由與實施例1步驟13同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(818mg：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：1152(M+H)+.
(步驟14)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-15-氟-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
使用上述步驟13中所獲得之化合物(818mg)，利用與實施例1步驟14同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物之非鏡像異構物1(107mg：含有雜質)及非鏡像異構物2(101mg：含有雜質)。
非鏡像異構物1(低極性)
MS(ESI)m/z：891(M+H)+.
非鏡像異構物2(高極性)
MS(ESI)m/z：891(M+H)+.
(步驟15-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物1)
使用上述步驟14中所獲得之化合物(非鏡像異構物1)(107mg：含有雜質)，藉由與實施例1步驟15-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而以三乙胺鹽之形式獲得標題化合物。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：5%-30%(0分鐘-30分鐘)]。
藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法對所獲得之三乙胺鹽進行鹽交換，而獲得標題化合物(29.1mg)。
MS(ESI)m/z：777(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.58(1H,m),8.11(1H,m),8.03(1H,s),7.11(1H,s),6.47(1H,d,J=17.5Hz),6.26(1H,d,J=8.5Hz),5.53-5.36(2H,m),5.29-5.17(1H,m),4.77(1H,d,J=4.2Hz),4.54-4.46(1H,m),4.44-4.38(1H,m),4.35-4.32(1H,m),4.30-4.25(2H,m),4.25-4.16(1H,m),4.06-3.99(1H,m),3.96-3.85(1H,m),3.82-3.71(2H,m),3.54-3.42(2H,m),2.77-2.68(1H,m),2.66-2.55(1H,m),2.02-1.81(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：57.5(s),53.0(s).
(步驟15-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物2)
使用上述步驟14中所獲得之化合物(非鏡像異構物2)(101 mg：含有雜質)，藉由與實施例1步驟15-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而以三乙胺鹽之形式獲得標題化合物。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：5%-20%(0分鐘-30分鐘)]。
藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法對所獲得之三乙胺鹽進行鹽交換，而獲得標題化合物(11.2mg)。
MS(ESI)m/z：777(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.61(1H,m),8.16(1H,m),8.02(1H,m),7.36(1H,s),6.49(1H,dd,J=16.0,2.1Hz),6.28(1H,d,J=8.5Hz),5.56-5.33(3H,m),4.58-4.49(2H,m),4.45-4.37(2H,m),4.31-4.27(1H,m),4.25-4.16(1H,m),4.10-3.98(3H,m),3.80(2H,t,J=5.1Hz),3.48(2H,dd,J=6.7,3.6Hz),2.90-2.72(2H,m),2.00-1.90(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：59.5(s),57.7(s).
實施例3：CDN49之合成
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-胺基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-雙(巰基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-二酮
[化97]
Figure 110108019-A0305-02-0156-152
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0156-153
Figure 110108019-A0305-02-0157-154
(步驟1)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-1-[2-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]肌苷
於市售(Aamdis Chemical)之5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]肌苷 (13.0g)之N,N-二甲基乙醯胺(60mL)懸浮液中添加N-(2-溴乙基)鄰苯二甲醯亞胺(7.02g)與1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(4.1mL)，於室溫下整夜攪拌。追加N-(2-溴乙基)鄰苯二甲醯亞胺(1.75g)與1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(1.1mL)，進一步攪拌1天。於反應液中添加水使反應停止，利用二氯甲烷進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[乙酸乙酯/甲醇]將殘留物純化而獲得標題化合物(12.4g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.83(1H,s),7.76-7.67(4H,m),7.64(1H,s),7.35-7.33(2H,m),7.25-7.11(7H,m),6.74-6.70(4H,m),5.93(1H,d,J=5.1Hz),5.68(1H,d,J=3.9Hz),4.71(1H,q,J=4.8Hz),4.43(1H,m),4.37-4.18(3H,m),4.10-4.06(2H,m),3.730(3H,s),3.728(3H,s),3.51(1H,m),3.36(1H,dd,J=10.6,3.9Hz),3.32(1H,dd,J=11.0,5.5Hz).
(步驟2)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-[2-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]肌苷
使用上述步驟1中所獲得之化合物(12.4g)，藉由與實施例1步驟10同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物(4.18g)與作為標題化合物之位置異構物之5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-[2-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]肌苷(6.31g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.00(1H,s),7.82-7.77(2H,m),7.74(1H,s),7.72-7.67(2H,m),7.41-7.39(2H,m),7.32-7.19(7H,m),6.83-6.78(4H,m),5.90(1H,d,J=5.1Hz),4.53-4.41(3H,m),4.32-4.25(1H,m),4.19-4.11(3H,m),3.79(3H,s),3.78(3H,s),3.46(1H,dd,J=10.6,3.1Hz), 3.24(1H,dd,J=10.8,4.1Hz),2.98(1H,d,J=6.7Hz),0.85(9H,s),0.04(3H,s),-0.03(3H,s).
位置異構物(2'-O-TBS體)
1H-NMR(CDCl3)δ：7.97(1H,s),7.82-7.78(2H,m),7.73-7.69(2H,m),7.66(1H,s),7.44-7.41(2H,m),7.33-7.18(7H,m),6.81(4H,d,J=7.8Hz),5.91(1H,d,J=5.9Hz),4.82(1H,t,J=5.5Hz),4.43(1H,m),4.34-4.23(3H,m),4.18-4.08(2H,m),3.79(6H,s),3.46(1H,dd,J=10.6,2.7Hz),3.36(1H,dd,J=10.6,3.5Hz),2.70(1H,d,J=3.1Hz),0.83(9H,s),-0.04(3H,s),-0.19(3H,s).
(步驟3)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-2'-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}-1-[2-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]肌苷
使用上述步驟2中所獲得之化合物(8.89g)，藉由與實施例1步驟6同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=1：1)之形式獲得標題化合物(9.45g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.01(0.5H,s),8.00(0.5H,s),7.82-7.77(2H,m),7.74(0.5H,s),7.72-7.67(2.5H,m),7.42(2H,d,J=7.8Hz),7.33-7.18(7H,m),6.81(4H,d,J=8.6Hz),6.10(0.5H,d,J=5.5Hz),6.04(0.5H,d,J=5.1Hz),4.75(0.5H,m),4.60(0.5H,m),4.49-4.41(1H,m),4.38-4.23(2H,m),4.22-4.05(3H,m),3.79(6H,s),3.78-3.65(1H,m),3.62-3.39(4H,m),3.33-3.23(1H,m),2.49(1H,t,J=6.3Hz),2.34(1H,t,J=6.7Hz),1.12-1.08(9H,m),0.91(3H,d,J=7.0Hz),0.82(9H,s),0.06 (1.5H,s),0.03(1.5H,s),-0.03(3H,s).
(步驟4)
4-氯-5-碘-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
於冰浴冷卻下向市售(PharmaBlock)之4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(73.8g)之N,N-二甲基甲醯胺(10mL)溶液中添加氫化鈉(含有礦物油45%)(13.3g)，升溫至室溫並攪拌40分鐘。再次進行冰浴冷卻，歷經10分鐘添加[2-(氯甲氧基)乙基](三甲基)矽烷(51.0mL)後，於相同溫度下攪拌30分鐘。於大部分固化之反應液中逐量添加水(260mL)使反應停止。濾取固體，利用水(1500mL)與己烷(600mL)將其洗淨後，於減壓下在40℃加以乾燥，而獲得標題化合物(97.63g)。
MS(ESI)m/z：410(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.64(1H,s),7.54(1H,s),5.61(2H,s),3.52(2H,t,J=8.3Hz),0.92(2H,t,J=8.3Hz),-0.04(9H,s).
(步驟5)
4-(苄氧基)-5-碘-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
於冰浴冷卻下向苄醇(27mL)之N,N-二甲基甲醯胺(170mL)溶液中添加氫化鈉(含有礦物油45%)(12g)，升溫至室溫並攪拌40分鐘。再次進行冰浴冷卻，歷經40分鐘添加上述步驟4中所獲得之化合物(97.63g)之N,N-二甲基甲醯胺(360mL)懸浮液，於相同溫度下攪拌35分鐘。於反應液中添加冰碎片與飽和氯化銨水溶液使反應停止。將反應液注入飽和氯化銨水溶液與乙酸乙酯之兩層中，利用乙酸乙酯：甲苯(9：1)進行萃取。利用水與 飽和鹽水分別將有機層洗淨2次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(107.7g)。
MS(ESI)m/z：482(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.47(1H,s),7.61(2H,d,J=7.3Hz),7.41(2H,t,J=7.6Hz),7.36-7.30(1H,m),7.30(1H,s),5.65(2H,s),5.57(2H,s),3.52(2H,t,J=8.3Hz),0.91(2H,t,J=8.3Hz),-0.05(9H,s).
(步驟6)
4-(苄氧基)-5-(3,3-二乙氧基丙-1-炔-1-基)-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶
於氮氣環境下在室溫下向上述步驟5中所獲得之化合物(113.4g)之乙腈(1000mL)-三乙胺(98mL)混合溶液中添加碘化銅(4.49g)、四(三苯基膦)鈀(0)(8.17g)、及3,3-二乙氧基丙-1-炔(104mL)，於相同溫度下攪拌4.5小時。對反應液進行減壓濃縮後，於殘留物中添加乙酸乙酯與己烷，將所析出之固體過濾去除。利用乙酸乙酯：己烷(1：1)之混合液將固體洗淨後，將濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(145.5g：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：482(M+H)+.
(步驟7)
5-(3,3-二乙氧基丙基)-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-醇
於上述步驟6中所獲得之化合物(145.5g)之乙醇(900mL)溶液中添加10%鈀碳觸媒(M)濕式(50.2g)，於氫氣環境下在室溫下攪拌5小時。於反 應液中添加二氯甲烷(500mL)，利用矽藻土將觸媒過濾去除，將濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化2次，而獲得標題化合物(59.6g)。
MS(ESI)m/z：418(M+Na)+，394[M-H]-.
1H-NMR(CDCl3)δ：11.23(1H,brs),7.85(1H,s),6.79(1H,s),5.47(2H,s),4.58(1H,t,J=5.9Hz),3.69(2H,m),3.57-3.49(4H,m),2.90(2H,t,J=7.8Hz),2.07(2H,m),1.23(6H,t,J=7.1Hz),0.91(2H,t,J=8.1Hz),-0.04(9H,s).
(步驟8)
5-(3,3-二乙氧基丙基)-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-硫醇
於氮氣環境下向上述步驟7中所獲得之化合物(59.6g)之脫水二氯甲烷(300mL)溶液中添加2,6-二甲基吡啶(42mL)。於-20℃歷經20分鐘滴加三氟甲磺酸酐(31mL)，於相同溫度下攪拌20分鐘。於冰浴冷卻下添加N,N-二甲基甲醯胺(500mL)及一硫氫化鈉n水合物(33.5g)，升溫至室溫後，攪拌2.5小時。對反應液進行減壓濃縮，將低沸點成分蒸餾去除。將殘留物注入乙酸乙酯與經冰浴冷卻之飽和氯化銨水溶液之兩層中，利用乙酸乙酯：甲苯(9：1)之混合液進行萃取。對於有機層，利用飽和氯化銨水溶液洗淨1次、飽和鹽水洗淨2次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物與2,6-二甲基吡啶之混合物。將所獲得之混合物注入乙酸乙酯與1當量濃度鹽酸之兩層中，利用乙酸乙酯萃取2次。利用飽和鹽水將有機層洗淨3次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。將乾燥劑過 濾去除，將濾液進行減壓濃縮，而獲得標題化合物(57.6g)。
MS(ESI)m/z：410[M-H]-.
1H-NMR(CDCl3)δ：11.69(1H,brs),7.90(1H,s),6.96(1H,s),5.49(2H,s),4.61(1H,t,J=5.9Hz),3.71(2H,m),3.55(2H,m),3.49(2H,t,J=8.1Hz),3.14(2H,t,J=7.8Hz),2.08(2H,m),1.23(6H,t,J=7.1Hz),0.90(2H,t,J=8.3Hz),-0.04(9H,s).
(步驟9)
3-(4-巰基-7-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)丙烷-1-醇
將上述步驟8中所獲得之化合物(31.62g)溶解於80%乙酸水溶液(300mL)中，於室溫下攪拌30分鐘。確認原料消失後進行冰浴冷卻，多加注意地逐量添加硼氫化鈉(1.45g)，於相同溫度下攪拌30分鐘。繼而，歷經15分鐘添加三乙醯氧基硼氫化鈉(24.4g)，於相同溫度下攪拌1.5小時。將反應液減壓濃縮至五分之一左右之量。於殘留物中多加注意地添加碳酸氫鈉(固體)而一定程度地中和後，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉與飽和鹽水依序將有機層洗淨，並利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(17.93g)。
MS(ESI)m/z：340[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：11.92(1H,brs),7.95(1H,s),7.01(1H,s),5.51(2H,s),3.70(2H,t,J=5.9Hz),3.50(2H,t,J=8.1Hz),3.23(2H,t,J=7.3Hz),2.33(1H,brs),1.99(2H,m),0.91(2H,t,J=8.3Hz),-0.04(9H,s).
(步驟10)
2-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲基}-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於氮氣環境下在0℃向上述步驟9中所獲得之化合物(31.31g)之脫水四氫呋喃(600mL)溶液中添加三苯基膦(25.4g)及偶氮二羧酸二異丙酯(21.8g)，於相同溫度下攪拌1小時。對反應液進行減壓濃縮後，依序藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/乙酸乙酯]及矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(35.93g：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：322[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.57(1H,s),7.08(1H,s),5.58(2H,s),3.52(2H,t,J=8.3Hz),3.17(2H,m),3.06(2H,t,J=5.6Hz),2.36(2H,m),0.92(2H,t,J=8.3Hz),-0.05(9H,s).
(步驟11)
(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)甲醇
於室溫下向上述步驟10中所獲得之化合物(35.93g)之二氯甲烷(150mL)溶液中添加三氟乙酸(150mL)，於相同溫度下攪拌1.5小時。對反應液進行減壓濃縮後，利用甲苯共沸4次。於殘留物中添加二氯甲烷：己烷(1：2)之混合液，濾取所析出之固體(固體1)。將濾液進行減壓濃縮後，藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇]將殘留物進行純化，而獲得固體2。將固體1與固體2合併，而獲得標題化合物(20.13g)。
MS(ESI)m/z：222[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.60(1H,s),7.19(1H,s),5.71(2H,s),3.21(2H,m),3.07(2H,m),2.38(2H,m).(僅記載可觀測之峰)
(步驟12)
2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟11中所獲得之化合物(20.13g)之甲醇(250mL)懸浮液中添加28%氨水溶液(150mL)，於室溫下攪拌1.5小時。於減壓下將反應液濃縮至一半左右之量。濾取所析出之固體，利用乙醇將其洗淨，而獲得固體1。將濾液進行減壓濃縮，藉由同樣之操作獲得固體2。將濾液塗於矽膠後，藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇]進行純化。將含有目標物之溶出分進行減壓濃縮，利用乙醇進行漿料洗淨後，濾取固體(固體3)。將固體1、固體2、及固體3合併，而獲得標題化合物(12.36g)。
MS(ESI)m/z：192[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：10.53(1H,brs),8.57(1H,s),7.10(1H,s),3.18(2H,m),3.08(2H,t,J=5.6Hz),2.37(2H,m).
(步驟13)
2-(2,3,5-三-O-苄基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於氮氣環境下向上述步驟12中所獲得之化合物(13.47g)之脫水乙腈(350mL)懸浮液中添加粉末狀之氫氧化鉀(10.3g)及三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(1.13mL)，於室溫下攪拌1.5小時。於冰浴冷卻下逐量添加文獻已知(J.Med.Chem.1976,19,6,814-816)之2,3,5-三-O-苄基-α-D-阿拉伯呋喃糖基氯化物(40.2g)之乙腈(100mL)溶液後，升溫至室溫，並攪拌4小時。將不溶物過濾去除，利用乙腈進行洗淨。將濾液進行減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化2次，而獲得標題化合物(26.19g)。
MS(ESI)m/z：594[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.51(1H,s),7.37-7.17(14H,m),6.86(2H,m),6.82(1H,d,J=4.9Hz),4.68(1H,d,J=11.7Hz),4.59(1H,d,J=11.7Hz),4.54(1H,d,J=13.2Hz),4.52(1H,d,J=11.7Hz),4.36-4.33(2H,m),4.22(1H,d,J=11.7Hz),4.14-4.08(2H,m),3.77(1H,dd,J=10.7,3.9Hz),3.72(1H,dd,J=10.5,4.1Hz),3.13(2H,m),2.81(2H,m),2.27(2H,m).
(步驟14)
2-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於氮氣環境下在-78℃向上述步驟13中所獲得之化合物(26.19g)之脫水二氯甲烷(300mL)溶液中添加三氯化硼之二氯甲烷溶液(1M，200mL)，於相同溫度下攪拌2小時後，升溫至0℃，進一步攪拌4小時。將反應液再次冷卻至-78℃，添加甲醇(80mL)之二氯甲烷(160mL)溶液，一面升溫至室溫一面攪拌30分鐘。對反應液進行減壓濃縮，利用乙醇共沸2次。於殘留物中添加乙醇(200mL)與二乙醚(100mL)製成漿料狀，並濾取固體(固體1)。將濾液進行減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇]將殘留物進行純化。將含有目標物之溶出分進行減壓濃縮後，添加乙醇製成漿料狀，濾取固體(固體2)。將固體1與固體2合併，而獲得標題化合物(13.2g)。
MS(ESI)m/z：324[M+H]+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.73(1H,s),7.96(1H,s),6.70(1H,d,J=4.9Hz),4.32(1H,t,J=4.6Hz),4.25(1H,t,J=4.6Hz),3.97(1H,m),3.90(1H,dd,J=12.0,3.2Hz),3.85(1H,dd,J=12.0,4.6Hz),3.53(2H,m), 3.17(2H,m),2.43(2H,m).
(步驟15)
2-[3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0167-175
烷-2-基)-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於0℃向上述步驟14中所獲得之化合物(15.35g)之脫水二甲基亞碸(160mL)溶液中添加3,4-二氫-2H-哌喃(17.2mL)及對甲苯磺酸一水合物(9.02g)，於室溫下攪拌3小時。追加3,4-二氫-2H-哌喃(8.6mL)，並攪拌45分鐘後，立即添加三乙胺(13mL)使反應停止。將反應液注入乙酸乙酯與飽和碳酸氫鈉水溶液之兩層中，利用乙酸乙酯進行萃取。對於有機層，利用水洗淨1次、利用飽和鹽水洗淨2次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物進行純化，而以4種非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(10.81g)。
MS(ESI)m/z：492[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.548(0.2H,s),8.546(0.3H,s),8.54(0.3H,s),8.53(0.2H,s),7.54(0.2H,s),7.53(0.3H,s),7.51(0.2H,s),7.44(0.3H,s),6.75(0.2H,d,J=5.4Hz),6.71(0.2H,d,J=5.9Hz),6.57(0.3H,d,J=5.9Hz),6.56(0.3H,d,J=5.9Hz),4.87-4.69(2H,m),4.55-3.54(10H,m),3.18-3.12(2H,m),3.10-2.96(2H,m),2.40-2.30(2H,m),1.92-1.51(12H,m).
(步驟16)
2-[2-去氧-2-氟-3,5-雙-O-(
Figure 110108019-A0305-02-0167-176
烷-2-基)-β-D-呋喃核糖基]-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於氮氣環境下在0℃向上述步驟15中所獲得之化合物(10.81g)之脫水二氯甲烷(150mL)溶液中添加吡啶(5.3mL)及三氟甲磺酸酐(5.6mL)，於相同溫度下攪拌1小時。於反應液中加入冰碎片使反應停止後，將反應液注入乙酸乙酯與飽和碳酸氫鈉水溶液之兩層中，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水將有機層洗淨2次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。將乾燥劑過濾去除，將濾液進行減壓濃縮，而以非晶形式獲得三氟甲磺酸鹽之粗產物。將所獲得之三氟甲磺酸鹽之粗產物溶解於脫水四氫呋喃(150mL)中，於冰浴冷卻下逐量添加氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(約1M，154mL)，於相同溫度下整夜攪拌。於反應液中添加飽和氯化銨水溶液使反應停止。將反應液減壓濃縮至一半左右之量。將殘留物注入乙酸乙酯與飽和氯化銨水溶液之兩層中，利用乙酸乙酯進行萃取。對於有機層，利用飽和氯化銨水溶液洗淨1次、飽和鹽水洗淨2次。利用乙酸乙酯再次對水層進行萃取，並利用飽和鹽水將萃取液洗淨。合併有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥。將乾燥劑過濾去除，將濾液進行減壓濃縮，而獲得標題化合物(40.37g)之粗產物。
MS(ESI)m/z：494[M+H]+.
(步驟17)
2-(2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基)-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
於上述步驟16中所獲得之化合物(40.37g)之甲醇(400mL)溶液中添加對甲苯磺酸一水合物(2.09g)，於60℃攪拌4小時。於反應液中添加三乙胺(16mL)使反應停止。對反應液進行減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯→乙酸乙酯/甲醇]將殘留物進行純化。將含有目標物之溶出分 進行減壓濃縮直至成為漿料狀為止，濾取固體。利用己烷/乙酸乙酯(1：1)將所獲得之固體洗淨，而獲得固體1。將濾液進行減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇]將殘留物進行純化，而獲得固體2。將固體1與固體2合併，而獲得標題化合物(5.32g)。
MS(ESI)m/z：326[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.51(1H,s),7.01(1H,s),6.00(1H,dd,J=13.7,6.3Hz),5.95(1H,dd,J=11.7,2.0Hz),5.87(1H,ddd,J=52.7,6.3,4.9Hz),4.69(1H,m),4.32(1H,brs),3.96(1H,d,J=12.7Hz),3.77(1H,m),3.17(2H,m),3.04(2H,m),2.41-2.31(3H,m).
(步驟18)
2-{5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基}-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
使用上述步驟17中所獲得之化合物(5.32g)，利用與實施例2步驟10同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物(10.1g)。
MS(ESI)m/z：628[M+H]+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.54(1H,s),7.42(2H,d,J=7.3Hz),7.32-7.21(8H,m),6.81(4H,m),6.52(1H,dd,J=17.3,2.2Hz),5.37(1H,ddd,J=53.3,4.4,2.4Hz),4.76(1H,m),4.16(1H,m),3.789(3H,s),3.786(3H,s),3.59(1H,dd,J=10.7,2.4Hz),3.44(1H,dd,J=10.7,3.4Hz),3.12(2H,m),2.76(2H,t,J=5.6Hz),2.27(2H,m),2.18(1H,dd,J=7.8,2.9Hz).
(步驟19)
2-(5-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷 -2-基)胺基]膦基}-2-去氧-2-氟-β-D-呋喃核糖基)-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁
使用上述步驟18中所獲得之化合物(10.1g)，藉由與實施例1步驟6同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=1：1)之形式獲得標題化合物(12.6g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.53(1H,s),7.40(2H,m),7.34-7.17(8H,m),6.84-6.74(4H,m),6.53(0.5H,dd,J=17.3,2.2Hz),6.48(0.5H,dd,J=17.6,1.5Hz),5.50-5.31(1H,m),4.99(0.5H,m),4.85(0.5H,m),4.31-4.26(1H,m),3.93-3.76(1H,m),3.792(1.5H,s),3.789(1.5H,s),3.779(1.5H,s),3.776(1.5H,s),3.67-3.51(4H,m),3.34-3.30(1H,m),3.13-3.10(2H,m),2.76-2.69(2H,m),2.61(1H,td,J=6.3,2.4Hz),2.39(1H,m),2.28-2.21(2H,m),1.19-1.15(9H,m),1.03(3H,d,J=6.8Hz).
(步驟20)
使用上述步驟19中所獲得之化合物(1.80g)，藉由與實施例1步驟7同樣之方法進行反應，而獲得2-{2-去氧-2-氟-3-O-[羥基(側氧基)-λ5-膦基]-β-D-呋喃核糖基}-2,7,8,9-四氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁之乙腈溶液。使用所獲得之乙腈溶液與上述步驟3中所獲得之化合物(2.30g)，藉由與實施例1步驟12同樣之方法進行反應，將所獲得之粗產物直接用於下一反應。
(步驟21)
3-{[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-7-{1-[2-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-6-側氧基-1,6-二氫- 9H-嘌呤-9-基}-15-氟-2-側氧基-2-巰基-10-硫酮八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-10-基]氧基}丙腈
使用上述步驟20中所獲得之粗產物，藉由與實施例1步驟13同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(1.22g)。
MS(ESI)m/z：1090(M+H)+.
(步驟22)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-胺基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-2,10-二側氧八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
於上述步驟21中所獲得之化合物(1.22g)之乙醇(10mL)-四氫呋喃(10mL)混合溶液中添加肼一水合物(0.544mL)，於室溫下攪拌15小時。對反應液進行減壓濃縮後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]將殘留物純化而獲得標題化合物之非鏡像異構物1(108mg：含有雜質)與非鏡像異構物2(111mg：含有雜質)。
非鏡像異構物1(低極性)
MS(ESI)m/z：907(M+H)+.
非鏡像異構物2(高極性)
MS(ESI)m/z：907(M+H)+.
(步驟23-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-胺基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物1)
使用上述步驟22中所獲得之化合物(非鏡像異構物1)(108mg：含有雜質)，藉由與實施例1步驟15-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而以三乙胺鹽之形式獲得標題化合物。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈-甲醇溶液(1：1)，乙腈-甲醇溶液(1：1)：10%-50%(0分鐘-40分鐘)]。
藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法對所獲得之三乙胺鹽進行鹽交換，而獲得標題化合物(44.4mg)。
MS(ESI)m/z：793(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.50(1H,s),8.42(1H,s),7.92(1H,s),7.56(1H,s),6.56(1H,d,J=16.3Hz),6.21(1H,d,J=6.0Hz),5.57-5.40(2H,m),5.35-5.22(1H,m),4.73-4.67(1H,m),4.58-4.49(1H,m),4.45-4.26(4H,m),4.24-4.15(1H,m),4.05-3.96(1H,m),3.78-3.51(1H,m),3.26-3.06(4H,m),2.93-2.82(1H,m),2.70-2.51(1H,m),2.29-2.07(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：57.5(s),52.9(s).
(步驟23-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-7-[1-(2-胺基乙基)-6-側氧基- 1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物2)
使用上述步驟22中所獲得之化合物(非鏡像異構物2)(111mg：含有雜質)，藉由與實施例1步驟15-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而以三乙胺鹽之形式獲得標題化合物。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：5%-25%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇，甲醇：20%-60%(0分鐘-40分鐘)]。
藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法對所獲得之三乙胺鹽進行鹽交換，而獲得標題化合物(40.6mg)。
MS(ESI)m/z：793(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.57(1H,s),8.41(1H,s),8.13(1H,s),7.72(1H,s),6.59(1H,dd,J=15.7,1.8Hz),6.26(1H,d,J=8.5Hz),5.61-5.34(3H,m),4.57-4.48(2H,m),4.48-4.38(2H,m),4.38-4.28(2H,m),4.08-3.98(3H,m),3.29-3.21(2H,m),3.20-3.12(2H,m),3.02-2.92(1H,m),2.92-2.81(1H,m),2.29-2.15(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：58.7(s),57.8(s).
實施例4：CDN50之合成
N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫雜 -2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-雙(巰基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙基)-2-羥基乙醯胺
Figure 110108019-A0305-02-0174-155
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0174-156
(步驟1-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-7-{1-[2-(2-羥基乙醯胺)乙基]-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基}-2,10-二側氧八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物1)
於實施例3步驟23-1中所獲得之化合物(20.0mg)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加三乙胺(17μL)與1-[(羥基乙醯基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(10.3mg)，於室溫下攪拌3小時。利用10mM乙酸三乙酯銨水溶液稀釋反應液，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：10%-30%(0分鐘-40分鐘)]進行純化。對於所獲得之化合物(三乙胺鹽)，藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法進行鹽交換，而獲得標題化合物(15.6mg)。
MS(ESI)m/z：851(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.43(1H,s),8.40(1H,brs),7.66(1H,brs),7.58(1H,s),6.53(1H,d,J=16.3Hz),6.14(1H,d,J=8.5Hz),5.73-5.64(1H,m),5.59-5.42(1H,m),5.42-5.29(1H,m),4.80-4.74(1H,m),4.53-4.26(5H,m),4.21-4.12(1H,m),3.99-3.92(1H,m),3.83(2H,s),3.66-3.56(1H,m),3.43-3.26(2H,m),3.23-3.06(2H,m),2.89-2.79(1H,m),2.49-2.33(1H,m),2.27-2.15(1H,m),2.15-2.02(1H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：57.0(s),52.6(s).
(步驟1-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-7-{1-[2-(2-羥基乙醯胺)乙基]-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基}-2,10-二側氧八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)二鈉
(非鏡像異構物2)
使用實施例3步驟23-2中所獲得之化合物(10.0mg)，藉由與上述步驟1-1同樣之方法進行反應後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：7%-25%(0分鐘-40分鐘)]進行純化。對於所獲得之化合物(三乙胺鹽)，藉由與實施例1步驟15-1所記載之[向鈉鹽之轉換]同樣之方法進行鹽交換，而獲得標題化合物(6.6mg)。
MS(ESI)m/z：851(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.46(1H,s),8.42(1H,s),7.84(1H,s),7.78(1H,s),6.59(1H,d,J=15.1Hz),6.20(1H,d,J=7.9Hz),5.69-5.38(3H,m),4.60-4.50(2H,m),4.48-4.38(2H,m),4.31-4.20(2H,m),4.10-3.93(2H,m),3.87(2H,s),3.73-3.57(2H,m),3.52-3.41(1H,m),3.25-3.10(2H,m),3.01-2.90(1H,m),2.83-2.71(1H,m),2.30-2.11(2H,m).
31P-NMR(CD3OD)δ：58.2(s),57.6(s).
實施例5：藥物連接子2之合成
[合成流程]
[化101]
Figure 110108019-A0305-02-0177-158
(步驟1)
按照以下規模實施與實施例1步驟7相同之反應(原料：1.40g)。使用所獲得之化合物之乙腈溶液與實施例2步驟3中所獲得之化合物(1.41g)，藉由與實施例1步驟12同樣之方法進行反應。將所獲得之粗產物直接用於下一反應。
(步驟2)
苯甲酸2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-苯甲醯基-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)-15,16-雙{[第三丁基(二 甲基)矽烷基]氧基}-10-(2-氰基乙氧基)-2-側氧基-2-巰基-10-硫酮八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙酯
使用上述步驟1中所獲得之粗產物，藉由與實施例1步驟13同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(778mg)。
MS(ESI)m/z：1264(M+H)+.
(步驟3)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-雙{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-[1-(2-羥基乙基)-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
使用上述步驟2中所獲得之化合物(778mg)，藉由與實施例1步驟14同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物之非鏡像異構物1(255mg)與非鏡像異構物2(含有雜質)。藉由分取HPLC[水/含有0.2%三乙胺之乙腈，含有0.2%三乙胺之乙腈：5%-50%(0分鐘-40分鐘)]將非鏡像異構物2再次進行純化，而獲得標題化合物之非鏡像異構物2(94.6mg)。
非鏡像異構物1(低極性)
MS(ESI)m/z：1003(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.66(1H,s),8.21(1H,s),8.04(1H,s),7.33(1H,s),6.27(1H,d,J=5.1Hz),6.25(1H,d,J=3.6Hz),5.39-5.29(1H,m),5.18-5.11(1H,m),4.85-4.81(1H,m),4.79-4.74(1H,m),4.71-4.66 (1H,m),4.50-4.42(1H,m),4.36-4.21(2H,m),4.09-3.98(2H,m),3.85-3.78(2H,m),3.78-3.69(2H,m),3.55-3.46(2H,m),3.17(12H,q,J=7.3Hz),2.98-2.75(2H,m),2.05-1.88(2H,m),1.28(18H,t,J=7.3Hz),0.98(9H,s),0.85(9H,s),0.31(3H,s),0.27(3H,s),0.25(3H,s),0.09(3H,s).
非鏡像異構物2(高極性)
MS(ESI)m/z：1003(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.50(1H,s),8.22(1H,s),8.07(1H,s),7.20(1H,s),6.33(1H,d,J=7.3Hz),6.26(1H,d,J=9.1Hz),5.59-5.44(1H,m),5.38-5.32(1H,m),5.21-5.11(1H,m),4.99-4.89(2H,m),4.68-4.54(2H,m),4.25-4.12(3H,m),4.09-4.03(1H,m),3.90-3.80(3H,m),3.59-3.51(2H,m),3.20(12H,q,J=7.3Hz),2.96-2.89(2H,m),2.07-1.98(2H,m),1.30(18H,t,J=7.3Hz),0.99(9H,s),0.74(9H,s),0.27(3H,s),0.27(3H,s),0.20(3H,s),-0.05(3H,s).
(步驟4-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-雙{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-yl)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(非鏡像異構物1)
於上述步驟3中所獲得之化合物(非鏡像異構物1)(30mg)之 四氫呋喃(0.5mL)溶液中添加乙酸[(N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲酯(91.7mg)及對甲苯磺酸一水合物(11.8mg)，於室溫下攪拌6小時。於反應液中添加N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)與1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(56μL)，於室溫下攪拌3小時。於反應液中添加10mM乙酸三乙酯銨水溶液，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]進行純化，而獲得含有原料作為雜質之標題化合物(25.6mg)。
MS(ESI)m/z：1089(M+H)+.
(步驟4-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15,16-雙{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(非鏡像異構物2)
使用上述步驟3中所獲得之化合物(非鏡像異構物2)(84.6mg)，藉由與上述步驟4-1同樣之方法進行反應，而獲得含有原料作為雜質之標題化合物(70.9mg)。
MS(ESI)m/z：1089(M+H)+.
(步驟5-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-15,16-二羥基-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H- 5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)非鏡像異構物1
於上述步驟4-1中所獲得之化合物(25.6mg)中添加三乙胺三氫氟酸鹽(2mL)，於45℃攪拌3小時。於室溫下向反應液中添加經冰浴冷卻之1M碳酸氫三乙銨溶液(10mL)與三乙胺(2mL)之混合液。對反應液進行減壓濃縮後，藉由C18矽膠管柱層析法(10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈)進行純化，而獲得標題化合物(16.6mg：含有來自步驟7-1之原料之雜質)。
MS(ESI)m/z：861(M+H)+.
(步驟5-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aS,16R)-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-15,16-二羥基-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(非鏡像異構物2)
使用上述步驟4-2中所獲得之化合物(70.9mg)，藉由與上述步驟5-1同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物(51.7mg：含有來自步驟4-2之原料之雜質)。
MS(ESI)m/z：861(M+H)+.
(步驟6-1)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0181-177
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aS,16R)-15,16-二羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子2a：非鏡像異構物1)
於上述步驟5-1中所獲得之化合物(16.6mg)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加三乙胺(6μL)及下文所述之步驟8中所獲得之化合物(15.5mg)，於室溫下攪拌3小時。於反應液中添加苄基胺(3μL)，於室溫下攪拌1小時。添加10mM乙酸三乙酯銨水溶液與甲醇，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]與分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：10%-45%(0分鐘-30分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(5.1mg)。
MS(ESI)m/z：1409(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.66-8.60(1H,m),8.17(1H,s),8.02(1H,s),7.65-7.48(2H,m),7.43-7.36(3H,m),7.31-7.13(8H,m),7.11(1H,s),6.30-6.21(2H,m),5.46-5.37(1H,m),5.23-5.16(1H,m),5.08-4.99(1H,m),4.86-4.81(1H,m),4.80-4.75(1H,m),4.70-4.40(7H,m),4.40-4.20(3H,m),4.10-3.97(3H,m),3.86-3.58(8H,m),3.51-3.43(3H,m),3.18(12H,q,J=7.3Hz),3.01-2.93(1H,m),2.85-2.72(3H,m),2.37-2.15(2H,m),2.01-1.93(2H,m),1.29(18H,t,J=7.3Hz).(僅記載可觀測之峰)
(步驟6-2)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0182-178
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R, 15aS,16R)-15,16-二羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-yl)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子2b：非鏡像異構物2)
使用上述步驟5-2中所獲得之化合物(51.7mg)，藉由與上述步驟6-1同樣之方法進行反應後，於以下[純化條件]下進行純化，而獲得標題化合物(33.7mg)。
[純化條件]C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：10%-50%(0分鐘-30分鐘)]。
MS(ESI)m/z：1409(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.73(1H,d,J=6.7Hz),8.19(1H,d,J=3.0Hz),8.02(1H,s),7.66-7.50(2H,m),7.43-7.37(3H,m),7.33-7.13(8H,m),7.11(1H,s),6.33-6.23(2H,m),5.51-5.38(2H,m),5.04(1H,t,J=13.6Hz),4.83-4.77(1H,m),4.64-4.55(2H,m),4.52-4.26(6H,m),4.25-3.97(2H,m),3.93-3.45(13H,m),3.19(12H,q,J=7.3Hz),3.17-3.11(1H,m),3.02-2.92(1H,m),2.91-2.73(3H,m),2.40-2.24(2H,m),2.07-1.95(3H,m),1.30(18H,t,J=7.3Hz).
(步驟7)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0183-179
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯丙胺酸
於市售(BACHEM)之(2S)-2-[[2-[(2-胺基乙醯基)胺基]乙醯基]胺基]- 3-苯基丙烷酸(2.86g)之N,N-二甲基甲醯胺(51.2mL)溶液中添加三乙胺(2.56mL)與市售(Click Chemistry Tools)之1-{[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0184-180
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(3.69g)，於室溫下攪拌24小時。於反應液中添加檸檬酸一水合物(24.0g)之水(500mL)溶液，利用乙酸乙酯進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。使殘留物溶解於乙酸乙酯/乙腈混合溶液中後，利用二異丙醚使其析出並濾取，而獲得標題化合物(4.30g)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.8(1H,brs),8.15-7.95(3H,m),7.68-7.17(13H,m),5.01(1H,d,J=14.2Hz),4.41-4.37(1H,m),3.74-3.57(5H,m),3.05-3.01(1H,m),2.87(1H,dd,J=14.2,9.3Hz),2.68-2.59(1H,m),2.32-2.25(1H,m),2.09-2.03(1H,m),1.82-1.76(1H,m).
(步驟8)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0184-181
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺酸2,5-二側氧吡咯啶-1-基酯
於上述步驟7中所獲得之化合物(2.10g)之N,N-二甲基甲醯胺(75.9mL)溶液中添加N-羥基丁二醯亞胺(961mg)與1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(1.60g)，於氮氣環境下在室溫下攪拌21小時。利用二氯甲烷稀釋反應液，並利用冰水洗淨3次後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。於殘留物中添加甲苯，再次進行減壓濃縮。將殘留物溶解於乙腈中，藉由C18矽膠管柱層析法[乙腈：100%]進行純化。將含有目標物之溶出分進行減壓濃縮後，於殘留物中添加二異丙醚製成漿料狀。濾取所獲得之固體，而獲得標題化合物(2.59g)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.58-8.51(1H,m),8.17-8.00(2H,m),7.66-7.20(13H,m),5.02-4.98(1H,m),4.90-4.85(1H,m),3.78-3.57(5H,m),3.24-3.19(1H,m),3.06-3.00(1H,m),2.82(4H,brs),2.67-2.58(1H,m),2.32-2.23(1H,m),2.09-2.02(1H,m),1.82-1.75(1H,m).
實施例6：藥物連接子17之合成
[合成流程]
[化102]
Figure 110108019-A0305-02-0186-159
(步驟1)
乙酸[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲酯
於室溫下向市售(SUNDIA)之N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘 胺醯基甘胺酸(9.32g)之四氫呋喃(100mL)-甲苯(33.3mL)混合液中添加吡啶(3.26mL)與四乙酸鉛(17.9g)，於65℃攪拌3小時。將不溶物過濾去除，利用四氫呋喃洗淨後，將濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(8.24g)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.14(1H,brs),5.27(2H,d,J=7.3Hz),5.20(1H,brs),4.22-4.16(2H,m),3.88(2H,d,J=6.0Hz),2.08(3H,s),1.04-0.97(2H,m),0.05(9H,s).
(步驟2)
2',3',5'-三-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-羥基乙基)肌苷
於文獻已知(Chem.Pharm.Bull.1987,35(1),72-79)之2',3',5'-三-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]肌苷(31.3g)之四氫呋喃(75mL)-N,N-二甲基乙醯胺(75mL)混合溶液中添加2-溴乙醇(4.82mL)與1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(7.65mL)，於室溫下攪拌23小時。於反應液中添加水與乙酸乙酯，利用乙酸乙酯進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層，並利用無水硫酸鈉加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(29.4g)。
MS(ESI)m/z：655(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.16(1H,s),7.99(1H,d,J=2.4Hz),5.97(1H,d,J=4.2Hz),4.40-4.25(3H,m),4.18-4.06(3H,m),4.03-3.92(2H,m),3.79(1H,dd,J=11.5,2.4Hz),3.08-2.83(1H,brm),0.96(9H,s),0.92(9H,s),0.82(9H,s),0.15(3H,s),0.14(3H,s),0.09(3H,s),0.08(3H,s),-0.02(3H,s),-0.15(3H,s).
(步驟3)
2',3',5'-三-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)肌苷
於上述步驟2中所獲得之化合物(15.6g)之甲苯(46.8mL)溶液中添加上述步驟1中所獲得之化合物(10.4g)與吡啶(9.63mL)，於110℃攪拌12小時。於反應液中追加上述步驟1中所獲得之化合物(3.46g)，於110℃攪拌1天。於反應液中添加飽和碳酸氫鈉水溶液與二氯甲烷，利用二氯甲烷進行萃取。利用無水硫酸鈉將有機層加以乾燥後，過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。利用矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯]將殘留物純化而獲得標題化合物(20.6g：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：885(M+H)+.
(步驟4)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)肌苷
於上述步驟3中所獲得之化合物(20.6g)之四氫呋喃(50mL)溶液中添加三乙胺三氫氟酸鹽(10mL)，於室溫下攪拌17小時。於冰浴冷卻下向反應液中緩慢添加1M碳酸氫三乙銨溶液(50mL)與三乙胺(10mL)之混合液後，對反應液進行減壓濃縮。藉由C18矽膠管柱層析法[水/乙腈]將殘留物進行部分純化後，進行冷凍乾燥。利用吡啶將所獲得之粗產物進行共沸，於0℃向殘留物之吡啶(50mL)溶液中添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.73g)，於4℃攪拌17小時。於反應液中添加甲醇(2mL)，於室溫下攪拌15分鐘後，進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[己烷/乙酸乙酯/甲醇/0.1%三乙胺]將殘留物純化而獲得標題化合物(9.18g：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：845(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.94(1H,s),7.88(1H,s),7.65(1H,brs),7.41-7.36(2H,m),7.32-7.15(7H,m),6.83-6.76(4H,m),5.96(1H,d,J=6.1Hz),5.73-5.65(2H,m),4.87-4.80(1H,m),4.76-4.61(2H,m),4.44-4.39(1H,m),4.35-4.30(1H,m),4.22-4.05(4H,m),3.83-3.73(2H,m),3.77(6H,s),3.72-3.67(2H,m),3.48-3.32(3H,m),0.99-0.91(2H,m),0.02(9H,s).
(步驟5)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)肌苷
使用上述步驟4中所獲得之化合物(5.96g)，藉由與實施例1步驟10同樣之方法進行反應，而獲得標題化合物(2.33g)與作為標題化合物之位置異構物之5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-2'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)肌苷(2.45g)。
MS(ESI)m/z：959(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.99(1H,s),7.93(1H,s),7.45-7.39(2H,m),7.35-7.18(7H,m),7.05(1H,brs),6.84-6.77(4H,m),5.92(1H,d,J=5.4Hz),5.46(1H,brs),4.71-4.61(3H,m),4.54-4.51(1H,m),4.22-4.10(5H,m),3.81-3.76(2H,m),3.78(3H,s),3.78(3H,s),3.74(2H,d,J=6.0Hz),3.48(1H,dd,J=10.9,4.2Hz),3.26(1H,dd,J=10.9,4.2Hz),3.16(1H,d,J=6.7Hz),1.00-0.93(2H,m),0.89(9H,s),0.09(3H,s),0.02(9H,s),0.02(3H,s).
位置異構物(2'-O-TBS體)
MS(ESI)m/z：959(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.99(1H,s),7.91(1H,s),7.48-7.42(2H,m),7.37-7.18(8H,m),6.85-6.78(4H,m),5.96(1H,d,J=5.4Hz),5.63(1H,brs),4.88(1H,t,J=5.1Hz),4.66(2H,d,J=6.7Hz),4.36-4.32(1H,m),4.27-4.19(2H,m),4.18-4.10(3H,m),3.81-3.74(4H,m),3.78(3H,s),3.78(3H,s),3.50(1H,dd,J=10.9,3.6Hz),3.38(1H,dd,J=10.9,3.6Hz),2.73(1H,d,J=4.2Hz),0.97-0.90(2H,m),0.86(9H,s),0.02(3H,s),0.01(9H,s),-0.09(3H,s).
(步驟6)
5'-O-[雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]-3'-O-[第三丁基(二甲基)矽烷基]-2'-O-{(2-氰基乙氧基)[二(丙烷-2-基)胺基]膦基}-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)肌苷
使用上述步驟5中所獲得之化合物(2.33g)，藉由與實施例1步驟11同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物(非鏡像異構物比=6：4)之形式獲得標題化合物(2.72g)。
MS(ESI)m/z：1159(M+H)+.
1H-NMR(CDCl3)δ：8.03(0.4H,s),8.02(0.6H,s),7.95(0.6H,s),7.92(0.4H,s),7.46-7.40(2H,m),7.35-7.17(7H,m),6.88(1H,brs),6.84-6.78(4H,m),6.15(0.6H,d,J=4.2Hz),6.10(0.4H,d,J=4.8Hz),5.34(1H,brs),4.86-4.61(3H,m),4.48-4.42(1H,m),4.29-4.09(5H,m),3.83-3.44(9H,m),3.79(3H,s),3.78(3H,s),3.32-3.23(1H,m),2.58-2.49(1H,m),2.44-2.38(1H,m),1.15(3.6H,d,J=6.7Hz),1.11(6H,d,J=6.7Hz), 1.04-0.92(2H,m),0.97(2.4H,d,J=6.7Hz),0.85(3.6H,s),0.84(5.4H,s),0.09(1.2H,s),0.06(1.8H,s),0.03(9H,s),0.00(3H,s).
(步驟7)
使用實施例2步驟11中所獲得之化合物(2.15g)，藉由與實施例1步驟7同樣之方法進行反應，而獲得6-苯甲醯基-2-{2-去氧-2-氟-3-O-[羥基(側氧基)-λ5-膦基]-β-D-呋喃核糖基}-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁之乙腈溶液。使用所獲得之乙腈溶液與上述步驟6中所獲得之化合物(2.72g)，藉由與實施例1步驟12同樣之方法進行反應，將所獲得之粗產物直接用於下一反應。
(步驟8)
(2-{[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(6-苯甲醯基-6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-10-(2-氰基乙氧基)-15-氟-2-側氧基-2-巰基-10-硫酮八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]胺基}-2-側氧乙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
使用上述步驟7中所獲得之粗產物，藉由與實施例1步驟13同樣之方法進行反應，而以磷原子上之非鏡像異構物混合物之形式獲得標題化合物(1.47g：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：1278(M+H)+.
(步驟9)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-16-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-15-氟-2,10-二側氧基-7-[6-側氧基-1-(2-{[(N-{[2-(三甲基矽烷 基)乙氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙基)-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基]-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
於上述步驟8中所獲得之化合物(1.47g)之甲醇(10mL)-四氫呋喃(10mL)混合溶液中添加28%氨水(10mL)，於50℃攪拌6小時。對反應液進行減壓濃縮後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]將殘留物純化而獲得標題化合物之非鏡像異構物1(204mg：含有雜質)與非鏡像異構物2(205mg：含有雜質)。
非鏡像異構物1(低極性)
MS(ESI)m/z：1121(M+H)+.
非鏡像異構物2(高極性)
MS(ESI)m/z：1121(M+H)+.
(步驟10-1)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-16-羥基-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
於上述步驟9中所獲得之化合物(非鏡像異構物1)(204mg)之四氫呋喃(6mL)溶液中添加氟化四丁基銨之四氫呋喃溶液(約1M，3mL)，於室溫下攪拌33小時。於4℃保存3天後，於反應液中添加10mM乙酸三乙酯銨水溶液，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]與分取 HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈-甲醇溶液(1：1)，乙腈-甲醇溶液(1：1)：10%-50%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(40.7mg：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：863(M+H)+.
(步驟10-2)
(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(1-{2-[(甘胺醯胺基)甲氧基]乙基}-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-16-羥基-2,10-二側氧基-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-2,10-雙(硫醇)雙(N,N-二乙基乙烷銨)
使用上述步驟9中所獲得之化合物(非鏡像異構物2)(205mg)，藉由與上述步驟10-1同樣之方法進行反應後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]與分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈-甲醇溶液(1：1)，乙腈-甲醇溶液(1：1)：10%-50%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(50.8mg：含有雜質)。
MS(ESI)m/z：863(M+H)+.
(步驟11-1)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0193-182
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子17a：非鏡像異構物1)
於上述步驟10-1中所獲得之化合物(40.7mg)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加三乙胺(11μL)及實施例5步驟8中所獲得之化合物(25.4mg)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中添加苄基胺(8μL)，於室溫下攪拌1小時。添加10mM乙酸三乙酯銨水溶液與甲醇，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：20%-45%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇，甲醇：40%-90%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(25.1mg)。
MS(ESI)m/z：1411(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.58(1H,s),8.09(1H,s),8.04(1H,s),7.57-7.49(2H,m),7.43-7.34(3H,m),7.32-7.08(9H,m),6.47(1H,d,J=16.9Hz),6.23(1H,d,J=7.9Hz),5.56-5.37(2H,m),5.31-5.17(1H,m),5.03(1H,d,J=13.9Hz),4.79(1H,d,J=4.2Hz),4.64-4.38(6H,m),4.36-4.21(4H,m),4.05-3.60(10H,m),3.53-3.42(3H,m),3.18(12H,q,J=7.3Hz),3.01-2.92(1H,m),2.86-2.73(1H,m),2.70-2.54(2H,m),2.37-2.16(2H,m),2.06-1.77(3H,m),1.28(18H,t,J=7.3Hz).
(步驟11-2)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0194-183
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚-14-(6,7,8,9-四氫-2H-2,3,5,6-四氮雜苯并[cd]薁-2-基)八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基- 6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙氧基)甲基]甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子17b：非鏡像異構物2)
使用上述步驟10-2中所獲得之化合物(50.8mg)與實施例5步驟8中所獲得之化合物(31.7mg)，藉由與上述步驟11-1同樣之方法進行反應後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：25%-45%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇，甲醇：45%-90%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(23.4mg)。
MS(ESI)m/z：1411(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.67(1H,s),8.14(1H,s),8.02(1H,s),7.67-7.50(2H,m),7.43-7.36(3H,m),7.34-7.12(9H,m),6.48(1H,d,J=15.1Hz),6.26(1H,t,J=8.8Hz),5.60-5.31(3H,m),5.09-5.00(1H,m),4.61-4.22(9H,m),4.11-3.59(13H,m),3.50-3.44(2H,m),3.18(12H,q,J=7.3Hz),3.04-2.93(1H,m),2.87-2.74(3H,m),2.39-2.22(2H,m),2.06-1.85(3H,m),1.28(18H,t,J=7.3Hz).
實施例7：藥物連接子20之合成
[合成流程]
[化103]
Figure 110108019-A0305-02-0196-160
(步驟1)
N-(銨基乙醯基)甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基甘胺酸三氟乙酸酯
於室溫下向市售(BACHEM)之N-(第三丁氧基羰基)甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基甘胺酸(3.00g)之二氯甲烷(30mL)溶液中添加三氟乙酸(15mL)，於相同溫度下攪拌3小時。對反應液進行減壓濃縮後，懸浮於甲苯中再次進行減壓濃縮。將該濃縮操作進一步重複2次。利用二乙醚(100mL)使殘留物成為漿料狀後進行濾取，而獲得標題化合物(3.27g)之粗產物。
MS(ESI)m/z：337(M+H)+.
1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.60(1H,brs),8.48(1H,t,J=5.6Hz),8.44(1H,t,J=5.9Hz),8.31(1H,d,J=8.8Hz),7.97(3H,brs),7.28-7.16(5H,m),4.58(1H,m),3.87(1H,dd,J=16.8,5.6Hz),3.78(2H,d,J=5.9Hz),3.67(1H,dd,J=17.1,5.4Hz),3.56(2H,brd,J=4.4Hz),3.05(1H,dd,J=13.7,3.9Hz),2.74(1H,dd,J=13.7,10.3Hz).
(步驟2)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0197-184
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基甘胺酸
於上述步驟1中所獲得之化合物(2.09g)之N,N-二甲基甲醯胺(46.4mL)溶液中添加三乙胺(0.804mL)與1-{[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0197-185
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.87g)，於室溫下攪拌21小時。對反應液進行減壓濃縮，藉由矽膠管柱層析法[二氯甲烷/甲醇]將殘留物進行純化。於所獲得之化合物之二氯甲烷溶液中添加二乙醚製成漿料狀後進行濾取，而獲得標題化合物(2.10g)。
MS(ESI)m/z：624(M+H)+.
1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.20-7.91(4H,m),7.68-7.13(13H,m),4.98(1H,dd,J=13.9,3.2Hz),4.51-4.46(1H,m),3.73-3.47(7H,m),3.00(1H,dd,J=13.9,4.1Hz),2.73(1H,t,J=11.7Hz),2.67-2.57(1H,m),2.29-2.22(1H,m),2.06-2.01(1H,m),1.80-1.73(1H,m).(僅記載可觀測之峰)
(步驟3)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0197-186
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基甘胺酸2,5-二側氧吡咯啶-1-基酯
於上述步驟2中所獲得之化合物(2.10g)之N,N-二甲基甲醯胺(33.7mL)溶液中添加N-羥基丁二醯亞胺(426mg)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二醯亞胺鹽酸鹽(710mg)，於氮氣環境下在室溫下攪拌16小時。利用二氯甲烷將反應液稀釋後，利用冰水洗淨3次，並利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。於油狀之殘留物中添加乙酸乙酯使固體析出。將溶劑於減壓下蒸餾去除，於所獲得之固體中添加二乙醚 製成漿料狀後進行濾取，而獲得標題化合物(2.18g)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.74-8.69(1H,m),8.16-8.08(2H,m),8.00-7.93(1H,m),7.71-7.15(13H,m),5.00(1H,dd,J=13.9,3.0Hz),4.55-4.49(1H,m),4.27(2H,t,J=6.0Hz),3.77-3.68(1H,m),3.64-3.50(4H,m),3.02(1H,dd,J=13.9,4.2Hz),2.82-2.73(5H,m),2.69-2.58(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.10-2.02(1H,m),1.83-1.75(1H,m).
(步驟4)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0198-187
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙基)甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子20)
於實施例3步驟23-2中所獲得之化合物(25.0mg)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液中添加三乙胺(8μL)及上述步驟3中所獲得之化合物(25.8mg)，於室溫下攪拌2小時。於反應液中添加苄基胺(7μL)，於室溫下攪拌1小時。於反應液中添加10mM乙酸三乙酯銨水溶液與甲醇，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：30%-50%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇，甲醇：50%-90%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(33.1mg)。
MS(ESI)m/z：1398(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.58(1H,brs),8.39(1H,d,J=8.5Hz),8.00(1H,brs),7.71(1H,brs),7.64-7.49(2H,m),7.44-7.37(3H,m),7.32-7.10(8H,m),6.59(1H,d,J=15.1Hz),6.23(1H,d,J=8.5Hz),5.65-5.36(3H,m),5.03(1H,dd,J=16.6,14.2Hz),4.57-4.38(5H,m),4.30-4.17(2H,m),4.07-3.95(2H,m),3.94-3.50(9H,m),3.50-3.35(1H,m),3.19(12H,q,J=7.3Hz),3.18-3.07(3H,m),3.04-2.73(4H,m),2.40-2.11(4H,m),2.05-1.92(1H,m),1.29(18H,t,J=7.3Hz).
實施例8：藥物連接子21之合成
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0199-161
(步驟1)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0199-188
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺 醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-({2-[(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧乙氧基}甲基)甘胺醯胺
於文獻已知(WO2014/057687)之{[(N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}甘胺醯基)胺基]甲氧基}乙酸(955mg)之N,N-二甲基甲醯胺(8.0mL)溶液中添加1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(0.74mL)，於室溫下攪拌1小時(反應液A)。於實施例5步驟7中所獲得之化合物(938mg)之N,N-二甲基甲醯胺(8.0mL)溶液中添加N-羥基丁二醯亞胺(229mg)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二醯亞胺鹽酸鹽(380mg)，於室溫下攪拌50分鐘(反應液B)。將反應液A添加至反應液B中，於室溫下攪拌1小時。於反應液中添加二氯甲烷(50mL)與10%檸檬酸水溶液(10mL)，利用二氯甲烷進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[氯仿/(氯仿/甲醇/水=7：3：1之下層)]將殘留物進行純化。於所獲得之化合物之N,N-二甲基甲醯胺(8.0mL)溶液中添加N-羥基丁二醯亞胺(229mg)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二醯亞胺鹽酸鹽(380mg)，於室溫下攪拌30分鐘。於反應液中添加二氯甲烷(100mL)與水(25mL)，利用二氯甲烷進行萃取。利用飽和鹽水洗淨有機層後，利用無水硫酸鈉加以乾燥。過濾去除乾燥劑，並對濾液進行減壓濃縮。藉由矽膠管柱層析法[氯仿/甲醇]將殘留物進行純化。將含有目標物之溶出分進行減壓濃縮，於殘留物中添加二乙醚製成漿料狀。濾取所獲得之固體，而獲得標題化合物(412mg)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.72(1H,m),8.32(1H,m),8.17-7.96(3H,m),7.71-7.15(13H,m),5.01(1H,d,J=13.9Hz),4.70-4.48(5H,m),3.81-3.51(7H,m),3.05(1H,dd,J=14.2,3.9Hz),2.83(4H,s),2.80(1H,m), 2.64(1H,m),2.28(1H,m),2.07(1H,m),1.79(1H,m).
(步驟2)
N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]氮
Figure 110108019-A0305-02-0201-189
-5(6H)-基)-4-側氧丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-苯基丙胺醯基-N-({2-[(2-{9-[(5R,7R,8R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-14-(8,9-二氫-6-硫雜-2,3,5-三氮雜苯并[cd]薁-2(7H)-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二側氧基-2,10-二硫醚八氫-2H,10H,12H-5,8-甲橋-2λ5,10λ5-呋喃并[3,2-1][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜環十四炔-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-1-基}乙基)胺基]-2-側氧乙氧基}甲基)甘胺醯胺雙(N,N-二乙基乙烷銨)
(藥物連接子21)
使用實施例3步驟23-2中所獲得之化合物(15.0mg)與上述步驟1中所獲得之化合物(17.4mg)，藉由與實施例7步驟4同樣之方法進行反應後，藉由C18矽膠管柱層析法[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈]、分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/乙腈，乙腈：25%-50%(0分鐘-40分鐘)]、及分取HPLC[10mM乙酸三乙酯銨水溶液/甲醇，甲醇：40%-90%(0分鐘-40分鐘)]進行純化，而獲得標題化合物(21.8mg)。
MS(ESI)m/z：1485(M+H)+.
1H-NMR(CD3OD)δ：8.61(1H,brs),8.41-8.34(1H,m),8.10-8.05(1H,m),7.72-7.37(6H,m),7.32-7.12(8H,m),6.63-6.50(1H,m),6.27-6.22(1H,m),5.65-5.31(3H,m),5.07-4.94(1H,m),4.68-4.20(10H,m),4.11-3.53(14H,m),3.26-3.08(2H,m),3.19(12H,q,J=7.3Hz),3.06-2.67(4H,m),2.40-2.11(4H,m),2.05-1.88(1H,m),1.29(18H,t,J=7.3Hz).
實施例9：糖鏈重塑抗體1之合成
抗Trop2抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0202-162
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體1之製備
於依照參考例5所製備之抗Trop2抗體1之磷酸緩衝生理鹽水溶液(6.0mL，16.55mg/mL，pH值為6.0)中添加野生型EndoS之磷酸緩衝生理鹽水溶液(0.064mL，7.70mg/mL，pH值為6.0)，於37℃振盪2小時。利用Experion電泳工作站(BIO-RAD製造)確認反應之進行情況。反應結束後，依照以下方法，進行藉由親和層析法進行之純化及藉由羥磷灰石管柱層析法進行之純化。
(1)藉由親和層析法進行之純化
純化裝置：AKTA avant 25(GE Healthcare製造)
管柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE Healthcare製造)
流速：5mL/min(填充時為1.25mL/min)
於結合於管柱時，將反應液直接添加至管柱中，使結合緩衝液[20mM磷酸緩衝液(pH值為6.0)]以1.25mL/min流動2CV(Column Volume，管柱容積)，進而以5mL/min流動5CV。於中間洗淨時，使洗淨溶液[20mM磷酸緩衝液(pH值為7.0)，0.5M氯化鈉溶液]流動15CV。於溶出時， 使溶出緩衝液(ImmunoPure IgG溶出緩衝液，PIERCE製造)流動6CV。利用1M三羥甲基胺基甲烷緩衝液(pH值為9.0)立即中和溶出液。依照共通操作C所記載之方法，對含有目標物之溶出分進行緩衝液交換為5mM磷酸緩衝液、50mM之2-
Figure 110108019-A0305-02-0203-190
啉基乙磺酸(MES)溶液(pH值為6.8)。依照共通操作B所記載之方法測定所獲得之緩衝液之抗體濃度，而獲得經部分純化之標題抗體溶液(12.38mg/mL，8mL)。
(2)藉由羥磷灰石層析法進行之純化
純化裝置：AKTA avant 25(GE Healthcare製造)
管柱：Bio-Scale Mini CHT Type I筒(5mL)(BIO-RAD製造)
流速：5mL/min(填充時為1.25mL/min)
向管柱添加上述(1)中所獲得之溶液，使A液[5mM磷酸緩衝液、50mM MES溶液(pH值為6.8)]以1.25mL/min流動2CV，進而以5mL/min流動3CV。其後，使用A液與B液[5mM磷酸緩衝液、50mM MES溶液(pH值為6.8)、2M氯化鈉溶液]進行溶出。溶出條件為A液：B液=100：0~0：100(5CV)。進而，使洗淨溶液[500mM磷酸緩衝液(pH值為6.5)]流動5CV。依照共通操作C所記載之方法，對含有目標物之溶出分進行緩衝液交換為20mM磷酸緩衝液(pH值為6.0)。依照共通操作B所記載之方法測定所獲得之緩衝液之抗體濃度，而獲得標題抗體溶液(12.30mg/mL，8mL)。
(步驟2)
抗Trop2抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
於上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(12.30mg/mL，8mL，pH值為6.0)中添加[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(WO2018/003983之化合 物1-10)(22.7mg)與EndoS(D233Q/Q303L)之磷酸緩衝生理鹽水溶液(0.339mL，5.8mg/mL，pH值為6.0)，於30℃振盪4.5小時。利用Experion電泳工作站(BIO-RAD製造)確認反應之進行情況。反應結束後，與上述步驟1同樣地進行藉由親和層析法進行之純化與藉由羥磷灰石層析法進行之純化。依照共通操作C所記載之方法對含有目標物之溶出分進行向磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)之緩衝液交換。依照共通操作B所記載之方法測定所獲得之緩衝液之抗體濃度，而獲得標題抗體溶液(10.24mg/mL，9mL)。
實施例10：糖鏈重塑抗體2之合成
改型抗Trop2抗體-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0204-163
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗Trop2抗體之製備
使用依照參考例6所製備之改型抗Trop2抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10mL，16.75mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(18.11mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗Trop2抗體-[SG-(N3)2]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(18.11mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(32mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(11.03mg/mL，10.5mL，pH值為6.0)。
實施例11：糖鏈重塑抗體3之合成
改型抗CD70抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0205-164
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗CD70抗體1之製備
使用依照參考例3所製備之改型抗CD70抗體1之磷酸緩衝生理鹽水溶液(3.0mL，16.11mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(6.41mg/mL，5.5mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗CD70抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(6.41mg/mL，5.5mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(10mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(9.24mg/mL，3.25mL，pH值為6.0)。
實施例12：糖鏈重塑抗體4之合成
改型抗CD70抗體2-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0206-165
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗CD70抗體2之製備
使用依照參考例4所製備之改型抗CD70抗體2之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10.0mL，14.00mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(18.67mg/mL，6mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗CD70抗體2-[SG-(N3)2]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(18.67mg/mL，6mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(26mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(11.39mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
實施例13：糖鏈重塑抗體5之合成
改型抗EGFR抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
[化109]
Figure 110108019-A0305-02-0207-166
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗EGFR抗體1之製備
使用依照參考例7所製備之改型抗EGFR抗體1之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10.0mL，14.00mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(16.70mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗EGFR抗體1-[SG-(N3)2]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(16.70mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(29mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10.49mg/mL，10mL，pH值為6.0)。
實施例14：糖鏈重塑抗體6之合成
改型抗EGFR抗體2-[SG-(N3)2]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0207-167
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗EGFR抗體2之製備
使用依照參考例8所製備之改型抗EGFR抗體2之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10.0mL，14.10mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(16.88mg/mL，6mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗EGFR抗體2-[SG-(N3)2]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(16.88mg/mL，6mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]2-SG(10)Ox(23mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(8.34mg/mL，6.75mL，pH值為6.0)。
實施例15：抗體藥物共軛物1之合成(抗Trop2抗體1-CDN共軛物(1)之合成)
利用丙二醇(0.250mL)稀釋糖鏈重塑抗體1之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(10.24mg/mL，0.500mL)。於該溶液中添加藥物連接子2b之二甲基亞碸溶液(10mM，0.085mL，相對於1分子抗體為24當量)與丙二醇(0.165mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(3.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：0.89mg/mL
抗體產量：3.12mg(62%)
藥物平均結合數：3.7
實施例16：抗體藥物共軛物2之合成(抗Trop2抗體2-CDN共軛物(1)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體2之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.061mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.439mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.26mg/mL
抗體產量：8.16mg(74%)
藥物平均結合數：3.5
實施例17：抗體藥物共軛物3之合成(抗Trop2抗體2-CDN共軛物(2)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體2之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子20之二甲基亞碸溶液(10mM，0.061mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.439mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.30mg/mL
抗體產量：8.45mg(77%)
藥物平均結合數：3.5
實施例18：抗體藥物共軛物4之合成(抗Trop2抗體2-CDN共軛物(3)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體2之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(11.03mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子21之二甲基亞碸溶液(10mM，0.061mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.439mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.33mg/mL
抗體產量：8.62mg(78%)
藥物平均結合數：3.6
實施例19：抗體藥物共軛物5之合成(抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)之合成)
用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體3之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(9.24mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.051mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.449mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.08mg/mL
抗體產量：7.02mg(76%)
藥物平均結合數：3.8
實施例20：抗體藥物共軛物6之合成(抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體4之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(11.39mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.063mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.437mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.33mg/mL
抗體產量：8.65mg(76%)
藥物平均結合數：3.7
實施例21：抗體藥物共軛物7之合成(抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體5之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(10.49mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.058mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.442mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(7.0mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：0.69mg/mL
抗體產量：4.84mg(48%)
藥物平均結合數：3.6
實施例22：抗體藥物共軛物8之合成(抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體6之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(8.34mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.055mL，相對於1分子抗體為9.6當量)與丙二醇(0.445mL)之混合液，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(7.0mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：0.52mg/mL
抗體產量：3.62mg(43%)
藥物平均結合數：3.8
實施例23：糖鏈重塑抗體7之合成
改型抗Trop2抗體-[MSG1-(N3)]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0212-168
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗Trop2抗體之製備
使用改型抗Trop2抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(5mL，16.75mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(9.81mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗Trop2抗體-[MSG1-(N3)]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(9.81mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox(WO2018/003983之化合物1-11)(12mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(13.22mg/mL，5mL，pH值為6.0)。
實施例24：糖鏈重塑抗體8之合成
改型抗CD70抗體2-[MSG1-(N3)]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0213-169
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗CD70抗體2之製備
使用改型抗CD70抗體2之磷酸緩衝生理鹽水溶液(1.6mL，13.44mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(8.96mg/mL，2mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗CD70抗體2-[MSG1-(N3)]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(8.96mg/mL，2mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox(4mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(12.20mg/mL，1.2mL，pH值為6.0)。
實施例25：糖鏈重塑抗體9之合成
改型抗EGFR抗體1-[MSG1-(N3)]2之製備
[合成流程]
Figure 110108019-A0305-02-0214-170
(步驟1)
(Fucα1,6)GlcNAc-改型抗EGFR抗體1之製備
使用改型抗EGFR抗體1之磷酸緩衝生理鹽水溶液(10mL，14.00mg/mL，pH值為6.0)，進行與實施例9步驟1同樣之操作，而獲得標題抗體之20mM磷酸緩衝液(14.51mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
(步驟2)
改型抗EGFR抗體1-[MSG1-(N3)]2之製備
使用上述步驟1中所獲得之抗體之20mM磷酸緩衝液(14.51mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)與[N3-PEG(3)]-MSG1(9)Ox(17.3mg)，進行與實施例9步驟2同樣之操作，而獲得標題抗體之磷酸緩衝生理鹽水溶液(13.34 mg/mL，7.5mL，pH值為6.0)。
實施例26：抗體藥物共軛物9之合成(抗Trop2抗體2-CDN共軛物(4)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體7之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(13.22mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.073mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.427mL)之混合液，使用試管旋轉器於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.36mg/mL
抗體產量：8.83mg(67%)
藥物平均結合數：1.9
實施例27：抗體藥物共軛物10之合成(抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)之合成)
利用丙二醇(0.600mL)稀釋糖鏈重塑抗體8之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(12.20mg/mL，1.20mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.081mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.519mL)之混合液，使用試管旋轉器於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(7mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.46mg/mL
抗體產量：10.25mg(70%)
藥物平均結合數：1.9
實施例28：抗體藥物共軛物11之合成(抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)之合成)
利用丙二醇(0.500mL)稀釋糖鏈重塑抗體9之磷酸緩衝生理鹽水(pH值為6.0)溶液(13.34mg/mL，1.00mL)。於該溶液中添加藥物連接子17a之二甲基亞碸溶液(10mM，0.074mL，相對於1分子抗體為8當量)與丙二醇(0.426mL)之混合液，使用試管旋轉器於室溫下反應2天。依照共通操作D所記載之方法對反應液進行純化，而獲得作為目標之抗體藥物共軛物之ABS溶液(6.5mL)。
依照共通操作E及G所記載之方法進行分析，獲得下述結果。
抗體濃度：1.68mg/mL
抗體產量：10.91mg(82%)
藥物平均結合數：1.9
(參考例1：ML-RR-CDA-2Na+之合成)
於本說明書中，作為參考化合物而使用之ML-RR-CDA-2Na+係依照專利文獻3(WO2014/189805)所記載之方法合成。
(參考例2：2',3'-cGAMP之合成)
於本說明書中，作為參考化合物而使用之2',3'-cGAMP係使用cGAS由ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)與GTP(guanosine triphosphate，三磷酸鳥苷)酶性合成。cGAS之製備及酶反應係將文獻記載之方法(Immunity,2013,39,1019-1031、Cell Rep.2014,6,421-430)適當改變而實施。純化係藉由使用弱鹼性陰離子交換樹脂(DIAION WA10) 及合成吸附劑(SEPABEADS SP207SS)之管柱層析法實施。
(參考例3：抗CD70抗體1之製作)
抗CD70抗體1係參照WO2004/073656製作。實施例中所使用之抗CD70抗體1之同型為IgG1，具有LALA變異。將本實施例中所使用之抗CD70抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列編號1)及重鏈胺基酸序列(序列編號2)示於圖4。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號35)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號36)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號37)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號38)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號39)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號40)示於圖16。
(參考例4：抗CD70抗體2之製作)
抗CD70抗體2係參照WO2007/038637製作。本實施例中所使用之抗CD70抗體2之同型為IgG1，具有LALA變異。將本實施例中所使用之抗CD70抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列編號3)及重鏈胺基酸序列(序列編號4)示於圖5。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號41)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號42)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號43)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號44)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號45)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號46)示於圖17。
(參考例5：抗TROP2抗體1之製作)
抗TROP2抗體1係參照WO2015/098099製作。本實施例中所使用之抗TROP2抗體1之同型為IgG1。將本實施例中所使用之抗TROP2抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列編號5)及重鏈胺基酸序列(序列編號6)示於圖6。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號47)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號48)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號49)、CDRH1之胺基酸序列(序列 編號50)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號51)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號52)示於圖18。
(參考例6：抗TROP2抗體2之製作)
抗TROP2抗體1係參照WO2015/098099製作。本實施例中所使用之抗TROP2抗體1之同型為IgG1。抗TROP2抗體2係對抗TROP2抗體1導入LALA變異。將本實施例中所使用之抗TROP2抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列編號7)及重鏈胺基酸序列(序列編號8)示於圖7。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號53)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號54)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號55)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號56)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號57)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號58)示於圖19。
(參考例7：抗EGFR抗體1之製作)
抗EGFR抗體1係參照Vectibix點滴靜脈注射100mg審查結果報告書(2010年3月5日醫藥食品局審查管理課)製作。本實施例中所使用之抗EGFR抗體1之同型為IgG1，具有LALA變異。將本實施例中所使用之抗EGFR抗體1之輕鏈胺基酸序列(序列編號9)及重鏈胺基酸序列(序列編號10)示於圖8。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號59)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號60)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號61)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號62)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號63)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號64)示於圖20。CDR序列參照WO1998/050433。
(參考例8：抗EGFR抗體2之製作)
抗EGFR抗體2係參照WO2002/092771製作。本實施例中所使用之抗 EGFR抗體2之同型為IgG1，具有LALA變異。將本實施例中所使用之抗EGFR抗體2之輕鏈胺基酸序列(序列編號11)及重鏈胺基酸序列(序列編號12)示於圖9。將該抗體之CDRL1之胺基酸序列(序列編號65)、CDRL2之胺基酸序列(序列編號66)、CDRL3之胺基酸序列(序列編號67)、CDRH1之胺基酸序列(序列編號68)、CDRH2之胺基酸序列(序列編號69)、及CDRH3之胺基酸序列(序列編號70)示於圖21。
(試驗例1)使用報導細胞之STING促效劑活性評價
<報導基因分析>
人STING促效劑活性係使用可確認處於STING路徑之下游之干擾素控制因子3(interferon regulatory factor-3(IRF3))之路徑之活化的THP1-DualTM細胞(HAQ變異型)(InvivoGen，CA，US)進行評價。小鼠STING促效劑活性係使用RAW-DualTM細胞(InvivoGen)進行評價。
分析係以如下方式實施。首先將經PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝鹽水)稀釋之受驗化合物以20μL/孔分注於透明96孔板(Corning，NY，US)。繼而，以180μL/孔(1×105個細胞/孔)添加懸浮於分析緩衝液(含有10%牛血清白蛋白之RPMI(Roswell Park Memorial Institute，羅斯韋爾帕克紀念研究所)1640培養基或DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，達爾伯克改良伊格爾培養基)培養基)中之報導細胞開始刺激。於37℃、5%CO2環境下培養24小時後，將所得之離心上清液回收。將6μL之回收之上清液添加至白色384孔板，於其中添加QUANTI-Luc(InvivoGen)溶液15μL。充分混合後，使用讀板儀(PerkinElmer，MA，US)測定發光。將已對1.37至100μM之ML-RR-CDA-2Na+(WO2014/189805中之化合物21)進行處理之細胞中之最大 計數值設為100%，將經PBS處理之細胞之計數設為0%，將獲得受驗化合物為50%之計數所需之濃度設為EC50(μM)值，使用GraphPad Prism(GraphPad Software，CA，US)算出。將人STING促效劑活性試驗之結果示於表1。
Figure 110108019-A0305-02-0220-9
結果可知，本發明之抗體藥物共軛物所使用之化合物具有對人STING之促效劑活性。又，對於小鼠STING，亦確認到與現有之CDN同等以上之促效劑活性。
(試驗例2)使用重組STING C末結合域蛋白質之蛋白質熱位移分析(Protein thermal shift assay)
(i)各種表現質體之構建
<人TMEM173表現質體之構建>
人STING(本說明書中有時亦稱為人TMEM173)之哺乳動物細胞表現用質體係購入第232號之精胺酸(R)變異為組胺酸(H)(本說明書中稱為H232變異或REF變異)之人TMEM173 cDNA純系(Accession NM_198282.3，H232(REF)變異型STING表現質體)(GeneCopoeia，MD，US)。將人H232(REF)變異型STING之胺基酸序列示於序列編號15，將核苷酸序列示於序列編號16。又，以H232變異型STING表現質體為模板，進行基於反向(Inverse)PCR(polymerase chain reaction，聚合酶 鏈反應)法之定點突變導入，而製作野生型STING及變異型STING之表現質體。詳細而言，首先，使用2種引子(Primer)(5'-CGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3'(H232R(WT)fwd)(序列編號25)及5'-GTCACCGGTCT GCTGGGGCAGTT TATC-3'(H232R(WT)rev))(序列編號26)與KOD-Plus-Mutagenesis套組(SMK-101)(東洋紡)實施PCR，藉由DNA定序確認目標之野生型(R232)STING表現質體之構建。將人野生型STING之胺基酸序列示於序列編號13，將核苷酸序列示於序列編號14。
繼而，藉由與野生型STING表現質體同樣之方法製作HAQ(R71H、G230A及R293Q)變異型。詳細而言，以H232變異型STING表現質體為模板，使用2種引子(5'-GCTGACCGTGCTGGCATCAAGGATCGGGTTTAC-3'(H232R/G230A fwd)(序列編號27)及5'-GGTCTGCTGGGGCAGTTTATCCAGG-3'(H232R/G230A rev)(序列編號28))與變異誘發套組實施PCR。藉由對兩處同時導入變異，而獲得G230A變異型STING質體。進而，以G230A變異型STING表現質體為模板，使用2種引子(5'-CACCACATCCACTCCAGGTACCGG-3'(R71H fwd)(序列編號29)及5'-CAGCTCCTCAGCCAGGCTGCAGAC-3'(R71H rev)(序列編號30))與變異誘發套組實施PCR，而獲得R71H/G230A變異型STING表現質體。
繼而，以R71H/G230A變異型之STING表現質體為模板，使用2種引子(5'-CAGACACTTGAGGACATCCTGGCAG-3'(R293Q fwd)(序列編號31)及5'-GCAGAAGAGTTTGGCCTGCTCAA-3'(R293Q rev)(序列編號32))與變異誘發套組實施PCR，而獲得HAQ(R71H/G230A/R293Q)變異型之表現質體。將人HAQ變異型STING 之胺基酸序列示於序列編號17，將核苷酸序列示於序列編號18。將人之野生型STING、REF變異型STING、HAQ變異型STING之胺基酸序列示於圖10。
<重組STING C末結合域蛋白質表現質體等之構建>
人STINGC末結合域(aa139-342)蛋白質(UniProt entry Q86WV6)cDNA係藉由使用2種引子(5'-ACCTGTATTTTCA GGGCCTGGCCCCAGCTGAGATCTCTG-3'(hST Fw_v2)(序列編號33)及5'-CAGAATTCGCAAGCTTTTAAGTAACCTCTTCCTTTTCCTCCTGC-3'(hST Rv_V3)(序列編號34))之PCR由全長之人TMEM173 cDNA純系表現質體(野生型、H232變異型及HAQ變異型)製作。PCR產物係以N末具有包含組胺酸6個鹼基之6xHis標籤、抗生物素蛋白(Avidin)標籤及TEV(Tobacco Etch Virus，煙草蝕刻病毒)蛋白酶切斷位點之方式，使用融合HD選殖套組(In-Fusion HD Cloning Kit)(TAKARA BIO)插入作為大腸桿菌表現用載體之pET15b，而構建pET15b-HisAviTEV-hSTING(139-342)人野生型、pET15b-HisAviTEV-hSTING(139-342)人REF變異型及pET15b-HisAviTEV-hSTING(139-342)人HAQ變異型之表現質體。
小鼠STING C末結合域(aa138-341)蛋白質(UniProt entry Q3TBT3)表現用cDNA使用由eurofins Genomics人工合成與小鼠TMEM173 cDNA序列中第138號至第341號之胺基酸相當之cDNA而成者。將小鼠STING之胺基酸序列示於序列編號19，將核苷酸序列示於序列編號20。所合成之cDNA係以N末具有包含6個組胺酸鹼基之6xHis標籤、抗生物素蛋白標籤及TEV蛋白酶切斷位點之方式，使用融合HD選殖套組插入作為大腸桿菌表現用載體之pET15b，構建pET15b-HisAviTEV- mSTING(138-341)小鼠野生型之表現質體。
對pCDF_Duet-1載體插入人工合成之大腸桿菌BirA(UniProt entry P06709)cDNA，構建pCDF_Duet-1 BirA(1-321)表現質體。
(ii)STING C末結合域蛋白質之製備法
所製作之各pET15b-HisAviTEV-hSTING(139-342)(人野生型(Hu-WT)、人REF變異型(Hu-REF)及人HAQ變異型(Hu-HAQ)之STING C末結合域蛋白質)表現質體及pET15b-HisAviTEV-mSTING(138-341)(小鼠野生型(Ms-WT)之STING C末結合域蛋白質)表現質體分別與pCDF_Duet-1 BirA(1-321)表現質體同時轉形為Competent E.coli Rosetta 2(DE3)(Merck Millipore，MA，US)，製作各HisAviTEV-STING表現株。將該等表現株添加至含有100μg/mL安比西林、50μg/mL鏈黴素、及30μg/mL康黴素之TB(Terrific Broth，超級肉湯)培養基中，於37℃培養後，利用100μM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)進行誘導表現，進而於16℃進行培養。
對培養液進行離心，使所獲得之菌體懸浮於50mM HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid，4-(2-羥乙基)-1-哌
Figure 110108019-A0305-02-0223-191
乙磺酸)(pH值為8.0)、500mM NaCl、20mM咪唑、1mM DTT、5%(w/v)甘油、完全不含EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)中後，進行凍結融解。添加溶菌酶(Lysozyme)、DNase I後，藉由超音波破碎萃取蛋白質，經由離心回收上清液。使用AKTAexpress層析系統(GE Healthcare，IL，US)並利用HisTrap FF管柱(GE Healthcare)將所獲得之上清液純化，通入Superdex200 16/60管柱(GE Healthcare)中，利用緩衝液(20mM HEPES(pH值為7.5)、120mM NaCl、 20%甘油、0.8mM DTT)進行溶出。藉由SEC(size exclusion chromatography，尺寸排外層析法)進行包含目標分子量之蛋白質之組分回收，以His-Avi-TEV-hSTING(139-342)人野生型蛋白質、HisAviTEV-hSTING(139-342)人REF變異型蛋白質、HisAviTEV-hSTING(139-342)人HAQ變異型蛋白質及His-Avi-TEV-mSTING(138-341)小鼠野生型蛋白質之形式進行回收。蛋白質濃度係使用Nanodrop2000(Thermo Fisher Scientific，MA，US)進行測定，使用前於-80℃冷凍保存。
將HisAviTEV-hSTING(139-342)人野生型蛋白質之胺基酸序列示於序列編號21，將HisAviTEV-hSTING(139-342)人REF變異型蛋白質之胺基酸序列示於序列編號22，將HisAviTEV-hSTING(139-342)人HAQ變異型蛋白質之胺基酸序列示於序列編號23，將His-Avi-TEV-mSTING(138-341)小鼠野生型蛋白質之胺基酸序列示於序列編號24。
(iii)STING結合試驗
化合物對STING C末結合域蛋白質之結合性係藉由以蛋白質之熱改性溫度之上升作為指標之蛋白質熱位移分析進行。
詳細而言，使用分析緩衝液(20mM Tris-HCl(pH值為7.5)，120mM NaCl)於384孔之即時PCR板混合3μL之受驗化合物(最終濃度0.5mM)、3μL之SYPRO橙色蛋白凝膠染色劑(Orange Protein Gel Stain)(Thermo Fisher Scientific)(最終濃度20×濃度)及6μL之STING蛋白質，並使用盤式振盪器加以混合。藉由即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific)，使溫度以每秒0.03℃之速度自25℃上升至95℃，以SYPRO橙色所發出之螢光為指標測定蛋白質之熱改性溫度。對於所獲得之測定值，使用作為解析軟體之蛋白熱位移軟體(Protein Thermal Shift software)(Thermo Fisher Scientific)，求出Tm(展開轉移之中點(the midpoint of the unfolding transition))(℃)作為螢光強度之增加速度顯示為最大值之溫度。各化合物之Tm值減去未添加化合物之孔之Tm值，藉此算出受驗化合物之Tm之位移作為△Tm(℃)。將對STING蛋白質之結合試驗之結果示於表2。
Figure 110108019-A0305-02-0225-10
結果可知，本發明之抗體藥物共軛物所使用之化合物對人之野生型STING及變異型STING、小鼠之野生型STING具有結合活性。
(試驗例3)HCC細胞分析
作為恆常高度表現TROP2及STING之株，使用自American Type Culture Collection公司購入之人乳腺癌細胞株HCC1954(CRL-2338)細胞，製作使IFIT1啟動子報導基因穩定表現之HCC1954-IFIT1報導細胞。詳細而言，使用FuGene HD(Promega)，將所購入之人IFIT1(ISG-56)啟動子報導(promoter reporter)質體(GeneCopoeia，HPRM40290-PG04)向HCC1954細胞轉染。利用1.0μg/mL嘌呤黴素(Puromycin)(LifeTechnologies)添加培養基對細胞進行繼代而製作穩定表現株，進行選殖而獲得評價用細胞株。將懸浮於分析緩衝液(含有10%牛血清白蛋白之RPMI1640培養基)中之HCC1954-IFIT1報導細胞以90μL/孔(2.5×104個細胞/孔)分注於384孔板。第二天，利用PBS稀釋試驗化合物，添加10μL 開始刺激。於37℃、5%CO2環境下培養24小時後，回收所得之離心上清液。將6μL之回收之上清液添加至白色384孔板，於其中添加QUANTI-Luc(InvivoGen)溶液15μL。充分混合後，使用讀板儀(PerkinElmer，MA，US)測定發光。
將結果示於圖11。縱軸表示發光計數值，橫軸表示各試驗化合物之濃度。圖中之白圈線表示參考例6中所製作之抗TROP2抗體2，圖中之黑圈線表示使參考例6中所製作之抗TROP2抗體2與實施例2之化合物34a共軛而成之抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)，圖中之黑三角線表示使抗TROP2抗體2與實施例3之化合物49b共軛而成之抗TROP2抗體2-CDN共軛物(2)，圖中之黑四角線表示使抗TROP2抗體2與實施例4之化合物50b共軛而成之抗TROP2抗體2-CDN共軛物(3)。抗TROP2抗體2未增加發光計數，相對於此，抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)、(2)、(3)使計數值濃度依賴性地上升。根據以上可知抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)、(2)、(3)具有人STING路徑之活化能力。
(試驗例4)CT26.WT及CT26.WT-hCD70細胞株與源自小鼠骨髓之樹狀細胞之共培養分析系統
製作對自American Type Culture Collection公司購入之小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入人CD70基因(NP_001243)而成之CT26.WT-hCD70細胞。詳細而言，製作插入有人CD70基因之pLVSIN慢病毒載體(TAKARA BIO)，使用Lentiviral High Titer Packaging Mix(TAKARA BIO)導入Lenti-X293T細胞株(TAKARA BIO)中，回收上清液並使其感染CT26.WT。細胞於10μg/mL嘌呤黴素(Thermo Fisher Scientific)添加培養基中維持。
自5週齡之雌性BALB/c小鼠(BALB/cAnNCrlCrlj)(Charles River Laboratories Japan)之大腿骨採集小鼠骨髓細胞。將小鼠骨髓細胞於20μg/mL鼠GM-CSF(PEPROTECH)存在下培養7天，獲得源自小鼠骨髓之樹狀細胞。對於96孔板每孔接種CT26.WT或CT26.WT-hCD70細胞株1.5×105個細胞、源自小鼠骨髓之樹狀細胞1×105個細胞。利用RPMI培養基(Invitrogen)將試驗化合物進行稀釋，添加200μL。培養20小時後，利用FCM(flow cytometry，流式細胞儀)緩衝液(HBSS(Wako)，5% FBS(HyClone)，1mM EDTA(THERMO FISHER))將細胞洗淨，使用FCM抗體(抗小鼠CD16/32(Becton Dickinson)、抗小鼠CD45、抗小鼠CD11c、抗小鼠I-A/I-E、抗小鼠CD86(均為BIOLEGEND))進行染色。再次利用FCM緩衝液洗淨後，藉由Fortessa(BD Biosciences)進行解析。於CD45+、CD11c+、I-A/I-E+區分中算出CD86之MFI(mean fluorescence intensity，平均螢光強度)後，計算相對於未添加試驗化合物組之比例。將結果示於圖12。圖中之DC表示源自小鼠骨髓之樹狀細胞與各試驗化合物之培養結果，圖中之DC+CT26.WT表示源自小鼠骨髓之樹狀細胞及CT26.WT與各試驗化合物之培養結果，圖中之DC+CT26.WT-hCD70表示源自小鼠骨髓之樹狀細胞及CT26.WT-hCD70與各試驗化合物之培養結果。縱軸表示相對於未添加組之MFI之比例，橫軸表示各試驗化合物。圖中之抗CD70抗體1-CDN(1)係使參考例3之抗CD70抗體1與實施例2之化合物34a共軛而成者，圖中之抗CD70抗體2-CDN(1)係使參考例4之抗CD70抗體2與實施例2之化合物34a共軛而成者。實施例2之化合物34a於全部條件下使小鼠樹狀細胞上之CD86表現上升，抗CD70抗體1及抗CD70抗體2於任意條件下均未使CD86表現上升。與此相對，抗CD70抗體1-CDN共軛 物(1)、及抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)僅於將源自小鼠骨髓之樹狀細胞與CT26.WT-hCD70培養之情形時，小鼠樹狀細胞上之CD86表現增強。根據以上，確認到抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)、及抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)之CD70依賴性之樹狀細胞活化。
(試驗例5)抗腫瘤試驗(1)
製作對自American Type Culture Collection公司購入之小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入人TROP2基因(NP_002344.2)而成之CT26.WT-hTROP2細胞。詳細而言，利用BamHI及Eco RI將pQCIXN載體(TAKARA BIO)切斷，利用T4 DNA聚合酶切斷後將切斷末端平滑化，使用Gateway系統(Thermo Fisher Scientific)向與Gateway閱讀框盒(reading frame cassette)A連接所製作之pQCIXN-DEN載體插入人TROP2。使用脂染胺(Lipofectamine)3000(Thermo Fisher Scientific)將人TROP2插入pQCXIN-DEN反轉錄病毒載體導入EcoPack2-293細胞株(TAKARA BIO)，回收上清液並使其感染CT26.WT。細胞於250μg/mL遺傳黴素(Geneticin)(Thermo Fisher Scientific)添加培養基中維持。
抗體、及抗體-CDN共軛物係藉由乙酸鹽緩衝液(10mM之乙酸鹽緩衝液，5%山梨糖醇，pH值為5.5)(Nacalai Tesque)進行稀釋而使用。
使CT26.WT-hTROP2細胞懸浮於生理鹽水中，將2.0×106個細胞皮下移植至BALB/c小鼠之右腋窩部(第0天)，7天後實施隨機分組。抗TROP2抗體1、及抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)以30μg/隻(相當於1.5mg/kg)之用量，抗TROP2抗體2、及抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)以3.0mg/kg之用量，於第7天尾靜脈內投予共計1次。又，將投予乙酸鹽緩衝液之組設定為媒劑組。各組之小鼠隻數設為8隻。
將抗TROP2抗體1及抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)之結果示於圖13。圖中之黑四角線表示媒劑組，白圈線表示參考例5中所製作之抗TROP2抗體1投予組，白倒三角線表示使抗TROP2抗體1與實施例1之化合物6b共軛而成之抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。於媒劑組及抗TROP2抗體1投予組中，腫瘤之增殖有進展。與此相對，於抗TROP2抗體1-CDN共軛物(1)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
將抗TROP2抗體2及抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)之結果示於圖14。圖中之黑四角線表示媒劑組，白圈線表示參考例6中所製作之抗TROP2抗體2投予組，白倒三角線表示使抗TROP2抗體2與實施例2之化合物34a共軛而成之抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。於媒劑組及抗TROP2抗體投予組中，腫瘤之增殖有進展。與此相對，於抗TROP2抗體2-CDN共軛物(1)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
根據以上，於抗TROP2抗體未表現出效果之藥效模型中，確認到藉由抗TROP2抗體-CDN共軛物之靜脈內投予所獲得之抗體標的依賴性之抗腫瘤效果。
(試驗例6)抗腫瘤試驗(2)
製作對自American Type Culture Collection公司購入之小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入人EGFR基因(NP_005219.2)而成之CT26.WT-hEGFR細胞。詳細而言，製作插入有人EGFR基因之pLVSIN慢病毒載體(TAKARA BIO)，使用Lentiviral High Titer Packaging Mix(TAKARA BIO)導入Lenti-X293T細胞株(TAKARA BIO)中，回收上 清液並使其感染CT26.WT。細胞於10μg/mL嘌呤黴素(Thermo Fisher Scientific)添加培養基中維持。
使CT26.WT-hEGFR細胞懸浮於生理鹽水中，將3×106個細胞皮下移植至BALB/c小鼠之右腋窩部(第0天)，12天後實施隨機分組。抗EGFR抗體1、抗EGFR抗體2、抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)、及抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)以1.5mg/kg之用量，於第12天尾靜脈內投予共計1次。又，將投予乙酸鹽緩衝液之組設定為媒劑組。各組之小鼠隻數設為8隻。
將結果示於圖15。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示參考例7中所製作之抗EGFR抗體1投予組，黑三角線表示抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示參考例8中所製作之抗EGFR抗體2投予組，黑圈線表示抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。媒劑組中腫瘤之增殖有進展。抗EGFR抗體1投予組、及抗EGFR抗體2投予組中未抑制腫瘤之增殖。與此相對，於抗EGFR抗體1-CDN共軛物(1)投予組、及抗EGFR抗體2-CDN共軛物(1)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
根據以上，使用抗EGFR抗體未表現出抗腫瘤效果之模型確認到抗EGFR抗體-CDN共軛物之較強之抗腫瘤效果。
(試驗例7)抗腫瘤試驗(3)
抗體、及抗體-CDN共軛物係藉由乙酸鹽緩衝液(10mM之乙酸鹽緩衝液，5%山梨糖醇，pH值為5.5)(Nacalai Tesque)進行稀釋而使用。
將自American Type Culture Collection公司購入之人類腎癌細胞株Caki-1(HTB-46)細胞懸浮於利用生理鹽水進行50%稀釋而成之 Matrigel(CORNING)中，將2.5×106個細胞皮下移植至BALB/c-nu小鼠之右腋窩部(第0天)，13天後實施隨機分組。抗CD70抗體1、抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)及抗CD70抗體2、抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)以1.5mg/kg之用量，於第13天尾靜脈內投予共計1次。又，將投予乙酸鹽緩衝液之組設定為媒劑組。各組之小鼠隻數設為8隻。
將結果示於圖22。圖中之抗CD70抗體1-共軛物(1)係使參考例3之抗CD70抗體1與實施例2之化合物34a共軛而成者，圖中之抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)係使參考例4之抗CD70抗體2與實施例2之化合物34a共軛而成者。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗CD70抗體1投予組，白倒三角線表示抗CD70抗體2投予組，白菱形線表示抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)投予組，白圈線表示抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。於媒劑組、抗CD70抗體1投予組、抗CD70抗體2投予組中，腫瘤之增殖有進展。與此相對，於抗CD70抗體1-CDN共軛物(1)投予組及抗CD70抗體2-CDN共軛物(1)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
根據以上，於抗CD70抗體未表現出效果之藥效模型中，任一抗CD70抗體-CDN共軛物之靜脈內投予均確認到抗體標的依賴性之抗腫瘤效果。
(試驗例8)抗腫瘤試驗(4)
抗體、及抗體-CDN共軛物係藉由乙酸鹽緩衝液(10mM之乙酸鹽緩衝液，5%山梨糖醇，pH值為5.5)(Nacalai Tesque)進行稀釋而使用。
使自American Type Culture Collection公司購入之人類腎癌細胞株A-498(HTB-44)細胞懸浮於生理鹽水中，將3.0×106個細胞皮下移植至 BALB/c-nu小鼠之右腋窩部(第0天)，於20天後實施隨機分組。抗CD70抗體2及抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)以1.0mg/kg之用量，於第20天尾靜脈內投予共計1次。又，將投予乙酸鹽緩衝液之組設定為媒劑組。各組之小鼠隻數設為6隻。
將結果示於圖23。圖中之抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)係使用藥物平均結合數約為2之MSG型糖鏈重塑抗體之抗體-CDN共軛物。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗CD70抗體2投予組，白倒三角線表示抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。於媒劑組中腫瘤之增殖有進展。抗CD70抗體2投予組未抑制腫瘤之增殖。與此相對，於抗CD70抗體2-CDN共軛物(2)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
根據以上，於抗CD70抗體未表現出效果之藥效模型中確認到抗CD70抗體-CDN共軛物之較強之抗腫瘤效果。
(試驗例9)抗腫瘤試驗(5)
製作對自American Type Culture Collection公司購入之小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入將抗EGFR抗體1之表位部位置換為人型之人小鼠嵌合EGFR基因(NP_005219.2)而成之CT26.WT-嵌合EGFR細胞。詳細而言，製作插入有人小鼠嵌合EGFR基因之pLVSIN慢病毒載體(TAKARA BIO)，使用Lentiviral High Titer Packaging Mix(TAKARA BIO)導入至Lenti-X293T細胞株(TAKARA BIO)中，回收上清液並使其感染CT26.WT。細胞於2μg/mL嘌呤黴素(Thermo Fisher Scientific)添加培養基中維持。
使CT26.WT-嵌合EGFR細胞懸浮於生理鹽水中，將1×106個細胞皮下 移植至BALB/c小鼠之右腋窩部(第0天)，於7天後實施隨機分組。化合物34a以0.01mg/kg之用量，抗EGFR抗體1以0.98mg/kg之用量，抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)以1.0mg/kg之用量，於第7天尾靜脈內投予共計1次。化合物編號34a及抗EGFR抗體1之投予量為構成抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)之各成分之當量。又，將投予乙酸鹽緩衝液之組設定為媒劑組。各組之小鼠隻數設為8隻。
將結果示於圖24。圖中之抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)係使用藥物平均結合數約為2之MSG型糖鏈重塑抗體之抗體-CDN共軛物。圖中之黑四角線表示媒劑組，白三角線表示抗EGFR抗體1投予組，白菱形線表示化合物34a投予組，白四角線表示抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)投予組。縱軸表示腫瘤體積(mm3)，橫軸表示腫瘤移植後之天數。媒劑組中腫瘤之增殖有進展。化合物34a投予組及抗EGFR抗體1投予組中未抑制腫瘤之增殖。與此相對，於抗EGFR抗體1-CDN共軛物(2)投予組中，腫瘤之增殖被顯著抑制。
根據以上，使用抗EGFR抗體未表現出抗腫瘤效果之模型確認到抗EGFR抗體-CDN共軛物之較強之抗腫瘤效果。
產業上之可利用性
根據本發明，可提供一種包含具有較強之STING促效劑活性且表現出較強之抗腫瘤效果之新穎CDN衍生物的抗體藥物共軛物。該抗體藥物共軛物可用作與STING促效劑活性相關之疾病(例如，癌症)之治療劑。
序列表非關鍵文字
序列編號1：抗CD70抗體1之輕鏈之胺基酸序列
序列編號2：抗CD70抗體1之重鏈之胺基酸序列
序列編號3：抗CD70抗體2之輕鏈之胺基酸序列
序列編號4：抗CD70抗體2之重鏈之胺基酸序列
序列編號5：抗TROP2抗體1之輕鏈之胺基酸序列
序列編號6：抗TROP2抗體1之重鏈之胺基酸序列
序列編號7：抗TROP2抗體2之輕鏈之胺基酸序列
序列編號8：抗TROP2抗體2之重鏈之胺基酸序列
序列編號9：抗EGFR抗體1之輕鏈之胺基酸序列
序列編號10：抗EGFR抗體1之重鏈之胺基酸序列
序列編號11：抗EGFR抗體2之輕鏈之胺基酸序列
序列編號12：抗EGFR抗體2之重鏈之胺基酸序列
序列編號13：人野生型STING之胺基酸序列
序列編號14：人野生型STING之核苷酸序列
序列編號15：人H232(REF)變異型STING之胺基酸序列
序列編號16：人H232(REF)變異型STING之核苷酸序列
序列編號17：人HAQ變異型STING之胺基酸序列
序列編號18：人HAQ變異型STING之核苷酸序列
序列編號19：小鼠STING之胺基酸序列
序列編號20：小鼠STING之核苷酸序列
序列編號21：HisAviTEV-hSTING(139-342)人野生型蛋白質之胺基酸序列
序列編號22：HisAviTEV-hSTING(139-342)人REF變異型蛋白質之胺基酸序列
序列編號23：HisAviTEV-hSTING(139-342)人HAQ變異型蛋白質之胺基酸序列
序列編號24：His-Avi-TEV-mSTING(138-341)小鼠野生型蛋白質之胺基酸序列
序列編號25~34：引子之序列
序列編號35：抗CD70抗體1之CDRL1之胺基酸序列
序列編號36：抗CD70抗體1之CDRL2之胺基酸序列
序列編號37：抗CD70抗體1之CDRL3之胺基酸序列
序列編號38：抗CD70抗體1之CDRH1之胺基酸序列
序列編號39：抗CD70抗體1之CDRH2之胺基酸序列
序列編號40：抗CD70抗體1之CDRH3之胺基酸序列
序列編號41：抗CD70抗體2之CDRL1之胺基酸序列
序列編號42：抗CD70抗體2之CDRL2之胺基酸序列
序列編號43：抗CD70抗體2之CDRL3之胺基酸序列
序列編號44：抗CD70抗體2之CDRH1之胺基酸序列
序列編號45：抗CD70抗體2之CDRH2之胺基酸序列
序列編號46：抗CD70抗體2之CDRH3之胺基酸序列
序列編號47：抗TROP2抗體1之CDRL1之胺基酸序列
序列編號48：抗TROP2抗體1之CDRL2之胺基酸序列
序列編號49：抗TROP2抗體1之CDRL3之胺基酸序列
序列編號50：抗TROP2抗體1之CDRH1之胺基酸序列
序列編號51：抗TROP2抗體1之CDRH2之胺基酸序列
序列編號52：抗TROP2抗體1之CDRH3之胺基酸序列
序列編號53：抗TROP2抗體2之CDRL1之胺基酸序列
序列編號54：抗TROP2抗體2之CDRL2之胺基酸序列
序列編號55：抗TROP2抗體2之CDRL3之胺基酸序列
序列編號56：抗TROP2抗體2之CDRH1之胺基酸序列
序列編號57：抗TROP2抗體2之CDRH2之胺基酸序列
序列編號58：抗TROP2抗體2之CDRH3之胺基酸序列
序列編號59：抗EGFR抗體1之CDRL1之胺基酸序列
序列編號60：抗EGFR抗體1之CDRL2之胺基酸序列
序列編號61：抗EGFR抗體1之CDRL3之胺基酸序列
序列編號62：抗EGFR抗體1之CDRH1之胺基酸序列
序列編號63：抗EGFR抗體1之CDRH2之胺基酸序列
序列編號64：抗EGFR抗體1之CDRH3之胺基酸序列
序列編號65：抗EGFR抗體2之CDRL1之胺基酸序列
序列編號66：抗EGFR抗體2之CDRL2之胺基酸序列
序列編號67：抗EGFR抗體2之CDRL3之胺基酸序列
序列編號68：抗EGFR抗體2之CDRH1之胺基酸序列
序列編號69：抗EGFR抗體2之CDRH2之胺基酸序列
序列編號70：抗EGFR抗體2之CDRH3之胺基酸序列
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (58)

  1. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式(II)表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0288-11
     (式中，m1為1至10之範圍，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，該抗體之糖鏈可經重塑，(此處，抗體表示選自由抗CD70抗體、及抗EGFR抗體所組成之群中之任一抗體)L表示將Ab與D連結之連接子，Ab可自其胺基酸殘基直接鍵結於L，或可自Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結於L，D表示以下式(I)所表示之化合物：
    Figure 110108019-A0305-02-0288-12
     (此處，L與L1所含之任意之-NH2或羥基鍵結，L1表示以下3式之任一基：[化3]
    Figure 110108019-A0305-02-0289-13
     (此處，波形線表示取代位置)，Q及Q'分別獨立地表示羥基或硫醇基，R21及R22分別獨立地表示羥基或氟原子，W表示-NH-或硫原子))。
  2. 如請求項1之抗體藥物共軛物，其中D由以下2式之任一者表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0289-14
     (此處，L1、Q、Q'及W如上文所定義)。
  3. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由以下4式之任一者表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0289-15
     (此處，星號表示與L鍵結，Q、Q'及W如上文所定義)。
  4. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由以下3式之任一者表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0290-16
     (此處，星號表示與L鍵結，W如上文所定義)。
  5. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由以下3式之任一者表示：[化7]
    Figure 110108019-A0305-02-0291-17
     (此處，星號表示與L鍵結)。
  6. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由以下4式之任一者表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0291-18
     (此處，星號表示與L鍵結)。
  7. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0292-19
     (此處，星號表示與L鍵結)。
  8. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由以下2式之任一者表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0292-20
     (此處，星號表示與L鍵結，W如上文所定義)。
  9. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中D由下述4式之任一者表示：[化11]
    Figure 110108019-A0305-02-0293-21
     (此處，星號表示與L鍵結)。
  10. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中連接子L由-Lb-La-Lp-Lc-*表示，式中，星號表示與藥物D鍵結，Lp表示包含可於標的細胞中切斷之胺基酸序列之連接子或不存在，La表示選自以下群中之任一者：-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-、及-(CH2)n9-C(=O)-(此處，n2表示1~3之整數，n3表示1~5之整數，n4表示0~2之整 數，n9表示2~7之整數)，Lb表示將La與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結之間隔子或將La與Ab之半胱胺酸殘基鍵結之間隔子，以及Lc表示-NH-CH2-、-NH-苯基-CH2-O(C=O)-或-NH-雜芳基-CH2-O(C=O)-或不存在。
  11. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中Lc為-NH-CH2-。
  12. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中Lp為-GGFG-、-GGPI-、-GGVA-、-GGFM-、-GGVCit-、-GGFCit-、-GGICit-、-GGPL-、-GGAQ-或-GGPP-之任一者。
  13. 如請求項12之抗體藥物共軛物，Lp為-GGFG-或-GGPI-。
  14. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中La表示選自由以下：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)4-CH2-C(=O)-、及-(CH2)5-C(=O)-所組成之群中之任一者。
  15. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中Lb由下式之任一者表示：[化12]
    Figure 110108019-A0305-02-0295-22
     或者
    Figure 110108019-A0305-02-0295-23
     (於上述所表示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)。
  16. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中Lb為-(丁二醯亞胺-3-基-N)-，此處，-(丁二醯亞胺-3-基-N)-表示以下結構式：
    Figure 110108019-A0305-02-0295-24
     此處，星號表示與La鍵結，波形線表示與抗體之半胱胺酸殘基之側鏈形成硫醚而鍵結。
  17. 如請求項10之抗體藥物共軛物，其中連接子L由-Lb-La-Lp-Lc-*表示，式中，星號表示與藥物D鍵結， Lp為-GGFG-、或-GGPI-，La表示-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-，Lb表示下式：
    Figure 110108019-A0305-02-0296-25
     (於上述所表示之Lb之結構式中，星號表示與La鍵結，波形線表示與Ab之糖鏈或經重塑之糖鏈鍵結)，Lc表示-NH-CH2-。
  18. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為1至10之範圍。
  19. 如請求項18之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為1至5之範圍。
  20. 如請求項19之抗體藥物共軛物，其中抗體藥物共軛物中之每1分子抗體之平均藥物結合數為3至5之範圍。
  21. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中抗體自抗體之Asn297鍵結之糖鏈(N297糖鏈)鍵結於L。
  22. 如請求項21之抗體藥物共軛物，其中N297糖鏈為經重塑之糖鏈。
  23. 如請求項21之抗體藥物共軛物，其中N297糖鏈為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG：
    Figure 110108019-A0305-02-0297-26
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5為2~5之整數；
    Figure 110108019-A0305-02-0297-27
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5為2~5之整數。
  24. 如請求項21之抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0298-28
     (式中，m2表示1或2之整數，L為將Ab之N297糖鏈與D連結之連接子，如上文所定義，Ab表示抗CD70抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG，
    Figure 110108019-A0305-02-0298-29
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
    Figure 110108019-A0305-02-0298-30
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結， L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數，D由以下4式之任一者表示，
    Figure 110108019-A0305-02-0299-31
     此處，式中，星號表示與L鍵結)。
  25. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其係選自下式：[化22]
    Figure 110108019-A0305-02-0300-32
    Figure 110108019-A0305-02-0301-33
     於上述所表示之各結構式中，m2表示為1或2之整數，Ab表示抗CD70抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG之任一者，
    Figure 110108019-A0305-02-0301-34
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結， L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
    Figure 110108019-A0305-02-0302-35
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數。
  26. 如請求項25之抗體藥物共軛物，其係選自下式：[化25]
    Figure 110108019-A0305-02-0303-36
    Figure 110108019-A0305-02-0304-37
     於上述所表示之各結構式中，m2表示為1或2之整數，Ab表示抗CD70抗體、或抗EGFR抗體或者該等抗體之功能性片段，Ab之N297糖鏈表示為具有下式所表示之結構之N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)SG之任一者，
    Figure 110108019-A0305-02-0304-38
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結， L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數；
    Figure 110108019-A0305-02-0305-39
     式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，及n5表示2~5之整數。
  27. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中抗體或該抗體之抗原結合片段為抗CD70抗體或該抗體之抗原結合片段。
  28. 如請求項1或2之抗體藥物共軛物，其中抗體或該抗體之抗原結合片段為抗EGFR抗體或該抗體之抗原結合片段。
  29. 如請求項27之抗體藥物共軛物，其中抗體為含有包含序列編號1所記 載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體、或含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體。
  30. 如請求項28之抗體藥物共軛物，其中抗體為含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體、或含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體。
  31. 如請求項27之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  32. 如請求項28之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至 116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  33. 如請求項27之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3。
  34. 如請求項28之抗體藥物共軛物，其中抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；或為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號 68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3。
  35. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0308-40
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：含有包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體； 含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0309-41
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為2)。
  36. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化30]
    Figure 110108019-A0305-02-0310-42
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺 基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0311-43
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為2)。
  37. 如請求項36之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  38. 如請求項36之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而 成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  39. 如請求項36之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  40. 如請求項36之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  41. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化32]
    Figure 110108019-A0305-02-0313-44
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之 CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0314-45
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及 m2為2)。
  42. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0315-46
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：含有包含序列編號1所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號2所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號3所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號4所 記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號9所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號10所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；含有包含序列編號11所記載之胺基酸序列之輕鏈及包含序列編號12所記載之胺基酸序列之重鏈的抗體；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0316-47
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為1)。
  43. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化36]
    Figure 110108019-A0305-02-0317-50
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺 基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0318-51
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結，n5為3，及m2為1)。
  44. 如請求項43之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號1中胺基酸編號1至112所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區、上述重鏈含有包含序列編號2中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  45. 如請求項43之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號3中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號4中胺基酸編號1至118所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  46. 如請求項43之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號9中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號10中胺基酸編號1至119所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  47. 如請求項43之抗體藥物共軛物，其中該抗體為包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號11中胺基酸編號1至108所記載之胺基酸序列之輕鏈可變區，上述重鏈含有包含序列編號12中胺基酸編號1至116所記載之胺基酸序列之重鏈可變區。
  48. 一種抗體藥物共軛物，其係以下式表示：[化38]
    Figure 110108019-A0305-02-0320-53
     式中，Ab表示選自以下群中之任一者：包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號35所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號36所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號37所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號38所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號39所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號40所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號41所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號42所記載之胺基酸序列之 CDRL2、及包含序列編號43所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號44所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號45所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號46所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號59所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號60所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號61所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號62所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號63所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號64所記載之胺基酸序列之CDRH3；包含如下輕鏈及重鏈而成之抗體，上述輕鏈含有包含序列編號65所記載之胺基酸序列之CDRL1、包含序列編號66所記載之胺基酸序列之CDRL2、及包含序列編號67所記載之胺基酸序列之CDRL3，上述重鏈含有包含序列編號68所記載之胺基酸序列之CDRH1、包含序列編號69所記載之胺基酸序列之CDRH2、及包含序列編號70所記載之胺基酸序列之CDRH3；Ab之N297糖鏈由下式表示：
    Figure 110108019-A0305-02-0321-54
     (式中，波形線表示與抗體之Asn297鍵結，L(PEG)表示-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-NH-，表示該L(PEG)之右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側兩者之非還原末端之唾液酸的2位之羧基進行醯胺鍵結，星號表示與上述連接子L中之Lb之1,2,3-三唑環上的1位或3位之氮原子鍵結， n5為3，及m2為1)。
  49. 如請求項1、2、35至48中任一項之抗體藥物共軛物，其中於重鏈羧基末端缺失1或2個胺基酸。
  50. 如請求項1、2、35至48中任一項之抗體藥物共軛物，其中抗體或該抗體之抗原結合片段為使用以基因工程方式經改型之基因於適當之宿主細胞中產生之蛋白質。
  51. 一種STING促效劑，其含有如請求項1至50中任一項之抗體藥物共軛物。
  52. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至50中任一項之抗體藥物共軛物。
  53. 一種抗腫瘤劑，其含有如請求項1至50中任一項之抗體藥物共軛物。
  54. 如請求項53之抗腫瘤劑，其中腫瘤為肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、睾丸癌、子宮頸癌、胎盤絨毛膜癌、腦瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、間皮瘤、胃腸道間質腫瘤(GIST)、膽囊癌、膽管癌、腎上腺癌、鱗狀細胞癌、咽癌、舌癌、聽覺器 官癌、胸腺癌、小腸癌、白血病、惡性淋巴瘤、漿細胞瘤、骨髓瘤或肉瘤。
  55. 如請求項53或54之抗腫瘤劑，其中腫瘤為肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、攝護腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、子宮頸癌、腦瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、間皮瘤、胃腸道間質腫瘤(GIST)、膽囊癌、膽管癌、鱗狀細胞癌、咽癌、舌癌、胸腺癌或小腸癌。
  56. 如請求項27之抗體藥物共軛物，其於皮下移植了人類腎癌細胞株Caki-1細胞之BALB/c-nu小鼠中發揮出抗體標的依賴性之抗腫瘤效果。
  57. 如請求項42至48中任一項之抗體藥物共軛物，其於下述(i)或(ii)所記載之動物中發揮出比抗體藥物共軛物所含之抗體更強之抗腫瘤效果：(i)皮下移植有小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)之BALB/c小鼠，該小鼠大腸癌細胞株CT26.WT(CRL2638)導入有該抗體藥物共軛物所含之抗體所結合之抗原上之表位部位被置換為人型而成之人鼠嵌合抗原之基因；(ii)皮下移植有人類腎癌細胞株A-498(HTB-44)細胞之BALB/c-nu小鼠。
  58. 一種如請求項1至50中任一項之抗體藥物共軛物、請求項51之STING促效劑、請求項52之醫藥組合物、或者是請求項53或54之抗腫瘤劑之用途，其係用於製造癌症治療用醫藥。
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