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KR20100082042A - Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체 - Google Patents

Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체 Download PDF

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KR20100082042A
KR20100082042A KR1020107014840A KR20107014840A KR20100082042A KR 20100082042 A KR20100082042 A KR 20100082042A KR 1020107014840 A KR1020107014840 A KR 1020107014840A KR 20107014840 A KR20107014840 A KR 20107014840A KR 20100082042 A KR20100082042 A KR 20100082042A
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토마스 투스클
필립 에이. 샤프
필립 디. 자모어
데이비드 피. 바텔
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화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치
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Abstract

본 발명은 dsRNA가 21 내지 23개 누클레오티드(nt) 길이의 RNA 세그먼트로 프로세싱됨을 입증하기 위해 사용되는 드로소필라(Drosophila) 시험관내 시스템에 관한 것이다. 또한, 이들 21 내지 23개 nt 단편들이 정제되어 드로소필라 추출물에 도로 첨가되는 경우, 이들은 긴 dsRNA의 부재하에 RNA 간섭을 매개한다. 따라서, 이들 21 내지 23개 nt 단편들은 RNA 분해의 서열 특이적인 매개체이다. 이들의 특정 길이일 수 있는 분자적 시그널이 RNAi에 포함된 세포성 인자를 보충하기 위해 이들 21 내지 23개 nt 단편내에 존재하는 것이 틀림없다. 본 발명은 이러한 21 내지 23개 nt 단편 및 유전자 기능을 특이적으로 불활성화시키기 위한 이들의 용도를 포함한다. 이들 단편(또는 동일하거나 유사한 성질의 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드)의 사용은 포유류 세포에서 분해를 위해 특이적인 mRNA를 표적화하도록 해주며, 여기서 RNAi를 일으키기 위해 긴 dsRNA를 사용하는 것은 보편적으로 실용적이지 못한데, 그 이유는 추측상 인터페론 반응의 유해한 영향 때문이다. 특정 유전자 기능의 이러한 특이적인 표적화는 기능 유전체학적 적용 및 치료학적 적용에 유용하다.

Description

ＲＮＡ 간섭의 ＲＮＡ 서열 특이적인 매개체{RNA SEQUENCE-SPECIFIC MEDIATORS OF RNA INTERFERENCE}
본 발명은 dsRNA가 21 내지 23개 누클레오티드(nt) 길이의 RNA 세그먼트로 프로세싱됨을 입증하기 위해 사용되는 드로소필라(Drosophila) 시험관내 시스템에 관한 것이다.
RNA 간섭 또는 "RNAi"는, 이중 가닥의 RNA(dsRNA)가 웜(worm) 내로 도입될 경우 유전자 발현을 차단할 수 있다는 관찰을 설명하기 위해 파이어(Fire)와 공동 연구자에 의해 최초로 만들어진 용어이다 [참조: Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811]. dsRNA는 척추 동물을 포함하는 다수의 생물체에서 유전자 특이적인 후-전사 침묵을 유도하고, 유전자 기능을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공하였다. RNAi는 mRNA 분해를 포함하나, 이러한 간섭의 기초를 이루는 다수의 생화학적인 메카니즘은 알려지지 않고 있다. 상기 현상을 생화학적으로 분석하기 위해, 시험관 내에서 RNAi의 본질적인 특성을 재현해야할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 합포성 포배엽 드로소필라(Drosophila) 배아로부터 유래한 무세포 시스템에서 유전자 특이적인 dsRNA-매개된 간섭에 관한 것이다. 상기 시험관내 시스템은 RNAi의 분자적 기초를 분석하기 위한 유전학적 방법을 완전하게 한다. 본원에서 기술한 바와 같이, RNAi의 기초를 이루는 분자 메카니즘을 시험관내 시스템에서 드로소필라를 사용하여 조사하였다. 결과는 RNAi가 ATP에 의존적이지만 mRNA 번역과 커플링되지 않았음을 보여주었다. 말하자면, 시험관 내의 RNAi에 대해서는 단백질 합성이 요구되지 않는다. RNAi 반응에서 dsRNA의 양 가닥(센스 및 안티센스)은 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드(nt) 길이를 갖는 작은 RNA 단편 또는 세그먼트(segment)로 프로세싱된다(시퀀싱 겔에서 이동성을 갖는 RNA는 21 내지 23 nt의 길이를 갖는 마커에 상응하는데, 임의적으로 이것을 21 내지 23 nt RNA라 칭한다). dsRNA를 작은 RNA 단편으로 프로세싱하는 것은 표적화된 mRNA가 필요하지 않으며, 이러한 사실로부터 작은 RNA 종이 dsRNA의 프로세싱에 의해 형성되며, 이것은 dsRNA-표적화된 mRNA 분해의 산물이 아님이 입증되었다. mRNA는 dsRNA와 동일성인 영역 내에서만 절단된다. 절단은 21 내지 23개 뉴클레오티드 만큼 떨어진 위치에서 일어나며, dsRNA 자체에 대해서도 동일한 간격이 관찰되는데, 이는 dsRNA로부터의 21 내지 23개 뉴클레오티드 단편이 mRNA의 절단을 유도한다는 것을 시사한다. 정제된 21 내지 23 nt RNA가 RNAi를 매개한다는 것은 이러한 단편이 mRNA 절단을 유도함을 확인시켜준다.
따라서, 본 발명은 RNAi를 매개하는 약 21 내지 23개 뉴클레오티드의 분리된 RNA 분자(이중 가닥; 단일 가닥)에 관한 것이다. 말하자면, 본 발명의 분리된 RNA는 이에 상응하는 유전자의 mRNA의 분해를 매개한다(유전자의 전사 생성물인 mRNA의 분해를 매개하는데, 이러한 유전자는 표적 유전자라고 하기도 한다). 간단히, 본원에서는 이러한 mRNA를 분해시키려는 mRNA라고 칭하였다. 본원에서 사용된 바와 같이, RNA, RNA 분자(들), RNA 세그먼트(들) 및 RNA 단편(들)이라는 용어들은 RNA 간섭을 매개하는 RNA를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어에는 이중 가닥의 RNA, 단일 가닥의 RNA, 분리된 RNA(부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA) 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 RNA와는 상이한 변경된 RNA가 포함된다. 이러한 변경에는 비뉴클레오티드 물질을 21 내지 23 nt RNA의 말단(들)에 또는 내부(RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서)에 첨가시키는 것이 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 RNA 분자 중의 뉴클레오티드는 비천연 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 모든 변경된 RNA를 총칭하여 유사체 또는 천연 RNA의 유사체라고 한다. 본 발명의 21 내지 23 뉴클레오티드의 RNA는 RNAi를 매개하는 능력을 갖는 천연 RNA와 단지 충분히 유사하기만 하면 된다. 본원에 사용된 "RNAi를 매개하다"란 구문은, 어떠한 RNA가 RNAi 기구 또는 프로세스에 의해 분해되어야 하는 지를 구별하는 능력을 의미한다(나타낸다). RNAi를 매개하는 RNA는, 이것이 특정 mRNA를 분해시키는 기구를 유도하도록 RNAi 기구와 상호 작용한다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 상응하는 특이적인 mRNA의 절단을 유도하는 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA 분자에 관한 것이다. 서열이 완벽하게 상응할 필요는 없으나, 이러한 상응성(correspondence)은 RNA가 표적 mRNA의 RNAi 절단을 유도할 수 있을 만큼 충분해야 한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 21 내지 23 nt의 RNA 분자는 3' 하이드록실기를 포함한다.
또한, 본 발명은 RNAi 절단을 매개하는 능력을 갖는 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 시험관내 시스템에서 드로소필라가 사용된다. 본 구체예에서, dsRNA는 드로소필라 배아로부터 유래한 가용성 추출물과 배합되어, 배합물을 생성한다. 이 배합물은, dsRNA가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드의 RNA 분자로 프로세싱되는 조건 하에서 유지된다. 또 다른 구체예에서, 특정 유전자(예를 들어, 종양 유전자, 바이러스 유전자)의 mRNA의 RNA 간섭을 매개하는 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA 서열을 얻는데, 시험관 시스템 내에서 드로소필라가 사용된다. 본 구체예에서, 표적화시키려는 유전자 서열에 상응하는 이중 가닥의 RNA가 드로소필라 배아로부터 유래한 가용성 추출물과 배합되어, 배합물을 생성한다. 이 배합물은, 이중 가닥 RNA가 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 RNA로 프로세싱되는 조건하에서 유지된다. 본원에서 알 수 있는 바와 같이, 21 내지 23 nt의 RNA는 표적화된 유전자(mRNA가 분해될 유전자)의 mRNA의 RNAi를 매개한다. 시험관 시스템 내에서 드로소필라를 사용하여 21 내지 23 nt의 RNA를 수득하기 위한 방법은 상기 배합물로부터 RNA 서열을 분리시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, RNAi를 매개하는 본 발명의 방법으로 생성된 것들과 같은 천연 RNA와 동일하거나 사실상 동일한 서열을 갖는 본 발명의 방법으로 생성된 21 내지 23 nt의 RNA 뿐만 아니라, 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술과 같은 그밖의 방법으로 생성된 21 내지 23 nt의 RNA에 관한 것이다. 이들 모두를 RNA 간섭을 매개하는 21 내지 23 nt의 RNA라고 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분리된 RNA"에는 본원에 기술된 바와 같은 dsRNA의 절단 또는 프로세싱; 화학적 합성 방법에 의한 생성; 및 재조합 DNA 기술에 의한 생성을 포함하는 임의의 수단으로 수득된 RNA가 포함된다. 또한, 본 발명은 치료학적 또는 예방학적 처리용과 같은 21 내지 23 nt의 RNA의 용도, 및 21 내지 23 nt의 RNA와 적절한 담체(예를 들어, 완충액 또는 물)를 포함하는 약제학적 조성물과 같은, RNAi를 매개하는 21 내지 23 nt의 RNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세포 또는 생물체(예를 들어, 마우스 또는 사람과 같은 포유 동물) 중의 유전자의 mRNA의 RNA 간섭을 매개하는 방법에 관한 것이다. 하나 구체예에서, 분해시키려는 mRNA를 표적으로 하는 약 21 내지 약 23 nt의 RNA가 세포 또는 생물체 내로 도입된다. 상기 세포 또는 생물체는 mRNA의 분해가 일어나는 조건 하에서 유지되어, 세포 또는 생물체 중의 유전자의 mRNA의 RNA 간섭을 매개한다. 상기 세포 또는 생물체는, 세포 또는 생물체가 수득될 때 RNAi가 일어나는 것일 수 있거나, RNAi가 일어나도록 변형된 (예를 들어, RNAi를 매개하는 세포 또는 세포 추출물로부터 수득된 성분을 첨가하거나, 내인성 성분을 활성화시킴으로써) 것일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "RNAi가 일어나는 세포 또는 생물체"에는 세포 또는 생물체가 수득될 때 RNAi가 일어나는 세포 또는 생물체 뿐만 아니라 RNAi가 일어나도록 변형된 세포 또는 생물체 모두가 포함된다. 또 다른 구체예에서, 세포 중의 유전자의 RNA 간섭을 매개하는 방법은, 드로소필라 배아로부터 유래한 가용성 추출물과 상기 유전자의 서열에 상응하는 이중 가닥의 RNA를 배합시켜, 배합물을 생성하는 것을 포함한다. 이 배합물은 이중 가닥의 RNA가 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA로 프로세싱되는 조건하에서 유지된다. 그런 다음, 21 내지 23 nt RNA를 분리시키고, 세포 또는 생물체 내로 도입시킨다. 이러한 세포 또는 생물체를, 유전자의 mRNA가 분해되어 세포 또는 생물체 중의 유전자 RNA 간섭을 매개하는 조건하에서 유지한다. 이전 구체예에 대해서 설명한 바와 같이, 세포 또는 생물체는 RNAi가 (수득된 세포 또는 생물체 내에서) 자연적으로 발생된 것이거나, RNAi가 일어나도록 하는 방식으로 변형된 것이다. 21 내지 23 nt의 RNA는 또한 화학적 합성 방법 또는 재조합 DNA 기술과 같은 그밖의 방법에 의해 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 dsRNA를 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드로 프로세싱하는 드로소필라 세포와 같은 세포의 생화학적 성분에 관한 것이다. 또한, mRNA를 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA로 표적화시키는 것에 관여하는 세포의 생화학적 성분이 본 발명의 주제이다. 두가지 모두의 구체예에서, 생화학적 성분은 이러한 성분이 발생하거나 화학적 합성 또는 재조합 DNA 방법과 같은 그밖의 방법으로 생성될 수 있는 세포로부터 수득될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "분리된"이란 용어에는 이들이 발생하는 공급원으로부터 수득된 물질(예를 들어, 생화학적 성분, RNA) 및 화학적 합성 또는 재조합 핵산(DNA, RNA) 방법과 같은 방법으로 생성된 물질이 포함된다.
또한, 본 발명은 표적화된 유전자를 (부분적으로 또는 전체적으로) 녹다운(knock down)시켜, 현재 활용되고 있는 유전자(들)의 녹다운(또는 녹아웃) 방법에 대한 대안책을 제공하기 위한 방법에 관한 것이다. 유전자 발현을 녹다운시키는 이러한 방법을 치료학적으로 사용하거나 (예를 들어, 질병의 상태를 나타내는 모델을 생성시키고, 유전자 기능을 조사하고, 작용제가 유전자에 대해서 작용하는 지의 여부를 평가하고, 그리고 약물 발견에 대한 표적을 확인하기 위한) 연구를 목적으로 사용할 수 있다. 유전자 기능이 제거되는 그러한 예에서, 생성되는 세포 또는 생물체는 녹아웃(knockout)이라고 일컬어진다. 녹다운시킨 세포 및 생물체를 생성하는 방법 중의 하나의 구체예는, 유전자(표적화된 유전자라고 칭함)를 녹다운시킬 세포 또는 생물체 내로 상기 유전자를 표적화하는 약 21 내지 약 23 nt의 RNA를 도입시키는 단계 및 생성되는 세포 또는 생물체를 RNAi가 일어나는 조건하에서 유지시켜서, 표적화된 유전자의 mRNA를 분해시킴으로써 녹다운된 세포 또는 생물체를 생성하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법으로 생성된 녹다운된 세포 및 생물체 또한 본 발명의 주제이다.
본 발명은 또한, 세포 또는 생물체에서 유전자의 기능을 시험하거나 평가하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 분해를 위해 유전자의 mRNA를 표적화시킨 약 21 내지 약 23nt의 RNA를 RNAi가 발생하는 세포 또는 생물체로 도입시켰다. 세포 또는 생물체는 시험 세포 또는 생물체로 일컬어진다. 시험 세포 또는 생물체를 유전자의 mRNA 분해가 발생하는 조건하에 유지시켰다. 그 후, 시험 세포 또는 생물체의 표현형을 관찰하고, 표적화된 (특이적) 유전자가 표적화되지 않았다는 점을 제외하고는 동일한 방식으로 처리된 상응하는 세포 또는 생물체와 같은 적합한 대조 세포 또는 생물체의 표현형과 비교하였다. 반드시 그럴 필요는 없지만, 분해를 위해 mRNA를 표적화하지 않는 21 내지 23nt RNA를 시험 세포 또는 생물체로 도입된 RNA 대신 대조 세포 또는 생물체로 도입시킬 수 있다. 시험 세포 또는 생물체와 대조 세포 또는 생물체의 표현형의 차이는 분해된 mRNA의 기능에 대한 정보를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 유전자의 서열에 상응하는 이중 가닥 RNA를, 이중 가닥 RNA가 약 21 내지 약 23개의 누클레오티드의 RNA를 생성하도록 프로세싱되는 조건하에서 본원에 설명된 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 같은 RNAi를 매개하는 가용성 추출물과 배합시켰다. 약 21 내지 약 23 누클레오티드의 RNA를 분리하고, RNAi가 발생하는 세포 또는 생물체로 도입시켰다(시험 세포 또는 시험 생물체). 시험 세포 또는 시험 생물체를 mRNA의 분해가 발생하는 조건하에 유지시켰다. 그 후, 시험 세포 또는 생물체의 표현형을 관찰하고, 표적화된 유저자가 표적화되지 않는다는 점을 제외하고는 시험 세포 또는 생물체에서와 동일한 방식으로 처리된 상응하는 세포 또는 생물체와 같은 적합한 대조표준의 표현형과 비교하였다. 시험 세포 또는 생물체와 대조표준 세포 또는 생물체의 표현형의 차는 표적화된 유전자의 기능에 대한 정보를 제공한다. 제공된 정보는 유전자의 기능을 확인(규정)하기에 충분할 수 있거나, 이를 위해 다른 검정 또는 분석으로부터 수득된 정보와 함께 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 주제는 작용제가 유전자에 작용하는지의 여부를 확인하는 방법이다. 이러한 방법에서, 분해시키려는 mRNA를 표적화하는 약 21 내지 약 23 누클레오티드의 RNA를 RNAi가 발생하는 세포 또는 생물체에 도입시켰다. 세포 또는 생물체(도입된 RNA를 함유)를 mRNA 분해가 발생하는 조건하에 유지시키고, 작용제를 세포 또는 생물체에 도입시켰다. 작용제가 세포 또는 생물체에 영향을 끼치는 지를 측정하였는데, 작용제가 세포 또는 생물체에 영향을 끼치지 않는 경우, 이는 유전자에 작용을 한다.
본 발명은 또한, 유전자 생성물이 약물 발견 또는 개발을 위한 표적인지의 여부를 확인하는 방법을 제공한다. 분해를 위한 유전자에 상응하는 mRNA를 표적화시키는 약 21 내지 약 23 누클레오티드의 RNA를 세포 또는 생물체에 도입시켰다. 세포 또는 생물체를, 유전자의 감소된 발현을 초래하는 mRNA 분해가 발생하는 조건하에 유지시켰다. 유전자의 감소된 발현이 세포 또는 생물체에 영향을 끼치는 지의 여부를 측정하였는데, 유전자의 감소된 발현이 영향을 끼치는 경우, 유전자 생성물은 약물 발견 또는 개발을 위한 표적이다.
또한, 본 발명은 분해를 위해 단백질의 mRNA(단백질을 엔코딩하는 mRNA)를 표적화하는 약 21 내지 약 23 누클레오티드의 RNA를 개체에 투여하는 것을 포함하여, 개체에서 단백질의 존재와 관련된 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 그 결과, 단백질은 치료 부재시 발생하는 정도까지 생성되지 않거나 전혀 생성되지 않는다.
또한, 본 발명은 RNA 간섭을 매개하는 21 내지 23개의 내인성 누클레오티드 RNA 분자의 시퀀싱에 의해 확인된 유전자를 포함한다.
또한, 본 발명은 RNAi에 특히 적합한 mRNA내의 표적 위치를 확인하는 방법 및 RNAi를 매개하는 21-23nt RNA의 능력을 평가하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
이중 가닥 RNA(dsRNA)는 RNA 간섭(RNAi)으로서 공지된 프로세스를 통해 mRNA의 서열 특이적 분해를 유도한다. 이러한 프로세스는 포유 동물 및 다른 척추동물의 배아를 포함하는 광범위한 생물체에서 일어나는 것으로 공지되어 있다. 본원에 기술된 시험관내 시스템에서 드로소필라를 사용하므로써, dsRNA가, 길이가 21 내지 23개 누클레오티드(nt)인 RNA 세그먼트로 프로세싱되고, 추가로, 21 내지 23 nt 단편이 정제되어 드로소필라 추출물에 다시 첨가되는 경우, 이들이 보다 긴 dsRNA의 부재하에 RNA 간섭을 매개함이 입증되었다. 따라서, 이러한 21 내지 23 nt 단편은 RNA 분해의 서열 특이적인 매개체이다. 단편의 특이적 길이일 수 있는, 분자 시그널은 RNAi에 관여하는 세포 인자를 보충하기 위해 이들 21 내지 23 nt 단편에 존재해야 한다. 본 발명은 이러한 21 내지 23 단편 및 유전자 기능을 특이적으로 불활성화시키는 이들의 용도를 포함한다. 이들 단편(또는 동일하거나 유사한 성질의 재조합에 의해 생성되거나, 화학적으로 합성된 올리고누클레오티드)을 사용하므로써 포유 동물 세포에서 분해를 위해 특정 mRNA를 표적화시킬 수 있다. RNAi를 유도하기 위해 포유동물 세포에서의 긴 dsRNA를 사용하는 것은 보통 실용적이지 않은데, 그 이유는 아마도 인터페론 반응의 유해한 영향때문일 것이다. 본 발명의 21 내지 23nt 단편으로 가능한 특정 유전자 기능의 특이적 표적화는 기능적 게놈 및 치료 응용에 유용하다.
특히, 본 발명은 RNAi를 매개하는 약 21 내지 23개의 누클레오티드로 된 RNA 분자에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 약 21 내지 약 23개의 누클레오티드로 된 RNA 분자에 관한 것으로, 이들 분자는 이들에 상응하는 특정 mRNA의절단을 유도한다. 본 발명의 21 내지 23nt RNA 분자는 또한 3' 하이드록실기를 포함할 수 있다. 이러한 21 내지 23 nt RNA 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥(두개의 21 내지 23 nt RNA)로서 존재할 수 있으며, 이러한 분자는 블런트(blunt) 말단이거나 오버행잉(overhanging) 말단(예를 들어, 5', 3')를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 RNA 분자는 이중 가닥이며, 블런트 말단이거나 오버행잉 말단을 포함한다(두개의 21 내지 23 nt RNA로서).
하나의 구체예에서, RNA 분자의 하나 이상의 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6개의 누클레오티드(예를 들어, 피리미딘 누클레오티드, 퓨린 누클레오티드)의 3' 오버행을 갖는다. 다른 구체예에서, 3' 오버행은 길이가 약 1 내지 약 5개의 누클레오티드, 약 1 내지 약 3개의 누클레오티드, 및 약 2 내지 약 4개의 누클레오티드이다. 하나의 구체예에서, RNA 분자는 이중 가닥이며, 한 가닥은 3' 오버행을 가지며, 나머지 가닥은 블런트 말단이거나 하나의 오버행을 가질 수 있다. RNA 분자가 이중 가닥이며, 두개의 가닥 모두 오버행을 포함하는 구체예에서, 오버행의 길이는 각각의 가닥에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 RNA는 쌍을 이루고 RNA의 양 3' 말단에 약 1 내지 약 3개, 특히 2개의 누클레오티드의 오버행을 가진 21개의 누클레오티드 가닥을 포함한다. 본 발명의 RNA의 안정성을 추가로 향상시키기 위해 3' 오버행은 분해에 대해 안정화될 수 있다. 하나의 구체예에서, RNA는 아데노신 또는 구아노신 누클레오티드와 같은 퓨린 누클레오티드를 포함하므로써 안정화된다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 누클레오티드의 치환, 예를 들어, 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘 2 누클레오티드 3' 오버행의 치환이 허용되며, RNAi의 효능에는 영향을 미치지 않는다. 2' 하이드록실의 부재는 조직 배양 배지에서 오버행잉의 누클레아제 내성을 현저히 증진시킨다.
본 발명의 21 내지 23 nt RNA 분자는 당업자들에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, RNA는 당해 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합하여 생성될 수 있다. 21 내지 23 nt RNA는 또한 본원에 기술된 시험관내 시스템에서 드로소필라를 사용하여 얻어질 수 있다. 드로소필라 시험관내 시스템의 사용은 dsRNA를 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 배합시키는 것을 필요로 하며, 이로써 배합물을 생성시킨다. 이러한 배합물은, dsRNA가 약 21 내지 약 23개의 누클레오티드로 된 RNA로 프로세싱되는 조건 하에서 유지된다. 드로소필라 시험관내 시스템은 또한 특정 유전자(예를 들어, 종양유전자, 바이러스 유전자)의 mRNA의 RNA 간섭을 매개하는 길이가 약 21 내지 약 23개의 누클레오티드로 된 RNA를 얻는데 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 유전자 서열에 상응하는 이중 가닥 RNA는 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 배합되고, 이로써 배합물을 생성시킨다. 이러한 배합물은, 이중 가닥 RNA가 약 21 내지 약 23개의 누클레오티드로 된 RNA로 프로세싱되는 조건 하에서 유지된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 21 내지 23 nt RNA는 분해시키려는 mRNA의 RNAi를 매개한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 21 내지 23 nt RNA 분자에 관한 것이다.
하나의 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 RNA 분해의 서열 특이적 매개체로서 유용한 21 내지 23 nt RNA 분자를 확인하거나 얻기 위해 사용되며, 이에 따라 질병 또는 바람직하지 않은 질환과 관련되거나 원인이 되는 생성물을 엔코딩하는 사람 mRNA와 같은 mRNA를 억제한다. 예를 들어, 종양단백질 또는 바이러스 단백질의 생성은 질병이나 질환이 일어나지 않도록 억제하거나, 발생하는 정도를 제한하거나, 역전시키도록 사람에게서 억제될 수 있다. 사람에게서 표적화시키려는 유전자 서열이 공지되어 있는 경우, 21 내지 23 nt RNA가 생성되어 사람 또는 그 밖의 영장동물 세포와 같은 세포에서 RNAi를 매개하는 능력에 대해 시험될 수 있다. RNAi를 매개하는 것으로 나타난 이러한 21 내지 23 nt 사람 RNA 분자는 경우에 따라 적합한 동물 모델내에서 시험되어 이들의 생체내 효능을 추가로 평가할 수 있다. RNAi를 매개하는 것으로 나타난 21 내지 23 nt RNA의 추가의 카피(copy)는 본원에 기술된 방법에 의해 생성될 수 있다.
드로소필라 시험관내 시스템을 사용하여 21 내지 23개 nt RNA 서열을 수득하는 방법은 혼합물로부터 RNA 서열을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 21 내지 23개 nt RNA 분자는 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동을 사용하여 배합물로부터 21 내지 23개 nt RNA를 분리할 수 있고, RNA 서열을 포함하는 겔 슬라이스가 분리될 수 있고, RNA가 겔 슬라이스로부터 용리될 수 있다. 대안적으로, 비-변성 컬럼 크로마토그래피와 같은 비-변성 방법이 생성된 RNA를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 크로마토그래피(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피), 글리세롤 구배 원심분리, 항체를 이용한 친화성 정제를 사용하여 21 내지 23개 nt RNA를 분리할 수 있다. 또한, 드로소필라 시험관내 시스템으로부터 분리된 RNA-단백질 복합체가 본원에 기술된 방법 (예를 들어, 유전자의 mRNA의 RNAi를 매개하는 방법)에 직접 사용될 수 있다. RNAi를 매개하는 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물이 본 발명에 포함된다. 가용성 드로소필라 추출물은 다양한 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 가용성 추출물은 실시예 1, 2 및 3에 기술된 바와 같이 합포성 포배엽 드로소필라 배아로부터 수득될 수 있다. 가용성 추출물은 RNAi가 일어나는 그 밖의 세포로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 가용성 추출물은 RNAi를 실행하지 않는 세포로부터 수득될 수 있다. 이 경우, RNAi를 매개하는 데에 필요한 인자들이 상기 세포내로 도입된 후, 가용성 추출물이 수득된다. 또한, 추출물의 성분들은 화학 합성될 수 있고/있거나 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 배합될 수 있다.
임의의 dsRNA가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는데, 단, 이는 RNAi를 매개하도록 표적화된 유전자에 대해 충분한 상응성을 지닌다. 본 발명의 방법에 사용되는 dsRNA의 서열은 공지되어 있을 필요가 없다. 대안적으로, 본 발명에 사용되는 dsRNA는 전체 유전자 (하나 이상) 또는 이의 일부의 서열과 같은 공지된 서열에 상응할 수 있다. 사용될 수 있는 dsRNA의 길이에 대한 상한은 없다. 예를 들어, dsRNA는 유전자의 약 21개 염기쌍(bp) 내지 유전자의 전장이거나 그 이상일 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 방법에 사용된 dsRNA의 길이는 약 1000 bp 이다. 또 다른 구체예에 있어서, dsRNA의 길이는 약 500 bp 이다. 또 다른 구체예에 있어서, dsRNA의 길이는 약 22 bp 이다.
본원에 기술된 21 내지 23개 nt RNA는 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 21 내지 23개 nt RNA 분자를 사용하여 세포 또는 생물체내의 유전자의 mRNA의 RNA 간섭을 매개할 수 있다. 한 가지 특정한 구체예에 있어서, 21 내지 23개 nt RNA가 인간 세포 또는 인간내로 도입되어 세포 또는 개체의 세포에서 RNA 간섭을 매개하여, 예를 들어 질병 또는 바람직하지 않은 질환을 예방하거나 치료한다. 이러한 방법에 있어서, 질병 또는 바람직하지 않은 질환을 야기하거나 이에 기여하는 유전자(들)이 표적화되고, 상응하는 mRNA (표적화된 유전자의 전사 생성물)이 RNAi에 의해 분해된다. 이러한 구체예에 있어서, 분해를 위해 상응하는 mRNA(표적화된 유전자의 mRNA)를 표적화하는 약 21 내지 약 23개 누클레오티드의 RNA가 세포 또는 생물체내로 도입된다. 세포 또는 생물체는 상응하는 mRNA의 분해가 일어나는 조건하에서 유지됨으로써, 세포 또는 생물체에서 유전자의 mRNA의 RNA 간섭을 매개한다. 한 가지 특정한 구체예에 있어서, 세포에서 유전자의 RNA 간섭을 매개하는 방법은 유전자의 서열에 상응하는 이중가닥 RNA를 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 배합시켜서 배합물을 생성시키는 것을 포함한다. 배합물은 이중가닥 RNA가 약 21 내지 약 23개 누클레오티드의 RNA로 프로세싱되는 조건하에서 유지된다. 그 후, 21 내지 23개 nt RNA가 분리되고, 세포 또는 생물체내로 도입된다. 세포 또는 생물체는 유전자의 mRNA의 분해가 일어나는 조건하에서 유지됨으로써, 세포 또는 생물체에서 유전자의 RNA 간섭을 매개한다. RNAi가 정상적으로 일어나지 않는 세포내로 21 내지 23개 nt RNA가 도입되는 경우, RNAi를 매개하는 데에 필요한 인자들이 이러한 세포내로 도입되거나 필요한 인자들의 발현이 이러한 세포에서 유도된다. 대안적으로, RNAi를 매개하는 것으로 공지된 21 내지 23개 nt RNA와 동일하거나 이와 충분히 유사한 조성을 지니는 다른 방법(예를 들어, 화학 합성, 재조합 DNA 생성)에 의해 생성된 21 내지 23개 nt RNA가 RNAi를 매개하기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 이러한 21 내지 23개 nt RNA는 하나 이상의 누클레오티드의 첨가, 결실, 치환 또는 변형에 의해 변화되고/되거나 비-누클레오티드 (non-nucleotide) 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예는 백혈병 또는 AIDS와 같은 질병 또는 바람직하지 못한 질환을 유발하거나 이와 관련있는 유전자(들)을 분해시키기 위해 개체로부터의 세포를 처리하는 생체외 방법이다. 이러한 구체예에 있어서, 처리하려는 세포는 공지된 방법(예를 들어, 정맥절개술 또는 골수의 수집)을 사용하여 개체로부터 수득되고, 상응하는 mRNA(들)의 분해를 매개하는 21 내지 23개 nt RNA가 세포내로 도입된 후, 이들 세포가 개체내로 재도입된다. 필요한 경우, RNAi가 일어나게 하는 데에 필요한 생화학적 성분들이 세포내로 또한 도입될 수 있다.
임의의 유전자의 mRNA가 본원에 기술된 mRNA의 간섭을 매개하는 방법을 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있다. 예를 들어, 임의의 세포 또는 바이러스 mRNA가 표적화될 수 있으며, 이로써, 엔코딩된 단백질(예를 들어, 종양단백질, 바이러스 단백질) 발현이 감소할 것이다. 또한, 질병 또는 바람직하지 못한 질환과 관련되거나 이를 야기하는 임의의 단백질의 mRNA가 본원에 기술된 방법을 사용하여 분해를 위해 표적화될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 또는 생물체내의 유전자의 기능을 검사하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 구체예에 있어서, 분해를 위해 유전자의 mRNA를 표적화하는 약 21 내지 약 23개 누클레오티드의 RNA 서열이 세포 또는 생물체내로 도입된다. 세포 또는 생물체는 유전자의 mRNA의 분해가 일어나는 조건하에서 유지된다. 그 후, 세포 또는 생물체의 표현형이 관찰되고 적합한 대조표준과 비교됨으로써, 유전자의 기능에 관한 정보를 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 유전자의 서열에 상응하는 이중가닥 RNA는 이중가닥 RNA가 약 21 내지 약 23 누클레오티드의 RNA를 생성시키도록 프로세싱되는 조건하에서 드로소필라 배아로부터 유래된 가용성 추출물과 배합된다. 약 21 내지 23개 누클레오티드의 RNA는 분리된 후, 세포 또는 생물체내로 도입된다. 세포 또는 생물체는 유전자의 mRNA의 분해가 일어나는 조건하에서 유지된다. 그 후, 세포 또는 생물체의 표현형이 관찰되고 적합한 대조표준과 비교됨으로써, 유전자의 기능을 확인한다.
본 발명의 또 다른 일면은 RNAi를 매개하는 21 내지 23개 nt RNA의 능력을 평가하는 방법, 특히 21 내지 23개 nt RNA(들)가 RNAi를 효과적으로 매개하는 지를 측정하는 방법이다. 상기 방법의 한 가지 구체예에 있어서, 분해시키려는 mRNA의 서열에 상응하는 dsRNA는 검출가능하게 표지된(예를 들어, 방사능표지화와 같이 말단 표지됨) mRNA 및 본 발명의 가용성 추출물과 배합되어 배합물을 생성시킨다. 이 배합물은 이중가닥 RNA가 프로세싱되고 mRNA가 분해되는 조건하에서 유지된다. 가장 효과적인 절단 부위는 표지된 mRNA 절단 생성물의 이동을 공지된 길이의 마커와 비교함으로써 맵핑된다. 그 후, 이러한 부위를 스패닝(spanning)하는 21량체가 설계되고, RNAi를 매개하는 데에 있어서 이들의 효율에 대해 시험된다.
대안적으로, 본 발명의 추출물을 사용하여, 다른 영역 보다 RNAi에 의해 더욱 효과적으로 표적화되므로 특히 유용한 표적 부위가 될 수 있는, 유전자에 상응하는 mRNA의 특정 세그먼트(들)이 존재하는 지를 결정할 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 분해시키려는 유전자의 서열에 상응하는 dsRNA, 이 유전자의 표지된 mRNA가 RNAi를 매개하는 가용성 추출물과 배합되어 배합물을 생성시킨다. 생성된 혼합물은 dsRNA가 분해되는 조건하에서 유지되고, 시퀀싱 겔상에서 공지된 크기 표준물질과 비교하는 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 가장 효과적으로 절단되는 mRNA상의 부위가 확인된다.
본 발명은 하나 이상의 원색 도면을 갖는다. 원색 도면과 본 특허의 복사본은 필요한 요금과 함께 요건에 맞게 특허청에 제공될 것이다.
도 1은 수용체 mRNA 및 dsRNA Rr-Luc 및 Pp-Luc의 개략도이다. ssRNA, asRNS 및 dsRNA의 길이 및 위치는 Rr-Luc 및 Pp-Luc 수용체 mRNA 서열에 대해 흑색 막대로 나타냈다. 흑색 직사각형은 두개의 관련되지 않은 루시퍼라아제 코딩 서열을 나타내며, 라인은 mRNA의 5' 및 3' 비번역된 영역에 해당한다.
도 2a는 시험관내에서 dsRNA에 의해 유전자 특이적 간섭을 나타내는 505bp의 Pp-Luc 유전자 세그먼트로부터의 10nM ssRNA, asRNA 또는 dsRNA로 50pM Pp-Luc mRNA를 표적화시킨 후의 루시퍼라아제 활성 비를 나타낸 그래프이다. 데이터는 7회 실험의 평균 값 ±표준 편차이다. 네개의 독립적으로 준비된 용해질이 사용되었다. 완충액 대조표준에 대해 루시퍼라아제 활성을 표준화시켰다: 1에 해당하는 비는 유전자 특이적 간섭이 없음을 나타낸다.
도 2b는 시험관내에서 dsRNA에 의한 유전자 특이적 간섭을 나타내는 501bp의 Rr-Luc 유전자 세그먼트로부터의 10nM ssRNA, asRNA 또는 dsRNA로 50pM Rr-Luc mRNA를 표적화시킨 후의 루시퍼라아제 활성 비를 나타낸 그래프이다. 데이터는 6회 실험의 평균 값 ±표준 편차이다. 1에 해당하는 Rr-Luc/Pp-Luc 비는 유전자 특이적 간섭이 없음을 나타낸다.
도 3a는 드로소필라 배아 용해질에서의 인큐베이션이 유전자 특이적 간섭을 위해 dsRNA를 증강시킴을 보여주는데 이용되는 실험 방법의 개략적인 도면이다. 도 2에 사용된 동일한 dsRNA(또는 완충액)는 드로소필라 배아 용해질과의 6회 연속 반응에서 2배 희석물을 사용하여 연속 사전인큐베이션하고, mRNA 발현을 차단할 수 있는 이들의 능력을 시험하였다. 대조표준으로서, 동일한 양의 dsRNA(10nM) 또는 완충액을 완충액으로 직접 희석하고, Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA 및 용해질과 인큐베이션하였다.
도 3b는 Pp-Luc mRNA를 표적화시킬 경우의 증강을 나타낸 그래프이다. 흑색 컬럼은 dsRNA 또는 완충액이 연속적으로 사전인큐베이션된 것을 의미하며; 흰색 컬럼은 dsRNA의 32배 직접 희석물에 상응한다. 값은 완충액 대조표준의 값에 대해 표준화되었다.
도 3c는 Rr-Luc mRNA를 표적화하는 경우의 증강의 그래프이다. 상응하는 완충액 대조표준은 도 3b에 도시되어 있다.
도 4는 유전자 특이적 간섭에 대한 경쟁물 dsRNA의 효과를 나타낸 그래프이다. 증가된 농도의 나노스(nanos) dsRNA(508bp)를, Pp-Luc mRNA(흑색 컬럼, 왼쪽 축) 또는 Rr-Luc mRNA(흰색 컬럼, 오른쪽 축)을 표적화하는 5nM dsRNA(도 2a 및 2B에 사용된 것과 동일한 dsRNA)을 함유하는 반응물에 첨가하였다. 각각의 반응물은 표적 mRNA(흑색 컬럼에 대한 Pp-Luc, 흰색 컬럼에 대한 Rr-Luc) 및 관련되지 않은 대조표준 mRNA(흑색 컬럼에 대한 Rr-Luc, 흰색 컬럼에 대한 Pp-Luc) 둘 모두를 함유하였다. 값은 완충액 대조표준(도시하지 않음)에 대해 표준화하였다. 반응물을 표준 조건(방법 참조)하에 인큐베이션시켰다.
도 5a는 mRNA 안정도에 대한 dsRNA의 영향을 나타낸 그래프이다. 원형, Pp-Luc mRNA; 사각형, Rr-Luc mRNA; 채워진 심볼, 완충액 인큐베이션; 개방된 심볼, Pp-dsRNA와의 인큐베이션.
도 5b는 Rr-dsRNA 또는 Pp-dsRNA와 인큐베이션된 Rr-Luc mRNA의 안정도를 나타낸 그래프이다. 채워진 사각형, 완충액; 개방된 사각형, Pp-dsRNA(10nM); 개방된 원형, Rr-dsRNA(10nM).
도 5c는 dsRNA 길이에 대한 의존도를 나타낸 그래프이다. Pp-Luc mRNA의 안정도를 상이한 길이의 dsRNA 또는 완충액의 존재하에 용해질에서 인큐베이션한 후 평가하였다. 채워진 사각형, 완충액; 개방된 원형, 49bp dsRNA(10nM); 개방된 역삼각형, 149bp dsRNA(10nM); 개방된 삼각형, 505bp dsRNA(10nM); 개방된 다이아몬드, 997bp dsRNA(10nM). 반응물을 표준 조건(방법 참조)하에서 인큐베이션하였다.
도 6은 RNAi가 ATP가 필요하다는 것을 나타내는 그래프이다. 크레아틴 키나제(CK)는 크레이틴 포스페이트(CP)를 이용하여 ATP를 재생시킨다. 원형, +ATP, +CP, +CK; 사각형, -ATP, +CP, +CK; 삼각형, -ATP, -CP, +CK; 역삼각형, -ATP, +CP, -CK.
도 7a는 어떠한 억제제도 함유하지 않는 반응에 대한, 단백질 합성 억제제인 아니소마이신, 사이클로헥시미드 또는 클로람페니콜의 존재하에 1시간 동안 실험관내 RNAi 반응에서 Rr-luc mRNA를 인큐베이션 시킨 후, 생성된 루시퍼라아제 활성에 의해 반영된 단백질 합성 그래프이며, 이는 RNAi가 mRNA 번역을 필요로 하지 않는다는 것을 보여준다.
도 7b는 1시간 인큐베이션 동안 생성된 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된 바와 같은, dsRNA의 부재하의 RNAi 반응에서 7-메틸-구아노신- 및 아데노신-캡핑된 Pp-luc mRNA(각각 원형 및 사각형)의 번역을 나타낸 그래프이다.
도 7c는 505bp Pp-luc dsRNA의 존재(개방된 심볼) 및 부재(채워진 심볼)하에 균일하게 32P-방사능표지된 7-메틸-구아노신-캡핑된 Pp-luc mRNA(원형) 및 아데노신-캡핑된 Pp-luc mRNA(사각형)의 RNAi 반응에서의 인큐베이션을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 지정된 시간 동안 완충액, 505nt Pp-asRNA 또는 505bp Pp-dsRNA와의 표준 RNAi 반응에서 인큐베이션된 Pp-luc mRNA의 변성 아가로스-겔(denaturing agarose-gel) 분석의 그래프이며, 이는 시험관내에서 asRNA가 소량의 RNAi를 유도한다는 것을 보여준다.
도 8b는 지정된 시간 동안 완충액, 505nt Pp-asRNA 또는 505bp Pp-dsRNA와의 표준 RNAi 반응에서 인큐베이션된 Rr-luc mRNA의 변성 아가로스-겔 분석의 그래프이며, 이는 시험관내에서 asRNA가 소량의 RNAi를 유도한다는 것을 보여준다.
도 9는 Rr-luc mRNA에 대한, 3가지 dsRNA, 'A', 'B' 및 'C'의 위치의 개략도이다.
도 10은 Rr-luc mRNA(SEQ ID NO: 1)의 최초 267nt상으로 맵핑된 절단 부위를 나타낸다. 서열 밑의 청색 막대는 dsRNA 'C'의 위치를 나타내며, 청색 원형은 dsRNA에 의해 유도된 절단 부위의 위치를 나타낸다. 녹색 막대는 dsRNA 'B'의 위치를 나타내며, 녹색 원형은 절단 부위를 나타낸다. 자홍색 막대는 dsRNA 'A'의 위치를 나타내며, 자홍색 원형은 절단 부위를 나타낸다. 7 우라실의 런(run)내의 예외적인 절단 부위는 붉은 화살표로 표시하였다.
도 11은 RNAi의 제안 모델이다. RNAi는 아마도 다중단백질 복합체내의 dsRNA-특이적 누클레아제에 의해 21-23nt 생성물로 dsRNA가 절단되기 시작하도록 설계되어 있다. 그 후, 이러한 짧은 dsRNA는 가능하게는 초기 복합체 성분인 ATP-의존성 헬리카제에 의해 절단을 위해 mRNA를 표적화할 수 있는 21-23nt asRNA로 해리될 수 있다. 짧은 asRNA는 완전한 길이의 dsRNA에 의해 원래 결합된 RNAi-특이적 단백질(원형)과 결합된 채로 유지되는 것으로 여겨지며, 따라서, 생체내 및 시험관내에서 RNAi를 촉발하는데 있어 asRNA이 아무런 영향도 끼칠 수 없다는 것을 설명한다. 최종적으로, 누클레아제(삼각형)는 mRNA를 절단한다.
도 12는 21 내지 23 nt 단편에 의한 서열 특이적 유전자 침묵을 나타내는 막대 그래프이다. 드로소필라(Drosophila) 용해질중의 각각의 dsRNA의 이전 인큐베이션으로부터 분리된 5nM Pp-Luc 또는 Rr-Luc dsRNA(500bp) 또는 21 내지 23 nt 단편에 의한 Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA의 표적화 후의 루시퍼라제 활성 비. 인큐베이션 반응에서 존재하는 분리된 21 내지 23 량체의 양은 5nM 500bp dsRNA와의 인큐베이션 반응 동안에 생성된 21 내지 23 량체의 동일량과 대략 상응한다. 데이터는 3회 시험의 평균값이며, 표준 편차는 오차 막대에 의해 주어진다. 루시퍼라제 활성을 완충액 대조표준에 대해 표준화시켰다.
도 13a는 실시예 4에 기술된 방법을 사용하여 수퍼덱스(Superdex) HR 200 10/30 여과 컬럼(Pharmacia) 상에서 RNA 단편을 정제한 것을 도시한 것이다. dsRNA를 32P-표지시키고, 각각의 컬럼 분획에서 회수된 방사능(radioactivity)을 그래프화한 것이다. 분획을 변성 겔 전기영동에 의해 분석하였다(삽입 그림).
도 13b는 도 13a에서와 같은 드로소필라 용해질에서의 인큐베이션 및 분별화 후에 Rr-루시퍼라제 표적 mRNA의 발현에 대한 서열 특이적 간섭을 매개하는 Rr-루퍼라아제 RNA의 능력을 입증하고 있다. 각각의 재현탁된 분획중 1 마이크로리터를 시험관내 RNAi 반응의 10마이크로리터 중에서 시험하였다(실시예 1 참조). 이러한 절차는 컬럼에 로딩되기 전의 원래 반응에서의 RNA 종의 농도와 거의 동일한, 표준 시험관내 RNAi 반응의 RNA 농도를 산출하였다. 초당 상대적 발광을 2개의 완충 대조표준의 평균 값에 대해 표준화시켰다.
도 13c는 도 13b에 대한 특이성 대조표준이다. 이것은 분별화된 도 13b의 RNA가 Pp-루시퍼라제 mRNA의 발현의 서열 특이적 간섭을 효과적으로 매개하지 않음을 입증한다. 검정은 도 13b에서와 동일하다.
도 14a 및 14b는 리포터 작제물 및 siRNA 듀플렉스를 개략적으로 도시한 것이다. 도 14a는 플라스미드 pGL2-대조표준, pGL3-대조표준 및 pRL-TK(Promega)으로부터의 반딧불이(Pp-luc) 및 씨팬시(sea pansy)(Rr-luc) 루시퍼라제 리포터 유전자 영역을 도시한 것이다. HSV 티미딘 키나제 프로모터인 SV 40 조절 엘리먼트 및 두개의 인트론(라인)이 표시되어 있다. GL3 루시퍼라제의 서열은 GL2와 95% 동일하지만, RL은 둘 모두에 대해 완전히 무관하다. pGL2로부터의 루시퍼라제 발현은 트랜스펙션된 포유동물 세포에서의 pGL3로부터 보다는 약 10배 낮다. siRNA 듀플렉스에 의해 표적화된 영역은 루시퍼라제 유전자의 코딩 영역 아래에 흑색 막대로서 표시되어 있다. 도 14b는 siRNA 듀플렉스를 표적화하는 GL2(SEQ ID No: 10 및 11), GL3(SEQ ID No: 12 및 13) 및 RL(SEQ ID No: 14 및 15) 루시퍼라제의 센스(상부) 및 안티센스(하부) 서열이 도시되어 있다. GL2 및 GL3 siRNA 듀플렉스는 단지 3개의 단일 누클레오티드 치환(회색으로 박스 표시된) 만큼 다르다. 비특이적 대조표준으로서, 인버티드(inverted) GL2 서열, 즉 invGL2(SEQ ID No: 16 및 17)과의 듀플렉스를 합성하였다. 2'-데옥시티미딘의 2nt 3' 오버행(overhang)은 TT로서 표시되어 있으며; uGL2(SEQ ID No: 18 및 19)는 GL2 siRNA와 유사하나, 리보-우리딘 3' 오버행을 함유한다.
도 15a 내지 15j는 siRNA 듀플렉스에 의한 RNA 간섭을 보여주는 그래프이다. 표적 대 대조표준 루시퍼라제의 비는 완충액 대조표준(bu, 흑색 막대)에 대해 표준화되었으며, 회색 막대는 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)(Pp-luc)GL2 또는 GL3 루시퍼라제 대 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)(Rr-luc) RL 루시퍼라제(좌축)의 비를 나타내고, 백색 막대는 RL 대 GL2 또는 GL3의 비(우축)를 나타낸다. 도 15a, 15c, 15e, 15g 및 15i는 pGL2-대조표준 및 pRL-TK 리포터 플라스미드의 배합물로 수행된 실험의 결과를 보여주는 것이며, 도 15b, 15d, 15f, 15h 및 15j는 pGL3-대조표준 및 pRL-TK 리포터 플라스미드로 수행된 실험의 결과를 보여주는 것이다. 간섭 실험을 위해 사용된 세포주는 각각의 플롯 상부에 표시되어 있다. 완충 대조표준(bu)에 대한 Pp-luc/Rr-luc의 비는 표준화 전 및 시험한 여러가지 세포주 간에, 각각 pGL2/pRL에 대해 0.5 내지 10이고, pGL3/pRL에 대해 0.03 내지 1로 다양하였다. 플롯팅된 데이터는 3개의 독립된 실험 ±표준 편차로부터 평균낸 것이었다.
도 16a 내지 16f는 HeLa 세포에서 루시퍼라제 발현에 대한 21 nt siRNA, 50 bp 및 500bp dsRNA의 효과를 보여주는 그래프이다. 긴 dsRNA의 정확한 길이는 막대 아래에 표시된다. 도 16a, 16c 및 16e는 pGL2 대조표준 및 pRL-TK 리포터 플라스미드로 수행된 실험을 기재한 것이며, 도 16b, 16d 및 16f는 pGL3-대조표준 및 pRL-TK 리포터 플라스미드로 수행된 실험을 기재한 것이다. 이러한 데이터는 2개의 독립된 실험 ±표준 편차로부터 평균낸 것이었다. 도 16a 및 16b는 임의의 발광 단위로 플롯팅된 고유한 Pp-luc 발현을 도시하고 있다. 도 16c 및 16d는 임의의 발광단위로 플롯팅된 Rr-luc 발현을 도시하고 있다. 도 16e 및 16f는 표준화된 표적 대 대조표준 루시퍼라제의 비를 도시한 것이다. siRNA 듀플렉스에 대한 루시퍼라제 활성의 비는 완충 대조표준(bu, 흑색 막대)에 대해 표준화되었으며, 50 또는 500 bp dsRNA에 대한 발광비는 사람화된 GFP(hG, 흑색 막대)로부터의 50 및 500bp dsRNA에 대해 관찰된 각각의 비에 대해 표준화되었다. 49 및 484bp dsRNA를 표적화하는 GL2 및 GL3 사이의 서열에서의 전반적인 차이점은 GL2와 GL3 표적물 사이의 특이성을 부여하는데 충분하지 않음(49bp 세그먼트에서 43nt 연속 동일성, 484bp 세그먼트에서 239nt 최장 연속 동일성)을 유의해야 한다[참조: Parrish, S., et al., Mol. Cell, 6:1077-1087 (2000)].
실시예의 개요
RNAi의 생화학적 분석은 실시예 1에 기술된 유전자 발현의 dsRNA 의존성 침묵을 재현하는 시험관내 드로소필라 배아 용해질의 개발과 관련하여 가능해졌다 (Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)). 시험관내 시스템에 있어서, dsRNA (센스 또는 asRNA는 아님)는 분해를 위해 상응하는 mRNA를 표적화하지만, 관련없는 대조 mRNA의 안정성에는 영향을 미치지 않는다. 또한, 용해질에서의 dsRNA의 사전 인큐베이션은 표적 mRNA 분해를 위한 이의 활성을 증강시키는 데, 이는 dsRNA가 추출물중의 단백질과 결합함으로써 또는 공유 변형에 의해 활성 형태로 전환되었음을 제시해준다 (Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)).
RNAi의 다수의 특징을 재현하는 합포성 포배엽 드로소필라 배아로부터 무세포 시스템을 개발하는 것이 본원에 기술되어 있다. 이 반응에서 관찰된 간섭은 서열 특이적이고, dsRNA (단일가닥 RNA는 아님)에 의해 촉진되고, 특이적 mRNA 분해에 의해 작용하고, 최소 길이의 dsRNA를 필요로 하며, 긴 dsRNA의 경우 가장 효과적이다. 또한, dsRNA의 사전 인큐베이션은 이의 활성을 증강시킨다. 이러한 결과는 RNAi가 가용성 반응에서 서열 특이적 프로세스에 의해 매개됨을 나타낸다.
실시예 2에 기술된 바와 같이, 시험관내 시스템을 사용하여 RNAi의 요건을 분석하고, dsRNA 및 mRNA의 운명을 결정하였다. 시험관내에서 RNAi는 ATP를 필요로 하지만, mRNA 번역 또는 표적화된 mRNA의 7-메틸-구아노신 캡의 인식을 필요로 하지 않는다. dsRNA (단일가닥 RNA는 아님)는 시험관내에서 21 내지 23개 nt 종의 집단으로 프로세싱된다. dsRNA내에서의 아데노신의 탈아민화는 21 내지 23개 nt RNA의 형성에 필요한 것으로 여겨지지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이, mRNA는 dsRNA의 서열에 상응하는 영역에서만 절단되고 mRNA는 21 내지 23개 nt 간격으로 절단되는 데, 이는 dsRNA로부터의 21 내지 23개 nt 단편이 mRNA의 절단을 표적화함을 강력히 나타내준다. 또한, 실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이, 21 내지 23개 nt 단편이 정제되어 가용성 추출물에 다시 첨가된 경우, 이들 단편은 RNA를 매개한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되며, 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1: 시험관내 이중 나선 RNA에 의한 표적화된 mRNA 분해
재료 및 방법
RNA
Rr-Luc mRNA는 pSP64 플라스미드 폴리링커의 25nt의 5' 비번역 서열 및 6nt의 SacI 부위가 후속하는 19nt의 pSP64 플라스미드 폴리링커 서열로 구성된 25nt의 3' 비번역 서열에 의해 플랭킹된 926nt Rr 루시퍼라제 코딩 서열로 구성되었다. Pp-Luc mRNA는 Pp 루시퍼라제 정지 코돈 바로 앞에 도입된 KpnI 부위를 가지는 1653nt의 Pp 루시퍼라제 코딩 서열을 함유한다. Pp 코딩 서열은, 드로소필라 헌취백(Drosophila hunchback) mRNA로부터의 512nt의 5' 비번역 영역(UTR)이 후속하는 21nt의 pSP64 플라스미드 폴리링커로 구성된 5' 비번역 서열 및 6nt의 SacI 부위가 후속하는 562nt의 헌취백 3' UTR로 구성된 3' 비번역 서열에 의해 플랭킹되었다. 사용된 헌츠백 3' UTR 서열은 생체내 및 시험관내에서 나노스 레스판스 엘리먼츠(Nanos Response Elements)의 기능을 붕괴하는 6개의 G→U 돌연변이를 함유한다. 리포터 mRNA 둘 모두는 전사된 플라스미드에서 엔코딩된 25nt 폴리(A) 테일에서 종결되었다. Rr-Luc 및 Pp-Luc mRNA 둘 모두에 대해서, 전사체는 25nt 엔코딩된 폴리(A) 테일에 바로 후속하는 NsiI 부위에서 절단된 플라스미드 주형으로부터 런-오프 전사(run-off transcription)에 의해 생성된다. 전사체가 폴리(A) 테일로 끝났는지를 확인하기 위하여, NsiI-절단된 전사 주형을 dNTP의 존재하에 T4 DNA 중합효소로 잘라내었다. SP6 mMessage mMachine kit(Ambion)을 시험관내 전사를 위하여 사용하였다. 상기 키트를 사용할 경우에 생성된 전사체의 약 80%가 7-메틸 구아노신 캡핑된다. 32P-방사능표지는 전사 반응에 α-32P-UTP를 포함시킴에 의해 수행되었다.
Pp-Luc에 있어서, ss, as 및 dsRNA는 번역의 개시점에 대하여 위치 93 내지 597에 해당하여 505bp dsRNA를 생성시킨다. Rr-Luc에 있어서, ss, as 및 dsRNA는 번역의 개시점에 대하여 위치 118 내지 618에 해당하여 501bp dsRNA를 생성시킨다. 드로소필라 나노스 경쟁자(Drosophila nanos competitor) dsRNA는 번역의 개시점에 대하여 위치 122 내지 629에 해당하여 508bp dsRNA를 생성시킨다. ssRNA, asRNA 및 dsRNA(도 1에 도시됨)를 중합효소 연쇄 반응에 의해 생산된 주형으로부터 T7 RNA 중합효소로 시험관내에서 전사시켰다. T7 RNA 전사체의 겔 정제 후에, 잔류 DNA 주형을 RQ1 DNase(Promega)로 처리하여 제거하였다. 다음에 RNA를 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후에 침전시키고 물중에서 용해시켰다.
RNA 어닐링 및 네이티브 겔 전기영동
20mM NaCl을 함유한 10mM Tris-HCl(pH 7.5)중의 ssRNA 및 asRNA(0.5μM)을 1분 동안 95℃로 가열한 다음에 냉각시키고, 12시간 내지 16시간동안 실온에서 어닐링하였다. RNA를 침전시키고 용해 완충액에 재현탁하였다 (하기). 어닐링을 모니터링하기 위하여 RNA를 TBE 완충액 중의 2% 아가로오스 겔에서 전기 영동하였고, 에티듐브로마이드로 염색하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, 1989).
용해질 제조
오레곤 알 파리(Oregon R fly)의 0 내지 2 시간된 배아를 25℃에서 효모 당밀 아가상에 수집하였다. 배아를 50%(v/v) 블리취(bleach)에서 4 내지 5분동안 디코리오네이팅(dechorionating)하고, 물로 세척하고, 건조시켜 블로팅하고, 냉각된 포터 엘베젤(Potter-Elvehjem) 조직 분쇄기(Kontes)에 옮겼다. 배아를 4℃에서 5mM 디티오트레이톨(DTT) 및 습윤 배아의 그람당 1㎎/㎖ Pefabloc SC(Boehringer-Mannheim)을 함유하는 용해 완충액 1㎖(100mM 포타슘 아세테이트, 30mM HEPES-KOH, pH 7.4, 2mM 마그네슘 아세테이트)중에서 용해하였다. 용해질을 4℃로 14,500×g에서 25분동안 원심분리하고, 분취량의 신선한 상층액을 액체 질소중에서 냉동시키고 -80℃에서 저장하였다.
반응 조건
용해질 제조 및 반응 조건은 후사인 및 레이보위츠(참조: Hussain and Leibowitz, Gene 46: 13-23, 1986)에 의해 기술된 조건으로부터 유래하였다. 반응은 50%(v/v) 용해질, mRNA(10 내지 50pM 최종 농도), 및 ssRNA, asRNA, 또는 dsRNA를 함유하는 10%(v/v) 용해 완충액(10nM 최종 농도)을 함유한다. 또한, 각 반응은 10mM 크레아틴 포스페이트, 10㎍/㎖ 크레아틴 포스포키나제, 100μM GTP, 100μM UTP, 100μM CTP, 500μM ATP, 5μM DTT, 0.1 U/㎖ RNasin(Promega) 및 100μM의 각 아미노산을 함유한다. 포타슘 아세테이트의 최종 농도를 100mM로 조정하였다. 표준 조건을 위해, 반응을 얼음상에서 어셈블링한 다음, mRNA를 첨가하기 전에 10분동안 25℃에서 사전인큐베이션하였다. mRNA를 첨가한 후에, 인큐베이션을 추가 60분동안 계속하였다. 10분 사전인큐베이션 단계는 도 3a-3c 및 5a-5c의 실험에서 생략되었다. 반응을 4부피의 1.25×패시브 용해 완충액(Passive Lysis Buffer)(Promega)으로 켄칭하였다. Pp 및 Rr 루시퍼라제 활성을 듀얼-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega)을 사용하여 모노라이트 2010 루미노미터(Monolight 2010 Luminometer, Analytical Luminescence Laboratory)에서 검출하였다.
RNA 안정성
32P-방사능표지된 mRNA와의 반응을 40 부피의 2×PK 완충액(200mM Tris-HCl, pH 7.5, 25mM EDTA, 300mM NaCl, 2% w/v 소듐 도데실 설페이트)를 첨가하여 켄칭하였다. 단백질가수분해효소 K(E.M. Merch; 물중에 용해됨)를 465㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 다음, 반응을 65℃에서 15분동안 인큐베이션하고, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1)로 추출하고, 동일 부피의 이소프로판올로 침전시켰다. 반응을 포름알데하이드/아가로오스(0.8% w/v) 겔에서 전기영동하여 분석하였다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY., 1989). 방사능을 아가로오스 겔[니트란 플러스 멤브레인(Nytran Plus membrane, Amersham)상에서 진공하에 건조됨]을 이미지 플레이트(Fujix)에 노출시키고 후직스 바스 2000(Fujix Bas 2000) 및 이미지 게이지 3.0(Image Gauge 3.0, Fujix) 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.
시판 용해질
처리되지 않은 토끼 망상적혈구 용해질(Ambion) 및 맥아 추출물(Ambion) 반응물을 제조자의 지시에 따라 어셈블링하였다. dsRNA를 mRNA의 첨가 전에 10분동안 27℃(맥아) 또는 30℃(망상적혈구 용해질)에서 인큐베이션하였다.
결과 및 토론
dsRNA가 시험관내에서 유전자 발현을 특이적으로 차단할 수 있는지 여부를 평가하기 위하여, 서열 및 루시페린 기질 특이성 둘 모두에서 관련성이 없는 두 개의 상이한 루시퍼라제 유전자로부터 유래된 리포터 mRNA를 사용하였다: 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis, 씨 팬시(sea pansy)) 루시퍼라제(Rr-Luc) 및 포투리스 펜실바니카(Photuris pennsylvanica, 반딧불이) 루시퍼라제(Pp-Luc). 하나의 유전자로부터 유래된 dsRNA를 하나의 루시퍼라제를 표적하는데 사용한 반면에, 다른 루시퍼라제 mRNA는 동일한 반응에서 함께 번역되는 내부 대조표준으로 사용하였다. 약 500bp의 dsRNA를 Rr-Luc 및 Pp-Luc 유전자의 중합효소 연쇄 반응 생성물의 전사에 의하여 제조하였다. 각 dsRNA는 번역 개시점으로부터 약 100bp 다운스트림에서 시작하였다(도 1). 센스(ss) 및 안티-센스(as) RNA는 시험관내에서 전사되어 서로에 대해 어닐링되어 dsRNA를 생성하였다. Rr 및 Pp dsRNA를 형성하기 위하여 사용된 개개 Rr 501 및 Pp 505nt asRNA 및 ssRNA의 네이티브 겔 전기영동을 수행하였다. ssRNA, asRNA 및 dsRNA를 각각 이들의 동계 mRNA의 발현을 특이적으로 차단하고 관련되지 않은 내부 대조표준 mRNA의 발현은 차단하지 않는 능력에 대해 시험하였다.
ssRNA, asRNA 또는 dsRNA를 드로소필라 배아 용해질을 함유하는 반응에서 10분동안 인큐베이션한 다음에, Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA 둘 모두를 첨가하고 추가 60분 동안 인큐베이션을 계속하였다. 드로소필라 배아 용해질은 사용된 조건하에서 외인적으로 전사된 mRNA를 효과적으로 번역하였다. Pp-Luc 및 Rr-Luc 효소 활성의 정도를 측정하였고, Pp-Luc/Rr-Luc(도 2a) 또는 Rr-Luc/Pp-Luc(도 2b)의 비를 계산하는데 사용하였다. 상이한 실험의 비교를 용이하게 하기 위하여, 각 실험으로부터의 비를 완충액이 ssRNA, asRNA, 또는 dsRNA 대신에 반응에 첨가된 대조표준에 대해 관찰된 비에 대해 표준화하였다.
도 2a는 Pp-Luc 유전자의 서열의 일부와 동일한 10nM 농도의 505bp dsRNA가 Pp-Luc mRNA의 발현을 특이적으로 억제하였으나, Rr-Luc 내부 대조표준의 발현에 영향을 주지 않았다는 것을 도시한다. ssRNA 및 asRNA는 모두 Pp-Luc 또는 Rr-Luc 내부 대조표준의 발현에 영향을 주지 못했다. 이와 같이, Pp-Luc 발현은 이의 동계 dsRNA에 의해 특이적으로 억제되었다. 반대로, Rr-Luc mRNA에 대해 유도된 10nM 농도의 501bp dsRNA는 Rr-Luc 발현을 특이적으로 억제하였으나 Pp-Luc 내부 대조표준의 발현은 억제하지 않았다 (도 2b. 또한, ssRNA 또는 asRNA의 상당한 수준이 리포터 mRNA의 발현에 영향을 거의 주지 않거나 전혀 주지 않았다. 평균적으로, dsRNA는 상기 실험에서 특정 루시퍼라제 발현을 70% 감소시켰고, 여기서 루시퍼라제 활성을 1시간동안 인큐베이션 한 후에 측정하였다. 반응의 번역 능력이 신선한 용해질 및 반응 성분의 첨가에 의하여 보충된 다른 실험에서, 내부 대조표준에 대한 표적화된 루시퍼라제 활성의 추가 감소를 관찰하였다.
asRNA가 아닌 dsRNA의 상기 용해질에서 유전자 발현을 억제하는 능력은 단지 단일 가닥 RNA (약 10분의 반감기)에 대한 dsRNA의 보다 큰 안정성(약 2시간의 반감기)의 결과가 아니다. 7-메틸 구아노신 캡을 지니도록 전사된 ssRNA 및 asRNA는 캡핑되지 않은 dsRNA 만큼 용해질에서 안정하였으나 유전자 발현을 저해하지 못했다. 대조적으로, 캡핑된 ssRNA 및 asRNA로부터 형성된 dsRNA는 표적화된 mRNA의 발현을 특이적으로 차단하지 않는다.
드로소필라의 효과적인 RNAi는 합포성 포배엽 배아로 약 0.2 fmol의 dsRNA의 주입을 필요로 한다(참조: Kennerdell and Carthew, Cell 95: 1017-1026, 1998; Carthew, www1.pitt.edu/∼carthew/manual/RNAi_Protocol.html, 1999). 드로소필라 배아의 평균 부피가 약 7.3nl이기 때문에, 이는 약 25nM의 세포내 농도에 해당한다(참조: Mazur et al., Cryobiology 25: 543-544, 1988). 드로소필라 용해질의 유전자 발현은 dsRNA의 필적하는 농도(10nM)에 의해 저해되었으나, dsRNA농도를 10배 낮추는 것은 특이적 간섭의 양을 감소시킨다. 10 나노몰 dsRNA는 용해질에 첨가된 표적 mRNA에 비해 200배 과량의 dsRNA에 해당한다. 상기 과량의 dsRNA가 주입 dsRNA가 유전자-특이적 간섭에 활성인 형태로 전환되는 시간 및/또는 농도 의존 단계를 반영하는지를 시험하기 위하여, 동계 mRNA의 발현을 억제하는 능력에 대한 dsRNA의 사전인큐베이션의 효과를 조사하였다. 용해질의 번역 능력은 25℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 후에 현저하게 감소하였기 때문에(공개되지 않은 관찰결과), RNAi를 위하여 필요한 모든 인자가 사전인큐베이션 기간을 통해 활성 상태로 남아 있는지를 보정하는 것이 요망되었다. 따라서, 매 30분마다, dsRNA 및 용해질을 함유하는 반응물을 인큐베이션되지 않은 용해질을 함유하는 신선한 반응물과 혼합하였다(도 3a). 3시간의 사전인큐베이션에 걸친 6번의 연속적인 일련의 전달 후에, 원래 농도에 비해 64배 희석된 dsRNA를 60분동안 용해질 및 50pM의 표적 mRNA와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, Pp-Luc 및 Rr-Luc 효소 수준을 측정하였다. 비교를 위하여, dsRNA의 주입량(10nM)을 완충액에서 32배 희석하고, 임의의 사전인큐베이션 단계 없이 유전자-특이적 dsRNA 간섭을 생성하는 능력을 평가하였다.
용해질내의 dsRNA의 사전 인큐베이션은 특정 유전자 발현을 억제하는 그 능력을 상당히 강화시킨다. 32배로 희석된 dsRNA는 아무런 영향을 나타내지 않는 반면, 사전 인큐베이션된 dsRNA는 64배 희석되었음에 불구하고 실험 오차 범위내에서 비희석 dsRNA 만큼 강력하였다. 사전 인큐베이션에 의한 dsRNA의 증강은 Pp-Luc mRNA(도 3b) 및 Rr-Luc mRNA(도 3c) 모두를 표적화하는 dsRNA에 대하여 관찰되었다. 64배 희석된 점을 고려하면, 사전인큐베이션에 의해 부여된 활성화는 156 pM 농도의 dsRNA가 50pM 표적 mRNA를 억제하게 하였다. 게다가, "활성화된" dsRNA의 희석은 효과적일 수 있지만 시험되지 않았다. 시험된 두 dsRNA 모두가 사전 인큐베이션 절차에 의해 활성화되었음에 불구하고, 각각은 상응성인 mRNA의 발현만을 간섭하는 특이성을 충분히 보유하였다. 반응에 대한 추가 연구는 dsRNA 증강의 메카니즘을 확인하는 경로를 제공할 수 있다.
dsRNA의 사전인큐베이션이 이들 용해질내에서 유전자 발현을 억제하는 능력을 향상시킨다는 결과에 대한 하나의 가능한 설명은, 특이적인 인자가 dsRNA를 변형시키고/거나 이와 결합한다는 것이다. 따라서, 반응에 점증적인 양의 dsRNA를 첨가하는 것은 그러한 인자를 적정(titration)할 수 있고, 관련없는 서열의 제 2 dsRNA에 의해 초래된 유전자 특이적 간섭의 양을 감소시킬 수 있다. Pp-Luc mRNA 및 Rr-Luc mRNA 둘 모두에 대하여, 반응에 관련없는 드로소필라 나노스(Drosophila nanos) dsRNA의 점증적인 농도의 첨가는 리포터 mRNA를 표적화하는 dsRNA에 의해 초래된 유전자 특이적 간섭의 양을 감소시켰다(도 4). 시험된 농도의 나노스 dsRNA의 어느 것도 비표적화된 mRNA의 번역 수준에 영향을 미치지 않으며, 이것은 나노스 dsRNA가 유전자 특이적 간섭과 관련된 인자를 특이적으로 적정하지만 번역 기구의 성분은 적정하지 않는다는 것을 입증한다. 제한 인자(들)를 특이적 간섭을 생성하기 위해 사용된 5 nM의 dsRNA에 200배 과량인 약 1000 nM dsRNA를 첨가하여 적정하였다.
시험관내에서 간섭은 mRNA 번역의 특이적 억제나 특이적 mRNA의 표적화된 파괴를 반영하는 것일 수 있다. 이들 2가지 가능성을 구분하기 위하여, Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA의 운명을 32P-방사능 표지된 기질을 사용하여 직접 관찰하였다. 용해질내에서 완충액 또는 505 bp Pp-dsRNA(10 nM)와 함께 인큐베이션된 10 nM Pp-Luc mRNA 또는 Rr-Luc mRNA의 안정성. 지정된 시간 이후에 샘플로부터 단백질을 제거한 다음 32P-방사능 표지된 mRNA를 변성 겔 전기영동에 의해 분석하였다. dsRNA의 부재하에, Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA 둘 모두는 인큐베이션 3시간 후에 잔류하는 투입 mRNA의 약 75%를 가지며, 용해질내에서 안정하였다. (투입 mRNA의 약 25%가 반응에서 신속히 분해되고 시험관내 전사 프로세스에 의해 생성되는 언캡핑된(uncapped) mRNA를 나타내는 것으로 여겨진다.) Pp-Luc mRNA를 표적화하는 dsRNA (10 nM, 505 bp)의 존재하에, 3시간 후에 15% 미만의 Pp-Luc mRNA가 잔류되었다(도 5a). 기대된 바와 같이, Rr-Luc mRNA는 Pp-Luc mRNA를 표적화하는 dsRNA의 존재하에 안정하게 존재하였다. 역으로, Rr-Luc mRNA를 표적화하는 dsRNA (10 nM, 501 bp)는 Rr-Luc mRNA의 파괴를 초래하지만, Pp-Luc mRNA의 안정성에는 아무 영향이 없었다(도 5b). 따라서, dsRNA는 관련없는 대조 mRNA의 안정성에는 아무런 영향을 미치지 않으면서 상응성인 mRNA의 가속된 붕괴를 특이적으로 초래하였다. 이러한 발견은, 생체내에서 적어도 드로소필라에서, dsRNA의 효과가, 예를 들어 mRNA를 핵내에 특이적으로 보유시켜 비특이적 분해를 초래함으로써, mRNA의 세포내 배치를 변화시키는 것이 아니라 표적 mRNA를 직접 불안정화시킴을 나타낸다.
이러한 결과는, 동일계내 하이브리드화[참고문헌: Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502-15507 (1998)] 및 노던 블로팅[참고문헌: Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14687-14692 (1998)]에 의해 측정된 바와 같이, RNAi가 생체내 세포질 mRNA 수준을 감소시킨다는 관찰과 일치한다. 트리파노소움 및 히드라에서의 노던 블롯 분석은, dsRNA가 통상 90% 미만 정도의 mRNA 수준을 감소시킴을 시사한다[참고문헌: Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14687-14692 (1998); Lohmann et al., Dev. Biol. 214:211-214 (1999)]. 본원에 제시된 데이타는 시험관내에서 mRNA 수준이 3시간 인큐베이션 후에 65 내지 85% 감소되었음을 보여주며, 이러한 효과는 생체내 관찰과 대등한 것이다. 이들은 캐노라브디티스 엘레강스(C.elegans)내의 RNAi가 후-전사적이라는 발견과 일치된다[참고문헌: Montgomery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502-15507 (1998)]. 단백질 합성에 대한 특이적인 효과에 관한 가장 간단한 설명은, 그것이 RNA 분해의 가속된 속도를 반영한다는 것이다. 그러나, 상기 결과는 안정성 뿐만 아니라 번역에 대한 독립적이지만 특이적인 영향을 배제하지는 않는다.
생체내에서, RNAi는 최소 길이의 dsRNA를 필요로 한다[참고문헌: Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95:14687-14692 (1998)]. 길이가 49 bp, 149 bp, 505 bp 및 997 bp인(도 1 참조) RNA 듀플렉스가 시험관내 Pp-Luc mRNA의 분해를 표적화하는 능력을 평가하였다. 생체내 관찰과 양호하게 일치되게, 49 bp dsRNA가 시험관내에서 효과가 없는 반면, 149 bp dsRNA는 mRNA 붕괴를 약간만 향상시켰고, 505 및 997 bp dsRNA 둘 모두는 왕성한 mRNA 분해를 초래하였다(도 5c). mRNA의 다른 부분을 표적화하는 50 bp dsRNA는 검출가능한 mRNA 분해를 초래하지만, 500bp dsRNA에 대해 관찰된 것 만큼 왕성하지는 않다. 따라서, 어느 정도 짧은 dsRNA가 RNAi를 매개하지 못하다고 하여도, 거의 동일한 길이지만 상이한 조성의 다른 것은 RNAi를 매개할 수 있을 것이다.
드로소필라 용해질내에서 관찰된 유전자 특이적 간섭이 무세포 번역 시스템의 일반 특성인지를 검사하였다. Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA의 발현에 대한 dsRNA의 영향을 시판되는 맥아 추출물 및 토끼 세망세포 용해질내에서 관찰하였다. ssRNA, asRNA, 또는 dsRNA 중 하나를 10 nM 첨가하는 것은 맥아 추출물내에서의 mRNA 리포터의 발현에 대하여 아무런 영향이 없었다. 대조적으로, 10 nM의 dsRNA를 토끼 세망세포 용해질내에 첨가하는 것은 mRNA 안정성에 의미심장하고 신속한 비특이적 감소를 초래하였다. 예를 들어, Rr-Luc dsRNA의 첨가는 15분 이내에 Rr-Luc 및 Pp-Luc mRNA의 분해를 초래하였다. 동일한 비특이적 영향이 Pp-Luc dsRNA의 첨가시에 관찰되었다. dsRNA를 토끼 세망세포 용해질에 첨가하여 유도된 mRNA의 비특이적 파괴는 이전에 관찰된 dsRNA에 의한 RNase L의 활성화를 반영하는 것 같다[참고문헌: Clemens and Williams, Cell 13: 565-572 (1978); Williams et al., Nucleic Acids Res. 6: 1335-1350 (1979); Zhou et al., Cell 72: 753-765 (1993); Matthews, Interactions between Viruses and the Cellular Machinery for Protein Synthesis. In Translational Control (eds. J. Hershey, M. Mathews and N. Sonenberg), pp. 505-548. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY. (1996)]. dsRNA-유도된 항-바이러스 경로가 결핍된 마우스 세포주가 최근에 설명되었으며[참고문헌: Zhou et al., Virology 258: 435-440 (1999)], 포유류 RNAi에 대한 조사에 유용할 수 있다. RNAi가 몇몇 포유류 세포에 존재한다고 알려져 있지만[참고문헌: Wianny and Zernicka-Goetz Nat. Cell Biol. 2: 70-75 (2000)], 많은 포유류 세포 타입에서 그 존재는 비특이적 항-바이러스 반응의 dsRNA에 의한 신속한 유도에 의해 불명확한 것 같다.
특이적 mRNA의 dsRNA-표적화된 파괴는 RNAi의 특징이고, 이것은 드로소필라를 포함하는 많은 생물체에서 생체내에서 관찰되었다. 상기 시스템은 RNAi의 많은 측면을 시험관내 반응에서 재현하였다. 표적화된 mRNA는 특이적으로 분해되지만, 동일한 용액내에 존재하는 관련없는 대조 mRNA는 아무 영향을 받지 않는다. 상기 프로세스는 150bp 길이 보다 긴 dsRNA의 경우 가장 효율적이다. 시험관내 dsRNA-특이적 분해 반응은, 2개의 관련없는 유전자를 사용하여 관찰되었기 때문에 전부는 아니라도 많은 mRNA에서 일반적인 것이다.
본원에 기술한 시험관내에서의 mRNA 안정성에 대한 영향의 크기는 생체내에서 보고된 것과 대등하다[참고문헌: Ngo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 14687-14692 (1998); Lohmann et al., Dev. Biol., 214: 211-214 (1999)]. 그러나, 시험관내 반응은 mRNA에 비해 과량의 dsRNA를 요구한다. 대조적으로, 세포당 약간의 dsRNA 분자는 생체내에서 유전자 발현을 억제할 수 있다[참고문헌: Fire et al., Nature, 391: 806-811 (1998); Kennerdell and Carthew, Cell, 95: 1017-1026 (1998)]. 생체내 및 시험관내에서 표적 mRNA에 대한 dsRNA의 화학양론 사이의 차이는 시험관내 반응의 대부분이 그 상응하는 생체내 프로세스에 비해 덜 효율적이라는 점에서 놀라운 것이 아니다. 흥미롭게도, 용해질 내에서의 dsRNA의 인큐베이션은 RNAi에 대한 그것의 활성을 크게 증강시켰고, 이것은 그것이 변형되었거나 또는 다른 인자와 연결되었거나 둘 모두가 이루어졌다는 것을 나타낸다. 아마도 적은 수의 분자가 생체내에서 표적화된 mRNA를 억제하는데 효과적일 것이며, 이것은 주입된 dsRNA가 드로소필라 용해질내의 RNAi에 대하여 본원에 보고된 것과 유사한 프로세스에 의해 활성화되기 때문이다.
실시예 2 이중가닥 RNA는 21 내지 23개 뉴클레오티드 간격으로 mRNA의 ATP-의존성 절단을 유도한다.
방법 및 재료
시험관내 RNAi
시험관내 RNAi 반응물 및 용해질 프레퍼레이션은 상기 반응물이 0.03 g/ml 크레아틴 키나제, 25 μM 크레아틴 포스페이트(Fluka) 및 1 mM ATP를 함유하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 것과 동일하였다 [참고문헌: Tusch1 et al., Genes Dev., 13: 3191-7 (1999)]. 크레이틴 포스페이트를 매 실험마다 새롭게 물 중에 500 mM로 용해시켰다. GTP는 도 2 및 3을 제외하고는 반응물로부터 생략시켰다.
RNA 합성
Pp-Luc 및 Rr-Luc mRNA 및 Pp- 및 Rr-dsRNA (도 6에서 dsRNA 'B' 포함)를 이전에 설명된 바와 같이[참고문헌: Tusch1 et al., Genes Dev., 13: 3191-7 (1999)], 시험관내 전사에 의해 합성하였다. dsRNA 'C'용 전사 주형을 생성하기 위하여 5' 센스 RNA 프라이머는 gcgtaatacgactcactataGAACAAAGGAAACGGATGAT (SEQ ID NO: 2)이고, 3' 센스 RNA 프라이머는 GAAGAAGTTATTCTCCAAAA (SEQ ID NO: 3)이며; 5' asRNA 프라미어는 gcgtaatacgactcactataGAAGAAGTTATTCTCCAAAA (SEQ ID NO: 4)이고, 3' asRNA 프라이머는 GAACAAAGGAAACGGATGAT (SEQ ID NO: 5)이었다. dsRNA 'A'를 위하여, 5' 센스 RNA 프라이머는 gcgtaatacgactcactataGTAGCGCGGTGTATTATACC (SEQ ID NO: 6)이고, 3' 센스 RNA 프라이머는 GTACAACGTCAGGTTTACCA (SEQ ID NO: 7)이며; 5' asRNA 프라이머는 gcgtaatacgactcactataGTACAACGTCAGGTTTACCA (SEQ ID NO: 8)이고, 3' asRNA 프라이머는 GTAGCGCGGTGTATTATACC (SEQ ID NO: 9)(소문자, T7 프로모터 서열)이다.
제조업자의 지시에 따라 구아닐릴 트랜스퍼라제(Gibco/BRL), S-아데노실 메티오닌(Sigma), 및 α-32P-GTP(3000 Ci/mmol; New England Nuclear)를 사용하여 mRNA를 5'-말단 표지시켰다. 방사능 표지된 RNA를 폴리(A) 트랙(Tract) Ⅲ 키트(Promega)를 사용하여 폴리(A) 선별에 의해 정제하였다. 비방사성인 7-메틸-구아노신- 및 아데노신-캡핑된 RNA를 GTP에 비해 5배 과량의 7-메틸-G(5')ppp(5')G 또는 A(5')ppp(5')G와의 시험관내 전사 반응으로 합성시켰다. 캡 유사체는 뉴잉글랜드 바이오랩으로부터 구입하였다.
ATP 고갈 및 단백질 합성 억제
용해질을 25℃에서 10분 동안 2mM 글루코오스 및 0.1U/ml 헥소키나제(Sigma)와 함께 인큐베이션하여 ATP를 고갈시켰다. 단백질 합성 억제제를 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 무수 에탄올에 용해시켜 250배 농축된 스톡으로 하였다. 반응물중의 억제제의 최종 농도는 다음과 같다: 아니소마이신 53mg/ml; 사이클로헥시미드 100mg/ml; 클로람페니콜 100mg/ml. 상기 기술된 바와 같이[참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)], 1시간 후에 RNAi 반응에서 Rr-luc mRNA의 번역에 의해 생성된 Rr 루시퍼라제 단백질의 활성을 측정함으로써 상대적 단백질 합성을 측정하였다.
dsRNA 프로세싱의 분석
내부적으로 α-32P-ATP로 표지된 dsRNA(505 bp Pp-luc 또는 501 Rr-luc) 또는 7-메틸-구아노신 캡핑된 Rr-luc 안티센스 RNA(501 nt)를 드로소필라 (Drosophila) 용해질중에서 표지되지 않는 mRNA의 존재 또는 부재하에 5nM 최종 농도로 2시간 동안 표준 조건에서 인큐베이션하였다. 2x 단백질가수분해효소 K 완충액을 첨가하여 반응을 정지시키고 상기 기술된 바와 같이[참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-3197 (1999)] 단백질을 제거하였다. 생성물을 15% 또는 18% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔중에서 전기영동하여 분석하였다. α-32P-ATP로 표지된 501 nt Rr-luc 센스 RNA 및 asRNA를 RNas T1로 완전히 분해시켜 길이 표준물질을 만들었다.
mRNA 절단의 분석을 위해, 5'-32P-방사능 표지된 mRNA(상기에서 기술함)를 상기에서 기술된 바와 같이[참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-3197 (1999)] dsRNA와 함께 인큐베이션하고 5%(도 5b) 및 6%(도 6c) 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔중에서 전기영동에 의해 분석하였다. 길이 표준물질은 상기 기술된 바와 같이 구아닐릴 트랜스퍼라제로 방사능 표지되고 부분적으로 염기 가수분해된 시판되는 RNA 크기 표준물질(FMC Bioproducts) 및 5'-방사능 표지된 mRNA로부터 생성된 RNase T1 래더(Ladder)를 포함하였다.
탈아미노화 검정
내부적으로 α-32P-ATP로 표지된 dsRNA(5nM)를 드로소필라(Drosophila) 용해질중에서 2시간 동안 표준 조건에서 인큐베이션하였다. 단백질 제거후에, 샘플을 12% 시퀀싱 겔상에 런닝시켜 21 내지 23 nt 생성물로부터 전장 dsRNA를 분리하였다. 0.3M NaCl중의 겔 슬라이스로부터 RNA를 밤새 용리시키고, 에탄올로 침전시키고, 원심분리에 의해 수집하고, 20㎕ 물에 재용해시켰다. 누클레아제 P1을 사용하여 RNA를 누클레오시드 5-포스페이트로 가수분해시켰다(물중 8㎕ RNA, 30mM KOAc pH 5.3, 10mM ZnSO4, 10㎍ 또는 3유닛의 누클레아제 P1을 함유하는 반응액 10㎕, 3시간, 50℃). 샘플(1ml)을 비방사성 5-모노누클레오티드[pA, pC, pG, pI, 및 pU의 0.05 O.D. 유닛 (A260)]와 함께 셀룰로오스 HPTLC 플레이트(EM Merck)상에 동시 스팟팅하고, 이소부티르산/25% 암모니아/물(66/1/33, v/v/v)에서 퍼스트 디멘션 (first dimension)으로 분리하고 0.1M 인산 나트륨, pH 6.8/황산 암모늄/1-프로판올(100/60/2, v/w/v; Silberklang et al., 1979)에서 세컨드 디멘션 (second dimension)으로 분리하였다. 비방사성 내부 표준물질의 이동을 UV-쉐도잉(shadowing)으로 측정하였다.
결과 및 토론
RNAi는 ATP를 필요로 한다.
실시예 1에서 기술한 바와 같이, 드로소필라 배아 용해질은 RNAi를 신뢰성있게 재현한다[참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)]. 종래에는, dsRNA 매개의 유전자 침묵을, 표적화된 mRNA로부터 루시퍼라제 단백질의 합성을 측정함으로써 모니터링하였다. 따라서, 이러한 RNAi 반응은 mRNA의 효율적인 번역에 필요한 ATP 재생 시스템을 포함하였다. ATP가 실제로 RNAi에 필요한지 여부를 시험하기 위하여, ATP를 ADP로 전환시키는 헥소키나제 및 글루코오스로 용해질을 처리하여 ATP를 고갈시키고, 32P로 방사능 표지된 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시퍼라제(Rr-luc) mRNA의 운명을 추적하여 RNAi를 직접 모니터링하였다(도 6). 헥소키나제 및 글루코오스 처리는 용해질중의 내인성 ATP 수준을 250μM에서 10μM 미만으로 감소시켰다. ATP 재생에는 외인성 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 포스페이트로부터 고에너지 포스페이트를 ADP에 전달하는 작용을 하는 크레아틴 키나제 둘 모두가 필요하였다. ATP가 고갈된 추출물에 크레아틴 포스페이트 또는 크레아틴 키나제를 개별적으로 보충한 경우에, RNAi는 관찰되지 않았다. 따라서, RNAi는 시험관내에서 ATP를 필요로 한다. ATP, 크레아틴 포스페이트, 및 크레아틴 키나제 모두가 ATP가 고갈된 용해질을 함유하는 반응물에 함께 첨가된 경우, Rr-luc mRNA의 dsRNA 의존적 분해가 회복되었다(도 6). 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나제 둘 모두가 존재하면 상기 고갈된 용해질에서 효율적인 RNAi에 외인성 ATP의 첨가가 요구되지 않았고, 이는 아데노신 누클레오티드의 내인성 농도(250mM)가 RNAi를 지지하는데 충분하다는 것을 나타낸다. 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제(Pp-luc) mRNA에 있어서 RNAi도 역시 ATP 의존적이었다.
Rr-dsRNA의 부재하의 Rr-luc mRNA의 안정성은, 에너지 재생 시스템이 포함된 경우에 관찰되는 것에 비해 ATP가 고갈된 용해질에서 감소하였으나, 이러한 조건하의 mRNA의 붕괴는 시험관내에서 RNAi의 특징인 신속한 분해 역학을 나타내지 않았고, dsRNA 유도된 RNAi(dsRNA-directed RNAi)의 특징인 안정한 mRNA 절단 생성물을 생성하지도 않았다. 이러한 실험들은 RNAi에 있어서 ATP 요구가 직접적인 지 (이는 RNAi 메카니즘의 하나 이상의 단계에서 ATP를 관련시킴), 또는 간접적인 지 (이는 용해질중에 또다른 누클레오시드 트리포스페이트를 고농도로 유지하는데 있어서 ATP의 역할을 반영함)을 확립하지 못한다.
번역은 시험관내에서 RNAi를 위해 요구되지 않는다.
ATP에 대한 요구는 RNAi가 고에너지 의존적 과정인 mRNA 번역과 커플링될 수 있음을 시사하였다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 단백질 합성 억제제의 존재 및 부재하에 표준 RNAi 반응에서 지정된 시간 동안 인큐베이션한 후, 5'-32P 방사능 표지된 Pp-luc mRNA의 변성 아가로오스 겔 분석을 준비함으로써 단백질 합성의 다양한 억제제를 반응에 첨가하였다. 진핵성 번역 억제제들, 즉, 초기 펩티드 결합 형성 억제제인 아니소마이신, 펩티드 사슬 연장 억제제인 사이클로헥시미드, 및 번역의 조기 종결을 초래하는 tRNA 모사체인 퓨로마이신[참조: Cundliffe, Antibiotic Inhibitors of Ribosome Function. In The Molecular Basis of Antibiotic Action, E. Gale, E. Cundliffe, P. Reynolds, M. Richmond and M. Warning, eds. (New York: Wiley), pp. 402-547 (1981)]을 시험하였다. 이들 억제제 각각은 드로소필라 용해질에서 단백질 합성을 1900배 넘게 감소시켰다(도 7a). 대조적으로, 드로소필라 미토콘드리아 단백질 합성의 억제제인 클로람페니콜[참조: Page and Orr-Weaver, Dev. Biol., 183:195-207 (1997)]은 용해질에서 번역에 전혀 영향을 미치지 않았다(도 7a). 아니소마이신, 사이클로헥시미드, 또는 클로람페니콜의 존재에도 불구하고, RNAi는 정상적인 효율로 진행되었다. 퓨로마이신도 효율적인 RNAi를 방해하지 않았다. 따라서, 단백질 합성은 시험관내에서 RNAi를 위해 요구되지 않는다.
번역 개시는 mRNA의 7-메틸 구아노신 캡의 인식을 수반하는 ATP 의존적 과정이다[참조: Kozak, Gene, 234:187-208 (1999); Merrick and Hershey, The Pathway and Mechanism of Eukaryotic Protein Synthesis. In Translational Control, J. Hershey, M. Mathews and N. Sonenberg, eds.(Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp31-69 (1996)]. 시험관내에서 RNAi를 지지하는데 사용된 드로소필라 용해질은 또한 번역의 캡 의존성을 재현하였고; 7-메틸-구아노신 캡을 갖는 Pp-luc mRNA는 A(5')ppp(5')G 캡을 갖는 동일한 mRNA의 경우 보다 10배가 넘게 보다 효율적으로 번역되었다(도 7b). 두 RNA는 모두 드로소필라 용해질에서 동등하게 안정하였고, 이는 효율성의 차이가 아데노신 캡을 갖는 mRNA의 보다 신속한 붕괴에 의해 단순히 설명될 수 없다는 것을 나타낸다[참조: Gebauer et al., EMBO J., 18:6146-54 (1999)]. 번역 기구가 7-메틸-구아노신 및 아데노신 캡을 갖는 Pp-luc mRNA들간에 구별되지 않지만, 두 mRNA는 Pp-dsRNA의 존재하에 RNAi에 대해 동등하게 민감하였다(도 7c). 이러한 결과는 캡 인식의 단계들이 RNAi와 관련되지 않음을 시사한다.
dsRNA는 21 내지 23 nt 종으로 프로세싱된다.
길이 25nt의 RNA는 식물에서 후-전사 유전자 침묵을 거치는 유전자의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두로부터 생성된다[참조: Hamilton and Baulcombe, Science, 286:950-2 (1999)]. 표준 RNAi 조건하에서, 표적 mRNA의 존재 및 부재하에, 용해질중의 균일하게 32P로 방사능 표지된 dsRNA 및 캡핑된 asRNA의 2시간 인큐베이션으로 형성된 생성물의 변성 아크릴아미드 겔 분석. dsRNA는 또한 작은 RNA 단편으로 프로세싱되는 것으로 밝혀졌다. 용해질중에서 인큐베이션한 경우, 501bp Rr-dsRNA 및 505 bp Pp-dsRNA 둘 모두의 투입 방사능의 약 15%가 21 내지 23 nt RNA 단편에서 나타났다. dsRNA는 길이가 500bp 보다 크기 때문에, 단편의 15% 수율은 다수의 21 내지 23 nt RNA가 각각의 전장 dsRNA 분자로부터 생성된다는 것을 의미한다. 다른 안정한 생성물은 검출되지 않았다. 작은 RNA 종이 두 가닥 모두 균일하게 32P로 방사능 표지된 dsRNA로부터 생성되었다. dsRNA로부터 21 내지 23 nt RNA의 형성은 상응하는 mRNA의 존재를 필요로 하지 않았고, 이는 작은 RNA 종이 dsRNA 표적화된 mRNA 분해의 생성물로서 보다는 dsRNA의 프로세싱에 의해 생성된다는 것을 나타낸다. 22개의 누클레오티드는 A-형 RNA-RNA 헬릭스의 2회전에 상응한다는 것이 주목되었다.
센스 또는 안티센스 가닥내에 방사능 표지된 dsRNA를 표준 RNAi 반응에서 용해질과 함께 인큐베이션한 경우, 21 내지 23 nt RNA는 대등한 효율로 생성되었다. 이러한 데이터는 21 내지 23 nt RNA가 dsRNA의 대칭 프로세싱에 의해 생성된다는 견해를 뒷받침한다. 다양한 데이터가 21 내지 23 nt RNA가 dsRNA로부터만 효율적으로 생성되고 단일 가닥 RNA 및 dsRNA간의 상호작용의 결과가 아니라는 견해를 뒷받침한다. 첫째로, 32P로 방사능 표지된 505nt Pp-luc 센스 RNA 또는 asRNA는 5nM 비방사성 505 bp Pp-dsRNA와 함께 인큐베이션한 경우, 21 내지 23 nt 생성물로 효율적으로 전환되지 않았다. 둘째로, mRNA 부재하에, 501 nt 7-메틸-구아노신 캡핑된 Rr-asRNA는 거의 검출되지 않는 양의 21 내지 23 nt RNA만을 생성하였고[캡핑된 단일 가닥 RNA는 용해질내에서 dsRNA와 동일하게 안정하다. 참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)], 이는 아마도 안티센스 프레퍼레이션을 오염시키는 소량의 dsRNA로 인한 것이다. 그러나, Rr-luc mRNA가 32P로 방사능 표지되고, 캡핑된 Rr-asRNA와 함께 반응에 포함된 경우, 등몰량의 Rr-dsRNA로부터 생성된 21 내지 23 nt RNA 량의 4%에 상응하는 소량의 21 내지 23 nt 생성물이 생성되었다. 이러한 결과는, Rr-luc mRNA의 부재시 보다 존재시에 현저히 많은 양의 생성물이 asRNA로부터 생성되기 때문에, Rr-asRNA 프레퍼레이션중에 오염성 dsRNA의 존재를 반영하는 것 같지는 않다. 대신, 상기 데이터는 asRNA가 상보적인 mRNA 서열과 상호작용하여 반응중에 dsRNA를 형성하고, 생성된 dsRNA가 후속하여 작은 RNA 종으로 프로세싱되는 것을 시사한다. Rr-asRNA는 시험관내에서 진정한 RNAi의 낮은 수준을 뒷받침할 수 있고(하기 참조), 이는 이러한 설명과 일치한다.
다음으로, dsRNA로부터 21 내지 23 nt RNA의 생성이 ATP를 필요로 하였는지 여부가 의문시되었다. 헥소키나제 및 글루코오스로 처리하여 ATP가 고갈된 용해질에서 505 bp Pp-dsRNA를 인큐베이션한 경우, 크레아틴 키나제 및 크레아틴 포스페이트의 포함에 의해 고갈된 용해질에서 ATP가 재생된 경우 보다 6배 더 느리기는 하지만, 21 내지 23 nt RNA가 생성되었다. 따라서, ATP는 21 내지 23 nt RNA 종의 생성을 위해 요구되지 않을 수 있지만, 대신 그 형성을 단순히 향상시킬 수 있다. 대안적으로, ATP는 dsRNA의 프로세싱을 위해 필요할 수 있는데, 단지 헥소키나제 처리후 남은 농도 미만의 농도에서 그러하다. ATP가 고갈된 용해질에서 생성된 작은 RNA 단편의 보다 느린 이동성에 대한 분자적 기초는 이해되지 않고 있다.
와그너와 선[참조: Wagner and Sun, Nature, 391:744-745 (1998)] 및 샤프[참조: Sharp, Genes Dev., 13:139-41 (1999)]는 RNAi에 의한 유전자 침묵에서 dsRNA에 대한 필요성은 상기 프로세스에서 dsRNA-특이적 아데노신 데아미나제의 수반을 반영한다고 추측하였다. dsRNA 아데노신 데아미나제는 아데노신을 이노신으로 전환시킴으로써 dsRNA를 풀고, 이노신은 우라실과 염기쌍를 이루지 않는다. dsRNA 아데노신 데아미나제는 mRNA의 후전사 편집에서 기능한다 [참조: Bass, Trends Biochem. Sci., 22:157-62 (1997)]. RNAi에서 dsRNA 아데노신 데아미나제의 수반을 시험하기 위해, 표준 시험관내 RNAi 반응에서 드로소필라 배아 용해질과의 인큐베이션 후에 501 bp Rr-luc 및 505 bp Pp-luc dsRNA에서 이노신으로의 아데노신의 전환 정도를 검사하였다. 전장 dsRNA 및 21 내지 23 nt RNA 종에서의 아데노신 탈아미노화를 2차원 박층 크로마토그래피에 의해 평가하였다. 무기 인산염(Pi)을 시판되는 누클레아제 P1을 오염시키는 포스파타제에 의해 모노누클레오티드를 분해시킴으로써 생성시켰다[참조: Auxilien et al., J. Mol. Biol., 262:437-458 (1996)]. 21 내지 23 nt 종에서의 아데노신 탈아미노화의 정도를 또한 측정하였다. [32P]-아데노신으로 방사능표지된 전장 dsRNA를 상기 용해질중에 인큐베이션시키고, 전장 dsRNA 및 21 내지 23 nt RNA 생성물 둘 모두를 변성 아크릴아미드 겔로부터 정제하여, 누클레아제 P1을 사용하여 모노누클레아제로 절단하고, 이차원 박층 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
전장 dsRNA에서 아데노신의 상당한 분획은 2시간 후에 이노신으로 전환되었다(Pp-luc 및 Rr-luc dsRNA에 대해 각각 3.1% 및 5.6% 전환). 이와 대조적으로, 21 내지 23 nt 종에서 아데노신의 단지 0.4%(Pp-dsRNA) 또는 0.7%(Rr-dsRNA)만이 탈아미노화되었다. 이들 데이터는 21 내지 23 nt RNA 종의 27개 분자에서 1개도 안되는 분자가 이노신을 함유함을 암시한다. 그러므로, 21 내지 23 nt 종내에서 dsRNA 의존성 아데노신 탈아미노화는 이의 생성을 위해 필요치 않은 것 같다.
asRNA는 시험관내에서 소량의 RNAi를 일으킨다
mRNA가 5'-7-메틸-구아노신 캡내에서 32P-방사능표지된 경우, 안정한 5' 붕괴 생성물이 RNAi 반응 동안 축적된다. 이러한 안정한 5' 붕괴 생성물을 이들의 동계 dsRNA와 함께 인큐베이션시킨 경우 Pp-luc 및 Rr-luc mRNA 둘 모두에 대해 관찰하였다. 이전에, asRNA가 dsRNA 대신에 사용되는 경우 효과적인 RNAi가 일어나지 않음이 보고되었다[참조: Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191-7 (1999)]. 그럼에도 불구하고, mRNA는 완충액과 함께 인큐베이션되는 경우 보다 asRNA와 함께 인큐베이션되는 경우 다소 덜 안정하였다(도 8a 및 도 8b). 이것은 특히 Rr-luc mRNA에 대해 명백하였다: 용해질중에 인큐베이션시킨지 3시간 후에 RNA의 약 90%가 온전하게 남아있었지만, asRNA가 첨가된 경우에는 불과 50%였다. dsRNA가 첨가된 경우에는 5% 미만이었다. 흥미롭게도, asRNA에 의해 야기된 mRNA 안정성의 감소는 dsRNA에 의한 RNAi 반응의 특징인 소량의 안정한 5'-붕괴 생성물의 형성을 수반하였다. 이러한 발견은 mRNA와 함께 인큐베이션되었을 때 소량의 21 내지 23 nt 생성물이 asRNA로부터 형성되었다는 관찰과 일치하며 (상기 참조), asRNA가 비효율적이긴 하지만 RNAi 경로에 들어갈 수 있다는 견해에 힘을 더해준다.
mRNA 절단 부위는 dsRNA의 서열에 의해 결정된다
mRNA 절단 부위를 약 100 nt에 의해 Rr-luc 서열을 따라 배치된 3가지의 상이한 dsRNA, 'A', 'B' 및 'C'를 사용하여 검사하였다. 3가지 dsRNA, 'A, 'B' 및 'C' 각각 또는 완충액(Ø)과 함께 지정된 시간 동안 Rr-luc mRNA를 인큐베이션시킨 후에 생성된 안정한 5'-절단 생성물의 변성 아크릴아미드-겔 분석을 수행하였다. Rr-luc mRNA 서열에 대한 이들 위치들을 도 9에 도시하였다. 3가지 dsRNA 각각을 5'-캡내에서 32P-방사능표지된 Rr-luc mRNA와 함께 표준 RNAi 반응에서 인큐베이션시켰다. dsRNA의 부재하에서는, 심지어 용해질중에서 3시간 인큐베이션 후에도, 어떠한 안정한 5'-절단 생성물도 상기 mRNA에 대해 검출되지 않았다. 이와 대조적으로, 20분 인큐베이션 후에, 3가지 dsRNA 각각은 특정 dsRNA에 대한 특징인 한 세트의 mRNA 절단 생성물에 상응하는 밴드의 래더(ladder)를 생성시켰다. 각 dsRNA에 대해, 안정한 5' mRNA 절단 생성물은 dsRNA에 상응했던 Rr-luc mRNA의 영역에 제한되었다(도 9 및 도 10). dsRNA 'A'에 대해, 5'-절단 생성물의 길이는 236 내지 약 759 nt 바로전 이었고; dsRNA 'A'는 Rr-luc mRNA의 누클레오티드 233 내지 729에 걸쳐있다. dsRNA 'B'와 함께 mRNA의 인큐베이션은 길이가 150 내지 약 600 nt인 mRNA 5'-절단 생성물을 생성시켰고; dsRNA 'B'는 상기 mRNA의 누클레오티드 143 내지 644에 걸쳐있다. 마지막으로, dsRNA 'C'는 길이가 66 내지 약 500 nt인 mRNA 절단 생성물을 생성시켰다. 이 dsRNA는 Rr-luc mRNA의 누클레오티드 50 내지 569에 걸쳐있다. 그러므로, dsRNA는 RNAi 반응에 대한 특이성을 제공하여 전체 세포성 mRNA 푸울로부터 어떠한 mRNA가 분해되는 지를 선택할 뿐만 아니라 mRNA 서열을 따라 정확한 절단 위치를 결정한다.
상기 mRNA는 21 내지 23 누클레오티드 간격으로 절단된다
RNAi에 대한 메카니즘을 추가로 조사하기 위해, 3가지 dsRNA 각각에 대해 수개의 mRNA 절단 부위의 위치를 맵핑하였다(도 10). 상기 기술한 5'-절단 생성물의 서브셋의 고해상도 변성 아크릴아미드-겔 분석을 수행하였다. 주목할만하게도, 대부분의 절단은 21 내지 23 nt 간격으로 일어났다(도 10). 이러한 간격은 dsRNA가 21 내지 23 nt RNA 종으로 프로세싱된다는 본 발명자들의 관찰 및 25 nt RNA가 식물에서의 후-전사 유전자 침묵과 상호관련있다는 해밀톤과 바울콤베의 발견[참조: Hamilton and Baulcombe, Science, 286:950-2 (1999)]에 비추어 특히 현저하였다. 본 발명자들이 맵핑한 16개 절단 부위중에서(daRNA 'A' 2개, dsRNA 'B' 5개 및 dsRNA 'C' 9개), 2개를 제외하고는 모두 21 내지 23 nt 간격을 반영하였다. 2개의 예외적인 절단중 하나는 dsRNA 'C'에 의해 생성된 약한 절단 부위였다(도 10에서 청색 개방환으로 표시됨). 이러한 절단은 다음 절단 부위에 대해 5'쪽으로 32 nt에서 일어났다. 다른 예외는 특히 흥미로웠다. 21 내지 23 nt 거리의 공백을 둔 4개의 절단 후에, dsRNA 'C'는 이전의 절단 부위에 대해 3'쪽으로 단 9개 nt의 mRNA의 절단을 초래하였다(도 10에서 적색 화살촉). 이러한 절단은 연속적인 7개의 우라실 잔기에서 일어났고 절단을 위한 자를 "재설정"한 듯 하며; 다음 절단 부위는 상기 예외적인 부위에 대해 3'쪽으로 21 내지 23 nt 였다. 본 발명자들이 맵핑한 3개의 후속하는 절단 부위들은 또한 21 내지 23 nt 거리의 간격이었다. 이상하게도, 3가지 상이한 dsRNA에 의해 초래된 16개의 절단 부위중에서, 14개는 우라실 잔기에서 일어났다. 이러한 발견의 중요성은 밝혀지지 않았지만, mRNA 절단이 21 내지 23 nt 간격을 측정하고 우라실에서 절단에 대한 서열 선호도를 가지는 방법에 의해 결정됨을 시사한다. 결과들은 용해질중에서의 약 500 bp dsRNA의 인큐베이션에 의해 생성된 21 내지 23 nt RNA 종이 아크릴아미드 겔로부터 분리되어 전장 dsRNA 대신에 새로운 RNAi 반응에 첨가되는 경우 시험관내에서 서열 특이적인 간섭을 일으킴을 보여준다.
dsRNA 유도된(daRNA-directed) mRNA 절단을 위한 모델
이론에 얽매이고 싶지 않지만, 캐노라브디티스 엘레강스(C. elegans) 및 뉴로스포라(Neurospora)에서의 최근 유전학적 실험[참조: Cogoni and Macino, Nature, 399:166-9 (1999); Grishok et al., Science, 287:2494-7 (2000); Ketting et al., Cell, 99:133-41 (1999); Tabara et al., Cell, 99:123-32 (1999)]과 함께 본원에 기술한 생화학적 데이터는 어떻게 dsRNA가 파괴를 위해 mRNA를 표적화하는지에 대한 모델을 제안한다(도 11). 이러한 모델에서, dsRNA는 우선 캐노라브디티스 엘레강스 좌위 rde-1 및 rde-4와 같은 유전자와 관련되어 있을 것 같은 과정에서 21 내지 23 nt 긴 단편으로 절단된다. 그런 다음 아마도 RNAi 특이적 단백질에 의해 결합된 짧은 asRNA로서 생성된 단편은 mRNA와 쌍을 이루고 mRNA를 절단하는 누클레아제를 보충한다. 또한, mRNA에 가까운 21 내지 23 nt dsRNA 단편을 일시적으로 가진 단백질-RNA 복합체에서 가닥 교환이 일어날 수도 있다. 단편화 이후 dsRNA의 두 가닥의 분리는 ATP 의존성 RNA 헬리카제에 의해 보조될 수 있으며, 이는 21 내지 23 nt RNA 생성의 관찰된 ATP 증강을 설명해준다.
각각의 작은 RNA 단편은 mRNA, 아마도 21 내지 23 nt 단편의 5' 또는 3' 말단에 하나 또는 기껏해야 두개의 절단을 생성시키는 것 같다. 상기 작은 RNA들은 캐노라브디티스 엘레강스의 ego-1 유전자[참조: Smardon et al., Current Biology, 10:169-178 (2000)] 또는 뉴로스포라의 qde-1 유전자[참조: Cogoni and Macino, Nature, 399:166-9 (1999)]에 의해 엔코딩된 효소와 같은 RNA 주형 RNA 중합효소(RNA-directed RNA polymerase)에 의해 증폭되어, RNAi 효과를 개시시켰던 dsRNA의 부재하에 오래 지속되는 후-전사 유전자 침묵을 생성시킬 수 있다. 캐노라브디티스 엘레강스의 유전가능한 RNAi는 개시를 위해 rde-1 및 rde-4 유전자를 필요로 하지만, 후속적으로 생성을 지속시키기 위해서는 그렇지 않다. 캐노라브디티스 엘레강스의 rde-2, rde-3 및 mut-7 유전자는 RNAi가 일어나는 경우 조직에서 필요로 하지만, 유전가능한 RNAi의 개시를 위해서는 필요로 하지 않는다[참조: Grishok et al., Science, in press 2000]. 이러한 '이펙터' 유전자[참조: Grishok et al., Science, in press 2000]는 mRNA 표적의 실제적인 선택 및 이들의 후속적인 절단에서 기능하는 단백질을 엔코딩하는 것 같다. ATP는 dsRNA상의 복합체 형성, dsRNA 절단 동안 또는 절단 후에 가닥 분리, 21 내지 23 nt RNA와 표적 mRNA와의 쌍형성, mRNA 절단 및 복합체 표적화의 재순환을 포함하는, RNAi 동안 임의의 수많은 단계 중 어느 하나에서 요구될 수 있다. 시험관내 RNAi 시스템을 사용하여 이러한 개념을 시험하는 것은 미래를 위한 중요한 도전일 것이다. RNAi와 관련된 일부 유전자들은 또한 트랜스포손 침묵 및 공동 억제를 위해 중요하다. 공동 억제는 식물, 곤충 및 사람에게도 미치는 광범한 생물학적 현상이다. 드로소필라 멜라노카스터(Drosophila melanogaster)(노랑초파리)에서 가능성이 높은 메카니즘은 전사적 침묵이다[참조: Pal-Bhanra et al, Cell 99: 35-36]. 따라서, 21 내지 23 nt 단편들은 전사 제어 뿐만 아니라 후-전사 제어와 관련되어 있는 것 같다.
실시예 3 분리된 21 내지 23 량체는 새로운 RNAi 반응에 첨가되는 경우 서열 특이적 간섭을 일으켰다
용해질중에서의 500 bp dsRNA의 인큐베이션 반응물로부터 21 내지 23 nt 단편들의 분리.
이중가닥 RNA(500 bp)를 상기 기술된 표준 조건하에서 드로소필라 배아 용해질중에 10 nM 농도로 25℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플의 단백질제거 후에, 21 내지 23 nt 반응 생성물을 변성 폴리아크릴아미드(15%) 겔 전기영동법에 의해 프로세싱되지 않은 dsRNA로부터 분리하였다. 방사능표지되지 않은 21 내지 23 nt 단편의 검출을 위해, 방사능표지된 dsRNA와의 인큐베이션 반응물을 동일한 겔의 별도의 레인에 로딩시켰다. 비-방사능 21 내지 23 nt 단편을 함유하는 겔 슬라이스를 도려내고 21 내지 23 nt 단편을 겔 슬라이스로부터 4℃에서 0.3 M NaCl 0.4 ml중에서 밤새 용리시켰다. 상기 RNA를 에탄올 침전 및 원심분리에 의해 상층액으로부터 회수하였다. RNA 펠렛을 용해 완충액 10 ㎕중에 용해시켰다. 대조표준으로서, 21 내지 23 nt 밴드의 조금 위와 조금 아래의 겔 슬라이스를 또한 도려내고 동일한 용리 및 침전 과정으로 처리하였다. 또한, 인큐베이션시키지 않은 dsRNA를 15% 겔상에 로딩시키고 21 내지 23 nt 단편에 상응하는 겔 슬라이스를 도려내어 용리시켰다. 대조 실험으로부터의 모든 펠렛을 용해 완충액 10 ㎕중에 용해시켰다. 용리에 의한 겔 슬라이스로부터의 회수 동안 RNA의 손실은 약 50%였다.
번역에 기초한 RNAi 검정에서 정제된 21 내지 23 nt 단편의 인큐베이션
용리된 21 내지 23 량체 또는 대조 RNA 용액 1 ㎕를 표준 10 ㎕ RNAi 인큐베이션 반응을 위해 사용하였다(상기 참조). 21 내지 23 량체를 반응 혼합물을 함유하는 용해질중에서 10분 또는 30분 동안 예비인큐베이션시킨 후에 표적 및 대조 mRNA를 첨가하였다. 예비-인큐베이션 동안, RNA 간섭에 관여하는 단백질은 이들 RNA상에 존재하는 특이적인 시그널에 기인하여 21 내지 23 량체와 재결합할 수 있다. 인큐베이션을 추가 1시간 동안 계속하여 표적 및 대조 mRNA의 번역이 가능하도록 하였다. 반응을 패시브 용해 완충액(Promega)을 첨가함으로써 켄칭시키고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. RNA 간섭은 RNA 비함유 완충액 대조표준에 의해 표준화된 대조 루시퍼라제 활성 대 표적의 비로서 표현하였다. 표적 유전자의 특이적인 억제를 10분 또는 30분 예비-인큐베이션으로 관찰하였다. 상기 억제는 재현가능하였고 표적 대 대조표준의 상대적인 비를 2 내지 3배까지 감소시켰다. 대조표준으로서 분리된 RNA 단편중 어떤 것도 특이적인 간섭을 나타내지 않았다. 비교를 위해, 5 nM 500 bp dsRNA의 인큐베이션(10분 예비-인큐베이션)은 대조표준 대 표적 유전자의 상대적인 비에 약 30배로 영향을 미쳤다.
새로운 용해질 인큐베이션 반응에서 분리된 21 내지 23 nt 단편의 안정성.
정제된 21 내지 23 nt RNA 단편에 의해 매개된 RNAi의 관찰과 일치하게, 투입 21 내지 23 nt RNA중 35%가 이러한 인큐베이션 반응에서 3시간 이상 동안 지속되었음이 밝혀졌다. 이것은 세포성 인자가 단백질제거된 21 내지 23 nt 단편과 결합하여 기능적인 mRNA-분해 입자를 재구성함을 시사한다. 이들 21 내지 23 nt 단편, 또는 이들의 가능한 이중가닥 특성 또는 특이적인 길이와 관련된 시그널이 이러한 결과를 초래한 것 같다. 21 내지 23 nt 단편은 과요오드산염 처리 및 베타-제거 이후 시퀀싱 겔상에서 변경된 이동성에 의해 증명된 바와 같이, 말단 3' 하이드록실기를 가진다.
실시예 4 비-변성 방법에 의해 정제된 21 내지 23 량체는 새로운 RNAi 반응에 첨가되는 경우 서열 특이적인 간섭을 야기시킨다.
50 nM의 이중가닥 RNA(실시예 1에서 기술한 바와 같이, 501 bp Rr-luc dsRNA)를 용해질과 함께 시험관내 반응물 1 ml중에 25℃에서 인큐베이션시켰다(실시예 1 참조). 그런 다음 반응을 동일한 부피의 2x PK 완충액을 첨가함으로써 중지시키고(실시예 1 참조) 단백질가수분해효소 K를 1.8 ㎍/㎕의 최종 농도로 첨가하였다. 반응물을 25℃에서 추가 1시간 동안 인큐베이션시키고, 페놀 추출한 다음, RNA를 3배 부피의 에탄올로 침전시켰다. 에탄올 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 펠렛을 용해 완충액 100 ㎕중에 재현탁시키고 용해 완충액에서 0.75 ml/분으로 작동하는 Superdex HR 200 10/30 겔 여과 컬럼 (Pharmacia)에 적용시켰다. 200 ㎕ 분획을 컬럼으로부터 수집하였다. 3 M 소듐 아세테이트 20 ㎕ 및 20 ㎍ 글리코겐을 각 분획에 첨가하였고, RNA를 3배 부피의 에탄올을 사용한 침전에 의해 회수하였다. 침전물을 용해 완충액 30 ㎕중에 재현탁시켰다. 32P-표지된 투입 RNA의 분별화 이후 컬럼 프로파일을 도 13a에 도시하였다.
각각의 재현탁된 분획 1 ㎕를 표준 시험관내 RNAi 반응물 10 ㎕중에 시험하였다(실시예 1 참조). 본 방법은 컬럼상에 로딩하기 이전에 본래의 반응에서 상기 RNA 종의 농도와 대략적으로 동일한 시험관내 RNAi 반응에서의 RNA의 농도를 생성시켰다. 분획들을 10 nM Rr-luc mRNA 표적 및 10 nM Pp-luc 대조 mRNA의 첨가 전에 30분 동안 반응 혼합물을 함유하는 용해질에서 예비인큐베이션시켰다. 예비-인큐베이션 동안, RNA 간섭에 관여하는 단백질은 이들 RNA상에 존재하는 특이적인 시그널에 기인하여 21 내지 23 량체와 재결합할 수 있다. 인큐베이션을 추가 3시간 동안 계속하여 표적 및 대조 mRNA의 번역이 가능하도록 하였다. 반응을 패시브 용해 완충액 (Promega)의 첨가에 의해 켄칭시키고, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 정제된 21 내지 23 nt 단편에 의한 Rr-luc mRNA 표적 발현의 억제는 재현가능하였고 표적 대 대조표준의 상대적인 비를 30배 이상까지 50 nM 500 bp dsRNA 대조표준과 유사한 양으로 감소시켰다. 표적 mRNA 발현의 억제는 특이적이었으며: Pp-luc mRNA 대조표준의 발현에 대한 영향는 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.
상기 데이터는 절단되지 않은 dsRNA(분획 3 내지 5) 또는 길고 부분적으로 절단된 dsRNA(분획 7 내지 13)를 함유하는 분획들 및 완전히 프로세싱된 21 내지 23 nt siRNA를 함유하는 분획들(분획 41 내지 50) 둘 모두가 시험관내에서 효과적인 RNA 간섭을 매개함을 보여준다(도 13b). 표적 mRNA 발현의 억제는 특이적이며: Pp-luc mRNA 대조표준의 발현에 대한 영향은 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다(도 13c). 이전의 실시예에서의 데이터와 함께 이들 데이터는 21 내지 23 nt siRNA가 (1) RNAi 경로의 진정한 중간생성물이고 (2) 시험관내에서 RNA 간섭의 효과적인 매개체임을 보여준다.
실시예 5 21 누클레오티드 siRNA 듀플렉스는 사람 조직 배양물에서 RNA 간섭을 매개한다
방법
RNA 프레퍼레이션
21 nt RNA를 Expedite RNA 포스포라미디트 및 티미딘 포스포라미디트 (Proligo, Germany)를 사용하여 화학적으로 합성하였다. 합성 올리고누클레오티드를 탈보호시키고 겔-정제[참조: Elbashir, S.M., Lendeckel, W. & Tuschul, T., Gene & Dev. 15, 188-200 (2001)]에 이어 Sep-Pak C18 카트리지(Waters, Milford, MA, USA) 정제[참조: Tuschl, T., et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)]시켰다. 표적화하는 GL2(Acc. X65324) 및 GL3 루시퍼라제(Acc. U47296)를 표적화하는 siRNA 서열은 개시 코돈의 첫번째 누클레오티드에 대한 코딩 영역 153-173에 상응하였고, RL(Acc. AF025846)을 표적화하는 siRNA은 개시 코돈 이후 영역 119-129에 상응하였다. 더 긴 RNA는 PCR 생성물로부터 T7 RNA 중합효소를 사용하여 전사시킨 후에, 겔 및 Sep-Pak 정제를 수행하였다. 49 및 484 bp GL2 또는 GL3 dsRNA는 번역의 개시점에 대해, 각각 위치 113-161 및 113-596에 상응하였고; 50 및 501 bp RL dsRNA는 각각 위치 118-167 및 118-618에 상응하였다. 사람화된 GFP(hG)를 표적화하는 dsRNA 합성을 위한 PCR 주형을 pAD3로부터 증폭시켰고[참조: Kehlenbach, R.H., et al., J. Cell Biol., 141:863-874 (1998)], 이에 의하여 50 및 501 bp hG dsRNA는 개시 코돈에 대해 각각 위치 118-167 및 118-618에 상응하였다.
siRNA의 어닐링을 위해, 20 μM 단일 가닥을 어닐링 완충액(100 mM 칼륨 아세테이트, 30 mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mM 마그네슘 아세테이트)중에 90℃에서 1분에 이어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 37℃ 인큐베이션 단계를 50 및 500 bp dsRNA를 위해 밤새 연장시키고, 이러한 어닐링 반응을 각각 8.4 μM 및 0.84 μM 가닥 농도에서 수행하였다.
세포 배양
S2 세포를 10% FBS, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 슈나이더(Schneider) 드로소필라 배지(Life Technologies)중에 25℃에서 증식시켰다. 293, NIH/3T3, HeLa S3, COS-7 세포를 10% FBS, 100 유닛/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 개질된 이글스 배지중에 37℃에서 성장시켰다. 세포를 정기적으로 계대시켜 지수 성장을 유지시켰다. 트랜스펙션시키기 24시간 전에 약 80% 컨플루언스가 되게 하고, 포유류 세포를 트립신처리하고 항생제가 없는 신선한 배지를 사용하여 1:5로 희석시키고(1-3 x 105 세포/ml) 24-웰 플레이트로 옮겼다(500 ㎕/웰). S2 세포를 분할하기 전에 트립신처리하지 않았다. 트랜스펙션을 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(Life Technologies)을 사용하여 점착성 세포주에 대한 제조업체의 설명대로 수행하였다. 웰당 리포솜내로 포뮬레이션된, 1.0 ㎍ pGL2-대조군(Promega) 또는 pGL3-대조군(Promega), 0.1 ㎍ pRL-TK(Promega) 및 0.28 ㎍ siRNA 듀플렉스 또는 dsRNA를 적용시켰으며; 최종 부피는 웰당 600 ㎕였다. 세포를 트랜스펙션한지 20시간 후에 인큐베이션시켰으며 그후 건강해 보였다. 루시퍼라제 발현을 듀얼 루시퍼라제 검정(Promega)를 사용하여 후속적으로 모니터링하였다. 트랜스펙션 효율을 1.1 ㎍ hGFP-엔코딩 pAD322 및 0.28 ㎍ invGL2 siRNA의 공동-트랜스펙션 후에 포유류 세포주에 대한 형광 현미경법에 의해 측정하였고, 70 내지 90%였다. 리포터 플라스미드를 XL-1 블루(Strategene)에서 증폭시키고 퀴아젠 엔도프리 플라스미드 키트(Qiagen EndoFree Maxi Plasmid Kit)를 사용하여 정제하였다.
결과
RNA 간섭(RNAi)은 침묵된 유전자와 서열 상응성인 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 개시되는, 동물 및 식물에서 서열 특이적이고, 후-전사적인 유전자 침묵의 과정이다[참조: Fire, A., Trends Genet., 15:358-363 (1999); Sharp, P.A. & Zamore, P.D., Science, 287:2431-2433 (2000); Sijen, T. & Kooter, J.M., Bioessays, 22:520-531 (2000); Bass, B.L., Cell, 101:235-238 (2000); Hammond, S.M., et al., Nat. Rev. Genet., 2:110-119 (2001)]. 서열 특이적 mRNA 분해의 매개체는 더 긴 dsRNA6-10으로부터 RNase III 절단에 의해 생성된 21 내지 22 nt 작은 간섭 RNA(siRNA)이다[참조: Hamilton, A.J. & Baulcombe, D.C., Science, 286:950-952 (1999); Hammond, S.M., et al., Nature, 404:293-296 (2000); Zamore, P.D., et al., Cell, 101:25-33 (2000); Bernstein, E., et al., Nature, 409:363-366 (2001); Elbashir, S.M., et al., Genes & Dev., 15:188-200 (2001)]. 본원에 제시된 바와 같이, 21 nt siRNA 듀플렉스는 사람 태아 신장(293) 및 HeLa 세포를 포함하는, 다양한 포유류 조직 배양물에서 리포터 유전자 발현을 특이적으로 억제시킬 수 있다. 50 또는 500 bp dsRNA와는 대조적으로, siRNA는 인터페론 반응을 활성화시키지 않는다. 이들 결과는 siRNA 듀플렉스가 포유류 세포에서 유전자 기능의 서열 특이적 불활성화를 위한 일반적인 도구임을 시사한다.
오버행 3' 말단을 지닌 염기쌍을 이룬 21 및 22 nt siRNA는 드로소필라 멜라노가스터 배아로부터 제조된 용해질에서 효율적인 서열 특이적 mRNA 분해를 매개한다[참조: Elbashir, S.M., et al., Genes & Dev., 15:188-200 (2001)]. siRNA가 또한 조직 배양에서 RNAi를 매개할 수 있는지를 시험하기 위해, 씨팬지(sea pansy)(Renilla reniformis) 및 반딧불이의 2가지 서열 변이체(Photinus pyralis, GL2 및 GL3) 루시퍼라제를 코딩하는 리포터 유전자에 대해 유도된 대칭형 2 nt 3' 오버행을 가진 21 nt siRNA 듀플렉스(도 14a, 14b)를 작제하였다. siRNA 듀플렉스를 양이온성 리포솜을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터 슈나이더 S2 세포 또는 포유류 세포내로 리포터 플라스미드 배합물 pGL2/pRL 또는 pGL3/pRL로 공동-트랜스펙션시켰다. 루시퍼라제 활성을 트랜스펙션시킨지 20시간 후에 측정하였다. 시험된 모든 세포주에서, 동계 siRNA 듀플렉스의 존재하에 리포터 유전자의 발현의 특이적인 감소가 관찰되었다(도 15a-15j). 주목할만하게도, 고유한 루시퍼라제 발현 수준은 비-동계 siRNA에 의해 영향을 받지 않았으며, 이는 21 nt RNA 듀플렉스에 의한 유해한 부작용의 부재를 시사한다(예컨대, HeLa 세포에 대해서는 도 16a-16d 참조). 드로소필라 멜라노가스터 S2 세포(도 15a, 15b)에서, 루시퍼라제의 특이적인 억제는 완전하였고, 이는 더 긴 dsRNA에 대해 이전에 수득된 결과와 유사하였다[참조: Hammond, S.M., et al., Nature, 404:293-296 (2000); Caplen, N.J., et al., Gene, 252:95-105 (2000); Clemens, M & Williams, B., Cell, 13:565-572 (1978); Ui-Tei, K., et al., FEBS Letters, 479:79-82 (2000)]. 포유류 세포에서, 리포터 유전자는 50 내지 100배 더욱 강력하게 발현되었고, 특이적인 발현은 덜 완전하였다(도 15c-15j). GL2 발현은 동계 siRNA에 비해 3 내지 12배, GL3 발현은 9 내지 25배, RL 발현은 1 내지 3배 감소하였다. 293 세포에 대해, RL siRNA에 의한 RL 루시퍼라제의 표적화는 GL2 및 GL3 표적이 특이적으로 반응하였음에도 불구하고 비효율적이었다(도 15i, 15j). 293 세포에서 RL 발현의 감소의 결여는 시험된 임의의 다른 포유류 세포주에 비해 5 내지 20배 더 높은 발현 및/또는 RNA 이차 구조 또는 관련 단백질에 기인한 표적 서열의 제한된 접근성에 기인한다. 그럼에도 불구하고, 동계 siRNA 듀플렉스에 의한 GL2 및 GL3 루시퍼라제의 특이적인 표적화는 RNAi가 또한 293 세포에서 기능적임을 시사하였다.
uGL2를 제외한 모든 siRNA 듀플렉스에서 2 nt 3' 오버행은 (2'-데옥시)티미딘으로 구성되었다. 3' 오버행에서 티미딘에 의한 우리딘의 치환은 시험관내 시스템의 드로소필라 멜라노가스터에서 잘 허용되었고, 오버행의 서열은 표적 인식을 위해 중요하지 않았다[참조: Elbashir, S.M., et al., Genes & Dev., 15:188-200 (2001)]. 티미딘 오버행을 선택하였는데, 그 이유는 조직 배양 배지 및 트랜스펙션된 세포내에서 siRNA의 누클레아제 내성을 향상시킨다고 생각되기 때문이다. 실제로, 티미딘-개질된 GL2 siRNA는 시험된 모든 세포주에서 개질되지 않은 uGL2 siRNA 보다 약간 더 강력하였다(도 15a, 15c, 15e, 15g, 15i). 3' 오버행 누클레오티드의 추가적인 개질은 siRNA 듀플렉스의 운반 및 안정성에 추가적인 잇점을 제공할 것이라고 생각될 수 있다.
공동-트랜스펙션 실험에서, 조직 배양 배지의 최종 부피에 관하여 25 nM siRNA를 사용하였다(도 15a-15j, 16a-16f). siRNA 농도를 100 nM로 증가시키는 것은 특이적인 침묵 효과를 향상시키지 않았지만, 플라스미드 DNA와 siRNA간에 리포솜 캡슐화에 대한 경쟁에 기인하여 트랜스펙션 효율에 영향을 미치기 시작하였다. siRNA 농도를 1.5 nM로 감소시키는 것은, 심지어 siRNA를 DNA 플라스미드 보다 단지 2 내지 20배 더 농축시켰음에도 불구하고, 특이적인 침묵 효과를 감소시키지 않았다. 이것은 siRNA가 유전자 침묵을 매개하기 위한 매우 강력한 시약이고, siRNA가 통상적인 안티센스 또는 리보자임 유전자 표적화 실험에서 적용되는 농도 보다 몇배 낮은 농도에서도 효과적임을 시사한다.
포유류 세포에 대한 더 긴 dsRNA의 효과를 모니터링하기 위해, 리포터 유전자와 동계인 50 및 500 bp dsRNA를 제조하였다. 비특이적인 대조표준으로서, 사람화된 GFP(hG)로부터의 dsRNA를 사용하였다[참조: Kehlenbach, R.H., et al., J. Cell Biol., 141:863-874 (1998)]. dsRNA가 공동-트랜스펙션되는 경우, siRNA 듀플렉스에 대해 동일한 양(농축물이 아님)에서, 리포터 유전자 발현은 강력하고 비특이적으로 감소되었다. 이러한 효과를 대표적인 예로서 HeLa 세포에 대해 예증하였다(도 16a-16d). 고유한 루시퍼라제 활성은 각각 50 bp dsRNA에 의해 10 내지 20배, 500 bp dsRNA 공동-트랜스펙션에 의해 20 내지 200배 비특이적으로 감소되었다. 유사한 비특이적 효과는 COS-7 및 NIH/3T3 세포에 대해 관찰되었다. 293 세포에 대해, 10배 내지 20배 비특이적 감소는 500 bp dsRNA에 대해서만 관찰되었다. 30 bp 초과 dsRNA에 의한 리포터 유전자 발현에서의 비특이적 감소는 인터페론 반응의 부분으로서 예상되었다[참조: Matthews, M., Interactions between viruses and the cellular machinery for protein synthesis in Translationl Control (eds., Hershey, J., Matthews, M. & Sonenberg, N.) 505-548 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY; 1996); Kumar, M. & Carmichael, G.G., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62:1415-1434 (1998); Stark, G.R., et al., Annu. Rev. Biochem., 67:227-264 (1998)]. 놀랍게도, 리포터 유전자 발현에서의 강력한 비특이적 감소에도 불구하고, 추가적인 서열 특이적인, dsRNA 매개된 침묵이 재현성있게 검출되었다. 그러나 특이적인 침묵 효과는 상대적인 리포터 유전자 활성이 hG dsRNA 대조표준에 대해 표준화된 경우에만 분명하였다(도 16e, 16f). 동계 dsRNA에 비해 2 내지 10배의 특이적인 감소가 관찰되었고, 시험된 다른 3가지 포유류 세포주에서도 그러하였다. dsRNA(356-1662 bp)를 사용한 특이적인 침묵 효과는 CHO-K1 세포에서 이전에 보고되었지만, 2 내지 4배의 특이적인 감소를 검출하기 위해 필요한 dsRNA의 양은 본 발명자들의 실험에서 보다 약 20배 많았다[참조: Ui-Tei, K., et al., FEBS Letters, 479:79-82 (2000)]. 또한, CHO-K1 세포는 인터페론 반응에 결함이 있어 보인다. 또 다른 보고에서, 293, NIH/3T3 및 BHK-21 세포는 루시퍼라제/lacZ 리포터 배합물 및 829 bp 특이적 lacZ 또는 717 bp 비특이적 GFP dsRNA를 사용하여 RNAi에 대해 시험되었다[참조: Caplen, N.J., et al., Gene, 252:95-105 (2000)]. 이 경우에 RNAi를 검출하는데 실패하였는데 이는 덜 민감한 루시퍼라제/lacZ 리포터 검정 및 표적과 대조 dsRNA의 길이 차이 때문인것 같다. 종합하면, 본원에 기술된 결과들은 RNAi가 포유류 세포에서 활성이지만, 침묵 효과는 인터페론 시스템이 30 bp 초과 dsRNA에 의해 활성화되는 경우에는 검출되기 어려움을 시사한다.
포유류 세포에서 21 nt siRNA 매개된 간섭 과정에 대한 메카니즘은 밝혀지지 않은 채로 남아있으며, 침묵은 후-전사 및/또는 전사적으로 일어날 수 있다. 드로소필라 멜라노가스터 용해질에서, siRNA 듀플렉스는 siRNA-단백질 복합체(siRNP)의 재구성에 의해 후-전사적 유전자 침묵을 매개하며, 이는 mRNA 인식 및 표적화된 절단을 유도한다[참조: Hammond, S.M., et al., Nature, 404:293-296 (2000); Zamore, P.D., et al., Cell, 101:25-33 (2000); Elbashir, S.M., et al., Genes & Dev., 15:188-200 (2001)]. 식물에 있어서, dsRNA 매개된 후-전사적 침묵은 또한 RNA-유도된 DNA 메틸화와 연관되어 있으며, 이는 또한 21 nt siRNA에 의해 유도될 수 있다[참조: Wassenegger, M., Plant Mol. Biol, 43:203-220 (2000); Finnegan, E.J., et al., Curr. Biol., 11:R99-R102 (2000)]. 프로모터 영역의 메틸화는 전사적 침묵을 유도할 수 있지만[참조: Metter, M.F., et al., EMBO J., 19:5194-5201 (2000)], 코딩 서열에서의 메틸화는 그러하지 않을 것이다 [참조: Wang, M. B., RNA, 7:16-28 (2001)]. 포유동물에서 DNA 메틸화 및 전사적 침묵은 널리 문헌화된 과정이지만[참조: Kass, S.U., et al., Trends Genet., 13:444-449 (1997); Razin, A., EMBO J, 17:4905-4908 (1998)], 이들은 후-전사적 침묵과 연관된 적이 없었다. 포유동물에서 메틸화는 주로 CpG 잔기에 대해 유도된다. RL siRNA에 CpG가 존재하지 않지만, RL siRNA가 포유류 조직 배양에서 특이적인 침묵을 매개하기 때문에, DNA 메틸화가 본 발명자들이 관찰한 침묵 과정을 위해 중요한 것 같지는 않다. 요약하면, 본원에 기술된 내용은 포유류 세포에서의 siRNA 매개된 유전자 침묵이다. 21 nt siRNA의 사용은 사람 조직 배양에서 유전자 기능의 불활성화 및 유전자 특이적 치료학의 개발을 위한 뛰어난 가망성을 가지고 있다.
본 발명이 본 발명의 바람직한 구체예에 대한 참조와 함께 상세하게 제시되고 설명되었지만, 첨부된 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 수행될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
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Claims (1)

  1. (a) 분해시키기 위한 유전자의 mRNA를 표적화하는 약 21개 내지 약 23개 뉴클레오티드의 RNA를 세포 또는 생물체로 도입시키는 단계;
    (b) 상기 유전자의 mRNA의 분해가 일어나는 조건하에서 상기 시험 세포 또는 시험 생물체를 유지시켜, 상기 유전자의 mRNA가 분해된 시험 세포 또는 시험 생물체를 생산하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)에서 생산된 시험 세포 또는 시험 생물체의 표현형을 관찰하고, 임의적으로, 관찰된 표현형을 적절한 대조군 세포 또는 대조군 생물체의 표현형과 비교하여, 유전자의 기능에 관한 정보를 제공하는 단계
    를 포함하는, 세포 또는 생물체에서 유전자의 기능을 조사하는 방법.
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