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CN1498964A - 可诱导RNAi途径的用于基因治疗的系列重组腺相关病毒 - Google Patents

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CN1498964A
CN1498964A CNA021493197A CN02149319A CN1498964A CN 1498964 A CN1498964 A CN 1498964A CN A021493197 A CNA021493197 A CN A021493197A CN 02149319 A CN02149319 A CN 02149319A CN 1498964 A CN1498964 A CN 1498964A
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鲁晓春
马鑫
董小岩
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AGTC Gene Technology Co Ltd
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Abstract

本发明名称为“可诱导RNAi途径的用于基因治疗的系列重组腺相关病毒”，属于生物技术领域，具体涉及一系列通过RNAi途径特异地抑制特定疾病相关基因的用于基因治疗领域的腺病毒伴随病毒载体的构建策略、方法及用途。

Description

可诱导RNAi途径的用于基因治疗的系列重组腺相关病毒
技术领域  本发明属于生物技术领域，具体涉及一系列通过RNAi途径特异地抑制特定疾病相关基因的用于基因治疗领域的腺病毒伴随病毒载体的构建策略、方法及用途。
背景技术  本发明申请是在我们所申请的前一个类似的发明专利申请(专利申请号：02125762.0，发明名称：利用RNA干扰现象介导功能基因下调的腺相关病毒载体)的基础上(马鑫，鲁晓春，吴小兵等。AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达。中华实验和临床病毒学杂志，2002，16(3)：253-255)所做的进一步的应用，同时，也是重组腺相关病毒载体的进一步的应用(WU Zj，WU Xb，CAO H，等，A novel and highly efficient productionsystem for recombinant adeno-associated virus vector.中国科学C辑英文2002；45(1)：96-104。吴小兵，董小岩，伍志坚等.一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法。科学通报，2000，45(19)：2071-2075。伍志坚，吴小兵，曹晖等.一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统。中国科学C辑，2001，31(5)：423-430)。
在专利申请号为02125762.0的发明专利申请中，我们描述了用重组腺相关病毒载体质粒pSNAV质粒携带RNAi核苷酸片段，将携带RNAi的质粒转染至体外培养的细胞内或动物体内，从而使质粒能在细胞内或动物体内源源不断地复制RNAi核苷酸片段，来达到RNAi核苷酸片段应起到的生物学作用。另外，该RNAi核苷酸片段也被包装成为一种携带了RNAi核苷酸片段的重组腺相关病毒(载体)，通过重组腺相关病毒这种载体进行RNAi核苷酸片段的基因转移和基因复制，来达到RNAi核苷酸片段应起到的生物学作用。在专利申请号为02125762.0的发明专利申请中，做为实施例，我们应用上述思路和策略构建了一个短发夹环表达质粒(pSNAV/U6/Luc)，并使其在BHK-21细胞中抑制荧光素酶的表达(马鑫，吴小兵等，AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达。中华实验和临床病毒学杂志。2002，16(3)：253-255)。该实施例的具体方法是从人基因组DNA中设计引物用PCR调出人U6 snRNA启动子，与被9bp序列间隔的21bp荧光素酶靶序列的反向重复及AAV载体质粒pSNAV相连接，构建成荧光素酶RNAi表达质粒pSNAV/U6/Luc。将荧光素酶RNAi表达质粒pSNAV/U6/Luc与pMAMneoLuc质粒共转染BHK-21细胞，以及单独转染荧光素酶细胞株，分别检测对荧光素酶表达的抑制效果。实验结果显示pSNAV/U6/Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制50％，而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制70％。抑制实验证实体内转录出的短发夹环荧光素酶能够有效抑制其在BHK-21细胞中的表达。
基因沉默(GENE SILENCING)现象广泛存在于植物、真菌和动物(LeirdalM，Sioud M.Gene silencing in mammalian cells by preformed small RNA duplexes.Biochem Biophys Res Commun.2002 Jul 19；295(3)：744-8.)中，由于转基因技术的兴起，人们对转基因沉默进行了更深入的研究。在高等植物中大约30％的转基因实验都导致了基因沉默，是一种普遍存在的基因调控机制。
转基因沉默主要分为两种类型：一是转录水平上的基因沉默(TranscriptionalGene Silencing，TGS)，二是转录后水平上的基因沉默(Posttranscriptional GeneSilencing，PTGS)。前者是发生在核内的事件，而后者发生在细胞质中。两者都与超甲基化(Hypermethylated)有关，在TGS现象中，甲基化主要发生在启动子区域，基因的转录受到抑制；而PTGS中，甲基化主要发生在基因的编码区，基因能够转录，产生mRNA，但mRNA在细胞质中被特异性地降解。二者在时间上并非简单的前后关系，在空间上也不因为核膜的存在而相互隔离。
转录后沉默表现为一种序列特异性的RNA降解过程，主要作用于同源性较高的转录产物，包括具有同源性的内源基因的转录产物。它广泛存在于各种生物中，直到最近人们才发现在植物中被称为共抑制(Cosuppression)、真菌中被称为(Quelling)、动物中被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)的现象可能具有很大的相似性，都与PTGS现象有关(Hannon GJ.RNA interference.Nature.2002 Jul 11；418(6894)：244-51.)。现在普遍认为PTGS是生物在长期进化过程中所形成的对病毒、转座因子和其它可转移核酸的防御系统。因为这些外源核酸的引入很可能使宿主细胞内的平衡机制遭到致命破坏。而转基因沉默，无非是宿主细胞将外源基因视为对自身有害的序列而将其抑制。细胞对外源核酸的这种抑制作用具有序列特异性的特点，所以一旦细胞内转录后沉默机制被启动，细胞对转入的核酸的同源序列就有了“免疫”能力。
尽管PTGS(首先在植物和真菌中证实)和RNAi(首先在caenorhabditis线虫和果蝇中观察到)分别被证实，遗传和生化分析揭示这些多步骤途径间的进化上的联系。这些途径有一些共同的成分，包括它们被双链RNA(dsRNA)引发，且引发的dsRNA被酶切加工成小的长为20-25个碱基的片段，这些片段介导序列特异性识别靶单链RNA(ssRNA)。已经证实负责切割引发dsRNA的酶是dsRNA特异性RNase，称为Dicer，产生dsRNA降解产物。这些小dsRNA或者短的干扰性RNAs(siRNAs)作为降解靶ssRNA所需的酶复合体的向导，它包括在对应于输入dsRNA的区域中常规间隙中21-23个碱基。Dicer还有解旋酶活性，其它区域的功能尚不能确定，这些对果蝇和线虫中的RNAi是很重要的。而且，Dicer在正常发育所需的转录物的加工中有作用。到目前为止，仅证实多亚基复合体或者RNA介导的切割靶RNA沉默复合体(RISC)中的一种蛋白质成分Argonaute2。dsRNA引发哺乳动物体细胞中的基因沉默小的合成的dsRNA或者siRNA能够避免哺乳动物细胞中基因表达的这种非特异性抑制。研究RNAi作为实验调控基因表达和在基因组水平探索基因功能的一种方法。
RNA干扰是一种进化上保守的基因组水平的免疫监控机制，是多步骤过程，涉及通过RNaseIII内切核酸酶Dicer的作用产生有活性的小的21-23nt干扰性RNA(siRNA)，介导其互补同源mRNA序列的特异性降解(Hannon GJ.RNAinterference.Nature.2002 Jul 11；418(6894)：244-51。Sharp PA.RNA interference-2001.GENES & DEVELOPMENT，2001，15：485-490)。RNAi现象广泛发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。RNAi的机制正在逐步阐明，与此同时，作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
有关RNAi最令人感兴趣的地方是：
1.dsRNA即双链RNA，而非单链反义RNA，是干扰试剂。
2.其作用是高度特异的。
3.其作用强度是相当强的(每个细胞中仅需要几个dsRNA分子即可以产生有效的干预)
4.干预活性(并假设是dsRNA)能在远离导入位点的细胞和组织中产生干预。
哺乳动物细胞对dsRNAs的反应可以活化两条途径，超过30bp的dsRNAs引起的广泛的非序列特异性mRNA的降解和翻译的关闭，体外合成的短的dsRNA分子19-23bp(short dsRNA molecules，siRNA)模拟RNAi途径中间体，能在哺乳动物中引起序列特异性的基因表达的抑制(Brummelkamp TR，BernardsR，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAi in mammaliancells.Science，2002，296：550-553。Sui G，Soohoo C，Affar EIB，et al.A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammaliancells.PNAS，2002，99：5515-5520。Yu JY，DeRuiter SL，Turner DL.RNA interferenceby expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.PNAS，2002，99：6047-6052)。
RNA干扰(RNAi)是一种具有高度的序列专一性，特异地使特定基因沉默，使其功能丧失或降低的一种RNA诱导的转录后调控方式，它属于转录后水平上的基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing，PTGS)。
RNA干扰(RNAi)的基本过程分两步，首先进入细胞的双链RNA(doublestrands RNA，dsRNS)被一种RNA酶III家族成员Dicer切割成21-23核苷酸长的小RNA片段(small interfering RNAs，siRNA)，这些siRNA片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，整合进入RNA沉默复合物(RISC)，作为模板识别目的mRNA，在RISC复合物中，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割降解，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象(RNA干扰，RNAinterference)。其优点和特点在于其高度的序列专一性和高效的靶基因抑制效率。
RNAi现象在各种生物的基因调控机制中广泛存在，被认为是一种细胞抗RNA病毒复制的机制，与其它几种导致功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi技术具有明显的优势，它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失。正是其高度序列专一性和高效靶基因抑制效率的特点使其倍受瞩目，从发现至今的短短不足5年间RNAi技术的应用从线虫、斑马鱼等低等生物迅速扩展到高等植物、哺乳动物。目前RNAi技术主要做为一种强有力的用以确定特定基因功能的后基因组计划研究工具，用以对特定基因进行功能丧失或降低突变，从而确定其功能，并已在美丽线虫的几近全部19000个基因功能分析中获得成功。
1.早期的RNAi技术是通过注射或浸泡等方法将合成的dsRNA直接导入靶组织细胞内的，这些方法虽然可以抑制目的基因的表达，但这种基因沉默却不能稳定存在(Billy E，Brondani V，Zhang H，et al.Specific interference with geneexpression induced by long，double-stranded RNA in mouse embryonalteratocarcinoma cell lines.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Dec4；98(25)：14428-33。Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature.2001 May 24；411(6836)：494-8。Fraser AG，Kamath RS，Zipperlen P，et al.Functional genomic analysis of C.elegans chromosome I by systematic RNAinterference.Nature.2000 Nov 16；408(6810)：325-30。Schmidt U，Monte F，Miyamoto MI，et al.Restoration of diastolic function in senescent rat heartsthrough adenoviral gene transfer of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase.Circulation 2000；101：790-6)。而后科学家们对RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，在特定启动子调控下，在转基因生物中表达形成具发夹环结构的dsRNA产物，从而使目的基因沉默。进入2002年，关于RNAi的哺乳动物表达载体不断涌现，最初的载体采用长茎发夹样结构(long hairpin RNA，lhRNA)，使目的基因得到极大抑制，达到90％以上，但因其激活RNA依赖蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase，PKR)、引发其他mRNA非特异降解和机体干扰素反应，而应用受限。随后科学家们(Miyagishi M，Taira K.U6 promoter driven siRNAs with four uridine 3′overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.Nature Biotechnol.2002 May；20(5)：497-500。Paul CP，Good PD，Winer I，et al.Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nat Biotechnol.2002 May；20(5)：505-8)利用在DNA指导的RNA聚合酶III(TFIII)的基因外启动子(包括U6 snRNA、H1 RNA等)构建了可形成具小片段(19-23碱基茎)发夹环结构dsRNA(short hairpin RNA，shRNA)产物的载体，模仿Dicer切割成的21-23bp siRNA获得成功，该方法具有抑制作用强、不激活PKR、不引发其他mRNA降解、表达产物稳定、作用持久等优点。目前已有数个对此的相关报导(Paddison PJ，Caudy AA，Bernstein E，et al.Short hairpinRNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.GenesDev.2002 Apr 15；16(8)：948-58.Paddison PJ，Caudy AA，Hannon GJ.Stablesuppression of gene expression by RNAi in mammalian
cells.PNAS.2002，99：1443-1448。Sui G，Soohoo C，Affar EIB，et al.A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammaliancells.PNAS，2002，99：5515-5520。Wurl，P.；Kappler，M.；Meye，A.；et al：Co-expression of survivin and TERT and risk of tumour-related death in patientswith soft-tissue sarcoma.Lancet 2002，359：943-945，.)，并有利用该类载体构建的哺乳动物细胞系产生。
在传统反义基因治疗方案中，人们通常病毒、质粒等方式，使特定靶基因的反义链得以表达，或直接通过非病毒载体导入经或未经修饰的反义DNA(EizemaK，Fechner H，Bezstarosti K，et al.Adenovirus-based phospholamban antisenseexpression as a novel approach to improve cardiac contractile dysfunction：comparison of a constitutive viral versus an endothelin-1-responsive cardiac promoter.Circulation.2000 May 9；101(18)：2193-9.)。这些方法虽然可使特定靶基因得到某种程度的抑制，但抑制程度效果大多仍无法达到临床治疗的要求。随着RNAi研究的深入，应用各种方式使dsRNA在细胞内产生的方法接连涌现，在此基础上，在专利中请号为02125762.0的发明专利申请中，我们提出了应用AAV为载体，导入可产生诱导RNAi途径，使特定疾病相关基因得以高度、特异性抑制的基因治疗方案。
另外，需要说明的是，国外文献中对转录出某一特定RNAi核苷酸片段的过程称之为表达。我们认为，表达是说明由DNA转录成RNA然后翻译成蛋白质的完整过程，而由DNA转录成RNA的这一特定的过程应该称之为转录，因而，在本发明的描述中，涉及相关概念之处我们一般描述为转录，而完成转录作用的功能单位我们称之为转录单元。但也有按国外同行惯例沿用“表达”字眼的。
腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)是一种非致病性的微小病毒，基因组为4680nt的单链DNA。AAV病毒的生活周期有潜伏性感染和裂解性感染两种方式。AAV病毒的裂解性复制需要有辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的参与。在没有辅助病毒存在时，AAV病毒以前病毒方式整合在宿主细胞染色体中。由AAV病毒改造而来的重组AAV病毒载体因其安全、稳定、既可感染分裂细胞又可感染不分裂细胞、感染效率高、可长期表达外源基因等优点而受到关注，是一种具有广泛用途的新型基因转移及基因治疗载体。
在本发明中，我们使用了我们先前发明的重组AAV病毒载体的包装和生产的策略(吴小兵等，申请号：99119039.4，发明名称：可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途；伍志坚，吴小兵，曹晖等.一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统。中国科学C辑，2001，31(5)：423-430)，将各种具有特定目的的RNAi核苷酸片段进行包装，成为各种携带了RNAi核苷酸片段的重组腺相关病毒。并通过重组腺相关病毒这种载体进行RNAi核苷酸片段的基因转移和基因复制，以达到相应的研究和治疗目的。
发明内容  本发明利用了我们先前申请的发明的技术平台(专利申请号：99119038.6，发明名称：系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途；专利申请号：99119039.4，发明名称：可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途)，通过提供一系列可产生诱导RNAi途径，使特定疾病相关基因得以高度、特异性抑制的AAV载体构建方法，生产出可供基因治疗研究和临床应用的重组AAV病毒。
本发明的RNAi技术涉及具有18-29碱基茎的shRNA，含有较长100-700碱基茎和包含或不包含其它相关基因序列的环状结构lhRNA以及不具有发夹样结构的dsRNA。
本发明涉及：
(1)确定特定靶基因的用于诱导RNAi的目的序列，构建在U6 snRNA或H1RNA启动子控制下的可形成shRNA产物的AAV载体；
(2)构建在U6 snRNA或H1RNA启动子分别控制下的特定靶基因的正义和反义DNA序列的AAV载体；
(3)构建在多个U6 snRNA或H1RNA启动子分别控制下的特定靶基因的多个目的序列的可形成shRNA产物的AAV载体；
(4)构建在多个U6 snRNA或H1RNA启动子分别控制下的多个特定靶基因的单个或多个目的序列的可形成shRNA产物的AAV载体；
(5)构建含特异调控序列(如单个和多个缺氧反应元件、血糖反应元件等)和/或组织特异性或强效启动子控制下的可形成具lhRNA产物的AAV载体。
在本发明的各种携带有lhRNA结构的重组AAV病毒的构建过程中，首先需要确定并获得特定靶基因的用于诱导RNAi的目的序列，然后构建在U6 snRNA或H1RNA启动子控制下的shRNA结构AAV载体质粒，构建含特异调控序列和/或组织特异性或强效启动子控制下的可形成lhRNA结构的AAV载体质粒，之后制备相应的重组AAV病毒，最后我们对常见的心血管疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的数个靶基因进行了抑制实验。
针对特定靶基因的用于诱导RNAi的目的序列的确定的方法和步骤：
1.获得特定靶基因mRNA序列；
2.如利用U6 snRNA或H1RNA启动子，在其起始密码子下游50-100bp以下位置开始寻找，以避开DNA结合蛋白位点，一般选取起始密码子后100-300(经验值)；
2.1方法A：目的序列应以G为开始(PCR引入法shRNAi转录产物先反义)，向后记录18-29个碱基，推荐19-23bp；方法B：目的序列应以C(PCR引入法shRNAi转录产物先正义)为开始，
2.2寻到或实验获得的最佳目的序列片段5’端如无G或C，应添加G或C，一般而言添加1-5个碱基对RNAi抑制作用无明显影响，除转录起始位点应为G外，5’端1-3个A可能有利于shRNA稳定；
2.3要求序列内无连续3个及以上T，如采用发夹样结构，还要求序列内无连续3个及以上A；
2.4要求序列GC含量在20％-70％，推荐30％-65％；并可将引物中与正义链互补的A换为G或反之，注意与反义链互补部分不要变，改变后可在转录产物形成UG配对，可能不影响RNAi活性，仍要求正义序列内无连续3个及以上T；
2.5如采用发夹样结构，应进行序列2级结构分析；
3.如利用lsRNA结构，50-700碱基茎序列应大部分在编码区，推荐200-600bp；
3.1建议序列GC含量适中，环内若包含其它基因，应选择其编码区小于茎长度1/2的基因；
3.2本方法另一种选择，寻找两个序列，其中一个序列包含有另一个序列，长片段多出部分主要集中在一端，用以形成环状结构；
3.3注意不要使编码区得以正确转录；
4.将寻到的序列到NCBI进行BLAST查询，确保该序列仅有一个靶序列，否则重复步骤2或3；
5.对于要求抑制效率很高的序列选择，可采用以下两种方法：
5.1将选择的多个序列人工合成方法或体外dsRNA合成试剂盒(如Dharmacon siACE-RNAi)合成dsRNA；
5.2在相对的两个U6 snRNA启动子或其它TFIII的基因外启动子之间插入双链选择的多个序列，构建小规模质粒文库，进行转染，在蛋白和或RNA水平检测，观察抑制效率，或通过抗体亲和、免疫磁珠、流式细胞仪等方法的筛选，以选择最佳。
构建在U6 snRNA或H1RNA启动子控制下的shRNA结构AAV载体质粒的方法：
方法1：PCR引入法
1.1上游引物在U6 snRNA启动子或其它三类TFIII的基因外启动子的近端调控元件5’外侧，一般而言PCR扩增产物包含TATA盒及近端调控元件即可使引入的shRNA结构得到有效转录，在此范围内还可加入特定调控序列，如：缺氧反应元件、四环素可诱导元件等。我们实验的上游引物位于U6启动子的-329--312(GGTGTTTCGTCCTTTCCACAA)，为便于操作，5’加入Xho1位点。
1.2下游引物为两部分，首先确定外侧发夹样结构序列，茎应用前面方法B或A确定的片段，环结构为5-9bp碱基，一般9bp效果最理想。根据我们的经验和文献，转录后的5’为正义片段，3’为反义片段比相反设计所产生的抑制效果要高，在其外侧加入终止序列TTTTT和所用的限制性内切酶位点(我们用Bgl II或BamH I)。内侧部分为U6启动子的3’端，我们应用-1--20部分(CCCCAGTGGAAAGACGCG)。注意这是反义引物。
1.3模板我们应用我们提取构建的pTeasy-U6质粒，该质粒包括U6基因的-417-300片段。条件循环30个94℃ 45”、56℃ 45”、72℃ 45”，产物可经酶切后连接于穿梭质粒，或经T载体后再构建。
方法2：大衔接头法
2.1确定发夹样结构序列，茎应用前面方法A确定的片段，环结构为5-9bp碱基，一般9bp效果最理想。根据我们的经验和文献，转录后的5’为正义片段，3’为反义片段比反过来抑制效果要高。在其外侧加入终止序列TTTTT和所用的限制性内切酶位点(我们用Bgl II或BamH I)酶切后的末端构造。内侧添加碱基以保证发夹样结构序列在U6启动子转录后位点。人工合成一平一粘的大衔接头，可用合成双链，退火后应用，注意平端5’应磷酸化。
2.2上游引物同上(参见“方法1：PCR引入法，1.1”)
下游引物为：GAAGTGTTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA，引入了Xmn1位点，(应用该下游引物，需在发夹样结构序列5’端加入两个碱基AC，以保证发夹样结构的正确转录)。
2.3将大衔接头、U6启动子片段及穿梭质粒载体行3片段连接构建目的质粒。
构建在多个TFIII的基因外启动子分别控制下多个发夹环结构的AAV载体质粒方法即将上述方法加以改进，将各单元串连即可，但要保证方向一致。
构建含特异调控序列和/或组织特异性或强效启动子控制下的可形成lhRNA结构的AAV载体质粒：
将酶切或PCR法得到茎及环片段连接在AAV载体质粒pSNAV的目的启动子下游并连有PolyA序列。根据我们的经验和文献，该方法产物抑制效率极高，但可能引起干扰素反应，激活PKR和RNaseL，非特异降解其它mRNA，并可能引发凋亡。对此我们采用环中引入腺病毒VAI RNA以求克服此付作用。通用型AAV载体质粒pSNAV为本室构建(中国专利申请号：99119038.6)。
可形成lhRNA结构的重组AAV病毒载体细胞株的建立及相应的重组AAV病毒的制备：
用携带了lhRNA结构的pSNAV重组质粒转染BHK细胞经选择培养得到相应的AAV病毒载体细胞株BHK/pSNAV/lhRNA：BHK细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养。将携带了lhRNA结构的pSNAV重组质粒用脂质体lipofectamine(GIBCO BRL)转染BHK细胞，24hr后消化，1∶2～5传代。加G418 800μg/ml选择培养。10天后可形成明显抗性细胞克隆。在倒置荧光显微镜下观察细胞克隆，见细胞状况良好，将其消化后混合并扩大培养并分别冻存保种。用全功能辅助病毒HSV1-rc感染扩大培养的细胞，经检测发现产生了重组AAV-lhRNA病毒。测定重组AAV-lhRNA病毒的滴度。重组AAV病毒的生产、制备方法(吴小兵，董小岩，伍志坚等.一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法。科学通报，2000，45(19)：2071-2075。伍志坚，吴小兵，曹晖等.一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统。中国科学C辑，2001，31(5)：423-430)参见我们先前所申请的专利技术(专利申请号：99119039.4，发明名称：可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途；专利申请号：99119038.6，发明名称：系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途)。
具体实施方式  我们对常见的心血管疾病、肿瘤及自身免疫性疾病(Folkman，J：Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoid and other disease.Nature Med.1995，1：27-31)的数个靶基因进行了抑制，下面提供出部分实施实例并对其中部分方法和用途作了详细说明，但并不意味着本发明范围仅限于下面所列举的序列、靶基因和疾病，也并不意味着限制本发明的内容。
实施例1
用于治疗心血管疾病的可诱导RNAi途径的重组腺相关病毒：
通过对心血管疾病相关的研究进展的分析，我们进行了下面的设计。所参考的相关的文献如下：(Baartscheer A.Adenovirus gene transfer of SERCA in heartfailure.A promising therapeutic approach？Cardiovasc Res.2001 Feb 1；49(2)：249-52.del Monte F，Harding SE，Dec GW，et al：Targeting phospholamban by gene transfer inhuman heart failure.Circulation.2002 Feb 26；105(8)：904-7.Gelband CH，Reaves PY，Evans J，et al.Angiotensin II type 1 receptor antisense gene therapy prevents alteredrenal vascular calcium homeostasis in hypertension.Hypertension.1999 Jan；33(1 Pt2)：360-5。Martens，J.R.；Reaves，P.Y.；et al：Prevention of renovascular and cardiacpathophysiological changes in hypertension by angiotensin II type 1 receptorantisense gene therapy.Proc.Nat.Acad.Sci.1998，95：2664-2669.Miyamoto MI，Monte F，Schmidt U，et al.Adenoviral gene transfer of SERCA2a improvesleft-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure.Pro NatAcad Sci 2000；97：793-8。Pachori AS，Numan MT，Ferrario CM，et al.Bloodpressure-independent attenuation of cardiac hypertrophy by AT(1)R-AS gene therapy.Hypertension.2002 May；39(5)：969-75.Paradis，P.；Dali-Youcef，N.；Paradis，F.W.；etal：Overexpression of angiotensin II type I receptor in cardiomyocytes inducescardiac hypertrophy and remodeling.Proc.Nat.Acad.Sci.2000，97：931-936。Periasamy M，Huke S.SERCA pump level is a critical determinant ofCa(2+)homeostasis and cardiac contractility.J Mol Cell Cardiol.2001；Jun；33(6)：1053-63.Schmidt U，Monte F，Miyamoto MI，et al.Restoration of diastolicfunction in senescent rat hearts through adenoviral gene transfer of sarcoplasmicreticulum Ca2+-ATPase.Circulation 2000；101：790-6)。
1.1治疗心力衰竭，针对的靶基因A是：受磷蛋白基因(phospholamban)。
针对受磷蛋白基因(PHOSPHOLAMBAN)的SHRNA1：其编码区为受磷蛋白基因的59-79，序列为GCCCCAGCAAGCGCGTCAGAA，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-1。
在此编码区的基础上采用大衔接头法设计所获的序列为：5’-CGCCCCAGCAAGCGCGTCAGAACTATCGTACTTCTGACGCGCTTGCTGGGGCTTTTTAGATC-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-24。
针对受磷蛋白基因(phospholamban)的ShRNA2：其编码区为受磷蛋白基因的73-93，序列为GTCAGAACCTCCAGAACCTCT，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-2。loop环应用GGACTCGAT。下游引物：5’-AAAAAGTCAGAACCTCCAGAACCTCTGGACTCGATAGAGGTTCTGGAGGTTCTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-25。以下各shRNAi方法中loop环均采用TCAAGCTTC(内含HindIII位点)。
针对受磷蛋白基因(phospholamban)的ShRNA3：其编码区为受磷蛋白基因的59-78，序列为GCCCCAGCAAGCGCGTCAGA，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-3。下游引物：5’-AAAAAGACATATCAAGATGAGACAGATCAAGCTTCTCTGTCTCATCTTGATATGTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-26。
针对受磷蛋白基因(phospholamban)的LhRNA：
用Short sence primer和Antisence primer两条引物进行PCR扩增，得到的针对受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA短片段的长度为535bp。
用Long sence primer和Antisence primer两条引物进行PCR扩增，得到的针对受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA长片段的长度为652bp。
用Short sence primer和Antisence primer两条引物进行PCR扩增，得到的针对受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA，将长、短片段首、首相接，两尾断形成新lhRNA的首尾，用设计的内切酶位点连于载体。
Short sence primer：AAGT CCAATACCTT ACTCGC(编码区7-26)短片段，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-4。
Antisence primer：AAAA GTGGT GGCAA CGCAG，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-5。
Long sence primer：TAAA AGGAG ACAGC TCGCG  长片段，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-6。
1.2治疗高血压，靶基因B：血管紧张素2受体1型(angiotensin receptor 1，ATR1)
shRNA4：GCTGAAGACTGTGGCCAGTGT(编码区174-194)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-7。下游引物：5’-GGATCCAAAAACTGAAGACTGTGGCCAGTGTTCAAGCTTCACACTGGCCACAGTCTTCAGGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-27。
实施例2
用于治疗肿瘤的可诱导RNAi途径的重组腺相关病毒：
通过对肿瘤疾病相关的研究进展7，9，11，13，14，15，27，29，32，34的分析，我们进行了下面的设计。
2.1靶基因C：血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor，VEGF)
shRNA5：GTCTATCAGCGCAGCTACTGC(编码区136-156)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-7。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGTCTATCAGCGCAGCTACTGCTCAAGCTTCGCAGTAGCTGCGCTGATAGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-28。
shRNA6：GTGGACATCTTCCAGGAGTAC(编码区175-195)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-8。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGTGGACATCTTCCAGGAGTACTCAAGCTTCGTACTCCTGGAAGATGTCCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-29。
shRNA7：GCTACTGCCATCCAATCGAGACC(编码区149-171)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-9。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCTCAAGCTTCGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-30。
lhRNA：
Short sence primer：GAGGAGGGCAGAATCATCACGA(编码区95-116)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-10。
Antisence primer：GCCTTGCAACGCGAGTCTGT(编码区502-521)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-11。
Long sence primer：CAATGACGAGGGCCTGGAGTG(编码区261-281)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-12。长片段426bp短片段260bp。
2.2靶基因D：细胞周期蛋白D1(cyclin D1)
shRNA8：GAAGATCGTCGCCACCTGGAT(编码区171-191)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-13。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGAAGATCGTCGCCACCTGGATTCAAGCTTCATCCAGGTGGCGACGATCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-31。
shRNA9：GAGGTCTGCGAGGAACAGAAG(编码区196-216)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-14。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTCAAGCTTCCTTCTGTTCCTCGCAGACCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-32。
shRNA10：GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG(编码区208-228)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-15。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGTCAAGCTTCCTCCTCCTCGCACTTCTGTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-33。
lhRNA
Short sence primer：CGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCA(编码区141-136)510bp，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-16。
Antisence primer：ACGCTCCCCGCTGCCACCAT(编码区604-623)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-17。
Long sence primer：GCTGCGGGCCATGCTGAAGG(编码区81-100)543bp，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-18。长片段543bp短片段510bp。
2.3靶基因E：端粒酶RNA成分(Telomerase RNA，TR)
在载体构建中我们采用了双U6启动子分别控制下的双shRNA的串连方式。
shRNA11：GCCTTCCACCGTTCATTCTAG(编码区98-118)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-19。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGCCTTCCACCGTTCATTCTAGTCAAGCTTCCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-34。
shRNA12：GAAGAGTTGGGCTCTGTCAGC(编码区255-275)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-20。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCTCAAGCTTCGCTGACAGAGCCCAACTCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-35。
2.4靶基因F：端粒酶逆转录组分(telomerase reverse transcriptase，TERT)
在载体构建中我们采用了双U6启动子分别控制下的双shRNA(shRNA11和shRNA13)的串连方式。
shRNA13：GTGTCCTGCCTGAAGGAGCTG(编码区220-240)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-21。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGTCAAGCTTCCAGCTCCTTCAGGCAGGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-36。
实施例3
用于治疗自身免疫疾病的可诱导RNAi途径的重组腺相关病毒：
治疗类风湿性关节炎，靶基因肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)。
shRNA14：GTGGAGCTGAGAGATAACCAG(编码区121-141)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-22。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTCAAGCTTCCTGGTTATCTCTCAGCTCCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-37。
shRNA15：GATAACCAGCTGGTGGTGCCA(编码区133-153)，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-23。下游引物：5’-GGATCCAAAAAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAAGCTTCTGGCACCACCAGCTGGTTATCGGTGTTTTCGTCCTTTCCACAA-3’，在电子版的核酸序列中的代码为sequence-38。

Claims (9)

1.一类携带了特定的RNAi核苷酸片段的重组腺相关病毒由以下成分构成：
1)重组腺相关病毒外壳；
2)特定的RNAi核苷酸片段；
3)对重组腺相关病毒外壳内包裹携带的特定的RNAi核苷酸片段进行转录、表达调控的调控单元。
2.根据权利要求1，重组腺相关病毒外壳来源于2型腺相关病毒。
3.根据权利要求1，重组腺相关病毒外壳来源于1型腺相关病毒。
4.根据权利要求1，重组腺相关病毒所携带特定的RNAi核苷酸片段是针对心血管疾病的；
5.根据权利要求1，重组腺相关病毒所携带特定的RNAi核苷酸片段是针对肿瘤的；
6.根据权利要求4，针对心血管疾病的特定的ShRNAi核苷酸片段的核苷酸序列特征是：5’-GCCCCAGCAAGCGCGTCAGAA-3’。
7.根据权利要求5，针对肿瘤疾病的特定的RNAi核苷酸片段的核苷酸序列特征是：
5’-GTCTATCAGCGCAGCTACTGC-3’。
8.根据权利要求1，对特定的RNAi核苷酸片段进行转录、表达调控的调控单元的结构是：在U6 snRNA或H1RNA启动子控制下的可形成shRNA产物的AAV载体。
9.根据权利要求1，携带了特定的RNAi核苷酸片段的重组腺相关病毒可以用于治疗各种疾病。
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