JP6789513B2 - 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 - Google Patents
有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6789513B2 JP6789513B2 JP2016214411A JP2016214411A JP6789513B2 JP 6789513 B2 JP6789513 B2 JP 6789513B2 JP 2016214411 A JP2016214411 A JP 2016214411A JP 2016214411 A JP2016214411 A JP 2016214411A JP 6789513 B2 JP6789513 B2 JP 6789513B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sgp
- gene
- dsrna
- shrimp
- double
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 title claims description 91
- 230000035800 maturation Effects 0.000 title claims description 48
- 230000001629 suppression Effects 0.000 title claims description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 175
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 168
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 126
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 80
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 41
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 26
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 22
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 22
- 241000238553 Litopenaeus vannamei Species 0.000 claims description 18
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims description 18
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 18
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 claims description 16
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 claims description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 101710163156 Vitellogenesis-inhibiting hormone Proteins 0.000 description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 17
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 15
- 101150061019 vih gene Proteins 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 10
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 10
- 101800002780 Crustacean hyperglycemic hormone Proteins 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000238552 Penaeus monodon Species 0.000 description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 2
- 101710134317 CHH precursor-related peptide Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000335017 Melicertus latisulcatus Species 0.000 description 2
- 101710102814 Molt-inhibiting hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000238550 Penaeidae Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100022460 Alpha-1-acid glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000995704 Fenneropenaeus chinensis Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710091446 Gonad-inhibiting hormone Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000678191 Homo sapiens Alpha-1-acid glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 241001124325 Marsupenaeus japonicus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000907637 Penaeus semisulcatus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K61/00—Culture of aquatic animals
- A01K61/50—Culture of aquatic animals of shellfish
- A01K61/59—Culture of aquatic animals of shellfish of crustaceans, e.g. lobsters or shrimps
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/30—Rearing or breeding invertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、分子生物学手法を用いてエビ類の生体内において本来の生物学的機能を制御する方法に関し、具体的にはRNA干渉の手法を用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法に関する。
現在、年間350万トンにのぼるバナメイエビ養殖生産を支えるために世界で年間約2,000億尾の稚エビが生産されており、その親エビとして米国ハワイ州だけで80万尾が生産・輸出されている。バナメイエビを含むクルマエビ類は人為的に成熟させることが困難であり、現状では眼柄切除を行い、成熟を促している。しかし、眼柄切除は成熟成功率が低いだけでなく、エビの片方の眼柄を焼き切ることから、動物虐待との非難も浴びている。眼柄切除に代わる成熟促進技術を開発し、計画的、効率的な稚エビ生産を可能にすることは喫緊の課題である。
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA（dsRNA）によって、その配列特異的にmRNAが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象であり、生物共通の核酸レベルの防御システムであることが報告されている（非特許文献１を参照）。RNAiにおいては、dsRNAがダイサー(Dicer)の作用によりプロセッシングされsiRNA(short interfering RNA)が形成され、siRNAがガイドRNAとしてターゲット配列を認識し、ターゲットmRNAを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。
現在、ふ化場等において人為的にエビ類を成熟・産卵させるためには、眼柄切除に代わる技術は存在しない。しかしながら、最近ではRNA干渉法を用いウシエビ（Penaeus monodon）などのエビ類でVIHの発現を抑制することを目的とした研究事例が報告されている（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３を参照）。また、同方法で成熟を促すことが可能であると訴える特許出願の事例もある（特許文献１を参照）。
Tiu and Chan, 2007, FEBS Journal, 274: 4385-4395.
Treerattrakool et al., 2008, FEBS Journal, 275: 970-980.
Treerattrakool et al., 2013, Aquaculture, 404-405: 116-121.
RNA干渉の手法を用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法の提供を目的とする。
本発明者らは、エビ類の卵成熟を制御する方法として、RNA干渉の原理を利用し、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子のmRNAに結合するdsRNAを用いエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することについて鋭意検討を行った。この検討は、生化学的研究に基づいた効率的な成熟制御を可能にするための第一歩であり、生体内で成熟を抑制するホルモンの遺伝子発現を解除するものである。その結果、前記dsRNAにより効率的にエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟の抑制を解除し得ることを見出した。
さらに、本発明者らは、複数の遺伝子が卵成熟の抑制に関与しており、それぞれの遺伝子の発現を抑制し得る複数のdsRNAを混ぜて使用することにより、より効果的に卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法。
[２] 養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[１]の方法。
[３] 養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[２]の方法。
[４] 卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)が、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA(dsRNA)である、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５] 卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いる、[１]〜[５]のいずれかの方法。
[７] 卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)であって、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNAを含む、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する組成物。
[８] 養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[７]の組成物。
[９] 養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[８]の組成物。
[１０] 卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ペプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[７]〜[９]のいずれかの組成物。
[１１] センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を含む、[７]〜[１０]のいずれかの組成物。
[１] 養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法。
[２] 養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[１]の方法。
[３] 養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[２]の方法。
[４] 卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)が、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA(dsRNA)である、[１]〜[３]のいずれかの方法。
[５] 卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いる、[１]〜[５]のいずれかの方法。
[７] 卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)であって、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNAを含む、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する組成物。
[８] 養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[７]の組成物。
[９] 養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[８]の組成物。
[１０] 卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ペプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[７]〜[９]のいずれかの組成物。
[１１] センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を含む、[７]〜[１０]のいずれかの組成物。
本発明の二本鎖RNA（dsRNA）を用いることにより、RNA干渉の原理でエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除することができる。このようにして卵成熟抑制が解除されたエビ類の卵成熟を促進することにより、計画的かつ効率的な稚エビの生産が可能になる。
本発明の二本鎖RNA（dsRNA）を使用することより、10日で全個体において、遺伝子発現レベルを皆無にすることができ、少なくともこの状態が30日間保たれる。また、本発明のdsRNAを用いた場合の遺伝子発現ノックダウン率は76.9〜99.9％である。これに対してRNA干渉法を用いた他グループの結果では、例えばFeijo et al (2016), Mar Biotechnol. 18: 117-123において、遺伝子発現のノックダウン率は投与後64〜73%のみであった。
以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明は、RNA干渉法により、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法である。
養殖エビ類では、卵成熟が抑制されてしまい、従来は眼柄切除により、卵成熟を促進していた。本発明においては、養殖エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、卵成熟抑制を解除する。
本願発明の方法により、卵成熟抑制を解除するエビ類は、クルマエビ科に属するエビ類であり、クルマエビ（Penaeus japonicus)、バナメイエビ（Litopenaeus vannamei）、大正エビ（Penaeus chinensis）、クマエビ（Penaeus semisulcatus）、ウシエビ（Penaeus monodon）、フトミゾエビ（Melicertus latisulcatus）等が挙げられる。この中でも、食用エビとして大量に生産されているバナメイエビ又はクルマエビが好ましい。また、成エビを対象としても亜成エビを対象としてもよい。ここで、体重10g以上25g未満を亜成エビ、35g以上を成エビと称する。
本願発明の方法により、発現を抑制するエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子は、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH：crustacean hyperglycemic hormone)ファミリーに属する遺伝子である。CHHファミリーに属する遺伝子としては、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH: crustacean hyperglycemic hormone)遺伝子、卵黄形成抑制ホルモン（VIH: vitellogenesis-inhibiting hormone)遺伝子、脱皮抑制ホルモン（MIH：molt-inhibiting hormone）遺伝子等が属する。なお、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)をGonad-inhibiting hormoneともいう。
本発明では、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH：crustacean hyperglycemic hormone)ファミリーに属する卵黄形成抑制ホルモン（VIH）遺伝子の発現を抑制する。卵黄形成抑制ホルモン（VIH）遺伝子として、眼柄由来ペプチド（SGP：sinus gland peptide)遺伝子が挙げられる。眼柄由来ペプチドには、SGP-A〜SGP-Gの７つが存在するが、本発明においては、SGP-A、AGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gの５つの眼柄由来ペプチド遺伝子の１種又は複数種の遺伝子の発現を抑えることにより、卵黄形成抑制ホルモンの発現を抑制し、卵黄タンパク質を作りやすくし卵成熟させることにより、卵成熟を制御する。
以下のように、配列番号１〜１０に遺伝子の塩基配列及び遺伝子がコードするペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１ SGP-A 塩基配列
配列番号２ SGP-A アミノ酸配列
配列番号３ SGP-B 塩基配列
配列番号４ SGP-B アミノ酸配列
配列番号５ SGP-C 塩基配列
配列番号６ SGP-C アミノ酸配列
配列番号７ SGP-F 塩基配列
配列番号８ SGP-F アミノ酸配列
配列番号９ SGP-G 塩基配列
配列番号１０ SGP-G アミノ酸配列
配列番号１ SGP-A 塩基配列
配列番号２ SGP-A アミノ酸配列
配列番号３ SGP-B 塩基配列
配列番号４ SGP-B アミノ酸配列
配列番号５ SGP-C 塩基配列
配列番号６ SGP-C アミノ酸配列
配列番号７ SGP-F 塩基配列
配列番号８ SGP-F アミノ酸配列
配列番号９ SGP-G 塩基配列
配列番号１０ SGP-G アミノ酸配列
また、SGP-Aの塩基配列及びアミノ酸配列を図６に、SGP-Bの塩基配列及びアミノ酸配列を図７に、SGP-Cの塩基配列及びアミノ酸配列を図５に、SGP-Fの塩基配列及びアミノ酸配列を図８に、SGP-Gの塩基配列及びアミノ酸配列を図２に示す。
上記の遺伝子の発現を抑制するためには、それぞれの遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖からなるdsRNA(double stranded RNA；二本鎖RNA)を用いればよい。dsRNAは、RNA干渉により標的遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）する。該dsRNAの一方の鎖は各遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であり、該センス鎖とアンチセンス鎖は相補的に結合し、dsRNAを形成する。ただし、センス鎖とアンチセンス鎖は完全に相補的である必要は必ずしもなく、相補的に結合する限り、１又は複数、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、特に好ましくは２個若しくは１個のミスマッチがあってもよい。上記の眼柄由来ペプチド遺伝子中の標的配列は、コーディング領域であっても、非コーディング領域であってもよい。また、コーディング領域と非コーディング領域の両方を含んでいてもよい。
本発明において、dsRNAは、shRNA(small hairpin RNA)及びsiRNA（small interfering RNA)を含む。shRNAは２本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有する。shRNAにおいて、センス鎖の3’末端とアンチセンス鎖の5’末端がループ（ヘアピンループ配列）を介して連結されている。ヘアピンループ配列は限定されないが、５〜12塩基からなるUUで始まる配列、例えばUUCAAGAGAが挙げられる。dsRNA及びshRNAは、生体内でダイサーによりプロセシングされてsiRNAを生成する。また、dsRNAはmiRNAを形成し得る。本発明のdsRNAが、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハングを有する21〜27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。
dsRNAの塩基数は、限定されないが、50〜800塩基、好ましくは100〜500塩基、さらに好ましくは100〜300塩基である。
dsRNAの眼柄由来ペプチド遺伝子の標的配列にハイブリダイズし、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制し得るセンス鎖として、配列番号１で表されるSGP-A遺伝子の塩基配列、配列番号３で表されるSGP-B遺伝子の塩基配列、配列番号５で表されるSGP-C遺伝子の塩基配列、配列番号７で表されるSGP-F遺伝子の塩基配列及び配列番号９で表されるSGP-G遺伝子の塩基配列の部分配列であって、遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するRNA配列を有するものが挙げられる。
具体的には、例えば、センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いることができる。これらのセンス鎖に、相補的な配列からなるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてdsRNAが形成される。上記センス鎖は、dsRNA用のプライマーを用いて作製することができる。配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号３１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号３４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３５で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA) 用のプライマーとして、配列番号３７で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３８で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
本発明のdsRNAを構成するセンス鎖は、眼柄由来ペプチド遺伝子の塩基配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一な配列であってもよい。すなわち、dsRNAのセンス鎖と実際に標的となる眼柄由来ペプチドのmRNA配列がハイブリダイズする限り１又は複数個の塩基、すなわち、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個、あるいは、２個若しくは１個の塩基が欠失、置換又は付加してミスマッチが生じていてもよい。
エビ類の卵成熟抑制を解除するために、上記の眼柄由来ペプチド遺伝子の少なくとも１種、好ましくは２種、３種、４種又は５種の複数の遺伝子の発現を抑制する。複数種の遺伝子の発現を抑制した場合、より効率的に卵成熟抑制を解除することができる。複数種の遺伝子の発現を抑制するためには、各遺伝子の発現を抑制し得る複数のdsRNAを用いればよい。
dsRNA分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は、3’末端にオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングの塩基の種類、数は限定されない。例えば、１〜５塩基、好ましくは１〜３塩基、さらに好ましくは１若しくは２塩基からなる配列が挙げられる。具体的には、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。ここで、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。
本発明のdsRNAは、化学合成や、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することができる。例えば、化学合成により合成する場合、互いに相補的な配列を逆方向配列として有しており自己相補性を有するRNA一本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。
また、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いて合成する場合、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有する鋳型DNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写すればよい。プロモーターとしては、in vitroで製造する場合、T7プロモーター、T3プロモーター等が用いられる。また、ベクターに本発明のdsRNAの鋳型DNAを導入し、該ベクターをエビ類の生体内に投与して生体内でdsRNAを合成する場合、H1プロモーター、U6プロモーター等のPolIII系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、pSUPERベクター、pBAsiベクター等を用いることができ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。
本発明は、上記dsRNA分子を発現するベクターをも包含する。
本発明のdsRNAは、配列特異的に眼柄由来ペプチド遺伝子のmRNAを切断し、その結果、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こし、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制し得る。
本発明のdsRNAは、配列特異的に眼柄由来ペプチド遺伝子のmRNAを切断し、その結果、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こし、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制し得る。
本発明のdsRNAを用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟を解除するためには、本発明のdsRNAをエビ類の生体内に投与すればよい。投与は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は非経腸的ルートで行うことができる。例えば、dsRNAを注射により腹内に投与すればよい。この際、30G〜33G程度の細い針を有するインスリン注射用注射針を用いることが好ましい。また、本発明のdsRNAを餌に混合し、摂食させることにより投与することもできる。
本発明のdsRNAは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤と配合して使用される。担体としては、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液及び緩衝生理食塩水が挙げられる。担体と配合される場合、本発明のdsRNAの含有量は、製剤により適宜選択されればよく、製剤により種々異なるが、0.001〜１重量％であることが好ましい。本発明のdsRNAのエビ類への投与量は、0.0001〜１mgを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。また、１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM〜100μM、好ましくは10nM〜50μM、より好ましくは100nM〜20μM投与するのが好ましい。
本発明において、RNA干渉により標的遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）するとは、遺伝子の発現をその遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のsiRNAを導入しない場合に対して、100％抑制される場合のみならず、75％以上、50％以上あるいは20％以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、遺伝子のmRNA又はタンパク質の産生量をsiRNA導入前後で比較すればよい。mRNAの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridization等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ELISA等の公知の方法により測定することができる。
本発明のdsRNAを用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、エビ類の卵成熟抑制を解除することができる。すなわち、本発明は、本発明のdsRNAをエビ類に投与して、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、エビ類の卵成熟抑制を解除する方法を包含する。該方法は、本発明のdsRNAをエビ類に投与して、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、卵成熟抑制を解除したエビ類を製造する方法でもある。
エビ類に本発明のdsRNAを投与した場合、数日から十数日程度で、卵成熟を抑制する遺伝子の発現を完全に抑制することができる。また、遺伝子発現が抑制された状態は10〜50日、好ましくは少なくとも30日保たれる。また、本発明のdsRNAを用いた場合の、遺伝子発現の抑制率は、76.6〜99.9％である。
このように、卵成熟抑制を解除したエビ類に対して、卵成熟を促進することにより、人為的に成熟させたエビ類を製造することができる。該エビ類から、計画的かつ効率的に稚エビを生産することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ バナメイ雌成エビにおける卵黄形成抑制ホルモン（VIH；SGP-G）の遺伝子発現の抑制
1. VIH(vitellogenesis-inhibiting hormone)遺伝子の二本鎖RNA(ds-RNA)の作製
VIH遺伝子はTsutsui et al.（2013）Fish. Sci., 79: 357-365で報告されている配列（SGP-G遺伝子配列）を基に、VIH遺伝子をクローニングしてプラスミドを作製した。作製したプラスミドを鋳型にT7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマー（T7-VIH-L、T7-VIH-R、表１を参照）を用いmature VIH部位を増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを作製した（図２）。表１に示す配列中、TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号２０）で表される部分はt7プロモーターの配列である。
1. VIH(vitellogenesis-inhibiting hormone)遺伝子の二本鎖RNA(ds-RNA)の作製
VIH遺伝子はTsutsui et al.（2013）Fish. Sci., 79: 357-365で報告されている配列（SGP-G遺伝子配列）を基に、VIH遺伝子をクローニングしてプラスミドを作製した。作製したプラスミドを鋳型にT7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマー（T7-VIH-L、T7-VIH-R、表１を参照）を用いmature VIH部位を増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを作製した（図２）。表１に示す配列中、TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号２０）で表される部分はt7プロモーターの配列である。
2. VIH-dsRNAの投与
バナメイ雌成エビ（体重39g〜70g）の脱皮間期（ステージC0-C1）の個体を選び実験に用いた。作製したVIH-dsRNAはTE buffer(10mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA)に溶解して（1μg/μL）、体重（g）あたり3μgを注射した（VIH-dsRNA区）。また、bufferの影響を調べるため、TE bufferを同量の体重（g）あたり3μLを注射した（TE buffer区）。ネガティブコントロールとして、エビの生体に存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子に対するdsRNA（1μg/μL）を作製し、体重（g）あたり3μgを注射した（GFP-dsRNA区）。各実験区は注射後10日、20日にサンプリングを行い、眼柄でのVIH発現を調べた。また、本来の生体内でのVIH発現量を基準とするため、何も注射していない雌成エビ（Initial区）もサンプリングして眼柄でのVIH遺伝子の発現を調べた。なお、各実験区でサンプリングされた個体は、実験区・サンプリング日・番号順にラベルした。つまり、TE bufferを注射し（TE buffer区）10日後にサンプリングした個体はTE10-1〜TE10-5に、注射20日後にサンプリングした個体はTE20-1〜TE20-5に略称した。
バナメイ雌成エビ（体重39g〜70g）の脱皮間期（ステージC0-C1）の個体を選び実験に用いた。作製したVIH-dsRNAはTE buffer(10mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA)に溶解して（1μg/μL）、体重（g）あたり3μgを注射した（VIH-dsRNA区）。また、bufferの影響を調べるため、TE bufferを同量の体重（g）あたり3μLを注射した（TE buffer区）。ネガティブコントロールとして、エビの生体に存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子に対するdsRNA（1μg/μL）を作製し、体重（g）あたり3μgを注射した（GFP-dsRNA区）。各実験区は注射後10日、20日にサンプリングを行い、眼柄でのVIH発現を調べた。また、本来の生体内でのVIH発現量を基準とするため、何も注射していない雌成エビ（Initial区）もサンプリングして眼柄でのVIH遺伝子の発現を調べた。なお、各実験区でサンプリングされた個体は、実験区・サンプリング日・番号順にラベルした。つまり、TE bufferを注射し（TE buffer区）10日後にサンプリングした個体はTE10-1〜TE10-5に、注射20日後にサンプリングした個体はTE20-1〜TE20-5に略称した。
3. 遺伝子発現量の分析（全RNA抽出、半定量PCR法、定量PCR法）
サンプリングした眼柄からRNeasy mini kit（Qiagen）とClean-up kit（Qiagen）を用いて全RNA（total RNA）を精製した。精製した一部のtotal RNAサンプルでは（TE10-3、TE10-4、VIH10-2）、色相が残り色がついていた。精製したtotal RNAはHigh capacity RNA to cDNA kit（Applied Biosystems）で逆転写することでcDNAを合成し、これを4倍希釈したものを鋳型として、半定量PCR法及び定量PCR法によりVIH遺伝子の発現量を調べた。
サンプリングした眼柄からRNeasy mini kit（Qiagen）とClean-up kit（Qiagen）を用いて全RNA（total RNA）を精製した。精製した一部のtotal RNAサンプルでは（TE10-3、TE10-4、VIH10-2）、色相が残り色がついていた。精製したtotal RNAはHigh capacity RNA to cDNA kit（Applied Biosystems）で逆転写することでcDNAを合成し、これを4倍希釈したものを鋳型として、半定量PCR法及び定量PCR法によりVIH遺伝子の発現量を調べた。
半定量PCR法では、目的遺伝子の発現量を調べるため、VIH遺伝子に対する特異的なプライマー（Liv-SGP-G-F：CGGAGTGCAGGAGCAACTG（配列番号２１）、Liv-R3：CCTCTCTGTGTCTTCTGGCCGTTGG（配列番号２２））とTaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2x NoAmpErase UNG、Applied Biosystems）を用いてPCR（94℃2分間変性後、94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒で30サイクル）を行い、発現量を分析した。また、内部標準遺伝子としてbeta-actin遺伝子（ACTB）を増幅するプライマー（Liv-act-Fw1：CGACCTCACAGACTACCTGATGAAGAT（配列番号２３）、Liv-act-Rv2：GTGGTCATCTCCTGCTCGAAG（配列番号２４））を用いて同様にPCRを行い、相対的に比較した。
定量PCR法では、上記の遺伝子特異的なプライマーとキットにプローブ（VIHにはLiv-SGP-G-Prb：TCTACAACCCCGTGTTCGTCCAGTGC（配列番号２５）を、ACTBにはLiv-act-Prb：CGACCACCGCCGAGCGAGAAATCGTTCGT（配列番号２６））を加え、以下の条件でリアルタイムPCR（7500Fast Real-Time PCR system、Applied Biosystems）を行った：95℃2分の変性後、95℃10秒、62℃30秒で40サイクル。VIH遺伝子の発現量は内部標準遺伝子（ACTB）に対する目的遺伝子（VIH; SGP-G）の発現量を計算した相対定量で示した。
4. 結果
眼柄から精製したtotal RNAサンプルのうち、TE10-3、TE10-4、VIH10-2のRNAサンプルでは色相が残り色がついていた。半定量PCR後、DNA電気泳動で確認した結果、TE10-3、TE10-4では内部標準遺伝子が増幅されていなかったので（図３）、遺伝子発現量の分析から外した。VIH10-2サンプルでは内部標準遺伝子が増えていたが、残っていた色相がVIHの増幅を妨害する恐れがあるため、同様に発現量の分析から外した。30サイクルの半定量PCRでは、Initial-2、GFP10-2、5、TE20-1、GFP20-5の個体ではVIHの発現が見られなかったが、Initial区、TE buffer区、GFP-dsRNA区の全般的にVIHの発現が確認された。一方、VIH-dsRNAを注射した実験区では10日及び20日のすべての個体でVIHの発現が見られなかった。
眼柄から精製したtotal RNAサンプルのうち、TE10-3、TE10-4、VIH10-2のRNAサンプルでは色相が残り色がついていた。半定量PCR後、DNA電気泳動で確認した結果、TE10-3、TE10-4では内部標準遺伝子が増幅されていなかったので（図３）、遺伝子発現量の分析から外した。VIH10-2サンプルでは内部標準遺伝子が増えていたが、残っていた色相がVIHの増幅を妨害する恐れがあるため、同様に発現量の分析から外した。30サイクルの半定量PCRでは、Initial-2、GFP10-2、5、TE20-1、GFP20-5の個体ではVIHの発現が見られなかったが、Initial区、TE buffer区、GFP-dsRNA区の全般的にVIHの発現が確認された。一方、VIH-dsRNAを注射した実験区では10日及び20日のすべての個体でVIHの発現が見られなかった。
また、図４で示したように、定量PCRの結果では、Initial区に対し、TE buffer区とGFP-dsRNA区では10日、20日ともにVIH発現量の有意的な変動が見られなかったが、VIH-dsRNA区では10日、20日ともにVIH発現量が有意に減少した。以上のように、成エビにおいて、VIH-dsRNAの投与によりVIH遺伝子発現を抑制することができると立証された。
実施例２ バナメイ雌亜成エビにおけるVIH遺伝子の発現制御
1. 眼柄由来ペプチドのクローニング
バナメイエビにおいては7つの眼柄由来ペプチド（sinus gland peptides：SGP- A〜G）が同定されており、そのうち6つの眼柄由来ペプチド（A、B、C、E、F、G）が卵黄タンパク質の発現を抑制することが報告されている（Tsutsui et al., 2007, Mar. Biotechnol., 9:360-369）。そのうちSGP-Gが最も多く存在していることから、SGP-Gは主なVIHとして研究のさらなる対象となっていた。しかしながら、SGP-Cの塩基配列は構造的に甲殻類血糖上昇ホルモン（crustacean hyperglycemic hormore: CHH）に類似しており、またCHHと同様な作用を有すること突き止めたので、両方のホルモンの性質を有すると判断された（Lago-Leston et al., 2007, Aquaculture, 270: 343-357; Liu et al., 2014, Peptides, 53: 115-124）。本発明では、SGP-G（VIH）のみならず、上記のSGP-C及びその他の類似したSGP遺伝子に対するdsRNAをエビの生体内に注入することでVIHの発現量を抑制することができる。そのため、眼柄のcDNAライブラリーからSGP-Cの全cDNA配列を得て、SGP-A、SGP-B、SGP-FのcDNAを新たにクローニングした。
1. 眼柄由来ペプチドのクローニング
バナメイエビにおいては7つの眼柄由来ペプチド（sinus gland peptides：SGP- A〜G）が同定されており、そのうち6つの眼柄由来ペプチド（A、B、C、E、F、G）が卵黄タンパク質の発現を抑制することが報告されている（Tsutsui et al., 2007, Mar. Biotechnol., 9:360-369）。そのうちSGP-Gが最も多く存在していることから、SGP-Gは主なVIHとして研究のさらなる対象となっていた。しかしながら、SGP-Cの塩基配列は構造的に甲殻類血糖上昇ホルモン（crustacean hyperglycemic hormore: CHH）に類似しており、またCHHと同様な作用を有すること突き止めたので、両方のホルモンの性質を有すると判断された（Lago-Leston et al., 2007, Aquaculture, 270: 343-357; Liu et al., 2014, Peptides, 53: 115-124）。本発明では、SGP-G（VIH）のみならず、上記のSGP-C及びその他の類似したSGP遺伝子に対するdsRNAをエビの生体内に注入することでVIHの発現量を抑制することができる。そのため、眼柄のcDNAライブラリーからSGP-Cの全cDNA配列を得て、SGP-A、SGP-B、SGP-FのcDNAを新たにクローニングした。
2. 眼柄由来ペプチドのdsRNA作成
成エビと同様にVIH遺伝子のプラスミドを基に、mature VIH部位の遺伝子断片をPCRにより増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを、ネガティブコントロールとしてGFP-dsRNAを作成した。また、VIH-dsRNAと同様に、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F遺伝子のmature部位を標的としたdsRNAを合成するため、T7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマーとT7プロモータープライマー（表１を参照）を用いて、クローニングした各プラスミドを鋳型にPCRにより遺伝子断片を増幅し、それを鋳型にVIH-dsRNAと同じ方法で各遺伝子のdsRNAを合成した。得られたGFP-dsRNA 、VIH-dsRNA、SGP-C-dsRNAは3μg/4μL濃度でTE bufferに溶解して使用した。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAの3つは、各dsRNAが1μg/4μL濃度になるように混ぜて総dsRNA濃度が3μg/4μLになるようTE bufferで溶解して使用した。
成エビと同様にVIH遺伝子のプラスミドを基に、mature VIH部位の遺伝子断片をPCRにより増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを、ネガティブコントロールとしてGFP-dsRNAを作成した。また、VIH-dsRNAと同様に、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F遺伝子のmature部位を標的としたdsRNAを合成するため、T7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマーとT7プロモータープライマー（表１を参照）を用いて、クローニングした各プラスミドを鋳型にPCRにより遺伝子断片を増幅し、それを鋳型にVIH-dsRNAと同じ方法で各遺伝子のdsRNAを合成した。得られたGFP-dsRNA 、VIH-dsRNA、SGP-C-dsRNAは3μg/4μL濃度でTE bufferに溶解して使用した。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAの3つは、各dsRNAが1μg/4μL濃度になるように混ぜて総dsRNA濃度が3μg/4μLになるようTE bufferで溶解して使用した。
3. dsRNAの投与
無作為に選んだ雌亜成エビ（体重15g〜25g）個体に、VIH-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射（VIH-1区）と、7日間隔で3回注射した（VIH-2区）。SGP-C-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（SGP-C区）。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAは同濃度に混ぜて、体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（Mix区）。ネガティブコントロールとして、GFP-dsRNAを体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（GFP区）。サンプリングは最初注射後、10日、20日、30日で行い、眼柄でのVIH発現量を調べた。
無作為に選んだ雌亜成エビ（体重15g〜25g）個体に、VIH-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射（VIH-1区）と、7日間隔で3回注射した（VIH-2区）。SGP-C-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（SGP-C区）。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAは同濃度に混ぜて、体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（Mix区）。ネガティブコントロールとして、GFP-dsRNAを体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（GFP区）。サンプリングは最初注射後、10日、20日、30日で行い、眼柄でのVIH発現量を調べた。
4．遺伝子発現量の分析（全RNA抽出、半定量PCR法、定量PCR法）
実施例１の3と同様の方法で遺伝子発現量の分析を行った。
実施例１の3と同様の方法で遺伝子発現量の分析を行った。
5. 結果
眼柄のcDNAライブラリーからクローニングしたSGP-C遺伝子は、115残基のアミノ酸配列をコードしており、その一次構造は、Signal peptide（24残基）、CPRP（CHH precursor-related peptide；16残基）、mature SGP-C（75残基）で構成されていた（図５）。また、SGP-A、SGP-B、SGP-Fの遺伝子と思われるcDNAもクローニングすることができた。それぞれのcDNAを以前眼柄から抽出されたペプチド配列と比較したことろ、SGP-Aではmature部位の推定アミノ酸配列と一致したが（図６）、SGP-B（図７）とSGP-F（図８）ではアミノ酸の2残基が異なっていた。これらのcDNAはそれぞれのdsRNAの合成で鋳型として使用した。図２及び５〜８には、dsRNAの作製に用いたdsRNA用のプライマーの配列を二重下線部に示す。該プライマーを用いて各眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するためのdsRNAを作製した。図２のSGP-G用のdsRNA配列を配列番号３９に示し、SGP-G用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３７及び３８に示す。図５のSGP-C用のdsRNA配列を配列番号３３に示し、SGP-C用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３１及び３２に示す。図６のSGP-A用のdsRNA配列を配列番号２８に示し、SGP-A用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２７に示す。図７のSGP-B用のdsRNA配列を配列番号３０に示し、SGP-B用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２９に示す。図８のSGP-F用のdsRNA配列を配列番号３６に示し、SGP-F用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３４及び３５に示す。
眼柄のcDNAライブラリーからクローニングしたSGP-C遺伝子は、115残基のアミノ酸配列をコードしており、その一次構造は、Signal peptide（24残基）、CPRP（CHH precursor-related peptide；16残基）、mature SGP-C（75残基）で構成されていた（図５）。また、SGP-A、SGP-B、SGP-Fの遺伝子と思われるcDNAもクローニングすることができた。それぞれのcDNAを以前眼柄から抽出されたペプチド配列と比較したことろ、SGP-Aではmature部位の推定アミノ酸配列と一致したが（図６）、SGP-B（図７）とSGP-F（図８）ではアミノ酸の2残基が異なっていた。これらのcDNAはそれぞれのdsRNAの合成で鋳型として使用した。図２及び５〜８には、dsRNAの作製に用いたdsRNA用のプライマーの配列を二重下線部に示す。該プライマーを用いて各眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するためのdsRNAを作製した。図２のSGP-G用のdsRNA配列を配列番号３９に示し、SGP-G用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３７及び３８に示す。図５のSGP-C用のdsRNA配列を配列番号３３に示し、SGP-C用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３１及び３２に示す。図６のSGP-A用のdsRNA配列を配列番号２８に示し、SGP-A用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２７に示す。図７のSGP-B用のdsRNA配列を配列番号３０に示し、SGP-B用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２９に示す。図８のSGP-F用のdsRNA配列を配列番号３６に示し、SGP-F用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３４及び３５に示す。
dsRNAの注射による眼柄でのVIH遺伝子発現を定量PCR法で分析した結果、Initial区（注射無し）に対し、GFP-dsRNAを注射したGFP区では10日、20日、30日ともにVIH発現量に有意な減少は見られなかったが、VIH-dsRNAを注射したVIH-1区（1回）とVIH-2区（3回）では、注射後10日、20日、30日にVIHの発現量が有意に減少した（図９）。類似したSGP-C遺伝子のdsRNAを注射したSGP-C区では、注射後10日ではVIH発現量が有意に減少したが、20日、30日にはInitial区のVIH発現量に対し有意差は認められなかった。また、SGP-A、SGP-B、SGP-F遺伝子のdsRNAを混ぜて注射したMix区では、注射後10日、30日ではVIH発現量が有意に減少したが、20日ではInitial区のVIH発現量に対し有意差は認められなかった。
以上、亜成体エビにおいてもVIH（SGP-G）に対するdsRNAを使用することで VIH遺伝子の発現量を大幅に抑制することができる。また、VIHに類似したその他の遺伝子を用いても同様な効果を得ることができる。
本発明のdsRNAを用いてエビ類を計画的かつ効率的に生産することができる。
配列番号１１〜１９、２１〜２７、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８ プライマー
Claims (2)
- 養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子であって、クルマエビ科に属するエビ類の眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C及びSGP-Fからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法であって、
養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビであり、
卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)が、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA(dsRNA)であり、
センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いる、方法。 - 卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子であって、クルマエビ科に属するエビ類の眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C及びSGP-Fからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)であって、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA（dsRNA)を含む、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する組成物であって、
養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビであり、
センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を含む、組成物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016214411A JP6789513B2 (ja) | 2016-11-01 | 2016-11-01 | 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 |
| PCT/JP2017/038853 WO2018084077A1 (ja) | 2016-11-01 | 2017-10-27 | 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 |
| US16/333,544 US11060090B2 (en) | 2016-11-01 | 2017-10-27 | Method of releasing the suppression of egg maturation in economically-important prawn/shrimp species |
| CN201780057737.9A CN109715806B (zh) | 2016-11-01 | 2017-10-27 | 解除有用虾类的卵成熟抑制的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016214411A JP6789513B2 (ja) | 2016-11-01 | 2016-11-01 | 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018068243A JP2018068243A (ja) | 2018-05-10 |
| JP6789513B2 true JP6789513B2 (ja) | 2020-11-25 |
Family
ID=62076572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016214411A Active JP6789513B2 (ja) | 2016-11-01 | 2016-11-01 | 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11060090B2 (ja) |
| JP (1) | JP6789513B2 (ja) |
| CN (1) | CN109715806B (ja) |
| WO (1) | WO2018084077A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110760545B (zh) * | 2019-10-31 | 2021-05-04 | 福建农林大学 | 基于miRNA的虾蟹卵巢发育促进剂 |
| CN111621501B (zh) * | 2020-06-12 | 2021-07-16 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 斑节对虾雌性亲虾性腺促熟小干扰rna组合物、试剂盒及使用方法 |
| WO2022092170A1 (ja) * | 2020-10-27 | 2022-05-05 | 国立大学法人 東京大学 | 十脚目甲殻類の成長調節方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002083717A1 (en) * | 2001-04-11 | 2002-10-24 | Australian Institute Of Marine Science | Induction of spawning in crustacea |
| CN1860220A (zh) * | 2003-07-02 | 2006-11-08 | 南卡罗来纳医科大学研究发展基金会 | dsRNA 诱导的在甲壳动物和其它无脊椎动物中的特异性和非特异性免疫及其中所用的生物送递载体 |
| US20150099702A1 (en) * | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Siu Ming Chan | Use of rna interfearence, farnesoic acid and recombinant protein approach to induce gonad maturation in crustacean species |
| CN104212813A (zh) * | 2014-09-22 | 2014-12-17 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法 |
-
2016
- 2016-11-01 JP JP2016214411A patent/JP6789513B2/ja active Active
-
2017
- 2017-10-27 US US16/333,544 patent/US11060090B2/en active Active
- 2017-10-27 CN CN201780057737.9A patent/CN109715806B/zh active Active
- 2017-10-27 WO PCT/JP2017/038853 patent/WO2018084077A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2018068243A (ja) | 2018-05-10 |
| WO2018084077A1 (ja) | 2018-05-11 |
| CN109715806A (zh) | 2019-05-03 |
| CN109715806B (zh) | 2022-07-15 |
| US11060090B2 (en) | 2021-07-13 |
| US20190233819A1 (en) | 2019-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2584609C2 (ru) | Олигорибонуклеотиды и способы их применения для лечения острой почечной недостаточности | |
| AU778474B2 (en) | Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene | |
| KR101605144B1 (ko) | Ｃｎｓ 질환의 치료 | |
| US8486910B2 (en) | SnoRNAi-small nucleolar RNA degradation by RNA interference in trypanosomatids | |
| CN101981046B (zh) | 对虾中的胰岛素样基因和其用途 | |
| JP2009522303A (ja) | 瘢痕を生じない皮膚創傷治癒を促進するｓｉＲＮＡ組成物および創傷処置の方法 | |
| JP2007530414A (ja) | 甲殻類動物、及び他の無脊椎動物における、ｄｓＲＮＡで誘導された特異的、及び非特異的免疫、及びそこで使用する生物送達媒体 | |
| US20120227119A1 (en) | Methods of Modulating the Sex of Avians | |
| CN1604963A (zh) | 短的双链RNAs的体外合成方法 | |
| JP6789513B2 (ja) | 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 | |
| Lugo et al. | Molecular cloning and characterization of the crustacean hyperglycemic hormone cDNA from Litopenaeus schmitti: Functional analysis by double‐stranded RNA interference technique | |
| Zhao et al. | Schistosoma japonicum: inhibition of Mago nashi gene expression by shRNA-mediated RNA interference | |
| RU2418594C2 (ru) | Лечение заболеваний кишечника | |
| CN104726500B (zh) | MicroRNA26b‑3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用 | |
| EP2489729B1 (en) | Apoptotic cell-mediated transfection of mammalian cells with interfering RNA | |
| WO2005010185A1 (ja) | Klf5遺伝子の発現を抑制するrna | |
| CN112725436A (zh) | 一种人circMKLN1基因的用途及相关产品 | |
| WO2022270071A1 (ja) | 肝線維化抑制のための剤及び医薬組成物 | |
| KR101667384B1 (ko) | miR-551b-3p 를 이용한 허혈성 뇌중풍의 예방 또는 치료 | |
| RU2434942C2 (ru) | Олигорибонуклеотиды и способы их применения для лечения острой почечной недостаточности и других заболеваний | |
| JP4911501B2 (ja) | 新規遺伝子発現抑制剤 | |
| WO2018232191A1 (en) | Enhanced organogenesis through manipulation of lin28/let-7/dis3l2 | |
| Estrada et al. | Effects of RNA interference on gene functions of aquatic organisms | |
| KR101414383B1 (ko) | Ｄｌｋ-1 유전자 발현억제용 조성물 | |
| KR20110093840A (ko) | 지방세포 형성의 조절을 위한 ｐｌａｃ８ 활성 억제제의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190108 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191218 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200214 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20200616 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200811 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200811 |
|
| C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20200825 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200914 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20200915 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20201006 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20201020 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6789513 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |