CN109715806A

CN109715806A - 解除有用虾类的卵成熟抑制的方法

Info

Publication number: CN109715806A
Application number: CN201780057737.9A
Authority: CN
Inventors: 姜奉廷; 玛茜·维尔德
Original assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS
Current assignee: Japan International Research Center for Agricultural Sciences JIRCAS
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: JP2018068243A; WO2018084077A1; JP6789513B2; CN109715806B; US11060090B2; US20190233819A1

Abstract

一种解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法。本发明的目的在于提供使用RNA干涉的手法抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而解除卵成熟抑制的方法。具体而言，本发明为使用以养殖虾类的卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶的双链RNA(dsRNA)，通过RNA干涉法，抑制虾类的卵黄生成抑制激素基因的表达，从而解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法。

Description

解除有用虾类的卵成熟抑制的方法

技术领域

本发明涉及使用分子生物学手法控制虾类的机体内原来的生物学功能的方法，具体而言，涉及使用RNA干涉的手法抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而解除卵成熟抑制的方法。

背景技术

当前，为了支援每年高达350万吨的凡纳滨对虾养殖生产，世界上每年约生产2,000亿尾幼虾，作为其母虾仅美国夏威夷州就生产·输出80万尾。人为地使包括凡纳滨对虾的对虾类成熟十分困难，目前进行眼柄切除来促进成熟。然而，眼柄切除不仅成熟成功率低，而且由于烧断虾的一边的眼柄，因此还遭到虐待动物的责难。开发代替眼柄切除的成熟促进技术，使计划地、有效地生产幼虾成为可能是紧迫的课题。

RNA干涉(RNAi)是通过双链RNA(dsRNA)序列特异性地切断mRNA，结果抑制基因表达的现象，据报告是生物共通的核酸级别的防御系统(参照非专利文献1)。在RNAi中，dsRNA通过Dicer酶(一种核糖核酸内切酶)的作用被加工生成siRNA(short interfering RNA：小干扰RNA)，siRNA作为引导RNA来识别靶序列，通过切断靶mRNA，抑制基因的表达。

当前，还没有为了在孵化场等人为地使虾类成熟·产卵来代替切除眼柄的技术。然而，近来报告以使用RNA干涉法在斑节对虾(Penaeus monodon)等虾类中抑制VIH的表达为目的的研究事例(参照非专利文献1、非专利文献2以及非专利文献3)。此外，还有宣称能够用相同的方法促进成熟的专利申请的事例(参照专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第US2015/0099702号说明书。

非专利文献

非专利文献1：Tiu and Chan,2007,FEBS Journal,274:4385-4395.

非专利文献2：Treerattrakool et al.,2008,FEBS Journal,275:970-980.

非专利文献3：Treerattrakool et al.,2013,Aquaculture,404-405:116-121.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于提供使用RNA干涉的手法抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而解除卵成熟抑制的方法。

用于解决课题的手段

作为控制虾类的卵成熟的方法，本发明者们对利用RNA干涉的原理，使用与抑制虾类的卵成熟的基因的mRNA结合的dsRNA，抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达进行了深入研究。该研究是基于生化学研究的为使有效控制成熟成为可能的第一步，而且是解除机体内抑制成熟的激素的基因表达的研究。结果发现，通过上述dsRNA，能够有效地抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而能够解除卵成熟的抑制。

进而，本发明者们发现，多个基因与卵成熟的抑制相关，通过混合使用能够抑制各个基因表达的多个dsRNA，能够更有效地抑制卵成熟抑制基因的表达，以至于完成本发明。

即，本发明如下所示。

[1]一种解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其使用以养殖虾类的卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶的双链RNA(dsRNA)，通过RNA干涉法，抑制虾类的卵黄生成抑制激素基因的表达。

[2]根据[1]的方法，所述养殖虾类是属于对虾科的虾类。

[3]根据[2]的方法，所述养殖虾类是凡纳滨对虾或日本对虾的成虾或亚成虾。

[4]根据[1]至[3]中的任一方法，以卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶的双链RNA(dsRNA)是如下的正义链以及包含与所述正义链的碱基序列互补的碱基序列的反义链互补结合的双链RNA(dsRNA)，所述正义链相对于卵黄生成抑制激素(VIH)基因的碱基序列的一部分具有相同的碱基序列，并且能够与该基因进行杂交。

[5]根据[1]至[4]中的任一方法，所述卵黄生成抑制激素基因是来源于凡纳滨对虾的眼柄的肽的、选自于由SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F以及SGP-G组成的组中的一种或多种基因。

[6]根据[1]至[5]中的任一方法，使用选自于由如下双链RNA(dsRNA)组成的组中的双链RNA(dsRNA)的一种或多种：正义链用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)；以及正义链用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)。

[7]一种解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其包含如下的双链RNA(dsRNA)，从而抑制虾类的卵成熟抑制激素基因的表达，所述双链RNA(dsRNA)以卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶，并且是如下的正义链以及包含与所述正义链的碱基序列互补的碱基序列的反义链互补结合的双链RNA(dsRNA)，所述正义链相对于卵黄生成抑制激素(VIH)基因的碱基序列的一部分具有相同的碱基序列，并且能够与该基因进行杂交，。

[8]根据[7]的组合物，所述养殖虾类是属于对虾科的虾类。

[9]根据[8]的组合物，所述养殖虾类是凡纳滨对虾或日本对虾的成虾或亚成虾。

[10]根据[7]至[9]中的任一组合物，所述卵黄生成抑制激素基因是来源于凡纳滨对虾的眼柄的肽的、选自于由SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F以及SGP-G组成的组中的一种或多种基因。

[11]根据[7]至[10]中的任一组合物，其特征在于，包含选自于由如下双链RNA(dsRNA)组成的组中的双链RNA(dsRNA)的一种或多种：正义链用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)；以及正义链用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)。

本说明书包括成为本申请的优先权的基础的日本专利申请第2016-214411号公开的内容。

发明效果

通过使用本发明的双链RNA(dsRNA)，利用RNA干涉的原理抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而能够解除卵成熟抑制。像这样通过促进卵成熟抑制被解除的虾类的卵成熟，能够有计划地、且有效地生产幼虾。

通过使用本发明的双链RNA(dsRNA)，能够在10天中使全部个体内基因表达水平全无，并至少保持该状态30天。此外，使用了本发明的dsRNA时的基因表达敲除率为76.9％至99.9％。相对于此，使用了RNA干涉法的其它研究组织的结果中，例如在Feijo et al(2016),Mar Biotechnol.18:117-123中，基因表达的敲除率在投药后仅为64％至73％。

附图说明

图1是示出本发明的方法的概念的图。

图2是示出凡纳滨对虾的VIH(SGP-G)cDNA(互补DNA)的碱基序列和推算氨基酸序列的图。推测的切断位点用箭头(▼)表示，双下划线部表示dsRNA用的引物位点。碱基序列数标记在右侧。

图3是示出通过半定量PCR(半定量聚合酶链式反应)的眼柄内的VIH基因表达的测量结果的图。Initial表示无注射区，TE表示TE缓冲液(Tris-EDTA Buffer，三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液)注射区，GFP表示GFP-dsRNA(绿色萤光蛋白质标记dsRNA)注射区，VIH表示VIH-dsRNA注射区。

图4是示出通过定量PCR(定量聚合酶链式反应)的成虾眼柄内的VIH基因表达量的测量结果的图。(N)表示分析的个体数，*表示相对于Initial存在有意差(P＜0.05)。

图5是示出凡纳滨对虾的SGP-C cDNA的碱基序列和推定氨基酸序列的图。推测的切断位点用(↓)表示，双下划线部表示dsRNA用的引物位点。碱基序列数标记在右侧，氨基酸序列数标记在左侧。

图6是示出凡纳滨对虾的SGP-A cDNA的碱基序列和推算氨基酸序列的图。推测的切断位点用(↓)表示，双下划线部表示dsRNA用引物位点，加粗字体表示合成的dsRNA位点。碱基序列数标记在右侧。

图7是示出凡纳滨对虾的SGP-B cDNA的碱基序列和推算氨基酸序列的图。推测的切断位点用(↓)表示，双下划线部表示dsRNA用引物位点，加粗字体表示合成的dsRNA位点。碱基序列数标记在右侧。报告的肽序列和从cDNA的推算氨基酸序列不同的地方用下划线表示。

图8是示出凡纳滨对虾的SGP-F cDNA的碱基序列和推算氨基酸序列的图。推测的切断位点用(↓)表示，双下划线部表示dsRNA用引物位点，加粗字体表示合成的dsRNA位点。碱基序列数标记在右侧。报告的肽序列和从cDNA的推算氨基酸序列不同的地方用下划线表示。

图9是示出通过定量PCR的亚成虾眼柄内的VIH基因表达量的测量结果的图。(N)表示分析的个体数，*表示相对于Initial存在有意差(P＜0.05)。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明是通过RNA干涉法，抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而解除卵成熟抑制的方法。

在养殖虾类中，卵成熟会被抑制，当前是通过眼柄切除来促进卵成熟。在本发明中，通过抑制养殖虾类的卵成熟抑制基因的表达来解除卵成熟抑制。

通过本申请发明的方法，解除卵成熟抑制的虾类是属于对虾科的虾类，有日本对虾(Penaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国对虾(Penaeuschinensis)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus)、斑节对虾(Penaeus monodon)、宽沟对虾(Melicertus latisulcatus)等。其中，优选作为食用虾而大量生产的凡纳滨对虾或日本对虾。此外，以成虾为对象还是以亚成虾为对象均可。在此，体重10g以上且小于25g称为亚成虾，35g以上称为成虾。

通过本申请发明的方法，抑制表达的虾类的卵成熟抑制基因是属于甲壳类高血糖激素(CHH：crustacean hyperglycemic hormone)家族的基因。作为属于CHH家族的基因，有甲壳类高血糖激素(CHH：crustacean hyperglycemic hormone)基因、卵黄生成抑制激素(VIH：vitellogenesis-inhibiting hormone)基因、脱皮抑制激素(MIH：molt-inhibitinghormone)基因等。需要注意的是，卵黄生成抑制激素(VIH)也称为性腺抑制激素(Gonad-inhibiting hormone)。

在本发明中，抑制属于甲壳类高血糖激素(CHH：crustacean hyperglycemichormone)家族的卵黄生成抑制激素(VIH)基因的表达。作为卵黄生成抑制激素(VIH)基因，有来源于眼柄的肽(SGP：sinus gland peptide：窦腺肽)基因。虽然在来源于眼柄的肽中，存在SGP-A至SGP-G 7个，但在本发明中，通过抑制SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F以及SGP-G 5个来源于眼柄的肽基因中的一种或多种基因的表达，抑制卵黄生成抑制激素的表达，使卵黄蛋白质容易合成，使卵成熟，从而控制卵成熟。

如下所示，序列号1至10为基因的碱基序列及由基因编码的肽的氨基酸序列。

序列号1 SGP-A碱基序列

序列号2 SGP-A氨基酸序列

序列号3 SGP-B碱基序列

序列号4 SGP-B氨基酸序列

序列号5 SGP-C碱基序列

序列号6 SGP-C氨基酸序列

序列号7 SGP-F碱基序列

序列号8 SGP-F氨基酸序列

序列号9 SGP-G碱基序列

序列号10 SGP-G氨基酸序列

此外，将SGP-A的碱基序列及氨基酸序列示于图6；将SGP-B的碱基序列及氨基酸序列示于图7；将SGP-C的碱基序列及氨基酸序列示于图5；将SGP-F的碱基序列及氨基酸序列示于图8；将SGP-G的碱基序列及氨基酸序列示于图2。

为了抑制上述的基因表达，使用以各自的基因的mRNA为靶的由双链形成的dsRNA(double stranded RNA：双链RNA)即可。dsRNA通过RNA干涉抑制靶基因的表达(基因沉默)。该dsRNA的一条链是对于各基因的碱基序列的一部分具有相同的碱基序列，并且是可以与该基因杂交的正义链，另一条链是包含与该正义链的碱基序列互补的碱基序列的反义链，该正义链和反义链互补地结合形成dsRNA。但是，正义链和反义链不一定需要完全互补，只要互补地结合，允许存在一个或多个，即1至10个、优选1至5个、进一步优选1至3个、尤其优选2个或1个错配。上述的来源于眼柄的肽基因中的靶序列既可以是编码区，也可以是非编码区。此外，也可以包含编码区和非编码区两者。

在本发明中，dsRNA包含shRNA(small hairpin RNA：短发夹RNA)及siRNA(smallinterfering RNA：小干扰RNA)。shRNA包含双链部分，具有正义链和反义链经由环序列连结的茎环结构。在shRNA中，正义链的3’末端和反义链的5’末端经由环(发夹环序列)连结。发夹环序列没有限定，是由5至12碱基组成的以UU开头的序列，例如有UUCAAGAGA。dsRNA及shRNA在机体内通过Dicer被加工生成siRNA。此外，dsRNA可生成miRNA。当本发明的dsRNA由30碱基以上的长度提供时，通过被称为Dicer的RnaseIII样酶的作用而被加工，能够生成在3’末端具有2碱基悬垂的21至27碱基的siRNA(small interfering RNA：小干扰RNA)分子。

dsRNA的碱基数没有限定，为50至800碱基、优选100至500碱基、进一步优选100至300碱基。

作为dsRNA的与来源于眼柄的肽基因的靶序列进行杂交、能够抑制来源于眼柄的肽基因的表达的正义链，可举出具有拥有如下碱基序列的RNA序列的正义链，该碱基序列是用序列号1表示的SGP-A基因的碱基序列、用序列号3表示的SGP-B基因的碱基序列、用序列号5表示的SGP-C基因的碱基序列、用序列号7表示的SGP-F基因的碱基序列以及用序列号9表示的SGP-G基因的碱基序列的部分序列，且基因序列中的胸腺嘧啶被置换成尿嘧啶。

具体而言，可以使用选自于由如下双链RNA(dsRNA)组成的组中的双链RNA(dsRNA)的一种或多种：例如，正义链用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)；以及正义链用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)。由与这些正义链互补的序列组成的反义链与这些正义链杂交而生成dsRNA。上述正义链可使用dsRNA用的引物制备。作为用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)用的引物，有用序列号27表示的碱基序列组成的引物；作为用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)用的引物，有用序列号29表示的碱基序列组成的引物；作为用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)用的引物，有用序列号31表示的碱基序列组成的引物及用序列号32表示的碱基序列组成的引物；作为用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)用的引物，有用序列号34表示的碱基序列组成的引物及用序列号35表示的碱基序列组成的引物；作为用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)用的引物，有用序列号37表示的碱基序列组成的引物及用序列号38表示的碱基序列组成的引物。

虽然构成本发明的dsRNA的正义链最好与来源于眼柄的肽基因的碱基序列相同，但也可以是实质上相同的序列。即，只要dsRNA的正义链与实际上成为靶的来源于眼柄的肽的mRNA序列进行杂交，允许发生1个或多个碱基，即1至10个、优选1至5个、进一步优选1至3个、或者2个或1个碱基缺失、置换或附加而错配。

为了解除虾类的卵成熟抑制，抑制上述的来源于眼柄的肽基因的至少1种、优选2种、3种、4种或5种的多种基因的表达。在抑制了多种基因的表达的情况下，能够更有效地解除卵成熟抑制。为了抑制多种基因的表达，使用能够抑制各基因的表达的多种dsRNA即可。

构成dsRNA分子的正义链或反义链也可以在3’末端具有悬垂。悬垂的碱基种类、数量不受限定。例如，有1至5碱基、优选1至3碱基、进一步优选由1或2碱基组成的序列。具体而言，例如有TTT、UU或TT。在此，悬垂是指附加于dsRNA分子的一条链的末端的碱基，并且是不存在能够与另一条链的对应位置互补结合的碱基的碱基。

本发明的dsRNA可以通过化学合成或使用了启动子及RNA聚合酶的转录系统在体外合成。例如，通过化学合成时，合成具有以彼此互补的序列作为反方向序列从而具有自身互补性的RNA一条链，使自身互补性部分结合即可。所合成的正义链及反义链的退火可通过本领域技术人员公知的通常的方法进行。

此外，使用启动子及RNA聚合酶合成时，合成具有在一个启动子的下游处正义链和反义链以环连结的结构的模板DNA，通过RNA聚合酶转录出RNA即可。当在体外制造时，作为启动子可使用T7启动子、T3启动子等。此外，当对载体引入本发明的dsRNA的模板DNA，对虾类的机体内投药该载体而在机体内合成dsRNA时，可使用H1启动子、U6启动子等PolIII类启动子等。使用载体时，作为载体可使用质粒载体、病毒载体等。作为质粒载体，可使用pSUPER载体、pBAsi载体等；作为病毒载体，可使用腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体等。

本发明还包括表达上述dsRNA分子的载体。

本发明的dsRNA序列特异性地切断来源于眼柄的肽基因的mRNA，其结果引起抑制来源于眼柄的肽基因的表达的RNA干涉(RNAi)，从而能够抑制来源于眼柄的肽基因的表达。

为了使用本发明的dsRNA抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达从而解除卵成熟，对虾类的机体内投放本发明的dsRNA即可。投药可以通过经口途径以及静脉内、肌肉内、皮下以及腹腔内的注射或非经肠的途径进行。例如，通过注射dsRNA对腹内投药即可。此时，优选使用具有30G至33G左右的细针的胰岛素注射用注射针。此外，还可以将本发明的dsRNA与饲料混合，通过摄食来投药。

本发明的dsRNA可与药理学允许的载体、稀释剂或赋形剂配合使用。作为载体，有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、磷酸缓冲生理盐水葡萄糖液及缓冲生理盐水。在与载体配合时，本发明的dsRNA的含量根据制剂适当选择即可，虽然根据制剂的不同而存在各种不同，但优选为0.001重量％至1重量％。本发明的dsRNA对虾类的投放量为0.0001mg至1mg，1天1次至数次分开投药即可。此外，优选每1投放量单位，按dsRNA分子量计投放1nM至100μM、优选10nM至50μM、更优选100nM至20μM。

本发明中，通过RNA干涉抑制靶基因的表达(基因沉默)是指在基因的表达以该基因的mRNA或蛋白质的表达量为指标进行判断时，相对于不导入本发明的siRNA时，不仅是100％抑制的情况，还包括75％以上、50％以上或20％以上抑制的情况。表达抑制的程度比较siRNA导入前后的基因的mRNA或蛋白质的产生量即可。mRNA的情况下，可以通过Northern印迹法(RNA印迹法)、RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)、原位杂交等测定；蛋白质的情况下，可以通过Western印迹法(免疫印迹法)、ELISA(酶联免疫吸附试验)等公知的方法测量。

通过使用本发明的dsRNA抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，能够解除虾类的卵成熟抑制。即，本发明包括通过对虾类投放本发明的dsRNA，抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而解除虾类的卵成熟抑制的方法。该方法还是通过对虾类投放本发明的dsRNA，抑制虾类的卵成熟抑制基因的表达，从而制造解除了卵成熟抑制的虾类的方法。

当对虾类投放本发明的dsRNA时，在几天至十几天左右能够完全地抑制卵成熟抑制基因的表达。此外，基因表达的被抑制状态可保持10天至50天、优选至少30天。此外，使用了本发明的dsRNA时的基因表达抑制率为76.6％至99.9％。

像这样，通过对解除了卵成熟抑制的虾类促进卵成熟，能够制造人为成熟的虾类。由该虾类能够有计划且有效地生产幼虾。

实施例

通过以下的实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1凡纳滨对虾雌成虾中的卵黄生成抑制激素(VIH；SGP-G)的基因表达的抑制

1.VIH(vitellogenesis-inhibiting hormone：卵黄生成抑制激素)基因的双链RNA(ds-RNA)的制备

VIH基因以Tsutsui et al.(2013)Fish.Sci.,79:357-365中报告的序列(SGP-G基因序列)为底物，克隆VIH基因制备质粒。对制备的质粒使用在模板上与T7启动子结合的基因特异性引物(T7-VIH-L、T7-VIH-R，参照表1)扩增成熟VIH位点，将其作为模板使用MEGAscript RNAi试剂盒(一种体外转录及翻译试验药)制备VIH-dsRNA(图2)。在表1所示的序列中，以TAATACGACTCACTATAGGG(序列号20)表示的部分是t7启动子的序列。

2.VIH-dsRNA的投放

选择凡纳滨对虾雌成虾(体重39g至70g)的脱皮期间(阶段C0-C1)的个体用于实验。制备的VIH-dsRNA溶解于TE缓冲液(10mM Tris–HCl pH 7，1mM EDTA)(1μg/μL)，每单位体重(g)注射3μg(VIH-dsRNA区)。此外，为了调查缓冲液的影响，每等量单位体重(g)注射3μL TE缓冲液(TE缓冲液区)。作为阴性对照，制备虾的机体内不存在的绿色荧光蛋白质(GFP)基因对应的dsRNA(1μg/μL)，每单位体重(g)注射3μg(GFP-dsRNA区)。各实验区在注射后10天、20天进行采样，调查在眼柄的VIH表达。此外，为了将原来的机体内的VIH表达量作为标准，还采样未注射任何物质的雌成虾(Initial区)调查在眼柄的VIH基因的表达。此外，在各实验区采样后的个体贴附实验区·采样日·序号标签。即，注射TE缓冲液(TE缓冲液区)10天后采样的个体简称为TE10-1至TE10-5，注射20天后采样的个体简称为TE20-1至TE20-5。

3.基因表达量的分析(总RNA提取、半定量PCR法、定量PCR法)

使用RNeasy mini kit(RNA小量提取试剂盒)(Qiagen)和Clean-up kit(纯化试剂盒)(Qiagen)从采样的眼柄纯化总RNA(total RNA)。在纯化的一部分总RNA样品(TE10-3、TE10-4、VIH10-2)中，色相残留并带有颜色。纯化的总RNA通过用High capacity RNA tocDNA kit(大容量逆转录试剂盒)(Applied Biosystems，应用生物系统)逆转录合成cDNA，将其4倍稀释后作为模板，通过半定量PCR法及定量PCR法调查VIH基因的表达量。

在半定量PCR法中，为了调查靶基因的表达量，使用对VIH基因特异的引物(Liv-SGP-G-F：CGGAGTGCAGGAGCAACTG(序列号21)、Liv-R3：CCTCTCTGTGTCTTCTGGCCGTTGG(序列号22))和TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2x NoAmpErase UNG、美国应用生物系统公司)进行PCR(94℃2分钟变性后、在94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒循环30次)，分析表达量。此外，作为内部标准基因使用扩增beta-actin(β-肌动蛋白)基因(ACTB)的引物(Liv-act-Fw1：CGACCTCACAGACTACCTGATGAAGAT(序列号23)、Liv-act-Rv2：GTGGTCATCTCCTGCTCGAAG(序列号24))同样地进行PCR，相对地进行比较。

在定量PCR法中，对上述的基因特异性引物和试剂盒施加探针(对VIH是Liv-SGP-G-Prb：TCTACAACCCCGTGTTCGTCCAGTGC(序列号25)、对ACTB是Liv-act-Prb：CGACCACCGCCGAGCGAGAAATCGTTCGT(序列号26))，在以下的条件下进行即时PCR(7500FastReal-Time PCR system(7500快速实时PCR系统)、Applied Biosystems)：95℃2分钟的变性后，在95℃10秒、62℃30秒循环40次。VIH基因的表达量由计算了相对于内部标准基因(ACTB)的靶基因(VIH；SPG-G)的表达量的相对定量表示。

4.结果

在从眼柄纯化的总RNA试样中，在TE10-3、TE10-4、VIH10-2的RNA试样中色相残留并带有颜色。半定量PCR后，利用DNA电泳确认的结果，由于TE10-3、TE10-4没有扩增内部标准基因(图3)，因此排除其基因表达量的分析。VIH10-2试样虽然扩增了内部标准基因，但由于残留的色相有可能会妨碍VIH的扩增，因此，同样地排除其表达量的分析。在循环30次的半定量PCR中，虽然Initial-2、GFP10-2、5、TE20-1、GFP20-5的个体没有显示VIH的表达，但Initial区、TE缓冲液区、GFP-dsRNA区的整体确认了VIH的表达。另一方面，注射了VIH-dsRNA的实验区在10天及20天的全部个体中都未显示VIH的表达。

此外，如图4所示，在定量PCR的结果中，虽然相对于Initial区，TE缓冲液区和GFP-dsRNA区中10天、20天均未显示VIH表达量的有意地变动，但在VIH-dsRNA区中10天、20天VIH表达量均有意地减少。如上所示，证明了在成虾中，通过VIH-dsRNA的投放能够抑制VIH基因表达。

表1

RNA干涉中使用的基因特异性引物表

实施例2凡纳滨对虾雌亚成虾中的VIH基因的表达控制

1.来源于眼柄的肽的克隆

在凡纳滨对虾中鉴定了7个来源于眼柄的肽(sinus gland peptides(窦腺肽)：SGP-A～G)，其中报告了6个来源于眼柄的肽(A、B、C、E、F、G)抑制卵黄蛋白质的表达(Tsutsui et al.,2007,Mar.Biotechnol.,9:360-369)。其中，由于SGP-G存在最多，因此，SGP-G作为主要的VIH成为进一步研究的对象。然而，SGP-C的碱基序列与甲壳类高糖激素(crustacean hyperglycemic hormore：CHH)结构上类似，此外，查明具有与CHH同样的作用，因此判断为具有双方的激素性质(Lago-Leston et al.,2007,Aquaculture,270:343-357；Liu et al.,2014,Peptides,53:115-124)。在本发明中，通过不仅是对于SGP-G(VIH)，还有上述的SGP-C及其它的类似的SGP基因在虾的机体内注入dsRNA可以抑制VIH的表达量。为此，从眼柄的cDNA基因文库获得SGP-C的总cDNA序列，重新克隆SGP-A、SGP-B、SGP-F的cDNA。

2.来源于眼柄的肽的dsRNA制备

与成虾同样地以VIH基因的质粒为底物，通过PCR扩增成熟VIH位点的基因片段，将其作为模板使用MEGAscript RNAi Kit试剂盒(一种体外转录及翻译试验药)制备VIH-dsRNA，并将其制备成GFP-dsRNA作为阴性对照。此外，与VIH-dsRNA同样地，为了合成以SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F基因的成熟位点作为靶的dsRNA，使用与T7启动子结合的基因特异性引物和T7启动子引物(参照表1)，以克隆的各质粒为模板通过PCR扩增基因片段，并将其作为模板利用与VIH-dsRNA相同的方法合成各基因的dsRNA。将所获得的GFP-dsRNA、VIH-dsRNA、SGP-C-dsRNA以浓度3μg/4μL溶解于TE缓冲液来使用。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNA三种以各dsRNA浓度成为1μg/4μL的方式混合，并用TE缓冲液溶解以使总dsRNA浓度达到3μg/4μL后使用。

3.dsRNA的投放

对随机挑选的雌亚成虾(体重15g至25g)个体，VIH-dsRNA以每单位体重(g)3μg的浓度只注射一次(VIH-1区)和间隔7天注射3次(VIH-2区)。SGP-C-dsRNA以每单位体重(g)3μg的浓度只注射一次(SGP-C区)。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNA同浓度混合，并以每单位体重(g)3μg的浓度只注射一次(Mix(混合)区)。作为阴性对照，GFP-dsRNA以每单位体重(g)3μg的浓度只注射一次(GFP区)。在最初注射后、10天、20天、30天进行采样，调查在眼柄的VIH表达量。

4.基因表达量的分析(总RNA提取、半定量PCR法、定量PCR法)

用与实施例1的3相同的方法进行基因表达量的分析。

5.结果

从眼柄的cDNA文库克隆的SGP-C基因编码115残基的氨基酸序列，其线性结构由信号肽(24残基)、CPRP(CHH precursor-related peptide：CHH前驱体相关肽；16残基)、成熟SGP-C(75残基)构成(图5)。此外，被认为是SGP-A、SGP-B、SGP-F的基因的cDNA也完成了克隆。各个cDNA与之前从眼柄提取的肽序列进行对比，虽然对于SGP-A，与成熟位点的推算氨基酸序列一致(图6)，但对于SGP-B(图7)和SGP-F(图8)，氨基酸的两个残基不同。这些cDNA在各自的dsRNA的合成中用作模板。在图2及图5至8中，用双下划线部表示dsRNA的制备中使用的dsRNA用的引物的序列。使用该引物制备了用于抑制各来源于眼柄的肽基因的表达的dsRNA。用序列号39表示图2的SGP-G用的dsRNA序列，用序列号37及38表示用于制备SGP-G用的dsRNA的dsRNA用引物的序列。用序列号33表示图5的SGP-C用的dsRNA序列，用序列号31及32表示用于制备SGP-C用的dsRNA的dsRNA用引物的序列。用序列号28表示图6的SGP-A用的dsRNA序列，用序列号27表示用于制备SGP-A用的dsRNA的dsRNA用引物的序列。用序列号30表示图7的SGP-B用的dsRNA序列，用序列号29表示用于制备SGP-B用的dsRNA的dsRNA用引物的序列。用序列号36表示图8的SGP-F用的dsRNA序列，用序列号34及35表示用于制备SGP-F用的dsRNA的dsRNA用引物的序列。

用定量PCR法分析基于dsRNA的注射的眼柄中的VIH基因表达，结果虽然相对于Initial区(未注射)，注射了GFP-dsRNA的GFP区中在10天、20天、30天时均没有发现VIH表达量有意地减少，但在注射了VIH-dsRNA的VIH-1区(1次)和VIH-2区(3次)中，注射后在10天、20天、30天时VIH的表达量有意地减少(图9)。类似地在注射了SGP-C基因的dsRNA的SGP-C区中，虽然注射后在10天时VIH表达量有意地减少，但在20天、30天时未确认相对于Initial区的VIH表达量的有意差。此外，在混合SGP-A、SGP-B、SGP-F基因的dsRNA后注射的Mix区中，虽然注射后在10天、30天时VIH表达量有意地减少，但在20天时未确认相对于Initial区的VIH表达量的有意差。

以上，在亚成体虾中也能够通过对VIH(SGP-G)使用dsRNA大幅度抑制VIH基因的表达量。此外，使用与VIH类似的其它基因也能够获得同样的效果。

产业利用的可能性

使用本发明的dsRNA能够有计划地、且有效地生产虾类。

序列表文本

序列号11至19、21至27、29、31、32、34、35、37、38引物

本说明书中引用的全部刊行物、专利以及专利申请通过直接引用而被纳入本说明书中。

序列表

<110> 国立研究开发法人国际农林水产业研究中心

<120> 解除有用虾类的卵成熟抑制的方法

<130> PH-7033-PCT

<150> JP 2016-214411

<151> 2016-11-01

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 364

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> CDS

<222> (12)..(356)

<400> 1

ttgcgtaaac t atg ctt gcc tac cgt act atg tgg tca gcg ata atg gcc 50

Met Leu Ala Tyr Arg Thr Met Trp Ser Ala Ile Met Ala

1 5 10

tct ttg ctg ctg ctg ctc gcg gcg tcg tcc gct gcc ccc gcc gac gcc 98

Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser Ala Ala Pro Ala Asp Ala

15 20 25

tta tcc gcc cct gcg gca ggc ctc acc aaa cgc tcg cta ttc gac cct 146

Leu Ser Ala Pro Ala Ala Gly Leu Thr Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro

30 35 40 45

tcc tgc agc ggc gtc ttc gac cgg cag ctc ttg cgg agg ctg cgt cga 194

Ser Cys Ser Gly Val Phe Asp Arg Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg

50 55 60

gtg tgt gat gac tgt ttc aac gta ttt agg gaa ccc aac gta gct att 242

Val Cys Asp Asp Cys Phe Asn Val Phe Arg Glu Pro Asn Val Ala Ile

65 70 75

gat tgc agg gag aac tgt tac aac aac gaa gtg ttc cgc cag tgc atg 290

Asp Cys Arg Glu Asn Cys Tyr Asn Asn Glu Val Phe Arg Gln Cys Met

80 85 90

gca tac gtc gtt ccc gca aac ctc cac gac gaa cac agg caa gcc gtg 338

Ala Tyr Val Val Pro Ala Asn Leu His Asp Glu His Arg Gln Ala Val

95 100 105

cag atg gtc ggc aag taa actacttc 364

Gln Met Val Gly Lys

110

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾

<400> 2

Met Leu Ala Tyr Arg Thr Met Trp Ser Ala Ile Met Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser Ala Ala Pro Ala Asp Ala Leu Ser Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Gly Leu Thr Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro Ser Cys Ser

35 40 45

Gly Val Phe Asp Arg Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg Val Cys Asp

50 55 60

Asp Cys Phe Asn Val Phe Arg Glu Pro Asn Val Ala Ile Asp Cys Arg

65 70 75 80

Glu Asn Cys Tyr Asn Asn Glu Val Phe Arg Gln Cys Met Ala Tyr Val

85 90 95

Val Pro Ala Asn Leu His Asp Glu His Arg Gln Ala Val Gln Met Val

100 105 110

Gly Lys

<210> 3

<211> 450

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> CDS

<222> (54)..(449)

<400> 3

gaagagcctc gaagtcgccg tctctcctcc cgattcgagt cgacgccgag gaa atg 56

Met

1

att ggg gtt cga ctg gtg cgt tca gct gtc ctg gta tcc ctg ctg cta 104

Ile Gly Val Arg Leu Val Arg Ser Ala Val Leu Val Ser Leu Leu Leu

5 10 15

gtg ttc ccg gcc tct gtc ctc gcc tct tgg gac gga aat gaa atc cct 152

Val Phe Pro Ala Ser Val Leu Ala Ser Trp Asp Gly Asn Glu Ile Pro

20 25 30

ccg tcc ctg cct tcc tcc tca gaa tcc tct cct gcg acc ccc ctc gcg 200

Pro Ser Leu Pro Ser Ser Ser Glu Ser Ser Pro Ala Thr Pro Leu Ala

35 40 45

gga gcc cag acc gca aac aag cgc agc ata tcc ttc gac tcg tgc acg 248

Gly Ala Gln Thr Ala Asn Lys Arg Ser Ile Ser Phe Asp Ser Cys Thr

50 55 60 65

ggc gtc tac gac cgc gaa ctc ctt gta agg ctc gac cgc gtg tgc gaa 296

Gly Val Tyr Asp Arg Glu Leu Leu Val Arg Leu Asp Arg Val Cys Glu

70 75 80

gac tgc tac aac ctg tac cgc gac acc gac gtg gcg gtc gaa tgc agg 344

Asp Cys Tyr Asn Leu Tyr Arg Asp Thr Asp Val Ala Val Glu Cys Arg

85 90 95

agc aac tgt ttc cac aac gag gta ttc ctg tac tgc gtc gac tac atg 392

Ser Asn Cys Phe His Asn Glu Val Phe Leu Tyr Cys Val Asp Tyr Met

100 105 110

tac cgg cct cgc caa agg aac cag tac cgg gcc gcc ctg cag agg ctc 440

Tyr Arg Pro Arg Gln Arg Asn Gln Tyr Arg Ala Ala Leu Gln Arg Leu

115 120 125

ggc aag tag g 450

Gly Lys

130

<210> 4

<211> 131

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾

<400> 4

Met Ile Gly Val Arg Leu Val Arg Ser Ala Val Leu Val Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Val Phe Pro Ala Ser Val Leu Ala Ser Trp Asp Gly Asn Glu Ile

20 25 30

Pro Pro Ser Leu Pro Ser Ser Ser Glu Ser Ser Pro Ala Thr Pro Leu

35 40 45

Ala Gly Ala Gln Thr Ala Asn Lys Arg Ser Ile Ser Phe Asp Ser Cys

50 55 60

Thr Gly Val Tyr Asp Arg Glu Leu Leu Val Arg Leu Asp Arg Val Cys

65 70 75 80

Glu Asp Cys Tyr Asn Leu Tyr Arg Asp Thr Asp Val Ala Val Glu Cys

85 90 95

Arg Ser Asn Cys Phe His Asn Glu Val Phe Leu Tyr Cys Val Asp Tyr

100 105 110

Met Tyr Arg Pro Arg Gln Arg Asn Gln Tyr Arg Ala Ala Leu Gln Arg

115 120 125

Leu Gly Lys

130

<210> 5

<211> 833

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> CDS

<222> (45)..(389)

<400> 5

agtgccttca ccacatctaa aagccgttgt gatttacacg agct atg act gcc ttc 56

Met Thr Ala Phe

1

cgt atg gta tgg tca atg ttg ttg gct tct tta ctg ctg ctg ctc gcg 104

Arg Met Val Trp Ser Met Leu Leu Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ala

5 10 15 20

gcg tcg tcc gct gcc ccc gcc gac gcc tta tcc gcc cct gcg gca ggc 152

Ala Ser Ser Ala Ala Pro Ala Asp Ala Leu Ser Ala Pro Ala Ala Gly

25 30 35

ctc acc aaa cgc tcg ctc ttc gac cct tcc tgc acc ggc gtc ttc gac 200

Leu Thr Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro Ser Cys Thr Gly Val Phe Asp

40 45 50

cgg cag ctc ttg cgg agg ctg cgt cga gtg tgt gac gac tgt ttc aac 248

Arg Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg Val Cys Asp Asp Cys Phe Asn

55 60 65

gta ttc agg gaa ccc aac gta tct act gaa tgc aga agt aac tgt tac 296

Val Phe Arg Glu Pro Asn Val Ser Thr Glu Cys Arg Ser Asn Cys Tyr

70 75 80

aac aat gaa gtg ttc cgc cag tgt atg gaa tac ctc ctc ccg cct cac 344

Asn Asn Glu Val Phe Arg Gln Cys Met Glu Tyr Leu Leu Pro Pro His

85 90 95 100

ctt cac gaa gag cac aga cta gct gtc cag atg gtc ggg aaa tag 389

Leu His Glu Glu His Arg Leu Ala Val Gln Met Val Gly Lys

105 110

atttacggtt aagacgctgc aacccacttc gctgacgaca ggaattcgat gatagtaaaa 449

ggcaccctaa ttccacttat tctacagcat agcactgagt cctcgatcgc tgtaacgaat 509

ggttttcaat gctgaagact tatactatga aatgaagctg acttccactc taagaaataa 569

gaatgaaagg gtgcagtttg ccattatatt gggactatca tgacacattt agttcggcca 629

ctgatcacag tatagaaaat atatatacac atgaacgcca tttatcagga aactggagaa 689

aaaatatcac tgaaagagat tgttcttagg actcgaggct ttaattaaca ttagaatagg 749

tatttgtgat gttttattat gtttaaattt acgaataaag cactggcatg ctaaaaaaaa 809

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 833

<210> 6

<211> 114

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾

<400> 6

Met Thr Ala Phe Arg Met Val Trp Ser Met Leu Leu Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser Ala Ala Pro Ala Asp Ala Leu Ser Ala

20 25 30

Pro Ala Ala Gly Leu Thr Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro Ser Cys Thr

35 40 45

Gly Val Phe Asp Arg Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg Val Cys Asp

50 55 60

Asp Cys Phe Asn Val Phe Arg Glu Pro Asn Val Ser Thr Glu Cys Arg

65 70 75 80

Ser Asn Cys Tyr Asn Asn Glu Val Phe Arg Gln Cys Met Glu Tyr Leu

85 90 95

Leu Pro Pro His Leu His Glu Glu His Arg Leu Ala Val Gln Met Val

100 105 110

Gly Lys

<210> 7

<211> 404

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> CDS

<222> (49)..(402)

<400> 7

gaaaggacct cgttgcaatt gagtatttcg agtttcgcgt catttaca atg gta ctt 57

Met Val Leu

1

caa tac atg ctg tct gcg gcc ctg ctg gtg ctc gcc gcc tcg tcc tcg 105

Gln Tyr Met Leu Ser Ala Ala Leu Leu Val Leu Ala Ala Ser Ser Ser

5 10 15

ccc gcc gcc gcc cgc tcc ctc gac gcg gcg cct tcg tct gcg tcc tca 153

Pro Ala Ala Ala Arg Ser Leu Asp Ala Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ser

20 25 30 35

gga agc cac agc ctc agc aag cgc tcc ctc ttc gac ccg gcg tgc acc 201

Gly Ser His Ser Leu Ser Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro Ala Cys Thr

40 45 50

ggc atc tac gac cgg cag ctg ctg ggc aag ctg ggg cgc ctg tgc gac 249

Gly Ile Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Gly Lys Leu Gly Arg Leu Cys Asp

55 60 65

gac tgc tac aac gtg ttc cgg gag ccc aag gtg gcc acg gga tgc agg 297

Asp Cys Tyr Asn Val Phe Arg Glu Pro Lys Val Ala Thr Gly Cys Arg

70 75 80

agt aac tgc tac tac aac ctc atc ttc ctc gac tgc ctc gag tac ctg 345

Ser Asn Cys Tyr Tyr Asn Leu Ile Phe Leu Asp Cys Leu Glu Tyr Leu

85 90 95

atc ccg agc cac ctt cag gag gag cac atg tcg gcc ctg cag acc gtc 393

Ile Pro Ser His Leu Gln Glu Glu His Met Ser Ala Leu Gln Thr Val

100 105 110 115

ggc aaa taa ag 404

Gly Lys

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾

<400> 8

Met Val Leu Gln Tyr Met Leu Ser Ala Ala Leu Leu Val Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Pro Ala Ala Ala Arg Ser Leu Asp Ala Ala Pro Ser Ser

20 25 30

Ala Ser Ser Gly Ser His Ser Leu Ser Lys Arg Ser Leu Phe Asp Pro

35 40 45

Ala Cys Thr Gly Ile Tyr Asp Arg Gln Leu Leu Gly Lys Leu Gly Arg

50 55 60

Leu Cys Asp Asp Cys Tyr Asn Val Phe Arg Glu Pro Lys Val Ala Thr

65 70 75 80

Gly Cys Arg Ser Asn Cys Tyr Tyr Asn Leu Ile Phe Leu Asp Cys Leu

85 90 95

Glu Tyr Leu Ile Pro Ser His Leu Gln Glu Glu His Met Ser Ala Leu

100 105 110

Gln Thr Val Gly Lys

115

<210> 9

<211> 587

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> CDS

<222> (60)..(416)

<400> 9

ggtcgcagtc acagtcgcca gctgctcata ctctgaactc ttgacacaga ctgctcgcc 59

atg aca gcc ttt cgc ttg atg gcc gtg gcc ctg gtg gtg gtc gtg gcg 107

Met Thr Ala Phe Arg Leu Met Ala Val Ala Leu Val Val Val Val Ala

1 5 10 15

tgc tcg acg acc tgg gct cgc tcc gcc gag ggg tcg tcg tcc ccc gtg 155

Cys Ser Thr Thr Trp Ala Arg Ser Ala Glu Gly Ser Ser Ser Pro Val

20 25 30

gcc tcc ctc atc agg ggc cgc agc ctc agc aag cga gca aac ttc gac 203

Ala Ser Leu Ile Arg Gly Arg Ser Leu Ser Lys Arg Ala Asn Phe Asp

35 40 45

cct tcc tgc acg ggc gtc tac gac cgg gag ctc ctg ggg agg ctg agc 251

Pro Ser Cys Thr Gly Val Tyr Asp Arg Glu Leu Leu Gly Arg Leu Ser

50 55 60

cgc ctc tgc gac gac tgc tac aac gtg ttt cgc gag ccc aag gtg gcc 299

Arg Leu Cys Asp Asp Cys Tyr Asn Val Phe Arg Glu Pro Lys Val Ala

65 70 75 80

acg gag tgc agg agc aac tgc ttc tac aac ccc gtg ttc gtc cag tgc 347

Thr Glu Cys Arg Ser Asn Cys Phe Tyr Asn Pro Val Phe Val Gln Cys

85 90 95

ctg gag tac ctg att ccg gcc gac ctg cac gag gag tac caa gcc ctc 395

Leu Glu Tyr Leu Ile Pro Ala Asp Leu His Glu Glu Tyr Gln Ala Leu

100 105 110

gtg cag acg gtg ggc aag tag gctcgctcga cctgccacgg cctcgcctcg 446

Val Gln Thr Val Gly Lys

115

cgcactcacg ccaacggccg gaagacacag agaggatttc aggatttgtt tctggctaac 506

tggtgtattt catcgaccct gctcggattt tgatatgatt tctcatgtcc taaattgtga 566

tgaatctcta aatgaagtgt g 587

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 凡纳滨对虾

<400> 10

Met Thr Ala Phe Arg Leu Met Ala Val Ala Leu Val Val Val Val Ala

1 5 10 15

Cys Ser Thr Thr Trp Ala Arg Ser Ala Glu Gly Ser Ser Ser Pro Val

20 25 30

Ala Ser Leu Ile Arg Gly Arg Ser Leu Ser Lys Arg Ala Asn Phe Asp

35 40 45

Pro Ser Cys Thr Gly Val Tyr Asp Arg Glu Leu Leu Gly Arg Leu Ser

50 55 60

Arg Leu Cys Asp Asp Cys Tyr Asn Val Phe Arg Glu Pro Lys Val Ala

65 70 75 80

Thr Glu Cys Arg Ser Asn Cys Phe Tyr Asn Pro Val Phe Val Gln Cys

85 90 95

Leu Glu Tyr Leu Ile Pro Ala Asp Leu His Glu Glu Tyr Gln Ala Leu

100 105 110

Val Gln Thr Val Gly Lys

115

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 11

taatacgact cactataggg agagcatcga cttcaaggag gac 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 12

taatacgact cactataggg agatgggtgc tcaggtagtg gtt 43

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 13

taatacgact cactataggg agaaagcgag caaacttcga c 41

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 14

taatacgact cactataggg agactacttg cccaccgtct g 41

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 15

taatacgact cactataggg agactcgctc ttcgaccctt cc 42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 16

taatacgact cactataggg agactatttc ccgaccatct gg 42

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 17

taatacgact cactataggg agacgcagca tatccttcga ctcgt 45

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

taatacgact cactataggg agaaagcgct ccctcttcga cc 42

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

taatacgact cactataggg agactttatt tgccgacggt ctgcagg 47

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 20

taatacgact cactataggg 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 21

cggagtgcag gagcaactg 19

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 22

cctctctgtg tcttctggcc gttgg 25

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 23

cgacctcaca gactacctga tgaagat 27

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 24

gtggtcatct cctgctcgaa g 21

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 25

tctacaaccc cgtgttcgtc cagtgc 26

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 26

cgaccaccgc cgagcgagaa atcgttcgt 29

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 27

ctcgctattc gacccttcc 19

<210> 28

<211> 234

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<400> 28

ctcgctattc gacccttcct gcagcggcgt cttcgaccgg cagctcttgc ggaggctgcg 60

tcgagtgtgt gatgactgtt tcaacgtatt tagggaaccc aacgtagcta ttgattgcag 120

ggagaactgt tacaacaacg aagtgttccg ccagtgcatg gcatacgtcg ttcccgcaaa 180

cctccacgac gaacacaggc aagccgtgca gatggtcggc aagtaaacta cttc 234

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 29

cgcagcatat ccttcgactc gt 22

<210> 30

<211> 229

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<400> 30

cgcagcatat ccttcgactc gtgcacgggc gtctacgacc gcgaactcct tgtaaggctc 60

gaccgcgtgt gcgaagactg ctacaacctg taccgcgaca ccgacgtggc ggtcgaatgc 120

aggagcaact gtttccacaa cgaggtattc ctgtactgcg tcgactacat gtaccggcct 180

cgccaaagga accagtaccg ggccgccctg cagaggctcg gcaagtagg 229

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 31

ctcgctcttc gacccttcct 20

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 32

ccagatggtc gggaaatag 19

<210> 33

<211> 226

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<400> 33

ctcgctcttc gacccttcct gcaccggcgt cttcgaccgg cagctcttgc ggaggctgcg 60

tcgagtgtgt gacgactgtt tcaacgtatt cagggaaccc aacgtatcta ctgaatgcag 120

aagtaactgt tacaacaatg aagtgttccg ccagtgtatg gaatacctcc tcccgcctca 180

ccttcacgaa gagcacagac tagctgtcca gatggtcggg aaatag 226

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 34

aagcgctccc tcttcgacc 19

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 35

cctgcagacc gtcggcaaat aaag 24

<210> 36

<211> 233

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<400> 36

aagcgctccc tcttcgaccc ggcgtgcacc ggcatctacg accggcagct gctgggcaag 60

ctggggcgcc tgtgcgacga ctgctacaac gtgttccggg agcccaaggt ggccacggga 120

tgcaggagta actgctacta caacctcatc ttcctcgact gcctcgagta cctgatcccg 180

agccaccttc aggaggagca catgtcggcc ctgcagaccg tcggcaaata aag 233

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 37

aagcgagcaa acttcgac 18

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 38

cagacggtgg gcaagtag 18

<210> 39

<211> 231

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<400> 39

aagcgagcaa acttcgaccc ttcctgcacg ggcgtctacg accgggagct cctggggagg 60

ctgagccgcc tctgcgacga ctgctacaac gtgtttcgcg agcccaaggt ggccacggag 120

tgcaggagca actgcttcta caaccccgtg ttcgtccagt gcctggagta cctgattccg 180

gccgacctgc acgaggagta ccaagccctc gtgcagacgg tgggcaagta g 231

Claims

1.一种解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

使用以养殖虾类的卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶的双链RNA(dsRNA)，通过RNA干涉法，抑制虾类的卵黄生成抑制激素基因的表达。

2.根据权利要求1所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

所述养殖虾类是属于对虾科的虾类。

3.根据权利要求2所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

所述养殖虾类是凡纳滨对虾或日本对虾的成虾或亚成虾。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

以卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶的双链RNA(dsRNA)是如下的正义链以及包含与所述正义链的碱基序列互补的碱基序列的反义链互补结合的双链RNA(dsRNA)，所述正义链相对于卵黄生成抑制激素(VIH)基因的碱基序列的一部分具有相同的碱基序列并且能够与该基因进行杂交。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

所述卵黄生成抑制激素基因是来源于凡纳滨对虾的眼柄的肽的、选自于由SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F以及SGP-G组成的组中的一种或多种基因。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的方法，其特征在于，

使用选自于由如下双链RNA(dsRNA)组成的组中的双链RNA(dsRNA)的一种或多种：正义链用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)；以及正义链用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)。

7.一种解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其特征在于，

包含如下的双链RNA(dsRNA)，从而抑制虾类的卵黄生成抑制激素基因的表达，所述双链RNA(dsRNA)以卵黄生成抑制激素(VIH)基因的mRNA为靶，并且是如下的正义链以及包含与所述正义链的碱基序列互补的碱基序列的反义链互补结合的双链RNA(dsRNA)，所述正义链相对于卵黄生成抑制激素(VIH)基因的碱基序列的一部分具有相同的碱基序列，并且能够与该基因进行杂交。

8.根据权利要求7所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其特征在于，

所述养殖虾类是属于对虾科的虾类。

9.根据权利要求8所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其特征在于，

所述养殖虾类是凡纳滨对虾或日本对虾的成虾或亚成虾。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其特征在于，

11.根据权利要求7至10中任一项所述的解除养殖虾类的卵成熟抑制的组合物，其特征在于，

包含选自于由如下双链RNA(dsRNA)组成的组中的双链RNA(dsRNA)的一种或多种：正义链用序列号28表示的碱基序列组成的以SGP-A基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号30表示的碱基序列组成的以SGP-B基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号33表示的碱基序列组成的以SGP-C基因为靶的双链RNA(dsRNA)；正义链用序列号36表示的碱基序列组成的以SGP-F基因为靶的双链RNA(dsRNA)；以及正义链用序列号39表示的碱基序列组成的以SGP-G基因为靶的双链RNA(dsRNA)。