CN110760545B - 基于miRNA的虾蟹卵巢发育促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于microRNA(以下简称miRNA)的促进虾蟹卵巢发育的方法，其特征在于，在眼柄中注射可特异性结合拟穴青蟹眼柄vih的miRNA，从而抑制vih的表达，促进虾蟹卵巢发育。可特异性结合拟穴青蟹眼柄vih的miRNA序列为GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG。通过体外实验证实其可以有效降低拟穴青蟹vih mRNA的表达，进一步地，在体实验也证实在眼柄中注射该miRNA可抑制拟穴青蟹眼柄vihmRNA的表达。由于miRNA作用的特异性，使其较剪除眼柄的方法的副作用小；由于miRNA的分子量小于抗体，其在眼柄中扩散能力较强，效率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于miRNA的虾蟹卵巢发育促进剂。
背景技术
十足目甲壳动物如虾、蟹的性腺发育是由其眼柄分泌的性腺抑制激素（GIH 或VIH）负调控的。因此，抑制其性腺抑制激素的分泌是促进虾、蟹性腺发育的有效手段。最早是通过剪除虾、蟹眼柄的方法来促进虾、蟹的性腺特别是卵巢的发育。但因虾、蟹眼柄分泌的激素除VIH外还有其它激素，因此该法有比较大的负作用如较高的死亡率，较差的卵子质量等。有人尝试了用在眼柄中注射VIH的抗体以抑制VIH的方法来促进虾、蟹的性腺发育。但该法的效率较低，与抗体在眼柄中的扩散能力较低有关，且价格较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一个特异性较强，作用效率较高的基于miRNA的虾蟹卵巢发育促进剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于microRNA (以下简称miRNA)的促进虾蟹卵巢发育的方法，其特征在于，在眼柄中注射可特异性结合拟穴青蟹眼柄vih的miRNA，从而抑制vih的表达，促进虾蟹卵巢发育。
1.通过生物信息学分析拟穴青蟹眼柄的miRNA组，我们发现了一个可特异性地结合拟穴青蟹眼vih的miRNA，即miRNA-277（以下简称mir-277,其序列为：GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG）。
2.通过将人工合成的miR-277 mimics （序列为：GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG）与miR-277mimics NC（序列为：AGGUUGCUUGACGUUGGGGGAGAUU）以及 miR-277 inhibitor（序列为：CUUCACCAGACACGCACUCCAUAAC） 与 miR-277 inhibitor NC （序列为：AAUCUCCCCCAACGUCAAGCAACCU）经过细胞转染进入 HEK293T 细胞，对荧光素酶活性分析发现，miR-277 mimics 与对照组 miR-277 mimics NC 活性相比显著降低，miR-277inhibitor 与对照组 miR-277 inhibitor NC 活性相比显著升高；结果初步验证 miR-277对 vih 有抑制作用。
3.将化学合成的 miR-277 agomir（序列为：GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG） 与miR-277 antagomir（AAUCUCCCCCAACGUCAAGCAACCU） 注射入拟穴青蟹眼柄基部，检测眼柄中 vih 与 miR-277的相对表达量，结果表明：注射 miR-277 agomir 后眼柄中的miR-277表达量显著升高，而vih的表达量显著降低；注射 miR-277 antagomir 后眼柄中的miR-277表达量显著降低，vih的表达量却显著升高。进一步验证了 miR-277对 vih 的抑制作用。
本发明的优点在于：本发明所建立的基于miRNA的方法，由于miRNA作用的特异性，使其较剪除眼柄的方法的副作用较小；由于miRNA的分子量小于抗体，其在眼柄中扩散能力较强，效率会比较高。
附图说明
图1为miR-277与拟穴青蟹vih的3’-UTR作用的预测结果图；
图2为miR-277 mimics NC与vih的3’-UTR预测结果图；
图3为miR-277 mimics/ mimics NC与pRR-vih-3’-UTR共转染后双荧光素酶报告基因活性结果（p<0.05）；
图4为miR-277 inhibitor/ inhibitor NC与pRR-vih-3’-UTR共转染后双荧光素酶报告基因活性结果（p<0.05）；
图5为注射miR-277 agomir和miR-277 antagomir后卵巢中卵黄蛋白原vtg基因的相对表达量（p<0.05）；
图6为注射miR-277 agomir和miR-277 antagomir后肝胰腺中vtg基因的相对表达量（p<0.05）。
具体实施方式
实施例1
在进行体外实验时，分别将人工合成的miR-277 mimics（序列为：GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG） / miR-277 mimics NC（序列为：AGGUUGCUUGACGUUGGGGGAGAUU）以及miR-277 inhibitor（序列为：CUUCACCAGACACGCACUCCAUAAC） / miR-277 inhibitor NC（序列为：AAUCUCCCCCAACGUCAAGCAACCU）代替内参质粒与目的质粒pRR-vih-3’-UTR（Zhou M, Jia X,Wan H, et al. miR‐34 regulates reproduction by inhibiting the expression ofMIH, CHH, EcR, and FAMeT genes in mud crab Scylla paramamosain [J]. Molecularreproduction and development, 2019, 86(2): 122-131.）进行共转染，实验采用的脂质体转染试剂为Lipofectamine 2000；目的质粒和内参质粒的比例为3:1；转染试剂和质粒的比例为2.1:1。经过细胞转染进入 HEK293T 细胞后，收集贴壁的细胞并加入细胞裂解液低速离心，取上清液，进行酶活性的测定，向上清液中先加入Luciferase Assay ReagentⅡ（LARII）试剂，记录萤火虫荧光素酶活性值；然后再加入Stop&Glo试剂，随之记录海肾荧光素酶的活性值（两种试剂均避光），前者与后者活性值的比值即为质粒双荧光素酶报告基因的相对活性。通过比较目的质粒分别与miR-277 mimics / miR-277 mimics NC以及miR-277 inhibitor / miR-277 inhibitor NC的荧光素酶报告基因的相对活性分析发现，miR-277 mimics 与对照组 miR-277 mimics NC 活性相比显著降低（图3），miR-277 inhibitor与对照组 miR-277 inhibitor NC 活性相比显著升高（图4）；结果初步验证 miR-277 对vih 有抑制作用。
所述pRR-vih-3’-UTR是以pmir‐RB‐REPORTTM（广州市锐博生物科技）为质粒骨架，利用VIH-F/R从拟穴青蟹基因组中扩增出vih-3’-UTR基因，连接至pmir‐RB‐REPORTTM载体上，获得pRR-vih-3’-UTR目的质粒；
VIH-F：5’-CCGCTCGAG GGCACTGAACCTCATTAAACCTTTC-3’；
VIH-R：5’-GAATGCGGCCGC ATTTATCGTTTGATGACTGT-3’。
实施例2
在进行在体实验时，将化学合成的 miR-277 agomir （序列为：GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG）与 miR-277 antagomir （AAUCUCCCCCAACGUCAAGCAACCU）注射入拟穴青蟹眼柄基部，检测眼柄中 vih 与 miR-277的相对表达量，根据LightCycler480实时荧光定量PCR仪显示出的每个样品的Cp值，计算待测基因的相对表达量（RQ）值，RQ使用比较阈值循环法（ΔΔCT）（ΔCT=目标基因的CT-内参基因的CT，ΔΔCT=ΔCT-校准物样品）来计算所有这些基因的相对表达水平，并用SPSS20.0统计学软件对数据进行单因素方差统计学分析，采用t检验确定各数据处理间的平均值差异，以p<0.05为差异显著。结果表明：注射 miR-277 agomir 后眼柄中的miR-277表达量显著升高，而vih的表达量显著降低；注射 miR-277 antagomir 后眼柄中的miR-277表达量显著降低，vih的表达量却显著升高。进一步验证了 miR-277对 vih 的抑制作用。
在 miR-277 agomir 与 miR-277 antagomir 注射入拟穴青蟹眼柄基部的基础上，检测卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原 vtg 的相对表达量，结果表明：注射 miR-277 agomir后 vtg在卵巢和肝胰腺中的表达量均显著升高，而注射 miR-277 antagomir 后 vtg 在卵巢和肝胰腺中的表达量均显著降低（图5、图6）。说明miR-277可以作为拟穴青蟹卵巢发育促进剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学，集美大学
<120> 基于miRNA的虾蟹卵巢发育促进剂
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
guuauggagu gcgugucugg ugaag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agguugcuug acguuggggg agauu 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cuucaccaga cacgcacucc auaac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaucuccccc aacgucaagc aaccu 25
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctcgagg gcactgaacc tcattaaacc tttc 34
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaatgcggcc gcatttatcg tttgatgact gt 32
Claims (1)
1.一种特异性结合拟穴青蟹眼柄vih的miRNA在制备促进虾蟹卵巢发育制剂中的应用，所述miRNA为miR-277，其序列为GUUAUGGAGUGCGUGUCUGGUGAAG；
所述制剂为用于拟穴青蟹眼柄注射用制剂。
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| 拟穴青蟹 miR-34/miR277/miR279 的表达特征及其对眼柄重要基因的调控;梁萌萌;《cnki中国优秀硕士论文数据库》;20170503;第4,5，24，32页，第38页第2段，第40页图4.1，第1.6.1，3.1.1，3.3.1节 * |
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