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WO2005010185A1 - Klf5遺伝子の発現を抑制するrna - Google Patents

Klf5遺伝子の発現を抑制するrna Download PDF

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Publication number
WO2005010185A1
WO2005010185A1 PCT/JP2004/011223 JP2004011223W WO2005010185A1 WO 2005010185 A1 WO2005010185 A1 WO 2005010185A1 JP 2004011223 W JP2004011223 W JP 2004011223W WO 2005010185 A1 WO2005010185 A1 WO 2005010185A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
klf5
sequence
sirna
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/011223
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ryozo Nagai
Ichiro Manabe
Atsushi Ishihara
Tsuneaki Tottori
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to EP04771250A priority Critical patent/EP1652917A4/en
Priority to US10/565,997 priority patent/US20070275917A1/en
Priority to JP2005512128A priority patent/JPWO2005010185A1/ja
Publication of WO2005010185A1 publication Critical patent/WO2005010185A1/ja

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to RNA that suppresses the expression of KLF5 gene.
  • Kruppel-like factor (Kppel-like factor, abbreviated as Byeon KLF) Family 1 is a family of transcription factors characterized by the C-terminal zinc finger motif, KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11 ⁇ KLF12, KLF13, Bandit 4, KLF15, KLF16 and the like are known.
  • the KLF family is important for various tissues and cells, such as red blood cells, vascular endothelial cells, smooth muscle, skin, lymphocytes, etc., and cancer, cardiovascular disease, cirrhosis, and kidney disease. It has been reported that it plays an important role in the pathogenesis of various diseases such as immune diseases (J. Biol. Chem., 276, 34355-34358, 2001; Genome Biol., 4, 206, 2003).
  • KLF5 of the KLF family is also called BTEB2 (basic transcriptional element binding protein 2) or IKLF (intestinal-enriched Kruppel-like factor).
  • KLF5 expression in vascular smooth muscle is developmentally regulated, with high expression in fetal vascular smooth muscle, but absent in normal adult vascular smooth muscle.
  • high expression of KLF5 is observed in the intima smooth muscle newly born after balloon catheter ablation, and KLF5 expression is also observed in the smooth muscle of arteriosclerotic and restenotic lesions (Circulation, 10> 2528). -2534, 2000).
  • Vascular smooth muscle at lesion sites such as atherosclerotic lesions and restenosis sites after percutaneous coronary angioplasty is activated, showing muscle filament loss, increased protein synthesis, proliferative and migratory activities, and It is transformed to the same trait (fetal type) as vascular smooth muscle.
  • myosin heavy chain SM1, SM2, and SMemb
  • SM1 myosin heavy chain
  • SM2 disappears during fetal transformation and SMemb expression is induced.
  • KLF5 binds to the transcription control sequence of SMemb gene and activates its transcription (see Non-Patent Document 4).
  • PDGF-A platelet-derived growth factor A chain
  • TGF transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • the KLF5 gene is a transcription factor not only involved in smooth muscle transformation but also widely involved in cardiovascular pathogenesis, and its gene expression level is extremely important for its functional expression. It is. Since KLF5 is involved in the pathogenesis of cardiovascular diseases such as arteriosclerosis and cardiac hypertrophy, and diseases involving angiogenesis such as cancer, treatment of these diseases by suppressing the expression of KLF5 gene Alternatively, it is expected that the drug may be useful for prevention. However, at present, no drug that effectively suppresses the expression of the KLF family gene is known, whereas RNA interference (hereinafter referred to as RNAi) is the same as the target gene in C. elegans. It was reported that the expression of the target gene was specifically suppressed by introducing double-stranded RNA having a sequence (Nature, 391, 806-811, 1998).
  • RNAi short interfering RNA (siRNA) (W01 / 75164).
  • RNAi In RNAi, it has been reported that double-stranded RNA significantly suppresses the expression of target genes as compared with single-stranded antisense RNA (Nature, 391> 806-811, 1998; Mol. Cell, 10 , 549-561, 2002). In addition, it has been reported that single-stranded RNA that forms a hairpin structure due to intramolecular hybridization, instead of double-stranded RNA, exhibits RNAi similarly to siRNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99> 6047-6052, 2002). -RNAi has been validated not only in vitro but also in in vivo tests.
  • siRNAs of 50 bp or less in fetal animals TO 02/132788) and the effect in adult mice (W03 / 132788) 10180
  • siRNA intravenously administered to a mouse fetus
  • its expression-suppressing effect has been confirmed in kidney, spleen, lung, renal and liver organs (Nat. Genet. 32, 107-108, 2002).
  • it has been reported that it works by directly administering siRNA to brain cells. ('Nat. Biotechnol., 0, 1006-1010, 2002)
  • An object of the present invention is to find A that suppresses the expression of the KLF5 gene.
  • Such RNAs inhibit the function of KLF5 as a transcription factor by suppressing the expression of the KLF5 gene. It can be used as a therapeutic or prophylactic agent with few side effects for diseases in which KLF5 is involved in the formation of pathological conditions such as cardiovascular diseases and cancer.
  • RNA that suppresses the expression of the KLF5 gene including a sequence of 15 to 30 consecutive nucleotides of KLF5A and a sequence complementary to the sequence.
  • the RNA is composed of 1 to 6 nucleotides at the 3 'end of each strand of a double-stranded RNA consisting of a continuous strand of 15 to 30 bases of KLF5 mRNA and a strand of a sequence complementary to the sequence.
  • the RNA is composed of an RNA consisting of a continuous sequence of 15 to 30 nucleotides of KLF5 mRNA and an RNA consisting of a sequence complementary to the sequence, which are connected by a spacer oligonucleotide, and 1 to 6 at the 3 ′ end.
  • RNA that forms a hairpin structure with the addition of nucleotides
  • RNA that suppresses the expression of the KLF5 gene selected from the group consisting of the following (a ') to (c).
  • RNA consisting of any one of SEQ ID NOs: 2 to 16 and an RNA consisting of a sequence complementary to the sequence are connected with two RNAs having a peridylic acid at the 5 ′ end, and 3 'At the end
  • RNA that forms a hairpin structure with the addition of 2 to 4 peridylates.
  • a method for suppressing the expression of the KLF5 gene in a cell by introducing the RNA according to any one of (1) to (5) or the vector according to (6) into the cell.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient the RNA according to any one of (1) to (5) or the vector according to (6).
  • a pharmaceutical composition for inhibiting angiogenesis comprising, as an active ingredient, the RNA according to any one of (1) to (5) or the vector according to (6).
  • a therapeutic or prophylactic agent for cardiovascular disease or cancer comprising as an active ingredient the A according to any one of (1) to (5) or the vector according to (6).
  • RNA that expresses the RNA or A is an active ingredient of a therapeutic or prophylactic agent for atherosclerosis, restenosis after coronary artery disease, cardiovascular disease of cardiac hypertrophy, or cancer. Can be used as
  • the RNA of the present invention comprises a sequence of 15 to 30 bases, preferably 17 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases of KLF5 mRNA (hereinafter referred to as “Robot sequence X”) and a sequence complementary to the sequence ( (Hereinafter referred to as the complementary sequence X '), and suppresses the expression of the KLF5 gene.
  • Robot sequence X KLF5 mRNA
  • complementary sequence X ' a sequence complementary to the sequence
  • the RNA include (a) 1 to 6 at the 3 ′ end of each strand of a double-stranded RNA consisting of a strand of sequence X (sense strand) and a strand of complementary sequence X ′ (antisense strand).
  • RNA having such a structure is referred to as siA
  • siA which suppresses the expression of the KLF5 gene.
  • B Sequence X And the RNA consisting of the complementary sequence X 'are connected by a spacer oligonucleotide to form a hairpin structure having 1 to 6, preferably 2 to 4 nucleotides added to the 3' end.
  • shRNA which is an RNA that suppresses the expression of the KLF5 gene.
  • the nucleotide base to be added to these RNAs may be guanine, adenine, cytosine, thymine, or peracil, and may be RNA or DNA, but preferably peridylic acid (U) or deoxythymidylic acid (dT).
  • the oligonucleotide of the spacer is preferably RNA of 6 to 12 bases, and the sequence at the 5 ′ end thereof is preferably 2 U.
  • an RNA consisting of the sequence of UUCAAGAGA can be mentioned.
  • the order of the two RNAs connected by the spacer oligonucleotide may be either 5 ′.
  • the sequence X may be any sequence as long as it is a sequence of 15 to 30 bases, preferably 17 to 25 bases, more preferably 19 to 23 bases of KLF5 mRNA, but is described in the following (1).
  • the sequence of 19 bases designed by the above method is most preferable.
  • RNA having the above structure that suppresses the expression of the KLF5 gene is included in the RNA of the present invention.
  • the RNA of the present invention can be obtained by introducing the RNA having the above structure into cells expressing the KLF5 gene, measuring the expression of the KLF5 gene, and selecting an RM that suppresses the expression of the KLF5 gene.
  • the sequence is preferably a sequence within the coding region and a sequence that is at least 75 bases downstream from the start codon.
  • Information on the nucleotide sequence of KLF5 cDNA can be obtained from a nucleotide sequence database such as GenBank.
  • GenBank accession number accession number
  • NMJ09769 (SEQ ID NO: 49) and human KLF5 cDNA is GenBank accession number AF287272 (SEQ ID NO: 50), and the sequence information can be obtained.
  • RNA can be prepared as follows. In the following, the case of two U or dT is described as an oligonucleotide to be added, but the case of other nucleotides can be similarly prepared.
  • RNA consisting of a sequence with two U or dT added to the 3 'end of sequence X and RNA consisting of a sequence with two U or dT added to the 3' end of complementary sequence X ' Prepare. These two RNAs can be prepared by chemical synthesis or in vitro transcription. Chemical synthesis can be performed using a DNA synthesizer. It is also possible to request chemical synthesis from manufacturers such as Ambion, Nippon Bioservices Co., Ltd. and QIAGEN.
  • a double-stranded RNA can be prepared by adding two U or dT to the RNA. The cleaning can be performed by heating the two RNAs in an appropriate buffer at 90 to 95 ° C for 1 to 5 minutes, and then cooling to room temperature over 45 to 60 minutes.
  • RNA by in vitro transcription can be performed as follows. First, (i) DNA (T7 primer 1) having the promoter sequence of T7 RNA polymerase, (ii) U of complementary sequence X 'is changed to T, and two A's are added at the 5' end. A DNA having a sequence complementary to the 8 bases at the 3 'end of the T7 primer at the 3' end, (ii i) changing U of sequence X to T, and adding 2 at the 5 'end DNA having a sequence in which a sequence complementary to 8 bases at the 3 ′ end of the T7 primer has been added at the 3 ′ end.
  • the DNA After annealing the T7 primer and the DNA of (ii), the DNA is converted into double-stranded DNA by MA polymerase reaction. Using the obtained double-stranded DNA as type III, two U's are added to the 3 'end of sequence X and a leader is RNA having a sequence to which a sequence has been added can be synthesized. Similarly, by performing the same reaction using the T7 primer and the DNA of (iii), two U's are added to the 3 'end of the complementary sequence X', and a leader sequence is added to 5 '. Can be synthesized.
  • RNAs containing sequences complementary to each other are annealed. Thereafter, the type II double-stranded DNA and the leader sequence at the 5 ′ side of each RNA strand are decomposed and removed by deoxyribonuclease and ribonuclease specific to single-stranded RNA. The two Us at the 3 'end of each RNA strand remain attached without undergoing degradation.
  • the above reaction can be performed using a kit such as a silencer-siRNA preparation kit (Silencer siRNA Construction Kit, manufactured by Ambion).
  • DNA to be annealed with T7 primer can be chemically synthesized using a DNA synthesizer. It is also possible to request chemical synthesis from manufacturers such as Ambion, Japan Bioservices, Hokkaido System Science, and Qiagen.
  • RNA comprising the sequence X and the RNA comprising the complementary sequence X ′ are connected by a spacer oligonucleotide to form a hairpin structure having 1 to 6, preferably 2 to 4 nucleotides added to the 3 ′ end.
  • the RNA to be formed can be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer. Also, by introducing the siRNA expression vector described later in Section 2 into cells, shRNA is synthesized in the cells. This shRNA is converted into siRNA inside the cell.
  • the siRM or shRM prepared in (2) is introduced into a cell line expressing the KLF5 gene.
  • a cell line use a cell of the same animal species as the KLF5 cDNA used for designing the sequence X in (1).
  • Cell lines expressing the KLF5 gene include cell lines derived from smooth muscle, fibroblasts or vascular endothelial cells, such as mouse embryonic fibroblast cell line C3IV10T1 / 2 (ATCC No .: CCL-226), human umbilical cord vascular endothelium Cells and the like.
  • RNA is introduced into animal cells using transfection reagents such as Polyfect Transfection Reagent (Qiagen), TransMessenger Transfection Reagent, and Oligofectamine Reagent (Impitro). These reagents are mixed with RNA using Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen), etc. to form a complex, and then added to cells. Can be.
  • the expression of the KLF5 gene in cells into which the RNA of the present invention or the siRNA expression vector described in 2. has been introduced can be analyzed by RT-PCR.
  • Total RNA is prepared from cells into which RNA or siRNA expression vectors have been introduced and cells into which it has not been introduced, and cDNA is synthesized from this RNA.
  • the KLF5 gene expression level was determined by converting the synthesized cDNA into type I, performing PCR using primers specific to the KLF5 gene, and quantifying the amount of amplification product derived from the KLF5 cDNA by agarose gel electrophoresis. Can be measured.
  • the thus selected RNA that suppresses the expression of the KLF5 gene includes that of a double-stranded RNA consisting of a strand of any one of SEQ ID NOS: 2 to 11 and a strand complementary to the sequence.
  • a double-stranded RNA in which two perilidylic acids have been added to the 3 'end of its strand.
  • the RNA is designed based on the sequence of mouse cDNA and suppresses the expression of mouse KLF5 gene.
  • the sequences of SEQ ID NOs: 4, 8 and 10 are sequences common to mouse and human KLF5 mRNAs, respectively, so that the strands of any one of SEQ ID NOs: 4, 8 and 10 are used.
  • the double-stranded RNA having two peridylates added to the 3 'end of each strand of a double-stranded RNA consisting of a strand having a sequence complementary to this sequence is not only a mouse KLF5 gene but also a human KLF5. It also suppresses gene expression.
  • a double-stranded RNA comprising a strand of any one of SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 9 and 11 based on the sequence of mouse KLF5 cDNA and a strand of a sequence complementary to the sequence.
  • Double-stranded RNA with two peridylic acids added to the 3 'end of the 3'-chain suppresses the expression of the mouse KLF5 gene.
  • any of SEQ ID NOS: 12 to 16 which is the corresponding sequence in human KLF5 cDNA
  • a double-stranded RNA consisting of one sequence and a sequence complementary to the sequence has two perilidylic acids added to the 3 'end of each strand. Is considered to be suppressed.
  • RNA By introducing a plasmid vector that expresses RNA that suppresses the expression of the KLF5 gene into cultured cells or cells in a living body, the RNA is produced in the cell and the expression of the KLF5 gene in the introduced cell is suppressed. can do.
  • the vector is selected in step 1 below the promoter of a siHNA expression vector such as a plasmid vector for animal cells containing a promoter of RNA polymerase III such as U6 Promoter or HI Promoter.
  • the sequence X and its complementary sequence X ' are linked by two T's at the 5' end with a spacer sequence, and at the 3 'end an RNA polymerase III It can be prepared by inserting DNA containing a sequence consisting of 4 to 6 Ts, which will be one after one minute and one after one minute (hereinafter referred to as KLF5 siRNA DNA).
  • the spacer sequence is preferably a sequence of 6 to 12 bases having two Ts at the 5 'end, and examples thereof include TTCAAGAGA. Either of the sequence X and the complementary sequence ⁇ may be on the 5 ′ side.
  • pSilencer 1.0-U6 manufactured by Ambion
  • pSilencer 3.0 manufactured by Ambion
  • pSUPER manufactured by OligoEngine
  • SIREN-DNR BD BioScience
  • shRNA described in 1. (1) was synthesized by the RNA polymerase II I reaction from U6 Promo overnight. This shRNA is cleaved in the cell and converted into siRNA.
  • the introduction of the recombinant vector into cells is carried out in the same manner as the introduction of vectors into normal animal cells, by the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075) and the lipofection method (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417, 1987).
  • a vector for expressing siRNA using a virus vector such as a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, or the like can also be used.
  • virus vector such as a retrovirus vector, a lentivirus vector, an adenovirus vector, or the like
  • vectors for siRNA expression using the virus vector include pSUPER.retro (manufactured by Oligo Engine), pSIREN-RetroQ (manufactured by BD Biosciences Clontech), and literature (Pro Natl ' Acad. Sci USA, 100. 1844-1848, 2003; Nat. Genet., 33, 401-406, 2003). Wear.
  • the recombinant vector prepared by inserting the same KLF5 siRNA DNA into the siRNA expression vector using a viral vector as described above is introduced into a packaging cell corresponding to the virus vector used.
  • a recombinant virus containing the recombinant vector is produced.
  • the introduction of the recombinant vector into the packaging cells can be carried out by the calcium phosphate method, the lipofection method or the like in the same manner as described above.
  • the recombinant vector is introduced into the cells, and the shRNA described in 1. (1) is synthesized.
  • the shRNA is cleaved intracellularly and KLF5 It is converted to siRNA that suppresses gene expression.
  • KLF5 activates the expression of various genes as transcription factors.
  • Genes whose transcription is activated by KLF5 include genes such as SMemb, PDGF-A, TGF- ?, VEGF receptor Yuichi, PAI-1, and Egr-1.
  • RNA that suppresses the expression of KLF5 gene can be applied to various cells and examining changes in the characteristics of the cells and changes in the expression levels of various genes.
  • the RNA can suppress the expression of the KLF5 gene in animals at various stages of development from the fetus to the adult, it becomes possible to elucidate the function of KLF5, which cannot be understood only by analyzing heterozygous mice. 4.
  • RNA that specifically suppresses the expression of the KLF5 gene of the present invention or a vector that expresses the RNA By administering an RNA that specifically suppresses the expression of the KLF5 gene of the present invention or a vector that expresses the RNA, the expression of KLF5 and a gene that activates transcription by KLF5 is suppressed, and smooth muscle is expressed. Since the proliferation and angiogenesis are inhibited, cardiovascular diseases such as arteriosclerosis, restenosis after coronary artery implantation, and cardiac hypertrophy, or cancer can be treated or prevented.
  • RNA of the present invention or a vector expressing the RNA when used as a pharmaceutical, it can be administered alone, but it is usually a pharmacologically acceptable additive (eg, a carrier, an excipient). (Formulations, diluents, etc.), stabilizers or pharmaceutically necessary ingredients, and provided as a pharmaceutical preparation produced by any method well-known in the technical field of pharmaceutics.
  • a pharmacologically acceptable additive eg, a carrier, an excipient.
  • diluents, etc. stabilizers or pharmaceutically necessary ingredients, and provided as a pharmaceutical preparation produced by any method well-known in the technical field of pharmaceutics.
  • a virus vector it is desirable to administer the virus vector in the form of a recombinant virus.
  • parenteral or oral administration such as oral, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration.
  • Desirable examples include intravenous administration and intramuscular administration.
  • Formulations suitable for intravenous or intramuscular administration include injections.
  • the carrier may be, for example, ice, ethyl alcohol, macrogol, or propylene.
  • Diluents such as glycol, citrate, acetic acid, phosphoric acid, lactic acid, sodium lactate, sulfuric acid and sodium hydroxide; sodium citrate, sodium acetate and sodium phosphate; pH adjusters and buffers such as sodium chloride; sodium pyrosulfite And stabilizers such as ethylenediaminetetraacetic acid, thioglycolic acid and thiolactic acid.
  • a sufficient amount of salt, pudose, mannitol or glycerin for preparing an isotonic solution may be included in the pharmaceutical preparation.
  • the stabilizing agent include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as saccharose and maltose, sugar alcohols such as mannitol and sorbitol, neutral salts such as sodium chloride, amino acids such as glycine, and polyethylene.
  • examples thereof include nonionic surfactants such as glycol, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (pluronic), and polyoxyethylene sorbin fatty acid ester (tween), and human albumin.
  • the RNA of the present invention or a vector expressing the RNA may be prepared and used as a liposome containing the RNA or vector in order to promote the uptake into cells.
  • FIG. 1 shows the suppression of KLF5 gene expression by KLF5 gene-specific siRNA. From the left, 'lOObp Ma-Richi, cells without siRNA, SEAP-siRNA, siRNA No.2, siRNA No.3, siRNA No.4, siRNA No.5, siRNA No.6 In the measurement by PCR on the isolated cells, KLF5 indicates the position of the amplification product derived from KLF5 mRNA, and 18S indicates the position of the amplification product derived from 18S rRNA.
  • Fig. 2 shows the suppression of KLF5 gene expression by KLF5 gene-specific siioA. From left to right, lOObp Maichichi, cells without siRNA, SEAP-siRNA, siRNA No. 7, siRNA No.
  • siRNA No. 9 indicates the position of an amplification product derived from KLF5 mRNA
  • siRNA No. 4 KLF5 indicates the position of an amplification product derived from KLF5 mRNA
  • 18S indicates the position of an amplification product derived from 18S rRNA, as measured by PCR in cells into which siRNA No. 1 has been introduced.
  • FIG. 3 shows suppression of PDGF-A gene expression by siRNA specific to the KLF5 gene. From left to right, lOObp information, cells without siRNA, SEAP-siRNA, siRNA No. 7, siRNA No. 8, siRNA No. 9, siNA No. 10, siRNA No. 11, siRNA No. 4. As measured by PCR in cells into which siRNA No. 1 has been introduced, PDGF-A indicates the position of an amplification product derived from PDGF-A mRNA, and 18S indicates the position of an amplification product derived from 18S rRNA.
  • Fig. 4 Suppression of SMemb gene expression by siRNA specific to KLF5 gene. From the left, lOObp marker, cells without siRNA, SEAP-siRNA, siRNA No. 7, siRNA No. 8, siRNA No. 9, siRNA No. 10, siRNA No. 11, siRNA No. 4, siRNA No.
  • SMemb indicates the position of an amplification product derived from SMemb mRNA
  • 18S indicates the position of an amplification product derived from 18S rRNA.
  • FIG. 5 shows that siRNA specific to the KLF5 gene does not suppress SRF gene expression.
  • SEAP-siRNA siRNA No. 1, siRNA No. 4, siRNA No. 7, siRNA No. 9, and siRNA No. 10
  • SRF indicates the position of an amplification product derived from SRF mRNA
  • 18S indicates the position of an amplification product derived from 18S rRNA.
  • FIG. 6 shows suppression of human KLF5 gene expression by siRNA No. 4. From the left, PCR was performed on lOObp markers, cells without siRNA, SEAP-siRNA, and cells into which siRNA No. 4 had been introduced.KLF was the amplification product derived from KLF5 mRNA, 18S Indicates the position of the amplification product derived from 18S rRNA.
  • FIG. 7 shows the inhibition of migration of vascular endothelial cells by siRNA No. 4.
  • the horizontal axis indicates time (hours), the vertical axis indicates the number of cells that migrated, and the graph indicates the results of cells into which siRNA No. 4 was introduced, and the symbol ⁇ indicates the results of cells into which SEAP-siRNA was introduced.
  • -Errano One is the standard deviation of four cases.
  • FIG. 8 shows the antitumor effect of siRNA No. 4.
  • the horizontal axis represents time (days), the vertical axis represents tumor volume (mm 3 ), and the tumor volume of mice to which KLF5 siRNA Nos. And 4 were administered, and the garden represents the tumor volume of mice to which SEAP-siRNA was administered.
  • the sequence of siRNA that can suppress the expression of the KLF5 gene is (a) a 21-base sequence starting with AA, and (b) a GC content of 20. Eleven subsequences were selected that met the two conditions of ⁇ 80%. However, it is a sequence within the coding region (sequences at positions 167 to 1507) that is at least 75 bases downstream from the start codon (sequences at positions 167 to 169 of SEQ ID NO: 49) and has a GC content of 40 to 60%. I chose the best thing. Table 1 shows the position and GC content of the selected sequence in SEQ ID NO: 49. Sequences obtained by changing T to U in a 19-base sequence excluding the AA at the 5 'end of the selected sequence are shown in SEQ ID NOS: 1 to 11, respectively.
  • siRNA No. l to No. 11 11 types of double-stranded RNA consisting of any of SEQ ID NOS: 1 to 11 and a sequence complementary to the sequence and having two U or dT added to the 3 ′ end (hereinafter referred to as siRNA No. l to No. 11) were prepared as follows. The sequences of siRNA No. 1 to No. 11 and their sense and antisense strands are shown in Table 1 (SEQ ID NOS: 17 to 38). siRNA No. 1 was prepared by chemically synthesizing two RNAs consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 17 and 18 by requesting Nippon Bioservice Co., Ltd., and performing annealing. siRNA Nos.
  • silencer-siRNA preparation kit Silencer TM siRNA Construction Kit, Ambion
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • mice fetal fibroblast cell line C3H / 10T1 / 2 available from American 'type' culture-collection (ATCC). ATCC number: CCL-226), 4 x 10 5 cells / well 'Plating was performed on a plate (manufactured by Koningu). 1. Add 10 ⁇ L of intracellular transfection reagent polyfect (polyfectR, Qiagen) to each of the 5 gC siRNA No. 2, No. 3, No. 4, No. 5, No. 6, and SEAP-siRNA. After mixing at room temperature for 5 to 10 minutes, the mixture was added to each well. In 5% C0 2 present under 37 C and 72 hours of incubation 48 hours to introduce it it it siRNA into the cell.
  • polyfectR intracellular transfection reagent polyfect
  • QIA shredder QIAshredder, Qiagen
  • RNeasy total RNA purification kit RNeasy
  • RNA solution for RNA 1.0 ⁇ g
  • 5's buffer 2.5 u 0.1 mol / L dithiothreitol (DTT) 2.0 JUL 20 mmol / L dNTP (Roche) 1.0 j50 ⁇ mol / L Random Primer (Takara Shuzo Co., Ltd.) 2.0 zL
  • Nuclease-ase inhibitor Superase'-in SUPERase-In, Ambion
  • PowerScript PowerScript Reverse Transcriptase
  • the extension reaction was carried out for 28 cycles, with the elongation reaction being performed at 72 ° C for 40 seconds as one cycle, followed by holding at 72 ° C for 10 minutes.
  • As the 10 XPCR buffer the one attached to the hot polymerase DNA polymerase was used.
  • An amplification product (161 bp) derived from KLF5 mA was detected by 0.8% agarose gel electrophoresis of the solution after the reaction, and compared with the amount of the amplification product in cells into which siRNA had not been introduced.
  • An amplification product (488 bp) derived from 18S rRNA was used as an internal standard.
  • control SEAP-siRNA did not inhibit the expression of KLF5 gene
  • siRNA No. 2, No. 3, No. 4, No. 4 specific to KLF5 gene. 5 and No. 6 were confirmed to suppress the expression of the KLF5 gene.
  • siRNA No. 3 and siRNA No. 4 strongly suppressed the expression of KLF5 gene.
  • siRNA No. 1, No. 4, No. 7, No. 8, No. 9, No. 10 and No. 11 as siRNA specific to the KLF5 gene
  • ⁇ C3iVlOTl / 2 cells were transfected with siRNA and the expression of KLF5 gene was analyzed by RT-PCR.
  • control SEAP-siRNA did not inhibit the expression of KLF5 gene
  • siRNA No. 4, No. 7, No. 8, Nos. 9, 10, and 11 were confirmed to suppress the expression of the KLF5 gene.
  • siRNA No. 4, siRNA No. 7, siRNA No. 9, and siRNA No. 10 strongly suppressed the expression of KLF5 gene.
  • siRNA No. 1 showed no suppression.
  • Example 2 KLF5 gene-specific siRNA suppresses expression of genes whose transcription is activated by KLF5
  • siRNA No. 1, No. 4, No. 7, No. 8, No. 9, No. 10 and No. 11 as siRNA specific to the KLF5 gene into C3H 0T1 / 2 cells, and RT-PCR Analyzed the expression of the PDGF-A gene, a gene whose transcription is activated by KLF5.
  • siRNA was introduced into C3H / 10T1 / 2 cells, and cDNA was prepared.
  • Two DNAs consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 43 and 44 were chemically synthesized, and used as a PDGF-A gene-specific forward primer and a reverse primer, respectively.
  • a 403 bp fragment is amplified from PDGF-A cDNA.
  • Similar to the KLF5 gene expression analysis of Example 1 (2) except that the PDGF-A gene-specific forward primer and reverse primer are used in place of the KLF5 gene-specific forward primer and reverse primer. Then, the expression of the PDGF-A gene was analyzed.
  • one cycle consists of holding the PCR reaction solution at 95 ° C for 15 minutes, heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 53 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C for 40 seconds.
  • the electrophoresis was performed under the conditions of holding at 72 PC for 10 minutes, and electrophoresis was performed with 1% agarose per gel.
  • siRNA No. 4 did not inhibit the expression of PDGF-A gene
  • siRNA No. 7, No. 8, No. 9, No. 10, and No. 11 were also confirmed to suppress the expression of PDGF-A gene, a gene whose transcription is activated by KLF5.
  • siRNA No. 4 siRNA No. 7, siRNA No. 9 and siRNA No. 10 strongly suppressed the expression of PDGF-A gene.
  • siRNA No. 1 showed no suppression.
  • siRNA No. 1, No. 4, No. 7, No. 8, No. 9, No. 10 and No. 11 were introduced into C3H80T1 / 2 cells, and RT-
  • the expression of the SMemb gene, a gene whose transcription is activated by KLF5 was analyzed by PCR.
  • siRNA was introduced into C3H / 10T1 / 2 cells, and cDNA was prepared.
  • Two DNAs consisting of the sequences of SEQ ID NOS: 45 and 46 were chemically synthesized, which were designated as SMemb gene-specific forward primer and reverse primer, respectively.
  • SMemb gene-specific forward primer and reverse primer were chemically synthesized, which were designated as SMemb gene-specific forward primer and reverse primer, respectively.
  • Primer-based PCR amplifies a 235 bp fragment from SMemb cDNA.
  • the SMemb gene-specific forward and reverse primers were used in place of the KLF5 gene-specific forward and reverse primers, and the SMemb gene expression analysis was performed in the same manner as in Example 1 (2). Gene expression was analyzed.
  • siRNA No. 4 As shown in FIG. 4, the control SEAP-siRNA did not inhibit the expression of the SMemb gene, whereas the siRNA No. 4, No. 7, No. 8, No. 8 specific to the KLF5 gene. 9, No. 10 and No. 11 were also confirmed to suppress the expression of SMemb gene, a gene whose transcription is activated by KLF5. Among them, siRNA No. 4, siRNA No. ⁇ , siRNA No. 9 and siRNA No. 10 strongly suppressed the expression of SMemb gene. Despite being specific for the KLF5 gene, siRNA No. 1 showed no suppression.
  • siRNA specific to the KLF5 gene was transferred to C3H80T1 / 2 cells And verified by analyzing the expression of serum response factor (SRF) gene by RT-PCR.
  • SRF gene is a transcription factor gene that is frequently expressed in smooth muscle cells, and is not a gene whose transcription is activated by KLF5.
  • siRNA No. 1, No. 4, No. 7, No. 9 and No. 10 as siRNA specific to the KLF5 gene, the siRNA was converted to C3H / 10T1 / in the same manner as in Example 1 (2). After introduction into two cells, gene expression was analyzed by RT-PCR. Two DNAs consisting of the sequences of SEQ ID NOs: 47 and 48 were chemically synthesized, and used as a forward primer and a reverse primer specific to the SRF gene. PCR using these primers amplifies a 519 bp fragment from the SRF cDNA.
  • SRF gene-specific forward primer and reverse primer in place of the KLF5 gene-specific forward primer and reverse primer, in the same manner as in the KLF5 gene expression analysis of Example 1 (2), The expression of SRF gene was analyzed. However, for PCR, after holding the PCR reaction solution at 95 ° C for 15 minutes, one cycle consisting of a reaction consisting of 30 ° C at 94 ° C for 30 seconds, 30 seconds at 53 ° C for annealing, and 40 seconds at 72 ° C for elongation reaction 26 cycles were carried out, and then the conditions were maintained at 72 ° C. for 10 minutes, and electrophoresis was carried out on a 1.2% agarose gel.
  • siRNA No. 1 As shown in FIG. 5, in all of siRNA No. 1, siRNA No. 4, No. 7, No. 9 and No. 10 specific to the KLF5 gene, the SRF gene was similar to the control SEAP-siRNA. Was not suppressed. Therefore, it is clear that siRNA specific to the KLF5 gene not specifically suppresses the expression of the entire gene, but also specifically suppresses the expression of the KLF5 gene and genes that are activated by KLF.
  • the siRNA No. 4 prepared in Example 1 has the nucleotide sequence of mouse KLF5 cDNA (SEQ ID NO: 49). It is a siRNA based on the sequence from position 1303 to 1323 (AAAAGCTCACCTGAGGACTCA), and strongly suppressed the expression of mouse KLF5 gene in C3H / 10T1 / 2 cells. However, since this sequence of AAAAGCTCACCTGAGGACTCA is also present at nucleotides 1481 to 1501 of the nucleotide sequence of human KLF5 c-ring A (SEQ ID NO: 50), siRNA No. 4 suppresses not only expression of the KLF5 gene in mice but also in humans It is expected. As described below, it was confirmed that siRNA No. 4 also strongly suppressed the expression of the human KLF5 gene.
  • Human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVEC, source: Sanko Junyaku, product number: CC-2517) were seeded on a 6 cm dish (Koning Co., Ltd.) so as to have approximately 3 ⁇ 10 5 cells.
  • 200 pmol of siRNA No. ⁇ 4 and SEAP-siRNA and 10 ⁇ L of intracellular transfection reagent (Ribofectamine 2000, manufactured by Invitrogen) are added and mixed, and the mixture is kept at room temperature for 20 minutes. Added to each dish. The cells were incubated at 37 ° C. for 24 hours in the presence of 5% CO 2 to introduce the respective siRNA into the cells.
  • RNA was isolated from cells by the same method as described in Example 1 (2), and the suppression of human KLF5 gene expression by RT-PCR was examined.
  • KLF gene-specific forward primer and reverse primer DNAs comprising the sequences of SEQ ID NOS: 41 and 42 used in Example 1 were used.
  • PCR using these primers a 161 bp fragment corresponding to the 1446 to 1606 sequence of SEQ ID NO: 50 is amplified from human KLF5 cDNA.
  • An amplification product (161 bp) derived from KLF5 mRNA was detected by 0.8% agarose gel electrophoresis of the solution after the reaction, and compared with the amount of the amplification product in cells into which siRNA had not been introduced.
  • siRNA No. 4 can strongly suppress not only the expression of the mouse KLF5 gene but also the expression of the human KLF5 gene.
  • Table 2 shows that in the siRNA Nos. 2 to 4 and 7 to 11 in which the expression of the mouse KLF5 gene was suppressed in Example 1, the 21-base sequence on the designed mouse KLF5 cDNA and the The position, the 21-base sequence on the human cDNA corresponding to the mouse sequence, the position in SEQ ID NO: 50, and the sequence number representing the RNA sequence excluding the AA at the 5 'end from the human sequence are shown. Since siRNA Nos. 5 and 6 are based on the sequence of the non-coding region, the corresponding human sequence is not shown. Double-stranded RNAs based on these human sequences are also considered to suppress the expression of the human KLF5 gene. SiRNA Nos.
  • AAAAGCTCACCTGAGGACTCA 1303-1323 AAAAGCTCACCTGAGGACTCA 1481-1501 4
  • Human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVEC, source: Sanko Junyaku, product number: CC-2517) were seeded on a 6 cm dish (Koning Co., Ltd.) so as to have approximately 3 ⁇ 10 5 cells. After adding 10 / L intracellular transfection reagent (LipoFectamine 2000, manufactured by Invitrogen) to 200 pmol of siRNA No. 4 and control SEAP-siRNA, each mixture was mixed and incubated at room temperature for 20 minutes. The whole amount was added to the dish. In 5% C0 2 present under 37 ° C for 18 hours I Nkyu Bae Shiyon, it was introduced siRNA.
  • L intracellular transfection reagent LipoFectamine 2000, manufactured by Invitrogen
  • the cells were fluorescently labeled with 5 g / mL of a fluorescent dye for live cell staining (Rikisin AM, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.).
  • a fluorescent dye for live cell staining (Rikisin AM, manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.).
  • the obtained fluorescent-labeled cells are detached with trypsin, washed, and resuspended in a vascular endothelial cell base medium (EBM-2, Sanko Junyaku) to a cell concentration of 5 x 10 5 cells / mL. It became cloudy. !
  • the fluorescent labeling cell suspension is placed on the insert side.
  • ⁇ L, and 600 ⁇ L of vascular endothelial cell growth medium (Bretto kit EGM-2, Sanko Junyaku) containing 10 ng / mL human VEGF (manufactured by R & D Systems) on the 24-well plate side was added.
  • Matrigel mixture was prepared by adding 0.5 ml (5 mg) of Matrigel matrix (manufactured by BD Biosciences) to mouse VEGF (manufactured by R & D Systems Inc., Log No. 493-MV, 0.6 jg). 0.6 g of sibasic fibroblast growth factor (bFGF, manufactured by R & D Systems, catalog No. 133-FB) and 10 g of siRNA No. were added, and the mixture was mixed by pitting on ice. As a control, a Matrigel mixture using SEAP-siRNA instead of siRNA No. 4 was also prepared. The prepared Matrigel mixture was injected subcutaneously on the back of 6-week-old male C57BL / 6 mice.
  • Matrigel matrix manufactured by & D Systems Inc., Log No. 493-MV, 0.6 jg
  • sibasic fibroblast growth factor bFGF, manufactured by R & D Systems, catalog No. 133-FB
  • siRNA No. sibasic fibroblast
  • the gelled Matrigel was removed.
  • the removed Matrigel was washed once with PBS and fixed with a 10% formaldehyde-PBS solution.
  • the fixed Matrigel was cut to a thickness of 5 mm, embedded in paraffin, sectioned using a normal histological technique, and stained with hematoxylin resin. The stained Matrigel sections were observed under a microscope.
  • Tumor volume (thigh 3 ) ⁇ tumor length (thigh) X tumor width (maraud) 2 ⁇ / 2
  • the tumor volume of mice to which control SEAP-siRNA was administered increased from the start of administration, whereas the mice to which siRNA No. 4 was administered
  • the increase in tumor volume was suppressed from day 1 after administration. Therefore, it was confirmed that the siRNA that suppresses the expression of the KLF5 gene has an antitumor effect in vivo, and can suppress tumor growth by administration.
  • SEQ ID NO: 11 Inventor: Ryozo Nagai; Ichiro Manabe; Jun Ishihara
  • SEQ ID NO: 17 siRNA No. 1 sense strand
  • SEQ ID NO: 18 siRNA No. 1 antisense strand
  • SEQ ID NO: 19 siRNA No. 2 sense strand
  • SEQ ID NO: 20 siRNA No. 2 antisense strand
  • SEQ ID NO: 21 siRNA No. 3 sense strand.
  • SEQ ID NO: 22 siRNA No. 3 antisense strand
  • SEQ ID NO: 23 siRNA No. Sense strand
  • SEQ ID NO: 24 siRNA No. 4 antisense strand
  • SEQ ID NO: 25 siRNA No. 5 sense strand
  • SEQ ID NO: 26 siRNA No. 5 antisense strand ''
  • SEQ ID NO: 27 siRNA No. 6 Sense strand
  • SEQ ID NO: 28 si A No. 6 Antisense strand
  • SEQ ID NO: 29 siRNA No. 7 Sense strand
  • SEQ ID NO: 30 siRNA No. 7 antisense strand
  • SEQ ID NO: 32 siRNA No. 8 antisense strand
  • SEQ ID NO: 33 siRNA No. 9 sense strand
  • SEQ ID NO: 34 siRNA No. 9 antisense strand
  • SEQ ID NO: 35 siRNA No. 10 sense strand
  • SEQ ID NO: 36 siRNA No. 10 antisense strand
  • SEQ ID NO: 37 siRNA ⁇ , ⁇ . 11 sense strand
  • SEQ ID NO: 39 siRNA-SEAP sense strand
  • SEQ ID NO: 40 siRNA-SEAP antisense strand
  • SEQ ID NO: 41 KLF5 gene-specific primer
  • SEQ ID NO: 42 Reverse primer specific for KLF5 gene
  • SEQ ID NO: 44 Reverse braimer specific to PDGF-A gene
  • SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 45—SMemb gene-specific forward primer
  • SEQ ID NO: 46 SMemb gene-specific reverse primer
  • SEQ ID NO: 47 SRF gene-specific forward primer
  • SEQ ID NO: 48 SRF gene-specific reverse primer

Landscapes

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Abstract

クルッペル様因子５（KLF5）cDNAの塩基配列から設計した、KLF5mRNAの連続する15～30塩基の配列および該配列を含みKLF5遺伝子の発現を抑制するRNA。特に、配列番号２～16のいずれか１つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖RNAのそれぞれの鎖の3'端に２個のウリジル酸を付加した二本鎖RNA。該RNAまたは該RNAを発現するベクターを細胞に導入することにより、該細胞中のKLF5遺伝子の発現を抑制することができる。該RNAまたは該RNAを発現するベクターは、心血管系疾患または癌の治療薬に用いることができる。

Description

明 細 書
KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA 技術分野
本発明は、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAに関する。 背景技術
クルツペル様因子 （K ppel- like factor, 以卞 KLFと略す） ファミリ一は、 C末 端のジンク ·フィンガー (zinc f inger) モチーフを特徴とする、 転写因子のフアミ リーであり、 KLF1、 KLF2、 KLF3, KLF4、 KLF5、 KLF6, KLF7、 KLF8, KLF9、 KLF10, KLF11ヽ KLF12、 KLF13、 匪 4、 KLF15, KLF16等が知られている。 哺乳類において、 KLFファミリ一は、 様々な組織や細胞、 例えば赤血球、 血管内皮細胞、 平滑筋、 皮膚、 リンパ球等の分ィヒに重要であること、 また癌、 心血管疾患、 肝硬変、 腎疾患、 免疫 疾患等の各種疾患の病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている （J. Biol . Chem. , 276 , 34355-34358 , 2001 ; Genome Biol . , 4 , 206 , 2003) 。
KLFファミリーのうちの KLF5は、 BTEB2 (basic transcriptional element binding protein 2) あるいは IKLF (intestinal-enriched Kruppel-l ike factor) ともよば れる。 血管平滑筋における KLF5の発現は、 発生段階で制御を受けており、 胎児の血 管平滑筋では、 高い発現を示すのに対し、 正常な成人の血管平滑筋では発現が見ら れなくなる。 また、 バルーンカテーテルによる削剥後に新生した血管内膜の平滑筋 では、 KLF5の高い発現がみられ、 動脈硬化や再狭窄の病変部の平滑筋でも KLF5の発 現がみられる (Circulation, 10 > 2528-2534 , 2000) 。
動脈硬化巣や経皮的冠動脈形成術後の再狭窄部位などの病変部位の血管平滑筋は、 活性化しており、 筋フィラメントの消失、 蛋白合成の亢進、 増殖能や遊走能を示し、 胎児の血管平滑筋と同様の形質 （胎児型） へ形質転換している。 平滑筋細胞には SM1、 SM2、 SMembという 3種類のミオシン重鎖のアイソフオームが存在するが、 胎児型へ の形質転換に伴い、 SM2が消失し、 SMembの発現誘導が認められる。 KLF5は、 SMemb遺 伝子の転写制御配列と結合し、 その転写を活性化する （非特許文献 4参照） 。 さら に、 血小板由来増殖因子 A鎖 （以下 PDGF- Aとよぶ） 、 トランスフォーミング増殖因 子 （TGF) -β、 血管内皮増殖因子 （VEGF) リセプ夕一、 誘導型一酸化窒素合成酵素 (iNOS) 、 プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一インヒビ夕一 （PAI) -1および転写因子 Egr (early growth response) - 1など、 血管の形質や血管新生に関与する遺伝子の 転写を活性化することが報告されている (Nat . Med . , 8 , 856-863 , 2002 ; Ann . N. Y. Acad. Sci .， Ml, 56-66 , 2001) 。
また、 KLF5遺伝子のヘテロノ,ックアウトマウスにおいて、 心血管系への物理的負 荷やアンジォテンシン I Iにより引き起こされる血管平滑筋増殖と血管内膜肥厚、 血 管新生、 血管外膜の肉芽形成、 心肥大および心筋線維化等が著明に抑制されている ことが報告されている （Nat . Med . , 8 , 856-863 , 2002) 。 '
このように、 KLF5遺伝子は平滑筋形質変換に関わるだけでなく、 広く心血管系の 病態形成に関わる転写因子であり、 その機能発現には遺伝子発現量がきわめて重要 である。 KLF5は、 動脈硬化や、 心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌等の血管新生 が関与する疾患の病態形成に関与するので、 KLF5遺伝子の発現を抑制することでこ れらの疾患の治療または予防に有用な薬剤となりうることが予想される。 .しかし、 現在のところ KLFフアミリー遺伝子の発現を効果的に抑制する薬剤は知られていない 一方、 RNA干渉 （腿 A interference, 以下、 RNAiとよぶ） は、 線虫において標的と する遺伝子と同一の配列を有する二本鎖 RNAを導入することにより、 標的遺伝子の発 現が特異的に抑制される現象として報告された （Nature, 391 , 806-811, 1998) 。
RNAiは、 導入した二本鎖 RNAが、 21〜23塩基の長さの二本鎖 RNAに分解された後、 蛋白質複合体がこの短い二本鎖 RNAと結合し、 同じ配列を有する mRNAを認識し切断す ることによって起こると考えられている。 Tuschlらは、 ショウジヨウバエにおいて 長い二本鎖 RNAの代わりに、 21〜23塩基の長さの二本鎖 RNAを導入することによって も、 標的遺伝子の発現が抑制されること,を見いだし、 これを short interfering RNA (siRNA)と名づけた （W0 01/75164) 。 si謂 Aの配列と標的遺伝子とのミスマッチがあ ると非常に発現抑制の効果が弱まること、 長さは 21塩基が最も効果が高く、 平滑末 端よりも、 両方の鎖の 3'末端にヌクレオチドが付加して、 末端が突出した構造の方 が効果が高いことが示された (W0 02/44321) 。
哺乳類細胞では、 長い二本鎖 RNAを導入した場合、 ウィルス防御機構により遺伝子 全体の発現抑制とアポトーシスが起こり、 特定の遺伝子の抑制をすることができな かったが、 20〜29塩基の siRNAであれば、 このような反応がおこらず、 特定の遺伝子 の発現を抑制をすることができることが見いだされた。 なかでも 21〜25塩基のもの が発現抑制効果が高い (Nature, 411, 494-498, 2001; Nat. Rev. Genet., 3, 737- 747, 2002; Mol. Cell, 10, 549-561, 2002; Nat. Biotechnol., 20, 497-500, 2002) 。
RNAiでは、 二本鎖 RNAは一本鎖アンチセンス RNAに比べ、 標的遺伝子に対する発現 抑制効果が飛躍的に高いことが報告されている（Nature, 391> 806-811, 1998; Mol. Cell, 10, 549-561, 2002) 。 また、 二本鎖 RNAでなく、 分子内ハイブリダィズによ り、 ヘアピン構造を形成する一本鎖 RNAも、 siRNAと同様に RNAiを示すことが報告さ れている (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 > 6047-6052, 2002) 。 - RNAiは in vitroのみならず、 in vivo試験においても多く検証されており、 50bp以 下の siRNAを用いた胎児の動物での効果 （TO 02/132788) 、 成体マウスでの効果 （W0 03/10180) が報告されている。 また、 siRNAをマウス胎児に静脈内投与した場合に、 腎臓、 脾臓、 肺、 臈臓、 肝臓の各臓器で発現抑制効果が確認されている （Nat. Genet. 32, 107-108, 2002) 。 さらに、 脳細胞においても siRNAを直接投与すること で作用することが報告されている。 ('Nat. Biotechnol., 0, 1006 - 1010， 2002) しかし、 これまでのところ KLF5あるいは他の KLFファミリ一遺伝子に対する siRNAを 用 ヽた RNAiに関しては報告例がない。 発明の開示
本発明の目的は KLF5遺伝子の発現を抑制する Aを見出すことである。 このような RNAは、 KLF5遺伝子の発現を抑制することにより、 KLF5の転写因子としての機能を阻 害し、 心血管性疾患や癌等の KLF5が病態の形成に関与する疾患に対する、 副作項の 少ない治療薬または予防薬に用いることができる。
本発明者らは、 鋭意検討を行った結果、 以下に記載する発明を完成するに至った c すなわち、 本発明ば以下の （1) 〜 （13) に関する。
' ( 1) KLF5 m而 Aの連続する 15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA。
( 2 ) KLF5 mRNAがヒトまたはマウスの KLF5 mRNAである、 （ 1 ) に記載の RNA。
(3) RNAが、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な 配列の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3'端に 1〜 6個のヌクレオチドを付加 した二本鎖 RNAである、 （1) または （2) に記載の RNA。
(4) RNAが、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列からなる RNAおよび該配列と相 補的な配列からなる RNAを、 スぺーサーオリゴヌクレオチドでつなぎ、 3'端に 1〜6 個のヌクレオチドを付加した、 ヘアピン構造を形成する RNAである、 （1) または
(2) に記載の RNA。
( 5 ) 以下の（ a ')〜（ c )からなる群から選ばれる KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA。
(a)配列番号 2 ~16のいずれか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖 からなる二本鎖 RNAのそれぞれの鎖の 3 '端に 2〜4個のゥリジル酸またはデォキシチ ミジル酸を付加した二本鎖 RNA。
( b )配列番号 2〜16のいずれか 1つの配列からなる RNAおよび該配列と相補的な配 列からなる RNAを 2個のゥリジル酸を 5'端に有するスぺーサ一 RNAでつなぎ、 3'端に
2〜 4個のゥリジル酸を付加した、 ヘアピン構造を形成する RNA。
( c ).配列番号 2〜11のいずれか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖 からなる二本鎖 RNAのそれぞれの鎖の 3'端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNA。 (6) ( 1) - (5) の 、ずれか 1項に記載の RNAを発現するベクター。
(7) (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の RNAまたは （6) に記載のベクタ一を 細胞に導入することにより、 該細胞中の KLF5遺伝子の発現を抑制する方法。
(8) (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の RNAまたは （6) に記載のベクターを 細胞に導入することにより、 該細胞中の KLF5により転写が活性化される遺伝子の発 現を抑制する方法。
(9) KLF5により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子 A鎖遺伝子また は平滑筋ミオシン重鎖 SMemb遺伝子である （8) に記載の方法。
(10) (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の RNAまたは （6) に記載のベクタ一 を有効成分として含有する医薬組成物。
(11) (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の RNAまたは （6) に記載のベクタ一 を有効成分として含有する、 血管新生を阻害するための医薬組成物。
(12) (1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の Aまたは （6) に記載のベクター を有効成分として含有する、 心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
(13) 心血管系疾患が動脈硬化、 冠動脈インターペンション後の再狭窄または心 肥大である （12) に記載の治療薬または予防薬。
本発明の RNAにより、 KLF5遺伝子および KLF5により転写が活性化される遺伝子の発 . 現を抑制することができる。 本発明の RNAまたは該 RNAを発現するべクタ一の投与に より、 KLF5遺伝子および KLF5により転写が活性化される遺伝子の発現が抑制され、 平滑筋の増殖や血管新生を抑制できるので、 本発明の RNAまたは該 Aを発現するべ ク夕一は、 動脈硬化、 .冠動脈ィン夕一ベンション後の再狭窄、 心肥大^の心血管系' 疾患、 あるいは癌の治療剤または予防剤の有効成分として使用することができる。
1 . KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA
本発明の RNAは、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基、 好ましくは 17〜25塩基、 より 好ましくは 19〜23塩基の配列 （以下酉己列 Xとする） および該配列と相補的な配列 （以 下、 相補配列 X'とする） を含み、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAである。 該 RNAと しては、 （a ) 配列 Xの鎖 （センス鎖） および相補配列 X'の鎖 （アンチセンス鎖） か らなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3 '端に 1〜 6個、 好ましくは 2〜4個のヌクレオ チドを付加した二本鎖 UNA (以下、 このような構造の RNAを si Aとよぶ） であって KLF5遺伝子の発現を抑制する丽、 ( b ) 配列 Xからなる RNAおよび相補配列 X'からな る RNAを、 スぺ一サ一オリゴヌクレオチドでつなぎ、 3 '端に 1〜6個、 好ましくは 2 〜4個のヌクレオチドを付加した、 ヘアピン構造を形成する RNA (以下、 このような RNAを shRNAとよぶ） であって、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAがあげられる。 これ らの RNAにおいて付加するヌクレオチドの塩基はグァニン、 アデニン、 シトシン、 チ ミン、 ゥラシルのいずれでもよく、 また RNAでも DNAでもよいが、 ゥリジル酸 （U) ま たはデォキシチミジル酸 (dT) が好まし 。 またスぺ一サ一オリゴヌクレオチドは 6 ~12塩基の RNAが好ましく、 その 5 '端の配列は 2個の Uが好ましい。 スぺ一サ一ォ リゴヌクレオチドの例として、 UUCAAGAGAの配列からなる RNAをあげることができる, スぺーサ―ォリゴヌクレオチドによってつながれる 2つの RNAの順番はどちらが 5 '側 になってもよい。
配列 Xは、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列、 好ましくは 17〜25塩基、 より 好ましくは 19〜23塩基の配列であれば、 いずれの配列でもよいが、 以下の （1 ) に 記載の方法で設計した 19塩基の配列が最も好ましい。 以上の構造を有する RNAであつ て、 KLF5遺伝子の発現を抑制するものであれば、 本発明の RNAに含まれる。
本発明の RNAば、 上記の構造の RNAを KLF5遺伝子が発現している細胞に導入して KLF5遺伝子の発現を測定し、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RMを選択することより取 得できる。
( 1 ) 配列 Xの設計
遺伝子の発現を抑制したい動物の KLF5 cDNAの塩基配列から.、 AAではじまる 21塩基 の部分配列を取り出す。 取り出した配列の GC含量を計算し、 GC含量が 20〜80%、 好 ましくは 30%〜70%、 より好ましくは 40〜60%の配列を複数個選択する。
配列は、 好ましくは、 コード領域内の配列で、 開始コドンから 75塩基以上下流の 配列を選択する。 KLF5 cDNAの塩基配列の情報は、 GenBank等の塩基配列データべ一 スから得ることができる。 例えば、 マウス KLF5 cDNAの配列は GenBank登録番号
NMJ09769 (配列番号 49) 、 ヒト KLF5 cDNAの配列は GenBank登録番号 AF287272 (配列 番号 50) で、 配列情報が得られる。
選択した配列の 5 '末端の Mを除き、 配列中の Tを Uに変えた 19塩基の配列を配列 Xと する。
( 2 ) 本発明の RMの調製
( 1 ) で選択した配列 Xを元に、 以下のようにして RNAを調製することができる。 以下には付加するオリゴヌクレオチドとして 2個の Uまたは dTの場合を記載するが、 他のヌクレオチドの場合も同様にして調製することができる。
( a ) siRNAの場合
配列 Xの 3 '端に 2個の Uまたは dTを付加した配列からなる RNA、 および相補配列 X'の 3 '端に 2個の Uまたは dTを付加した配列からなる RNAの 2本の RNAを調製する。 この 2 本の RNAは、 化学合成あるいはインビトロ転写により調製できる。化学合成は、 DNA 合成機を用いて行うことができる。 またアンビオン （Ambion) 社、 日本バイオサ一 ビス株式会社、 キアゲン (QIAGEN) 社等のメーカ一に化学合成を依頼することもで きる。化学合成した互いに相補的な配列を含む 2本の RNAをァ二一リングすることに より、 配列 Xの鎖および相補配列 X'の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3 '端に 2個の Uまたは dTを付加した二本鎖 RNAを調製することができる。 ァニ一リングは、 2本の RNAを適当なバッファ一中で 90〜95°Cで 1〜5分加熱後、 45〜60分間かけて室 温にまで冷却することにより行うことができる。
インビトロ転写による RNAの調製は、 以!^のようにして行うことができる。 まず、 (i) T7 RNAポリメラ一ゼのプロモ一夕一配列を有する DNA(T7プライマ一）、 (ii) 相補配列 X'の Uを Tに変え、 その 5 '端には 2個の Aを付加し、 3 '端には T7プライマ一の 3 '端 8塩基と相補的な配列を付加した配列を有する DNA、 (ii i)配列 Xの Uを Tに変え、 その 5 '端には 2個の Αを付加し、 3 '端には T7プライマ一の 3 '端 8塩基と相補的な配列 を付加した配列を有する DNA、 をそれそれ調製する。
T7プライマ一と （ii ) .の DNAとをァニールさせた後、 MAボリメラ一ゼ反応により、 二本鎖 DNAにする。 得られた二本鎖 DNAを錡型として、 T7履 Aポリメラ一ゼを用いた インビトロ転写反応を行うことにより、 配列 Xの 3 '端に 2個の Uが付加し、 5 '端には リーダー配列が付加した配列を有する RNAを合成することができる。 同様に T7ブラィ マーと （iii) の DNAとを用いて同様の反応を行うことにより、 相補配列 X'の 3 '端に 2個の Uが付加し、 5 ' にはリ一ダー配列が付加した配列を有する RNAを合成するこ とができる。
2つの反応液を混ぜて、 さらにインビトロ転写反応を続けることにより、 互いに 相補的な配列を含む 2本の RNAをァニールさせる。 その後、 デォキシリボヌクレア一 ゼおよび一本鎖 RNA特異的なリボヌクレア一ゼにより、 铸型の二本鎖 DNAおよび各 RNA 鎖の 5 '側のリーダー配列を分解して除去する。 各 RNA鎖の 3 '端の 2個の Uは分解を受 けずに付加したまま残る。
以上の反応は、 サイレンサ一 siRNA作製キット （Si lencer · si RNA Construction Kit, アンビオン社製） 等のキットを用いて行うことができる。 T7プライマ一とァニ ールさせる DNAは、 DNA合成機により化学合成することができる。 またアンビオン社、 日本バイオサービス株式会社、 北海道システムサイエンス株式会社、 キアゲン社等 のメーカーに化学合成を依頼することもできる。
( b ) shRNAの場合 _ 配列 Xからなる RNAおよび相補配列 X'からなる RNAを、 スぺ一サーオリゴヌクレオチ ドでつなぎ、 3 '端に 1〜6個、 好ましくは 2〜4個のヌクレオチドを付加した、 へ ァピン構造を形成する RNAは、 DNA合成機を用いた化学合成によって調製できる.。 ま た、 2 . に後述する siRNA発現べクタ一を細胞に導入することにより、 細胞内に shRNAが合成される。 この shRNAは、 細胞内で siRNAに変換される。 ベクターを導入し て細胞内で合成させた場合は、 sh冊 Aの単離と （3 ) に記載した細胞への導入の操作 は不要であり、 ベクターを導入した細胞について KLF5遺伝子の発現を解析すればよ い。
( 3 ) KLF5遺伝子の発現抑制
KLF5遺伝子を発現する細胞株に （2 ) で調製した siRMまたは shRMを導入する。 細胞株は、 （ 1 ) の配列 Xの設計のもとにした KLF5 cDNAと同じ動物種の細胞を用い, る。 KLF5遺伝子を発現する細胞株としては、 平滑筋、 繊維芽細胞または血管内皮細 胞に由来する細胞株、 例えばマウス胎児繊維芽細胞株 C3IV10T1/2 (ATCC番号： CCL- 226) 、 ヒト臍帯血管内皮細胞等をあげることができる。 RNAの導入は、 動物細胞へ のトランスフエクシヨン用試薬、 例えばポリフエクト (Polyfect) トランスフエク シヨン試薬 （キアゲン社製） 、 トランスメッセンジャー （TransMessenger) トラン スフエクシヨン試薬、 オリゴフエクトァミン （Ol igofectamine) 試薬 （インピトロ ジェン社製） 、 リポフエクトァミン (Lipofectamine) 2000 (インビトロジェン社 製） 等を利用して、 これらの試薬と RNAを混合して複合体を形成させた後、 細胞に添 加することにより行うことができる。
本発明の RNAまたは 2 . で後述する siRNA発現ベクターを導入した細胞の KLF5遺伝 子の発現は、 RT-PCRにより解析することができる。 RNAまたは siRNA発現べク夕一を 導入した細胞および導入しなかつた細胞から総 RNAを調製し、 この RNAから cDNAを合 成する。 合成した cDNAを錶型にして、 KLF5遺伝子に特異的なプライマーを用いた PCR を行い、 KLF5 cDNAに由来する増幅産物の量を、 ァガロースゲル電気泳動によって定 量することにより、 KLF5遺伝子の発現量を測定することができる。 RNAまたは siRNA 発現べクタ一を導入しなかった細胞の KLF5遺伝子の発現量と比較して、 KLF5遺伝子 の発現量が減少した細胞に導入した RNAを、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAとして 選択する。 '
このようにして選択された、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAとしては、 配列番号 2 ~11のいずれか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3 '端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNAをあげることが できる。 該 RNAはマウス cDNAの配列に基づいて設計されたものであり、 マウス KLF5 遺伝子の発現を抑制する。 このうち、 配列番号 4、 8および 10の配列はそれそれマ ウスとヒトのそれぞれの KLF5 mRNAで共通する配列であるので、 配列番号 4、 8およ び 10のいずれか 1つの配列の鎖おょぴ該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖 RNA のそれそれの鎖の 3 '端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNAは、 マウス KLF5遺伝 子だけでなくヒト KLF5遺伝子の発現も抑制する。
( 1 ) の配列 Xの設計のもとにしたある動物種 Aの KLF5 cDNAと、 異なる動物種 Bの KLF5 cDNAを配列の相同性に基づいてァライメントすることにより、 動物種 Aで選択 された配列 Xと対応する動物種 Bの配列 Yを得ることができ ¾。 上記の方法で、 動物種 Αの KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAが得られた場合、 該 RNAの配列 Xおよびその相補 配列 X'の領域をそれそれ配列 Yとその相補配列 Y'に置換した RNAは、 動物種 Bの KLF5遺 伝子を抑制すると考えられる。
例えば、 マウス KLF5 cDNAの配列に基づく配列番号 2.、 3、 7、 9および 11のいず れか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれ の鎖の 3 '端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNAは、 マウス KLF5遺伝子の発現を 抑制するので、 ヒト KLF5 cDNAにおいて対応する配列である配列番号 12〜16のいず れか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれ の鎖の 3 '端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNAは、 ヒト KLF5遺伝子の発現を抑 制すると考えられる。
2 . KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAを発現するべクタ一
( 1 ) プラスミドベクター
KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAを発現するプラスミ ドベクタ一を、 培養細胞また は生体内の細胞に導入することにより、 細胞内で該 RNAが産生され、 導入した細胞で の KLF5遺伝子の発現を抑制することができる。 該ベクターは、 U6プロモー夕一ある いは HIプロモ一夕一等 RNAポリメラーゼ I IIのプロモー夕一を含む動物細胞用プラス ミドベクター等の siHNA発現用ベクターのプロモーターの下流に、 1 . で選択された 配列 Xおよびその相補配列 X' (それそれ Uは Tに変換する） を、 2個の Tを 5 '端に有す るスぺ一サー配列でつなぎ、 3 '端に RNAポリメラ一ゼ I I I夕一ミネ一夕一となる 4〜6 個の Tからなる配列を含む DNA (以下、 KLF5 siRNA用 DNAとよぶ） を挿入して作製する ことができる。 スぺーサ一配列としては、 2個の Tを 5 '端に有する 6〜12塩基の配列 が好ましく、 例えば、 TTCAAGAGAをあげることができる。 配列 Xと相補配列 Γの順序 は、 どちらが 5 '側でもよい。 siRNA発現用べクタ一としては、 pSi lencer 1.0-U6 (ァ ンビオン社製) 、 pSi lencer 3.0 (アンビオン社製) 、 pSUPER 〔オリゴエンジン (Ol igoEngine)社製〕 、 SIREN-DNR 〔B Dバイオサイェンシズ ·クロンテック (BD Biosciences Clontech) 社製〕等をあげることができる。
上記の KLF5 siRNA用 DNAを揷入して作製した組換えべクタ一を導入した細胞では、 U6プロモ一夕一からの RNAポリメラーゼ II I反応により、 1 . ( 1 ) に記載した shRNA が合成され、 この shRNAが細胞内で切断を受けて siRNAに変換される。 組換えべクタ —の細胞への導入は、 通常の動物細胞へのベクタ一の導入と同様に、 リン酸カルシ ゥム法 （特開平 2-227075 ) 、 リポフエクシヨン法 （Pro Natl . Acad . Sci . USA, 84, 7413-7417 , 1987) 等により行うことができる。
( 2 ) ウィルスベクター
siRNA発現ぺク夕一として、 レトロウイルスベクタ一やレンチウィルスベクタ一、 アデノウィルスベクター等のウィルスベクターを利用した siRNA発現用べクタ一を用 いることもできる。 このようなウィルスべク夕一を利用した siRNA発現用べク夕一と して、 pSUPER. retro (オリゴエンジン社製） 、 pSIREN- RetroQ ( B Dバイオサイェン シズ ·クロンテック社製） 、 文献 （Pro Natl '. Acad . Sci USA, 100. 1844-1848 , 2003 ; Nat . Genet . , 33 , 401-406 , 2003) に記載のベクターなどをあげることがで きる。
ウィルスベクターを利用した siRNA発現用べクタ一に上記と同様の KLF5 siRNA用 DNAを挿入して作製した組換えべク夕一を、 用いた'ウィルスベクタ一に応じたパッケ 一ジング細胞に導入することにより、 該組換えベクターを含む組換えゥィルスを生 産させる。 組換えべクタ.一のパッケージング細胞への導入は、 上記と同様に、 リン 酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法等により行うことができる。 得られた組換え ウィルスを細胞に接触させて感染させることにより、 組換えベクターが細胞に導入 され、 1 . ( 1 ) に記載した shRNAが合成され、 この shRNAが細胞内で切断を受けて KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNAに変換される。
3 . KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAの利用法
( 1 ) KLF5により転写が活性化される遺伝子の発現の抑制
KLF5は転写因子として、 種々の遺伝子の発現を活性化している。 KLF5遺伝子の発 現を抑制する RNAにより、 KLF5遺伝子の発現が抑制される結果、 KLF5により転写が活 性化される遺伝子の発現も抑制することができる。 KLF5により転写が活性化される 遺伝子としては、 SMemb、 PDGF- A、 TGF- ?、 VEGFリセプ夕一、 PAI-1、 Egr- 1等の遺伝 子をあげることができる。 ·
( 2 ) KLF5の機能の解析
KLF5遺伝子の発現を抑制する RNAを、 種々の細胞に作用させ、 その細胞の形質の変 化や、 各種遺伝子の発現量の変動を調べることにより、 それそれの細胞における KLF5の機能を解析することができる。 また、 該 RNAは、 胎児から成体まで、 さまざま な発育段階の動物で KLF5遺伝子の発現抑制をすることができるので、 ヘテロノック ァゥトマウスの解析だけではわからない KLF5の機能の解明をすることが可能となる。 4 . 本発明の RNAまたはベクターを有効成分として含有する医薬組成物
本発明の KLF5遺伝子の発現を特異的に抑制する RNA、 または該 RNAを発現するべク 夕一を投与することにより、 KLF5および、 KLF5が転写を活性化する遺伝子の発現が 抑制され、 平滑筋の増殖や血管新生が阻害されるので、 動脈硬化、 冠動脈イン夕一 ペンション後の再狭窄や心肥大等の心血管系の疾患あるいは癌の治療または予防を することができる。
'本発明の RNAまたは該 RNAを発現するべクタ一は、 医薬品として使用する場合、 単 独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される添加剤 （例えば 担体、 賦形剤、 希釈剤等） 、 安定化剤または製薬上必要な成分と混合し、 製剤学の 技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供する のが望ましい。 また、 ウィルスベクターの場合は、 組換えウィルスの形態でウィル スベクターを投与することが望ましい。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 口腔内、 気 道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内などの非経口投与または経口投与をあげ ' ることができ、 望ましくは静脈内投与、 筋肉内投与をあげることができる。 静脈内 投与、 筋肉内投与に適当な製剤としては、 注射剤があげられる。
本発明の RNAまたは該 RNAを発現するべクタ一を、 注射剤の形態に成形するに際し ては、 担体として、 たとえば、 氷、 エチルアルコール、 マクロゴール、 プロピレン グリコール、 クェン酸、 酢酸、 リン酸、 乳酸、 乳酸ナトリウム、 硫酸および水酸化 ナトリゥム等の希釈剤、 クェン酸ナトリゥム、 酢酸ナトリゥムおよびリン酸ナトリ. ゥム等の pH調整剤および緩衝剤、 ピロ亜硫酸ナトリウム、 エチレンジァミン四酢酸、 チォグリコール酸およびチォ乳酸等の安定化剤等が使用できる。 なお、 この場合等 張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、 プドウ糖、 マンニトールまたはグリセリ ンを医薬製剤中に含有せしめてもよい。 安定化剤としては、 グルコース等の単糖類、 サヅカロ一ス、 マルト一ス等の二糖類、 マンニトール、 ソルビト一ル等の糖アルコ ール、 塩化ナトリゥム等の中性塩、 グリシン等のアミノ酸、 ポリエチレングリコ一 ル、 ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体 （プルロニヅク） 、 ポリ ォキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル （トウイ一ン） 等の非イオン系界面活性 剤、 ヒトアルブミン等が例示される。 また、 細胞内への取り込みを促進するため、 本発明の RNAまたは該 RNAを発現するベクターを、 該 RNAまたはベクターを含むリポソ —ムとして調製して用いてもよい。 図面の簡単な説明
第 1図 KLF5遺伝子特異的な siRNAによる KLF5遺伝子の発現抑制を示す。 左から、 ' lOObpマ一力一、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP- siRNA、 siRNA No . 2、 siRNA No . 3、 siRNA No . 4、 siRNA No . 5、 siRNA No . 6をそれそれ導入した細胞での PCRによる 測定で、 KLF5は、 KLF5 mRNA由来の増幅産物、 18Sは、 18S rRNA由籴の増幅産物の位 置を示す。 ， 第 2図 KLF5遺伝子特異的な si應 Aによる KLF5遺伝子の発現抑制を示す。 左から、 lOObpマ一力一、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP-siRNA、 siRNA No . 7、 siRNA No . 8、 siRNA No . 9、 siRNA No . 10、 siRNA No . 11、 siRNA No . 4、 siRNA No . 1をそれ それ導入した細胞での PCRによる測定で、 KLF5は、 KLF5 mRNA由来の増幅産物、 18Sは、 18S rRNA由来の増幅産物の位置を示す。
第 3図 KLF5遺伝子特異的な siRNAによる PDGF- A遺伝子の発現抑制を示す。 左から、 lOObpマ一力一、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP- siRNA、 siRNA No . 7、 siRNA No . 8、 siRNA No . 9、 si NA No . 10、 siRNA No . 11、 siRNA No . 4、 siRNA No . 1をそれ それ導入した細胞での PCRによる測定で、 PDGF-Aは、 PDGF- A mRNA由来の増幅産物、 18Sは、 18S rRNA由来の増幅産物の位置を示す。
第 4.図 KLF5遺伝子特異的な siRNAによる SMemb遺伝子の発現抑制を示す。 左から、 lOObpマーカー、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP- siRNA、 siRNA No . 7、 siRNA No . 8、 siRNA No . 9、 siRNA No . 10、 siRNA No . 11、 siRNA No . 4、 siRNA No . 1をそれ それ導入した細胞での PCRによる測定で、 SMembは、 SMemb mRNA由来の増幅産物、 18S は、 18S rRNA由来の増幅産物の位置を示す。
第 5図 KLF5遺伝子特異的な siRNAは SRF遺伝子の発現は抑制しないことを示す。 左 から、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP - siRNA、 siRNA No . 1、 siRNA No . 4、 siRNA No . 7、 siRNA No . 9、 siRNA No . 10をそれぞれ導入した細胞での PCRによる測 定で、 SRFは、 SRFmRNA由来の増幅産物、 18Sは、 18S rRNA由来の増幅産物の位置を示 す。 第 6図 siRNA No . 4によるヒト KLF5遺伝子の発現抑制を示す。 左から、 lOObpマー 力一、 siRNAを導入しなかった細胞、 SEAP- siRNA、 および siRNA No . 4をそれそれ導 入した細胞での PCRによる測定で、 KLFは、 KLF5 mRNA由来の増幅産物、 18Sは、 18S rRNA由来の増幅産物の位置を示す。
第 7図 siRNA No . 4による血管内皮細胞の遊走の阻害を示す。 横軸は時間 （時間） .、 縦軸は遊走した細胞数で、 書は siRNA No . 4を導入した細胞、 酾は SEAP- siRNAを導入 した細胞の結果を示す。 -エラーノ 一は例数 4の標準偏差である。
第 8図 siRNA No . 4による抗腫瘍効果を示す。 横軸は時間 （日数） 、 縦軸は腫瘍体 積 （mm3) で、 きは KLF5 siRNA No , 4を投与したマウスの腫瘍体積、 園は SEAP- siRNA を投与したマウスの腫瘍体積を示す。 . 発明を実施するための最良の形態
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によつ て限定されるものではない。
実施例 1 siRNA,による KLF5遺伝子の発現抑制
( 1 ) siRNAの調製 '
KLF5遺伝子の発現を抑制できる siRNAの配列として、 マウス KLF5 cDNAの配列 (GenBank登録番号：画— 009769、 配列番号 49 ) から、 （a ) AAではじまる 21塩基の 配列、 （b ) GC含量が 20〜80%の 2つの条件に当てはまる、 11個の部分配列を選択 した。 ただし、 閧始コドン （配列番号 49の 167〜169番目の配列） より 75塩基以上下 流の、 コード領域 （配列番号 167〜1507番目の配列） 内の配列で、 GC含量が 40〜60% のものをなるベく選択するようにした。 選択した配列の配列番号 49における配列の 位置、 GC含量を第 1表に示した。 選択した配列の 5 '端の AAを除いた 19塩基の配列の T を Uに変えた配列をそれぞれ配列番号 1〜11に示した。
第 1表
Figure imgf000012_0001
配列番号 1〜 11のいずれかの配列および該配列と相補的な配列の 3 '端にそれそれ 2個の Uまたは dTを付加した配列からなる 11種類の二本鎖 RNA (以下、 それそれ siRNA No . l〜No . 11とよぶ） を以下のようにして調製した。 siRNA No . l〜No . 11それそ れのセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を第 1表に示した （配列番号 17〜38) 。 siRNA No . 1は、 配列番号 17および 18の配列からなる 2本の RNAを、 株式会社日本バ ィォサービスに依頼して化学合成し、 ァニ一リングさせることにより調製した。 siRNA No . 2〜No . 11はサイ レ ンサ一 siRNA作製キ ヅ ト （Silencer™ siRNA Construction Kit, アンビオン社製） を利用したインビトロ転写により調製した。 インビトロ転写の鎵型作製に用いる DNAは、 北海道システム 'サイエンス株式会社に 化学合成を依頼した。 また、 文献 （Nat . Genet . , 32 , 107-108 , 2002 ; 米国特許出 願公開 第 2002/0132788号明細書） に基づき、 配列番号 39および 40の配列からなる、 分泌型アルカリフォスファターゼ （SEAP) 遺伝子の発現を抑制する siRNA (以下、 SEAP- siRNAとよぶ） を、 サイレンサー siRNA作製キットを利用したインビトロ転写に より調製し、 コントロールの siRNAとして用いた。
( 2 ) siRNAによる KLF5遺伝子の発現抑制
' マウス胎児線維芽細胞株 C3H/10T1/2 (入手先：アメリカン 'タイプ 'カルチヤ ― .コレクション （ATCC).、 ATCC番号： CCL-226) をゥエルあたり 4 X 105個になるよ う 6ゥエル 'プレート （コ一二ング社製） に播種した。 1. 5 gC siRNA No . 2、 No . 3、 No . 4、 No . 5、 No . 6および SEAP-siRNAそれぞれに、 細胞内導入試薬ポリフエク ト （polyfectR、 キアゲン社製） 10 〃Lを添加して混合し、 室温下 5〜10分保持した 後、 各ゥエルに添加した。 5%C02存在下 37 Cで 48時間から 72時間インキュベーション し、 細胞にそれそれの siRNAを導入した。
siRNAによる KLF5遺伝子の発現抑制は、 以下に示す RT- PCRにより確認した。 インキ ュベーシヨン終了後、 回収した細胞から、 細胞溶解液ホモジェナイズ用キットの QIA シュレッダ一 （QIAshredder、 キアゲン社製）および総 RNA精製用キットの RNイージー (RNeasy、 キアゲン社製） を用いて RNAを単離した。 単離した RNAを、 30〜50 〃Lの 注射用水 （大塚蒸留水、 大塚製薬株式会社製） で溶解し、 逆転写反応により cDNAを 合成した。 逆転写反応は、 上記の RNA溶液 （RNA 1 .0 〃g分） と、 5ズ緩衝液2.5 u 0.1 mol/L ジチオスレィ トール (DTT) 2.0 JUL 20 mmol/L dNTP (ロッシュ社製) 1.0 j 50 ^mol/L ランダムプライマ一 （宝酒造株式会社製） 2.0 zL、 ヌクレア —ゼ阻害剤スーパ一ァーゼ 'イン （SUPERase - In、 アンビオン社製） 1.0 〃Lおよび パワースクリプト （PowerScript) 逆転写酵素 （クロンテック社製） 1.0 Lを含む 溶液 l . Q /gを混合し、 合計 18 Lになるよう注射用水を加えた反応溶液で、 42°Cで 1.5時間実施した。 5 X緩衝液および DTTはパワースクリプト逆転写酵素に付属のも のを用いた。
, 配列番号 41および 42の配列それそれからなる 2本の DNAを化学合成し、 それそれマ ウス KLF5遺伝子特異的なフォワードプライマ一、 リバースプライマ一とした。 これ らのプライマ一を用いた PCRにより、 KLF5 cDNAから配列番号 49の 1268〜1428番目の 配列に相当する 161¾)の断片が増幅される。
10 >< ?0&緩衝液2. 5 〃L、 2.5 醒 ol/L dNTP (ロッシュ製） 2.0〃L、 5 ^mol/Lフォ ワードプライマー 2.0 〃L、 5 〃mol/:Lリバースプライマ一 2.0 〃L、 ホットスター夕 ヅク （HotStarTaq) DNAポリメラ一ゼ （キアゲン社製、 5単位/〃 L) 0.125 〃L、 18S rRNA特異的プライマ一 〔クォン夕 i A (QuantumRNA) クラシック 18S内部標準、 アン ビオン社製〕 2 〃L、 注射用水 13.375 cDNA 1.0 〃Lからなる 25 〃Lの PCR反応 溶液を調製し、 95°Cで 15分保持後、 熱変性 94°Cで 30秒間、 アニーリング 53°Cで 30秒 間、 伸長反応 72°Cで 40秒間の反応を 1サイクルとして、 28サイクルの PCRを実施し、 その後 72°Cで 10分間保持した。 10 XPCR緩衝液はホットス夕一夕ヅク DNAポリメラー ゼに付属のものを使用した。 反応後の溶液の 0.8%ァガロースゲル電気泳動により、 KLF5 m Aに由来する増幅産物（161bp )を検出し、 siRNAを導入しなかった細胞での増 幅産物の量と比較した。 内部標準として、 18S rRNAに由来する増幅産物 （488bp) を 用いた。 第 1図に示すように、 コントロールの SEAP- siRNAでは KLF5遺伝子の発現の 抑制が見られないのに対し、 KLF5遺伝子に特異的な、 siRNA No . 2、 No . 3、 No . 4、 No . 5および No . 6は、 KLF5遺伝子の発現を抑制することが確認できた。 中でも、 siRNANo. 3および siRNA No. 4は強く KLF5遺伝子の発現を抑制した。
' KLF5遺伝子に特異的な siRNAとして、 siRNA No. 1、 No. 4、 No. 7、 No. 8、 No. 9、 No. 10および No. 11を用いて、'上記と同様にして、 C3iVlOTl/2細胞への siRNAの導入 と、 RT- PCRによる KLF5遺伝子の発現の解析を行った。 第 2図に示すように、 コント ロールの SEAP-siRNAでは KLF5遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、 KLF5遺伝 子に特異的な、 siRNA No.4、 No. 7、 No. 8、 No. 9、 No. 10および No. 11は、 KLF5遺 伝子の発現を抑制することが確認できた。 中でも、 siRNA No. 4、 siRNA No. 7、 siRNA No. 9および siRNA No, 10は強く KLF5遺伝子の発現を抑制した。 KLF5遺伝子に 特異的であるにもかかわらず、 siRNA No. 1では抑制がみられなかった。 実施例 2 KLF5遣伝子特異的な siRNAによる、 KLF5により転写が活性化される遺伝子 の発現の抑制
( 1 ) PDGF- A遺伝子の発現の抑制
KLF5遺伝子に特異的な siRNAとして、 siRNA No. 1、 No. 4、 No. 7、 No. 8、 No. 9、 No. 10および No. 11を C3H 0T1/2細胞へ導入し、 RT-PCRにより、 KLF5により転写が 活性化される遺伝子である PDGF-A遺伝子の発現の解析を行った。
実施例 1 (2) と同様にして、 siRNAの C3H/10T1/2細胞への導入、 cDNAの調製を行 つた。 配列番号 43および 44の配列からなる 2本の DNAを化学合成し、 それそれ PDGF- A 遺伝子特異的なフォワードプライマ一およびリバースプライマ一とした。 これらの プライマ一を用いた PCRにより、 PDGF- A cDNAから 403bpの断片が増幅される。 PDGF-A 遺伝子特異的なフォワードプライマ一およびリバースプライマーを、 KLF5遺伝子特 異的なフォヮ一ドプライマ一およびリバ一スプライマーの代わりに用いて、 実施例 1 (2) の KLF5遺伝子の発現解析と同様にして、 PDGF- A遺伝子の発現を解析した。 ただし PCRは、 PCR反応溶液を 95°Cで 15分間保持後、 熱変性 94°Cで 30秒間、 ァニーリ ング 53°Cで 30秒間、 伸長反応 72°Cで 40秒間からなる反応を 1サイクルとし、 26サイ クル実施し、 その後 72PCで 10分間保持する条件で行い、 電気泳動は 1%ァガ口一スゲ ルで行った。
第 3図に示すように、 コントロールの SMP- siRMでは PDGF- A遺伝子の発現の抑制 が見られないのに対し、 KLF5遺伝子に特異的な、 siRNA No. 4、 No. 7、 No. 8、 No. 9、 No. 10および No. 11はく KLF5により転写が活性化される遺伝子である PDGF- A遺伝 子の発現をも抑制することが確認できた。 中でも、 siRNA No. 4、 siRNA No. 7、 siRNA No. 9および siRNA No.10は強く PDGF-A遺伝子の発現を抑制した。 KLF5遺伝子 に特異的であるにもかかわらず、 siRNA No. 1では抑制がみられなかった。
(2) SMemb遺伝子の発現の抑制
KLF5遺伝子に特異的な siRNAとして、 siRNA No. 1、 No. 4、 No. 7、 No. 8、 No. 9、 No. 10および No. 11を C3H八 0T1/2細胞へ導入し、 RT- PCRにより、 KLF5により転写が 活性化される遺伝子で る SMemb遺伝子の発現の解析を行った。
実施例 1 (2) と同様にして、 siRNAの C3H/10T1/2細胞への導入、 cDNAの調製を行 つた。 配列番号 45および 46の配列からなる 2本の DNAを化学合成し、 それそれ SMemb 遺伝子特異的なフォワードプライマ一およびリバースプライマ一とした。 これらの プライマ一を用いた PCRにより、 . SMemb cDNAから 235bpの断片が増幅される。 SMemb遺 伝子特異的なフォワードプライマ一およびリバースプライマ一を、 KLF5遺伝子特異 的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの代わりに用いて、 実施例 1 ( 2 ) の KLF5遺伝子の発現解析と同様にして、 SMemb遺伝子の発現を解析した。 ただ し PCRは、 PCR反応 液を 95°Cで 15分間保持後、 熱変性 94°Cで 30秒間、 アニーリング 53°Cで 30秒間、 伸長反応 72 Cで 40秒間からなる反応を 1サイクルとし、 26サイクル 実施し、 その後 72°Cで 10分間保持する条件で行い、 電気泳動は 1 %ァガロースゲ で TTつた。
第 4図に示すように、 コントロールの SEAP-siRNAでは SMemb遺伝子の発現の抑制が 見られないのに対し、 KLF5遺伝子に特異的な、 siRNA No . 4、 No . 7、 No . 8、 No . 9、 No . 10および No . 11は、 KLF5により転写が活性化される遺伝子である SMemb遺伝子の 発現をも抑制することが確認できた。 中でも、 siRNA No . 4、 siRNA No . Ί、 siRNA No . 9および siRNA No . 10は強く SMemb遺伝子の発現を抑制した。 KLF5遺伝子に特異 的であるにもかかわらず、 siRNA No . 1では抑制がみられなかった。
( 3 ) KLF5遺伝子特異的な siRNAによる遺伝子発現の抑制の特異性
KLF5遺伝子に特異的な siRNAによる遺伝子の発現の抑制が、 KLF5遺伝子および KLF5 により転写が活性化される遺伝子に特異的である,ことを、 KLF5遺伝子に特異的な siRNAを C3H八 0T1/2細胞へ導入し、 RT- PCRにより血清応答因子 （SRF) 遺伝子の発現 を解析することにより、 検証した。 SRF遺伝子は平滑筋細胞で多く発現する転写因子 の遺伝子であり、 KLF5により転写が活性化される遺伝子ではない。 ■
KLF5遺伝子に特異的な siRNAとして、 siRNA No . 1、 No . 4、 No . 7、 No . 9および No . 10を用いて、 実施例 1 ( 2 ) と同様にして、 siRNAを C3H/10T1/2細胞へ導入した後、 RT - PCRによる遺伝子発現の解析を行った。 配列番号 47および 48の配列からなる 2本 の DNAを化学合成し、 それそれ SRF遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリバ —スプライマーとした。 これらのプライマ一を用いた PCRにより、 SRF cDNAから 519bpの断片が増幅される。 SRF遺伝子特異的なフォワードプライマーおよびリパ一 スプライマ一を、 KLF5遺伝子特異的なフォワードプライマ一およびリバ一スプライ マーの代わりに用いて、 実施例 1 ( 2 ) の KLF5遺伝子の発現解析と同様にして、 SRF 遺伝子の発現を解析した。 ただし PCRは、 PCR反応溶液を 95°Cで 15分間保持後、 熱変 性 94°Cで 30秒間、 アニーリング 53°Cで 30秒間、 伸長反応 72°Cで 40秒間 らなる反応' を 1サイクルとし、 26サイクル実施し、 その後 72°Cで 10分間保持する条件で行い、 電気泳動は 1.2 %ァガロースゲルで行った。
第 5図に示すように、 KLF5遺伝子に特異的な、 siRNA No . 1、 siRNA No . 4、 No . 7、 No . 9および No . 10全てにおいて、 コントロールの SEAP- siRNAと同様に、 SRF遺伝子 の発現の抑制がみられなかった。 したがって、 KLF5遺伝子に特異的な siRNAは、 非特 異的に、 遺伝子全体の発現を抑制するのでなく、 KLF5遺伝子および KLFにより転写の 活性化をうける遺伝子の発現を特異的に抑制することが明らかとなつた。 実施例 3 s iRNAによるヒト KLF5遺伝子の発現抑制
実施例 1で作製した siRNA No . 4は、 マウス KLF5 cDNAの塩基配列 （配列番号 49) の 1303〜 1323番目の配列 （AAAAGCTCACCTGAGGACTCA) をもとにした siRNAであり、 C3H/10T1/2細胞においてマウスの KLF5遺伝子の発現を強く抑制した。 しかし、 この AAAAGCTCACCTGAGGACTCA の配列は、 ヒト KLF5 c環 Aの塩基配列 （配列番号 50) の 1481 〜1501番目にも存在するため、 siRNA No . 4はマウスだけでなくヒトの KLF5遺伝子の 発現も抑制することが期待される。 以下のようにして、 siRNA No . 4がヒト KLF5遺伝 子の発現も強く抑制をすることを確認した。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞 （HUVEC、 入手先：三光純薬、 製品番号： CC- 2517) を約 3 X 105個となるように 6 cmディッシュ （コ一ニング社） に播種した。 200 pmolの siRNA No . · 4および SEAP- siRNAそれそれに、 細胞内導入試薬 （リボフヱクトァミン 2000、 インビトロジヱン社製） 10 〃Lを添加して混合し、 室温下 20分保持した後、 全量を各ディッシュに添加した。 5% C02存在下 37 °Cで 24時間インキュベーションし、 細胞にそれそれの siRNAを導入した。
実施例 1 ( 2 ) に記載した方法と同じ方法で、 細胞から RNAを単離し、 RT-PCRによ るヒト KLF5遺伝子の発現抑制を調べた。 なお、. KLF遺伝子特異的なフォワードプライ マー、 リバースプライマ一としては、 実施例 1で用いた配列番号 41および 42それぞ れの配列からなる DNAを用いた。 これらのプライマーを用いた PCRにより、 ヒト KLF5 cDNAから配列番号 50の 1446〜1606番目の配列に相当する 161bpの断片が増幅される。 反応後の溶液の 0.8%ァガロースゲル電気泳動により、 KLF5 mRNAに由来する増幅産 物（161bp)を検出し、 siRNAを導入しなかった細胞での増幅産物の量と比較した。 内 部標準として、 18S rRNAに由来する増幅産物 （488bp) を用いた。 第 6図に示すよう に、 コントロールの SEAP-siRNAでは KLF5遺伝子の発現の抑制が見られないのに対し、 KLF5遺伝子に特異的な、' siRNA No . 4は、 ヒトさい帯血管内皮細胞の KLF5遺伝子の発 現を抑制していた。 したがって、 siRNA No . 4はマウスの KLF5遺伝子だけでなく、 ヒ トの KLF5遺伝子の発現も強く抑制できることが確認された。
第 2表に、 実施例 1でマウス KLF5遺伝子の発現を抑制した siRNA No . 2〜4および 7 〜11において、 設計のもとにしたマウス KLF5 cDNA上の 21塩基の配列および配列番号 49におけるその位置と、 該マウス配列に対応するヒト cDNA上の 21塩基の配列、 配列 番号 50におけるその位置、 該ヒト配列から 5 '端の AAを除いた RNAの配列を表す配列番 号を示した。 なお、 siRNA No . 5および 6は、 非コード領域の配列をもとにしている ため、 対応するヒト配列は示さなかつ 。 これらのヒト配列を'もとにした二本鎖 RNA もヒト KLF5遺伝子の発現を抑制すると考えられる。 なお、 siRNA No . 4、 8および 10 は、 対応するヒト配列がマウス配列と全く同じであり、 siRNA No . 8および 10は、 siRNA No . 4と同様に、 マウス KLF5遺伝子だけでなくヒト KLF5遺伝子の発現を抑制す ると考えられた。 。 マウス KLF5 cDNA ヒト KLF5 cDNA siRNA
So夕1」 番 配列 位置 対応する配列 位置
番号
No . 2 AAATTTACCTGCCACTCTGCC 1156-1176 AAATTTACCCACCACCCTGCC 1334-1354 12
No . 3 AAGGAGTAACCCGGATCTGGA 1216-1236 AAGGAGTAACCCCGATTTGGA 1394-1414 13
No . 4 AAAAGCTCACCTGAGGACTCA 1303-1323 AAAAGCTCACCTGAGGACTCA 1481-1501 4
No . 7 AAATGGAGAAGTATCTGACCC 405-425 AAATGGAGAAGTATCTGACAC 583-603 14
No . 8 AAAGTATAGACGAGACAGTGC 463-483 AAAGTATAGACGAGACAGTGC 641-661 8
No . 9 AAACCAGACGGCAGTAATGGA 874-894 AAATCAGACAGCAGCAATGGA 1040-1060 15
No . 10 AAGCTCAGAGCCTGGAAGTCC 2048-2068 AAGCTCAGAGCCTGGAAGTCC 1226-1246 10
No . 11 AAGCCGTTCCAGTGCATGGTG 1424-1444 AAGCCCTTCCAGTGCGGGGTG 1602-1622 16 実施例 4 KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNAによる血管内皮細胞の遊走の阻害
KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNA No . 4の、 血管内皮細胞の遊走に対する阻害を、 以下に示すような微小孔フィル夕一を用いた血管内皮細胞のインビトロ細胞遊走試 験 （J . Cell Biol . , 147 , 1073-1084 , 1999 ; Becton, Dickinson and Company, Technical Bul letin, 429 , 薦) により調べた。
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞 （HUVEC、 入手先：三光純薬、 製品番号： CC- 2517) を約 3 X 105個となるように 6 cmディッシュ （コ一ニング社） に播種した。 siRNA No . 4およびコントロールの SEAP- siRNAそれそれ 200 pmolに 10 /Lの細胞内導入試薬 （リ ポフエクタミン 2000， インビトロジェン社製） を添加、 混合し、 室温下 20分インキ ュぺ一シヨンした後、 全量をディッシュに添加した。 5 % C02存在下 37°Cで 18時間ィ ンキュぺーシヨンし、 siRNAを導入した。
siRNA導入細胞を洗浄後、 5 g/mLの生細胞染色用蛍光色素 （力ルセイン AM、 同 仁化学社製） で細胞を蛍光標識した。 得られた蛍光標識細胞は、 トリプシンで細胞 を剥離、 洗浄後、 細胞濃度 5 X 105個/ mLになるように血管内皮細胞用基礎培地 （EBM- 2、 三光純薬社製） で再懸濁した。！ HTSフルォロブロック個別型インサート （24ゥエルプ レート用ポアサイズ インサート、 BDファルコン） を 24ゥエルセルカルチャーィ ンサート用プレート （BDファルコン） に取り付けた後、 インサート側には蛍光標識 細胞の懸濁液 100 〃Lを、 24ゥヱルプレート側には 10 ng/mLのヒト VEGF ( Rアンド D システムズ社製） を含有する血管内皮細胞用増殖培地 （ブレツトキット EGM-2、 三光 純薬製） 600 〃Lをそれそれ添加した。
添加後 4時間まで、 経時的にフィル夕一の微小孔を遊走してきた細胞をプレート 底から蛍光顕微鏡で観察および撮影した。 得られた画像から、 画像解析ソフトウヱ ァ （Scion Image、 Scion社製） を用いて、 遊走細胞数を計測した。 第 7図に示すよ うに、 コントロールの SEAP-siRNAと比較して、 KLF5遺伝子特異的な si'RNA No . 4を導 入した血管内皮細胞では、 遊走細胞数が低下した。 したがって、 KLF5遺伝子の発現 を抑制する siRMにより、 血管内皮細胞の遊走を阻害できることが確認された。 実施例 5 KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNAのィンビボでの血管新生阻害効果
KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNA No . 4のインビボでの血管新生阻害効果を、 以 下に示すようなマトリゲル （Matrigel ) を用いたァヅセィ （Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 94 , 13612-13617, 1997 ; J . Biol . Chem. , 277, 6667-6675 , 2002〕 により調 ベた。
マトリゲル混合物は、 マトリゲルマトリックス (BD バイオサイエンス製) 0.5 mL (5 mg量） にマウス VEGF 〔Rアンド Dシステムズ社 （R & D Systems Inc . ) 製、 力夕ログ番号 493- MV〕 0.6 j g, ゥシ塩基性線維芽細胞増殖因子 （bFGF、 Rアンド D システムズ社製、 カタログ番号 133-FB) 0. 6 〃gおよび siRNA No . 10 gを加え、 氷上でピぺヅティングにより混合して調製した。 コントロールとして、 siRNA No . 4 の代わりに SEAP- siRNAを用いたマトリゲル混合物も調製した。 調製したマトリゲル 混合物を 6週齢のォスの C57BL/6マウスの背中の皮下に注射した。 注射 14日後にゲル 化したマトリゲルを取り出した。 取り出したマトリゲルを PBSで 1回洗浄し、 10%ホ ルムアルデヒドー PBS溶液で固定した。 固定したマトリゲルを 5 mm厚にカヅ トしてパ ラフィンに包埋し、 通常の組織学的手法を使用して切片化し、 へマトキシリンーェ ォジンで染色した。 染色したマトリゲル切片を顕微鏡で観察した。
その結果、 コントロールの SEAP- siRNAを加えたマトリゲルでは、 マトリゲルに添 加した VEGFおよび bFGFに反応して、 多数の血管内皮細胞が遊走して、 マトリゲル内 に浸潤しているのに対し、 siRNA No . 4を加えたマトリゲルではマトリゲル内への血 管内皮細胞の浸潤が抑制されていた。 したがって KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNA により、 血管新生が阻害できることが確認された。 実施例 6 KLF5遺伝子の発現を抑制する siRNAのインビボでの抗腫瘍効果
KLF5遺伝子の発現を抑制する si丽 A No . 4のインビボでの抗腫瘍効果を、 以下のよ うに腫瘍の増殖抑制を指標にして調べた。
ォス 5週齢の C57BL/6マウスの背中の皮下に、 マウスルイス肺ガン細胞株 LL/2 (入 手先：大日本製案株式会社、 カタログ番号： 09-1642) を 1 X 106個注射した。 注射 2 日後、 ルイス肺ガンが固定されているのを確認し、 ガン周辺皮下に siRNA No . 4を注 射した。 コントロールとして SEAP- siRNAを同様にガン周辺に皮下投与した。 siRNA No . 4および SEAP- siRNAの投与量はマウス 1匹あたり 1 〃gを 50 /Lの注射用水 （大塚 ' 蒸留水、 大塚製薬株式会社製） で溶解したものを用い、 投与期間は連続 8日間、 投 与回数は 1日 1回で行った。 投与開始後の腫瘍の体積を下記式 '（1 ) を用いて算出 し、 腫瘍体積の増加をコントロールと比較した。
式 （1 ) ：腫瘍体積 （腿3) = {腫瘍長さ（腿） X腫瘍幅 (匪) 2}/ 2
その結果、 第 8図に示すように、 コントロールの SEAP- siRNAを投与したマウスで の腫瘍体積は、 投与開始より増加していくのに対し、 siRNA No .4を投与したマウス の腫瘍体積の増加は投与後 1日目より抑制された。 したがって KLF5遺伝子の発現を抑 制する siRNAはィンビボでの抗腫瘍効果を有し、 投与により腫瘍の増殖を抑制できる ことが確認された。 「配列表フリーテキスト」 、
配列番号 1一発明者：永井良三；眞鍋一郎；石原淳
発明者：鳥取恒彰
配列番号 17— siRNA No. 1 センス鎖
配列番号 18— siRNA No. 1 アンチセンス鎖'
配列番号 19— siRNA No. 2 センス鎖
配列番号 20— siRNA No. 2 アンチセンス鎖
配列番号 21— siRNA No. 3 センス鎖 .
配列番号 22— siRNA No. 3 アンチセンス鎖
配列番号 23— siRNA No. センス鎖
配列番号 24— siRNA No. 4 アンチセンス鎖
配列番号 25— siRNA No. 5 センス鎖
配列番号 26— siRNA No. 5 アンチセンス鎖 '
配列番号 27— siRNA No. 6 センス鎖 ·
配列番号 28— si A No. 6 アンチセンス鎖
配列番号 29— siRNA No. 7 センス鎖
配列番号 30— siRNA No. 7 アンチセンス鎖
配列番号 31— siRNA No. 8 センス鎖
配列番号 32— siRNA No. 8 アンチセンス鎖 ,
配列番号 33— siRNA No. 9 センス鎖
配列番号 34— siRNA No. 9 アンチセンス鎖
配列番号 35— siRNA No. 10 センス鎖
配列番号 36— siRNA No. 10 アンチセンス鎖
配列番号 37— siRNA Ν,ο. 11 センス鎖
配列番号 38— si請 A No. 12 アンチセンス鎖
配列番号 39— siRNA- SEAP センス鎖
配列番号 40— siRNA- SEAP アンチセンス鎖
配列番号 41— KLF5遺伝子特異的フォヮ一ドプライマ一
配列番号 42— KLF5遺伝子特異的リバースプライマー
配列番号 43— PDGF- A遺伝子特異的フォヮ一ドプライマ一
配列番号 44— PDGF- A遺伝子特異的リバースブラィマー
配列番号 45— SMemb遺伝子特異的フォワードプライマ一
配列番号 46— SMemb遺伝子特異的リバースブラィマ一
配列番号 47— SRF遺伝子特異的フォワードプライマー
配列番号 48—SRF遺伝子特異的リバースブラィマ一

Claims

請求の範囲
I . LF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列および該配列と相補的な配列を含み、 KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA。
2 . KLF5 mRNAがヒトまたはマウスの KLF5 mRNAである、 請求項 1に記載の RNA。
3 . RNAが、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列の鎖および該配列と相補的な 配列の鎖からなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3 '端に 1〜 6個のヌクレオチドを付カロ した二本鎖 RNAである、 請求項 1または 2に記載の RNA。
'
4 . RNAが、 KLF5 mRNAの連続する 15〜30塩基の配列からなる RNAおよび該配列と相 ' 補的な配列からなる RNAを、 スぺ一サ一オリゴヌクレオチドでつなぎ、 3 '端に 1〜6 個のヌクレオチドを付加した、 ヘアピン構造を形成する RNAである、 請求項 1または 2に記載の履 A。
5 . 以下の（ a )〜（ c )からなる群から選ばれる KLF5遺伝子の発現を抑制する RNA。
( a ) 配列番号 2〜16のいずれか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖 からなる二本鎖 RNAのそれそれの鎖の 3 '端に 2〜 4個のゥリジル酸またはデォキシチ ミジル酸を付加した二本鎖 RNA。
( b ) 配列番号 2〜16のいずれか 1つの配列からなる RNAおよび該配列と相補的な配 列からなる RNAを 2個のゥリジル酸またはデォキシチミジル酸を 5 '端に有するスぺ一 サーォリゴヌクレオチドでつなぎ、 3 '端に 2〜 4個のゥリジル酸またはデォキシ体 チミジル酸を付加した、 ヘアビン構造を形成する RNA。
( c ) 配列番号 2〜11のいずれか 1つの配列の鎖および該配列と相補的な配列の鎖 からなる二本鎖 RNAのそれそれの龥の 3 '端に 2個のゥリジル酸を付加した二本鎖 RNAC
6 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の RNAを発現するベクター。
7 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の RNAまたは請求項 6に記載のベクタ一を 細胞に導入
することにより、 該細胞中の KLF5遺伝子の発現を抑制する方法。
8 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の RNAまたは請求項 6に記載のベクターを 細胞に導入することにより、 該細胞中の KLF5により転写が活性化される遺伝子の発 現を抑制する方法。
9 . KLF5により転写が活性化される遺伝子が血小板由来増殖因子 A鎖遺伝子また は平滑筋ミオシン重鎖 SMemb遺伝子である請求項 8に記載の方法。
1 0 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の RNAまたは請求項 6に記載のベクター を有効成分として含有する医薬組成物。
I I . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の Aまたは請求項 6に記載のベクタ一 を有効成分として含有する、 血管新生を阻害するための医薬組成物。
1 2 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の Aまたは請求項 6に記載のベクター を有効成分として含有する、 心血管系疾患もしくは癌の治療薬または予防薬。
1 3 . 心血管系疾患が動脈硬化、 冠動脈ィン夕ーペンション後の再狭窄または心 肥大である請求項 1 2に記載の治療薬または予防薬。
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