CN104830863A - 一种抑制FABP4基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制FABP4基因表达的siRNA，所述的siRNA序列为：正义链：5’-CGACCACAAUAAAGAGAAA-3’反义链：5’-UUUCUCUUUAUUGUGGUCG-3’。本发明针对FABP4基因，设计了三对siRNA序列，通过细胞转染实验筛选出一条可以有效下调目的基因表达的siRNA；根据所筛选的siRNA-368序列，构建了相应的慢病毒表达载体；通过高脂肥胖小鼠转染及抑制小鼠内脏脂肪组织FABP4基因表达实验，证实本发明所筛选的siRNA能有效抑制小鼠FABP4基因表达，降低高脂肥胖小鼠的体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平。

Description

一种抑制FABP4基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种抑制FABP4基因表达的siRNA及其在制备减肥、降脂或降糖的药物中的应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象，是生物体在进化过程中抵御外界病毒等感染和维持基因组稳定性的一种保护型机制。当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅疾产生反应，其胞质中RNaseIII核酶家族的Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(即siRNA)。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义和反义链，而反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC与外源性基因表达mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA依赖的RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。RNAi技术具有高度的特异性，与传统的反义RNA技术相比，RNAi技术的沉默效率更高、效果更好，而慢性病毒载体介导的RNAi技术则可以提供长期的基因表达抑制，RNAi作为一种崭新的技术手段，为基因功能、基因表达调控、基因治疗等方面的研究提供了一个全新的方法及其理论基础。

使用RNAi治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相关的基因序列，设计和制备与这些基因序列具有同源性的小干扰RNA(siRNA)，然后通过某种方式将siRNA转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默，从而达到治疗目的。直接转染合成的siRNA能特异性抑制动物细胞内同源基因的表达，但是细胞内siRNA很容易降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干扰。而慢病毒载体在动物细胞内感染效率高，免疫原型低，既能干扰分裂期的细胞又能感染非分裂期的细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类动物细胞内长期稳定地表达siRNA，抑制相关基因表达，因此该方法具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点。在siRNA设计的过程中，不同位点的siRNA对基因的抑制作用不同，siRNA的抑制效率与基因的设计位点密切相关。因此，寻找最合适的siRNA对于RNA干扰的应用至关重要。

脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins，FABPs)是一系列脂质伴侣蛋白，其蛋白中央空腔可以结合长链脂肪酸及其它一些疏水性配体。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)是细胞内FABPs家族成员之一。早期研究发现，FABP4的基本功能包括以非共价方式和可逆性结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸的代谢和转运；FABP4能够可逆性结合饱和及不饱和长链脂肪酸，促进脂肪酸代谢和转运；脂肪细胞分化过程中FABP4的表达及活性显著增强，是脂肪细胞分化的标志物之一。此外，FABP4在其他生物学过程中尤其是代谢综合征的许多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪饮食诱导的动脉粥样硬化发展，在巨噬细胞中诱导FABP4高表达会促进泡沫细胞形成，表明FABP4在动脉粥样硬化的发展中也具有重要作用。

中国专利文献201010127886.8，公开了一组能有效下调PRDM1β表达的siRNA分子及其应用，所述的siRNA能有效下调淋巴瘤细胞中PRDM1β。中国专利文献201410541314.2公开了一种抑制S100A8基因表达的siRNA，所述的siRNS能降低S100A8基因的表达。中国专利文献CN201410474752.1公开了一种抑制奶牛EEF1D基因表达的siRNA，该siRNA能有效降低奶牛EEF1D基因的表达量。中国专利文献CN201110107036.6公开了一种抑制caspase-3基因表达的siRNA，将所述的siRNA进入到神经细胞时，可以显著提高神经细胞的活力，明显减少神经细胞凋亡相关基因caspase-3基因的表达。但是关于能有效抑制FABP4基因表达的siRNA，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种能有效抑制FABP4基因表达的siRNA。

本发明的再一的目的是，提供一种DNA分子。

本发明的另一的目的是，提供一种重组慢病毒表达载体。

本发明的第四个目的是，提供一种慢病毒。

本发明的第五个目的是，提供上述siRNA、DNA分子、重组慢病毒表达载体、慢病毒的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种抑制FABP4基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列为：

正义链：5’-CGACCACAAUAAAGAGAAA-3’

反义链：5’-UUUCUCUUUAUUGUGGUCG-3’。

所述的抑制FABP4基因表达的siRNA序列3’端垂悬有dTdT。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子序列为：

正义链：5’-GATCCGCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTTTTTTG-3’

反义链：5’-AATTCAAAAAAGCGACCACAATAAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCGCG-3’。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

包含如上所述DNA分子的重组慢病毒表达载体。

所述重组慢病毒表达载体是将权利要求3所述的DNA分子插入载体质粒的BamHI和EcoR I位点间得到。

所述的载体质粒为LV3穿梭质粒。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种慢病毒，由如上所述的重组慢病毒表达载体和病毒包装系统共转染病毒包装细胞得到。

所述病毒包装系统含有pGag/Pol，pRev和pVSV-G。

所述病毒包装细胞为293T细胞。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的siRNA、DNA分子、重组表达载体、慢病毒在制备减肥药物中的应用。

如上所述的siRNA、DNA分子、重组表达载体、慢病毒在制备抑制糖化血红蛋白和/或总胆固醇水平的药物中的应用。

一种抑制小鼠FABP4基因表达的方法，是将本发明提供的siRNA、DNA分子(即实施例的shDNA模板序列)、慢病毒转染表达FABP4基因的细胞。所述的细胞为3T3-L1前脂肪细胞。

本发明所提供的siRNA还用于制备与FABP4基因相关的疾病的治疗药物，即通过本发明提供的siRNA、DNA分子(即实施例的shDNA模板序列)、慢病毒的使用达到降低受体的FABP4基因表达后，对相关疾病的治疗有一定/显著效果的产品、方法或用途都在本发明的保护范围以内。

本发明优点在于：

本发明针对FABP4基因，设计了三对siRNA序列，通过细胞转染实验筛选出一条可以有效下调目的基因表达的siRNA。根据所筛选的siRNA-368序列，构建了相应的慢病毒表达载体，通过高脂肥胖小鼠转染及抑制小鼠内脏脂肪组织FABP4基因表达实验，证实本发明所筛选的siRNA、构建的慢病毒能有效抑制小鼠FABP4基因表达，降低高脂肥胖小鼠的体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的水平。

附图说明

附图1为siRNA转染脂肪细胞的荧光显微摄片。

附图2为siRNA慢病毒载体测序结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

针对靶基因的siRNA设计是实现基因沉默的重要前提，目前有许多设计软件可以完成此项工作，但并不是所有的siRNA都具有抑制作用，且不同siRNA抑制基因的表达效果也各不相同。

实施例1 抑制FABP4基因表达的siRNA合成

本发明以GeneBank基因库中FABP4已知序列为基础，按照siRNA设计原则，设计了三对siRNA序列，经细胞学干预、荧光定位和RT-PCR基因检测等试验，验证了以下序列能够显著抑制FABP4基因的表达。本发明设计的三对siRNA序列分别为(委托genepharma生物公司合成)：

siRNA-309：

正义链：5’-GAGCAUCAUAACCCUAGAUtt-3’

反义链：5’-AUCUAGGGUUAUGAUGCUCtt-3’

siRNA-368：

正义链：5’-CGACCACAAUAAAGAGAAAtt-3’

反义链：5’-UUUCUCUUUAUUGUGGUCGtt-3’

siRNA-432：

正义链：5’-CGACCACAAUAAAGAGAAAtt-3’

反义链：5’-UUUCUCUUUAUUGUGGUCGtt-3’

阴性对照序列为:

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3’

购自上海吉玛制药有限公司(产品编号D01001)。

siRNA序列3’端垂悬有dTdT。

实施例2 细胞培养及转染抑制FABP4基因的表达试验

一、细胞培养

(1)3T3-L1前脂肪细胞株的复苏

从液氮中取出细胞株，立即置37℃水浴，快速振荡复苏约1.5-2min。将复苏的细胞加入装有5ml培养液的50ml离心管中，室温离心4min、900rpm。倾倒弃上清，再加入5ml培养液，在显微镜下观察细胞形态和数目。置于5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养，24h后换液。本发明所用的3T3-L1前脂肪细胞株由上海市瑞金医院内分泌科实验室惠赠。

(2)3T3-L1前脂肪细胞株的培养与传代

显微镜下观察细胞已贴壁，呈梭形、透亮，换培养液。长满80％时传代。将培养液倾出，加入新鲜PBS 4-5ml清洗，弃去PBS液。加入消化液1ml进行消化，轻轻转动，于37℃2min，用滴管吹打，使细胞重悬，用移管吸入50ml离心管中，900rpm离心4-5min，沉淀细胞。倾去上清，再加入培养液，用滴管吹打，使细胞分散。取部分含细胞的培养液加入培养瓶中，于5％CO₂的培养箱中37℃培养。

(3)3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化

将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10％小牛血清的高糖DMEM培养液在37℃、5％CO₂培养。待细胞融合2天后，加含0.5mM异丁基-甲基-黄嘌呤、1μM地塞米松和10μg/ml胰岛素的10％小牛血清高糖DMEM培养48h。换以含1μg/ml胰岛素的10％小牛血清高糖DMEM培养液在培养48h，随后以10％小牛血清高糖DMEM继续培养，2天换培养液一次，诱导分化8-12天的3T3-L1细胞90％多呈脂肪细胞表型。

二、细胞转染

转染前24h用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化3T3-L1细胞，以1×10⁶个细胞/孔铺12孔板，并更换不含血清的DMEM培养基。取2μl/孔Lipofectamine2000，使用前轻轻摇匀，用100μ10MEN稀释后再室温孵育5min。取4μL FAM-siRNA(荧光基团标记的标记的siRNA)，用100μ10MEN稀释，轻轻混合均匀。将稀释后的Lipofectamine2000和siRNA轻轻混合，室温静置20min，以形成FAM-siRNA-转染试剂混合物。12孔板中每孔加入转染液200μl、不含血清的细胞培养液800μl。置于5％CO₂的培养箱中37℃孵育4-6小时。

三、荧光显微镜摄片

保持实验环境尽量避光，在荧光显微镜下观察siRNA转染情况，如图1所示，细胞内有明显的绿色荧光，表明目的基因siRNA已转染至3T3-L1细胞。

实施例3 RT-PCR实验检测FABP4基因表达

siRNA转染至细胞后，在5％CO₂的培养箱中37℃孵育48小时。Trizol法提取细胞总RNA，反转录至cDNA。

委托上海生物工程公司合成FABP4引物，引物序列：

FABP4-F：CATGGCCAAGCCCAACAT

FABP4-R：CGCCCAGTTTGAAGGAAATC

RT-PCR体系如下：

成分	体积
		2×SYBR Green Mix	10ul
FABP4引物Mix	1ul
		cDNA	2ul
ddH2O	7ul
		总体积	20ul

分装至AXYGEN PCR8连管，微型离心机瞬时离心混匀。将上述样品放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪，SYBR Green法荧光定量PCR以分析各基因的表达，PCR程序设置如下：

应用ABI 7500实时定量PCR仪进行反应，采用三步法循环条件：

数据分析：△△Ct法进行各组表达的相对定量。两样本t检验方法检验两组间的差异。细胞感染分为四组，其中阴性对照组的siRNA为实施例1的阴性对照序列；siRNA-309组、siRNA-368组、siRNA-432组的siRNA分别为实施例1的siRNA-309、siRNA-368、siRNA-432序列，实验结果见表1。

表1 FABP4基因相对表达量数据结果

样品	t	p
			阴性对照组	5.450909
siRNA-309组	5.95864	0.808208
			siRNA-368组	1.974754	0.015337*
siRNA-432组	3.937345	0.415618

注：其中*表示与阴性对照组相比，具有统计学差异。

从表1的结果可以看出，相较于阴性对照组，siRNA-368组与siRNA-432组细胞中目的基因的表达量都降低了，而siRNA-368组表达量降低最为明显。因此，编号siRNA-368即为所筛选FABP4基因的目的siRNA。

实施例4 包载siRNA慢病毒的制备

根据实施例3所筛选的siRNA-368序列，设计siRNA-368对应的带有环状结构的DNA序列(即对应siRNA的shDNA，其两条互补链中间由一个不能互补的5-6bp的单链连接，shRNA由对应的DNA序列转录形成，转录后的RNA单链通过碱基互补及形成茎环结构，中间不互补的地方形成环，以此形成shRNA)。

shDNA模板序列：

S：5’-GATCCGCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTTTTTTG-3’

A：5’-AATTCAAAAAAGCGACCACAATAAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCGCG-3’

其中正向序列从5’至3’依次为BamHI酶切位点+靶序列+茎环结构+靶序列+RNA poly III聚合酶转录终止位点+EcoR I酶切位点。

转录产物RNA序列：

GCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTT

测序结果：

TTAATCTGAATAATAAGATGACATGAACTACTACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTGAAAGGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCTTAAGCAGTGGGTTCCCTAGTTAGCCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTAGAAGCAAAAAGCAGAATCGAAGAATTCAAAAAAGCGACCACAAT AAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCGCGGATCCAAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCCAATTCTTGACATCGTTGGGAGTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAAGTGGCTAAGATCTACAGCTGCCTTGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTACCAGGCGGGGAGGCGGCCCAAAGGGAGATCCGACTCGTCTGAGGGCGAAGGCGGAGACGCGGAAGAGGCCGCAGAGCCGGCAGCAGGCCGCGGGAAGGAAGGTCCGCTGGATTGAGGGCCGAAGGGACGTAGCAGAAGGACGTCCCGCGCAGAATCCAGGTGGCAACACAGGCGAGCAGCCAAGGAAAGGACGATGATTTCCCCGACACACCACGGAATTGTCAGTGCCCAACAGCCGAGCCCCTGTCCAGCAGCGGGCAGGCAGGCGGCGATGAGTTCCGCCGTGCATAGGGAGGGGGAAGCGAAAGTCCCGGAAAGGAGCTGACAGTGTGGCATGCCCCACCAGTGGGGGTGCGTCAGCAAACCACAGGGCACCACCCACGCCACGTG

本发明所用的siRNA慢病毒载体由吉玛基因公司合成，主要步骤如下：用BamHI和EcoR I双酶切LV3穿梭质粒(上海上海吉玛制药技术有限公司，商品号：D01001)，得到载体大片段；将上述shDNA模板序列与载体大片段连接，得到重组穿梭质粒；测序正确后将重组穿梭质粒与pGag/Pol，pRev，pVSV-G一起转染293T细胞，包装慢病毒颗粒，得到包载siRNA的慢病毒。

测序结果如图2所示。

实施例5 高脂肥胖小鼠转染及抑制小鼠内脏脂肪组织FABP4基因表达实验

1、高脂肥胖小鼠模型的建立

对6周龄雄性C57bl6小鼠，给予60％高脂饲料，并置于21℃恒温及21h昼夜周期环境饲养。每周测量并记录小鼠体重。于第14周分别注射包载实施例4所制备的siRNA的慢病毒、空载慢病毒(由上海吉玛制药技术有限公司提供)，每只注射计量为100μl、含病毒10⁸TU，一周后重复注射，并分别于第16、18周断颈处死小鼠，收集血液及肝脏、内脏脂肪等脏器标本。

2、小鼠内脏脂肪组织组织FABP4基因的表达

提取小鼠内脏脂肪组织总RNA，将所提取的mRNA逆转录至DNA。采用RT-PCR法检测内脏脂肪组织中FABP4基因的表达水平，结果如表2所示。

表2 小鼠内脏组织FABP4基因表达量实验结果

样品	t	p
			空载慢病毒对照组	0.835288
siRNA干预2周	0.29712	0.000262*
			siRNA干预4周	0.357997	0.001101*

注：其中*表示与空载慢病毒对照组相比，具有统计学差异。

从表2可以看出，转染含siRNA-368的慢病毒载体后，肥胖、糖尿病小鼠内脏脂肪组织中FABP4基因表达量均明显低于空载慢病毒对照组。

3、siRNA干预高脂肪肥胖小鼠的体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯实验

小鼠体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等指标委托长海医院检验科检测。具体方法如下：取6周龄雄性C57bl6小鼠，将其分为普食组与高脂饲料组，其中高脂饲料组小鼠给予60％高脂饲料喂养，普食组小鼠给予普通饲料喂养。饲养后于第14周将普食组与高脂饲料组随机分为对照组和干预组，干预组小鼠给予注射实施例4所制备的siRNA的慢病毒，对照组小鼠给予注射空载慢病毒(由吉玛基因公司提供)，给药注射后送至长海医院检验科检测各组小鼠体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯情况，并进行统计分析，结果如表3所示。

表3 siRNA干预前后各组小鼠体重及糖脂代谢指标变化

注：其中*表示与对照组相比，具有统计学差异。

从表3可以看出，经siRNA干预4周后，与对照组小鼠相比，高脂肪肥胖小鼠的体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇明显下降，差异具有统计学意义，而高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯的水平也有一定程度的降低。本发明首次通过siRNA干扰技术抑制高脂肥胖小鼠FABP4基因表达，使得小鼠的体重、糖化血红蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等明显下降。为发明和研制降糖、调脂新药打好了坚实理论和实验基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抑制FABP4基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA序列为：

正义链：5’-CGACCACAAUAAAGAGAAA-3’

反义链：5’-UUUCUCUUUAUUGUGGUCG-3’。

2.根据权利要求1所述的抑制FABP4基因表达的siRNA，其特征在于，所述的抑制FABP4基因表达的siRNA序列3’端垂悬有dTdT。

3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子序列如下所示：

正义链：5’-GATCCGCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTTTTTTG-3’

反义链：5’-AATTCAAAAAAGCGACCACAATAAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCGCG-3’。

4.含权利要求3所述DNA分子的重组慢病毒表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组慢病毒表达载体，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体是将权利要求3所述的DNA分子插入载体质粒的BamHI和EcoR I位点间得到。

6.根据权利要求5所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述的载体质粒为LV3穿梭质粒。

7.一种慢病毒，其特征在于，由权利要求4-6任一所述的重组慢病毒表达载体和病毒包装系统共转染病毒包装细胞得到。

8.权利要求1所述的siRNA、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4-6任一所述的重组表达载体、权利要求7所述的慢病毒在制备抑制FABP4基因表达的产品中的应用。

9.权利要求1所述的siRNA、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4-6任一所述的重组表达载体、权利要求7所述的慢病毒在制备减肥药物中的应用。

10.权利要求1所述的siRNA、权利要求3所述的DNA分子、权利要求4-6任一所述的重组表达载体、权利要求7所述的慢病毒在制备抑制糖化血红蛋白和/或总胆固醇水平的药物中的应用。