JP4982757B2

JP4982757B2 - ｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子

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Publication number: JP4982757B2
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Description

本発明は、ｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子に関する。

発癌のメカニズムにおいて極めて重要な役割を果たすと考えられる酵素テロメレースに関しては、テロメレース逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）とＲＮＡテープ（ｈＴＲ）が主要なテロメレース酵素発現の調節因子であることが知られており、多くの研究がなされている。しかし、テロメレース発現と発癌とを結びつける直接的メカニズムは依然として明確ではない。ゲノム内の多くの因子が関与していると予想されるが、テロメレース活性化のメカニズムも複雑であり、さらなる未知の因子が存在することが想定されている。

また、２０００年以降、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる小さなＲＮＡの役割が注目され、この役割解明がこれまでに類をみないぐらい激しい国際競争となった。注目すべきことにｍｉＲＮＡがヒト細胞の運命を決定する重要な役割を担っているにもかかわらず、発癌（特にテロメレース）に関与するＲＮＡ遺伝子およびそのｍｉＲＮＡがヒト細胞はまだ知られていない。

また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定の遺伝子の発現をブロックする効率的なテクノロジーとして注目されている。ＲＮＡｉテクノロジーを用いることにより、研究者は研究したい遺伝子の発現を抑制することができる。これにより、その遺伝子の発現しない状態での細胞表現型を調べ、遺伝子機能を解析することができる。

当初、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａやＣ．Ｅｌｅｇａｎｓのような無脊椎動物に長い２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を導入することにより、ＲＮＡｉは特定の遺伝子の発現を低下させる強力な方法であることが明らかになった。現在では、改良されたＲＮＡｉノックダウン法を利用して哺乳類動物細胞を含む真核細胞を分析できる。

従来のＲＮＡｉテクノロジーとしては、例えば、特表２００２−５１６０６２号公報に記載されたものがある。このＲＮＡｉテクノロジーでは、ターゲットとなる遺伝子と相同配列のＲＮＡおよびその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡによるターゲット遺伝子の不活性化を行う。なお、この文献には、用いるＲＮＡ配列は最低５０塩基必要である旨記載されている。また、この文献に記載されている実験例は、線虫を用いたものである。

また、従来のＲＮＡｉテクノロジーとしては、例えば、特表２００３−５２９３７４号公報に記載されたものがある。このＲＮＡｉテクノロジーは、ＲＮＡｉを誘導するためにｓｉＲＮＡを用いる。この文献には、（１）ｓｉＲＮＡの構造上の特徴、（２）ＲＮＡｉ活性があるショウジョウバエ胚細胞の抽出液中で（その中のＤｉｃｅｒ活性を用いて）約２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡを生成させる方法、（３）ｓｉＲＮＡを化学合成すること、（４）ｓｉＲＮＡを細胞または生物個体に導入して保持すること、が記載されている。

また、従来のＲＮＡｉテクノロジーとしては、例えば、SAYDA M. ELBASHIR, JENS HARBORTH, WINFRIED LENDECKEL, ABDULLAH YALCIN, KLAUS WEBER & THOMAS TUSCHL, “Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells”, Nature, 24 May 2001, VOL. 411, Pages 494 - 498に記載されたものがある。この文献には、Ｄｉｃｅｒによって短く切断されたｓｉＲＮＡを直接哺乳類細胞に導入すれば、インターフェロン経路の活性化なしにＲＮＡｉ経路を働かせることができる旨記載されている。

また、従来のＲＮＡｉテクノロジーとしては、例えば、Jurgen Soutschek, Akin Akinc, Birgit Bramlage, Klaus Charisse, Rainer Constien, Mary Donoghue, Sayda Elbashir, Anke Geick, Philipp Hadwiger, Jens Harborth, Matthias John, Venkitasamy Kesavan, Gary Lavine, Rajendra K. Pandey, Timothy Racie, Kallanthottathi G. Rajeev, Ingo Ro¨ hl, Ivanka Toudjarska, Gang Wang, Silvio Wuschko, David Bumcrot, Victor Koteliansky, Stefan Limmer, Muthiah Manoharan & Hans-Peter Vornlocher, “Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs”, NATURE, 11 NOVEMBER 2004, VOL. 432, Pages 173 - 178に記載されたものがある。この文献には、コレステロールと結合したｓｉＲＮＡｓが持続的にａｐｏＢをコードする遺伝子の発現を抑制した旨が記載されている。

また、従来のテロメレース活性を抑制する技術としては、例えば、特開２００２−１０４９９５号公報に記載されたものがある。この文献には、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃等のビタミンＤレセプターのアゴニストと９−ｃｉｓレチノイン酸等のレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）のリガンドとの組合せからなる医薬が記載されている。また、この文献によれば、この医薬は、ヒトテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のプロモーター領域に直接的または間接的に作用してその発現量を低下させることができる物質で、テロメレース活性抑制剤および抗癌剤等として有用な医薬である旨記載されている。

また、従来のテロメレース活性を抑制する技術としては、例えば、特開２００４−３５０６０７号公報に記載されたものがある。この文献には、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子に対してＲＮＡ干渉効果を示す二重鎖ポリヌクレオチドが記載されている。この文献には、この二重鎖ポリヌクレオチドは、ヒトテロメレース逆転写酵素遺伝子の配列に基づいて設計されており、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を阻害する旨記載されている。

また、従来のテロメレース活性を抑制する技術としては、例えば、米国特許出願公開第２００３／００９９６１６号明細書に記載されたものがある。この文献には、テロメレース・プロモーターによる二面特異性のある腫瘍細胞死ベクターが記載されている。また、この文献には、このテロメレース・プロモーターによって働く発現ベクターは、癌細胞を標的にでき、ＲＮＡｉ用にも使える旨記載されている。

しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、上記特許文献３および特許文献４記載の従来技術では、テロメレース活性の抑制の面でさらなる改善の余地がある。とりわけテロメレースが約４．０ｋｂの大きな分子であるため人為的制御が困難であるため、テロメレース活性の抑制の効率および安定性の面でさらなる改善の余地がある。

第二に、上記特許文献１、特許文献２、特許文献５、非特許文献１および非特許文献２記載の従来技術では、抗癌抑制に役立つ薬剤候補物質の設計方法および投与方法に関する分野の開発が進展している反面、その投与する薬剤候補物質の設計元となる原試料の発見が遅れている。すなわち、テロメレースの活性化（特にテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現の活性化）に関する新規な因子およびメカニズムの報告が乏しいため、薬剤候補物質の設計元となる原試料が不足し、テロメレースの活性を抑制する薬剤候補物質の設計の自由度の面でさらなる改善の余地がある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、哺乳類の細胞内でテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節する新規な物質を提供することを目的とする。

本発明によれば、配列番号１で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子が提供される。

この配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子の発現を阻害すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。また、この配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子を過剰発現させると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

また、本発明によれば、配列番号３で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡなどの生成物が提供される。

この配列番号３で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。また、この配列番号３で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡを過剰発現させると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

なお、上述の説明は一見すると矛盾しているようにも思えるため、誤解を避けるための説明を以下に記載する。図２７は、ＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）、ｈＴＥＲＴ遺伝子の予想される互いの制御関係をまとめた概念図である。なお、図２７において、＋は促進、−は抑制を意味する。すなわち、後述する実施例１および実施例２の実験データを見るとわかるように、ＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）は、通常の発現量ではｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を促進するが、過剰発現させるとｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制する。そのため、ＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）の発現を阻害しても、過剰発現させても、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制することになる。

また、後述する実施例１および実施例２の実験データを見るとわかるように、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）は、通常の発現量ではｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を促進する。一方で、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）は、過剰発現させるとＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）の発現を促進してＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）を過剰発現させることが示唆されている（データ示さず）。そのため、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）を過剰発現させると、結果としてｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制すると想定される。そのため、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）の発現を阻害しても、過剰発現させても、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現を抑制することになると想定される。

また、本発明によれば、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの一部に相当する１５塩基以上３０塩基以下の長さの第一の塩基配列と、この第一の塩基配列と相補的な１５塩基以上３０塩基以下の長さの第二の塩基配列と、を含む二本鎖のＲＮＡが提供される。

この二本鎖のＲＮＡは、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制する。また、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

なお、第一の塩基配列は、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。また、第二の塩基配列も、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。これらの範囲の長さの塩基配列を含む二本鎖のＲＮＡであれば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとしての機能が向上するからである。

また、本発明によれば、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの一部に相当する１５塩基以上３０塩基以下の長さの第一の塩基配列と、この第一の塩基配列と逆方向に配置されている、この第一の塩基配列と相補的な１５塩基以上３０塩基以下の長さの第二の塩基配列と、を含む一本鎖のＲＮＡが提供される。

この一本鎖のＲＮＡは、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制する。また、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

なお、第一の塩基配列は、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。また、第二の塩基配列も、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。これらの範囲の長さの塩基配列を含む一本鎖のＲＮＡであれば、ｓｈＲＮＡとしての機能が向上するからである。

また、本発明によれば、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと、このｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡをマイクロＲＮＡ成熟酵素により切断してなる複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡが提供される。なお、マイクロＲＮＡ成熟酵素としては、ＤｒｏｓｈａやＤｉｃｅｒなどのマイクロＲＮＡの成熟に関わる酵素が挙げられる。

この複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡは、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制する。また、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

また、本発明によれば、配列番号２で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子が提供される。

この配列番号２で表される塩基配列からなる遺伝子の発現を阻害すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

また、本発明によれば、配列番号４で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡが提供される。

この配列番号４で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの発現を抑制すると、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現が抑制される。よって、この構成によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

なお、第一の塩基配列は、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。また、第二の塩基配列も、１８塩基以上２５塩基以下の長さであってもよい。これらの範囲の長さの塩基配列を含む二本鎖のＲＮＡであれば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして好適に機能するからである。

また、本発明によれば、上記のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと、このｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡをマイクロＲＮＡ成熟酵素により切断してなる複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡが提供される。なお、マイクロＲＮＡ成熟酵素としては、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｇｏ２、ＴＲＢＰなどのマイクロＲＮＡの成熟に関わる酵素が挙げられる。

なお、上記の現象は、いずれも哺乳類の細胞内での現象である。

また、上記の遺伝子およびＲＮＡは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子およびＲＮＡも同様の作用効果を奏する。

また、上記の遺伝子およびＲＮＡは、上記の塩基配列に限定されず、これらの塩基配列からなるポリヌクレオチド分子に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のポリヌクレオチド分子の塩基配列からなる遺伝子およびＲＮＡも同様の作用効果を奏する。

また、上記の遺伝子およびＲＮＡは本発明の一態様であり、本発明の遺伝子およびＲＮＡは、以上の構成要素の任意の組合せであってもよい。また、本発明のベクター、複合体なども、同様の構成を有し、同様の作用効果を奏する。

すなわち、本発明によれば、テロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節する新規な２種類の遺伝子のいずれかまたはこれらの遺伝子に基づいて得られる物質を用いるため、哺乳類の細胞内でテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節することができる。

遺伝子１および遺伝子２のヒト１０番染色体上の短腕上の１５．１区画近傍における配置を示した物理地図である。遺伝子１のクローニングの順序を説明するための概念図である。遺伝子２のヒト１０番染色体上の局在部位と構造を説明するための概念図である。遺伝子１および遺伝子２の転写産物であるＲＮＡの構造および互いの位置関係を説明するための概念図である。遺伝子１および遺伝子２の配列を説明するための図である。遺伝子１の変異体の配列を説明するための図である。遺伝子１を元に設計するｓｉＲＮＡの配列を説明するための図である。遺伝子２を元に設計するｓｉＲＮＡの配列を説明するための図である。ＲＮＡの細胞内への導入法を説明するための図である。ＲＮＡｉの作用を示す模式図である。ダイサーによる２種類のｍＲＮＡの切断について説明するための電気泳動図である。肝癌細胞におけるＲＧＭ３７６の分化特異的な発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ３７６過剰発現によるテロメレース活性の抑制について説明するためのグラフおよび電気泳動図である。形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴおよびＲＧＭ３７６の発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡ導入細胞での遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡによるｈＴＥＲＴ抑制結果をまとめたグラフおよび電気泳動図である。肝癌細胞におけるＲＧＭ２４９の分化特異的な発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ２４９ｄｓＲＮＡのＨＭｃ−Ｌｉ７への導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＲＰＬ２２ｄｓＲＮＡのＨＭへの導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡのＨＬＦへの導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡ発現抑制率をまとめたグラフである。ＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡの導入によるＲＧＭ３７６の発現およびＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡの導入によるＲＧＭ２４９の発現を示す電気泳動図である。ＭｉｃｒｏＲＮＡｓによるｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｉｌｅｎｓｉｎｇの想定メカニズムを説明するための概念図である。ｓｈＲＮＡを生成するためのプラスミドからｓｈＲＮＡが生成され、標的遺伝子の発現を阻害するメカニズムを説明するための概念図である。ＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡの発現を示す電気泳動図である。ＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡ発現抑制率をまとめたグラフである。ＲＧＭ３７６遺伝子（配列番号１）、ＲＧＭ２４９遺伝子（配列番号３）、ｈＴＥＲＴ遺伝子の予想される互いの制御関係をまとめた概念図である。遺伝子２を元に設計するＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡの配列を説明するための図である。遺伝子２を元に設計するＲＧＭ２４９変異ｓｈＲＮＡの配列を説明するための図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。

＜テロメレースの説明＞
本実施の形態は、発癌のメカニズムにおいて極めて重要な役割を果たすと考えられる酵素テロメレースに関する。本実施の形態では、発癌すなわち癌抗原の第一候補であるテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現に密接に関与しながら、それを制御する２つのＲＮＡ遺伝子の機能解析を遂行する。

テロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）とは、染色体末端のテロメア配列の伸長、染色体の安定に必要な酵素であり、細胞老化からの逸脱、癌化の誘導に深く関与している。より詳細には、テロメレース（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）とは、染色体末端のテロメアを修復する酵素である。

テロメレース形成に必要な分子としては、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：テロメレース逆転写酵素）、ｈＴＲ（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅＲＮＡｔａｐｅ：ＲＮＡｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、ＴＥＰ１（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１）、Ｄｙｓｋｅｒｉｎ（ＤＫＣ１）、ＲＰＬ２２、Ｎｏｌａ３、Ｌａ−ａｎｔｉｇｅｎ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｈ／ＡＣＡなどが挙げられ、これらの分子によりテロメレース酵素の活性や生成が制御されている。

＜２つの遺伝子の染色体上の位置および発見の経緯＞
図１は、遺伝子１および遺伝子２のヒト１０番染色体上の短腕上の１５．１区画近傍における配置を示した物理地図である。

本発明者がテロメレース制御遺伝子として、ヒト１０番染色体短腕よりクローニングした両遺伝子は、ゲノム上約１．５ｋｂの隣接した位置にマップされる。なお、図中、左側に示す染色体上において、上側はテロメア方向であり、下側はセントロメア方向である。

Ｇｅｎｅ１は、本発明者がＲＧＭ３７６と名付けた遺伝子１の存在箇所を示す。また、Ｇｅｎｅ２は、本発明者がＲＧＭ２４９と名付けた遺伝子２の存在箇所を示す。なお、Ｇｅｎｅ１およびＧｅｎｅ２の間には、さらにＤ１０Ｓ１７２８およびＤ１０Ｓ１６４９と名付けられているＤＮＡマーカーが存在する。

Ｇｅｎｅ１、Ｄ１０Ｓ１７２８、Ｄ１０Ｓ１６４９、Ｇｅｎｅ２は、いずれもＡＬ３５５５９１．３、ＡＬ１３８７７４．５、Ｊ２１、Ｈ１１、Ｍ６と名付けられているゲノムライブラリーの１．５ｋｂの長さの共通領域に存在している。

図２は、遺伝子１のクローニングの順序を説明するための概念図である。
本発明者は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）をクローニングするために、まず、微小核融合法およびＢＡＣスクリーニングの後、Ｅｘｏｎｔｒａｐｐｉｎｇを施行した。次いで、Ｅｘｏｎｔｒａｐｐｉｎｇにより絞り込んだ領域について、強制発現によりテロメレース活性、ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現を抑制するＥｘｏｎの同定を行った。

そして、同定したＲＧＭ３７６遺伝子のＥｘｏｎの塩基配列の検討、ＯＲＦ解析、ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎの結果、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）は、蛋白質を合成しない、ｎｃＲＮＡであることが強く示唆された。

なお、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）のクローニングの際に得られた複数のクローンに共通する約１．５ｋｂの長さの領域中のＥｘｏｎとして同定された遺伝子である。

このＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）も、テロメレースおよび癌関連制御遺伝子の存在が示唆されてきたヒト１０番染色体短腕１０ｐ１４−１５領域のＢＡＣライブラリーを用いてＥｘｏｎｔｒａｐｐｉｎｇ法で得た４４個のＥｘｏｎの中から、癌細胞株で発現を有する遺伝子として選別され、ｃＤＮＡを取得された遺伝子である。

同定したＲＧＭ２４９遺伝子のＥｘｏｎの塩基配列の解析、ＯＲＦ解析、蛋白質発現ベクターを用いたｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ＆ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎの結果、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）は、蛋白質をコードしない、ｎｃＲＮＡであることが強く示唆された。

＜２つの遺伝子の構造および機能の説明＞
図３は、遺伝子２のヒト１０番染色体上の局在部位と構造を説明するための概念図である。ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）は、図３のように、ヒト１０番染色体の短腕の１５．３の位置に存在している。また、ＲＧＭ２４９遺伝子の長さは２４９ｂｐである。さらに、ＲＧＭ２４９遺伝子は、２つのエキソンから構成されている。一方のエキソンは、長さ１９０ｂｐであり、他方のエキソンは、長さ５９ｂｐである。

ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）も、同様にヒト１０番染色体の短腕の１５．３の位置に存在している。また、ＲＧＭ３７６遺伝子の長さは３７６ｂｐである。

図４は、遺伝子１および遺伝子２の転写産物であるＲＮＡの構造および互いの位置関係を説明するための概念図である。図４（ａ）は、ＲＧＭ３７６遺伝子の転写産物であるＲＮＡの想定される２次元構造を示す。また、図４（ｂ）は、ＲＧＭ２４９遺伝子の転写産物であるＲＮＡの想定される２次元構造を示す。

図４（ｃ）は、ヒト１０番染色体短腕上におけるＲＧＭ３７６遺伝子およびＲＧＭ２４９遺伝子の互いの位置関係を示す。このように、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ＲＧＭ３７６遺伝子の上流に位置していることから、これらの遺伝子を統合制御するメカニズムも想定され、発癌メカニズムにおける両遺伝子の関与が示唆される。

このうち一つのＲＮＡ遺伝子であるＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）は、過剰発現によりｈＴＥＲＴを抑制性に機能し、他方のＲＮＡ遺伝子であるＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）は、ｈＴＥＲＴ発現と同期的に機能している。

より詳細には、これらのＲＮＡ遺伝子は、後述するように、肝癌で発現しｈＴＥＲＴの発現と挙動を共にするもの（遺伝子２）と、肝細胞で発現し、癌細胞に対し抑制性に機能するもの（遺伝子１）と２つあり、互いに相反する機能を有している。また、後述するように、前者（遺伝子２）はｄｓＲＮＡによりテロメレース遺伝子を抑制した後、癌細胞に細胞死をもたらし、後者（遺伝子１）は強制発現により肝癌、肺癌、乳癌などに対し抑制性に作用する。

また、図４（ａ）および図４（ｂ）より、これらのＲＮＡからは、ＤｒｏｓｈａやＤｉｃｅｒなどの酵素による切断により、ｍｉＲＮＡが生体内で生成されている可能性がある。実際、後述するように、テロメレース制御遺伝子として、ヒト１０番染色体短腕よりクローニングしたｍｉＲＮＡクラスター遺伝子（遺伝子１および遺伝子２）は、ＤｒｏｓｈａやＤｉｃｅｒなどの酵素により２０ｍｅｒと６０〜７０ｍｅｒのｍｉＲＮＡを産生する。このように、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を産生して、制御に関与することが実験データからも強く示唆される。そして、これらのｍｉＲＮＡのような小さな機能ＲＮＡを設計・構築することで、特異性の高い抗癌遺伝子医薬への応用が期待できる。

図５は、遺伝子１および遺伝子２の配列を説明するための図である。図５（ａ）は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の塩基配列を示す。ＲＧＭ３７６遺伝子は、３７６塩基の長さである。また、図５（ｂ）は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の塩基配列を示す。ＲＧＭ２４９遺伝子は、２４９塩基の長さである。

図５（ｃ）は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の転写産物であるＲＮＡの塩基配列を示す。ＲＧＭ３７６遺伝子の転写産物であるＲＮＡは、３７６塩基の長さである。また、図５（ｄ）は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の転写産物であるＲＮＡの塩基配列を示す。ＲＧＭ２４９遺伝子の転写産物であるＲＮＡは、２４９塩基の長さである。

図６は、遺伝子１の変異体の配列を説明するための図である。ｍｕｔａｚｙｍｅで変異を誘導したＲＧＭ３７６の変異体による導入効果は、５’末端側から２８０番目の塩基に相当する１塩基（Ａ）が変異を有するクローン（ｍｕｔａ３７６−３−１−２）が弱い増殖抑制とテロメレース発現抑制（ｍＲＮＡ発現の抑制およびテロメレース活性の抑制）を呈する。

すなわち、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子も、遺伝子１と同様にテロメレース発現抑制（ｍＲＮＡ発現の抑制およびテロメレース活性の抑制）を呈する。

また、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなる遺伝子も、遺伝子１と同様にテロメレース発現抑制（ｍＲＮＡ発現の抑制およびテロメレース活性の抑制）を呈すると想定される。

また、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）についても、遺伝子２の塩基配列のうち１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなる遺伝子も、遺伝子２と同様にｈＴＥＲＴの発現と同期するｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子としての機能を有すると想定される。

さらに、遺伝子２に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなる遺伝子も、遺伝子２と同様にｈＴＥＲＴの発現と同期するｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子としての機能を有すると想定される。

また、これらの遺伝子１および遺伝子２の転写産物であるＲＮＡについても、もとのＲＮＡに対して１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された配列からなるＲＮＡは、もとのＲＮＡと同様の機能を有すると想定される。

さらに、これらの遺伝子１および遺伝子２の転写産物であるＲＮＡについても、もとのＲＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＲＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＲＮＡは、もとのＲＮＡと同様の機能を有すると想定される。

図７は、遺伝子１を元に設計するｓｉＲＮＡの配列を説明するための図である。図７（ａ）のＡおよびＢは、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）を元に設計するｓｉＲＮＡの一例の２本鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）をともに示す図である。これらのＡおよびＢにより示される２本鎖のｓｉＲＮＡは、後述するように、ともにＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）のＲＮＡの発現を抑制する。

図７（ｂ）は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）を元に、インビトロジェン株式会社製、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒにより設計したｓｉＲＮＡのうちセンス鎖の複数の例を示す図である。これらのｓｉＲＮＡのうちセンス鎖のうち、配列番号６のセンス鎖は、図７（ａ）のＡに対応する。

より詳細には、Ｓｔｅａｌｔｈ（登録商標）ＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒを用いて、化学修飾したｓｉＲＮＡの設計を行っている。図７（ｂ）には、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒによる機能予測の結果、ｓｉＲＮＡとしての機能の予測値が高いものを列挙している。なお、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉの化学修飾の詳細は、企業秘密として公開されていないが、インビトロジェン株式会社に発注することにより、入手可能である。

図７（ｂ）に列挙された配列をセンス鎖とする２重鎖のｓｉＲＮＡは、いずれも図７（ａ）のＡおよびＢのｓｉＲＮＡと同様に、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）のＲＮＡの発現を抑制すると想定される。

なお、２重鎖のｓｉＲＮＡは、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉであってもよいが、特に限定されず、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端側にそれぞれ２塩基長の突端部（オーバーハング）を有していてもよい。また、これらのＲＮＡは、２本鎖のｓｉＲＮＡではなく、センス配列（センス鎖に相当）およびアンチセンス配列（アンチセンス鎖）の間に４塩基以上の長さのヘアピンループ配列を挟む１本鎖のｓｈＲＮＡであってもよい。なお、このヘアピンループ配列の長さの上限は、特に限定しないが、例えば８塩基であってもよい。いずれも、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）のＲＮＡの発現を抑制すると想定されるためである。

図７（ｃ）は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の全長配列のうち図７（ａ）のＡおよびＢのセンス鎖の配列に相当する箇所を示す図である。ＡおよびＢの符号の付された下線部がＡおよびＢのセンス鎖の配列に相当する。

図８は、遺伝子２を元に設計するｓｉＲＮＡの配列を説明するための図である。
図８（ａ）の（１）（図中では丸付き文字で示す）および（２）（図中では丸付き文字で示す）は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）を元に設計するｓｉＲＮＡの一例の２本鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）をともに示す図である。これらの（１）および（２）により示される２本鎖のｓｉＲＮＡは、後述するように、ともにＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）のＲＮＡの発現を抑制する。

図８（ｂ）は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）を元に、インビトロジェン株式会社製、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＢＬＯＣＫ−ｉＴＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒにより設計したｓｉＲＮＡのうちセンス鎖の複数の例を示す図である。これらのｓｉＲＮＡのうちセンス鎖のうち、配列番号２０のセンス鎖は、図７（ａ）の（１）（図中では丸付き文字で示す）に対応する。また、配列番号３２のセンス鎖は、図７（ａ）の（２）（図中では丸付き文字で示す）をＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の全塩基配列中で１塩基分だけ５’側にシフトさせた配列（２）’（図中では丸付き文字で示す）に相当する。

図７の場合と同様に、図８でも、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒを用いて、化学修飾したｓｉＲＮＡの設計を行っている。つまり、図８（ｂ）には、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒによる機能予測の結果、ｓｉＲＮＡとしての機能の予測値が高いものを列挙している。なお、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉの化学修飾の詳細は、企業秘密として公開されていないが、インビトロジェン株式会社に発注することにより、入手可能である。

図８（ｂ）に列挙された配列をセンス鎖とする２重鎖のｓｉＲＮＡは、いずれも図８（ａ）の（１）および（２）のｓｉＲＮＡと同様に、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）のＲＮＡの発現を抑制すると想定される。

なお、２重鎖のｓｉＲＮＡは、ＳｔｅａｌｔｈＲＮＡｉであってもよいが、特に限定されず、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端側にそれぞれ２塩基長の突端部（オーバーハング）を有していてもよい。また、これらのＲＮＡは、２本鎖のｓｉＲＮＡではなく、センス配列（センス鎖に相当）およびアンチセンス配列（アンチセンス鎖）の間に４塩基以上の長さのヘアピンループ配列を挟む１本鎖のｓｈＲＮＡであってもよい。なお、このヘアピンループ配列の長さの上限は、特に限定しないが、例えば８塩基であってもよい。いずれも、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）のＲＮＡの発現を抑制すると想定されるためである。

図８（ｃ）は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の全長配列のうち図８（ａ）の（１）および（２）のセンス鎖の配列に相当する箇所を示す図である。（１）および（２）の符号の付された下線部が（１）および（２）のセンス鎖の配列に相当する。

図９は、ＲＮＡの細胞内への導入法を説明するための図である。
例えば、（１）ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の２本鎖ＲＮＡや、（２）ＲＰＬ２２遺伝子の２本鎖ＲＮＡや、（３）上述のＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）に基づいて設計される特異的な２本鎖ＲＮＡを含むｓｉＲＮＡなどを用いて、後述の実施例に示す実験を行うには、まず、これらのＲＮＡを哺乳類動物細胞へトランスフェクションさせる。この際、トランスフェクション試薬としては、例えばインビトロジェン株式会社製のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００を用いることができる。

次に、これらのＲＮＡをそれぞれトランスフェクションした哺乳類動物細胞を所定の条件で培養した後に、これらの哺乳類動物細胞からそれぞれのＲＮＡを抽出する。その後、抽出されたＲＮＡを用いて、それぞれＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、これらのＲＮＡをトランスフェクションすることによる各種ＲＮＡの発現の変化を検出できる。

図１０は、ＲＮＡｉの作用を示す模式図である。ｓｉＲＮＡは、相補的細胞ｍＲＮＡをターゲットとするＲＮＡ−ヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＩＳＣ）の一部となる。この際、センス鎖はアンチセンス鎖から離れて分解される。

そして、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含むＲＮＡ−ヌクレアーゼ複合体は、アンチセンス鎖と相補的な標的ｍＲＮＡを認識して切断することにより、細胞内での標的ｍＲＮＡの発現を抑制する。

なお、ＲＮＡｉに用いるＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端側にそれぞれ２塩基長の突端部（オーバーハング）を有しているｓｉＲＮＡに限定されず、センス配列（センス鎖に相当）およびアンチセンス配列（アンチセンス鎖）の間に４塩基以上の長さのヘアピンループ配列を挟む１本鎖のｓｈＲＮＡであってもよい。なお、このヘアピンループ配列の長さの上限は、特に限定しないが、例えば８塩基であってもよい。このようなｓｈＲＮＡは、細胞内でヘアピンループ配列が切断されて、ｓｉＲＮＡに変化するためである。

以下、本実施の形態の２つのＲＮＡ遺伝子の用途について説明する。
本実施の形態の２つのＲＮＡ遺伝子は、ともにテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を調節する機能を有するため、哺乳類の細胞内でテロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を調節することができる。

より詳細には、本実施の形態の２つのＲＮＡ遺伝子は、発癌の分子的メカニズムを解明する鍵となり、テロメレース抑制による抗癌治療（分子標的治療）への展開に有用である。とりわけテロメレースが４．０ｋｂの大きな分子であるため人為的制御が困難であるのに対し、当該遺伝子は４００ｂｐ以下の分子であり、遺伝子発現の調節がより容易であると考えられる。近年多くの抗癌研究が試行されているが、その投与方法に関する分野の開発が進展している反面、その投与する原試料の発見が遅れている。癌に極めて直接的に関わる因子の報告が乏しい中で、この領域の解明とこの分子が癌撲滅というテーマに関われるということは画期的かつ刷新的と考えられる。

特に、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）については、転写産物であるＲＮＡを過剰に発現させると、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。そのため、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の転写産物であるＲＮＡを過剰発現させることにより、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる。また、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）については、発癌の分子的メカニズムを解明するためのリサーチツールとしても活用できる。

また、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）をベクターに連結して発現可能に構成されている発現ベクターは、細胞内に導入されると、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。よって、この発現ベクターは、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる。

このため、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の転写産物であるＲＮＡまたは上記発現ベクターを含む医薬は、人体に投与されると、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。よって、この医薬は、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる癌治療剤として好適に用いることができる。

また、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）に基づいて設計される、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの各種ＲＮＡは、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の発現を抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。また、ＲＧＭ３７６（遺伝子１）の転写産物であるＲＮＡと、このＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡをダイサーなどにより切断してなる複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡ（ＲＮＡカクテルまたはＲＮＡプール）も、同様にＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の発現を抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。よって、これらの各種ＲＮＡは、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる。

また、これらのｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの各種ＲＮＡと、コレステロールなどの脂質や細胞内への取り込み促進（誘導）物質と、を結合してなる複合体は、非特許文献２に示すように、人体をはじめとする哺乳類動物細胞内で長時間持続的に標的ｍＲＮＡ（ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１））の発現を抑制する。このため、このＲＮＡ−コレステロール複合体などの各種複合体は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）の発現を長時間にわたり抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を長時間にわたり抑制する。また、各種ＲＮＡに取り込み促進（誘導）物質を結合して得られる複合体であれば、細胞内への取り込み効率も向上する。よって、これらの各種ＲＮＡは、テロメレース活性を長時間にわたり抑制し、その結果、発癌を長期にわたり抑制することができる。

このため、上記のｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの各種ＲＮＡまたは上記のＲＮＡ−コレステロール複合体を含む医薬は、人体に投与されると、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。よって、この医薬は、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる癌治療剤として好適に用いることができる。特に、上記のＲＮＡ−コレステロール複合体を含む医薬は、上記の作用機序により、発癌を長期にわたり抑制するため、人体への投与間隔を長くできるという利点もある。

一方、また、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）については、転写産物であるＲＮＡの発現およびｈＴＥＲＴの発現（細胞の癌化）が同期するため、発癌の分子的メカニズムを解明するためのリサーチツールとして活用できる。また、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）をベクターに連結して発現可能に構成されている発現ベクターは、細胞内に導入されると、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を促進し、テロメレース活性を促進して癌化を引き起こす。このため、この発現ベクターもリサーチツールとして活用できる。

また、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）に基づいて設計される、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの各種ＲＮＡは、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の発現を抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。また、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の転写産物であるＲＮＡと、このＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡをダイサーにより切断してなる複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡ（ＲＮＡカクテルまたはＲＮＡプール）も、同様にＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の発現を抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を抑制する。よって、これらの各種ＲＮＡは、テロメレース活性を抑制し、その結果、発癌を抑制することができる。

また、これらのｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの各種ＲＮＡと、コレステロールなどの脂質や細胞内への取り込み促進（誘導）物質と、を結合してなる複合体は、非特許文献２に示すように、人体をはじめとする哺乳類動物細胞内で長時間持続的に標的ｍＲＮＡ（ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２））の発現を抑制する。このため、このＲＮＡ−コレステロール複合体などの各種複合体は、ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の発現を長時間にわたり抑制することにより、テロメレース逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子の発現を長時間にわたり抑制する。また、各種ＲＮＡに取り込み促進（誘導）物質を結合して得られる複合体であれば、細胞内への取り込み効率も向上する。よって、これらの各種ＲＮＡは、テロメレース活性を長時間にわたり抑制し、その結果、発癌を長期にわたり抑制することができる。

以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

例えば、上記実施の形態ではＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）またはＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の塩基配列の一部であって、ＢＬＯＣＫ−ｉＴＲＮＡｉＤｅｓｉｇｎｅｒにより予想される配列をセンス鎖とするｓｉＲＮＡを用いたが、他のＲＮＡｉ設計ソフトウェアを用いてもよく、あるいはランダムにＲＮＡを作成して実験によりＲＮＡｉ作用を引き起こすｓｉＲＮＡを選択してもよい。このようにしても、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）またはＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡが得られる。

以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜ｍｉＲＮＡ生成についての検討＞
図１１は、ダイサーによる２種類のｍＲＮＡの切断について説明するための電気泳動図である。下記の実施例を行うに先立ち、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）およびＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）からのｍｉＲＮＡの生成についての検討を行った。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、遺伝子ＲＧＭ２４９，３７６を、Ｔ７プロモーターを中に有する発現ベクターに組み込み、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＲＮＡ大量調整法（Ｔ７ＲｉｂｏＭＡＸ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓＬａｒｇｅＳｃａｌｅＲＮＡＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＲＧＭ２４９（遺伝子１ｍＲＮＡ）、ＲＧＭ３７６（遺伝子２ｍＲＮＡ）の各ＲＮＡを生成させ、ＲＮａｓｅＩＩＩ群のＤｉｃｅｒ（ＴｕｒｂｏＤｉｃｅｒ：Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）で、それぞれ切断した。その結果、Ｄｉｃｅｄｇｅｎｅ１，Ｄｉｃｅｄｇｅｎｅ２に相当するＲＮＡが得られた。その後、反応生成物を３０％アクリルアミドゲル内で泳動し可視化した。

ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）およびＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）のｍＲＮＡをダイサーで切断したところ、いずれも２５ｂｐ程度の大きさのバンドが生成された。これらの２５ｂｐ程度の大きさのバンドの存在は、ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１）およびＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２）が細胞内でダイサーにより切断されることにより、ｍｉＲＮＡが生成していることを示唆している。

＜実施例１＞
本実施例では、テロメレース逆転写酵素遺伝子ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現を抑制する遺伝子（ＲＧＭ３７６遺伝子（遺伝子１））の機能解析を行った。

より詳細には、本実施例では、（１）遺伝子発現の検討として、肝癌細胞株および初代培養肝細胞株の比較、肝癌部および非癌部の組織の比較を行い、（２）強制発現ベクターによる遺伝子導入として、増殖曲線およびテロメレース活性の解析を行った。

なお、上記の実験を行うにあたっては、ＰＣＲの過程で変異が発生していないことを保証するために、ＰＣＲ産物はシークエンスの確認を行った。

図１２は、肝癌細胞におけるＲＧＭ３７６の分化特異的な発現を示す電気泳動図である。Ａｌｅｘａｎｄｅｒｃｅｌｌｓ（未分化）、ＨｅｐＧ２（高分化）、ＨＬＦ（未分化）、ＨｕＨ７（高分化）、ＨＭｃ−Ｌｉ７（高〜中分化）、初代培養肝細胞をサンプルとして、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動により、ＲＧＭ３７６遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、β−ａｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡの細胞内での発現量を調べた。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、５種の肝がん細胞株におけるＲＧＭ２４９，ｈＴＥＲＴ，β−ａｃｔｉｎの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、３０〜３５サイクルで反応させて、電気泳動法で検出した。初代培養肝細胞（ＫＩＡ）は、肝がん細胞株と同条件で反応させ、各遺伝子の発現を検出した。なお、検出法としては、１％アガロースゲル内で電気泳動した。

電気泳動の結果、癌細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が増加し、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現が減少していた。一方、正常細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が減少し、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現が増加していた。すなわち、肝癌細胞株では、分化特異的な発現が認められた。図１２で得られた肝癌部および非癌部の組織における分化特異的な発現結果および不図示の臨床結果をまとめると、以下のようになる。

（１）非癌部の組織のうち８４．４％（４５サンプルのうち３８サンプル、一部不図示）で、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現が認められた。

（２）臨床パラメータとの比較（不図示）では、癌部でのＲＧＭ３７６遺伝子の発現の有無は、Ｔ検定により、腫瘍径（Ｐ＝０．００３）、腫瘍数（Ｐ＝０．０４７）、分化度（Ｐ＝０．０２１）、血管浸潤の有無（Ｐ＜０．００１）などで有意差が認められた。

（３）再発予知因子での比較（不図示）では、被膜浸潤（Ｐ＝０．００１）との強い相関が認められた。

これらの結果を総合して考えると、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現強度が低いと、癌細胞の分化度が高くなり、被膜浸潤が低くなるものと想定される。一方、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現強度が高いと、癌細胞の分化度は中程度となり、被膜浸潤が高くなるものと想定される。

図１３は、ＲＧＭ３７６過剰発現によるテロメレース活性の抑制について説明するためのグラフおよび電気泳動図である。図１３（ａ）は、横軸がセレクション後の培養日数を示し、縦軸が細胞数を示す。なお、ＨＭは、ＨＭｃ−Ｌｉ７株（クロンテック社より購入）を示し、ＴＨＭは、ｐＬＸＩＮ−ｈＴＥＲＴでテロメライズされたＨＭを示し、ＶＨＭは、ｐＬＸＩＮ（広島大学医学部田原先生のご厚意により入手）のみ導入されたＨＭを示す。ＨＭ＋ＲＧＭ３７６はＨＭｃ−Ｌｉ７株にＲＧＭ３７６が導入された遺伝子導入株を示す。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、肝がん細胞株ＨＭについては、ＨＭ株に加えて、ＨＭ株でｈＴＥＲＴが強制発現しているＴＨＭ株（広島大学田原久俊氏より供与）、ベクターのみが導入されているＶＨＭ株に対して、それぞれＲＧＭ３７６を導入したものを用いた。なお、ＲＧＭ３７６は、発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（当時クロンテック社）に組み込まれて、導入された。また、こうしてＲＧＭ３７６等が導入された細胞におけるテロメレース活性を、それぞれＴＲＡＰｅｚｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ：ＯｎｃｏｒＩｎｃ．）を用いて検出した。なお、この検出の際には、Ｏｎｃｏｒ社から供される試薬を用いて指定されたプロトコールに従って検出した。

図１３（ａ）のグラフに示すように、ＨＭｃ−Ｌｉ７株において、ＲＧＭ３７６遺伝子を過剰に発現させると、当初は増殖期にあった細胞は、約２５日後には増殖抑制期に入り、約５０日後からは細胞数が減少し始める。一方、ＨＭｃ−Ｌｉ７株において、ＲＧＭ３７６遺伝子を過剰に発現させない場合には、増殖期がそのまま続く。また、ＨＭｃ−Ｌｉ７株において、ＲＧＭ３７６遺伝子およびｈＴＥＲＴ遺伝子をともに過剰に発現させると、増殖期がそのまま続く。一方、復帰変異株（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）では、約２５日後には増殖抑制期に入り、約５０日後からは再び細胞数が増加し始める。

図１３（ｂ）は、ＴＨＭ、ＴＨＭ＋ＲＧＭ３７６、ＨＭ、ＨＭ＋ＲＧＭ３７６、ＶＨＭ、Ｒｅｖｅｒｔａｎｔのそれぞれの細胞株について、ＲＮａｓｅ処理の有無の両方の場合に、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動をした結果を示す。なお、ＨＭ＋ＲＧＭ３７６およびＲｅｖｅｒｔａｎｔの株については、図１３（ａ）の黒丸の印の日にサンプルを採取した。

図１４は、形質転換細胞におけるｈＴＥＲＴおよびＲＧＭ３７６の発現を示す電気泳動図である。増殖期（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）、増殖抑制期（ｉｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、復帰変異株（ｉｎｒｅｖｅｒｔａｎｔ）の細胞のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動により、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＲＧＭ３７６遺伝子、β−ａｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を調べた。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図１３においてＲＧＭ３７６が遺伝子導入された細胞において、増殖期、増殖抑制期、導入遺伝子脱落開始による再増殖期で、ＤＮａｓｅにより処理されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法で各遺伝子発現を検討した。ＲＮＡ精製は、プロメガ社のＳＶｔｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍを用いた。

その結果、増殖期では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量が低く、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現量は高かった。また、増殖抑制期でも、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量が低く、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現量は高かった。しかし、増殖抑制期では、増殖期に比べると、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量が高く、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現量は低くなっていた。一方、復帰変異株では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現量が高く、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現量は低かった。

これらの結果から、遺伝子発現については、高分化型癌に比べて未分化型癌でＲＧＭ３７６遺伝子は高発現していることがわかる。また、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現量は、癌の悪性度に関する臨床パラメータ（腫瘍径、腫瘍数、分化度、血管浸潤）と強い相関があることがわかる。よって、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現は、腫瘍の分化度と関与している可能性が示唆される。すなわち、ＲＧＭ３７６遺伝子には、細胞内のテロメレース活性を抑制し、細胞の癌化を抑制する機能があることが示唆される。

また、ＲＧＭ３７６遺伝子の過剰発現には、静止期を経た細胞の増殖を抑制し、細胞を老化させ、細胞死を促進する機能があることが示唆される。また、ＲＧＭ３７６遺伝子の過剰発現には、テロメレース活性を低下させる機能があることが示唆される。さらに、ＲＧＭ３７６遺伝子の過剰発現には、ｈＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を低下させる機能があることが示唆される。すなわち、ＲＧＭ３７６遺伝子は、テロメレース（ｈＴＥＲＴ）を介した癌抑制作用を有する遺伝子であると想定される。

図１５は、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡ導入細胞での遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ｓｉＲＮＡを導入しない細胞をコントロールとし、ＲＧＭ３７６遺伝子に対するｓｉＲＮＡとして、上記のＡおよびＢの配列からなるｓｉＲＮＡを用いた。そして、それぞれのｓｉＲＮＡが導入された細胞について、ＲＧＭ３７６遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、β−ａｃｔｉｎ遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動を行った。また、ＡおよびＢを混合して導入した場合についても調べた。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢｌｏｃｋ−ｉｔＲＮＡｉｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｏｍｅｐａｇｅ）を用いてデザインされ、同社で合成された２種類のｓｉＲＮＡをＡおよびＢとし、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、肝がん細胞株ＨＬＦに導入濃度２５ｎＭで遺伝子導入した。なお、ＡおよびＢは、各２５ｎＭを混合して導入した。さらに、各遺伝子発現については、図１４と同じ方法で導入細胞からＲＮＡを精製した後、ＲＴ−ＰＣＲ法で検出した。

図１６は、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡによるｈＴＥＲＴ抑制結果をまとめたグラフおよび電気泳動図である。また、図１６では、この実験に用いたｓｉＲＮＡ（ＡおよびＢ）のセンス鎖の配列についても示している。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図１５で示されるｓｉＲＮＡの導入を３回試み、ＲＴ−ＰＣＲ法でＲＧＭ３７６の発現抑制度を検討し、それと同時に、電気泳動像をｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでその発現強度を測定し、その測定値をｎｏｓｉＲＮＡの測定値で標準化して棒グラフで示した。

図１６に示すように、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡにより、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現も同様に抑制される。なお、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡのうち、Ａを単独で用いた場合に最も抑制効果が優れている。また、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡのうち、Ｂを単独で用いた場合にも、優れた抑制効果が得られたが、Ａよりは抑制効果が低かった。さらに、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡのうち、ＡおよびＢをともに導入した場合にも、優れた抑制効果が得られたが、Ａよりは抑制効果が低かった。

よって、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡにより、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現も同様に抑制される。このため、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡにより、テロメレース活性を抑制でき、その結果、細胞の癌化を抑制することができる。

＜実施例２＞
本実施例では、テロメレース逆転写酵素遺伝子ｈＴＥＲＴｍＲＮＡと同期的に発現する遺伝子（ＲＧＭ２４９遺伝子（遺伝子２））の機能解析を行った。

より詳細には、（１）肝癌細胞株での発現をＲＴ−ＰＣＲで調べ、（２）肝組織での発現をＲＴ−ＰＣＲで調べ、（３）テロメレース形成に関連する遺伝子との関連性について調べ、（４）関与が示唆された遺伝子由来のｄｓＲＮＡの発現およびｓｉＲＮＡによる遺伝子導入をして、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙ、ＭＴＴアッセイ、形態変化の観察を行った。

図１７は、肝癌細胞におけるＲＧＭ２４９の分化特異的な発現を示す電気泳動図である。Ａｌｅｘａｎｄｅｒｃｅｌｌｓ（未分化）、ＨｅｐＧ２（高分化）、ＨＬＦ（未分化）、ＨｕＨ７（高分化）、ＨＭｃ−Ｌｉ７（Ｔ、Ｎ、Ｃ）、初代培養肝細胞をサンプルとして、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動により、ＲＧＭ２４９遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＲＰＬ２２遺伝子、β−ａｃｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡの細胞内での発現量を調べた。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図１２と同様の方法により、ＲＧＭ２４９，ｈＴＥＲＴ，ＲＰＬ２２，β−ａｃｔｉｎの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。なお、図１７で、ＨＭｃ‐Ｌｉ７では、Ｔ：総ＲＮＡ，Ｎ：核内より抽出したＲＮＡ、Ｃ：細胞質内のＲＮＡを示す。

電気泳動の結果、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ｈＴＥＲＴ遺伝子が発現している肝癌細胞株、初代培養肝細胞株での発現が認められた。また、癌細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が増加し、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現が同期して増加していた。一方、正常細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が減少していた。すなわち、肝癌細胞株では、分化特異的な発現が認められた。

図１８は、ＲＧＭ２４９ｄｓＲＮＡのＨＭｃ−Ｌｉ７への導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＨＭｃ−Ｌｉ７細胞に、ＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計したｄｓＲＮＡを導入し、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲ、ＴＥＰ１、ｄｙｓｋｅｒｉｎ、ＲＰＬ２２、Ｎｏｌａ３、ＲＧＭ２４９の各遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動を行った。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、ＲＧＭ２４９ｄｓＲＮＡを、Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｅｒをｄｕａｌｄｉｒｅｃｔｉｏｎに有するベクターＬｉｔｍａｓ２８ｉ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ）の制限酵素部位に組み込み、Ｔ７ＲＮＡポリメレースで２本鎖ＲＮＡを生成させた。この２本鎖ＲＮＡを精製後、ＨＭにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓにより導入した形質転換細胞を用いて、テロメレース関連遺伝子（ｈＴＥＲＴ，ｈＴＲ，ＴＥＰ１，Ｄｙｓｋｅｒｉｎ，ＲＰＬ２２，Ｎｏｌａ３，ＲＧＭ２４９）の発現強度をｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒで測定して、図１８に示した結果を得た。

その結果、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現が抑制されたＨＭｃ−Ｌｉ７細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現も同期して抑制された。よって、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現を促進する機能を有していることが示唆される。

図１９は、ＲＰＬ２２ｄｓＲＮＡのＨＭへの導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＨＭｃ−Ｌｉ７細胞に、ＲＰＬ２２の発現を抑制するように設計したｄｓＲＮＡを導入し、ｈＴＥＲＴ、ＴＥＰ１、ｈＴＲ、ＲＧＭ２４９、ｄｙｓｋｅｒｉｎ、Ｎｏｌａ３、ＲＰＬ２２、ＧＡＰＤＨの各遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動を行った。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、ＲＰＬ２２ｃＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ）を購入し、大腸菌株で培養後、ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡを精製し、ＲＰＬ２２ｃＤＮＡをＬｉｔａｍａｓ２８ｉの制限酵素部位に組み込み、図１８と同様にＲＰＬ２２のｄｓＲＮＡを得て、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＭへ導入した。こうして得られた形質転換細胞において、上述のｄｓＲＮＡは、導入濃度４０、２０、１０、０μｇ／ｍｌで導入された。その後、各遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲで発現を検討し、電気泳動した。

その結果、ＲＰＬ２２遺伝子の発現が抑制されたＨＭｃ−Ｌｉ７細胞では、（１）ＲＧＭ２４９遺伝子、（２）ｈＴＥＲＴ遺伝子、（３）ｄｙｓｋｅｒｉｎの発現も同期して抑制された。よって、ＲＰＬ２２遺伝子は、ＲＧＭ２４９遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ｄｙｓｋｅｒｉｎ遺伝子の発現を促進する機能を有していることが示唆される。

図２０は、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡのＨＬＦへの導入による遺伝子の発現を示す電気泳動図である。ＨＬＦ細胞に、ＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｉＲＮＡ（上記の（１）（図中では丸付き文字で示す）および（２）（図中では丸付き文字で示す）のｓｉＲＮＡ）を導入し、ＲＧＭ２４９、ｈＴＥＲＴ、ＲＰＬ２２、β−ａｃｔｉｎの各遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動を行った。その結果、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現がｓｉＲＮＡ（１）により抑制されたＨＬＦ細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＲＰＬ２２遺伝子の発現も同期して抑制された。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図１５と同様、Ｂｌｏｃｋ−ｉｔＲＮＡｉｄｅｓｉｇｎｅｒでデザインされ、合成されたＲＧＭ２４９のｓｉＲＮＡ２種類丸１、丸２を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて肝がん細胞株ＨＬＦに導入し、導入細胞から、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、発現強度を電気泳動で可視化し、検出した。

図２１は、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡ発現抑制率をまとめたグラフである。図２１に示すように、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ（１）（図中では丸付き文字で示す）により、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現も同様に抑制される。また、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡのうち、（２）（図中では丸付き文字で示す）を単独で用いた場合、（１）および（２）をともに導入した場合には、（１）を単独で用いた場合よりはｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現抑制効果が低かった。

よって、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ（１）により、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現も同様に抑制される。このため、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ（１）により、テロメレース活性を抑制でき、その結果、細胞の癌化を抑制することができる。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図２０で検討した導入実験を３回行い、電気泳動像をｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでＩｍａｇｅＳｃａｎし、測定値をｎｏｓｉＲＮＡで標準化し、ｓｉＲＮＡの遺伝子抑制程度を棒グラフで示した。

これらのＲＧＭ２４９遺伝子についての実験結果から、肝癌細胞株、肝癌組織の８０％程度でＲＧＭ２４９遺伝子が発現していることがわかった。また、ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡの遺伝子導入の実験により、ＲＧＭ２４９由来のｓｉＲＮＡは、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現を抑制することがわかった。さらに、図示しないが、肝組織の検討では、各種臨床パラメータにおける相関で、Ｔ検定、多変量解析、Ｐｅｒｓｏｎ相関検定において肝癌の腫瘍マーカーであるＰＩＶＫＡ−２とＲＧＭ２４９遺伝子の発現量とが有意な相関を示すことがわかった。

よって、ｈＴＥＲＴ遺伝子が発現している肝癌細胞および初代培養肝細胞、肝癌組織、非肝癌組織でＲＧＭ２４９遺伝子は一様に発現していると想定される。また、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現に関与している可能性がある。さらに、ＲＧＭ２４９遺伝子の発癌への関与が示唆される。

＜ＲＧＭ３７６およびＲＧＭ２４９の関係＞
図２２は、ＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡの導入によるＲＧＭ３７６の発現およびＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡの導入によるＲＧＭ２４９の発現を示す電気泳動図である。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図２１および図１５で行われた導入実験で、（ａ）ＲＧＭ２４９導入ではＲＧＭ３７６の発現を、（ｂ）ＲＧＭ３７６導入ではＲＧＭ２４９の発現を、導入された細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法で、検出した。

図２２（ａ）は、ＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡ（（１）（図中では丸付き文字で示す）および（２）（図中では丸付き文字で示す））の導入によるＲＧＭ３７６の発現への影響を、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動により観察した結果である。ＲＧＭ２４９特異的ｓｉＲＮＡ（１）により、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を抑制すると、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現も同様に抑制される。また、ＲＧＭ特異的２４９ｓｉＲＮＡのうち、（２）を単独で用いた場合、（１）および（２）をともに導入した場合には、（１）を単独で用いた場合よりはＲＧＭ３７６遺伝子の発現抑制効果が低かった。

図２２（ｂ）は、ＲＧＭ３７６ｓｉＲＮＡ（ＡおよびＢ）の導入によるＲＧＭ２４９の発現への影響を、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動により観察した結果である。ＲＧＭ３７６特異的ｓｉＲＮＡにより、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現を抑制しても、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現は抑制されなかった。

上述の結果から、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現を制御していることがわかる。その際、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ＲＧＭ３７６遺伝子の発現を促進する形で制御しているものと想定される。一方、ＲＧＭ３７６遺伝子は、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を制御していないことがわかる。

図２４は、ｓｈＲＮＡを生成するためのプラスミドからｓｈＲＮＡが生成され、標的遺伝子の発現を阻害するメカニズムを説明するための概念図である。図２４の左側に示すように、上述のＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の間にＣＧＡＡからなるＲＮＡ配列を挟んだ領域に相補的なＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターを構築した。なお、このＤＮＡ配列は、プラスミドベクターのプロモーターの下流に配置した。

図２８は、遺伝子２を元に設計するＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡの配列を説明するための図である。この図に示すように、配列番号３３に示すＤＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡと、配列番号３４に示すＤＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡと、をアニーリングさせて、これらの２本の一本鎖ＤＮＡが相補的に結合してなる二本鎖ＤＮＡを得た。そして、この二本鎖ＤＮＡを、上述のようにプラスミドベクターに組み込んで、ＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡを発現するためのベクターを作製した。

次いで、このプラスミドベクターのＤＮＡ配列から、上述のＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の間にＣＧＡＡからなるＲＮＡ配列を挟んだＲＮＡ鎖が、ＣＧＡＡの部分でループを形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖の結合によりステムを形成してなるＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡを生成させた。そして、このＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡにより、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を阻害させた。

一方、図２４の右側に示すように、上述のＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端側から８番目のＴ残基の一つが欠失したアンチセンス変異鎖の間にＣＧＡＡからなるＲＮＡ配列を挟んだ領域に相補的なＤＮＡ配列を含むｍｔプラスミドベクターを構築した。なお、このＤＮＡ配列は、ｍｔプラスミドベクターのプロモーターの下流に配置した。

図２９は、遺伝子２を元に設計するＲＧＭ２４９変異ｓｈＲＮＡの配列を説明するための図である。この図に示すように、配列番号３３に示すＤＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡのアンチセンスターゲット配列の５’末端側から８番目のＴ残基の一つが欠失した、配列番号３５に示すＤＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡと、配列番号３６に示すＤＮＡ配列からなる一本鎖ＤＮＡと、をアニーリングさせて、これらの２本の一本鎖ＤＮＡが相補的に結合してなる二本鎖ＤＮＡを得た。そして、この二本鎖ＤＮＡを、上述のようにプラスミドベクターに組み込んで、ＲＧＭ２４９変異ｓｈＲＮＡを発現するためのベクターを作製した。

次いで、このｍｔプラスミドベクターのＤＮＡ配列から、上述のＲＧＭ２４９ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス変異鎖の間にＣＧＡＡからなるＲＮＡ配列を挟んだＲＮＡ鎖が、ＣＧＡＡの部分でループを形成し、センス鎖およびアンチセンス変異鎖の結合によりステムを形成してなるＲＧＭ２４９変異ｓｈＲＮＡを生成させた。そして、このＲＧＭ２４９変異ｓｈＲＮＡにより、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を阻害させた。

図２５は、ＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡの発現を示す電気泳動図である。ＨＬＦ細胞に、上述のＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡを生成するプラスミドベクターおよびｍｔプラスミドベクターを導入し、ＲＧＭ２４９、ｈＴＥＲＴ、ＲＰＬ２２、β−ａｃｔｉｎの各遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲおよび電気泳動を行った。その結果、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現がｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡにより抑制されたＨＬＦ細胞では、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＲＰＬ２２遺伝子の発現も同期して抑制された。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図２０と同様、Ｂｌｏｃｋ−ｉｔＲＮＡｉｄｅｓｉｇｎｅｒでデザインされ、合成された、上述のＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡを生成するプラスミドベクターおよびｍｔプラスミドベクターを肝がん細胞株ＨＬＦに導入し、ｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡを発現させた導入細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、発現強度を電気泳動で可視化し、検出した。

図２６は、ＲＧＭ２４９ｓｈＲＮＡ導入後の各遺伝子ｍＲＮＡ発現抑制率をまとめたグラフである。図２６に示すように、上述のＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡを生成するプラスミドベクターおよびｍｔプラスミドベクターにより、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現も同様に抑制される。また、プラスミドベクターおよびｍｔプラスミドベクターのいずれを用いた場合でも、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現抑制効果が同程度であった。

よって、ＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡにより、ＲＧＭ２４９遺伝子の発現を抑制すると、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現も同様に抑制される。このため、ＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡにより、テロメレース活性を抑制でき、その結果、細胞の癌化を抑制することができる。

このとき、実験方法は、以下のようにして行った。すなわち、図２５で検討した導入実験を３回行い、電気泳動像をｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでＩｍａｇｅＳｃａｎし、測定値をｎｏｓｉＲＮＡで標準化し、ｓｉＲＮＡの遺伝子抑制程度を棒グラフで示した。

これらのＲＧＭ２４９遺伝子についての実験結果から、ＲＧＭ２４９の発現を抑制するように設計した特異的なｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡの遺伝子導入の実験により、ＲＧＭ２４９由来のｓｈＲＮＡおよび変異ｓｈＲＮＡは、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現を抑制することがわかった。よって、ＲＧＭ２４９遺伝子は、ｈＴＥＲＴ遺伝子およびＲＰＬ２２遺伝子の発現に関与している可能性がある。

以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。

たとえば、上記実施例では、ｓｉＲＮＡとして、インビトロジェン株式会社のｓｔｅａｌｔｈ（登録商標）ＲＮＡｉを用いたたが、他のメーカーの構造の異なるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどを用いてもよい。この場合にも、標的ｍＲＮＡの発現を抑制することができれば、同様の作用効果を得られるためである。

たとえば、上記実施例では、ｓｉＲＮＡまたはＤｉｃｅｒで切断して得られるｓｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）について説明したが、特に限定するわけではない。たとえば、生体内では、ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍｉＲＮＡｇｅｎｅからＤｒｏｓｈａで約７０数ｂｐ以下のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが生成し、Ｄｉｃｅｒでｐｒｅ−ｍｉＲＮＡになるメカニズムも想定されている（図２３のＭｉｃｒｏＲＮＡｓによるｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｓｉｌｅｎｓｉｎｇの想定メカニズムを説明するための概念図を参照すること）。このｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを介して得られるｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＰとなって細胞内での標的ｍＲＮＡの翻訳などを抑制するメカニズムにより、上記の実施例と同様の作用効果が奏されてもよい。

なお、上記実施例では、ＲＮＡについて説明したが、ＲＮＡはＲＮＰとして機能してもよい。ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＲＮＡがタンパク質と結合して機能する複合体である。これらの微小のＲＮＡがＲＩＳＣに取り込まれてＲＮＰを形成することにより、標的を切断するメカニズムが想定されている。

以上のように、本発明にかかるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子は、哺乳類の細胞内でテロメレース逆転写酵素遺伝子の発現を調節するという効果を有するため、その遺伝子またはその遺伝子の発現を抑制する特異的なＲＮＡは、リサーチツール、医薬（癌治療剤）の原材料等として有用である。

Claims

配列番号１で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子。
配列番号１で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子。
配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＤＮＡ分子の塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子。
請求項１乃至３いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子をベクターに連結して発現可能に構成されているｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子発現ベクター。
請求項１乃至３いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子の転写産物であるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡ。
配列番号３で表される塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡ。
配列番号３で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失・置換若しくは付加された塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡ。
配列番号３で表される塩基配列からなるＲＮＡ分子に対して相補的な塩基配列からなるＲＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする哺乳動物由来のＲＮＡ分子の塩基配列からなるｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡ。
請求項５乃至８いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの一部に相当する１５塩基以上３０塩基以下の長さの第一の塩基配列と、
前記第一の塩基配列と相補的な１５塩基以上３０塩基以下の長さの第二の塩基配列と、を含む、請求項１乃至３いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子の発現を抑制する二本鎖のＲＮＡ。
請求項９に記載の二本鎖のＲＮＡにおいて、
前記第一の塩基配列は、配列番号６又は９に記載の塩基配列であるＲＮＡ。
請求項９記載の二本鎖のＲＮＡにおいて、
前記第一の塩基配列は、３’末端に２塩基の長さの突端部位を含み、
前記第二の塩基配列は、３’末端に２塩基の長さの突端部位を含むＲＮＡ。
請求項５乃至８いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡの一部に相当する１５塩基以上３０塩基以下の長さの第一の塩基配列と、
前記第一の塩基配列と逆方向に配置されている、前記第一の塩基配列と相補的な１５塩基以上３０塩基以下の長さの第二の塩基配列と、
前記第一の塩基配列および前記第二の塩基配列の間にある４塩基以上のヘアピンループ配列と、を含む、請求項１乃至３いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節遺伝子の発現を抑制する一本鎖のｓｈＲＮＡ。
請求項１２記載のｓｈＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ配列をベクターに連結して発現可能に構成されているｓｈＲＮＡ発現ベクター。
請求項５乃至８いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと、
前記ｈＴＥＲＴ発現調節ＲＮＡと相補的な塩基配列を含むＲＮＡと、を含む二本鎖のＲＮＡをマイクロＲＮＡ成熟酵素により切断してなる、請求項１乃至３いずれかに記載のｈＴＥＲＴ発現遺伝子の発現を抑制する二本鎖のＲＮＡが含まれる複数の種類の二本鎖のＲＮＡを含有するＲＮＡプール。
請求項９記載の二本鎖のＲＮＡと、
細胞内への取込促進物質と、
を結合してなる複合体。