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CN105492598B - 与细胞的抗衰老相关的生物分子群 - Google Patents

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CN105492598B CN201480047897.1A CN201480047897A CN105492598B CN 105492598 B CN105492598 B CN 105492598B CN 201480047897 A CN201480047897 A CN 201480047897A CN 105492598 B CN105492598 B CN 105492598B
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Abstract

提出一种新型类Muse细胞的生产方法、或延长细胞群的寿命的方法。类Muse细胞的生产方法包含抑制ELAVL2、TEAD1，或GATAD2B的表达或功能的工艺。此时，也可以通过siRNA或shRNA来抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能。

Description

与细胞的抗衰老相关的生物分子群
技术领域
本发明涉及类Muse细胞（Muse-like cell）的生产方法、或延长细胞群的寿命的方法等。
背景技术
2012年的诺贝尔生理学・医学奖被颁发给初次制成iPS细胞的山中伸弥教授和进行该制成技术的基础研究的约翰·格登博士。人们所期待的是，该iPS细胞将目前没有的全新的治疗战略带到医疗行业中。
作为与该iPS细胞相关的技术，例如在专利文献1中记载了将4个基因（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）导入细胞的结果，细胞多能干细胞化。此外，作为与多能干细胞相关的技术，例如，在专利文献2中，记载了通过将3个基因（Oct3/4、Klf4、Sox2）和一个miRNA（hsa-miR-372等）导入细胞来制备多能干细胞。另外，在非专利文献1中，记载了当导入所述的4个或3个基因时，如果缺少多能干细胞化的细胞的p53基因，则多能干细胞的制备效率上升。另外，在专利文献3以及4中，记载了通过将特定的RNA链（miR-520d-5p等）导入细胞来制备多能干细胞。
另一方面，为了将iPS细胞应用于实际的医疗中，在癌变控制和分化控制方面存在改善的余地。其中，作为与多能干细胞相关的新的方法，在专利文献5中，报告了分离出含有Muse细胞的细胞分离组分。在该专利文献5中，记载了专利文献5的Muse细胞可以分化为所有的组织、作为iPS细胞的来源是有用的（iPS细胞的制成效率高）、可以不经过基因的导入而分离。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/069666号
专利文献2：国际公开第2009/075119号
专利文献3：国际公开第2012/008301号
专利文献4：国际公开第2012/008302号
专利文献5：日本专利第5185443号公报。
非专利文献
非专利文献1：‘Suppression of induced pluripotent stem cell generationby the p53-p21 pathway.’ Hong et al., Nature. 2009 Aug 27;460(7259):1132-5.Epub 2009 Aug 9。
发明内容
然而，虽然存在如上述的成功制备多能干细胞的事例，但作为治疗用途，不存在从官方获得制造销售批准的产品。这是由于多能干细胞的制备方法被限制，该领域的研究无法进行而造成。另外，如果除去少量的方法中确认了副作用（例如，基于c-Myc的培养初期的癌变等）的方法，则有效的方法进一步受到限定。
如上所述，还公开了一种基于Muse细胞的新的方法。然而，专利文献5的Muse细胞需要从生物体的间充质组织或培养间充质细胞中以SSEA-3的表达为阳性为指标进行分离，为了调整原料以及分离Muse细胞，将产生复杂的操作以及高成本。
本发明是鉴于所述问题而完成的，目的在于提供一种新型类Muse细胞的生产方法、或延长细胞群的寿命的方法等。
本发明的发明人发现如后述的实施例所记载的那样，如果抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达，则出现类Muse细胞，从而完成本发明。另外，令人吃惊的是细胞制品的寿命延长。
即，根据本发明的一方式，提供一种类Muse细胞的生产方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。
另外，根据本发明的一方式，提供一种通过所述生产方法得到的类Muse细胞或其类Muse细胞群。
另外，根据本发明的一方式，提供一种再生医疗用材料，该材料通过培养介由所述生产方法得到类Muse细胞而得到。
另外，根据本发明的一方式，提供一种治疗药或化妆品，其中含有所述类Muse细胞或类Muse细胞群。
另外，根据本发明的一方式，提供一种类Muse细胞诱导剂、治疗药、化妆品、或细胞群的寿命延长剂，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。
另外，根据本发明的一方式，提供一种延长细胞或细胞群的寿命的方法、寿命延长后的细胞或细胞群的生产方法、CD105 mRNA高表达细胞的生产方法、成纤维细胞产生细胞的生产方法、或使类Muse细胞活性化的方法，并且这些方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。
根据本发明，可以通过新型的方法来生产类Muse细胞。或者，根据本发明，可以大大地延长细胞或细胞群的寿命。
附图说明
图1是培养成纤维细胞时的照片。
图2是培养第0天的成纤维细胞的照片。
图3是培养第一个月的成纤维细胞的照片。
图4是培养第一个月和第3周的成纤维细胞的照片。
图5是当使培养第一个月的成纤维细胞感染导入慢病毒之后，培养3周时的照片。
图6是将图5的细胞群进一步在ReproStem培养基中培养1周时的照片。
图7是将图6的类Muse细胞进一步在ReproStem培养基中培养4天时的照片。
图8是将图5的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基中培养1周时的照片。
图9是将图8的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基中培养4天时的照片。
图10是针对导入或未导入siETG的细胞，测定CD105 mRNA表达量的结果。
图11是随时间变化来测定CD105 mRNA表达量的结果。
图12是随时间变化来测定hTERT mRNA表达量的结果。
图13是随时间变化来测定Oct4 mRNA表达量的结果。
图14是随时间变化来测定SIRT1 mRNA表达量的结果。
图15是随时间变化来测定P53 mRNA表达量的结果。
图16是随时间变化来测定Nanog mRNA表达量的结果。
图17是随时间变化来测定胶原质（Collagen）产生能力的结果。
图18是对293FT细胞导入hsa-miR-520d-5p的结果。
具体实施方式
以下，针对本发明的实施方式详细地进行说明。另外，针对相同的内容，为了避免重复，适当地省略说明。
本发明的一实施方式是新型的类Muse细胞的生产方法。该生产方法例如是类Muse细胞的生产方法，其中包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地生产类Muse细胞或类Muse细胞群。该生产方法不一定需要复杂的操作，并且在效率以及成本方面优良。
该生产方法也可以包含将抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达的RNA链导入细胞群的工艺和从导入有所述RNA链的细胞群中回收类Muse细胞的工艺。所述回收也可以以细胞形态、或基因表达为指标来回收。所述回收包含分离或游离的操作。
所述类Muse细胞也可以高表达内源性的hTERT以及SIRT1。hTERT以及SIRT1是年轻的细胞中表达量高的基因，因此，高表达hTERT以及SIRT1的类Muse细胞可以说是相对未老化的年轻细胞。另外，所述类Muse细胞也可以高表达内源性的p53。p53是分类为恶性肿瘤抑制基因的基因，因此，可以说高表达p53的类Muse细胞的恶性肿瘤化的风险低。
所述类Muse细胞也可以是CD105、SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanog、SSEA-3阳性。类Muse细胞的CD105、SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanog、SSEA-3（以下，有时称为“CD105等”）的表达量例如相对于对照试样（例如，hiPSC（HPS0002 253G1）、CD105等基因剔除细胞、正常细胞、非多能性细胞、或来自这些的试样等）的CD105等表达量，优选显著地高表达。另外，该CD105等表达量例如相对于对照试样的CD105等表达量，也可以是1.1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、40、50、100、500、或1000倍以上。CD105等表达量的测定方法考虑到实现测定精度以及简便性，优选为实时PCR。
类Muse细胞的存在也可以以细胞为眼球（黑眼球和白眼球）那样的形态为指标来判断。另外，类Muse细胞也可以是粘合性或浮游性的。另外，类Muse细胞成为眼球那样的形态之后，可以变化为细长的成纤维细胞那样的形态，另外，之后也可以变化为眼球那样的形态。另外，类Muse细胞包含所述专利文献5所记载的Muse细胞、或实质上性质与该Muse细胞相同的细胞。是否是类Muse细胞例如也可以通过与所述专利文献5的Muse细胞的形态比较、或基因表达量比较等来评估。其中，介由本实施方式的生产方法得到的类Muse细胞与所述专利文献5所记载的Muse细胞相比，优选高表达hTERT的、更年轻的细胞。另外，是否是类Muse细胞例如也可以通过对对照细胞高表达CD105等一个以上来评估。
所述类Muse细胞的直径也可以是1、5、10、20、50、75、或100μm以上，也可以在这些任意两个值的范围内。从细胞群中有效地分离类Muse细胞的观点出发，优选直径为5μm以上，更优选为10μm以上。
另外，与ELAVL2等相关的碱基序列等的细节可以从HGNC(HUGO GeneNomenclature Committee)或NCBI（National Center for Biotechnology Information）的WEB网站上看到。HGNC所记载的HGNC ID中，ELAVL2为HGNC:3313，TEAD1为HGNC:11714，GATAD2B为HGNC:30778。ELAVL2 mRNA也可以包含序列编号29的碱基序列。TEAD1 mRNA也可以包含序列编号30的碱基序列。GATAD2B mRNA也可以包含序列编号31的碱基序列。另外，各基因有时冠以其他名称，其他名称记载在HGNC的WEB网站中。因此，各基因也可以使用成为其他名称。例如，ELAVL2包括被称为HEL-N1或HuB的基因。
本发明的一实施方式是一种再生医疗用材料的生产方法，该方法包含培养所述类Muse细胞的工艺。再生医疗用材料例如是再生医疗用脏器。另外，另一实施方式是一种再生医疗用材料，该材料通过培养所述类Muse细胞而得到。另外，另一实施方式是一种损伤组织的治疗方法，该方法包含将所述类Muse细胞或类Muse细胞群导入损伤部位的工艺。另外，另一实施方式是一种用于治疗损伤组织的治疗药，该治疗药含有所述类Muse细胞或类Muse细胞群。另外，另一实施方式是一种抗衰老方法，该方法包含将所述类Muse细胞或类Muse细胞群导入组织的工艺。另外，另一实施方式是用于抗衰老的化妆品，该化妆品含有所述类Muse细胞或类Muse细胞群。
本发明的一实施方式是一种类Muse细胞诱导剂，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。如果使用该诱导剂，则可以从细胞中诱导Muse细胞。另外，如果将该类Muse细胞诱导剂应用于恶性肿瘤细胞，则可以治疗恶性肿瘤。另外，通过抑制恶性肿瘤等效果，还可以在用于辅助畜牧业中的动物的饲养的添加剂等中使用。
本发明的一实施方式是一种损伤组织的治疗方法，该方法包含抑制损伤组织的细胞中的ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。此时，损伤组织中的细胞转化为Muse细胞，进一步分化，由此修复损伤组织。另外，另一实施方式是一种治疗药，该治疗药中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。
本发明的一实施方式是一种组织的抗衰老方法，该方法包含抑制组织的细胞中的ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。此时，组织中的细胞转化为Muse细胞，进一步进行分化，由此重建组织。另外，另一实施方式是一种抗衰老剂或用于抗衰老的化妆品，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。
本发明的一实施方式是一种延长细胞或细胞群的寿命的方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该方法，可以延长细胞或细胞群的寿命，因此，可以长期培养研究用的细胞。另外，可以用于抗衰老。另外，另一实施方式是细胞或细胞群的寿命延长剂，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。延长的期间可以是1、2、3、4、5、10、15、20、25、或30周以上，也可以是这些任意两个值的范围内。延长后的细胞的寿命可以是6、7、8、9、10、15、18、20、25、30、或40周以上，也可以是这些任意两个值的范围内。
正常细胞通过重复分裂来形成组织。另一方面，分裂的次数存在界限，为人所知的是，通常以存在细胞时为分界线停止分裂为人所知。一般将该细胞分裂面临停止状态的情况称为细胞老化。细胞老化是组织的功能降低和人老化的原因。该细胞老化实际上可以在in vitro实验中观察到，通常，如果重复正常细胞的继代培养，则以存在细胞时为界限，细胞不增殖。这对研究用细胞的可用性设置了界限，是抑制细胞工程学领域的研究的发展的一个原因。另一方面，如果使用所述实施方式所涉及的方法，则可以延长细胞或细胞群的寿命。
本发明的一实施方式是一种寿命延长后的细胞或细胞群的生产方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地生成寿命被延长的细胞或细胞群。所得到的细胞或细胞群的寿命被延长，因此例如在研究或再生医疗等用途中有用。
本发明的一实施方式是一种CD105 mRNA高表达细胞的生产方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地生产CD105mRNA高表达细胞。另外，所得到的CD105 mRNA高表达细胞可以用于与上述的类Muse细胞相同的用途。
本发明的一实施方式是一种成纤维细胞产生细胞的生产方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地生产成纤维细胞产生细胞。另外，所得到的成纤维细胞产生细胞可以用于与上述的类Muse细胞相同的用途。
本发明的一实施方式是一种使类Muse细胞活性化的方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。根据该生产方法，可以简便地使类Muse细胞活性化。在此，“活性化”包含细胞大小变大。此时的细胞大小也可以变大到2、5、或10倍以上。活性化后的类Muse细胞可以用于与上述的类Muse细胞相同的用途。另外，另一实施方式是一种类Muse细胞活性化剂，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。
本发明的一实施方式是一种恶性肿瘤的治疗方法，该方法包含抑制ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的工艺。另外，另一实施方式是一种恶性肿瘤的治疗药，其中含有针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂。由以往的低分子化合物构成的治疗药诱导细胞死亡来治疗恶性肿瘤，本实施方式的治疗方法、治疗药、或诱导剂可以通过将恶性肿瘤细胞向类Muse细胞诱导来发挥治疗效果。
所述实施方式所涉及的各方法还可以包含（a）对细胞导入针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂的工艺、或（b）培养或增殖导入有所述抑制剂的细胞的工艺。
本发明的一实施方式是一种增加细胞群中的类Muse细胞的比例的方法，该方法包含使针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂与细胞群接触的工艺。另外，另一实施方式是一种类Muse细胞的比例增加后的细胞群的生产方法，该方法包含使针对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的抑制剂与细胞群接触的工艺。
本发明的一实施方式是一种研究用或医疗用试剂盒，其中含有所述抑制剂。该试剂盒例如也可以是一种制成类Muse细胞用、制成人工脏器用、延长细胞或细胞群的寿命用、抗衰老用、或治疗用的试剂盒。该试剂盒例如还可以包含缓冲液、记载有效成分信息的附件、用于收容有效成分的容器、或包装等。
本发明的一实施方式是一种类Muse细胞诱导剂、细胞或细胞群的寿命延长剂、类Muse细胞活性化剂、抗衰老剂、用于抗衰老的化妆品、或治疗药的筛选方法，并且该方法包含挑选降低ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能的被测物质的工艺。根据该方法，可以得到类Muse细胞诱导剂等。该方法也可以包含向细胞导入被测物质的工艺和测定ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的表达或功能量的工艺。
在本发明的一实施方式中使用的“细胞”也可以是体细胞。该体细胞是除了生殖细胞的其他的细胞，因此包含皮肤细胞、或成纤维细胞等。体细胞通常多能性被限定或消失。另外，所述细胞也可以是来自皮肤、心脏、肺、胃、肠、肾脏、子宫、大动脉外膜、或间充质组织的细胞。或者，所述细胞也可以是恶性肿瘤细胞。恶性肿瘤例如包含正常的细胞发生突然变异而产生的肿瘤。恶性肿瘤可能发生在全身的所有的脏器和组织，如果恶性肿瘤细胞增殖，则形成块并侵入破坏周囲的正常的组织。该恶性肿瘤例如包含恶性上皮肿瘤、肉瘤、血液恶性肿瘤、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胆道癌、乳癌、大肠癌、小肠癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、尿管癌、肾盂癌、尿管癌、阴经癌、精巢癌、脑癌、中枢神经系统的癌、末梢神经系统的癌、头颈癌（口腔癌、鼻咽癌、咽喉癌、鼻腔・鼻窦癌、唾液腺癌、甲状腺癌等）、胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、皮肤癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、唾液腺癌、或恶性淋巴等。
在本发明的一实施方式中，所谓“内源性”表示被测物质从细胞的内部的机制而来而存在的。例如，在细胞内持续地表达的蛋白质仅限于表达出来的蛋白质属于内源性。
在本发明的一实施方式中，“抑制基因的表达”例如包含抑制从基因向mRNA的转录机制、或抑制从mRNA向蛋白质或多肽翻译的机制。另外，例如包含通过诱导基因、mRNA、蛋白质的分解来抑制。另外，在生物化学领域中，基因的作用例如有生成来自该基因的mRNA、生成来自该基因的蛋白质、以及使来自该基因的蛋白质发挥活性。因此，在本发明的一实施方式中，“抑制基因的功能”包含抑制基因的表达的结果，mRNA或蛋白质的生成量减少。或者，“抑制基因的功能”包含降低来自该基因的mRNA、或来自该基因的蛋白质所具有的活性。
在本发明的一实施方式中，“表达被抑制的状态”包含表达量与正常时相比较，显著地减少的状态。所述“显著地减少”例如可以是表达量减少到0.35、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01、或0倍以下的状态，也可以是减少到这些任意两个值的范围内的状态。从稳定地诱导类Muse细胞的观点、或更稳定地延长细胞或细胞群的寿命的观点出发，优选为0.2倍以下，更优选0.1倍以下。另外，表达量也可以以mRNA量、或蛋白质量为指标。另外，在本发明的一实施方式中，“显著地”例如也可以是使用学者的t检测(单侧或两侧)来评估统计学上的显著性差异，结果p<0.05时的情况。或者，包括实质上产生差异的状态。另外，针对“功能被抑制的状态”的抑制强度，可以说与表达抑制的抑制强度的实施方式相同。
在本发明的一实施方式中，“抑制剂的形态”没有特别地限定，例如，也可以是RNA链、DNA链、低分子有机化合物、抗体、或多肽。所述RNA链例如可以使用对ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B具有RNAi作用的RNA链（例如，siRNA、shRNA、或small RNA等）。作为所述DNA链，可以使用对所述RNA链进行编码的DNA链。该DNA链的形态例如也可以是载体。所述低分子有机化合物可以通过活用组合化学或HTS（高通量筛选）来得到。在组合化学中，例如也可以使用自动合成装置L-COS系列（昭光科学公司）。在HTS中，例如也可以使用Octet系统（ForteBio公司）。所述抗体可以通过公知的抗体制备法（例如，Clackson et al., Nature. 1991 Aug15;352(6336):624-628.所记载的方法）来制备，也可以从受托公司（例如，EVEC, Inc.）购买。此时，优选制备抗体库，选择抑制活性高的抗体。所述多肽可以从受托公司（例如，WakoPure Chemical Industries, Ltd.）购买。另外，抑制剂包含抑制对象的表达的物质、或抑制功能的物质。抑制剂优选为细胞毒性低、或实质上不具有细胞毒性的物质。此时，当将抑制剂投入到生物体内时，可以抑制副作用。从抑制细胞毒性或副作用、且稳定地诱导类Muse细胞的观点、或抑制细胞毒性或副作用、且更稳定地延长细胞或细胞群的寿命的观点出发，抑制剂优选为具有RNAi作用的RNA链、或具有对该RNA链进行编码的DNA序列的DNA链。另外，当特别地指定时，根据抑制剂的形态也可以除去hsa-miR-520d-5p、含有该导链的核酸、实质上与它们相同的核酸、或表达它们的核酸。
在本发明的一实施方式中，“RNAi”包含由于siRNA、shRNA、miRNA、短链或长链的单链或多链RNA、或它们的修饰物等的一个以上，导致靶基因或mRNA等的功能被抑制或沉默的现象。一般地，基于RNAi的抑制机制是序列特异性的，存在于各种物种。使用siRNA或shRNA时，典型的哺乳类中的RNAi的机制如以下那样。首先，将可以表达siRNA或shRNA的载体导入细胞。之后，在细胞内表达了siRNA或shRNA之后，发生siRNA或shRNA的单链化，之后形成RISC（RNA-induced Silencing Complex）。将引入带有RISC的单链RNA作为导向分子，识别具有与该单链RNA的互补性高的序列的靶RNA链。靶RNA链被RISC内的AGO2等酶切断。之后，被切断的靶RNA链分解。以上是机制的一个例子。另外，具有RNAi作用的RNA链、或对该RNA链进行编码的DNA链也可以多个共同导入细胞，例如，可以导入1、2、3、4、5、6、8、10、或20个以上，也可以导入这些任意的两个值的范围内的数。另外，具有RNAi作用的RNA链从更稳定地抑制靶基因或mRNA等的功能的观点出发，优选单链或双链。
在具有RNAi作用的RNA链的设计中，可以使用Stealth RNAi designer（Invitrogen）或siDirect 2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等。另外，也可以委托给受托公司（例如，GeneCopoeia公司、Thermo Scientific公司等）。RNAi作用的确认可以通过根据基于实时RT-PCR的RNA链表达量的定量来进行。或者还可以通过基于Northern杂交的RNA链表达量的分析或基于蛋白质印迹法的蛋白量的分析・表现型的观察等方法来进行。特别地，基于实时RT-PCR的方法较有效。
在本发明的一实施方式中，“siRNA”包含可以诱导RNAi的RNA链。一般地，siRNA的双链可以分为导链和过客链（passenger strand），导链被引入RISC。被引入RISC的导链用于识别靶RNA。在RNAi研究中主要使用人工制成的链，为人所知的是在生物体内内在地也存在该链。所述导链也可以由15碱基以上的RNA构成。如果是15碱基以上，则可以高精度地与靶的多核苷酸结合的可能性增大。另外，该导链也可以由40碱基以下的RNA构成。如果是40碱基以下，则发生干扰素反应等不利的现象的风险更低。
在本发明的一实施方式中，“shRNA”包含可以诱导RNAi，且可以形成折叠为发夹状的构造（发夹样构造）的单链的RNA链。典型的情况是shRNA在细胞内被Dicer切断，剪切出siRNA。通过该siRNA来切断靶RNA的情况为人所知。所述shRNA也可以由35以上的核苷酸构成。如果是35以上，则提高可以高精度地形成shRNA所特有的发夹样构造的可能性。另外，所述shRNA也可以由100碱基以下的RNA构成。如果是100碱基以下，则发生干扰素反应等不利现象的风险降低。其中，一般而言，构造以及功能与shRNA类似的pre-miRNA大部分具有100核苷酸程度或其以上的长度，因此，shRNA的长度不一定为100碱基以下，可以作为shRNA而发挥功能。
在本发明的一实施方式中，“miRNA”包含具有与siRNA类似的功能的RNA链，进行靶RNA链的翻译抑制或分解的情况为人所知。miRNA与siRNA的差异一般在于生成路径和详细的机制。
在本发明的一实施方式中，“small RNA”是指比较小的RNA链，例如有siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、单链或多链的低分子RNA等，但并不限定于这些。当使用small RNA时，可以抑制干扰素反应等不利的现象。
所述RNA链在5’末端或3’末端也可以包含由1～5碱基构成的突出（Overhang）。此时，RNAi的效率上升。该数例如可以为5、4、3、2、或1碱基，也可以是这些任意两个值的范围内。突出例如也可以是ac、c、uc、ag、aa、或uu 。从稳定地发挥RNAi作用的观点出发，突出优选3’末端的ac、c、uc。另外，当所述RNA链为双链时，在各RNA链间也可以存在错配RNA。该数例如可以为1、2、3、4、5、或10个以下，也可以是这些任意的两个值的范围内。另外，所述RNA链也可以包含发夹环，发夹环的碱基数例如可以为10、8、6、5、4、或3碱基，也可以是这些任意两个值的范围内。发夹环的碱基序列例如也可以是gugcuc、或cucuuga。该碱基序列只要具有所希望的效果，也可以缺失、置换、插入、或附加一个或多个碱基序列。另外，各碱基序列的标记左侧为5’末端，右侧为3’末端。
另外，所述RNA链的长度例如可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、40、50、60、80、100、200、或500碱基，也可以是这些任意两个值的范围内。该数如是15以上，则可以高精度地与靶的多核苷酸结合的可能性增加。另外，如果该数为100以下，当将RNA链投入到生物体内时，发生干扰素反应等不利的现象的风险降低。所谓干扰素反应一般是指细胞由于感知dsRNA而成为抗病毒状态的现象。
在本发明的一实施方式中，“RNA链”包含RNA或其等同物以多个结合在一起的状态构成的链。另外，在本发明的一实施方式中，“DNA链”包含DNA或其等同物以多个结合在一起的状态构成的链。该RNA链或DNA链包含单链或多链（例如，双链）的形态的RNA链或DNA链。RNA链或DNA链也可以与细胞引入促进物质（例如，PEG或其衍生物）、标识标记（例如，荧光标识标记等）、连接体（例如，核苷酸连接体等）、或化学疗法剂（例如，抗恶性肿瘤物质等）等结合。RNA链或DNA链可以使用核酸合成装置来合成。此外，还可以从受托公司(例如，英杰公司等)购买。生物体内的RNA链或DNA链有时形成盐或溶剂合物。另外，生物体内的RNA链或DNA链有时接受化学修饰。RNA链或DNA链的用语例如包含形成盐或溶剂合物的RNA链或DNA链、或接受化学修饰的RNA链或DNA链等。另外，RNA链或DNA链也可以是RNA链的类似物（analog）、或DNA链的类似物（analog）。所述“盐”没有特别地限定，例如包含由任意的酸性（例如，羧）基形成的阴离子盐、或由任意的碱基性（例如，氨）基形成的阳离子盐。在盐类中包含无机盐或有机盐，例如， 包含Berge et al., J.Pharm.Sci., 1977, 66, 1-19所记载的盐。另外，例如有金属盐、铵盐、与有机碱基的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐等。所述“溶剂合物”是由溶质以及溶剂形成的化合物。针对溶剂合物，例如可以参照J.Honig etal., The Van Nostrand Chemist’s Dictionary P650 (1953)。如果溶剂为水，则形成的溶剂合物为水和物。该溶剂优选不会妨碍溶质的生物活性。作为那样的优选的溶剂的例子，没有特别地限定，例如有水、或各种缓冲剂。所述作为“化学修饰”，例如有基于PEG或其衍生物的修饰、荧光素修饰、或生物素修饰等。
另外，所述RNA链从稳定地发挥RNAi作用的观点出发，相对于来自靶基因的mRNA的碱基序列的一部分，优选包含互补的碱基序列。所述“一部分”例如可以是5、10、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、或50碱基以上，也可以是这些任意的两个值的范围内。
生成相对于特定的基因的siRNA或shRNA的质粒例如可以由受托公司（例如，GeneCopoeia公司、Thermo Scientific公司等）购入。在后述的实施例中，从GeneCopoeia公司购买了validated shRNA clone set来使用。在后述的实施例1中使用的validatedshRNA clone set中，包含可以生成ELAVL2 siRNA的质粒4个，可以生成TEAD1 siRNA的质粒4个，以及可以生成GATAD2B siRNA的质粒4个。可以生成在后述的实施例1中使用的ELAVL2siRNA的4个质粒的碱基序列为序列编号25、26、27、或28。可以生成在后述的实施例1中使用的TEAD1 siRNA或GATAD2B siRNA的8个质粒分别在psiLv-U6TM载体上载有编码TEAD1 shRNA或GATAD2B shRNA的DNA序列。
另外，通过可以生成在后述的实施例1中使用的ELAVL2 siRNA的4个质粒，分别生成包含序列编号5、6、7、或8的碱基序列的shRNA。这些shRNA在细胞内被酶切断，生成siRNA。这些siRNA分别包含序列编号1 (uuauugguguuaaagucacgg)、2 (aauacgagaaguaauaaugcg)、3 (uuuguuugucuuaaaggag)、或4 (auuugcaucucugauagaagc)的碱基序列。该序列编号1、2、3、或4的碱基序列是与ELAVL2 mRNA的一部分互补的碱基序列，是负责作为导链的功能的部分。
另外，通过可以生成在后述的实施例1中使用的TEAD1 siRNA的4个质粒，分别生成包含序列编号13、14、15、或16的碱基序列的shRNA。这些shRNA在细胞内被酶切断，生成siRNA。这些siRNA分别包含序列编号9 (uuggcuuaucugcagaguc)、10(gcuuguuaugaauggcag)、11 (guaagaaugguuggcaugc)、或12 (aguuccuuuaagccaccuu)的碱基序列。该序列编号9、10、11、或12的碱基序列是与TEAD1 mRNA的一部分互补的碱基序列，是负责作为导链的功能的部分。
另外，通过可以生成在后述的实施例1中使用的GATAD2B siRNA的4个质粒，分别生成包含序列编号21、22、23、或24的碱基序列的shRNA。这些shRNA在细胞内被酶切断，生成siRNA。这些siRNA分别包含序列编号17 (caacagauucaagcgaaga)、18(caauagaugcugcauucug)、19 (caucaacauguguggaagg)、或20 (aggauguuguacgcugaca)的碱基序列。该序列编号17、18，19、或20的碱基序列是与GATAD2B mRNA的一部分互补的碱基序列，是负责作为导链的功能的部分。
在本发明的一实施方式中，ELAVL2 siRNA也可以包含与序列编号1、2、3、或4的碱基序列互补的碱基序列（例如，序列编号5的碱基序列的1-21位的碱基序列、序列编号6的碱基序列的1-21位的碱基序列、序列编号7的碱基序列的1-19位的碱基序列、或序列编号8的碱基序列的1-21位的碱基序列）。在本发明的一实施方式中，TEAD1 siRNA也可以包含与序列编号9、10、11、或12的碱基序列互补的碱基序列（例如，序列编号13的碱基序列的1-19位的碱基序列、序列编号14的碱基序列的1-18位的碱基序列、序列编号15的碱基序列的1-19位的碱基序列、或序列编号16的碱基序列的1-19位的碱基序列）。在本发明的一实施方式中，GATAD2B siRNA也可以含有与序列编号17、18、19、或20的碱基序列互补的碱基序列（例如，序列编号21、22、23、或24的碱基序列的1-19位的碱基序列）。
在本发明的一实施方式中，序列编号1～40所示的碱基序列只要具有所希望的效果，也可以是从由以下碱基序列构成的组中选择的一个以上碱基序列，即，（c）在任意的碱基序列中，1个或多个碱基序列缺失、置换、插入、或附加的碱基序列，（d）相对于任意的碱基序列，具有90％以上的同源性的碱基序列，（e）与由与任意的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下（Under stringent conditions）特异性地杂交的多核苷酸所编码得到的碱基序列。在本发明的一实施方式中，“互补的碱基序列”是指相对于一个多核苷酸，可以杂交的互补性高的其他的多核苷酸所具有的碱基序列。所谓杂交表示在多个多核苷酸间，通过碱基间的氢键等可以形成碱基对的性质。碱基对以沃森-克里克碱基对、Hoogsteen碱基对、或任意的其他的序列特异性的形式产生。两个单链杂交的状态被称为双链。
所述“多个”例如可以是10、8、6、5、4、3、或2个，也可以是这些任意的值以下。从稳定地诱导类Muse细胞的观点、或更稳定地延长细胞或细胞群的寿命的观点出发，该数越小越好。另外，如本领域的技术人员所知，接受1个或多个碱基的缺失、附加、插入、或置换的RNA链维持其生物学活性。
所述“90％以上”例如可以是90、95、96、97、98、99、或100％以上，也可以这些任意两个值的范围内。从稳定地诱导类Muse细胞的观点、或更稳定地延长细胞或细胞群的寿命的观点出发，该数越大越好。所述“同源性”也可以按照该技术领域中公知的方法计算两个或多个碱基序列中相同的碱基的比例。在计算比例之前，对所比较的碱基序列组的碱基进行排列，当需要使同一碱基的比例最大时，对碱基序列的一部分导入间隙。用于排列的方法、比例的算定方法、比较方法、以及与这些相关联的计算机程序在该技术领域中一直为人所知(例如，BLAST、GENETYX等)。在本说明书中，“同源性”只要没有特别地断定，就可以由通过NCBI的BLAST而测定到的值来表示。在由BLAST来比较碱基序列时的算法中，可以在默认设定中使用Blastn。
所述“严格的条件”例如可以采用以下的条件。(1)为了清洗，使用低离子强度以及高温度(例如，50℃、0.015M的氯化钠/0.0015M的柠檬酸钠/0.1％的十二烷基硫酸钠)，(2)在杂化中使用甲酰胺等变性剂(例如，42℃下、50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％的聚乙烯吡咯烷酮/50mM的pH6.5的磷酸钠缓冲剂、以及750mM的氯化钠、75mM柠檬酸钠)、或(3)在含有20％甲酰胺、5×SSC、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×DENHARDT溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20mg/ml的变性剪断鲑鱼精DNA的溶液中，以37℃孵化一晩，接着，在大约37-50℃以1×SSC清洗过滤器。另外，甲酰胺浓度也可以是50％或其以上。清洗时间也可以是5、15、30、60、或120分钟、或这些以上。作为影响杂化反应的严格性的要素，考虑温度、盐浓度等多个要素，细节可以参照Ausubel et al., Current Protocols inMolecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。
所述抑制剂向细胞的导入、以及该细胞的培养方法可以按照在该技术领域中公知的方法来进行。向细胞导入例如可以使用利用病毒载体的感染导入、磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法、或微喷射等。另外，可以利用药剂耐性或细胞分选仪等，只选择被导入的细胞。培养基例如可以使用未分化维持用培养基（例如，多能干细胞用培养基、ReproStem、灵长类ES细胞用培养基（Cosmo Bio公司））、或通常的人类细胞用的培养基（例如，基于DMEM或RPMI的培养基）等。例如，也可以由ReproStem以37℃、5％ CO2、10％ FBS的条件来培养。该数值例如也可以在负10、20、或30％的范围内增减。也可以在不存在饲养细胞的情况下建立（establish）、或培养。建立类Muse细胞时培养的天数没有特别地限定，例如可以为1、2、3、4、5、6、8、10、15、30、60、或100天以上，也可以是这些任意两个值的范围内。另外，从可以更稳定地建立类Muse细胞的观点、或可以稳定地延长细胞或细胞群的寿命的观点出发，优选导入抑制剂的细胞是成纤维细胞。另外，当将所述RNA链导入细胞时，也可以并用导入RNA链至细胞。另外，当将所述DNA链导入细胞时，也可以将多个DNA链导入细胞。在此，“多个RNA链”或“多个DNA链”也可以是2、3、4、5、10、或20个以上的RNA链或DNA链。
在本发明的一实施方式中，“载体”可以使用病毒（例如，慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、或HIV等）载体、来自大肠杆菌的质粒（例如，pBR322）、来自枯草芽孢杆菌的质粒（例如，pUB110），来自酵母的质粒（例如，pSH19）、λ噬菌体等噬菌体、psiCHECK-2、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPER（OligoEngine公司）、BLOCK-it Inducible H1 RNAiEntry Vector（英杰公司）、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp., NJ, USA)等。所述载体也可以包含启动子、复制起始点、或抗生物质耐性基因等、DNA链的表达所需的构成要素。所述载体也可以是所谓的表达载体。
在本发明的一实施方式中，“细胞群“是含有多个细胞的集团。该细胞群例如也可以是包括实质上同质细胞的集团。另外，细胞群也可以是细胞制品。细胞制品例如也可以含有细胞和缓冲液或培养基成分。类Muse细胞群例如可以含有类Muse细胞80、90、95、96、97、98、99、或100％以上，也可以包含于这些任意的两个值的范围内。
在本发明的一实施方式中，“治疗”包含发挥被测者的疾病、或伴随疾病的1个以上的症状的、症状改善效果或预防效果。在本发明的一实施方式中，“治疗药”也可以是含有药理学上允许的一个或一个以上的载体的医药组合物。医药组合物例如混合有效成分和所述载体，通过制剂学的技术领域中熟知的任意的方法来制造。另外，治疗药如果可以用于治疗，则使用方式没有限定，可以单独使用有效成分，也可以混合有效成分与任意的成分。另外，所述载体的形状没有特别地限定，例如也可以是固体或液体（例如，缓冲液）。另外，恶性肿瘤的治疗药包含用于预防恶性肿瘤的药物（预防药）、或恶性肿瘤的良性化诱导剂或正常干细胞化诱导剂。
治疗药的投入路径优选在治疗时使用有效的路径，例如可以是静脉内、皮下、肌肉内、腹腔内、或经口投入等。作为投入方式，例如也可以是注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂等。当投入多核苷酸时，使用注射剂比较有效。注射用的水溶液例如也可以由小瓶、或不锈钢容器来保存。另外，注射用的水溶液例如也可以配合生理盐水、糖(例如，海藻糖)、NaCl、或NaOH等。另外，治疗药例如也可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液)、稳定剂等。
投入量并没有特别地限定，例如可以为每次0.0001mg～1000mg/kg体重。投入间隔也没有特别地限定，例如可以1～10日投入一次。投入量、投入间隔、投入方法可以根据被测者的年龄、体重、症状、对象脏器等适当地选择。另外，也可以与其他的合适的化学疗法药并用地投入。另外，治疗药优选包含治疗有效量、或发挥所希望的作用的有效量的有效成分。当恶性肿瘤的标记在投入后减少时，也可以判断为存在治疗效果。
在本发明的一实施方式中，“被测者”包含人、或除人以外的哺乳动物(例如，大鼠、豚鼠、仓鼠、小鼠、老鼠、兔子、猪、羊、山羊、牛、马、猫、狗、狨、猴、或黑猩猩等一种以上)。
另外，抑制以上的ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B时的各种实施方式还可以适用于来自ELAVL2等一种以上的RNA链或蛋白质的活性的情况（其中，除去基因的功能所特异性的实施方式）。那样的情况下的实施方式也包含于本发明的一实施方式中。例如，本发明的一实施方式是一种类Muse细胞的生产方法、或延长细胞或细胞群的寿命的方法，该方法包含抑制来自ELAVL2、TEAD1、或GATAD2B的RNA链或蛋白质的活性的工艺。
在本说明书中，“或”可以在采样文章中所列举的事项的“至少1个以上”时使用。“或者”也相同。在本说明书中，当记作“两个值的范围内”时，在该范围中还包含两个值本身。
以上，针对本发明的实施方式进行了叙述，但这些是本发明的示例，还可以采用所述以外的各种结构。另外，还可以组合采用所述实施方式所记载的结构。
【实施例】
以下，通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不限定于此。
＜实验例1＞成纤维细胞的培养
购买了人类成人成纤维细胞（NHDF-Ad，TakaraBio公司）之后，在FBM+FGM-2培养基（Ronza公司）中以37℃培养4周。其结果，观察细胞老化（图1）。
图1(a)是购买NHDF-Ad后，第0天的图像。图1(b)是培养四周图1(a)的细胞时的图像。图1(c)是培养NHDF-Ad开始大约一个月后暂时保存，为了再次培养目的而产生的细胞。图1(d)是培养四周图1(c)的细胞时的图像。
＜实施例1＞
分别从GeneCopoeia公司购买生成ELAVL2 siRNA、TEAD1 siRNA、或GATAD2B siRNA的质粒DNA（validated shRNA clone set）。将这些质粒DNA与Virapower（用于提高导入效率、Invitrogen公司）导入人肾系膜细胞株（293FT细胞），作为慢病毒，通过超离心操作将培养液（上清）所产生的粒子分离为小球。使用miR-X lenti titeration kit (TakaraBio公司)来测定效价，以1个细胞1次复制的导入为目标，向人类成人成纤维细胞（NHDF-Ad，TakaraBio公司）感染导入慢病毒。之后，针对转化出的细胞，评估细胞的形态变化、基因表达（CD105、Oct4、Sirt1、hTERT、Nanog等Muse细胞标记（Cell marker）、多能性标记、长寿标记、老化标记等）、胶原质产生能力。在下述(1)～(3)中说明以下的结果。
(1) 细胞的形态变化
细胞形态使用倒立电子显微镜来观察，导入细胞的确认通过荧光显微镜（基恩士公司）来观察GFP的表达。图2是培养第0天的细胞的照片。
图3是培养第一个月的细胞的照片。得知细胞数减少，发生细胞老化。另外，在培养一个月的期间进行4～5次继代培养。
图4是培养第一个月和第三周的细胞的照片。得知细胞数较图3减少，细胞老化进一步恶化。
图5是对培养第一个月的细胞（相当于图3）感染导入慢病毒之后，培养3周后的照片。如照片右侧所示，观察到密度高的细胞群。其表示细胞老化的恶化被抑制，生成了年轻的细胞。
图6是将图5的细胞群进一步在ReproStem培养基 (股份公司ReproCELL)中培养1周时的照片。如照片中央所示，观察到圆形的类Muse细胞。
图7是将图6的类Muse细胞进一步在ReproStem培养基中培养4天时的照片。由照片中央的类Muse细胞得知，大量的年轻的成纤维细胞依次放射线状地生成。另外，该类Muse细胞在Muse细胞中是特异地观察到的眼球（黑眼球和白眼球）那样的形态。
另外，该类Muse细胞在培养18周后的时间点依然存活，继续产生成纤维细胞。如果仅仅培养以往市售的成纤维细胞，则一个月左右细胞老化。因此，所述细胞生存18周令人吃惊。
图8是将图5的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基（Ronza公司）中培养1周时的照片。此时，没有观察到类Muse细胞。
图9是将图8的细胞群进一步在FBM+FGM-2培养基中培养4天时的照片。该成纤维细胞的轮廓鲜明，是更年轻、健康的细胞。
(2) 基因表达的评估
(2-1) CD105表达的评估
随着时间变化由胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）将细胞玻璃，提取RNA。之后，由RT-PCR（OneStep RT-PCR kit、QIAGEN公司）测定CD105的表达量（CD105是muse细胞的标记）。此时，一律使用RNA25ng，将由热循环仪（LineGene，Bioflux公司）测定到的Ct值相对于β-actin进行标准化，通过2-ΔΔ法计算CD105的表达量。
图10表示其结果。未导入siETG（ELAVL2 siRNA、TEAD1 siRNA、以及GATAD2BsiRNA）的NHDF-Ad没有表达CD105 mRNA（图10的2W以及5W）。另一方面，通过siETG导入，表达了CD105 mRNA（图10的7W）。另外，在形成有类Muse细胞的阶段中，表达了非常高的浓度的CD105 mRNA（图10的右端）。
(2-2) 各基因表达的评估
随着时间变化由胰蛋白酶-EDTA将细胞剥离，提取RNA。之后，由RT-PCR测定各基因的表达量。此时，一律使用RNA 25ng，将由热循环仪测定到的Ct值相对于β-actin进行标准化，由2-ΔΔ法计算各基因的表达量。当图表化时，设培养四周NHDF-Ad时的检测量为1，由其倍数(fold)表示。另外，对老化诱导后的状态的细胞、或濒临死亡的细胞，按照1个细胞1个拷贝（copy）的基准感染导入siETG，同样地讨论之后的变化。
其结果，本实施例的类Muse细胞高表达CD105、hTERT、Oct4、SIRT1、P53、以及NanogmRNA。图10～16表示测定结果。CD105是muse细胞的标记(marker)。hTERT以及SIRT1是在年轻的细胞中表达量高的基因。Oct4以及Nanog是多能性标记。p53是被分类为恶性肿瘤抑制基因的基因。
本实施例的类Muse细胞除了CD105之外，同步地高表达SIRT1、hTERT、P53、Oct4、Nanog。即，在本实施例中得到的类Muse细胞变为具有多能性的年轻的正常细胞。另外，由于高表达p53 mRNA，因此，可以说本实施例的类Muse细胞的恶性肿瘤化的风险较低。
图中的样品名的“W”是指培养的期间（周）。图中的样品名的“siETG”是指导入有siETG的样品。图中的样品名的“-1”和“-2”是指对两个样品进行试验。图中的transufection是指导入有siETG。图中的senescence是指看作细胞自然死亡。图中的左侧第9列的“10W-siETG-1”是指对第6列的“10W-siETG-1”再次导入siETG之后，培养3天，回收细胞并测定时的结果。图中的左侧第8列的“10W-siETG-2”表示将第5列的“8W-siETG-2”」进一步在2个月的培养时间点再次导入siETG之后，培养3天，回收细胞并测定mRNA表达量时的结果。图中的左侧第10列的“Muse”是选择性地取得包含培养左侧第8列的“10W-siETG-2”一周后观察到的类Muse细胞的群体，测定mRNA表达量时的结果。图中的“19W-siETG”是对左侧第12列的“16W-siETG-2”再培养3周后的结果。
另外，根据不同于所述的实验而进行的延时摄影，所有的导入细胞至少暂时地变化为类Muse细胞。这与在CD105所测定到的所有的导入细胞中为阳性的情况一致。另外，NHDF-Ad如果导入siRNA，则与其形态无关，变为CD105阳性，变为类Muse细胞。特别地，当施加负荷时（培养基更换中浅播的状态等）观察到成为眼球那样的样子。类Muse细胞有的浮游，有的粘合在一起。观察到从粘合的类Muse细胞中产生新的成纤维细胞的样子。另外，在那样的不固定的位置有时出现成纤维细胞。
(3) 胶原质产生能力
针对转化后的细胞，测定胶原质产生能力。在该测定中，使用类人胶原蛋白IELISA试剂盒（ACEL公司）。基因导入后，成纤维细胞被活性化，生成更多的胶原质（图17）。另外，该图是一个例子，由于进行6周左右的老化诱导，因此还存在进行基因导入，活性化的细胞组。
＜实施例2＞
对293FT细胞导入hsa-miR-520d-5p（序列编号32），观察细胞形态。具体而言，首先使用S&B公司的pMIR-520d-5p/GFP生成质粒DNA。通过与所述相同的步骤，将质粒DNA导入293FT细胞，收集病毒粒子，效价测定后向TIG-1-20细胞进行感染导入。其结果，观察类Muse细胞（图18）。另外，培养该Muse细胞的结果，TIG-1-20细胞放射线状地增殖。其中，与实施例1时相比较，细胞变大，且细胞的轮廓不鲜明。即，与实施例1相比，细胞老化恶化。
以上，根据实施例说明了本发明。该实施例只不过是示例，还能够进行各种变形，本领域的技术人员应该理解，这样的变形例也包含在本发明的范围内。

Claims (16)

1.一种类Muse细胞的非治疗目的的生产方法，其中，包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺，所述类Muse细胞是表达CD105 mRNA的细胞。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述抑制是通过siRNA或shRNA进行抑制。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，包含：
将抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达的RNA链导入细胞群的工序，
从导入有所述RNA链的细胞群中，回收类Muse细胞的工序，所述类Muse细胞是表达CD105 mRNA的细胞。
4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其中，所述类Muse细胞的直径为5μm以上。
5.一种类Muse细胞的非治疗目的的诱导方法，其包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺，所述类Muse细胞是表达CD105 mRNA的细胞。
6.针对ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的抑制剂在制备损伤组织的治疗药中的应用，其中所述治疗包括将成纤维细胞通过所述针对ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的抑制剂诱导成表达CD105 mRNA的类Muse细胞的工艺。
7.针对ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的抑制剂的化妆用途，其中所述用途包括将成纤维细胞诱导成表达CD105 mRNA的类Muse细胞的工艺。
8.一种延长细胞或细胞群的寿命的非治疗目的的方法，其中，该方法包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述抑制是通过siRNA或shRNA进行抑制。
10.针对成纤维细胞中的ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的抑制剂的延长细胞或细胞群的寿命的非治疗目的的用途。
11.一种寿命得到延长的细胞或细胞群的非治疗目的的生产方法，其中，该方法包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺。
12.根据权利要求11所述的生产方法，其中，所述抑制是通过siRNA或shRNA进行抑制。
13.根据权利要求11或12所述的生产方法，其中，包含：
将抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达的RNA链导入细胞群的工序，
从导入有所述RNA链的细胞群中，以CD105的表达为指标来回收寿命得到延长的细胞的工序。
14.一种CD105 mRNA高表达细胞的非治疗目的的生产方法，其中，该方法包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺。
15.一种成纤维细胞产生细胞的非治疗目的的生产方法，其中，该方法包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺。
16.一种使成纤维细胞活性化的非治疗目的的方法，其中，该方法包含在成纤维细胞中抑制ELAVL2、TEAD1、以及GATAD2B的表达或功能的工艺。
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